BRPI0717510A2 - Análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada - Google Patents

Análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada Download PDF

Info

Publication number
BRPI0717510A2
BRPI0717510A2 BRPI0717510-8A BRPI0717510A BRPI0717510A2 BR PI0717510 A2 BRPI0717510 A2 BR PI0717510A2 BR PI0717510 A BRPI0717510 A BR PI0717510A BR PI0717510 A2 BRPI0717510 A2 BR PI0717510A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
class
odn
oligonucleotide
dna
Prior art date
Application number
BRPI0717510-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Harald Debelak
Eugen Uhlmann
Marion Jurk
Original Assignee
Coley Pharm Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharm Gmbh filed Critical Coley Pharm Gmbh
Publication of BRPI0717510A2 publication Critical patent/BRPI0717510A2/pt
Publication of BRPI0717510B1 publication Critical patent/BRPI0717510B1/pt
Publication of BRPI0717510B8 publication Critical patent/BRPI0717510B8/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLOGOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO CPG CONTENDO ANÁLOGOS T HIDROFÓBI- COS COM ATIVIDADE IMUNOESTIMULATÓRIA INTENSIFICADA".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de modo geral, ao campo de i-
munologia. Mais especificamente, a invenção refere-se a oligonucleotídeos terapêuticos com capacidade imunoestimulatória intensificada. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
DNA bacteriano tem efeitos estimulatórios imunes para ativar células B e células assassinas naturais, mas DNA de vertebrado não (Toku- naga, T. et. al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T. et. al., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J.P. et. al., 1991, J. Immunol. 147: 1759- 1764; e revisto em Krieg, 1998, Em: Applied Oligonucleotide Technology,
C.A. Stein e A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY1 páginas 431-448). Agora, entende-se que esses efeitos estimulatórios imu- nes do DNA bacteriano são um resultado da presença de dinucleotídeos CpG não-metilados, em particular contextos de base (motivos CpG), os quais são comuns em DNA bactériano, mas metilados e sub-representados em DNA de vertebrado (Krieg et. al., 1995 Nature 374: 546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321: 1-10). Os efeitos estimulatórios imunes do DNA bacteriano podem ser imitados com oligodesoxinucleotídeos sintéticos (ODN) contendo esses motivos CpG. Tal ODN de CpG tem efeitos altamente estimulatórios sobre leucócitos humanos e de murino, induzindo à prolifera- ção de células B; secreção de citocina e imunoglobulina; atividade lítica de células assassinas naturais (NK) e secreção de IFN-γ; e ativação de células dendríticas (DCs) e outras células que apresentam antígeno para expressar moléculas coestímulatórias e secretar citocinas, especialmente as citocinas Do tipo Th1 que são importantes na promoção do desenvolvimento de res- postas de células T Do tipo Th1. Esses efeitos estimulatórios imunes do ODN de CpG com parte principal de fosfodiéster nativa são altamente espe- cíficos ao CpG pelo fato de que os efeitos são dramaticamente reduzidos se o motivo CpG é metilado, alterado para GpC ou de outro modo eliminado ou alterado (Krieg et. al., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann et. al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10).
Em estudos anteriores, acreditava-se que o motivo de CpH esti- mulatório imune seguia a fórmula purina-purina-CpG-pirimidina-pirimidina 5 (Krieg et. al., 1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et. al., 1998 EMBO J. 17: 6230-6240; Lipford et. al., 1998 Trends in Microbiol. 6: 496-500). Contudo, agora está claro que linfócitos de camundongo respondem muito bem aos motivos CpG de fosfodiéster que não seguem essa "fórmula" (Yi et. al., 1998 J. Immunol. 160: 5898-5906) e o 10 mesmo é verdadeiro para células B humanas e células dendríticas (Hart- mann et. al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).
Várias classes diferentes de ácidos nucleicos de CpG foram re- centemente descritas. Uma classe é potente para ativação de células B, mas 15 é relativamente fraca na indução de IFN-γ e ativação de células NK; essa classe foi denominada classe B. Ácidos nucleicos de CpG da classe B são, tipicamente, totalmente estabilizados e incluem um dinucleotídeo de CpG não-metilado dentro de determinados contextos de base preferidos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 20 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Outra classe de ácidos nucleicos de CpG ativa células B e células NK e induz ao IFN-γ; essa classe foi denominada a classe C. Os ácidos nucleicos de CpG da classe C, conforme primeiro carac- terizado, são, tipicamente, totalmente estabilizados, incluem uma seqüência do tipo classe B e um palindroma rico em GC ou palindroma semelhante. 25 Essa classe foi descrita no pedido de patente provisório US copendente 60/313.273, depositado em 17 de Agosto de 2001 e US10/224.523 deposi- tado em 19 de Agosto de 2002 e Pedido de Patente PCT relacionado PCT/US02/26468 publicado sob o Número de Publicação Internacional WO 03/015711.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a um oligonucleotídeo o qual compreende uma ou mais modificações que estimulam capacidade imunoestimulatória intensificada. Em particular, a invenção é baseada na descoberta de que subclasses específicas de oligonucleotídeos tendo pelo menos um análogo de nucleotídeo substituído lipofílíco são altamente eficazes em mediação de resposta imune. Esses oligonucleotídeos são úteis terapêutica e profilatica- 5 mente para indução de uma resposta imune e para tratamento de doenças e distúrbios, tais como câncer e infecções virais.
Em um aspecto, a invenção é uma composição compreendendo a seqüência: RiYZR2, em que Ri e R2 representam um análogo de nucleotí- deo substituído lipofílico (L), um nucleotídeo e uma ligação, em que pelo 10 menos um de Ri e R2 é um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (L)1 em que Y é um nucleotídeo de pirimidina e em que Z é um resíduo de puri- na, uma pirimidina ou um resíduo abásico.
Em algumas modalidades, L compreende um análogo de nucle- obase com anel de 5 ou 6 elementos.
Em outras modalidades do aspecto da invenção, L é um grupo
de fórmula I.
Fórmula I
tendo os seguintes elementos: A, B, X, D, E e F são C (carbono) ou N (nitro- gênio) opcionalmente trazendo hidrogênio ou um substituinte; n é 0 ou 1; as linhas pontilhadas indicam ligações duplas opcionais; em que pelo menos um substituinte não é escolhido do grupo consistindo em oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino, metila e hidrogênio e que o total de átomos A, B, X,
D, E e F não é mais do que 3 nitrogênios (N). Em alguns casos, n é 1 e, em outros casos, n é 0. Em algumas modalidades, todos os átomos A, B, X, D,
E, F são carbono (C). Em algumas modalidades, um, dois ou três dos áto- mos A, B, X, D, E, F são nitrogênio (N). De acordo com algumas modalida- des, pelo menos um dos átomos A, B, X, D, E, F é substituído por um dos seguintes: F, Cl, Br, I, alquila, alquenila, alquinila, alquila halogenada, alque- nila halogenada, cicloalquila, O-alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2;
-S-alquila, -SO-alquila, -S02-alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofeni- la, benzila, oxo, tio, hidróxi, mercapto e imino, em que pelo menos um substi- tuinte não é oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino ou metila.
De acordo com ainda outras modalidades, um dos dois átomos A ou E é substituído por um dos seguintes: F, Cl, Br, I, C2-C6-alquila, alqueni- 10 Ia, alquinila, alquila halogenada, alquenila halogenada, cicloalquila, O- alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2,' -S-alquila, -SO-alquila, -SO2- alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila ou metila contanto que, se metila, então, A, B, X, D, E e F são todos C.
Em algumas modalidades, a fórmula I compreende uma pirimidi- na substituída, uracila, tolueno, imidazol ou pirazol ou azola. De acordo com outras modalidades, a fórmula I é selecionada do seguinte: 5-cloro-uracila, 5- bromo-uracila, 5-iodo-uracila, 5-etil-uracila, 5-propil-uracila, 5-proinil-uracila, (E)-5-(2-bromovinil)-uracila e 2,4-difluoro-tolueno. De acordo com uma mo- dalidade da invenção, a fórmula I é fundida com um sistema de anel alifático ou aromático de 3 a 6 elementos. De acordo com outras modalidades, a fórmula I é ligada a uma porção de anticorpo com 5 a 6 elementos, incluindo uma pentose ou hexose. Em alguns casos, a pentose é furanose e hexose é uma piranose, a qual pode ser opcionalmente substituída por F, amino, alcó- xi, alcóxi-etóxi, aminopropila, alquenila, alquinila ou uma ligação em ponte de 02,C4-alquileno. Em outros casos, a furanose é ribose ou desoxirribose.
De acordo com algumas modalidades da invenção, Ri e R2 são ambos L. Em algumas modalidades, R1 é L e R2 é um nucleotídeo. Alternati- vamente, em alguns casos Ri é um L e R2 é uma ligação, de modo que o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ RiCG 3’. Outras modalidades 30 incluem oligonucleotídeos em que Ri é L e R2 é uma ligação e em que R3 é 5’ a R-ιYZ, de modo o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R3R1YZ 3’. Em algumas modalidades, Ri é L e R2 é uma ligação e em que um se- gundo Ri é 5’ a R-iYZ espaçado por um nucleotídeo N, de modo que o oligo- nucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R1NRiYZ 3’. Em alguns casos, o oligonucleotídeo pode incluir dois motivos 5’ R1NR1YZ 3’.
De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui Y, que é uma das seguintes pirimidinas: citocina, 5-metil-citosina, 5-hidróxi- citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-halogeno-citosina, 2-tiocitosina, 4- tiocitosina, N3-metil-citosina, N4-alquil-citosina ou uma citosina 6-substituída.
De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui Z, que é um nucleotídeo de purina incluindo: guanina, 7-deaza-guanina, hi- 10 poxantina, 7-deaza-hipoxantina, 2-amino-purina, 4-tio-purina, 2.6-diamino- purina, 8-oxo-7.8-di-hidroguanina, 7-tia-8-oxo-7.8-di-hidroguanina, 7-alil-8- oxo-7.8-di-hidroguanina, 7-deaza-8-aza-guanina, 8-aza-guanina, N1-metil- guanina ou purina. Em outras modalidades, Z é um nucleotídeo de pirimidi- na, incluindo T.
De acordo com algumas modalidades da invenção, R2 é L e R1 é
um nucleotídeo.
De acordo com algumas modalidades, o oligonucleotídeo tem entre 3-100 nucleotídeos de comprimento; por exemplo, o oligonucleotídeo tem 3-6 nucleotídeos de comprimento, 3-100 nucleotídeos de comprimento 20 ou 7-100 nucleotídeos de comprimento. Em algumas circunstâncias, o oligo- nucleotídeo é rico em T, de modo que pelo menos 80% dos nucleotídeos são T.
A invenção inclui modalidades compreendendo pelo menos uma seqüência palindrômica. Por exemplo, em alguns casos, o oligonucleotídeo inclui duas seqüências palindrômicas.
De acordo com a invenção, algumas modalidades incluem um a quatro dinucleotídeos de CG não-metilados. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo pode incluir pelo menos uma seqüência (G)m, em que m é
4 a 10. Em alguns casos, pelo menos um, mas até todos os dinucleotídeos de CG são não-metilados. De acordo com algumas modalidades, o oligonu- cleotídeo pode, adicionalmente, compreender uma modificação de não nu- cleotídeo. As modificações de não nucleotídeo incluem, mas não estão Iimi- tadas a: C6-C48-polietilenoglicol, C3-C2o-alcano-diol, Iigante de C3-C18- alquilamino, Iigante de C3-Ci8-alquiltiol, colesterol, ácido biliar, ácido graxo saturado ou insaturado, folato, um hexadecil-glicerol ou um grupo di- hexadecil-glicerol, um octadecil-glicerol ou um grupo dioctadecil-glicerol, um 5 grupo vitamina E. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo da invenção ainda compreende uma porção ramificada não-nucleotídica ou uma porção ramificada nucleotídica. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo inclui uma porção ramificada em que o oligonucleotídeo tem pelo menos duas ex- tremidades 5'.
De acordo com a invenção, algumas modalidades incluem pelo
menos dois nucleotídeos do oligonucleotídeo têm uma ligação estabilizada, incluindo: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfosfonotioato bo- ranofosfonato, fosforamidato ou uma ligação defosfo, quer como uma mistu- ra enantiomérica ou configuração S ou R enantiomérica.
Em algumas modalidades, o YZ de R1YZR2 tem uma ligação de
fosfodiéster ou uma ligação de fosforotioato. Em alguns casos, o RiY e ou o ZR2 de R-ιYZR2 tem uma ligação fosforotioato. Em algumas modalidades, todos os outros nucleotídeos têm uma ligação de fosforotioato.
De acordo com algumas modalidades da invenção, o oligonucle- otídeo é isento de um microveículo, incluindo um veículo lipídico.
De acordo com a invenção, os oligonucleotídeos podem ser um oligonucleo- tídeo da classe A, um oligonucleotídeo da classe B, um oligonucleotídeo da classe C, um oligonucleotídeo da classe P ou um oligonucleotídeo da classe T. Para o oligonucleotídeo de classe B da invenção, algumas modalidades 25 incluem a seqüência 5' TcN1TX1X2CGXsX4 3', em que Xi é G ou A; X2 é T1 G , ou A; X3 é T ou C e X4 é T ou C; e N é qualquer nucleotídeo e N1 e N2 são seqüências de ácido nucleico de cerca de 0-25 N’s cada.
De acordo com algumas modalidades da invenção, o oligonucle- otídeo compreende pelo menos uma ligação 3’-3’ e/ou pelo menos uma Iiga- ção 5’-5’.
Em outro aspecto, a invenção é uma composição dos oligonu- cleotídeos descritos aqui em combinação com um antígeno ou outro com- posto terapêutico, tal como um agente antimicrobiano. O agente antimicrobi- ano pode ser, por exemplo, um agente antiviral, um agente antiparasítico, um agente antibacteriano ou um agente antifúngico.
Uma composição de um dispositivo com liberação sustentada incluií ido os oligonucleotídeos descritos aqui é proporcionada de acordo com outro aspecto da invenção.
A composição pode, opcionalmente, incluir um veículo farmacêu- tico e/ou ser formulada em um dispositivo de distribuição. Em algumas mo- dalidades, o dispositivo de distribuição é selecionado do grupo consistindo 10 em lipídios catiônicos, proteínas de permeação celular e dispositivos com liberação sustentada. Em uma modalidade, o dispositivo com liberação sus- tentada é um polímero biodegradável ou uma micropartícula.
De acordo com outro aspecto da invenção, um método de esti- mulação de uma resposta imune é proporcionado. O método envolve admi- 15 nistração de um oligonucleotídeo a um indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir a uma resposta imune no indivíduo. De preferência, o oligonu- cleotídeo é administrado oralmente, localmente, em um dispositivo com libe- ração sustentada, mucosalmente, sistemicamente, parenteralmente ou in- tramuscularmente. Quando o oligonucleotídeo é administrado à superfície 20 mucosal, ele pode ser distribuído em uma quantidade eficaz para induzir a uma resposta imune mucosal ou uma resposta imune sistêmica. Em modali- dades preferidas, a superfície mucosal é selecionada do grupo consistindo em uma superfície oral, nasal, retal, vaginal e ocular.
Em algumas modalidades, o método inclui exposição do indiví- duo a um antígeno, em que a resposta imune é uma resposta imune antíge- no-específica. Em algumas modalidades, o antígeno é selecionado do grupo consistindo em um antígeno tumorígeno, um antígeno viral, um antígeno bacteriano, um antígeno parasítico e um antígeno peptídico.
Os oligonucleotídeos são úteis para tratamento de câncer em um indivíduo tendo câncer ou em um indivíduo em risco de desenvolver cân- cer (por exemplo, redução do risco de desenvolver câncer). O câncer pode ser selecionado do grupo consistindo em câncer do trato biliar, câncer de mama, câncer cervical, coriocarcinoma, câncer de cólon, câncer endometri- al, câncer gástrico, neoplasmas intraepiteliais, linfomas, câncer de fígado, câncer de pulmão (por exemplo, células pequenas e células não-pequenas), melanoma, neuroblastomas, câncer oral, câncer ovariano, câncer pancreáti- 5 co, câncer de próstata, câncer retal, sarcomas, câncer da tiróide e câncer renal, bem como outros carcinomas e sarcomas. Em algumas modalidades importantes, o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer ósseo, câncer de cérebro e CNS, câncer de tecido conectivo, câncer esofageal, câncer de olho, Iinfoma de Hodgkin, câncer de laringe, câncer de cavidade 10 oral, câncer de pele e câncer testicular.
Os oligonucleotídeos podem também ser usados para aumento da responsividade de uma célula cancerígena a uma terapia para o câncer (por exemplo, uma terapia anticâncer), opcionalmente quando o oligonucleo- tídeo imunoestimulatório de CpG é administrado em conjunto com uma tera- 15 pia anticâncer. A terapia anticâncer pode ser uma quimioterapia, uma vacina (por exemplo, uma vacina de célula dendrítica produzida in vitro ou uma va- cina de antígeno cancerígeno) ou uma terapia baseada em anticorpo. Essa última terapia pode também envolver administração de um anticorpo especí- fico para um antígeno na superfície celular, por exemplo, de uma célula can- 20 cerígena, em que a resposta imune resulta em citotoxicidade celular anticor- po-dependente (ADCC). Em uma modalidade, o anticorpo pode ser selecio- nado do grupo consistindo em Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar1 LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, an- 25 tiVEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti- FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab e Immu- RAIT-CEA.
Assim, de acordo com alguns aspectos da invenção, a um indi-
víduo tendo câncer ou em risco de ter um câncer é administrado um oligonu- cleotídeo e uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a terapia anti- câncer é selecionada do grupo consistindo em um agente quimioterapêutico, um agente imunoterapêutico e uma vacina contra o câncer.
A invenção, em outros aspectos, refere-se a métodos para pre- venção de doenças em um indivíduo. O método envolve administração, ao 5 indivíduo, de um oligonucleotídeo em uma base regular para promover a responsividade do sistema imune para prevenir doença no indivíduo. Exem- plos de doenças ou condições podem ser prevenidas usando os métodos profiláticos da invenção incluem infecções microbianas (por exemplo, doen- ças sexualmente transmissíveis) e choque anafilático por alergias alimenta- 10 res.
Em outros aspectos da invenção, um método para tratamento de uma infecção viral ou retroviral é proporcionado. O método envolve adminis- tração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção viral ou retrovi- ral, de uma quantidade eficaz para tratamento da infecção viral ou retroviral 15 de qualquer uma das composições da invenção. Em algumas modalidades, o vírus é causado por um vírus da hepatite, por exemplo, hepatite B, hepatite C, HIV, vírus do herpes ou papilomavírus.
Um método para tratamento de uma infecção bacteriana é pro- porcionada de acordo com outro aspecto da invenção. O método envolve 20 administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção bacte- riana, de uma quantidade eficaz para tratamento da infecção bacteriana de qualquer uma das composições da invenção. Em uma modalidade, a infec- ção bacteriana é em virtude de uma bactéria intracelular.
Em outro aspecto, a invenção é um método para tratamento de 25 uma infecção parasítica através de administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção parasítica, de uma quantidade eficaz para tra- tamento da infecção parasítica de qualquer uma das composições da inven- ção. Em uma modalidade, a infecção parasítica é em virtude de infecção de qualquer uma das composições da invenção. Em uma modalidade, a infec- 30 ção parasítica é em virtude de um parasita intracelular. Em outra modalida- de, a infecção parasítica é em virtude de um parasita não-helmíntico.
Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano e, em outras modalidades, o indivíduo é um vertebrado não-humano selecionado do grupo consistindo em um cão, um gato, cavalo, vaca, porco, peru, cabra, peixe, macaco, galinha, rato, camundongo e ovelha.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tra- tamento de doença auto-imune através de administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter uma doença autoimune, de uma quantidade eficaz para tratamento ou prevenção da doença autoimune de qualquer uma das composições da invenção.
A invenção, em alguns aspectos, é um método para tratamento de remodelamento das vias aéreas, asma ou alergia compreendendo: admi- nistração, a um indivíduo, de qualquer uma das composições da invenção, em uma quantidade eficaz para tratamento ou prevenção da doença autoi- mune de qualquer uma das composições da invenção.
A invenção, em alguns aspectos, é um método para tratamento 15 de remodelamento das vias aéreas, asma ou alergia compreendendo: admi- nistração, a um indivíduo, de qualquer uma das composições da invenção, em uma quantidade eficaz para tratar remodelamento das vias aéreas, asma ou alergia no indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo tem asma, doença pulmonar obstrutiva crônica ou é um fumante. Em outras modalidades, o 20 indivíduo não tem sintomas de asma.
Uso de um oligonucleotídeo da invenção para estimulação de uma resposta imune é também proporcionado como um aspecto da inven- ção.
Um método para fabricação de um medicamento de um oligonu- cleotídeo da invenção para estimulação de uma resposta imune é também proporcionado.
Cada uma das limitações da invenção pode abranger várias modalidades da invenção. Portanto, é previsto que cada uma das limitações da invenção en- volvendo qualquer elemento ou combinações de elementos pode ser incluí- 30 da em cada aspecto da invenção. A presente invenção não está limitada quanto à sua aplicação aos detalhes de construção e à disposição dos com- ponentes apresentados na descrição a seguir ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou ser realizada de várias formas. Também, a fraseologia e terminologia usadas aqui são para fins de descrição e não deverão ser consideradas como limitativas. O uso de "incluindo", "compreendendo" ou "tendo", "contendo", "envolvendo" e 5 variações dos mesmos aqui se destina a abranger os itens listados aqui de- pois e equivalentes dos mesmos, bem como itens adicionais.
BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS
A figura 1 são dois desenhos ilustrando a estrutura das bases modificadas da invenção. A figura 1a mostra uma seção de um motivo de hexâmero de CpG (GTCGTT). A figura 1b mostra os análogos de formato hidrofóbico incorporados de 2’-deoxitimidina: 2,4-Difluorotolueno (FF), 5- bromouridina (BU) e 5-iodouridina (JU).
A figura 2 é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio de Iuciferase com oligonucleotídeo da classe B (ODN) modificados com aná- 15 logo em formato de timina 2,4-difluorotolueno (FF). A atividade do ODN FF- modificado (SEQ ID NO: 3-9) foi comparada àquela da seqüência precursora da classe B não-modificada (SEQ ID NO: 1), seqüência precursora PS total (SEQ ID NO: 2) e um terceiro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). Células hTLR9-LUC-293 foram estimuladas com quantidades indicadas 20 de ODN e a estimulação de NF-κΒ foi determinada através de medição da atividade de Iuciferase 16h depois. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativo.
A figura 3 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN da classe B modificado. Timidina (T) foi substi- 25 tuída por 5-bromo-2’-desoxiuridina (BU) (SEQ ID NO: 10-12) e 5-iodo-2’- desoxiuridina (JU) (SEQ ID NO: 13-15). Sua atividade foi comparada àquela da seqüência precursora da classe B não-modificada (SEQ ID NO: 1), se- qüência precursora PS total (SEQ ID NO: 2) e um terceiro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). Células hTLR9-LUC-293 foram estimula- 30 das com quantidades indicadas de ODN e a estimulação de NF-κΒ foi de- terminada através de medição da atividade de Iuciferase 16h depois. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativo.
A figura 4 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN da classe B modificado. 2’-deoxitimidina (T) foi substituída por 2’-desoxiuridina (U) (SEQ ID NO: 16-18). A atividade do ODN 5 U-modificado foi comparada àquela da seqüência precursora da classe B não-modificada (SEQ ID NO: 1), seqüência precursora PS total (SEQ ID NO: 2) e um terceiro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). Células hTLR9-LUC-293 foram estimuladas com as quantidades indicadas de ODN e a estimulação de NF-κΒ foi determinada através de medição da atividade de 10 Iuciferase 16h depois. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o ei- xo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 5 são dois gráficos demonstrando os resultados de um ensaio de Iuciferase e um ensaio com PBMC com ODN da classe B modifi- cado. A atividade relativa de um ODN com 5-Etil-2’-desoxiuridina (EU) (SEQ 15 ID NO: 42), 2’-desoxiuridina (U) (SEQ ID NO: 16), 5-iodo-2’-desoxiuridina (JU) (SEQ ID NO: 13), 5-bromo-2’-desoxiuridina (BU) (SEQ ID NO: 10) e 5- Cloro-2’-desoxiuridina (CU) (SEQ ID NO: 41) foi comparada àquela da se- qüência precursora (SEQ ID NO: 1). A figura 5a mostra a atividade de TLR9 e a figura 5b mostra a produção de IFN-alfa. É mostrada a média +/- SEM de 20 três doadores. Os eixos x são a concentração de ODN em μΜ e os eixos y são o índice de estimulação relativa (figura 5a) ou a concentração de IFN- alfa em pg/ml (figura 5b).
A figura 6 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN EU-modificado. A atividade do ODN EU- 25 modificado SEQ ID NO: 29, 30 e 42 foi comparada àquela da seqüência pre- cursora (SEQ ID NO: 1) e outro ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). O eixo x é a concentração de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 7 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN da classe B modificado. A atividade de SEQ ID NO: 19-24 JU-modificado foi comparada àquela da seqüência precursora SEQ ID NO: 37. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 8 são dois gráficos demonstrando os resultados de um ensaio de Iuciferase e um ensaio com PBMC com um ODN da classe A mo- dificado. A atividade de SEQ ID NO: 35-37 JU-modificado foi comparada à- 5 quela da seqüência precursora não-modificada (SEQ ID NO: 43) e com o ODN da classe B não-modificado SEQ ID NO: 1. A figura 8a mostra a ativi- dade de TLR9 e a figura 8b mostra a produção de IFN-alfa. É mostrada a média +/- SEM de três doadores. Os eixos x são a concentração Iog de ODN (figura 8a) ou a concentração de ODN (figura 8b) em μΜ e os eixos y são o 10 índice de estimulação relativa (figura 8a) ou a concentração de IFN-alfa em pg/ml (figura 8b).
A figura 9 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN da classe C modificado. A atividade do ODN da classe C JU-modificado SEQ ID NO: 27-28 e 44-45 foi comparada àquela da 15 seqüência precursora não-modificada SEQ ID NO: 45 e um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37). O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 10 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com um ODN da classe P modificado. A atividade de SEQ ID NO: 31-33 JU-modificado foi comparado àquela da seqüência precursora não-modificada (SEQ ID NO: 52). O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 11 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN da classe T modificado. A atividade de SEQ ID 25 NO: 47-50 JU-modificado e SEQ ID NO: 51 U-modificado foi comparada à- quela da seqüência precursora não-modificada SEQ ID NO: 25. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relati- va.
A figura 12 é um gráfico demonstrando os resultados de um en- saio de Iuciferase com ODN curto. A atividade do ODN curto JU-modificado SEQ ID NO: 39-40 foi comparada àquela da seqüência precursora não- modificada SEQ ID NO: 38 e com o ODN da classe B SEQ ID NO: 37. Os ODNs foram formulados com e sem DOTAP. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 13 são quatro gráficos mostrando os resultados de um ensaio ELISA que mede a concentração de citocina em sobrenadantes de 5 cultura de esplenócitos onde esplenócitos de camundongo BALB/c foram cultivados com diferentes ODNs. Os sobrenadantes de cultura foram coleta- dos a 6 horas (para TNF-alfa) ou 24 horas (para IL-6, IL-10 e IL-12). As ativi- dades de um ODN da classe B JU-modificado (SEQ ID NO: 13), um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37) e um ODN de controle negativo 10 de não-CpG (SEQ ID NO: 26) foram comparadas. As figuras 13a-d mostram a concentração de TNF-alfa, IL-6, IL-10 e IL-12, respectivamente. Os eixos x são a concentração de ODN em pg/ml e os eixos y são a concentração de citocina em pg/ml.
A figura 14 é um gráfico mostrando os resultados de análise por 15 FACS de proliferação de células B. esplenócitos de camundongo BALB/c corados com CFSE (4 x 105/cavidade) foram incubados com 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 ou 10 pg/ml de ODN. A 72 horas pós-incubação, as células fo- ram coradas para CD19 e a proliferação de células B foi determinada atra- vés de FACS, seguido por análise através do software ModFit. As atividades 20 de um ODN da classe B JU-modificado (SEQ ID NO: 13), um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37) e um ODN de controle negativo de não- CpG (SEQ ID NO: 26) foram comparadas. O eixo x é a concentração de ODN em pg/ml e o eixo y é a proliferação relativa de células B.
A figura 15 são dois gráficos mostrando a produção de citocina 25 in vivo, conforme medido através de ELISA. Camundongos BALB/c (5 por grupo) foram injetados SC com 10, 50 ou 100 pg de ODN. O grupo de con- trole recebeu 100 pl de PBS apenas. O sangue dos animais foi coletado a- través de punção cardíaca em 1 hora (para TNF-alfa) ou 3 horas (para IP- 10) pós-injeção e o plasma avaliado com relação ao TNF-alfa e IP-10 atra- 30 vés de ELISA. As atividades de um ODN da classe B JU-modificado (SEQ ID NO: 13) e um ODN da classe B não-modificado ODN (SEQ ID NO: 37) foram comparadas. A figura 15a mostra a concentração de TNF-alfa e a figura 15b mostra a concentração de IP-10. Os eixos x são a dose de ODN em pg e os eixos y são a concentração de citocina em pg/ml.
A figura 16 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ TLR9- mediada por ODN da classe B com uma base universal (6-nitrobenzimidazol) 5 (SEQ IC NO: 178) em lugar de timidina na seqüência precursora (SEQ ID NO: 1). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indi- cadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 17 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ TLR9-
mediada por ODN da classe B com 5-(2-bromovinil)-uridina (SEQ ID NO: 153 e 154) em Iugarde timina na seqüência precursora (SEQ ID NO: 1). Cé- lulas hTLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através 15 de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 18 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ TLR9- mediada por ODN da classe B com uma modificação de açúcar (2’-0- metilguanosina) além de um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico 20 (SEQ ID NO: 111-113). A atividade desse ODN foi comparada àquela da seqüência precursora (SEQ ID NO: 1) e a mesma seqüência com um análo- go de nucleotídeo substituído lipofílico apenas (SEQ ID NO: 13). Células h- TLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de me- 25 dição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 19 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ TLR9- mediada através de ODN da classe B ramificado com múltiplas extremida- des 5’ acessíveis. A atividade do ODN ramificado (SEQ ID NO: 96, 97, 101 e 30 102) foi comparada àquela de SEQ ID NO: 1. Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de medição da atividade de Iucife- rase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concen- tração de IFN-α em pg/ml.
A figura 20 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ TLR9- mediada através de um ODN da classe B não-modificado curto (SEQ ID NO: 5 38) e um ODN da mesma seqüência com um análogo de nucleotídeo substi- tuído lipofílico e uma tag 3’ lipofílica (SEQ ID NO: 126). Ambos foram formu- lados com e sem DOTAP. Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com as quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi deter- minada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é 10 a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 21 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ TLR9- mediada por dois ODN's da classe B com 5-proinil-dU (SEQ ID NO: 116 e 117) em lugar de timina da seqüência precursora (SEQ ID NO: 1). Células 15 hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nu- cleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de medi- ção da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 22 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ hTLR9- 20 mediada por ODN da classe B com um segundo análogo de nucleotídeo a- lém de um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 138, 7- deaza-dG; SEQ ID NO: 139, inosina; SEQ ID NO: 140, 5-metil-dC). A ativi- dade desse ODN foi comparada àquela da seqüência precursora (SEQ ID NO: 1) e a mesma seqüência com um análogo de nucleotídeo substituído 25 lipofílico apenas (SEQ ID NO: 13). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 23 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ hTLR9-
mediada por ODN da classe T com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 132-134). A atividade do mesmo foi comparada àque- Ia de um ODN da classe C imunoestimulatório (SEQ ID NO: 198). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nu- cleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de medi- ção da atividade de luciferase. O eixo x é a concentração Iog de ODN em
μΜ e o eixc y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 24 são dois gráficos mostrando a ativação de NF-κΒ hTLR9-meciiada por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo subs- tituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-63). A figura 24a mostra a atividade de SEQ ID NO: 58-61 comparado àquela de um controle positivo da classe B (SEQ 10 ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). A figura 24b mostra a atividade de SEQ ID NO: 62-63 comparado àquela dos mes- mos controles positivos e negativos. Células hTLR9-LUC-293 foram incuba- das com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-kB foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O 15 eixo x é a concentração Iog de ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimu- lação relativa.
A figura 25 é um gráfico mostrando a ativação de NF-κΒ hTLR9- mediada por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 64, 66-67). A atividade do mesmo é comparada àque- 20 Ia de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57). Células hTLR9-LUC-293 foram incubadas com quantidades indicadas de ácidos nucleicos e a ativação de NF-κΒ foi determinada 16h depois através de medição da atividade de luciferase. O eixo x é Iog da concentração de 25 ODN em μΜ e o eixo y é o índice de estimulação relativa.
A figura 26 são dois gráficos mostrando a indução de IFN-α por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-63). A figura 26a mostra a atividade de SEQ ID NO: 58-61 compa- rada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN 30 da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). A figura 26b mostra a ativida- de de SEQ ID NO: 62-63 comparada àquela dos mesmos controles positivos e negativos. PBMCs humanas foram incubadas com o ODN indicado duran- te 48 horas. IFN-α foi, então, determinado nos sobrenadantes de cultura de célula através de ELISA. Os eixos χ são a concentração de ODN em μΜ e os eixos y são a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 27 é um gráfico mostrando a indução de IFN-α por um ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 64, 66-67). A atividade do mesmo é comparada àquela de um contro- le positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57). PBMCs hu- manas foram incubadas com o ODN indicado durante 48 horas. IFN-α foi, então, determinado nos sobrenadantes de cultura de célula através de ELI- SA. Os eixos χ são a concentração de ODN em μM e os eixos y são a con- centração de IFN-α em pg/ml.
A figura 28 são dois gráficos mostrando a indução de IL-6 por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 28a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 28b). A atividade foi comparada àquela de um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55) e ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de con- trole negativo (SEQ ID NO: 53) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). PBMCs desses três doadores foram incubadas com o ODN du- rante 24 horas e os sobrenadantes foram analisados com luminex. É mos- trada a média +/- SEM. Os eixos χ são a concentração de ODN em μΜ e os eixos y são a concentração de IL-6 em pg/ml.
A figura 29 são dois gráficos mostrando a proliferação de células B após tratamento com ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 29a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 29b). A atividade foi comparada àquela de um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo (SEQ ID NO: 53), ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56), LPS1 R-848, SEB e um poli[l]: [C] ODN. PBMC CFSE-rotulada de três doadores foram incubados com o ODN durante 5 dias e, então, coradas com um anticorpo CD19. O percentual de células B com coloração de CFSE reduzida foi determinado. Os eixos χ são a concentração de ODN em μΜ e os eixos y são o % de células B com colo- ração reduzida após divisão.
A figura 30 é um gráfico mostrando a indução de IFN-α de muri- no por ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofíli- co (SEQ ID NO: 58, 60-62, 64 e 67). A atividade do mesmo é comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um controle negativo (SEQ ID NO: 26). Camundongos BALB/c (5 por grupo) foram inje- tados SC com diferentes doses de ODN. O sangue dos animais foi coletado em 3 horas pós-injeção e o plasma testado com relação ao IFN-alfa através de ELISA. O eixo χ é a dose de ODN em pg e o eixo y é a concentração de IFN-α em pg/ml.
A figura 31 são dois gráficos mostrando o efeito do ODN sobre o volume de tumor no modelo de tumor SA1N de camundongo. Camundongos A/J fê- meas (10 por grupo) foram injetados SC com 5 χ 105 células tumorígenas Sal/N no dia 0. Os camundongos foram tratados com 35 μg (figura 31a) ou 100 μg (figura 31b) de ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 60, 64 e 67), um ODN da classe C não- modificado, um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55) ou PBS apenas fornecido SC uma vez por semana começando a partir do dia 8 pós- indução de tumor. Os animais foram monitorados com relação à sobrevivên- cia e volume do tumor. O tamanho do tumor (o comprimento e a largura) foi medido usando um calibrador Vernier digital. O volume do tumor foi calcula- do usando a fórmula: volume do tumor = (0,4) (ab2), onde a = diâmetro mai- or e b = diâmetro menor. O eixo χ mostra dias pós-indução de tumor e o eixo y mostra o volume do tumor em mm3. DESCRIÇÃO DETALHADA
A invenção é baseada, em parte, sobre oligonucleotídeos de CpG que mostram capacidade imunoestimulatória intensificada. Oligonucleo- tídeos de CpG que mostram capacidade imunoestimulatória intensificada são conhecidos por estimular o sistema imune, por exemplo, através de inte- ração com o receptor 9 tipo sino (TLR9). Estimulação de TLR9 tem muitos efeitos, incluindo estimulação de uma resposta imune que tende a Th1, ati- vação de células NK e ativação de células Β. A invenção está relacionada, em alguns aspectos, à identificação de oligonucleotídeos imunoestimulató- rios com estrutura alterada que afeta sua interação com TLR9. Foi descober- to, pelos inventores, que oligonucleotídeos com análogos de nucleotídeo substituído lipofílico fora do motivo CpG têm capacidade intensificada de estimular a produção de interferon-α (IFN-a) e induzir à ativação de TLR9. Esse efeito foi observado em todas as classes de oligonucleotídeos imuno- estimulatórios testados. Esses oligonucleotídeos modificados com capacida- de estimulatória intensificada foram denominados oligonucleotídeos da clas- se E.
Os oligonucleotídeos modificados da classe E da presente in- venção têm, em alguns casos, capacidade intensificada de induzir a uma resposta imune. Uma indução de uma resposta imune refere-se a qualquer aumento no número ou atividade de uma célula imune ou um aumento na expressão ou níveis absolutos de um fator imune, tal como uma citocina. Células imunes incluem, mas não estão limitadas a, células NK, linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+, células B, células dendríticas, macrófagos e outras células que apresentam antígeno. Citocinas incluem, mas não estão limita- das a, interleucinas, TNF-a, IFN-α,β e γ, Flt-Iigante e moléculas coestimula- tórias.
Sabe-se que oligonucleotídeos contendo motivos CpG não- metilados são capazes de estimular respostas imunes através da através de do receptor 9 Tipo sino (TLR9). A indução de muitas citocinas se correlacio- na com a ativação de TLR9. Assim, a indução aumenta à medida que a es- timulação de TLR9 aumenta. Contudo, em geral, há uma correlação inversa entre o TLR9 e a indução de IFN-α para ODN de CpG. Descobriu-se que algumas das modificações da invenção podem produzir um padrão de sinali- zação modificado, de modo que uma correlação mais direta, ao invés de uma correlação inversa entre ativação de TLR9 e IFN-α, seja observada. Os inventores começaram a investigar o impacto dos resíduos
lipofílicos na região que circunda o motivo CpG. Conforme descrito nos e- xemplos abaixo, vários tipos diferentes de análogos de nucleotídeo substitu- ido lipofílico, tais como 2,4-difluorotolueno, 5-bromouracila e 5-iodouracila, foram incorporados em um oligonucleotídeo de CpG sobre o lado 5' ou 3' do motivo CpG. Inesperadamente, a incorporação desses análogos de nucleo- tídeo substituído lipofílico levou a um aumento incomumente forte na ativida- de do hTLR9, bem como indução de IFN-α em PBMCs humanas. A substitu- ição por um nucleotídeo não lipofílico, tal como um resíduo de uracila (o qual é estruturalmente similar à timina, mas carece de um grupo metila) produziu uma forte diminuição na estimulação de hTLR9. Nos oligonucleotídeos tes- tados, o aumento na estimulação de TLR9 parecia ser melhor se o análogo de nucleotídeo lipofílico substituído está posicionado 5' ao motivo CpG do que quando ele estava posicionado 3' ao motivo. Substituição dupla (isto é, uma substituição por análogo de nucleotídeo lipofílico substituído 5' e 3') re- sultou em estimulação mais potente daquelas testadas. Em contraste, subs- tituição de guanina ou citosina por 2,4-difluorotolueno no motivo CpG levou a uma forte diminuição do índice de estimulação de TLR9.
A modificação dos análogos de nucleotídeo substituído lipofílico resultou em uma forte intensificação de indução de IFN-α. Especialmente, para o ODN modificado com 5-bromouracila e 5-iodouracila, parecia haver uma boa correlação entre a estimulação de TLR9 e a indução de IFN-α. Conforme mencionado acima, essa observação era inesperada, uma vez que (i) a molécula precursora 21317 é virtualmente inativa quanto à indução de IFN-α e (ii) usualmente, há uma correlação inversa entre o TLR9 e a in- dução de IFN-α para ODN de CpG o qual não contém essas modificações.
Em alguns aspectos da invenção, o oligonucleotídeo tem a se- quência R1YZR2. O oligonucleotídeo pode incluir um ou mais de tais motivos. R1 e R2 são, independentemente um do outro, um análogo de nucleotídeo lipofílico substituído (L), um nucleotídeo ou uma ligação. É preferido, contu- do, que pelo menos um de Ri e R2 seja um análogo de nucleotídeo substitu- ído lipofílico (L). Em alguns casos, Ri e R2 são ambos L. Conforme mostrado na seção exemplos abaixo, oligonucleotídeos tendo um L 5' e 3' ao motivo CpG eram particularmente estimulatórios. Contudo, algumas vezes, apenas um R é um L. Por exemplo, R1 pode ser L e R2 é um nucleotídeo ou vice versa. Alternativamente, R1 pode ser um L e R2 pode ser uma ligação, de modo que o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5' RiCG 3'.
Em alguns casos, o oligonucleotídeo tem a seqüência RiN1YZN2R2 em que N1 e N2 são nucleotídeos de 0-3 nucleotídeos de com- primento. Outras possíveis variações incluem estruturas tais como 5' R1 N1R1YZ N2 3', 5' R3R1YZ 3 e R1ZN2R2.
Y é um nucleotídeo de pirimidina. Z é um resíduo de purina, pi- rimidina ou um resíduo abásico. Em algumas modalidades, Z é, de preferên- cia, uma purina.
L é um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico o qual pode
ser, por exemplo, um análogo de nucleobase com anel de 5 ou 6 elementos. Um exemplo de um análogo de nucleobase com anel de 5 ou 6 elementos é mostrado no grupo a seguir de fórmula I.
Fórmula I
A, Β, X, D, E e F são, independentemente, qualquer um de C (carbono) ou N (nitrogênio) opcionalmente trazendo hidrogênio ou um substi- tuinte tal como, por exemplo, mas não limitado a, F, Cl, Br11, alquila, alqueni- la, alquinila, alquila halogenada, alquenila halogenada, cicloalquila, O- alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2; -S-alquila, -SO-alquila, -SO2- alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila, oxo, tio, hidróxi, mercapto e imino. Em alguns casos, pelo menos um substituinte não é oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino ou metila. η é 0 ou 1. As linhas pontilha- das indicam ligações duplas opcionais. Contudo, pelo menos um substituinte não é escolhido do grupo consistindo em oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino, metila e hidrogênio. Adicionalmente, o total de átomos A, B1 X, D, E e F não é mais do que 3 nitrogênios (N). Em algumas modalidades, todos os átomos A, Β, X, D, E, F são carbono (C). Alternativamente, pelo menos um, dois ou três dos átomos A, Β, X, D, E, F é nitrogênio (N).
O composto de fórmula I pode ser, por exemplo, qualquer um dos seguintes análogos de nucleotídeo lipofílico substituído: uma pirimidina substituída, uma uracila substituída, um tolueno substituído, uma imidazol ou pirazol substituída, um triazol substituído, 5-cloro-uracila, 5-bromo-uracila, 5- iodo-uracila, 5-etil-uracila, 5-propil-uracila, 5-proinil-uracila, (E)-5-(2- bromovinil)-uracila ou 2.4-difluoro-tolueno. O análogo de nucleotídeo lipofílico substituído pode ser separa-
do ou ele pode ser fundido com outro composto. Por exemplo, ele pode ser fundido a um sistema de anel aromático ou alifático de 3 a 6 elementos. Ele pode ser também ligado a uma porção de açúcar com 5 a 6 elementos tal como, por exemplo, uma pentose ou hexose. Um exemplo de uma pentose é uma furanose, tal como uma ribose ou desoxirribose e um exemplo de uma hexose é uma piranose. A pentose ou hexose pode, opcionalmente, ser substituída por F, amino, alcóxi, alcóxi-etóxi, aminopropila, alquenila, alquini- Ia ou uma ligação em ponte de 02,C4-alquileno.
O oligonucleotídeo pode também incluir uma modificação não- nucleotídica, tal como um Iigante de C6-C4S-PoIietiIeno glicol, C3-C2o-alcano- diol, C3-Ci8-alquilamino, um Iigante de C3-Ci8-alquiltiol, colesterol, ácido bili- ar, ácido graxo saturado ou insaturado, folato, um grupo hexadecil-glicerol, di-hexadecil-glicerol, um grupo octadecil-glicerol ou dioctadecil-glicerol ou um grupo vitamina E. Os análogos de nucleotídeo lipofílico substituídos podem ser
incorporados em qualquer oligonucleotídeo imunoestimulatório. Em algumas modalidades da invenção, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios incluem motivos imunoestimulatórios os quais são "dinucleotídeos de CpG". Um di- nucleotídeo de CpG pode ser metilado ou não-metilado. Um ácido nucleico imunoestimulatório contendo pelo menos um dinucleotídeo de CpG não- metilado é uma molécula de ácido nucleico a qual contém uma seqüência dinucleotídica de citosina-guanina não-metilada (isto é, uma citidina 5' não- metilada, seguido por uma guanosina 3' e ligadas por uma ligação de fosfa- to) e o qual ativa o sistema imune; tal ácido nucleico imunoestimulatório é um ácido nucleico de CpG. Ácidos nucleicos de CpG foram descritos em uma série de patentes emitidas, pedidos de patente publicados e outras pu- blicações, incluindo Patentes U.S. Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Um ácido nucleico imunoestimulatório contendo pelo menos um dinucleotídeo de CpG metilado é um ácido nuclei- co o qual contém uma seqüência dinucleotídica de citosina-guanina metilada (isto é, uma citidina 5' metilada, seguido por uma guanosina 3' e ligadas por uma ligação de fosfato) e o qual ativa o sistema imune. Em outras modalida- des, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios são isentos de dinucleotídeos de CpG. Esses oligonucleotídeos os quais são isentos de dinucleotídeos de CpG são referidos como oligonucleotídeos de não-CpG e eles não têm moti- vos imunoestimulatórios de CpG. De preferência, esses são ODNs ricos em T, tal como um ODN tendo pelo menos 80% de T.
Os ODNs da classe E da invenção podem incluir motivos e pro- priedades de outras classes de ODN de CpG, tal como classe A, classe B, classe C, classe T e classe P, na medida em que eles incluam análogos de nucleotídeo lipofílico substituídos 5' e/ou 3' de um motivo YGZ. Ácidos nucleicos imunoestimulatórios de CpG da "classe A" fo-
ram descritos no Pedido de Patente Não-provisório U.S. N°. de Série: 09/672.126 e pedido PCT publicado PCT/US00/26527 (WO 01/22990), am- bos depositados em 27 de Setembro de 2000. Esses ácidos nucleicos são caracterizados pela capacidade de induzir a altos níveis de interferon-alfa, ao mesmo tempo em que têm efeitos mínimos sobre a ativação de células B. O ácido nucleico imunoestimulatório de CpG da classe A não contém neces- sariamente um palindroma hexamérico de GACGTC, AGCGCT ou AACGTT, descrito por Yamamoto et. al.. Yamamoto S. et. al., J Immunol 148: 4072-6 (1992).
Seqüências exemplificativas de ácidos nucleicos imunoestimula-
tórios da classe A são descritas no Pedido de Patente Não-Provisório U.S. N°. de Série: 09/672.126 e pedido PCT publicado PCT/US00/26527 (WO 01/22990), ambos depositados em 27 de Setembro de 2000.
ODNs da "classe B" são potentes na ativação de células B, mas são relativamente fracos na indução de ativação de IFN-γ e células NK. Os ácidos nucleicos de CpG da classe B são, tipicamente, totalmente estabili- zados e incluem um dinucleotídeo de CpG não-metilado dentro de determi- nados contextos de base preferidos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068. Outra classe é potente para indução de ativação de IFN-γ e células NK, mas relati- vamente fraca na estimulação de células B; essa classe foi denominada a "classe A". Os ácidos nucleicos de CpG da classe A têm, tipicamente, se- qüências de poli-G estabilizadas nas extremidades 5' e 3' e uma seqüência contendo dinucleotídeo de CpG de fosfodiéster palindrômica de pelo menos 6 nucleotídeos. Veja, por exemplo, pedido de patente publicado PCT/US00/26527.
Ainda outra classe de ácidos nucleicos de CpG ativa células B e
células NK e induz ao IFN-γ; essa classe foi denominada a classe C. Os áci- dos nucleicos imunoestimulatórios da "classe C" contêm pelo menos dois motivos distintos únicos e têm efeitos estimulatórios desejáveis sobre células do sistema imune. Alguns desses ODNs têm uma seqüência de CpG "esti- mulatória" tradicional e um motivo "rico em GC" ou "de neutralização de cé- lulas B". Esses ácidos nucleicos com motivo combinado têm efeitos de esti- mulação imune que se assemelham um pouco àqueles efeitos associados a um ODN de CpG da "classe B" tradicional, os quais são fortes indutores de ativação de células B e ativação de células dendríticas (DC) e àqueles efei- tos associados a uma classe mais recentemente descrita de ácidos nuclei- cos imunoestimulatórios (ODN de CpG da "classe A"), os quais são fortes indutores de ativação de IFN-γ e células assassinas naturais (NK), mas indu- tores relativamente pobres de ativação de células B e DC. Krieg AM et. al. (1995) Nature 374: 546-9; Bailas ZK et. al. (1996) J Immunol 157: 1840-5; Yamamoto S. et. al. (1992) J Immunol 148: 4072-6. Embora o ODN de CpG da classe B preferido freqüentemente tenha partes principais de fosforotioato e ODN de CpG da classe A preferidos têm partes principais misturadas ou quiméricas, os ácidos nucleicos imunoestimulatórios com motivo combinado podem ter partes principais estabilizadas, por exemplo, de fosforotioato, quiméricas ou fosfodiéster e, em algumas modalidades preferidas, eles têm partes principais semimacias. Essa classe foi descrita no pedido de patente U.S. US10/224.523, depositado em 19 de Agosto de 2002, os conteúdos todos do qual são aqui incorporados por referência.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios da "classe P" têm vá- rios domínios, incluindo um domínio de ativação 5'TLR, 2 regiões de forma- ção de dupla e um espaçador opcional e cauda 3'. Essa classe de oligonu- cleotídeos tem a capacidade, em alguns casos, de induzir a níveis muito maiores de secreção de IFN-α do que a classe C. Os oligonucleotídeos da classe P têm a capacidade de se autoestruturar espontaneamente em con- catâmeros in vitro e/ou in vivo. Sem estar preso a qualquer teoria em particu- lar quanto ao método de ação dessas moléculas, uma hipótese potencial é que essa propriedade dota os oligonucleotídeos da classe P com a capaci- dade de se ligar cruzadamente ao TLR9 de maneira mais intensa dentro de determinadas células imunes, induzindo a um padrão distinto de ativação imune, comparado com as classes previamente descritas de oligonucleotí- deos de CpG. Ligação cruzada de receptores TLR9 pode induzir à ativação de secreção mais forte de IFN-α através do Ioop de feedback de IFNR do tipo I em células dendríticas plasmacitóides. Oligonucleotídeos da classe P são descritos pelo menos no Pedido de Patente US No. de Série 11/706.561.
Os oligonucleotídeos da "classe T" induzem à secreção de me- nores níveis de IFN-alfa quando não-modificados, conforme nos ODNs da invenção e citocinas e quimiocinas relacionadas a IFN do que oligonucleotí- deos da classe B ou da classe C, ao mesmo tempo em que retêm a capaci- dade de induzir a níveis de IL-10 similares aos oligonucleotídeos da classe B. Oligonucleotídeos da classe T são descritos pelo menos no Pedido de Patente US No. de Série 11/099.683, os conteúdos todos do qual são aqui incorporados por referência.
Em uma modalidade, o ODN imunoestimulatório da invenção é, vantajosamente, combinado com um lipídio catiônico. Em uma modalidade, o lipídio catiônico é DOTAP (metil-sulfato de N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]- Ν,Ν,Ν-trimetilamônio). Outros agentes com propriedades similares, incluindo tráfego ao compartimento endossômico, podem ser usados em lugar de ou além de DOTAP. Outras formulações lipídicas incluem, por exemplo, EF- FECTENE® (um lipídio não-lipossômico com um intensificador de condensa- ção de DNA especial) e SUPERFECT® (uma nova tecnologia de atuação dendrimérica). Lipossomas estão comercialmente disponíveis da Gibco BRL1 por exemplo, como LIPOFECTIN® e LIPOFECTACE®, os quais são forma- dos de lipídios catiônicos, tais como cloreto de N-[1-(2, 3 dioleilóxi)-propil]-N, N, N-trimetilamônio (DOTMA) e brometo de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Métodos para fabricação de Iipossomas são bem conhecidos na técnica e foram descritos em muitas publicações. Lipossomas também foram revistos por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3: 235-241.
Em outras modalidades, os ODNs imunoestimulatórios não são formulados em Iipossomas catiônicos. Em virtude da natureza lipofílica dos análogos modificados dentro do ODN, mesmo o ODNs curtos, tal como com 3 nucleotídeos de comprimento, podem não requerer formulação para fun- cionar eficientemente in vivo.
Em uma modalidade, o ODN imunoestimulatório da invenção está na forma de moléculas em formato de haltere, covalentemente fecha- das, com estrutura primária e secundária. Em uma modalidade, tais oligori- bonucleotídeos cíclicos incluem dois Ioops fita simples conectados através de um segmento fita dupla interveniente. Em uma modalidade, pelo menos um Ioop fita simples inclui um motivo de DNA imunoestimulatório da inven- ção. Outras moléculas em formato de haltere, covalentemente fechadas da invenção incluem moléculas de DNA:RNA quiméricas nas quais, por exem- plo, o segmento fita dupla é pelo menos parcialmente DNA (por exemplo, dsDNA homodimérico ou DNA:RNA heterodimérico) e pelo menos um Ioop fita simples inclui um motivo de DNA imunoestimulatório da invenção. Alter- nativamente, o segmento fita dupla da molécula quimérica é DNA.
Em determinadas modalidades, o ODN imunoestimulatório é iso- lado. Uma molécula isolada é uma molécula que é substancialmente pura e é isenta de outras substâncias com as quais ela é comumente encontrada na natureza ou em sistemas in vivo até um ponto prático e apropriado para seu uso pretendido. Em particular, os ODNs imunoestimulatórios são sufici- entemente puros e são suficientemente isentos de outros constituintes bioló- gicos das células de modo a serem úteis, por exemplo, na produção de pre- parados farmacêuticos. Em virtude do fato de um ODN imunoestimulatório isolado da invenção poder ser misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável em um preparado farmacêutico, o ODN imunoestimulatório pode compreender apenas um pequeno percentual em peso do preparado. O ODN imunoestimulatório, todavia, é substancialmente puro pelo fato de que ele foi substancialmente separado das substâncias com as quais ele pode estar associado em sistemas vivos.
As moléculas de ácido nucleico imunoestimulatórias podem ter uma parte principal quimérica. Para fins da presente invenção, uma parte principal quimérica refere-se a uma parte principal parcialmente estabilizada, em que pelo menos uma ligação internucleotídeo é fosfodiéster ou fosfodiés- ter-semelhante e em que pelo menos uma outra ligação internucleotídeo é uma ligação internucleotídeo estabilizada, em que a pelo menos uma ligação de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante e a pelo menos uma ligação es- tabilizada são diferentes. Uma vez que foi reportado que ligações de borano- fosfonato são estabilizadas com relação à ligações de fosfodiéster, para fins da natureza quimérica da parte principal, ligações de boranofosfonato po- dem ser classificadas como fosfodiéster-semelhantes ou como estabilizadas, dependendo do contexto. Por exemplo, uma parte principal quimérica de acordo com a invenção poderia, em uma modalidade, incluir pelo menos uma ligação de fosfodiéster (fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante) e pelo menos uma ligação de boranofosfonato (estabilizada). Em outra modalidade, uma parte principal quimérica de acordo com a presente invenção poderia incluir ligações de boranofosfonato (fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante) e fosforotioato (estabilizada). Uma "ligação internucleotídeo estabilizada" significará uma ligação internucleotídeo que é relativamente resistente à de- gradação in vivo (por exemplo, através de uma exo- ou endo-nuclease), comparado com a ligação internucleotídeo de fosfodiéster. Ligações internu- cleotídeo estabilizadas preferidas incluem, sem limitação, fosforotioato, fos- foroditioato, metilfosfonato e metilfosforotioato. Outras ligações internucleotí- deo estabilizadas incluem, sem limitação: peptídeo, alquila, defosfo e outras, conforme descrito acima.
Partes principais modificadas, tais como fosforotioatos, podem ser sintetizadas usando técnicas automáticas empregando químicas de fos- foramidato ou H-fosfonato. Aril- e alquil-fosfonatos podem ser feitos, por e- xemplo, conforme descrito na Patente U.S. N°. 4.469.863; e alquilfosfotriés- teres (nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada, conforme descrito na Patente U.S. N°. 5.023.243 e Patente Européia No. 092.574) podem ser preparados através de síntese em fase sólida automática usando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para fazer outras modificações e subs- tituições da parte principal do DNA foram descritos. Uhlmann E et. al. (1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. Métodos para preparo de oligonucleotídeos quiméricos também são conhecidos. Por exemplo, as patentes emitidas para Uhlmann et. al. descreveram tais técni- cas.
ODNs com parte principal misturada modificados podem ser sin-
tetizados usando um sintetizador de DNA comercialmente disponível e quí- mica padrão de fosforamidita (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogs - A Practical Approach" IRL Press. Oxford. Reino Unido. 1991 e M. D. Mat- teucci e Μ. H. Caruthers. Tetrahedron Lett. 21. 719 (1980)) Após acoplamen- to, as ligações PS são introduzidas através de sulfurização usando reagente de Beaucage (R. P. lyer, W. Egan, J. B. Regan e S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soe. 112, 1253 (1990)) (0,075 M em acetonitrilo) ou dissulfeto de fenil acetila (PADS), seguido por revestimento com anidrido acético, 2,6-lutidina em tetrahidrofurano (1: 1: 8; v: v: v) e A/-metilimidazola (16 % em tetrahidro- furano). Essa etapa de revestimento é realizada após a reação de sulfuriza- ção para minimizar a formação de ligações de fosfodiéster (PO) indesejadas em posições onde uma ligação de fosforotioato deveria estar localizada. No caso da introdução de uma ligação de fosforodiéster, por exemplo, em um dinucleotídeo de CpG, o fósforo-lll intermediário é oxidado através de trata- mento com uma solução de iodo em água/piridina. Após clivagem do suporte sólido e desproteção final através de tratamento com amônia concentrada (15 horas a 50°C), os ODNs são analisados através de HPLC sobre uma
coluna Gen-Pak Fax (MiIIipore-Waters) usando um gradiente de NaCI (por exemplo, tampão A: NaH2PC>4 a 10 mM em acetonitrilo/água = 1: 4/v: v, pH
de 6,8; tampão B: NaH2P04 a 10 mJVL NaCI a 1,5 M em acetonitrilo/água =
1: 4/v: v; 5 a 60 % de B em 30 minutos a 1 ml/min) ou através de eletrofore- se em gel capilar. O ODN pode ser purificado através de HPLC ou através de FPLC sobre uma coluna Source High Performance (Amersham Pharma- cia). Frações homogêneas por HPLC são combinadas e desalinizadas atra- vés de uma coluna C18 ou através de uItrafiItração. O ODN foi analisado através de espectrometria de massa MALDI-TOF para confirmar a massa calculada.
Os ácidos nucleicos da invenção podem também incluir outras modificações. Essas incluem análogos de DNA não-iônico, tais como alquil- e aril-fosfatos (nos quais o oxigênio do fosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada. Também foi mostrado que ácidos nucleicos os quais contêm diol, tal como tetraetileno glicol ou hexaetileno glicol, em um ou ambos os términos são substancialmente resistentes à de- gradação por nuclease.
Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser oli- gonucleotídeos macios ou semimacios. Um oligonucleotídeo macio é um oligonucleotídeo imunoestimulatório tendo uma parte principal parcialmente estabilizada, na qual ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiés- ter-semelhantes ocorrem apenas dentro e imediatamente adjacentes a pelo menos um dinucleotídeo interno de pirimidina -purina (YZ). De preferência, YZ é YG, um dinucleotídeo de pirimidina-guanosina (YG). O pelo menos um dinucleotídeo YZ interno tem, em si, uma ligação internucleotídeo de fosfodi- éster ou fosfodiéster-semelhante. Uma ligação internucleotídeo de fosfodiés- ter ou fosfodiéster-semelhante que ocorre imediatamente adjacente a pelo menos um dinucleotídeo YZ interno pode estar 5', 3' ou 5' e 3' ao pelo menos um dinucleotídeo YZ interno.
Em particular, ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfo- diéster-semelhantes envolver "dinucleotídeos internos". Um dinucleotídeo interno, em geral, significará qualquer par de nucleotídeos adjacentes conec- tados através de uma ligação internucleotídeo, no qual nenhum nucleotídeo no par de nucleotídeos é um nucleotídeo terminal, isto é, nenhum nucleotí- deo no par de nucleotídeos é um nucleotídeo que define a extremidade 5' ou 3' do oligonucleotídeo. Assim, um oligonucleotídeo linear que tem η nucleo- tídeos de comprimento tem um total de n-1 dinucleotídeos e apenas n-3 di- nucleotídeos internos. Cada ligação internucleotídeo em um dinucleotídeo interno é uma ligação internucleotídeo interna. Assim, um oligonucleotídeo linear que tem η nucleotídeos de comprimento tem um total de n-1 ligações internucleotídeo e apenas n-3 ligações internucleotídeo internas. As ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes estrategicamen- te colocadas, portanto, referem-se à ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes posicionadas entre qualquer par de nucleotí- deos na seqüência de ácido nucleico. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes não estão posi- cionadas entre o par de nucleotídeos mais próximo da extremidade 5' ou 3'.
De preferência, uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante que ocorre imediatamente adjacente ao pelo menos um dinucleotídeo YZ interno é, em si, uma ligação internucleotídeo interna. Assim, para uma seqüência Ni YZ N2, em que Ni e N2 são, cada um inde- pendentemente um do outro, qualquer único nucleotídeo, o dinucleotídeo YZ tem uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante e, além disso (a) Ni e Y são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante quando Ni é um nucleotídeo in- terno, (b) Z e N2 são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fos- fodiéster ou fosfodiéster-semelhante quando N2 é um nucleotídeo interno ou (c) Ni e Y são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiés- ter ou fosfodiéster-semelhante quando Ni é um nucleotídeo interno e Z e N2 são ligados através de uma ligação internucleotídeo de fosfodiéster ou fos- fodiéster-semelhante quando N2 é um nucleotídeo interno.
No oligonucleotídeo da invenção, pelo menos um YZ de RiYZR2 pode ter uma ligação de fosforodiéster. Alternativamente, o YZ de R1YZR2 pode ter uma ligação de fosforotioato. Em algumas modalidades, o RiY e ou ZR2 de R1YZR2 tem uma ligação de fosforotioato.
Acredita-se que oligonucleotídeos macios de acordo com a pre- sente invenção sejam relativamente suscetíveis à clivagem por nuclease comparado com oligonucleotídeos completamente estabilizados. Sem pre- tender estar preso a uma teoria ou mecanismo em particular, acredita-se que oligonucleotídeos macios da invenção são cliváveis em fragmentos com ati- vidade imunoestimulatória reduzida ou nenhuma com relação a oligonucleo- tídeos macios de comprimento total. Acredita-se que a incorporação de pelo menos uma ligação internucleotídeo sensível à nuclease, particularmente próximo da parte mediana do oligonucleotídeo, proporciona um "desligamen- to", o qual altera a farmacocinética do oligonucleotídeo de modo a reduzir a duração da atividade imunoestimulatória máxima do oligonucleotídeo. Isso pode ser de valor particular em tecidos e aplicações clínicas nas quais é de- sejável evitar lesão relacionada à inflamação ou imuno-estimulação local crônica, por exemplo, no rim.
Um oligonucleotídeo semimacio é um oligonucleotídeo imunoes- timulatório tendo uma parte principal parcialmente estabilizada, na qual liga- ções internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes ocorrem apenas dentro de pelo menos um dinucleotídeo interno de pirimidina-purina (YZ). Oligonucleotídeos semimacios geralmente possuem potência imunoes- timulatória aumentada com relação aos oligonucleotídeos imunoestimulató- rios totalmente estabilizados correspondentes. Em virtude da maior potência dos oligonucleotídeos semimacios, oligonucleotídeos semimacios podem ser usados, em alguns casos, em menores concentrações eficazes e têm meno- res doses eficazes do que oligonucleotídeos imunoestímulatórios totalmente estabilizados convencionais de forma a obter um efeito biológico desejado. Acredita-se que as propriedades precedentes dos oligonucleotídeos semimacios geralmente aumentam com aumento da "dose" de ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes envolvendo dinucleotídeos YZ internos. Assim, acredita-se que, por exemplo, em geral, para uma determinada seqüência de oligonucleotídeo com cinco dinucleotídeos YZ internos, um oligonucleotídeo com ligações internucleotídeo YZ internas de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com quatro ligações internucleotídeo YG internas de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes o qual, por sua vez, é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com três ligações internucleotídeo YZ internas de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes o qual, por s ua vez, é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com duas ligações internucleotídeo YG internas de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes o qual, por sua vez, é mais imunoestimulatório do que um oligonucleotídeo com uma ligação internucleotídeo YZ interna de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhante. De modo importante, acreidta-se que mesmo a inclusão de uma ligação internucleotídeo YZ interna de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhante é vantajosa com relação a nenhuma ligação internucleotídeo YZ interna de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhante. Além do número de ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster-semelhantes, a posição ao longo do ácido nucleico também pode afetar a potência.
Os oligonucleotídeos macios e semimacios geralmente incluem, além das ligações internucleotídeo de fosfodiéster ou fosfodiéster- semelhantes em posições internas preferidas, extremidades 5' e 3' que são resistentes à degradação. Tais extremidades resistentes à degradação po- dem envolver qualquer modificação que resulta em uma resistência aumen- tada contra digestão por exonuclease com relação às extremidades não- modificadas correspondentes. Por exemplo, as extremidades 5' e 3' podem ser estabilizadas através da inclusão de pelo menos uma modificação de fosfato na parte principal. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma modificação de fosfato da proporciona em cada extremidade é, independen- temente, uma ligação internucleotídeo de fosforotioato, fosforoditioato, metil- fosfonato ou metilfosforotioato. Em outra modalidade, a extremidade resis- tente à degradação inclui uma ou mais unidades nucleotídicas conectadas por ligações peptídicas ou de amida na extremidade 3'.
A ligação internucleotídeo de fosfodiéster é o tipo de ligação ca-
racterística dos ácidos nucleicos encontrados na natureza. A ligação internu- cleotídeo de fosfodiéster incluiu um átomo de fósforo flanqueado por dois átomos de oxigênio ligados em ponte e ligados também por dois átomos adi- cionais de oxigênio, um carregado e o outro descarregado. Ligação internu- cleotídeo de fosfodiéster é particularmente preferida quando é importante reduzir a meia-vida tecidual do oligonucleotídeo.
Uma ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante é um gru- po de ligação em ponte contendo fósforo que é química e/ou diastereomeri- camente similar ao fosfodiéster. Medidas de similaridade ao fosfodiéster in- cluem suscetibilidade à digestão por nuclease e a capacidade de ativar RNAse H. Assim, por exemplo, oligonucleotídeos de fosfodiéster, mas não fosforotioato, são suscetíveis à digestão por nuclease, enquanto que oligo- nucleotídeos de fosfodiéster e fosforotioato ativam RNAse H. Em uma moda- lidade preferida, a ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante é uma ligação de boranofosfato (ou, equivalentemente, boranofosfonato). Patente U.S. N°. 5.177.198; Patente U.S. N°. 5.859.231; Patente U.S. N°. 6.160.109; Patente U.S. N°. 6.207.819; Sergueev et. al„ (1998) J Am Chem Soc 120: 9417-27. Em outra modalidade preferida, a ligação internucleotídeo fosfodi- éster-semelhante é Rp fosforotioato diastereomericamente puro. Acredita-se que Rp fosforotioato diastereomericamente puro é mais suscetível à disges- tão por nuclease e é melhor na ativação de RNAse H do que Sp fosforotioato misturado ou diastereomericamente puro. Estereoisômeros de oligonucleotí- deos de CpG são o assunto do pedido de patente U.S. copendente 09/361.575, depositado em 27 de Julho de 1999 e pedido PCT publicado PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Deve ser notado que, para fins da presen- te invenção, o termo "ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhante" ex- clui especificamente ligações internucleotídeo de fosforoditioato e metilfosfo- nato.
Conforme descrito acima, os oligonucleotídeos macios e semi- macios da invenção podem ter ligações fosfodiéster-semelhantes entre C e G. Um exemplo de uma ligação fosfodiéster-semelhante é uma ligação de fosforotioato em uma conformação Rp. A p-quiralidade do oligonucleotídeo pode ter efeitos evidentemente opostos sobre a atividade imune de um oli- gonucleotídeo de CpG1 dependendo do ponto de tempo no qual a atividade é medida. Em um ponto de tempo inicial de 40 minutos, o estereoisômero Rp, mas não o Sp1 do oligonucleotídeo de CpG de fosforotioato induzi à fosforila- ção de JNK em células de baço de camundongo. Em contraste, quando en- saiado em um ponto de tempo posterior de 44 horas, o estereoisômero Sp1 mas não o Rp, é ativo na estimulação de proliferação de células do baço. Essa diferença na cinética e bioatividade dos estereoisômeros Rp e Sp não resulta de qualquer diferença na captação celular, mas antes, mas prova- velmente, é em virtude de dois papéis biológicos opostos da p-quiralidade. Primeiro, a atividade intensificada do estereoisômero Rp1 comparado com o Sp, com relação à estimulação de células imunes em pontos de tempo inici- ais indica que o Rp pode ser mais eficaz na interação com o receptor de CpG1 TLR9 ou indução de vias de sinalização a jusante. Por outro lado, a degradação mais rápida dos PS-oligonucleotídeos Rp, comparado com o Sp, resulta em uma duração de sinalização muito mais curta, de modo que os PS-oligonucleotídeos Sp parecem ser mais biologicamente ativos quanto testados em pontos de tempo posteriores.
Um efeito surpreendentemente forte é obtido através da p- quiralidade no dinucleotídeo de CpG em si. Em comparação com um oligo- nucleotídeo de CpG estéreo-aleatório, o congênero no qual o único dinucleo- tídeo de CpG foi ligado em Rp era ligeiramente mais ativo, enquanto que o congênere contendo uma ligação Sp era quase que inativo para induzir a proliferação de células do baço. Os termos "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" também abran-
gem ácidos nucleicos ou oligonucleotídeos com substituições ou modifica- ções, tal como nas bases e/ou açúcares. Por exemplo, eles incluem ácidos nucleicos tendo açúcares na parte principal que são covalentemente presos a outros grupos orgânicos de baixo peso molecular que não um grupo hidro- xila na posição 2' e outros que não um grupo fosfato ou grupo hidróxi na po- sição 5'. Assim, ácidos nucleicos modificados podem incluir um grupo ribose 2'-0-alquilado. Além disso, ácidos nucleicos modificados podem incluir açú- cares, tal como arabinose ou 2'-fluoroarabinose, ao invés de ribose. Assim, os ácidos nucleicos podem ser heterogêneos quanto à composição da parte principal, desse modo, contendo qualquer combinação possível de unidades poliméricas juntas, tais como ácidos nucleicos-peptídeo (os quais têm uma parte principal de aminoácido com bases de ácido nucleico).
Ácidos nucleicos incluem também purinas e pirimidinas substitu- ídas, tais como bases modificadas de C-5 propino pirimidina e purina 7- deaza-7-substituída. Wagner RW et. al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Purinas e pirimidinas incluem, mas não estão limitadas a, adenina, citosina, guanina, timina, 5-metilcitosina, 5-hidroxicitosina, 5-fluorocitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina e ou- tras nucleobases que ocorrem naturalmente e não-naturalmente, porções aromáticas substituídas e não-substituídas. Outras de tais modificações são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios da presente invenção podem abranger várias modificações químicas e substituições, em compara- ção com RNA e DNA neutro, envolvendo uma ligação em ponte internucleo- tídeo de fosfodiéster, uma unidade α-D-ribose e/ou uma base nucleotídica natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracila. Exemplos de modifica- ções químicas são conhecidas por aqueles versados na técnica e são des- critas, por exemplo, em Uhlmann E et. al. (1990) Chem Rev 90: 543; "Proto- cols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, EUA 1993; Crooke ST et. al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36: 107-129; e Hunziker J et. al. (1995) Mod Synth Methods 7: 331-417. Um oligonucleotí- deo de acordo com a invenção pode ter uma ou mais modificações, em que cada modificação está localizada na posição de uma ligação em ponte inter- nucleotídeo de fosfodiéster particular e/ou em uma unidade de a-D-ribose particular e/ou em uma base nucleotidica natural particular em comparação com um oligonucleotídeo da mesma seqüência o qual é composto de DNA ou RNA natural.
Por exemplo, a invenção refere-se a um oligonucleotídeo o qual
pode compreender uma ou mais modificações e em que cada modificação é independentemente selecionada de:
a) a substituição de uma ligação em ponte internucleotídeo de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo por uma
ligação em ponte internucleotídeo modificada,
b) a substituição da ligação em ponte de fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo por uma ligação em ponte de- fosfo,
c) a substituição de uma unidade fosfato de açúcar da parte principal fosfato de açúcar por outra unidade,
d) a substituição de uma unidade α-D-ribose por uma unidade açúcar modificado, e
e) a substituição de uma base nucleotidica natural por uma base nucleotidica modificada.
Exemplos mais detalhados para a modificação química de um
oligonucleotídeo são como segue.
Uma ligação em ponte internucleotídeo de fosfodiéster localiza- da na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo pode ser substituída por uma ligação em ponte internucleotídeo modificada, em que a ligação em ponte internucleotídeo modificada é, por exemplo, selecionada de ligações em ponte de fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfa- to, α-hidroxibenzil fosfonato, fosfato-(C-i-C2i)-0-alquil éster, fosfato-[(C6- Ci2)aril-(Ci-C2i)-0-alquil]éster, (CrC8)alquilfosfonato e/ou (C6- Ci2)arilfosfonato, (C7-Ci2)-a-hidroximetil-arila (por exemplo, divulgada no WO 95/01363), em que (C6-C12)arila, (C6-C20)arila e (C6-C14)arila são opcio- nalmente substituídas por halogênio, alquila, alcóxi, nitro, ciano e onde R1 e R2 são, independentemente um do outro, hidrogênio, (CrCi8)-alquila, (Ce- C2o)-arila, (C6-Ci4)-aril-(CrC8)-alquila, de preferência hidrogênio, (CrC8)- alquila, de preferência (CrC4)-alquila e/ou metoxietila ou R1 e R2 formam, junto com o átomo de nitrogênio que traz os mesmos, um anel heterocíclico de 5-6 elementos o qual pode, adicionalmente, conter um outro heteroátomo do grupo O, S e N.
A substituição de uma ligação em ponte de fosfodiéster localiza- da na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleotídeo por uma ligação em ponte defosfo (ligações em ponte defosfo são descritas, por exemplo, em Uhlmann E e Peyman A em "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, páginas 355 ff), em que uma ligação em ponte defosfo é, por exemplo, selecionada das ligações em ponte defosfo de grupos formace- tal, 3'-tioformacetal, metilhidróxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dime- tileno-sulfona e/ou silila. Uma unidade fosfato de açúcar (isto é, uma ligação em ponte
internucleotídeo de β-D-ribose e fosfodiéster que forma, junto, uma unidade fosfato de açúcar) da parte principal fosfato de açúcar (isto é, uma parte principal fosfato de açúcar é composta de unidades fosfato de açúcar) pode ser substituída por outra unidade, em que a outra unidade é, por exemplo, adequada para construir um oligômero "morfolino-derivado" (conforme des- crito, por exemplo, em Stirchak EP et. al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 6129- 41), isto é, por exemplo, a substituição por uma unidade morfolino-derivada; ou construir um ácido nucleico de poliamida ("PNA"; conforme descrito, por exemplo, em Nielsen PE et. al. (1994) Bioconjug Chem 5: 3-7), isto é, por exemplo, a substituição por uma unidade com parte principal de PNA, por exemplo, por 2-aminoetilglicina.
Uma unidade de β-ribose ou uma unidade de β -D-2'- desoxirribose pode ser substituída por uma unidade de açúcar modificada, em que a unidade de açúcar modificada é, por exemplo, selecionada de β-D- ribose, a-D-2'-desoxirribose, L-2'-desoxirribose, 2'-F-2'-desoxirribose, 2'-F- arabinose, 2'-0-(Ci-C6)alquil-ribose, de preferência 2'-0-(CrC6)alquil-ribose é 2'-0-metilribose, 2'-0-(C2-C6)alquenil-ribose, 2,-[0-(C1-C6)alquil-0-(Ci- C6)alquil]-ribose, 2'-NH2-2'-desoxirribose, β-D-xilo-furanose,
α-arabinofuranose, 2,4-dideoxi-p-D-eritro-hexo-piranose e carbocíclica (des- crita, por exemplo, em Froehler J (1992) Am Chem Soc 114: 8320) e/ou aná- logos de açúcar com cadeia aberta (descritos, por exemplo, em Vandendri- essche et. al. (1993) Tetrahedron 49: 7223) e/ou análogos de açúcar biciclo (descritos, por exemplo, em Tarkov M et. al. (1993) Helv ChimActa 76: 481).
Em algumas modalidades preferidas o açúcar é 2'-0-metilribose, preferivelmente para um ou ambos nucleotídeos ligados por um fosfodiéster ou por uma ligação internucleotídeo fosfodiéster-semelhantes. Ácidos nucleicos também incluem purinas e pirimidinas substitu-
ídas, tais como C-5 propino pirimidina e bases de purina 7-deaza-7- substituída modificadas. Wagner RW et. al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Purinas e pirimidinas incluem, mas não estão limitadas a, adenina, citosina, guanina e timina e outras nucleobases que ocorrem naturalmente e não- naturalmente, porções aromáticas substituídas e não-substituídas.
Uma base modificada é qualquer base a qual é quimicamente distinta das bases que ocorrem naturalmente encontradas tipicamente em DNA e RNA, tais como T, C, G, A e U, mas as quais compartilham estruturas químicas básicas com essas bases que ocorrem naturalmente. A base de nucleotídeo modificado pode ser, por exemplo, selecionada de hipoxantina, uracila, dihidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5-(CrC6)-alquiluracila, 5-(C2-C6)-alqueniluracila, 5-(C2-C6)- alquiniluracila, 5-(hidroximetil)uracila, 5-clorouracila, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-hidroxicitosina, 5-(Ci-C6)-alquilcitosina, 5-(C2-C6)- alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, uma 7-deazapurina substituída, de preferência purina 7-deaza-7-substituída e/ou 7-deaza-8-substituída, 5-hidróximetilcitosina, N4-alquilcitosina, por exemplo, N4-etilcitosina, 5-hidroxideoxicitidina, 5-hidroximetildeoxicitidina, N4- alquildeoxicitidina, por exemplo, N4-etildeoxicitidina, 6-tiodeoxiguanosina e desoxirribonucleotídeos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina e diaminopurina, por exemplo, 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina ou outras modificações de bases de nu- cleotídeo naturais. Essa lista se destina a ser exemplificativa e não deve ser interpretada como sendo limitativa.
Em fórmulas particulares descritas aqui, um conjunto de bases modificadas é definido. Por exemplo, a letra Y é usada para se referir à piri- midina e, em algumas modalidades, um nucleotídeo contendo uma citosina ou uma citosina modificada. Uma citosina modificada, conforme usado aqui, é um análogo de base de pirimidina que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente o qual pode substituir essa base sem prejudicar a atividade imunoestimulatória do oligonucleotídeo. Citosinas modificadas incluem, mas não estão limitadas a, citosinas 5-substituídas (por exemplo, 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidróxi- citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina e 5-alquinil-citosina substituída ou não-substituída), citosinas 6-substituídas, citosinas N4- substituídas (por exemplo, N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto- citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sistemas de anel condensado (por exemplo, Ν,Ν'-propileno citosina ou fenoxazina) e uracila e seus derivados (por exemplo, 5-fluoro-uracila, 5-bromo-uracila, 5- bromovinil-uracila, 4-tio-uracila, 5-hidróxi-uracila, 5-proinil-uracila). Algumas das citosinas preferidas incluem 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidróxi- citosina, 5-hidroximetil-citosina e N4-etil-citosina. Em outra modalidade da invenção, a base citosina é substituída por uma base universal (por exemplo,
3-nitropirrol, P-base), um sistema de anel aromático (por exemplo, fluoro- benzeno ou difluorobenzeno) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer).
A letra Z é usada para se referir a uma purina, pirimidina ou abá-
sica e, em algumas modalidades, uma base de guanina ou guanina modifi- cada. Uma guanina modificada, conforme usado aqui, é um análogo de base de purina que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente o qual pode substituir essa base sem prejudicar a atividade imunoestimulatória do oligo- nucleotídeo. Guaninas modificadas incluem, mas não estão limitadas a, 7-deazaguanina, guanina 7-deaza-7-substituída (tal como 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina), guanina 7-deaza-8-substituída, hipoxan- tina, guaninas N2-substituídas (por exemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3- metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina,
2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas substituídas (por exemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina), guanina 8-substituída (por exemplo, 8-hidróxiguanina e 8-bromoguanina) e 6-tioguanina. Em outra modalidade da invenção, a base guanina é substituída por uma base universal (por exem- plo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol e K-base), um sistema de anel aromático (por exemplo, benzimidazol ou dicloro- benzimidazol, amida de ácido 1-metil-1H- [1,2,4]triazol-3-carboxílico) ou um átomo de hidrogênio (dSpacer). Os oligonucleotídeos podem ter uma ou mais extremidades 5'
acessíveis. É possível criar oligonucleotídeos modificados tendo duas de tais extremidades 5'. Isso pode ser obtido, por exemplo, por meio de fixação de dois oligonucleotídeos através de uma ligação 3'-3' para gerar um oligonu- cleotídeo tendo uma ou duas extremidades 5' acessíveis. A ligação 3'3' pode ser uma ligação intemucleotídeo de fosfodiéster, fosforotioato ou qualquer outra modificada. Métodos para realizar tais ligações são conhecidos na téc- nica. Por exemplo, tais ligações foram descritas em Seliger, H. et. ai., Oligo- nucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic Iinkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 e Jiang et. al., Pseudo-ciclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727- 2735.
Adicionalmente, ácidos nucleicos 3'3'-ligados onde a ligação en- tre os nucleotídeos 3'-terminais não é um fosfodiéster, fosforotioato ou outra ligação em ponte modificada, podem ser preparados usando um espaçador adicional, tal como uma porção de fosfato de tri- ou tetra-etileno glicol (Du- rand, M. et. al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaetilene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, Patente US No. 5658738 e Patente US No. 5668265). Alternativamente, o Iigante não-nucleotídico pode ser de- rivado de uma unidade de etanodiol, propanodíol ou de uma desoxirribose abásica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et. al., Sterical recognition by Τ4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5-attached to oligonu- cleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) usando química padrão com fosforamidita. Os Iigantes não-nucleotídicos podem ser incorpo- rados uma ou múltiplas vezes ou combinados uns com os outros, permitindo que qu; Iquer distância desejável entre as extremidades 3' dos dois ODNs sejam ligadas.
Os oligonucleotídeos são parcialmente resistentes à degradação (por exe mplo, são estabilizados). Uma "molécula de oligonucleotídeo estabi- lizada" s ignificará um oligonucleotídeo que é relativamente resistente à de- gradação in vivo (por exemplo, através de uma exo- ou endo-nuclease). A estabilização de ácido nucleico pode ser realizada através de modificações da parte principal. Oligonucleotídeos tendo ligações de fosforotioato propor- cionam atividade máxima e protegem o oligonucleotídeo de degradação por exo- e endo-nucleases intracelulares. Outros oligonucleotídeos modificados incluem ácidos nucleicos fosfodiéster-modificados, combinações de ácido nucleico de fosfodiéster e fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etóxi e combinações dos mesmos.
Partes principais modificadas, tais como fosforotioatos, podem ser sintetizadas usando técnicas automáticas que empregam químicas de fosforamidato ou H-fosfonato. Aril- e alquil-fosfonatos podem ser feitos, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N0. 4.469.863; e alquilfosfotriés- teres (nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada, conforme descrito na Patente U.S. N°. 5.023.243 e Patente Européia No. 092.574) podem ser preparados através de síntese em fase sólida automática usando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para fazer outras modificações e subs- tituições na parte principal do DNA foram descritos (por exemplo, Uhlmann, E. e Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. V. 165, 1990).
Outros oligonucleotídeos estabilizados incluem: análogos de DNA não-iônicos, tais como alquil- e aril-fosfatos (nos quais o oxigênio do fosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, nos quais a porção oxigênio carregado é alquilada. Também foi mostrado que ácidos nucleicos os quais contêm diol, tais como tetraetilenoglicol ou hexaetilenoglicol, em qualquer um ou ambos os térmi- nos, são substancialmente resistentes à degradação por nuclease.
Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreenda uma ou mais seqüências p&lindrômicas. Conforme usado aqui, "palindroma" e, equivalentemente, "seqüência palindrômica", se referirão a uma repetição invertida, isto é, uma seqüência tal como ABCDEEOOOW na qual A e A', B e B', etc., são bases capazes de formar pares de base de Watson-Crick u- suais. Em alguns casos, o palindroma é rico em GC. Um palindroma rico em GC é um palindroma tendo uma composição de base de pelo menos dois terços de G's e C's. Em algumas modalidades, o domínio rico em GC está, de preferência, 3' ao "domínio estimulatório de células B". No caso de um palindroma rico em GC de 10 bases de comprimento, o palindroma, assim, contém pelo menos 8 G's e C's. No caso de um palindroma rico em GC de 12 bases de comprimento, o palindroma também contém pelo menos 8 G's e C's. No caso de um palindroma rico em GC de 14-mer, pelo menos dez ba- ses do palindroma são G's e Cs. Em algumas modalidades, o palindroma rico em Gc é composto exclusivamente de G's e Cs. Em algumas modalida- des, o oligonucleotídeo contém mais do que uma seqüência palindrômica.
DNA é um polímero de desoxirribonucleotídeos unidos através de ligações de fosfodiéster 3-5'. Unidades do polímero da invenção também podem ser unidas através de ligações de fosfodiéster 3-5'. Contudo, a in- venção também abrange polímeros tendo ligações internucleotídeo inco- muns, incluindo especificamente ligações internucleotídeo 5-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' e 2-5'. Em uma modalidade, tais ligações incomuns são excluídas do motivo de DNA imunoestimulatório, mesmo embora uma ou mais de tais li- gações possam ocorrer em qualquer parte dentro do polímero. Para políme- ros tendo extremidades livres, a inclusão de uma ligação internucleotídeo 3'- 3' pode resultar em um polímero tendo duas extremidades 5' livres. Inversa- mente, para polímeros tendo extremidades livres, a inclusão de uma ligação internucleotídeo 5-5' pode resultar em um polímero tendo duas extremida- des 3' livres. Uma composição imunoestimulatória da presente invenção pode conter dois ou mais motivos de DNA imunoestimulatório os quais podem ser ligados através de uma unidade de ramificação. As ligações internucleotídeo podem ser ligações 3'-5\ 5'-5', 3'-3\ 2'-2\ 2'-3' ou 2'-5'. Desse modo, a no- menclatura 2-5' é escolhida de acordo com o í tomo de carbono da desoxir- ribose. Contudo, se porções de açúcar não natural são empregadas, tais como análogos de açúcar com anel expandido (por exemplo, hexanose, ci- Iohexeno ou piranose) ou análogos de açúcar bi- ou tricíclicos, então, essa nomenclatura muda de acordo com a nomenclatura do monômero. A ligação internucleotídeo incomum pode ser uma ligação de fosforodiéster, mas tam- bém pode ser, alternativamente, modificada como fosforotioato ou qualquer outra ligação modificada, conforme descrito aqui. A Fórmula IV mostra uma estrutura geral para oligômeros de DNA ramificado e análogos de oligorribo- nucleotídeo modificados da invenção através de uma unidade de ramificação nucleotídica. Desse modo, Nu-ι, Nu2 e Nu3 pode ser ligado através de liga- ções 3-5', 5-5', 3-3', 2-2', 2'-3' ou 2'-5'. Ramificação de oligômeros de DNA pode também envolver o uso de Iigantes não-nucleotídicos e espaçadores abásicos. Em uma modalidade, Nu-ι, Nu2 e Nu3 representam motivos de DNA
imunoestimulatórios idênticos ou diferentes.
Nu3
X2
Fórmula IV
O análogo de oligorribonucleotídeo modificado pode conter uma unidade duplicadora ou triplicadora (Glen Research, Sterling, VA), em parti- cular aquelas análogos de oligodesoxiribonucleotídeo modificados com uma ligação 3-3'. Uma unidade duplicadora, em uma modalidade, pode ser ba- seada em 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoxitritilóxi)pentilamido]propil-2-[(2-cianoetil)- (N,N-diisopropil)]-fosforamidita. Uma unidade triplicadora, em uma modali- dade, pode ser baseada na incorporação de Tris-2,2,2-[3-(4,4'- dimetóxitritilóxi)propilóximetil]etil-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]- fosforamidita. Ramificação dos análogos de oligorribonucleotídeo modifica- dos através de múltiplas unidades duplicadoras, triplicadoras ou outras mul- tiplicadoras leva a dendrímeros, os quais são uma outra modalidade da pre- sente invenção. Análogos de oligorribonucleotídeo ramificados modificados podem levar à ligação cruzada de receptores, particularmente para combi- nações de RNA e DNA imunoestimulatórios, tais como TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9, com efeitos imunes distintos comparado com formas não ramificadas de análogos. Além disso, a síntese de análogos multiméricos ramificados ou outros pode estabilizar o DNA contra degradação e pode permitir que se- qüências de DNA fracas ou parcialmente eficazes exerçam um nível tera- peuticamente útil de atividade imune. Os análogos de oligodeóxiribonucleo- tídeo modificados podem também conter unidades Iigantes resultantes de reagentes de modificação de peptídeo ou reagentes de modificação de oli- gonucleotídeo (Glen Research). Além disso, os análogos de oligodeóxiribo- nucleotídeo modificados podem conter um ou mais resíduos de aminoácido naturais ou não naturais os quais são conectados ao polímero através de ligações peptídicas (amida). As ligações internucleotídeo 3-5', 5-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' e 2'-5'
podem ser diretas ou indiretas. Ligações diretas, nesse contexto, refere-se a uma ligação de fosfato ou fosfato modificado conforme divulgado aqui, sem uma porção Iigante interveniente. Uma porção Iigante interveniente é uma porção orgânica distinta de uma ligação de fosfato ou fosfato modificado conforme divulgado aqui a qual pode incluir, por exemplo, polietileno glicol, trietileno glicol, hexaetileno glicol, dSpacer (isto é, um deoxinucleotídeo abá- sico), unidade duplicadora ou unidade triplicadora. As ligações são, de preferência, compostas de C, Η, N1O , S1 B, P e halogênio contendo 3 a 300 átomos. Por exemplo, com 3 átomos é uma ligação de acetal (0DN1-3'-0-CH2-0-3'-0DN2) conectando, por exemplo, o grupo 3'-hidróxi de um nucleotídeo ao grupo 3'-hidróxi de um segundo oligo- nucleotídeo. Um exemplo com cerca de 300 átomos é PEG-40 (tetra polieti- Ieno glicol). Ligações preferidas são ligações de fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato, fosforamidato, boranofosfonato, amida, éter, tioéter, acetal, tioacetal, uréia, tiouréia, sulfonamida, Base de Schiff e dissulfeto. Também é possível usar o Solulink BioConjugation System (www.trilinkbiotech.com). Se o oligonucleotídeo é composto de duas ou mais partes de
seqüência, essas partes podem ser idênticas ou diferentes. Assim, em um oligonucleotídeo com uma ligação 3'3', as seqüências podem ser 5'-ODN1- 3'3'-ODN1-5' idênticas ou 5,-ODN1-3'3'-ODN2-5' diferentes. Além disso, a modificação química das várias partes do oligonucleotídeo, bem como o Ii- gante que conecta as mesmas, podem ser diferentes. Uma vez que a capta- ção de oligonucleotídeos curtos parece ser menos eficiente do que aquela de oligonucleotídeos longos, a ligação de duas ou mais seqüências curtas resulta em estimulação imune aperfeiçoada. O comprimento dos oligonu- cleotídeos curtos é, de preferência, 2-20 nucleotídeos, mais preferivelmente 3-16 nucleotídeos mas, mais preferivelmente, 5-10 nucleotídeos. Preferidos são oligonucleotídeos ligados os quais têm duas ou mais extremidades 5' não ligadas.
As seqüências parciais de oligonucleotídeo também podem ser ligadas através de Iigantes não-nucleotídicos. Um "ligante não-nucleotídico", conforme usado aqui, refere-se a qualquer elemento ligante que não é um nucleotídeo ou polímero do mesmo (isto é, um polinucleotídeo), em que um nucleotídeo inclui uma nucleobase purina ou pirimidina e um fosfato de açú- car, em particular Iigantes abásicos (dSpacers), unidades de trietileno glicol ou unidades de hexaetileno glicol. Outros Iigantes preferidos são Iigantes de alquilamino, tais como C3, C6, C12 aminoligantes e também Iigantes de al- quiltiol, tais como Iigantes de C3 ou C6 tiol. Os oligonucleotídeos podem também ser ligados através de resíduos aromáticos os quais podem ser ain- da substituídos por grupos alquila ou alquila substituída.
Para facilitar a captação em células, os oligonucleotídeos imu- noestimulatórios têm, em algumas modalidades, na faixa de 3 a 100 bases de comprimento. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos têm 7-100 bases de comprimento. Tipicamente, ácidos nucle icos de qualquer tamanho maior do que 6 nucleotídeos (mesmo muitos kb de comprimento) são capa- zes de induzir a uma resposta imune de acordo com antígeno se motivos imunoestimulatórios suficientes estão presentes. Contudo, a capacidade i- munoestimulatória aprimorada dos oligonucleotídeos modificados da inven- ção proporciona moléculas imunoestimulatórias de comprimento muito mais curto. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios têm 3-6 bases de comprimento.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são úteis, em alguns aspectos da invenção, como uma vacina para o tratamento de um indivíduo em risco de desenvolver alergia ou asma, uma infecção com um organismo infeccioso ou um câncer no qual um antígeno cancerígeno espe- cífico foi identificado. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG po- dem também ser fornecidos sem o antígeno ou alérgeno para proteção con- tra infecção, alergia e câncer e, nesse caso, doses repetidas podem permitir proteção a longo prazo. Um indivíduo em risco, conforme usado aqui, é um indivíduo que tem qualquer risco de exposição a uma infecção causada por um patógeno ou um câncer ou um alérgeno ou um risco de desenvolver câncer. Por exemplo, um indivíduo em risco pode ser um indivíduo que está planejando viajar para uma área onde um tipo particular de agente infeccioso é encontrado ou pode ser um indivíduo que, pelo estilo de vida ou procedi- mentos médicos, está exposto a fluidos corporais os quais podem conter organismos infecciosos ou diretamente ao organismo ou mesmo qualquer indivíduo que vive em uma área onde um organismo infeccioso ou um alér- geno tenha sido identificado. Indivíduos em risco de desenvolver infecção também incluem populações em geral às quais uma agência médica reco- menda vacinação com um antígeno de organismo infeccioso em particular. Se o antígeno é um alérgeno e o indivíduo desenvolve respostas alérgicas a esse antígeno em particular e o indivíduo é exposto ao antígeno, isto é, du- rante estação de pólen, então, esse indivíduo está em risco de exposição ao antígeno. Um indivíduo em risco de desenvolver alergia ou asma inclui aque- les indivíduos que foram identificados como tendo uma alergia ou asma, mas que não têm a doença ativa durante o tratamento com oligonucleotídeo imu- noestimulatório de CpG1 bem como indivíduos que são considerados em risco de desenvolver essas doenças em virtude de fatores genéticos ou am- bientais.
Um indivíduo em risco de desenvolver um câncer é um que tem uma alta probabilidade de desenvolver câncer. Esses indivíduos incluem, por exemplo, indivíduos tendo uma anormalidade genética, a presença da qual foi demonstrada como tendo uma correlação com uma maior probabilidade de desenvolver um câncer e indivíduos expostos a agentes que causam câncer, tais como tabaco, amianto ou outras toxinas químicas ou um indiví- duo que foi previamente tratado para câncer e está em evidente remissão. Quando um indivíduo em risco de desenvolver um câncer é tratado com um antígeno específico para o tipo de câncer ao qual o indivíduo está em risco de desenvolver e um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG, o indiví- duo pode ser capaz de matar as células cancerígenas à medida que elas se desenvolvem. Se um tumor começa a se formar no indivíduo, o indivíduo desenvolverá uma resposta imune específica contra o antígeno tumoral.
Além do uso dos oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG para tratamento profilático, a invenção também abrange o uso dos oligonu- cleotídeos imunoestimulatórios de CpG para o tratamento de um indivíduo tendo uma infecção, uma alergia, asma ou um câncer.
Um indivíduo tendo uma infecção é um indivíduo que foi exposto a um patógeno infeccioso e tem níveis detectáveis agudos ou crônicos do patógeno no corpo. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG po- dem ser usados com ou sem um antígeno para montar uma resposta imune sistêmica ou mucosal específica a antígeno que é capaz de reduzir o nível de ou erradicar o patógeno infeccioso. Uma doença infecciosa, conforme usado aqui, é uma doença que surge da presença de um micro-organismo estranho no corpo. É particularmente importante desenvolver estratégias de vacina e tratamentos eficazes para proteger as superfícies mucosais do cor- po, as quais são o local primário de entrada patogênica.
Um indivíduo te ndo uma alergia é um indivíduo que tem ou está em risco de desenvolver una reação alérgica em resposta a um alérgeno. Um alérgeno refere-se a uma hiper-sensibilidade adquirida a uma substância (alérgeno). Condições alérgicas incluem, mas não estão limitadas a, ecze- ma, rinite alérgica ou coriza, febre do feno, conjuntivite, asma brônquica, ur- ticária e alergias alimentares e outras condições atópicas.
Alergias são, em geral, causadas pela geração de anticorpo IgE contra alérgenos prejudiciais. As citocinas que são induzidas através de ad- ministração sistêmica ou mucosal de oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são predominantemente de uma classe denominada Th1 (exemplos são IL-12, IP-10, IFN-α e IFN-γ) e essas induzem à respostas imunes humo- rais e celulares. O outro principal tipo de resposta imune a qual está associ- ada à produção de citocinas IL-4 e IL-5 é denominado uma resposta imune Th2. Em geral, parece que doenças alérgicas são mediadas por respostas imunes do tipo Th2. Baseado na capacidade dos oligonucleotídeos imunoes- timulatórios de CpG de desviar a resposta imune em um indivíduo de uma resposta Th2 predominante (a qual está associada à produção de anticorpos IgE e alergia) para uma resposta Th2/Th1 equilibrada (a qual é protetora contra reações alérgicas), uma dose eficaz para indução de uma resposta imune de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG pode ser adminis- trada a um indivíduo para tratar ou prevenir asma e alergia.
Assim, os oligc nucleotídeos imunoestimulatórios de CpG têm utilidade terapêutica significativa no tratamento de condições alérgicas e não alérgicas, tais como asma. Citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, estão elevadas nas vias aéreas de indivíduos asmáticos. Essas citocinas promo- vem aspectos importantes da resposta inflamatória asmática, incluindo troca de isotipo IgE, quimiotaxia de eosinófilos e ativação e crescimento de mas- tócitos. Citocinas Th1, especialmente IFN-γ e IL-12, podem suprimir a for- mação de clones de Th2 e a produção de citocinas Th2. Asma refere-se a um distúrbio do sistema respiratório caracterizado por inflamação, estreita- mento das vias aéreas e reatividade aumentada das vias aéreas a agentes inalados. A asma está freqüente, embora não exclusivamente, associada a sintomas atópicos ou alérgicos.
Um indivíduo tendo um câncer é um indivíduo que tem células
cancerígenas detectáveis. O câncer pode ser um câncer maligno ou não- maligno. Cânceres ou tumores incluem, mas não estão limitados a, câncer do trato biliar; câncer de cérebro; câncer de mama; câncer cervical; coriocar- cinoma; câncer de cólon; câncer endometrial; câncer esofageal; câncer gás- tricô; neoplasmas intraepiteliais; linfomas; câncer de fígado; câncer de pul- mão (por exemplo, células pequenas e células não-pequenas); melanoma; neuroblastomas; câncer oral; câncer ovariano; câncer de pâncreas; câncer de próstata; câncer retal; sarcomas; câncer de pele; câncer testicular; câncer da tiróide; e câncer renal, bem como outros carcinomas e sarcomas. Em uma modalidade, o câncer é leucemia de células pilosas, leucemia mielogê- nea crônica, leucemia de células T cutâneas, mieloma múltiplo, Iinfoma foli- cular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renais, carcinoma de próstata, carcinoma de células da bexiga ou carcinoma de cólon.
Um indivíduo significará um ser humano ou animal vertebrado
incluindo, mas não limitado a, um cão, gato, cavalo, vaca, porco, ovelha, ca- bra, peru, galinha, primata, por exemplo, macaco e peixe (espécies de aqui- cultura), por exemplo, salmão. Assim, a invenção também pode ser usada para tratar câncer e tumores, infecções e alergia/asma em indivíduos não humanos. Câncer e uma das causas de morte em animais de companhia (isto é, cães e gatos).
Conforme usado aqui, o termo tratar, tratado ou tratamento, quando usado com relação a um distúrbio, tal como uma doença infecciosa, câncer, alergia ou asma, refere-se a um tratamento profilático o qual aumen- ta a resistência de um indivíduo ao desenvolvimento da doença (por exem- plo, à infecção com um patógeno) ou, em outras palavras, diminui a probabi- lidade de que o indivíduo desenvolva a doença (por exemplo, se torne infec- tado com o patógeno), bem como um tratamento após o indivíduo ter desen- volvido a doença de modo a combater a doença (por exemplo, reduzir ou eliminar a infecção) ou impedir que a doença se torne pior.
Nos casos quando o oligonucleotídeo de CpG é administrado com um antígeno, o indivíduo pode ser exposto ao antígeno. Conforme usa- do aqui, o termo exposto refere-se à etapa ativa de contato do indivíduo com um antígeno ou à exposição passiva do indivíduo ao antígeno in vivo. Méto- dos para a exposição ativa de um indivíduo a um antígeno são bem conhe- cidos na técnica. Em geral, um antígeno é administrado diretamente ao indi- víduo através de qualquer meio, tal como administração intravenosa, intra- muscular, oral, transdérmica, mucosal, intranasal, intratraqueal ou subcutâ- nea. O antígeno pode ser administrado sistêmica ou localmente. Métodos para administração do antígeno e do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG são descritos em maiores detalhes abaixo. Um indivíduo é passivamen- te exposto a um antígeno se um antígeno se torna disponível para exposição às células imunes no corpo. Um indivíduo pode ser passivamente exposto a um antígeno, por exemplo, através de entrada de um patógeno estranho no corpo ou através do desenvolvimento de uma célula tumoral expressando um antígeno estranho sobre sua superfície.
Os métodos nos quais um indivíduo é passivamente exposto a um antígeno podem ser particularmente dependentes da sincronização de administração do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG. Por exemplo, em um indivíduo em risco de desenvolver um câncer ou uma doença infec- ciosa ou uma resposta alérgica ou asmática, o indivíduo pode ser adminis- trado com o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG em uma base regu- lar quando esse risco é maior, isto é, durante uma estação de alergia ou a - pós exposição a um agente que causa câncer. Adicionalmente, o oligonucle- otídeo imunoestimulatório de CpG pode ser administrado a viajantes antes que eles viagem para países estrangeiros onde eles estão em risco de ex- posição a agentes infecciosos. Da mesma forma, o oligonucleotídeo imuno- estimulatório de CpG pode ser administrado a soldados ou civis em risco de exposição à guerra biológica para induzir a uma resposta imune sistêmica ou mucosal ao antígeno quando e se o indivíduo for exposto ao mesmo.
Um antígeno, conforme usado aqui, é uma molécula capaz de provocar uma resposta imune. Antígenos incluem, mas não estão limitados a, células, extratos de células, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissa- carídeos, conjugados de polissacarídeos, mímicos de polissacarídeo de pep- tídeo e não-peptídeo e outras moléculas, pequenas moléculas, lipídios, glico- lipídios, carboidratos, vírus e extratos virais e organismos multicelulares, tais como parasitas e alérgenos. O termo antígeno inclui, amplamente, qualquer tipo de molécula a qual é reconhecida pelo sistema imune do hospedeiro como sendo estranho. Antígenos incluem, mas não estão limitados a, antí- genos cancerígenos, antígenos microbianos e alérgenos.
Um antígeno cancerígeno, conforme usado aqui, é um compos- to, tal como um peptídeo ou proteína, associado à superfície celular de um tumor ou câncer e o qual é capaz de provocar uma resposta imune quando expresso sobre a superfície de uma célula apresentando antígeno no con- texto de uma molécula do MHC. Antígenos cancerígenos podem ser prepa- rados a partir de células cancerígenas através de preparo de extratos brutos de células cancerígenas, por exemplo, conforme descrito em Cohen et. al., 1994, Câncer Research, 54: 1055, através de purificação parcial dos antíge- nos, através da tecnologia recombinante ou através da síntese de novo de antígenos conhecidos. Antígenos cancerígenos incluem, mas não estão limi- tados a, antígenos que são recombinantemente expressos, uma porção i- munogênica de ou todo um tumor ou câncer. Tais antígenos podem ser iso- lados ou preparados recombinantemente ou através de qualquer outro meio conhecido na técnica.
Um antígeno microbiano, conforme usado aqui, é um antígeno de um micro-organismo e inclui, mas não está limitado a, vírus, bactérias, parasitas e fungos. Tais antígenos incluem o micro-organismo intacto, bem como isolados naturais e fragmentos ou derivados dos mesmos e também compostos sintéticos os quais são idênticos a ou similares a antígenos de micro-organismo naturais e induzem a uma resposta imune específica para esse micro-organismo. Um composto é simular a um antígeno de micro- organismo natural se ele induz a uma resposta imune (humoral e/ou celular) a um antígeno de micro-organismo natural. Tais antígenos são usados roti- neiramente na técnica e são bem conhecidos por aqueles versados na técni- ca.
Vírus são pequenos agentes infecciosos os quais geralmente
contêm um núcleo de ácido nucleico e um revestimento de proteína, mas não são organismos vivos independentes. Vírus podem tomar também a forma de ácidos nucleicos infecciosos carecendo de uma proteína. Um vírus não pode sobreviver na ausência de uma célula viva, dentro da qual ele se replica. Vírus entram em células vivas específicas através de endocitose ou injeção direta de DNA (fago) e se multiplicam, causando doença. O vírus multiplicado pode, então, ser liberado e infectar células adicionais. Alguns vírus são vírus contendo DNA e outros são vírus contendo RNA. Vírus de DNA incluem Pox, Herpes, Adeno, Papova, Parvo e Hepadna. Vírus de RNA incluem Picorna, Calici, Astro1Toga, Flavi1 Corona, Paramyxo1 Orthomyxo, Bunya, Arena, Rhabdo, Filo, Borna, Reo e Retro. Em alguns aspectos, a in- venção também se destina a tratar doenças nas quais prions estão implica- dos na progressão da doença tais como, por exemplo, encefalopatia espon- giforme bovina (isto é, doença da vaca louca, BSE) ou infecção paraplexia enzoótica em animais ou doença de Creutzfeldt-Jakob em seres humanos.
Vírus incluem, mas não estão limitados a, enterovírus (incluindo, mas não limitado a, vírus da família picornaviridae, tais como o pólio vírus, vírus Coxsackie, eco vírus), rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite, tal co- mo hepatite A, B, C D e E. Exemplos específicos de vírus que foram encon- trados em seres humanos incluem, mas não estão limitados a: Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana, tal como HIV-1 (também referido como HTLV-III, LAV ou HTLV-IIl/LAV ou HIV-III; e outros isolados, tal como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, pólio vírus, vírus da hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exemplo, cepas que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite eqüina, vírus da rubéola); Flaviviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite ve- sicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, ebola vírus); Paramyxoviri- dae (por exemplo, vírus da paraínfluenza, vírus da catapora, vírus do saram- po, vírus sincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da in- fluenza); Bunyaviridae (por exemplo, vírus de Hantaan, bunya vírus, fleboví- rus e Nairo vírus); Arenaviridae (vírus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus da hepatite B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus, po- Iioma vírus); Adenoviridae (a maioria dos adenovírus); Herpesviridae (vírus do herpes simplex (HSV) 1 e 2, vírus da varicela zoster, citomegalovírus (CMV)); Poxviridae (vírus da varíola, vírus da vaccinia, pox vírus); Iridoviri- dae (por exemplo, vírus da febre suína Africana); e outros vírus, tais como vírus da Iaringotraqueobronquite aguda, Alfavírus, herpes vírus sarcoma de Kaposi-associado, vírus da doença de Newcastle, Nipah vírus, Norwalk ví- rus, Papilomavírus, vírus da paraínfluenza, influenza aviária, vírus da SARs, vírus West Nile.
Os métodos da invenção são particularmente úteis, em algumas modalidades, para o tratamento de vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus da hepatite. O HIV, uma espécie de retrovírus, também conhecido como vírus Ill linfotrópico de células T humanas (HTLV III), é responsável por causar a deterioração que resulta no distúrbio conhecido como AIDS. O HIV infecta e destrói células T, alterando o equilíbrio global do sistema imu- ne, resultando em uma perda da capacidade dos pacientes de combater ou- tras infecções e predispondo o paciente à infecções oportunistas, as quais freqüentemente provam ser fatais.
A hepatite viral é uma inflamação do fígado a qual pode produzir inchaço, dor e algumas vezes dano permanente ao fígado. Se a inflamação do fígado continua pelo menos seis meses ou mais, ela é referida como he- patite crônica. Existem pelo menos cinco vírus diferentes conhecidos por causar hepatite viral, incluindo hepatite A, B, C, D e Ε. A hepatite A é geral- mente transmitida através de alimento ou água contaminada com fezes hu- manas. A hepatite B é geralmente transmitida através de fluidos corporais, tal como sangue. Por exemplo, ela pode ser transmitida da mãe para a cri- ança ao nascer, através de contato sexual, transfusões de sangue e agulhas contaminadas. A hepatite C é muito comum e, assim como a hepatite B, é freqüentemente transmitida através de transfusões de sangue e agulhas contaminadas. A hepatite D é encontrada mais freqüentemente em usuários de drogas IV que são portadores do vírus da hepatite B com ele se co- associa. A hepatite E é similar à hepatite A viral e está geralmente associado à pobre sanitarização.
Bactérias gram negativas e gram positivas servem como antíge- nos em animais vertebrados. Tais bactérias gram positivas incluem, mas não estão limitadas a, espécies Pasteurella, espécies Staphilococci e espécies Streptococcus. Bactérias gram negativas incluem, mas não estão limitadas a, espécies Escherichia coii, Pseudomonas e espécies Salmoneiia. Exem- plos específicos de bactérias infecciosas incluem, mas não estão limitados a, Helicobaeter piloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobac- teria sps (por exemplo, M. tubereulosis, M. avium, M. intraeellulare, M. kan- saii, M. gordonae), Staphiloeoeeus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monoeytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptoco- co do Grupo A), Streptococcus agalactiae (Estreptococo do Grupo B), Strep- tococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, S- treptococcus (sps. anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campilobacter sp. patogênico, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebaeterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopati- ae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobaeter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobaeterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia e Actinomyces israelli.
Exemplos de fungos incluem Cryptococcus neoformans, Histo- plasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, C- hlamydia trachomatis, Candida albicans.
Outros organismos infecciosos (isto é, protistas) incluem Plas- modium spp. tais como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium vivax e Toxoplasma gondii. Parasitas teci- duais e/ou trazidos no sangue incluem Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania brazili- ensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense e Trypanosoma rho- desiense (doença do sono Africana), Trypanosoma cruzi (doença de Cha- gas) e Toxoplasma gondii.
Outros micro-organismos medicamente relevantes foram descri- tos extensivamente na literatura, por exemplo, veja C.G.A Thomas, Medicai Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, os conteúdos todos do qual são aqui incorporados por referência.
Um alérgeno refere-se a uma substância (antígeno) que pode induzir a uma resposta alérgica ou asmática em um indivíduo suscetível. A lista de alérgenos é enorme e pode incluir polens, venenos de inseto, pó de caspa animal, esporos fúngicos e fármacos (por exemplo, penicilina). Exem- pios de alérgenos naturais, de animal e planta incluem, mas não estão limi- tados a, proteínas específicas aos seguintes gêneros: Canine (Canis familia- ris); Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoides farinae)·, Felis (Fe- Iis domesticus)] Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia\ Lolium (por exemplo, Loli- um perenne ou Lolium muItiflorum)] Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Al- ternaria (Alternaria alternata)·, Alder, Alnus (Alnus gultinoasa)·, Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemi- sia vulgaris)·, Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata)·, Parietaria (por exemplo, Parietaria officinalis ou Parietaria judaica)·, Blattella (por exemplo, Blattella germanica); Apis (por exemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por exemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica e Cupressus ma- crocarpa)·, Juniperus (por exemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginia- na, Juniperus communis e Juniperus ashei)·, Thuya (por exemplo, Thuya ori- entalis)] Chamaecyparis (por exemplo, Chamaecyparis obtusa)·, Periplaneta (por exemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por exemplo, Agropyron repens); Secale (por exemplo, Seeale eereale)·, Triticum (por exemplo, Triti- eum aestivum)·, Dactilis (por exemplo, Daetilis glomerata)] Festuca (por e- xemplo, Festuca elatior)', Poa (por exemplo, Poa pratensis ou Poa compres- sa); Avena (por exemplo, Avena sativa); Holcus (por exemplo, Holcus Iana- tus)\ Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthum odoratum)\ Arrhenatherum (por exemplo, Arrhenatherum elatius)·, Agrostis (por exemplo, Agrostis alba)·, Phleum (por exemplo, Phleum pratense)·, Phalaris (por exemplo, Phalaris arundinacea)·, Paspalum (por exemplo, Paspalum notatum); Sorghum (por exemplo, Sorghum halepensis)·, e Bromus (por exemplo, Bromus inermis).
O termo substancialmente purificado, conforme usado aqui, refe- re-se a um polipeptídeo o qual é substancialmente isento de outras proteí- nas, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais ele está natural- mente associado. Aqueles versados na técnica podem purificar polipeptí- deos virais ou bacterianos usando técnicas padrões para purificação de pro- teína. O polipeptídeo substancialmente puro freqüentemente proporcionará uma única banda principal sobre um gel de poliacrilamida de não redução. No caso de polipeptídeos parcialmente glicosilados ou aqueles que têm vá- rios códons iniciais, podem haver várias bandas sobre um gel de poliacrila- mida de não redução, mas essas formarão um padrão distintivo para esse polipeptídeo. A pureza do polipeptídeo viral ou bacteriano também pode ser determinada através de análise de seqüência de aminoácido amino-terminal. Outros tipos de antígeno não codificados por um vetor de ácido nucleico, tais como polissacarídeos, pequenas moléculas, mímicos, etc. estão incluídos dentro da invenção.
Os oligonucleotídeos da invenção podem ser administrados a um indivíduo com um agente antimicrobiano. Um agente antimicrobiano, conforme usado aqui, refere-se a um composto sintético ou que ocorre natu- ralmente, o qual é capaz de matar ou inibir micro-organismos infecciosos. O tipo de agente antimicrobiano útil de acordo com a invenção dependerá do tipo de micro-organismo com o qual o indivíduo é infectado ou está em risco de se tornar infectado. Agentes antimicrobianos incluem, mas não estão limi- tados a, agentes antibacterianos, agentes antivirais, agentes antifúngicos e agentes antiparasíticos. Frases tais como "agente anti-infeccioso", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente antifúngico", "agente antiparasíti- co" e "parasiticida" têm significados bem estabelecidos por aqueles versados na técnica e são definidos em textos médicos padrões. Resumidamente, a - gentes antibacterianos matam ou inibem bactérias e incluem antibióticos, bem como outros compostos sintéticos ou naturais tendo funções similares. Antibióticos são moléculas de baixo peso molecular as quais são produzidas como metabolitos secundários por células, tais como micro-organismos. Em geral, antibióticos interferem com uma ou mais funções ou estruturas bacte- rianas as quais são específicas para o micro-organismo e as quais não estão presentes em células hospedeiras. Agentes antivirais podem ser isolados de fontes naturais ou sintetizados e são úteis para matar ou inibir vírus. Agentes antifúngicos são usados para tratar infecções fúngicas superficiais, bem co- mo infecções fúngicas oportunísticas e sistêmicas primárias. Agentes antipa- rasíticos matam ou inibem parasitas.
Exemplos de agentes antiparasíticos, também referidos como parasiticidas, úteis para administração a seres humanos incluem, mas não estão limitados a, albendazola, anfotericina B, benzimidazol, bitionol, cloro- quina HCI1 fosfato de cloroquina, clindamicina, dehidroemetina, dietilcarba- mazina, furoato de diloxanida, eflornitina, furazolidona, glicocorticóides, halo- fantrina, iodoquinol, ivermectina, mebendazola, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronidazola, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, prazi- quantel, fosfato de primaquina, proguanil, pamoato de pyrantel, pirimetana- mina-sulfonamidas, pirimetanamina-sulfadoxina, quinacrina HCI, sulfato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, estibogluconato sódico (gluco- nato de antimônio de sódio), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazola, tinidazola, trimetroprim-sulfametoxazola e triparsamida, alguns dos quais são usados apenas ou em combinação com outras.
Agentes antibacterianos matam ou inibem o crescimento ou função de bactérias. Uma grande classe de agentes antibacterianos são an- tibióticos. Antibióticos os quais são eficazes para matar ou inibir uma ampla faixa de bactérias são referidos como antibióticos de amplo espectro. Outros tipos de antibióticos são predominantemente eficazes contra as bactérias da classe gram positiva ou gram negativa. Esses tipos de antibióticos são refe- ridos como antibióticos de espectro limitado. Outros antibióticos os quais são eficazes contra um único organismo ou doença e não contra outros tipos de bactérias são referidos como antibióticos de espectro limitado. Agentes anti- bacterianos são, algumas vezes, classificados baseado no modo primário de ação. Em geral, agentes antibacterianos são inibidores da síntese da parede celular, inibidores da membrana celular, inibidores da síntese de proteína, inibidores da síntese de ácido nucleico ou funcionais e inibidores competiti- vos.
Agentes antivirais são compostos os quais impedem a infecção de células por vírus ou a replicação do vírus dentro da célula. Existem muito menos fármacos antivirais do que fármacos antibacterianos porque o pro- cesso de replicação viral é tão próximo da replicação de DNA dentro da célu- la hospedeira que agentes antivirais não específicos freqüentemente são tóxicos para o hospedeiro. Existem vários estágios dentro do processo de infecção viral os quais podem ser bloqueados ou inibidos por agentes antivi- rais. Esses estágios incluem fixação do vírus à célula hospedeira (imunoglo- bulina ou peptídeos de ligação), não revestimento do vírus (por exemplo, amantadina), síntese ou tradução de mRNA viral (por exemplo, interferon), replicação de RNA ou DNA viral (por exemplo, análogos de nucleotídeo), maturação de novas proteínas virais (por exemplo, inibidores de protease) e surgimento e liberação do vírus.
Análogos de nucleotídeo são compostos sintéticos os quais são similares aos nucleotídeos, mas os quais têm um grupo desoxirribose ou ribose anormal ou incompleto. Uma vez que os análogos de nucleotídeo es- tão na célula, eles são fosforilados, produzindo o trifosfato formado o qual compete com nucleotídeos normais pela incorporação no DNA ou RNA viral. Uma vez que a forma de trifosfato do análogo de nucleotídeo é incorporada na cadeia de ácido nucleico em crescimento, ela causa associação irreversí- vel com a polimerase viral e, assim, término de cadeia. Análogos de nucleo- tídeo incluem, mas não estão limitados a, aciclovir (usado para o tratamento do vírus do herpes simplex e vírus de varicela-zoster), ganciclovir (útil para o tratamento de citomegalovírus), idoxuridina, ribavirina (útil para o tratamento de vírus sincicial respiratório), dideóxiinosina, dideóxicitidina, zidovudina (a- zidotimidina), imiquimod e resimiquimod.
Os interferons são citocinas as quais são secretadas por células infectadas com vírus, bem como células imunes. Os interferons funcionam através de ligação a receptores específicos sobre células adjacentes às cé- lulas infectadas, causando a alteração na célula a qual a protege contra in- fecção pelo vírus, α e β-interferon também induzem à expressão de molécu- las do MHC da Classe I e da Classe Il sobre a superfície de células infecta- das, resultando em apresentação aumentada de antígeno para reconheci- mento por células imunes do hospedeiro, α e β-interferons estão disponíveis como formas recombinantes e têm sido usados para o tratamento de infec- ção crônica por hepatite B e C. Nas dosagens as quais são eficazes para terapia antiviral, interferons têm vários efeitos colaterais, tais como febre, mal estar e perda de peso. Agentes antivirais úteis na invenção incluem, mas não estão limi-
tados a, imunoglobulinas, amantadina, interferons, análogos de nucleotídeo e inibidores de protease. Exemplos específicos de antivirais incluem, mas não estão limitados a, Acemannan; Aciclovir; Aciclovir Sódico; Adefovir; Alo- vudina; Alvircept Sudotox; Hidrocloreto de Amantadina; Aranotina; Arildona; Mesilato de Atevirdina; Avridina; Cidofovir; Cipanfillina; Hidrocloreto de Cita- rabina; Mesilato de Delavirdina; Desciclovir; Didanosina; Disoxaril; Edoxudi- na; Enviradeno; Enviroxima; Famciclovir; Hidrocloreto de Famotina; Fiacita- bina; Fialuridina; Fosarilato; Foscarnet Sódico; Fosfonet Sódico; Ganciclovir; Ganciclovir Sódico; Idoxuridina; Kethoxal; Lamivudina; Lobucavir; Hidroclore- to de Memotina; Metisazona; Nevirapina; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirina; Hidrocloreto de Rimantadina; Mesilato de Saquinavir; Hidroeloreto de So- mantadina; Sorivudina; Statolon; Estavudina; Hidrocloreto de Tilorona; Triflu- ridina; Hidrocloreto de Valaciclovir; Vidarabina; Fosfato de Vidarabina; Fosfa- to de sódio de Vidarabina; Viroxima; Zalcitabina; Zidovudina; e Zinviroxima. Agentes antifúngicos são úteis para o tratamento e prevenção de
fungos infecciosos. Agentes antifúngicos são, algumas vezes, classificados por seu mecanismo de ação. Alguns agentes antifúngicos funcionam como inibidores da parede celular através de inibição da sintase de glicose. Esses incluem, mas não estão limitados a, basiungina/ECB. Outros agentes anti- fúngicos funcionam através de desestabilização de integridade da membra- na. Esses incluem, mas não estão limitados a, imidazolas, tais como clotri- mazola, sertaconzola, fluconazola, itraconazola, cetoconazola, miconazola e voriconacola, bem como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pra- dimicina, UK 292, butenafina e terbinafina. Outros agentes antifúngicos fun- cionam através de ruptura de quitina (por exemplo, quitinase) ou imuno- supressão (creme 501). Oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem ser com-
binados com outros agentes terapêuticos, tais como adjuvantes, para inten- sificar respostas imunes. O oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG e outros agentes terapêuticos podem ser administrados simultânea ou se- qüencialmente. Quando os outros agentes terapêuticos são administrados simultaneamente, eles podem ser administrados na mesma ou em formula- ções distintas, mas são administrados ao mesmo tempo. Os outros agentes terapêuticos são administrados seqüencialmente uns com os outros e com um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG, quando a administração dos outros agentes terapêuticos e do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG é temporariamente separada. A separação no tempo entre a adminis- tração desses compostos pode ser uma questão de minutos ou pode ser mais longa. Outros agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes, citocinas, anticorpos, antígenos, etc.
As composições da invenção podem também ser administradas com adjuvantes que não são de ácido nucleico. Um adjuvante que não é de ácido nucleico é qualquer molécula ou composto, exceto quanto aos oligo- nucleotídeos imunoestimulatórios de CpG descritos aqui, a qual pode esti- mular a resposta imune humoral e/ou celular. Adjuvantes que não são de ácido nucleico incluem, por exemplo, adjuvantes que criam um efeito de de- pósito, adjuvantes de estimulação imune e adjuvantes que criam um efeito de depósito e estimulam o sistema imune.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são também úteis como adjuvantes mucosais. Descobriu-se anteriormente que a imuni- dade sistêmica e mucosal é induzida pela distribuição mucosal de ácidos nucleicos de CpG. Assim, os oligonucleotídeos podem ser administrados em combinação com outros adjuvantes mucosais.
Respostas imunes podem também ser induzidas ou aumentadas
através da coadministração ou expressão colinear de citocinas (Bueler & Mulligan1 1996; Chow et. ai, 1997; Geissler et. al.,1997; Iwasaki et. al.,1997; Kim et. al.,1997) ou moléculas coestimulatórias B7 (Iwasaki et. al.,1997; Tsu- ji et. al.,1997) com os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG. O ter- mo citocina é usado como um nome genérico para um grupo diverso de pro- teínas solúveis e peptídeos os quais atuam como reguladores hormonais em concentrações nano- a picomolar e os quais, sob condições normais ou pa- tológicas, modulam as atividade funcionais de células e tecidos individuais. Essas proteínas também mediam interações entre células diretamente e re- guiam processos que ocorrem no ambiente extracelular. Exemplos de citoci- nas incluem, mas não estão limitados a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 10, IL-12, IL-15, IL-18, fator de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (G- CSF), interferon-α (a-IFN), IFN-β, fator de necrose de tumor (TNF), TNF-β, Iigante FLT-3 e Iigante CD40.
Os oligonucleotídeos são também úteis para redirecionamento de uma resposta imune de uma resposta imune Th2 para uma resposta imu- ne Th1. Isso resulta na produção de um ambiente Th1/Th2 relativamente equilibrado. Redirecionamento de uma resposta imune de uma resposta i- mune Th2 para Th1 pode ser avaliado através de medição dos níveis de ci- tocinas produzidas em resposta ao ácido nucleico (por exemplo, através de indução de células monocíticas e outras células a produzir citocinas Th1, incluindo IL-12, IFN-α e GM-CSF). O redirecionamento ou reequilíbrio da resposta imune de uma resposta Th2 para Th 1 é particularmente útil para o tratamento ou prevenção de asma. Por exemplo, uma quantidade eficaz pa- ra tratamento de asma pode ser aquela quantidade útil para redirecionamen- to de uma resposta imune do tipo Th2 que está associada à asma para uma resposta do tipo Th1 ou um ambiente Th1/Th2 equilibrado. Citocinas Th2, especialmente IL-4 e IL-5, estão elevadas nas vias aéreas de indivíduos as- máticos. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG da invenção causam um aumento em citocinas Th1, o que ajuda a reequilibrar o sistema imune, prevenindo ou reduzindo os efeitos adversos associados a uma res- posta imune predominantemente Th2.
Os oligonucleotídeos da invenção podem também ser úteis para o tratamento de remodelamento das vias aéreas. Remodelamento das vias aéreas resulta de proliferação de células do músculo liso e/ou espessamento submucosal nas vias aéreas e, por fim, causa estreitamento das vias aéreas, levando a um fluxo de ar restrito. Os oligonucleotídeos da invenção podem prevenir remodelamento adicional e possivelmente mesmo reduzir o desen- volvimento tecidual resultante do processo de remodelamento.
Os oligonucleotídeos são também úteis para melhorar a sobrevi- vência, diferenciação, ativação e maturação de células dendríticas. Os oligo- nucleotídeos imunoestimulatórios de CpG têm a capacidade única de pro- mover a sobrevivência, diferenciação, ativação e maturação de células den- dríticas.
Oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG também aumen- tam a atividade lítica de células assassinas naturais e a citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). A ADCC pode ser obtida usando um oligonu- cleotídeo imunoestimulatório de CpG em combinação com um anticorpo es- pecífico para um alvo celular, tal como uma célula cancerígena. Quando o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG é administrado a um indivíduo em conjunto com o anticorpo, o sistema imune do indivíduo é induzido a ma- tar a célula tumoral. Os anticorpos úteis no procedimento de ADCC incluem anticorpos os quais interagem com uma célula no corpo. Muitos de tais anti- corpos específicos para alvos celulares foram descritos na técnica e muitos estão comercialmente disponíveis. Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem tam-
bém ser administrados em conjunto com uma terapia anticâncer. Terapias anticâncer incluem medicamentos para o câncer, radiação e procedimentos cirúrgicos. Conforme usado aqui, um "medicamento para o câncer" refere-se a um agente o qual é administrado a um indivíduo para fins de tratamento de um câncer. Conforme usado aqui, "tratamento de câncer" inclui prevenção do desenvolvimento de um câncer, redução dos sintomas de câncer e/ou inibição do crescimento de um câncer estabelecido. Em outros aspectos, o medicamento para câncer é administrado a um indivíduo em risco de desen- volver um câncer para fins de redução do risco de desenvolvimento de cân- cer. Vários tipos de medicamentos para o tratamento de câncer são descri- tos aqui. Para fins da presente especificação, medicamentos para o câncer são classificados como agentes quimioterapêuticos, agentes imunoterapêu- ticos, vacinas contra o câncer, terapia hormonal e modificadores de resposta biológica.
Adicionalmente, os métodos da invenção se destinam a abran- ger o uso de mais de um medicamento para o câncer junto com os oligonu- cleotídeos imunoestimulatórios de CpG. Como um exemplo, onde apropria- do, os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem ser administra- dos com um agente quimioterapêutico e um agente imunoterapêutico. Alter- nativamente, o medicamento para o câncer pode abranger um agente imu- noterapêutico e uma vacina contra o câncer ou um agente quimioterapêutico e uma vacina contra o câncer ou um agente quimioterapêutico, um agente imunoterapêutico e uma vacina contra o câncer, todos administrados a um indivíduo para fins de tratamento de um indivíduo tendo um câncer ou em risco de desenvolver um câncer.
O agente quimioterapêutico pode ser selecionado do grupo con- sistindo em metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatina, cloroetilnitrosou- réias não contendo açúcar, 5-fluorouracila, mitomicina C1 bleomicina, doxo- rubicina, dacarbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina, carmustí- na e poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inibidor de farnesil transferase RAS, inibidor de famesil transferase, MMP1 MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtina/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrona/Mitroxantrona, Metaret/Suramina, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX- 710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951Í, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metastron/derivado de estrôncio, Temodal/Temozolomida, Evacet/doxorubicina lipossômica, Yewta- xan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulon/Doxifluridina, Ciclopax/paclitaxel oral, Taxóide Oral, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inibidor de oncogene RAS, BMS-182751/platina oral, UFT(Tegafur/Uracila), Ergamisol/Levamisola, Eniluracil/776C85/intensificador de 5FU, Campto/Levamisola, Campto- sar/lrinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatina/Cladribina, Paxex/Paclitaxel, Doxil/doxorubicina lipossômica, Caelyx/doxorubicina lipossômica, Fluda- ra/Fludarabina, Farmarubicina/Epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis- Naftalimida1 LU 103793/Dolastaína, Caetyx/doxorubicina lipossômica, Gem- zar/Gemcitabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, sementes de lodina, inibidores de CDK4 e CDK2, inibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, I- fes/Mesnex/lfosamida, Vumon/Teniposídeo, Paraplatina/Carboplatina, Plan- tinol/cisplatina, Vepesida/Etoposídeo, ZD 9331, Taxotero/Docetaxel, pró- fármaco de arabinosídeo de guanina, análogo de Taxano, nitrosouréias, a- gentes de alquilação, tais como melphelan e ciclofosfamida, Aminoglutetimi- da, Asparaginase, Busulfan, Carboplatina, Clorombucila, Citarabina HCI, Dactinomicina, Daunorubicina HCI, fosfato sódico de Estramustina, Etoposí- deo (VP16-213), Floxuridina, Fluorouracila (5-FU), Flutamida, Hidróxiuréia (hidróxicarbamida), lfosfamida, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, acetato de Leu- prolida (análogo de fator de liberação de LHRH), Lomustina (CCNU), Meclo- retamina HCI (mostarda de nitrogênio), Mercaptopurina, Mesna, Mitotano (ο.ρ'-DDD), Mitoxantrona HCI, Octreotídeo, Plicamicina, Procarbazina HCI, Estreptozocina, citrato de Tamoxifeno1 Tioguanina1 Tiotepa, sulfato de Vin- blastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Eritropoietina, Hexametilmela- mina (HMM), Interleucina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metila glioxal bis- guanilhidrazona; MGBG), Pentostatina (2'deóxicoformicina), Semustina (me- til-CCNU), Teniposídeo (VM-26) e sulfato de Vindesina, mas não estão as- sim limitados. O agente imunoterapêutico pode ser selecionado do grupo con- sistindo em Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, antiVEGF, Zenapax, MDX- 220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, No- voMAb-G2, TNT1 Gliomab-H1 GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab1 SMART 1D10 Ab1 SMART ABL 364 Ab e ImmuRAIT-CEA1 mas não está as- sim limitado.
A vacina contra câncer pode ser selecionada do grupo consistin-
do em EGF1 vacinas contra câncer anti-idiotípicas, antígeno Gp75, vacina contra melanoma GMK, vacina conjugada com gangliosídeo MGV, Her2/neu, Ovarex, M-Vax1 O-Vax1 L-Vax1 teratopo STn-KHL, BLP25 (MUC-1), vacina idiotípica lipossômica, Melacine, vacinas de antígeno peptídico, vacinas de toxina/antígeno, vacina MVA-baseada, PACIS1 vacina BCG1 TA-HPV1 TA- CIN1 DISC-vírus e ImmuCyst/TheraCys, mas não está assim limitada.
O uso de oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG em con- junto com agentes imunoterapêuticos, tais como anticorpos monoclonais, é capaz de aumentar a sobrevivência a longo prazo através de uma série de mecanismos, incluindo intensificação significativa de ADCC (conforme discu- tido acima), ativação de células assassinas naturais (NK) e aumento nos níveis de IFNa. Os ácidos nucleicos, quando usados em combinação com anticorpos monoclonais, servem para reduzir a dose do anticorpo requerida para obter um resultado biológico. Conforme usado aqui, os termos "antígeno cancerígeno" e "antí-
geno tumoral" são usados permutavelmente para se referir a antígenos os quais são diferencialmente expressos por células cancerígenas e podem, desse modo, ser explorados de forma a objetivar células imunes. Antígenos cancerígenos são antígenos os quais podem estimular potencialmente res- postas imunes evidentemente tumor-específicas. Alguns desses antígenos são codificados, embora não necessariamente expressos, por células nor- mais. Esses antígenos podem ser caracterizados como aqueles os quais normalmente estão silenciosos (isto é, não-expressos) em células normais, aqueles que são expressos apenas em determinados estágios de diferencia- ção e aqueles que são temporariamente expressos, tais como antígenos embriônicos e fetais. Outros antígenos cancerígenos são codificados por 5 genes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene rãs ativado), genes supressores (por exemplo, mutante p53), proteínas de fusão resultantes de deleções internas ou translocações cromossômicas. Ainda outros antígenos cancerígenos podem ser codificados por genes virais, tais como aqueles trazidos sobre vírus de tumor de RNA e DNA.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG também são
úteis para o tratamento e prevenção de doença autoimune. Doença autoi- mune é uma classe de doenças nas quais os próprios anticorpos do indiví- duo reagem com tecido hospedeiro ou na qual células T efetuadoras imunes são autoreativas a autopeptídeos endógenos e causam destruição tecidual. 15 Assim, uma resposta imune é montada contra os próprios antígenos do indi- víduo, referidos como autoantígenos. Doenças autoimunes incluem, mas não estão limitadas a, artrite reumatóide, doença de Crohn, esclerose múlti- pla, Iupus eritematoso sistêmico (SLE), encefalomielite autoimune, miastenia gravis (MG), tiroidite de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pênfigo (por 20 exemplo, pênfigo vulgaris), doença de Grave, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia púrpura autoimune, escleroderma com anticorpos anticolá- geno, doença mista do tecido conectivo, polimiosite, anemia perniciosa, do- ença idiopática de Addison, infertilidade autoimune-associada, glomerulone- frite (por exemplo, glomerulonefrite crescêntica, glomerulonefrite proliferati- 25 va), penfigóide bolhoso, síndrome de Sjõgren, resistência à insulina e diabe- tes mellitus autoimune. Syndrome, insulin resistance e autoimmune diabetes mellitus.
Um "autoantígeno", conforme usado aqui, refere-se a um antí- geno de um tecido hospedeiro normal. Tecido hospedeiro normal não inclui células cancerígenas. Assim, uma resposta imune montada contra um auto- antígeno, no contexto de uma doença autoimune, é uma resposta imune in- desejável e contribui para a destruição e dano do tecido normal, enquanto que uma resposta imune montada contra um antígeno cancerígeno é uma resposta imune desejável e contribui para a destruição do tumor ou câncer. Assim, em alguns aspectos da invenção objetivados ao tratamento de dis- túrbios autoimunes, não é recomendado que os ácidos nucleicos imunoesti- 5 mulatórios de ODN sejam administrados com autoantígenos, particularmente aqueles que são os alvos do distúrbio autoimune.
Em outros casos, os ácidos nucleicos imunoestimulatórios de CpG podem ser distribuídos com baixas doses de autoantígenos. Uma série de estudos com animais demonstrou que a administração mucosal de baixas doses de antígeno pode resultar em um estado de hipo-responsividade imu- ne ou "tolerância". O mecanismo ativo parece ser um desvio imune citocina- mediado de uma resposta Th1 para predominantemente Th2 e Th3 (isto é, TGF-α dominado). A supressão ativa com baixa dose de antígeno pode também suprimir uma resposta imune desregulada (supressão "bystander") a qual é de interesse considerável na terapia de doenças autoimunes, por exemplo, artrite reumatóide e SLE. A supressão "bystander" envolve a se- creção de citocinas supressoras contrarregulatórias de Th1 no ambiente lo- cal onde citocinas pró-inflamatórias e Th1 são liberadas de uma maneira antígeno-específica ou não antígeno-específica. "Tolerância", conforme usa- do aqui, é usada para se referir a esse fenômeno. Na verdade, a tolerância oral tem sido eficaz no tratamento de uma série de doenças autoimunes em animais, incluindo: encefalomielite autoimune experimental (EAE), miastenia gravis autoimune experimental; artrite colágeno-induzida (CIA) e diabetes mellitus insulina-dependente. Nesses modelos, a prevenção e supressão de doença autoimune estão associadas a um desvio em respostas celulares e humorais antígeno-específicas de uma resposta Th1 para Th2/Th3.
A invenção também inclui um método para indução de ativação imune inata não antígeno-específica e resistência de amplo espectro a estí- mulos infecciosos usando os oligonucleotídeos imunoestimulatório de CpG. 30 O termo ativação imune inata não antígeno-específica, conforme usado aqui, refere-se à ativação de outras células imunes que não células B e, por e- xemplo, pode incluir a ativação de células NK, células T ou outras células imunes que podem responder de um modo independente de antígeno ou alguma combinação dessas células. Uma resistência de amplo espectro a estímulo infeccioso é induzida porque as células imunes estão em uma for- ma ativa e são produzidas para responder a qualquer composto ou micro- 5 organismo invasor. As células não têm de ser especificamente produzidas contra um antígeno em particular. Isso é particularmente útil em bio- segurança e as outras circunstâncias descritas acima, tais como viajantes.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG podem ser diretamente administrados ao indivíduo ou podem ser administrados em con- 10 junto com um complexo de distribuição de ácido nucleico. Um complexo de distribuição de ácido nucleico significará uma molécula de ácido nucleico associada com (por exemplo, iônica ou covalentemente ligada a; ou encap- sulada dentro de) um meio de objetivação (por exemplo, uma molécula que resulta em maior afinidade de ligação por uma célula-alvo). Exemplos de 15 complexos de distribuição de ácido nucleico incluem ácidos nucleicos asso- ciados a um esterol (por exemplo, colesterol), um lipídio (por exemplo, um lipídio catiônico, virossoma ou lipossoma) ou um agente de ligação específi- co a uma célula-alvo (por exemplo, um Iigante reconhecido por um receptor específico a uma célula-alvo). Complexos preferidos podem ser suficiente- 20 mente estáveis in vivo para impedir acoplamento significativo antes de inter- nalização pela célula-alvo. Contudo, o complexo pode ser clivável sob condi- ções apropriadas dentro da célula, de modo que o oligonucleotídeo é libera- do em uma forma funcional.
Veículos de distribuição ou dispositivos de distribuição para dis- 25 tribuição de antígeno e os oligonucleotídeos às superfícies foram descritos. O oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG e/ou o antígeno e/ou outros produtos terapêuticos podem ser administrados sozinhos (por exemplo, em solução salina ou tampão) ou usando quaisquer veículos de distribuição co- nhecidos na técnica. Por exemplo, os seguintes veículos de distribuição fo- 30 ram descritos: Cocleatos; Emulssomas, ISCOMs; Lipossomas; vetores bac- terianos vivos (por exemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte- guerin, Shigella, Lactobacillus); vetores virais vivos (por exemplo, Varíola, adenovírus, Herpes Simplex); Microesferas; vacinas de ácido nucleico; polí- meros; anéis poliméricos; proteossomas; fluoreto de sódio; plantas transgê- nicas; virossomas; partículas vírus-semelhantes. Outros veículos de distribu- ição são conhecidos na técnica e alguns exemplos adicionais são fornecidos 5 abaixo na discussão de vetores.
O termo quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimu- latório de CpG refere-se à quantidade necessária ou suficiente para obter um efeito biológico desejado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG administrada com um antígeno 10 para indução de imunidade mucosal é aquela quantidade necessária para causar o desenvolvimento de IgA em resposta a um antígeno quando de exposição ao antígeno, enquanto que a quantidade requerida para indução de imunidade sistêmica é aquela quantidade necessária para causar o de- senvolvimento de IgG em resposta a um antígeno quando de exposição ao 15 antígeno. Combinado com os ensinamentos fornecidos aqui, escolhendo dentre os vários compostos ativos e fatores de peso, tais como potência, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, gravidade de efeitos colaterais adversos e modo preferido de administração, um regime de trata- mento profilático ou terapêutico eficaz pode ser planejado, o qual não causa 20 toxicidade substancial e ainda é totalmente eficaz para tratar o indivíduo em particular. A quantidade eficaz para qualquer aplicação em particular pode variar, dependendo de fatores tais como a doença ou condição que está sendo tratada, o oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG que está sen- do administrado em particular, o tamanho do indivíduo ou a gravidade da 25 doença ou condição, aqueles versados na técnica podem determinar empiri- camente a quantidade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG em particular e/ou antígeno e/ou outro agente terapêutico sem necessi- tar de experimentação indevida.
Doses em questão dos compostos descritos aqui para distribui- ção mucosal ou local oscilam, tipicamente, de cerca de 0,1 μg a 10 mg por administração a qual, dependendo da aplicação, poderia ser fornecido diari- amente, semanalmente ou mensalmente e qualquer outra quantidade de tempo entre os mesmos. Mais tipicamente, doses mucosais ou locais osci- lam de cerca de 10 μ9 a 5 mg por administração e, mais tipicamente, de cer- ca de 100 a 1 mg, com 2-4 administrações sendo espaçadas dias ou se- manas de distância. Mais tipicamente, as doses de estimulante imune osci- Iam de 1 μg a 10 mg por administração e, mais tipicamente, 10 μg a 1 mg, com administrações diárias ou semanais. Doses em questão dos compostos descritos aqui para distribuição parenteral para fins de indução de uma res- posta imune antígeno-específica, em que os compostos são distribuídos com um antígeno, mas não outro agente terapêutico são, tipicamente, 5 a 10.000 vezes maior do que a dose mucosal eficaz para adjuvante de vacina ou apli- cações de estimulante imune e, mais tipicamente, 10 a 1.000 vezes maior e, mais tipicamente, 20 a 100 vezes maior. Doses dos compostos descritos aqui para distribuição parenteral para fins de indução de uma resposta imu- ne inata ou para aumento de ADCC ou para indução de uma resposta imune antígeno-específica quando oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG são administrados em combinação com outros agentes terapêuticos ou em veículos de distribuição especializados oscilam, tipicamente, de cerca de 0,1 μg a 10 mg por administração a qual, dependendo da aplicação, poderia ser fornecida diariamente, semanalmente ou mensalmente e qualquer outra quantidade de tempo entre os mesmos. Mais tipicamente, doses parenterais para essas finalidades oscilam de cerca de 10 μg a 5 mg por administração e, mais tipicamente, de cerca de 100 μg a 1 mg, com 2-4 administrações sendo espaçadas dias ou semanas. Em algumas modalidades, contudo, do- ses parenterais para essas finalidades podem ser usadas em uma faixa de 5 a 10.000 vezes maior do que as doses típicas descritas acima.
Para muitos compostos descritos aqui, as quantidades terapeuti- camente eficazes podem ser inicialmente determinadas a partir de modelos animais. Uma dose terapeuticamente eficaz também pode ser determinada a partir de dados com seres humanos para oligonucleotídeos de CpG os quais 30 foram testados em seres humanos (experimentos clínicos com seres huma- nos foram iniciados) e para compostos os quais são conhecidos por exibir atividades farmacológicas similares, tais como outros adjuvantes, por exem- plo, LT e outros antígenos para fins de vacinação. Doses maiores podem ser requeridas para administração parenteral. A dose aplicada pode ser ajustada baseado na biodisponibilidade relativa e potência do composto administrado. Ajuste da dose para obter eficácia máxima baseado nos métodos descritos 5 acima e outros métodos são bem conhecidos na técnica e está bem dentro das capacidades daqueles versados na técnica.
As formulações da invenção são administradas em soluções farmaceuticamente aceitáveis as quais podem, rotineiramente, conter con- centrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes de tamponamento, conservantes, veículos compatíveis, adjuvantes e opcionalmente outros in- gredientes terapêuticos.
Para uso em terapia, uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG pode ser administrada a um indivíduo através de qualquer modo que distribui o oligonucleotídeo à superfície desejada, por 15 exemplo, mucosal, sistêmica, administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser realizada através de qualquer meio conhecido por aqueles versados na técnica. Vias preferidas de administração incluem, mas não estão limitadas a, oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublin- gual, intratraqueal, inalação, ocular, vaginal e retal.
Para administração oral, os compostos (isto é, oligonucleotídeos
imunoestimulatórios de CpG, antígenos e outros agentes terapêuticos) po- dem ser formulados prontamente através de combinação do(s) composto(s) ativo(s) com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na téc- nica. Tais veículos permitem que os compostos da invenção sejam formula- 25 dos como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. Preparados farmacêuticos para uso oral podem ser obtidos co- mo um excipiente sólido, opcionalmente trituração da mistura resultante e processamento da mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequa- 30 dos, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipien- tes adequados são, em particular, enchedores tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparados de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidróxipropil metil celulose, carbo- ximetil celulose de sódio e/ou polivinil pirrolidona (PVP). Se desejado, agen- tes de desintegração podem ser adicionados, tais como polivinil pirrolidona 5 reticulada, Agar ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações orais também podem ser formuladas em solução salina ou tampões, isto é, EDTA para neutralização de condi- ções ácidas internas ou podem ser administradas sem quaisquer veículos.
Também especificamente consideradas são formas de dosagem orais do componente ou componentes acima. O componente ou componen- tes podem ser quimicamente modificados, de modo que a distribuição oral do derivado seja eficaz. Geralmente, a modificação química considerada é a fixação de pelo menos uma porção à molécula do componente em si, onde a referida porção permite (a) a inibição de proteólise; e (b) a captação na cor- rente sanguíneo do estômago ou intestino. Também desejado é o aumento na estabilidade global do componente ou componentes e aumento do tempo em circulação no corpo. Exemplos de tais porções incluem: polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetil celulose, dextra- no, álcool polivínílico, polivinil pirrolidona e poliprolina. Abuchowski e Davis1 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" Em: Enzymes as Drugs, Hocen- berg e Roberts, editores, Wiley-Interscience, New York, NY, páginas 367- 383; Newmark et. al., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189. Outros polímeros que poderiam ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano. Pre- feridas para uso farmacêutico, conforme indicado acima, são porções de polietileno glicol.
Para o componente (ou derivado), o local de liberação pode ser o estômago, o intestino delgado (o duodeno, o jejuno ou o íleo) ou o intestino grosso. Aqueles versados na técnica têm formulações disponíveis as quais não dissolvem no estômago, ao mesmo tempo em que liberam o material no 30 duodeno ou mesmo no intestino. De preferência, a liberação evitará os efei- tos prejudiciais do ambiente estomacal, quer através de proteção do oligo- nucleotídeo (ou derivado) ou através de liberação do material biologicamente ativo além do ambiente estomacal, tal como no intestino.
Para assegurar resistência gástrica total, um revestimento im- permeável a um pH de pelo menos 5,0 é essencial. Exemplos dos ingredien- tes inertes mais comuns que são usados como revestimentos entéricos são 5 trimelitato de acetato de celulose (CAT), ftalato de hidróxipropil metil celulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinila (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulose (CAP), Eudragit L, Eudragit S e goma-laca. Esses revestimentos podem ser usados como fil- mes misturados.
Um revestimento ou mistura de revestimentos também pode ser
usada sobre comprimidos, os quais não destinam à proteção contra o estô- mago. Esses podem incluir revestimentos de açúcar ou revestimentos os quais tornam o comprimido mais fácil de engolir. Cápsulas podem consistir de um envoltório rígido (tal como gelatina) para distribuição do produto tera- 15 pêutico seco, isto é, pó; para formas líquidas, um envoltório de gelatina mole pode ser usado. O material do envoltório de sachês poderia ser amido es- pesso ou outro papel comestível. Para pílulas, comprimidos, comprimidos moldados ou triturados de comprimido, técnicas de formação de massa úmi- da podem ser usadas.
O produto terapêutico pode ser incluído na formulação como
multi-partículas finas na forma de grânulos ou péletes com um tamanho de partícula de cerca de 1 mm. A formulação do material para administração de cápsulas também poderia ser como um pó, tampões ligeiramente comprimi- dos ou mesmo como comprimidos. O produto terapêutico poderia ser prepa- rado através de compressão.
Colorantes e agentes de flavorização podem todos ser incluídos. Por exemplo, o oligonucleotídeo (ou derivado) pode ser formulado (tal como através de encapsulação em Iipossoma ou microesfera) e, então, ainda con- tido dentro de um produto comestível, tal como uma bebida refrigerada con- tendo colorantes e agentes de flavorização.
Pode-se diluir ou aumentar o volume do produto terapêutico com um material inerte. Esses diluentes poderiam incluir carboidratos, especial- mente manitol, α-lactose, Iactose anídrica, celulose, sacarose, dextranas modificadas e amido. Determinados sais inorgânicos também podem ser usados como enchedores, incluindo trifosfato de cálcio, carbonato de mag- nésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são 5 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.
Desintegrantes podem ser incluídos na formulação do produto terapêutico em uma forma de dosagem sólida. Materiais usados como desin- tegrantes incluem, mas não estão limitados a, amido, incluindo o desinte- grante comercial baseado em amido Explotab. Amido glicolato de sódio, 10 Amberlite, carboximetil celulose de sódio, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca de laranja, carboximetil celulose ácida, esponja natural e bentonita podem todos ser usados. Outra forma dos desintegrantes são as resinas de troca catiônica insolúveis. Gomas em pó podem ser usadas como desintegrantes e como aglutinantes e essas podem incluir gomas em pó, tais 15 como Agar, Karaya ou tragacanto. Ácido algínico e seu sal de sódio também são úteis como desintegrantes.
Aglutinantes podem ser usados para manter o agente terapêuti- co junto para formar um comprimido duro e incluem materiais de produtos naturais, tais como acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem me- 20 til celulose (MC), etil celulose (EC) e carboximetil celulose (CMC). Polivinil pirrolidona (PVP) e hidróxipropil metil celulose (HPMC) poderiam ser usados em soluções alcoólicas para granular o produto terapêutico.
Um agente anti-atrito pode ser incluído na formulação do produto terapêutico para prevenir aderência durante o processo de formulação. Lu- 25 brificantes podem ser usados como uma camada entre o produto terapêutico e a parede da matriz e esses podem incluir, mas não estão limitados a: ácido esteárico, incluindo seus sais de magnésio e cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, óleos vegetais e ceras. Lubrificantes solúveis po- dem também ser usados, tais como Iauril sulfato de sódio, Iauril sulfato de 30 magnésio, polietileno glicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4000 e 6000.
Glidantes que poderiam melhorar as propriedades de fluxo do fármaco durante formulação e auxiliar na reestruturação durante compres- são poderiam ser adicionados. Os glidantes podem incluir amido, talco, sílica pirogênica e silico-aluminato hidratado.
Para auxiliar na dissolução do produto terapêutico no ambiente aquoso, um tensoativo poderia ser adicionado como um agente de composi- ção de volume. Tensoativos podem incluir detergentes aniônicos, tais como Iauril sulfato de sódio, dioctil sulfo-succinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiônicos poderiam ser usados e poderiam incluir cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio. A lista de detergentes não-iônicos potenciais que poderiam ser incluídos na formulação como tensoativos são Iauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, polioxietileno de óleo de ma- mona hidrogenado 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Esses tensoativos poderiam estar presentes na formulação do oli- gonucleotídeo ou derivado sozinhos ou como uma mistura em diferentes proporções.
Preparados farmacêuticos os quais podem ser usados oralmente incluem cápsulas de encaixe por pressão feitas de gelatina, bem como cáp- sulas vedadas moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol 20 ou sorbitol. As cápsulas de encaixe por pressão podem conter os ingredien- tes ativos em mistura com um enchedor, tal como lactose, aglutinantes, tais como amidos e/ou lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos ativos po- dem estar dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos 25 graxos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, estabili- zantes podem ser adicionados. Microesferas formuladas para administração oral também podem ser usadas. Tais microesferas foram bem definidas na técnica. Todas as formulações para administração oral deverão estar em dosagens adequadas para tal administração.
Para administração bucal, as composições podem tomar a forma
de comprimidos ou comprimidos formulados de maneira convencional.
Para administração através de inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção podem, convenientemente, ser distribuí- dos na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de embala- gens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente ade- quado, por exemplo, diclorodifluoroetano, triclorofluorometano, diclorotetra- 5 fluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um ae- rossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada para pro- porcionar uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina, para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma 10 base em pó adequada, tal como Iactose ou amido.
Também considerada aqui é a distribuição pulmonar dos oligo- nucleotídeos (ou derivados dos mesmos). O oligonucleotídeo (ou derivado) é distribuição aos pulmões de um mamífero enquanto de inalação e atravessa o revestimento epitelial do pulmão para a corrente sanguínea. Outros relatos 15 de moléculas inaladas incluem Adjei et. al., 1990, Pharmaceutical Research, 7: 565-569; Adjei et. al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (acetato de leuprolida); Braquet et. al., 1989, Journal of Cardiovas- cular Pharmacology, 13 (supl. 5): 143-146 (endotelina-1); Hubbard et. al., 1989, Annals of Internai Medicine, Vol. Ill, páginas 206-212 (a1- antitripsina); 20 Smith et. al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (a-1-proteinase); Oswein et. al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (hormônio do cres- cimento humano recombinante); Debs et. al., 1988, J. Immunol. 140: 3482-3488 (interferon-g e fator alfa de necrose de tumor) e Platz et. al., Pa- 25 tente U.S. N0. 5.284.656 (fator de estimulação de colônia de granulócito). Um método e composição para a distribuição pulmonar de fármacos para efeito sistêmico são descritos na Patente U.S. N°. 5.451.569, emitida em 19 de Setembro de 1995 para Wong et. al..
Considerados para uso na prática da presente invenção são uma ampla faixa de dispositivos mecânicos projetados para a distribuição pulmonar de produtos terapêuticos incluindo, mas não limitado a, nebuliza- dores, inaladores de dose medida e inaladores de pó, todos os quais são familiares para aqueles versados na técnica.
Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis adequados para a prática da presente invenção são o nebuliza- dor Ultravent1 fabricado pela Mallinckrodt1 Inc., St. Louis, Missouri; o nebuli- 5 zador Acorn Il1 fabricado pela Marquest Medicai Products, Englewood1 Colo- rado; o inalador de dose medida Ventolin1 fabricado pela Glaxo Inc., Resear- ch Triangle Park, North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler, fabricado pela Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Todos de tais dispositivos requerem o uso de formulações ade- 10 quadas para a distribuição de oligonucleotídeo (ou derivado). Tipicamente, cada formulação é específica para o tipo de dispositivo empregado e pode envolver o uso de um material propelente adequado, além dos diluentes, adjuvantes e/ou veículos usuais úteis em terapia. Também, o uso de Iipos- somas, microcápsulas ou microesferas, complexos de inclusão ou outros 15 tipos de veículo é considerado.Oligonucleotídeo quimicamente modificado também pode ser preparado em diferentes formulações, dependendo do tipo de modificação química ou do tipo de dispositivo empregado.
Formulações adequadas para uso com um nebulizador, quer a jato ou ultrassônico, compreenderão, tipicamente, oligonucleotídeo (ou deri- 20 vado) dissolvido em água em uma concentração de cerca de 0,1 a 25 mg de oligonucleotídeo biologicamente ativo por ml_ de solução. A formulação tam- bém pode incluir um tampão e um açúcar simples (por exemplo, para estabi- lização do oligonucleotídeo e regulação da pressão osmótica). A formulação para nebulizador também pode conter um tensoativo para reduzir ou preve- 25 nir a agregação induzida na superfície do oligonucleotídeo causada pela a- tomização da solução na formação do aerossol.
Formulações para uso com um dispositivo inalador de dose me- dida geralmente compreenderão um pó finamente dividido contendo o oligo- nucleotídeo (ou derivado) suspenso em um propelente com o auxílio de um 30 tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional emprega- do para essa finalidade, tal como um clorofluoro carboneto, um hidrocloroflu- oro carboneto, um hidrofluoro carboneto um hidrocarboneto, incluindo triclo- rofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2- tetrafluoroetano ou combinações dos mesmos. Tensoativos adequados in- cluem trioleato de sorbitan e Iecitina de soja. Ácido oleico pode ser útil tam- bém como um tensoativo.
Formulações para distribuição a partir de um dispositivo inalador
de pó compreenderão um pó seco finamente dividido contendo oligonucleo- tídeo (ou derivado) e também podem incluir um agente de composição de volume, tal como lactose, sorbitol, sacarose ou manitol em quantidades as quais facilitam a dispersão do pó do dispositivo, por exemplo, 50 a 90% em 10 peso da formulação. O oligonucleotídeo (ou derivado) deverá, mais vantajo- samente, ser preparado na forma de partículas com um tamanho médio de partícula de menos de 10 mm (ou mícrons), mais preferivelmente 0,5 a 5 mm, para distribuição mais eficaz à parte distai do pulmão.
Distribuição nasal de uma composição farmacêutica da presente 15 invenção também é considerada. A distribuição nasal permite a passagem de uma composição farmacêutica da presente invenção à corrente sanguí- nea diretamente após administração do produto terapêutico ao nariz, sem a necessidade de depósito do produto no pulmão. Formulações para distribui- ção nasal incluem aquelas com dextrano ou ciclodextrano.
Para administração intranasal, um dispositivo útil é uma pequena
garrafa rígida à qual um pulverizador de dose medida é preso. Em uma mo- dalidade, a dose medida é distribuída extraindo a composição farmacêutica da solução da presente invenção em uma câmara de volume definido, câma- ra a qual tem uma abertura dimensionada para aerossolizar a formulação em 25 aerossol através de formação de um spray quando um líquido na câmara é comprimido. A câmara é comprimida para administrar a composição farma- cêutica da presente invenção. Em uma modalidade específica, a câmara é uma disposição de pistão. Tais dispositivos estão comercialmente disponí- veis.
Alternativamente, uma garrafa plástica comprimível com uma
abertura ou furo dimensionado para aerossolizar uma formulação em aeros- sol através de formação de um spray quando apertada é usada. A abertura é, usualmente, encontrada na parte de cima da garrafa e a parte de cima é, em geral, afunilada para se adaptar parcialmente às passagens nasais para administração eficiente da formulação em aerossol. De preferência, o inala- dor nasal fornecerá uma quantidade medida da formulação em aerossol para 5 administração de uma dose medida do fármaco.
Os compostos, quando é desejável distribuir os mesmos siste- micamente, podem ser formulados para administração parenteral através de injeção, por exemplo, através de injeção de bolo ou infusão contínua. Formu- lações para injeção podem ser apresentadas em uma forma de dosagem 10 unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes com multidose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e po- dem conter agentes formulatórios, tais como agentes de suspensão, estabili- zação e/ou dispersão.
Formulações farmacêuticas para administração parenteral inclu-
em soluções aquosas dos compostos ativos na forma solúvel em água. Adi- cionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões para injeção oleosa apropriadas. Solventes ou veículos lipofíli- cos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim ou ésteres 20 de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos ou Iipos- somas. Suspensões para injeção aquosas podem conter substâncias as quais aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulo- se de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também po- de conter estabilizantes ou agentes adequados os quais aumentam a solubi- 25 Iidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
Alternativamente, os compostos ativos podem estar na forma em pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênio, antes de uso.
Os compostos também podem ser formulados em composições
retais ou vaginais, tais como supositórios ou enemas de retenção, por e- xemplo, contendo bases para supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.
Além das formulações descritas previamente, os compostos também podem ser formulados como um preparado em depósito. Tais for- mulações de longa ação podem ser formuladas com materiais poliméricos 5 ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca de íons ou como derivados solúveis pulverizá- veis, por exemplo, como um sal solúvel pulverizável.
As composições farmacêuticas também podem compreender veículos ou excipientes em fase sólida ou de gel. Exemplos de tais veículos ou excipientes incluem, mas não estão limitados a, carbonato de cálcio, fos- fato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros, tais como polietileno glicóis.
Formas de preparação farmacêutica líquida ou sólida adequadas são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, microencap- suladas, revestidas sobre partículas de ouro microscópicas, contidas em Ii- possomas, nebulizadas, aerossóis, péletes para implante na pele ou secas sobre um objeto pontiagudo a ser raspado na pele. As composições farma- cêuticas também incluem grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revesti- dos, (micro) cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, cre- mes, gotas ou preparações com liberação retardada dos compostos ativos, em cuja preparação excipientes e aditivos e/ou auxiliares, tais como desinte- grantes, aglutinantes, agentes de revestimento, agentes de intumescimento, lubrificantes, flavorizantes, adoçantes ou solubilizantes são comumente usa- dos conforme descrito acima. Para uma rápida revisão de métodos para dis- tribuição de fármaco veja Langer, Science 249: 1527-1533, 1990, o qual é incorporado aqui por referência.
Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios de CpG e opcional- mente outros produtos terapêuticos e/ou antígenos podem ser administrados per se (puros) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando 30 usados em medicina, os sais deverão ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitáveis podem, convenientemente, ser usados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Tais sais incluem, mas não estão limitados a, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno sulfônico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônico e benzenossulfônico.
5 Também, tais sais podem ser preparados como sais de metal alcalino ou alcalino-terroso, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo ácido carboxílico.
Agentes de tamponamento adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2% em peso/v); ácido cítrico e um sal (1-3% em peso/v); ácido bó- 10 rico e um sal (0,5-2,5% em peso/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% em peso/v). Conservantes adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003- 0,03% em peso/v); clorobutanol (0,3-0,9% em peso/v); parabenos (0,01- 0,25% em peso/v) e timerosal (0,004-0,02% em peso/v).
As composições farmacêuticas da invenção contêm uma quanti- dade eficaz de um oligonucleotídeo imunoestimulatório de CpG e opcional- mente antígenos e/ou outros agentes terapêuticos opcionalmente incluídos em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo veículo farmaceutica- mente aceitável significa um ou mais agentes de enchimento, diluentes ou substâncias de encapsulação sólidas ou líquidas compatíveis as quais são adequadas para administração a um ser humano ou a outro animal verte- brado. O termo veículo denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natu- ral ou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de serem misturados com os compostos da presente invenção e uns com os outros, de uma maneira que não haja interação, o que prejudica substancialmente a eficiência farmacêutica desejada.
A presente invenção é ainda ilustrada pelos Exemplos a seguir, os quais não deverão, de maneira nenhuma, ser construídos como outra limitação. Os conteúdos inteiros de todas as referências (incluindo as refe- 30 rências na literatura, patentes emitidas, pedidos de patente publicados e pe- didos de patente copendentes) citados por todo o presente pedido são aqui expressamente incorporados por referência. EXEMPLOS Materiais e Métodos
Oligodesoxinucleotídeos (ODN) e reagentes
Todos os ODN foram sintetizados seguindo protocolos-padrão 5 de química com fosforamidita e controlados com relação à identidade e pu- reza pela Coley Pharmaceutical GmbH e tinham níveis indetectáveis de en- dotoxina (< 0,1 EU/ml) medidos através do ensaio Limulus (BioWhittaker, Verviers, Bélgica). Os ODNs foram suspensos em Tris-EDTA estéril, isento de endotoxina (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) e armazenados e manipula- 10 dos sob condições assépticas para prevenir contaminação microbiana e por endotoxina. Todas as diluições foram realizadas usando Tris-EDTA isento de endotoxina.
Ensaios de TLR
Células HEK293 foram transfectadas através de eletroporação 15 com vetores expressando o respectivo TLR humano e um plasmídeo- repórter de 6xNF-KB-luciferase. Transfectantes estáveis (3 x 104 célu- las/cavidade) foram incubados com as quantidades indicadas de ODN du- rante 16h a 37°C em uma incubadora umidificada. Cada ponto de dados foi feito em triplicata. As células foram submetidas à Iise e ensaiadas com rela- 20 ção à atividade do gene de Iuciferase (usando o kit BriteLite da Perkin-Elmer, Zaventem, Bélgica). Os índices de estimulação foram calculados em refe- rência à atividade do gene-repórter do meio sem a adição de ODN. Purificação de células
Preparações da camada leucoplaquetária de sangue periférico 25 de doadores humanos saudáveis foram obtidas do Banco de Sangue da U- niversity of Dusseldorf (Alemanha) e PBMCs foram purificadas através de centrifugação sobre Ficoll-Hypaque (Sigma). As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C em meio RPMI 1640 suplementado com soro AB humano inativado termicamente a 5% (v/v) (BioWhittaker) ou FCS 30 termicamente inativado a 10% (v/v), L-glutamina a 2 mM, 100 U/ml de penici- lina e 100 μg/ml de estreptomicina (todos da Sigma).
Detecção de citocina e análise citométrica de fluxo PBMC foi ressuspensa em uma concentração de 5 x 106 célu- las/ml e adicionada às lâminas de fundo redondo com 96 cavidades (250 μΙ/cavidade). PBMCs foram incubadas com ODN e os sobrenadantes de cul- tura (SN) foram coletados após os pontos de tempo indicados. Se não ime- diatamente usados, os SNs foram armazenados a -20°C até requeridos.
As quantidades de citocinas no SN foram avaliadas usando um ELISA próprio para IFN-α desenvolvido usando anticorpo comercialmente disponível (PBL, New Brunswick, NJ1 EUA) ou sobre o sistema multiplex Luminex (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).
Animais
Camundongos BALB/c fêmeas (6-8 semanas de idade) foram adquiridas de Charles River Canada (Quebec, Canadá) e alojados em mi- croisoladores no Animal Care Facility at Coley Pharmaceutical Group Cana- 15 da. Todos os estudos foram conduzidos de acordo com o Animal Care Committee of Coley Canada sob a orientação do Canadian Council on Ani- mal Care. Todos os animais eram naive para ODNs de CpG.
Modelo de tumor SA1N: Camundongos A/J fêmeas (10 por gru- po) foram injetados SC com 5 x 105 células tumorais Sal/N no dia 0. Os ca- 20 mundongos foram tratados com 100 μg de ODN ou PBS apenas fornecido SC uma vez por semana, começando no dia 8 pós-indução de tumor. Os animais foram monitorados com relação à sobrevivência e volume do tumor. O tamanho do tumor (o comprimento e a largura) foi medido usando um cali- brador Vemier digital. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula: 25 Volume do tumor = (0,4) (ab2), onde a = diâmetro maior e b = diâmetro me- nor.
Ensaios in vitro
Esplenócitos de camundongo BALB/c naive (dos reservatórios de 3-5 animais) foram usados para ensaios in vitro. Os animais foram anes- tesiados com isoflurano e sofreram eutanásia através de deslocamento cer- vical. Os baços foram removidos sob condições assépticas e colocados em PBS +'albumina de soro bovino a 0,2% (Sigma Chemical Company). Os ba- ços foram, então, homogeneizados e os esplenócitos foram ressuspensos em meio de cultura tecidual RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com soro de camundongo normal a 2% (Cedarlane Labo- ratories, Ontario, Canadá), solução de penicilina-estreptomicina (concentra- 5 ção final de 1000 U/ml e 1 mg/ml, respectivamente; Sigma Chemical Com- pany) e β-mercaptoetanol a 5 χ 10'5 M (Sigma Chemical Company).
Ensaios de proliferação de células B
Esplenócitos de camundongo BALB/c corados com diacetato de carbóxi-fluoresceína, succimidil éster (CFSE) (Invitrogen, Eugene, Oregon, 10 EUA) (4 x 105/cavidade) foram incubados com diferentes concentrações de ODN em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37°C durante 5 di- as. As células foram, então, coradas com anticorpo anti-CD19 PE-conjugado (BD Pharmingen, San Diego, CA1 EUA) para CD19 e a proliferação de célu- las B foi determinada através de FACS, seguida por análise através do soft- 15 ware ModFit V3.0 (Verity Software House Inc., Topsham, ME, EUA).
Exemplo 1: Investigação da relação de atividade estrutural no motivo CpG
Sabe-se que oligonucleotídeos contendo motivos CpG não- metilados são capazes de estimular respostas imunes através da através de do receptor 9 Tipo sino (TLR9). De forma a identificar oligonucleotídeos com 20 a maior capacidade de estimular a através de de TLR9, um estudo da rela- ção estrutural compreensivo (SAR) no motivo CpG foi realizado. Os resulta- dos mostraram que substituição de guanina por hipoxantina e 6-tioguanina leva a uma atividade similar no ensaio de hTLR9, enquanto que substituição de purina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-oxo-7,8-di-hidroguanina e 7- 25 deazaguanina resultou em uma redução de 40-80% na estimulação de h- TLR9. Ainda, modificação em C5 e N4 não resultou em estimulação da atra- vés de de hTLR9. Essas observações resultaram em um modelo de SAR no qual guanina é reconhecida através de 0 sítio de Hoogsteen, enquanto que citosina se liga à borda C1H ao receptor TLR9 (veja figura 1a). Assim, ne- 30 nhuma modificação, no sítio de reconhecimento de Hoogsteen, de guanina, bem como da borda C,H da citosina era possível sem perda significativa na atividade de hTLR9. Nenhuma das modificações de base investigadas no motivo de dinucleotídeo era mais ativa do que o motivo CpG não-modificado. Exemplo 2: O efeito de análogos em formato de base de timina hidrofóbica próxima do motivo CpG
Para investigar o impacto dos resíduos de dT em proximidade ao 5 motivo CpG, vários análogos em formato de base de timina hidrofóbica, tais como 2,4-difluorotolueno (FF) (SEQ ID NO: 3-9), 5-bromo-2’-desoxiuridina (BU) e 5-iodo-2’-desoxiuridina (JU)1 foram incorporados fora do motivo CpG (veja tabela 1 e figuras 2-3). Surpreendentemente, a incorporação de todos os análogos de timina hidrofóbica testados levou a um forte aumento inco- 10 mum na atividade de hTLR9, enquanto substituição por resíduos de uracila (timina carecendo de um grupo metila, figura 4) levou a uma forte diminuição na estimulação de hTLR9. O aumento na estimulação de TLR9 foi pronunci- ado quando a modificação era 5’ ao motivo CpG. Substituição dupla por 5- iodouracila (JU) 5’ e 3’ do motivo CpG resultou na estimulação mais potente
daquelas testadas. Em contraste, substituição de guanina e citosina por 2,4- difluorotolueno no motivo CpG levou, em ambos os casos, a uma forte dimi- nuição do índice de estimulação de TLR9.
A incorporação de análogos T hidrofóbicos também resultou em uma forte intensificação na indução de IFN-alfa em PBMCs humanas. Ines- 20 peradamente, a modificação de um ODN (SEQ ID NO: 1) que é virtualmente inativo na indução de IFN-alfa por 5-bromouridina e 5-iodouridina em particu- lar resultou em estimulação de TLR9 e indução de IFN-alfa aumentadas. Usualmente, há uma correlação inversa entre o TLR9 e a indução de IFN- alfa para o ODN de CpG o qual não contém essas modificações.
Tabela 1: Exemplos de oligonucleotídeos modificado com análogos em for- mato de base de timina hidrofóbica próximo do motivo CpG
Seq ID Seqüência de Oligonucleotídeo Descrição/classe de¬ N0 # rivada de 1 1xPO de SEQ ID NO: 2 2 T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 3 T* G * F F*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 5’FF de SEQ ID NO: 1 4 T * G*T*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 3’FF de SEQ ID NO: 1 1 ’ G * FF*C-G* FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 3’ e 5’FF de SEQ ID NO: 1 6 T G *T* F F-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T C->FF 7 G->FF 8 GT->FF 9 Derivado 3’FF de SEQ ID NO: 1 T*G*BU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 5’BU de SEQ ID NO: 1 11 Derivado 3’BU de SEQ ID NO: 1 12 T*G*BU*C-G*BU *j*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 3’ e 5’BU de SEQ ID NO: 1 13 T* G * J U *C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 5’J U de SEQ ID NO: 1 14 Derivado 3’JU de SEQ ID NO: 1 Derivado 3’ e 5’JU de SEQ ID NO: 1 16 Derivado 5’U de SEQ ID NO: 1 17 Derivado 3’U de SEQ ID NO: 1 18 1 ’ G*U*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Derivado 3’ e 5’U de SEQ ID NO: 1 * ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Exemplo 3: Ativação de TLR9 com substituições em formato de base lipofíli- ça
Uma vez que diferentes tipos de substituição lipofílica da base 5’ no motivo CpG causaram aumentos significativos na estimulação de hTLR9, outros análogos de base, tais como resíduos de 5-cloro-uracila, 5- 5 trifluorometil-uracila, fenila, arila e arila substituída foram investigados com relação à sua capacidade de estimular hTLR9 (Tabela 3). Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotídeos modificados da classe B com vários análogos de base lipofílicos, ODN da classe B SEQ ID NO: 1 foi modificado com 5-Cloro-2’-desoxiuridina (CU), 5-Bromo-2’-desoxiuridina 10 (BU), 5-lodo-2’-desoxiuridina (JU) e 5-Etil-2’-desoxiuridina (EU). Células h- TLR9-NFkB-293 foram incubadas com o ODN indicado (figura 5a) durante
16 horas. As células foram, então, submetidas à Iise e a atividade de Iucife- rase foi determinada. Oligonucleotídeos CU-modificado (SEQ ID NO: 41), BU-modificado (SEQ ID NO: 10) JU-modificado (SEQ ID NO: 13) e EU- 15 modificado (SEQ ID NO: 42), todos mostraram maior estimulação de ativida- de de TLR9 com relação ao controle (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 16 com modificação de uridina mostrou atividade dramaticamente diminuída. Em um segundo experimento, a produção de IFN-alfa foi medida (figura 5b). PBMCs humanas foram incubadas com o ODN modificado, conforme indicado du- 20 rante 24h, após o que os sobrenadantes foram testados através de ELISA. ODN JU-modificado , BU-modificado e EU- modificado resultou no maior aumento no IFN-alfa com relação ao controle. Esses dados demonstram que a 5’-substituição de dU sobre o ODN da classe B aumenta a atividade de TLR9 e a produção de IFN-alfa.
Para investigar o efeito da modificação EU sobre a ativação de
TLR9, o experimento foi repetido com oligonucleotídeos modificados tendo modificações EU 5’ do CpG (SEQ ID NO: 42), 3’ do CpG (SEQ ID NO: 29) e 5’ e 3’ do CpG (SEQ ID NO: 30). SEQ ID NOs 42 e 30 mostraram um au- mento significativo na ativação de TLR9 com relação a SEQ ID NO: 1 não- modificada e ODN da classe B não-modificado SEQ ID NO: 37 (figura 6).
Tabela 2: Exemplos de oligonucleotídeos modificados com substituições de análogo de base lipofílicos Seq ID Seqüência de oligonucleotídeo Descrição/derivado da N0 # classe 1 T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Não-modificado 41 T*G*CU*C- Derivado Cl de SEQ ID NO: 1 T*G*BU*C- Derivado de 5’BU de SEQ ID NO: 1 13 T*G*JU*C- Derivado 5’JU de SEQ ID NO: 1 16 T*G*U*C- Derivado U de SEQ ID NO: 1 41 T*G*CU*C- Derivado CU de SEQ ID NO: 1 42 T*G*EU*C- Derivado EU de SEQ ID NO: 1 29 T*G*T*C- Derivado 3’ EU de SEQ ID NO: 1 T*G*EU*C-G*EU Derivado 5’3’ EU de SEQ ID NO: 1 * ligação internucleotídeo de fosforotioato
- ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Exemplo 4: Substituição lipofílica sobre oligonucleotídeos das classes A. B. C. PeT
Para investigar os efeitos de substituição de análogo de base
lipofílica sobre as diferentes classes de ODN1 modificações foram feitas em oligonucleotídeos da classe A, classe B1 classe C1 classe P e classe T. Al- guns exemplos desses oligonucleotídeos são fornecidos na Tabela 3.
Tabela 3: Oligonucleotídeos JU-modificados das classes A, B1 C1 P e T
Seq ID Oligonucleotídeo Modificado Classe de N°. Oligo 16 B 17 B 18 B 19 B B 21 B 22 B 23 B 24 B T 26 T‘G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T ODN de não-CpG Tl ju*c- C 28 T*C*G*JU*C- C 31 JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G P 32 T*C*G*JU*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G P 33 JU*C- P G*JU*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 34 JU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G A T*C-G-A-C-G-JU-C-G-T-G-G*G*G*G A 36 T*C-G-A-C-G-JU-C-G-JU-G-G*G*G*G A 37 T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T B 43 T*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G A 44 JU*C- P 45 T*C*G*JU*C- P 46 P 47 T 48 T 49 T 50 T 51 T 52 T*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G P * ligação internucleotídeo de fosforotioato
- ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotí- deos da classe B modificados, derivados de classe B 5-iodo-2’- 5 desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 37 foram avaliados em um ensaio de Iuciferase com relação à sua capacidade de ativar TLR9 (veja materiais e métodos). Todos os oligonucleotídeos da classe B modificados mostraram um aumento significativo na ativação de TLR9 com relação ao SEQ ID NO: 37 não-modificado (figura 7).
Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotí-
deos da classe A modificados, derivados da classe A 5-iodo-2’- desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 43 foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9 em um ensaio de Iuciferase (figura 8a) e um ensaio com PBMC (figura 8b), conforme na figura 5. O aumento na estimula- 15 ção de TLR9 foi pronunciado quando a modificação era 5’ ao motivo CpG, embora a dupla substituição com 5-iodouracila (JU) 5’ e 3’ do motivo CpG tenha resultado em estimulação mais potente.
Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotí- deos da classe C modificados, derivados de classe C 5-iodo-2’- 20 desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 e 45, foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9. Seqüências da clas- se A SEQ ID NO: 43 (não-modificada) e SEQ ID NO: 35 e 36 foram testadas simultaneamente. Conforme mostrado na figura 9, os ODNs modificados SEQ ID NO: 35, 36, 44 e 45 mostraram todos estimulação aumentada de 25 TLR9, acima das classes AeC não-modificadas em um ensaio de Iucifera- se. Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotídeos da classe P, derivados da classe P 5-iodo-2’-desoxiuridina-modificados de SEQ ID NO: 46 foram testados com relação à sua capacidade de ativar TLR9 em um ensaio de luciferase. Conforme mostrado na figura 10, o ODN modificado SEQ ID NO: 31-33 mostrou uma estimulação aumentada de TLR9 com rela- ção ao ODN não-modificado.
Para investigar a ativação de TLR9 humano por oligonucleotí- deos da classe T modificados, derivados da classe T 5-iodo-2’-desoxiuridina-
5 modificados do ODN da classe T não-modificado SEQ ID NO: 52 foram tes- tados com relação à sua capacidade de ativar TLR9. Conforme mostrado na figura 11, o ODN modificado SEQ ID NOs 47-50 mostrou uma estimulação aumentada de TLR9 com relação ao ODN da classe T não-modificado em um ensaio de luciferase. O derivado de uridina SEQ ID NO: 51 mostrou es- 10 timulação reduzida de TLR9.
Conforme os exemplos acima demonstram, substituição dos T- análogos lipofílicos 5’ no motivo CpG resulta em um forte aumento na ativa- ção de TLR9 em todas as classes testadas e resultou em uma capacidade aumentada de induzir a produção de IFN-alfa.
Exemplo 5: Estimulação de TLR9 por oligonucleotídeos modificados curtos Uma vez que o ODN de CpG modificado de 20 nucleotídeos de comprimento mostrou uma afinidade incomum pela ativação de TLR9, ODNs de CpG muito curtos foram investigados com relação à sua capacidade de ativar TLR9. Oligonucleotídeos muito curtos teriam uma maior vantagem com relação a oligonucleotídeos mais longos para uso em tratamento em virtude da facilidade aumentada de captação pelas células, bem como o po- tencial de uma formulação mais simples, sem o uso de DOTAP. Três ODNs de CpG curtos ("curtâmeros") foram investigados (Tabela 3): um hexâmero com motivo de CpG de 6-meros (SEQ ID NO: 38), uma modificação 5’JU do hexâmero (SEQ ID NO: 39) e uma modificação 5’3’ JU do hexâmero (SEQ ID NO: 40) (Tabela 4). A atividade dos "curtâmeros" foi comparada com o oligonucleotídeo da classe B não-modificado SEQ ID NO: 37 em um ensaio de luciferase. Conforme mostrado na figura 12, em sua maioria, particular- mente com SEQ ID NO: 40, o uso dos "curtâmeros" modificados mostra grande potencial como um medicamento aperfeiçoado para imunoterapia. Tabela 4: Oligonucleotídeos curtos modificados Seq ID Seqüência do "curtâmero" Modificação N°. 38 G*T*C-G*T*T Não-modificada 39 G*JU*C-G*T*T 5’JU 40 G*JU*C-G*JU*T 5’ e 3’ JU 37 Classe B não- modificada * ligação internucleotídeo de fosforotioato
- ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Exemplo 6: Ativação da através de de TLR9 in vivo por oligonucleotídeos modificados
De forma a determinar a eficácia do ODN modificado da inven-
ção in vivo, o ODN com análogos T lipofílicos foram testados em esplenóci- tos isolados de camundongo. Esplenócitos de camundongo BALB/c foram isolados e incubados com ODN da classe B modificado (SEQ ID NO: 13), ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 37) e um ODN de não-CpG (SEQ ID NO: 26) (Tabela 5). Os sobrenadantes de cultura foram coletados a
6 horas (TNF-alfa) ou 24 horas (IL-6, IL-10, IL-12) e a concentração de cito- cina foi medida através de ELISA. Conforme mostrado na figura 13, incuba- ção com SEQ ID NO: 13 modificada resultou em níveis dramaticamente au- mentados de todas as citocinas testadas.
Os ODN foram, então, testados com relação à sua capacidade
de induzir a proliferação de células B em esplenócitos. Esplenócitos de ca- mundongo BALB/c CFSE-corados (4 x 105/cavidade) foram incubados com 0,001, 0,01, 0,1, 0,3,1, 3 ou 10 pg/ml do ODN indicado (figura 14). A 72 ho- ras pós-incubação, as células foram coradas com relação ao marcador na 20 superfície celular CD19 e a proliferação de células B foi determinada através de FACS, seguida por análise através do software ModFit. Conforme mos- trado na figura 14, incubação com SEQ ID NO: 13 modificado resultou em um aumento acentuado na proliferação de células B. O aumento foi mais pronunciado mesmo na menor concentração de ODN.
Para medir o efeito de um ODN modificado in vivo, camundon- gos BALB/c (5 por grupo) foram injetados subcutaneamente (SC) com 10, 50 ou 100 pg de SEQ ID NO: 13 ou 100 pg de SEQ ID NO: 37 em um volume total de 100 μΙ de SC. O grupo de controle negativo recebeu 100 μΙ de PBS apenas. O sangue dos animais foi coletado através de punção cardíaca em 5 1 hora pós-injeção (TNF-alfa) ou 3 horas pós-injeção (IP-10). Amostras de plasma foram ensaiadas através de ELISA com relação ao TNF-alfa (figura 15a) e IP-10 (figura 15b). Injeção de camundongos BALB/c com SEQ ID NO: 13 modificada resultou em maior produção de TNF-alfa e IP-10 do que SEQ ID NO: 37 não-modificada, demonstrando que o ODN substituído com forma- 10 to de base lipofílica da invenção resultou em maior estimulação imune in vivo do que o ODN estimulatório imune não-modificado.
Tabela 5: Oligonucleotídeos testados in vivo
Seq ID Seqüência Modificação N°. 13 Derivado 5’JU de SEQ ID NO: 1 37 Classe B não- modificada 26 Controle de não-CpG * ligação internucleotídeo de fosforotioato
- ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Exemplo 7: Oligonucleotídeos com modificações adicionais
ODN com análogos de base lipofílicos foram testados com rela- ção à sua capacidade de induzir à atividade de NF-κΒ TLR9-mediada em um ensaio de luciferase (veja materiais e métodos). As figuras 16-23 mostram a atividade do ODN com modificações adicionais (veja tabela 6).
De forma a testar a atividade de outros análogos de base, a ati- vidade do ODN 6-nitro-benzimidazol (6NB)-modificado SEQ ID NO: 178 e da seqüência precursora não-modificada SEQ ID NO: 1 foram comparadas. Conforme mostrado na figura 12, SEQ ID NO: 178 foi capaz de ativar NF-kB TLR9-mediada em um grau comparável à seqüência precursora não- 5 modificada. Em seguida, a atividade do ODN 5-(2-bromovinil)-uridina modifi- cado (SEQ ID NO: 153-154) foi comparada àquela da seqüência precursora não-modificada SEQ ID NO: 1. Conforme mostrado na figura 17, ambos os ODNs modificados foram mais ativos no ensaio do que a seqüência precur- sora. Em seguida, a atividade de dois ODNs da classe B com 5-proinil-dU 10 (SEQ ID NO: 116 e 117) em Iugardetimidina da seqüência precursora (SEQ ID NO: 1). Conforme mostrado na figura 21, ambos os ODNs modificados tinham atividade comparável àquela da seqüência precursora. A atividade de SEQ ID NO: 116, na qual a modificação é 5’ ao dinucleotídeo CG, era ligei- ramente aperfeiçoada com relação à seqüência precursora.
De forma a testar o efeito de um segundo tipo de modificação
sobre o ODN JU-modificado, 2’0-metilguanosinas foram incorporadas no ODN JU-modificado. A atividade do ODN 2’-0-metilguanosina/JU, SEQ ID NO: 111-113, foi comparada àquela de SEQ ID NO: 1 precursora e JU modi- ficado apenas, SEQ ID NO: 13. Conforme mostrado na figura 18, ali ODN 20 JU-modificado foi mais ativo do que o ODN precursor. O ODN com a modifi- cação 3' 2’O-metilguanosina do dinucleotídeo CG (SEQ ID NO: 112-113) era ligeiramente mais ativo do que o ODN com a modificação 5' 2Ό- metilguanosina do dinucleotídeo CG (SEQ ID NO: 111) ou o ODN modifica- do com JU apenas (SEQ ID NO: 13).
Em seguida, a atividade do ODN ramificado JU-modificado (SEQ
ID NO: 96, 97, 101 e 102) foi comparada àquela de SEQ ID NO: 1. Conforme mostrado na figura 19, os ODNs ramificados com duas extremidades 5’ a- cessíveis eram todos ativos ou mais ativos do que SEQ ID NO: 1 não- modificada no ensaio. SEQ ID NO: 101 e 102, com o espaçador de fosfato 30 de trietileno glicol, foram mais ativos do que SEQ ID NO: 96 e 97 com o es- paçador 3’-0-Metil-G.
Em seguida, a atividade de um ODN da classe B curto não- modificado (SEQ ID NO: 38) e um ODN da mesma seqüência com um aná- logo de nucleotídeo substituído lipofílica e um tag 3' lipofílico (SEQ ID NO: 126) foram comparados. Ambos foram formulados com e sem DOTAP. Con- forme mostrado na figura 20, a adição da JU-modificação e do tag lipofílico 5 intensificou grandemente a atividade do ODN, assim como a adição de DO- TAP.
Em seguida, a atividade do ODN da classe B com um segundo análogo de nucleotídeo além de um análogo de nucleotídeo substituído lipo- fílico (SEQ ID NO: 138, 7-deaza-dG; SEQ ID NO: 139, inosina; SEQ ID NO: 10 140, 5-metil-dC) foi comparada àquela da seqüência precursora (SEQ ID NO: 1) e a mesma seqüência com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico apenas (SEQ ID NO: 13). Conforme mostrado na figura 22, todos os ODNs modificados foram mais ativos no ensaio do que o ODN precursor.
Em seguida, a atividade do ODN da classe T com um análogo 15 de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 132-134) foi comparada àquela de um ODN da classe C (SEQ ID NO: 198) conhecido por ser imuno- estimulatório. Conforme mostrado na figura 23, todos os ODNs modificados mostraram atividade muito maior no ensaio do que o ODN da classe C não- modificado.
Tabela 6: Oligonucleotídeos substituídos lipofílicos com modificações adicio- nais
Seq Seqüência Tipo e modifica¬ ID ção N°. 1 T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T classe B não- modificada 13 classe B: deriva¬ do 5’JU de SEQ ID NO: 1 38 G*T*C-G*T*T Classe B não- modificada 96 (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-3mG 3'3'-ramificado 97 (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-3mG S^-ramificado 101 (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-teg 3'3'-ramificado 102 (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-teg 3'3'-ramificado 111 Classe B 2'-0- metila modifica¬ da 112 T*G * J U *C-m G *r*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Classe B 2'-0- metila modifica¬ da 113 T*mG*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T Classe B 2'-0- metila modifica¬ da 116 classe B com 5- proinil-dll (PU) 117 classe B com 5- proinil-dU (PU) 126 G* J U*C-G* J U*T -hex derivado da classe B de 38 com JU e 3' tag de hexadecilgli- cerila 132 classe T 133 classe T 134 classe T 138 classe B com 7- deaza-dG (E) 139 classe B com inosina (I) 140 classe B com 5- metil-dC (Z) 153 classe B com 5- (2-bromo-vinil)- uridina (BVU) 154 T*G*T*C-G*BVU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T classe B com 5- (2-bromo-vinil)- uridina (BVU) 178 T*G*6NB*C-G *T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*TT*T*T classe B com 6-nitro- benzimidazol (6NB) 198 C*G*G*C*G*C*C*T*C*G classe C * ligação internucleotídeo de fosforotioato
- ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Exemplo 8: Atividade de oligonucleotídeos da classe P modificados
ODN da classe P com análogos de base lipofílicos foram testa- 5 dos com relação à capacidade de ativar a através de de NF-kB através de TLR9, conforme medido pelo ensaio de luciferase. A atividade do ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-61) foi comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). Conforme 10 mostrado na figura 24, todos os ODNs da classe P modificados mostraram estimulação aumentada de TLR9 comparado com os controles. A figura 24a mostra o ODN da classe P JU-modificado e 24b mostra o ODN da classe P EU-modificado.
Em seguida, a atividade do ODN da classe P modificado (SEQ 15 ID NO: 64 (EU-modificado), 66-67 (JU-modificado) foi comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57). Conforme mostrado na figura 25, todos os ODNs modificados mostraram um grau de estimulação de TLR9 do que o ODN da classe P não-modificado. 20 SEQ ID NO: 66, com a ligação de fosfodiéster no dinucleotídeo CG, mostrou atividade reduzida comparada com o fosforotioato total, SEQ ID NO: 67.
Em seguida, o ODN da classe P modificado foi testado com re- lação à sua capacidade de induzir à expressão de IFN-alfa. A atividade do ODN da classe P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 58-61) foi comparada àquela de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56) 5 conforme medido através de um ensaio ELISA. Conforme mostrado na figura 26, todos os ODNs da classe P modificados mostraram um aumento na in- dução de IFN-alfa. A figura 26a mostra ODN da classe P JU-modificado e 26b mostra ODN da classe P EU-modificado .
Em seguida, o ODN da classe P modificado (EU-modificado), 10 66-67 (JU-modificado) foi comparado com aquele de um controle positivo da classe B (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C (SEQ ID NO: 68) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 57) com relação à capacida- de de induzir ao IFN-alfa, conforme medido através de um ensaio ELISA. Conforme mostrado na figura 27, o ODN da classe P modificado mostrou 15 capacidade intensificada de induzir ao IFN-alfa. Conforme na figura 24, SEQ ID NO: 66 mostrou atividade reduzida comparado com SEQ ID NO: 67.
Em seguida, o ODN da classe P modificado foi testado com re- lação à capacidade de induzir a IL-6 em PBMCs humanas. PBMCs de três doadores foram incubadas com ODN em concentrações conforme indicado 20 durante 24h, seguido por análise com Luminex 25-plex dos sobrenadantes com relação à IL-6. A atividade do ODN da classe P modificado (SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 28a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 28b) foi comparada àquela de um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55) e ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo 25 (SEQ ID NO: 53) e um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56). O ODN JU-modificado (SEQ ID NO: 58, 60-61 e 67) mostrou uma ativação li- geiramente maior de IL-6 do que o ODN EU-modificado (SEQ ID NO: 62 e 64). Todos os ODNs modificados mostraram atividade aumentada compara- dos com o ODN não-modificado.
Em seguida, a atividade de um ODN da classe P modificado
(SEQ ID NO: 58, 60-62, figura 29a) (SEQ ID NO: 64 e 67, figura 29b) foi comparada àquela de um ODN da classe B não-modificado (SEQ ID NO: 55), um ODN da classe C não-modificado (SEQ ID NO: 54), um ODN de controle negativo (SEQ ID NO: 53), um ODN da classe P não-modificado (SEQ ID NO: 56), LPS, R-848, SEB e um ODN poli[l]: [C], PBMCs CFSE- rotuladas de três doadores foram incubadas com o ODN durante 5 dias e, 5 então, coradas com um anticorpo a CD19. O percentual de células B com coloração reduzida de CFSE foi determinado. Tratamento com o ODN da classe B resultou no maior percentual de células B após divisão. Tratamento com o ODN JU-modificado resultou em um percentual de células B maior do que o ODN EU-modificado.
De forma a determinar o efeito do ODN da classe P modificado
in vivo, camundongos BALB/c (5 por grupo) foram injetados SC com diferen- tes doses de ODN. O sangue dos animais foi coletado a 3 horas pós-injeção e o plasma testado com relação ao IFN-alfa através de ELISA. A atividade do ODN da classe P modificado (SEQ ID NO: 58, 60-62, 64 e 67) foi compa- 15 rada àquela de um controle negativo da classe B (SEQ ID NO: 55) e um con- trole negativo (SEQ ID NO: 26). Conforme mostrado na figura 30, tratamento com o ODN JU-modificado SEQ NO: 58, 60 e 61 resultou em indução de IFN-alfa ligeiramente maior do que o ODN EU-modificado SEQ ID NO: 64. O ODN da classe B SEQ ID NO: 55 não induz a muito IFN-alfa de murino, con- 20 forme esperado.
Em seguida, o ODN da classe P modificado foi avaliado com relação à sua capacidade de reduzir o volume de tumor no modelo de tumor SA1N de camundongo. Camundongos A/J fêmeas (10 por grupo) foram inje- tados SC com 5 x 105 células tumorais Sal/N no dia 0. Os camundongos fo- 25 ram tratados com 35 μς (figura 31a) ou 100 μς (figura 31b) de ODN da clas- se P com um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (SEQ ID NO: 60, 64 e 67), um ODN da classe C não-modificado, um ODN da classe B não- modificado (SEQ ID NO: 55) ou PBS apenas. ODN foi fornecido SC uma vez por semana, começando no dia 8 pós-indução de tumor. Os animais foram
monitorados com relação à sobrevivência e volume do tumor. Conforme mostrado na figura 31a, na menor dosagem, tratamento com o ODN da clas- se P modificado mostrou a maior redução no volume de tumor, sugerindo que esse ODN seria eficaz no tratamento de câncer. Na maior dosagem em
31 b, todos os ODNs da classe P modificados e o ODN da classe C foram eficazes na redução do volume do tumor.
Tabela 7: Oligonucleotídeos da classe P modificados
Seq Seqüência Tipo e ID modifica¬ N°. ção 53 controle neg 54 classe C 55 classe B 56 T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P T->A, 5' CpG PO 57 Palindro- ma 3' da classe P1 PO de CpG 5' 58 JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P 59 JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P 60 JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T classe P 61 JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T classe P 62 EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P 63 EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P 64 EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P 65 EU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G classe P 66 classe P 67 JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T classe P 68 T*C G*C G*T*C G*T*T*C G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G classe C ‘ligação internucleotídeo de fosforotiato
- ligação internucleotídeo de fosfodiéster
Um sumário de ODNs modificados exemplificativos é apresenta- do na Tabela 8:
Tabela 8
Seq ID Seqüência de oligonucleotídeo N0 # CO T*G*FF*C“G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 4 T*G*T*C"G * F T*G* F F* C-G * F CO T*G*T*FF G 7 CXD T*pp*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T CO T*G*T*C-G*T*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T T*G *B U * C-G *t*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 11 T*G*T*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 12 T* G*BU*C-G*BU *"ρ*"Γ*Τ*"Γ*"Γ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ 13 T*G*JU*C Q*y*y*y+y*y*y*y*y*i**y*y*y*y**i"*y 14 T*G*T*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T T*G*J U*G G*JU 16 T* G * U * O· G *t*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 17 T*G*T*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 18 T*G * U * C- G * U *T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 19 JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T T*G*G*JU*G*G*T*T*T*T*T*G*G*G*T*C*G*T*T*T*T 21 T*ç*g*T*C*G*T*T*T*T*T*G*G*G*JU*C*G*T*T*T*T 22 JU*C*G*J U*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 23 T*C*G*JU*C*G*JU*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 24 T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*JU*T*T*T 27 JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G 28 T*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G 29 T*g*EU*C-G*EU *t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t 31 JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 32 T*C*G*JU*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 33 JU*C-G*JU*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 34 J U*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G T*C-G-A-C-G-JU-C-G-T-G-G*G*G*G 36 T*C-G-A-C-G-JU-C-G-JU-G-G*G*G*G 39 G*JU*C-G*T*T 40 G*JU*C-G*JU*T 41 X*G*CU*C G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 42 y*Q*E|J*Q Q*γ*γ*γ**|·*γ*γ*ι·*ι**γ*γ*γ*γ*γ*γ*γ 44 JU*C-G*JU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G 45 T*C-G*JU*C*G*JU*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G 47 T*c*T*T*T*T*T*T*G*JU*C“G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 48 JU*G G*JU*X*X*X*X*X*X*X*X*X 49 j y*Q*x*x*y*y*x*x*Q*y*Q G*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X 50 U U*c X*X*X*X*X*X*G*X*C Q*y*y*y*'|’*y*y*y*y*y*y 51 X*C*X*X*X*X*X*X*G*U*C G*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X 58 JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 59 JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 60 JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 61 JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 62 EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 63 EU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 64 JirC-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 65 JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 66 EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 67 JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 78 X*G*X*C-G*FU*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X*X 79 X*G *FU*C G*FU 80 T*G*U*C~G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 81 T*G*T*C-6 N B 82 *7*0 ^ g q *7*7*7*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 83 T*G*t*6nB-G“T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 84 JU*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 85 JU*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 86 T*g*T*C-G*T*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 87 I *Q 0 88 T*G*T*C G*FT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 89 7*Q*py*Q 0*ργ*γ*γ*γ*γ*γ*γ*γ*Ύ**^·)τγ*Ύ*γ*γ*γ 90 T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 91 T*G*T*C G*CU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 92 T*g*cU*C“G*CU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 93 T*JU*C q*7*7*7*7*7*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 94 T*G*JU*C-G*T*T*T*T 95 T*G*JU*C-G*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T 96 (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-3mG 97 (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-3mG 98 T*T* J U *C-G *T*C-G *T*T*T*C-G*T*C-G *T*T 99 BU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G-G*G*G 100 T*G*JU*G ^*7*"j"*7*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 101 (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-teg 102 (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-teg 103 JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 104 T*G*G*JU*G G*T*T*T*T*G*G*G*0*G*Q*G*C*G*C*0*G 105 T*C*G*T*C*G*T*T*T*JU*C-G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 106 JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T 107 T*C*G*J U*G*G*T*T*T*T*T*C*G*G*J U*^^*^5*T*T*T*T 108 T*G*JU*C G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*Q*JU*C G*T*T 109 T*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 110 J U*C-G-A-C-G-T-C-G-T -G-G*E*G*G 111 T*mG*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 112 y*G*J y*Q-rn G 113 T*m G *U LJ * C m G *"ρ*7*"ρ*7*7*"ρ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*ΊΓ*Τ*ΊΓ 114 jlj*q 0*jy*Q*G*y*y*"f*y*x*Q*G*Q*y*Q*(3*y*i**T'*y 115 JU*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 116 y*0* p U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 117 -p* q *7*q_G * p LJ *7*7*7*7*7*7*7*7*7*7*7*7*7*7 118 B U*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G 119 T*G*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 120 T*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 121 T* E LJ *G G *T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 122 T*G*EU*G C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 123 JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 124 125 G*JU*C-G*T*T-hex 126 G*JU*C-G*JU*T-hex 127 G*EU*C-G*EU*T-hex 128 EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G 129 T*C*G*EU*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G 130 EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 131 J U *C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 132 ju*c*t*t*t*t*t*t*t*t*c*g*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t 133 T*C*T*T*T*T*T*T*T*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 134 J LJ *Q*y*y*y*y*y*y*y*j LJ*G*G 135 JU*C G*T*C*G*T*T*T*G*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 136 137 jU*q *G*^3*"P*T*T*T*^3*ULJ*C G*T*T 138 T*G*JU*C e*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 139 -J-* Q * J U*Q_ I *“|"*i”*i_*^"*"|_*"|“*^"*^"*'|·*^'*^·*^’*^’*^"*^" 140 T*G*JU*Z g*X*X*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 141 T*G*T*C 142 T** q *T*Q-G*T*T*T*J U *τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ*Τ 143 JL|*C 0*γ*0*0*γ*"|"*γ*γ*0*0*0*0*0*0*0*0*0*0*0*0*γ 144 EU*C G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 145 T*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 146 T*C-G*T*C*G*T*T*T*JU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 147 T*C-G*T*C*G*T*T*T*EU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 148 EU*C-G*T*C*G*T*T*T*EU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 149 EU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 150 JU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 151 JLJ*0 g*X*Q*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 152 EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 153 T*G*BVU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 154 T*G*T*C-G*BVU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 155 JU*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 156 JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG 157 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG 158 EU*C*G*EU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG 159 EU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG 160 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*iT 161 JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 162 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 163 EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 164 EU*C*G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 165 EU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 166 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*EU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 167 JU*C*G*T*C*G*T*T*T*JU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 168 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT 169 JU*C*G*T*C*G*T*T*TT*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT 170 EU*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG 171 JU*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG 172 JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 173 EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG 174 EU*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*iT 175 EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT 176 T*G*NI*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 177 T*G*NP*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 178 T*G*6NB*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 179 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 180 JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*G*G*C*G*G*C*G*C*C*G*C*C 181 EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*G*G*C*G*G*C*G*C*C*G*C*C 182 T*T*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 183 T*EU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 184 JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 185 JU*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 186 T*JU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 187 EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*T 188 T*EU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*T 189 T*JU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*T 190 JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU 191 EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 192 EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 193 EU-C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 194 EU-C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 195 T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 196 X* G *T*C- G * U Chave * ligação internucleotídeo de fosforotioato - ligação internucleotídeo de fosfodiéster teg Espaçador 9 (fosfato de trietileno glicol) hex hexadecilglicerila 3mG 3'-0-Metil-rG iT Nucleotídeo inverso (3’ e 5’ trocados) 2doub Doubler2 (Chemgenes) FF 2,4-difluorotolueno BU 5-bromo-2’-desoxiuridina JU 5-iodo-2’-desoxiuridina U Uridina CU 5-cloro-2’-desoxiuridina FU 5-fluoro-dU EU 5-etil-2’-desoxiuridina 6NB 6-nitro-benzimidazol PU 5-proinil-dU I Inosina Z 5-metil-dC E 7-deaza-dG FT a,a,a-trifluoro-dT BVU 5-(d-bromo-vinil)-uridina NI nitroindol NP nitropirrol F 5-fluoro-dU L Espaçador 18 (fosfato de hexaetileno glicol) EQUIVALENTES
A especificação precedente escrita é considerada como sendo suficiente para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem a inven- ção. A presente invenção não está limitada, quanto ao escopo, pelos exem- 5 pios fornecidos, uma vez que os exemplos se destinam a ser uma simples ilustração de um aspecto da invenção e outras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e caem 10 dentro do escopo das reivindicações em anexo. As vantagens e os objetivos da invenção não são necessariamente abrangidos por cada modalidade da invenção. Listagem de Seqüência
<110> Coley Pharmaceutical GmbH <120> Análogos de Oligonucleotídeo Cpg bicos com Atividade Imunoestimulatória <130> Cl037.70069w000 <140> Ainda não-atribuído <141> 27/09/2007 <150> US 60/847.811 <151> 27/09/2006 <160> 198 <170> PatentIn versão 3.4 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <400> 1 tgtcgttttt tttttttttt <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <400> 2 tgtcgttttt tttttttttt <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético 20
20 <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é 2,4-difluorotolueno
<400> 3
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é 2,4-difluorotolueno <400> 4
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 5 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 2,4-difluorotolueno <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é 2,4-difluorotolueno tgncgntttt tttttttttt <210> 6 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que η é 2,4-difluorotolueno <400> 6
tgtngttttt tttttttttt <210> 7 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (5)..(5)
<223> em que n é 2,4-difluorotolueno <400> 7
tgtcnttttt tttttttttt <210> 8 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc__feature <222> (2)..(2)
<223> em que η é 2,4-difluorotolueno
<400> 8
tncgtttttt tttttttttt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que n é 2,4-difluorotolueno
<400> 9
tgtcgtnttt tttttttttt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-bromo-2'-desoxiuridina
<4 00> 10
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 11
<211> 20 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-bromo-2'-desoxiuridina <4 00> 11
tgtcgntttt tttttttttt <210> 12 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-bromo-21-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-bromo-21-desoxiuridina <4 00> 12
tgncgntttt tttttttttt <210> 13 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3) .. (3)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<4 00> 13
tgncgttttt tttttttttt
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<4 00> 14
tgtcgntttt tttttttttt
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 15
tgncgntttt tttttttttt <210> 16 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é uridina <4 00> 16
tgncgttttt tttttttttt
<210> 17 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é uridina <4 00> 17
tgtcgntttt tttttttttt <210> 18 <211> 20 <212> DNA 30 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é uridina <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é uridina <4 00> 18
tgncgntttt tttttttttt <210> 19 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 19
ncgtcgtttt tcggtcgttt t <210> 20 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 20
tcgncgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 21 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (15) . . (15)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 21
tcgtcgtttt tcggncgttt t 21
<210> 22 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) . . (4)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 22
ncgncgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 23
<211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina
<400> 23
tcgncgnttt tcggtcgttt t
<210> 24 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (15) . . (15)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (18) . . (18)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 24 tcgtcgtttt tcggncgntt t <210> 25 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 25
tcttttttgt cgtttttttt tt 22
<210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <400> 26
tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24
<210> 27 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 27
ncgtcgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 28
tcgncgtttt acggcgccgt gccg <210> 29 <211> 20 <212> DNA 10 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (6) . . (6)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina
<400> 29
tgtcgntttt tttttttttt
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <400> 30
tgncgntttt tttttttttt <210> 31 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 31
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg
<210> 32 <211> 23 < 212 > DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <400> 32
tcgncgacga tcggcgcgcg ccg <210> 33 <211> 23 <212> DNA 30 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> n é a, c, g ou t <400> 33
ncgncgacga tcggcgcgcg ccg
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 34
ncgacgtcgt ggggg
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 35
tcgacgncgt -ggggg 15
<210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (10) .. (10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 36
tcgacgncgn ggggg 15
<210> 37 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 37
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 38 <211> 6 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético 5 <400> 38 gtcgtt <210> 39 <211> 6 <212> DNA 10 <213> Seqüência artificia:
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 39 gncgtt
<210> 40
<211> 6
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (2) . . (2)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (5)..(5)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina gncgnt <210> 41 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-cloro-2'-desoxiuridina <400> 41
tgncgttttt tttttttttt <210> 42 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <400> 42
tgncgttttt tttttttttt <210> 43 <211> 15 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 43
tcgacgtcgt ggggg 15
<210> 44 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> n é a, c, g ou t <400> 44
ncgncgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 45 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220> <221> misc_feature
<222> (7) .. (7)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 45
tcgncgnttt acggcgccgt gccg <210> 46 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 46
tcgtcgtttt acggcgccgt gccg <210> 47 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 47
tcttttttgn cgtttttttt tt <210> 48 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (13) . . (13)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 48
tcttttttgn cgnttttttt tt 22
<210> 49 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 49
ncttttttgt cgtttttttt tt 22
<210> 50 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 50
ncttttttgt cgtttttttt tt <210> 51 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência- artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (10) . . (10)
<223> em que η é uridina <400> 51
tcttttttgn cgtttttttt tt
<210> 52 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 52
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg <210> 53 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 53 tccaggactt ctctcaggtt <210> 54 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 54
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg <210> 55 <211> 24 <212> DNA 10 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 55
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
<210> 56 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 56
tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg <210> 57 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 57 tcgtcgacga tcggcggccg ccg <210> 58 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 58
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(23)
<223> em que todas as ligações internucleotídeo são ligações de fos- forotioato <400> 59
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 60 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 60
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> em que todas as ligações internucleotídeo são ligações de fos-
forotioato
<400> 61
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc feature <222> (I)..(I)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<400> 62
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina
<400> 63
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-21-desoxiuridina <400> 64
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 65 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(23)
<223> em que todas as ligações internucleotídeo são ligações de fos- forotioato <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <400> 65
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 66 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-etil-21-desoxiuridina <400> 66
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<210> 67 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc_feature
<222> (I)..(I)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 67
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<210> 68 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 68
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 69 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 69
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 70
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 71
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 72 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 72
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<400> 73
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 74
tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 75
tcgcgtcgtt cggcgccg 18
<210> 76 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <400> 76
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-fluoro-dU
<400> 77
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 78 <211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que η é 5-fluoro-dU
<400> 78
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-fluoro-dU <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-fluoro-dU
<400> 79
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é uridina <220> <221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que η é uridina <400> 80
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 81 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (5)..(5)
<223> em que n é 6-nitro-benzimidazol <400> 81
tgtcnttttt tttttttttt 20
<210> 82 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4) . . (4)
<223> em que n é 6-nitro-benzimidazol <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(5)
<223> em que as ligações são uma ligação de fosfodiéster <400> 82 tgtngttttt tttttttttt 20
<210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> em que η é 6-nitro-benzimidazol <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(6)
<223> em que as ligações são ligações de fosfodiéster <400> 83
tgtngttttt tttttttttt 20
<210> 84 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 84
ngtcgttttt tttttttttt 20
<210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <400> 85
ngncgttttt tttttttttt 20
<210> 86 <211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (7)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 86
tgtcgtnttt tttttttttt 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220> <221> misc_feature
<222> (3) . . (3)
<223> em que η é a,a,a-trifluoro-dT
<400> 87
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é a,a,a-trifluoro-dT
<400> 88
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é a,a,a-trifluoro-dT <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é a,a,a-trifluoro-dT
<400> 89 tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-cloro-2'-desoxiuridina
<400> 90
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-cloro-2'-desoxiuridina
<400> 91
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-cloro-21-desoxiuridina <22 0>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-cloro-2'-desoxiuridina <400> 92
tgncgntttt tttttttttt 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 93
tncgtttttt tttttttttt 20
<210> 94
<211> 9
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 94 tgncgtttt 9
<210> 95 <211> 15 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 95
tgncgttttg tcgtt 15
<210> 96
<211> 10
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (8) .. (8)
<223> em que n é fosfato de hexaetileno glicol <220>
<221> misc_feature <222> (9)..(9)
<223> em que n é Doubler2 <220> <221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> em que η é 3'-O-Metil-rG <400> 96
tgncgttnnn 10
<210> 97 <211> 10 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> n é a, c, g ou t <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (8) . . (8)
<223> em que n é fosfato de hexaetileno glicol <220>
<221> misc_feature <222> (9)..(9)
<223> em que n é Doubler2 <220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <400> 97 ncgttcgnnn 10
<210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 98
ttncgtcgtt tcgtcgtt 18
<210> 99 <211> 15 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-bromo-2'-desoxiuridina <400> 99
ncgacgtcgt ggggg 15
<210> 100 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220> <221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 100
tgngcttttt tttttttttt 20
<210> 101 <211> 10 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (8)..(8)
<223> em que n é fosfato de hexaetileno glicol <220>
<221> misc_feature <222> (9)..(9)
<223> em que n é Doubler2 <220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> em que n é trietileno glicol phosphate <4 00> 101
tgncgttnnn 10
<210> 102 <211> 10 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> n é a, c, g ou t <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <22 0>
<221> misc_feature <222> (8) . . (8)
<223> em que n é fosfato de hexaetileno glicol <220>
<221> misc_feature <222> (9)..(9)
<223> em que n é Doubler2 <220>
<221> misc_feature <222> (10) . . (10)
<223> em que n é trietileno glicol phosphate <4 00> 102
ncgttcgnnn 10
<210> 103 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220> <221> misc_feature
<222> (I)..(I)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 103 5 ncgtcgtttt cggcgcgcgc cg <210> 104 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 104
tcgncgtttt cggcgcgcgc cg <210> 105 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 105
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cg
<210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <4 00> 106
ncgtcgtttt tcggncgttt t 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (4) . . (4)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 107
tcgncgtttt tcggncgttt t 21
<210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 108
tgncgttttt ttttgncgtt 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 109
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 110 <211> 15 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220> <221> misc_feature
<222> (I)..(I)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (13)..(13)
<223> em que n é 7-deaza-dG <4 00> 110 ncgacgtcgt ggngg 10 <210> 111 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (2) . . (2)
<223> em que n é 31-O-Metil-rG <220>
<221> misc_feature <222> (3) .. (3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 111 25 tnncgttttt tttttttttt <210> 112 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220> <221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG
<4 00> 112
tgncnttttt tttttttttt 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (5)..(5)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <400> 113
tnncnttttt tttttttttt 20
<210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (4 ) . . (4 )
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 114
ncgncgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(21)
<223> em que todas as ligações internucleotídeo são ligações de fos- forotioato <220>
<221> misc_feature <222> (4) . . (4)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 115
ncgncgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 116 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc__feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é 5-proinil-dU <4 00> 116
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 117 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é 5-proinil-dU <4 00> 117
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 118 <211> 15 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (I) .. (I)
<223> em que η é 5-bromo-2'-desoxiuridina <4 00> 118
ncgacgtcgt ggggg 15
<210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<4 00> 119
tgncgttttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (2) .. (2)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 120
tncgttttcg gcgcgcgccg t 21
<210> 121 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<22 0>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 121 10 tncgtttttt tttttttttt <210> 122 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina
<4 00> 122
tgngcttttt tttttttttt
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 123
ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 124 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 124
ncgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 125 <211> 7 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que n é hexadecilglicerila
<4 00> 125
gncgttn 7
<210> 126
<211> 7 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (2) . . (2)
<223> em que η é 5-iodo-21-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que n é hexadecilglicerila
<4 00> 126 gncgntn
<210> 127
<211> 7
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> em que η é hexadecilglicerila
<400> 127
gncgntn 7
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<400> 128
ncgtcgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 129
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (4) . . (4)
<223> em que n é 5-etil-21-desoxiuridina <4 00> 129
tcgncgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 130 <211> 23 <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-etil-21-desoxiuridina <4 00> 130
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg <210> 131 <211> 17 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 131
nctttttttt ttttttt <210> 132 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <4 00> 132
nctttttttt cgtttttttt tt <210> 133 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (10) .. (10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 133
tctttttttn cgtttttttt tt <210> 134 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 134 nctttttttn cgtttttttt tt <210> 135 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (I) .. (I)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 135
ncgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 136 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (20)..(20)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 136
tcgtcgtttc gtcgttttgn cgtt 24
<210> 137 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220> <221> misc_feature
<222> (20) .. (20)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 137
ncgtcgtttc gtcgttttgn cgtt <210> 138 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (5)..(5)
<223> em que n é 7-deaza-dG <400> 138
tgncnttttt tttttttttt <210> 139 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> em que η é inosina
<4 00> 139
tgncnttttt tttttttttt 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-metil-dC <4 00> 140
tgnngttttt tttttttttt 20
<210> 141 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (8)..(8)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina tgtcgttntt tttttttttt <210> 142 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (9)..(9)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 142
tgtcgtttnt tttttttttt <210> 143 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 143
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt <210> 144 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<400> 144
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (4) . . (4)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina
<4 00> 145
tcgncgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (10) . . (10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <400> 146
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23
<210> 147 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (10) .. (10)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina <400> 147
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23
<210> 148 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 148
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cgt 23
<210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-etil-21-desoxiuridina
<22 0>
<221> misc_feature <222> (4) . . (4)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 149 10 ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt <210> 150 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-etil-21-desoxiuridina <4 00> 150
ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 151
ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 152 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético <22 0>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina
<400> 152
ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotideo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 5-d-bromo-vinil-uridina <400> 153
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 154 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (6) .. (6)
<223> em que η é 5-d-bromo-vinil-uridina <4 00> 154
tgtcgntttt tttttttttt 20
<210> 155 <211> 13 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<400> 155
ncggcggccg ccg 13
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (24) .. (24) <223> em que n é 3'-0-Metil-rG <4 00> 156 ncgtcgtttt acggcgccgt gccn <210> 157 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc feature <222> (1) ·· (1) <223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (24) .. (24) <223> em que n é 3'-O-Metil-rG <4 00> 157 ncgtcgtttt acggcgccgt gccn <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> em que todas as ligações internucleotídeo são ligações de fos- 10
ncqncqtttt acqqcqccqt qccn 24
20
25
30
forotioato <220> <221> misc feature <222> (1) . · (1) <22 3> em que n é 5-etil-2' -desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (4) . . (4) <223> em que n é 5-etil-2' -desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (24) .. (24) <223> em que n é 3'-O-Metil-rG <4 00> 158 ncgncgtttt acggcgccgt gccn <210> 159 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> Λ Oligonucleotídeo sintético CO CM CM V <220> <221> misc feature <222> (1) · ■ (1) <223> em que n é 5-etil-2' -desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (4)..(4) <223> em que n é 5-etil-2' -desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (24)..(24) <223> em que n é 3'-O-Metil-rG
<4 00> 159
ncgncgtttt acggcgccgt gccn 24
<210> 160 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc feature <222> (1) · · (1) <223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (25) . . (25) <223> em que n é uma timidina 5' a 5' ligada <400> 160 ncgtcgtttt acggcgccgt gccgn <210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc feature <222> (1) .. (1) <223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (22)..(22) <223> em que n é 3'-O-Metil-rG
<4 00> 161
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 162 <211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (22) . . (22)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <4 00> 162
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 163 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> em que n é 31-O-Metil-rG
<4 00> 163
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222>, (1)..(22)
<223> em que todas as ligações internucleotídeo são ligações de fos- forotioato
<220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (4) .. (4)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <400> 164
ncgncgtttt cggcgcgcgc cn 22
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (22) . . (22)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <4 00> 165
ncgncgtttt cggcgcgcgc cn <210> 166 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-21-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (10)..(10)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc feature <222> (22) . . (22)
<223> em que η é 3'-O-Metil-rG
<400> 166
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn 22
<210> 167
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <22 0>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (10) .. (10)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (22)..(22)
<223> em que n é 3'-O-Metil-rG <400> 167
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn 22
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc feature <222> (I)..(I)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> em que n é uma timidina 5' a 5' ligada
<400> 168
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgn
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> em que n é uma timidina 5' a 5' ligada
<4 00> 169
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgn
<210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc feature <222> (1)·· (1) <223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (24) .. (24) <223> em que n é 31-O-Metil-rG <400> 170 ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc feature <222> (1) · ■ (1) <223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <220> <221> misc feature <222> (24) .. (24) <223> em que n é 3'-O-Metil-rG <400> 171 ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Oligonucleotídeo sintético <220> <221> misc feature <222> (I) .. (I)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23)
<223> n é a, c, g ou t <400> 172
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn <210> 173 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23)
<223> em que n é 31 -O-Metil-rG <400> 173
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn
<210> 174 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc feature <222> (I)..(I)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<220>
<221> misc_feature <222> (25)..(25)
<223> em que n é uma timidina 5' a 5' ligada <4 00> 174
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccgn <210> 175 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (24) .. (24)
<223> em que n é uma timidina 5' a 5' ligada <4 00> 175
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccgn <210> 176 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é nitroindol <400> 176
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 177 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <22 0>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é nitropirrol <4 00> 177
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que n é 6-nitro-benzimidazol <400> 178
tgncgttttt tttttttttt 20
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (1)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<4 00> 179
ncgtcgtttt tcggtcgttt t
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 180 20 ncgtcgacga tggcggcgcc gcc <210> 181 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <400> 181
ncgtcgacga tggcggcgcc gcc <210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<4 00> 182
ttcgttttcg gcgcgcgccg t
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 183 20 tncgttttcg gcgcgcgccg t <210> 184 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 184
ncgttttcgg cgcgcgccgt <210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (2)
<223> em que η é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 185
nncgttttcg gcgcgcgccg t <210> 186 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-iodo-2'-desoxiuridina <4 00> 186
tncgttttcg gcgcgcgccg t <210> 187 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc feature <222> (I)..(I) <223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina
<4 00> 187
ncgtcgtttt acggcgccgt gccgt <210> 188 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-etil-2' -desoxiuridina <4 00> 188
tncgttttac ggcgccgtgc cgt <210> 189 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <4 00> 189
tncgttttac ggcgccgtgc cgt <210> 190 <211> 17 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (10)
<223> em que os resíduos são desoxirribonucleotídeos <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-iodo-21-desoxiuridina <220>
<221> misc_feature <222> (11) .. (17)
<223> em que os resíduos são ribonucleotídeos <400> 190
ncgtcgtttt guugugu 17
<210> 191 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 191
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<210> 192 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> em que η é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 192
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<210> 193 <211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético
<220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <4 00> 193
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 194 <211> 23 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
<223> em que n é 5-etil-2'-desoxiuridina <400> 194
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23 <210> 195 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> em que η é uridina <4 00> 195
tgncgttttt tttttttttt <210> 196 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <220>
<221> misc_feature <222> (6)..(6)
<223> em que n é uridina <4 00> 196
tgtcgntttt tttttttttt <210> 197 <211> 22 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <4 00> 197
tctttttttt cgtttttttt tt <210> 198 <211> 13 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Oligonucleotídeo sintético <4 00> 198
cggcgccgtg ccg 13 REIVINDICAÇÕES 1. Oligonucleotídeo compreendendo:
a seqüência RiYZR2 em que Ri e R2 são selecionados do grupo consistindo em um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (L), um nu- 5 cleotídeo e uma ligação, em que pelo menos um de R1 e R2 é um análogo de nucleotídeo substituído lipofílico (L)1 em que Y é um nucleotídeo de piri- midina e em que Z é um resíduo de purina, pirimidina ou um resíduo abási- co.
2. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que L compreende um análogo de nucleobase com anel de 5 ou 6 elementos.
3. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 em que L compreende um grupo de fórmula I:
Fórmula I
em que A, B1 X, D, E e F são selecionados de C (carbono) ou N (nitrogê- nio) opcionalmente trazendo hidrogênio ou um substituinte; n é 0 ou 1;
as linhas pontilhadas indicam ligações duplas opcionais; em que pelo menos um substituinte não é escolhido do grupo consistindo em oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino, metila e hidrogênio e que o total de átomos A, B, X, D, E e F não é mais do que 3 nitrogênios (N).
4. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que n é
1.
5. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que n é 0.
6. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que todos os átomos A, B, X, D, E1 F são carbono (C).
7. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que um dos átomos A, B, X, D, E, F é nitrogênio (N).
8. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que dois dos átomos A, B, X, D, E, F são nitrogênio (N).
9. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que três dos átomos A, B1 X, D, E1 F são nitrogênio (N).
10. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que pelo menos um dos átomos A, B, X, D, E, F é substituído por um membro do
grupo consistindo em F1 Cl, Br, I, alquila, alquenila, alquinila, alquila haloge- nada, alquenila halogenada, cicloalquila, O-alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2; -S-alquila, -SO-alquila, -S02-alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila, oxo, tio, hidróxi, mercapto e imino,em que pelo me- nos um substituinte não é oxo, tio, hidróxi, mercapto, imino, amino ou metila.
11. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que
um dos dois átomos A ou E é substituído por F, Cl, Br, I, C2-C6-alquila, al- quenila, alquinila, alquila halogenada, alquenila halogenada, cicloalquila, O- alquila, O-alquenila, -NH-alquila, -N(alquila)2; -S-alquila, -SO-alquila, -SO2- alquila, nitro, ciano, carboxiléster, fenila, tiofenila, benzila ou metila contanto
que, se metila, então, A, B, X, D, E e F serão todos C.
12. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que fórmula I compreende uma pirimidina substituída.
13. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a fórmula I compreende uma uracila substituída.
14. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a
fórmula I compreende um tolueno substituído.
15. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a fórmula I compreende um imidazol ou pirazol substituído.
16. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a
fórmula I compreende um triazol substituído.
17. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a fórmula I é 5-cloro-uracila, 5-bromo-uracila ou 5-iodo-uracila. 18. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a fórmula I é 5-etil-uracila ou 5-propil-uracila.
19. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a fórmula I é 5-proinil-uracila ou (E)-5-(2-bromovinil)-uracila.
20. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a
fórmula I é 2,4-difluoro-tolueno.
21. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a fórmula I é fundida com um sistema de anel alifático ou aromático de 3 a 6 elementos.
22. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, em que a
fórmula I é ligada a uma porção de açúcar com 5 a 6 elementos.
23. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, em que a porção de açúcar com 5 a 6 elementos é uma pentose ou hexose.
24. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 23, em que
a pentose é uma furanose e hexose é uma piranose, a qual pode ser opcio- nalmente substituída por F, amino, alcóxi, alcóxi-etóxi, aminopropila, alqueni- la, alquinila ou uma ligação em ponte de 02,C4-alquileno.
25. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 23, em que a furanose é ribose ou desoxirribose.
26. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que
R1 e R2 são ambos L.
27. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que R1 é L e R2 é um nucleotídeo.
28. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que
R1 é um L e R2 é uma ligação, de modo que o oligonucleotídeo compreenda
uma estrutura 5’ RiCG 3’.
29. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que R1 é L e R2 é uma ligação e em que a R3 é 5’ a R1YZ, de modo que o oligo- nucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ R3R1YZ 3’.
30. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que
R1 é L e R2 é uma ligação e em que um segundo R1 é 5’ a R1YZ espaçado por um nucleotídeo N, de modo que o oligonucleotídeo compreenda uma estrutura 5’ RiNRiYZ 3’.
31. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 compre- endendo dois motivos 5’ RiNR1YZ 3’.
32. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que Y compreende uma pirimidina selecionada do grupo consistindo em citosina, 5-
metil-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-halogeno-citosina, 2-tiocitosina, 4-tiocitosina, N3-metil-citosina, N4-alquil-citosina ou uma citosi- na 6-substituída.
33. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que Z
é um nucleotídeo de purina.
34. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que Z compreende uma purina selecionada do grupo consistindo em guanina, 7- deaza-guanina, hipoxantina, 7-deaza-hipoxantina, 2-amino-purina, 4-tio- purina, 2,6-diamino-purina, 8-oxo-7,8-di-hidroguanina, 7-tia-8-oxo-7,8-di-
hidroguanina, 7-alil-8-oxo-7,8-di-hidroguanina, 7-deaza-8-aza-guanina, 8- aza-guanina, N1-metil-guanina ou purina.
35. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que Z é um nucleotídeo de pirimidina.
36. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que Z éT.
37. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que R2 é L e R-ι é um nucleotídeo.
38. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleotídeo tem 3 nucleotídeos de comprimento.
39. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
oligonucleotídeo tem 3-6 nucleotídeos de comprimento.
40. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleotídeo é 3-100 nucleotídeos de comprimento.
41. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
oligonucleotídeo é 7-100 nucleotídeos de comprimento.
42. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 41, em que o oligonucleotídeo é rico em T. 43. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 42, em que o oligonucleotídeo inclui pelo menos 80% de T.
44. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compre- endendo pelo menos uma seqüência palindrômica.
45. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compre-
endendo duas seqüências palindrômicas.
46. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compre- endendo um a quatro dinucleotídeos de CG não-metilados.
47. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compre-
endendo pelo menos uma seqüência (G)m, em que m é 4 a 10.
48. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compre- endendo pelo menos um dinucleotídeo de CG metilado.
49. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 em que todos os dinucleotídeos de CG são não-metilados.
50. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compre-
endendo adicionalmente uma modificação não-nucleotídica.
51. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 50, em que a modificação não-nucleotídica é selecionada do grupo consistindo em C6- C48-polietilenoglicol, C3-C2o-alcano-diol, um Iigante de C3-Ci8-alquilamino e
um Iigante de C3-C18-alquiltiol.
52. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 50, em que a modificação não-nucleotídica é selecionada do grupo consistindo em co- Iesterol1 ácido biliar, ácido graxo saturado ou insaturado e folato.
53. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 50, em que
a modificação não-nucleotídica é um grupo hexadecil-glicerol ou di-
hexadecil-glicerol.
54. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 50, em que a modificação não-nucleotídica é um grupo octadecil-glicerol ou dioctadecil- glicerol.
55. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 50, em que
a modificação não-nucleotídica é um grupo vitamina E.
56. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, ainda compreendendo uma porção ramificada não-nucleotídica.
57. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, ainda compreendendo uma porção ramificada nucleotídica.
58. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, ainda compreendendo uma porção ramificada, em que oligonucleotídeos tem pelo
menos duas extremidades 5’.
59. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos dois nucleotídeos do oligonucleotídeo têm uma ligação estabili- zada.
60. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 59, em que
a ligação estabilizada é fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, metilfos- fonotioato boranofosfonato, fosforamidato ou uma ligação defosfo, quer co- mo uma mistura enantiomérica ou como uma configuração S ou R enantio- mérica pura.
61. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
YZ de RiYZR2 tem uma ligação de fosforodiéster.
62. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o YZ de RiYZR2 tem uma ligação de fosforotioato.
63. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
R-iY de RiYZR2 tem uma ligação de fosforotioato.
64. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o ZR2 de RiYZR2 tem uma ligação de fosforotioato.
65. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 61, em que todos os outros nucleotídeos têm uma ligação de fosforotioato.
66. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
oligonucleotídeo é isento de um microveículo.
67. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 66, em que o oligonucleotídeo é isento de um veículo lipídico.
68. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo da classe A.
69. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo da classe B. 70. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 69, em que o oligonucleotídeo da classe B tem a seqüência 5' TcN1TX1X2CGXsX4 3' em que X1 é G ou A X2 é T, G ou A, X3 é T ou C e X4 é T ou C e N é qualquer nucleotídeo e N1 e N2 são seqüências de ácido nucleico compostas de cerca
de 0-25 N’s cada.
71. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo da classe C.
72. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo da classe P.
73. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo da classe T.
74. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação 3-3’.
75. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o
oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação 5’-5’.
76. Método para indução de uma resposta imune compreenden- do contato de uma célula imune com um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 75.
77. Método de acordo com a reivindicação 76, em que a respos-
ta imune é uma indução de IFN-a.
78. Método de acordo com a reivindicação 76, ainda compreen- dendo um antígeno.
79. Método de acordo com a reivindicação 76, em que o oligo- nucleotídeo é distribuído através de uma através de selecionada do grupo
consistindo em oral, nasal, sublingual, intravenosa, subcutânea, mucosal, ocular, respiratória, injeção direta e intradermicamente.
80. Método de acordo com a reivindicação 76, em que o oligo- nucleotídeo ou a composição é distribuída ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir à expressão de citocina e/ou quimiocina.
81. Método de acordo com a reivindicação 76, ainda compreen-
dendo administração, ao indivíduo, de um modulador imune adicional.
82. Método de acordo com a reivindicação 76, em que o oligo- nucleotídeo é distribuído ao indivíduo para tratar doença autoimune no indi- víduo.
83. Método de acordo com a reivindicação 76, em que o oligo- nucleotídeo é distribuído ao indivíduo para tratar remodelamento das vias
aéreas no indivíduo.
84. Método de acordo com a reivindicação 76, em que o oligo- nucleotídeo é administrado sem um antígeno ao indivíduo.
85. Método para tratamento de um indivíduo tendo câncer com- preendendo:
administração, ao indivíduo, de um oligonucleotídeo como defi-
nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 75, em uma quantidade eficaz para tratar o câncer.
86. Método de acordo com a reivindicação 85, em que o câncer é selecionado do grupo consistindo em carcinoma de células basais, câncer
do trato biliar; câncer de bexiga; câncer ósseo; câncer de cérebro e CNS; câncer de mama; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto; câncer de tecido conectivo; câncer do sistema digestivo; câncer endometrial; câncer esofageal; câncer dos olhos; câncer da cabeça e do pescoço; câncer gástrico; neoplasma intraepitelial; câncer de rim; câncer da laringe; leucemia;
câncer de fígado; câncer de pulmão; linfoma, incluindo Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral; câncer ovariano; câncer pancreático; câncer de próstata; retinoblastoma; rhabdomiossarcoma; câncer retal; câncer renal; câncer do sistema respirató- rio; sarcoma; câncer de pele; câncer de estômago; câncer testicular; câncer
da tiróide; câncer uterino; câncer do sistema urinário e outros carcinomas e sarcomas.
87. Método de acordo com a reivindicação 85, ainda compreen- dendo administração, ao indivíduo, de um medicamento ou tratamento anti- câncer, por exemplo, agentes quimioterapêuticos, radiação.
88. Método de acordo com a reivindicação 85, em que o oligo-
nucleotídeo é distribuído através de uma através de selecionada do grupo consistindo em oral, nasal, sublingual, intravenosa, subcutânea, mucosal, ocular, respiratória, injeção direta e dermicamente.
89. Método de acordo com a reivindicação 85, em que o indiví- duo é tratado com cirurgia.
90. Método para o tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de ter uma infecção viral, compreendendo:
administração, ao indivíduo tendo ou em risco de ter uma infec- ção viral, de um oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 75, em uma quantidade eficaz para tratar a infecção viral.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, em que a infec- ção viral é causada pelo vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C
(HCV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da influenza, vírus sincicial respiratório (RSV) ou papiloma do vírus humano (HPV).
92. Método de acordo com a reivindicação 90, em que o oligo- nucleotídeo é distribuído através de uma através de selecionada do grupo
consistindo em oral, nasal, sublingual, intravenosa, subcutânea, mucosal, ocular, respiratória, injeção direta e dermicamente.
93. Método de acordo com a reivindicação 90, ainda compreen- dendo um agente antiviral.
94. Método de acordo com a reivindicação 90, em que o indiví- duo é não-responsivo a uma terapia antiviral de não-CpG.

Claims (1)

1.<formula>formula see original document page 203</formula> <table>table see original document page 204</column></row><table> <table><table> <table>table see original document page 206</column></row><table> <table>table see original document page 207</column></row><table> <table>table see original document page 208</column></row><table> <table>table see original document page 209</column></row><table> <table>table see original document page 210</column></row><table> <table>table see original document page 211</column></row><table> <table>table see original document page 212</column></row><table> <table>table see original document page 213</column></row><table> <table>table see original document page 214</column></row><table> <table>table see original document page 215</column></row><table> <table>table see original document page 216</column></row><table> <table>table see original document page 217</column></row><table> <table>table see original document page 218</column></row><table> <table>table see original document page 219</column></row><table> <table>table see original document page 220</column></row><table> <table>table see original document page 221</column></row><table> <table>table see original document page 222</column></row><table> <table>table see original document page 223</column></row><table> <table>table see original document page 224</column></row><table> <table>table see original document page 225</column></row><table> <table>table see original document page 226</column></row><table> <table>table see original document page 227</column></row><table> <table><table> <table>table see original document page 229</column></row><table> <table>table see original document page 230</column></row><table> <table>table see original document page 231</column></row><table> <table>table see original document page 232</column></row><table> <table>table see original document page 233</column></row><table> <table>table see original document page 234</column></row><table>
BRPI0717510A 2006-09-27 2007-09-27 análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada e composição farmacêutica que os compreende BRPI0717510B8 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84781106P 2006-09-27 2006-09-27
US60/847,811 2006-09-27
PCT/IB2007/004389 WO2008068638A2 (en) 2006-09-27 2007-09-27 Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0717510A2 true BRPI0717510A2 (pt) 2013-11-19
BRPI0717510B1 BRPI0717510B1 (pt) 2021-01-12
BRPI0717510B8 BRPI0717510B8 (pt) 2021-09-14

Family

ID=39492695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0717510A BRPI0717510B8 (pt) 2006-09-27 2007-09-27 análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada e composição farmacêutica que os compreende

Country Status (22)

Country Link
US (3) US8580268B2 (pt)
EP (2) EP2078080B1 (pt)
JP (2) JP5455629B2 (pt)
KR (2) KR101251707B1 (pt)
CN (1) CN101517082B (pt)
AU (1) AU2007330410B2 (pt)
BR (1) BRPI0717510B8 (pt)
CA (1) CA2664219C (pt)
DK (1) DK2078080T3 (pt)
ES (1) ES2544958T3 (pt)
HK (1) HK1133440A1 (pt)
HU (1) HUE027064T2 (pt)
IL (1) IL197549A (pt)
MX (1) MX2009003398A (pt)
NO (1) NO342465B1 (pt)
NZ (1) NZ575437A (pt)
PL (1) PL2078080T3 (pt)
PT (1) PT2078080E (pt)
RU (1) RU2477315C2 (pt)
SI (1) SI2078080T1 (pt)
WO (1) WO2008068638A2 (pt)
ZA (1) ZA200901735B (pt)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
AU4343700A (en) * 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
EP1404873B1 (en) * 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
ATE411054T1 (de) 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharm Gmbh Kombinations-motif-immunstimulierende oligonukleotide mit verbesserter wirkung
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
NZ535952A (en) 2002-04-04 2009-01-31 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
NZ540098A (en) 2002-10-29 2008-09-26 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
CN1849142A (zh) 2002-11-15 2006-10-18 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 2′－支链核苷和黄病毒突变
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
JP4989225B2 (ja) * 2003-09-25 2012-08-01 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 核酸親油性接合体
AU2004285561C1 (en) 2003-10-30 2012-06-21 Coley Pharmaceutical Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
KR101251707B1 (ko) * 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
CA2696460A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Pfizer Inc. Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
CN101820908A (zh) 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
US8541569B2 (en) * 2008-09-06 2013-09-24 Chemgenes Corporation Phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, efficient RNA synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA
WO2010064146A2 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
CN103025351B (zh) 2010-05-28 2016-08-24 佐蒂斯比利时股份有限公司 包含胆固醇和作为唯一的佐剂-载剂分子的cpg的疫苗
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
JP2014514295A (ja) 2011-03-31 2014-06-19 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
JP6128529B2 (ja) 2011-07-19 2017-05-17 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． 官能化核酸の合成のための方法
TW201329096A (zh) * 2011-09-12 2013-07-16 Idenix Pharmaceuticals Inc 經取代羰氧基甲基磷酸醯胺化合物及用於治療病毒感染之藥學組成物
WO2013177195A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3',5'-cyclic phosphate prodrugs for hcv infection
WO2013177188A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3',5'-cyclic phosphoramidate prodrugs for hcv infection
SG11201407674TA (en) 2012-05-22 2014-12-30 Idenix Pharmaceuticals Inc D-amino acid compounds for liver disease
JP6453212B2 (ja) 2012-07-13 2019-01-16 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． キラル制御
CA2879066C (en) 2012-07-13 2019-08-13 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
DK2872485T3 (da) 2012-07-13 2021-03-08 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
US9192621B2 (en) 2012-09-27 2015-11-24 Idenix Pharmaceuticals Llc Esters and malonates of SATE prodrugs
TR201809048T4 (tr) 2012-10-08 2018-07-23 Centre Nat Rech Scient Hcv enfeksiyonu için 2'-kloro nükleosit analogları.
AU2013346767B2 (en) 2012-11-15 2019-04-11 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
US9309275B2 (en) 2013-03-04 2016-04-12 Idenix Pharmaceuticals Llc 3′-deoxy nucleosides for the treatment of HCV
US20140271547A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Amino acid phosphoramidate pronucleotides of 2'-cyano, azido and amino nucleosides for the treatment of hcv
ES2894138T3 (es) * 2013-05-14 2022-02-11 Zoetis Services Llc Composiciones de vacuna novedosas que comprenden oligonucleótidos inmunoestimulantes
WO2014197578A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 1',4'-thio nucleosides for the treatment of hcv
US20150037282A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 Idenix Pharmaceuticals, Inc. D-amino acid phosphoramidate pronucleotides of halogeno pyrimidine compounds for liver disease
AU2014321369B2 (en) * 2013-09-19 2020-04-16 Zoetis Services Llc Oil-based adjuvants
CN105925583B (zh) * 2013-11-08 2019-05-17 上海交通大学 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
US11318200B2 (en) 2013-11-26 2022-05-03 Zoetis Services Llc Methods and compositions for induction of immune response
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
WO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
SG10201912897UA (en) 2014-01-16 2020-02-27 Wave Life Sciences Ltd Chiral design
EP3131914B1 (en) 2014-04-16 2023-05-10 Idenix Pharmaceuticals LLC 3'-substituted methyl or alkynyl nucleosides for the treatment of hcv
NZ734144A (en) 2014-12-31 2023-06-30 Checkmate Pharmaceuticals Inc Combination tumor immunotherapy
WO2016115456A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Zoetis Services Llc Foot-and-mouth disease vaccine
US10456459B2 (en) 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions
US20190194746A1 (en) * 2016-03-09 2019-06-27 Tokyo University Of Science Foundation Nucleic acid oligomer for rna hybrid formation
CA3175832A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Zoetis Services Llc Composition comprising infectious bursal disease antigens, immunostimulatory oligonucleotides in an oil emulsion
WO2017210647A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotides, compositions and methods thereof
GB201703529D0 (en) 2017-03-06 2017-04-19 Cambridge Entpr Ltd Vaccine composition
IL269970B (en) 2017-04-14 2022-09-01 Tallac Therapeutics Inc Polynucleotides that modulate the immune system, their antibody binding, and methods of using them
CN107090009B (zh) * 2017-04-14 2019-10-25 佛山科学技术学院 一种二糖核苷化合物及其制备方法
WO2019115385A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Bayer Animal Health Gmbh Immunostimulatory compositions
EP3727443A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Zoetis Services LLC Vaccines against hendra and nipah virus infection
US11639364B2 (en) 2018-01-29 2023-05-02 Stichting Radboud Universiteit Potent sialyltransferase inhibitors
TW202206098A (zh) 2020-08-11 2022-02-16 美商碩騰服務公司 抗冠狀病毒疫苗
WO2024077025A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Zoetis Services Llc Poultry vaccines and methods of protecting poultry

Family Cites Families (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
JP2547714B2 (ja) 1981-10-23 1996-10-23 モルキユラ− バイオシステムズ インコ−ポレテツド オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法
CA1339596C (en) 1987-08-07 1997-12-23 New England Medical Center Hospitals, Inc. Viral expression inhibitors
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
JP3507486B2 (ja) 1991-03-15 2004-03-15 アムジエン・インコーポレーテツド 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与
CA2140542A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Abeysingle Padmapriya Oligonucleotide alkylphosphonothioates
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030050263A1 (en) 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US6030955A (en) 1996-03-21 2000-02-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York And Imclone Systems, Inc. Methods of affecting intracellular phosphorylation of tyrosine using phosphorothioate oligonucleotides, and antiangiogenic and antiproliferative uses thereof
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
EP1537877A3 (en) 1996-10-11 2005-08-03 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
AU738513B2 (en) 1997-02-28 2001-09-20 University Of Iowa Research Foundation, The Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
WO1998052962A1 (en) 1997-05-19 1998-11-26 Merck & Co., Inc. Oligonucleotide adjuvant
US6339068B1 (en) 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US20040006034A1 (en) 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
WO1999001154A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
ATE356630T1 (de) 1998-04-03 2007-04-15 Univ Iowa Res Found Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
JP2002513763A (ja) 1998-05-06 2002-05-14 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション Ｃｐｇオリゴヌクレオチドを使用して寄生生物感染および関連する疾患を予防および処置するための方法
DE69927495T2 (de) 1998-05-14 2006-07-06 Coley Pharmaceutical Group, Inc., Wellesley Verfahren zur regulieren der hämatopoese mit hilfe von cpg-oligonukleotiden
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20040247662A1 (en) 1998-06-25 2004-12-09 Dow Steven W. Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
JP2002521489A (ja) 1998-07-27 2002-07-16 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体および関連する方法
EP1108017A2 (en) 1998-09-03 2001-06-20 Coley Pharmaceutical GmbH G-motif oligonucleotides and uses thereof
FR2783170B1 (fr) 1998-09-11 2004-07-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Emulsion immunostimulante
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
AU3760100A (en) 1999-03-16 2000-10-04 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
AU4343700A (en) 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
ATE275727T1 (de) 1999-04-29 2004-09-15 Coley Pharm Gmbh Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna
OA11937A (en) 1999-05-06 2006-04-12 Immune Response Corp Inc HIV immunogenic compositions and methods.
EP1377554A1 (en) 1999-06-16 2004-01-07 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
JP5268214B2 (ja) 1999-08-13 2013-08-21 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ−媒体免疫刺激の変調
DE60022665T2 (de) 1999-09-25 2006-06-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunstimulierende nukeinsäuren
JP2003510290A (ja) 1999-09-27 2003-03-18 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激核酸誘導インターフェロンに関する方法
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
AU2593701A (en) 1999-12-21 2001-07-03 Regents Of The University Of California, The Method for preventing an anaphylactic reaction
CA2396871A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
AU783687B2 (en) 2000-01-26 2005-11-24 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
ATE292638T1 (de) * 2000-05-01 2005-04-15 Hybridon Inc Modulation von oligonukleotid cpg-vermittelter immunstimulation durch modifikation der nucleoside
WO2001085751A1 (en) 2000-05-09 2001-11-15 Reliable Biopharmaceutical, Inc. Polymeric compounds useful as prodrugs
WO2001093902A2 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
AU7013401A (en) 2000-06-22 2002-01-02 Univ Iowa Res Found Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
AU2001291096A1 (en) 2000-09-15 2002-03-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Process for high throughput screening of CpG-based immuno-agonist/antagonist
WO2002026757A2 (en) 2000-09-26 2002-04-04 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
FR2814958B1 (fr) 2000-10-06 2003-03-07 Aventis Pasteur Composition vaccinale
GB0025577D0 (en) 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1350262B8 (en) 2000-12-08 2008-08-13 Coley Pharmaceuticals GmbH Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
AU2002248185A1 (en) 2000-12-14 2002-07-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
EP1404873B1 (en) 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
EP1420829A4 (en) 2001-08-07 2006-05-17 Dynavax Tech Corp IMMUNOMODULATING COMPOSITIONS, FORMULATIONS AND METHOD FOR THEIR USE
ATE411054T1 (de) * 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharm Gmbh Kombinations-motif-immunstimulierende oligonukleotide mit verbesserter wirkung
BR0213097A (pt) 2001-10-05 2005-02-01 Coley Pharm Gmbh Agonistas e antagonistas sinalizadores do receptor 3 similar a toll
EP1478371A4 (en) 2001-10-12 2007-11-07 Univ Iowa Res Found METHODS AND PRODUCTS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSES USING IMIDAZOQUINOLINE COMPOUND
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
AU2003203079B8 (en) 2002-02-04 2009-01-15 Oncothyreon Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
NZ535952A (en) 2002-04-04 2009-01-31 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
CN101160399A (zh) 2002-04-22 2008-04-09 拜奥尼茨生命科学公司 寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用
JP2005532315A (ja) 2002-05-10 2005-10-27 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション メチル化免疫刺激性オリゴヌクレオチド及びその使用方法
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
AU2003243409A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AU2003247880B2 (en) * 2002-07-03 2010-09-02 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AU2003255969A1 (en) 2002-07-17 2004-02-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
CN1688192B (zh) * 2002-08-19 2012-07-18 科勒制药集团有限公司 免疫刺激核酸
WO2004026888A2 (en) 2002-09-19 2004-04-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
NZ540098A (en) 2002-10-29 2008-09-26 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
EP1625140A4 (en) 2002-12-23 2008-06-18 Dynavax Tech Corp BRANCHED IMMUNOMODULAR COMPOUNDS AND METHOD OF USE THEREOF
CA2512484A1 (en) 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US20040235770A1 (en) 2003-04-02 2004-11-25 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use
WO2005016235A2 (en) 2003-04-14 2005-02-24 The Regents Of The University Of California Combined use of impdh inhibitors with toll-like receptor agonists
EP1631687A2 (en) 2003-04-22 2006-03-08 Coley Pharmaceutical GmbH Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
WO2004103301A2 (en) 2003-05-16 2004-12-02 Hybridon, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with chemotherapeutic agents
EP2371834B1 (en) 2003-06-11 2016-02-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
JP2007524615A (ja) 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
CA2530062A1 (en) 2003-07-11 2005-01-20 Intercell Ag Hcv vaccines
US20050013812A1 (en) 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
JP2007531699A (ja) 2003-07-15 2007-11-08 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー化合物をサイトカインおよび／または化学療法剤または放射線療法と組み合わせて用いる、免疫系の相乗的刺激
WO2005023289A1 (ja) 2003-09-08 2005-03-17 Intellectual Property Consulting Incorporated 慢性ｃ型肝炎を治療するための医薬組成物
JP4989225B2 (ja) 2003-09-25 2012-08-01 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 核酸親油性接合体
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
AU2004285561C1 (en) 2003-10-30 2012-06-21 Coley Pharmaceutical Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
CA2549173A1 (en) 2003-12-08 2005-07-07 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
EP1720568A2 (en) 2004-02-19 2006-11-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral rna oligonucleotides
EP1729802A4 (en) 2004-03-12 2009-12-16 Hybridon Inc ENHANCED HIV VACCINE ACTIVITY USING SECOND GENERATION IMMUNOMODULATORY OLIGONUCLEOTIDE
EP1730281A2 (en) 2004-04-02 2006-12-13 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
WO2006080946A2 (en) 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
EP1765417A4 (en) 2004-06-15 2009-03-25 Idera Pharmaceuticals Inc MULTIMERS OF OLIGONUCLEOTIDES IMMUNOSTIMULATORS
EP2484374A1 (en) 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
US20070129320A9 (en) 2004-07-18 2007-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US20080009455A9 (en) 2005-02-24 2008-01-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
MEP44608A (en) 2005-04-08 2011-02-10 Coley Pharm Group Inc Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20060241076A1 (en) 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
AU2006269555A1 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
CN101321868A (zh) 2005-09-16 2008-12-10 科利制药公司 通过核苷酸修饰调节短干扰核糖核酸(siRNA)的免疫刺激特性
CA2622679A1 (en) 2005-09-16 2007-08-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
AU2006306521B2 (en) 2005-10-21 2011-12-22 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. The induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in dendritic cells by TLR ligands and uses thereof
US20070093439A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US7470674B2 (en) 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
US7662949B2 (en) 2005-11-25 2010-02-16 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
CA2632940A1 (en) 2005-12-20 2007-07-05 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory activity of palindromic immune modulatory oligonucleotides (imo tm) contiaining different lengths of palindromic segments
JP5473336B2 (ja) 2006-02-15 2014-04-16 アディウタイド・ファーマスーティカルズ・ゲーエムベーハー オリゴヌクレオチドの処方に関する組成物および方法
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
JP2010504982A (ja) 2006-09-27 2010-02-18 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｔｌｒのリガンドと抗ウイルス剤との組成物
KR101251707B1 (ko) * 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
KR20090058584A (ko) 2006-10-26 2009-06-09 콜리 파마슈티칼 게엠베하 올리고리보뉴클레오티드 및 그의 용도
WO2008057529A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (cetp)
EP2160199A2 (en) 2007-05-17 2010-03-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Class a oligonucleotides with immunostimulatory potency
CN101820908A (zh) 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
US9968305B1 (en) 2014-10-02 2018-05-15 James S Brown System and method of generating music from electrical activity data

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0717510B8 (pt) 2021-09-14
JP2010504750A (ja) 2010-02-18
ES2544958T3 (es) 2015-09-07
CA2664219A1 (en) 2008-06-12
WO2008068638A2 (en) 2008-06-12
DK2078080T3 (en) 2015-08-24
KR20130014620A (ko) 2013-02-07
NZ575437A (en) 2012-02-24
MX2009003398A (es) 2009-08-12
HUE027064T2 (hu) 2016-09-28
CN101517082B (zh) 2014-01-22
KR101251707B1 (ko) 2013-04-11
EP2078080B1 (en) 2015-06-17
US20160348115A1 (en) 2016-12-01
PL2078080T3 (pl) 2015-12-31
EP2078080A2 (en) 2009-07-15
HK1133440A1 (en) 2010-03-26
US9382545B2 (en) 2016-07-05
KR20090058581A (ko) 2009-06-09
EP2960332A1 (en) 2015-12-30
JP6006183B2 (ja) 2016-10-12
NO342465B1 (no) 2018-05-28
CA2664219C (en) 2013-12-17
CN101517082A (zh) 2009-08-26
BRPI0717510B1 (pt) 2021-01-12
AU2007330410A8 (en) 2012-05-03
NO20091218L (no) 2009-04-21
US20100166780A1 (en) 2010-07-01
ZA200901735B (en) 2010-05-26
JP2014036652A (ja) 2014-02-27
RU2477315C2 (ru) 2013-03-10
US10260071B2 (en) 2019-04-16
AU2007330410B2 (en) 2012-07-26
IL197549A (en) 2016-04-21
JP5455629B2 (ja) 2014-03-26
IL197549A0 (en) 2011-08-01
US8580268B2 (en) 2013-11-12
WO2008068638A8 (en) 2011-12-22
PT2078080E (pt) 2015-09-18
US20140163213A1 (en) 2014-06-12
SI2078080T1 (sl) 2015-09-30
AU2007330410A1 (en) 2008-06-12
RU2009109098A (ru) 2010-11-10
WO2008068638A3 (en) 2008-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10260071B2 (en) CpG oligonucleotide analogs containing hydrophobic T analogs with enhanced immunostimulatory activity
ES2486298T3 (es) Análogos de oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen azúcares modificados
US20060211644A1 (en) Immunostimulatory oligonucleotides
ES2544484T3 (es) Análogos de oligonucleótidos modificados con fosfato con actividad inmunoestimulante

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06T Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 12/01/2021, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: COLEY PHARMACEUTICAL GMBH (DE)

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: PFIZER INC. (US)

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 25/09/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: REF. RPI 2610 DE 12/01/2021 QUANTO A DATA DE DEPOSITO.

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: PFIZER INC. (US)