JP6006183B2 - 増強された免疫刺激活性を有する疎水性Ｔ類似体を含有するＣｐＧオリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

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Description

本発明は、一般的に、免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、増強された免疫刺激能力を有する治療用オリゴヌクレオチドに関する。
細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化するための免疫刺激効果を有しているが、脊椎動物ＤＮＡは、そのような効果を有していない（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．、他、１９８８．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：６８２〜６８６；Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．、他、１９８４、ＪＮＣＩ ７２：９５５〜９６２；Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．、他、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜１７６４；およびＫｒｉｅｇ、１９９８、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃ．Ａ．ＳｔｅｉｎおよびＡ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ、（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、４３１〜４４８ページで概説されている）。現在、細菌ＤＮＡのこれらの免疫刺激効果は、特定の塩基コンテクスト（ＣｐＧモチーフ）中の、細菌ＤＮＡに共通しているが、脊椎動物ＤＮＡではメチル化されていて占める割合が低い非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの存在の結果であると理解されている（Ｋｒｉｅｇ他、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｋｒｉｅｇ、１９９９ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９３３２１：１〜１０）。細菌ＤＮＡの免疫刺激効果は、これらのＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）で模倣することができる。そのようなＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞増殖；サイトカインおよび免疫グロブリン分泌；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ分泌；ならびに共刺激分子を発現し、サイトカイン、特に、Ｔｈ１様Ｔ細胞応答の発現を促進するのに重要であるＴｈ１様サイトカインを分泌するための樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞の活性化を包含する、ヒトおよびマウス白血球に対する高い刺激効果を有する。これら天然のホスホジエステル主鎖ＣｐＧ ＯＤＮの免疫刺激効果は、ＣｐＧモチーフがメチル化されている、ＧｐＣに変化している、さもなければ除去または改変されている場合にその効果が劇的に低下するという点で、高度にＣｐＧ特異的である（Ｋｒｉｅｇ他、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｈａｒｔｍａｎｎ他、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３０５〜１０）。
初期の研究において、免疫刺激性ＣｐＧモチーフは、プリン−プリン−ＣｐＧ−ピリミジン−ピリミジンという式に従っていると考えられていた（Ｋｒｉｅｇ他、１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ、１９９６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２１〜４２３；Ｈａｃｋｅｒ他、１９９８ ＥＭＢＯ Ｊ．１７：６２３０〜６２４０；Ｌｉｐｆｏｒｄ他、１９９８ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：４９６〜５００）。しかしながら、現在、マウスリンパ球は、この「式」に従っていないホスホジエステルＣｐＧモチーフに対して十分に応答し（Ｙｉ他、１９９８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５８９８〜５９０６）、同様のことは、ヒトのＢ細胞および樹状細胞に当てはまることが明らかになっている（Ｈａｒｔｍａｎｎ他、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９３０５〜１０；Ｌｉａｎｇ、１９９６ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９〜１１２９）。
最近になって、ＣｐＧ核酸のいくつかの異なるクラスが記載されている。１つのクラスは、Ｂ細胞を活性化することについては強力であるが、ＩＦＮ−γを誘導することおよびＮＫ細胞活性化においては比較的弱く；このクラスは、Ｂクラスと名付けられている。ＢクラスＣｐＧ核酸は、典型的には、完全に安定化されており、特定の好ましい塩基コンテクスト内に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を参照されたい。ＣｐＧ核酸の別のクラスは、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−αを誘導し；このクラスは、Ｃクラスと名付けられている。ＣクラスＣｐＧ核酸は、最初に特徴付けられたように、典型的には、完全に安定化されており、Ｂクラス型配列およびＧＣリッチなパリンドロームまたはニヤーパリンドローム（ｎｅａｒ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｅ）を包含する。このクラスは、同時係属の、２００１年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／３１３，２７３号および２００２年８月１９日に出願されたＵＳ１０／２２４，５２３ならびに国際公開番号ＷＯ０３／０１５７１１として公開された関連するＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６４６８に記載されている。
本発明は、増強された免疫刺激能力を誘発する１つまたは複数の修飾を含むオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、少なくとも１つの親油性置換ヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドの特定のサブクラスが、免疫応答を媒介するのに極めて有効であるという知見に基づいている。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫応答を誘導するのに、ならびに癌およびウイルス感染などの疾患および障害を治療するのに治療的および予防的に有用である。
一態様において、本発明は、配列：Ｒ１ＹＺＲ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、親油性置換ヌクレオチド類似体（Ｌ）、ヌクレオチド、および結合を表し、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、親油性置換ヌクレオチド類似体（Ｌ）であり、Ｙは、ピリミジンヌクレオチドであり、Ｚは、プリン、ピリミジン、または脱塩基残基である）を含む組成物である。
一部の実施形態において、Ｌは、５または６員環核酸塩基類似体を含む。
本発明の態様の他の実施形態において、Ｌは、以下の要素を有する式Ｉ
Figure 0006006183
 の基であり、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、水素または置換基を有していてもよいＣ（炭素）またはＮ（窒素）であり、ｎは、０または１であり、点線は、任意選択の二重結合を示し、少なくとも１つの置換基は、オキソ、チオ、ヒドロキシ、メルカプト、イミノ、アミノ、メチルおよび水素からなる群から選択されず、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、およびＦ原子の合計は、３窒素（Ｎ）以下である。一部の場合に、ｎは、１であり、他の場合に、ｎは、０である。一部の実施形態において、すべての原子Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、Ｆは、炭素（Ｃ）である。一部の実施形態において、原子Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、Ｆのうちの１つ、２つまたは３つは、窒素（Ｎ）である。一部の実施形態によれば、原子Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、Ｆのうちの少なくとも１つは、以下の、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、シクロアルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｓ−アルキル、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ２−アルキル、ニトロ、シアノ、カルボキシルエステル、フェニル、チオフェニル、ベンジル、オキソ、チオ、ヒドロキシ、メルカプト、およびイミノのうちの１つにより置換されており、少なくとも１つの置換基は、オキソ、チオ、ヒドロキシ、メルカプト、イミノ、アミノまたはメチルではない。さらに他の実施形態によれば、２つの原子ＡまたはＥのうちの１つは、以下のＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ２〜Ｃ６−アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、シクロアルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｓ−アルキル、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ２−アルキル、ニトロ、シアノ、カルボキシルエステル、フェニル、チオフェニル、ベンジル、またはメチルのうちの１つにより置換されており、ただし、メチルの場合、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、すべてＣである。
一部の実施形態において、式Ｉは、置換されているピリミジン、ウラシル、トルエン、イミダゾールまたはピラゾールまたはトリアゾールを含む。他の実施形態によれば、式Ｉは、以下の、５−クロロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、５−エチル−ウラシル、５−プロピル−ウラシル、５−プロピニル（ｐｒｏｐｉｎｙｌ）−ウラシル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−ウラシル、および２．４−ジフルオロ−トルエンから選択される。本発明の一実施形態によれば、式Ｉは、３〜６員の芳香族または脂肪族環系と縮合している。他の実施形態によれば、式Ｉは、ペントースまたはヘキソースを包含する５〜６員糖部分に連結している。一部の場合に、ペントースは、フラノースであり、ヘキソースは、ピラノースであり、それらは、Ｆ、アミノ、アルコキシ、アルコキシ−エトキシ、アモニプロピル（ａｍｏｎｉｐｒｏｐｙｌ）、アルケニル、アルキニル、またはＯ２，Ｃ４−アルキレン橋により置換されていてもよい。他の場合に、フラノースは、リボースまたはデオキシリボースである。
本発明の一部の実施形態によれば、Ｒ１とＲ２は、共にＬである。一部の実施形態によれば、Ｒ１は、Ｌであり、Ｒ２は、ヌクレオチドである。あるいは、一部の場合に、オリゴヌクレオチドが構造５’Ｒ１ＣＧ３’を含むように、Ｒ１は、Ｌであり、Ｒ２は、結合である。他の実施形態は、オリゴヌクレオチドが構造５’Ｒ３Ｒ１ＹＺ３’を含むように、Ｒ１が、Ｌであり、Ｒ２が、結合であり、Ｒ３が、Ｒ１ＹＺの５’側にあるオリゴヌクレオチドを包含する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドが構造５’Ｒ１ＮＲ１ＹＺ３’を含むように、Ｒ１は、Ｌであり、Ｒ２は、結合であり、第二のＲ１は、１つのヌクレオチドＮを狭みＲ１ＹＺの５’側にある。一部の場合に、オリゴヌクレオチドは、２つの５’Ｒ１ＮＲ１ＹＺ３’モチーフを包含することがある。
一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、以下のピリミジン、すなわち、シトシン、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ハロゲノ−シトシン、２−チオ−シトシン、４−チオ−シトシン、Ｎ３−メチル−シトシン、Ｎ４−アルキル−シトシンまたは６−置換シトシンのうちの１つであるＹを包含する。
一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザ−ヒポキサンチン、２−アミノ−プリン、４−チオ−プリン、２．６−ジアミノプリン、８−オキソ−７．８−ジヒドログアニン、７−チア−８−オキソ−７．８−ジヒドログアニン、７−アリル−８−オキソ−７．８−ジヒドログアニン、７−デアザ−８−アザ−グアニン、８−アザ−グアニン、Ｎ１−メチル−グアニンまたはプリンを包含するプリンヌクレオチドであるＺを包含する。他の実施形態において、Ｚは、Ｔを包含するピリミジンヌクレオチドである。
本発明の一部の実施形態によれば、Ｒ２は、Ｌであり、Ｒ１は、ヌクレオチドである。
一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドの長さは、３〜１００ヌクレオチドであり、例えば、オリゴヌクレオチドの長さは、３〜６ヌクレオチド、３〜１００ヌクレオチド、または７〜１００ヌクレオチドである。一部の環境において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも８０％がＴであるように、Ｔリッチである。
本発明は、少なくとも１つのパリンドローム配列を含む実施形態を包含する。例えば、一部の場合に、オリゴヌクレオチドは、２つのパリンドローム配列を包含する。
本発明によれば、一部の実施形態は、１〜４個の非メチル化ＣＧジヌクレオチドを包含する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの（Ｇ）ｍ配列（式中、ｍは、４〜１０である）を包含することがある。一部の場合に、すべてまでとは言わないが、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドは、メチル化されていない。一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチド修飾をさらに含むことがある。非ヌクレオチド修飾は、Ｃ６〜Ｃ４８−ポリエチレングリコール、Ｃ３〜Ｃ２０−アルカン−ジオール、Ｃ３〜Ｃ１８−アルキルアミノリンカー、Ｃ３〜Ｃ１８−アルキルチオールリンカー、コレステロール、胆汁酸、飽和または不飽和脂肪酸、フォレート、ヘキサデシル−グリセロールまたはジヘキサデシル−グリセロール基、オクタデシル−グリセロールまたはジオクタデシル−グリセロール基、ビタミンＥ基を包含するが、これらに限定されるものではない。他の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドブランチャー部分またはヌクレオチドブランチャー部分をさらに含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが少なくとも２つの５’末端を有するブランチャー部分を包含する。
本発明によれば、一部の実施形態は、鏡像異性混合物か鏡像異性的に純粋なＳ−またはＲ−立体配置のどちらかとして、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ボラノホスホネート、ホスホルアミデート、またはデホスホ結合を包含する安定化された結合を有するオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２つのヌクレオチドを包含する。
さらに、一部の実施形態において、Ｒ１ＹＺＲ２のＹＺは、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合を有する。一部の場合に、Ｒ１ＹＺＲ２のＲ１Ｙおよび／またはＺＲ２は、ホスホロチオエート結合を有する。一部の実施形態において、すべての他のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有する。
本発明の一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、脂質担体を包含するマイクロキャリアを含まない。
本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、Ａクラスオリゴヌクレオチド、Ｂクラスオリゴヌクレオチド、Ｃクラスオリゴヌクレオチド、ＰクラスオリゴヌクレオチドまたはＴクラスオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明のＢクラスオリゴヌクレオチドの場合、一部の実施形態は、配列５’ＴＣＮ１ＴＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’（式中、Ｘ１は、ＧまたはＡであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ３は、ＴまたはＣであり、Ｘ４は、ＴまたはＣであり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎ１およびＮ２は、各々約０〜２５Ｎの核酸配列である）を包含する。
本発明の一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの３’−３’結合および／または少なくとも１つの５’−５’結合を含む。
別の態様において、本発明は、抗原または抗微生物薬などの他の治療用化合物と組み合わせた本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドの組成物である。抗微生物薬は、例えば、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、抗細菌薬または抗真菌薬であってもよい。
本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドを包含する持続放出装置の組成物は、本発明の別の態様に従って提供される。
組成物は、医薬担体を包含していてよく、かつ／または送達装置に製剤化されることがある。一部の実施形態において、送達装置は、陽イオン性脂質、細胞透過性タンパク質、および持続放出装置からなる群から選択される。一実施形態において、持続放出装置は、生分解性ポリマーまたは微小粒子である。
本発明の別の態様によれば、免疫応答を刺激する方法が提供される。方法は、対象において免疫応答を誘導するのに有効な量で対象にオリゴヌクレオチドを投与するものである。オリゴヌクレオチドは、経口的に、局所的に、持続放出装置で、粘膜に、全身的に、非経口的に、または筋肉内に投与されることが好ましい。オリゴヌクレオチドが粘膜表面に投与される場合、オリゴヌクレオチドは、粘膜免疫応答または全身免疫応答を誘導するのに有効な量で送達されることがある。好ましい実施形態において、粘膜表面は、口腔、鼻腔、直腸、膣、および眼の表面からなる群から選択される。
一部の実施形態において、方法は、免疫応答が抗原特異的免疫応答である、対象を抗原に曝露することを包含する。一部の実施形態において、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原およびペプチド抗原からなる群から選択される。
オリゴヌクレオチドは、癌を有する対象または癌を発症する危険性がある対象において癌を治療する（例えば、癌を発症する危険性を軽減する）のに有用である。癌は、胆道癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛癌、大腸癌、子宮内膜癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、甲状腺癌、および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫からなる群から選択することができる。一部の重要な実施形態において、癌は、骨癌、脳腫瘍およびＣＮＳ癌、結合組織癌、食道癌、眼癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、口腔癌、皮膚癌、ならびに精巣癌からなる群から選択される。
オリゴヌクレオチドは、場合により、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが抗癌療法と併せて投与される場合、癌療法（例えば、抗癌療法）に対する癌細胞の応答性を高めるために使用されることもある。抗癌療法は、化学療法、ワクチン（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初回刺激を受けた樹状細胞ワクチンまたは癌抗原ワクチン）または抗体ベースの療法であってもよい。この後者の療法は、免疫応答が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらす、例えば、癌細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体を投与するものであってもよい。一実施形態において、抗体は、リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、ハーセプチン、クアドラメット、パノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＳＭＡＲＴ Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、オバレックス（Ｏｖａｒｅｘ）、ベクサー、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、ゼナパックス、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、プレターゲット（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ）、ノボＭＡｂ（ＮｏｖｏＭＡｂ）−Ｇ２、ＴＮＴ、グリオマブ（Ｇｌｉｏｍａｂ）−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、リンフォサイド（ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ）、ＣＭＡ６７６、モノファーム（Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ）−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ １Ｄ１０Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ＡＢＬ３６４ＡｂおよびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡからなる群から選択することができる。
したがって、本発明の一部の態様によれば、癌を有するまたは癌を有する危険性がある対象は、オリゴヌクレオチドおよび抗癌療法を投与される。一部の実施形態において、抗癌療法は、化学療法薬、免疫療法薬および癌ワクチンからなる群から選択される。
他の態様における本発明は、対象において疾患を予防するための方法に関する。方法は、対象において疾患を予防するための免疫系応答性を促進するために、定期的にオリゴヌクレオチドを対象に投与するものである。本発明の予防的方法を用いて予防しようとする疾患または状態の例は、微生物感染（例えば、性感染疾患）および食物アレルギー由来のアナフィラキシーショックを包含する。
他の態様において、本発明は、先天性免疫応答を活性化するのに有効な量でオリゴヌクレオチドを対象に投与することにより先天性免疫応答を誘導するための方法である。
本発明の別の態様によれば、ウイルスまたはレトロウイルス感染を治療するための方法が提供される。方法は、ウイルスまたはレトロウイルス感染を有するか、またはウイルスもしくはレトロウイルス感染を有する危険性がある対象に、ウイルスまたはレトロウイルス感染を治療するのに有効な量の本発明の組成物のいずれかを投与するものである。一部の実施形態において、ウイルスは、肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスにより引き起こされる。
本発明の別の態様によれば、細菌感染を治療するための方法が提供される。方法は、細菌感染を有するか、または細菌感染を有する危険性がある対象に、細菌感染を治療するのに有効な量の本発明の組成物のいずれかを投与するものである。一実施形態において、細菌感染は、細胞内細菌が原因である。
別の態様において、本発明は、寄生虫感染を有するか、または寄生虫感染を有する危険性がある対象に、寄生虫感染を治療するのに有効な量の本発明の組成物のいずれかを投与することにより寄生虫感染を治療するための方法である。一実施形態において、寄生虫感染は、細胞内寄生虫が原因である。別の態様において、寄生虫感染は、非蠕虫（ｎｏｎ−ｈｅｌｍｉｎｔｈｉｃ）寄生虫が原因である。
一部の実施形態において、対象は、ヒトであり、他の実施形態において、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、シチメンチョウ、ヤギ、魚、サル、ニワトリ、ラット、マウス、およびヒツジからなる群から選択される非ヒト脊椎動物である。
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患を有する危険性がある対象に、自己免疫疾患を治療または予防するのに有効な量の本発明の組成物のいずれかを投与することにより自己免疫疾患を治療するための方法に関する。
本発明は、一部の態様において、対象において気道リモデリング、喘息またはアレルギーを治療するのに有効な量で、本発明の組成物のいずれかを対象に投与することを含む気道リモデリング、喘息またはアレルギーを治療するための方法である。一実施形態において、対象は、喘息、慢性閉塞性肺疾患を有するか、または喫煙者である。他の実施形態において、対象は、喘息の症状がない。
本発明の態様として、免疫応答を刺激するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用も提供される。
免疫応答を刺激するための本発明のオリゴヌクレオチドの医薬品を製造するための方法も提供される。
本発明の制限の各々は、本発明の様々な実施形態を包含することがある。したがって、いずれか１つの要素または要素の組合せが関わる本発明の制限の各々は、本発明の各態様に包含されることがあると予測される。本発明は、その用途において、以下の説明に記載されているか、または図面に例示されている構築の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施するか、または行うことが可能である。また、本明細書において使用される言い回しおよび用語は、説明のためであり、制限していると見なされるべきではない。本明細書において、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関わる（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびそれらの変形形態の使用は、その後に列挙される項目およびそれらの均等物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。
本発明の修飾塩基の構造を例示する２つの図面である。図１ａは、ＣｐＧ六量体モチーフ（ＧＴＣＧＴＴ）のあるセクションを示している。図１ｂは、組み入れられた２’−デオキシチミジンの疎水性形類似体：２，４−ジフルオロトルエン（ＦＦ）、５−ブロモウリジン（ＢＵ）および５−ヨードウリジン（ＪＵ）を示している。 チミン形類似体２，４−ジフルオロトルエン（ＦＦ）で修飾されたＢクラスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）についてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＦＦ修飾ＯＤＮ（配列番号３〜９）の活性を、非修飾Ｂクラス親配列（配列番号１）、完全ＰＳ親配列（配列番号２）、および第三の非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量のＯＤＮで刺激し、ＮＦ−κＢ刺激を、１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより決定した。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＢクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。チミジン（Ｔ）を、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＵ）（配列番号１０〜１２）および５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＪＵ）（配列番号１３〜１５）で置換した。それらの活性を、非修飾Ｂクラス親配列（配列番号１）、完全ＰＳ親配列（配列番号２）、および第三の非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量のＯＤＮで刺激し、ＮＦ−κＢ刺激を、１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより決定した。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＢクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。２’−デオキシチミジン（Ｔ）を、２’−デオキシウリジン（Ｕ）（配列番号１６〜１８）で置換した。Ｕ修飾ＯＤＮの活性を、非修飾Ｂクラス親配列（配列番号１）、完全ＰＳ親配列（配列番号２）、および第三の非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量のＯＤＮで刺激し、ＮＦ−κＢ刺激を、１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより決定した。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＢクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイおよびＰＢＭＣアッセイの結果を示す２つのグラフである。５−エチル−２’−デオキシウリジン（ＥＵ）（配列番号４２）、２’−デオキシウリジン（Ｕ）（配列番号１６）、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＪＵ）（配列番号１３）、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＵ）（配列番号１０）、および５−クロロ−２’−デオキシウリジン（ＣＵ）（配列番号４１）を有するＯＤＮの相対活性を、親配列（配列番号１）の活性と比較した。図５ａは、ＴＬＲ９活性を示し、図５ｂは、ＩＦＮ−α産生を示している。３名のドナーの平均＋／−ＳＥＭを示す。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数（図５ａ）またはＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）（図５ｂ）である。 ＥＵ修飾ＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＥＵ修飾ＯＤＮ配列番号２９、３０、および４２の活性を、親配列（配列番号１）および別の非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）の活性と比較した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＢクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＪＵ修飾配列番号１９〜２４の活性を、親配列配列番号３７の活性と比較した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＡクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイおよびＰＢＭＣアッセイの結果を示す２つのグラフである。ＪＵ修飾配列番号３５〜３７の活性を、非修飾親配列（配列番号４３）および非修飾ＢクラスＯＤＮ配列番号１の活性と比較した。図８ａは、ＴＬＲ９活性を示し、図８ｂは、ＩＦＮ−α産生を示している。３名のドナーの平均＋／−ＳＥＭを示す。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）（図８ａ）またはＯＤＮ濃度（μＭ）（図８ｂ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数（図８ａ）またはＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）（図８ｂ）である。 修飾ＣクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＪＵ修飾ＣクラスＯＤＮ配列番号２７〜２８および４４〜４５の活性を、非修飾親配列配列番号４５および非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）の活性と比較した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＰクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＪＵ修飾配列番号３１〜３３の活性を、非修飾親配列（配列番号５２）の活性と比較した。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 修飾ＴクラスＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＪＵ修飾配列番号４７〜５０およびＵ修飾配列番号５１の活性を、非修飾親配列配列番号２５の活性と比較した。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 短いＯＤＮについてのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＪＵ修飾された短いＯＤＮ配列番号３９〜４０の活性を、非修飾親配列配列番号３８およびＢクラスＯＤＮ配列番号３７の活性と比較した。ＯＤＮは、ＤＯＴＡＰと共に、およびＤＯＴＡＰなしに製剤化した。ｘ軸は、ｌｏｇＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 ＢＡＬＢ／ｃマウス膵細胞を様々なＯＤＮと共に培養した膵細胞培養上清中のサイトカイン濃度を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す４つのグラフである。培養上清は、６時間目（ＴＮＦ−αの場合）または２４時間目（ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の場合）に収集した。ＪＵ修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号１３）、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）、非ＣｐＧ陰性対照ＯＤＮ（配列番号２６）の活性を比較した。図１３ａ〜ｄは、それぞれＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２濃度を示している。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μｇ／ｍｌ）であり、ｙ軸は、サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 Ｂ細胞増殖のＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。ＣＦＳＥ染色ＢＡＬＢ／ｃマウス膵細胞（４×１０５／ウェル）を、ＯＤＮ０．００１、０．０１、０．１、０．３、１、３または１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした。インキュベーションの７２時間後に、細胞を、ＣＤ１９について染色し、Ｂ細胞増殖を、ＦＡＣＳと、続くＭｏｄＦｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅによる解析により決定した。ＪＵ修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号１３）、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）、および非ＣｐＧ陰性対照ＯＤＮ（配列番号２６）の活性を比較した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μｇ／ｍｌ）であり、ｙ軸は、相対Ｂ細胞増殖である。 ＥＬＩＳＡにより測定されるようなｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生を示す２つのグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹）に、ＯＤＮ１０、５０または１００μｇを皮下注射した。対照群には、ＰＢＳ１００μｌを単独で与えた。動物を、注射の１時間後（ＴＮＦ−αの場合）または３時間後（ＩＰ−１０の場合）に心臓穿刺により放血させ、血漿を、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−αおよびＩＰ−１０についてアッセイした。ＪＵ修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号１３）および非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３７）の活性を比較した。図１５ａは、ＴＮＦ−α濃度を示し、図１５ｂは、ＩＰ−１０濃度を示している。ｘ軸は、ＯＤＮ投与量（μｇ）であり、ｙ軸は、サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親配列（配列番号１）中のチミジンの代わりにユニバーサル塩基（６−ニトロベンズイミダゾール）を有するＢクラスＯＤＮ（配列番号１７８）によるＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親配列（配列番号１）中のチミジンの代わりに５−（２−ブロモビニル）−ウリジンを有するＢクラスＯＤＮ（配列番号１５３および１５４）によるＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体の他に糖修飾（２’−Ｏ−メチルグアノシン）を有するＢクラスＯＤＮ（配列番号１１１〜１１３）によるＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。これらのＯＤＮの活性を、親配列（配列番号１）および親油性置換ヌクレオチド類似体のみを有する同一配列（配列番号１３）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 複数の５’接近可能末端を有する分岐ＢクラスＯＤＮによるＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。分岐ＯＤＮ（配列番号９６、９７、１０１、および１０２）の活性を、配列番号１の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 短い非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３８）ならびに親油性置換ヌクレオチド類似体および親油性３’タグを有する同一配列のＯＤＮ（配列番号１２６）によるＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。両方とも、ＤＯＴＡＰと共に、およびＤＯＴＡＰなしに製剤化した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親配列（配列番号１）のチミンの代わりに５−プロイニル（ｐｒｏｙｎｙｌ）−ｄＵを有する２つのＢクラスＯＤＮ（配列番号１１６および１１７）によるＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体の他に第二のヌクレオチド類似体を有するＢクラスＯＤＮ（配列番号１３８、７−デアザ−ｄＧ；配列番号１３９、イノシン；配列番号１４０、５−メチル−ｄＣ）によるｈＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。これらのＯＤＮの活性を、親配列（配列番号１）および親油性置換ヌクレオチド類似体のみを有する同一配列（配列番号１３）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＴクラスＯＤＮ（配列番号１３２〜１３４）によるｈＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。これらの活性を、免疫刺激性ＣクラスＯＤＮ（配列番号１９８）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号５８〜６３）によるｈＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示す２つのグラフである。図２４ａは、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）の活性と比較した配列番号５８〜６１の活性を示している。図２４ｂは、同一の陽性対照および陰性対照の活性と比較した配列番号６２〜６３の活性を示している。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号６４、６６〜６７）によるｈＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化を示すグラフである。これらの活性を、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）、ＣクラスＯＤＮ（配列番号６８）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５７）の活性と比較した。ｈＴＬＲ９−ＬＵＣ−２９３細胞を、指示量の核酸と共にインキュベートし、ＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼ活性を測定することにより１６時間後に決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）の対数であり、ｙ軸は、相対刺激指数である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号５８〜６３）によるＩＦＮ−αの誘導を示す２つのグラフである。図２６ａは、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）の活性と比較した配列番号５８〜６１の活性を示している。図２６ｂは、同一の陽性対照および陰性対照の活性と比較した配列番号６２〜６３の活性を示している。ヒトＰＢＭＣを、４８時間にわたって指示されたＯＤＮと共にインキュベートした。次いで、ＩＦＮ−αを、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清中で決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号６４、６６〜６７）によるＩＦＮ−αの誘導を示すグラフである。これらの活性を、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）、ＣクラスＯＤＮ（配列番号６８）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５７）の活性と比較する。ヒトＰＢＭＣを、４８時間にわたって指示されたＯＤＮと共にインキュベートした。次いで、ＩＦＮ−αを、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清中で決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６２、図２８ａ）（配列番号６４および６７、図２８ｂ）によるＩＬ−６誘導を示す２つのグラフである。活性を、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号５５）、および非修飾ＣクラスＯＤＮ（配列番号５４）、陰性対照ＯＤＮ（配列番号５３）、および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）の活性と比較した。３名のドナー由来のＰＢＭＣを、２４時間にわたってＯＤＮと共にインキュベートし、上清を、ルミネックスにより分析した。平均＋／−ＳＥＭを示す。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスクラスＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６２、図２９ａ）（配列番号６４および６７、図２９ｂ）による処理後のＢ細胞増殖を示す２つのグラフである。活性を、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号５５）、非修飾ＣクラスＯＤＮ（配列番号５４）、陰性対照ＯＤＮ（配列番号５３）、非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）、ＬＰＳ、Ｒ−８４８、ＳＥＢ、およびポリ［Ｉ］：［Ｃ］ＯＤＮの活性と比較した。３名のドナー由来のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、５日にわたってＯＤＮと共にインキュベートし、次いで、ＣＤ１９抗体で染色した。ＣＦＳＥ染色が減少したＢ細胞の割合を決定した。ｘ軸は、ＯＤＮ濃度（μＭ）であり、ｙ軸は、分裂後に染色が減少したＢ細胞の％である。 親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６２、６４および６７）によるマウスＩＦＮ−αの誘導を示すグラフである。これらの活性を、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）および陰性対照（配列番号２６）の活性と比較する。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹）に、様々な投与量のＯＤＮを皮下注射した。動物を、注射の３時間後に放血させ、血漿を、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−αについて試験した。ｘ軸は、ＯＤＮ投与量（μｇ）であり、ｙ軸は、ＩＦＮ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）である。 マウスＳＡ１Ｎ腫瘍モデルにおける腫瘍体積に対するＯＤＮの効果を示す２つのグラフである。雌性Ａ／Ｊマウス（１群当たり１０匹）に、０日目に５×１０５ＳａＩ／Ｎ腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、腫瘍誘導後８日目に開始し、週に１回、皮下で与える３５μｇ（図３１ａ）または１００μｇ（図３１ｂ）の親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号６０、６４および６７）、非修飾ＣクラスＯＤＮ、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号５５）、またはＰＢＳ単独で処置した。動物を、生存および腫瘍体積についてモニターした。腫瘍サイズ（長さおよび幅）を、デジタルノギスを用いて測定した。腫瘍体積を、式：腫瘍体積＝（０．４）（ａｂ２）（ここで、ａは、長径であり、ｂは、短径である）を用いることにより計算した。ｘ軸は、腫瘍誘導後の日数を示し、ｙ軸は、腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。
本発明は、部分的に、増強された免疫刺激能力を示すＣｐＧオリゴヌクレオチドに基づいている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、例えば、トール様受容体９（ＴＬＲ９）との相互作用を介して免疫系を刺激することが知られている。ＴＬＲ９の刺激は、Ｔｈ１偏向免疫応答の刺激、ＮＫ細胞活性化およびＢ細胞活性化を包含する多くの効果を有する。本発明は、一部の態様において、それらのＴＬＲ９との相互作用に影響を及ぼす変化した構造を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドの同定に関する。ＣｐＧモチーフの外側に親油性置換ヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドが、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）産生を刺激し、ＴＬＲ９活性化を誘導する増強された能力を有することが本発明者らにより発見された。この効果は、試験した免疫刺激性オリゴヌクレオチドのすべてのクラスにおいて観察されている。増強された刺激能力を有するこれらの修飾オリゴヌクレオチドは、Ｅクラスオリゴヌクレオチドと名付けられている。
本発明のＥクラス修飾オリゴヌクレオチドは、一部の場合に、増強された免疫応答を誘導する能力を有する。免疫応答の誘導とは、免疫細胞の数または活性の任意の増加、またはサイトカインなどの免疫因子の発現または絶対レベルの増加を指す。免疫細胞は、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージおよび他の抗原提示細胞を包含するが、これらに限定されるものではない。サイトカインは、インターロイキン、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、βおよびγ、Ｆｌｔリガンド、および共刺激分子を包含するが、これらに限定されるものではない。
非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドが、トール様受容体９（ＴＬＲ９）経路を介して免疫応答を刺激することができることは知られている。多くのサイトカインの誘導は、ＴＬＲ９活性化と相関している。したがって、ＴＬＲ９刺激が増加するにつれて誘導が増加する。しかしながら、一般的に、ＣｐＧ ＯＤＮについてＴＬＲ９とＩＦＮ−α誘導の間には逆相関が存在する。本発明の修飾の一部は、ＴＬＲ活性化とＩＦＮ−αの間の逆相関ではなく、より直接的な相関が観察されるような修飾シグナル伝達パターンを生み出すことがあることが発見された。
本発明者らは、ＣｐＧモチーフと取り囲む領域中の親油性残基の影響について検討することを目指した。以下の実施例に記載されているように、２，４−ジフルオロトルエン、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシルなどの親油性置換ヌクレオチド類似体のいくつかの異なるタイプを、ＣｐＧモチーフの５’側か３’側のどちらかでＣｐＧオリゴヌクレオチド中に組み入れた。予想外に、これらの親油性置換ヌクレオチド類似体の組入れは、ヒトＰＢＭＣにおけるｈＴＬＲ９活性ならびにＩＦＮ−α誘導の異常に強い増加につながった。ウラシル残基（チミンと構造的に類似しているが、メチル基を欠く）などの非親油性ヌクレオチドによる置換は、ｈＴＬＲ９刺激の強い減少を生じた。試験したオリゴヌクレオチドにおいて、ＴＬＲ９刺激の増加は、親油性置換ヌクレオチド類似体が、モチーフの３’側に位置している場合よりも、ＣｐＧモチーフの５’側に位置している場合により良好であるように見えた。二重置換（すなわち、５’および３’親油性置換ヌクレオチド類似体置換）は、試験した置換のうちで最も強力な刺激をもたらした。対照的に、ＣｐＧモチーフにおける２，４−ジフルオロトルエンによるグアニンまたはシトシンの置換は、両方の場合に、ＴＬＲ９刺激指数の強い減少につながった。
親油性置換ヌクレオチド類似体修飾は、ＩＦＮ−α誘導の強い増強をもたらした。特に、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル修飾ＯＤＮの場合、ＴＬＲ９刺激とＩＦＮ−α誘導の間の良好な相関があるように見えた。上述のように、この知見は、（ｉ）親分子２１３１７が、ＩＦＮ−αを誘導するのに事実上不活性であり、（ｉｉ）普通は、これらの修飾を含有しないＣｐＧ ＯＤＮについてＴＬＲ９とＩＦＮ−α誘導の間に逆相関が存在することから、予想外であった。
本発明の一部の態様において、オリゴヌクレオチドは、配列Ｒ１ＹＺＲ２を有する。オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のそのようなモチーフを包含することがある。Ｒ１およびＲ２は、独立して、親油性置換ヌクレオチド類似体（Ｌ）、ヌクレオチド、または結合のうちのいずれか１つである。しかしながら、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、親油性置換ヌクレオチド類似体（Ｌ）であることが好ましい。一部の場合に、Ｒ１とＲ２は、共にＬである。以下の実施例の項に示すように、ＣｐＧモチーフの５’側と３’側の両方にＬを有するオリゴヌクレオチドは、特に刺激性である。しかしながら、１つのみのＲがＬであることがある。例えば、Ｒ１がＬであってよく、Ｒ２がヌクレオチドであり、逆もまた同様である。あるいは、オリゴヌクレオチドが構造５’Ｒ１ＣＧ３’を含むように、Ｒ１がＬであってもよく、Ｒ２が結合であってもよい。
一部の場合に、オリゴヌクレオチドは、配列Ｒ１Ｎ１ＹＺＮ２Ｒ２（式中、Ｎ１およびＮ２は、長さが０〜３ヌクレオチドのヌクレオチドである）を有する。他の可能な変形形態は、５’Ｒ１Ｎ１Ｒ１ＹＺＮ２３’、５’Ｒ３Ｒ１ＹＺ３およびＲ１ＺＮ２Ｒ２などの構造を包含する。
Ｙは、ピリミジンヌクレオチドである。Ｚは、プリン、ピリミジン、または脱塩基残基である。一部の実施形態において、Ｚは、プリンであることが好ましい。
Ｌは、例えば、５または６員環核酸塩基類似体であってもよい親油性置換ヌクレオチド類似体である。５または６員環核酸塩基類似体の例を以下の式Ｉの基に示す。
Figure 0006006183
Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、水素または例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アルケニル、シクロアルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｓ−アルキル、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ２−アルキル、ニトロ、シアノ、カルボキシルエステル、フェニル、チオフェニル、ベンジル、オキソ、チオ、ヒドロキシ、メルカプト、およびイミノなどであるがこれらに限定されない置換基を有していてもよいＣ（炭素）またはＮ（窒素）のうちのいずれか１つである。一部の場合に、少なくとも１つの置換基は、オキソ、チオ、ヒドロキシ、メルカプト、イミノ、アミノまたはメチルではない。ｎは、０または１である。点線は、任意選択の二重結合を示す。しかしながら、少なくとも１つの置換基は、オキソ、チオ、ヒドロキシ、メルカプト、イミノ、アミノ、メチルおよび水素からなる群から選択されることはない。さらに、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、およびＦ原子の合計は、３窒素（Ｎ）以下である。一部の実施形態において、すべての原子Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、Ｆは、炭素（Ｃ）である。あるいは、原子Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｄ、Ｅ、Ｆのうちの少なくとも１つ、２つまたは３つは、窒素（Ｎ）である。
式の化合物は、例えば、以下の親油性置換ヌクレオチド類似体：置換ピリミジン、置換ウラシル、置換トルエン、置換イミダゾールまたは置換ピラゾール、置換トリアゾール、５−クロロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、５−エチル−ウラシル、５−プロピル−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−ウラシル、または２．４−ジフルオロ−トルエンのうちのいずれかであってもよい。
親油性置換ヌクレオチド類似体は、別々であるか、または別の化合物と縮合していてもよい。例えば、親油性置換ヌクレオチド類似体は、３〜６員の芳香族または脂肪族環系と縮合していてもよい。親油性置換ヌクレオチド類似体は、例えば、ペントースまたはヘキソースなどの５〜６員糖部分に連結していてもよい。ペントースの例は、リボースまたはデオキシリボースなどのフラノースであり、ヘキソースの例は、ピラノースである。ペントースまたはヘキソースは、Ｆ、アミノ、アルコキシ、アルコキシ−エトキシ、アモニプロピル、アルケニル、アルキニル、またはＯ２，Ｃ４−アルキレン橋により置換されていてもよい。
オリゴヌクレオチドは、Ｃ６〜Ｃ４８−ポリエチレングリコール、Ｃ３〜Ｃ２０−アルカン−ジオール、Ｃ３〜Ｃ１８−アルキルアミノリンカー、Ｃ３〜Ｃ１８−アルキルチオールリンカー、コレステロール、胆汁酸、飽和または不飽和脂肪酸、フォレート、ヘキサデシル−グリセロール、ジヘキサデシル−グリセロール基、オクタデシル−グリセロールもしくはジオクタデシル−グリセロール基またはビタミンＥ基などの非ヌクレオチド修飾を包含することもある。
親油性置換ヌクレオチド類似体は、任意の免疫刺激性オリゴヌクレオチド中に組み入れることができる。本発明の一部の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、「ＣｐＧジヌクレオチド」である免疫刺激性モチーフを包含する。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていてもメチル化されていなくてもよい。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激性核酸は、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、非メチル化５’シチジンの後に３’グアノシンが続き、ホスフェート結合により連結している）を含有し、免疫系を活性化する核酸分子であり、そのような免疫刺激性核酸は、ＣｐＧ核酸である。ＣｐＧ核酸は、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を包含する多くの交付済み特許、公開済み特許出願、および他の刊行物に記載されている。少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激性核酸は、メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化５’シチジンの後に３’グアノシンが続き、ホスフェート結合により連結している）を含有し、免疫系を活性化する核酸である。他の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドを含まない。ＣｐＧジヌクレオチドを含まないこれらのオリゴヌクレオチドは、非ＣｐＧオリゴヌクレオチドと呼ばれ、それらは、非ＣｐＧ免疫刺激性モチーフを有する。これらは、少なくとも８０％のＴを有するＯＤＮなどのＴリッチＯＤＮであることが好ましい。
本発明のＥクラスＯＤＮは、それらが、ＹＧＺモチーフの５’および／または３’に親油性置換ヌクレオチド類似体を包含する限りは、Ａクラス、Ｂクラス、Ｃクラス、ＴクラスおよびＰクラスなどの他のＣｐＧ ＯＤＮクラスのモチーフおよび特性を包含することがある。
「Ａクラス」ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、両方とも２０００年９月２７日に出願された米国非仮特許出願第０９／６７２，１２６号および公開済みＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）に記載されている。これらの核酸は、Ｂ細胞活性化に対して最小限の効果を有する一方で、高レベルのインターフェロン−αを誘導する能力を特徴とする。ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Ｙａｍａｍｏｔｏおよび同僚により記載されている六量体パリンドロームＧＡＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＣＴ、またはＡＡＣＧＴＴを必ずしも含有しているわけではない。Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：４０７２〜６（１９９２）。
Ａクラス免疫刺激性核酸の例示的配列は、両方とも２０００年９月２７日に出願された米国非仮特許出願第０９／６７２，１２６号および公開済みＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）に記載されている。
「Ｂクラス」ＯＤＮは、Ｂ細胞を活性化するのには強力であるが、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞活性化を誘導するのには比較的弱い。ＢクラスＣｐＧ核酸は、典型的には、完全に安定化されており、特定の好ましい塩基コンテクスト内に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を参照されたい。別のクラスは、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞活性化を誘導するのには強力であるが、Ｂ細胞を刺激するのには比較的弱く、このクラスは、「Ａクラス」と名付けられている。ＡクラスＣｐＧ核酸は、典型的には、５’および３’末端に安定化されたポリ−Ｇ配列および少なくとも６ヌクレオチドのパリンドローム型ホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチド含有配列を有する。例えば、公開済み特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６５２７を参照されたい。
ＣｐＧ核酸のさらに別のクラスは、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−αを誘導し、このクラスは、Ｃクラスと名付けられている。「Ｃクラス」免疫刺激性核酸は、少なくとも２つの別個のモチーフを含有し、免疫系の細胞に対して独特で望ましい刺激効果を有する。これらのＯＤＮの一部は、従来の「刺激性」ＣｐＧ配列と「ＧＣリッチ」または「Ｂ細胞中和」モチーフの両方を有する。これらの組合せモチーフ核酸は、Ｂ細胞活性化および樹状細胞（ＤＣ）活性化の強い誘導剤である従来の「クラスＢ」ＣｐＧ ＯＤＮに関係する効果と、ＩＦＮ−αおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化の強い誘導剤であるがＢ細胞およびＤＣ活性化の比較的不十分な誘導剤である免疫刺激性核酸の最近記載されたクラス（「クラスＡ」ＣｐＧ ＯＤＮ）に関係する効果の中間に位置する免疫刺激効果を有する。Ｋｒｉｅｇ ＡＭ他（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜９；Ｂａｌｌａｓ ＺＫ他（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：１８４０〜５；Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ他（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：４０７２〜６。好ましいクラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮは、ホスホロチオエート主鎖を有することが多く、好ましいクラスＡ ＣｐＧ ＯＤＮは、混合型またはキメラの主鎖を有するが、組合せモチーフ免疫刺激性核酸のＣクラスは、安定化された、例えば、ホスホロチオエート、キメラ、またはホスホジエステル主鎖のどれかを有することがあり、一部の好ましい実施形態において、それらは、セミソフト主鎖を有する。このクラスは、２００２年８月１９に出願された米国特許出願ＵＳ１０／２２４，５２３に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
「Ｐクラス」免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン、２つの二重鎖形成領域ならびに任意選択のスペーサーおよび３’尾部を包含するいくつかのドメインを有する。このクラスのオリゴヌクレオチドは、一部の場合に、Ｃクラスに比べてかなり高レベルのＩＦＮ−α分泌を誘導する能力を有する。Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏのどちらかで自発的にコンカテマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｓ）に自己組織化する能力を有する。これらの分子の作用方法についていかなる特定の理論にも束縛されるわけではないが、１つの可能性のある仮説は、この特性が、Ｐクラスオリゴヌクレオチドに、特定の免疫細胞内でＴＬＲ９をより高度に架橋させる能力を与え、前に記載されたクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドに比較して別個のパターンの免疫活性化を誘導するということである。ＴＬＲ９受容体の架橋は、形質細胞様樹状細胞におけるＩ型ＩＦＮＲフィードバックループを介して、より強力なＩＦＮ−α分泌の活性化を誘導することがある。Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、少なくとも、米国出願第１１／７０６，５６１号に記載されている。
「Ｔクラス」オリゴヌクレオチドは、Ｂクラスオリゴヌクレオチドに類似したレベルのＩＬ−１０を誘導する能力を保持しながら、本発明のＯＤＮにおけるように修飾されていない場合にはＩＦＮ−α、ならびにＩＦＮ関連のサイトカインおよびケモカインの、ＢクラスまたはＣクラスオリゴヌクレオチドよりも低レベルの分泌を誘導する。Ｔクラスオリゴヌクレオチドは、少なくとも、米国特許出願第１１／０９９，６８３号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
一実施形態において、本発明の免疫刺激性ＯＤＮは、陽イオン性脂質と有利に組み合わせられる。一実施形態において、陽イオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−サルフェート）である。ＤＯＴＡＰの代わりにまたはＤＯＴＡＰの他に、エンドソームコンパートメントへの輸送を包含する類似の特性を有する他の薬剤を使用することができる。他の脂質製剤は、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（特殊なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム脂質）およびＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（商標）（新規な作用型デンドリマー技術）として包含する。リポソームは、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから、例えば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）などの陽イオン性脂質からなるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）として市販されている。リポソームを製造するための方法は、当技術分野においてよく知られており、多くの刊行物に記載されている。リポソームは、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：２３５〜２４１によっても概説されている。
他の実施形態において、免疫刺激性ＯＤＮは、陽イオン性リポソーム中で製剤化されない。ＯＤＮ内の修飾類似体の親油性のため、長さが３ヌクレオチドなどの短いＯＤＮでさえ、ｉｎ ｖｉｖｏで効率的に機能するための製剤化を必要としないことがある。
一実施形態において、本発明の免疫刺激性ＯＤＮは、１次構造と２次構造の両方に関して共有結合で閉じられたダンベル型分子の形態である。一実施形態において、そのような環状オリゴリボヌクレオチドは、介在する二本鎖セグメントにより連結された２つの一本鎖ループを包含する。一実施形態において、少なくとも１つの一本鎖ループは、本発明の免疫刺激性ＤＮＡモチーフを包含する。本発明の他の共有結合で閉じられたダンベル型分子は、例えば、二本鎖セグメントが少なくとも部分的にＤＮＡであるキメラＤＮＡ：ＲＮＡ分子（例えば、ホモ二量体ｄｓＤＮＡかヘテロ二量体ＤＮＡ：ＲＮＡのどちらか）を包含し、少なくとも１つの一本鎖ループは、本発明の免疫刺激性ＤＮＡモチーフを包含する。あるいは、キメラ分子の二本鎖セグメントは、ＤＮＡである。
特定の実施形態において、免疫刺激性ＯＤＮは、単離される。単離された分子は、実質的に純粋であり、その分子の意図する使用にとって実用的かつ適切な程度まで、天然もしくはｉｎ ｖｉｖｏ系において普通に見いだされる他の物質を含まない分子である。特に、免疫刺激性ＯＤＮは、十分に純粋であり、例えば、医薬調製物を製造するのに有用であるように、細胞の他の生物学的構成物質が十分に除かれている。本発明の単離された免疫刺激性ＯＤＮは、医薬調製物中で薬学的に許容できる担体と混合されることがあるため、免疫刺激性ＯＤＮは、調製物のわずかな重量百分率のみを占めることがある。しかしながら、免疫刺激性ＯＤＮは、生命系において関係する物質から実質的に分離されているという点で、実質的に純粋である。
免疫刺激性核酸分子は、キメラ主鎖を有する。本発明の目的のために、キメラ主鎖とは、少なくとも１つのインターヌクレオチド結合が、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、少なくとも１つの他のインターヌクレオチド結合が、安定化されたインターヌクレオチド結合であり、少なくとも１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様結合と少なくとも１つの安定化された結合が異なっている、部分的に安定化された主鎖を指す。ボラノホスホネート結合は、ホスホジエステル結合に比べて安定化されていると報告されていることから、主鎖のキメラ性の目的のために、ボラノホスホネート結合は、状況に応じて、ホスホジエステル様か安定化されているかのどちらかとして分類することができる。例えば、本発明によるキメラ主鎖は、一実施形態において、少なくとも１つのホスホジエステル（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）結合および少なくとも１つのボラノホスホネート（安定化された）結合を包含する可能性がある。別の実施形態において、本発明によるキメラ主鎖は、ボラノホスホネート（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）およびホスホロチオエート（安定化された）結合を包含する可能性がある。「安定化されたインターヌクレオチド結合」とは、ホスホジエステルインターヌクレオチド結合と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ分解（例えば、エキソ−またはエンド−ヌクレアーゼを介して）に対して比較的抵抗性であるインターヌクレオチド結合を意味するものとする。好ましい安定化されたインターヌクレオチド結合は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、およびメチルホスホロチオエートを包含するが、これらに限定されるものではない。他の安定化されたインターヌクレオチド結合は、ペプチド、アルキル、デホスホ、および上記に記載されているような他のものを包含するが、これらに限定されるものではない。
ホスホロチオエートなどの修飾主鎖は、ホスホルアミデート化学反応かＨ−ホスホネート化学反応のどちらかを用いる自動化技法を用いて合成することができる。アリール−およびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように製造することができ；アルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されているようにアルキル化されている）は、市販の試薬を用いて自動固相合成により調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換を作成するための方法が記載されている。Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ他（１９９０）Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １：１６５。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法も知られている。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ他により出願された特許が、そのような技法について記載している。
混合型主鎖修飾ＯＤＮは、市販のＤＮＡ合成装置および標準的ホスホルアミダイト化学反応を用いて合成することができる。（Ｆ．Ｅ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９９１、ならびにＭ．Ｄ．ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２１、７１９（１９８０））。カップリグ後、ＰＳ結合を、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ、Ｗ．Ｅｇａｎ、Ｊ．Ｂ．ＲｅｇａｎおよびＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２、１２５３（１９９０））（アセトニトリル中０．０７５Ｍ）またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を用いる硫化と、続く、無水酢酸、テトラヒドロフラン中２，６−ルチジン（１：１：８；ｖ：ｖ：ｖ）およびＮ−メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン中１６％）によるキャッピングにより導入する。このキャッピングステップは、ホスホロチオエート結合を位置させるべき位置における望ましくないホスホジエステル（ＰＯ）結合の形成を最小限に抑えるために、硫化反応後に行う。ホスホジエステル結合を、例えば、ＣｐＧジヌクレオチドに導入する場合、中間体ホスホラス（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）−ＩＩＩを、水／ピリジン中のヨウ素の溶液で処理することにより酸化する。固体支持体からの切断および濃アンモニアで処理することによる最終的な脱保護（５０℃にて１５時間）後、ＯＤＮを、ＮａＣｌ−グラジエント（例えば、緩衝液Ａ：アセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ中の１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ６．８；緩衝液Ｂ：アセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ中の１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．５Ｍ ＮａＣｌ；１ｍｌ／分にて３０分で５〜６０％Ｂ）を用いるＧｅｎ−Ｐａｋ Ｆａｘカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ）上のＨＰＬＣにより、またはキャピラリーゲル電気泳動により分析する。ＯＤＮは、ＨＰＬＣにより、またはＳｏｕｒｃｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のＦＰＬＣにより精製することができる。ＨＰＬＣ−均一分画を、混ぜ合わせ、Ｃ１８カラムを介し、または限外濾過により脱塩する。ＯＤＮを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析し、計算質量を確認した。
本発明の核酸は、他の修飾を包含することもある。これらは、アルキル−およびアリール−ホスフェート（荷電ホスホネート酸素は、アルキルまたはアリール基により置き換えられている）、ホスホジエステルおよび荷電酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性ＤＮＡ類似体を包含する。どちらかまたは両方の末端にテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含有する核酸も、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に抵抗性であることが明らかにされている。
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ソフト（ｓｏｆｔ）オリゴヌクレオチドまたはセミソフト（ｓｅｍｉ−ｓｏｆｔ）オリゴヌクレオチドであってよい。ソフトオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合が、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリンジヌクレオチド（ＹＺ）の内側および真隣にのみ存在する、部分的に安定化された主鎖を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＹＺは、ＹＧ、ピリミジン−グアノシン（ＹＧ）ジヌクレオチドであることが好ましい。少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチド自体は、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合を有する。少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドの真隣に存在するホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドの５’側、３’側、または５’側と３’側の両方であってもよい。
特に、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、「内部ジヌクレオチド」を伴う。内部ジヌクレオチドとは、一般に、ヌクレオチド対におけるどちらのヌクレオチドも末端ヌクレオチドではない、すなわち、ヌクレオチド対におけるどちらのヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端を規定するヌクレオチドではない、インターヌクレオチド結合により連結されている隣接ヌクレオチドの任意の対を意味するものとする。したがって、ｎヌクレオチド長である直鎖オリゴヌクレオチドは、合計ｎ−１のジヌクレオチドおよびｎ−３だけの内部ジヌクレオチドを有する。内部ジヌクレオチド中の各インターヌクレオチド結合は、内部インターヌクレオチド結合である。したがって、ｎヌクレオチド長である直鎖オリゴヌクレオチドは、合計ｎ−１のインターヌクレオチド結合およびｎ−３だけのインターヌクレオチド結合を有する。したがって、戦略的に置かれるホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合とは、核酸配列中のヌクレオチドの任意の対の間に位置するホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合を指す。一部の実施形態において、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、５’または３’末端に最も近いヌクレオチドのどちらの対の間にも位置しない。
少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドの真隣に存在するホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、それ自体が内部インターヌクレオチド結合であることが好ましい。したがって、Ｎ１およびＮ２が、各々、他とは無関係に、任意の単一ヌクレオチドである配列Ｎ１ＹＺＮ２の場合、ＹＺジヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合を有し、さらに、（ａ）Ｎ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合により連結され、（ｂ）ＺおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合により連結され、または（ｃ）Ｎ１およびＹは、Ｎ１が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合により連結され、ＺおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドである場合、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合により連結されている。
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、Ｒ１ＹＺＲ２のうちの少なくとも１つのＹＺは、ホスホジエステル結合を有することがある。あるいは、Ｒ１ＹＺＲ２のＹＺは、ホスホロチオエート結合を有することがある。一部の実施形態において、Ｒ１ＹＺＲ２のＲ１Ｙおよび／またはＺＲ２は、ホスホロチオエート結合を有する。
本発明によるソフトオリゴヌクレオチドは、完全に安定化されたオリゴヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ切断を比較的受けやすいと考えられる。特定の理論または機構に束縛されることを意味しないが、本発明のソフトオリゴヌクレオチドは、完全長ソフトオリゴヌクレオチドに比べて免疫刺激活性が低下したかまたは免疫刺激活性がない断片に切断可能であると考えられる。特にオリゴヌクレオチドの真ん中近くの、少なくとも１つのヌクレアーゼ感受性インターヌクレオチド結合の組入れは、オリゴヌクレオチドの最大免疫刺激活性の持続時間を短縮するためにオリゴヌクレオチドの薬物動態を変化させる「オフスイッチ」を提供すると考えられる。このことは、慢性局所炎症または免疫刺激に関係する損傷を避けることが望ましい組織および臨床応用例、例えば、腎臓において特に価値が高いことがある。
セミソフトオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合が、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリン（ＹＺ）ジヌクレオチドの内側にのみ存在する、部分的に安定化された主鎖を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。セミソフトオリゴヌクレオチドは、一般的に、対応する完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドに比べて、増大した免疫刺激効力を有する。セミソフトオリゴヌクレオチドのより大きな効力のため、セミソフトオリゴヌクレオチドは、一部の場合に、より低い有効濃度で使用されることがあり、望ましい生物学的効果を達成するために、従来の完全に安定化された免疫刺激性オリゴヌクレオチドよりも低い有効投与量を有する。
セミソフトオリゴヌクレオチドの上述の特性は、一般的に、内部ＹＺジヌクレオチドが関わるホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合の「投与量」を増やすにつれて増加すると考えられる。したがって、例えば、５つの内部ＹＺジヌクレオチドを有する所与のオリゴヌクレオチド配列について一般的に、５つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドは、４つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＧインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性であり、３つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性であり、２つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性であり、１つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性であると考えられる。重要なことには、１つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド結合の包含であっても、内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド結合がないよりも有利であると考えられる。ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合の数の他に、核酸の長さに沿った位置も、効力に影響を及ぼすことがある。
ソフトおよびセミソフトオリゴヌクレオチドは、一般的に、好ましい内部位置におけるホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合の他に、分解に対して抵抗性である５’および３’末端を包含するものとする。そのような分解抵抗性末端は、対応する非修飾末端を上回るエキソヌクレアーゼ消化に対する抵抗性の増加をもたらす任意の適当な修飾を必要とすることがある。例えば、５’および３’末端は、主鎖の少なくとも１つのホスフェート修飾をそこに包含することにより安定化することができる。好ましい実施形態において、各末端における主鎖の少なくとも１つのホスフェート修飾は、独立して、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、またはメチルホスホロチオエートインターヌクレオチド結合である。別の実施形態において、分解抵抗性末端は、３’末端においてペプチドまたはアミド結合により連結されている１つまたは複数のヌクレオチド単位を包含する。
ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、天然において見いだされる核酸を特徴とする結合のタイプである。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、２つの架橋酸素原子に両側を挟まれ、１つは荷電しておりもう１つは荷電していない２つの追加酸素原子も結合しているリン原子を包含する。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、オリゴヌクレオチドの組織半減期を短縮することが重要である場合に特に好ましい。
ホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、ホスホジエステルと化学的および／またはジアステレオマー的に類似しているリン含有架橋基である。ホスホジエステルとの類似性の尺度は、ヌクレアーゼ消化に対する脆弱性およびＲＮＡｓｅＨを活性化する能力を包含する。したがって、例えば、ホスホロチオエートではなくホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化を受けやすいが、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは共に、ＲＮＡｓｅＨを活性化する。好ましい実施形態において、ホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、ボラノホスフェート（または、同等に、ボラノホスホネート）結合である。米国特許第５，１７７，１９８号；米国特許第５，８５９，２３１号；米国特許第６，１６０，１０９号；米国特許第６，２０７，８１９号；Ｓｅｒｇｕｅｅｖ他、（１９９８）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２０：９４１７〜２７。別の好ましい実施形態において、ホスホジエステル様インターヌクレオチド結合は、ジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートである。ジアステレオマー的に純粋なＲｐホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ消化をより受けやすく、混合型またはジアステレオマー的に純粋なＳｐホスホロチオエートよりもＲＮＡｓｅＨの活性化において優れていると考えられる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体は、同時係属の、１９９９年７月２７に出願された米国特許出願０９／３６１，５７５および公開済みＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７１００（ＷＯ００／０６５８８）の主題である。本発明の目的にとって、「ホスホジエステル様インターヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネートインターヌクレオチド結合を具体的に除外することに留意されたい。
上記に記載されているように、本発明のソフトおよびセミソフトオリゴヌクレオチドは、ＣとＧの間のホスホジエステル様結合を有することがある。ホスホジエステル様結合の一例は、Ｒｐコンホメーションのホスホロチオエート結合である。オリゴヌクレオチドｐ−キラリティーは、活性が測定される時点に応じて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫活性に対する見掛け上反対の効果を有することがある。４０分の速い時点において、ホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドのＳｐではなくＲｐ立体異性体は、マウス脾臓細胞においてＪＮＫリン酸化を誘導する。対照的に、４４時間の遅い時点でアッセイされる場合、ＲｐではなくＳｐ立体異性体は、脾臓細胞増殖を刺激するのに活性である。ＲｐおよびＳｐ立体異性体の動態および生物活性のこの差異は、細胞取り込みのいかなる差異によるものではなく、むしろ、ｐ−キラリティーの２つの対立する生物学的役割に起因する可能性が高い。第一に、速い時点における免疫細胞を刺激することについてのＳｐと比較して増強されたＲｐ立体異性体の活性は、Ｒｐが、ＣｐＧ受容体、ＴＬＲ９と相互作用すること、または下流のシグナル伝達経路を誘導することにおいてより有効であり得ることを示している。一方、Ｓｐと比較してより速いＲｐ ＰＳ−オリゴヌクレオチドの分解は、シグナル伝達のかなり短い持続時間をもたらし、Ｓｐ ＰＳ−オリゴヌクレオチドは、遅い時点で試験された場合、より生物学的に活性であるように見える。
驚くほど強い効果は、ＣｐＧジヌクレオチド自体におけるｐ−キラリティーにより達成される。ステレオランダムなＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して、単一ＣｐＧジヌクレオチドがＲｐで連結している同族体は、わずかにより活性であるが、Ｓｐ結合を含有する同族体は、脾臓細胞増殖を誘導することについてほぼ不活性である。
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、塩基および／または糖におけるなどの、置換または修飾を有する核酸またはオリゴヌクレオチドも包含する。例えば、それらは、２’位のヒドロキシル基以外および５’位のホスフェート基またはヒドロキシ基以外の、低分子量有機基と共有結合している主鎖糖を有する核酸を包含する。したがって、修飾核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を包含することがある。さらに、修飾核酸は、リボースの代わりに、アラビノースまたは２’−フルオロアラビノースなどの糖を包含することがある。したがって、核酸は、主鎖組成が不均一であってよく、それによって、ペプチド−核酸（核酸塩基と共にアミノ酸主鎖を有する）などの一緒に連結されているポリマー単位の任意の可能な組合せを含有することがある。
核酸は、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾塩基などの置換プリンおよび置換ピリミジンも包含する。Ｗａｇｎｅｒ ＲＷ他（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４０〜４。プリンおよびピリミジンは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換芳香族部分を包含するが、これらに限定されるものではない。他のそのような修飾は、当業者によく知られている。
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルインターヌクレオチド架橋、β−Ｄ−リボース単位および／または天然のヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）が関わる天然のＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、様々な化学修飾および置換を包含することができる。化学修飾の例は、当業者に知られており、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ他（１９９０）Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ＆ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ、編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ他（１９９６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ Ｊ他（１９９５）Ｍｏｄ Ｓｙｎｔｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：３３１〜４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有することがあり、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同一配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルインターヌクレオチド架橋および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位および／または特定の天然ヌクレオチド塩基位置に位置する。
例えば、本発明は、１つまたは複数の修飾を含むことがあり、各修飾が、独立して、
ａ）ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルインターヌクレオチド架橋の修飾インターヌクレオチド架橋による置き換え、
ｂ）ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の、デホスホ架橋による置き換え、
ｃ）糖ホスフェート主鎖由来の糖ホスフェート単位の別の単位による置き換え、
ｄ）β−Ｄ−リボース単位の修飾糖単位による置き換え、および、
ｅ）天然ヌクレオチド塩基の修飾ヌクレオチド塩基による置き換えから選択されるオリゴヌクレオチドに関する。
オリゴヌクレオチドの化学修飾についてのより詳細な例は、以下の通りである。
ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルインターヌクレオチド架橋は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ６〜Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７〜Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示されている）から選択され、（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２０）アリールおよび、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールが、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノにより置換されていてもよく、Ｒ１およびＲ２が、互いに独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６〜Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル、および／または、メトキシエチルであるか、またはＲ１およびＲ２が、それらを保有する窒素原子と一緒に、群Ｏ、ＳおよびＮからの他のヘテロ原子をさらに含有することができる５〜６員複素環を形成する修飾インターヌクレオチド架橋により置き換えることができる。
ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の、例えば、デホスホ架橋ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基から選択されるデホスホ架橋による置き換え（デホスホ架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ ＥおよびＰｅｙｍａｎ Ａ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２０巻、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ、編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ １９９３、第１６章、３５５ｆｆページに記載されている）。
糖ホスフェート主鎖（すなわち、糖ホスフェート主鎖は、糖ホスフェート単位からなる）由来の糖ホスフェート単位（すなわち、一緒に糖ホスフェート単位を形成するβ−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルインターヌクレオチド架橋）は、例えば、モルホリノ−誘導体単位による置き換えである「モルホリノ−誘導体」オリゴマー（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ ＥＰ他（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：６１２９〜４１に記載されているような）を構築するのに、または、例えば、ＰＮＡ主鎖単位による、例えば、２−アミノエチルグリシンによる置き換えであるポリアミド核酸（「ＰＮＡ」；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ他（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ５：３〜７に記載されているような）を構築するのに適している別の単位により置き換えることができる。
β−リボース単位、または、β−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースから選択され、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースが、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、および、炭素環式（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ Ｊ（１９９２）Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１４：８３２０に記載されている）および／または開鎖糖類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ他（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：７２２３に記載されている）および／またはビシクロ糖類似体（例えば、Ｔａｒｋｏｖ Ｍ他（１９９３）Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ７６：４８１に記載されている）であることが好ましい修飾糖単位により置き換えることができる。
一部の実施形態において、糖は、特に、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド結合により連結されている一方または両方のヌクレオチドについては、２’−Ｏ−メチルリボースである。
核酸は、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾塩基などの置換プリンおよび置換ピリミジンも包含する。Ｗａｇｎｅｒ ＲＷ他（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４０〜４。プリンおよびピリミジンは、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン、ならびに他の天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換芳香族部分を包含するが、これらに限定されるものではない。
修飾塩基は、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵなどのＤＮＡおよびＲＮＡにおいて典型的に見いだされる天然に存在する塩基と化学的に異なっているが、これらの天然に存在する塩基と基本的化学構造を同じくする任意の塩基である。修飾ヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、好ましくは７−デアザ−７置換および／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えば、Ｎ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、およびジアミノプリン、例えば、２，６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチンまたは天然ヌクレオチド塩基の修飾から選択することができる。このリストは、例示的であることを意味しており、限定していると解釈されるべきではない。
本明細書に記載されている特定の式において、一連の修飾塩基が定義されている。例えば、Ｙという文字は、ピリミジンおよび、一部の実施形態において、シトシンまたは修飾シトシンを含有するヌクレオチドを指すために使用される。本明細書で使用する修飾シトシンとは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基を置き換えることができる天然に存在するまたは天然に存在しないシトシンのピリミジン塩基類似体である。修飾シトシンは、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、プソイド−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、およびウラシルならびにその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）を包含するが、これらに限定されるものではない。好ましいシトシンの一部は、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、およびＮ４−エチル−シトシンを包含する。本発明の別の実施形態において、シトシン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香族環系（例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）により置換されている。
Ｚという文字は、プリン、ピリミジン、または脱塩基および、一部の実施形態において、グアニンまたは修飾グアニン塩基を指すために使用される。本明細書で使用する修飾グアニンとは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基を置き換えることができる天然に存在するまたは天然に存在しないグアニンのプリン塩基類似体である。修飾グアニンは、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニンなど）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、および６−チオグアニンを包含するが、これらに限定されるものではない。本発明の別の実施形態において、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、および、Ｋ−塩基）、芳香族環系（例えば、ベンズイミダゾールまたはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）により置換されている。
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の接近可能な５’末端を有することがある。２つのそのような５’末端を有する修飾オリゴヌクレオチドを作成することが可能である。このことは、例えば、３’−３’結合を介して２つのオリゴヌクレオチドを接続させ、１つまたは２つの接近可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することにより達成することができる。３’３’結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはその他の修飾インターヌクレオチド架橋であってよい。そのような結合を完成するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、そのような結合は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．；他、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ３’−３’− ａｎｄ ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅｓ ａｓ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１）、１０（１〜３）、４６９〜７７およびＪｉａｎｇ、他、Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）、７（１２）、２７２７〜２７３５に記載されている。
さらに、３’−末端ヌクレオチド間の結合が、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよび他の修飾架橋ではない３’３’−連結核酸は、トリ−またはテトラ−エチレングリコールホスフェート部分などの追加スペーサーを用いて調製することができる（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．他、Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｎｅ（ｄＡ）１２ ａｎｄ ｔｗｏ（ｄＴ）１２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｒｉｄｇｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）、３１（３８）、９１９７〜２０４、米国特許第５６５８７３８号、および米国特許第５６６８２６５号）。あるいは、非ヌクレオチドリンカーは、エタンジオール、プロパンジオールから、または標準的なホスホルアミダイト化学反応を用いて脱塩基デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ Ｌａｕｒｅｎｃｅ他、Ｓｔｅｒｉｃａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ５’−ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、２２（１１）、２０２２〜７）から誘導することができる。非ヌクレオチドリンカーは、１回もしくは複数回組み入れるか、またはお互いと組み合わせ、連結すべき２つのＯＤＮの３’末端間にいかなる望ましい距離も可能にすることができる。
オリゴヌクレオチドは、分解に対して部分的に抵抗性である（例えば、安定化されている）。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ分解（例えば、エキソ−またはエンド−ヌクレアーゼを介する）に対して比較的抵抗性であるオリゴヌクレオチドを意味するものとする。核酸安定化は、主鎖修飾を介して行うことができる。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性を提供し、細胞内エキソ−およびエンド−ヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを守る。他の修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステル核酸とホスホロチオエート核酸の組合せ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組合せを包含する。
ホスホロチオエートなどの修飾主鎖は、ホスホルアミデートかＨ−ホスホネート化学反応のどちらかを用いる自動化技法を用いて合成することができる。アリール−およびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように製造することができ；アルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されているようにアルキル化されている）は、市販の試薬を用いる自動固相合成により調製することができる。他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換を作成するための方法が記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４、１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５、１９９０）。
他の安定化されたオリゴヌクレオチドは、アルキル−およびアリール−ホスフェート（荷電ホスホネート酸素は、アルキルまたはアリール基により置き換えられている）、荷電酸素部分がアルキル化されているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性ＤＮＡ類似体を包含する。どちらかまたは両方の末端にテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含有する核酸も、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に抵抗性であることが明らかにされている。
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のパリンドローム配列を含む。本明細書で使用する「パリンドローム」および、同等に、「パリンドローム配列」とは、逆方向反復、すなわち、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’などが、通常のワトソン−クリック塩基対を形成することができる塩基であるＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列を指すものとする。一部の場合に、パリンドロームは、ＧＣリッチである。ＧＣリッチなパリンドロームは、少なくとも３分の２のＧおよびＣの塩基組成を有するパリンドロームである。一部の実施形態において、ＧＣリッチなドメインは、「Ｂ細胞刺激性ドメイン」の３’側にあることが好ましい。１０塩基長のＧＣリッチなパリンドロームの場合、パリンドロームは、少なくとも８つのＧおよびＣを含有する。１２塩基長のＧＣリッチなパリンドロームの場合、パリンドロームは、この場合も少なくとも８つのＧおよびＣを含有する。１４量体のＧＣリッチなパリンドロームの場合、パリンドロームの少なくとも１０個の塩基は、ＧおよびＣである。一部の実施形態において、ＧＣリッチなパリンドロームは、もっぱらＧおよびＣで構成されている。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つ以上のパリンドローム配列を含有する。
ＤＮＡは、３’−５’ホスホジエステル結合を介して結合しているデオキシリボヌクレオチドのポリマーである。本発明のポリマーの単位は、３’−５’ホスホジエステル結合を介して結合させることもできる。しかしながら、本発明は、具体的には、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、および２’−５’インターヌクレオチド結合を包含する普通でないインターヌクレオチド結合を有するポリマーも包含する。一実施形態において、そのような普通でない結合は、たとえそのような結合のうちの１つまたは複数がポリマー内のどこかに存在することがあっても、免疫刺激性ＤＮＡモチーフから除外される。遊離末端を有するポリマーの場合、１つの３’−３’インターヌクレオチド結合の包含は、２つの遊離５’末端を有するポリマーをもたらすことがある。逆に、遊離末端を有するポリマーの場合、１つの５’−５’インターヌクレオチド結合の包含は、２つの遊離の３’末端を有するポリマーをもたらすことがある。
本発明の免疫刺激性組成物は、分岐単位を介して連結させることができる２つ以上の免疫刺激性ＤＮＡモチーフを含有することができる。インターヌクレオチド結合は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、または２’−５’結合であってよい。それに関して、２’−５’という命名は、デオキシリボースの炭素原子に従って選択される。しかしながら、環拡大糖類似体（例えば、ヘキサノース（ｈｅｘａｎｏｓｅ）、シクロヘキセン（ｃｙｌｏｈｅｘｅｎｅ）またはピラノース）または二環式もしくは三環式糖類似体などの非天然糖部分が用いられている場合、この命名は、単量体の命名に従って変化する。普通でないインターヌクレオチド結合は、ホスホジエステル結合であってよいが、あるいは、ホスホロチオエートまたは本明細書に記載されているようなその他の修飾結合として修飾することができる。式ＩＶは、ヌクレオチド分岐単位を介する本発明の分岐ＤＮＡオリゴマーおよび修飾オリゴリボヌクレオチド類似体についての一般構造を示している。それに関して、Ｎｕ１、Ｎｕ２、およびＮｕ３は、３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、または２’−５’結合を介して連結されていてよい。ＤＮＡオリゴマーの分岐は、非ヌクレオチドリンカーおよび脱塩基スペーサーの使用が関わることもある。一実施形態において、Ｎｕ１、Ｎｕ２、およびＮｕ３は、同一または異なる免疫刺激性ＤＮＡモチーフを表す。
Figure 0006006183
修飾オリゴリボヌクレオチド類似体は、ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）またはトレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）単位（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）、特に、３’−３’結合を有する修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド類似体を含有することがある。ダブラー単位は、一実施形態において、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトに基づいていることがある。トレブラー単位は、一実施形態において、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトの組入れに基づいていることがある。修飾オリゴリボヌクレオチド類似体の複数のダブラー、トレブラー、または他のマルチプライア（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）単位による分岐は、本発明の他の実施形態であるデンドリマーにつながる。分岐修飾オリゴリボヌクレオチド類似体は、特に、類似体の非分岐形態と比較して別個の免疫効果を有するＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９などの免疫刺激性ＲＮＡとＤＮＡの組合せについて、受容体の架橋につながることがある。さらに、分岐類似体かさもなければ多量体類似体の合成は、分解に対してＤＮＡを安定化させることがあり、治療に有用なレベルの免疫活性を発揮するには弱いか部分的に有効なＤＮＡ配列を可能にすることがある。修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド類似体は、ペプチド修飾試薬またはオリゴヌクレオチド修飾試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に由来するリンカー単位を含有することもある。さらに、修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド類似体は、ペプチド（アミド）結合によりポリマーに連結されている１つまたは複数の天然または非天然のアミノ酸残基を含有することがある。
３’−５’、５’−５’、３’−３’、２’−２’、２’−３’、および２’−５’インターヌクレオチド結合は、直接または間接であってよい。直接結合とは、これに関連して、介在するリンカー部分がない、本明細書に開示されているようなホスフェートまたは修飾ホスフェート結合を指す。介在するリンカー部分は、本明細書に開示されているようなホスフェートまたは修飾ホスフェート結合と区別される有機部分であり、例えば、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ｄＳｐａｃｅｒ（すなわち、脱塩基デオキシヌクレオチド）、ダブラー単位、またはトレブラー単位を包含することがある。
結合は、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｂ、Ｐ、およびハロゲンからなり、３〜３００原子を含有することが好ましい。３原子を有する例は、例えば、１つのヌクレオチドの３’−ヒドロキシ基を第二のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシ基と連結するアセタール結合（ＯＤＮ１−３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−３’−ＯＤＮ２）である。約３００原子を有する例は、ＰＥＧ−４０（テトラコンタポリエチレングリコール）である。好ましい結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ボラノホスホネート、アミド、エーテル、チオエーテル、アセタール、チオアセタール、尿素、チオ尿素、スルホンアミド、シッフ塩基およびジスルフィド結合である。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、すなわち、（ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ）を使用することも可能である。
オリゴヌクレオチドが、２つ以上の配列部分からなる場合、これらの部分は、同一または異なっていてよい。したがって、３’３’−結合を有するオリゴヌクレオチドにおいて、配列は、同一の５’−ＯＤＮ１−３’３’−ＯＤＮ１−５’または異なる５’−ＯＤＮ１−３’３’−ＯＤＮ２−５’であってよい。さらに、様々なオリゴヌクレオチド部分の化学修飾ならびにそれらを連結するリンカーは、異なっていてよい。短いオリゴヌクレオチドの取り込みは、長いオリゴヌクレオチドの取り込みより効率が低いように見えることから、２つ以上の短い配列の連結は、改善された免疫刺激をもたらす。短いオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは、２〜２０ヌクレオチド、より好ましくは、３〜１６ヌクレオチドであるが、最も好ましくは、５〜１０ヌクレオチドである。２つ以上の非連結５’末端を有する連結オリゴヌクレオチドが好ましい。
オリゴヌクレオチド部分配列は、非ヌクレオチドリンカーにより連結されていることもある。本明細書で使用する「非ヌクレオチドリンカー」とは、プリンまたはピリミジン核酸塩基、および糖ホスフェート、特に、脱塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位を包含するヌクレオチドおよびそのポリマー（すなわち、ポリヌクレオチド）ではない任意のリンカー要素を指す。他の好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカー、およびＣ３またはＣ６チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーである。オリゴヌクレオチドは、アルキルまたは置換アルキル基によりさらに置換されていてもよい芳香族残基により連結させることもできる。
細胞への取り込みを容易にするために、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、一部の実施形態において、長さ３〜１００塩基の範囲である。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さ７〜１００塩基である。典型的には、６ヌクレオチドを超える任意のサイズの核酸（数ｋｂ長であっても）は、十分な免疫刺激モチーフが存在すれば、本発明に従って免疫応答を誘導することができる。しかしながら、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの改善された免疫刺激能力は、かなり短い長さの免疫刺激性分子を提供する。一部の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、長さ３〜６塩基である。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本発明の一部の態様において、アレルギーもしくは喘息、感染性生物体による感染または具体的な癌抗原が同定されている癌を発症する危険性がある対象を治療するためのワクチンとして有用である。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、感染、アレルギーまたは癌を防御するための抗原またはアレルゲンなしに与えることもでき、この場合に、反復投与が長期の防御を可能にすることがある。本明細書で使用する危険性がある対象とは、感染を引き起こす病原体もしくは癌もしくはアレルゲンへの曝露の任意の危険性または癌を発症する危険性を有する対象である。例えば、危険性がある対象は、特定のタイプの感染因子が見いだされる地域へ旅行することを計画している対象であってよく、または、生活様式または医学的手技を介して、感染性生物体を含有することがある体液に、もしくは生物体に直接曝露される対象、またはさらには感染性生物体もしくはアレルゲンが同定されている地域に住んでいる任意の対象であってよい。感染を発症する危険性がある対象は、医療機関が、特定の感染性生物体抗原によるワクチン接種を推奨する一般集団も包含する。抗原がアレルゲンであり、対象が、その特定の抗原に対するアレルギー性応答を惹起し、対象が、抗原に曝露されることがある場合、すなわち、花粉シーズン中は、その対象は、抗原への曝露の危険性がある。アレルギーまたは喘息を発症する危険性がある対象は、アレルギーまたは喘息を有すると認定されているが、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド治療中は活動性疾患を有しない対象ならびに遺伝的または環境的要因のためにこれらの疾患を発症する危険性があると見なされる対象を包含する。
癌を発症する危険性がある対象とは、癌を発症する高い確率を有する対象である。これらの対象は、例えば、その存在が、癌を発症する高い可能性との相関関係を有することが立証されている遺伝的異常を有する対象およびタバコ、アスベスト、または他の化学的毒素などの発癌物質に曝露されている対象、または以前に癌の治療を受けたことがあり、見掛け上の寛解期にある対象を包含する。癌を発症する危険性がある対象が、対象が発症する危険性がある癌のタイプに特異的な抗原およびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドで治療される場合、対象は、癌細胞が発生したときに癌細胞を殺傷することができることがある。対象において腫瘍が形成し始めた場合、対象は、腫瘍抗原に対して特異的免疫応答を発現するであろう。
予防的治療のためのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用の他に、本発明は、感染、アレルギー、喘息、または癌を有する対象を治療するためのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用も包含する。
感染を有する対象とは、感染性病原体に曝露されたことがあり、体内に急性または慢性の検出可能レベルの病原体を有する対象である。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、抗原と共にまたは抗原なしに使用し、感染性病原体のレベルを低減するかまたは感染性病原体を根絶することができる抗原特異的な全身または粘膜の免疫応答を高めることができる。本明細書で使用する感染性疾患とは、体内の外来微生物の存在に起因する疾患である。病原侵入の主要部位である身体の粘膜表面を保護するのに有効なワクチン戦略および治療を開発することが特に重要である。
アレルギーを有する対象とは、アレルゲンに応答してアレルギー反応を有するまたはアレルギー反応を呈する危険性がある対象である。アレルギーとは、物質（アレルゲン）に対する獲得過敏性を指す。アレルギー状態は、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ））、および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性の状態を包含するが、これらに限定されるものではない。
アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体産生により引き起こされる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全身投与または粘膜投与により誘導されるサイトカインは、主に、Ｔｈ１と呼ばれるクラス（例は、ＩＬ−１２、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γである）であり、これらは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導する。ＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカインの産生に関係する免疫応答の他の主要なタイプは、Ｔｈ２免疫応答と名付けられている。一般に、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型免疫応答により媒介されるようである。対象における免疫応答を、優位なＴｈ２（ＩｇＥ抗体の産生およびアレルギーに関係している）からバランスの取れたＴｈ２／Ｔｈ１応答（アレルギー反応に対して予防的である）へシフトするＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの能力に基づいて、免疫応答を誘導するのに有効な投与量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを対象に投与し、喘息およびアレルギーを治療または予防することができる。
したがって、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、喘息などのアレルギー状態および非アレルギー状態の治療において有意な治療的有用性を有する。Ｔｈ２サイトカイン、特に、ＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息対象の気道において上昇している。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソトープスイッチング、好酸球の走化性および活性化ならびに肥満細胞増殖を包含する喘息の炎症性応答の重要な局面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカインの産生を抑制することができる。喘息とは、炎症、気道の狭窄および吸入された物質に対する気道の反応性増加を特徴とする呼吸器系の障害を指す。喘息は、それらに限らないが、アトピー性またはアレルギー性の症状を伴うことが多い。
癌を有する対象とは、検出可能な癌性細胞を有する対象である。癌は、悪性または非悪性の癌であってよい。癌または腫瘍は、胆道癌；脳腫瘍；乳癌；子宮頚癌；絨毛癌；大腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫を包含するが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、癌は、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌、または結腸癌である。
対象は、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、霊長類、例えば、サル、および魚（水産養殖種）、例えば、サケを包含するがこれに限定されない脊椎動物を意味するものとする。したがって、本発明は、非ヒト対象における癌および腫瘍、感染、ならびにアレルギー／喘息を治療するためにも使用することができる。癌は、コンパニオンアニマル（すなわち、ネコおよびイヌ）の主な死亡原因の１つである。
本明細書で使用する、治療する、治療される、または、治療することという用語は、感染性疾患、癌、アレルギー、または、喘息などの障害に関して使用される場合、疾患の発症（例えば、病原体の感染）に対する対象の抵抗性を高める、または、言い換えれば、対象が疾患を発症する（例えば、病原体に感染する）可能性を低くする予防的治療ならびに対象が疾患を発症した後に疾患と闘い（例えば、感染を減らすか排除する）または疾患が悪化するのを防ぐための治療を指す。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドが抗原と共に投与される場合において、対象は、抗原に曝露されることがある。本明細書で使用する「に曝露される」という用語は、対象を抗原と接触させる能動的ステップかｉｎ ｖｉｖｏにおける対象の抗原への受動的曝露のどちらかを指す。対象の抗原への能動的曝露のための方法は、当技術分野においてよく知られている。一般に、抗原は、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、鼻腔内、気管内、または皮下投与などの任意の手段により対象に直接投与される。抗原は、全身的または局所的に投与することができる。抗原およびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与するための方法を、以下でより詳細に記載する。対象は、抗原が、体内で免疫細胞への曝露に利用できるようになると、抗原に受動的に曝露される。対象は、例えば、体内への外来性病原体の侵入により、またはその表面上で外来性抗原を発現する腫瘍細胞の発生により、抗原に受動的に曝露されることがある。
対象が抗原に受動的に曝露される方法は、特に、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与するタイミングに左右されることがある。例えば、癌または感染性疾患またはアレルギー性もしくは喘息性応答を発症する危険性がある対象において、対象は、危険性が最大である場合、すなわち、アレルギーシーズン中または発癌物質への曝露後に、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを定期的に投与されることがある。さらに、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、旅行者が感染因子に曝露される危険性がある外国に旅行する前に、旅行者に投与されることがある。同様に、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、生物戦争への曝露の危険性がある兵士または民間人に投与され、もし対象が抗原に曝露される場合、抗原に対する全身または粘膜の免疫応答を誘導することができる。
本明細書で使用する抗原とは、免疫応答を誘発することができる分子である。抗原は、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖複合体、多糖および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物ならびに寄生虫などの多細胞生物体およびアレルゲンを包含するが、これらに限定されるものではない。抗原という用語は、宿主免疫系により外来性であると認識される任意のタイプの分子を広く包含する。抗原は、癌抗原、微生物抗原、およびアレルゲンを包含するが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する癌抗原とは、腫瘍または癌細胞表面と結び付き、ＭＨＣ分子との関連で抗原提示細胞の表面上で発現される場合に、免疫応答を誘発することができるペプチドまたはタンパク質などの化合物である。癌抗原は、例えば、Ｃｏｈｅｎ、他、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４：１０５５に記載されているように癌細胞の粗抽出物を調製すること、抗原を部分的に精製すること、組換え技術、または知られている抗原のｄｅ ｎｏｖｏ合成のいずれかにより、癌細胞から調製することができる。癌抗原は、組換え的に発現される抗原、腫瘍もしくは癌の免疫原性部分または腫瘍もしくは癌全体を包含するが、これらに限定されるものではない。そのような抗原は、組換え的にまたは当技術分野において知られているその他の手段により単離または調製することができる。
本明細書で使用する微生物抗原とは、微生物の抗原であり、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌を包含するが、これらに限定されるものではない。そのような抗原は、インタクトな微生物ならびに天然の分離株およびそれらの断片または誘導体と、天然の微生物抗原と同一であるかまたは類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物を包含する。ある化合物は、その化合物が天然の微生物抗原に対して免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、天然の微生物抗原に類似している。そのような抗原は、当技術分野において日常的に使用され、当業者によく知られている。
ウイルスは、核酸コアおよびタンパク質コートを一般的に含有するが、独立して生きる生物体ではない小さい感染因子である。ウイルスは、タンパク質を欠く感染性核酸の形態をとることもある。ウイルスは、ウイルスが複製することができる生きた細胞がないと生存することができない。ウイルスは、エンドサイトーシスかＤＮＡ（ファージ）の直接注入のどちらかにより特定の生きた細胞に入って増殖し、疾患を引き起こす。次いで、増殖したウイルスは、放出され、さらなる細胞に感染することができる。一部のウイルスは、ＤＮＡ含有ウイルスであり、他のウイルスは、ＲＮＡ含有ウイルスである。ＤＮＡウイルスは、ポックス、ヘルペス、アデノ、パポバ、パルボ、およびヘパドナを包含する。ＲＮＡウイルスは、ピコルナ、カリシ、アストロ、トガ、フラビ、コロナ、パラミクソ、オルソミクソ、ブニヤ、アレナ、ラブド、フィロ、ボルナ、レオ、およびレトロを包含する。一部の態様において、本発明は、例えば、動物における牛海綿状脳症（すなわち、狂牛病、ＢＳＥ）もしくはスクレイピー感染、またはヒトにおけるクロイツフェルト−ヤコブ病などの、プリオンが疾患進行に関与している疾患を治療することも意図している。
ウイルスは、エンテロウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどの、ピコルナウイルス科のウイルスを包含するが、これらに限定されるものではない）、ロタウイルス、アデノウイルス、ならびにＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎などの肝炎ウイルスを包含するが、これらに限定されるものではない。ヒトにおいて見いだされているウイルスの具体例は、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）、または、ＨＩＶ−ＩＩＩなどのヒト免疫不全ウイルス；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；および他のウイルス、急性喉頭気管気管支炎ウイルス、アルファウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザ、ＳＡＲｓウイルス、ウエストナイルウイルスを包含するが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法は、一部の実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および肝炎ウイルスの治療に特に有用である。ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルスＩＩＩ（ＨＩＬＶ ＩＩＩ）としても知られているレトロウイルスの１種であるＨＩＶは、ＡＩＤＳとして知られている障害をもたらす悪化を引き起こす原因である。ＨＩＶは、Ｔ細胞に感染して破壊し、免疫系の全体バランスを乱し、患者が他の感染と闘う能力の喪失をもたらし、致命的になることが多い日和見感染に患者をかかりやすくする。
ウイルス性肝炎は、腫脹、圧痛、および時には肝臓への永久的な損傷を生じることがある肝臓の炎症である。肝臓の炎症が少なくとも６カ月以上続く場合、慢性肝炎と呼ばれる。Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型を包含するウイルス性肝炎を引き起こすことが知られている少なくとも５つの異なるウイルスが存在する。Ａ型肝炎は、一般的に、ヒトの糞便で汚染されている食物または飲料水を介して移される。Ｂ型肝炎は、一般的に、血液などの体液を介して広がる。例えば、Ｂ型肝炎は、出生児に母から子供に、性的接触、汚染された輸血および注射針を介して広がることがある。Ｃ型肝炎は、とてもありふれており、Ｂ型肝炎と同様に、輸血および汚染された注射針を介して広がることが多い。Ｄ型肝炎は、併存するＢ型肝炎ウイルスのキャリアである静注（ＩＶ）薬物使用者に見いだされることが最も多い。Ｅ型肝炎は、Ａ型ウイルス性肝炎と類似しており、一般的に、粗末な下水設備に関係している。
グラム陰性とグラム陽性細菌は共に、脊椎動物において抗原としての役割を果たす。そのようなグラム陽性細菌は、パスツレラ種、ブドウ球菌種、および連鎖球菌種を包含するが、これらに限定されるものではない。グラム陰性細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス種、およびサルモネラ種を包含するが、これらに限定されるものではない。感染性細菌の具体例は、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム種（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムイントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、マイコバクテリウムゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカスアガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、ストレプトコッカスフェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカスボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性のカンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス種、フソバクテリウムヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラスモニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマパリディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ、リケッチア、およびアクチノマイセスイスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）を包含するが、これらに限定されるものではない。
真菌の例は、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマカプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデスイミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセスデルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を包含する。
他の感染性生物体（すなわち、原生生物）は、熱帯マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、および三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、およびトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）などのプラスモジウム種を包含する。血液感染性および／または組織寄生虫は、プラスモジウム種、バベシアミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシアディバージエンス（Ｂａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア種、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、およびローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）（アフリカ睡眠症）、トリパノソーマクルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）（シャーガス病）、およびトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）を包含する。
他の医学的に関連する微生物は、文献に広範囲にわたって記載されており、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３を参照されたい。その全内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
アレルゲンとは、感受性の対象においてアレルギー性または喘息性の応答を誘導することがある物質（抗原）を指す。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、粉塵、真菌胞子および薬物（例えば、ペニシリン）を包含することがある。天然、動物および植物アレルゲンの例は、以下の属、すなわち、イヌ科（カニスファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））；デルマトファゴイデス属（例えば、コナヒョウダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ））；ネコ属（イエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））；アンブロシア属（ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ））；ロリウム属（例えば、ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）またはイタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；クリプトメリア属（ニホンスギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ））；アルテルナリア属（アルテルナリアアルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ））；アルダー；ハンノキ属（ハンノキ（Ａｌｎｕｓ ｇｕｌｔｉｎｏａｓａ））；カバノキ属（ビーチ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ））；コナラ属（アメリカンホワイトオーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａｌｂａ））；オリーブ属（ヨーロッパオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａ））；ヨモギ属（オオヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））；オオバコ属（例えば、ヘラオオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））；ヒカゲミズ属（例えば、パリエタリアオフィシナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）またはパリエタリアユダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ））；チャバネゴキブリ属（例えば、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ））；ミツバチ属（例えば、アピスムルチフローラム（Ａｐｉｓ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；イトスギ属（例えば、ホソイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、アリゾナイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ）およびモントレーイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ））；ビャクシン属（例えば、ユニペルスサビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、エンピツビャクシン（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、セイヨウネズ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびユニペルスアシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ））；クロベ属（Ｔｈｕｙａ）（例えば、コノテガシワ（Ｔｈｕｙａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））；ヒノキ属（例えば、ヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ））；ゴキブリ属（例えば、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））；カモジグサ属（例えば、シバムギ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｒｅｐｅｎｓ））；ライムギ属（例えば、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））；コムギ属（例えば、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））；カモガヤ属（例えば、カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ））；ウシノケグサ属（例えば、ヒロハウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ｅｌａｔｉｏｒ））；イチゴツナギ属（例えば、ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）またはコイチゴツナギ（Ｐｏａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））；カラスムギ属（例えば、マカラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））；シラゲガヤ属（例えば、シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ））；ハルガヤ属（例えば、ハルガヤ（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ））；オオカニツリ属（例えば、オオカニツリ（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ ｅｌａｔｉｕｓ））；コヌカグサ属（例えば、コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ａｌｂａ））；アワガエリ属（例えば、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ））；クサヨシ属（例えば、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））；スズメノヒエ属（例えば、アメリカスズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ））；モロコシ属（例えば、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））；およびスズメノチャヒキ属（例えば、コスズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍｉｓ））に対して特異的なタンパク質を包含するが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する実質的に精製されたという用語は、天然で関係する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を実質的に含まないポリペプチドを指す。当業者は、タンパク質精製のための標準的技法を用いてウイルスまたは細菌のポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元性ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要なバンドを与えることが多いはずである。部分的にグリコシル化されたポリペプチドまたはいくつかの開始コドンを有するポリペプチドの場合、非還元性ポリアクリルアミドゲル上にいくつのバンドが存在することがあるが、これらは、そのポリペプチドに特有のパターンを形成するであろう。ウイルスまたは細菌のポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸配列分析により決定することもできる。多糖、小分子、模倣体などの核酸ベクターによりコードされない他のタイプの抗原は、本発明内に包含される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗微生物薬と共に対象に投与されることがある。本明細書で使用する抗微生物薬とは、感染性微生物を殺傷または阻害することができる天然に存在する化合物または合成化合物を指す。本発明に従って有用な抗微生物薬のタイプは、対象が感染しているか、または感染する危険性がある微生物のタイプによって異なるであろう。抗微生物薬は、抗細菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、および抗寄生虫薬を包含するが、これらに限定されるものではない。「抗感染薬」、「抗細菌薬」、「抗ウイルス薬」、「抗真菌薬」、「抗寄生虫薬」および「殺寄生虫薬」などの語句は、当業者には十分に確立した意味を有し、標準的な医療テキストで定義されている。手短に言えば、抗細菌薬は、細菌を殺傷または阻害し、抗生物質ならびに類似の機能を有する他の合成または天然化合物を包含する。抗生物質は、微生物などの細胞により二次代謝産物として産生される低分子量分子である。一般に、抗生物質は、微生物に特異的であり、宿主細胞には存在しない１つまたは複数の細菌の機能または構造を妨害する。抗ウイルス薬は、天然源から単離するか、または合成することができ、ウイルスを殺傷または阻害するのに有用である。抗真菌薬は、表在性真菌感染ならびに日和見性および原発性全身性真菌感染を治療するために使用される。抗寄生虫薬は、寄生虫を殺傷または阻害する。
ヒト投与に有用な殺寄生虫薬とも呼ばれる抗寄生虫薬の例は、アルベンダゾール、アンホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリダオン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、糖質コルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メトリフォネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタンミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）−スルホンアミド、ピリメタンミン−スルファドキシン、塩酸キナクリン、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトロプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール、およびトリパルサミドを包含するが、これらに限定されることはなく、これらの一部は、単独でまたは他の抗寄生虫薬と組み合わせて使用される。
抗細菌薬は、細菌を殺傷するか、または細菌の増殖または機能を阻害する。抗細菌薬の大きなクラスは、抗生物質である。広範囲の細菌を殺傷または阻害するのに有効である抗生物質は、広域抗生物質と呼ばれる。他のタイプの抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性クラスの細菌に対して主に有効である。これらのタイプの抗生物質は、狭域抗生物質と呼ばれる。単一の生物体または疾患に対して有効であるが、他のタイプの細菌に対して有効でない他の抗生物質は、限定域（ｌｉｍｉｔｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）抗生物質と呼ばれる。抗細菌薬は、それらの主要な作用機作に基づいて分類されることがある。一般に、抗細菌薬は、細胞壁合成阻害薬、細胞膜阻害薬、タンパク質合成阻害薬、核酸の合成または機能阻害薬、および競合的阻害薬である。
抗ウイルス薬は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内のウイルスの複製を防ぐ化合物である。抗ウイルス薬物が抗細菌薬物よりもずっと少ないのは、ウイルス複製のプロセスが、宿主細胞内のＤＮＡ複製と密接に関係しているため、非特異的抗ウイルス薬は宿主にとって毒性であることが多いためである。ウイルス感染のプロセス内には、抗ウイルス薬により遮断または阻害されることがあるいくつかの段階がある。これらの段階は、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリンまたは結合ペプチド）、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオチド類似体）、新たなウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害薬）、ならびにウイルスの出芽および放出を包含する。
ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドに類似しているが、不完全または異常なデオキシリボースまたはリボース基を有する合成化合物である。いったんヌクレオチド類似体が細胞内に入ると、それらはリン酸化され、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡへの組入れを正常なヌクレオチドと競合する三リン酸形態を生じる。いったんヌクレオチド類似体の三リン酸形態が、伸長中の核酸鎖に組み入れられると、ウイルスポリメラーゼとの不可逆的な会合と連鎖停止を引き起こす。ヌクレオチド類似体は、アシクロビル（単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの治療に使用される）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの治療に有用である）、イドクスウリジン、リバビリン（呼吸器合胞体ウイルスの治療に有用である）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、ジドブジン（アジドチミジン）、イミキモド、およびレシミキモド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）を包含するが、これらに限定されるものではない。
インターフェロンは、ウイルス感染細胞ならびに免疫細胞により分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞上の特異的受容体に結合することにより機能し、細胞において、ウイルスによる感染から細胞を守る変化を引き起こす。αおよびβ−インターフェロンも、感染細胞の表面上でクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子の発現を誘導し、宿主の免疫細胞認識のための抗原提示の増加をもたらす。αおよびβ−インターフェロンは、組換え形態として入手可能であり、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎感染の治療に使用されている。抗ウイルス療法に有効である用量において、インターフェロンは、発熱、倦怠感および体重減少などの重度の副作用を有する。
本発明において有用な抗ウイルス薬は、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオチド類似体、およびプロテアーゼ阻害薬を包含するが、これらに限定されるものではない。抗ウイルス剤の具体例は、エースマンナン；アシクロビル；アシクロビルナトリウム；アデフォビル；アロブジン；アルビルセプトスドトックス（Ａｌｖｉｒｃｅｐｔ Ｓｕｄｏｔｏｘ）；塩酸アマンタジン；アラノチン；アリルドン；メシル酸アテビルジン；アブリジン；シドホビル；シパムフィリン（Ｃｉｐａｍｆｙｌｌｉｎｅ）；塩酸シタラビン；メシル酸デラビルジン；デスシクロビル；ジダノシン；ジソキサリル；エドクスジン；エンビラデン；エンビロキシム；ファムシクロビル；塩酸ファモチン；フィアシタビン；フィアルリジン；ホサリラート；フォスカルネットナトリウム；ホスホネトナトリウム；ガンシクロビル；ガンシクロビルナトリウム；イドクスウリジン；ケトキサール（Ｋｅｔｈｏｘａｌ）；ラミブジン；ロブカビル；塩酸メモチン；メチサゾン；ネビラピン；ペンシクロビル；ピロダビル；リバビリン；塩酸リマンタジン；メシル酸サキナビル；塩酸ソマンタジン；ソリブジン；スタトロン（Ｓｔａｔｏｌｏｎ）；スタブジン；塩酸チロロン；トリフルリジン；塩酸バラシクロビル；ビダラビン；リン酸ビダラビン；ビダラビンナトリウムリン酸塩；ビロキシム；ザルシタビン；ジドブジン；およびジンビロキシムを包含するが、これらに限定されるものではない。
抗真菌薬は、感染性真菌の治療および予防に有用である。抗真菌薬は、それらの作用機序により分類されることがある。一部の抗真菌薬は、グルコース合成酵素を阻害することにより細胞壁阻害薬として機能する。これらは、バシウンギン（ｂａｓｉｕｎｇｉｎ）／ＥＣＢを包含するが、これに限定されるものではない。他の抗真菌薬は、膜の完全性を不安定にすることにより機能する。これらは、クロトリマゾール、セルタコナゾール（ｓｅｒｔａｃｏｎｚｏｌｅ）、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびボリコナゾール（ｖｏｒｉｃｏｎａｃｏｌｅ）などのイミダゾール、ならびにＦＫ４６３、アンホテリシンＢ、ＢＡＹ３８−９５０２、ＭＫ９９１、プラジミシン、ＵＫ２９２、ブテナフィン、およびテルビナフィンを包含するが、これらに限定されるものではない。他の抗真菌薬は、キチンを分解することにより（例えば、キチナーゼ）または免疫抑制（５０１クリーム）により機能する。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫応答を増強するために、アジュバントなどの他の治療薬と組み合わせることができる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび他の治療薬は、同時に、または順次に投与することができる。他の治療薬が同時に投与される場合、それらは、同じか、または別々の製剤で投与することができるが、同時に投与される。他の治療薬およびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与が時間的に分離されている場合、他の治療薬は、お互いにおよびＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドについて順次に投与される。これらの化合物の投与間の時間の分離は、数分であってよく、またはそれより長くてよい。他の治療薬は、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などを包含するが、これらに限定されるものではない。
本発明の組成物は、非核酸アジュバントと共に投与することもできる。非核酸アジュバントとは、本明細書に記載されているＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを除く、体液性および／または細胞性免疫応答を刺激することができる任意の分子または化合物である。非核酸アジュバントは、例えば、デポ効果を生み出すアジュバント、免疫刺激アジュバント、およびデポ効果を生み出しかつ免疫系を刺激するアジュバントを包含する。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、粘膜アジュバントとしても有用である。全身性免疫と粘膜免疫は共に、ＣｐＧ核酸の粘膜送達により誘導されることがこれまでに発見されている。したがって、オリゴヌクレオチドは、他の粘膜アジュバントと組み合わせて投与することができる。
免疫応答は、サイトカイン（Ｂｕｅｌｅｒ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９６；Ｃｈｏｗ他、１９９７；Ｇｅｉｓｓｌｅｒ他、１９９７；Ｉｗａｓａｋｉ他、１９９７；Ｋｉｍ他、１９９７）またはＢ−７共刺激分子（Ｉｗａｓａｋｉ他、１９９７；Ｔｓｕｊｉ他、１９９７）のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの同時投与または共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）発現により誘導または増大させることもできる。サイトカインという用語は、ナノ−〜ピコモル濃度で体液性レギュレーターとして作用し、正常な状態または病的な状態のどちらかで、個々の細胞および組織の機能活性をモジュレートする可溶性のタンパク質およびペプチドの多様な群の一般名として使用される。これらのタンパク質は、細胞間の相互作用も直接媒介し、細胞外環境において生じるプロセスも調節する。サイトカインの例は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（γ−ＩＦＮ）、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３リガンド、およびＣＤ４０リガンドを包含するが、これらに限定されるものではない。
オリゴヌクレオチドは、Ｔｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答に免疫応答を方向転換させるのにも有用である。このことは、比較的バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２環境を生み出す結果となる。Ｔｈ２からＴｈ１免疫応答への免疫応答の方向転換は、核酸に応答して産生されるサイトカインのレベルを測定することにより（例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを包含するＴｈ１サイトカインを産生する単球細胞および他の細胞を誘導することにより）評価することができる。Ｔｈ２からＴｈ１応答への免疫応答の方向転換または再平衡は、喘息の治療または予防に特に有用である。例えば、喘息を治療するのに有効な量は、喘息に関係しているＴｈ２タイプの免疫応答をＴｈ１タイプの応答またはバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２環境に方向転換するのに有用な量であってよい。Ｔｈ２サイトカイン、特に、ＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息対象の気道において上昇している。本発明のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫系の再平衡を助けるＴｈ１サイトカインの増加を引き起こし、主としてＴｈ２免疫応答に伴う有害作用を予防または軽減する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、気道リモデリングを治療するのにも有用なことがある。気道リモデリングは、気道における平滑筋細胞増殖および／または粘膜下肥厚に起因し、限られた気流につながる気道狭窄を最終的に引き起こす。本発明のオリゴヌクレオチドは、さらなるリモデリングを予防し、おそらくリモデリングプロセスによって生じる組織増加さえ軽減することがある。
オリゴヌクレオチドは、樹状細胞の生存、分化、活性化および成熟を改善するためにも有用である。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化および成熟を促進する独特な能力を有する。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ナチュラルキラー細胞溶解活性および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）も増加させる。ＡＤＣＣは、癌細胞などの細胞内標的に特異的な抗体と組み合わせてＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、抗体と併せて対象に投与される場合、対象の免疫系が誘導され、腫瘍細胞を殺傷する。ＡＤＣＣ手順において有用な抗体は、体内の細胞と相互作用する抗体を包含する。細胞内標的に特異的な多くのそのような抗体は、当技術分野において記載されており、多くは、市販されている。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、抗癌療法と併せて投与することもできる。抗癌療法は、癌医薬品、放射線および外科手術を包含する。本明細書で使用する「癌医薬品」とは、癌を治療する目的で対象に投与される薬剤を指す。本明細書で使用する「癌を治療すること」とは、癌の発症を予防すること、癌の症状を軽減すること、および／または確立した癌の増殖を阻害することを包含する。他の態様において、癌医薬品は、癌を発症する危険性を軽減する目的で癌を発症する危険性がある対象に投与される。癌を治療するための様々なタイプの医薬品を本明細書に記載する。本明細書のために、癌医薬品を、化学療法薬、免疫療法薬、癌ワクチン、ホルモン療法、および生物学的応答調整剤として分類する。
さらに、本発明の方法は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドと一緒に２種以上の癌医薬品を使用することを包含することを意図している。一例として、必要に応じて、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、化学療法薬と免疫療法薬の両方と共に投与することができる。あるいは、癌医薬品は、癌を有する対象または癌を発症する危険性がある対象を治療する目的で１対象にすべて投与される免疫療法薬および癌ワクチン、または化学療法薬および癌ワクチン、または化学療法薬、免疫療法薬および癌ワクチンを包含することがある。
化学療法薬は、メトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含有しないクロロエチルニトロソ尿素、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグラミン（Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタイン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）およびポリフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼ阻害薬、ファメシルトランスフェラーゼ阻害薬、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール（Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ）、グラモレク（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトロキサントロン（Ｍｉｔｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、メタレット（Ｍｅｔａｒｅｔ）／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、Ｉｎｃｅｌ／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロマイド、エバセト／リポソームドキソルビシン、ユータキサン（Ｙｅｗｔａｘａｎ）／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、ゼロード（Ｘｅｌｏａｄ）／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパクス（Ｃｙｃｌｏｐａｘ）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害薬、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミゾール／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミソール、カンプトサー／イリノテカン、ツモデックス（Ｔｕｍｏｄｅｘ）／ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ロイスタチン／クラドリビン、パキセクス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス（Ｃａｅｌｙｘ）／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルマルビシン（Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ）／エピルビシン、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタルイミド（Ｎａｐｈｔａｌｉｍｉｄｅ）、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、カエチクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソームドキソルビシン、ジェムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＹＭ１１６、ロジンシード（ｌｏｄｉｎｅ ｓｅｅｄ）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害薬、ＰＡＲＰ阻害薬、Ｄ４８０９／デキシフォサミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、アイフェス（Ｉｆｅｓ）／メスネクス（Ｍｅｓｎｅｘ）／イフォサミド（Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ブモン（Ｖｕｍｏｎ）／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール（Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ）／シスプラチン、ベペシド（Ｖｅｐｅｓｉｄｅ）／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソ尿素、メルフェラン（ｍｅｌｐｈｅｌａｎ）およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エルスロポエチン（Ｅｒｔｈｏｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、および硫酸ビンデシンからなる群から選択することができるが、これらに限定されるものではない。
免疫療法薬は、リブタキシン、ハーセプチン、クアドラメット、パノレックス、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム、ＳＭＡＲＴ Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、オバレックス、ベクサー、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、ゼナパックス、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、プレターゲット、ノボＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、グリオマブ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、リンフォサイド、ＣＭＡ６７６、モノファーム−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ １Ｄ１０Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ＡＢＬ３６４ＡｂおよびＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡからなる群から選択することができるが、これらに限定されるものではない。
癌ワクチンは、ＥＧＦ、抗イディオタイプ癌ワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫ黒色腫ワクチン、ＭＧＶガングリオシド共役ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、オバレックス、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬセラトープ（ｔｈｅｒａｔｏｐｅ）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン（Ｍｅｌａｃｉｎｅ）、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡベースのワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣ−ウイルスおよびイムシスト（ＩｍｍｕＣｙｓｔ）／テラシス（ＴｈｅｒａＣｙｓ）からなる群から選択することができるが、これらに限定されるものではない。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドをモノクローナル抗体などの免疫療法薬と併せて使用すると、ＡＤＣＣの有意な増強（上記のような）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、およびＩＦＮαレベルの増加を包含する多くの機序を介して長期生存を高めることができる。核酸は、モノクローナル抗体と組み合わせて使用される場合、生物学的結果を達成するのに必要とされる抗体の投与量を軽減するのに役立つ。
本明細書で使用する「癌抗原」および「腫瘍抗原」という用語は、癌細胞により差次的に発現され、それによって、癌細胞を標的とするために利用することができる抗原を指すために互換的に使用される。癌抗原とは、明らかに腫瘍特異的な免疫応答を潜在的に刺激することができる抗原である。これらの抗原の一部は、必ずしも発現されないが、正常な細胞によりコードされる。これらの抗原は、正常な細胞において普通はサイレントである（すなわち、発現されない）抗原、分化の特定の段階においてのみ発現される抗原ならびに胚抗原および胎児性抗原などの時間的に発現される抗原として特徴付けることができる。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）、内部欠失または染色体転座により生じた融合タンパク質などの突然変異体細胞性遺伝子によりコードされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスで運ばれるものなどのウイルス遺伝子によりコードされることがある。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、自己免疫疾患を治療および予防するのにも有用である。自己免疫疾患は、対象の自分の抗体が宿主組織と反応する、または免疫エフェクターＴ細胞が、内因性の自己ペプチドに対して自己反応性であり、組織の破壊を引き起こす疾患の一クラスである。したがって、免疫応答は、自己抗原と呼ばれる対象の自分の抗原に対して仕掛けられる。自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性糖尿病を包含するが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する「自己抗原」という用語は、正常宿主組織の抗原を指す。正常宿主組織は、癌細胞を包含していない。したがって、自己抗原に対して仕掛けられる免疫応答は、自己免疫疾患に関連して、望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷の一因となり、一方、癌抗原に対して仕掛けられる免疫応答は、望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊の一因となる。したがって、自己免疫疾患を治療することを目的とする本発明の一部の態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸が自己抗原、特に、自己免疫障害の標的である自己抗原と共に投与されることは推奨されない。
他の場合に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、低投与量の自己抗原と共に送達されることがある。多くの動物研究は、低投与量の抗原の粘膜投与が、免疫低応答性すなわち「免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」の状態をもたらすことがあることを立証している。能動機序は、Ｔｈ１から離れて主にＴｈ２およびＴｈ３（すなわち、ＴＧＦ−β支配の）応答に向かうサイトカイン媒介性免疫偏向であるように見える。低投与量抗原送達による能動抑制は、自己免疫疾患、例えば、関節リウマチおよびＳＬＥの療法において非常に興味深い非関連免疫応答（バイスタンダー抑制）を抑制することもある。バイスタンダー抑制には、炎症性サイトカインおよびＴｈ１サイトカインが抗原特異的か抗原非特異的のどちらかで放出される局所環境におけるＴｈ１−対抗制御的サプレッサーサイトカインの分泌が関わっている。本明細書で使用する「免疫寛容」とは、この現象を指すために使用される。実際に、経口免疫寛容は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫性重症筋無力症、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）、およびインスリン依存性糖尿病を包含する動物における多くの自己免疫疾患の治療に有効とされてきた。これらのモデルにおいて、自己免疫疾患の予防および抑制は、Ｔｈ１からＴｈ２／Ｔｈ３応答への抗原特異的な体液性および細胞性応答のシフトに関係している。
本発明は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて抗原非特異的先天性免疫活性化および感染チャレンジに対する広域抵抗性を誘導するための方法も包含する。本明細書で使用する抗原非特異的先天性免疫活性化という用語は、Ｂ細胞以外の免疫細胞の活性化を指し、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞もしくは抗原非依存的に応答することができる他の免疫細胞またはこれらの細胞の一部の組合せの活性化を包含することがある。感染チャレンジに対する広域抵抗性が誘導されるのは、免疫細胞が、活性な形態であり、初回刺激され、侵入するいかなる化合物または微生物にも応答するためである。細胞は、特定の抗原に対して特異的に初回刺激される必要はない。このことは、生物戦争、および旅行者などの上記に記載されている他の環境において特に有用である。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、対象に直接投与することができ、または核酸送達複合体と併せて投与することができる。核酸送達複合体とは、標的化手段（例えば、標的細胞に高親和性結合をもたらす分子）と会合している（例えば、それとイオン結合または共有結合している；または、その内部にカプセル化されている）核酸分子を意味するものとする。核酸送達複合体の例は、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、陽イオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合剤（例えば、標的細胞特異的受容体により認識されるリガンド）と会合している核酸を包含する。好ましい複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、標的細胞による内部移行前の有意な脱共役を防ぐのに十分に安定であってよい。しかしながら、複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的な形態で放出されるように、細胞内の適切な条件下で切断可能であってよい。
抗原およびオリゴヌクレオチドを表面に送達するための送達ビヒクルまたは送達装置について記載されている。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療薬は、単独で（例えば、食塩水または緩衝液中で）、または当技術分野において知られている任意の送達ビヒクルを用いて投与することができる。例えば、以下の送達ビヒクル、すなわち、コクリエート（Ｃｈｏｃｈｌｉａｔｅｓ）；エマルソーム（Ｅｍｕｌｓｏｍｅｓ）、ＩＳＣＯＭ；リポソーム；生細菌ベクター（例えば、サルモネラ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｍａｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ）、赤痢菌、乳酸桿菌）；生ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）；マイクロスフェア；核酸ワクチン；ポリマー；ポリマー環；プロテオソーム；フッ化ナトリウム；トランスジェニック植物；ビロソーム；ウイルス様粒子について記載されている。他の送達ビヒクルは、当技術分野において知られており、一部の追加例は、ベクターの議論において以下で提供される。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量という用語は、望ましい生物学的効果を実現するのに必要または十分な量を指す。例えば、粘膜免疫性を誘導するために抗原と共に投与されるＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量は、抗原への曝露により抗原に応答してＩｇＡの発生を引き起こすのに必要な量であり、一方、全身性免疫を誘導するために必要とされる量は、抗原への曝露により抗原に応答してＩｇＧの発生を引き起こすのに必要な量である。本明細書に提供されている教示と組み合わせて、様々な活性化合物の中から選ぶこと、ならびに効力、相対的生物学的利用能、患者体重、有害副作用の重症度、および好ましい投与様式などの要素を比較検討することにより、実質的な毒性を引き起こさず、さらに、特定の対象を治療するのに全体的に有効である有効な予防的または治療的な処置レジメンを計画することができる。任意の特定の応用例にとっての有効量は、治療されている疾患または状態、投与されている特定のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの要素に応じて様々であってよい。当業者は、特定のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療薬の有効量を、必要以上の実験を必要とすることなく経験的に決定することができる。
粘膜送達または局所送達のための本明細書に記載されている化合物の対象投与量は、典型的には、１回の投与当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲であり、応用例に応じて、毎日、毎週、または毎月およびそれらの間のその他の時間に与えてもよい。より典型的には、粘膜投与量または局所投与量は、１回の投与当たり約１０μｇ〜５ｍｇ、最も典型的には、約１００μｇ〜１ｍｇの範囲であり、２〜４回の投与に数日または数週間の間隔が置かれる。より典型的には、免疫刺激剤投与量は、毎日または毎週の投与で、１回の投与当たり１μｇ〜１０ｍｇ、最も典型的には１０μｇ〜１ｍｇの範囲である。化合物が、別の治療薬でなく抗原と共に送達される、抗原特異的な免疫応答を誘導する目的で非経口送達するための本明細書に記載されている化合物の対象投与量は、典型的には、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激剤の応用例の場合に有効な粘膜投与量よりも５〜１０，０００倍高く、より典型的には、１０〜１，０００倍高く、最も典型的には、２０〜１００倍高い。先天性免疫応答を誘導する目的で、またはＡＤＣＣを増加させるため、または抗原特異的免疫応答を誘導するために非経口送達するための本明細書に記載されている化合物の投与量は、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、他の治療薬と組み合わせて、または特殊化した送達ビヒクルで投与される場合、１回の投与当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲であり、応用例に応じて、毎日、毎週、または毎月およびそれらの間のその他の時間に与えてもよい。より典型的には、これらの目的のための非経口投与量は、１回の投与当たり約１０μｇ〜５ｍｇ、最も典型的には、約１００μｇ〜１ｍｇの範囲であり、２〜４回の投与に数日または数週間の間隔が置かれる。しかしながら、一部の実施形態において、これらの目的のための非経口投与量は、上記に記載されている典型的な投与量よりも５〜１０，０００倍高い範囲で使用することができる。
本明細書に記載されている任意の化合物について、治療有効量は、まず動物モデルから決定することができる。治療有効投与量は、ヒトで試験された（ヒト臨床試験が開始された）ＣｐＧオリゴヌクレオチドならびに他のアジュバント、例えば、ＬＴおよびワクチン接種目的の他の抗原などの類似の薬理学的活性を示すことが知られている化合物についてのヒトデータからも決定することができる。非経口投与には、より高い投与量が必要とされることがある。適用される投与量は、相対的生物学的利用能および投与される化合物の効力に基づいて調整することができる。上記に記載されている方法および当技術分野においてよく知られているような他の方法に基づいて最大の有効性が得られるように投与量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
本発明の製剤は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバント、および場合により、他の治療用成分を日常的に含有することがある薬学的に許容できる液剤で投与される。
治療で使用する場合、有効量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを望ましい表面、例えば、粘膜、全身へ送達する任意の様式により対象に投与することができる。本発明の医薬組成物を投与することは、当業者に知られている任意の手段により行うことができる。投与の好ましい経路は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸を包含するが、これらに限定されるものではない。
経口投与の場合、化合物（すなわち、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチド、抗原および他の治療薬）は、１種または複数の活性化合物を、当技術分野においてよく知られている薬学的に許容できる担体と混ぜ合わせることにより容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、治療すべき対象による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬調製物は、固形賦形剤として取得し、場合により、得られる混合物を粉砕し、必要な場合に、適当な助剤を添加した後で顆粒の混合物を処理し、錠剤または糖剤コアを得ることができる。適当な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えることができる。場合により、経口製剤は、食塩水または緩衝液、すなわち、内部の酸性条件を中和するためのＥＤＴＡ中で製剤化してもよく、または担体なしに投与してもよい。
上記の１種または複数の構成成分の経口剤形も具体的に企図されている。１種または複数の構成成分は、誘導体の経口送達が効果的であるように化学的に修飾することができる。一般的に、企図される化学修飾は、構成成分分子自体への少なくとも１つの部分の接続であり、前記部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。１種または複数の構成成分の総体的安定性の増加および体内の循環時間の増加も望ましい。そのような部分の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリプロリンを包含する。ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ、１９８１、「Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ」、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ、ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ、編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３６７〜３８３ページ；Ｎｅｗｍａｒｋ、他、１９８２、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜１８９。用いることができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。上記に示すように、ポリエチレングリコール部分が薬学的用法として好ましい。
構成成分（または、誘導体）について、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であってよい。当業者は、胃で溶解しないであろうが、十二指腸または腸内のどこかで材料を放出するであろう利用可能な製剤を有する。放出は、オリゴヌクレオチド（または、誘導体）の保護、または腸におけるなどの胃環境を越えた生物学的活性材料の放出のどちらかにより、胃環境の有害な効果を回避することが好ましい。
完全な胃抵抗性を保証するためには、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、オイドラギットＬ３０Ｄ、アクアテリック（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、およびシェラックである。これらのコーティングは、混合型のフィルム剤として使用することができる。
胃に対する保護を意図しないコーティングまたはコーティングの混合物を錠剤上で使用することもできる。これは、糖コーティング、または錠剤の嚥下をより容易にするコーティングを包含することがある。カプセル剤は、乾燥治療薬、すなわち、粉末を送達するためのハードシェル（ゼラチンなど）からなることがあり、液状形態については、ソフトゼラチンシェルを使用することができる。カシェ剤のシェル材料は、粘度の高いデンプン、または他の食用紙であってよい。丸剤、ロゼンジ剤、成形錠剤または湿製錠剤（ｔａｂｌｅｔ ｔｒｉｔｕｒａｔｅｓ）については、湿式塊化（ｍｏｉｓｔ ｍａｓｓｉｎｇ）技法を使用することができる。
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒剤またはペレット剤の形態で微細な多粒子剤として製剤に包含することができる。カプセル投与のための材料の製剤も、粉末、軽度に圧縮されたプラグ、または錠剤であってよい。治療薬は、圧縮により調製されることがある。
着色剤および矯味剤がすべて包含されることがある。例えば、オリゴヌクレオチド（または、誘導体）を製剤化し（リポソームまたはマイクロスフェアカプセル化などにより）、次いで、着色剤および矯味剤を含有する冷蔵飲料などの食用製品内にさらに含有させることができる。
不活性材料で治療薬の体積を希釈または増加させることができる。これらの希釈剤は、炭水化物、特にマンニトール、ａ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを包含することができる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを包含する特定の無機塩も、充填剤として使用することができる。一部の市販希釈剤は、ファスト−フロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ）、エムデックス（Ｅｍｄｅｘ）、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、エンコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）およびアビセル（Ａｖｉｃｅｌｌ）である。
治療薬の固形剤形への製剤化に崩壊剤が包含されることがある。崩壊剤として使用される材料は、市販のデンプンベースの崩壊剤、エクスプロタブ（Ｅｘｐｌｏｔａｂ）を包含するデンプンを包含するが、これに限定されるものではない。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトはすべて使用することができる。別の形態の崩壊剤は、不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ゴムは、崩壊剤および結合剤として使用することができ、これらは、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末ゴムを包含することがある。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
結合剤は、硬質錠剤を形成して治療薬を一緒に保持するために使用されることがあり、アカシア、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなどの天然産物由来の材料を包含する。他のものは、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を包含する。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は共に、治療薬を顆粒化するためにアルコール性溶液中で使用されることがある。
抗摩擦剤（ａｎｔｉ−ｆｒｉｃｔｉｏｎａｌ ａｇｅｎｔ）は、製剤化プロセス中の固着を防ぐために治療薬の製剤中に包含されることがある。滑沢剤は、治療薬とダイ壁の間の層として使用することができ、これらは、そのマグネシウムおよびカルシウム塩を包含するステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスを包含するが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カルボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）４０００および６０００などの可溶性滑沢剤も使用することができる。
製剤化中に薬物の流動特性を改善し、圧縮中の再構成を助けることがある流動促進剤が加えられることがある。流動促進剤は、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和シリコアルミネートを包含することがある。
水性環境中への治療薬の溶解を助けるために、界面活性剤が浸潤剤として加えられることがある。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤を包含することがある。陽イオン性界面活性剤が使用されることがあり、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウム（ｂｅｎｚｅｔｈｏｍｉｕｍ）を包含することがある。界面活性剤として製剤に包含されることがある可能な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独か様々な比の混合物としてのどちらかで、オリゴヌクレオチドまたは誘導体の製剤中に存在することがある。
経口的に使用することができる医薬調製物は、ゼラチン製の押し込み式（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製の軟質密封カプセル剤を包含する。押し込み式カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤ならびに、場合により、安定化剤との混合物中に活性成分を含有することができる。軟質カプセル剤において、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤が加えられることがある。経口投与のために製剤化されたマイクロスフェアも使用されることがある。そのようなマイクロスフェアは、当技術分野において十分に定義されている。経口投与のためのすべての製剤は、そのような投与に適した用量であるべきである。
口腔投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることがある。
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用し、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当粉末基剤の粉末ミックスを含有するインヘイラーまたはインサフレーターで使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジ剤を製剤化することができる。
オリゴヌクレオチド（または、それらの誘導体）の肺送達も本明細書において企図されている。オリゴヌクレオチド（または誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を横断して血流に至る。吸入される分子の他の報告は、Ａｄｊｅｉ他、１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７：５６５〜５６９；Ａｄｊｅｉ他、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、６３：１３５〜１４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔ他、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１３（補遺５）：１４３〜１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄ他、１９８９、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第ＩＩＩ巻、２０６〜２１２ページ（ａ１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ他、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５〜１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎ他、１９９０、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、３月（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ他、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２〜３４８８（インターフェロン−ｇおよび腫瘍壊死因子α）およびＰｌａｔｚ他、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を包含する。全身効果のための薬物の肺送達のための方法および組成物は、Ｗｏｎｇ他による１９９５年９月１９日に出願された米国特許第５，４５１，５６９号に記載されている。
本発明の実施において使用するために、ネブライザー、定量インヘイラー、および粉末インヘイラーを包含するがこれらに限定されない治療用製品の肺送達のために設計された広範囲な機械装置が企図されており、それらはすべて、当業者にはよく知られている。
本発明の実施に適した市販の装置の一部の具体例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製のウルトラベント（Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ）ネブライザー；Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ製のアコーン（Ａｃｏｒｎ）ＩＩネブライザー；Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ製のベントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）定量インヘイラー；およびＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製のスピンヘイラー（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ）粉末インヘイラーである。
すべてのそのような装置は、オリゴヌクレオチド（または、誘導体）の分注に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、用いられる装置のタイプに特異的であり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／または担体の他に、適切な噴射剤材料の使用を含むことがある。リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接錯体、または他のタイプのキャリアの使用も企図されている。化学修飾されたオリゴヌクレオチドも、化学修飾のタイプまたは用いられる装置のタイプに応じて様々な製剤中で調製することができる。
ジェット式か超音波式のどちらかのネブライザーで使用するのに適している製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物学的に活性なオリゴヌクレオチド約０．１〜２５ｍｇの濃度で水に溶解されたオリゴヌクレオチド（または、誘導体）を含むであろう。製剤は、緩衝液および単糖（例えば、オリゴヌクレオチド安定化および浸透圧の調節のため）を包含することもある。ネブライザー製剤は、エアロゾルを形成する際に溶液の霧化により引き起こされるオリゴヌクレオチドの表面誘起凝集を軽減または予防するために、界面活性剤を含有することもある。
定量インヘイラー装置で使用するための製剤は、一般的に、界面活性剤を用いて噴射剤中に懸濁されるオリゴヌクレオチド（または、誘導体）を含有する微粉化した粉末を含むであろう。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタンを包含する炭化水素、またはそれらの組合せなどの、この目的で用いられる任意の従来の材料であってよい。適当な界面活性剤は、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンを包含する。オレイン酸も、界面活性剤として有用であることがある。
粉末インヘイラー装置から分注するための製剤は、オリゴヌクレオチド（または、誘導体）を含有する微粉化した乾燥粉末を含み、装置からの粉末の分注を容易にする量、例えば、製剤の５０〜９０重量％でラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤を包含することもある。オリゴヌクレオチド（または、誘導体）は、遠位肺への最も効果的な送達のために、１０ｍｍ未満（または、ミクロン）、最も好ましくは、０．５〜５ｍｍの平均粒径を有する粒子形態で調製することが最も有利である。
本発明の医薬組成物の鼻腔送達も企図されている。鼻腔送達は、肺における製品の沈着を必要とせずに、鼻に治療用製品を投与した直後に、血流への本発明の医薬組成物の通過を可能にする。鼻腔送達のための製剤は、デキストランまたはシクロデキストリンを含む製剤を包含する。
鼻腔投与の場合、有用な装置は、定量噴霧器が接続されている小型の硬質ボトルである。一実施形態において、定量は、本発明の医薬組成物溶液を、規定体積のチャンバー（チャンバーは、チャンバー内の液体が圧縮された場合にスプレーを形成することにより、エアロゾル製剤をエアロゾル化するための寸法にされた開口部を有する）内に引き込むことにより送達される。チャンバーは、本発明の医薬組成物を投与するために圧縮される。具体的実施形態において、チャンバーは、ピストン配列である。そのような装置は、市販されている。
あるいは、圧搾された場合にスプレーを形成することによりエアロゾル製剤をエアロゾル化するための寸法にされた開口部または開口を有するプラスチックの圧搾ボトルが使用される。開口は、普通、ボトルの頂部に見いだされ、頂部は、一般的に、エアロゾル製剤の効率的な投与のために、鼻道に部分的にフィットするように先を細くされている。鼻腔インヘイラーは、測定投与量の薬物を投与するために、一定量のエアロゾル製剤を提供することが好ましい。
化合物は、それらを全身に送達することが望ましい場合、注射による、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤が添加された単位剤形で、例えば、アンプル剤またはマルチドーズ容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョン剤などの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することがある。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態で活性化合物の水溶液を包含する。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁剤として調製することができる。適当な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有することがある。場合により、懸濁液は、適当な安定化剤、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を高める試剤を含有することもある。
あるいは、活性化合物は、使用前に、適当なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水で構成するための粉末形態であってよい。
化合物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または保留浣腸などの直腸または膣用組成物に製剤化することもできる。
これまでに記載されている製剤の他に、化合物は、デポ調製物として製剤化することもできる。そのような長時間作用型製剤は、適当なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩として製剤化することができる。
医薬組成物は、適当な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含むこともある。そのような担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを包含するが、これらに限定されるものではない。
適当な液状または固形医薬調製物形態は、例えば、マイクロカプセル化されている、渦巻形（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）にされている、微視的金粒子上にコーティングされている、リポソーム、噴霧されるエアロゾル、皮膚に埋め込むためのペレットに含有されている、または皮膚内に掻き入れるための鋭い物体上に乾燥されている、吸入用の水溶液または食塩溶液である。医薬組成物は、それらの調製において、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、矯味剤、甘味料または可溶化剤などの賦形剤および添加剤および／または助剤が上記に記載されているように習慣的に使用される、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルジョン剤、懸濁剤、クリーム剤、点滴剤または活性化合物が遅延放出される調製物も包含する。医薬組成物は、様々な薬物送達システムで使用するのに適している。薬物送達のための方法についての短い総説については、参照により本明細書に組み込まれているＬａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３、１９９０を参照されたい。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドならびに、場合により、他の治療薬および／または抗原は、そのまま（ニート）で、または薬学的に許容できる塩の形態で投与することができる。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に許容できるものでなければならないが、薬学的に許容できない塩を好都合に使用し、薬学的に許容できるそれらの塩を調製することができる。そのような塩は、以下の酸、すなわち、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製される塩を包含するが、これらに限定されるものではない。カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩などの塩も調製することができる。
適当な緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を包含する。適当な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を包含する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体に包含されていてもよい有効量のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび、場合により、抗原および／または他の治療薬を含有する。薬学的に許容できる担体という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物へ投与するのに適している１種または複数の適合性の固形または液状の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体という用語は、適用を容易にするように活性成分と混ぜ合わせられる、天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分は、望ましい薬学的効率を実質的に損なう可能性がある相互作用がないように、本発明の化合物と、またはお互いと、混ぜ合わせることができる。
本発明は、さらに制限すると決して解釈すべきでない以下の実施例によりさらに例示される。本出願を通じて引用される参考文献（参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願、および同時係属の特許出願を包含する）の全内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれるものとする。
材料および方法
オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）および試薬
すべてのＯＤＮは、標準的なホスホルアミダイト化学反応プロトコルに従って合成し、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＧｍｂＨにより同一性および純度について制御し、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）により測定される検出不可能な内毒素レベル（＜０．１ＥＵ／ｍｌ）を有していた。ＯＤＮを、無菌で内毒素を含まないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁し、微生物汚染と内毒素汚染の両方を予防するために無菌条件下で保存および操作した。すべての希釈は、内毒素を含まないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡを用いて行った。
ＴＬＲ９アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を、エレクトロポレーションにより、それぞれのヒトＴＬＲおよび６ｘＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを発現するベクターでトランスフェクトした。安定なトランスフェクタント（３×１０４細胞／ウェル）を、加湿したインキュベーター中で３７℃にて１６時間にわたって指示量のＯＤＮと共にインキュベートした。各データポイントは、３回ずつ行った。細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ遺伝子活性について（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｚａｖｅｎｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ製のＢｒｉｔｅＬｉｔｅキットを用いて）アッセイした。刺激指数は、ＯＤＮを添加しない培地のレポーター遺伝子活性を参照して計算した。
細胞精製
健康なヒトドナー由来の末梢血液バフィーコート調製物は、ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｓｓｅｌｄｏｌｆ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）上の遠心分離により精製した。細胞を、５％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、または１０％（ｖ／ｖ）加熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてＳｉｇｍａ製）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中３７℃にて、加湿したインキュベーター中で培養した。
サイトカイン検出およびフローサイトメトリー分析
ＰＢＭＣを、５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、９６ウェル丸底プレート（２５０μｌ／ウェル）に加えた。ＰＢＭＣを、ＯＤＮと共にインキュベートし、培養上清（ＳＮ）を、指定された時点後に集めた。すぐに使用しない場合、ＳＮを、必要になるまで−２０℃にて保存した。
ＳＮ中のサイトカインの量は、市販の抗体（ＰＢＬ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて開発されたＩＦＮ−α用の社内ＥＬＩＳＡを用い、またはＬｕｍｉｎｅｘ多重システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１２２１２ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ７８７２７−６１１５）上で評価した。
動物
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ（Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から購入し、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃａｎａｄａのｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ内のマイクロアイソレーターに収容した。すべての研究は、ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの指針の下にｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃｏｌｅｙ Ｃａｎａｄａに準拠して行った。すべての動物は、ＣｐＧ ＯＤＮに対してナイーブであった。
ＳＡ１Ｎ腫瘍モデル：雌性Ａ／Ｊマウス（１群当たり１０匹）に、０日目に５×１０５個のＳａＩ／Ｎ腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、腫瘍誘導後８日目に開始し、週に１回、皮下で与えるＯＤＮ１００μｇまたはＰＢＳ単独で処置した。動物を、生存および腫瘍体積についてモニターした。腫瘍サイズ（長さおよび幅）を、デジタルノギスを用いて測定した。腫瘍体積を、式：腫瘍体積＝（０．４）（ａｂ２）（ここで、ａは、長径であり、ｂは、短径である）を用いることにより計算した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（３〜５匹の動物のプールから）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに使用した。動物をイソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により安楽死させた。脾臓を無菌条件下で摘出し、ＰＢＳ＋０．２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）に入れた。次いで、脾臓をホモジナイズし、脾細胞を、２％正常マウス血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（それぞれ、最終濃度１０００Ｕ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、および５×１０−５Ｍ ｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）組織培養培地に再懸濁した。
Ｂ細胞増殖アッセイ
カボキシ（Ｃａｂｏｘｙ）−フロレセイン（ｆｌｏｒｅｓｃｅｉｎ）ジアセテート、スクシミジル（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ）エステル（ＣＦＳＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）染色ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（４×１０５／ウェル）を、５日にわたって３７℃にて加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で様々な濃度のＯＤＮと共にインキュベートした。次いで、細胞を、ＣＤ１９用のＰＥ結合抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色し、ＦＡＣＳと、続いて、ＭｏｄＦｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．０（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ Ｉｎｃ．、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ、ＵＳＡ）による分析によりＢ細胞増殖を決定した。
（実施例１）
ＣｐＧモチーフにおける構造活性相関の検討
非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドが、トール様受容体９（ＴＬＲ９）経路を介して免疫応答を刺激することができることは知られている。ＴＬＲ９経路を刺激する最高の能力を有するオリゴヌクレオチドを同定するために、ＣｐＧモチーフにおける包括的構造活性相関（ＳＡＲ）研究を行った。結果は、ヒポキサンチンおよび６−チオグアニンによるグアニンの置換が、ｈＴＬＲ９アッセイにおいて類似の活性につながるが、プリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−オキソ−７，８−ジヒドログアニンおよび７−デアザグアニン置換は、ｈＴＬＲ９刺激において４０〜８０％の低下をもたらすことを示した。さらに、Ｃ５およびＮ４における修飾は、ｈＴＬＲ９経路の刺激をもたらさなかった。これらの知見から、グアニンは、フーグスティーン部位を介して認識され、一方、シトシンは、Ｃ，Ｈ−エッジにおいてＴＬＲ９受容体と結合するＳＡＲモデルが得られた（図１ａを参照）。したがって、グアニンのフーグスティーン認識部位ならびにシトシンのＣ，Ｈ−エッジにおける無修飾は、ｈＴＬＲ９活性の有意な喪失なしに可能であった。ジヌクレオチドモチーフにおいて検討した塩基修飾のどれも、非修飾ＣｐＧモチーフよりも活性であった。
（実施例２）
ＣｐＧモチーフに近い疎水性チミン塩基形類似体の効果
ＣｐＧモチーフに隣接するｄＴ残基の影響を検討するために、２，４−ジフルオロトルエン（ＦＦ）（配列番号３〜９）、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＵ）および５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＪＵ）などのいくつかの疎水性チミン塩基形類似体をＣｐＧモチーフの外側に組み入れた（表１および図２〜３を参照）。驚いたことに、すべての試験した疎水性チミン類似体の組入れは、ｈＴＬＲ９活性の異常に強い増加につながったが、ウラシル残基（メチル基を欠くチミン、図４）による置換は、ｈＴＬＲ９刺激の強い減少につながった。ＴＬＲ９刺激の増加は、修飾がＣｐＧモチーフの５’側にある場合に顕著であった。ＣｐＧモチーフの５’および３’の５−ヨードウラシル（ＪＵ）による二重置換は、試験したもののうちで最も強力な刺激をもたらした。対照的に、ＣｐＧモチーフにおける２，４−ジフルオロトルエンによるグアニンおよびシトシンの置換は、両方の場合に、ＴＬＲ９刺激指数の強い減少につながった。
疎水性Ｔ類似体の組入れも、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導の強い増強をもたらした。予想外に、５−ブロモウリジンおよび５−ヨードウリジンによる、ＩＦＮ−αを誘導するのに実質的に不活性であるＯＤＮ（配列番号１）の修飾は、特に、ＴＬＲ９刺激およびＩＦＮ−α誘導の増加をもたらした。これらの修飾を含有しないＣｐＧ ＯＤＮについてはＴＬＲ９とＩＦＮ−α誘導の間に逆相関が通常存在する。
Figure 0006006183
（実施例３）
親油性塩基形置換基によるＴＬＲ９の活性化
ＣｐＧモチーフの５’側にある塩基の様々なタイプの親油性置換が、ｈＴＬＲ９の刺激の有意な増加を引き起こしたことから、５−クロロ−ウラシル、５−トリフルオロメチル−ウラシル、フェニル、アリールおよび置換アリール残基などの他の塩基類似体を、ｈＴＬＲ９を刺激するそれらの能力について検討した（表３）。様々な親油性塩基類似体で修飾されたＢクラスオリゴヌクレオチドによるヒトＴＬＲ９の活性化を検討するために、ＢクラスＯＤＮ配列番号１を、５−クロロ−２’−デオキシウリジン（ＣＵ）、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＵ）、５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＪＵ）および５−エチル−２’−デオキシウリジン（ＥＵ）で修飾した。ｈＴＬＲ９−ＮＦｋＢ−２９３細胞を１６時間にわたって指示されたＯＤＮ（図５ａ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を決定した。ＣＵ修飾（配列番号４１）、ＢＵ修飾（配列番号１０）ＪＵ修飾（配列番号１３）およびＥＵ修飾（配列番号４２）オリゴヌクレオチドはすべて、対照（配列番号１）よりも高いＴＬＲ９活性の刺激を示した。ウリジン修飾を有する配列番号１６は、劇的に減少した活性を示した。第二の実験では、ＩＦＮ−α産生を測定した（図５ｂ）。ヒトＰＢＭＣを、２４時間にわたって指示されたように修飾ＯＤＮと共にインキュベートした後、上清をＥＬＩＳＡにより試験した。ＪＵ修飾、ＢＵ修飾、およびＥＵ修飾ＯＤＮは、対照に対して最も高いＩＦＮ−αの増加をもたらした。これらのデータは、ＢクラスＯＤＮ上のｄＵの５’置換が、ＴＬＲ９活性およびＩＦＮ−α産生を増加させることを証明している。
ＴＬＲ９活性化に対するＥＵ修飾の効果をさらに検討するために、ＣｐＧの５’（配列番号４２）、ＣｐＧの３’（配列番号２９）、ならびにＣｐＧの５’および３’（配列番号３０）にＥＵ修飾を有する修飾オリゴヌクレオチドについて実験を繰り返した。配列番号４２および３０は、非修飾配列番号１および非修飾ＢクラスＯＤＮ配列番号３７を上回るＴＬＲ９活性化の有意な増加を示した（図６）。
Figure 0006006183
（実施例４）
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｐ、およびＴクラスのオリゴヌクレオチド上の親油性置換
ＯＤＮの様々なクラスに対する親油性塩基類似体置換の効果を検討するために、Ａクラス、Ｂクラス、Ｃクラス、Ｐクラス、およびＴクラスオリゴヌクレオチドに修飾を行った。これらのオリゴヌクレオチドの一部の実施例を表３に示す。
Figure 0006006183
修飾ＢクラスオリゴヌクレオチドによるヒトＴＬＲ９の活性化を検討するために、配列番号３７の５−ヨード−２’−デオキシウリジン修飾Ｂクラス誘導体を、ＴＬＲ９を活性化するそれらの能力についてルシフェラーゼアッセイにおいて評価した（材料および方法を参照）。すべての修飾Ｂクラスオリゴヌクレオチドは、非修飾配列番号３７を上回るＴＬＲ９活性化の有意な増加を示した（図７）。
修飾ＡクラスオリゴヌクレオチドによるヒトＴＬＲ９の活性化を検討するために、配列番号４３の５−ヨード−２’−デオキシウリジン修飾Ａクラス誘導体を、図５におけるようにルシフェラーゼアッセイ（図８ａ）およびＰＢＭＣアッセイ（図８ｂ）においてＴＬＲ９を活性化するそれらの能力について試験した。ＴＬＲ９刺激の増加は、修飾がＣｐＧモチーフの５’側にある場合に顕著であったが、ＣｐＧモチーフの５’および３’の５−ヨードウラシル（ＪＵ）による二重置換は、最も強力な刺激をもたらした。
修飾ＣクラスオリゴヌクレオチドによるヒトＴＬＲ９の活性化を検討するために、配列番号４６、配列番号４４および４５の５−ヨード−２’−デオキシウリジン修飾Ｃクラス誘導体を、ＴＬＲ９を活性化するそれらの能力について試験した。Ａクラス配列配列番号４３（非修飾）ならびに配列番号３５および３６を同時に試験した。図９に示すように、修飾ＯＤＮ配列番号３５、３６、４４、および４５はすべて、ルシフェラーゼアッセイにおいて非修飾ＡおよびＣクラスを越えるＴＬＲ９刺激の増加を示した。修飾ＰクラスオリゴヌクレオチドによるヒトＴＬＲ９の活性化を検討するために、配列番号４６の５−ヨード−２’−デオキシウリジン修飾Ｐクラス誘導体を、ルシフェラーゼアッセイにおいてＴＬＲ９を活性化するそれらの能力について試験した。図１０に示すように、修飾ＯＤＮ配列番号３１〜３３は、非修飾ＯＤＮを上回るＴＬＲ９刺激の増加を示した。
修飾ＴクラスオリゴヌクレオチドによるヒトＴＬＲ９の活性化を検討するために、非修飾ＴクラスＯＤＮ配列番号５２の５−ヨード−２’−デオキシウリジン修飾Ｔクラス誘導体を、ＴＬＲ９を活性化するそれらの能力について試験した。図１１に示すように、修飾ＯＤＮ配列番号４７〜５０は、ルシフェラーゼアッセイにおいて非修飾ＴクラスＯＤＮを上回るＴＬＲ９刺激の増加を示した。ウリジン誘導体配列番号５１は、ＴＬＲ９刺激の低下を示した。
上記の実施例が証明するように、ＣｐＧモチーフの５’側での親油性Ｔ類似体の置換は、試験したすべてのクラスにおいてＴＬＲ９活性化の強い増加をもたらし、ＩＦＮ−α産生を誘導する能力の増加をもたらした。
（実施例５）
短い修飾オリゴヌクレオチドによるＴＬＲ９の刺激
長さが２０ヌクレオチドの修飾ＣｐＧ ＯＤＮが、ＴＬＲ９活性化について普通でない親和性を示したため、極めて短いＣｐＧ ＯＤＮを、ＴＬＲ９を活性化するそれの能力について検討した。極めて短いオリゴヌクレオチドは、細胞による取り込みやすさの増加ならびにＤＯＴＡＰを使用しない潜在的可能なより簡単な製剤化のために、治療で使用するより長いオリゴヌクレオチドよりも有利であると思われる。３種の短いＣｐＧ ＯＤＮ（ショートマー）すなわち、六量体ＣｐＧモチーフ六量体（配列番号３８）、六量体の５’ＪＵ修飾（配列番号３９）、および六量体の５’３’ＪＵ修飾（配列番号４０）を検討した（表３）（表４）。ショートマーの活性を、ルシフェラーゼアッセイにおいて非修飾Ｂクラスオリゴヌクレオチド配列番号３７と比較した。図１２に示すように、配列番号４０については特に、修飾ショートマーの使用は、改善された免疫療法医薬品としての高い可能性を示している。
Figure 0006006183
（実施例６）
修飾オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｖｏでのＴＬＲ９経路の活性化
ｉｎ ｖｉｖｏでの本発明の修飾ＯＤＮの有効性を決定するために、親油性Ｔ類似体を有するＯＤＮを、単離マウス脾細胞において試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞を単離し、修飾Ｂクラス（配列番号１３）、非修飾Ｂクラス（配列番号３７）、および非ＣｐＧ ＯＤＮ（配列番号２６）と共にインキュベートした（表５）。培養上清を、６時間目（ＴＮＦ−α）または２４時間目（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）に集め、サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図１３に示すように、修飾配列番号１３とのインキュベーションは、試験したすべてのサイトカインの劇的に増加したレベルをもたらした。
次いで、ＯＤＮを、脾細胞におけるＢ細胞増殖を誘導するそれらの能力について試験した。ＣＦＳＥ染色ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（４×１０５／ウェル）を、指示されたＯＤＮ０．００１、０．０１、０．１、０．３、１、３または１０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした（図１４）。インキュベーション後７２時間目に、細胞を、細胞表面マーカーＣＤ１９について染色し、Ｂ細胞増殖を、ＦＡＣＳと、続いて、ＭｏｄＦｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅによる分析により決定した。図１４に示すように、修飾配列番号１３とのインキュベーションは、Ｂ細胞増殖の顕著な増加をもたらした。増加は、より低いＯＤＮ濃度であっても最も顕著であった。
ｉｎ ｖｉｖｏでの修飾ＯＤＮの効果を測定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹）に、総体積１００μｌ中の配列番号１３ １０、５０もしくは１００μｇまたは配列番号３７ １００μｇを皮下（ＳＣ）注射した。対照群は、ＰＢＳ１００μｌのみを受けた。動物を、注射の１時間後（ＴＮＦ−α）または注射の３時間後（ＩＰ−１０）に心臓穿刺により放血させた。血漿サンプルを、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α（図１５ａ）およびＩＰ−１０（図１５ｂ）についてアッセイした。修飾配列番号１３のＢＡＬＢ／ｃマウスの注射は、非修飾配列番号３７よりも高いＴＮＦ−αおよびＩＰ−１０産生をもたらし、本発明の親油性塩基形置換ＯＤＮが、非修飾免疫刺激性ＯＤＮよりも高いｉｎ ｖｉｖｏでの免疫刺激をもたらすことを証明している。
Figure 0006006183
（実施例７）
追加修飾を有するオリゴヌクレオチド
親油性塩基類似体を有するＯＤＮを、ルシフェラーゼアッセイにおいてＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性を誘導するそれらの能力について試験した（材料および方法を参照）。図１６〜２３は、追加修飾を有するＯＤＮの活性を示している（表６を参照）。
他の塩基類似体の活性を試験するために、６−ニトロ−ベンズイミダゾール（６ＮＢ）修飾ＯＤＮ配列番号１７８および非修飾親配列配列番号１の活性を比較した。図１２に示すように、配列番号１７８は、非修飾親配列に匹敵する程度までＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢを活性することができた。次に、５−（２−ブロモビニル）−ウリジン修飾ＯＤＮ（配列番号１５３〜１５４）の活性を、非修飾親配列配列番号１の活性と比較した。図１７に示すように、両方の修飾ＯＤＮは、このアッセイにおいて、親配列よりも活性であった。次に、親配列（配列番号１）のチミジンの代わりに５−プロイニル−ｄＵを有する２種のＢクラスＯＤＮ（配列番号１１６および１１７）の活性。図２１に示すように、両方の修飾ＯＤＮは、親配列の活性に匹敵する活性を有していた。修飾がＣＧジヌクレオチドの５’側にある配列番号１１６の活性は、親配列よりもわずかに改善された。
ＪＵ修飾ＯＤＮに対する第二のタイプの修飾の効果を試験するために、２’Ｏ−メチルグアノシンをＪＵ修飾ＯＤＮに組み入れた。２’Ｏ−メチルグアノシン／ＪＵ ＯＤＮ配列番号１１１〜１１３の活性を、親配列番号１およびＪＵのみ修飾配列番号１３の活性と比較した。図１８に示すように、すべてのＪＵ修飾ＯＤＮは、親ＯＤＮよりも活性であった。ＣＧジヌクレオチドの３’に２’Ｏ−メチルグアノシン修飾を有するＯＤＮ（配列番号１１２〜１１３）は、ＣＧジヌクレオチドの５’に２’Ｏ−メチルグアノシン修飾を有するＯＤＮ（配列番号１１１）またはＪＵ単独で修飾されたＯＤＮ（配列番号１３）よりもわずかに活性であった。
次に、ＪＵ修飾分岐ＯＤＮ（配列番号９６、９７、１０１、および１０２）の活性を、配列番号１の活性と比較した。図１９に示すように、２つの接近可能な５’末端を有する分岐ＯＤＮはすべて、このアッセイにおいて非修飾配列番号１と同程度かより活性であった。トリエチレングリコールホスフェートスペーサーを有する配列番号１０１および１０２は、３’−Ｏ−メチル−Ｇスペーサーを有する配列番号９６および９７よりも活性であった。
次に、短い非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号３８）および親油性置換ヌクレオチド類似体および親油性３’タグを有する同一配列のＯＤＮ（配列番号１２６）の活性を比較した。両者は、ＤＯＴＡＰと共に、およびＤＯＴＡＰなしに製剤化した。図２０に示すように、ＪＵ修飾および親油性タグの追加は、ＤＯＴＡＰの添加のように、ＯＤＮの活性を大きく増強した。
次に、親油性置換ヌクレオチド類似体の他に第二のヌクレオチド類似体を有するＢクラスＯＤＮ（配列番号１３８、７−デアザ−ｄＧ；配列番号１３９、イノシン；配列番号１４０、５−メチル−ｄＣ）の活性を、親配列（配列番号１）および親油性置換ヌクレオチド類似体のみを有する同一配列（配列番号１３）の活性と比較した。図２２に示すように、すべての修飾ＯＤＮは、親ＯＤＮよりもこのアッセイにおいて活性であった。
次に、親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＴクラスＯＤＮ（配列番号１３２〜１３４）の活性を、免疫刺激性であることが知られているＣクラスＯＤＮ（配列番号１９８）の活性と比較した。図２３に示すように、すべての修飾ＯＤＮは、非修飾ＣクラスＯＤＮよりもこのアッセイにおいてかなり高い活性を示した。
Figure 0006006183
（実施例８）
修飾Ｐクラスオリゴヌクレオチドの活性
親油性塩基類似体を有するＰクラスＯＤＮを、ルシフェラーゼアッセイにより測定されるようなＴＬＲ９を介するＮＦ−ｋＢ経路を活性化する能力について試験した。親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号５８〜６１）の活性を、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）の活性と比較した。図２４に示すように、すべての修飾ＰクラスＯＤＮは、対照に比較して増加したＴＬＲ９刺激を示した。図２４ａは、ＪＵ修飾ＰクラスＯＤＮを示し、２４ｂは、ＥＵ修飾ＰクラスＯＤＮを示している。
次に、修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号６４（ＥＵ修飾）、６６〜６７（ＪＵ修飾））の活性を、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）、ＣクラスＯＤＮ（配列番号６８）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５７）の活性と比較した。図２５に示すように、すべての修飾ＯＤＮは、非修飾ＰクラスＯＤＮよりも高度なＴＬＲ９刺激を示した。ＣＧジヌクレオチド中にホスホジエステル結合を有する配列番号６６は、完全なホスホロチオエート配列番号６７と比較して低下した活性を示した。
次に、修飾ＰクラスＯＤＮを、ＩＦＮ−αの発現を誘導するそれらの能力について試験した。親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号５８〜６１）の活性を、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定して、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）の活性と比較した。図２６に示すように、すべての修飾ＰクラスＯＤＮは、ＩＦＮ−α誘導の増加を示した。図２６ａは、ＪＵ修飾ＰクラスＯＤＮを示し、２６ｂは、ＥＵ修飾ＰクラスＯＤＮを示している。
次に、修飾ＰクラスＯＤＮ（ＥＵ修飾）、６６〜６７（ＪＵ修飾）を、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるようなＩＦＮ−αを誘導する能力について、Ｂクラス陽性対照（配列番号５５）、ＣクラスＯＤＮ（配列番号６８）および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５７）のそれと比較した。図２７に示すように、修飾ＰクラスＯＤＮは、ＩＦＮ−αを誘導する増強された能力を示した。図２４におけるように、配列番号６６は、配列番号６７と比較して低下した活性を示した。
次に、修飾ＰクラスＯＤＮを、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−６を誘導する能力について試験した。３名のドナー由来のＰＢＭＣを、２４時間にわたって指示された濃度のＯＤＮと共にインキュベートし、続いて、上清を、ＩＬ−６についてルミネックス（ｌｕｍｉｎｅｘ）２５−ｐｌｅｘにより分析した。修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６２、図２８ａ）（配列番号６４および６７、図２８ｂ）の活性を、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号５５）、および非修飾ＣクラスＯＤＮ（配列番号５４）、陰性対照ＯＤＮ（配列番号５３）、および非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）の活性と比較した。ＪＵ修飾ＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６１および６７）は、ＥＵ修飾ＯＤＮ（配列番号６２および６４）よりもわずかに高いＩＬ−６の活性化を示した。すべての修飾ＯＤＮは、非修飾ＯＤＮと比較して増加した活性を示した。
次に、修飾ＰクラスクラスＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６２、図２９ａ）（配列番号６４および６７、図２９ｂ）の活性を、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号５５）、非修飾ＣクラスＯＤＮ（配列番号５４）、陰性対照ＯＤＮ（配列番号５３）、非修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５６）、ＬＰＳ、Ｒ−８４８、ＳＥＢ、およびポリ［Ｉ］：［Ｃ］ＯＤＮの活性と比較した。３名のドナー由来のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、５日にわたってＯＤＮと共にインキュベートし、次いで、ＣＤ１９抗体で染色した。ＣＦＳＥ染色が減少したＢ細胞の割合を決定した。ＢクラスＯＤＮによる処理は、分裂後のＢ細胞の最も高い割合をもたらした。ＪＵ修飾ＯＤＮによる処理は、ＥＵ修飾ＯＤＮよりも高いＢ細胞の割合をもたらした。
ｉｎ ｖｉｖｏでの修飾ＰクラスＯＤＮの効果を決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹）に、様々な投与量のＯＤＮを皮下注射した。動物を、注射の３時間後に放血させ、血漿を、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−αについて試験した。修飾ＰクラスＯＤＮ（配列番号５８、６０〜６２、６４および６７）の活性を、Ｂクラス陰性対照（配列番号５５）および陰性対照（配列番号２６）の活性と比較した。図３０に示すように、ＪＵ修飾ＯＤＮ配列番号５８、６０、および６１による処置は、ＥＵ修飾ＯＤＮ配列番号６４よりもわずかに高いＩＦＮ−α誘導をもたらした。ＢクラスＯＤＮ配列番号５５は、予想通り、マウスＩＦＮ−αをかなり減少させなかった。
次に、修飾ＰクラスＯＤＮを、マウスＳＡ１Ｎ腫瘍モデルにおける腫瘍体積を減少させるそれらの能力について試験した。雌性Ａ／Ｊマウス（１群当たり１０匹）に、０日目に５×１０５個のＳａＩ／Ｎ腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、親油性置換ヌクレオチド類似体を有するＰクラスＯＤＮ（配列番号６０、６４および６７）、非修飾ＣクラスＯＤＮ、非修飾ＢクラスＯＤＮ（配列番号５５）またはＰＢＳ単独、３５μｇ（図３１ａ）または１００μｇ（図３１ｂ）で処置した。ＯＤＮは、腫瘍誘導後８日目に開始し、週に１回、皮下で与えた。動物を、生存および腫瘍体積についてモニターした。図３１ａに示すように、修飾ＰクラスＯＤＮによる低用量処置は、腫瘍体積に最も大きな減少を示し、これらのＯＤＮが、癌を治療するのに有用であることを示唆した。３１ｂにおけるより高い用量において、すべての修飾ＰクラスＯＤＮおよびＣクラスＯＤＮは、腫瘍体積を低減するのに有効であった。
Figure 0006006183
例示的修飾ＯＤＮの要約を表８に提供する。
Figure 0006006183
Figure 0006006183
Figure 0006006183
Figure 0006006183
Figure 0006006183
Figure 0006006183
均等物
以上に記載された明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分であると見なされる。本発明が、提供される実施例により範囲を限定されないのは、実施例が、本発明の一態様の単なる例示として意図されており、他の機能的に均等な実施形態が、本発明の範囲内にあるためである。本明細書に示されかつ記載されているものの他に、本発明の様々な改変形態は、上記の説明から当業者に明らかになると思われ、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本発明の利点および目的は、必ずしも本発明の各実施形態により包含されるわけではない。

Claims (4)

  1. 下記の配列のオリゴヌクレオチド
    JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
    (配列番号31)
    T*C*G*JU*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
    (配列番号32)
    JU*C-G*JU*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
    (配列番号33)
    JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
    (配列番号58)
    JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
    (配列番号59)
    EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
    (配列番号62)
    ［ここで、JUは５−ヨード−2´−デオキシウリジンを示し、EUは5−エチル−2´−デオキシウリジンを示し、*はホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を示し、−はホスホジエステルインターヌクレオチド結合を示す］
    から選ばれる一つからなる、オリゴヌクレオチド。
  2. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、抗原を更に含む、医薬組成物。
  3. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体を更に含む、医薬組成物。
  4. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、抗原および薬学的に許容される担体を更に含む、医薬組成物。
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