NO342465B1 - CPG-oligonukleotidanaloger inneholdende hydrofobe T-analoger med forbedret immunstimulatorisk aktivitet - Google Patents

CPG-oligonukleotidanaloger inneholdende hydrofobe T-analoger med forbedret immunstimulatorisk aktivitet Download PDF

Info

Publication number
NO342465B1
NO342465B1 NO20091218A NO20091218A NO342465B1 NO 342465 B1 NO342465 B1 NO 342465B1 NO 20091218 A NO20091218 A NO 20091218A NO 20091218 A NO20091218 A NO 20091218A NO 342465 B1 NO342465 B1 NO 342465B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
oligonucleotide
cancer
seq
odn
class
Prior art date
Application number
NO20091218A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20091218L (no
Inventor
Eugen Uhlmann
Marion Jurk
Harald Debelak
Original Assignee
Coley Pharm Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharm Gmbh filed Critical Coley Pharm Gmbh
Publication of NO20091218L publication Critical patent/NO20091218L/no
Publication of NO342465B1 publication Critical patent/NO342465B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Det beskrives oligonukleotider som omfatter minst en lipofilisk substituert nukleotid-5 analog og en pyrimidin-purin dinukleotid. Det beskrives også farmasøytiske sammensetninger og fremgangsmåter for anvendelse derav.

Description

OMRÅDET FOR OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt området immunologi. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen terapeutiske oligonukleotider med forsterket immunstimulatoriske kapasitet.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Bakterielt DNA har immunstimulatoriske effekter i å aktivere B-celler og naturlige drepeceller, men vertebrat-DNA ikke gjør dette (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res.79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol.147:1759-1764; and reviewed in Krieg, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp.431-448). Det er nå forstått at disse immunstimulatoriske effekter av bakterielt DNA er et resultat av nærvær av ikke-metylert CpG-dinukleotider i bestemte basekontekster (CpG-motiv), som er vanlig i bakterielt DNA, men metylert og underrepresentert i vertebrat DNA (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). De immunstimulatoriske effekter av bakterielt DNA kan etterliknes med syntetiske oligodeoksynukleotider (ODN) som inneholder disse CpG motiv. Slik CpG ODN har høyeste stimulatoriske effekter på humane og murine leukocytter, inkluderende B-celle proliferasjon; cytokinog immunglobulinsekresjon; naturlig drepe (NK) cellelytisk aktivitet og IFN-γ-sekresjon; og aktivering av dendrittceller (DCer) og andre antigenpresenterende celler i å uttrykke ko-stimulatoriske molekyler og utskiller cytokiner, spesielt Th1-liknende cytokiner som er viktige i å fremme utvikling av Th1-liknende T-celleresponser. Disse immunstimulatoriske effekter av nativ fosfodiester backbone CpG ODN er sterkt CpG-spesifikke idet disse effekter dramatisk reduseres dersom CpG-motivet metyleres, forandres til en GpC, eller på annen måte elimineres eller forandres (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10).
I tidligere studier var det tenkt at den immunstimulatoriske CpG-motiv fulgte formelen purin-purin-CpG-pyrimidin-pyrimidin (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol.156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J.17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol.6:496-500). Det er imidlertid nå klart at muselymfocytter responderer ganske godt til fosfodiester CpG-motiv som ikke følger denne "formel" (Yi et al., 1998 J. Immunol.160:5898-5906) og det samme tilfellet for humane B-celler og dendrittceller (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest.98:1119-1129).
Immunstimulatoriske oligonukleotider er beskrevet i WO05/030259, Tsao et al., Biochemistry, 1991, Vol.30, Nr.18, side 4565-4572, WO01/83503, Eugen et al, Current opinion in drug discovery and Development, GB2003, Vol.6, Nr.2, sider 204-217, og Iyer et al, Current opinion in molecular theapetics.1999, Vol.1, Nr.3, sider 344-359.
Flere forskjellige klasser CpG nukleinsyrer er nylig blitt beskrevet. En klasse er potent for aktivering av B-celler men er relativ svak i å indusere IFN-α og NK-celleaktivering; og denne klasse har blitt benevnt B-klassen. B-klasse CpG nukleinsyrer er typisk fullt stabilisert og inkluderer en ikke-metylert CpG dinukleotid innen visse foretrukne basekontekster. Se for eksempel US patenter nr. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116 og 6,339,068. En klasse CpG nukleinsyrer aktiverer B-celler og NK-celler og induserer IFN-α; denne klasse har blitt benevnt C-klasse. C-klasssen CpG nukleinsyrer, som først karakterisert, er typisk fullstendig stabilisert, inkluderer en B-klassetype sekvens og en GC-rik palindrom eller nær-palindrom. Denne klasse har blitt beskrevet i ko-pending US provisorisk patentsøknad 60/313,273, innsendt 17. august 2001 og US10/224,523 av 19. august 2002 og beslektet PCT patentsøknad PCT/US02/26468 publisert under internasjonalt publiseringsnummer WO 03/015711.
SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse vedrører et oligonukleotid som omfatter én eller flere modifiseringer som utløser forsterket immunstimulatorisk kapasitet. Nærmere bestemt, oppfinnelsen er basert på funn om at spesifikke underklasser av oligonukleotider som har minst én lipofil substituert nukleotidanalog er sterkt effektive i å mediere immunrespons. Disse oligonukleotider er nyttige terapeutiske og profylaktiske for å indusere en immunrespons og for å behandle sykdommer og forstyrrelser så som cancer og virusinfeksjoner.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører i et aspekt et oligonukleotid omfattende sekvensen R1YZR2hvor R1og R2er valgt blant gruppen som består av en lipofil substituert nukleotidanalog (L), et nukleotid, og en binding, hvor minst én av R1og R2er en lipofil substituert nukleotidanalog (L), hvor Y er cytosin og hvor Z er guanin, hvor (L) er valg blant 5-klor-uracil, 5-brom-uracil, 5-iod-uracil, 5-etyluracil og (E)-5-(2-bromvinyl)-uracil, med den forutsetning at nevnte oligonukleotid ikke er d[GCGAA(BrU)(BrU)CGC] hvor BrU er 5-brom-uracil.
Foretrukne utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 2-8.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av et oligonukleotid som angitt over for å indusere en immunrespons, for å behandle cancer, og for å hindre eller behandle en virusinfeksjon. Ytterligere utførelse av disse aspekter er angitt i underkravene 10, 12 og 14.
I et aspekt omfatter beskrivelsen en sammensetning som omfatter sekvensen: R1YZR2, hvor R1og R2representerer en lipofil substituert nukleotidanalog (L), et nukleotid, og en binding, hvor minst en av R1og R2er en lipofil substituert nukleotidanalog (L), hvor Y er et pyrimidinnukleotid og Z er en purin, en pyrimidin eller en abasisk rest.
I noen utførelser omfatter L en 5- eller 6-leddet ring nukleobaseanalog.
I andre utførelser av dette aspekt av beskrivelsen er L en gruppe av formel I
Formel 1
som har følgende elementer: A, B, X, D, E og F er C (karbon) eller N (nitrogen) som valgfritt bærer hydrogen eller en substituent; n er 0 eller 1; de prikkete linjer indikerer valgfrie dobbeltbindinger; hvor minst én substituent ikke er valgt blant gruppen som består av okso, tio, hydroksy, merkapto, imino, amino, metyl og hydrogen, og at det totale atomer A, B, X, D, E og F ikke er mer enn 3 nitrogen (N). I noen tilfeller er n lik 1, og i andre tilfeller er n lik 0. I noen utførelser er alle atomer A, B, X, D, E og F karbon (C). I noen utførelser er en, to eller tre av atomene A, B, X, D, E og F nitrogen (N). I samsvar med noen utførelser er minst et av atomene A, B, X, D, E og F substituert med én av følgende: F, Cl, Br, I, alkyl, alkenyl, alkinyl, halogenert alkyl, halogenert alkenyl, cykloalkyl, O-alkyl, O-alkenyl, -NH-alkyl, -N(alkyl)2; -S-alkyl, -SO-alkyl, -SO2-alkyl, nitro, cyano, karboksylester, fenyl, tiofenyl, benzyl, okso, tio, hydroksy, merkapto og umuno, hvor minst én substituent ikke er okso, tio, hydroksy, merkapto, umuno, amino eller metyl. I samsvar med andre utførelser er et av de to atomer A eller E substituert med én av følgende: F, Cl, Br, I, C2-C6-alkyl, alkenyl, alkinyl, halogenert alkyl, halogenert alkenyl, cykloalkyl, O-alkyl, O-alkenyl, -NH-alkyl, -N(alkyl)2; -S-alkyl, -SO-alkyl, -SO2-alkyl, nitro, cyano, karboksylester, fenyl, tiofenyl, benzyl eller metyl, med den forutsetning at dersom de er metyl så er A, B, X, D, E, og F alle C.
I noen utførelser omfatter formel I en substituert pyrimidin, uracil, toluen, imidazol eller pyrazol eller triazol. I samsvar med andre utførelser, formel I er valgt blant følgende: 5-kloruracil, 5-bromuracil, 5-joduracil, 5-etyluracil, 5-propyluracil, 5-propinyluracil, (E)-5-(2-bromvinyl)-uracil og 2.4-difluor-toluen. I samsvar med én utførelse av beskrivelsen er formel I fusjonert med en 3- til 6-leddet aromatisk eller alifatisk ringsystem. I samsvar med andre utførelser er formel I koblet til en 5- til 6-leddet sukkerenhet, inkluderende en pentose eller heksose. I noen tilfeller er pentosen en furanose og heksosen er en pyranose, som valgfritt kan være substituert av F, amino, alkoksy, alkoksy-etoksy, amonipropyl, alkenyl, alkinyl, eller en O2, C4-alkylenbro. I andre tilfeller er furanosen ribose eller deoksyribose.
I samsvar med noen utførelser av foreliggende beskrivelse er R1og R2begge L. I andre utførelser er R1L og R2er et nukleotid. Alternativt, i noen tilfeller er R1en L og R2er en binding, slik at oligonukleotidet omfatter en struktur 5'R1CG 3'. Andre utførelser inkluderer nukleotid hvor R1er L og R2er en binding, og hvor en R3er 5' til R1YZ, slik at oligonukleotidet omfatter en struktur 5’ R3R1YZ 3’. I noen utførelser er R1L og R2er en binding, og hvor en andre R1er 5' til R1YZ i en avstand av en nukleotid N, slik at oligonukleotidet omfatter en struktur 5' R1NR1YZ 3'. I noen tilfeller kan oligonukleotidet inkludere to 5' R1NR1YZ 3'- motiver.
I samsvar med noen utførelser inkluderer oligonukleotidet Y som er én av følgende pyrimidiner: cytosin, 5-metylcytosin, 5-hydroksycytosin, 5-hydroksymetylcytosin, 5-halogencytosin, 2-tiocytosin, 4-tiocytosin, N3-metylcytosin, N4-alkylcytosin eller en 6-substituert cytosin.
I samsvar med noen utførelser inkluderer oligonukleotidet Z som er en purin molekyl inkluderende: guanin, 7-deazaguanin, hypoksantin, 7-deazahypoksantin, 2-aminopurin, 4-tiopurin, 2.6-diaminopurin, 8-okso-7.8-dihydroguanin, 7-tia-8-okso-7.8-dihydroguanin, 7-allyl-8-okso-7.8-dihydroguanin, 7-deaza-8-azaguanin, 8-aza-guanin, N1-metylguanin eller purin. I andre utførelser er Z et pyrimidinnukleotid, inkluderende T.
I samsvar med noen utførelser av oppfinnelsen er R2L og R1er et nukleotid.
I samsvar med noen utførelser er oligonukleotidet mellom 3-100 nukleotider i lengde; for eksempel er oligonukleotidet 3-6 nukleotider i lengde, 3-100 nukleotider i lengde, eller 7-100 nukleotider i lengde. Under noen tilfeller er oligonukleotidet T-rikt, slik at minst 80% av nukleotidene er T.
Oppfinnelsen inkluderer utførelser som omfatter minst en palindrom sekvens. For eksempel, i noen tilfeller, inkluderer oligonukleotidet to palindrome sekvenser.
I samsvar med oppfinnelsen, inkluderer noen utførelser én til fire ikke-metylerte CG-dinukleotider. I noen utførelser kan oligonukleotidet inkludere minst en (G)m-sekvens, hvor m er 4 til 10. I noen tilfeller, er minst én og opp til alle CG dinukleotider ikke-metylert. I samsvar med noen utførelser, oligonukleotidet kan valgfritt omfatte en ikke-nukleotidisk modifisering. Ikke-nukleotidiske modifiseringer inkluderer, men er ikke begrenset til: C6-C48-polyetylenglycol, C3-C20-alkandiol, C3-C18-alkylamino- linker, C3-C18-alkyltio-linker, kolesterol, gallesyrer, mettede eller umettede fettsyrer, folat, en heksadecylglyserol eller diheksadecylglycerol-gruppe, en oktadecylglycerol- eller dioktadecylglycerol-gruppe, en vitamin E-gruppe. I andre utførelser omfatter oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen ytterligere en ikke-nukleotidisk forgreningsenhet eller en nukleotidisk forgreningsenhet. I noen utførelser, inkluderer oligonukleotidet en forgreningsenhet, hvor oligonukleotidene har minst to 5'-ender.
I samsvar med oppfinnelsen, noen utførelser inkluderer minst to nukleotider av oligonukleotidene som har en stabilisert binding, inkluderende: fosforotioat, fosforoditioat, metylfosfonat, metylfosfonotioat boranofosfonat, fosforamidat eller en defosfobinding, enten som en enantiomerisk blanding eller som en enantiomerisk ren S- eller R-konfigurasjon.
I ytterligere utførelser har YZ en R1YZR2en fosfodiester binding eller en fosforotioat-binding. I noen tilfeller, har R1Y og/eller ZR2av R1YZR2en fosforotioatisk binding. I noen utførelser har alle andre nukleotider en fosforotioatisk binding.
I samsvar med noen utførelser av foreliggende oppfinnelse er oligonukleotidet fritt for mikrobærer, inkluderende en lipidbærer.
I samsvar med beskrivelsen, oligonukleotidene kan være en A-klasse oligonukleotid, en B-klasse oligonukleotid, en C-klasse oligonukleotid, en P-klasse oligonukleotid eller en T-klasse oligonukleotid. For B-klasse oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen inkluderer noen utførelser sekvensen 5' TCN1TX1X2CGX3X43', hvor X1er G eller A; X2er T, G eller A; X3er T eller C og X4er T eller C; og N er ethvert nukleotid, og N1og N2er nukleinsyresekvenser på ca.0,25 N'er hver.
I samsvar med noen utførelser av oppfinnelsen, oligonukleotidet omfatter minst én 3'-3'-binding og/eller minst én 5'-5'-binding.
I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen så omfattes en sammensetning av oligonukleotidet beskrevet heri i kombinasjon med et antigen eller en annen terapeutisk forbindelse, så som et antimikrobielt middel. Det antimikrobielle middel kan for eksempel være et antiviralt middel, et antiparasittisk middel, et antibakterielt middel eller et antifungalt middel.
En sammensetning for forlenget frigivelse inkluderende oligonukleotidene beskrevet heri tilveiebringes i samsvar med et annet aspekt av oppfinnelsen.
Sammensetningen kan valgfritt inkludere en farmasøytisk bærer og/eller formuleres i en avgivelsesanordning. I noen utførelser er angivelsesanordningen valgt blant gruppen som består av kationiske lipider, cellepermeerende proteiner og anordninger for forlenget frigivelse. I én utførelse er anordningen for forlenget frigivelse en bionedbrytbar polymer eller en mikropartikkel.
I samsvar med et ytterligere aspekt av oppfinnelsen beskrives en framgangsmåte for å stimulere en immunrespons. Framgangsmåten involverer å administrere et oligonukleotid til et individ i en mengde som er effektiv i å indusere en immunrespons til individet. Fortrinnsvis administreres oligonukleotidet oralt, lokalt eller i en anordning for forlenget frigivelse, mukosalt, systemisk, parenteralt eller intramuskulært. Idet oligonukleotidet administreres til den mukosale overflate, kan det avgis i en mengde effektiv for å indusere en mukosal immunrespons eller en systemisk immunrespons. I foretrukne utførelser er den mukosale overflate valgt blant gruppen som består av oral, nasal, rektal, vaginal og okular overflate.
I noen utførelser inkluderer framgangsmåten å eksponere individet til et antigen hvor immunresponsen er en antigenspesifikk immunrespons. I noen utførelser er antigenet valgt blant gruppen som består av et tumorantigen, et viralt antigen, et bakterielt antigen, et parasittisk antigen og et peptid antigen.
Oligonukleotidene er nyttige i å behandle cancer i et individ som har cancer eller som har risiko for å utvikle cancer (for eksempel ved å redusere en risiko for å utvikle cancer). Canceren kan være valgt blant gruppen som består av gallecancer, brystcancer, cervikal cancer, koriokarsinom, tarmcancer, endometrial cancer, gastrisk cancer, intraepitelial neoplasma, lymfomaer, levercancer, lungecancer (for eksempel småcelle og ikke-småcelle), melanom, nevroblastom, oral cancer, eggstokkcancer, pankreatisk cancer, prostatacancer, rektal cancer, sarkomaer, tyriod cancer og renal cancer, og likeledes andre karsinomaer og sarkomaer. I noen viktige utførelser er canceren valgt blant gruppen som består av bencancer, hjerne- og CNS-canser, bindevevscancer, esofageal cancer, øyecancer, Hodgkins lymfom, larynsk cancer, oral kavitetcancer, hudcancer og testikkulær cancer.
Oligonukleotidene kan også anvendes for å øke responsiviteten av en cancercelle til en cancerterapi (for eksempel en anti-cancerterapi), valgfritt idet CpG-immunstimulatorisk oligonukleotid administreres i forbindelser med en anticancerterapi. Anticancerterapien kan være en kjemoterapi, en vaksine (for eksempel en in vitro-primet dendrittcellevaksine eller en cancerantigenvaksine) eller en antistoffbasert terapi. Den siste terapi kan også involvere administrering av et antistoff som er spesifikk for et celleoverflateantigen, for eksempel en cancercelle, hvor immunresponsen resulterer i antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). I én utførelse kan antistoffet være valgt blant gruppen som består av Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab og ImmuRAIT-CEA.
Således, i samsvar med noen av aspekt av oppfinnelsen, et individ som har cancer eller risiko for å utvikle cancer, administreres et oligonukleotid og en anti-cancerterapi. I noen utførelser er anticancerterapien valgt blant gruppen som består av kjemoterapeutisk middel, immunterapeutisk middel og en cancervaksine.
Oppfinnelsen beskriver i ytterligere aspekter framgangsmåter for å hindre sykdom i et individ.
Framgangsmåten involverer å administrere til individet et oligonukleotid på regulær basis for å fremme immunsystemresponsivitet for å hindre sykdom i individet. Eksempler på sykdommer eller tilstander som søkes hindret ved anvendelse av profylaktiske framgangsmåter ifølge oppfinnelsen inkluderer mikrobielle infeksjoner (seksuelt overførte sykdommer) og anafylaktisk sjokk fra matallergier.
I ytterligere aspekter av foreliggende oppfinnelse er framgangsmåter for å redusere en iboende immunrespons ved å administrere til individet et oligonukleotid i en mengde tilstrekkelig å aktivere en iboende immunrespons.
I samsvar med andre aspekter av foreliggende oppfinnelse beskrives en framgangsmåte for å behandle en viral eller retroviral infeksjon. Framgangsmåten involverer å administrere til et individ som har en risiko for å ha en viral eller retroviral infeksjon, en effektiv mengde for å behandle den virale eller retrovirale infeksjon av ethvert av sammensetningene ifølge oppfinnelsen. I noen utførelser er viruset forårsaket av hepatittvirus, for eksempel hepatitt B, hepatitt C, HIV, herpesvirus eller papillomvirus.
En framgangsmåte for å behandle en bakteriell infeksjon tilveiebringes i et ytterligere aspekt av oppfinnelsen. Framgangsmåten involverer å administrere til et individ som har risiko for å ha en bakteriell infeksjon, en effektiv mengde for å behandle den bakterielle infeksjon av ethvert av sammensetningene ifølge oppfinnelsen. I én utførelse skyldes den bakterielle infeksjon en intracellulær bakterie.
I et annet aspekt beskrives en framgangsmåte for å behandle en parasittinfeksjon ved å administrere til et individ som har en risiko for å ha en parasittinfeksjon, en effektiv mengde for å behandle parasittinfeksjonen av enhver av sammensetningene ifølge oppfinnelsen. I én utførelse skyldes parasittinfeksjonen en intracellulær parasitt. I en annen utførelse er parasittinfeksjonen grunnet i en ikke-helmintisk parasitt.
I noen utførelser er individet et menneske og i andre utførelser er individet et ikke-humant vertebrat valgt blant gruppen som består av hund, katt, hest, ku, gris, kalkun, geit, fisk, ape, kylling, rotte, mus og sau.
I et annet aspekt beskriver oppfinnelsen en framgangsmåte for å behandle autoimmun sykdom ved å administrere til individet som har risiko for å ha en autoimmun sykdom en effektiv mengde for å behandle eller hindre en autoimmun sykdom av enhver sammensetning ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen er i noen aspekter beskriver framgangsmåter for å behandle luftveis remodellering, astma eller allergi omfattende å administrere til et individ et hvert av sammensetningene ifølge oppfinnelsen i en effektiv mengde til å behandle luftveis remodellerende astma eller allergi i individet. I én utførelse har individet astma, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom eller er en røyker. I andre utførelser er individet fri for symptomer av astma.
Anvendelse av et oligonukleotid ifølge oppfinnelsen for å stimulere en immunrespons tilveiebringes også som et aspekt ifølge oppfinnelsen.
En framgangsmåte for å framstille et medikament av et oligonukleotid ifølge oppfinnelsen for å stimulere en immunrespons tilveiebringes også.
Hver av begrensningene av oppfinnelsen kan omfatte forskjellige utførelser av oppfinnelsen. Det antesiperes derfor at hver av begrensningene av oppfinnelsen som involverer ethvert et element eller kombinasjoner av elementer kan inkluderes i hvert aspekt av oppfinnelsen. Videre, fraseologi og terminologi som anvendes heri, har som formål å beskrive og skal ikke anses som begrensende. Anvendelse av "inkluderende", "omfattende" eller som "har", "inneholder", "involverer" og variasjoner derav menes å omfatte enhetene angitt deri og likeledes ytterligere enheter.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 er to bilder som illustrerer strukturen av den modifiserte base ifølge oppfinnelsen. Figur 1a viser en seksjon av en CpG haksamer motiv (GTCGTT). Figur 1b viser den inkorporerte hydrofobiske formanalog av 2’-deoksytymidin: 2,4-difluortoluen (FF), 5-bromuridin (BU) og 5-joduridin (JU).
Figur 2 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med B-klasse oligonukleotider (ODN) modifisert med tyminformanalog 2-4 difluortoluen (FF). Aktiviteten av FF-modifisert ODN (SEQ ID NO:3-9) ble sammenliknet med ikke-modifisert B-klasse morsekvens (SEQ ID NO:1), fullstendig PS morsekvens (SEQ ID NO:2), og en tredje ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37). hTLR9-LUC-293-celler ble stimulert med angitte mengder av ODN og NF-κB-stimulering ble bestemt ved å måle luciferaseaktivitet 16 t senere. X-aksen er log ODN konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 3 er en graf som viser resultatet av en luciferaseanalyse med modifisert B-klasse ODN. Tymidin (T) ble substituert med 5-brom-2’-deoksyuridin (BU) (SEQ ID NO:10-12) og 5-jod-2’-deoksyuridin (JU) (SEQ ID NO:13-15). Deres aktivitet ble sammenliknet med ikke-modifisert B-klasse morsekvens (SEQ ID NO:1), fullstendig PS morsekvens (SEQ ID NO:2), og en tredje ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37). hTLR9-LUC-293-celler ble stimulert med angitte mengder av ODN, og NF-κB-stimulering ble bestemt ved måling av luciferaseaktivitet 16 t senere. X-aksen er log ODN konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 4 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med modifisert B-klasse ODN. 2’-deoksytymidin (T) ble substituert med 2’-deoksyuridin (U) (SEQ ID NO:16-18). Aktiviteten av U-modifisert ODN ble sammenliknet med ikke-modifisert B-klasse morsekvens (SEQ ID NO:1), fullstendig PS morsekvens (SEQ ID NO:2) og en tredje ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37). hTLR9-LUC-293-celler ble stimulert med angitte mengder av ODN, og NF-κB-stimulering ble målt ved å måle luciferaseaktivitet 16 t senere. X-akser er log ODN konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 5 er to grafer som viser resultatene av en luciferaseanalyse og en PBMC-analyse med modifisert B-klasse ODN. Den relative aktivitet av en ODN med 5-etyl-2’-deoksyuridin (EU) (SEQ ID NO:42), 2’-deoksyuridin (U) (SEQ ID NO:16), 5-jod-2’-deoksyuridin (JU) (SEQ ID NO:13), 5-brom-2’-deoksyuridin (BU) (SEQ ID NO:10), og 5-klor-2’-deoksyuridin (CU) (SEQ ID NO:41) ble sammenliknet med morsekvensen (SEQ ID NO:1). Figur 5a viser TLR9-aktivitet og figur 5b viser IFN-alfa produksjon. Det som vises er gjennomsnitt /- SEM i tre donorer. X-aksene er ODN konsentrasjon i μM og y-aksene er den relative stimuleringsindeks (figur 5a) eller IFN-alfa konsentrasjon i pg/ml (figur 5b).
Figur 6 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med EU-modifisert ODN. Aktiviteten av EU-modifisert ODN SEQ ID NO:29, 30 og 42 ble sammenliknet med morsekvensen (SEQ ID NO:1) og en ytterligere ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO.37). X-aksen er ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er relativ stimuleringsindeks.
Figur 7 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med modifisert B-klasse ODN.
Aktiviteten av JU-modifisert SEQ ID NO:19-24 ble sammenliknet med morsekvensen SEQ ID NO:37. X-aksen er ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 8 er to grafer som viser resultatene av en luciferaseanalyse og en PBMC-analyse med modifisert A-klasse ODN. Aktiviteten av JU-modifisert SEQ ID NO.35-37 ble sammenliknet med ikkemodifisert morsekvens (SEQ ID NO:43) og ikke-modifisert B-klasse ODN SEQ ID NO:1. Figur 8a viser TLR9-aktivitet og figur 8b viser IFN-alfa produksjon. Det som vises er gjennomsnitt /- SEM av tre donorer. X-aksene er log ODN-konsentrasjon (figur 8a) eller ODN-konsentrasjon (figur 8b) i µM og yaksene er relativ stimuleringsindeks (figur 8a) eller IFN-alfa konsentrasjon i pg/ml (figur 8b).
Figur 9 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med modifisert C-klasse ODN.
Aktiviteten av JU-modifisert C-klasse ODN SEQ ID NO:27-28 og 44-45 ble sammenliknet med ikkemodifisert morsekvens SEQ ID NO:45 og til en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37). X-aksen er ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 10 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med modifisert P-klasse ODN. Aktiviteten av JU-modifisert SEQ ID NO:31-33 ble sammenliknet med ikke-modifisert morsekvens (SEQ ID NO:52). X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 11 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med modifisert T-klasse ODN. Aktiviteten av JU-modifisert SEQ ID NO:47-50 og U-modifisert SEQ ID NO:51 ble sammenliknet med ikke-modifisert morsekvens SEQ ID NO:25. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 12 er en graf som viser resultatene av en luciferaseanalyse med kort ODN. Aktiviteten av JU-modifisert kort ODN SEQ ID NO:39-40 ble sammenliknet med ikke-modifisert morsekvens SEQ ID NO:38 og med B-klasse ODN SEQ ID NO:37. ODN ble formulert med og uten DOTAP. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 13 er fire grafer som viser resultatene av en ELISA-analyse som måler cytokinkonsentrasjon i splenocyttkultursupernatanter hvor BALB/c-mus-splenocytter ble dyrket i forskjellige ODNer.
Dyrkingssupernatanter ble høstet ved 6 t (for TNF-alfa) eller 24 t (for IL-6, IL-10 og IL-12). Aktivitetene av JU-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:13), ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37), og en ikke-CpG negativ kontroll ODN (SEQ ID NO:26) ble sammenliknet. Figurer 13a-d viser TNF-alfa, IL-6, IL-10 og IL-12 konsentrasjon, respektivt. X-aksene er ODN-konsentrasjon i µg/ml og y-aksene er cytokinkonsentrasjon i pg/ml.
Figur 14 er en graf som viser resultatene av FACS-analyser av B-celle proliferasjon. CFSE-farget BALB/c-musesplenocytter (4x10<5>/brønn) ble inkubert med 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 eller 10 µg/ml ODN.72 timer etter inkubering ble cellene farget for CD19 og B-celleproliferasjon ble bestemt med FACS etterfulgt av analyser med ModFit programvare. Aktivitetene av en JU-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:13), en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37), og en ikke-CpG negativ kontroll ODN (SEQ ID NO:26) ble sammenliknet. X-aksene er ODN-konsentrasjon i µg/ml og y-aksen er relativ B-celleproliferasjon.
Figur 15 er to grafer in vivo cytokinproduksjon som målt med ELISA. BALB/c-mus (5 per gruppe) ble injisert SC med 10, 50 eller 100 µg ODN. Kontrollgruppen mottok 100 µl PBS alene. Dyrene ble blødet med hjertepunktuering ved 1 time (for TNF-alfa) eller 3 timer (for IP-10) postinjeksjon og plasma ble analysert for TNF-alfa og IP-10 med ELISA. Aktivitetene med en JU-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:13) og en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:37) ble sammenliknet. Figur 15a viser TNF-alfa konsentrasjon og figur 15b viser IP-10 konsentrasjon. X-aksene er ODN-doseringer i µg og y-aksene er cytokin konsentrasjon i pg/ml.
Figur 16 er en graf som viser TLR9-mediert NF-κB-aktivering med en B-klasse ODN med en universell base (6-nitrobenzimidazol) (SEQ ID NO:178) i stedet for tymidin i morsekvensen (SEQ ID NO:1). hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivitet ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktivitet. X-aksen er log av ODN-konsentrasjon i µM og yaksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 17 er en graf som viser TLR9-mediert NF-κB-aktivering av B-klasse ODN med 5-(2-bromvinyl)-uridin (SEQ ID NO:153 og 154) i stedet for tymin i morsekvensen (SEQ ID NO:1). hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktivitet. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 18 er en graf som viser TLR9-mediert NF-κB-aktivering av B-klasse ODN med en sukkermodifisering (2'-O-metylguanosin) i tillegg til en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:111-113). Aktiviteten av disse ODN ble sammenliknet med morsekvensen (SEQ ID NO:1) og den samme sekvens med en lipofil substituert nukleotidanalog alene (SEQ ID NO:13). hTLR9-LUC-293-cellene ble inkubert med angitt mengde av nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktivitet. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 19 er en graf som viser TLR9-mediert NF-κB-aktivering med forgrenet B-klasse ODN med multiple 5'-aksessbare ender. Aktiviteten av den forgrenete ODN (SEQ ID NO:96, 97, 101 og 102) ble sammenliknet med SEQ ID NO:1. hTLR9-LUC-293-cellene ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktivitet. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 20 er en graf som viser TLR9-mediert NF-κB-aktivering ved en kort ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:38) og en ODN av den samme sekvens med en lipofil substituert nukleotidanalog og en lipofil 3'-markør (SEQ ID NO: 126). Begge ble formulert med og uten DOTAP. hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere med måling av luciferaseaktivitet. X-aksen er log av ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-αkonsentrasjon i pg/ml.
Figur 21 er en graf som viser TLR9-mediert NF-κB-aktivering av to B-klasser ODN med 5-proynyl-dU (SEQ ID NO:116 og 117) i stedet for tymin i morsekvensen (SEQ ID NO:1). hTLR9-LUC-293-celler inkubert med angitt mengde av nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktivitet. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 22 er en graf som viser hTLR9-mediert NF-κB-aktivering med B-klasse ODN med en andre nukleotidanalog i tillegg til en lipofil substituert nukleotidanalog SEQ ID NO:138, 7-deaza-dG; SEQ ID NO:139, inosin; SEQ ID NO:140, 5-metyl-dC). Aktivitetene av disse ODNer ble sammenliknet med morsekvensen (SEQ ID NO:1) og den samme sekvens med en lipofil substituert nukleotidanalog alene (SEQ ID NO:13). hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktiviteten. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 23 er en graf som viser hTLR9-mediert NF-κB-aktivering med T-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:132-134). Aktiviteten av disse ble sammenliknet med immunstimulatorisk C-klasse ODN (SEQ ID NO:198). hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktiviteten. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 24 er to grafer som viser hTLR9-mediert NF-κB-aktivering med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58-63). Figur 24a viser aktiviteten av SEQ ID NO:58-61 sammenliknet med B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56). Figur 24b viser aktiviteten av SEQ ID NO:62-63 sammenliknet med den samme positive og negative kontroller. hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitte mengder nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble målt 16 t senere ved måling av luciferaseaktivitet. X-aksen er log ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 25 er en graf som viser hTLR9-mediert NF-κB-aktivering med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:64, 66-67). Aktiviteten av disse sammenliknes med B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55), en C-klasse ODN (SEQ ID NO:68) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:57). hTLR9-LUC-293-celler ble inkubert med angitt mengder av nukleinsyrer og NF-κB-aktivering ble bestemt 16 t senere ved å måle luciferaseaktivitet. X-aksen er log av ODN-konsentrasjon i µM og y-aksen er den relative stimuleringsindeks.
Figur 26 er to grafer som viser induksjon av IFN-α med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58-63). Figur 26a viser aktiviteten av SEQ ID NO:58-61 sammenliknet med den B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56). Figur 26b viser aktiviteten av SEQ ID NO:62-63 sammenliknet med de samme positive og negative kontroller. Humane PBMC ble inkubert med den angitte ODN i 48 timer. IFN-α ble deretter bestemt i celledyrkningssupernatantene med ELISA. X-aksene er ODN-konsentrasjon i µM og yaksene er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 27 er en graf som viser induksjon av IFN-α med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:64, 66-67). Aktiviteten av disse sammenliknes med en B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55), en C-klasse ODN (SEQ ID NO:68) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:57). Humane PBMC med den angitte ODN i 48 timer. IFN-α ble deretter bestemt i celledyrkningssupernatantene med ELISA. X-aksene er ODN-konsentrasjon i µM og y-aksene er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 28 er to grafer som viser IL-6-induksjon med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58, 60-62, figur 28a) (SEQ ID NO:64 og 67, figur 28b). Aktiviteten ble sammenliknet med en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:55), en ikke-modifisert C-klasse ODN (SEQ ID NO:54), en negativ kontroll ODN (SEQ ID NO:53), og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56). PBMC fra tre donorer ble inkubert med ODN i 24 timer og supernatantene ble analysert med lumineks. Det som vises er gjennomsnitt /- SEM. X-aksene er ODN-konsentrasjon i µM og y-aksene er IL-6-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 29 er to grafer som viser B-celle proliferasjon etter behandling med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58, 60-62, figur 29a) (SEQ ID NO:64 og 67, figur 29b).
Aktiviteten ble sammenliknet med en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:55), en ikkemodifisert C-klasse ODN (SEQ ID NO:54), en negativ kontroll ODN (SEQ ID NO:53), en ikkemodifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56), LPS, R-848, SEB og en poly[I]:[C] ODN. CFSE-merket PBMC fra tre donorer ble inkubert med ODN I 5 dager, og deretter farget med et CD19-antistoff. Prosentandelen B-celler med redusert CFSE-farging ble bestemt. X-aksene er ODN-konsentrasjon i µM og y-aksene er % av B-celler med redusert farging etter deling.
Figur 30 er en graf som viser induksjon av murine IFN-α med P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58, 60-62, 64 og 67). Aktiviteten av disse sammenliknet med en B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55) og en negativ kontroll (SEQ ID NO:26). BALB/c-mus (5 per gruppe) ble injisert SC med forskjellige doseringer av ODN. Dyrene ble blødet ved 3 t etter injeksjon og plasma testet for IFN-alfa med ELISA. X-aksen er ODN-dosering i µg og y-aksen er IFN-α-konsentrasjon i pg/ml.
Figur 31 er to grafer som viser effekten av ODN på tumorvolum i mus SA1N-tumormodell. Hunkjønn A/J-mus (10 per gruppe) ble injisert SC med 5x10<5>SaI/N-tumorceller ved dag 0. Musene ble behandlet med 35 µg (figur 31a) eller 100 µg (figur 31b) P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:60, 64 og 67), en ikke-modifisert C-klasse ODN, en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:55), eller PBS alene gitt SC en gang ukentlig startende ved dag 8 post tumorinduksjon. Dyrene ble monitorert for overlevelse og tumorvolum. Tumorstørrelse (lengden og bredden) ble målt ved anvendelse av et digitalt vernier caliper. Tumorvolum ble beregnet ved anvendelse av formelen: Tumorvolum = (0,4) (ab2), hvor a = største diameter og b = minste diameter. X-aksene viser daglig post tumorinduksjon og y-aksene viser tumorvolum i mm<3>.
DETALJERT BESKRIVELSE
Foreliggende oppfinnelse er basert delvis på CpG oligonukleotider som viser forsterket immunstimulatorisk kapasitet. CpG oligonukleotider er kjent å stimulere immunsystemet, for eksempel gjennom interaksjon med toll-liknende reseptor 9 (TLR9). Stimulering av TLR9 har mange effekter inkluderende stimulering av en Th1-påvirket immunrespons, NK celleaktivering og B-celleaktivering. Oppfinnelsen er relatert i noen aspekter til identifisering av immunstimulatoriske oligonukleotider med forandret struktur som påvirker deres interaksjon med TLR9. Det ble oppdaget av oppfinnerne at oligonukleotider med lipofil substituerte nukleotidanaloger på utsiden av CpG-motiver har forsterket evne til å stimulere interferon-α (IFN-α) produksjon og indusere TLR9-aktivering. Denne effekt har blitt observert i alle klasser immunstimulatoriske oligonukleotider som har blitt testet. Disse modifiserte oligonukleotider med forbedret stimulatorisk kapasitet har blitt benevnt E-klasse oligonukleotider.
E-klasse modifiserte oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse har i noen tilfeller forbedret kapasitet for å indusere en immunrespons. En induksjon av en immunrespons refererer til en økning i antall, eller aktiviteten av en immuncelle, eller en økning i ekspresjon eller absolutte nivåer av en immunfaktor, så som et cytokin. Immunceller inkluderer, men er ikke begrenset til, NK-celler, CD4+ T-lymfocytter, CD8+ T-lymfocytter, B-celler, dendrittceller, makrofag- og andre antigenpresenterende celler. Cytokiner inkluderer, men er ikke begrenset til, interleukiner, TNF- α, IFN- α, β og γ, Flt-ligand, og ko-stimulatoriske molekyler.
Det er kjent at oligonukleotider som inneholder ikke-metylerte CpG-motiver er i stand til å stimulere immunresponser gjennom toll-liknende reseptor 9 (TLR9) reaksjonsvei. Induksjon av mange cytokiner korrelerer med TLR9-aktivering. Således, induksjon øker idet TLR9-stimuleringen øker. Imidlertid, der er generelt en invers korrelasjon mellom TLR9 og IFN-α-induksjon for CpG ODN. Det ble oppdaget at noen av modifikasjonene ifølge oppfinnelsen kan produsere et modifisert signaleringsmønster slik at en mer direkte korrelasjon, i stedet for en invers korrelasjon mellom TLR9-aktivering og IFN-α observeres.
Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse undersøkte innvirkningen av de lipofile enheter i regionen som omgir CpG-motivet. Som beskrevet i eksemplene nedenfor ble forskjellige typer lipofile substituerte nukleotidanaloger, så som 2,4-difluortoluen, 5-bromuracil og 5-joduracil inkorporert inn i et CpG-oligonukleotid på en av 5'- eller 3'-siden av CpG-motivet. Uventet, innkorporering av disse lipofile substituerte nukleotidanaloger førte til en uvanlig sterk økning i hTLR9-aktivitet og likeledes IFN-α-induksjon i humane PBMCer. Substituering med et ikke-lipofil nukleotid så som en uracilenhet (som er strukturelt lignende til en tymin men som mangler en metylgruppe) produserte en sterk reduksjon i hTLR9-stimulering. I oligonukleotidene som ble testet, synes økningen i TLR9-stimulering å være bedre dersom den lipofile substituerte nukleotidanalog er posisjonert 5' i forhold til CpG-motivet enn idet den er posisjonert 3' i forhold til motivet. Dobbelsubstituering (det vil si en 5'- og en 3'-lipofil substituert nukleotidanalogsubstituering) resulterte i den mest potente stimulering av de som ble testet. I motsetning, substituering av guanin eller cytosin med 2,4-difluortoluen ved CpG-motivet førte i begge tilfeller til en sterk reduksjon i TLR9-stimuleringsindeksen.
De lipofile substituerte nukleotidanalogmodifiseringer resulterte i en sterk forbedring av IFN-αinduksjon. Spesielt, for 5-bromuracil- og 5-joduracil-modifisert ODN, synes der å være en god korrelasjon mellom TLR9-stimulering og IFN-α-induksjon. Som nevnt over, denne observasjon var uventet, siden (i) mormolekylet 21317 er i hovedsak inaktivt i å indusere IFN-α, og (ii) der er vanligvis en invers korrelasjon mellom TLR9 og IFN-α-induksjon for CpG ODN som ikke inneholder disse modifiseringer.
I noen aspekter ifølge beskrivelsen har oligonukleotidet sekvensen R1YZR2. Oligonukleotidet kan inkludere én eller flere slike motiver. R1og R2er uavhengig enhver en av lipofilsubstituerte nukleotidanalog (L), et nukleotid, eller en binding. Det er foretrukket imidlertid at minst én av R1og R2er en lipofil substituert nukleotidanalog (L). I noen tilfeller er R1og R2begge L. Som vist i eksempelseksjonen nedenfor var oligonukleotidet som har en L både 5' og 3' i forhold til CpG-motivet spesielt stimulatoriske. Imidlertid, noen ganger var kun en R en L. For eksempel kan R1være L og R2kan være et nukleotid eller vice versa. Alternativt kan R1være en L og R2kan være en binding, slik at oligonukleotidet omfatter en struktur 5' R1CG 3'.
I noen tilfeller har oligonukleotidet sekvensen R1N1YZN2R2hvor N1og N2er nukleotider av 0-3 nukleotider i lengde. Andre mulige variasjoner inkluderer strukturer så som 5’ R1N1R1YZ N23’, 5’ R3R1YZ 3 og R1ZN2R2.
Y er et pyrimidinnukleotid. Z er en purin, en pyrimidin eller en abasisk enhet. I noen utførelser er Z fortrinnsvis en purin.
L er en lipofilisk substituert nukleotidanalog som kan være, for eksempel, en 5- eller 6-leddet ringnukleobaseanalog. Et eksempel på en 5- eller 6-leddet ringnukleobaseanalog er vist i følgende gruppe av formel I.
Formel 1
A, B, X, D, E og F er uavhengig enhver av C (karbon) eller N (nitrogen) som valgfritt bærer hydrogen eller en substituent så som for eksempel, men er ikke begrenset til, F, Cl, Br, I, alkyl, alkenyl, alkinyl, halogenert alkyl, halogenert alkenyl, cykloalkyl, O-alkyl, O-alkenyl, -NH-alkyl, -N(alkyl)2; -S-alkyl, -SO-alkyl, -SO2-alkyl, nitro, cyano, karboksylester, fenyl, tiofenyl, benzyl, okso, tio, hydroksy, merkapto og imino. I noen tilfeller, er minst én substituent ikke okso, tio, hydroksy, merkapto, imino, amino eller metyl. n er 0 eller 1. De prikkete linjer indikerer valgfrie dobbeltbindinger. Imidlertid, minst én substituent er ikke valgt blant gruppen som består av okso, tio, hydroksy, merkapto, imino, amino, metyl og hydrogen. Videre er totalen av A, B, X, D, E og F atomer ikke mindre enn 3 nitrogener (N). I noen tilfeller er alle atomer A, B, X, D, E, F karbon (C). Alternativt, minst en, to eller tre av atomene A, B, X, D, E, F er nitrogen (N).
Forbindelsen av formel kan for eksempel være enhver av de følgende lipofile substituerte nukleotidanaloger: en substituert pyrimidin, en substituert uracil, en substituert toluen, en substituert imidazol eller pyrazol, en substituert triazol, 5-kloruracil, 5-bromuracil, 5-joduracil, 5-etyluracil, 5-propyluracil, 5-propinyluracil, (E)-5-(2-bromvinyl)-uracil eller 2.4-difluortoluen.
Den lipofile substituerte nukleotidanalog kan separeres eller kan fusjoneres med andre forbindelser. For eksempel kan den fusjoneres til en 3-til 6-leddet aromatisk eller alifatisk ringsystem. Det kan også kobles til en 5- til 6-leddet sukkerenhet så som for eksempel pentose eller heksose. Et eksempel på en pentose er en furanose så som en ribose eller deoksyribose og et eksempel på en heksose er en pyranose. Pentosen eller heksosen kan valgfritt være substituert med F, amino, alkoksy, alkoksyetoksy, aminopropyl, alkenyl, alkinyl eller en O2,C4-alkylenbro.
Oligonukleotidet kan også inkludere en ikke-nukleotidisk modifisering så som en C6-C48-polyetylenglycol, C3-C20-alkandiol, C3-C18-alkylaminolinker, C3-C18-alkyltiollinker, kolesterol, garvesyre, mettet eller umettede fettsyrer, folat, heksadecylglyserol, diheksadecylglyserolgruppe, en oktadecylglycerol eller dioktadecylglyserolgruppe eller en vitamin E gruppe.
De lipofile substituerte nukleotidanaloger kan inkorporeres inn i et hvert immunstimulatorisk oligonukleotid. I noen utførelser av oppfinnelsen inkluderer de immunstimulatoriske oligonukleotider immunstimulatoriske motiver som er "CpG dinukleotider". Et CpG-dinukleotid kan være metylert eller ikke-metylert. En immunstimulatorisk nukleinsyre som inneholder minst én ikke-metylert CpG-dinukleotid er et nukleinsyremolekyl som inneholder ikke-metylert cytosin-guanin dinukleotidsekvens (det vil si en ikke-metylert 5' cytidin etterfulgt av 3' guanosin og koblet med en fosfatbinding) og som aktiverer immunsystemet; så som en immunstimulatorisk nukleinsyre er en CpG nukleinsyre. CpG nukleinsyrer har blitt beskrevet i et antall utstedte patenter, publiserte patentsøknader og andre publikasjoner inkluderende US patent nr.6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116 og 6,339,068. En immunstimulatorisk nukleinsyre som inneholder minst én metylen CpG dinukleotid er en nukleinsyre som inneholder en metylert cytosin-guanin dinukleotidsekvens (det vil si en metylert 5' cytidin etterfulgt av en 3' guanosin og koblet med en fosfatbinding) og som aktiverer immunsystemet. I andre utførelser er de immunstimulatoriske oligonukleotider frie for CpG dinukleotid. De oligigonukleotider som er frie for CpG dinukleotider refereres til som ikke-CpG oligonukleotider, og de har ingen CpG immunstimulatoriske motiver. Fortrinnsvis er disse T-rike ODN, så som ODN som har minst 80% T.
E-klassen ODNer ifølge oppfinnelsen kan inkludere motiver og egenskaper av andre CpG ODN-klasser så som A-klasse, B-klasse, C-klasse, T-klasse og P-klasse så lenge de inkluderer lipofile substituerte nukleotidanaloger 5' og/eller 3' av et YGZ motiv.
"A-klasse" CpG immunstimulatoriske nukleinsyrer har blitt beskrevet i US ikke-provisorisk patentsøknad med nr.09/672,126 og publisert PCT-søknad PCT/US00/26527 (WO 01/22990), begge innsendt 27. september 2000. Disse nukleinsyrer er karakterisert ved evne til å indusere høye nivåer av interferon-alfa mens de har minimale effekter på B-celleaktivering. A-klasse CpG immunstimulatoriske nukleinsyrer inneholder nødvendigvis ikke en heksamerpalindrom GACGTC, AGCGCT eller AACGTT beskrevet av Yamamoto og kolleger. Yamamoto S et al. J Immunol 148:4072-6 (1992).
Representative sekvenser av A-klasse immunstimulatoriske nukleinsyrer er beskrevet i US ikkeprovisorisk patentsøknad med nr.09/672,126 og publisert PCT-søknad PCT/US00/26527 (WO 01/22990), begge innsendt 27. september 2000.
"B-klasse" ODN er potente i å aktivere B-celler men er relativt svake i å indusere IFN-α og NK-celleaktivering. B-klasser CpG nukleinsyrer er typisk fullstendig stabilisert og inkluderer en ikkemetylert CpG dinukleotid innen visse fortrukne basekontekster. Se for eksempel US patenter nr. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116 og 6,339,068. En annen klasse potent for å indusere IFN-α og NK-celleaktivering, men er relativt svak i å stimulere B-celler; denne klasse har blitt benevnt "A-klasse". A-klasse CpG nukleinsyrer har typisk stabiliserte poly-G sekvenser ved 5' og 3' ender av en palindromisk fosfodiester CpG dinukleotid-inneholdende sekvens på minst 6 nukleotider. Se for eksempel publisert patentsøknad PCT/US00/26527.
En annen klasse CpG nukleinsyrer aktiverer B-celler og NK-celler og induserer IFN-α; denne klasse har blitt benevnt C-klasse. "C-klasse" immunstimulatoriske nukleinsyrer inneholder minst to distinkte motiver som har unike og ønskelige stimulatoriske effekter på celler i immunsystemet. Noen av disse ODN har både en tradisjonell "stimulatorisk" CpG-sekvens og en "GC-rik" eller "B-cellenøytraliserende" motiv. Disse kombinasjonsmotivnukleinsyrer har immunstimulatoriske effekter som faller mellom effektene assosiert med tradisjonelle "klasse B" CpG ODN, som er sterke indusere av B-celleaktivering og dendrittcelle (DC) aktivering, og de effekter som er assosiert med en mer nylig beskrevet klasse immunstimulatoriske nukleinsyrer ("klasse A" CpG ODN) som er sterke indusere av IFN-α og naturlige drepecelleaktivering (NK), men relativt svake indusere av B-celle- og DC-aktivering. Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6. Idet foretrukne klasse B CpG ODN ofte har fosforotioat backbones, og foretrukne klasse A CpG ODN har blandete eller kimeriske backbones, så kan C-klasse av kombinasjonsmotiv immunstimulatoriske nukleinsyrer ha enten stabiliserte, for eksempel fosforotioat, kimeriske eller fosfodiester backbones, og i noen foretrukne utførelser, så har de semi-myke backbones. Denne klasse har blitt beskrevet i US patentsøknad US10/224,523 av 29. august 2002, og hele innholdet i denne inkorporeres heri med henvisning.
"P-klasse" immunstimulatoriske oligonukleotider har flere domener, inkluderende et 5' TLR aktiveringsdomene, 2 dupleksdannende regioner og en valgfri spacer og en 3'-hale. Denne klasse oligonukleotider evner i noen tilfeller til å indusere mye høyere nivåer av IFN-α sekresjon enn C-klassen. P-klassen av oligonukleotider har evne til spontant å selvassosiere til konkatamerer enten in vitro og/eller in vivo. Uten å være bundet av noen bestemt teori for virkningsmekanisme av disse molekyler, så er én potensiell hypotese at denne egenskap bevirker P-klasse oligonukleotidene med evne til mer sterkt å kryssbinde TLR9 innsiden av visse immunceller, og induserer et distinkt mønster av immunaktivering sammenliknet med de tidligere beskrevne klasser av CpG oligonukleotider.
Krysslinking av TLR9-reseptorer kan indusere aktivering av sterke IFN-α-sekresjon gjennom type I IFNR feedbacksløyfe i plasmacytoid dendrittceller. P-klasser oligonukleotider beskrevet i det minste i US patentsøknad med nr.11/706,561.
"T-klasse" oligonukleotider induserer sekresjon av lavere nivåer av IFN-alfa idet de ikke er modifisert som i ODNene ifølge oppfinnelsen og IFN-relaterte cytokiner og kjemokiner andre enn B-klasse eller C-klasse oligonukleotider, idet de opprettholder evnen til å indusere nivåer av IL-10 tilsvarende til B-klasse oligonukleotider. T-klasse oligonukleotider er beskrevet i US patentsøknad med nr.
11/099,683, hvis hele innhold inkorporeres heri med referanse.
I én utførelse er den immunstimulerende ODN ifølge oppfinnelsen hensiktsmessig kombinert med et kationisk lipid. I én utførelse er det kationiske lipid DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoyloksy)propy- l]-N,N,N-trimetylammoniummetylsulfat). Andre midler med tilsvarende egenskaper som inkluderer trafikkering til de endosomale compartment kan anvendes i stedet for eller i tillegg til DOTAP. Andre lipidformuleringer inkluderer, for eksempel, EFFECTENE™ (et ikke-liposomalt lipid med en spesiell DNA-kondenserende enhancer), og SUPERFECT™ (e nyvirkende dendrimerisk teknologi).
Liposomer er kommersielt tilgjengelige fra Gibco BRL, for eksempel som LIPOFECTIN™ og LIPOFECTACE™, som er dannet av kationiske lipider så som N-[1-(2, 3 dioleyloksy)-propyl]-N, N, N-trimetylammoniumklorid (DOTMA) og dimetyl dioktadecylammoniumbromid (DDAB). Framgangsmåter for å framstille liposomer er godt kjent innen fagfeltet og har blitt beskrevet i mange publikasjoner. En oversikt over liposomer kan også finnes i Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.
I andre utførelser formuleres den immunstimulatoriske ODN ikke i kationiske liposomer. På grunn av den lipofile natur av de modifiserte analoger innen ODN så kan korte ODN så som de som har 3 nukleotider i lengde ikke kreve formulering for effektiv funksjon in vivo.
I én utførelse er den immunstimulatoriske ODN ifølge oppfinnelsen i form av en kovalent lukket, klokkeformete molekyler med både primær og sekundær struktur. I en utførelse inkluderr slike oligonukleotider to enkelttrådete sløyfer forbundet via intervernerende dobbelttrådet segment. I en utførelse inkluderer minst en enkelttrådet sløyfe en immunstimulatorisk DNA-motiv ifølge oppfinnelsen. Andre kovalent lokkede manualformete molekyler ifølge oppfinnelsen inkluderer kimeriske DNA:RNA-molekyler hvor, for eksempel, det dobbelttrådete segment er minst partielt DNA (for eksempel enten homodimerisk dsDNA eller heterodimerisk DNA:RNA) og minst én enkelttrådet sløyfe inkluderer en immunstimulatorisk DNA-motiv ifølge oppfinnelsen. Alternativt, det dobbelttrådete segment av det kimeriske molekyl er DNA.
I visse utførelser isoleres den immunstimulatoriske ODN. Et isolert molekyl er et molekyl som er i hovedsak rent og er fri for andre substanser som det normalt finnes med i naturen eller in vivo systemer i en grad som er praktisk og egnet for det tiltenkte bruk. Nærmere bestemt, immunstimulatoriske ODN er tilstrekkelig rene og er tilstrekkelig frie for andre biologiske bestanddeler av celler slik at de kan være nyttige for for eksempel å produsere farmasøytiske preparater. På grunn av et isolert immunstimulatorisk ODN ifølge oppfinnelsen kan sammenblandes med en farmasøytisk akseptabel bærer i et farmasøytisk preparat, kan det immunstimulatoriske ODN omfatte en liten prosentandel basert på vekt av preparatet. Den immunstimulatoriske ODN er imidlertid i hovedsak ren idet den har i det vesentligste blitt separert fra substanser som den kan være assosiert med i levende systemer.
De immunstimulatoriske nukleinsyremolekyler kan ha en kimerisk backbone. For formål med foreliggende oppfinnelse, en kimerisk backbone refererer til en partielt stabiliserende backbone, hvor minst en internukleotidbinding er fosfodiester eller fosfodiester-liknende, og hvor minst en annen internukleotidbinding er en stabilisert internukleotidbinding, hvor den minst ene fosfodiester eller fosfodiesterliknende binding og den minst ene stabiliserte binding er forskjellige. Siden boranfosfonatbindinger har blitt rapportert å være stabilisert i forhold til fosfodiesterbindinger, for formål av den kimeriske natur av backbone, kan boranfosfonatbindinger klassifiseres enten som fosfodiesterliknende eller som stabiliserte, avhengig av konteksten. For eksempel, en kimerisk backbone i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan i én utførelse inkludere minst én fosfodiester (fosfodiester eller fosfodiesterliknende) binding og minst én boranfosfonat (stabilisert binding). I en annen utførelse av en kimerisk backbone i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan inkludere boranfosfonat (fosfodiester eller fosfodiesterliknende) og fosforotionat (stabiliserte) bindinger. En "stabilisert internukleotidbinding" skal bety en internukleotidbinding som er relativ resistent til in vivo degradering (for eksempel via en ekso- eller endonuklease), sammenliknet med en fosfodiester internukleotidbinding. Foretrukne stabiliserte internukleotidbindinger inkluderer, uten begrensning, fosforotioat, fosforoditioat, metylfosfonat og metylfosforotioat. Andre stabiliserte internukleotidbindinger inkluderer, uten begrensning, peptid, alkyl, defosfo og andre som beskrevet over.
Modifiserte backbones, så som fosforotioater kan syntetiseres ved anvendelse av automatisert teknikker som benytter enten fosforamidat eller H-fosfonat kjemi. Aryl- og alkyl-fosfonater kan framstilles, for eksempel som beskrevet i US patent nr.4,469,863; og alkylfosfotriestere (hvor den ladete oksygenenhet alkyleres som beskrevet i US patent 5,023,243 og europeisk patent nr.092,574) kan framstilles ved automatisert fastfasesyntese ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser. Framgangsmåter for å framstille andre DNA backbone modifiseringer og substitueringer har blitt beskrevet. Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Framgangsmåter for å framstille kimeriske oligonukleotider er også kjente. For eksempel har patenter som er utstedt til Uhlmann et al beskrevet slike teknikker.
Blandete backbone-modifiserte ODN kan syntetiseres ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige DNA-syntetiseringer og standard fosforamidit kjemi (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogs - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991, and M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett.21, 719 (1980)). Etter kobling introduseres PS-bindingene med sulfurisering ved anvendelse av Beaucage-reagens (R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc.112, 1253 (1990)) (0,075 M i acetonitril) eller fenylacetyldisulfid (PADS) etter dekking med acetisk anhydrid, 2,6-lutidin i tetrahydrofuran (1:1:8; vol:vol:vol) og N-metylimidazol (16% i tetrahydrofuran). Dette dekketrinn utføres etter sulfiriseringsreaksjon for å minimere dannelse av uønskete fosfodiester (PO) bindinger ved posisjoner hvor fosforotioat-binding skal lokaliseres. I tilfelle av introduksjon av en fosfodiesterbinding, for eksempel ved et CpG dinukleotid, den mellomliggende fosfor-III oksideres ved behandling med en løsning av jod i vann/pyridin. Etter spalting fra dette faststoffstøttemedium og final avbeskyttelse ved behandling med konsentrert ammoniakk (15 timer ved 50<0>C), analyseres ODNen med HPLC på en Gen-Pak Fax kolonne (Millipore-Waters) ved anvendelse av en NaCl-gradient (for eksempel buffer A: 10 mM NaH2PO4i acetonitril/vann = 1:4/vol:vol pH 6.8; buffer B: 10 mM NaH2PO4, 1,5 M NaCl i acetonitril/vann = 1:4/vol:vol; 5 til 60% B i 30 minutter ved 1 ml/min) eller med kapilær geleketroforese. ODNen kan renses med HPLC eller med FPLC på en Source High Performance kolonne (Amersham Pharmacia). HPLC-homogene fraksjoner kombineres og desaltes via en C18 kolonne eller med ultrafiltrering. ODNen ble analysert med MALDI-TOF massespektrometri for å bekrefte beregnet masse.
Nukleinsyren ifølge oppfinnelsen kan også inkludere andre modifikasjoner. Disse inkluderer ikkeioniske DNA-analoger, så som alkyl- og arylfosfater (hvor de lagrete fosfonatoksygen er erstattet med et alkyl eller arylgruppe), fosfodiester- og alkylfosfotriestere, hvor den lagrete oksygenenhet er alkylert. Nukleinsyrer som inneholder diol, så som tetraetylenglykol eller heksaetylenglykol, ved én eller begge av endene har også blitt vist å være i hovedsak resistent til nukleasenedbryting.
I noen utførelser kan oligonukleotidene være myke eller semimyke oligonukleotider. Et mykt oligonukleotid er en immunstimulatorisk oligonukleotid som har en partielt stabilisert backbone, hvor fosfodiester- eller fosfodiesterliknende internukleotidbindingene foregår kun innen eller umiddelbart tilgrensende til minst en indre pyrimidin-purin dinukleotid (YZ). Fortrinnsvis er YZ lik YG, en pyrimidinguanosin (YG) dinukleotid. Den minst ene indre YZ dinukleotid har i seg selv en fosfodiester- eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding. En fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding forekommer umiddelbart tilgrensende til den minst ene indre YZ dinukleotid kan være 5', 3' eller både 5' og 3' til minst én indre YZ dinukleotid.
Fortrinnsvis, fosfodiesteren eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger involverer "indre dinukleotider". En indre dinukleotid skal generelt bety ethvert par av tilgrensende nukleotider forbundet med en internukleotidbinding, hvor ingen av nukleotidene i paret av nukleotidet er en terminalnukleotid, det vil si verken nukleotidet i paret av nukleotider er en nukleotid som definerer 5'-eller 3'-enden av oligonukleotidet. Således har et lineært oligonukleotid som er n nukleotider langt et totalt av n-1 dinukleotider og kun n-3 indre dinukleotider. Hver internukleotidbinding i et indre dinukleotid er en indre internukleotidbinding. Således, et lineært oligonukleotid som er n nukleotider langt har en total på n-1 internukleotidbindinger og kun n-3 indre internukleotidbindinger. De strategisk plasserte fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger, derfor, refererer til fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger posisjonert mellom ethvert par av nukleotidet i nukleinsyresekvensene. I noen utførelser er fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger ikke posisjonert mellom parene av nukleotider som er nærmest 5'- eller 3'-enden.
Fortrinnsvis er en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding som foregår umiddelbart tilgrensende til den minst ene indre YZ dinukleotid i seg selv en indre internukleotidbinding. Således, for sekvens N1YZ N2, hvor N1og N2er hver, uavhengig av hverandre, en enkelt nukleotid, så har YZ dinukleotidet en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding, og i tillegg (a) N1og Y er koblet ved en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidkobling idet N1er et indre nukleotid, (b) Z og N2er koblet med en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding idet N2er et indre nukleotid, eller (c) N1og Y er koblet med en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding idet N1er en indre nukleotid og Z og N2er koblet med en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding idet N2er et indre nukleotid.
I oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen kan minst én YZ av R1YZR2ha en fosfodiester koblet.
Alternativt, YZ av R1YZR2kan ha en fosforotioatkobling. I noen utførelser har
R1Y og/eller ZR2av R1YZR2en fosforotioatkobling.
Myke oligonukleotider i samsvar med foreliggende oppfinnelse antas å være relativt mottakelige for nukleasespalting sammenliknet med fullstendig stabiliserte oligonukleotider. Uten å være bundet av en bestemt teori for mekanisme, så er det antatt at myke oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan spaltes til fragmenter med redusert eller ingen immunstimulatorisk aktivitet i forhold til fullengde myke oligonukleotider. Inkorporering av minst én nukleasesensitiv internukleotidbinding, fortrinnsvis nær midten av oligonukleotidet, antas å tilveiebringe en "avkobling" som forandrer farmakokinetikk av oligonukleotidet slik at det reduserer varighet av maksimal immunstimulatorisk aktivitet av oligonukleotidet. Dette kan være av spesiell verdi i vev og i kliniske applikasjoner hvor det er ønskelig å unngå skader relatert til kronisk lokal inflammasjon eller immunstimulering, for eksempel i nyren.
Et semi-myk oligonukleotid er et immunstimulatorisk oligonukleotid som har en partielt stabilisert backbone, hvor fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger foregår kun innen minst én indre pyrimidinpurin (Z) dinukleotid. Semi-myke oligonukleotider oppviser generelt økt immunstimulatorisk potens relatert til korresponderende fullstendig stabiliserte immunstimulatoriske oligonukleotider. På grunn av større potens av semi-myke oligonukleotider, kan semi-myke oligonukleotider anvendes, i noen tilfeller, ved lavere effektive konsentrasjoner og ha lavere effektive doseringer enn konvensjonelle fullstendig stabiliserte immunstimulatoriske oligonukleotider og oppnå den ønskete biologiske effekt.
Det antas at de foregående angitte egenskaper for semi-myke oligonukleotider generelt vil øke med økende "dosering" av fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger som involverer indre YZ dinukleotider. Det er således antatt, for eksempel, at generelt for en gitt oligonukleotidsekvens med fem indre YZ dinukleotider, så vil et oligonukleotid med fem indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YZ internukleotidbindinger være mer immunstimulatorisk enn et oligonukleotid med fire indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YG internukleotidbindinger, som også er mer immunstimulatorisk enn et oligonukleotid med tre indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YZ internukleotidbindinger, som er mer immunstimulatorisk enn et oligonukleotid med to indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YZ internukleotidbindinger, som er mer immunstimmulatorisk enn et oligonukleotid med én indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YZ internukleotidbinding. Viktig, inkludering av også en indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YZ internukleotidbinding antas å være fordelaktig over ingen indre fosfodiester eller fosfodiesterliknende YZ internukleotidbinding. I tillegg til antallet av fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbindinger, så vil posisjonen langs lengden av nukleinsyren også påvirke potensitet.
Myke og semi-myke oligonukleotider vil generelt inkludere, i tillegg til fosfodiester eller diesterliknende internukleotidbindinger ved foretrukne indre posisjoner, 5'- og 3'-ender som er resistente mot degradering. Slike degraderingsresistente ender kan involvere enhver egnet modifisering som resulterer i en økt resistens mot eksonukleaseoppkutting over korresponderende ikke-modifiserte ender. For eksempel, 5'- og 3'-endene kan stabiliseres ved inkludering av minst én fosfatmodifisering i backbone. I en foretrukket utførelse, den minst ene fosfatmodifisering av backbone ved hver ende er uavhengig en fosforotioat, fosforoditioat, metylfosfonat eller metylfosforotioat internukleotid binding. I en annen utførelse, inkluderer den degraderingsresistente ende én eller flere nukleotidenheter forbundet til peptid eller amidbindinger ved 3'-enden.
En fosfodiester internukleotidbinding er den type binding som er karakteristisk for nukleinsyrer som finnes i naturen. Fosfodiester internukleotidbinding inkluderer et fosforatom flankert med to brodannende oksygenatomer og bundet også med to ytterligere oksygenatomer, et ladet og det andre uladet. Fosfodiester internukleotidbinding er spesielt foretrukket dersom det er viktig å redusere halveringstiden av oligonukleotidet i vevet.
En fosfodiesterliknende internukleotidbinding er en fosforinneholdende brodannende gruppe som er kjemisk og/eller diastereomerisk tilsvarende til fosfodiesteren. Mål på likhet til fosfodiesteren inkluderer mottakelse til nukleaseoppkutting og er villig til å aktivere RNAse H. Således er for eksempel fosfodiester, men ikke fosfortioat, oligonukleotider mottakelige til nukleaseoppkutting, mens både fosfodiester og fosforotioat oligonukleotider aktiverer RNAse H. I en foretrukket utførelse er den fosfodiesterliknende internukleotidbinding boranfosfat (eller tilsvarende, boranfosfonat) binding. US patent nr.5,177,198, US patent nr.5,859,231, US patent nr.6,160,109, US patent nr.6,207,819, Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. I en ytterligere foretrukket utførelse er den fosfodiesterliknende internukleotidbinding en dieasteromerisk ren Rp fosfortioat. Det antas at diastereomerisk ren Rp fosfortioat er mer mottakelig til nukleaseoppkutting og er bedre i å aktivere RNAse H enn blandete eller diastereomerisk ren Sp fosforotioat. Stereoisomerer av CpG oligonukleotider er gjenstand i co-søknad US patentsøknad 09/361,575 av 27. juli 1999, og publisert PCT-søknad PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Det skal nevnes for formålet med foreliggende oppfinnelse at termen "fosfodiesterliknende internukleotidbinding" spesifikt eksluderer fosforoditioat og metylfosfonat internukleotidbindinger.
Som beskrevet over, de myke og semi-myke oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan ha fosfodiesterliknende koblinger mellom C og G. Et eksempel på en fosfodiesterbinding er en fosforotioatbinding i en Rp-konformasjon. Oligonukleotid p-kiralitet kan ha tilsynelatende motsatte effekter på en immun aktivitet av et CpG oligonukleotid, avhengig av tidspunktet hvor aktiviteten måles. Ved et tidlig tidspunkt av 40 minutter, induserer Rp, men ikke Sp, stereoisomeren av fosforotioat CpG oligonukleotider JNK fosforylering i miltceller fra mus. I motsetning, idet det analyseres ved et senere tidspunkt på 44 timer, så er Sp, men ikke Rp, stereoisomeren aktiv i å stimulere proliferasjon av miltceller. Forskjellen i kinetikk og bioaktivitet av Rp- og Sp-stereoisomerene er ikke resultatet av forskjellig celleopptak, men i stedet mest sannsynlig grunnet i to motsatte biologiske funksjoner for p-kiraliteten. Først, den forsterkede aktivitet av Rp-stereoisomeren sammenliknet med Sp for stimulering av immunceller på et tidlig tidspunkt indikerer at Rp kan være mer effektiv i interaksjonen med CpG-reseptoren, TLR9 eller indusere nedstrøms signalerende reaksjonsveier. På den andre side, en hurtigere degradering av Rp PS-oligonukleotidene sammenliknet med Sp resulterer i en mye kortere varighet av signaleringen, slik at Sp PS-oligonukleotidene synes å være mer biologisk aktive idet de testes ved senere tidspunkt.
En overraskende sterk effekt oppnås med p-kiralitet ved CpG dinukleotiden i seg selv. Sammenliknet med en stereo-vilkårlig CpG oligonukleotid så var slektskapet hvor den enkle CpG dinukleotid var koblet i Rp noe mer aktiv, mens den slektning som inneholder Sp-binding var nær ikke-aktiv i å indusere proliferasjon av miltceller.
Termene "nukleinsyre" og "oligonukleotid" omfatter også nukleinsyre eller oligonukleotider med substitueringer eller modifiseringer, så som i baser og/eller sukkere. For eksempel, de inkluderer nukleinsyrer som har backbone sukkere som er kovalent tilfestet til lavmolekylvekt organiske grupper andre enn en hydroksylgruppe ved 2'-posisjon og andre enn en fosfatgruppe eller hydroksygruppe ved 5'-posisjon. Således, modifiserte nukleinsyrer kan inkludere en 2'-O-alkylert ribosegruppe. I tillegg, modifiserte nukleinsyrer kan inkludere sukkere, så som arabinose eller 2'-fluorarabinose i stedet for ribose. Således, nukleinsyrene kan være heterogene i backbone sammensetning og dermed inneholde alle mulige kombinasjoner av polymerenheter koblet sammen så som peptidnukleinsyre (som har en aminosyre backbone med nukleinsyrebaser).
Nukleinsyrene inkluderer også substituerte puriner og pyrimidiner så som C-5 propynpyrimidin og 7-deaza-7-substituert purin modifiserte baser. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Puriner og pyrimidiner inkluderer, men er ikke begrenset til, adenin, cytosin, guanin, tymin,
5-metylcytosin, 5-hydroksycytosin, 5-fluorcytosin, 2-aminopurin, 2-amino-6-klorpurin, 2,6-diaminopurin, hypoksantin og andre naturlig og ikke-naturlig forekommende nukleobaser, substituerte og ikke-substituerte aromatiske enheter. Andre slike modifiseringer er godt kjent for fagkyndige innen feltet.
De immunstimulatoriske oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte forskjellige kjemiske modifikasjoner og substitusjoner, sammenliknet med naturlig RNA og DNA, involverende en fosfodiester internukleotid bro, en β-D-riboseenhet og/eller en naturlig nukleotidbase (adenin, guanin, cytosin, tymin, uracil). Eksempler på kjemiske modifiseringer er kjent for fagkyndige innen feltet, og er beskrevet for eksempel i Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; “Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; and Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Et oligonukleotid i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan ha én eller flere modifiseringer, hvor hver modifisering er lokalisert ved en bestemt fosfodiester internukleotid bro og/eller ved en bestemt β-D-riboseenhet og/eller ved en bestemt naturlig nukleotid baseposisjon i sammenlikning med et oligonukleotid av samme sekvens som er sammensatt av naturlig DNA eller RNA.
For eksempel, oppfinnelsen vedrører et oligonukleotid som kan omfatte én eller flere modifiseringer og hvor modifisering er uavhengig valgt blant:
a) erstatning av en fosfodiester internukleotid bro lokalisert ved 3'- og/eller 5'-enden av et nukleotid med en modifisert internukleotid bro,
b) erstatning av fosfodiesterbroen lokalisert ved 3'- og/eller 5'-enden av et nukleotid med en difosfobro,
c) erstatning av en sukkerfosfatenhet fra sukkerfosfat backbone med en annen enhet, d) erstatning av en β-D-riboseenhet med en modifisert sukkerenhet, og
e) erstatning av en naturlig nukleotidbase med en modifisert nukleotidbase.
Mer detaljerte eksempler på de kjemiske modifiseringer av et oligonukleotid gis nedenfor.
En fosfodiester internukleotidbro lokalisert ved 3' og/eller 5'-enden av et nukleotid kan erstattes med en modifisert internukleotidbro, hvor den modifiserte internukleotidbro for eksempel er valgt blant fosforotioat, NR<1>R<2>-fosforamidat, boranfosfat, α-hydroksybenzylfosfonat, fosfat-(C1-C21)-O-alkylester, fosfat-[(C6-C12)aryl-(C1-C21)-O-alkyl]ester, (C1-C8)alkylfosfonat og/eller (C6-C12)arylfosfonatbroer, (C7-C12)-α-hydroksymetylaryl (for eksempel beskrevet i WO 95/01363), hvor (C6-C12)aryl, (C6-C20)aryl og (C6-C14)aryl er valgfritt substituert med halogen, alkyl, alkoksy, nitro, cyano, og hvor R<1>og R<2>er, uavhengig av hverandre, hydrogen, (C1-C18)-alkyl, (C6-C20)-aryl, (C6-C14)-aryl-(C1-C8)-alkyl, fortrinnsvis hydrogen, (C1-C8)-alkyl, fortrinnsvis (C1-C4)-alkyl og/eller metoksyetyl, eller R<1>og R<2>danner, sammen med nitrogenatomer som bærer dem, en 5-6-leddet heterosyklisk ring som ytterligere kan inneholde ytterligere heteroatom fra gruppen O, S og N.
Erstatningen av en fosfodiesterbro lokalisert ved 3'- og/eller 5'-enden av et nukleotid med en defosfobro (defosfobroer er beskrevet for eksempel i Uhlmann E and Peyman A in “Methods in Molecular Biology”, Vol.20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp.355 ff), hvor en desfosfobro for eksempel er valgt blant defosfobroene formacetal, 3'-tioformacetal, metylhydroksylamin, oksim, metylendimetylhydrazo, dimetylensulfon og/eller silylgrupper.
En sukkerfosfatenhet (det vil si en β-D-ribose og fosfodiester internukleotidbro som sammen danner en sukkerfosfatenhet) fra sukkerfosfat backbone (det vil si en sukkerfosfat backbone er sammensatt av sukkerfosfatenheter) kan erstattes med en annen enhet, hvor den andre enhet for eksempel er egnet for å bygge opp en "morfolinoderivat"-oligomer (som for eksempel beskrevet i Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), det vil si for eksempel ved erstatning av en morfolinoderivatenhet; eller å bygge opp et polyamidnukleinsyre ("PNA"; som beskrevet for eksempel i Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), det vil si for eksempel erstatning av PNA backbone enhet, for eksempel med 2-aminoetylglycin.
En β-riboseenhet, eller en β-D-2-deoksyriboseenhet kan erstattes med en modifisert sukkerenhet, hvor den modifiserte sukkerenhet for eksempel er valgt blant β-D-ribose, α-D-2'-deoksyribose, L-2'-deoksyribose, 2'-F-2'-deoksyribose, 2'-F-arabinose, 2'-O-(C1-C6)alkylribose, fortrinnsvis 2'-O-(C1-C6)alkylribose er 2'-O-metylribose, 2'-O-(C2-C6)alkenylribose, 2'-[O-(C1-C6)alkyl-O-(C1-C6)alkyl]-ribose, 2'-NH2-2'-deoksyribose, β-D-xylofuranose, α-arabinofuranose, 2,4-dideoksy- β-D-erytroheksopyranose og karboksylisk (beskrevet for eksempel i Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) og/eller sukkeranaloger med åpen kjede (beskrevet for eksempel i Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) og/eller bisyklosukkeranaloger (beskrevet for eksempel i Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481).
I noen foretrukne utførelser er sukkeret 2-O-metylribose, fortrinnsvis fra én eller begge nukleotider koblet med en fosfodiester eller fosfodiesterliknende internukleotidbinding.
Nukleinsyrer inkluderer også substituerte puriner og pyrimidiner så som C-5 propynpyrimidin og 7-deaza-7-substituert purin modifiserte baser. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4.
Puriner og pyrimidiner inkluderer, men er ikke begrenset til adenin, cytosin, guanin og tymin, og andre naturlig og ikke-naturlig forekommende nukleobaser, substituerte og ikke-substituerte aromatiske enheter.
En modifisert base er enhver base som er kjemisk forskjellig fra den naturlig forekommende base som typisk finnes i DNA og RNA så som T, C, G , A og U, men som deler basisk kjemiske strukturer med disse naturlig forekommende baser. Den modifiserte nukleotidbase kan for eksempel være valgt blant hypoksantin, uracil, dihydrouracil, pseudouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-aminouracil, 5-(C1-C6)-alkyluracil, 5-(C2-C6)-alkenyluracil, 5-(C2-C6)-alkynyluracil, 5-(hydroksymetyl)uracil, 5-kloruracil,
5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-hydroksycytosin, 5-(C1-C6)-alkylcytosin, 5-(C2-C6)-alkenylcytosin, 5-(C2C6)-alkynylcytosin, 5-klorcytosin, 5-fluorcytosin, 5-bromcytosin, N<2>-dimetylguanin, 2,4-diaminopurin, 8-azapurin, en substituert 7-deazapurin, fortrinnsvis 7-deaza-7-substituert og/eller
7-deaza-8-substituert purin, 5-hydroksymetylcytosin, N4-alkylcytosin, for eksempel N4-etylcytosin, 5-hydroksydeoksycytidin, 5-hydroksymetyldeoksycytidin, N4-alkyldeoksycytidin, for eksempel N4-etyldeoksycytidin, 6-tiodeoksyguanosin og deoksyribonukleotider av nitropyrol, C5-propynylpyrimidin og diaminopurin for eksempel 2,6-diaminopurin, inosin, 5-metylcytosin, 2-aminopurin,
2-amino-6-klorpurin, hyposkantin eller andre modifiseringer av en naturlig nukleotidbase. Denne liste er ment å angi eksempler og er ikke tiltenkt å tolkes begrensende.
I noen av formlene som er beskrevet heri, så blir et sett av modifiserte baser definert. For eksempel anvendes bokstaven Y for å referere til pyrimidin og i noen utførelser en nukleotidinneholdende cytosin eller en modifisert cytosin. En modifisert cytosin som anvendt heri er en naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende pyrimidin baseanalog av cytosin som kan erstatte denne base uten å svekke den immunstimulatoriske aktivitet av oligonukleotidet. Modifiserte cytosiner inkluderer, men er ikke begrenset til 5-substituerte cytosiner (for eksempel 5-metylcytosin, 5-fluorcytosin, 5-klorcytosin, 5-bromcytosin, 5-jodcytosin, 5-hydroksycytosin, 5-hydroksymetylcytosin, 5-difluormetylcytosin og ikke-substituert eller substituert 5-alkynylcytosin), 6-substituerte cytosiner, N4-substituerte cytosiner (for eksempel N4-etylcytosin), 5-azacytosin, 2-mercaptocytosin, isocytosin, pseudo-isocytosin, cytosine analoger med kondenserte ringsystemer (for eksempel N,N’-propylencytosin eller fenoksazin) og uracil og dets derivater (for eksempel 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-bromvinyluracil, 4-tiouracil, 5-hydroksyuracil, 5-propynyluracil). Noen av de foretrukne cytosiner inkluderer 5-metylcytosin, 5-fluorcytosin, 5-hydroksycytosin, 5-hydroksymetylcytosin og N4-etylcytosin. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er cytosinbasen substituert med en universell base (for eksempel 3-nitropyrrol, P-base), et aromatisk ringsystem (for eksempel fluorbenzen eller difluorbenzen) eller et hydrogenatom (dSpacer).
Bokstaven Z anvendes for å referere til en purin, pyrimidin eller a-baser og i noen utførelser en guanin eller modifisert guaninbase. En modifisert guanin som anvendt heri er en naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende purinbaseanalog av guanin som kan erstatte denne base uten å svekke den immunstimulatoriske aktivitet av oligonukleotidet. Modifiserte guaniner inkluderer, men er ikke begrenset til 7-deazaguanin, 7-deaza-7-substituert guanin (så som 7-deaza-7-(C2-C6)alkynylguanin), 7-deaza-8-substituert guanin, hypoksantin, N2-substituerte guaniner (for eksempel N2-metylguanin), 5-amino-3-metyl-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pyrimidin-2,7-dion, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, purin, indol, adenin, substituerte adeniner (for eksempel N6-metyladenin, 8-oksoadenin) 8-substituert guanin (for eksempel 8-hydroksyguanin og 8-bromguanin) og 6-tioguanin. I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen er guaninbasen substituert med en universalbase (for eksempel.4-metylindol, 5-nitroindol, og K-base), et aromatisk ringsystem (for eksempel benzimidazol eller diklorbenzimidazol, 1-metyl-1H-[1,2,4]triazol-3-karboksylisk syreamid) eller et hydrogenatom (dSpacer).
Oligonukleotidene kan ha én eller flere aksessbare 5'-ender. Det er mulig å etablere modifiserte oligonukleotider som har to slike 5'-ender. Dette kan oppnås for eksempel ved å tilfeste to oligonukleotider gjennom en 3'-3'-binding for å generere et oligonukleotid som har én eller to aksessbare 5'-ender.3'-3'-bindingen kan være en fosfodiester, fosforotioat eller enhver annen modifisert internukleotidbro. Framgangsmåter for å utføre slike koblinger er kjent innen feltet. For eksempel, slike bindinger har blitt beskrevet i Seliger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 and Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
Videre, 3'-3'-koblete nukleinsyrer hvor bindingen mellom 3'-termale nukleotider ikke er fosfodiester, fosfortioat eller annen modifisert bro, kan framstilles ved å anvende en ytterligere spacer, så som trieller tetraetylenglykolfosfatenhet (Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, US Patent No.5658738, and US Patent No.5668265).
Alternativt, den ikke-nukleotidiske linker kan være avledet fra et etandiol, propandiol eller fra en abasisk deoksyribose (dSpacer)- enhet (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) ved anvendelse av standard fosforamidat kjemi. Den ikkenukleotidiske linker kan være inkorporert én eller flere ganger, eller kombineres med hverandre, noe som muliggjør for enhver ønsket avstand mellom 3'-endene og av de to ODNer som skal forbindes.
Oligonukleotidene er spesielt resistente mot degradering (for eksempel er stabilisert). Et "stabilisert oligonukleotidmolekyl" skal bety et oligonukleotid som er relativt resistent til in vivo degradering (for eksempel via en ekso- eller endo-nuklease). Nukleinsyrestabilisering kan utføres med backbonemodifiseringer. Oligonukleotider som har fosforotioatbindinger tilveiebringer maksimal aktivitet og beskytter oligonukleotidet fra degradering av intracellulære ekso- og endo-nukleaser. Andre modifiserte oligonukleotider inkluderer fosfodiestermodifiserte nukleinsyrer, kombinasjoner av fosfodiester og fosfortioat nukleinsyrer, metylfosfonat, metylfosforotioat, fosforoditioat, p-etoksy og kombinasjoner derav.
Modifiserte backbones, så som fosforotioater kan syntetiseres ved anvendelse av automatiserte teknikker som benytter enten fosforamidat eller H-fosfonat kjemi. Aryl- og alkyl-fosfonater kan framstilles for eksempel som beskrevet i US patent nr.4,469,863; og alkylfosfotriestere (hvor den ladete oksygenenhet er alkylert som beskrevet i US patent nr.5,023,243 og europeisk patent nr. 092,574) kan framstilles med automatisert fastfasesyntese ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser. Framgangsmåter for å framstille andre DNA backbone modifiseringer og substitueringer har blitt beskrevet (for eksempel Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev.90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem.1:165, 1990).
Andre stabiliserte oligonukleotider inkluderer: ikke-ioniske DNA-analoger, så som alkyl- og arylfosfater (hvor det ladete fosfonatoksygen er erstattet av en alkyl- eller arylgruppe), fosfodiester og alkylfosfotriestere, hvor den ladete oksygenenhet er alkylert. Nukleinsyrer som inneholder diol, så som tetraetylenglykol eller heksaetylenglykol, ved én eller begge termini har også blitt vist å være i vesentlig grad resistent til nuklease degradering.
I noen utførelser omfatter oligonukleotidet én eller flere palindromiske sekvenser. Som anvendt heri, "palindrom" og ekvivalent, "palindromsekvens" skal bety en invertert repetering, det vil si en sekvens så som ABCDEE'D'C'B'A' hvor A og A', B og B', etc., er baser som er i stand til å danne den vanlige Watson-Crick basepar. I noen tilfeller er palindromet GC-rikt. Et GC-rikt palindrom er et palindrom som har en basesammensetning av minst to tredeler G'er og C'er. I noen utførelser er det GC-rike domene fortrinnsvis 3' til "B-cellestimulatorisk domene". I tilfelle av en 10-base lang GC-rik palindrom, inneholder palindromet således minst 8 G'er og C'er. I tilfelle av en 12-base lang GC-rik palindrom, inneholder palindromet også minst 8 G'er og C'er. I tilfelle av en 14-mer GC-rik palindrom, er minst ti baser av palindromet G'er og C'er. I noen utførelser er GC-rikt palindrom utgjort eksklusivt av G'er og C'er. I noen utførelser inneholder oligonukleotidet mer enn én palindromisk sekvens.
DNA er en polymer av deoksyribonukleotider koblet gjennom 3'-5' fosfodiesterbindinger. Enheter av polymeren ifølge oppfinnelsen kan også kobles gjennom 3'-5'-fosfodiesterbindinger. Imidlertid, oppfinnelsen omfatter også polymerer som har uvanlige internukleotidbindinger, inkluderende spesifikt 5′-5′, 3′-3′, 2′-2′, 2′-3′ og 2′-5′ internukleotidbindinger. I én utførelse er de uvanlige bindinger ekskludert fra det immunstimulatoriske DNA-motiv, selv om én eller flere av slike bindinger kan forekommer annet sted innen polymeren. For polymerer som har frie ender, kan inkludering av en 3'-3'-internukleotidbinding resultere i en polymer som har to frie 5'-ender. Omvendt, for polymerer som har frie endrer kan inkludering av en 5'-5'-internukleotidbinding resultere i en polymer som har to frie 3'-ender.
En immunstimulatorisk sammensetning ifølge oppfinnelsen kan inneholde to eller flere immunstimulatoriske DNA-motiver som kan kobles gjennom en forgreningsenhet. Internukleotidbindingene kan være 3′-5′, 5′-5′, 3′-3′, 2′-2′, 2′-3′ eller 2′-5′-bindinger. Dermed, nomenklanturen 2'-5' er valgt i samsvar med karbonatomet av deoksyribose. Imidlertid, dersom unaturlige sukkerenheter benyttes, så som ring-ekspanderte sukkeranaloger (for eksempel heksanose, syloheksen eller pyranose) eller bi- eller trisykliske sukkeranaloger, så forandres denne nomenklatur i samsvar med nomenklaturen av monomeren. Den uvanlige internukleotidbinding kan være en fosfodiesterbinding, men den kan alternativt være modifisert som fosforotioat eller enhver annen modifisert binding som beskrevet heri.
Formel IV viser en generell struktur for forgrenete DNA-oligomerer og modifiserte oligoribonukleotidanaloger ifølge oppfinnelsen via en nukleotidisk forgreningsenhet. Dermed kan Nu1, Nu2og Nu3være koblet gjennom 3′-5′, 5′-5′, 3′-3′, 2′-2′, 2′-3′ eller 2′-5′ -bindinger. Forgrening av DNA-oligomerer kan også involvere anvendelse av ikke-nukleotidiske linkere og abasiske spacere. I én utførelse representerer Nu1, Nu2og Nu3identiske eller forskjellige immunstimulatoriske DNA-motiv.
Formel IV
Den modifiserte oligoribonukleotidanalog kan inneholde en doblings- eller triplingsenhet (Glen Research, Sterling, VA), fortrinnsvis de som er modifisert av oligodeoksyribonukleotid analoger med en 3'-3'-binding. En doblingsenhet i én utførelse kan være basert på 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoksytrityloksy)pentylamido]propyl-2-[(2-cyanoetyl)-(N,N-diisopropyl)]-fosforamidit. En triplingsenhet i én utførelse kan være basert på inkorporering av tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimetoksytrityloksy)propyloksymetyl]etyl-[(2-cyanoetyl)-(N,N-diisopropyl)]-fosforamidit. Forgrening av de modifiserte oligoribonukleotidanaloger med multiple doblere, triplere eller andre multipliseringsenheter fører til dendrimerer som er en ytterligere utførelse av denne oppfinnelse. Forgrenete modifiserte oligoribonukleotidanaloger kan føre til kryssbinding av reseptorer spesielt for kombinasjoner av immunstimulatoriske RNA og NDA så som TLR3, TLR7, TLR8 og TLR9 med distinktive immuneffekter sammenliknet med ikke-forgrenete former av analogene. I tillegg, syntesen av forgrenete eller på annen måte multimeriske analoger kan stabilisere DNA mot degradering og kan muliggjøre svake eller spesielt effektive DNA-sekvenser og utløse en terapeutisk nyttig nivå av immunaktivitet. De modifiserte oligodeoksyribonukleotidanaloger kan også inneholde linkerenheter som resulterer fra peptidmodifiserende reagenser eller oligonukleotidmodifiserende reagenser (Glen Research). Videre, de modifiserte oligodeoksyribonukleotid analoger kan inneholde én eller flere naturlige eller unaturlige aminosyreenheter som er forbundet til polymeren med peptid (amid) bindinger.
3′-5′, 5′-5′, 3′-3′, 2′-2′, 2′-3′ og 2′-5′ internukleotidbindingene kan være direkte eller indirekte. Direkte bindinger i denne kontekst refererer til et fosfat eller modifisert fosfatbinding som beskrevet heri, uten en intervenerende linkerenhet. En intervenerende linkerenhet er en organisk enhet som er distinkt fra et fosfat eller modifisert fosfatbinding som beskrevet heri, som for eksempel kan inkludere polyetylenglykol, trietylenglykol, heksaetylenglykol, dSpacer (det vil si en abasisk deoksynukleotid), doblerenhet eller triplerenhet.
Bindingene er fortrinnsvis sammensatt av C, H, N, O, S, B, P og halogen, inneholdende 3 til 300 atomer. Et eksempel med 3 atomer er en acetalbinding (ODN1-3’-O-CH2-O-3’-ODN2) som forbinder for eksempel 3'-hydroksygruppen av et nukleotid til 3'-hydroksygruppen av en andre oligonukleotid. Et eksempel med ca.300 atomer er PEG-40 (tetrakontapolyetylenglykol). Foretrukne bindinger er fosfodiester, fosforotioat, metylfosfonat, fosforamidat, boranofosfonat, amid, eter, tioeter, acetal , tioacetal, urea, tiourea, sulfonamid, Schiffs base og disulfidbindinger. Det er mulig å anvende Solulink biokonjugeringssystem, det vil si (www.trilinkbiotech.com).
Dersom oligonukleotidet er sammensatt av to eller flere sekvensdeler, kan disse deler være identiske eller forskjellige. Således, i et oligonukleotid med en 3'-3'-binding, kan sekvensene være identiske 5’-ODN1-3’3’-ODN1-5’ eller forskjellige 5’-ODN1-3’3’-ODN2-5’. Videre, den kjemiske modifisering av de forskjellige oligonukleotideler, og likeledes linkeren som forbinder disse, kan være forskjellig. Siden opptaket av korte oligonukleotider synes å være mindre effektiv enn for lange oligonukleotider, kan kobling av to eller flere korte sekvenser resultere i forbedret immunstimulering. Lengden av de korte oligonukleotider er fortrinnsvis 2-20 nukleotider, mer fortrinnsvis 3-16 nukleotider, men mest fortrinnsvis 5-10 nukleotider. Foretrukket er koblete oligonukleotider som har to eller flere ikke-koblete 5'-ender.
De partielle sekvenser av oligonukleotidet kan også være koblet med ikke-nukleotidiske linkere. En "ikke-nukleotidisk linker" som anvendt heri refererer til ethvert linkerelement som ikke er et nukleotid eller polymer derav (det vil si et polynukleotid), hvor et nukleotid inkluderer en purin eller pyrimidinnukleobase og et sukkerfosfat, spesielt abasiske linkere (dSpacere), trietylenglykolenheter eller heksaetylenglykolenheter. Videre foretrukne linkere er alkylaminolinkere, så som C3, C6, C12 aminolinkere, og også alkyltiolinkere så som C3 eller C6 tiollinkere. Oligonukleotidene kan også være koblet med aromatiske enheter som kan være ytterligere substituert med alkyl eller substituerte alkylgrupper.
For å fremme opptak inn i cellene, er de immunstimulatoriske oligonukleotider i noen utførelser i området 3 til 100 baser i lengde. I noen utførelser er oligonukleotidene 7-100 baser i lengde. Typisk, nukleinsyrer av enhver størrelse større enn 6 nukleotider (også mange kb lang) er i stand til å indusere en immunrespons i samsvar med oppfinnelsen dersom tilstrekkelige immunstimulatoriske motiver er foreliggende. Imidlertid, den forbedrete immunstimulatoriske kapasitet av de modifiserte oligonukleotider ifølge oppfinnelsen tilveiebringer for immunstimulatoriske molekyler av mye kortere lengde. I noen utførelser er de immunstimulatoriske oligonukleotider 3-6 baser i lengde.
CpG immunstimulatoriske oligonukleotider er nyttige i noen aspekter av oppfinnelsen som en vaksine i behandling av et individ i risiko for å utvikle allergi eller astma, en infeksjon med en infeksiøs organisme eller en cancer hvor et spesifikt canceraktig gen har blitt identifisert. De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider kan også gis uten antigen eller allergen for å beskytte mot infeksjon, allergi eller cancer, og i dette tilfellet kan repeterte doseringer muliggjøre langtidsbeskyttelse. Et individ i risiko som anvendt heri, er et individ som har enhver risiko for eksponering til et infeksiøst forårsakende patogen eller en cancer eller et allergen eller som har en risiko for å utvikle cancer. For eksempel, et individ i risiko kan være et individ som planlegger å reise til et område hvor en bestemt type infeksjonsagent finnes, eller det kan være et individ som gjennom sin livsstil eller medisinske prosedyrer er eksponert til kroppsfluider som kan inneholde infeksiøse organismer eller direkte til organismen eller det kan være ethvert individ som lever i et område hvor en infeksiøs organisme eller et allergen har blitt identifisert. Individer i risiko for å utvikle infeksjon inkluderer også generelt populasjoner som et medisinsk byrå anbefaler vaksinering med bestemte infeksiøse organisme antigen. Dersom antigenet er et allergen og individet utvikler allergiske responser til dette bestemte antigen, og individet kan eksponeres til antigenet, for eksempel under en pollensesong, så er individet i risiko for eksponering til antigenet. Et individ i risiko for å utvikle allergi eller astma inkluderer de individer som har blitt identifisert som å ha allergi eller astma, men som ikke har den aktive sykdom under den CpG immunstimulatoriske oligonukleotidbehandling, og likeledes individer som vurderes å være under risiko for å utvikle disse sykdommer på grunn av genetiske eller miljømessige faktorer.
Et individ som er i risiko for å utvikle en cancer, er et som har høy sannsynlighet for å utvikle cancer. Disse individer inkluderer, for eksempel, individer som har en genetisk abnormitet, hvis nærvær har blitt demonstrert til å en korrelerende relasjon til en høyere sannsynlighet for å utvikle cancer, og individer som er eksponert til cancer - forårsakende midler så som tobakk, asbest eller andre kjemiske toksiner, eller et individ som tidligere har blitt behandlet for cancer og som kan få tilbakeslag. Idet et individ under risiko for å utvikle cancer behandles med et antigen som er spesifikt for den type cancer hvortil individet har en risiko for å utvikle, og et CpG immunstimulatorisk oligonukleotid, så kan individet være i stand til å drepe cancercellene idet de uvikler seg. Dersom en tumor begynner å dannes i individet vil individet utvikle en spesifikk immunrespons mot tumorantigenet.
I tillegg til anvendelse av de CpG immunstimulatoriske oligonukleotider for profylaktisk behandling, så omfatter oppfinnelsen også anvendelse av de CpG immunstimulatoriske oligonukleotider for behandling av et individ som har en infeksjon, en allergi, astma eller en cancer.
Et individ som har en infeksjon er et individ som har blitt eksponert til et infeksiøst patogen og har akutte eller kroniske detekterbare nivåer av patogenet i kroppen. De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider kan anvendes med eller uten et antigen for å etablere et antigen spesifikt systemisk eller mukosal immunrespons som er i stand til å redusere nivået av eller utrydde det infeksiøse patogen. En infeksiøs sykdom, som anvendt heri, er en sykdom som oppstår fra nærvær av en fremmed mikroorganisme i kroppen. Det er spesielt viktig å utvikle effektive vaksinestrategier og behandlinger for å beskytte kroppens mukosale overflater, som er primære sted for patogenisk inngang.
Et individ som har en allergi er et individ som har eller er under risiko for å utvikle en allergisk reaksjon i respons til et allergen. En allergi refererer til ervervet hypersensivitet til en substans (allergen).
Allergiske tilstander inkluderer, men er ikke begrenset til, eksem, allergisk rhinitt eller coryza, høyfeber, konjunktivitt, bronkial astma, urtikaria (elveblest) og ernæringsallergier, og andre atopiske tilstander.
Allergier er generelt forårsaket av IgE antistoff generering mot harmløse allergener. Cytokinene som induseres av systemisk eller mukosal administrering av CpG immunstimulatoriske oligonukleotider er i hovedsak av en klasse benevnt Th1 (eksempler er IL-12, IP-10, IFN-α og IFN-γ) og disse inkluderer både humorale og cellulære immunresponser. Den andre hovedtype immunresponser, som er assosiert med produksjon av IL-4 og IL-5 cytokiner, benevnes Th2 immunrespons. Generelt, det synes som om allergeniske sykdommer er mediert av Th2 type immunresponser. Basert på evnen av CpG immunstimulatoriske oligonukleotider til å skifte immunresponsen i et individ fra en dominerende Th2 (som assosiert med produksjon av IgE antistoff og allergi) til en balansert Th2/Th1-respons (som er beskyttende mot allergiske reaksjoner) kan en effektiv dosering for å indusere en immunrespons av et CpG immunstimulatorisk oligonukleotid administreres til et individ for å behandle eller hindre astma og allergi.
Således, de CpG immunstimulatoriske oligonukleotider har signifikant terapeutisk anvendelse i behandling av allergi og ikke-allergiske tilstander så som astma. Th2-cytokinene, spesielt IL-4 og IL-5, er forhøyet i luftveiene til astmatiske individer. Disse cytokiner fremmer viktige aspekter av den astmatiske inflammatoriske respons, inkluderende IgE isotopswitching, eosinofil kjemotaktisk og aktivering av mastcellevekst. Th1-cytokiner, spesielt IFN-γ og IL-12, kan undertrykke dannelse av Th2-kloner og produksjon av Th2-cytokiner. Astma refererer til en forstyrrelse av det respiratoriske system karakterisert ved inflammasjon, innsnevring av luftveiene og øket reaktivitet i luftveiene til inhalerte agents. Astma er hyppig, men ikke alltid, assosiert med atopiske eller allergiske symptomer.
Et individ som har en cancer er et individ som har detekterbare cancerceller. Canceren kan være en malign eller ikke-malign cancer. Cancere eller tumorer inkluderer, men er ikke begrenset til, gallecancer; hjernecancer; brystcancer; cervikal cancer; koriokarsinom; tarmcancer; endometrial cancer; esofageal cancer; gastrisk cancer; intraepitelial neoplasma; lymfomaer; levercancer; lungecancer (for eksempel småcelle- og ikke-småcelle); melanom; neuroblastomaer; oral cancer; eggstokkcancer; pancreas cancer; prostatacancer; rektal cancer; sarkomaer; hudcancer; testikkulær cancer; tyroid cancer; og renal cancer, og likeledes andre karsinomaer og sarkomaer. I én utførelse er canceren hårcelleleukemi, kronisk myelogenoøs leukemi, kutanøs T-celle leukemi, multippel myelom, follikulær lymfom, malign melanom, skvamøs cellekarsinom, renal cellekarsinom, prostata karsinom, blærecellekarsinom, eller tarmkarsinom.
Et individ skal bety et menneske eller vertebrat dyr, inkluderende men ikke begrensende til en hund, katt, hest, ku, gris, sau, geit, kalkun, kylling, primat, for eksempel ape og fisk (akvakulturarter), for eksempel laks. Således, oppfinnelsen kan også anvendes for å behandle cancer og tumorer, infeksjoner og allergi/astma i ikke-humane individer. Cancer er en av de viktigste årsaker til død i selskapsdyr (for eksempel katter og hunder).
Som anvendt heri, termen behandle, behandlet eller behandling, idet den anvendes med hensyn til en forstyrrelse så som en infeksiøs sykdom, cancer, allergi eller astma, refererer til en profylaktisk behandling som øker motstandsdyktighet i et individ til å utvikle sykdommen (for eksempel for infeksjon med et patogen), eller med andre ord, redusere sannsynligheten for at individet vil utvikle sykdommen (for eksempel bli infisert med patogenet) og likeledes behandling etter at individet har utviklet sykdommen for å kjempe mot sykdommen (for eksempel å redusere eller eliminere infeksjon) eller hindre at sykdommen blir verre.
I de tilfeller idet CpG oligonukleotidet administreres med et antigen, kan individet være eksponert for antigenet. Som anvendt heri, termen eksponert refererer til enten det aktive trinn å sette individet i forbindelse med et antigen eller den passive eksponering av individet til in vivo. Framgangsmåter for aktiv eksponering til et individ til et antigen er godt kjent innen fagfeltet. Generelt, et antigen administreres direkte til individet ved enhver måte så som intravenøs, intramuskulær, oral, transdermal, mukosal, intranasal, intratrakeal eller subkutanøs administrering. Antigenet kan administreres systemisk eller lokalt. Framgangsmåter for administrering av antigenet og de CpG immunstimulatoriske oligonukleotid er beskrevet i mer detalj nedenfor. Et individ eksponeres passivt til et antigen dersom et antigen blir tilgjengelig for eksponering til immuncellene i kroppen. Et individ kan for eksempel bli passivt eksponert til et antigen, for eksempel ved inngang av et fremmed patogen inn i kroppen eller ved utvikling av en tumorcelle som uttrykker et fremmed antigen på sin overflate.
Framgangsmåtene hvor et individ passivt eksponeres til et antigen kan spesielt være avhengig av timing av administrasjon av CpG immunstimulatoriske oligonukleotider. For eksempel, i et individ som har risiko for å utvikle cancer eller infeksiøs sykdom eller en allergisk eller astmatisk respons, kan individet administreres det CpG immunstimulatoriske oligonukleotid på en regulær basis idet denne risiko er høyest, det vil si under allergisesong eller etter eksponering til et cancerforårsakende agens. Videre, det CpG immunstimulatoriske oligonukleotid kan administreres til reisende før de reiser til fremmede land der de er under risiko for eksponering til infeksiøse midler. Likeledes, CpG immunstimulatorisk oligonukleotid kan administreres til soldater eller sivile i risiko for eksponering til en biokrigsføring for å indusere en systemisk eller mukosal immunrespons til antigenet når og dersom individet eksponeres til dette.
Et antigen som anvendt heri er et molekyl som er i stand til å fremme en immunrespons. Antigenet inkluderer, men er ikke begrenset til, celler, celleekstrakter, proteiner, polypeptider, peptider, polysakkarider, polysakkarid konjugater, peptid- og ikke-peptid etterlikninger av polysakkarider og andre molekyler, små molekyler, lipider, glykolipider, karbohydrater, virus og virale ekstrakter og multicellulære organismer så som parasitter og allergener. Termen antigen inkluderer bredt enhver type molekyl som gjenkjennes av en verts immunsystem som å være fremmende. Antigenet inkluderer, men er ikke begrenset til, cancerantigener, mikrobielle antigener og allergener.
Et cancer antigen som anvendt heri er en forbindelse, så som et peptid eller et protein, assosiert med en tumor eller cancercelleoverflate og som er i stand til å fremme en immunrespons idet den uttrykkes på overflaten av en antigenpresenterende celle i konteksten av et MHC-molekyl. Cancerantigener kan framstilles fra cancerceller enten ved å framstille råekstrakter av cancerceller, for eksempel som beskrevet i Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055, ved partielt å rense antigenene, ved rekombinant teknologi, eller med de novo syntese av kjente antigener. Cancerantigener inkluderer, men er ikke begrenset til, antigener som er rekombinant uttrykt, en immunogenisk porsjon av, eller en heltumor eller cancer. Slike antigener kan isoleres eller prepareres rekombinant eller med andre kjente metoder innen fagfeltet.
Et mikrobielt antigen som anvendt heri er et antigen av en mikroorganisme og inkluderer men er ikke begrenset til virus, bakterier, parasitter og fungi. Slike antigener inkluderer den intakte mikroorganisme og likeledes naturlig isolater og fragmenter eller derivater derav og også syntetiske forbindelser som er identiske til eller liknende til naturlige mikroorganismer antigener og som induserer en immunrespons som er spesifikk for denne mikroorganisme. En forbindelse er liknende til en naturlig mikroorganisme antigen dersom det induserer en immunrespons (humoral og/eller cellulær) til en naturlig mikroorganisme antigen. Slike antigener anvendes rutinemessig innen fagfeltet og er godt kjent for de fagkyndige inne fagfeltet.
Virus er små infeksiøse agens som generelt inneholder en nukleinsyrekjerne og en proteinkappe, men som ikke er uavhengig levende organismer. Virus kan også ha form av infeksiøse nukleinsyrer som mangler et protein. Et virus kan ikke overleve i fravær av en levende celle hvori den kan replikere. Virus entrer spesifikke levende celler enten ved endocytose eller med direkte injeksjon av DNA (fag) og multipliserer seg og forårsaker sykdom. De multipliserte virus kan deretter frigjøres og infisere ytterligere celler. Noen virus er DNA-inneholdende virus, og andre er RNA-inneholdende virus. DNA-virus inkluderer pox, herpes, adeno, papova, parvo og hepadna. RNA-virus inkluderer picorna, calici, astro, toga, flavi, corona, paramykso, ortomykso, bunya, arena, rabdo, filo, borna, reo og retro. I noen aspekter av foreliggende oppfinnelse søker oppfinnelsen også å behandle sykdommer hvor prioner er implisert i sykdomsutviklingen så som for eksempel bovin spongiform encefalopati (det vil si kugalskap, BSE) eller skrapesykeinfeksjon i dyr eller Creutzfeldt-Jakob sykdom i mennesker.
Virus inkluderer, men er ikke begrenset til, enterovirus (inkluderende, men ikke begrenset til virus av familien picornaviridae, så som poliovirus, coxsackie virus, echo virus), rotavirus, adenovirus og hepatittvirus, så som hepatitt A, B, C, D og E. Spesifikke eksempler på virus som har blitt funnet i mennesker inkluderer, men er ikke begrenset til: Retroviridae (for eksempel humane immunsviktvirus så som HIV-1 (også benevnt som HTLV-III, LAV eller HTLV-III/LAV, eller HIV-III; og andre isolater så som HIV-LP; Picornaviridae (for eksempel poliovirus, hepatitt A virus; enterovirus, humane Coxsackie virus, rhinovirus, echovirus); Calciviridae (for eksempel stammer som forårsaker gastroenteritt); Togaviridae (for eksempel ekuin encefalitt virus, rubellavirus); Flaviviridae (for eksempel denguvirus, encefalitt virus, gulfebervirus); Coronaviridae (for eksempel koronavirus); Rhabdoviridae (for eksempel vesikulære stomatitt virus, rabiesvirus); Filoviridae (for eksempel ebolavirus);
Paramyxoviridae (for eksempel parainfluensavirus, kusmavirus, meslingvirus, respiratorisk syncytial virus); Orthomyxoviridae (for eksempel influensavirus); Bunyaviridae (for eksempel hantaanvirus, bunyavirus, flebovirus og nairovirus); Arenaviridae (hemorrhagisk febervirus); Reoviridae (for eksempel reovirus, orbivirus og rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (hepatitt B virus);
Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (papillomavirus, polyomavirus); Adenoviridae (de fleste adenovirus); Herpesviridae (herpes simplex virus (HSV) 1 og 2, varicella zoster virus, cytomegalovirus (CMV)); Poxviridae (variolavirus, vaksiniavirus, pox virus); Iridoviridae (for eksempel afrikansk svinefebervirus); og andre virus så som akutt laryngotrakeal bronkittvirus, alfavirus, Kaposis sarkomassosiert herpesvirus, Newcastle sykdomvirus, Nipah virus, Norwalk virus, papillomavirus, parainfluensavirus, fugleinfluensa, SARs virus, West Nile virus.
Framgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige, i noen utførelser, for behandling av human immunsviktvirus (HIV) og hepatittvirus. HIV, en spesies av retrovirus også kjent som human T-celle lymfotropisk virus III (HTLV III), er ansvarlig for å forårsake den ødeleggelse som resulterer i forstyrrelser kjent som AIDS. HIV infiserer og ødelegger T-celler, forstyrrer den totale balanse i immunsystemet, som resulterer i et tap i pasienters evne til å bekjempe andre infeksjoner og en predisponering av pasienten for opportunistiske infeksjoner som hyppig blir fatale.
Viral hepatitt er en inflammasjon av leveren som kan produsere svelling, ømhet og noen ganger permanent skade på lever. Dersom inflammasjonen av leveren fortsetter i seks måneder eller lenger, så benevnes den som kronisk hepatitt. Der er minst fem forskjellige virus kjent til å forårsake viral hepatitt, inkluderende hepatitt A, B, C, D og E. Hepatitt A kommuniserer generelt gjennom ernæring eller drikkevann som er forurenset med human feces. Hepatitt B spres generelt gjennom kroppsfluider, så som blod. For eksempel, det kan spres fra mor til barn ved fødsel, gjennom seksuell kontakt, eller ved kontaminerte blodtransfusjoner og nåler. Hepatitt C er ganske vanlig og som hepatitt B spres den ofte gjennom blodtransfusjoner og kontaminerte nåler. Hepatitt D finnes for det meste i IV medikamentbrukere som er bærere av hepatitt B virus som det ko-assosierer til. Hepatitt E er liknende til viral hepatitt A og er generelt assosiert med dårlig hygiene.
Både gram negative og gram positive bakterier fungerer som antigener i vertebratdyr. Slike gram positive bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, Pasteurella arter, Staphylococci arter og Streptococcus arter. Gram negative bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, Escherichia coli, Pseudomonas arter og Salmonella arter. Spesifikke eksempler på infeksiøse bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (for eksempel M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia og Actinomyces israelli.
Eksempler på fungi inkluderer Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Andre infeksiøse organismer (det vil si protister) inkluderer Plasmodium spp .så som Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale og Plasmodium vivax og Toxoplasma gondii. Blodborne og/eller vevsparasitter inkluderer Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense and Trypanosoma rhodesiense (African sleeping sickness), Trypanosoma cruzi (Chagas’ sykdom) og Toxoplasma gondii.
Andre medisinsk relevante mikroorganismer har blitt beskrevet i stor grad i litteraturen, for eksempel se C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, hvis hele innhold inkorporeres heri med referanse.
Et allergen refererer til en substans (antigen) som kan indusere en allergisk eller astmatisk respons i et mottakelig individ. Listen av allergener er enorm og kan inkludere pollen, insekt venomer, flass fra dyr, fungale sporer og medikamenter (for eksempel penicillin). Eksempler på naturlige, animalske og planteallergener inkluderer, men er ikke begrenset til proteiner som er spesifikke til følgende genus: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (for eksempel Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (for eksempel Lolium perenne or Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (for eksempel Plantago lanceolata); Parietaria (for eksempel Parietaria officinalis or Parietaria judaica); Blattella (for eksempel Blattella germanica); Apis (for eksempel Apis multiflorum); Cupressus (for eksempel Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica and Cupressus macrocarpa); Juniperus (for eksempel Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis and Juniperus ashei); Thuya (for eksempel Thuya orientalis); Chamaecyparis (for eksempel Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (for eksempel Periplaneta americana); Agropyron (for eksempel Agropyron repens); Secale (for eksempel Secale cereale); Triticum (for eksempel Triticum aestivum); Dactylis (for eksempel Dactylis glomerata); Festuca (for eksempel Festuca elatior); Poa (for eksempel Poa pratensis or Poa compressa); Avena (for eksempel Avena sativa); Holcus (for eksempel Holcus lanatus); Anthoxanthum (for eksempel Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (for eksempel Arrhenatherum elatius); Agrostis (for eksempel Agrostis alba); Phleum (for eksempel Phleum pratense); Phalaris (for eksempel Phalaris arundinacea); Paspalum (for eksempel Paspalum notatum); Sorghum (for eksempel Sorghum halepensis); and Bromus (for eksempel Bromus inermis).
Termen i vesentlig grad renset som anvendt heri, refererer til et polypeptid som er i hovedsak fri for andre proteiner, lipider, karbohydrater eller annet materiale som det naturlig er assosiert med. En fagkyndig innen feltet kan rense virale og bakterielle polypeptider ved anvendelse av standardteknikker for proteinrensing. Det i hovedsak rene polypeptid vil ofte gi et enkelt hovedbånd på en ikkereduserende polyakrylamidgel. I tilfelle partielt glykosylerte polypeptider eller de som har flere start kodon, kan der være flere bånd på en ikke-reduserende polyakrylamidgel, men disse vil danne et distinktivt mønster for dette polypeptid. Renheten av det virale eller bakterielle polypeptid kan også bestemmes ved amino-terminal aminosyresekvensanalyse. Andre typer antigener som ikke kodes for av en nukleinsyrevektor så som polysakkarider, små molekyler, etterlikninger etc., er inkludert innenfor oppfinnelsen.
Oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et individ med et antimikrobielt middel. Et antimikrobielt middel, som anvendt heri, refererer til en naturlig forekommende eller syntetisk forbindelse som er i stand til å drepe eller inhibere infeksiøse mikroorganismer. Typen antimikrobielt middel som er nyttig i samsvar med oppfinnelsen, vil avhenge av type mikroorganisme som individet er infisert med eller som er under risiko for å bli infisert med. Antimikrobielle midler inkluderer, men er ikke begrenset til, antibakterielle midler, antivirale midler, antifungale midler og antiparasittiske midler.
Fraser så som "antiinfeksiøs middel", antibakterielt middel", antiviralt middel", "antifungalt middel", "antiparasittisk middel" og "parasitticid" har godt etablerte betydninger for de fagkyndige innen feltet og er definert i standard medisinske lærebøker. Kort forklart, antibakterielle midler dreper eller inhiberer bakterier, og inkluderer antibiotika og likeledes andre syntetiske eller naturlig forbindelser som har tilsvarende funksjoner. Antibiotika er lavmolekyl vektmolekyler som produseres som sekundære metabolitter av celler, så som mikroorganismer. Generelt, antibiotika interfererer med én eller flere bakterielle funksjoner eller strukturer som er spesifikke for mikroorganismen, og som ikke er foreliggende i vertscellene. Antivirale midler kan isoleres fra naturlige kilder eller syntetiseres og er nyttige for å drepe eller inhibere virus. Antifungale midler anvendes for å behandle overflatesoppinfeksjoner, og likeledes opportunistiske og primærsystemiske soppinfeksjoner. Antiparasittmidler dreper eller inhiberer parasitter.
Eksempler på antiparasittiske midler, også referert til som parasitticider som er nyttige for human administrering inkluderer, men er ikke begrenset til albendazol, amfotericin B, benznidazol, bitionol, klorquin HCl, klorquin fosfat, clindamycin, dehydroemetin, dietylkarbamazin, diloksanid furoat, eflornitin, furazolidaon, glukokortikoider, halofantrin, jodquinol, ivermektin, mebendazol, mefloquine, meglumin antimoniat, melarsoprol, metrifonat, metronidazol, niklosamid, nifurtimoks, oksamniquine, paromomycin, pentamidin isetionat, piperazin, praziquantel, primaquin fosfat, proguanil, pyrantel pamoat, pyrimetanmin-sulfonamider, pyrimetanmin-sulfadoksin, quinacrine HCl, quininsulfat, quinidin glukonat, spiramycin, stiboglukonat natrium (natrium antimon glukonat), suramin, tetracyklin, doksycyklin, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoksazol og tryparsamid, og noen kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre.
Antibakterielle midler dreper eller inhiberer vekst eller funksjon til bakterier. En stor klasse antibakterielle midler er antibiotika. Antibiotika, som er effektive i å drepe eller inhibere et bredt spekter av bakterier, benevnes som bredsprektrumsantibiotika. Andre typer antibiotika er i hovedsak effektiv mot bakterier av klassen gram-positive eller gram-negative. Disse typer antibiotika benevnes som smalspektrede antibiotika. Andre antibiotika som er effektive mot en enkelt organisme eller sykdom og ikke mot andre typer bakterier, benevnes som antibiotika med et begrenset spektrum. Antibakterielle midler klassifiseres noen ganger basert på deres primære virkningsmodus. Generelt, antibakterielle midler er celleveggsyntese inhibitorer, cellemembran inhibitorer, proteinsyntese inhibitorer, nukleinsyresyntese eller funksjonelle inhibitorer, og kompetitive inhibitorer.
Antivirale midler er forbindelser som hindrer infeksjon av celler av virus eller replikasjon av virus innen cellen. Der er mange færre antivirale midler enn antibakterielle midler på grunn av at framgangsmåten av viral replikasjon er så nært beslektet med DNA-replikasjon innen vertscellen, at ikke-spesifikke antivirale midler ofte vil være toksiske for verten. Der er flere trinn i prosessen av viral infeksjon som kan blokkeres eller inhiberes av antivirale midler. Disse inkluderer: tilfesting av virus til vertscellen (immunoglobulin eller bindingspeptider), ikke-coating av viruset (for eksempel amantadin), syntese eller translasjon av viralt mRNA (for eksempel interferon), replikasjon av viral RNA eller DNA (for eksempel nukleotidanaloger), moding av nye virusproteiner (for eksempel protease inhibitorer) og budding og frigivelse av viruset.
Nukleotidanaloger er syntetiske forbindelser som er liknende nukleotider, men som har en ukomplett eller avvikende deoksyribose eller ribosegruppe. Straks nukleotidanalogene er i cellen så fosforyleres de, og produserer trifosfatformen som konkurrerer med normale nukleotider for inkorporering inn i viralt DNA eller RNA. Straks trifosfatformen av nukleotidanalogen er inkorporert inn i den voksende nukleinsyrekjede, så forårsaker den irreversibel assosiering med viral polymerase og således terminering av kjeden. Nukleotidanalogene inkluderer, men er ikke begrenset til, acyklovir (anvendes for behandling av herpes simplex virus og varicella-zoster virus), gancyklovir (nyttig for behandling av cytomegalovirus), idoksuridin, ribavirin (nyttig for behandling av respiratorisk syncitialt virus), dideoksyinosin, dideoksycytidin, zidovudin (azidotymidin), imiquimod og resimiquimod.
Interferonene er cytokiner som utskilles av virusinfiserte celler og av immunceller. Interferonene fungerer ved å binde til spesifikke reseptorer på celler tilgrensende til de infiserte celler, og forårsaker forandring i cellen som beskytter den fra infeksjon av virus. α- og β-interferon induserer også ekspresjon av klasse I og klasse II MHC-molekyler på overflaten av infiserte celler, som resulterer i en øket antigenpresentasjon for vert-immuncelle-gjenkjennelse. α- og β-interferoner er tilgjengelige som rekombinante former og har blitt anvendt for behandling av kronisk hepatitt B og C infeksjon. I de doseringer som er effektive for antiviral terapi, har interferonene flere bieffekter så som feber, ubehag og vekttap.
Antivirale midler nyttige ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til immunoglobuliner, amantadin, interferoner, nukleotidanaloger og proteaseinhibitorer. Spesifikke eksempler på antivirale midler inkluderer, men er ikke begrenset til acemannan; acyklovir; acyklovir natrium; adefovir; alovudin; alvircept sudotoks; amantadin hydroklorid; aranotin; arildon; atevirdin mesylat; avridin; cidofovir; cipamfyllin; cytarabin hydroklorid; delavirdin mesylat; desciklovir; didanosin; disoksaril; edoksudin; enviraden; enviroksim; famciklovir; famotin hydroklorid; fiacitabin; fialuridin; fosarilat; foskarnet natrium; fosfonet natrium; ganciklovir; ganciklovir natrium; idoksuridin; ketoksal; lamivudin; lobucavir; memotin hydroklorid; metisazon; nevirapin; penciklovir; pirodavir; ribavirin; rimantadin hydroklorid; saquinavir mesylat; somantadin hydroklorid; sorivudin; statolon; stavudin; tiloron hydroklorid; trifluridin; valacyklovir hydroklorid; vidarabin; vidarabin fosfat; vidarabin natriumfosfat; viroksim; zalcitabin; zidovudin og zinviroksim.
Antifungale midler er nyttige for behandling og hindring av infeksiøs sopp. Antifungale midler klassifiseres noen ganger med deres virkningsmekanisme. Noen antifungale midler fungerer som cellevegg inhibitorer ved å inhibere glukosesyntase. De inkluderer, men er ikke begrenset til, basiungin/ECB. Andre antifungale midler fungerer ved å destabilisere membranintegritet. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, , immidazoler, så som klotrimazol, sertakonzol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol og vorikonacol, og likeledes FK 463, amfotericin B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin og terbinafin. Andre antifungale midler fungerer ved å bryte ned kitin (for eksempel kitinase) eller immunundertrykkelse (501 cream).
CpG immunstimulatoriske oligonukleotider kan kombineres med andre terapeutiske midler så som adjuvanter for å forsterke immunresponsene. De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider og andre terapeutiske middel kan administreres samtidig eller sekvensvis. Idet de andre terapeutiske midler administreres samtidig kan de administreres i den samme eller separate formuleringer, men administreres samtidig. De andre terapeutiske midler administreres sekvensvis med et annet og med CpG immunstimulatorisk oligonukleotid, idet administreringen av de andre terapeutiske midler og GpG immunstimulatoriske oligonukleotid er temporært separert. Separasjon med hensyn til tid mellom administrering av disse forbindelser kan være et spørsmål om minutter eller det kan være lengre. Andre terapeutiske midler inkluderer, men er ikke begrenset til adjuvanter, cytokiner, antistoff, antigen, etc.
Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan administreres med ikke-nukleinsyreadjuvanter. En ikkenukleinsyreadjuvant er ethvert molekyl eller forbindelser med unntak av CpG immunstimulatoriske oligonukleotider beskrevet heri som kan stimulere den humorale og/eller cellulære immunrespons. Ikke-nukleinsyreadjuvanter inkluderer, for eksempel, adjuvanter som etablerer en depoteffekt, immunstimulerende adjuvanter og adjuvanter som etablerer en depoteffekt og stimulerer immunsystemet.
CpG immunstimulatoriske oligonukleotider er også nyttige som mukosale adjuvanter. Det har tidligere blitt oppdaget at både systemiske og mukosal immunitet er indusert
av mukosal avgivelse av CpG nukleinsyrer. Således, oligonukleotidene kan administreres i kombinasjon med andre mukosale adjuvanter.
Immunresponser kan også induseres eller forsterkes med samadministrering eller ko-lineær ekspresjon av cykokiner (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al.,1997; Iwasaki et al.,1997; Kim et al.,1997) or B-7 co-stimulatory molecules (Iwasaki et al.,1997; Tsuji et al.,1997) med de CpG immunstimulatoriske oligonukleotider. Termen cytokin anvendes som et generisk navn for en divers gruppe av løselige proteiner og peptider som virker som humorale regulatorer ved nano- til pikomolare konsentrasjoner og som, enten ved normale eller patologiske tilstander, modulerer de funksjonelle aktiviteter av individuelle celler og vev. Disse proteiner medierer også interaksjoner mellom celler direkte og regulerer prosesser som foregår i de ekstracellulære miljø. Eksempler på cytokiner inkluderer, men er ikke begrenset til IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), granulocytt-stimulerende faktor (G-CSF), interferon-γ (γ-IFN), IFN-α, tumor nekrosefaktor (TNF), TGF-β, FLT-3-ligand og CD40-ligand.
Oligonukleotidene er også nyttige i å redirigere en immunrespons fra en Th2-immunrespons til en Th1-immunrespons. Dette resulterer i produksjon av et relativt balansert Th1/Th2-miljø. Redirigering av en immunrespons fra en Th2 til en Th1 immunrespons kan undersøkes ved å måle nivåene av cytokiner produsert i respons til nukleinsyren (for eksempel ved å indusere monocytiske celler og andre celler til å produsere Th1-cytokiner, inkluderende IL-12, IFN-γ og GM-CSF). Redirigeringen eller rebalanseringen av immunresponsen fra en Th2 til en Th1 respons er spesielt nyttig for behandling eller hindring av astma. For eksempel, en effektiv mengde for å behandle astma kan være den mengde som; som er nyttig for å redirigere en Th2-type immunrespons som er assosiert med astma til en Th1-type respons eller balansert Th1/Th2-miljø. Th2-cytokiner, spesielt IL-4 og IL-5 er forhøyet i luftveiene til astmatiske individer. De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider ifølge oppfinnelsen forårsaker en økning i Th1-cytokiner som bevirker rebalansering av immunsystemet, hindrer eller reduserer de skadelige effekter assosiert med en dominerende Th2-immunrespons.
Oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan også være nyttige i å behandle luftveis remodellering. Luftveis remodellering er resultatet av glatt muskelcelleproliferasjon og/eller submukosal fortykning i luftveiene, og fører til slutt til en innsnevring av luftveiene som fører til en begrenset luftgjennomstrømming. Oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen kan hindre ytterligere remodellering og kan muligens også redusere vevsoppbygging som et resultat av remodelleringsprosessen.
Oligonukleotidene er også nyttige for å forbedre overlevelse, differensiering, aktivering og modning av dendrittceller. De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider har en unik evne til å fremme celleoverlevelse, differensiering, aktivering og modning av dendrittceller.
CpG immunstimulatoriske oligonukleotider øker også den lytiske aktivitet i dreperceller og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). ADCC kan utføres ved anvendelse av en CpG immunstimulatorisk oligonukleotid i kombinasjon med et antistoff som er spesifikk for et cellulært mål, så som en cancercelle. Iden CpG immunstimulatorisk oligonukleotid administreres til et individ i forbindelse med antistoffet, så vil individets immunsystem induseres til å drepe tumorcellen. Antistoff nyttig i ADCC prosedyren inkluderer antistoff som interagerer med en celle i kroppen. Mange slike antistoff som er spesifikke for cellulære mål har blitt beskrevet innen fagfeltet og er kommersielt tilgengelige.
De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider kan også administreres i forbindelse med en anticancerterapi. Anticancerterapier inkluderer cancermedikamenter, bestråling og kirurgiske prosedyrer. Som anvendt heri, et "cancermedikament" refererer til midler som administreres til et individ for formål å behandle en cancer. Som anvendt heri, "behandle cancer" inkluderer å hindre utvikling av en cancer, redusere symptomene av cancer og/eller inhibere veksten av etablert cancer. I andre aspekter, cancermedikamentet administreres til et individ i risiko for å utvikle en cancer for formål å redusere risikoen for å utvikle canceren. Forskjelllige typer medikamenter for behandling av cancer er beskrevet heri. For formålet med denne beskrivelse, cancermedikamentet klassifiseres som kjemoterapeutiske midler, immunterapeutiske midler, cancervaksine, hormonterapi og biologiske responsmodifiserer.
Videre, framgangsmåten som beskrives er tiltenkt for å omfatte anvendelse av mer enn et cancermedikament sammen med CpG immunstimulatoriske oligonukleotider. Som et eksempel, dersom hensiktsmessig, de CpG immunstimulatoriske oligonukleotider kan administreres med både et kjemoterapeutisk middel og et immunterapeutisk middel. Alternativt, cancermedikamentet kan omfatte et immunterapeutisk middel og en cancervaksine, eller et kjemoterapeutisk middel og en cancervaksine eller et kjemoterapeutisk middel, et immunterapeutisk middel og en cancervaksine alle administrert til et individ for formålet å behandle et individ som har en cancer eller som har risiko for å utvikle en cancer.
Det kjemoterapeutiske middel kan utvelges blant gruppen som består av metotreksat, vincristin, adriamycin, cisplatin, ikke-sukkerinneholdende kloretylnitrosoureaer, 5-fluoruracil, mitomycin C, bleomycin, doksorubicin, dakarbazin, taksol, fragylin, meglamin GLA, valrubicin, karmustain og poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, RAS famesyl transferase inhibitor, famesyl transferase inhibitor, MMP, MTA/LY231514, LY264618/lometeksol, glamolec, CI-994, TNP-470, hycamtin/topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, novantron/mitroksantron, metaret/suramin, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/marmistat, BB2516/marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, lemonal DP 2202, FK 317, picibanil/OK-432, AD 32/valrubicin, metastron/strontiumderivativ, temodal/temozolomid, evacet/liposomalt doksorubicin, yewtaxan/paclitaxel, taksol/taclitaksel, xeload/capecitabin, furtulon/-doksifluridin, cyklopaks/oral paclitaksel, oral taksoid, SPU-077/cisplatin, HMR 1275/flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS onkogen inhibitor, BMS-182751/oral platinum, UFT(tegafur/uracil), ergamisol/levamisol, eniluracil/776C85/5FU enhancer, campto/levamisol, camptosar/irinotecan, tumodeks/ralitreksed, leustatin/cladribin, pakseks/paclitaksel, doksil/liposomalt doksorubicin, caelyks/liposomalt doksorubicin, fludara/fludarabin, farmarubicin/epirubicin, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-naftalimid, LU 103793/dolastain, caetyks/liposomalt doksorubicin, gemzar/gemcitabin, ZD 0473/Anormed, YM 116, jodfrø, CDK4 og CDK2 inhibitorer, PARP inhibitorer, D4809/deksifosamid, ifes/mesneks/ifosamid, vumon/teniposid, paraplatin/karboplatin, plantinol/cisplatin, vepesid/etoposid, ZD 9331, taksoter/docetaksel, prodrug av guanin arabinosid, taksane analoger, nitrosoureaer, alkylerende midler så som melfelan og cyklofosfamid, aminoglutetimid, asparaginase, busulfan, karboplatin, klorombucil, cytarabin HCI, dactinomycin, daunorubicin HCl, estramustin fosfatnatrium, etoposid (VP16-213), floksuridin, fluoruracil (5-FU), flutamid, hydroksyurea (hydroksykarbamid), ifosfamid, interferon alfa-2a, alfa-2b, leuprolid acetat (LHRH-frigjørende faktoranalog), lomustin (CCNU), mekloretamin HCl (nitrogensennep), mekcaptopurin, mesna, mitotan (o.p ́-DDD), mitoksantron HCl, oktreotid, plicamycin, prokarbazin HCl, streptozocin, tamoksifen sitrat, tioguanin, tiotepa, vinblastinsulfat, amsakrin (m-AMSA), azacitidin, ertropoietin, heksametylmelamin (HMM), interleukin 2, Mitoguazon (metyl-GAG; metyl glyoksal bisguanylhydrazon; MGBG), pentostatin (2’deoksycoformycin), semustin (metyl-CCNU), teniposid (VM-26) og vindesin sulfat, men er ikke begrenset til disse.
Det immunterapeutiske middel kan velges blant gruppen som består av ributaksin, herceptin, quadramet, panoreks, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, oncolym, SMART M195, ATRAGEN, ovareks, bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, zenapaks, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab og ImmuRAIT-CEA, men er ikke begrenset til disse.
Cancervaksinen kan velges blant gruppen som består av EGF, anti-idiotypiske cancervaksiner, Gp75 antigen, GMK melanomvaksine, MGV gangliosid konjugatvaksine, Her2/neu, ovareks, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratop, BLP25 (MUC-1), liposomal jodotypisk vaksine, melacin, peptid antigenvaksine, toksin/antigenvaksiner, MVA-basert vaksine, PACIS, BCG-vaksine, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus og ImmuCyst/TheraCys, men er ikke begrenset til disse.
Anvendelse av CpG immunstimulatoriske oligonukleotider i forbindelse med immunterapeutiske midler så som monoklonale antistoff er i stand til å øke langtids overlevelse gjennom en rekke mekanismer inkluderende signifikant forbedring av ADCC (som beskrevet over), aktivering av naturlige dreperceller (NK) og en økning i IFN-α-nivåer. Nukleinsyrene, idet de anvendes i kombinasjon med monoklonale antistoff, fungerer ved å redusere doseringen av antistoff som er nødvendig for å oppnå et biologisk resultat.
Som anvendt heri, termene "cancer antigen" og "tumor antigen" anvendes om hverandre for å referere til antigen som er forskjellig uttrykt av cancerceller og dermed kan benyttes for å målrette til cancerceller. Cancer antigener er antigener som potensielt kan stimulere tilsynelatende tumorspesifikke immunresponser. Noen av disse antigenene er kodet, om ikke nødvendigvis uttrykt, av normale celler. Disse antigener kan karakteriseres av de som er normalt stille (ikke uttrykkes) i normale celler, de som uttrykkes kun ved visse trinn i differensieringen, og de som temporært uttrykkes som embryoniske og føtale antigener. Andre cancerantigener kodes for mutante cellulære gener, så som onkogener (for eksempel aktiverte ras onkogener), supressorgener (for eksempel mutant p53), fusjonsproteiner resulterende fra indre deletering av kromosomale translokalisasjoner. Ytterligere antigener kan kodes av virale gener så som de som bæres på RNA- og DNA-tumorvirus.
CpG immunstimulatoriske oligonukleotider er også nyttige for å behandle og hindre autoimmune sykdommer. Autoimmune sykdommer er en klasse sykdommer hvor individets egne antistoff reagerer med vertsvev eller hvor immun effektor T-celler er autoreaktive til endogene selv-peptider og forårsaker ødeleggelse av vev. Således, en immunrespons som er rettet mot individets egne antigener, benevnes som selv-antigener. Autoimmune sykdommer inkluderer, men er ikke begrenset til, reumatoid artritt, Crohns sykdom, multiple sklerose, systemisk lupus erytematosus (SLE), autoimmun encefalomyelitt, myastenia gravis (MG), Hashimotos tyroiditt, Goodpasture’s syndrom, pemfigus (for eksempel pemfigus vulgaris), Graves sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopenisk purpura, skleroderma med anti-collagen antistoff, blandete bindevevssykdom, polymyositt, pernikiøs anemi, jodopatisk Addisons sykdom, autoimmun-assosiert infertilitet, glomerulonefrititt (for eksempel krescentisk glomerulonefrititt, proliferativ glomerulonefrititt), bulløs pemfigoid, Sjögrens syndrom, insulinresistens og autoimmun diabetes mellitus.
Et "selv-antigen" som anvendt heri refererer til et antigen i et normalt vertsvev. Normale vertsvev inkluderer således ikke cancerceller. Således, en immunrespons tiltenkt mot et selv-antigen i konteksten av en autoimmun sykdom, er en uønsket immunrespons for å bidra til ødeleggelse og skade på normalt vev, mens en immunrespons rettet mot et cancerantigen er en ønskelig immunrespons og bidrar til ødeleggelse av tumoren eller canceren. Således, i noen aspekter av oppfinnelsen rettet mot å behandle autoimmune forstyrrelser er det ikke anbefalt at CpG immunstimulatoriske nukleinsyrer administreres med selvantigener, spesielt de som er målene for den autoimmune forstyrrelse.
I andre tilfeller kan de CpG immunstimulatoriske nukleinsyrer avgis med lave doseringer av selvantigener. Et antall dyreforsøk har vist at mukosal administrering av lave doser av antigen kan resultere i en tilstand av immun hyporesponsivitet eller "toleranse". Den aktive mekanisme synes å være et cytokin-mediert immunavvik bort fra en Th1 mot en hovedsakelig Th2- og Th3-respons (det vil si TGF-β-dominert). Den aktive undertrykkelse med lave doser av antigenavgivelse kan også undertrykke en ubeslekted immunrespons (bystander suppression) som er av betydelig interesse i terapi av autoimmune sykdommer, for eksempel reumatoid artritt og SLE. Bystander suppression involverer utskillelse av Th1-mot-regulatoriske undertrykkende cytokiner i det lokale miljø hvor proinflammatoriske og Th1 cytokiner frigjøres i enten en antigen spesifikk eller antigen ikke-spesifikk måte. "Toleranse" som anvendt heri anvendes for å referere til dette fenomen. Faktisk, oral toleranse har vært effektiv i behandling av et antall autoimmune sykdommer i dyr inkluderende: eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), eksperimentell autoimmun myastenia gravis, kollagen-indusert artritt (CIA) og insulinavhengig diabetes melliltus. I disse modeller er undertrykkelser og hindring av autoimmun sykdom assosiert med et skift i antigen-spesifikk humoral og cellulære responser fra en Th1 til en Th2/Th3-respons.
Oppfinnelsen beskriver også framgangsmåter for å indusere en antigen ikke-spesifikk iboende immunaktivering og bredspektret resistens til infeksiøse utfordringer ved anvendelse av CpG immunstimulatoriske oligonukleotider. Termen antigen ikke-spesifikk iboende immunaktivering som anvendt heri, refererer til aktivering av immunceller som er andre enn B-cellene og kan for eksempel inkludere aktivering av NK-celler, T-celler eller andre immunceller som kan respondere på en antigen uavhengig måte eller en kombinasjon av disse celler. En bredspektret resistens til infeksiøse utfordringer induseres på grunn av at immuncellene er i aktiv form og påvirkes til å respondere på alle invaderende forbindelser eller mikroorganismer. Cellene trenger ikke å ha blitt spesifikt aktivert mot et bestemt antigen. Dette er spesielt nyttig i biokrigsføring, og under de andre forhold som beskrevet over så som for reisende.
De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider kan administreres direkte til individet eller kan administreres i forbindelse med enhver nukleinsyreavgivelseskompleks. Et nukleinsyreavgivelseskompleks skal bety et nukleinsyremolekyl assosiert med (for eksempel ionisk eller kovalent bundet til; eller innkapslet innen) et målmiddel (for eksempel et molekyl som resulterer i høyere bindingsaffinitet til målcellen). Eksempler på nukleinsyreavgivelseskomplekser inkluderer nukleinsyrer assosiert med en sterol (for eksempel kolesterol), et lipid (for eksempel et kationisk lipid, virosom eller liposom), eller et målcellespesifikt bindingsmiddel (for eksempel en ligand som gjenkjennes av en målecellespesifikk reseptor). Foretrukne komplekser kan være tilstrekkelig stabile in vivo til å hindre betydelig avkobling før internalisering i målcellen. Imidlertid, komplekset kan være spaltbar under egnete betingelser i cellen slik at oligonukleotidet frigjøres i en funksjonell form.
Avgivelsesvehikler eller avgivelsesanordninger for å avgi antigen og oligonukleotider til overflater har blitt beskrevet. De CpG immunstimulatoriske oligonukleotid og/eller antigen og/eller andre terapeutika kan administreres alene (for eksempel i saltløsning eller buffer) eller ved anvendelse av enhver avleveringsvehikkel kjent innen fagfeltet. For eksempel har følgende avleveringsvehikler blitt beskrevet: kokleater; emulsomer, Isomer; liposomer; levende bakterielle vektorer (for eksempel Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus);levende virale vektorer (for eksempel Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex); mikrosfærer; nucleinsyrevaksiner; polymerer; polymerringer; proteosomer; natriumfluorid; transgene planter; virosomer; virusliknende partikler. Andre avgivelsesvehikler er kjent innen fagfeltet og noen ytterligere eksempler tilveiebringes nedenfor i diskusjonen av vektorer.
Termen effektiv mengde av en CpG immunstimulatorisk oligonukleotid refererer til den mengde som er nødvendig eller tilstrekkelig til å realisere en ønsket biologisk effekt. For eksempel, en effektiv mengde av et CpG immunstimulatorisk oligonukleotid administrert med et antigen for å indusere mukosal immunitet er den mengde som er nødvendig til å forårsake utvikling av IgA i respons til et antigen ved eksponering til antigenet, mens den mengde som er nødvendig for å indusere systemisk immunitet er den mengde som er nødvendig til å forårsake utvikling av IgG i respons til et antigen ved eksponering til antigenet. Kombinert med beskrivelsen gitt heri, valgt av de forskjellige aktive forbindelser og vektfaktorer så som potens, relativ biotilgjengelighet, pasients kroppsvekt, alvorlighet og skadelige bieffekter og foretrukket administrasjonsmodus, kan et effektivt profylaktisk eller terapeutisk behandlingsregime planlegges om ikke forårsaker betydelig toksisitet og som framdeles er fullstendig effektiv til å behandle det bestemte individ. Den effektive mengde for enhver bestemt applikasjon kan variere avhengig av slike faktorer som sykdommen eller tilstanden som skal behandles, det bestemte CpG-immunstimulatoriske oligonukleotid som administreres, størrelsen på individet eller alvorligheten av sykdommen eller tilstanden. En av ordinær fagkunnskap innen fagfeltet kan empirisk bestemme den effektive mengde av et bestemt CpG immunstimulatorisk oligonukleotid og/eller antigen og/eller andre terapeutiske midler uten unødvendig eksperimentering.
Individdoseringer av forbindelsene beskrevet heri for mukosal eller lokal avgivelse er typiske områder fra ca.0,1 µg til 10 mg per administrering, som avhenger av om applikasjonen gis daglig, ukentlig eller månedlig, eller ethvert annet tidspunkt der i mellom. Mer typisk er mukosale eller lokal doseringsområder fra ca.10 µg til 5 mg per administrering, og mest typisk fra ca.100 µg til 1 mg, med 2-4 administreringer med dager eller uker der i mellom. Mer typisk, immunstimulant doseringsområder fra 1 µg til 10 mg per administrering, og mest typisk 10 µg til 1 mg, med daglige eller ukentlige administreringer. Individdoseringer av forbindelsene beskrevet heri for parenteral avgivelse for formålet å indusere en antigen spesifikk immunrespons, hvor forbindelsen avgis med et antigen men ikke et annet terapeutisk middel er typisk 5 til 10000 ganger høyere enn den effektive mukosale dosering for vaksineadjuvant eller immunstimulanet applikasjoner, og mer typisk 10 til 1000 ganger høyere, og mest typisk 20 til 100 ganger høyere. Doseringer av forbindelsene beskrevet heri for parenteral avgivelse for formål å indusere en iboende immunrespons eller for å øke ADCC eller for å øke antigen spesifikk immunrespons idet CpG immunstimulatoriske oligonukleotider administreres i kombinasjon med andre terapeutiske midler eller i spesialiserte avgivelsesvehikler er typisk i området fra ca.0,1 µg til 10 mg per administrering, som vil avhenge av om applikasjonen gis daglig, ukentlig eller månedlig eller ved en annen tidsperiode. Mer typisk, parenterale doseringer for disse formål er i området fra 10 µg til 5 mg per administrering, og mest typisk fra ca.100 µg til1 mg , med 2-4 administreringer med dager eller uker i mellom. I noen utførelser er imidlertid de parenterale doseringer for disse formål anvendt i et område fra 5 til 10000 høyere enn de typiske doseringer beskrevet over.
For enhver forbindelse beskrevet heri kan den terapeutiske effektive mengde innledningsvis bestemmes ut fra dyremodeller. En terapeutisk effektiv dosering kan også bestemmes fra data på mennesker for CpG oligonukleotider som har blitt testet i mennesker (humane kliniske forsøk har blitt initiert) og for forbindelser som er kjente for å utvise tilsvarende farmakologiske aktiviteter, så som andre adjuvanter, for eksempel LT og andre antigener for vaksineringsformål. Høyere doseringer kan være nødvendig for parenteral administrering. En applisert dosering kan justeres basert på den relative biotilgjengelighet og potens av den administrerte forbindelse. Justering av doseringen for å oppnå maksimal effektivitet basert på framgangsmåtene beskrevet over og andre framgangsmåter er godt kjent innen fagfeltet og er godt innenfor kapasiteten til den fagkyndige.
Formuleringene ifølge oppfinnelsen administreres i farmasøytisk akseptable løsninger, som rutinemessig kan inneholde farmasøytiske akseptable konsentrasjoner av salt, buffringsmidler, konserverende midler, kompatible bærere, adjuvanter og valgfritt andre terapeutiske ingredienser.
For anvendelse i terapi, kan en effektiv mengde av CpG immunstimulatorisk oligonukleotid administreres til et individ med enhver modus som avgir oligonukleotider til den ønskete overflate, for eksempel mukosal, systemisk. Administrering av den farmasøytiske sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres med ethvert middel kjent for den fagkyndige. Foretrukne administrasjonsruter inkluderer, men er ikke begrenset til oral, parenteral, intramuskulær, intranasal, sublingual, intratrakeal, inhalering, okular, vaginal og rektal.
For oral administrering, kan forbindelsene (det vil si CpG immunstimulatoriske oligonukleotider, antigener og andre terapeutiske midler) formuleres enkelt ved å kombinere de(n) aktive forbindelse(r) med farmasøytisk akseptable bærere godt kjent inn fagfeltet. Slike bærere muliggjør at forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan formuleres som tabletter, piller, drageer, kapsler, væsker, geler, siruper, slurrier, suspensjoner og lignende, for oralt inntak av et individ som skal behandles. Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan oppnås som faststoffeksipient, valgfritt ved å måle en resulterende blanding, og prosessere blandingen av granuler, etter å ha tilsatt egnete hjelpemidler, dersom hensiktsmessig, for å oppnå tabletter eller drage-kjerner. Egnete eksipienter er, fortrinnsvis, fyllmidler så som sukkere, inkluderende laktose, sukkrose, mannitol eller sorbitol; cellulosepreparater så som for eksempel maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse, potetstivelse, gelatin, gummitragakant, metylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og /eller polyvinylpyrrolidon (PVP). Dersom hensiktsmessig kan desintegrerende midler tilsettes, så som kryssbundet polyvinyl pyrrolidon, agar, eller alginisk syre eller salt derav så som natriumalginat. Valgfritt kan de orale formuleringer også formuleres i saltløsninger eller buffere, det vil si EDTA for å nøytralisere indre syretilstander eller de kan administreres uten noen bærere.
Også spesifikt vurdert er orale doseringsformer av komponenten eller komponentene over.
Komponenten eller komponentene kan være kjemisk modifisert slik at oral avgivelse av derivatet effektiviseres. Generelt, den kjemiske modifisering vurdert tilfestes ved minst én enhet til selve komponentmolekylet, hvor nevnte enhet muliggjør a) inhibering av proteolyse; og b) opptak inn i blodstrømmen fra mage eller tarm. Også ønsket er å øke den totale stabilitet av komponenten eller komponentene og øke sirkulasjonstiden i kroppen. Eksempler på slike enheter inkluderer: polyetylenglykol, kopolymerer av etylenglykol og propylenglykol, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinyl lkohol, polyvinylpyrrolidon og polyprolin. Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp.367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem.4:185-189. Andre polymerer som kan anvendes er poly-1,3-dioksolan og poly-1,3,6-tioksokan. Foretrukket for farmasøytisk bruk (som angitt over) er
polyetylenglykolenheter.
For komponenten (eller derivatet) kan lokalisering for frigivelse være magen, tynntarmen (duodenum, jejunum eller ileum), eller tykktarmen. En fagkyndig innen fagfeltet har tilgjengelige formuleringer som ikke vil oppløse i magen, men som vil frigjøre materiale i duodenum eller annet sted i tarmen.
Fortrinnsvis, frigivelsen vil unngå skadelige effekter i magemiljøet, enten ved å beskytte oligonukleotidet (eller derivater) eller ved få frigjøre det biologiske aktive materiale etter magemiljøet, så som i tarmen.
For å sikre full gastrisk motstandsdyktighet, kan en coating som er impermeabel til minst pH 5,0 være riktig. Eksempler på mer vanlige inerte ingredienser som anvendes er enteriske belegginger som celluloseacetat trimellitat (CAT), hydroksypropylmetylcellulose ftalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinylcetat ftalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, celluloseacetat ftalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S og Shellac. Disse belegginger kan anvendes som blandete filmer.
En coating eller blanding av coatinger kan også anvendes for tabletter, som er ikke tiltenkt for beskyttelse i magen. Disse inkluderer sukkerbelegginger, eller belegginger som kan gjøre tablettene enklere å svelge. Kapsler kan bestå av et hardt skall, så som gelatin, for avgivelse av tørre terapeutika, det vil si pulver; for væskeformer, et mykt gelatinskall kan anvendes. Skallmaterialet i cacheter kan være tykk stivelse eller annet spisbart papir. For pillene, lozenger, formete tabletter eller tablett triturater, kan fuktsammenslåingsteknikker anvendes.
De terapeutiske midler kan være inkludert i formuleringen som finfordelte multi-partikulater i form av granuler eller pellet av partikkelstørrelse på ca.1 mm. Formuleringen av materialet for kapseladministrering kan også være som et pulver, lett sammenpressede plugger eller også som tabletter. Det terapeutiske middel kan framstilles ved sammentrykking.
Fargemidler og smaksmidler kan også inkluderes. For eksempel, oligonukleotidet (eller derivatet) kan formuleres (så som med liposom eller mikrosfære enkapsulering) og kan deretter prepareres i et spisbart produkt, så som i en avkjølt drikkevare som inneholder smaksmidler og fargemidler.
Man kan fortynne eller øke volumet av terapeutika i et inert materiale. Disse fortynningsmidler kan inkludere karbohydrater, spesielt mannitol, a-laktose, vannfri laktose, cellulose, sukkrose, modifiserte dekstraner og stivelse. Visse uorganiske salter kan også anvendes som fyllmidler, inkluderende kalsiumtrifosfat, magnesiumkarbonat og natriumklorid. Noen kommersielle tilgjengelige fortynningsmidler er Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, emkompress og Avicell.
Desintegrerende midler kan inkluderes i formuleringen av det terapeutiske middel til en faststoffdoseringsform. Materialet anvendt som desintegrerende midler inkluderer, men er ikke begrenset til stivelse, inkluderende kommersielle disintegranter basert på stivelse, Explotab. Natriumstivelseglykolat, Amberlite, natriumkarboksymetylcellulose, ultramylopektin, natriumalginat, gelatin, appelsinskall, sur karboksymetylcellulose, naturlig svamp og bentonitt kan også anvendes. En annen form av de desintegrerende midler er de uløselige kationiske utbytteresiner. Pulverformige gummier kan anvendes som desintegrerende midler og som bindemidler, og disse kan inkludere pulverformige gummier så som agar, Karaya eller tragakant. Alginisk syre og dets natriumsalt er også nyttige som desintegrerende midler.
Bindere kan anvendes for å holde de terapeutiske middel sammen for å danne en hard tablett, og kan inkludere materialer fra naturlige produkter så som akacia, tragakant, stivelse og gelatin. Andre inkluderer metylcellulose (MC), etylcellulose (EC) og karboksymetylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) og hydroksypropylmetylcellulose (HPMC) kan begge anvendes i alkoholiske løsninger for å granulere det terapeutiske middel.
Antifriksjonsmidler kan inkluderes i formuleringen av det terapeutiske middel for å hindre klebing under formuleringsprosessen. Smøremidler kan anvendes som et sjikt mellom det terapeutiske middel og pregeveggen og disse kan inkludere, men er ikke begrenset til stearinsyre inkluderende dets magnesiumog kalsiumsalter, polytetrafluoretylen (PTFE), væskeformig parafin, vegetabilske oljer og vokser. Løselige smøremidler kan også anvendes så som natriumlaurylsulfat, magnesiumlaurylsulfat, polyetylenglykol av forskjellige molekylvekt, Carbowax 4000 og 6000.
Glimidler som kan forbedre flytegenskapene av medikament under formulering og bevirke rearrangement under sammenpressing kan tilsettes. Glimidlene kan inkludere stivelse, talg, pyrogenisk silika og hydrert silikoaluminat.
For å bedre oppløsning av det terapeutiske middel til et vandig miljø, kan en surfaktant tilsettes som et fuktmiddel. Surfaktanter kan inkludere anioniske detergenter så som natriumlaurylsulfat, dioktylnatriumsulfosukkinat og dioktylnatriumsulfonat. Kationiske detergenter kan anvendes og kan inkludere benzalkoniumklorid. Listen av potensielle ikke-ioniske detergenter som kan anvendes i formuleringen som surfaktanter er lauromacrogol 400, polyoksyl 40 stearat, polyoksyetylen hydrogenert lakserolje 10, 50 og 60, glycerolmonostearat, polysorbat 40, 60, 65 og 80, sukkrose, fettsyreester, metylcellulose og karboksymetylcellulose. Disse surfaktanter kan være til stede i formuleringen av oligonukleotidet eller derivatet enten alene eller som en blanding i forskjellige forhold.
Farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt inkluderer push-fit kapsler framstilt av gelatin, og likeledes myke, forseglede kapsler framstilt av gelatin og et plastiserende middel så som glyserol eller sorbitol. Push-fit kapslene kan inneholde de aktive ingredienser i samblanding med fyllmidler så som laktose, bindemidler så som stivelse, og/eller smøremidler så som talg eller magnesiumstearat, og valgfritt stabiliserende midler. I myke kapsler kan den aktive forbindelse være oppløst eller suspendert i egnet væsker, så som fettoljer, væskeformet parafin eller væskeformige polyetylenglykoler. I tillegg, kan stabiliserende midler tilsettes. Mikrosfærer formulert for oral administrering kan også anvendes. Slike mikrosfærer har blitt godt definert innen fagfeltet. Alle formuleringer for oral administrering bør være i doseringer egnet for slik administrering.
For bukkal administrering kan sammensetningene ha form av tabletter eller lozenger formulert på konvensjonell måte.
For administrering ved inhalering kan forbindelsene for anvendelse i samsvar med foreliggende oppfinnelse hensiktsmessig avgis i form av en aerosolspraypresentasjon fra pressuriserte pakker eller en neubiliserer, med anvendelse av et egnet drivmiddel, for eksempel diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller annen egnet gass. I tilfelle en pressurisert aerosol kan doseringsenheten bestemmes ved å tilveiebringe en ventil for å avgi en utmålt mengde. Kapsler og kassetter av for eksempel gelatin for anvendelse i en inhalator eller insufflator kan formuleres inneholdende en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase så som laktose eller stivelse.
Også vurdert heri er pulmonar avgivelse oligonukleotidene (eller derivater derav). Oligonukleotidet (eller derivat) avgis til lungene i et pattedyr under inhalering og transporteres over lungeepital lining til blodstrømmen. Andre rapporter av inhalerte molekyler inkluderer Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (leuprolid acetate); Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl.5):143-146 (endothelin-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp.206-212 (a1- antitrypsin); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest.84:1145-1146 (a-1-proteinase); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (recombinant human growth hormone); Debs et al., 1988, J. Immunol.140:3482-3488 (interferon and tumor necrosis factor alpha) and Platz et al., U.S. Patent No.5,284,656 (granulocyte colony stimulating factor). En framgangsmåte og sammensetning for pulmonar avgivelse av medikamenter for systemisk effekt er beskrevet i US patent nr.5,451,569, utstedt 19. september 1995 til Wong et al.
Vurdert for anvendelse i praktisering av foreliggende oppfinnelse er et bredt spekter av mekaniske anordninger konstruert for pulmonar avgivelse av terapeutiske produkter, inkluderende men ikke begrenset til, neubiliserer, måle doseringsinhalatorer og pulverinhalatorer og alle disse er kjent for den fagkyndige innen feltet.
Noen spesifikke eksempler på kommersielt tilgjengelige anordninger egnet for praktisering av oppfinnelsen er Ultravent nebuliserer, framstilt av Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; the Acorn II nebuliserer, framstilt av Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin utmålt doseringsinhalator, framstilt av Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; og Spinhaler pulverinhalator, framstilt av Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Alle slike anordninger krever anvendelse av formuleringer egnet for dispergering av oligonukleotidet (eller derivater). Typisk, hver formulering er spesifikk til den type anordning som benyttes og involverer anvendelse av et egnet drivmateriale, i tillegg til vanlige fortynningsmidler, adjuvanter og/eller bærere som er nyttige i terapi. Videre, anvendelse av liposomer, mikrokapsler eller mikrosfærer, inklusjonskomplekser eller andre typer bærere vurderes også. Kjemisk modifisert oligonukleotid kan også framstilles i forskjellige formuleringer avhengig av type kjemisk modifisering eller type anordning som benyttes.
Formuleringer egnet for anvendelse med en nebuliserer, enten jet eller ultrasonisk, vil typisk omfatte oligonukleotid (eller derivat) oppløst i vann med en konsentrasjon av ca.0,1 til 25 mg av biologisk aktiv oligonukleotid per ml løsning. Formuleringen kan også inkludere buffer og et enkelt sukker (for eksempel for oligonukleotidstabilisering og regulering av osmotisk trykk). Nebulisererformuleringen kan også inneholde en surfaktant, for å redusere eller hindre overflateindusert aggregering av oligonukleotidet forårsaket av atomisering av løsningen ved dannelse av aerosolen.
Formuleringer for anvendelse med en utmålt doseringsinhalatoranordning vil generelt omfatte et finfordelt pulver inneholdende oligonukleotidet (eller derivatet) suspendert i et drivmiddel ved hjelp av en surfaktant. Propellanten kan være ethvert konvensjonelt materiale som benyttes for dette formål, så som klorfluorkarbon, hydroklorfluorkarbon, hydrofluorkarbon eller et hydrokarbon, inkluderende triklorfluormetan, diklorfluormetan, diklortetrafluoretanol, og 1,1,1,2-tetrafluoretan eller kombinasjoner derav. Egnete surfaktanter inkluderer sorbitan trioleat og soyalecitin. Oleisk syre kan også være nyttig som en surfaktant.
Formuleringer for dispensering fra en pulverinhalatoranording vil omfatte et finfordelt tørrpulver inneholdende oligonukleotid (eller derivat) og kan også inkludere et bulkmiddel, så som laktose, sorbitol, sukkrose eller mannitol i mengder som fremmer dispergering av pulvere fra anordningen, for eksempel 50 til 90 vekt% av formuleringen. Oligonukleotidet (eller derivatet) kan hensiktsmessig framstilles i partikulat form med en midlet partikkelstørrelse på mindre enn 10 mm (eller MM), mer fortrinnsvis 0,5 til 5 mm. for mest effektiv avgivelse til distal lunge.
Nasal avgivelse av en farmasøytisk sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse vurderes også. Nasal avgivelse muliggjør passasje av en farmasøytisk sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse til blodstrømmen direkte etter administrering av det terapeutiske produkt til nesen, uten nødvendigheten for deponering av produktet i lungen. Formuleringer for nasal avgivelse inkluderer dekstran eller syklodekstran.
For nasal administrering, er en nyttig anordning en liten hard flaske hvortil en utmålt doseringsspray er festet. I én utførelse avgis den utmålte dosering ved å trekke den farmasøytiske sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse inn i et kammer av definert volum, hvor kammeret har en åpning som er dimensjonert for aerosolet å aerosolformulere ved å danne en spray idet en væske i kammeret sammenpresses. Kammeret sammenpresses for å administrere den farmasøytiske sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse. I én spesifikk utførelse er kammeret et stempelarrangement. Slike anordninger er kommersielt tilgjengelige.
Alternativt, en plastskviseflaske med en åpning dimensjonert for å aerosole en aerosolformulering for å danne en spray idet skvises ut kan også anvendes. Åpningen finnes vanligvis i toppen av flasken, og toppen er vanligvis avsmalnet for å tilpasse nasal passasje for effektiv administrering av aerosolformuleringen.
Fortrinnsvis vil nasal inhalator tilveiebringe en utmålt mengde av aerosolformuleringen, for administrering av en utmålt dosering av medikamentet.
Forbindelsene, idet det er hensiktsmessig å avgi de systemisk, kan formuleres for parenteral administrering ved injeksjon, for eksempel ved bolus injeksjon eller kontinuerlig infusjon. Formuleringer for injeksjon kan presenteres i enhetsdoseringsform, for eksempel i ampuller eller i multidoseringsbeholdere, med et tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan ha form av suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljeformige eller vandige vehikler, og kan inneholde formuleringsmidler så som suspenderende, stabiliserende og/eller dispergerende midler.
Farmasøytiske formuleringer for parenteral administrering inkluderer vandige løsninger av de aktive forbindelser i vannløselig form. Videre, suspensjoner av aktive forbindelser framstilles dersom hensiktsmessig som oljeinjeksjonssuspensjoner. Egnete lipofile oppløsningsmidler eller vehikler inkluderer fettoljer så som sesamolje eller syntetiske fettsyrer estere, så som etyloleat eller triglyserider eller liposomer. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde substanser som øker viskositeten av suspensjonen, så som natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. Valgfritt, suspensjonen kan også inneholde egnet stabiliserende midler som øker løseligheten av forbindelsene og muliggjør for framstilling av sterkt konsentrerte løsninger.
Alternativt, de aktive forbindelser kan være i pulverform for konstituering med en egnet vehikkel. for eksempel sterilt pyrogenfritt vann, før anvendelse.
Forbindelsene kan også formuleres i rektale eller vaginale sammensetninger så som stikkpiller eller retensjonsklyster, for eksempel som inneholder konvensjonelle stikkpillebaser så som kakaosmør eller andre glyserider.
I tillegg til formuleringer beskrevet tidligere kan forbindelsene også formuleres som et depotpreparat. Slike langtidsvirkende formuleringer kan formuleres med egnete polymeriske eller hydrofobe materialer (for eksempel som en emulsjon i en akseptabel olje) eller ioneutbytteresiner, eller som forsiktig løselige derivater, for eksempel som et forsiktig løselig salt.
De farmasøytiske sammensetninger kan også omfatte egnete faststoff eller gelfasebærere eller eksipienter. Eksempler på slike bærere eller eksipienter inkluderer men er ikke begrenset til, kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, forskjellige sukkere, stivelser, cellulosederivater, gelatin og polymerer så som polyetylenglykoler.
Egnete væske- eller faststoff farmasøytiske preparatformer er for eksempel vandige eller saltløsninger for inhalering, mikroenkapsulert, enkoklerte, belagte på mikroskopiske gullpartikler, inneholdende i liposomer, neubiliserte, aerosoler, pelleter for implantasjon i huden, eller tørket på et skarpt objekt for å kunne skrapes inn i huden. De farmasøytiske sammensetninger inkluderer også granuler, pulvere, tabletter, belagte tabletter, (mikro)kapsler, stikkpiller, siruper, emulsjoner, suspensjoner, kremer, dråper eller preparater med forlenget frigivelse av aktive forbindelser, i hvilke preparater eksipienter og tilsettingsmidler og/eller hjelpemidler så som desintegrerende midler, bindemidler, beleggingsmidler, svellingsmidler, smøremidler, smaksmidler, søtningsmidler eller solubiliserende midler hensiktsmessig anvendes som beskrevet ovenfor. De farmasøytiske sammensetninger er egnet for anvendelse i en rekke medikamentavgivelsessystemer. For en kort oversikt av framgangsmåter for medikamentavgivelse , se Langer, Science 249:1527-1533, 1990, som inkorporeres heri med henvisning.
De CpG immunstimulatoriske oligonukleotider og valgfritt andre terapeutiske terapeutika og/eller antigener kan administreres per se (neat) eller i form av et farmasøytisk akseptabelt salt. Dersom det anvendes i medisin må saltet være farmasøytisk akseptabelt, men ikke-farmasøytisk akseptable salter kan hensiktsmessig anvendes for å framstille farmasøytisk akseptable salter derav. Slike salter inkluderer, men er ikke begrenset til de som framstilles av følgende syrer:
hydroklorisk, hydrobromisk, sulfurisk, nitrisk, fosforisk, maleisk, acetisk, salicylisk, p-toluen sulfonisk, tartarisk, citrisk, metan sulfonisk, formisk, malonisk, sukkinisk, naftalen-2-sulfonisk og benzen sulfonisk. Videre kan slike salter framstilles som alkaliske metall eller alkaliske jordsalter, så som natrium, kalium eller kalsiumsalter av karboksyliske syregrupper.
Egnete buffringsmidler inkluderer:: eddiksyre og et salt (1-2% vekt/vol); sitronsyre og et salt (1-3% vekt/vol); borsyre og et salt (0,5-2,5% vekt/vol); og fosforsyre og et salt (0,8-2% vekt/vol). Egnete konserveringsmidler inkluderer benzalkoniumklorid (0,003-0,03% vekt/vol); klorbutanol (0,3-0,9% vekt/vol); parabener (0,01-0,25% vekt/vol) og timerosal (0,004-0,02% vekt/vol).
De farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen inneholder en effektiv mengde av et CpG immunstimulatorisk oligonukleotid og valgfrie antigener og/eller andre terapeutiske midler valgfritt inkludert i en farmasøytisk akseptabel bærer. Termen farmasøytisk akseptabel bærer betyr én eller flere kompatible faststoff eller væskeformige fyllmaterialer, fortynningsmidler eller innkapslingssubstanser som er egnet for administrering til et menneske eller et vertebratdyr. Termen angir en organisk eller uorganisk ingrediens, naturlig eller syntetisk, med hvilken den aktive ingrediens kombineres for å fremme applikasjon. Komponentene av de farmasøytiske sammensetninger er også i stand til å samblandes med forbindelsene ifølge oppfinnelsen, og med hverandre, på en måte slik at der ikke er noen interaksjon som vesentlig vil nedsette den ønskete farmasøytiske effektivitet.
Foreliggende oppfinnelse illustreres videre med påfølgende eksempler, som ikke skal vurderes som begrensende.
EKSEMPLER
Materialer og metoder
Oligodeoksynukleotider (ODN) og reagenser
Alle ODN ble syntetisert ved å følge standard fosforamidit kjemiprotokoller og kontrollert for identitet og renhet av Coley Pharmaceutical GmbH og hadde ikke-detekterbare endotoksinnivåer (<0,1EU/ml) målt med Limulus analysen (BioWhittaker, Verviers, Belgium). ODN ble suspendert i steril, endotoksinfri Tris-EDTA (Sigma, Deisenhofen, Germany), og lagret og behandlet under aseptiske betingelser for å hindre både mikrobiell og endoksin kontaminering. Alle fortynninger ble utført ved anvendelse av endotoksinfri Tris-EDTA.
TLR-analyser
HEK293-celler ble transfektert med elektroporering med vektorer som uttrykker det respektive humane TLR og en 6xNF-κB-luciferase reporterplasmid. Egnete transfektanter (3x10<4>celler/brønn) ble inkubert med de angitte mengder av ODN i 16 t ved 37<0>C i en humidifisert inkubator. Hvert datapunkt ble utført i triplikat. Cellen ble lysert og analysert for luciferase genaktivitet (ved anvendelse av BriteLite kitt fra Perkin-Elmer, Zaventem, Belgia). Stimuleringsindekser ble beregnet med referanse til rapportergen aktivitet av medium uten tilsetting av ODN.
Rensing av celler
Perifere blod buffy coat preparater fra friske mennesker var tilgjengelig fra Blood Bank of the University of Düsseldorf (Tyskland)) og PBMC ble renset med sentrifugering over Ficoll-Hypaque (Sigma). Cellene ble dyrket i en humidifisert inkubator ved 37<0>C i RPMI 1640 medium tilsatt 5% (vol/vol) varmeinaktivert human AB serum (BioWhittaker) eller 10% (vol/vol) varmeinaktivert FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin (alle fra Sigma).
Cytokindeteksjon og flowcytometriske analyser
<6>PBMC ble resuspendert ved en konsentrasjon av 5x10 celler/ml og tilsatt til 96 brønns rundbunnete plater (250 µl/brønn). PBMC ble inkubert med ODN og dyrkingsupernatanter (SN) ble samlet etter de angitte tidspunkter. Dersom de ikke ble brukt umiddelbart, ble SN lagret ved -20<0>C til bruk.
Mengder av cytokiner i SNen ble undersøkt ved anvendelse av in-house ELISA for IFN-α utviklet ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig antistoff (PBL, New Brunswick, NJ, USA) eller på Luminex multiplekssystem (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).
Dyr
Hunkjønn BALB/c mus (6-8 uker gamle) ble innkjøpt fra Charles River Canada (Quebec, Canada) og huset i mikroisolater i Animal Care Facility ved Coley Pharmaceutical Group Canada. Alle studiene ble utført i samsvar med Animal Care Committee of Coley Canada ifølge retningslinjer fra Canadian Council on Animal Care. Alle dyrene var naive til CpG ODNer.
SA1N tumormodell: Hunkjønn A/J-bus (10 per gruppe) ble injisert SC med 5x10<5>SaI/N tumorceller ved dag 0. Musene ble behandlet med 100 µg ODN eller PBS alene gitt SC en gang ukentlig startende ved dag 8 posttumorinduksjon. Dyrene ble monitorert for overlevelse og tumorvolum. Tumorstørrelse (lengde og bredde) ble målt ved anvendelse av en digital vernier caliper. Tumorvolum ble beregnet ved anvendelse av formelen: Tumorvolum = (0,4)(ab2), hvor a = største diameter og b = minste diameter.
In vitro analyser
Naive BALB/c-musesplenocytter (fra samlinger av 3-5 dyr) ble anvendt for in vitro analyse. Dyrene ble anestetisert med isofluran og eutanisert med cervikal dislokalisasjon. Miltene ble fjernet under aseptiske betingelser og plassert i PBS 0,2% bovint serumalbumin (Sigma Chemical Company). Miltene ble deretter homogenisert og splenocytter ble resuspendert i RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) vevsdyrkingsmedium tilsatt 2% normalt museserum (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canada), penicillin-streptomycinløsning (final konsentrasjon av 1000 U/ml og 1 mg/ml respektivt; Sigma Chemical Company), og 5 × 10<-5>M b-merkaptoetanol (Sigma Chemical Company).
B-celle proliferasjonsanalyser
Karboksy fluorescin diacetat, sukkimidylester (CFSE) (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) fargete BALB/c-musesplenocytter (4x10<5>/brønn) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av ODN i en humidifisert 5% CO2inkubator ved 37<0>C i 5 dager. Cellene ble deretter farget med PE konjugert anti-CD19 antistoff (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) for CD19- og B-celle-proliferasjon ble bestemt med FACS etterfulgt av analyse med ModFit Software V3.0 (Verity Software House Inc., Topsham, ME, USA).
Eksempel 1: Undersøkelse av strukturaktivitetsrelasjoner ved CpG-motiv
Det er kjent at oligonukleotider som inneholder ikke-metylerte CpG-motiver er i stand til å stimulere immunresponser gjennom Toll-liknende reseptor 9 (TLR9) reaksjonsvei. For å identifisere oligonukleotider med den største evne til å stimulere TLR9-reaksjonsveien, ble utstrakte strukturaktivitetsrelasjonsstudier (SAR) ved CpG-motivet utført. Resultatene viste at substituering av guanin med hypoksantin og 6-tioguanin førte til en liknende aktivitet i hTLR9-analysen, mens purin, 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 8-okso-7,8-dihydroguanin og 7-deazaguinin substituering resulterte i en 40-80% reduksjon i hTLR9-stimulering. Videre, modifisering ved C5 og N4 resulterte i ingen stimulering av hTLR9-reaksjonsveien. Disse observasjoner resulterte i en SAR-modell hvor guanin gjenkjennes via Hoogsteen-sete, mens cytosin binder med C,H-kanten til TLR9-reseptoren (se fig.1 a). Således, ingen modifisering med Hoogsteen-gjenkjenningssete for guanin og likeledes ved C,H-kanten av cytosin var mulig uten signifikant tap av hTLR9-aktivitet. Ingen av de undersøkte basemodifiseringer ved dinukleotidmotivet var mer aktiv enn den ikke-modifiserte CpT-motiv.
Eksempel 2: Effekten av hydrofobisk tyminbaseformanaloger nær CpG-motivet
For å undersøke virkningen av dT-enhetene i naboområdet til CpG-motivet, ble flere hydrofobe tyminbaseformanaloger så som 2,4-difluorotoluen (FF) (SEQ ID NO:3-9), 5-brom-2’-deoksyuridin (BU) og 5-jod-2’-deoksyuridin (JU), inkorporert på utsiden av CpG-motivet (se tabell 1 og figurer 2-3).
Overraskende, inkorporering av alle testede hydrofobe tyminanaloger førte til en unaturlig sterk økning i hTLR9-aktivitet, mens substituering med uracilenheter (tymin med manglende metylgruppe, figur 4) førte til en sterk reduksjon i hTLR9-stimulering. Økningen i TLR9-stimulering var uttalt idet modifiseringen var 5' i forhold t il CpG-motivet. Dobbeltsubstituering med 5-joduracil (JU) 5' og 3' av CpG-motivet resulterte i den mest potente stimulering av de som ble testet. I motsetning, substituering av guanin og cytosin med 2,4-difluortoluen ved CpG-motivet førte i begge tilfeller til sterk reduksjon i TLR9-stimuleringsindeksen.
Inkorporering av hydrofobe T-analoger resulterte også i en sterk forbedring av IFN-alfa-induksjon i humane PBMCer. Uventet, modifisering av en ODN (SEQ ID NO:1) som er virtuelt inaktiv i å indusere IFN-alfa med 5-bromuridin og 5-joduridin resulterte spesielt i øket TLR9-stimulering og IFN-alfa induksjon. Der er vanligvis en invers korrelasjon mellom TLR9 og IFN-alfa induksjon for CpG ODN som ikke inneholder disse modifiseringer.
Tabell 1: Eksempler på modifiserte oligonukleotider med hydrofobe tyminbaseformanaloger nær CpG-motivet
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
Eksempel 3: Aktivering av TLR9 med lipofile baseformsubstitueringer
Siden forskjellige typer av lipofile substitueringer av basen 5' til CpG-motivet forårsaket signifikant økning i stimulering av hTLR9, ble andre baseanaloger, så som 5-kloruracil, 5-trifluormetyluracil, fenyl, aryl og substituerte arylenheter undersøkt for deres evne til å stimulere hTLR9 (tabell 3). For å undersøke aktivering av humane TLR9 med B-klasse oligonukleotider modifisert med forskjellige lipofile baseanaloger, ble B-klasse ODN SEQ ID NO:1 modifisert med 5-klor-2'-deoksyuridin (CU), 5-brom-2'-deoksyuridin (BU), 5-jod-2'-deoksyuridin (JU) og 5-etyl-2'-deoksyuridin (EU). hTRL9-NFkB-293-celler ble inkubert med den angitte ODN (figur 5a) i 16 timer. Cellene ble deretter lysert og luciferaseaktivitet ble bestemt. CU-modifisert (SEQ ID NO:41), BU-modifisert (SEQ ID NO:10), JU modifisert (SEQ ID NO:13) og EU-modifisert (SEQ ID NO:42) oligonukleotider viste alle større stimulering av TLR9-aktivitet i forhold til kontroll (SEQ ID NO.1). SEQ ID NO:16 med uridinmodifisering viste dramatisk redusert aktivitet. I et andre eksperiment ble IFN-alfaproduksjon målt (figur 5b). Humane PBMC ble inkubert den modifiserte ODN som angitt i 24 t, hvoretter supernatantene ble testet med ELISA. JU-modifisert, BU-modifisert og EU-modifisert ODN resulterte i den største økning i IFN-alfa i forhold til kontroll. Disse data viser at 5'-substituering av dU på en B-klasse ODN øker TLR9-aktivitet og IFN-alfaproduksjon.
For å ytterligere å undersøke effekten av EU-modifisering på TLR9-aktivering, ble eksperimentet repetert med modifiserte oligonukleotider som har EU-modifiseringer 5’ i forhold til CpG (SEQ ID NO:42), 3’ i forhold til CpG (SEQ ID NO:29), og 5’ og 3’ i forhold til CpG (SEQ ID NO:30). SEQ ID NO: 42 og 30 viste en signifikant økning i TLR9-aktivering over ikke-modifisert SEQ ID NO:1 og ikkemodifisert B-klasse ODN SEQ ID NO:37 (figur 6).
Tabell 2: Eksempler på modifiserte oligonukleotider med lipofile baseanalogsubstitueringer
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
Eksempel 4: Lipofil substituering på oligonukleotider av A, B, C, P og T-klasser
For å undersøke effektene av lipofile baseanalogsubstituering på de forskjellige klasser av ODN, ble modifiseringer utført på A-klasse, B-klasse, C-klasse, P-klasse og T-klasse oligonukleotider. Noen eksempler på disse oligonukleotider er gitt i tabell 3.
Tabell 3: JU-modifiserte oligonukleotider av klasse A, B, C, P og T.
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
For å undersøke aktivering av human TLR9 med modifiserte B-klasser oligonukleotider, ble 5'-jod-2'-deoksyuridin-modifisert B-klasse derivater av SEQ ID NO:37 evaluert i en luciferaseanalyse for deres evne til å aktivere TLR9 (se materialer og metoder). Alle modifiserte B-klasse oligonukleotider viste en signifikant økning i TLR9-aktivering over ikke-modifisert SEQ ID NO:37 (figur 7).
For å undersøke aktivering av humant TLR9 med modifiserte A-klasse oligonukleotider, ble 5-jod-2'-deoksyuridin-modifisert A-klasse derivater av SEQ ID NO:43 testet for deres evne til å aktivere TLR9 i en luciferaseanalyse (figur 8a) og en PBMC-analyse (figur 8b) som i figur 5. Økningen i TLR9-stimulering var uttalt idet modifiseringen var 5' i forhold til CpG-motivet, selv om dobbeltsubstituering med 5-joduracil (JU) 5' og 3' i forhold til CpG-motivet resulterte i den mest potente stimulering.
For å undersøke aktiveringen av humant TLR9 av modifisert C-klasse oligonukleotider, ble 5-jod-2'-deoksyuridin-modifisert C-klasse derivater av SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 44 og 45 testet for deres evne til å aktivere TLR9. En klasse sekvenser SEQ ID NO: 43 (ikke-modifisert) og SEQ ID NO:35 og 36 ble testet samtidig. Som vist i figur 9, modifiserte ODN SEQ ID NO:35, 36, 44 og 45 viste alle øket stimulering av TLR9 over ikke-modifisert A- og C-klasse i en luciferaseanalyse. For å undersøke aktivering av human TLR9 med modifisert P-klasse oligonukleotider, ble 5-jod-2'-deoksyuridin modifisert P-klasse derivater av SEQ ID NO:46 testet for deres evne til å aktivere TLR9 i en luciferaseanalyse. Som vist i figur 10, modifisert ODN SEQ ID NO:31-33 viste en øket stimulering av TLR9 over ikke-modifisert ODN.
For å undersøke aktiveringen av humant TLR9 med modifisert T-klasse oligonukleotider ble 5-jod-2'-deoskyuridin-modifisert T-klassederivater av ikke-modifisert T-klasse ODN SEQ ID NO:52 testet for deres evne til å aktivere TLR9. Som vist i figur 11, viste modifiserte ODN SEQ ID NO:47-50 en øket stimulering av TLR9 over ikke-modifisert T-klasse ODN i en luciferaseanalyse. Uridinderivatet SEQ ID NO:51 viste redusert stimulering av TLR9.
Som eksemplene viser, substituering av lipofile T-analoger 5' til CpG-motivet resulterer i en sterk økning i TLR9-aktivering i alle klasser som ble testet, og resulterte i en øket evne til å indusere IFN-alfa-produksjon.
Eksempel 5: Stimulering av TLR9 av korte modifiserte oligonukleotider
Idet de modifiserte CpG ODN på 20 nukleotider i lende viste en uvanlig affinitet for TLR9-aktivering, ble svært korte CpG ODN undersøkt for deres evne til å aktivere TLR9. Svært korte oligonukleotider vil være en fordel over lengre oligonukleotider for anvendelse i behandling på grunn av den økete letthet ved opptak i celler, og likeledes potensialet for enklere formulering, uten anvendelse av DOTAP. Tre korte CpG ODN (kortmerer) ble undersøkt (tabell 3): en 6-mer CpG motivheksamer (SEQ ID NO:38), en 5' JU-modifisering av heksameren (SEQ ID NO:39) og en 5'3' JU-modifisering av heksameren (SEQ ID NO:40) (tabell 4). Aktiviteten av kort-merene ble sammenliknet med ikkemodifisert B-klasse oligonukleotid SEQ ID NO:37 i en luciferaseanalyse. Som vist i figur 12, mest fortrinnsvis med SEQ ID NO:40, viser anvendelse av modifiserte korte-merer stort potensiale som et forbedret immunterapimedikament.
Tabell 4: Modifiserte korte oligonukleotider
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
Eksempel 6: Aktivering av TLR9- reaksjonsvei in vivo med modifiserte oligonukleotider
For å bestemme effektiviteten av modifisert ODN ifølge oppfinnelsen in vivo ble ODN med lipofile T-analoger testet i isolerte musesplenocytter. BALB/c musesplenocytter ble isolert og inkubert med modifisert B-klasse (SEQ ID NO:13), ikke-modifisert B-klasse (SEQ ID NO:37) og en ikke-CpG ODN (SEQ ID NO:26) (tabell 5). Dyrkingsupernatanter ble samlet ved 6 timer (TNF-alfa) eller 24 timer (IL-6, IL-10, IL12) og cytokinkonsentrasjon ble målt med ELISA. Som vist i figur 13, inkubering med modifisert SEQ ID NO:13 resulterte i dramatiske økete nivåer av alle cytokiner som ble testet.
ODN ble deretter testet for deres evne til å indusere B-celleproliferasjon i splenocytter. CFSE-fargete BALB/c musesplenocytter (4x10<5>/brønn) ble inkubert med 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 eller 10 µg/ml av den angitte ODN (figur 14).72 timer etter inkubering ble cellene farget for celleoverflatemarkør CD19 og B-celleproliferasjon ble bestemt med FACS etterfulgt av analyser med ModFit programvare. Som vist i figur 14, inkubering med modifisert SEQ ID NO:13 resulterte i en markert økning i B-celleproliferasjon. Økningen var mest uttalt selv ved lavere ODN-konsentrasjon.
For å måle effekten av modifisert ODN in vivo, ble BALB/c-mus (5 per gruppe) injisert subkutanøst (SC) med 10, 50 eller 100 µg av SEQ ID NO:13 eller 100 µg av SEQ ID NO:37 i et totalt volum av 100 µl SC. Kontrollgruppen mottok 100 µl PBS alene. Dyrene ble blødet med hjertepunktuering ved 1 time etter injeksjon (TNF-alfa) eller 3 timer etter injeksjon (IP-10). Plasmaprøver ble analysert med ELISA for TNF-alfa (figur 15a) og IP-10 (figur 15b). Injeksjon av BALB/c-mus med modifisert SEQ ID NO:13 resulterte i høyere TNF-alfa og IP-10 produksjon enn ikke-modifisert SEQ ID NO:37, noe som viser at den lipofile baseformsubstituerte ODN ved oppfinnelsen resulterer i en større immunstimulering in vivo enn ikke-modifisert immunstimulatorisk ODN.
Tabell 5: Oligonukleotider testet in vivo
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
Eksempel 7: Oligonukleotider med ytterligere modifiseringer
ODN med lipofile baseanaloger ble testet for deres evne til å indusere TLR9-mediert NF-κB-aktivitet i en luciferaseanalyse (se materialer og metoder). Figur 16-23 viser aktiviteten av ODN med ytterligere modifiseringer (se tabell 6).
For å teste aktiviteten av andre baseanaloger ble aktiviteten av 6-nitrobenzimidazol (6NB)-modifisert ODN SEQ ID NO:178 og ikke-modifisert morsekvens SEQ ID NO:1 sammenliknet. Som vist i figur 12, SEQ ID NO:178 var i stand til å aktivere TLR9-mediert NF-κB i en grad som var sammenliknbar med ikke-modifisert morsekvens. Deretter ble aktiviteten av 5-(2-bromvinyl)-uridin-modifisert ODN (SEQ ID NO:153-154) sammenliknet med ikke-modifisert morsekvens SEQ ID NO:1. Som vist i figur 17, begge modifiserte ODN var mer aktive i analysen enn morsekvensen. Deretter ble aktiviteten av to B-klasse ODN med 5-proynul-dU (SEQ ID NO:116 og 117) i stedet for tymidin i morsekvensen (SEQ ID NO:1). Som vist i figur 21, begge modifiserte ODN hadde aktivitet sammenlignbar med morsekvensen.
Aktiviteten av SEQ ID NO:116, hvor modifiseringen av 5' i forhold til CG-dinukleotidene, var noe forbedret over morsekvensen.
For å teste effekten av en andre type modifisering på JU-modifisert ODN, ble
2’O-metylguanosiner inkorporert i JU-modifisert ODN. Aktiviteten av 2’-O-metylguanosin/JU ODN SEQ ID NO:111-113 ble sammenliknet med morsekvensen SEQ ID NO:1 og JU kun modifisert SEQ ID NO:13. Som vist i figur 18, alle JU-modifiserte ODN var mer aktive enn mor-ODN. ODN med 2’O-metylguanosin modifisering 3' i forhold til CG dinukleotid (SEQ ID NO:112-113) var noe mer aktive enn ODN med 2’O-metylguanosin modifisering 5’ i forhold til CG-dinukleotidet (SEQ ID NO:111) eller ODN modifisert med JU alene (SEQ ID NO:13).
Deretter ble aktiviteten av JU-modifisert forgrenet ODN (SEQ ID NO:96, 97, 101 og 102) sammenliknet med SEQ ID NO:1. Som vist i figur 19, forgrenet ODN med to aksessbare 5'-ender var alle like aktive eller mer aktive enn den ikke-modifiserte SEQ ID NO:1 i analysen. SEQ ID NO:101 og 102, med trietylenglykolfosat-spaceren, var mer aktiv enn SEQ ID NO:96 og 97 med 3'-O-metyl-G-spaceren.
Deretter ble aktiviteten av en kort ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:38) og en ODN av samme sekvens med en lipofil substituert nukleotidanalog og en lipofil 3'-markør (SEQ ID NO:126) sammenliknet. Begge ble formulert med og uten DOTAP. Som vist i figur 20, tilsetting av JU-modifiseringen og den lipofile markør forsterket sterkt aktiviteten av ODN, slik det gjorde med tilsetting av DOTAP.
Deretter ble aktiviteten av B-klasse ODN med den andre nukleotidanalog i tillegg til en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:138; 7-deaza-dG; SEQ ID NO:139, inosin; SEQ ID NO:140, 5-metyl-dC) sammenliknet med morsekvensen (SEQ ID NO:1) og den samme sekvens med en lipofil substituert nukleotidanalog alene (SEQ ID NO:13). Som vist i figur 22, alle modifiserte ODN var mer aktive i analysen enn mor-ODN.
Deretter ble aktiviteten av T-klasse ODN med en lipofil substituert nuleotidanalog (SEQ ID NO:132-134) sammenliknet med C-klasse ODN (SEQ ID NO:198) som er kjent å være immunstimulatorisk. Som vist i figur 23, alle modifiserte ODN viste langt større aktivitet i analysen enn ikke-modifisert C-klasse ODN.
Tabell 6: Lipofile substituerte oligonukleotider med ytterligere modifiseringer
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
Eksempel 8: Aktivitet av modifiserte P-klasse oligonukleotider
P-klasse ODN med lipofile baseanaloger ble testet for deres evne til å aktivere NF-κB-reaksjonsveien gjennom TLR9 som målt med luciferaseanalyse. Aktiviteten av P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58-61) ble sammenliknet med en B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56). Som vist i figur 24, alle modifiserte P-klasse ODN viste øket TLR9-stimulering sammenliknet med kontrollene. Figur 24a viser JU-modifsiert P-klasse ODN og 24b viser EU-modifisert P-klasse ODN.
Deretter ble aktiviteten av modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:64 (EU-modifisert), 66-67 (JU-modifisert) sammenliknet med B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55), en C-klasse ODN (SEQ ID NO:68) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:57). Som vist i figur 25, alle modifiserte ODN viste en høyere grad av TLR9-stimulering enn den ikke modifiserte P-klasse ODN. SEQ ID NO:66, med fosfodiesterbindingen i CG-dinukleotidet viste redusert aktivitet sammenliknet med den fullstendige fosforotioat SEQ ID NO:67.
Deretter ble modifisert P-klasse ODN testet for deres evne til å indusere ekspresjon av IFN-alfa. Aktiviteten av P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:58-61) ble sammenliknet med en B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56) som målt med en ELISA-analyse. Som vist i figur 26, alle modifiserte P-klasse ODN viste en økning i IFN-alfa induksjon. Figur 26a viser JU-modifisert P-klasse ODN og 26b viser EU-modifisert P-klasse ODN.
Deretter ble modifisert P-klasse ODN (EU-modifisert), 66-67 (JU-modifisert) sammenliknet med en B-klasse positiv kontroll (SEQ ID NO:55), en C-klasse ODN (SEQ ID NO:68) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:57) for evnen til å indusere IFN-alfa som målt med en ELISA-analyse. Som vist i figur 27, den modifiserte P-klasse ODN viste forsterket evne til å indusere IFN-alfa. Som i figur 24, SEQ ID NO:66 viste redusert aktivitet sammenliknet med SEQ ID NO:67.
Deretter ble modifisert P-klasse ODN testet for evne til å indusere IL-6 i human PBMC. PBMC fra tre donorer ble inkubert med ODN ved konsentrasjoner som angitt for 24 timer, etterfulgt av lumineks 25-pleks analyse av supernatantene for IL-6. Aktiviteten av modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:58, 60-62, figur 28a) (SEQ ID NO:64 og 67, figur 28b) ble sammenliknet med ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:55), og ikke-modifisert C-klasse ODN (SEQ ID NO:54), en negativ kontroll ODN (SEQ ID NO:53) og en ikke-modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56). JU-modifisert ODN (SEQ ID NO:58, 60-61 og 67) viste en noe høyere aktivering av IL-6 enn EU-modifisert ODN (SEQ ID NO:62 og 64). Alle modifiserte ODN viste øket aktivitet sammenliknet med ikke-modifisert ODN.
Deretter ble aktiviteten av modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:58, 60-62, figur 29a) (SEQ ID NO:64 og 67, figur 29b) sammenliknet med en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:55), en ikkemodifisert C-klasse ODN (SEQ ID NO:54), en negativ kontroll ODN (SEQ ID NO:53), en ikkemodifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:56), LPS, R-848, SEB og poly[I]:[C] ODN. CFSE-merket PBMC fra tre donorer ble inkubert med ODN i 5 dager og deretter farget med et CD19-antistoff. Prosentandelen av B-celler med redusert CFSE-farging ble bestemt. Behandling med B-klasse ODN resulterte i den høyeste prosentandel av B-celler etter oppdeling. Behandling med JU-modifisert ODN resulterte i en høyere prosentandel B-celler enn EU-modifisert ODN.
For å bestemme effekten av modifisert P-klasse ODN in vivo, ble BALB/c-mus (5 per gruppe) injisert SC med forskjellige doseringer av ODN. Dyrene ble blødet ved 3 t etter injeksjon og plasma ble testet for IFN-alfa med ELISA. Aktiviteten av modifisert P-klasse ODN (SEQ ID NO:58, 60-62, 64 og 67) ble sammenliknet med en B-klasse negativ kontroll (SEQ ID NO:55) og en negativ kontroll (SEQ ID NO:26). Som vist i figur 30, behandling med JU-modifisert ODN SEQ ID NO:58, 60 og 61 resulterte i en noe høyere IFN-alfa induksjon enn i EU-modifisert ODN SEQ ID NO:64. B-klasse ODN SEQ ID NO:55 induserte ikke mye murin IFN-alfa, som forventet.
Deretter ble modifisert P-klasse ODN evaluert for deres evne til å redusere tumorvolum i mus SA1N tumormodell. Hunkjønn A/J-mus (10 per gruppe) ble injisert SC med 5 x 10<5>SaI/N-tumorceller ved dag 0. Musene ble behandlet med 35 µg (figur 31a) eller 100 µg (figur 31b) P-klasse ODN med en lipofil substituert nukleotidanalog (SEQ ID NO:60, 64 og 67), en ikke-modifisert C-klasse ODN, en ikke-modifisert B-klasse ODN (SEQ ID NO:55), eller PBS alene. ODN ble gitt SC en gang i uken startende ved dag 8 post tumor induksjon. Dyrene ble monitorert for overlevelse og tumorvolum. Som vist i figur 31a, ved den lavere doseringsbehandling med den modifiserte P-klasse ODN viste den største reduksjon i tumorvolum, noe som antyder at disse ODN vil være effektive i å behandle cancer. Ved den høyere dosering i 31b, var alle modifiserte P-klasse ODN og C-klasse ODN effektive i å redusere tumorvolum.
Tabell 7: Modifiserte P-klasse oligonukleotider
* fosforotioat internukleotidbinding
- fosfodiester internukleotidbinding
Et sammendrag av representative modifiserte ODN presenteres i tabell 8:
Tabell 8
nøkkel

Claims (14)

  1. Patentkrav 1. Oligonukleotid, k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter: sekvensen R1YZR2hvor R1og R2er valgt blant gruppen som består av en lipofil substituert nukleotidanalog (L), et nukleotid, og en binding, hvor minst én av R1og R2er en lipofil substituert nukleotidanalog (L), hvor Y er cytosin og hvor Z er guanin, hvor (L) er valg blant 5-klor-uracil, 5-brom-uracil, 5-iod-uracil, 5-etyl-uracil og (E)-5-(2-bromvinyl)-uracil, med den forutsetning at nevnte oligonukleotid ikke er d[GCGAA(BrU)(BrU)CGC] hvor BrU er 5-brom-uracil.
  2. 2. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t: (i) R1og R2er begge L, eller (ii) R1er L og R2er et nukleotid, eller (iii) R1er en L og R2er en binding, slik at oligonukleotidet omfatter en struktur 5' R1CG 3', eller (iv) R1er L og R2er en binding, og hvor en andre R1er 5' til R1YZ i en avstand av en nukleotid N, slik at oligonukleotidet omfatter en struktur 5’ R1NR1YZ 3’.
  3. 3. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, , k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter to 5’ R1NR1YZ 3’ motiver hvor N er et nukleotid.
  4. 4. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, , k a r a k t e r i s e r t v e d a t: (i) R2er L og R1er et nukleotid, eller (ii) oligonukleotidet er 3 nukleotider i lengde, eller (iii) oligonukleotidet er 3-6 nukleotider i lengde, eller (iv) oligonukleotidet er 3-100 nukleotider i lengde, eller (v) oligonukleotidet er 7-100 nukleotider i lengde, eller (vi) oligonukleotidet er T-rikt, eller (vii) oligonukleotidet inkluderer minst 80% T.
  5. 5. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t: (i) det omfatter minst én palindromisk sekvens, eller (ii) det omfatter to palindrom sekvenser, eller (iii) det omfatter én til fire ikke-metylerte CG dinukleotider, eller (iv) det omfatter minst én (G)m-sekvens, hvor m er 4 til 10, eller (v) det omfatter minst én metylert CG dinukleotid, eller (vi) alle CG-dinukleotider er ikke-metylert, eller (vii) det omfatter ytterligere en ikke-nukleotidisk modifisering valgt blant gruppen som består av C6-C48-polyetylenglykol, C3-C20-alkandiol, C3-C18-alkylaminolinker og C3-C18- alkyltiollinker, kolesterol, gallesyre, mettet eller umettet fettsyre og folat, fortrinnsvis en heksadecylglyserol eller diheksadecylglyserolgruppe eller en oktadecyl glyserol- eller dioktadecylglyserolgruppe, eller en vitamin E-gruppe, eller (viii) den ytterligere omfatter en ikke-nukleotidisk forgrenet enhet, eller (ix) den ytterligere omfatter en nukleotidisk forgreningsenhet, eller (x) den ytterligere omfatter en forgreningsenhet, hvor oligonukleotidene har minst to 5'-ender, eller (xi) hvor minst to nukleotider av oligonukleotidet har en stabilisert binding, valgt blant fosforotioat, fosforoditioat, metylfosfonat, metylfosfonotioat boranfosfonat, fosforamidat eller en defosfobinding, enten som en enantiomerisk blanding eller som en enantiomerisk ren S- eller R-konfigurasjon, eller (xii) hvor YZ av R1YZR2har en fosfodiesterbinding, eller (xiii) hvor YZ av R1YZR2har en fosforotioatbinding, eller (xiv) hvor R1Y av R1YZR2har en fosforotioatbinding, eller (xv) hvor ZR2av R1YZR2har en fosforotioatbinding, eller (xvi) hvor alle andre nukleotider har en fosforotioatbinding, eller (xvii) hvor oligonukleotidet er fri fra en mikrobærer, fortrinnsvis fri fra en lipidbærer, eller (xviii) hvor oligonukleotidet omfatter minst én 3'-3'-kobling, eller (xix) hvor oligonukleotidet omfatter minst én 5'-5'-kobling.
  6. 6. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte oligonukleotid er valgt blant SEQ ID No 10 til15, SEQ ID No 19 til 24, SEQ ID No.27 til 36, SEQ ID No 39 til 42, SEQ ID No 44, SEQ ID No 45, SEQ ID No 47, SEQ ID No 48, SEQ ID No 58, SEQ ID No 60, SEQ ID No 62, SEQ ID No 64, SEQ ID No 66, SEQ ID No 67, SEQ ID No 85, SEQ ID No 90 til 99, SEQ ID No 101 til 115, SEQ ID No 118 til 121, SEQ ID No 123 til 130, SEQ ID No 133 til 137, SEQ ID No 143 til 175, SEQ ID No 179 til 181 og SEQ ID No 183 til 194.
  7. 7. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte oligonukleotid er valgt blant:
    Ċ Ĩfortsatt)
    Ċ Ĩfortsatt)
    (fortsatt)
    hvor «*» representerer en tiofosfat internukleotidbinding; «-» representerer en fosfodiester internukleotidbinding; «EU» representerer 5-etyl-2’-deoksyuridin; «JU» representerer 5-iod-2’-deoksyuridin; «BVU» representer 5-(d-brom-vinyl)-uridin; «3 mg» representer 3’-O-metylrG, og «iT» representer invers nukleotid (3’ og 5’ ombyttet).
  8. 8. Oligonukleotid i samsvar med krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte oligonukleotid er valgt blant: ; ;hvor «*» representerer en tiofosfat internukleotidbinding; «-» representerer en fosfodiester internukleotidbinding; «EU» representerer 5-etyl-2’-deoksyuridin; og «JU» representerer 5-iod-2’-deoksyuridin.
  9. 9. Oligonukleotid i samsvar med ethvert av kravene 1-8 for anvendelse til å indusere en immunrespons.
  10. 10. Oligonukleotid i samsvar med ethvert av kravene 1-8 for anvendelse til å indusere en immunrespons i samsvar med krav 9, (i) hvor immunresponsen er en IFN-α induksjon, eller (ii) den ytterligere omfatter et antigen, eller (iii) hvor oligonukleotidet avgis av en rute valgt blant gruppen som består av oral, nasal, sublingual, intravenøs, subkutanøs, mukosal, okular, respiratorisk, direkte injeksjon og intradermalt, eller (iv) hvor oligonukleotidet eller sammensetningen avgis i et individ i en effektiv mengde for å indusere cytokin og/eller kjemokin ekspresjon, eller (v) den ytterligere omfatter å administrere til individet en ytterligere immunmodulator, eller (vi) hvor oligonukleotidet avgis til individet for å behandle en autoimmun sykdom i individet, eller (vii) hvor oligonukleotidet avgis til individet for å behandle luftveisremodellering i individet, eller (viii) oligonukleotidet administreres uten et antigen til individet.
  11. 11. Oligonukleotid i samsvar med ethvert av kravene 1-8 for anvendelse til å behandle cancer.
  12. 12. Oligonukleotid i samsvar med ethvert av kravene 1-8 for anvendelse til å behandle cancer i samsvar med krav 11, (i) hvor nevnte cancer er valgt blant gruppen som består av basal cellecarsinom, gallecancer, blærecancer, bencancer, hjerne- og CNS cancer, brystcancer, cervikal cancer, koriokarsinom, tarmcancer og rektumcancer, bindevevscancer, cancer i fordøyelsessystemet, endometrial cancer, øsofagal cancer, øyecancer, cancer i hode og hals, gastrisk cancer, intraepitelial neoplasma, nyrecancer, larynxcancer, leukemi, levercancer, lungecancer, lymfom inkluderende Hodginks og ikke-Hodgins lymfom, melanom, myelom, nevroblastom, munnhulecancer, eggstokkcancer, pankreatisk cancer, prostatacancer, retinoblastom, rhabdomyosarkom, rektal cancer, renal cancer, cancer i respirasjonssystemet, sarkom, hudcancer, magecancer, testikkulær cancer, thyroid cancer, eggledercancer, cancer i urinveiene, og andre karsinomaer og sarkomaer, eller (ii) ytterligere omfatter å administrere til individet et anti-cancermedikament eller behandling, for eksempel kjemoterapeutiske midler, bestråling, eller (iii) hvor oligonukleotidet avgis av en rute valgt blant gruppen som består av oral, nasal, sublingual, intravenøs, subkutanøs, mukosal, okular, respiratorisk, direkte injeksjon og dermalt, eller (iv) hvor individet behandles med kirurgi.
  13. 13. Oligonukleotid i samsvar med ethvert av kravene 1-8 for anvendelse til å behandle eller hindre en virusinfeksjon.
  14. 14. Oligonukleotid i samsvar med ethvert av kravene 1-8 for anvendelse til å behandle eller hindre en virusinfeksjon i samsvar med krav 13, (i) hvor nevnte virusinfeksjon er forårsaket av hepatitt B virus (HBV), hepatitt C virus (HCV), human immunsviktvirus (HIV), influensavirus, respiratorisk syncytialvirus (RSV) eller humant papillomavirus (HPV), eller (ii) hvor oligonukleotidet avgis med en rute valgt blant gruppen som består av oral, nasal, sublingual, intravenøs, subkutanøs, mukosal, okular, respiratorisk, direkte injeksjon og dermalt, eller (iii) hvor den ytterligere omfatter et antiviralt middel, eller (iv) hvor individet er ikke-responsiv til en ikke-CpG antiviral terapi.
NO20091218A 2006-09-27 2009-03-23 CPG-oligonukleotidanaloger inneholdende hydrofobe T-analoger med forbedret immunstimulatorisk aktivitet NO342465B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84781106P 2006-09-27 2006-09-27
PCT/IB2007/004389 WO2008068638A2 (en) 2006-09-27 2007-09-27 Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20091218L NO20091218L (no) 2009-04-21
NO342465B1 true NO342465B1 (no) 2018-05-28

Family

ID=39492695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20091218A NO342465B1 (no) 2006-09-27 2009-03-23 CPG-oligonukleotidanaloger inneholdende hydrofobe T-analoger med forbedret immunstimulatorisk aktivitet

Country Status (22)

Country Link
US (3) US8580268B2 (no)
EP (2) EP2960332A1 (no)
JP (2) JP5455629B2 (no)
KR (2) KR101251707B1 (no)
CN (1) CN101517082B (no)
AU (1) AU2007330410B2 (no)
BR (1) BRPI0717510B8 (no)
CA (1) CA2664219C (no)
DK (1) DK2078080T3 (no)
ES (1) ES2544958T3 (no)
HK (1) HK1133440A1 (no)
HU (1) HUE027064T2 (no)
IL (1) IL197549A (no)
MX (1) MX2009003398A (no)
NO (1) NO342465B1 (no)
NZ (1) NZ575437A (no)
PL (1) PL2078080T3 (no)
PT (1) PT2078080E (no)
RU (1) RU2477315C2 (no)
SI (1) SI2078080T1 (no)
WO (1) WO2008068638A2 (no)
ZA (1) ZA200901735B (no)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
PT1077722E (pt) 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
EP1176966B1 (en) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
JP4598389B2 (ja) * 2001-06-21 2010-12-15 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション キメラ免疫調節化合物とその使用方法
JP4383534B2 (ja) 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
NZ573064A (en) 2002-04-04 2011-02-25 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
ZA200503511B (en) 2002-10-29 2006-10-25 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
HUE033832T2 (en) 2002-11-15 2018-01-29 Idenix Pharmaceuticals Llc 2'-methyl nucleosides in combination with interferon and Flaviviridae mutation
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US7615539B2 (en) * 2003-09-25 2009-11-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
GEP20094767B (en) 2003-10-30 2009-09-10 Coley Pharm Group Inc C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
KR101251707B1 (ko) * 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
EP2190440A1 (en) 2007-08-13 2010-06-02 Pfizer Inc. Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
KR20100068422A (ko) 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체
US8541569B2 (en) * 2008-09-06 2013-09-24 Chemgenes Corporation Phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, efficient RNA synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA
KR101881596B1 (ko) 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
KR100998365B1 (ko) * 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
CN102596204B (zh) 2009-07-06 2016-11-23 波涛生命科学有限公司 新的核酸前药及其使用方法
JP2011251963A (ja) 2010-05-28 2011-12-15 Coley Pharmaceutical Group Inc 抗原および免疫調節ワクチンおよびコレステロール、ならびにその使用
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
JP2014514295A (ja) 2011-03-31 2014-06-19 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
ES2626488T3 (es) 2011-07-19 2017-07-25 Wave Life Sciences Pte. Ltd. Procedimientos para la síntesis de ácidos nucleicos funcionalizados
EP2755983B1 (en) * 2011-09-12 2017-03-15 Idenix Pharmaceuticals LLC. Substituted carbonyloxymethylphosphoramidate compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of viral infections
EA031301B1 (ru) 2012-05-22 2018-12-28 Иденикс Фармасьютикалз Ллс D-аминокислотные химические соединения для лечения заболеваний печени
US9296778B2 (en) 2012-05-22 2016-03-29 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3′,5′-cyclic phosphate prodrugs for HCV infection
US9109001B2 (en) 2012-05-22 2015-08-18 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3′,5′-cyclic phosphoramidate prodrugs for HCV infection
SG11201500232UA (en) * 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
EP2873674B1 (en) 2012-07-13 2020-05-06 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
AU2013288048A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
WO2014052638A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Esters and malonates of sate prodrugs
MX353422B (es) 2012-10-08 2018-01-12 Idenix Pharmaceuticals Llc Análogos de 2'-cloronucleósido para infección por vhc.
SG10201804331TA (en) 2012-11-15 2018-07-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligonucleotide conjugates
US9309275B2 (en) 2013-03-04 2016-04-12 Idenix Pharmaceuticals Llc 3′-deoxy nucleosides for the treatment of HCV
US20140271547A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Amino acid phosphoramidate pronucleotides of 2'-cyano, azido and amino nucleosides for the treatment of hcv
ES2894138T3 (es) * 2013-05-14 2022-02-11 Zoetis Services Llc Composiciones de vacuna novedosas que comprenden oligonucleótidos inmunoestimulantes
WO2014197578A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 1',4'-thio nucleosides for the treatment of hcv
WO2015017713A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 Idenix Pharmaceuticals, Inc. D-amino acid phosphoramidate pronucleotides of halogeno pyrimidine compounds for liver disease
JP6586083B2 (ja) * 2013-09-19 2019-10-02 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー 油性アジュバント
CN105936906B (zh) * 2013-11-08 2019-06-21 上海交通大学 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
EP3074003B1 (en) 2013-11-26 2023-01-11 Zoetis Services LLC Compositions for induction of immune response
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
CN106068325B (zh) 2014-01-16 2021-07-09 波涛生命科学有限公司 手性设计
US10202411B2 (en) 2014-04-16 2019-02-12 Idenix Pharmaceuticals Llc 3′-substituted methyl or alkynyl nucleosides nucleotides for the treatment of HCV
PL3240801T3 (pl) 2014-12-31 2021-06-14 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Skojarzona immunoterapia nowotworów
SI3244920T1 (sl) * 2015-01-16 2023-09-29 The United States of America, represented by The Secretary of Agriculture, United States Department of Agriculture Cepivo proti slinavki in parkljevki
US10456459B2 (en) 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions
JP7039800B2 (ja) * 2016-03-09 2022-03-23 学校法人東京理科大学 Ｒｎａハイブリッド形成用核酸オリゴマー
AU2017274332B2 (en) 2016-06-02 2024-06-27 Zoetis Services Llc Vaccine against infectious bronchitis
EP3463386A4 (en) * 2016-06-03 2020-03-04 Wave Life Sciences Ltd. OLIGONUCLEOTIDES, COMPOSITIONS AND METHOD THEREFOR
GB201703529D0 (en) 2017-03-06 2017-04-19 Cambridge Entpr Ltd Vaccine composition
SG11201909516VA (en) 2017-04-14 2019-11-28 Tollnine Inc Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
CN107090009B (zh) * 2017-04-14 2019-10-25 佛山科学技术学院 一种二糖核苷化合物及其制备方法
JP7458977B2 (ja) 2017-12-15 2024-04-01 エランコ アニマル ヘルス ゲー・エム・ベー・ハー 免疫刺激性組成物
AU2018390817A1 (en) 2017-12-20 2020-06-25 Zoetis Services Llc Vaccines against Hendra and Nipah virus infection
EP3746457A1 (en) 2018-01-29 2020-12-09 Stichting Katholieke Universiteit New potent sialyltransferase inhibitors
JP7511478B2 (ja) 2018-04-09 2024-07-05 チェックメイト ファーマシューティカルズ ウイルス様粒子中へのオリゴヌクレオチドのパッケージ化
TW202206098A (zh) 2020-08-11 2022-02-16 美商碩騰服務公司 抗冠狀病毒疫苗
TW202426483A (zh) 2022-10-04 2024-07-01 美商碩騰服務有限責任公司 家禽疫苗及保護家禽之方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083503A2 (en) * 2000-05-01 2001-11-08 Hybridon, Inc. MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES
WO2005030259A2 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates

Family Cites Families (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
AU568067B2 (en) 1981-10-23 1987-12-17 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and methods of making same
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
CA1339596C (en) 1987-08-07 1997-12-23 New England Medical Center Hospitals, Inc. Viral expression inhibitors
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
CA2082951C (en) 1991-03-15 1999-12-21 Robert M. Platz Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
AU678769B2 (en) 1992-07-27 1997-06-12 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DK0772619T4 (da) * 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030050263A1 (en) 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US6030955A (en) 1996-03-21 2000-02-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York And Imclone Systems, Inc. Methods of affecting intracellular phosphorylation of tyrosine using phosphorothioate oligonucleotides, and antiangiogenic and antiproliferative uses thereof
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6214806B1 (en) 1997-02-28 2001-04-10 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CPC dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
EP0983289A4 (en) 1997-05-19 2001-04-25 Merck & Co Inc OLIGONUCLEOTIDE ADJUVANT
US6339068B1 (en) 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US20040006034A1 (en) 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
WO1999001154A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
CA2323929C (en) * 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
WO1999056755A1 (en) 1998-05-06 1999-11-11 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
NZ508650A (en) 1998-05-14 2003-05-30 Coley Pharm Gmbh Regulating hematopoiesis using unmethylated C and G CpG-oligonucleotides with a phosphorothioate modification
PT1077722E (pt) 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20040247662A1 (en) 1998-06-25 2004-12-09 Dow Steven W. Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
CA2333854A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation Stereoisomers of cpg oligonucleotides and related methods
CA2341338A1 (en) 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
FR2783170B1 (fr) 1998-09-11 2004-07-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Emulsion immunostimulante
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
WO2000054803A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
EP1177439B1 (en) 1999-04-29 2004-09-08 Coley Pharmaceutical GmbH Screening for immunostimulatory dna functional modifiers
OA11937A (en) 1999-05-06 2006-04-12 Immune Response Corp Inc HIV immunogenic compositions and methods.
AU6051800A (en) 1999-06-16 2001-01-02 University Of Iowa Research Foundation, The Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
US6476000B1 (en) 1999-08-13 2002-11-05 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
OA12028A (en) 1999-09-25 2006-04-28 Univ Iowa Res Found Immunostimulatory nucleic acids.
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ES2265980T5 (es) 1999-09-27 2010-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Metodos relacionados con interferón inducido por ácidos nucleicos inmunoestimuladores.
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
WO2001045750A1 (en) 1999-12-21 2001-06-28 The Regents Of The University Of California Method for preventing an anaphylactic reaction
US20010044416A1 (en) 2000-01-20 2001-11-22 Mccluskie Michael J. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a Th2 immune response
US6815429B2 (en) 2000-01-26 2004-11-09 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
AU2001259706A1 (en) 2000-05-09 2001-11-20 Reliable Biopharmaceutical, Inc. Polymeric compounds useful as prodrugs
WO2001093902A2 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
ATE440618T1 (de) 2000-06-22 2009-09-15 Univ Iowa Res Found Kombination von cpg und antikírpern gegen cd19, cd20,cd22 oder cd40 zur prävention oder behandlung von krebs.
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
DK1366077T3 (da) 2000-09-15 2011-09-12 Coley Pharm Gmbh Fremgangsmåde til screening i store mængder af CpG-baserede immunoagonister/-antagonister
AU9475001A (en) 2000-09-26 2002-04-08 Hybridon Inc Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
FR2814958B1 (fr) 2000-10-06 2003-03-07 Aventis Pasteur Composition vaccinale
GB0025577D0 (en) 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ATE398175T1 (de) 2000-12-08 2008-07-15 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
WO2002053141A2 (en) 2000-12-14 2002-07-11 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
JP4598389B2 (ja) 2001-06-21 2010-12-15 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション キメラ免疫調節化合物とその使用方法
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
CA2456328C (en) 2001-08-07 2015-05-26 Dynavax Technologies Corporation Complexes of a short cpg-containing oligonucleotide bound to the surface of a solid phase microcarrier and methods for use thereof
JP4383534B2 (ja) * 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
CN1633598A (zh) 2001-10-05 2005-06-29 科勒制药股份公司 Toll样受体3信号传导的激动剂和拮抗剂
EP1478371A4 (en) 2001-10-12 2007-11-07 Univ Iowa Res Found METHODS AND PRODUCTS FOR ENHANCING IMMUNE RESPONSES USING IMIDAZOQUINOLINE COMPOUND
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003066649A1 (en) 2002-02-04 2003-08-14 Biomira Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
NZ573064A (en) * 2002-04-04 2011-02-25 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
CN101160399A (zh) 2002-04-22 2008-04-09 拜奥尼茨生命科学公司 寡核苷酸组合物及其在调节免疫应答中的应用
AU2003229434A1 (en) 2002-05-10 2003-11-11 Inex Pharmaceuticals Corporation Cancer vaccines and methods of using the same
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2003103586A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
CN1678188B (zh) * 2002-07-03 2012-10-10 科勒制药集团有限公司 调节免疫反应的核酸成份
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
ZA200500963B (en) * 2002-08-19 2006-10-25 Coley Pharm Group Inc Immunostimulatory nucleic acids
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
ZA200503511B (en) 2002-10-29 2006-10-25 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
WO2004058159A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
CA2512484A1 (en) 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
WO2004087203A2 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2005016235A2 (en) 2003-04-14 2005-02-24 The Regents Of The University Of California Combined use of impdh inhibitors with toll-like receptor agonists
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
CA2526212C (en) 2003-05-16 2013-08-27 Hybridon, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with chemotherapeutic agents
JP4874801B2 (ja) 2003-06-11 2012-02-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
JP2007524615A (ja) 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
TWI358301B (en) 2003-07-11 2012-02-21 Intercell Ag Hcv vaccines
US20050013812A1 (en) 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
AU2004259204B2 (en) 2003-07-15 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
US20070110714A1 (en) 2003-09-08 2007-05-17 Norio Hayashi Medicinal composition for treatment of chronic hepatitis c
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
GEP20094767B (en) 2003-10-30 2009-09-10 Coley Pharm Group Inc C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
US7713535B2 (en) 2003-12-08 2010-05-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
CA2555390C (en) 2004-02-19 2014-08-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral rna oligonucleotides
AU2005222909B2 (en) 2004-03-12 2010-03-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Enhanced activity of HIV vaccine using a second generation immunomodulatory oligonucleotide
JP2007531746A (ja) 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
EP1753453A2 (en) 2004-06-08 2007-02-21 Coley Pharmaceutical GmbH Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
HUE036894T2 (hu) 2004-06-15 2018-08-28 Idera Pharmaceuticals Inc Immunstimuláló oligonukleotid multimerek
NZ553244A (en) 2004-07-18 2009-10-30 Csl Ltd Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
JP2008506683A (ja) 2004-07-18 2008-03-06 コーリー ファーマシューティカル グループ， リミテッド 先天免疫応答を誘導するための方法および組成物
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
AU2006216493A1 (en) 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligonucleotides
MX2007012488A (es) 2005-04-08 2008-03-11 Coley Pharm Group Inc Metodos para el tratamiento de asma exacerbado por enfermedad infecciosa.
WO2006116458A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhances immunostimulatory activity
AU2006269555A1 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
BRPI0616069A2 (pt) 2005-09-16 2011-06-07 Coley Pharm Gmbh modulação de propriedades imunomoduladoras de ácido ribonucléico interferente pequeno (sirna) através de modificação de nucleotìdeo
EP1945766A2 (en) 2005-09-16 2008-07-23 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
CA2626547A1 (en) 2005-10-21 2007-05-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. The induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in dendritic cells by tlr ligands and uses thereof
US20070093439A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US7470674B2 (en) 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
PT1957647E (pt) 2005-11-25 2015-06-01 Zoetis Belgium S A Oligorribonucleótidos imunoestimulantes
JP2009521218A (ja) 2005-12-20 2009-06-04 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 異なる長さのパリンドロームセグメントを含むパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド（ｉｍｏ（ｔｍ））の免疫賦活作用
PT2405002E (pt) 2006-02-15 2015-01-05 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Composições e métodos para formulações de oligonucleotídeos
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
US20100189772A1 (en) 2006-09-27 2010-07-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc Compositions of TLR ligands and antivirals
KR101251707B1 (ko) * 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
JP2010507386A (ja) 2006-10-26 2010-03-11 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー オリゴリボヌクレオチドおよびその使用
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
US20100285041A1 (en) 2007-05-17 2010-11-11 Eugen Uhlmann Class A Oligonucleotides with Immunostimulatory Potency
KR20100068422A (ko) 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체
US9968305B1 (en) 2014-10-02 2018-05-15 James S Brown System and method of generating music from electrical activity data

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083503A2 (en) * 2000-05-01 2001-11-08 Hybridon, Inc. MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES
WO2005030259A2 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRAWAL S. ET AL. Medicinal chemistry and therapeutic potential of CpG DNA. Trends Mol Med. 2002, Vol. 8, No. 3, side 114-121. Review., Dated: 01.01.0001 *
EUGEN U. ET AL. Recent advances in the Development of immunostimulatory oligonucleotides. Current opinion in drug discovery and Development, Current drugs, London, GB. 2003, Vol. 6, No. 2, side 204-217., Dated: 01.01.0001 *
IYER RP. ET AL. Modified oligonucleotides- synthesis, Properties and Applications. Current opinion in molecular therapeutics. 1999, Vol. 1, No. 3, side 344-358., Dated: 01.01.0001 *
TSAO DH. ET AL. Optically detected magnetic resonance study of the interaction of an arsenic(III) derivative of cacodylic acid with EcoRI methyl transferase. Biochemistry. 1991, Vol. 30, No. 18, side 4565-4572. , Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
PT2078080E (pt) 2015-09-18
JP2014036652A (ja) 2014-02-27
RU2477315C2 (ru) 2013-03-10
EP2078080B1 (en) 2015-06-17
DK2078080T3 (en) 2015-08-24
AU2007330410A1 (en) 2008-06-12
KR20090058581A (ko) 2009-06-09
CA2664219A1 (en) 2008-06-12
US20100166780A1 (en) 2010-07-01
JP2010504750A (ja) 2010-02-18
EP2960332A1 (en) 2015-12-30
BRPI0717510B1 (pt) 2021-01-12
WO2008068638A3 (en) 2008-11-13
IL197549A (en) 2016-04-21
US20140163213A1 (en) 2014-06-12
US9382545B2 (en) 2016-07-05
HUE027064T2 (hu) 2016-09-28
HK1133440A1 (en) 2010-03-26
AU2007330410B2 (en) 2012-07-26
US8580268B2 (en) 2013-11-12
WO2008068638A2 (en) 2008-06-12
KR101251707B1 (ko) 2013-04-11
AU2007330410A8 (en) 2012-05-03
BRPI0717510B8 (pt) 2021-09-14
JP5455629B2 (ja) 2014-03-26
US20160348115A1 (en) 2016-12-01
ES2544958T3 (es) 2015-09-07
SI2078080T1 (sl) 2015-09-30
BRPI0717510A2 (pt) 2013-11-19
NZ575437A (en) 2012-02-24
RU2009109098A (ru) 2010-11-10
KR20130014620A (ko) 2013-02-07
IL197549A0 (en) 2011-08-01
MX2009003398A (es) 2009-08-12
NO20091218L (no) 2009-04-21
US10260071B2 (en) 2019-04-16
PL2078080T3 (pl) 2015-12-31
CN101517082B (zh) 2014-01-22
ZA200901735B (en) 2010-05-26
CA2664219C (en) 2013-12-17
EP2078080A2 (en) 2009-07-15
JP6006183B2 (ja) 2016-10-12
WO2008068638A8 (en) 2011-12-22
CN101517082A (zh) 2009-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10260071B2 (en) CpG oligonucleotide analogs containing hydrophobic T analogs with enhanced immunostimulatory activity
US20180171338A1 (en) Compositions and methods for oligonucleotide formulations
US9186399B2 (en) Immune stimulatory oligonucleotide analogs containing modified sugar moieties
US20060211644A1 (en) Immunostimulatory oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: PFIZER INC., US

CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: PFIZER INC., US