JP5414961B2 - 免疫刺激性核酸 - Google Patents
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Description
本発明は概して、免疫刺激性核酸、ならびに腎炎症作用の低下した免疫刺激性オリゴヌクレオチド、その組成物およびこの免疫刺激性核酸を用いる方法に関する。
細菌DNAは、B細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する免疫刺激性効果を有するが、脊椎動物DNAは有さない(Tokunaga,Tら、1988、Jpn.J.Cancer Res.79:682〜686;Tokunaga,Tら、1984、JNCI 72:955〜962;Messina,J.P.ら、1991、J.Immunol.147:1759〜1764;そしてKrieg,1998、Applied Oligonucleotide Technology,C.A.SteinおよびA.M.Krieg(編)、John Wiley and Sons,Inc.,New York,NY,431〜448頁に概説される)。細菌DNAのこれらの免疫刺激効果は、細菌DNAにおいて一般的であるが、ただし脊椎動物DNAにおいてはメチル化されて十分提示されていない、特定の塩基の状況(CpGモチーフ)におけるメチル化されていないCpGジヌクレオチドの存在の結果であることが現在理解されている(Kriegら,1995 Nature 374:546〜549;Krieg,1999 Biochim.Biophys.Acta 93321:1〜10)。細菌DNAの免疫刺激効果は、これらのCpGモチーフを含む合成のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を用いて模倣できる。このようなCpG ODNは、ヒトおよびマウスの白血球に高度に刺激性の効果を有し、B細胞増殖;サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌;ナチュラルキラー(NK)細胞溶解活性およびIFN−γ分泌;ならびに同時刺激分子を発現してサイトカイン、特にTh1様T細胞応答の発達を促進するのに重要なTh1様サイトカインを分泌する樹状細胞(DC)および他の抗原提示細胞の活性化を誘導する。天然のホスホジエステル骨格CpG ODNのこれらの免疫刺激効果は、CpGモチーフがメチル化されて、CpGに変化されるか、さもなければ排除されるかまたは変更される場合、その効果が劇的に低下するという点で高度にCpG特異的である(Kreigら、1995 Nature 374:546〜549;Hartmannら、1999 Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:9305〜10)。
驚くべきことに、BクラスおよびCクラスのCpG核酸および他の安定化された免疫刺激性核酸の免疫刺激特性は、特定のヌクレオチド間の1つ以上の非安定化連結の選択的包含によって維持されるかまたは改善さえされ得ることが発見された。安定化されていない連結は好ましくは天然の連結、すなわちホスホジエステル連結またはホスホジエステル様連結である。安定化されていない連結は代表的には、ただし必須ではないが、ヌクレアーゼ消化に対して比較的感受性である。本発明の免疫刺激核酸は、5’ピリミジン(Y)と隣接する3’プリン(Z)、好ましくはグアニン(G)との間に位置する少なくとも1つの安定化されていない連結であって、ここで5’Yおよび3’Zの両方とも内部ヌクレオチドである連結を含む。
り、安定化されてもされなくてもよい。安定化されたヌクレオチド間連結はホスホロチオエート連結であってもよい。いくつかの実施形態ではN1は0〜2ヌクレオチドである。好ましくはオリゴヌクレオチドは16〜24ヌクレオチド長である。
は修飾ピリミジンであり、Zはグアノシンまたは修飾グアノシンであり、このオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの安定化されたヌクレオチド間連結を含む。
またはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、ここで全ての他のヌクレオチド間連結が安定化される。
ここで*は、ホスホロチオエートであり、_はホスホジエステルである。
ここで*は、ホスホロチオエートであり、_はホスホジエステルである。
。1つの実施形態では、この免疫刺激性核酸分子はCクラス免疫刺激性核酸分子である。
N1−C_G−N2−C_G−N3
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでN1およびN3が各々独立して、1〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、_が内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を示し、N2が独立して0〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、G−N2−Cが1または2つの安定化された連結を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
N1−C_G−N2−C_G−N3
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでN1およびN3が各々独立して、1〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、_が内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を示し、
N2が独立して4〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、G−N2−Cが少なくとも5つの安定化された連結を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。
N1−C_G−N2−C_G−N3
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでN1、N2およびN3は各々独立して、0〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、_は内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を示し、このオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもないオリゴヌクレオチドを提供する。
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここでN1およびN2は各々独立して、0〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、n=2またはn=4〜6であり、X1およびX2が各々独立して3〜10個のヌクレオチドのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する核酸配列であり、N1−(GTCGTT)n−N2が、少なくとも1つのホスホジエステルヌクレオチド間連結を含み、そしてこのオリゴヌクレオチドの3’および5’ヌクレオチドがポリG、ポリA、ポリTまたはポリCの配列を含まない、オリゴヌクレオチドを提供する。
択される。
b、SMART ABL 364 AbおよびImmuRAIT−CEAからなる群より選択され得る。
ホジエステルヌクレオチド間連結を誘導する。
本発明によって柔軟性および半柔軟性の免疫刺激核酸が提供される。本明細書において記載される本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、同様のまたは増強された力価、腎臓、肝臓および脾臓に対する全身性曝露の低下を含む改善された特性を有し、そして注射部位での反応原性が低下し得る。出願人らはある機構に拘束されることはないが、これらの改善された特性は、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドのホスホジエステルまたはホスホジエステル様の「ヌクレオチド間連結(internucleotide linkage)」内の戦略上の位置に関連すると考えられる。本明細書に用いられるような「ヌクレオチド間連結(internucleotide linkage)」という用語は、核酸分子における2つの隣接するヌクレオチドを接続する共有結合的骨格連結をいう。共有結合的な骨格連結は代表的には、修飾されるかまたは未修飾のリン酸連結であるが、他の修飾も可能である。従って、nヌクレオチド長の直鎖状オリゴヌクレオチドは、全部でn−1のヌクレオチド間連結を有する。これらの共有結合的な骨格連結は、本発明の教示による免疫刺激性オリゴヌクレオチドにおいて修飾されて
もされなくてもよい。
結を有し、さらに(a)N1およびYは、N1が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、(b)ZおよびN2は、N2が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結されるか、または(c)N1およびYは、N1が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、そしてZおよびN2は、N2が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結される。
クレオチドについての至適濃度を超える高濃度まで延びる、単調に増大する用量応答曲線(TLR9刺激によってアッセイされるような)を有すると考えられる。従って、本発明の半柔軟性オリゴヌクレオチドは、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドよりも大きい免疫刺激性を誘導し得ると考えられる。
NO:243は、その完全に安定化された対応物であるSEQ ID NO:244よりも大きい免疫刺激性活性を有するが、SEQ ID NO:244はSEQ ID NO:242に比較して比較的弱い免疫刺激性オリゴヌクレオチドであることが見出された:
NO:245および5602(両方とも、SEQ ID NO:242に対して部分的な配列類似性を有する16マー)は、SEQ ID NO:242(24マー)の免疫刺激性活性に匹敵する活性を示す。
ル様のYZヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドが免疫刺激性であり、この次に1つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のYZヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドが免疫刺激性である。重要なことに、1つだけの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のYZヌクレオチド間連結を含むことは、内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様のYZヌクレオチド間連結を有さないよりも有利な利点を有すると考えられる。ホスホジエステルまたはホスホジエステル様の内部連結の数に加えて、核酸の長さにそった位置も効力に影響し得る。
徴である。図20に示されるように、ホスホジエステルヌクレオチド間連結は、2つの架橋酸素原子に隣接し、そして一方は荷電され他方は荷電されていない2つのさらなる酸素原子によっても結合されるリン原子を含む。ホスホジエステルヌクレオチド間連結は、オリゴヌクレオチドの組織半減期を短縮させることが重要である場合、特に好ましい。
のいずれかを用いる自動化技術を用いて合成され得る。アリールおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第4,469,863号に記載のように作成できる;そしてアルキルホスホトリエステル(荷電された酸素部分は、米国特許第5,023,243号および欧州特許第092,574号に記載のようにアルキル化される)は、市販の試薬を用いる自動化固相合成によって調製され得る。他のDNA骨格修飾および置換を作成するための方法は、記載されている。Uhlmann Eら(1990)Chem Rev 90:544;Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1:165。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法も公知である。例えば、Uhlmannらに発行された本特許は、このような技術を記載している。
NaClを含有するアセトニトリル/水=1:4/v:v;5〜60%のB、1ml/分で30分)を用いるGen−Pak Faxカラム(Millipore−Waters)でのHPLCによって、またはキャピラリーゲル電気泳動によってODNを解析する。ODNは、Source High Performanceカラム(Amersham Pharmacia)でのHPLCまたはFPLCによって精製されてもよい。HPLCの同種画分を合わせて、C18カラムを介するかまたは超遠心によって脱塩する。ODNをMALDI−TOF質量分析によって解析して、算出された質量を確認した。
の短い半柔軟性のオリゴヌクレオチドはまた、それらが細胞の内側に送達され得る場合、免疫刺激性であると本発明者は考える。本発明による特定の好ましい実施形態において、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは4〜100ヌクレオチド長である。代表的な実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは6〜40ヌクレオチド長である。本発明による特定の好ましい実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは6〜19ヌクレオチド長である。
nucleic acid molecules)」および同等に「免疫刺激性核酸(immunostimulatory nucleic acid)」または「免疫刺激性オリゴヌクレオチド(immunostimulatory oligonucleotides)」と呼ばれる。従って、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの免疫刺激性モチーフを含む。好ましい実施形態では、この免疫刺激性モチーフは、「内部免疫刺激性モチーフ(internal immunostimulatory motif)」である。「内部免疫刺激性モチーフ(internal immnostimulatory motif)」という用語は、この免疫刺激性モチーフ配列の5’末端および3’末端の両方に連結された少なくとも1つのヌクレオチドによって、このモチーフ配列よりも長い、さらに長い核酸配列内のモチーフ配列の位置をいう。
IFN−αおよびNK細胞活性化を誘導するのに強力であるが、B細胞を刺激するには比較的弱い;このクラスはAクラスと命名されている。このAクラスCpG核酸は代表的には5’末端および3’末端で安定化されたポリG配列を、そして少なくとも6つのヌクレオチドの回文構造のホスホジエステルCpGジヌクレオチド含有配列を有する。例えば、公開された特許出願PCT/US00/26527(WO01/22990)を参照のこと。CpG核酸のさらに別のクラスはB細胞およびNK細胞を活性化して、IFN−αを誘導する;このクラスはCクラスと呼ばれている。このCクラスのCpG核酸は、最初に特徴付けられたように、代表的には完全に安定化されており、Bクラスタイプの配列およびGCリッチの回文構造またはほぼ回文構造を含む。このクラスは、その内容が全体として、参考として本明細書に援用される、2001年8月17日提出の同時係属の米国仮特許出願60/313,273および2002年8月19日提出の米国特許第10/224,523号に記載されている。Cクラス核酸のいくつかの非限定的な例としては:
ID NO:368)が挙げられるが、ここで少なくとも1つのCGジヌクレオチドがホスホジエステルまたはホスホジエステル様のヌクレオチド間連結を有し、そしてこのオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの安定化されたヌクレオチド間連結および5’GNC3’を含み、ここでNは4〜10ヌクレオチド長の核酸配列であり、そして少なくとも50%のTであり、CGジヌクレオチドは含まず、そしてこのオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの安定化されたヌクレオチド間連結を含む。
アデニン、シトシン、グアニン、チミン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシシトシン、5−フルオロシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、2,6−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在する核酸塩基および天然には存在しない核酸塩基、置換された芳香族部分および置換されていない芳香族部分が挙げられるがこれらに限定されない。他のこのような修飾は当業者に周知である。
a)修飾されたヌクレオチド間架橋による、ヌクレオチドの3’および/または5’末端に位置するホスホジエステルヌクレオチド間架橋の置換
b)デホスホ架橋による、ヌクレオチドの3’および/または5’末端に位置するホスホジエステル架橋の置換、
c)別の単位による、糖リン酸骨格からの糖リン酸単位の置換、
d)修飾糖単位による、β−D−リボース単位の置換、ならびに
e)修飾ヌクレオチド塩基による、天然のヌクレオチド塩基の置換、
から選択されるオリゴヌクレオチドに関する。
子をさらに含み得る5−6−員の複素環を形成する。
出される天然に存在する塩基とは化学的に別個であるが、これらの天然に存在する塩基と基本的な化学的構造を共有する任意の塩基である。この修飾されたヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−アミノウラシル、5−(C1−C6)アルキルウラシル、5−(C2−C6)−アルケニルウラシル、5−(C2−C6)アルキニルウラシル、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−クロロウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−ヒドロキシシトシン、5−(C1−C6)−アルキルシトシン、5−(C2−C6)−アルケニルシトシン、5−(C2−C6)−アルキニルシトシン、5−クロロシトシン、5−フルオロシトシン、5−ブロモシトシン、N2−ジメチルグアニン、2,4−ジアミノ−プリン、8−アザプリン、置換7−デアザプリン、好ましくは7−デアザ−7−置換および/または7−デアザ−8−置換プリン、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−アルキルシトシン、例えばN4−エチルシトシン、5−ヒドロキシデオキシシチジン、5−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、N4−アルキルデオキシシチジン、例えば、N4−エチルデオキシシチジン、6−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、C5−プロピニルピリミジンおよびジアミノプリン、例えば、2,6−ジアミノプリン、イノシン、5−メチルシトシン、2−アミノプリン、2−アミノ−6−クロロプリン、ヒポキサンチンまたは天然のヌクレオチド塩基の他の修飾から選択され得る。この列挙は例示的であることを意味しており、限定されると解釈されるべきではない。
オグアニンが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の別の実施形態では、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基(例えば、4−メチル−インドール、5−ニトロ−インドール、およびK塩基)、芳香族環系(例えば、ベンズイミダゾールまたはジクロロベンズイミダゾール、1−メチル−1H−[1,2,4]トリアゾール−3−カルボン酸アミド)、または水素原子(dSpacer)で置換される。
as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleotides & Nucleotides(1991)、10(1〜3)、469〜77およびJiangら、Pseudo−cyclic oligonucleotides:in vitro and in vivo properties,Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)、7(12)、2727〜2735に記載されている。
kinase of non−nucleosidic moieties 5’−attached to oligonucleotides;Nucleic Acids Research(1994)、22(11)2022〜7)から誘導されてもよい。非ヌクレオチドのリンカーは、1回もしくは数回組み込まれてもよいし、またはお互いと組み合わされてもよく、これによって連結されるべき2つのODNの3’末端の間の任意の所望の距離が可能になる。
法(Beaucage,S.L.およびCaruthers、M.H.Tet.Let.22:1859,1981);ヌクレオチドH−ホスホネート法(Gareggら、Tet.Let.27:4051〜4054,1986;Froehlerら、Nucl.Acid.Res.14:5399〜5407,1986;Gareggら、Tet.Let.27:4055〜4058,1986、Gaffneyら、Tet.Let.29:2619〜2622,1988)。これらの化学は、市販されている種々の自動的な核酸シンセサイザーによって行なうことができる。これらのオリゴヌクレオチドは合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単離されたオリゴヌクレオチドは一般に、正常には天然に関連する成分から分離されているオリゴヌクレオチドをいう。例えば、単離されたオリゴヌクレオチドとは、細胞から、核から、ミトコンドリアからまたはクロマチンから分離されているオリゴヌクレオチドであってもよい。
例えば、この感染を軽減するかまたは排除する)ためまたはこの疾患が悪化することを防ぐための、被験体がこの疾患を発症させた後の処置をいう。
応答を誘導する合成化合物が挙げられる。天然の微生物抗原に対する免疫応答(体液性および/または細胞性)をある化合物が誘導する場合、その化合物はその天然の微生物抗原に類似である。このような抗原は、当該分野で慣用的に用いられており、そして当業者に周知である。
bacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides種、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema papillidium、Treponema pertenue、Leptospira,Rickettsia、およびActinomyces israelliが挙げられるがこれらに限定されない。
1983を参照のこと。
germanica);Apis(例えば、Apis multiflorum);Cupressus(例えば、Cupressus sempervirens、Cupressus arizonicaおよびCupressus macrocarpa);Juniperus(例えば、Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communisおよびJunioerus ashei);Thuya(例えば、Thuya orientalis
);Chamaecyparis(例えば、Chamaecyparis obtusa);Periplaneta(例えば、Periplaneta americana);Agropyron(例えば、Agropyron repens);Secale(例えば、Secale cereale);Triticum(例えば、Triticum aestivum);Dactylis(例えば、Dactylis glomerata);Festuca(例えば、Festuca elatior):Poa(例えば、Poa pratensisまたはPoa compressa);Avena(例えば、Avena sativa);Holcus(例えば、Holcus lanatus);Anthoxanthum(例えば、Anthoxanthum odoratum);Arrhenatherum(例えば、Arrhenatherum elatius);Agrostis(例えば、Agrostis alba);Phleum(例えば、Phleum pratense);Phalaris(例えば、Phalaris arundinacea);Pasalum(例えば、Paspalum notatum);Sorghum(例えば、Sorghum halepensis);およびBromus(例えば、Bromus inermis)に特異的なタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
ンダゾール、アンホテリシンB、ベンジニダゾール、ビチオノール、クロロキンHCl、クロロキンホスフェート、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリドン、グルココルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリホネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス(nifurtimox)、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、プリマキンホスフェート、プログアニル、ピランテルパモエート、ピリメタナミン−スルホナミド、ピリメタナミン−スルファドキシン、キナクリンHCl、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム(グルコン酸アンチモニルナトリウム)、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトロプリム−フルファメトキサゾール、およびトリパルサミドが挙げられるがこれらに限定されず、そのうちのいくつかは単独でまたは他と組み合わせて用いられる。
保護する。αおよびβインターフェロンはまた、感染した細胞の表面上のクラスIおよびクラスII MHC分子の発現を誘導し、これが宿主免疫細胞認識についての抗原提示の増大を生じる。αおよびβインターフェロンは組み換え型として利用可能であるが、慢性のB型肝炎およびC型肝炎の感染の処置のために用いられている。抗ウイルス治療のために有効な投与量では、インターフェロンは熱、倦怠感および体重低下のような重篤な副作用を有する。
原などが挙げられるがこれらに限定されない。
12−9566、RASファメシルトランスフェラーゼインヒビター、ファメシルトランスフェラーゼインヒビター、MMP、MTA/LY231514、LY264618/ロメテキソール、グラモレック(Glamolec)、CI−994、TNP−470、ハイカムチン(Hycamtin)/トポテカン(Topotecan)、PKC412、バルスポダー(Valspodar)/PSC833、ノバントロン(Novantrone)/ミトロキサントロン(Mitroxantrone)、メタレット(Meratet)/スラミン(Suramin)、バチスマスタット(Batimastat)、E7070、BCH−4556、CS−682、9−AC、AG3340、AG3433、Incel/VX−710、VX−853、ZD0101、ISI641、ODN698、TA 2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、Lemonal DP2202、FK317、ピシバニル(Picibanil)/OK−432、AD32/バルビシン、メタストロン(Metastron)/ストロンチウム誘導体、Temodal/Temozolomide、Evacet/リポソームドキソルビシン、Yewtaxan/パクリタキセル(Paclitaxel)、タキソール(Taxol)/パクリタキセル(Paclitaxel)、Xeload/Capecitabine、フルツロン
(Furtulon)/ドキシフルリジン(Doxifluridine)、シクロパックス(Cyclopax)/経口パクリタキセル、経口タキソイド(Taxoid)、SPU−077/シスプラチン(Cisplatin)、HMR 1275/フラボピリドール(Fravopiridol)、CP−358(774)/EGFR、CP−609(754)/RASオンコジーンインヒビター、BMS−182751/経口白金、UFT(テガフール(Tegafur)/ウラシル(Uracil))、エルガミゾール(Ergamisol)/レバミゾール(Levamisole)、エニルウラシル(Eniluracil)/776C85/5FUエンハンサー、カンプト(Campto)/レバミゾール(Levamisole)、カンプトゾール(Camptosar)/イリノテカン、ツモデックス(Tumodex)/ラリトレキシド(Ralitrexed)、レウスタイン(Leustain)/クラドリビン(Cladribine)、パキセクス(Paxex)/パクリタキセル、ドキシル/リポソームドキソルビシン、Caelyx/リポソームドキソルビシン、Fludara/Fludarabine、Pharmarubicin/Epirubicin、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis−Naphtalimide、LU103793/ドラスタイン(Dolastain)、Caetyx/リポソームドキソルビシン、Gemzar/Gemcitabine、ZD0473/Anormed、YM116、ロジンシード(lodine
seeds)、CDK4およびCDK2インヒビター、PARPインヒビター、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/Ifosamide、Vumon/Teniposide、Paraplatin/Carboplatin、Plantinol/cisplatin、Vepeside/エトポシド、ZD9331、タキソテール/ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン(Taxane)アナログ、ニトロソウレア、アルキル化剤、例えば、メルファランおよびシクロフォスファミド、アミノグルテチミド(Aminoglutethimide)、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロンブシル(Chlorombucil)、シタラビンHCl、ダクチノマイシン、ダウノルビシンHCl、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド(VP16−213)、フロクスリジン(Floxuridine)、フルオロウラシル(5−FU)、フルタミド、ヒドロキシウレア(ヒドロキシカルバミド)、イフォスファミド、インターフェロンα−2a、α−2b、酢酸ロイプロイド(LHRH−放出因子アナログ)、ロムスチン(CCNU)、塩酸メクロレタミン(Mechlorethamine HCl)(ナイトロジェン・マスタード)、メルカプトプリン、メスナ(Mesna)、ミトタン(Mitotane)(o.p.’−DDD)、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン(Plicamycin)、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン(Amsacrine)(m−AMSA)、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン2、ミトグアゾン(Mitoguazone)(メチル−GAG;メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン;MGBG)、ペントスタチン(2’デオキシコフォルマイシン)、セムスチン(メチル−CCNU)、テニポシド(VM−26)および硫酸ビンデシンからなる群より選択されてもよいが、それに限定されない。
FLK−2、MDX−260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART
ABL 364 AbおよびImmuRAIT−CEAからなる群より選択されてもよいが、それに限定されない。
目的の本発明のいくつかの局面では、CpG免疫刺激性核酸が、自己抗原、詳細にはこの自己免疫障害の標的である自己抗原とともに投与されることは推奨されない。
pステレオアイソマーは、マウス脾臓細胞においてJNKリン酸化を誘導するがSpステレオアイソマーは誘導しない(実施例において考察している)。対照的に、44時間という後期時点でアッセイした場合、Spは脾臓細胞増殖を刺激するのに活性であるが、Rpは活性ではない。本発明者らは、RpおよびSpのステレオアイソマーのこの動態および生物活性における相違が細胞取り込みにおけるなんらかの相違から生じるのではなく、p鏡像異性の2つの対立する生物学的役割に起因する可能性が高いということを実証した。第一に、初期の時点で免疫細胞を刺激することについてSpと比較したRpステレオアイソマーの活性の増強によって、CpGレセプターであるTLR9と相互作用すること、または下流のシグナル伝達経路を誘導するために、Rpがさらに効果的であり得ることが示される。他方では、Spに比較したRp PSオリゴヌクレオチドのさらにはやい分解によって、シグナル伝達の期間がかなり短くなり、その結果Sp PSオリゴヌクレオチドは、後期の時点で試験した場合にさらに生物学的に活性であるらしい。
従って、Sp3’末端連結を有するようにPS−オリゴを合成した場合、それらはステレオ−ランダムPSオリゴに比較して、かなり遅い分解、および異なるPKプロフィールを有するはずである。これによって、インビボ適用のためにいくらか短いオリゴヌクレオチドを使用することが可能になるはずである。アンチセンス適用のために至適のオリゴを設計することにおいて、Rpステレオアイソマーの増強したRNA結合によって、Rp構成にできるだけ多くのオリゴヌクレオチドの内部コアを有することが望ましいことが指摘される。他方では、免疫刺激性適用のために最適のCpGオリゴヌクレオチドは、CpGを除いて全てのヌクレオチド間連結がSp鏡像異性であるものであってもよい。
、いくつかのさらなる例がベクターの考察で以下に示されている。
剤、防腐剤、適合性のキャリア、アジュバントおよび必要に応じて他の治療成分の薬学的に受容可能な濃度を含み得る。
する。
が挙げられる。他には、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、およびカルボキシメチルセルロース(CMC)が挙げられる。ポリビニルピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は両方とも、治療剤を粒化するためにアルコール溶液中で用いることができる。
ースまたはデンプンを含んで処方されてもよい。
げられる。水性注射懸濁液は、懸濁物の粘性を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含んでもよい。必要に応じて、この懸濁物はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするように化合物の溶解度を増大する、適切な安定化剤または因子を含んでもよい。
ム(0.003〜0.03% w/v);クロロブタノール(0.3〜0.9% w/v);パラベン(0.01〜0.25% w/v)およびチメロサール(0.004〜0.02% w/v)が挙げられる。
オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
全てのODNは、biospring(Frankfurt,Germany)またはSigma−Ark(Darmstadt,Germany)から購入して、Coley
Pharmaceutical GmbH(Langenfeld,Germany)によって同一性および純度を管理した。ODNをリン酸緩衝化生理食塩水(Sigma,Germany)中で希釈して、−20℃で保管した。全ての希釈は、発熱物質を含まない試薬を用いて行なった。
健常な男性および女性のヒトドナーからの末梢血バフィーコート調製物をUniversity of Duesseldolf(Germany)の血液バンク(Blood
Bank)から入手して、Ficoll−Hypaque(Sigma)での遠心分離によってそれからPBMCを精製した。精製したPBMCを新鮮に用いるか(ほとんどのアッセイについて)、または凍結培地中に懸濁して−70℃で保管した。必要に応じてこれらの細胞のアリコートを解凍して、洗浄し、5%(v/v)の熱不活性化ヒトAB血清(Bio Whittaker Belgium)または10%(v/v)熱不活性化FCS、2mM L−グルタミン(BioWhittaker)、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen(Karlsruhe,Germany))を補充した、RPMI1640培養培地(Bio Whittaker,Belgium)に再懸濁した。
解凍したPBMCまたは新鮮なPBMCを48ウェルの平底プレートに、または96ウェル丸底プレートに播種して、加湿したインキュベーター中において37℃で示したとおりの濃度のODNとともにインキュベートした。培養上清を収集して、直ちに用いられない場合には、必要になるまで−20℃で凍結させた。市販のELISAキット(Diaclone,USA)か、または市販の抗体(Becton Dickinson/PharmingenまたはPBLから)を用いて発色させた自社製のELISAを用いて、上清中のサイトカインの量を評価した。
CD3(T細胞マーカー)、CD56(NK細胞マーカー)およびCD69(NK細胞およびT細胞における初期活性化マーカー)に対する蛍光色素結合体化モノクローナル抗体をBecton Dickinsonから購入した。96ウェル丸底プレート中に種々の濃度のODNを添加するかまたは添加せずに、PBMCを24時間インキュベートした。NK細胞をフローサイトメトリーによってCD56陽性細胞およびCD3陰性細胞として同定した。フローサイトメトリーデータは、FACSCalibur(Becton Dickinson)で得た。コンピュータープログラム CellQuest(Becton Dickinson)を用いてデータを解析した。
B細胞上の活性化マーカーとして同時刺激分子CD86の発現の測定のために、PBMCを示した濃度でのODNとともに48時間インキュベートさせて、細胞をCD19およびCD86(Pharmingen,Germany)についてmAbを用いて染色した。CD19陽性B細胞でのCD86発現をフローサイトメトリーによって測定した。
本明細書に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対するヒトPBMCの細胞の曝露後にこれらのヒトPBMCから分泌されるインターフェロン(IFN−α)、IFN−γ、IL−10、IL−6およびTHF−αのレベルは、添付の図1〜5に示される。試験された試験オリゴヌクレオチドを、この図に黒三角で示す。陽性コントロールオリゴヌクレオチドとして働くオリゴヌクレオチドを、黒四角として示した。図1A、2A、3A、4Aおよび5Aに示される試験オリゴヌクレオチドとしては、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323およびSEQ ID NO:324が挙げられる。図1B、2B、3B、4Bおよび5Bに示される試験オリゴヌクレオチドとしては、SEQ ID NO:325、SEQ ID NO:326、SEQ ID NO:327、およびSEQ ID NO:328が挙げられる。特定のデータポイントを得るために用いられるオリゴヌクレオチドの濃度をX軸にそって示す(μM)。このグラフの下には、陰性(培地)、そしてある場合にはLPSで処置した細胞によって分泌されるサイトカインのレベルを各々の実験について挙げている。
試験オリゴヌクレオチド対コントロールオリゴヌクレオチドを用いた処置に応答するNK細胞でのCD69発現(MFI)のレベルを検査した。CD69発現は、T細胞およびNK細胞活性化の指標である。図6に黒三角で示される試験オリゴヌクレオチド対黒四角で示される陽性コントロールオリゴヌクレオチドに対して細胞を曝露した。図6Aに示される試験オリゴヌクレオチドとしては、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323およびSEQ ID NO:324が挙げられる。図6Bに示される試験オリ
ゴヌクレオチドとしては、SEQ ID NO:325、SEQ ID NO:326、SEQ ID NO:327およびSEQ ID NO:328が挙げられる。これらの研究で用いられる陽性コントロールオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:329である。以下のグラフは、陰性コントロール(培地)およびLPSを用いて処置したT細胞およびNK細胞上のCD69発現のレベルを各々の実験について列挙する。
本明細書に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対するヒトPBMCの細胞の曝露後に、これらのヒトPBMCによって生成されたインターフェロンα(IFN−α)およびIL−10のレベルは、添付の図7〜12および17に示される。試験される試験オリゴヌクレオチドは、この図に黒四角で示される。陽性コントロールオリゴヌクレオチドとして機能するオリゴヌクレオチドSEQ ID NO:242を黒丸で示す。陰性コントロールオリゴヌクレオチドとして機能するオリゴヌクレオチドは(黒菱形)SEQ ID NO:330で示す。図7Aおよび図7Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:313である。図8Aおよび図8Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:314である。図9Aおよび図9Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:319である。図10Aおよび図10Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:316である。図11Aおよび図11Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:317である。図12Aおよび図12Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:320である。図17Aおよび図17Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:321である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をX軸にそって示す(μM)。
ID NO:242とのインキュベーション後と同様のレベルのインターフェロンα(IFNα)およびインターロイキン−10(IL−10)を分泌する。SEQ ID NO:314は、ヒトPBMCから分泌されるIL−10の量に対してSEQ ID NO:242と同様の効果を有するが、IFNαの分泌は強力に増大される。SEQ ID NO:242と対照的に、SEQ ID NO:319がヒトPBMCから誘導するIFNα分泌のレベルはごく低いレベルであるが、分泌されるIL−10の量は2つのオリゴヌクレオチドの間で匹敵する。SEQ ID NO:316が誘導できたヒトPBMCからのIFNαのレベルはSEQ ID NO:242よりも数倍高かった。分泌されたIL−10の総量の増大も観察された。SEQ ID NO:317は、SEQ ID NO:316に対して類似の特性を示したが、ここではSEQ ID NO:242に比較して、ヒトPBMCからのIFNα分泌の強力な増大を伴った。IL−10分泌のレベルはわずかに上昇した。SEQ ID NO:320は、ヒトPBMCからのIFNαおよびIL−10の誘導を生じたが、この誘導はSEQ ID NO:242による誘導より
も少なかった。SEQ ID NO:321は、ヒトPBMCからSEQ ID NO:242よりも10倍高いレベルのIFNαを誘導することができる(図17A)。SEQ
ID NO:242に比較して、SEQ ID NO:321によって誘導されるヒトPBMCからのIL−10分泌は、このオリゴヌクレオチドのさらに高濃度でわずかに増大される(図17B)。
本明細書に記載されるCpGオリゴヌクレオチドに対するこれらの細胞の曝露後のB細胞および単球の活性化のレベルは、添付の図13〜15、16および18〜20に示される。検査された試験オリゴヌクレオチドを、この図において黒四角によって示す。陽性コントロールオリゴヌクレオチドとして役立つオリゴヌクレオチドSEQ ID NO:242は、黒丸で示した。陰性コントロールオリゴヌクレオチドとして役立つオリゴヌクレオチドは、(黒菱形)SEQ ID NO:330で示した。図13Aおよび図13Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:313である。図14Aおよび14Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:314である。図15Aおよび図15Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:319である。図16Aおよび図16Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:316である。図18Aおよび図18Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:321である。図19Aおよび図19Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:317である。図20Aおよび図20Bに示される試験オリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:320である。特定のデータポイントを得るために用いるオリゴヌクレオチドの濃度をX軸にそって示す(μM)。
NO:242と匹敵するレベルでB細胞上のCD86発現を誘導する(図19A)が、
単球上の活性化マーカーCD80の発現は、SEQ ID NO:242に比較して増大される(図19B)。SEQ ID NO:320は、B細胞上のCD86発現をSEQ
ID NO:2426と同じ程度まで誘導する(図20A)。
NO:241よりも多くのIFN−αを誘導し、高濃度ではSEQ ID NO:242もSEQ ID NO:241も多くのIFN−αを誘導しなかった。ケモカインIP−10は、半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドによって同じ程度まで、そして同様の濃度依存で刺激された。両方の場合とも、低濃度のオリゴヌクレオチドで約700pg/mLのIP−10が観察され、そして高濃度のオリゴヌクレオチドで誘導されたIP−10は少なかった。半柔軟性オリゴヌクレオチドは0.05μMで有意な量のIL−10を誘導したが、完全に安定化されたオリゴヌクレオチドは0.05μMでIL−10をほとんど誘導しないかまたは全く誘導しなかったこと以外は、サイトカインIL−10で、IP−10のパターンに類似のパターンが観察された。半柔軟性および完全に安定化されたオリゴヌクレオチドは、それがTNF−αを誘導する能力において同様であった。すなわち、両方のタイプのオリゴヌクレオチドとも、特に高濃度ではTNF−αを強力に誘導した。
実施例6.半柔軟性SEQ ID NO:241対完全に安定化されたODNによるイ
ンビトロでのマウスマクロファージの刺激
マウスマクロファージ細胞株(RAW264)を、半柔軟性オリゴヌクレオチドSEQ
ID NO:241、完全に安定化されたオリゴヌクレオチドSEQ ID NO:242、完全に安定化されたODN1826、リポポリサッカライド(LPS)またはPBSとともに16時間インキュベートした。半柔軟性および完全に安定化されたODNを0.02、0.05および0.1μMの濃度で検査した。上清を収集して、IL−12のp40サブユニット(IL−12p40,pg/mL)をELISAによって測定した。結果は表2に示される。半柔軟性オリゴヌクレオチドSEQ ID NO:241は、いずれの完全に安定化されたODNよりもIL−12p40を分泌するためのマクロファージを誘導するのに有意に強力であった。
ID NO:242は、同一の塩基配列を有する。結果を表3に示す。最低濃度では、SEQ ID NO:241およびSEQ ID NO:242が有する免疫刺激効果は最小であった。しかし濃度が14nM以上に増大するにつれて、SEQ ID NO:241はSEQ ID NO:242よりも明らかに免疫刺激性になった。本実験で研究した最高濃度では、SEQ ID NO:241は、マウスの最適に完全に安定化されたオ
リゴヌクレオチドODN5890と少なくとも同じ程度の刺激性であった。
以下:
D NO:241は、完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドSEQ ID NO:242よりも30〜45パーセント多いTNF−αを誘導した(1つの実験では、約1,550pg/mL対約1,175pg/mL、そして別の実験では、約710pg/mL対約490pg/mL。
た免疫刺激性オリゴヌクレオチドを上記のように、ただしさらに高いまたは低いオリゴヌクレオチド用量(単数または複数)を用いて投与したサルの対になった群を、オリゴヌクレオチド用量の関数としてのさらなる結果を評価するために包含する。
マウスに、25mg/kgの半柔軟性オリゴヌクレオチドSEQ ID NO:241、柔軟性オリゴヌクレオチド
Research)またはそれに匹敵するカラム(HLB、Waters)を用いて、得られた溶出物を脱塩した。水およびアセトニトリルのみを含む、RPカラムからの溶出物を乾燥させて、同じチューブで60μlの脱イオン水に溶解した。このサンプルのさらなる脱塩のために、膜透析を行なった。キャピラリーゲル電気泳動によってサンプルを直接解析した。MALDI−TOF MSについて、サンプルを希釈しないかまたは濃縮して用いた。すなわち50μlのODNサンプルを減圧下で乾燥して、脱イオン水に溶解し、以下に記載のとおりアッセイした。
MALDI−TOF。解析物およびその代謝物を含む脱塩サンプルを、遅延抽出源、337nm波長の窒素レーザーおよび1.2メートルの飛行管を備える、Applied Biosystems MALDI−TOF質量分析計で解析した。装置の設定は以下のとおりであった:電圧25kV;グリッド電圧95.4%;ガイドワイア0.1%;遅延時間1200nsec。同様に、マトリックス3−ヒドロキシピコリン酸含有クエン酸ジ
アンモニウムを用いた。ODNサンプルのスペクトルを、既知の分子量の標準ODNのセットを用いて同一の条件下で同じプレート上に外面上に較正した。
NO:241および柔軟性ODN SEQ ID NO:294が、全てホスホロチオエートのSEQ ID NO:242に比較して劇的に低下した(それぞれ93%までおよび87%まで)ことが示される。
ID NO:255)は、ちょうど3’非回文構造部分における半柔軟性配列の組み込み(ODN SEQ ID NO:251)に比較してTLR9活性を有意に増強した。5’非回文構造部分および3’回文構造部分の両方における半柔軟性配列の組みこみ(ODN SEQ ID NO:295)によって、ちょうど3’回文構造部分での半柔軟性配列の組みこみ(ODN SEQ ID NO:251)に比較して増大したTLR9活性が得られた。
SEQ ID NO:255およびODN SEQ ID NO:295)において最
も顕著であった。ODN SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:251およびSEQ ID NO:295をELISAによって評価して、これらの3つの半柔軟性オリゴヌクレオチドのうち完全に安定化された形態であって、IFN−αの強力なCクラスオリゴヌクレオチド誘導因子であるSEQ ID NO:242と比較した。結果を表11に示す。
方法:
SEQ ID NO:313の粉末X線回折によって、非晶相の特徴であるハロー(halo)が示された。水蒸気収着解析によって、SEQ ID NO:313が高度に吸湿性であることが示された。薬物が湿度を交換する傾向によって、環境の湿度に依存して湿度の量が変化し得る。この化合物は、高い水溶性(>100mg/mL)を示し、従って、使用されるpH範囲にわたって十分な溶解度を有する。上昇した温度でのこの薬物の水溶液の解析によって、この薬物は軽度に酸性から酸性の環境で急速に分解するが、pH6を超える緩衝化溶液は十分な溶液安定性を有すると思われることが示される。
SEQ ID NO:313は、実質的に非結晶性であって高度に吸湿性であることが見出された。この化合物は高い水溶性を示し(>100mg/mL)、従って使用されるpH範囲にわたって十分な溶解度を有する。ODNは軽度に酸性から酸性の環境で急速に分解する。pH6を超える緩衝化溶液は十分な溶液安定性を有すると思われる。
方法:
ヒトTLR9でトランスフェクトしたHEK293細胞をSEQ ID NO:313またはSEQ ID NO:329を用いて16時間インキュベートさせた。ルシフェラーゼ読み取りによってシグナルを決定した。
SEQ ID NO:329に比較して、SEQ ID NO:313は、標的レセプターTLR9のさらに強力な刺激因子であった。
方法:
6人のドナー由来のヒト末梢血単核球をSEQ ID NO:313またはSEQ ID NO:329を用いて24時間または48時間インキュベートさせた。サイトカインの分泌を測定した。
この結果を図23に示す。SEQ ID NO:329に比較して、SEQ ID NO:313は、TLR9関連サイトカインIL−6、IL−10、IFNαおよびIP−10の誘導因子として、増大するか、または少なくとも同様の有効性および/または効力を示した。
方法:
マウス(BALB/c)脾臓細胞をSEQ ID NO:313またはSEQ ID NO:329とともに48時間インキュベートした。サイトカインおよびIP−10の分泌を測定した。
SEQ ID NO:329に比較して、SEQ ID NO:313は、サイトカインIL−6、IL−10、IL−12p40、IFNα、TNFαおよびIP−10の誘導因子として、増大するか、または少なくとも同様の有効性および/または力価を示した。データを図24に示す。このデータによって、マウス免疫細胞でのSEQ ID NO:313の活性はヒト細胞(上記)での活性に匹敵すること、およびTLR9を介した活性化と同様に一致することが示される。
方法:
この研究によって、SEQ ID NO:313を気道へ投与した後のマウス肺におけるサイトカインの発現を評価した。腎臓曝露を検討するため、この器官における同じサイトカインの誘導(実施例10および21に記載される)をまた評価した。マウス(雄性、BALB/c)に、経鼻滴下またはボーラス静脈内注射のいずれかによってSEQ ID
NO:313またはSEQ ID NO:329を投与した(各々1mg/kg)。肺および腎臓を投与後8時間または15時間で取り出した。RNAを抽出してcDNAに逆転写した。cDNAの標的フラグメントを増幅してリアルタイムPCR(SYBR Green検出法を用いるRoche LightCycler)によって検出した。RocheのLC PROBE DESIGNソフトウェア(Rocheカタログ番号3139174のバージョン1.0)を用いてGAPDH、IFNγ、IL−6、IP−10およびTNFαのためのプライマーを設計した。IFNαのためのプライマーをPRIMER
3ソフトウェアを用いて設計した。収率をコントロール遺伝子(GAPDH)発現の比として正規化した。
気道への投与の後、SEQ ID NO:313は肺においてTLR9関連遺伝子(IL−6、TNFα、IFNγ、およびIP−10)の発現を誘導した。結果を図25に示す。しかし、IP−10の発現によって、これらの遺伝子は、この経路によって投与されたマウスの腎臓では発現されなかった。IP−10は代表的にインターフェロンによって誘導されるので、このケモカインの発現は、インターフェロンの肺から全身循環への分泌の結果として間接的に生じ得る。SEQ ID NO:313が静脈内に投与された後、これらの遺伝子の各々はIFNγを除いて、腎臓で誘導された。従って、気道への投与後のSEQ ID NO:313の腎臓への影響の欠失は、低い前身暴露に起因する可能性が高かった。
後に観察されている。本発明者らの結果によって、気道に投与されたSEQ ID NO:313への全身曝露が腎臓においてTLR9関連遺伝子を直接誘導するのに十分でないということが示唆される。
方法:
本研究によって、SEQ ID NO:313がマウスの排出リンパ節におけるTh2型応答から離れて免疫偏移を誘導する能力を検討した。マウス(雄性、BALB/c)を、抗原(オボアルブミン、100μg)を含む完全フロイントアジュバントを用いて右後足蹠への注射によって感作させた。マウスに、SEQ ID NO:313またはSEQ
ID NO:329(1.5mg/kg)またはビヒクル(生理食塩水)を用いて同じ足蹠に同時に注射した。足蹠注射後6日で、排出膝窩リンパ節を取り出した。T細胞(CD3+)およびB細胞(B220+)をフローサイトメトリーによってカウントした。エキソビボ抗原想起アッセイ(antigen recall assay)を、オボアルブミン(100μg/ml)または希釈物のいずれかを含む、220μlの培地RPMI
1640+10%ウシ胎仔血清中で、1×106個の細胞(排出膝窩リンパ節から)をインキュベートして、行なった。36時間の培養後に、培地を取り出して、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12p70、GM−CSF、IFNγおよびTNFαの濃度を、LINCO research,Inc.14 researchPark Drive,st charles,Missouri 63304のキットを用いて測定して、Luminexマルチプレックスシステム(Luminex Corporation,12212 Technology Boulevard,Austin,Texas 78727〜6115)で解析した。
(膝窩リンパ節における細胞数)感作によって、排出膝窩リンパ節におけるT細胞およびB細胞の蓄積が生じた。これらの抗原誘導性蓄積は、これもCpG ODNを受けたマウスにおいてさらに有意に増大はされなかった。しかし、未感作のマウスに対する各々のCpG ODNのみの注射でT細胞およびB細胞の両方の蓄積を生じた。このデータを図26に示す。
方法:
水酸化アルミニウムアジュバントとともに抗原(オボアルブミン、100μg、i.p.)を用いて研究の0日および7日にマウス(雄性BALB/c)を感作した。各々の感作の2日前および各々の感作の日に、SEQ ID NO:313(0.15または1.5mg/kg、i.p.)またはSEQ ID NO:17(1.5mg/kg、i.p.)をマウスに投与した。血清を研究の18日目に収集した。抗原(オボアルブミン)特異的IgEおよびIgG2aの力価をELISAによって測定した。プロトコールのまとめを表12に示す。
SEQ ID NO:313またはSEQ ID NO:329を用いて処置したマウスでは、抗原特異的IgEの産生は完全に予防された。対照的に、IgG2aの産生は増大した。IgEおよびIgG2aの産生は、それぞれTh2型およびTh1型の応答の特徴であるので、この影響は、SEQ ID NO:313が抗原感作に対するTh2型応答を抑制し得るというさらなる証拠である。あるいは、CpG ODNはT−β発現およびB細胞におけるIgEからのクラス切り替えを直接誘導し得る。このデータを図28に示す。結果は平均±s.e.m.である(n=10〜12、SEQ ID NO:329群についての5を除いて)。*P<0.05は、感作された、ビヒクル処置群と比較(クラスカル・ワリス多重比較検定)。
方法:
水酸化アルミニウムアジュバントとともに抗原(オボアルブミン、100μg、i.p.)を用いて研究の0日および7日にマウス(雄性BALB/c)を感作した。2週間連続して各週2回、吸入オボアルブミンエアロゾルに対する曝露によってマウスを抗原チャレンジした。1回目のチャレンジは21日目であった。第一回の抗原チャレンジの週の2日前に、各週に1回、経鼻的滴下によって、SEQ ID NO:313(0.1〜1000μg/kg)、SEQ ID NO:329(1〜1000μg/kg)またはビヒクル(生理食塩水、20μl)を気道に投与した。最後の抗原チャレンジの48時間後に終点を評価した。気管支肺胞洗浄によって気道の細胞を回収して、示差的な細胞カウントを行なった。肺組織における好酸球の数(好酸球密度)および肺組織における粘膜分泌(PAS染色)を組織病理学的評価によって決定した。そのプロトコールを表13にまとめる。
抗原チャレンジは、気道の管腔において、白血球主に好酸球の総数の増大を生じた。データを図29に示す。好酸球は、SEQ ID NO:313またはSEQ ID NO:329によって用量に関連した様式で有意に抑制された。好酸球に対するED50値は:SEQ ID NO:313:23μg/kg;SEQ ID NO:329:47μg/kgであった。チャレンジはまた、SEQ ID NO:313によって有意に抑制されたCD4+T細胞(CD3+CD4+細胞)の蓄積を生じた。SEQ ID NO:313はまた、肺組織における抗原誘導性好酸球蓄積および上皮粘液分泌を有意に抑制した。図29の結果は、平均±s.e.m.である(n=15)。*P<0.05は、チャレンジされた、ビヒクル処置群との比較(クラスカル・ワリス多重比較検定)。図30の結果は、平均±s.e.m.である(n=6)。*P<0.05、**P<0.001は、チャレンジされた、ビヒクル処置群との比較(ANOVA、ダネット(Dunnett)多重比較検定)。
方法:
水酸化アルミニウムアジュバントとともに抗原(オボアルブミン、100μg、i.p.)を用いて研究の0日および7日にマウス(雄性BALB/c)を感作した。2週間連続して各週2回、吸入オボアルブミンエアロゾルに対する曝露によってマウスを抗原チャレンジした。1回目のチャレンジは19日目であった。第一回の抗原チャレンジの週の2日前に、各週に1回、SEQ ID NO:313(10〜1000μg/kg)、またはビヒクル(生理食塩水、20μl)を経鼻的に投与した。静脈内メタコリンに対する気管狭窄(気道抵抗性の増大)を測定することによって最後の抗原チャレンジの24時間後に気道反応性亢進を評価した。各動物について、メタコリンに対する用量応答曲線を得て、気道反応性を曲線下面積として定量した。そのプロトコールを表14にまとめる。
抗原チャレンジは、気道の反応性亢進を生じた。SEQ ID NO:313は、用量に関連した様式で抗原誘導性の気道反応亢進性の発達を抑制した。SEQ ID NO:313(1000μg/kg)の効果を示すメタコリンに対するサンプルの用量応答曲線としてデータを図31および32に示す。メタコリンに対する用量応答曲線を曲線下面積として定量する。結果は、平均±s.e.m.である(n=6〜8)。*P<0.05は、チャレンジされた、ビヒクル処置群との比較(クラスカル・ワリス多重比較検定)。
ID NO:313で処置されたそれぞれのマウスの各々との間の完全な用量応答(R
L)曲線の解析を、反復測定MANOVAを用いて行なった。100μg/kgと1000μg/kgのSEQ ID NO:313を用いた処置群の用量応答曲線の間には有意な相違(P<0.05)が存在したが、抗原チャレンジして、ビヒクルで処置されたマウスと、同様に処置された、10μg/kgのSEQ ID NO:313を投与された動物との間に有意な相違はなかった。
ラットにおいてPK研究を行なって、SEQ ID NO:313に対して塩基配列において同一である完全にホスホチオエートのODNであるSEQ ID NO:329よりもはやい速度で、SEQ ID NO:313、「半柔軟性(semi−soft)」ODNが、血漿および組織から、詳細には腎臓から排除されるか否かを決定した。
SEQ ID NO:313およびSEQ ID NO:329の5mg/kg(IVおよびITの両方について)を静脈内(IV)および気管内(IT)経路によって、56匹のラットに投与した。血漿、肺、腎臓を収集した。研究は5日間続続け、1用量群あたり14の時点を用いた。IV群(総計=42匹)については1時点あたり3匹のラット、そしてIT群については1時点あたり4匹のラットを用いた。
図33は、5mg/kgのIVおよびIT投与後のラット血漿におけるODN濃度を示す。血漿データによって、SEQ ID NO:313は、IVおよびITの両方の投与後のSEQ ID NO:329に比較して血漿からさらに急速に排除されることが示される。
ID NO:329についての肺データは投与後48時間までしか利用できない。
ID NO:313およびSEQ ID NO:329についての平均PKパラメーターのまとめ
nc−算出不能。研究期間の間には到達しない終末相または終末排出相においてデータポイントが不十分であることに起因して正確に推定できない。
*−48時間前最終測定可能濃度の場合の、AUC0−48hまたはAUC0−LAST。
**−極めて近似的な推定値(終末相における2つのデータポイントのみに基づく)。
10−SEQ ID NO:313
17−SEQ ID NO:329
表16(a)−(c):5mg/kgの投与レベルでのラットに対するITおよびIV投与後のSEQ ID NO:313およびSEQ ID NO:329に対する全身的および組織曝露。
方法
ヒトTLR9を発現する安定にトランスフェクトされたHEK293細胞は前に記載さ
れた[Bauerら;PNAS;2001]。要するに、HEK293細胞を、ヒトTLR9および6×NFκB−ルシフェラーゼレポータープラスミドを発現するベクターを用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。安定なトランスフェクト体(3×104細胞/ウェル)を、加湿されたインキュベーター中において37℃で16時間ODNと共にインキュベートした。各々のデータポイントを三連で行なった。細胞を溶解して、ルシフェラーゼ遺伝子活性について(Perkin−Elmer,Ueberlingen,GermanyのBrightliteキットを用いて)アッセイした。ODNの添加なしに培地のレポーター遺伝子活性に関して、刺激指数を算出した。
最適の免疫刺激性CpG配列を含むODNによって、TLR9は容易に活性化される。本発明者らは、半柔軟性ODNのパネル、および半柔軟性のODNと同じODN配列を有する完全にホスホロチオエートODNのパネルを用いて、ヒトTLR9を安定に発現するヒトTLR9細胞株をインキュベートした。結果を図40に示す。
方法
細胞培養条件および試薬
B細胞増殖アッセイのために、BALB/cマウス(4〜18週齢)由来の脾臓細胞を、96ウェルマイクロタイタープレート中でRPMI中において、2〜5×105〜106細胞/mlで44時間培養して、次いで回収の前に1μCiの3Hチミジンで4〜6時間パルスして、前に記載されたように(Kriegら、1995)シンチレーションカウ
ンティングによってcpmを決定した。ウェスタンブロットのために、WEHI−231細胞(American Type Culture Collection,Rockville,MD)を5%CO2加湿インキュベーター中で37℃で培養して、10%熱不活性化FCS(Life Technologies,Gaithersburg,MD)、1.5mM Lグルタミン、50μM 2−ME、100U/mlペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640(Life Technologies,Gaithersburg,MD)中で維持した。
オリゴデオキシヌクレオチド(PO−オリゴ)およびステレオ−ランダム(stereo−random)オリゴ(デオキシヌクレオシドホスホロチオエート)[Mix−PS]−オリゴは、Operon Technologies(Alameda,CA)から購入して、標準的ホスホラミダイト法(Caruthers,1985)(Stecら,1984)によって調製した。オリゴヌクレオチド[Mix−PS]−d(TCCATGACGTTCCTGACGTT)([Mix−PS]−SEQ ID NO:386)を陽性コントロールとして用いた。なぜなら、これは、マウス細胞に対して強力な免疫刺激性効果を有することが以前に見出されているからである(Yiら、1996)。最小の刺激モチーフを有するCpG PS−オリゴについては、CpG DNAの広範なファミリーに代表的な広範な免疫刺激効果を有する代表的なCpGモチーフとして、研究のために配列PS−d(TCAACGTT)−2066を選択した。この配列は、ステレオ−ランダムな骨格で作成された場合[Mix−PS]−2066と呼ばれた。この八量体配列が完全または部分的に立体規定された骨格で作製された場合、PS−オリゴは、[All−Rp−PS]−2066と呼ばれるか、もしくはこの全体的骨格が立体規定される場合[All−Sp−PS]−2066と呼ばれ、またはCpGジヌクレオチドが立体規定された場合、[CG−Rp−PS]−2066もしくは[CG−Sp−PS]−2066と呼ばれる。用いられる他のPS−オリゴは、CpG PS−d(TCAACGTTGA)([Mix−PS]−SEQ ID NO:387)およびそのAll−Rp−およびAll−Sp−ステレオ−規定対応物、ならびにコントロールの非CpG PS−d(TCAAGCTTGA)[Mix−PS]−SEQ ID NO:388を含んだ。
ion,Ashland,MA;作業濃度125mg/mL)および1−H−テトラゾールを慣用的に添加して(カップリング時間120s)、続いて、S−Tetra試薬を用いる硫化を続けた(Stecら、1993)。濃水酸化アンモニウムを用いて、それぞれ室温で1時間および55℃で4時間、支持体からの切断および脱保護を行なった。得られたオリゴマーを、1工程RP−HPLC(上記参照)によって精製した。フルオレセイン部分の顕著な疎水性のせいで、Rp−およびSp−オリゴマーは、それぞれ、14.5、14.8および14.7、15.0分の保持時間で、すなわち失敗した配列の終わりに、溶出された。両方の場合とも、2つのP−ジアステレオマーは、フルオレセインモノマーを用いた伸長のホスホラミダイト/硫化法の非立体特異性に起因して溶出された。
細胞を回収して、2*106細胞/mlの濃度で新鮮な培地に再懸濁した。細胞を40分の刺激の前に4時間休止させた。細胞を回収して冷PBSを用いて3回洗浄した。細胞を0.05M Tris(pH7.4)、0.14M NaCl、1% NP−40、0.001M Na3 VO4、0.01M NaF、4.3mg/ml β−グリセロホスフェート、0.002M DTT、50μg/ml PMSF、12.5μg/mlアンチパイン、12.5μg/mlアプロチニン、12.5μg/mlロイペプチン、1.25μg/mlペプスタチン、19μg/ml ベスタチン、10μg/mlホスホラミドン、12.5μg/mlトリプシンインヒビターに溶解して、凍結融解して、続いて氷上で30分インキュベーションした。次いで、サンプルを4℃で10,000×gで10分間遠心分離した。上清をさらなる解析のための全細胞溶解物として保存した。等量の全細胞溶解物(20μg)をSDSサンプル緩衝液中で5分間煮沸して、その後に11%変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に供した。電気泳動後に、半乾燥吸い取り紙(Semi−dry blotter)(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を用いてタンパク質をニトロセルロース膜に移した。ホスホ−SAPK/JNK(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)、IκB−αおよびJNK1(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)とのハイブリダイゼーションの前に5%脱脂乳を用いてブロットをブロックした。製造業者のプロトコールに従って、増感化学発光試薬(ECL,Amersham International)を用いてブロットを可視化した。
CpG PSオリゴのSpステレオアイソマーによる脾臓細胞3Hチミジン取り込みの誘導。CpG DNAの免疫刺激性効果の立体特異性を決定するために、BALB/c脾臓細胞を、全てのヌクレオチド間連結が表17に示される濃度でRpまたはSp構成のいずれかである立体規定オクタヌクレオチドPS−d(TCAACGTT)−2066とともに培養した。この細胞を48時間培養して、これによってB細胞を十分な時間誘導してCpGモチーフによる増殖を可能にさせる(Kriegら、1995)。CpGモチーフを保有するステレオ−ランダム[Mix−PS]−2066は、強力な用量依存性の脾臓細胞増殖を誘導した(表17)。Spアイソマーはまた、増殖を誘導して、[Mix−PS]−2066よりもわずかに強力であると考えられた。対照的に、Rpステレオアイソマーは、なんら検出可能な増殖を誘導せず、これはYuら(Yuら、2000)の知見と一致した。
12つのPSオリゴの各々を培養の開始時点で、示した濃度に添加した。
ID NO:387および[All−Sp−PS]−SEQ ID NO:387の両方が、用量依存性の様式で強力な3Hチミジン取り込みを誘導した。しかし、この場合、[All−Rp−PS]−SEQ ID NO:387はまた、最高濃度で細胞増殖の実質的な増大を誘導することが可能であって、このことはこれが少なくとも部分的な刺激活性を保持していたことを示す。
ID NO:386およびPS−SEQ ID NO:387を用いた処置の際、40分内のJNKリン酸化が強力に、[Sp−PS]アイソマーによってではなく、ステレオランダム[Mix−PS]−によっておよび[Rp−PS]アイソマーによってのみ誘導されたことを見出した。コントロールの非CpG[Mix−PS]−SEQ ID NO:388は、検出可能なJNKリン酸化を誘導しなかった。全てのサンプルが匹敵する量の総JNKタンパク質を含んだ。
ボアルブミン、10μg、i.p.)を用いて研究の0日および7日にマウス(雄性BALB/c)を感作した。
本研究によって、半柔軟性B、CおよびTクラスODNがインビトロでマウス脾臓細胞からのサイトカイン分泌を誘導する能力を検討した。
L−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、GM−CSF、IFN−γおよびTNFαの濃度を、Luminexサイトカイン多重システムを用いて測定した。IL−12p40、IFN−αおよびIP−10の濃度をELISAによって測定した。正確な検出可能性の下限は3.2〜10pg/mlであった。フローサイトメトリーによってCD3+およびB220+細胞上でCD40、CD69およびCD86の発現を測定することによって、細胞の活性化状態を評価した。
表18.半柔軟性B、CおよびTクラスのODNに応答するインビトロサイトカイン分泌
半柔軟性BクラスODN313と比較した場合、2つの半柔軟性CクラスODNは、さらに高い力価のIL−10、IL−12p40、IFN−α、TFN−αおよびIP−10を誘導したが、さらに顕著なB細胞活性化は生じなかった。この2つの半柔軟性TクラスODNは、サイトカイン誘導因子として、半柔軟性のBおよびCクラスのODNよりも有効性が劣るようであった。
サイトカイン測定:BALB/cマウスに400mg ODN(SEQ ID NO:294(柔軟性)、241(半柔軟性)、242、および286)をSC注射によって投与した。動物を注射後3時間で採血して、血漿中のIP−10、IFN−γおよびTNF−αのレベルをELISAによって測定した。この結果を示す この結果を図41AおよびB(IP−10)、C(IFN)、およびDおよびE(TNF)に示す。
本発明のODNを、単独療法として3つのガンモデルで有効性について試験した。最初にODNを腎細胞癌腫(renca)を有するマウスに投与した。この方法は以下のとおり行なった:0日目にマウスの左脇腹に2×105個のrenca細胞をSC注射することによって腫瘍を誘導した。処置には、腫瘍細胞注射後10日で開始して5週間の間に毎週、PBS、CpG ODN241または242の含まれるSC注射を続けた。結果を図43AおよびBに示す。
腎周囲の炎症をBALB/cマウスにおけるTLR−9ノックアウトマウスにおいて評価した。結果をそれぞれ表19および20に示す。半柔軟性ODN(241)は、注射の部位で誘導する腎周囲の炎症が少ないか、誘導しないか(100mg用量)、またはほとんどなく(250mg用量)、そして複数回のODNの投与後も良好に耐容された。
Claims (33)
- 少なくとも2つの内部シトシン−グアニン(CG)ジヌクレオチドおよびキメラ骨格を有する、16〜24ヌクレオチド長の間の免疫刺激性核酸分子を含むオリゴヌクレオチドであって、該少なくとも2つの内部CGジヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間連結を有し、
ここで、該オリゴヌクレオチドが、さらなる内部CGジヌクレオチドを含む場合、該さらなる内部CGジヌクレオチドがホスホジエステル、または安定化されたヌクレオチド間連結を有し、全ての他のヌクレオチド間連結が安定化され、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。 - 請求項1に記載のオリゴヌクレオチドであって、該免疫刺激性核酸が、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有する複数の少なくとも3つの内部CGジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
- 請求項2に記載のオリゴヌクレオチドであって、あらゆる内部CGジヌクレオチドが、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有する、オリゴヌクレオチド。
- 前記免疫刺激核酸分子がBクラス免疫刺激核酸分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記免疫刺激核酸分子がCクラス免疫刺激核酸分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記免疫刺激核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもない、請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- N1−C_G−N2−C_G−N3を含む、16〜24ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであって、
N1およびN3が各々独立して、核酸配列であり、_が内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を示し、N2が独立して核酸配列であり、ここで、CとGとの間以外の全ての他のヌクレオチド間連結が安定化された連結であり、ここで、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。 - N1−C_G−N2−C_G−N3を含む、16〜24ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであって、
N1およびN3が各々独立して、核酸配列であり、_が内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を示し、N2が独立して4〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、ここで、CとGとの間以外の全ての他のヌクレオチド間連結が安定化された連結であり、ここで、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。 - N1−C_G−N2−C_G−N3を含む、16〜24ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであって、
N1、N2およびN3が各々独立して、0〜20ヌクレオチド長の核酸配列であり、_が内部ホスホジエステルヌクレオチド間連結を示し、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、三重らせん形成オリゴヌクレオチドでも、リボザイムでもなく、全ての他のヌクレオチド間連結が安定化され、該安定化されたヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結である、オリゴヌクレオチド。 - 前記オリゴヌクレオチドが、アジュバントもしくはサイトカインまたは抗原をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 免疫応答を調節するのに有効な量で、被験体に投与するために処方されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫応答調節するための薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが被験体におけるガンを処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが被験体における感染性疾患を処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが被験体における自己免疫疾患を処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが被験体における気道再構築を処置するために該被験体に送達するために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 抗原をさらに含む、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 被験体に対する治療プロトコールの一部としての投与のために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記治療プロトコールが外科手術である、請求項17に記載の薬学的組成物。
- 前記治療プロトコールが放射線である、請求項17に記載の薬学的組成物。
- 前記治療プロトコールが医薬である、請求項17に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが処方される、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが標的化分子に会合される、請求項21に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、経口、経鼻、舌下、静脈内、皮下、粘膜、呼吸、直接注射および経皮的経路からなる群より選択される経路による送達のために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、サイトカイン発現を誘導するのに有効な量で前記被験体に送達するために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記サイトカインがIL−6、TNFα、IFNα、IFNγおよびIP−10からなる群より選択される、請求項24に記載の薬学的組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、Th2バイアス応答からTh1バイアス応答に免疫応答を偏移するのに有効な量で前記被験体に送達するために処方されている、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫応答を刺激するための薬学的組成物。
- 免疫応答を刺激するための請求項1〜10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの医薬を製造するための方法。
- 被験体における免疫応答を調節するための医薬の製造における請求項1〜10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 前記被験体がガンを有する、請求項29に記載の使用。
- 前記被験体が感染性疾患を有する、請求項29に記載の使用。
- 前記医薬が、Th2バイアス応答からTh1バイアス応答に免疫応答を偏移する、請求項29に記載の使用。
- 5’ T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3’(SEQ ID NO.313)を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドであって、ここで、CとGとの間以外の全ての他のヌクレオチド間結合が安定化された結合である、免疫刺激性オリゴヌクレオチド。
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