JPWO2005001116A1 - Ｔｏｌｌ様レセプター強制発現細胞の利用 - Google Patents
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Abstract
Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）遺伝子をブタ腸管パイエル板よりクローニングし、ブタＴＬＲ９を強制発現させた細胞を作製した。該細胞を用いたＣｐＧ ＤＮＡに対する機能性解析を行なった結果、ブタＴＬＲ９はマウス特異的ＣｐＧ ＤＮＡモチーフ（ＣｐＧ１８２６）よりもヒトのＣｐＧ ＤＮＡモチーフ（ＣｐＧ２００６）に対する認識性が高いことが判明した。さらにＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現量を各種組織において比較した結果、腸管免疫系で中心的な役割を果たすパイエル板および腸管膜リンパ節において、脾臓の３倍以上のｍＲＮＡが発現していることが判明した。よって、ＴＬＲ９等の腸管組織において発現しているＴＬＲを強制発現させた細胞は、腸管免疫系を活性化する試料の同定に利用できる。
Description
本発明は、Ｔｏｌｌ様レセプター強制発現細胞の利用法に関する。
生体の免疫システムには先天的な自然免疫と後天的に生じる獲得免疫の２種類がある。ヒト等の高等生物にしか存在しない獲得免疫に対して、自然免疫は昆虫からヒトまで広く保存された免疫機構である。自然免疫を担当する細胞（マクロファージや樹状細胞等）は外界からの病原細菌等が侵入すると、すばやくこれを探知し、食作用等の直接的な攻撃に加え、サイトカイン等の警戒シグナルを発して獲得免疫系を活性化するといった感染防御の第一段階として機能している。この様な一連の免疫反応システムにおいて最初のきっかけとなる細菌を発見する役目を果たしている受容体タンパクがＴｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）である。ＴＬＲは現在までにヒトにおいて１０種類が同定されており、それぞれのＴＬＲは認識する分子構造が異なるものと考えられている（非特許文献１）。その中で２０００年に審良らの研究グループによって報告されたＴＬＲ９は細菌のＤＮＡ、特にＣｐＧモチーフを認識するレセプターとして同定された（非特許文献２、特許文献１）。
すでに、リポペプチドがヒトＴＬＲ２を強制発現させたＣＨＯ細胞におけるＮＦ−κＢの発現活性に与える影響について、また、病原性大腸菌由来ＣｐＧ ＤＮＡの様々なモチーフがヒトＴＬＲ９を強制発現させたＨＥＫ２９３細胞におけるサイトカイン（ＩＬ−８）の産生量に与える影響について報告されている（非特許文献３〜５）。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
特開２００２−３４５６５ Ｏ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｓ．Ａｋｉｒａ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １（２００１）６２５−６３５ Ｈ．Ｈｅｍｍｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４０８（２０００）７４０−７４５ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ａ．Ｔａｋａｄａ Ｈ．Ｋａｎｅｋｏ Ｔ．Ｋａｔｏ Ｉ．Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ Ｄ．Ｈａｒａ Ｙ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｍｕｒａｍｙｌｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６（５）：４０７−１０，２０００． Ｋｌｉｎｍａｎ ＤＭ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｆ．Ｇｕｒｓｅｌ Ｉ．Ｌｅｉｆｅｒ Ｃ．Ｉｓｈｉｉ ＫＪ．Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ Ｄ．Ｇｕｒｓｅｌ Ｍ．ＣｐＧ ＤＮＡ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．４（９）：８９７−９０１，２００２ Ｊｕｌ． Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｆ．Ｌｅｉｆｅｒ ＣＡ．Ｇｕｒｓｅｌ Ｉ．Ｉｓｈｉｉ ＫＪ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．Ｇｕｒｓｅｌ Ｍ．Ｋｌｉｎｍａｎ ＤＭ．Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９ ｉｎ ＣｐＧ ＤＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６７（７）：３５５５−８，２００１ Ｏｃｔ １．
すでに、リポペプチドがヒトＴＬＲ２を強制発現させたＣＨＯ細胞におけるＮＦ−κＢの発現活性に与える影響について、また、病原性大腸菌由来ＣｐＧ ＤＮＡの様々なモチーフがヒトＴＬＲ９を強制発現させたＨＥＫ２９３細胞におけるサイトカイン（ＩＬ−８）の産生量に与える影響について報告されている（非特許文献３〜５）。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
本発明者らはこれまでにプロバイオティック乳酸菌を含む乳業用乳酸菌由来のＤＮＡモチーフが腸管免疫系において免疫賦活化機能を有することを明らかにしてきた（Ｈ．Ｋｉｔａｚａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（２００１）１４９−１６２、Ｈ．Ｋｉｔａｚａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，（２００３）ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。本発明者らは、この知見からＴＬＲ９が病原細菌由来ＤＮＡのみならず、食餌性乳酸菌由来のＤＮＡに対しても認識性を持ち、免疫の活性化に寄与する可能性を考えた。多様なＤＮＡモチーフに対する認識性および活性評価系の構築が可能となれば、今後、病原性細菌の負の評価のためのみならず、乳業用乳酸菌を用いた機能性食品開発の上で重要なツールとなる。
機能性食品の開発を考える場合、最終的にヒトに対する効果を評価する必要があるが、その基礎的知見を得るためには、動物細胞および実験動物を用いた検討が必要不可欠となる。そこで本発明では、実験対象動物として、臓器移植等の観点からヒトモデル系としてその利用性が期待され、また食品産業の面から大きな価値を持つブタに着目し、ブタのＴＬＲ９遺伝子のクローニングと、その遺伝子を導入し強制発現させた動物細胞を作製し、機能性ＤＮＡ評価系のためのＴＬＲ９強制発現細胞を構築することを考えた。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＴＬＲ強制発現細胞の利用法を提供することを目的とする。
本発明者らは、病原細菌由来のＣｐＧ ＤＮＡモチーフを認識する受容体タンパクＴｏｌｌ様レセプター９遺伝子をブタ腸管パイエル板よりクローニングし、ブタＴＬＲ９（ｓＴＬＲ９）を強制発現させた動物細胞（トランスフェクタント）を作製した。動物細胞におけるｓＴＬＲ９タンパクの発現の有無は、ｓＴＬＲ９に対するポリクローナル抗体を作成し、同抗体を用いて確認した。さらに、ｓＴＬＲ９トランスフェクタントのＣｐＧ ＤＮＡに対する機能性を解析し、乳酸菌ＤＮＡの活性評価系への応用を目指した。
具体的には、下記（１）〜（５）を行った。
（１）ブタ腸管パイエル板よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ヒトおよびマウスＴＬＲ９遺伝子における保存性の高い領域より作製したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法によりブタＴＬＲ９遺伝子をクローニングし、その全遺伝子配列を決定した。
（２）遺伝子情報から得られたブタＴＬＲ９全アミノ酸配列から抗原決定基部位を探索し、選抜した領域をペプチド合成しブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体作製用抗原とした。抗原は化学合成後、定法によりウサギに免疫し、ブタＴＬＲ９に対するポリクローナル抗体を作成した。
（３）ブタＴＬＲ９遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞）に導入し、ブタＴＬＲ９遺伝子導入細胞（トランスフェクタント）を作製した。
（４）ブタＴＬＲ９のＨＥＫ２９３Ｔにおける発現については、ブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により、また、ブタＴＬＲ９膜タンパクの発現をブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体による免疫染色法によりレーザー顕微鏡およびフローサイトメーターを用いて確認した。
（５）ヒトおよびマウス細胞を強く刺激する特異的ＣｐＧ ＤＮＡモチーフを含むオリゴＤＮＡ（それぞれＣｐＧ２００６，ＣｐＧ１８２６）に対する反応性を解析した。
検討の結果、ブタＴＬＲ９遺伝子は１０２９残基（ＭＷ：１１５．８）のアミノ酸をコードする３０９０塩基からなり、その遺伝子を含め３１４５塩基のｃＤＮＡ塩基配列を決定することができた。ブタＴＬＲ９のアミノ酸配列はヒトＴＬＲ９に対して８２．９％と非常に高く、マウスＴＬＲ９には７４．９％の相同性を示したことから、ヒトＴＬＲ９に対してマウスよりも比較的高い相同性を示すことが明らかとなった。ブタＴＬＲ９トランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９タンパク質はＲＴ−ＰＣＲ法およびブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体の免疫染色から確実に発現し、膜タンパク質として発現したことを確認できた。このことは、ブタＴＬＲ９トランスフェクタントの作製に成功したことを意味する。本トランスフェクタントを用いたＣｐＧ ＤＮＡに対する機能性解析よりブタＴＬＲ９はＣｐＧ１８２６よりもＣｐＧ２００６に対して強い反応性を示したことから、ブタＴＬＲ９はマウス特異的ＣｐＧ ＤＮＡモチーフよりも比較的ヒトのモチーフに対する認識性が高いことが判明した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現量を各種組織において比較した結果、驚くべきことに、腸管免疫系で中心的な役割を果たすパイエル板および腸管膜リンパ節において、脾臓の３倍以上のｍＲＮＡが発現していることが判明した。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２１〕を提供するものである。
〔１〕被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法であって、
（ａ）腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞に、被験試料を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、上記被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される方法。
〔２〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法。
（ａ）〔１〕に記載の評価方法により、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する工程
〔３〕〔２〕に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する医薬組成物の製造方法。
〔４〕被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験微生物から抽出物を調製する工程
（ｂ）腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞に、該抽出物を接触させる工程
（ｃ）該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、上記抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される方法。
〔５〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法。
（ａ）〔４〕に記載の評価方法により、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験微生物から、腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物を選択する工程
〔６〕〔５〕に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物と食品上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する食品組成物の製造方法。
〔７〕微生物が乳酸菌であり、食品組成物が乳製品である、〔６〕に記載の方法。
〔８〕微生物が細菌である、〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕細菌が乳酸菌である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入する工程を含む、腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法。
〔１１〕腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞を、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法。
〔１２〕腸管組織が腸管リンパ系組織である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕Ｔｏｌｌ様レセプターがブタ由来である、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕Ｔｏｌｌ様レセプターがＴｏｌｌ様レセプター９である、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法に用いるための、腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞。
〔１７〕腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入することで製造される、腸管免疫担当細胞のモデル細胞。
〔１８〕腸管組織が腸管リンパ系組織である、〔１６〕または〔１７〕に記載の細胞。
〔１９〕腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、〔１８〕に記載の細胞。
〔２０〕Ｔｏｌｌ様レセプターがブタ由来である、〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の細胞。
〔２１〕Ｔｏｌｌ様レセプターがＴｏｌｌ様レセプター９である、〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の細胞。
免疫活性化に関与するＴｏｌｌ様レセプター９（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９；ＴＬＲ９）は、脾臓において強く発現していることが知られていた（Ｚａｒｅｍｂｅｒ ＫＡ．ａｎｄ Ｇｏｄｏｗｓｋｉ ＰＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６８（２００２）５５４−５６１）。これに対し、本発明者らは、ＴＬＲ９が腸管リンパ系組織、特にパイエル板や腸管膜リンパ節において強く発現していることを初めて見出した。
腸管は体内と体外の境界組織として、経口摂取された栄養成分の吸収のみならず、外界からの刺激（細菌やウイルスなどの微生物、薬剤や食品添加物、食物に付着した農薬や環境汚染物質など）に常に接触しており、これら異物の受容、伝達、応答、および排除など種々の第一線生体防御機構（ｆｉｒｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｌｉｎｅ）が存在している（Ｍａｎｔｉｓ ＮＪ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（２００２）１８４４−１８５１）。さらに防御機構として特有のリンパ組織、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ；ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）が存在し、ＧＡＬＴは非集合性組成と集合性組成から構成され、非集合性組成には腸管上皮間リンパ球と粘膜固有層リンパ球が含まれ、集合性組成にはパイエル板、リンパ濾胞および腸管膜リンパ節が含まれる（Ｓｐａｈｎ ＴＷ．ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（２００２）：１１０９−１１１３）。パイエル板はリンパ組織関連上皮（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＦＡＥ）に覆われ、腸管絨毛の存在しない部位でドーム形態をなしている。また、胚中心を持ちＢ細胞の存在する濾胞域（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｒｅａ）と、ヘルパーＴ細胞を含む傍濾胞域（ｐａｒａｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｒｅａ）を備えている（Ｏｗｅｎ ＲＬ．Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１９９９）１５７−１６３）。腸管の局所免疫機構の最初の役割を果たす細胞として、ＦＡＥには特殊な上皮細胞であるＭｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（Ｍ ｃｅｌｌｓ；Ｍ細胞）が散在し、細胞質を通って基底表層へとつながる抗原のトンネルとしてリンパ球や樹状細胞、マクロファージなど抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）との接触のためＭ細胞膜は深く陥入している。気管上皮粘膜においてもＭ細胞の存在は確認されており、結核菌などの病原体の入り口として貢献していることが報告されている（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１０（１９９９）６４１−６５０）。また、食品中に含まれる機能性因子のみならず微生物や食物抗原の入り口としても存在することが認められている。腸管内の抗原（特に高分子）はＭ細胞に取り込まれた後、パイエル板の内部へと運ばれ、パイエル板内部の樹状細胞、マクロファージなどのＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩＩ陽性の抗原提示細胞に接触する（Ｋａｎｅｋｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６１（１９９９）１１７５−１１７７、Ｇｅｂｅｒｔ Ａ．ｅｔ ａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１５４（１９９９）１５７３−１５８２、Ｊｅｎｓｅｎ ＶＢ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．６６（１９９８）３７５８−３７６６、Ｐｅｎｈｅｉｔｅｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４（１９９７）６９７−７０９、Ｄｅｂａｒｄ Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２０（２００１）１１７３−１１８２、Ｇｅｂｅｒｔ Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．１６７（１９９６）９１−１５９）。抗原刺激を受けたヘルパーＴ細胞はＦｃレセプターや抗体結合因子（ＩＢＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６を産生し、抗原提示を受け活性化したＴ細胞およびＢ細胞は循環帰巣（ｈｏｍｉｎｇ）という現象を開始し、腸管膜リンパ節を経て、胸腺に入り、体内循環して実行組織である腸管粘膜固有層、乳腺、涙腺、唾液腺、泌尿生殖器などに送られ、さらにＢ細胞は形質細胞となってＩｇＡを産生する。分泌型ＩｇＡは、腸管およびその他の粘膜組織に侵入したウイルス、細菌、細菌毒素、アレルゲンなどを排除する役割を果たしている（Ｖａｅｒｍａｎ ＪＰ．ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５４（１９８５）６０１−６０３、Ｍａｃｈｔｉｎｇｅｒ Ｓ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ Ｒ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７７（１９８６）３４１−３４７、Ｍａｔｈｅｗｓｏｎ ＪＪ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１６９（１９９４）６１４−６１７）。さらにパイエル板の下には腸管膜リンパ節が発達し、パイエル板を越える多くのリンパ球、樹状細胞、マクロファージが待機している。このように、パイエル板や腸管膜リンパ節は、腸管免疫系（上記のような腸管に存在する免疫系）において中心的な役割を果たすことが知られている。
一方、ＴＬＲ４抗体、ＩＲＡＫ抗体を用いて、サルの腸管上皮からのＦＩＴＣ標識したＴＬＲ４のリガンドとして知られるＬＰＳ（リポポリサッカライド）の取り込みと腸管粘膜上皮細胞との関係について解析した結果、ＬＰＳが腸管上皮細胞中のＴＬＲ４とＩＲＡＫを発現する細胞により取り込まれ、粘膜固有層にまで運ばれる様子が観察された（Ｉｍａｅｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１１８（２００２）３８１−３８８）。以上を考慮すると、ＴＬＲ９等の腸管組織において発現しているＴＬＲは、腸管免疫系に関与していると考えられる。
本発明は、以上の知見に基づき、被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法を提供する。該評価方法としては、まず、腸管組織において発現しているＴＬＲを強制発現させた細胞（ＴＬＲトランスフェクタント）に、被験試料を接触させる。この工程により、被験試料を、トランスフェクタント表面のＴＬＲに接触させる。次いで、該ＴＬＲトランスフェクタントにおけるシグナル伝達を指標に、該ＴＬＲの活性を測定する。該評価方法においては、該ＴＬＲの活性が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される。
本発明において、被験試料としては、例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、非哺乳動物細胞培養上清、非哺乳動物細胞抽出物、発酵微生物産生物、微生物培養上清、微生物抽出物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記ＤＮＡ断片としては、由来する生物に制限はないが、ＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有するＤＮＡ断片が好ましい。また、上記微生物抽出物としては、例えば、細胞壁、細胞膜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、鞭毛等が挙げられる。また、該微生物としては、細菌、酵母等を例示できる。また、該細菌としては、病原性細菌、乳酸菌等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
また、本発明における腸管としては、十二指腸、空腸、回腸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明における腸管組織としては、特に制限はないが、好ましくは腸管リンパ系組織、より好ましくはパイエル板または腸管リンパ節、さらに好ましくは回腸由来パイエル板または回腸由来腸管リンパ節が挙げられる。
また、腸管組織において発現しているＴＬＲには、全てのタイプのＴＬＲが包含され、例えばＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０が挙げられる。現在までに１０種類のＴＬＲの存在が報告されており、ＴＬＲファミリーはそれぞれ認識分子すなわち細菌性モデュリンが異なると考えられている。細菌性モデュリンとは、細菌に特異的な分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＰＡＭＰｓ）で、宿主に対しサイトカイン誘導能を示し、免疫応答を制御するものと定義されている。また、ＴＬＲは、細胞外にロイシンリッチリピート（ＬＲＲｓ）、細胞内にインターロイキン１受容体と相同性のある領域（ＴＩＲドメイン）を持つことが知られている。また、腸管組織において発現しているＴＬＲが由来する生物としては、ブタ、ヒト、マウス、ネコ等、無脊椎、脊椎動物全般あるいは生物一般が挙げられる。
本発明におけるＴＬＲ９としては、例えば、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、胸腺、肺臓、脾臓、十二指腸、パイエル板および腸管膜リンパ節よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、配列番号：１、３、５または７に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、上記タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製できる。
また、本発明におけるＴＬＲ９には、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。このようなタンパク質には、例えば、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の生物学的機能（生物学的役割）、生化学的機能（生化学的活性）を有することを指す。
ＴＬＲは菌体成分を認識すると細胞内シグナル伝達系路を活性化し、共通のアダプター分子ＭｙＤ８８を介してＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＩＲＡＫ）、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ６（ＴＲＡＦ６）、そして転写因子であるＮＦ−κＢの核移行を促し、最終的にｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α（ＴＮＦ−α）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γなどといった様々な炎症性サイトカインの産生や、細胞表面共刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を誘導する（Ｋａｉｓｈｏ Ｔ．ａｎｄ Ａｋｉｒａ Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２２（２００１）７８−８３）。ＴＬＲは主に病原体の糖質、脂質や核酸を認識することから、タンパクを認識する獲得免疫と相補的であるといえる。
すなわち、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的機能、生化学的機能としては、微生物成分認識能、細胞内シグナル伝達系路の活性化能、炎症性サイトカイン発現誘導能、細胞表面共刺激因子発現誘導能などが挙げられる。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製する方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、配列番号：１、３、５または７に記載の塩基配列もしくはその一部を利用して、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離することができる。
配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると考えられる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度等複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号：１、３、５または７に記載の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質とアミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも６０％以上の同一性、好ましくは７０％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるタンパク質も本発明に含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは２アミノ酸以内である。
本発明の方法においては、上記ＴＬＲトランスフェクタントが使用される。該ＴＬＲトランスフェクタントは、腸管組織において発現しているＴＬＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入することで製造することができる。該発現ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（インビトロゲン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路が欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ遺伝子）を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩ等）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤ等）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子等を含むことができる。
また、宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞、昆虫類細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳類細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、昆虫類細胞としては、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。
ＣＨＯ細胞としては、特に、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。また、宿主細胞としては、不死化した細胞株が好ましい。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＦデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ロッシュダイアグノスティックス社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクション等当業者に周知の方法で行うことが可能である。
本発明においては、上記トランスフェクタントにおけるシグナル伝達を指標に、ＴＬＲの活性を測定する。ＴＬＲの活性は、例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等）の発現、シグナル伝達経路における分子（例えばＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等）の活性化等を指標に測定できる。サイトカインの発現は、ｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも行うことが可能である。例えば、サイトカインのタンパク質レベルでの発現は、ヒトＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＴＮＦ−α，ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（株式会社テイエフビー（ＴＦＢ，ＩＮＣ．））等の既存のヒト用キットを使用することで測定できる。また、シグナル伝達経路における分子の活性上昇は、ルシフェラーゼアッセイで行うことが可能である。例えば、ブタＴＬＲトランスフェクタントにＮＦ−κＢおよびルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクター（ｐＧＬＭ−ＥＮＨ）をトランスフェクションし、１８時間後にリガンド（ＤＮＡ等）で刺激する。刺激２４時間後に細胞を溶解後、細胞溶解液を回収し測定まで−８０℃で保存する。ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液にルシフェリンを含む反応液を添加後、２秒後から８秒間にわたる発光の変化を測定する。各試料で３回同様の操作を行い、その平均をとる。以上の測定で発光が強い程、ＮＦ−κＢの活性が強いことを示す。
本発明はまた、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法を提供する。本発明におけるスクリーニング方法としては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価し、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する。
また、腸管組織において発現しているＴＬＲに結合する試料を予めスクリーニングし、これにより得られた試料を被験試料として用いてもよい。腸管組織において発現しているＴＬＲに結合する試料のスクリーニングに用いられるＴＬＲは、組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また、スクリーニングに用いられるＴＬＲは部分ペプチドであってもよい。腸管組織において発現しているＴＬＲに結合する試料のスクリーニング方法としては、まず、複数の被験試料を腸管組織において発現しているＴＬＲに接触させる。次いで、該ＴＬＲと被験試料との結合を検出する。次いで、該ＴＬＲと結合する被験試料を選択する。ＴＬＲと被験試料との結合は、当業者に周知の方法で検出できる。
上記評価方法またはスクリーニング方法によって得られた試料は、免疫賦活化機能を有する試料として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
さらに、本発明においては、腸管免疫系を活性化する医薬組成物の製造方法を提供する。本発明の医薬組成物は、免疫賦活化機能を有する医薬組成物として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。また、本発明の医薬組成物は、好ましくはワクチンとして使用される。
本発明の医薬組成物の製造方法においては、上記スクリーニング方法によって腸管免疫系を活性化すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する。医薬上許容される担体としては、例えばアジュバント（抗体産生増強剤）が挙げられる。また、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等も医薬上許容される担体として挙げられるが、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。このようにして製造された腸管免疫系を活性化する医薬組成物は、経口剤または注射剤として使用できる。
また、本発明は、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法も提供する。本発明における微生物としては、細菌、酵母等が例示できるが、これらに限定されるものではない。また、細菌としては、特に制限はないが、乳酸菌（例えば腸管常在乳酸菌や乳業用乳酸菌）が挙げられる。
該評価方法においては、まず、被験微生物から抽出物を調製する。微生物抽出物としては、例えば、細胞壁、細胞膜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、鞭毛等が挙げられる。また、該ＤＮＡとしては、ＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有する断片が好適である。このような抽出物は、当業者に周知の方法によって微生物から調製できる。
以下に、乳業用乳酸菌からＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有する断片の調整方法を例示するが、本発明の方法はこれに限定されない。
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）で、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉはＥｌｌｉｋｅｒ ｂｒｏｔｈでそれぞれ３回継代培養（３７℃，２４時間）後、５０ｍｌの培地に１％接種し、３７℃で１６時間培養する。菌体を遠心（３，０００ｘｇ，４℃，２０分間）集菌し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で２回遠心（４，０００ｘｇ，４℃，２０分間）洗浄後、５．０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁する。この菌液に、２．５ｍｌのリゾチーム（生化学工業、東京、３０ｍｇ／ｍｌ）、２０μｌのＮ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業、東京、２５０μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１０〜３０分間反応する。反応後、１０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−１％ ＳＤＳ溶液を添加し、穏やかに撹拌する。これにプロテイナーゼＫ（ＴａＫａＲａ，京都 ２０ｍｇ／ｍｌ，１５０μｌ）溶液を加え、３７℃で一晩反応させる。反応後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液（２．５ｍｌ）を加え撹拌し、滅菌したビーカーに移す。１００％エタノール（５０ｍｌ）を加えることにより核酸を沈殿させ、生じた沈殿を滅菌したガラス棒を用いて巻き取り、７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ緩衝液（１０ｍｌ）に溶解し、一晩４℃下で完全に溶解させる。ＲＮａｓｅＡ（ＳＩＧＭＡ，１０ｍｇ／ｍｌ，１００μｌ）を加え、３７℃で６０分間インキュベートした後、１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌ（１ｍｌ）及び等量の１００％エタノールを加え、核酸を沈殿させる。生じた沈殿を滅菌したガラス棒を用いて巻き取り、７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ緩衝液（２ｍｌ）に溶解する。以上の操作でＤＮＡが精製され、使用までの間４℃下で保存する。染色体ＤＮＡはＳａｕ ３ＡＩ（制限酵素）により切断処理し、３％アガロースゲル電気泳動に供する。アガロースゲルよりＤＮＡを回収し、プラスミドベクターにライゲーション後、クローニングしＤＮＡ配列をシークエンサーにて決定し、ＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有する断片を調製する。
該評価方法においては、次いで、該抽出物をＴＬＲトランスフェクタントに接触させる。次いで、該形質転換細胞におけるシグナル伝達を指標に、腸管組織において発現しているＴＬＲの活性を測定する。該評価方法においては、該ＴＬＲの活性が、該抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される。
また、本発明は、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法も提供する。該スクリーニング方法としては、上記評価方法を利用して、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価し、腸管免疫系を活性化すると評価された微生物を選択する。
上記評価方法またはスクリーニング方法によって得られた微生物は、免疫賦活化機能を有する微生物として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
腸管免疫系を活性化する微生物を使用することで、腸管免疫系を活性化する食品組成物を製造できる。本発明は、このような腸管免疫系を活性化する食品組成物の製造方法もまた提供する。本発明の食品組成物の製造方法においては、上記スクリーニング方法によって腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物と食品上許容される担体とを混合する。食品上許容される担体としては、例えば安定化剤、保存剤、着色料、香料等が挙げられる。
本発明の食品組成物の好ましい態様としては、乳酸菌や酵母を含む食品、ドリンク等が挙げられる。乳酸菌や酵母を含む食品、ドリンクとしては、例えば乳製品が挙げられる。本発明の乳製品としては、発酵乳、チーズ、発酵食品（乳酸菌を含む食品、キムチ等）が挙げられる。これらは、当業者に周知の方法で製造できる。
このようにして製造された食品組成物は、免疫賦活化機能を有する食品組成物（例えば機能性食品、健康食品、特定保健用食品等）として、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
本発明者らは、ＴＬＲと腸管免疫との関連を初めて見出した。また、ＴＬＲは、自然免疫を担当する細胞（例えばマクロファージや樹状細胞等）に発現していることが知られている（Ｇｏｒｄｏｎ Ｓ．Ｃｅｌｌ．１１１（２００２）９２７−９３０、Ａｋｉｒａ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２（２００１）６７５−６８０）。よって、本発明のＴＬＲトランスフェクタントは、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として、例えば上記本発明の方法に使用できる。また、該ＴＬＲトランスフェクタントは、本発明の方法に用いる他の成分とともに、本発明の方法用のキットとして利用することもできる。
本発明は、上記本発明の方法に利用できるＴＬＲトランスフェクタント、該ＴＬＲトランスフェクタントを腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法、該腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法、および該製造方法によって製造されるモデル細胞もまた提供するものである。
機能性食品の開発を考える場合、最終的にヒトに対する効果を評価する必要があるが、その基礎的知見を得るためには、動物細胞および実験動物を用いた検討が必要不可欠となる。そこで本発明では、実験対象動物として、臓器移植等の観点からヒトモデル系としてその利用性が期待され、また食品産業の面から大きな価値を持つブタに着目し、ブタのＴＬＲ９遺伝子のクローニングと、その遺伝子を導入し強制発現させた動物細胞を作製し、機能性ＤＮＡ評価系のためのＴＬＲ９強制発現細胞を構築することを考えた。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＴＬＲ強制発現細胞の利用法を提供することを目的とする。
本発明者らは、病原細菌由来のＣｐＧ ＤＮＡモチーフを認識する受容体タンパクＴｏｌｌ様レセプター９遺伝子をブタ腸管パイエル板よりクローニングし、ブタＴＬＲ９（ｓＴＬＲ９）を強制発現させた動物細胞（トランスフェクタント）を作製した。動物細胞におけるｓＴＬＲ９タンパクの発現の有無は、ｓＴＬＲ９に対するポリクローナル抗体を作成し、同抗体を用いて確認した。さらに、ｓＴＬＲ９トランスフェクタントのＣｐＧ ＤＮＡに対する機能性を解析し、乳酸菌ＤＮＡの活性評価系への応用を目指した。
具体的には、下記（１）〜（５）を行った。
（１）ブタ腸管パイエル板よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ヒトおよびマウスＴＬＲ９遺伝子における保存性の高い領域より作製したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法によりブタＴＬＲ９遺伝子をクローニングし、その全遺伝子配列を決定した。
（２）遺伝子情報から得られたブタＴＬＲ９全アミノ酸配列から抗原決定基部位を探索し、選抜した領域をペプチド合成しブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体作製用抗原とした。抗原は化学合成後、定法によりウサギに免疫し、ブタＴＬＲ９に対するポリクローナル抗体を作成した。
（３）ブタＴＬＲ９遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞）に導入し、ブタＴＬＲ９遺伝子導入細胞（トランスフェクタント）を作製した。
（４）ブタＴＬＲ９のＨＥＫ２９３Ｔにおける発現については、ブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法により、また、ブタＴＬＲ９膜タンパクの発現をブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体による免疫染色法によりレーザー顕微鏡およびフローサイトメーターを用いて確認した。
（５）ヒトおよびマウス細胞を強く刺激する特異的ＣｐＧ ＤＮＡモチーフを含むオリゴＤＮＡ（それぞれＣｐＧ２００６，ＣｐＧ１８２６）に対する反応性を解析した。
検討の結果、ブタＴＬＲ９遺伝子は１０２９残基（ＭＷ：１１５．８）のアミノ酸をコードする３０９０塩基からなり、その遺伝子を含め３１４５塩基のｃＤＮＡ塩基配列を決定することができた。ブタＴＬＲ９のアミノ酸配列はヒトＴＬＲ９に対して８２．９％と非常に高く、マウスＴＬＲ９には７４．９％の相同性を示したことから、ヒトＴＬＲ９に対してマウスよりも比較的高い相同性を示すことが明らかとなった。ブタＴＬＲ９トランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９タンパク質はＲＴ−ＰＣＲ法およびブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体の免疫染色から確実に発現し、膜タンパク質として発現したことを確認できた。このことは、ブタＴＬＲ９トランスフェクタントの作製に成功したことを意味する。本トランスフェクタントを用いたＣｐＧ ＤＮＡに対する機能性解析よりブタＴＬＲ９はＣｐＧ１８２６よりもＣｐＧ２００６に対して強い反応性を示したことから、ブタＴＬＲ９はマウス特異的ＣｐＧ ＤＮＡモチーフよりも比較的ヒトのモチーフに対する認識性が高いことが判明した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現量を各種組織において比較した結果、驚くべきことに、腸管免疫系で中心的な役割を果たすパイエル板および腸管膜リンパ節において、脾臓の３倍以上のｍＲＮＡが発現していることが判明した。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２１〕を提供するものである。
〔１〕被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法であって、
（ａ）腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞に、被験試料を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、上記被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される方法。
〔２〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法。
（ａ）〔１〕に記載の評価方法により、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する工程
〔３〕〔２〕に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する医薬組成物の製造方法。
〔４〕被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験微生物から抽出物を調製する工程
（ｂ）腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞に、該抽出物を接触させる工程
（ｃ）該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、上記抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される方法。
〔５〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法。
（ａ）〔４〕に記載の評価方法により、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験微生物から、腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物を選択する工程
〔６〕〔５〕に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物と食品上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する食品組成物の製造方法。
〔７〕微生物が乳酸菌であり、食品組成物が乳製品である、〔６〕に記載の方法。
〔８〕微生物が細菌である、〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕細菌が乳酸菌である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入する工程を含む、腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法。
〔１１〕腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞を、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法。
〔１２〕腸管組織が腸管リンパ系組織である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕Ｔｏｌｌ様レセプターがブタ由来である、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕Ｔｏｌｌ様レセプターがＴｏｌｌ様レセプター９である、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法に用いるための、腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞。
〔１７〕腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入することで製造される、腸管免疫担当細胞のモデル細胞。
〔１８〕腸管組織が腸管リンパ系組織である、〔１６〕または〔１７〕に記載の細胞。
〔１９〕腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、〔１８〕に記載の細胞。
〔２０〕Ｔｏｌｌ様レセプターがブタ由来である、〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の細胞。
〔２１〕Ｔｏｌｌ様レセプターがＴｏｌｌ様レセプター９である、〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の細胞。
免疫活性化に関与するＴｏｌｌ様レセプター９（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９；ＴＬＲ９）は、脾臓において強く発現していることが知られていた（Ｚａｒｅｍｂｅｒ ＫＡ．ａｎｄ Ｇｏｄｏｗｓｋｉ ＰＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６８（２００２）５５４−５６１）。これに対し、本発明者らは、ＴＬＲ９が腸管リンパ系組織、特にパイエル板や腸管膜リンパ節において強く発現していることを初めて見出した。
腸管は体内と体外の境界組織として、経口摂取された栄養成分の吸収のみならず、外界からの刺激（細菌やウイルスなどの微生物、薬剤や食品添加物、食物に付着した農薬や環境汚染物質など）に常に接触しており、これら異物の受容、伝達、応答、および排除など種々の第一線生体防御機構（ｆｉｒｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｌｉｎｅ）が存在している（Ｍａｎｔｉｓ ＮＪ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（２００２）１８４４−１８５１）。さらに防御機構として特有のリンパ組織、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ；ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）が存在し、ＧＡＬＴは非集合性組成と集合性組成から構成され、非集合性組成には腸管上皮間リンパ球と粘膜固有層リンパ球が含まれ、集合性組成にはパイエル板、リンパ濾胞および腸管膜リンパ節が含まれる（Ｓｐａｈｎ ＴＷ．ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（２００２）：１１０９−１１１３）。パイエル板はリンパ組織関連上皮（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＦＡＥ）に覆われ、腸管絨毛の存在しない部位でドーム形態をなしている。また、胚中心を持ちＢ細胞の存在する濾胞域（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｒｅａ）と、ヘルパーＴ細胞を含む傍濾胞域（ｐａｒａｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｒｅａ）を備えている（Ｏｗｅｎ ＲＬ．Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１９９９）１５７−１６３）。腸管の局所免疫機構の最初の役割を果たす細胞として、ＦＡＥには特殊な上皮細胞であるＭｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（Ｍ ｃｅｌｌｓ；Ｍ細胞）が散在し、細胞質を通って基底表層へとつながる抗原のトンネルとしてリンパ球や樹状細胞、マクロファージなど抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）との接触のためＭ細胞膜は深く陥入している。気管上皮粘膜においてもＭ細胞の存在は確認されており、結核菌などの病原体の入り口として貢献していることが報告されている（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１０（１９９９）６４１−６５０）。また、食品中に含まれる機能性因子のみならず微生物や食物抗原の入り口としても存在することが認められている。腸管内の抗原（特に高分子）はＭ細胞に取り込まれた後、パイエル板の内部へと運ばれ、パイエル板内部の樹状細胞、マクロファージなどのＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩＩ陽性の抗原提示細胞に接触する（Ｋａｎｅｋｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６１（１９９９）１１７５−１１７７、Ｇｅｂｅｒｔ Ａ．ｅｔ ａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１５４（１９９９）１５７３−１５８２、Ｊｅｎｓｅｎ ＶＢ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．６６（１９９８）３７５８−３７６６、Ｐｅｎｈｅｉｔｅｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４（１９９７）６９７−７０９、Ｄｅｂａｒｄ Ｎ．ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２０（２００１）１１７３−１１８２、Ｇｅｂｅｒｔ Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．１６７（１９９６）９１−１５９）。抗原刺激を受けたヘルパーＴ細胞はＦｃレセプターや抗体結合因子（ＩＢＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６を産生し、抗原提示を受け活性化したＴ細胞およびＢ細胞は循環帰巣（ｈｏｍｉｎｇ）という現象を開始し、腸管膜リンパ節を経て、胸腺に入り、体内循環して実行組織である腸管粘膜固有層、乳腺、涙腺、唾液腺、泌尿生殖器などに送られ、さらにＢ細胞は形質細胞となってＩｇＡを産生する。分泌型ＩｇＡは、腸管およびその他の粘膜組織に侵入したウイルス、細菌、細菌毒素、アレルゲンなどを排除する役割を果たしている（Ｖａｅｒｍａｎ ＪＰ．ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５４（１９８５）６０１−６０３、Ｍａｃｈｔｉｎｇｅｒ Ｓ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ Ｒ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７７（１９８６）３４１−３４７、Ｍａｔｈｅｗｓｏｎ ＪＪ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１６９（１９９４）６１４−６１７）。さらにパイエル板の下には腸管膜リンパ節が発達し、パイエル板を越える多くのリンパ球、樹状細胞、マクロファージが待機している。このように、パイエル板や腸管膜リンパ節は、腸管免疫系（上記のような腸管に存在する免疫系）において中心的な役割を果たすことが知られている。
一方、ＴＬＲ４抗体、ＩＲＡＫ抗体を用いて、サルの腸管上皮からのＦＩＴＣ標識したＴＬＲ４のリガンドとして知られるＬＰＳ（リポポリサッカライド）の取り込みと腸管粘膜上皮細胞との関係について解析した結果、ＬＰＳが腸管上皮細胞中のＴＬＲ４とＩＲＡＫを発現する細胞により取り込まれ、粘膜固有層にまで運ばれる様子が観察された（Ｉｍａｅｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１１８（２００２）３８１−３８８）。以上を考慮すると、ＴＬＲ９等の腸管組織において発現しているＴＬＲは、腸管免疫系に関与していると考えられる。
本発明は、以上の知見に基づき、被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法を提供する。該評価方法としては、まず、腸管組織において発現しているＴＬＲを強制発現させた細胞（ＴＬＲトランスフェクタント）に、被験試料を接触させる。この工程により、被験試料を、トランスフェクタント表面のＴＬＲに接触させる。次いで、該ＴＬＲトランスフェクタントにおけるシグナル伝達を指標に、該ＴＬＲの活性を測定する。該評価方法においては、該ＴＬＲの活性が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される。
本発明において、被験試料としては、例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、非哺乳動物細胞培養上清、非哺乳動物細胞抽出物、発酵微生物産生物、微生物培養上清、微生物抽出物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。上記ＤＮＡ断片としては、由来する生物に制限はないが、ＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有するＤＮＡ断片が好ましい。また、上記微生物抽出物としては、例えば、細胞壁、細胞膜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、鞭毛等が挙げられる。また、該微生物としては、細菌、酵母等を例示できる。また、該細菌としては、病原性細菌、乳酸菌等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
また、本発明における腸管としては、十二指腸、空腸、回腸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明における腸管組織としては、特に制限はないが、好ましくは腸管リンパ系組織、より好ましくはパイエル板または腸管リンパ節、さらに好ましくは回腸由来パイエル板または回腸由来腸管リンパ節が挙げられる。
また、腸管組織において発現しているＴＬＲには、全てのタイプのＴＬＲが包含され、例えばＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０が挙げられる。現在までに１０種類のＴＬＲの存在が報告されており、ＴＬＲファミリーはそれぞれ認識分子すなわち細菌性モデュリンが異なると考えられている。細菌性モデュリンとは、細菌に特異的な分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＰＡＭＰｓ）で、宿主に対しサイトカイン誘導能を示し、免疫応答を制御するものと定義されている。また、ＴＬＲは、細胞外にロイシンリッチリピート（ＬＲＲｓ）、細胞内にインターロイキン１受容体と相同性のある領域（ＴＩＲドメイン）を持つことが知られている。また、腸管組織において発現しているＴＬＲが由来する生物としては、ブタ、ヒト、マウス、ネコ等、無脊椎、脊椎動物全般あるいは生物一般が挙げられる。
本発明におけるＴＬＲ９としては、例えば、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、胸腺、肺臓、脾臓、十二指腸、パイエル板および腸管膜リンパ節よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、配列番号：１、３、５または７に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、上記タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製できる。
また、本発明におけるＴＬＲ９には、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。このようなタンパク質には、例えば、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の生物学的機能（生物学的役割）、生化学的機能（生化学的活性）を有することを指す。
ＴＬＲは菌体成分を認識すると細胞内シグナル伝達系路を活性化し、共通のアダプター分子ＭｙＤ８８を介してＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＩＲＡＫ）、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ６（ＴＲＡＦ６）、そして転写因子であるＮＦ−κＢの核移行を促し、最終的にｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α（ＴＮＦ−α）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γなどといった様々な炎症性サイトカインの産生や、細胞表面共刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を誘導する（Ｋａｉｓｈｏ Ｔ．ａｎｄ Ａｋｉｒａ Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２２（２００１）７８−８３）。ＴＬＲは主に病原体の糖質、脂質や核酸を認識することから、タンパクを認識する獲得免疫と相補的であるといえる。
すなわち、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的機能、生化学的機能としては、微生物成分認識能、細胞内シグナル伝達系路の活性化能、炎症性サイトカイン発現誘導能、細胞表面共刺激因子発現誘導能などが挙げられる。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製する方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、配列番号：１、３、５または７に記載の塩基配列もしくはその一部を利用して、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離することができる。
配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると考えられる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度等複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号：１、３、５または７に記載の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質とアミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも６０％以上の同一性、好ましくは７０％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を指す。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、配列番号：２、４、６または８に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるタンパク質も本発明に含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは２アミノ酸以内である。
本発明の方法においては、上記ＴＬＲトランスフェクタントが使用される。該ＴＬＲトランスフェクタントは、腸管組織において発現しているＴＬＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを細胞に導入することで製造することができる。該発現ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（インビトロゲン社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路が欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ遺伝子）を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩ等）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤ等）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子等を含むことができる。
また、宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞、昆虫類細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳類細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、昆虫類細胞としては、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。
ＣＨＯ細胞としては、特に、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。また、宿主細胞としては、不死化した細胞株が好ましい。
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＦデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ロッシュダイアグノスティックス社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクション等当業者に周知の方法で行うことが可能である。
本発明においては、上記トランスフェクタントにおけるシグナル伝達を指標に、ＴＬＲの活性を測定する。ＴＬＲの活性は、例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等）の発現、シグナル伝達経路における分子（例えばＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等）の活性化等を指標に測定できる。サイトカインの発現は、ｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも行うことが可能である。例えば、サイトカインのタンパク質レベルでの発現は、ヒトＩＬ−６，ＩＬ−１２，ＴＮＦ−α，ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（株式会社テイエフビー（ＴＦＢ，ＩＮＣ．））等の既存のヒト用キットを使用することで測定できる。また、シグナル伝達経路における分子の活性上昇は、ルシフェラーゼアッセイで行うことが可能である。例えば、ブタＴＬＲトランスフェクタントにＮＦ−κＢおよびルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクター（ｐＧＬＭ−ＥＮＨ）をトランスフェクションし、１８時間後にリガンド（ＤＮＡ等）で刺激する。刺激２４時間後に細胞を溶解後、細胞溶解液を回収し測定まで−８０℃で保存する。ルシフェラーゼ活性は、細胞溶解液にルシフェリンを含む反応液を添加後、２秒後から８秒間にわたる発光の変化を測定する。各試料で３回同様の操作を行い、その平均をとる。以上の測定で発光が強い程、ＮＦ−κＢの活性が強いことを示す。
本発明はまた、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法を提供する。本発明におけるスクリーニング方法としては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価し、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する。
また、腸管組織において発現しているＴＬＲに結合する試料を予めスクリーニングし、これにより得られた試料を被験試料として用いてもよい。腸管組織において発現しているＴＬＲに結合する試料のスクリーニングに用いられるＴＬＲは、組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また、スクリーニングに用いられるＴＬＲは部分ペプチドであってもよい。腸管組織において発現しているＴＬＲに結合する試料のスクリーニング方法としては、まず、複数の被験試料を腸管組織において発現しているＴＬＲに接触させる。次いで、該ＴＬＲと被験試料との結合を検出する。次いで、該ＴＬＲと結合する被験試料を選択する。ＴＬＲと被験試料との結合は、当業者に周知の方法で検出できる。
上記評価方法またはスクリーニング方法によって得られた試料は、免疫賦活化機能を有する試料として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
さらに、本発明においては、腸管免疫系を活性化する医薬組成物の製造方法を提供する。本発明の医薬組成物は、免疫賦活化機能を有する医薬組成物として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。また、本発明の医薬組成物は、好ましくはワクチンとして使用される。
本発明の医薬組成物の製造方法においては、上記スクリーニング方法によって腸管免疫系を活性化すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する。医薬上許容される担体としては、例えばアジュバント（抗体産生増強剤）が挙げられる。また、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等も医薬上許容される担体として挙げられるが、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。このようにして製造された腸管免疫系を活性化する医薬組成物は、経口剤または注射剤として使用できる。
また、本発明は、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法も提供する。本発明における微生物としては、細菌、酵母等が例示できるが、これらに限定されるものではない。また、細菌としては、特に制限はないが、乳酸菌（例えば腸管常在乳酸菌や乳業用乳酸菌）が挙げられる。
該評価方法においては、まず、被験微生物から抽出物を調製する。微生物抽出物としては、例えば、細胞壁、細胞膜、ＤＮＡ、ＲＮＡ、鞭毛等が挙げられる。また、該ＤＮＡとしては、ＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有する断片が好適である。このような抽出物は、当業者に周知の方法によって微生物から調製できる。
以下に、乳業用乳酸菌からＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有する断片の調整方法を例示するが、本発明の方法はこれに限定されない。
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）で、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉはＥｌｌｉｋｅｒ ｂｒｏｔｈでそれぞれ３回継代培養（３７℃，２４時間）後、５０ｍｌの培地に１％接種し、３７℃で１６時間培養する。菌体を遠心（３，０００ｘｇ，４℃，２０分間）集菌し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で２回遠心（４，０００ｘｇ，４℃，２０分間）洗浄後、５．０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁する。この菌液に、２．５ｍｌのリゾチーム（生化学工業、東京、３０ｍｇ／ｍｌ）、２０μｌのＮ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業、東京、２５０μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１０〜３０分間反応する。反応後、１０ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−１％ ＳＤＳ溶液を添加し、穏やかに撹拌する。これにプロテイナーゼＫ（ＴａＫａＲａ，京都 ２０ｍｇ／ｍｌ，１５０μｌ）溶液を加え、３７℃で一晩反応させる。反応後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液（２．５ｍｌ）を加え撹拌し、滅菌したビーカーに移す。１００％エタノール（５０ｍｌ）を加えることにより核酸を沈殿させ、生じた沈殿を滅菌したガラス棒を用いて巻き取り、７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ緩衝液（１０ｍｌ）に溶解し、一晩４℃下で完全に溶解させる。ＲＮａｓｅＡ（ＳＩＧＭＡ，１０ｍｇ／ｍｌ，１００μｌ）を加え、３７℃で６０分間インキュベートした後、１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌ（１ｍｌ）及び等量の１００％エタノールを加え、核酸を沈殿させる。生じた沈殿を滅菌したガラス棒を用いて巻き取り、７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ緩衝液（２ｍｌ）に溶解する。以上の操作でＤＮＡが精製され、使用までの間４℃下で保存する。染色体ＤＮＡはＳａｕ ３ＡＩ（制限酵素）により切断処理し、３％アガロースゲル電気泳動に供する。アガロースゲルよりＤＮＡを回収し、プラスミドベクターにライゲーション後、クローニングしＤＮＡ配列をシークエンサーにて決定し、ＣｐＧモチーフ、ＡＴモチーフまたはＣｐＧ様モチーフを有する断片を調製する。
該評価方法においては、次いで、該抽出物をＴＬＲトランスフェクタントに接触させる。次いで、該形質転換細胞におけるシグナル伝達を指標に、腸管組織において発現しているＴＬＲの活性を測定する。該評価方法においては、該ＴＬＲの活性が、該抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される。
また、本発明は、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法も提供する。該スクリーニング方法としては、上記評価方法を利用して、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価し、腸管免疫系を活性化すると評価された微生物を選択する。
上記評価方法またはスクリーニング方法によって得られた微生物は、免疫賦活化機能を有する微生物として、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
腸管免疫系を活性化する微生物を使用することで、腸管免疫系を活性化する食品組成物を製造できる。本発明は、このような腸管免疫系を活性化する食品組成物の製造方法もまた提供する。本発明の食品組成物の製造方法においては、上記スクリーニング方法によって腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物と食品上許容される担体とを混合する。食品上許容される担体としては、例えば安定化剤、保存剤、着色料、香料等が挙げられる。
本発明の食品組成物の好ましい態様としては、乳酸菌や酵母を含む食品、ドリンク等が挙げられる。乳酸菌や酵母を含む食品、ドリンクとしては、例えば乳製品が挙げられる。本発明の乳製品としては、発酵乳、チーズ、発酵食品（乳酸菌を含む食品、キムチ等）が挙げられる。これらは、当業者に周知の方法で製造できる。
このようにして製造された食品組成物は、免疫賦活化機能を有する食品組成物（例えば機能性食品、健康食品、特定保健用食品等）として、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
本発明者らは、ＴＬＲと腸管免疫との関連を初めて見出した。また、ＴＬＲは、自然免疫を担当する細胞（例えばマクロファージや樹状細胞等）に発現していることが知られている（Ｇｏｒｄｏｎ Ｓ．Ｃｅｌｌ．１１１（２００２）９２７−９３０、Ａｋｉｒａ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２（２００１）６７５−６８０）。よって、本発明のＴＬＲトランスフェクタントは、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として、例えば上記本発明の方法に使用できる。また、該ＴＬＲトランスフェクタントは、本発明の方法に用いる他の成分とともに、本発明の方法用のキットとして利用することもできる。
本発明は、上記本発明の方法に利用できるＴＬＲトランスフェクタント、該ＴＬＲトランスフェクタントを腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法、該腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法、および該製造方法によって製造されるモデル細胞もまた提供するものである。
図１は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。下線はシグナルペプチド領域を示す図である。
図２は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。図１の続きを示す。
図３は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。図２の続きを示す。
図４は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。図３の続きを示す。下線は膜貫通領域を示す図である。
図５は、ブタＴＬＲ９のＳＭＡＲＴによるドメイン解析を示す図である。
図６は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
図７は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図６の続きを示す図である。
図８は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図７の続きを示す図である。
図９は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図９の続きを示す図である。
図１０は、トランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９のＲＴ−ＰＣＲ法による発現解析を示す写真である。
図１１は、トランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９の発現とＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析を示す図である。ａ；抗ＦＬＡＧ抗体による解析を示す。ｂ；抗ブタＴＬＲ９抗体による解析を示す。ｃ；ＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析を示す。図中の矢印（１）はコントロール細胞のＣｐＧ１８２６および２００６の取り込みを示し、矢印（２）はトランスフェクタントにおけるＣｐＧ１８２６を示し、矢印（３）はトランスフェクタントにおけるＣｐＧ２００６を示す。
図１２は、トランスフェクタントの共焦点レーザー顕微鏡による解析を示す写真である。ａ，ｂ，ｃ；対照細胞、ｄ，ｅ，ｆ；ブタＴＬＲ９トランスフェクタントを示す。ａ，ｄ；抗ＦＬＡＧ抗体による解析を示す。ｂ，ｅ；抗ブタＴＬＲ９抗体による解析を示す。ｃ，ｆ；ＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析を示す。
図１３は、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ定量ＰＣＲによるブタＴＬＲ９の各種組織における発現解析を示す図である。
図２は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。図１の続きを示す。
図３は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。図２の続きを示す。
図４は、ブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列を示す図である。図３の続きを示す。下線は膜貫通領域を示す図である。
図５は、ブタＴＬＲ９のＳＭＡＲＴによるドメイン解析を示す図である。
図６は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
図７は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図６の続きを示す図である。
図８は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図７の続きを示す図である。
図９は、ＴＬＲ９アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図９の続きを示す図である。
図１０は、トランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９のＲＴ−ＰＣＲ法による発現解析を示す写真である。
図１１は、トランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９の発現とＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析を示す図である。ａ；抗ＦＬＡＧ抗体による解析を示す。ｂ；抗ブタＴＬＲ９抗体による解析を示す。ｃ；ＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析を示す。図中の矢印（１）はコントロール細胞のＣｐＧ１８２６および２００６の取り込みを示し、矢印（２）はトランスフェクタントにおけるＣｐＧ１８２６を示し、矢印（３）はトランスフェクタントにおけるＣｐＧ２００６を示す。
図１２は、トランスフェクタントの共焦点レーザー顕微鏡による解析を示す写真である。ａ，ｂ，ｃ；対照細胞、ｄ，ｅ，ｆ；ブタＴＬＲ９トランスフェクタントを示す。ａ，ｄ；抗ＦＬＡＧ抗体による解析を示す。ｂ，ｅ；抗ブタＴＬＲ９抗体による解析を示す。ｃ，ｆ；ＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析を示す。
図１３は、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ定量ＰＣＲによるブタＴＬＲ９の各種組織における発現解析を示す図である。
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
１）ブタ組織
フナコシ株式会社より購入した。
２）ブタＴＬＲ９遺伝子のクローニングと塩基配列決定
ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにおいて公開されているヒトおよびマウスＴＬＲ９（それぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０４５１８０およびＡＦ３４８１４０）遺伝子配列をもとに保存性の高い領域を探索しプライマーを作製した。そのプライマーを用いてブタ腸管パイエル板由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりブタＴＬＲ９遺伝子断片を得た。得られた遺伝子断片はｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにライゲーションしＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルにトランスフォーメーションしサブクローニングした。ＤＮＡ配列はＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）により決定した。塩基配列、アミノ酸配列解析にはＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣ Ｖｅｒ．１１．０．３．１を用いた。残りのブタＴＬＲ９遺伝子配列はブタＴＬＲ９遺伝子断片から設計したプライマーを用いてＲＡＣＥ法により得た。全ＴＬＲ９遺伝子をＰＣＲ法により増幅しクローニングした。
３）ブタＴＬＲ９特異的ポリクローナル抗体の作製
ＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣ Ｖｅｒ．１１．０．３．１を用いた抗原決定基（エピトープ）解析とタンパク２次構造解析よりブタＴＬＲ９アミノ酸配列中より２６８から２８４番目の領域が高い抗原性を持つことを見出した。その領域のペプチド合成および合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体作製をサワディテクノロジー株式会社に依頼した。
４）ブタＴＬＲ９遺伝子を導入したトランスフェクタントの構築
ブタＴＬＲ９遺伝子を導入する宿主細胞としては、ヒトの細胞系で遺伝子導入のホスト細胞として広く利用されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞）を選択した。ヒトＴＬＲ９特異的プライマーを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＴＬＲ９遺伝子を発現していないことを解析し、シグナルペプチドを除くブタＴＬＲ９遺伝子をライゲーションしたｐＣＸＮ２．１−ＦＬＡＧ遺伝子発現ベクター（Ｈ．Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１０８（１９９１）１９３−１９９）（大阪大学大学院医学研究科宮崎純一氏より分譲）をリポフェクション法によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。抗生物質にはＧ４１８ネオマイシン（ＳＩＧＭＡ）を用い、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＥＰＩＣＳセルソーターシステムによりブタＴＬＲ９発現細胞をセレクションした。
５）ＲＴ−ＰＣＲ法によるトランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９発現解析
トランスフェクタントよりＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ブタＴＬＲ９特異的プライマー（本発明で設計）、ヒトＴＬＲ９特異的プライマーおよびポジティブコントロールとしてヒトＧＡＰＤＨプライマー（Ｋ．Ａ．Ｚａｒｅｍｂｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｇｏｄｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６８（２００２）５５４−５６１）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によるＴＬＲ９ ｍＲＮＡ遺伝子発現解析を行った。
６）フローサイトメトリー法および共焦点レーザー顕微鏡によるブタＴＬＲ９のトランスフェクタントにおける発現解析
細胞を１次抗体としてａｎｔｉ−ＦＬＡＧ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ）で４℃、１時間処理後、２次抗体としてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＰｅｒＣＰ標識抗体で４℃、３０分間染色した。核染色はＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅを４℃、１０分間処理で行った。解析にはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ（日本ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ株式会社）を用いた。ブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体による免疫染色は、上記のように１次抗体染色後、２次抗体として、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８標識抗体で４℃、３０分間染色し、核染後解析した。また、細胞をＩ型コラーゲンコートＤｉｓｋ（ＩＷＡＫＩ）に播き１次抗体としてａｎｔｉ−ＦＬＡＧ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧビオチン標識抗体（ＳＩＧＭＡ）で４℃、１時間処理後、２次抗体としてストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５抗体で４℃、３０分間染色した。核染色にはＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ ４℃、１０分間処理した。解析には共焦点レーザー顕微鏡（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いた。
７）トランスフェクタントを用いたＣｐＧ ＤＮＡ取り込みの解析
ＣｐＧ ＤＮＡは、既に報告のあるヒト免疫細胞を強く刺激する大腸菌ゲノムＤＮＡ由来ｃｐＧ２００６型（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号：９））とマウス免疫細胞を強く刺激するＣｐＧ１８２６型（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣ ＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：１０））（Ｓ．Ｐｉｃｈｙａｎｇｋｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４７（２００１）８３−９４）を用い、１Ｍの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、３７℃にて１時間反応後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭおよび共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析を行なった。
８）ブタ各種組織におけるＴＬＲ９のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法による発現解析
ブタ各種組織（心臓、胸腺、肺臓、脾臓、肝臓、腎臓、骨格筋、十二指腸、空腸、回腸、回腸由来パイエル板、回腸由来腸管膜リンパ節）よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからｏｌｉｇｏ−ｄ（Ｔ）１８プライマーを用いてｃＤＮＡを合成後精製した。ブタＴＬＲ９特異的プライマーおよび精製ｃＤＮＡからＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲに供した。リアクションキットとしてＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ−Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。検量線から求めたブタＴＬＲ９遺伝子量とハウスキーピング遺伝子であるβアクチン遺伝子量との比から、ブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡ量を算出した。結果は、脾臓中のＴＬＲ９発現量を１．０００とした場合の各種組織に含まれるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡ量を数値化し比較した。
本発明で用いたプライマーの塩基配列情報を表１にまとめた。
［実施例１］ ブタＴＬＲ９遺伝子配列の決定と他種ＴＬＲ９との相同性
本発明により決定したブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列は３０９０塩基の構造遺伝子（ＯＲＦ）を含む３１４５塩基（５’側に５４塩基の非転写領域を含む）であった。ＯＲＦは１０２９残基のアミノ酸をコードしており、分子量は１１５．８ｋＤａであった（図１〜４）。多種ＴＬＲ９に対するアライメントを図６〜９に示した。ブタＴＬＲ９アミノ酸配列とヒト、マウス、ネコＴＬＲ９に対してそれぞれ８２．０％、７４．９％および８６．６％の相同性が認められた（表２）。
ａヒト、マウスおよびネコＴＬＲ９の配列情報は、ＤＤＢＪより以下のａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．（それぞれＡＢ０４５１８０、ＡＦ３４８１４０およびＡＹ１３７５８１）で入手した。
［実施例２］ ブタＴＬＲ９トランスフェクタントの発現解析
コントロール細胞とトランスフェクタント由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としたブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡとヒトＴＬＲ９ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ発現解析によりトランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの強い発現が認められた。また、両者ともにヒトＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現は認められなかった（図１０）。
フローサイトメトリーによる発現解析から、１次抗体として抗−ＦＬＡＧ抗体を用いた場合、コントロール細胞と比較してポジティブ側への大きなシフトがみられた（図１１−ａ）。またブタＴＬＲ９抗体を用いた場合もポジティブ側へのシフトがみられた（図１１−ｂ）。レーザー顕微鏡による解析からも同様に発現が確認された（図１２−ａ、ｃ、ｂ、ｄ）。
［実施例３］ ＣｐＧ ＤＮＡ取り込み解析
共焦点レーザー顕微鏡による解析ではＣｐＧ ＤＮＡの違いによる取り込みの顕著な差は判断できなかったが、フローサイトメトリーによるＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析によりブタＴＬＲ９はマウス型ＣｐＧ １８２６よりもヒト型ＣｐＧ２００６を比較的多く取り込んでいることが明らかとなった（図１１−ｃ、１２−ｅ、ｆ）。
［実施例４］ 各種組織におけるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現解析
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法による各種組織におけるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現解析の結果、ブタＴＬＲ９は、腸管リンパ系組織において、特にパイエル板と腸管膜リンパ節において強く発現していることが明らかとなった（図１３）。
本実施例によりブタＴＬＲ９はマウスに比べヒトやネコＴＬＲ９と高い相同性を示すことが明らかとなった。また、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現解析から、これまでＴＬＲ９は脾臓において強い発現が認められるという報告がされていたが、経口的に病原細菌に曝される可能性が最も高い腸管粘膜系の内、腸管免疫の中心的な役割を果たすパイエル板や腸管膜リンパ節において、脾臓の約３倍以上のｍＲＮＡ発現が認められた点は大変興味深い新知見である。また、本実施例はブタＴＬＲ９トランスフェクタントを構築することに成功し、本トランスフェクタントを用いたＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析から、ブタＴＬＲ９がマウス型に比べてヒト型ＣｐＧ ＤＮＡに対する反応性が高かったことから、今後、このトランスフェクタントを用いた機能性乳酸菌ＤＮＡの認識性の解析が飛躍的に進み、ブタを実験動物としたヒトへのモデル系の計画的解析を通して、機能性食品開発の基礎研究が分子間の反応としてより詳細に検討できる。
ＴＬＲ９により認識される細菌ＤＮＡはマクロファージや樹状細胞等を刺激し、サイトカイン等のシグナル分子の産生を促すことが知られている（Ｍ．Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（２００１）５０００−５００７）。本実施例の成果は細菌ＤＮＡによる刺激とＴＬＲ９による認識およびシグナル伝達システムを応用したワクチンの開発につながるものであり（Ｒ．Ｌ．Ｍｏｄｌｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４０８（２０００）６５９−６６０）、感染を抑制するだけの低い免疫応答から、細菌を殺す有効性の高い応答へと切り換えることができるため、結核等の感染症の治療、さらには癌、アレルギー等への幅広い応用が期待できる。最近、腸管まで届く生きた抗原運搬役として乳酸菌が注目を浴びているが、それに加えて乳酸菌由来ＤＮＡもまた免疫賦活化能があることが本発明者らの研究で明らかになったことから乳酸菌に対する期待が大いに高まっている。本発明でＴＬＲ９がパイエル板および腸管膜リンパ節で強い発現が認められたことから、ＴＬＲ９が腸管免疫系において重要な役割を担っていることが強く示唆され、腸管に存在する乳酸菌や食餌性の乳業用乳酸菌のＤＮＡがＴＬＲ９を刺激し、免疫を活性化する可能性が考えられる。それゆえ、乳酸菌ＤＮＡのＴＬＲ９を介した腸管免疫系を明らかにすることは、腸管常在乳酸菌や乳業用乳酸菌を用いたＤＮＡワクチンの開発に向けた解決すべき課題である。
また、パイエル板および腸管膜リンパ節におけるＴＬＲ９の強い発現は、これら腸管免疫における自然免疫系の顕著な発達を意味しているかもしれない。近年、医学、免疫学の分野において腸管免疫系が極めて重要な領域として注目を集めるようになってきた。比較的新しい研究分野であるため基本的な免疫機構についての知見が少なく、その機構解明が大いに期待されている。
本発明で得られた知見は、今後腸管におけるＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路についてその認識メカニズムを分子レベルで明らかするための糸口となり、自然免疫という基本的な免疫システムがより発展的に解明されるための原動力ともなる。
産業上の利用の可能性
本発明においてＴＬＲトランスフェクタントの利用法が提供された。ＴＬＲトランスフェクタントは、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として利用できる。また、ＴＬＲトランスフェクタントを利用することで、腸管免疫系を活性化する試料および微生物を同定でき、腸管免疫系を活性化する医薬組成物および食品組成物を製造できる。該試料、微生物、医薬組成物、および食品組成物は、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
１）ブタ組織
フナコシ株式会社より購入した。
２）ブタＴＬＲ９遺伝子のクローニングと塩基配列決定
ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにおいて公開されているヒトおよびマウスＴＬＲ９（それぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０４５１８０およびＡＦ３４８１４０）遺伝子配列をもとに保存性の高い領域を探索しプライマーを作製した。そのプライマーを用いてブタ腸管パイエル板由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりブタＴＬＲ９遺伝子断片を得た。得られた遺伝子断片はｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにライゲーションしＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルにトランスフォーメーションしサブクローニングした。ＤＮＡ配列はＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）により決定した。塩基配列、アミノ酸配列解析にはＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣ Ｖｅｒ．１１．０．３．１を用いた。残りのブタＴＬＲ９遺伝子配列はブタＴＬＲ９遺伝子断片から設計したプライマーを用いてＲＡＣＥ法により得た。全ＴＬＲ９遺伝子をＰＣＲ法により増幅しクローニングした。
３）ブタＴＬＲ９特異的ポリクローナル抗体の作製
ＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣ Ｖｅｒ．１１．０．３．１を用いた抗原決定基（エピトープ）解析とタンパク２次構造解析よりブタＴＬＲ９アミノ酸配列中より２６８から２８４番目の領域が高い抗原性を持つことを見出した。その領域のペプチド合成および合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体作製をサワディテクノロジー株式会社に依頼した。
４）ブタＴＬＲ９遺伝子を導入したトランスフェクタントの構築
ブタＴＬＲ９遺伝子を導入する宿主細胞としては、ヒトの細胞系で遺伝子導入のホスト細胞として広く利用されているＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞）を選択した。ヒトＴＬＲ９特異的プライマーを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞がＴＬＲ９遺伝子を発現していないことを解析し、シグナルペプチドを除くブタＴＬＲ９遺伝子をライゲーションしたｐＣＸＮ２．１−ＦＬＡＧ遺伝子発現ベクター（Ｈ．Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１０８（１９９１）１９３−１９９）（大阪大学大学院医学研究科宮崎純一氏より分譲）をリポフェクション法によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。抗生物質にはＧ４１８ネオマイシン（ＳＩＧＭＡ）を用い、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＥＰＩＣＳセルソーターシステムによりブタＴＬＲ９発現細胞をセレクションした。
５）ＲＴ−ＰＣＲ法によるトランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９発現解析
トランスフェクタントよりＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ブタＴＬＲ９特異的プライマー（本発明で設計）、ヒトＴＬＲ９特異的プライマーおよびポジティブコントロールとしてヒトＧＡＰＤＨプライマー（Ｋ．Ａ．Ｚａｒｅｍｂｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｇｏｄｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６８（２００２）５５４−５６１）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によるＴＬＲ９ ｍＲＮＡ遺伝子発現解析を行った。
６）フローサイトメトリー法および共焦点レーザー顕微鏡によるブタＴＬＲ９のトランスフェクタントにおける発現解析
細胞を１次抗体としてａｎｔｉ−ＦＬＡＧ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ）で４℃、１時間処理後、２次抗体としてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＰｅｒＣＰ標識抗体で４℃、３０分間染色した。核染色はＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅを４℃、１０分間処理で行った。解析にはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ（日本ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ株式会社）を用いた。ブタＴＬＲ９ポリクローナル抗体による免疫染色は、上記のように１次抗体染色後、２次抗体として、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８標識抗体で４℃、３０分間染色し、核染後解析した。また、細胞をＩ型コラーゲンコートＤｉｓｋ（ＩＷＡＫＩ）に播き１次抗体としてａｎｔｉ−ＦＬＡＧ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧビオチン標識抗体（ＳＩＧＭＡ）で４℃、１時間処理後、２次抗体としてストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５抗体で４℃、３０分間染色した。核染色にはＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ ４℃、１０分間処理した。解析には共焦点レーザー顕微鏡（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いた。
７）トランスフェクタントを用いたＣｐＧ ＤＮＡ取り込みの解析
ＣｐＧ ＤＮＡは、既に報告のあるヒト免疫細胞を強く刺激する大腸菌ゲノムＤＮＡ由来ｃｐＧ２００６型（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号：９））とマウス免疫細胞を強く刺激するＣｐＧ１８２６型（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣ ＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号：１０））（Ｓ．Ｐｉｃｈｙａｎｇｋｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４７（２００１）８３−９４）を用い、１Ｍの濃度のＣｐＧ ＤＮＡで、３７℃にて１時間反応後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭおよび共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析を行なった。
８）ブタ各種組織におけるＴＬＲ９のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法による発現解析
ブタ各種組織（心臓、胸腺、肺臓、脾臓、肝臓、腎臓、骨格筋、十二指腸、空腸、回腸、回腸由来パイエル板、回腸由来腸管膜リンパ節）よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからｏｌｉｇｏ−ｄ（Ｔ）１８プライマーを用いてｃＤＮＡを合成後精製した。ブタＴＬＲ９特異的プライマーおよび精製ｃＤＮＡからＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲに供した。リアクションキットとしてＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ−Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。検量線から求めたブタＴＬＲ９遺伝子量とハウスキーピング遺伝子であるβアクチン遺伝子量との比から、ブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡ量を算出した。結果は、脾臓中のＴＬＲ９発現量を１．０００とした場合の各種組織に含まれるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡ量を数値化し比較した。
本発明で用いたプライマーの塩基配列情報を表１にまとめた。
本発明により決定したブタＴＬＲ９ ｃＤＮＡ塩基配列は３０９０塩基の構造遺伝子（ＯＲＦ）を含む３１４５塩基（５’側に５４塩基の非転写領域を含む）であった。ＯＲＦは１０２９残基のアミノ酸をコードしており、分子量は１１５．８ｋＤａであった（図１〜４）。多種ＴＬＲ９に対するアライメントを図６〜９に示した。ブタＴＬＲ９アミノ酸配列とヒト、マウス、ネコＴＬＲ９に対してそれぞれ８２．０％、７４．９％および８６．６％の相同性が認められた（表２）。
［実施例２］ ブタＴＬＲ９トランスフェクタントの発現解析
コントロール細胞とトランスフェクタント由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型としたブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡとヒトＴＬＲ９ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ発現解析によりトランスフェクタントにおけるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの強い発現が認められた。また、両者ともにヒトＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現は認められなかった（図１０）。
フローサイトメトリーによる発現解析から、１次抗体として抗−ＦＬＡＧ抗体を用いた場合、コントロール細胞と比較してポジティブ側への大きなシフトがみられた（図１１−ａ）。またブタＴＬＲ９抗体を用いた場合もポジティブ側へのシフトがみられた（図１１−ｂ）。レーザー顕微鏡による解析からも同様に発現が確認された（図１２−ａ、ｃ、ｂ、ｄ）。
［実施例３］ ＣｐＧ ＤＮＡ取り込み解析
共焦点レーザー顕微鏡による解析ではＣｐＧ ＤＮＡの違いによる取り込みの顕著な差は判断できなかったが、フローサイトメトリーによるＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析によりブタＴＬＲ９はマウス型ＣｐＧ １８２６よりもヒト型ＣｐＧ２００６を比較的多く取り込んでいることが明らかとなった（図１１−ｃ、１２−ｅ、ｆ）。
［実施例４］ 各種組織におけるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現解析
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法による各種組織におけるブタＴＬＲ９ ｍＲＮＡの発現解析の結果、ブタＴＬＲ９は、腸管リンパ系組織において、特にパイエル板と腸管膜リンパ節において強く発現していることが明らかとなった（図１３）。
本実施例によりブタＴＬＲ９はマウスに比べヒトやネコＴＬＲ９と高い相同性を示すことが明らかとなった。また、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる発現解析から、これまでＴＬＲ９は脾臓において強い発現が認められるという報告がされていたが、経口的に病原細菌に曝される可能性が最も高い腸管粘膜系の内、腸管免疫の中心的な役割を果たすパイエル板や腸管膜リンパ節において、脾臓の約３倍以上のｍＲＮＡ発現が認められた点は大変興味深い新知見である。また、本実施例はブタＴＬＲ９トランスフェクタントを構築することに成功し、本トランスフェクタントを用いたＣｐＧ ＤＮＡの取り込み解析から、ブタＴＬＲ９がマウス型に比べてヒト型ＣｐＧ ＤＮＡに対する反応性が高かったことから、今後、このトランスフェクタントを用いた機能性乳酸菌ＤＮＡの認識性の解析が飛躍的に進み、ブタを実験動物としたヒトへのモデル系の計画的解析を通して、機能性食品開発の基礎研究が分子間の反応としてより詳細に検討できる。
ＴＬＲ９により認識される細菌ＤＮＡはマクロファージや樹状細胞等を刺激し、サイトカイン等のシグナル分子の産生を促すことが知られている（Ｍ．Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（２００１）５０００−５００７）。本実施例の成果は細菌ＤＮＡによる刺激とＴＬＲ９による認識およびシグナル伝達システムを応用したワクチンの開発につながるものであり（Ｒ．Ｌ．Ｍｏｄｌｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４０８（２０００）６５９−６６０）、感染を抑制するだけの低い免疫応答から、細菌を殺す有効性の高い応答へと切り換えることができるため、結核等の感染症の治療、さらには癌、アレルギー等への幅広い応用が期待できる。最近、腸管まで届く生きた抗原運搬役として乳酸菌が注目を浴びているが、それに加えて乳酸菌由来ＤＮＡもまた免疫賦活化能があることが本発明者らの研究で明らかになったことから乳酸菌に対する期待が大いに高まっている。本発明でＴＬＲ９がパイエル板および腸管膜リンパ節で強い発現が認められたことから、ＴＬＲ９が腸管免疫系において重要な役割を担っていることが強く示唆され、腸管に存在する乳酸菌や食餌性の乳業用乳酸菌のＤＮＡがＴＬＲ９を刺激し、免疫を活性化する可能性が考えられる。それゆえ、乳酸菌ＤＮＡのＴＬＲ９を介した腸管免疫系を明らかにすることは、腸管常在乳酸菌や乳業用乳酸菌を用いたＤＮＡワクチンの開発に向けた解決すべき課題である。
また、パイエル板および腸管膜リンパ節におけるＴＬＲ９の強い発現は、これら腸管免疫における自然免疫系の顕著な発達を意味しているかもしれない。近年、医学、免疫学の分野において腸管免疫系が極めて重要な領域として注目を集めるようになってきた。比較的新しい研究分野であるため基本的な免疫機構についての知見が少なく、その機構解明が大いに期待されている。
本発明で得られた知見は、今後腸管におけるＴＬＲ９を介したシグナル伝達経路についてその認識メカニズムを分子レベルで明らかするための糸口となり、自然免疫という基本的な免疫システムがより発展的に解明されるための原動力ともなる。
産業上の利用の可能性
本発明においてＴＬＲトランスフェクタントの利用法が提供された。ＴＬＲトランスフェクタントは、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として利用できる。また、ＴＬＲトランスフェクタントを利用することで、腸管免疫系を活性化する試料および微生物を同定でき、腸管免疫系を活性化する医薬組成物および食品組成物を製造できる。該試料、微生物、医薬組成物、および食品組成物は、例えば、アレルギー、癌、感染症等の治療または予防に使用できる。
【配列表】
Claims (21)
- 被験試料が腸管免疫系を活性化するか否かを評価する方法であって、
（ａ）腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞に、被験試料を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、上記被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腸管免疫系を活性化すると判定される方法。 - 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、腸管免疫系を活性化する試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１に記載の評価方法により、複数の被験試料について、腸管免疫系を活性化するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、腸管免疫系を活性化すると評価された試料を選択する工程 - 請求項２に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する医薬組成物の製造方法。
- 被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験微生物から抽出物を調製する工程
（ｂ）腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞に、該抽出物を接触させる工程
（ｃ）該細胞におけるシグナル伝達を指標に、該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性を測定する工程
を含み、上記Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、上記抽出物を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験微生物が腸管免疫系を活性化する微生物であると判定される方法。 - 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、腸管免疫系を活性化する微生物のスクリーニング方法。
（ａ）請求項４に記載の評価方法により、複数の被験微生物について、腸管免疫系を活性化する微生物であるか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験微生物から、腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物を選択する工程 - 請求項５に記載の工程に、さらに腸管免疫系を活性化する微生物であると評価された微生物と食品上許容される担体とを混合する工程を含む、腸管免疫系を活性化する食品組成物の製造方法。
- 微生物が乳酸菌であり、食品組成物が乳製品である、請求項６に記載の方法。
- 微生物が細菌である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
- 細菌が乳酸菌である、請求項８に記載の方法。
- 腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入する工程を含む、腸管免疫担当細胞のモデル細胞の製造方法。
- 腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞を、腸管免疫担当細胞のモデル細胞として使用する方法。
- 腸管組織が腸管リンパ系組織である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- 腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、請求項１２に記載の方法。
- Ｔｏｌｌ様レセプターがブタ由来である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- Ｔｏｌｌ様レセプターがＴｏｌｌ様レセプター９である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- 請求項１〜９のいずれかに記載の方法に用いるための、腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターを強制発現させた細胞。
- 腸管組織において発現しているＴｏｌｌ様レセプターをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入することで製造される、腸管免疫担当細胞のモデル細胞。
- 腸管組織が腸管リンパ系組織である、請求項１６または１７に記載の細胞。
- 腸管リンパ系組織がパイエル板または腸管リンパ節である、請求項１８に記載の細胞。
- Ｔｏｌｌ様レセプターがブタ由来である、請求項１６〜１９のいずれかに記載の細胞。
- Ｔｏｌｌ様レセプターがＴｏｌｌ様レセプター９である、請求項１６〜１９のいずれかに記載の細胞。
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