BRPI0616069A2 - modulação de propriedades imunomoduladoras de ácido ribonucléico interferente pequeno (sirna) através de modificação de nucleotìdeo - Google Patents

Abstract

MODULAçàO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS DE áCIDO RIBONUCLéICO INTERFERENTE PEQUENO (SIRNA) ATRAVéS DE MODIFICAçAO DE NUCLEOTIDEO ácido ribonucléico interferente pequeno de fita dupla (SIRNA) são modificados para redução ou eliminação de seu efeito imunoestimulador sem afetar significantemente seu efeito de silenciamento de gene. SIRNA modificado inclui uma ou mais modificações de açúcar 2<39>' e, opcionalmente, ligações de inter-nucleotídeo na fita senso. Composições contendo o SIRNA modificado e processos de fabricação e de uso de SIRNA modificado são mostrados. SIRNA novo e previamente caracterizado pode ser sintetizado para incorporar modificações de acordo com a invenção.

Description

"MODULAÇÃO DE PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS DE Á-CIDO RIBONUCLÉICO INTERFERENTE PEQUENO (SIRNA) ATRAVÉS DEMODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO"

Antecedentes da Invenção

Ácido ribonucléico (RNA) tem sido recentemente ofoco de intenso interesse devido seu potencial recentementereconhecido como um terapêutico. Foi recentemente reportado,por exemplo, que certos RNA de fita dupla especifico de se-qüência, genericamente de cerca de 21-23 nucleotideos decomprimento, podem ser usados para silenciar expressão degene em uma maneira seletiva, em um processo chamado inter-ferência de RNA (RNAi) ou silenciamento de gene pós-transcricional. RNA de fita dupla usado para este tipo deinterferência de RNA inclui, em particular, o assim chamadoRNA interferente pequeno (siRNA). Hannon GJ (2002) Nature418:244-51. Em contraste, também foi recentemente reportadoque RNA de fita dupla não-especifico de seqüência pode indu-zir efeitos imuno-estimuladores, atuando através de receptorsemelhante -Toll 3 (TLR3). Alexopoulou L et al. (2001) Natu-re 413:732-8. Ainda, também foi recentemente reportado quecertos RNAs de fita simples, genericamente incluindo guano-sina (G) e uridina (U) , e particularmente incluindo certosmotivos de seqüência, também são imuno-estimuladores. Lip-ford et al. US 2003/0232074 Al.

Em esforços para desenvolver siRNA para aplicaçãoclinica, recentemente tornou-se aparente que pelo menos al-gum siRNA também são imuno-estimuladores. Em alguns exemplospode ser desejável ter-se ambos, silenciamento de gene e i-muno-estimulação. Entretanto, em outros cenários pode serdesejado ao invés ter-se silenciamento de gene sem acompa-nhante imuno-estimulação.

Sumário da Invenção

A invenção provê composições e processos relacio-nando-se a siRNA caracterizado por certas modificações denucleotideos dentro de fita senso, de modo que o resultantesiRNA com modificação é menos imuno-estimulador que o cor-respondente siRNA sem modificação. A modificação na fitasenso tem pequeno ou nenhum efeito sobre a habilidade dosiRNA para silenciar genes alvos.

Em um aspecto a invenção é uma composição incluin-do um ácido ribonucléico interferente pequeno de fita dupla(siRNA) tendo uma fita senso e uma fita anti-senso, cada fi-ta tendo uma extremidade 5' e uma extremidade 3', onde a fi-ta anti-senso é complementar a uma seqüência alvo e onde afita senso compreende pelo menos um nucleotideo modificadotendo um açúcar com uma modificação 2', com a condição deque o nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modifica-ção 2' não é um ácido nucléico fechado (LNA) ou um nucleoti-deo 2'-0-metila.

Em um aspecto a invenção é um processo para redu-ção de potencial imuno-estimulador de um ácido ribonucléicointerferente pequeno de fita dupla (siRNA), o dito siRNAtendo uma fita senso e uma fita anti-senso, cada fita tendouma extremidade 5' e uma extremidade 3' , onde a fita anti-senso é complementar a uma seqüência alvo. O processo incluia etapa de introdução na fita senso do siRNA pelo menos umnucleotideo modificado tendo um açúcar com uma modificação2' , com a condição de que o nucleotideo modificado tendo oaçúcar com a modificação 2' não é um ácido nucléico fechado(LNA) ou um nucleotideo 2'-0-metila.

Em um aspecto a invenção é um processo para redu-ção de expressão de um gene tendo uma seqüência alvo. O pro-cesso de acordo com este aspecto inclui a etapa de contatode uma célula compreendendo o gene tendo a seqüência alvocom uma quantidade efetiva de um ácido ribonucléico interfe-rente pequeno de fita dupla (siRNA) tendo uma fita senso euma fita anti-senso, cada fita tendo uma extremidade 5' euma extremidade 3' , onde a fita anti-senso é complementarpara a seqüência alvo e onde a fita senso compreende pelomenos um nucleotideo modificado tendo um açúcar com uma mo-dificação 2', com a condição de que o nucleotideo modificadotendo o açúcar com a modificação 2' não é um ácido nucléicofechado (LNA) ou um nucleotideo 2'-0-metila, para reduzirexpressão do gene tendo a seqüência alvo.

Em uma realização a fita senso incluindo o nucleo-tideo modificado tendo o açúcar com modificação 2' é uma fi-ta senso incluindo somente um nucleotideo modificado tendoum açúcar com uma modificação 2'.

Em uma realização a fita senso incluindo o nucleo-tideo modificado tendo o açúcar com a modificação 2' é umafita senso incluindo uma pluralidade de nucleotideos modifi-cados tendo um açúcar com uma modificação 2' , onde cada nu-cleotideo modificado tendo o açúcar com a modificação 2' éselecionado independentemente de qualquer outro.Em uma realização a modificação 2' é selecionadado grupo consistindo em 2'-O-alquila, 2'-O-alquenila, e 2'-O-alquinila, com a condição de que 2'-O-alquila exclui 2'-0-metila.

Em uma realização a modificação 2' é selecionadado grupo consistindo em 2'-metoxi etila, 2'-0-alila, 2'-prop.inila, 2'-amino propargila, 2'-0-(3-amino propila) , 2'-0-propila e 2'-0-butila.

Em uma realização a modificação 2' é selecionadado grupo consistindo em 2'-desoxi, 2'-flúor, e 2'-amino.

Em uma realização a modificação 2' é 2'-flúor.

Em uma realização a modificação 2' é selecionadade 2'-O-alquenila, 2'-O-alquinila, 2'-metoxi etila, 2'-aminopropargila, 2'-0-(3-amino propila), e 2'-amino.

Em uma realização o pelo menos um nucleotideo mo-dificado tendo o açúcar com a modificação 2' ocorre na ex-tremidade 5' da fita senso. Em uma realização o pelo menosum nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modificação2' ocorre na extremidade 5' da fita senso, exclusive dequalquer projeção.

Em uma realização o pelo menos um nucleotideo mo-dificado tendo o açúcar com a modificação 2' ocorre na ex-tremidade 3' da fita senso. Em uma realização o pelo menosum nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modificação2' ocorre na extremidade 3' da fita senso, exclusive dequalquer projeção.

Em uma realização o pelo menos um nucleotideo mo-dificado tendo o açúcar com a modificação 2' ocorre internocom relação à extremidade 5' e a extremidade 3' da fita sen-so. Em uma realização o pelo menos um nucleotídeo modificadotendo o açúcar com a modificação 2' ocorre interno com rela-ção à extremidade 5' e a extremidade 3' da fita senso, ex-clusive de qualquer projeção.

Em uma realização a fita senso inclui pelo menosum nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modificação2' na extremidade 5' da fita senso e pelo menos um nucleoti-deo modificado tendo o açúcar com a modificação 2' na extre-midade 3' da fita senso. Em uma realização a fita senso in-clui pelo menos um nucleotideo modificado tendo o açúcar coma modificação 2' na extremidade 5' da fita senso e pelo me-nos um nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modifica-ção 2' na extremidade 3' da fita senso, exclusive de qual-quer projeção.

Em uma realização a fita senso tem uma cadeiaprincipal fosfo diéster.

Em uma realização a fita senso tem uma cadeiaprincipal estabilizada incluindo pelo menos uma ligação in-ter-nucleotideo estabilizada.

Em uma realização a fita senso tem uma cadeiaprincipal estabilizada incluindo pelo menos uma ligação in-ter-nucleotideo estabilizada selecionada do grupo consistin-do em tio formacetal, fósforotioato, metil fosfonato, boranofosfonato, e formacetato.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 é um grupo de quatro gráficos mostrandoprodução de citocina por células mono-nucleares de sangueperiférico humano (PBMC). Concentrações indicadas de siRNAde fita dupla indicado (senso (s) : anti-senso (as)) na pre-sença de DOTAP foram incubadas com PBMC humana e quantidadede IFN-alfa (pg/mL; painéis A e C) ou IL-12p40 (pg/mL; pai-néis BeD) foi determinada no sobrenadante 24 horas depoisatravés de ELISA. Seqüências de RNA para painéis AeB sãocomo se segue: MAPK2s, SEQ ID N0:1; MAPK2as, SEQ ID N0:2;MAPK2 Exp27 s, SEQ ID NO: 3; MAPK2 Exp27 as, SEQ ID NO: 4;MAPK2 Exp30 s, SEQ ID NO:3; MAPK2 Exp30 as, SEQ ID NO:5. Se-qüências de RNA para painéis CeD são como se segue: LaminAC s, SEQ ID NO: 6; Lamin AC as, SEQ ID NO: 7; Lamin AC Exp27s, SEQ ID NO: 8, Lamin AC Exp27 as, SEQ ID NO: 9, Lamin ACExp30 s, SEQ ID NO:8; Lamin AC Exp30 as, SEQ ID NO:10.

A Fig. 2 é um grupo de doze gráficos mostrandoprodução de citocina por PBMC humana. Concentrações indica-das de espécies indicadas de RNA (siRNA de fita dupla (senso(s) : anti-senso (as)); fita senso sozinha (s); e fita anti-senso sozinha (as)) na presença de DOTAP foram incubadas comPBMC humanas e quantidade de IFN-alfa (pg/mL; painéis A e C)ou IL-12p40 (pg/mL; painéis BeD) foi determinada no sobre-nadante 24 horas depois através de ELISA. Seqüências de RNApara apinéis AeB são como se segue: MAPK2 s, SEQ ID N0:1;MAPK2 as, SEQ ID NO: 2; MAPK2 Exp27 s, SEQ ID NO: 3; MAPK2Exp27 as, SEQ ID NO: 4; MAPK2 Exp30 s, SEQ ID NO: 3; MAPK2Exp30 a, SEQ ID NO: 5; Seqüências de RNA para painéis CeDsão como se segue: Lamin AC s, SEQ ID NO:6; Lamin AC as, SEQID NO: 7; Lamin AC Exp27 s, SEQ ID NO: 8; Lamin AC Exp27 as,SEQ ID NO: 9; Lamin AC Exp30 s, SEQ ID NO: 8; Lamin AC Exp30as, SEQ ID NO:10.

Descrição Detalhada da Invenção

Interferência de RNA, incluindo tecnologia de RNAinterferente pequeno (siRNA), tornou-se uma importante fer-ramenta para regulação descendente de específicos genes, eterapêuticas de siRNA já estão em desenvolvimento. siRNAsintético genericamente consiste em oligorribonucleotídeosde fita dupla de 21-23 nucleotídeos de comprimento com ca-deia principal fosfodiéster. Entretanto, além de específicoefeito de alvejamento de gene de siRNA, efeitos não-específicos desta tecnologia foram recentemente descritos.siRNA foi mostrado induzir ativação não-específica do siste-ma imune inato, incluindo regulação ascendente de certas ci-tocinas, por exemplo, interferon tipo I e/ou tipo II assimcomo produção de IL-12, IL-6 e/ou TNF-alfa. A origem destesefeitos é pensada ser ativação de receptores semelhantes aToll como TLR7, TLR8 e/ou TLR3 por siRNA.

Embora ativação do sistema imune seja freqüente-mente um efeito desejado, no contexto de silenciamento deRNA a ativação não-específica do sistema imune pode interfe-rir com o real modo de ação de siRNA e pode alterar signifi-cantemente o resultado de tratamento.

Em exemplos descritos abaixo, a atividade imuno-estimuladora de certas construções de siRNA, caracterizadaspor certas modificações de açúcares nucleotídeos 2' em espe-cíficas localizações, foi surpreendentemente verificada terreduzidas propriedades imuno-estimuladoras reduzidas semsignificante comprometimento de suas propriedades de silen-ciamento de gene. siRNA derivado das seqüências dos genesMAPK2 (Erk2) e Lamin AC (Tabela 1) induziram significanteprodução de citocina quando incubado com PBMC humana na pre-sença do lipideo catiônico N-[1-(2,3-dioleoiloxi) propil]-N, N,N-trimetil amônio (DOTAP; Fig. 1). Indução de citocinasé pensada ser induzida por seqüências imuno-estimuladoraspresentes na fita anti-senso e/ou senso dos siRNAs.

Foi verificado de acordo com a invenção que modi-ficações químicas dentro da fita senso e anti-senso podemsuprimir significantemente a atividade imuno-estimuladorados siRNAs. Introdução de modificações açúcar 2' na extremi-dade 5' e 3' da fita senso (Fig. 1) e adicionais modifica-ções açúcar 2' na extremidade 3' da fita anti-senso aboliucompletamente produção de IL-12p40 e TNF-alfa dos siRNAs ereduziu significantemente produção de IFN-alfa.

Surpreendentemente, foi verificado de acordo com ainvenção que as modificações introduzidas afetaram somente aatividade imuno-estimuladora da fita senso (s, RNA de fitasimples) e o siRNA de fita dupla contendo a fita senso e an-ti-senso, mas não a fita anti-senso (as, RNA de fita sim-ples) que ainda reteve maior parte de sua atividade imuno-estimuladora. Por isso, uma supressão da atividade estimula-dora de um dsRNA ou siRNA parece ser possível através de mo-dificação de fita senso e não a fita anti-senso. Isto é deimportância na medida em que é pensado que somente a fitaanti-senso é responsável pelo efeito de silenciamento desiRNA, de modo que modificações químicas para controle deimuno-estimulação podem ser introduzidas na fita senso semafetar a fita anti-senso e, por isso, sem afetar o efeito desilenciamento.

Também foi surpreendentemente verificado de acordocom a invenção que modificações da fita senso de RNA somenteintroduzidas nas extremidades 5' e 3', e, particularmente,não em uma seqüência imuno-estimuladora potencial, aindaconduzem a forte ou completa supressão de atividade imuno-estimuladora.

Em adição, foi surpreendentemente verificado deacordo com a invenção que mesmo uma simples modificação 2'em uma fita simples imuno-estimuladora afeta fortemente aresposta imune, indicando que uma tal simples modificação nafita senso pode ser suficiente para influenciar atividadeimuno-estimuladora do siRNA ou dsRNA.

Em uma recente publicação de Hornung et al. (Natu-re Medicine 11:263-70, 2005), foi reportado que modificaçõesde ácido nucléico fechado (LNA) de um motivo imuno-estimulador na extremidade 3' diminuiu as propriedades imu-no-estimuladoras de siRNA. Em contraste ao relatório porHornung et al., foi verificado de acordo com a invenção que,inesperadamente, as modificações não precisam estar dentrode um motivo imuno-estimulador e modificação da fita sensosozinha ser não-estimuladora é suficiente para suprimir ati-vidade imuno-estimuladora.

A invenção em um aspecto refere-se genericamente acomposições e processos envolvendo siRNA de fita dupla queinclui certas modificações. As especificas modificações re-duzem o potencial imuno-estimulador do siRNA comparado aocorrespondente siRNA sem as modificações. Como aqui usado,siRNA deve referir-se a um particular tipo de molécula deácido ribonucléico de fita dupla (RNA) isolada caracterizadapor um comprimento de cerca de 21-23 nucleotideos, uma fitasenso (s) de fita simples e uma fita anti-senso (as) de fitasimples, onde a fita anti-senso tem uma seqüência de nucleo-tideos complementar à uma seqüência de nucleotideos alvo,cuja molécula de RNA, quando liberada em uma célula expres-sando uma proteína codificada pela seqüência alvo, reduz aquantidade de seqüência de nucleotideos alvo (e a proteínacodificada) na célula.

As fitas senso e anti-senso de siRNA têm seqüên-cias de nucleotideos que são estritamente ou pelo menossubstancialmente complementares umas às outras, de modo queelas podem formar uma estrutura duplex estável sob condiçõesapropriadas, in vivo ou in vitro. Em certas realizações umaou ambas extremidades de qualquer fita pode se estender alémde correspondente extremidade ou extremidades da outra fitana estrutura duplex, pelo que permitindo curta seqüênciaprojetando (genericamente 1-2 nucleotideos em comprimento)em qualquer ou ambas extremidades do siRNA.

0 siRNA genericamente incluirá subunidades nucleo-tideos tendo núcleo-bases canônicas comuns para RNA, por e-xemplo, adenina, citosina, guanina, e uracila, mas não assimlimitadas. Outras núcleo-bases, incluindo mas não limitadasa timina e hipoxantina, também podem estar presentes em al-gumas realizações.Como aqui usado em referência a qualquer moléculade RNA, potencial imuno-estimulador refere-se à capacidadeda molécula de RNA estimular uma resposta imune, por exem-plo, para estimular uma célula do sistema imune tornar-seativada para proliferar, diferenciar, aumentar expressão deprodutos secretados associados com ativação de célula imune,aumentar expressão de marcadores de superfície de célula oumoléculas co-estimuladoras associadas com ativação de célulaimune, ou qualquer combinação dos mesmos. Produtos secreta-dos associados com ativação de célula imune são bem conheci-dos na técnica e podem incluir, sem limitação, citocinas,quimiocinas, e anticorpos.

Como uma característica da invenção, a fita sensode siRNA da invenção inclui um nucleotídeo modificado tendoum açúcar com uma modificação 2' , com a condição de que onucleotídeo modificado tendo o açúcar com a modificação 2'não é um ácido nucléico fechado (LNA) ou um nucleotídeo 2'-O-metila. A fita senso pode incluir somente um nucleotídeomodificado simples tendo um açúcar com uma modificação 2',ou ele pode conter dois ou mais nucleotídeos modificadostendo um açúcar com uma modificação 2', cada um selecionadoindependentemente do outro. Em uma realização a fita sensoinclui somente nucleotídeos modificados tendo um açúcar comuma modificação 2', cada um selecionado independentemen-te do outro. Mais tipicamente, a fita senso incluirá uma seis nucleotídeos modificados tendo um açúcar com umamodificação 2', cada um selecionado independentemente dooutro. Quando há mais que um nucleotídeo modificadosimples tendo um açúcar com uma modificação 2', os nucleotí-deos modificados tendo um açúcar com uma modificação 2' po-dem ocorrer, na medida em que seu número permita, como nu-cleotideos adjacentes, como nucleotideos não-adjacentes, oucomo uma combinação de nucleotideos adjacentes e não-adjacentes.

Como aqui usado, um nucleotideo refere-se a um a-çúcar (por exemplo, ribose ou desoxirribose) ligado a umgrupo fosfato e a uma base orgânica que pode ser trocada(por exemplo, uma núcleo-base), que é tanto uma pirimidinasubstituída (por exemplo, citosina, timina, ou uracila) oupurina substituída (por exemplo, adenina ou guanina). Comoaqui usado, nucleotideos tendo citosina, timina, uracila,adenina, ou guanina como sua núcleo - base são representadospor seus convencionais símbolos de letra única C, T, U, A,ou G, respectivamente. Ribonucleotídeos incluem ribonucleo-tídeos C, U, A, e G canônicos, mas não são assim limitados.

Como aqui usado em referência a quaisquer espéciesde RNA, um nucleotideo modificado tendo um açúcar com umamodificação 2' refere-se a um nucleotideo no qual o açúcartem um substituinte na posição 2' que não é padrão para umribonucleotídeo. Em uma realização o açúcar com a modifica-ção 2' é um açúcar desoxirribose 2', de modo que o corres-pondente nucleotideo é um desoxirribonucleotídeo. Em uma re-alização a modificação 2' é selecionada do grupo consistindoem 2'-0-alquila, 2'-O-alquenila e 2'-O-alquinila, com a con-dição de que 2'-0-alquila exclui 2'-0-metila. Em uma reali-zação a modificação 2' é selecionada do grupo consistindo em2'-metoxi etila, 2'-0-alila, 2'-propinila, 2'-amino propar-gila, 2'-0-(3-amino propila), 2'-0-propila, e 2'-0-butila.Em uma realização a modificação 2' é selecionada do grupoconsistindo em 2'-desoxi, 2'-flúor-2'-desoxi (isto é, 2'-flúor), e 2'-amino-2'-desoxi (isto é, 2'-amino). Em uma rea-lização a modificação 2' é 2'-flúor. Em uma realização a mo-dificação 2' é selecionada de 2'-O-alquenila, 2'-0-alquinila, 2'-metoxi etila, 2'-amino propargila, 2'-0-(3-amino propila), e 2'-amino.

Como aqui usado, um ácido nucléico fechado (LNA)refere-se a um derivado de RNA no qual o anel ribose é cons-trangido por uma ligação metileno entre o oxigênio-2' e ocarbono-4'. Wahlestedt C et al. (2000) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 97:5633-8.

Falando genericamente, um nucleotideo modificadotendo um açúcar com uma modificação 2' pode ocorrer em qual-quer lugar ao longo de fita senso. Em particular, em uma re-alização um nucleotideo modificado tendo um açúcar com umamodificação 2' ocorre na extremidade 5' da fita senso. Emuma realização um nucleotideo modificado tendo um açúcar comuma modificação 2' ocorre na extremidade 3' da fita senso.Em uma realização um nucleotideo modificado tendo um açúcarcom uma modificação 2' ocorre na extremidade 5' da fita sen-so e na extremidade 3' da fita senso. Um nucleotideo modifi-cado tendo um açúcar com uma modificação 2' não precisa o-correr em uma extremidade da fita senso, mas antes pode o-correr entre as extremidades da fita senso, isto é, inter-na com relação à extremidade 5' e a extremidade 3' da fitasenso. Em certas realizações um nucleotídeo modificado tendoum açúcar com uma modificação 2' ocorre em uma ou ambas ex-tremidades 5' e 3' da fita senso, e também interna com rela-ção à extremidade 5' e a extremidade 3' da fita senso.

A seqüência de nucleotideos da fita senso, a fitaanti-senso, ou ambas, a fita senso e a fita anti-senso op-cionalmente pode incluir uma seqüência imuno-estimuladora oumotivo. Em uma realização a seqüência imuno-estimuladora oumotivo é 5'-RURGY-3', onde cada R independentemente repre-senta ribonucleotideo purina e Y representa ribonucleotideopirimidina. Em várias realizações 5'-RURGY-3' especificamen-te pode incluir mas não está limitada a 5'-GUGGU-3', 5'-GUGGC-3', 5'-GUAGU-3', 5'-GUAGC-3', Sf-AUGGU-SiiS1-AUGGC-S',5'-AUAGU-3', e 5'-AUAGC-3'. Em uma realização a seqüência15 imuno-estimuladora ou motivo é 5'-GUAGUGU-3'. Em uma reali-zação a seqüência imuno-estimuladora ou motivo é 51-GUUGB-3', onde B representa U, G, ou C. Em várias realizações 5'-GUUGB-3' especificamente inclui 5'-GUUGU-3', 5'-GUUGG-3', e5'-GUUGC-3'. Em uma realização a seqüência imuno-20 estimuladora ou motivo é 5'-GUGUG-3'. Em uma realização aseqüência imuno-estimuladora ou motivo é 5'-GUGUUUAC-3'. Emuma realização a seqüência imuno-estimuladora ou motivo é5'-GUAGGCAC-3'. Em uma realização a seqüência imuno - esti-muladora ou motivo é 5'-CUCGGCAC-3'.25 Quando a fita senso inclui uma seqüência imuno -

estimuladora ou motivo identificável, o nucleotídeo modifi-cado tendo um açúcar com uma modificação 2/ em uma realiza-ção ocorre dentro de seqüência imuno-estimuladora ou motivoidentificável.

Alternativamente, e significantemente, quando fitasenso inclui uma seqüência imuno-estimuladora ou motivo i-dentificável, o nucleotideo modificado tendo um açúcar comuma modificação 2' em uma realização ocorre fora da seqüên-cia imuno-estimuladora ou motivo identificável. Quando a fi-ta senso inclui uma seqüência imuno - estimuladora ou motivoidentificável e o nucleotideo modificado tendo um açúcar comuma modificação 2' ocorre fora da seqüência imuno - estimu-ladora ou motivo identificável, em uma realização o nucleo-tideo modificado tendo um açúcar com uma modificação 2' o-corre imediatamente adjacente à seqüência imuno - estimula-dora ou motivo identificável. Imediatamente adjacente a, emuma realização, é imediatamente 5' com relação à seqüênciaimuno - estimuladora ou motivo. Imediatamente adjacente a,em uma realização, é imediatamente 3' com relação à seqüên-cia imuno - estimuladora ou motivo. Em outras realizaçõesnas quais a fita senso inclui uma seqüência imuno - estimu-ladora ou motivo identificável e o nucleotideo modificadotendo um açúcar com uma modificação 2' ocorre fora da se-qüência imuno - estimuladora ou motivo identificável, o nu-cleotideo modificado tendo um açúcar com uma modificação 2'ocorre pelo menos um nucleotideo removido da seqüência imuno- estimuladora ou motivo. O número de nucleotideos entre onucleotideo modificado tendo um açúcar com uma modificação2' e a seqüência imuno - estimuladora ou motivo pode ser, emvárias realizações, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17 ou 18.

Qualquer nucleotideo da fita senso, incluindoqualquer nucleotideo modificado tendo um açúcar com uma mo-dificação 2', como definido acima, pode opcionalmente inclu-ir uma modificação envolvendo o grupo fosfato. Em uma reali-zação a fita senso tem uma cadeia principal fosfodiéster,isto é, os nucleotideos da fita senso são ligados um ao se-guinte por ligações fosfodiéster. Tais ligações fosfodiéstere cadeia principal fosfodiéster são típicas de moléculas deácido nucléico quando elas ocorrem em natureza, e elas sãorelativamente suscetíveis a clivagem com nuclease in vivo.

Em uma realização a fita senso tem uma cadeiaprincipal estabilizada. A cadeia principal estabilizada tempelo menos uma ligação inter-nucleotídeo estabilizada, re-sultando em uma cadeia principal que é relativamente resis-tente a clivagem com nuclease in vivo ou in vitro comparadoa cadeia principal fosfodiéster. Em uma realização a cadeiaprincipal estabilizada inclui somente ligações de inter-nucleotideos estabilizadas. Em uma realização a ligação in-ter-nucleotídeo estabilizada é selecionada do grupo consis-tindo em tioformacetal, fósforotioato, metil fosfonato, bo-rano fosfonato, e formacetato. Em uma realização a ligaçãointer-nucleotídeo estabilizada é uma ligaçfósforotioato.O siRNA da invenção pode ser sintetizado usando técnicas au-tomatizadas e dispositivos empregando, por exemplo, tantoquímicas fosforamidato como H-fosfonato. Processos para fa-bricação de outras modificações e substituições de cadeiaprincipal de ácido nucléico foram descritas e são contempla-das para uso na invenção. Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165.

As fitas senso e anti-senso podem ser sintetizadasseparadamente. Alternativamente, as fitas senso e anti-sensopodem ser sintetizadas como uma construção simples e entãotratadas para retirar ou de outro modo remover nucleotideosou metades ligantes intervenientes ou estranhas. Não impor-tando como eles são sintetizados, o desejado siRNA ou fitassenso e anti-senso componentes são preferivelmente isoladosde reagentes de síntese estranhos e, opcionalmente, purifi-cados antes de uso.

As composições da invenção são acreditadas seremúteis em qualquer situação requerendo o uso de siRNA. Assima seqüência alvo pode ser qualquer seqüência alvo apropria-da. Situações clínicas requerendo o uso de siRNA incluem,sem limitação, tratamento de sujeitos tendo câncer, trata-mento de sujeitos tendo doença infecciosa, tratamento de su-jeitos tendo doença autoimune, tratamento de sujeitos tendorejeição de transplante, e tratamento de sujeitos tendo a-lergia ou asma. Aqueles versados na técnica serão familiarescom como selecionar uma apropriada seqüência alvo e avaliara eficácia da interferência de ARN para aquele alvo. Proces-sos para avaliação de eficácia da interferência de ARN paraum particular alvo podem ser realizados usando técnicas pa-drões de análises de nucleotideos e proteína, como reação decadeia polimerase - transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) , imuno-manchamento, e ensaio imuno-sorvente ligado aenzima (ELISA), contanto que tais técnicas sejam apropriada-mente adaptadas para o particular alvo, por exemplo, atravésde própria seleção de iniciadores de amplificação e anticor-pos.

A invenção em um aspecto provê um processo pararedução de potencial imuno - modulador de um siRNA. Esteprocesso em uma realização pode ser usado para reduzir o po-tencial imuno - estimulador de um siRNA previamente caracte-rizado. Em uma realização o processo pode ser usado para re-duzir o potencial imuno - estimulador de um siRNA previamen-te não-caracterizado, por exemplo, no desenho e síntese deum siRNA pela primeira vez. 0 processo inclui a etapa de in-trodução de um nucleotídeo modificado tendo um açúcar comuma modificação 2' em uma fita senso de um siRNA de fita du-pia tendo uma fita senso e uma fita anti-senso, onde a fitaanti-senso é complementar a uma seqüência alvo, com a condi-ção de que o nucleotídeo modificado tendo o açúcar com a mo-dificação 2' não é um ácido nucléico fechado (LNA) ou um nu-cleotídeo 2'-0-metila. Como aqui usado com referência a esteaspecto da invenção, introdução de um nucleotídeo modificadotendo um açúcar com uma modificação 2' refere-se a substitu-ição de um nucleotídeo modificado tendo um açúcar com umamodificação 2', como definido acima, no lugar de um nucleo-tídeo ocorrendo naturalmente ou existente. Por exemplo, ondeem um siRNA existente a fita anti-senso tem uma G que requeruma C sobre a fita senso, uma desoxicitidina (dC)· é substi-tuída no lugar da C. A etapa de introdução de um nucleotídeomodificado tendo um açúcar com uma modificação 2' em uma fi-ta senso assim tipicamente envolve desenho e realizaçãode síntese da fita senso em uma maneira tal que o deseja-do nucleotídeo modificado é incorporado na fita sensoproduto na desejada localização.

A invenção em um aspecto é um processo de prá-tica de interferência de ARN usando um siRNA da invenção.Mais particularmente, o processo de acordo com este as-pecto da invenção é um processo para redução de expressãode um gene tendo uma seqüência alvo. Como aqui usado, emuma realização redução de expressão de um gene tendo umaseqüência alvo refere-se a redução da quantidade de ARNmensageiro transcrita a partir de um particular gene deinteresse. Como aqui usado, em uma realização redução deexpressão de um gene tendo uma seqüência alvo refere-se aredução de quantidade de produto proteína presente em umacélula codificada por um particular gene de interesse. 0processo de acordo com este aspecto da invenção inclui aetapa de contato de uma célula incluindo o gene tendo aseqüência alvo com uma quantidade efetiva de um ácido ri-bonucléico interferente pequeno de fita dupla (siRNA)tendo uma fita senso e uma fita anti-senso, onde a fitaanti-senso é complementar para a seqüência alvo e onde afita senso inclui um nucleotídeo modificado tendo um açú-car com uma modificação 2', com a condição de que o nu-cleotídeo modificado tendo o açúcar com a modificação 2'não é um ácido nucléico fechado (LNA) ou um nucleotí-deo 2'-O-metila, para reduzir expressão do gene tendoa seqüência alvo. 0 processo de acordo com este aspectoda invenção pode ser realizado in vitro e in vivo. Quandopraticando o processo in vivo, a etapa de contato ainda vin-cula administração de uma composição da invenção a um su-jeito.

siRNA da invenção pode ser de particular uso notratamento de sujeitos tendo câncer, sujeitos tendo uma do-ença infecciosa, sujeitos tendo uma doença autoimune, sujei-tos tendo alergia, e sujeitos tendo asma, mas não é assimlimitado.

"Câncer" como aqui usado refere-se a um crescimen-to descontrolado de células que interfere com o funcionamen-to normal dos órgãos e sistemas do corpo. Cânceres que mi-gram de sua localização original e semeiam órgãos vitais po-dem eventualmente conduzir à morte do sujeito através de de-terioração funcional dos órgãos afetados. Cânceres hemopoié-ticos, como leucemia, são capazes de superarem compartimen-tos hemopoiéticos normais em um sujeito, pelo que conduzindoa insuficiência hemopoiética (na forma de anemia, tromboci-topenia e neutropenia) por último causando morte.

Como aqui usado, um sujeito tendo câncer refere-sea um sujeito que tem células cancerosas detectáveis.

Uma metástase é uma região de células de câncer,distinta da localização de tumor primária resultante da dis-seminação de células de câncer a partir de tumor primáriopara outras partes do corpo. No momento de diagnóstico damassa de tumor primária, o sujeito pode ser monitorado paraa presença de metástases. Metástases são mais freqüentementedetectadas através do uso único ou combinado de exploraçõesde formação de imagem de ressonância magnética (MRI), explo-rações de tomografia computadorizada (CT), contagens de san-gue e plaquetas, estudos de função de fígado, raios-x de tó-rax e explorações de osso em adição à monitoração de sinto-mas específicos.

Cânceres incluem, mas não são limitados a, carci-noma de célula basal, câncer de trato biliar; câncer de be-xiga; câncer de osso; câncer de cérebro e CNS; câncer de ma-ma; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto;câncer de tecido conjuntivo; câncer dosistema digstivo; cân-cer endometrial; câncer do esôfago; câncer de olho; câncerde cabeça e pescoço; câncer gástrico; neoplasma intra-epitelial; câncer de rim; câncer de laringe; leucemia; cân-cer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, célula pequena e célula não-pequena); Iinfoma incluindo linfoma de Hodgkine não-Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer decavidade oral (por exmeplo, lábios, língua, boca, e farin-ge); câncer de ovário; câncer de pâncreas; câncer de prósta-ta; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; câncer retal; câncerrenal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer depele; câncer do estômago; câncer de testículos; câncer detiróide; câncer uterino; câncer do sistema urinário, assimcomo outros carcinomas e sarcomas.

Uma "doença infecciosa" como aqui usado, refere-sea um distúrbio surgindo a partir da invasão de um hospedei-ro, superficialmente, localmente, ou sistemicamente, por ummicroorganismo infeccioso. Microorganismos infecciosos in-cluem bactérias, vírus, parasitas e fungos.Como aqui usado, um sujeito tendo uma doença in-fecciosa refere-se a um sujeito que foi exposto a um orga-nismo infeccioso e tem níveis detectáveis crônicos ou agudosdo organismo no corpo. Exposição ao organismo infeccioso ge-nericamente ocorre com a superfície externa do sujeito, porexemplo, pele ou membranas de mucosa e/ou refere-se à pene-tração da superfície externa do sujeito pelo organismo in-feccioso .

Exemplos de vírus que foram verificados em humanosincluem mas não são limitados a: Retroviridae (por exemplo,vírus de imunodeficiência humana, tal como HIV-I (também re-ferido como HDTV-III, LAVE ou HTLV-III/LAV, ou HIV-III; eoutros isolados como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo,vírus de pólio, vírus de hepatite A; enterovírus; vírus Cox-sackie humano, rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exem-plo, linhagens que causam gastroenterite); Togaviridae (porexmeplo, vírus de encefalite eqüina, vírus de rubéola); Fla-viridae (por exemplo, vírus de dengue, vírus de encefalite,vírus de febre amarela); Coronoviridae (por exemplo, corona-vírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus de estomatite ve-sicular, vírus de raiva); Filoviridae (por exemplo, vírusebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus parainfluenza,vírus de caxumba, vírus de sarampo, vírus sincicial respira-tório) ; Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus influenza);Bungaviridae (por exemplo, vírus Hantaan, vírus bunga, fle-bovírus e vírus Nairo); Arena viridae (vírus de febre hemor-rágica) ; Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e ro-tavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vde hepatite B) ;Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (vírus papiloma,vírus polioma); Adenoviridae (maioria de adenovírus); Her-pesviridae (vírus de herpes simplex (HSV) 1 e 2, vírus vari-cella zoster, citomegalovírus (CMV), vírus de herpes; Poxvi-ridae (vírus de varíola, vírus vaccinia, vírus pox); e Iri-doviridae (por exemplo, vírus de febre suína Africana); evírus não-classifiçados (por exemplo, o agnete de hepatitedelta (pensado ser um satélite defeituoso de vírus de hepa-tite Β) , os agentes de hepatite não-A, não-B (classe 1 =transmitido internamente; classe 2 = transmitido parenteral-mente (isto é Hepatite C) ; vírus Norwalk e relacionados, eastrovírus).

Ambas bactérias gram negativas e gram positivasservem como antígenos em animais vertebrados. Tais bactériasgram positivas incluem, mas não são limitadas a, espéciesPasteurella, espécies Staphylococci, e espécies Streptococ-cus. Bactérias gram negtivas incluem, mas não são limitadasa, Escherichia coli, espécies Pseudomonas e espécies Salmo-nella. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluemmas não são limitados a, Helicobacter pyloris, Borreliaburgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (porexemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M.kansasii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria go-norrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes,Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A) , Streptococ-cus agalactiae (Streptocoçcus Grupo Β), Streptococcus (grupoviridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, S-treptococcus (sps. Anaeróbica), Streptococcus pneumoniae,Campylobacter sp. patogênica, Enterococcus sp., Haemophilusinfluenzae, Baeillus anthracis, Corynebaeterium diphtheriae,Corynebaeterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostri-dium perfringens, Clostridium tetani, Enterobaeter aeroge-nes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Baeteroi-des sp., Fusobacterium nueleatum, Streptobacillus monilifor-mis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira,Rekettsia, e Aetinomyees israelli.

Exemplos de fungos incluem Cryptococcus neofor-mans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blas-tomyees dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albi-cans.

Outros organismos infecciosos (isto é, protistas)incluem Plasmodium spp., tais como Plasmodium falciparum,Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, e Plasmodium vivax eToxoplasma gondii. Parasitas de tecido e/ou transportadospor sangue incluem Plasmodium spp., Babesia microti, Babesiadivergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmaniabraziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense eTrypanosoma rhodesiense (doença do sono Africana) , Trypano-soma cruzi (doença de Chagas), e Toxoplasma gondii.

Outros microorganismos medicamente relevantes fo-ram extensivamente descritos na literatura, ver, por exem-plo, C.G.A. Thomas, Medicai Microbiology, Bailliere Tindall,Great Britain 1983, os inteiros conteúdos do qual são aquiincorporados por referência.

O siRNAQ da invenção também é útil para tratamentoe prevenção de doença autoimune. Doença autoimune é umaclasse de doenças nas quais anticorpos do próprio sujeitoreagem com tecido hospedeiro ou onde células T efetoras imu-nes são auto-reativas para auto peptideos endógenos e causamdestruição de tecido. Assim, uma resposta imune é montadacontra um antigeno do próprio sujeito, referido como autoantigenos. Doenças autoimunes incluem mas não são limitadasa artrite reumatóide, doença de Crohn, esclerose múltipla,lupus sistêmico eritematoso (SLE), encefalomielite autoimu-ne, miastenia gravis (MG), tiróidite de Hashimoto, sindromede Goodpasture, pênfigo (por exemplo, pênfigo vulgaris), do-ença de Grave, anemia hemolitica autoimune, trombocitopeniapúrpura autoimune, escleroderma com anticorpos anticolágeno,doença de tecido conjuntivo mista, polimiosite, anemia per-niciosa, doença de Addison idiopática, infertilidade associ-ada autoimune, glomerulonefrite (por exemplo, glomerulone-frite crescente, glomerulonefrite proliferativa) penfigóidebulosa, sindrome Sjõgren, resistência a insulina, e diabetesmellitus autoimune.

Como aqui usado, uma alergia refere-se a hiper-sensitividade adquirida a uma substância (alérgeno). Condi-ções alérgicas incluem mas não são limitadas a eczema, rini-te alérgica ou coriza, febre de feno, conjuntivite alérgica,asma bronquial, urticária (urticária) e alergias a alimento,outras condições atópicas incluindo dermatite atópica; ana-filaxia; alergia a droga; e angiodema. Doenças alérgicas in-cluem mas não são limitadas a rinite (febre de feno) , asma,urticária, e dermatite atópica.Como aqui usado, um sujeito tendo uma alergia é umsujeito que tem uma reação alérgica em resposta a um alérge-no.

Um alérgeno refere-se a uma substância (antigeno)que pode induzir uma resposta alérgica ou asmática em um su-jeito suscetível. A lista de alérgenos é enorme e pode in-cluir polens, venenos de insetos, pó de descamação animal,esporos de fungos e drogas (por exmeplo, penicilina). Exem-plos de alérgenos naturais, de animais e plantas incluem masnão são limitados a proteínas específicas para os seguintesgêneros: Canis (Canis familiaris); Dermatophagoides (por e-xemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus);Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por exemplo, Loli-um perenne ou Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeriajaponica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus(Alnus gultinoasa); Bétula (Bétula verrucosa); Quercus(Quercus alba); Olea (Olea Europa); Artemisia (Artemísiavulgaris); Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata); Pa-rietaria (por exemplo, Parietaria officinalis ou Parietariajudaica); Blatella (por exemplo, Blatella germânica); Apis(por exemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por exemplo, Cu-pressus sempervirens, Cupressus arizonica e Cupressus macro-carpa); Juniperus (por exemplo, Juniperus sabinoides, Juni-perus virginiana, Juniperus communis e Junipeus ashei); Thu-ya (por exemplo, Thuya orientalis); Chamaecyparis (por·exem-plo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por exemplo, Peri-planeta americana); Agropyron (por exemplo, Agropyron re-pens); Secale (por exemplo, Secale cereale); Triticum (porexemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por exemplo, Dactylisglomerata); Festuea (por exemplo, Festuea elatior); Poa (porexemplo, Poa pratensis ou Poa compressa); Avena (por exem-plo, Avena sativva); Holcus (por exemplo, Holcus lanatus);Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthum odoratum) ; Arrhena-therum (por exemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis (porexemplo, Agrostis alba); Phleum (por exemplo, Phleum praten-se); Phalaris (por exemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum(por exemplo, Paspalum notatum); Sorghum (por exemplo, Sor-ghum halepensis); e Bromus (por exemplo, Bromus inermis).

Como aqui usado, asma refere-se a um distúrbio dosistema respiratório caracterizado por inflamação, estreita-mento das vias aéreas, e aumentada reatividade da vias aé-reas para agentes inalados. Asma é freqüentemente, emboranão exclusivamente associada com uma condição atópica ou a-lérgica. Sintomas de asma incluem episódios recorrentes derespiração ruidosa, falta de ar, e rigidez de tórax, e tos-se, resultante de obstrução de vias aéreas. Inflamação devias aéreas associada com asma pode ser detectada através deobservação de um número de mudanças fisiológicas, tais como,denudação de epitélio de vias aéreas, deposição de colágenodebaixo de membrana base, edema, ativação de mastócitos, in-filtração de célula inflamatória, incluindo neutrófilos, i-nosineófilos e linfócitos. Como um resultado da inflamaçãode vias aéreas, pacientes de asma freqüentemente experimen-tam hiper-responsividade de vias aéreas, limitação de fluxode ar, sintomas respiratórios, e cronicidade de doença. Li-mitações de fluxo de ar incluem broncoconstrição, edema devias aéreas, formação de plug de muco, e remodelagem de viasaéreas, características que freqüentemente conduzem a obs-trução bronquial. Em alguns casos de asma, fibrose de mem-brana sub-base pode ocorrer, conduzindo a persistentes anor-malidades em função de pulmão.

Como aqui usado, um sujeito tendo asma é um sujei-to que tem um distúrbio do sistema respiratório caracteriza-do por inflamação, estreitamento das vias aéreas e aumentadareatividade das vias aéreas para agentes inalados. Asma éfreqüentemente, embora não exclusivamente, associada comsintomas atópicos ou alérgicos. Asma também é freqüentementeembora não exclusivamente, associada com contato com um ini-ciador. Um "iniciador" como aqui usado refere-se a uma com-posição ou condição ambiental que dispara asma. Iniciadoresincluem, mas não são limitados a, alérgenos, temperaturasfrias, exercício, infecções virais, SO2.

siRNA da invenção pode ser usado sozinho ou combi-nado com outros agentes terapêuticos. Os outros agentes te-rapêuticos em uma realização são outros siRNA da invenção. OsiRNA e outro agente terapêutico podem ser administrados si-multaneamente ou seqüencialmente. Quando os outros agentesterapêuticos são administrados simultaneamente, eles podemser administrados na mesma ou em formulações separadas, massão administrados ao mesmo tempo. Os outros agentes terapêu-ticos são administrados seqüencialmente uns com os outros ecom siRNA, quando a administração dos outros agentes tera-pêuticos e o siRNA é separada por tempo. A separação em tem-po entre a administração destes compostos pode ser uma ques-tão de minutos ou pode ser mais longa. Outros agentes tera-pêuticos incluem mas não são limitados a agentes antimicro-biais, agentes anticâncer, agentes anti-alergia, etc.

0 siRNA da invenção pode ser administrado a um su-jeito com um agente anti-microbiano. Um agente anti-microbiano, como aqui usado, refere-se a um composto ocor-rendo naturalmente ou sintético que é capaz de matar ou ini-bir microorganismos infecciosos. 0 tipo de agente anti-microbiano útil de acordo com a invenção dependerá do tipode microorganismo com o qual o sujeito está infectado ou emrisco de tornar-se infectado. Agentes anti-microbianos in-cluem, mas não são limitados a, agentes anti-bacterianos ,agentes anti-virais, agentes anti-fungos, e agentes anti-parasitas. Frases tais como "agente anti-infecção", "agenteanti-bacteriano", "agente anti-viral", "agente anti-fungo","agente anti-parasítico" e "parasiticida" têm significadosbem estabelecidos para aqueles versados na técnica e são de-finidos em textos médicos padrões. Resumidamente, agentesanti-bacterianos matam ou inibem bactérias, e incluem anti-bióticos assim como outros compostos naturais ou sintéticostendo funções similares. Antibióticos são moléculas de baixopeso molecular que são produzidas como metabólitos secundá-rios por células, tais como microorganismos. Em geral, anti-bióticos interferem com uma ou mais funções bacterianas ouestruturas que são especificas para o microorganismo e quenão estão presentes em células hospedeiras. Agentes anti-virais podem ser isolados a partir de fontes naturais ousintetizados e são úteis para matar ou inibir virus. Agentesanti-fungos são usados para tratamento de infecções superfi-ciais com fungos assim como infecções com fungos sistêmicasprimárias e oportunisticas. Agentes anti-parasita matam ouinibem parasitas.

Exemplos de agentes anti-parasiticos, também refe-ridos como parasiticidas úteis para administração humana in-cluem mas não são limitados a albendazol, anfotericina B,benznidazol, bitionol, cloroquina HCl, fosfato de cloroqui-na, clindamicina, desidroemetina, dietil carbamazina, furoa-to de diloxanida, eflornitina, furazolidaona, glucocorticói-des, halofantrina, iodoquinol, ivermectina, mebendazol, me-floquina, antimoniato de meglumina, melarsorpol, metrifona-to, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, pa-romomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, prazi-quantel, fosfato de primaquina, proguanil, pamoato de piran-tel, pirimetamina sulfonamidas, pirimetamina sulfadoxina,quinacrina HCl, sulfato de quinina, gluconato de quinidina,espiramicina, estibogluconato de sódio (gluconato de sódio eantimônio), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabenda-zol, tinidazol, trimetroprim sulfa metoxazol, e triparsamidaalguns dos quais são usados sozinhos ou em combinação comoutros.

Agentes antibacterianos matam ou inibem o cresci-mento ou função de bactérias. Uma grande classe de agentesanti-bacterianos é a de antibióticos. Antibióticos, que sãoefetivos para matar ou inibir uma ampla faixa de bactérias,são referidos como antibióticos de espectro amplo. Outrostipos de antibióticos são predominantemente efetivos contraas bactérias da classe gram-positiva ou gram-negativa. Estestipos de antibióticos são referidos como antibióticos de es-pectro estreito. Outros antibióticos que são efetivos contraum único organismo ou doença e não contra outros tipos debactérias, são referidos como antibióticos de espectro limi-tado. Agentes anti-bacterianos são algumas vezes classifica-dos baseado em seu modo de ação primário. Em geral, agentesanti-bacterianos são inibidores de síntese de parede de cé-lula, inibidores de membrana de célula, inibidores de sínte-se de proteína, inibidores funcionais ou de síntese de ácidonucléico, e inibidores competitivos.

Agentes antivirais são compostos que previnem in-fecção de células por vírus ou replicação dos vírus dentroda célula. Existem muito menos drogas antivirais que drogasantibacterianas porque o processo de replicação viral é tãoproximamente relacionado a replicação de ADN dentro da célu-la hospedeira, que agentes antivirais não-específicos fre-qüentemente podem ser tóxicos para o hospedeiro. Existem vá-rios estágios dentro do processo de infecção viral que podemser bloqueados ou inibidos por agentes antivirais. Estes es-tágios incluem, ligação do vírus à célula hospedeira (imuno-globulina ou peptídeo ligante), retirada de revestimento devírus (por exemplo, amantadina), síntese ou tradução de mRNAviral (por exemplo, interferon) , replicação de RNA ou DNAviral (por exemplo, análogos de nucleotídeos) , maturação denovas proteínas de vírus (por exemplo, inibidores de protea-se), e brotamento e liberação dos vírus.Análogos de nucleotídeos são compostos sintéticosque são similares a nucleotídeos, mas que têm um grupo ribo-se ou desoxirribose anormal ou incompleto. Uma vez os análo-gos de nucleotídeos estejam na célula, eles são fosforila-dos, produzindo o trifosfato formado que compete com nucleo-tídeos normais para incorporação no DNA ou RNA viral. Umavez a forma trifosfato do análogo de nucleotídeo seja incor-porada na cadeia de ácido nucléico em crescimento, ela causairreversível associação com a polimerase viral e assim ter-minação de cadeia. Análogos de nucleotídeos incluem, mas nãosão limitados a, aciclovir (usado para o tratamento de vírusde herpes simplex e vírus varicella - zoster), ganciclovir(útil para o tratamento de citomegalovírus), idoxuridina,ribavirina (útil para o tratamento de vírus sincicial respi-ratório) , dideoxi inosina, dideoxi citidina, zidovudina (a-zidotimidina), imiquimod e resimiquimod.

Os interferons são citocinas que são secretadaspor células infectadas com vírus assim como células imunes.Os interferons funcionam através de ligação a específicosreceptores sobre células adjacentes às células infectadas,causando a mudança na célula que protege a mesma de infecçãopelo vírus, interferon alfa e beta também induzem a expres-são de moléculas MHC Classe I e Classe II sobre a superfíciede células infectadas, resultando em aumentada apresentaçãode antígeno para reconhecimento de célula imune hospedeira.Interferons alfa e beta são disponíveis como formas recombi-nantes e têm sido usados para o tratamento de infecção dehepatite BeC crônica. Nas dosagens que são efetivas paraterapia antiviral, interferons têm severos efeitos colate-rais como febre, mal-estar e perda de peso.

Agentes antivirais úteis na invenção incluem masnão são limitados a imunoglobulinas, amantadina, interfe-rons, análogos de nucleotideos, e inibidores de protease.Exemplos específicos de antivirais incluem mas não são limi-tados a Acemannan; Aciclovir; Aciclovir sódio; Adefovir; A-lovudina; Alvicerpt Sudotox; Cloridrato de Amantadina; Ara-notina; Arildone; Atevirdina; Mesilato; Avridina; Cidofovir;Cipamfilina; Cloridrato de Citarabina; Mesilato de Delavir-dina; Desciclovir; Didanosina; Disoxaril; Enviradene; Envi-roxima; Famciclovir; Cloridrato de Famotina; Fiacitabina;Fialuridina; Fosarilato; Foscarnet Sódio; Fosfonet Sódio;Ganciclovir; Ganciclovir Sódio; Idoxuridina; Ketoxal; Lami-vudina; Lobucavir; Cloridrato de Memotina; Metisazona; Nevi-rapina; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirina; Cloridrato deRimantadina; Mesilato de Saquinavir; cloridrato de Somantqa-dine; Sorivudina; Statolon; Stavudina; Cloridrato de Tiloro-na; Trifluridina; Cloridrato de Valaciclovir; Vidarabina;Fosfato de Vidarabina; Sódio Fosfato de Vidarabina; Viroxi-ma; Zalcitabina; Zidovudina e Zinviroxima.

Agentes anti-fungos são úteis para o tratamento eprevenção de fungos infeetantes. Agentes anti-fungos algumasvezes são classificados por seu mecanismo de ação. Algunsagentes anti-fungo funcionam como inibidores de parede decélula através de inibição de glucose sintase. Estes inclu-em, mas não são limitados a, basiungina/ECB. Outros agentesanti-fungos funcionam através de desestabilização de inte-gridade de membrana. Estes incluem mas não são limitados a,imidazóis, como clortrimazol, sertaconazol, fluconazol, i-traconazol, cetoconazol, miconazol, e voriconacol, assim co-mo FK463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK991, pradimicina,UK292, butenafina e terbinafina. Outros agentes anti-fungosfuncionam através de colapso de quitina (por exemplo, quiti-nase) ou imuno-supressão (creme 501).

O siRNA da invenção também pode ser administradoem conjunção com uma terapia anticâncer. Terapias anticâncerincluem medicamentos de câncer, radiação e procedimentos ci-rúrgicos. Como aqui usado, um "medicamento anticâncer" refe-re-se a um agente que é administrado a um sujeito para opropósito de tratamento de um câncer. Como aqui usado, "tra-tamento de câncer" inclui prevenção de desenvolvimento de umcâncer, redução de sintomas de câncer, e/ ou inibição decrescimento de um câncer estabelecido. Em outros aspectos, omedicamento de câncer é administrado a um sujeito em riscode desenvolvimento de um câncer para o propósito de reduçãode risco de desenvolvimento de câncer. Vários tipos de medi-camentos para o tratamento de câncer são aqui descritos. Pa-ra o propósito deste relatório descritivo, medicamentos decâncer são classificados como agentes quimioterapêuticos,agentes imunoterapêuticos, vacinas contra câncer, terapia dehormônio, e modificadores de resposta biológica.

O agente quimioterapêutico pode ser selecionado dogrupo consistindo em metotrexato, vincristina, adriamicina,cisplatina, cloro etil nitroso uréias contendo não-açúcar,5-flúor uracila, mitomicina C, bleomicina, doxorubicina, da-carbazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina,carmustaina e poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, RAS inibi-dor de farnesil transferase, inibidor de farnesil transfera-se, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994,TNP-470, Hycamtin/Topotecan, PKC412, Vlaspodar/PSC833, No-vantrona / Mitroxantrona, Metaret / Suramin, Batimastat,E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel / VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat,BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, LemonalDP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, Metas-tron / derivado de estrôncio, Temodal / Temozolomida, Evacet/ doxorubicina lipossomal, Yewtaxano / Paclitaxel, Taxol /Paclitaxel, Xeload / Capecitabina, Furtulon / Doxifluridina,Cyclopax / paclitaxel oral, Taxóide Oral, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275 / Flavopiridol, CP-358 (774) /EGFR, CP-609 (754) / RAS inibidor de oncogene, BMS-182751 /platina oral, UFT (Tegafur / Uracila), Ergamisol / Levami-sol, Aperfeiçoador de Enuluraeila / 776C85/5FU, Campto / Le-vamisol, Camptosar / Irinotecano, Tumodex / Ralitrexed,Leustatina / Cladribina, Paxex / Paclitaxel, Doxil / doxoru-bicina lipossomal, Caelyx / doxorubicina lipossomal, Fludara/ Fludarabina, Farmarubicina / Epirubicina, DepoCyt, ZD1839,LU 7 9553/bis-naftalimida, LU 103793 / Dolastaina, caetyx /doxorubicina lipossomal, Gemzar / Gemcitabina, ZD 0473 / A-normed, YM 116, sementes lodina, inibidores de CDK4 e CDK2,inibidores de PARP, D4809/ Dexifosamida, Ifes / Mesnex / I-fosamida, Vumon / Teniposida, Paraplatina / Carboplatina,Plantinol / cisplatina, Vepeside / Etoposide, ZD 9331, Taxo-tere / Docetaxel, pró-droga de guanina arabinosideo, Análogode Taxano, nitrosouréias, agentes alquilantes como melfelame ciclofosfamida, Aminoglutetimida, Asparaginase, Busulfano,carboplatina, Clorambucilf Citarabina HCl, Dactinomicina,Daunorubicina HCl, Sódio fosfato de Estramustina, Etoposida(VP16-213), Floxuridina, Flúor uracila (5-FU), Flutamida,hidroxi uréia (hidroxi carbamida), Ifosfamida, InterferonAlfa-2a, Alfa-2b, acetato de Leuprolida (análogo de fator deliberação -LHRH), Lomustina (CCNU), Mecloretamina HCl (mos-tarda nitrogênio), Mercapto purina, Mesna, Mitotane (°p'~DDD) , Mitoxantrona HCl, Octeotrideo, Plicamicina, Procarba-zina HCl, Streptozoeina, eitrato de Tamoxifeno, Tioguanina,Tiotepa, sulfato de Vinblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azaei-tidina, Ertropoietina, Hexa metil melamina (HMM), interleu-eina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanil hi-drazona); MGBG), Pentostatina (2' desoxi eoformieina), Se-mustina (metil-CCNU), Teniposida (VM-26), e sulfato de vin-desina, mas não assim limitado.

O agente imunoterapêutieo pode ser selecionado dogrupo consistindo em Ributaxina, Herceptina, Quadramet, Pa-norex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolim, SMART M195, ATRAGEN,Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-22, OV103,3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2,MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H,GNI-250, EMD-72000, LimfoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5,ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMARTIDlO Ab, SMART ABL 364 Ab, e ImmuRAIT-CEA, mas não está as-sim limitado.A vacina contra câncer pode ser selecionada dogrupo consistindo em EGF, vacinas contra câncer anti-idiopáticas, antigeno de G175, vacina de melanoma GMK, vaci-na de conjugado de gangliosideo MGV, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratopo, BLP25(MUC-I), vacinaidiotipica lipossomal, Melacina, vacinas de antigeno pepti-deo, vacinas antigeno / toxina, vacina baseada em MVA,PACIS, vacina BCG, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus, e Im-muCyst/TheraCys, mas não é assim limitado.

O siRNA da invenção pode ser administrado a um su-jeito com um medicamento de asma / alergia. Um "medicamentode asma / alergia" como aqui usado é uma composição de maté-ria que reduz os sintomas de, previne o desenvolvimento de,ou inibe uma reação asmática ou alérgica. Vários tipos demedicamentos para o tratamento de asma e alergia são descri-tos no Guidelines For The Diagnosis and Management of Asth-ma, Expert Panei Report 2, NIH Publication N°"97/4051, 19 dejulho de 1997, os inteiros conteúdos dos quais são aqui in-corporados por referência. 0 resumo dos medicamentos comodescrito na publicação NIH é apresentado abaixo. Na maioriadas realizações o medicamento de asma / alergia é útil emalgum grau para tratamento de ambas, asma e alergia.

Medicações para o tratamento de asma são generica-mente separadas em duas categorias, medicações de alivio emedicações de controle de longo termo. Pacientes de asma to-mam as medicações de controle de longo termo em uma base di-ária para obter e manter controle de asma persistente. Medi-cações de longo termo incluem agentes antiinflamatórios comocorticosteróides, cromolina sódio e nedocromil; broncodila-tadores de atuação longa, como agonistas de β2 e metil xan-tinas; e modificadores de leucotrieno. As medicações de rá-pido alivio incluem agonistas de β2 de atuação curta, anti-colinérgicos, e corticosteróides sistêmicos. Existem muitosefeitos colaterais associados com cada uma destas drogas enenhuma das drogas sozinha ou em combinação é capaz de pre-venir ou tratar completamente asma.

Medicamentos de asma incluem, mas não são limita-dos a, inibidores de PDE-4, broncodilatador / agonistas debeta-2, abridores de canal de K+, antagonistas de VLA-4, an-tagonistas de neurocina, inibidores de síntese de tromboxanoA2 (TXA2), xantinas, antagonistas de ácido araquidônico, i-nibidores de lipoxigenase 5, antagonistas de receptor deTXA2, antagonistas de TXA2, inibidor de proteínas de ativa-ção de lipox-5, e inibidores de protease.

Agonistas de β2 / broncodilatador são uma classede compostos que causam broncodilatação ou relaxamento demúsculo liso. Agonistas de β2 / broncodilatador incluem, masnão são limitados a, salmeterol, salbutamol, albuterol, ter-butalina, D2522 / formoterol, fenoterol, bitolterol, pirbue-rol metil xantinas e orciprenalina. Agonistas de β2 de longaatuação e broncodilatadores são compostos que são usados pa-ra prevenção de longo termo de sintomas em adição às terapi-as antiinflamatórias. Agonistas de β2 de longa atuação in-cluem, mas não são limitados a, salmeterol e albuterol. Es-tes compostos são usualmente usados em combinação com corti-costeróides e genericamente não são usados sem qualquer te-rapia inflamatória. Eles foram associados com efeitos cola-terais como taquicardia, tremor de músculo de esqueleto, hi-pocalemia, e prolongamento de intervalo QTc em overdose.

Metil xantinas, incluindo, por exemplo, teofilina,têm sido usadas para controle de longo termo e prevenção desintomas. Estes compostos causam broncodilatação resultantede inibição de fosfodiesterase e provavelmente antagonismode adenosina. Toxidez agudas relacionada a dose é um parti-cular problema com estes tipos de compostos. Como resultado,concentração em soro rotineira tem de ser monitorada de modoa levar em conta a toxidez e estreita faixa terapêutica sur-gindo de diferenças individuais em depuração metabólica. E-feitos colaterais incluem taquicardia, taqui-arritmias, náu-sea e vômito, estimulação de sistema nervoso central, dor decabeça, ataques, hematemese, hiperglicemia e hipocalemia.Agonistas de β2 de curta atuação incluem, mas não são limi-tados a, albuterol, bitolterol, pirbuterol, e terbutalina.Alguns dos efeitos adversos associados com a administraçãode agonistas β2 de curta atuação incluem taquicardia, tremorde músculo de esqueleto, hipocalemia, ácido lático aumenta-do, dor de cabeça, e hiperglicemia.

Processos convencionais para tratamento ou preven-ção de alergia envolveram o uso de terapias de dessensibili-zação ou anti-histaminas. Anti-histaminas e outras drogasque bloqueiam os efeitos de mediadores químicos da reaçãoalérgica ajudam a regular a severidade dos sintomas alérgi-cos mas não previnem a reação alérgica e não têm efeito so-bre subseqüentes respostas alérgicas. Terapias de dessensi-tização são realizadas dando-se pequenas doses de um alérge-no, usualmente através de injeção sob a pele, de modo a in-duzir uma resposta tipo IgG contra o alérgeno. A presença deanticorpo IgG ajuda a neutralizar a produção de mediadoresresultantes da indução de anticorpos IgE, é acreditado. Ini-cialmente, o sujeito é tratado com uma dose muito baixa doalérgeno para evitar indução de uma severa reação e a dose élentamente aumentada. Este tipo de terapia é perigoso porqueo sujeito realmente é administrado com os compostos que cau-sam a resposta alérgica e severas reações alérgicas podemresultar.

Medicamentos de alergia incluem, mas não são limi-tados a, anti-histaminas, esteróides, e indutores de prosta-glandina. Anti - histaminas são compostos que neutralizamhistamina liberada por mastócitos ou basófilos. Estes com-postos são bem conhecidos na técnica e comumente usados parao tratamento de alergia. Anti - histaminas incluem, mas nãosão limitadas a, asternizol, azelastina, betatastina, bucli-zina, ceterizina, análogos de cetirizina, CS 560, deslorata-dina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, levoca-bastina, loratidina, mizolastina, norastemizol, terfenadina,e tranilast.

Indutores de prostaglandina são compostos que in-duzem atividade de prostaglandina. Prostaglandinas funcionamatravés de regulação de relaxamento de músculo liso. Induto-res de prostaglandina incluem, mas não são limitados a, S-5751.Os medicamentos de asma / alergia também incluemesteróides e imunomoduladores. Os esteróides incluem, masnão são limitados a, beclometasona, fluticasona, triamcino-lona, budesonida, corticosteróides e budenosida.

Corticosteróides incluem, mas não são limitados a,dipropionato de beclometasona, budesonida, flunisolida, pro-pionato de fluticaosona, e triamcinolona acetonideo. Emboradexametasona seja um corticosteróide tendo ação antiinflama-tória, ela não é regularmente usada para o tratamento de as-ma / alergia em uma forma inalada porque ela é altamente ab-sorvida e ela tem efeitos colaterais supressivos de longotermo em uma dose efetiva. Dexametasona, entretanto, podeser usada de acordo com a invenção para o tratamento de asma/ alergia porque quando administrada em combinação com áci-15 dos nucléicos da invenção ela pode ser administrada em umabaixa dose para reduzir seus efeitos colaterais. Alguns dosefeitos colaterais associados com corticosteróide incluitosse, disfonia, afta oral (candidiase), e em maiores doses,efeitos sistêmicos, como supressão adrenal, osteoporose, su-pressão de crescimento, afinamento de pele e fácil contusão.Barnes & Peterson (1993) Am Ver Respir Dis 148:S1-S26; eKamada AK et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48.

Corticosteróides sistêmicos incluem, mas não sãolimitados a, metil prednisolona, prednisolona e prednisona.Corticosteróides são associados com anormalidades reversí-veis em metabolismo de glucose, apetite aumentado, retençãode fluido, ganho de peso, alteração de humor, hipertensão,úlcera péptica, e necrose asséptica de osso. Estes compostossão úteis para prevenção de curto termo (3-10 dias) da rea-ção inflamatória em asma persistente controlada inadequada-mente. Eles também funcionam em uma prevenção de longo termode sintomas em asma severa persistente para suprimir e con-trolar e realmente reverter inflamação. Alguns efeitos cola-terais associados com uso de termo mais longo incluem su-pressão de eixo adrenal, supressão de crescimento, afinamen-to dérmico, hipertensão, diabetes, sindrome de Cushing, ca-tarata, fraqueza de músculo, e em raros exemplos, prejudica-da função imune. É recomendado que estes tipos de compostossejam usados em sua mais baixa dose efetiva (diretrizes parao diagnóstico e gerenciamento de asma; relatório de painelespecialista para; NIH Publication No. 97-4051; Julho de 1997).

Os imunomoduladores incluem, mas não são limitadosa, o grupo consistindo em agentes antiinflamatórios, antago-nistas de leucotrieno, muteinas de IL-4, receptores de IL-4solúveis, imuno-supressores (tal como vacina de peptideo to-lerizing), anticorpos anti-IL-4, antagonistas de IL-4, anti-corpos anti-IL-5, proteínas de fusão Fc - receptor de IL-13solúvel, anticorpos anti-IL-9, antagonistas de CCR3, antago-nistas de CCR5, inibidores de VLA-4, e reguladores descen-dentes de IgE.

Modificadores de leucotrieno são freqüentementeusados para controle de longo termo e prevenção de sintomasem asma persistente suave. Modificadores de leucotrieno fun-cionam como antagonistas de receptor de leucotrieno atravésde competição seletiva para receptores de LTD-4 e LTE-4. Es-tes compostos incluem, mas não são limitados a, comprimidosde zafirlukast e comprimidos de zileuton. Comprimidos de Zi-leuton funcionam como inibidores de 5-lipoxigenase. Estasdrogas foram associadas com elevação de enzimas de figado ealguns casos de hepatite reversível e hiper-bilirrubinemia.Leucotrienos são mediadores bioquímicos que são liberados demastócitos, inosineófilos, e basófilos que causam contraçãode músculo liso de vias aéreas e aumentam permeabilidadevascular, secreções de mucosa e ativam células inflamatóriasnas vias aéreas de pacientes com asma.

Outros imuno-moduladores incluem neuropeptídeosque foram mostrados terem propriedades imunomoduladoras. Es-tudos funcionais mostraram que substância P, por exemplo,pode influenciar função de linfócito através de específicosmecanismos mediados por receptor. Substância P também foimostrada modular distintas respostas de hiper-sensitividadeimediatas através de estimulação de geração de mediadoresderivados de ácido araquidônico a partir de mastócitos demucosa. McGillies J et al. (1987) Fed Proc 4 6:196-9(1987).Substância P é um neuropeptídeo primeiro identificado em1931. Von Euler and Gaddum J Physiol (London) 72:74-87(1931). Sua seqüência de aminoácidos foi reportada por Changet al. em 1971. Chang MM et al. (1971) Nature New Biol232:86-87. A atividade imuno-reguladora de fragmentos desubstância P foi estudada por Siemion IZ et al. (1990) MolecImmunol 27:887-890 (1990).Uma outra classe de compostos são os reguladoresdescendentes de IgE. Estes compostos incluem peptideos ououtras moléculas com a habilidade de ligarem-se ao receptorIgE e pelo que evitarem ligação de IgE especifica de antíge-no. Um outro tipo de regulador descendente de IgE é um anti-corpo monoclonal direcionado contra a região de ligação dereceptor de IgE da molécula de IgE humana. Assim, um tipo deregulador descendente de IgE é um anticorpo anti-IgE oufragmento de anticorpo. Anti-IgE está sendo desenvolvido porGenentech. Aqueles versados na técnica podem preparar frag-mentos de anticorpos funcionalmente ativos de peptideos Ii-gantes que têm a mesma função. Outros tipos de reguladoresdescendentes de IgE são polipeptideos capazes de bloquearema ligação do anticorpo IgE aos receptores de Fc sobre as su-perficies de células e deslocando IgE de sitios de ligaçãocom os quais IgE já está ligada.

Um problema associado com reguladores descendentesde IgE é que muitas moléculas não têm uma resistência de li-gação ao receptor correspondendo à interação muito forte en-tre a molécula IgE nativa e seu receptor. As moléculas tendoesta resistência tendem a serem irreversivelmente ligadas aoreceptor. Entretanto, tais substâncias são relativamente tó-xicas uma vez que elas podem se ligar covalentemente e blo-quearem outras moléculas estruturalmente similares no corpo.De interesse neste contexto é que a cadeia alfa do receptorde IgE pertence a uma maior família de gene onde, por exem-plo, vários dos diferentes receptores Fc IgG estão contidos.Estes receptores são absolutamente essenciais para a defesado corpo contra, por exemplo, infecções bacterianas. Molécu-las ativadas para ligação covalente são, além disso, fre-qüentemente relativamente instáveis e por isso elas prova-velmente têm de ser administradas várias vezes ao dia e en-tão em concentrações relativamente altas de modo a tornarpossível bloquear completamente a reunião renovando continu-amente de receptores de IgE sobre mastócitos e leucócitosbasofílicos.

Sódio cromolina e nedocromil são usados como medi-cações de controle de longo termo para prevenção de primari-amente sintomas de asma surgindo de exercício ou sintomasalérgicos surgindo de alérgenos. Estes compostos são acredi-tados bloquearem reações iniciais e posteriores a alérgenosatravés de interferência com função de canal de cloreto. E-les também estabilizam membranas de mastócitos e inibem ati-vação e liberação de mediadores a partir de inosinófilos ecélulas epiteliais. Um período de quatro a seis semanas deadministração é genericamente requerido para obtenção de má-ximo benefício.

Anticolinérgicos são genericamente usados para oalívio de broncoespasmo agudo. Estes compostos são acredita-dos funcionarem através de inibição competitiva de recepto-res colinérgicos muscarínicos. Anticolinérgicos incluem, masnão são limitados a, brometo de ipratropium. Estes compostosrevertem somente broncoespasmo mediado colinergicamente enão modificam qualquer reação a antígeno. Efeitos colateraisincluem secagem das secreções respiratórias e da boca, au-mentada respiração ruidosa, e visão manchada se espargidosnos olhos.

Para seu uso in vitro e in vivo, siRNA da invençãosão genericamente usados em uma quantidade efetiva. Como a-qui usado, uma quantidade efetiva refere-se genericamente aqualquer quantidade que é suficiente para obter um desejadoefeito biológico. Em uma realização uma quantidade efetiva éuma quantidade clinicamente efetiva, onde uma quantidadeclinicamente efetiva é qualquer quantidade que é suficientepara tratar um sujeito tendo uma doença. Como aqui usado,tratar e tratando referem-se a redução, eliminação, .ou pre-venção de pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença em umsujeito tendo ou em risco de ter a doença. Como aqui usado,um sujeito refere-se a um humano ou outro mamífero.

Combinado com os ensinamentos aqui providos, atra-vés de escolha entre os vários compostos ativos e fatores depeso como potência, biodisponibilidade relativa, peso decorpo de paciente, severidade de efeitos colaterais adversose modo preferido de administração, um regime de tratamentoterapêutico ou profilático efetivo pode ser planejado o qualnão cause substancial toxidez e ainda seja efetivo para tra-tar o particular sujeito. A quantidade efetiva para qualquerparticular aplicação pode variar dependendo de fatores taiscomo a doença ou condição sendo tratada, o particular siRNAsendo administrado, o tamanho do sujeito, ou a severidade dadoença ou condição. Aqueles versados na técnica podem deter-minar empiricamente a quantidade efetiva de um particularsiRNA e/ou outro agente terapêutico sem necessidade de inde-vida experimentação. É genericamente preferido que uma dosemáxima seja usada, ou seja, a mais alta dose segura de acor-do com algum julgamento médico. Doses múltiplas por dia po-dem ser contempladas para obtenção de apropriados níveissistêmicos de compostos. Apropriados níveis de sistema podemser determinados através de, por exemplo, medição do nívelde droga sustentado em plasma ou de pico do paciente. "Dose"e "dosagem" são aqui usados intercambiavelmente.

Genericamente, doses diárias orais de compostosativos serão de cerca de 0,01 miligramas/kg por dia a 1000miligramas/kg por dia. É esperado que doses orais na faixade 0,5 a 50 miligramas/kg, em uma ou várias administraçõespor dia, renderão os resultados desejados. Dosagem pode serajustada apropriadamente para obter-se os desejados níveisde droga, local ou sistêmico, dependendo do modo de adminis-tração. Por exemplo, é esperado que administração intraveno-sa possa ser da ordem de várias ordens de magnitude menorque uma dose por dia. No caso de a resposta em um sujeitoser insuficiente em tais doses, doses mesmo maiores (ou do-ses maiores efetivas através de uma rota de liberação maislocalizada, diferente) podem ser empregadas na extensão emque a tolerância de paciente permita. Doses múltiplas pordia são contempladas para obter-se apropriados níveis sistê-micos de compostos.

Para qualquer compostos aqui descrito a quantidadeterapeuticamente efetiva pode ser inicialmente determinada apartir de modelos animais. Uma dose terapeuticamente efetivatambém pode ser determinada a partir de dados humanos parasiRNA que foi testado em humanos e para compostos que sãoconhecidos exibirem similares atividades farmacológicas, co-mo os outros agentes ativos relacionados. Maiores doses po-dem ser requeridas para administração parenteral. A dose a-plicada pode ser ajustada baseado na relativa biodisponibi-lidade e potência do composto administrado. Ajuste de dosepara obtenção de máxima eficácia baseado nos processos des-critos acima e outros processos como são bem conhecidos natécnica está bem dentro das capacidades daqueles versados.

De modo a promover liberação de siRNA em células,o siRNA opcionalmente pode ser apresentado, formulado, ou deoutro modo combinado com um lipideo catiônico. Em uma reali-zação tal lipideo catiônico é DOTAP.

Para uso em terapia, uma quantidade efetiva dosiRNA pode ser administrada a um sujeito através de qualquermodo que libere o siRNA para a desejada superfície. Adminis-tração de composição farmacêutica da presente invenção podeser realizada através de quaisquer meios conhecidos por a-queles versados na técnica. Preferidas rotas de administra-ção incluem mas não são limitadas a oral, parenteral, intra-muscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, inalação,ocular, vaginal, e retal.

O siRNA da invenção pode ser liberado para um par-ticular tecido, tipo de célula, ou para o sistema imune, ouambos, com o auxílio de um vetor. Em seu sentido mais amplo,um "vetor" é qualquer veículo capaz de facilitar a transfe-rência das composições para as células alvos. O vetor gene-ricamente transporta o siRNA, anticorpo, antígeno e/ou medi-camente específico de desordem para as células alvos com re-duzida degradação em relação Pa extensão de degradação quepode resultar na ausência do vetor.

Em geral, os vetores úteis na invenção são dividi-5 dos em duas classes: vetores biológicos e vetores químicos /físicos. Vetores biológicos e vetores químicos / físicos sãoúteis na liberação e/ou tomada de agentes terapêuticos dainvenção.

Como aqui usado, um "vetor químico / físico" refe-10 re-se a uma molécula natural ou sintética, outra que não a-quelas derivadas de fontes bacteriológicas ou virais, capazde liberar o siRNA e/ou outro medicamento.

Um vetor químico / físico preferido da invenção éum sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão co-15 loidal incluem sistemas baseados em lipídeo incluindo emul-sões óleo-em-água, micelas, micelas mistas, e lipossomas. Umsistema coloidal preferido da invenção é lipossoma. Liposso-mas são vasos de membrana artificiais que são úteis como umvetor de liberação in vivo ou in vitro. Foi mostrado que20 grande vesículas unilamelares (LUVs), que variam em tamanhode 0,2-4,0 μπι podem encapsular grandes macromoléculas. RNA,DNA e virions intactos podem ser encapsulados dentro de in-terior aquoso e serem liberados para células em uma formabiologicamente ativa. Fraley et al. (1981) Trends Biochem25 Sci 6:77.

Lipossomas podem ser direcionadas para um particu-lar tecido através de acoplamento de lipossoma a um especí-fico ligante tal como um anticorpo monoclonal, açúcar, gli-colipideo, ou proteína. Ligantes que podem ser úteis paraalvejar uma lipossoma para uma célula imune incluem, mas nãolimitados a, moléculas intactas ou em fragmentos, que inte-ragem com receptores específicos de células imunes e molécu-las, tais como anticorpos, que interagem com os marcadoresde superfície de célula de células imunes. Tais ligantes po-dem ser facilmente identificados através de ensaios de liga-ção bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Ainda emoutras realizações, o lipossoma pode ser alvejado para ocâncer através de acoplamento a um dos anticorpos imunotera-pêuticos discutidos anteriormente. Adicionalmente, o vetorpode ser acoplado a um peptídeo de alvejar nuclear, que di-recionará o vetor para o núcleo de uma célula hospedeira.

Formulações de lipídeos para transfecção são co-mercialmente disponíveis de QIAGEN, por exemplo, comoEFFECTENE (um lipídeo não-lipossomal com um aperfeiçoador decondensação de DNA especial) e SUPERFECT (uma nova tecnolo-gia dendrimérica atuante).

Lipossomas são comercialmente disponíveis de GibcoBRL, por exemplo, como LIPOFECTIN e LIPOFECTACE, que sãoformados por lipídeos catiônicos como cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi) propil]-Ν,N,N-trimetil amônio (DOTMA) e brometode dimetil diocta decil amônio (DDAB). Processos para fabri-cação de lipossomas são bem conhecidos na técnica e foramdescritos em muitas publicações. Lipossomas também foram re-vistos por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

Em uma realização, o veículo é uma micropartículaou implante biocompatível que é apropriado para implantaçãoou administração para o receptor mamífero. Implantes bioero-díveis exemplares que são úteis de acordo com este processosão descritos no pedido de patente internacional publicadoWO 95/24929, intitulado "Polymeric Gene Delivery System". WO5 95/24929 descreve uma matriz polimérica biocompativel, pre-ferivelmente biodegradável para conter um gene exógeno sobo controle de um apropriado promotor. A matriz poliméricapode ser usada para obtenção de liberação sustentada do a-gente terapêutico no sujeito.10 A matriz polimérica preferivelmente está na forma

de uma micropartícula tal como uma microesfera (onde o ácidonucléico e/oü o outro agente terapêutico é disperso por todauma matriz polimérica sólida) ou uma microcápsula (onde oácido nucléico e/ou o outro agente terapêutico é estocado no15 núcleo de uma concha polimérica). Outras formas da matrizpolimérica para conter o agente terapêutico incluem filmes,revestimentos, géis, implantes e sondas. 0 tamanho e compo-sição do dispositivo de matriz polimérica são selecionadospara resultarem em favoráveis cinéticas de liberação no te-20 cido no qual a matriz é introduzida. 0 tamanho da matriz po-limérica é ainda selecionado de acordo com o processo de li-beração que é para ser usado, tipicamente injeção em um te-cido ou administração de uma suspensão através de aerossolnas áreas nasais e/ou pulmonares. Preferivelmente quando uma25 rota de aerossol é usada a matriz polimérica e o ácido nu-cléico e/ou o outro agente terapêutico são encerrados em umveículo tensoativo. A composição de matriz polimérica podeser selecionada para ter ambas, taxas de degradação favorá-veis e também para ser formada por um material que seja bio-adesivo, para ainda aumentar a eficácia de transferênciaquando a matriz é administrada a uma superfície nasal e/oupulmonar que tenha sustentado um dano. A composição de ma-5 triz também pode ser selecionada para não degradar, mas an-tes, para liberar por difusão sobre um estendido período detempo. Em algumas realizações preferidas, o ácido nucléico éadministrado ao sujeito via um implante enquanto o outro a-gente terapêutico é administrado de modo penetrante. Micro-10 esferas biocompatíveis que são apropriadas para liberação,tal como liberação oral ou em mucosa, são mostradas em Chic-kering et al. (1996) Biotech Bioeng 52:96-101 e Mathiowitz Eet al. (1997) Nature 386:410-414 e pedido de patente PCTW097/03702.

15 Ambas matrizes poliméricas não-biodegradáveis e

biodegradáveis podem ser usadas para liberação de ácido nu-cléico e/ou o outro agente terapêutico para o sujeito. Ma-trizes biodegradáveis são preferidas. Tais polímeros podemser polímeros naturais ou sintéticos. 0 polímero é selecio-20 nado baseado no período de tempo sobre o qual é desejada li-beração, genericamente da ordem de umas poucas horas a umano ou mais. Tipicamente, liberação em um período variandode entre poucas horas e três a quatro meses é mais desejá-vel, particularmente para os agentes ácidos nucléicos. 0 po-25 límero opcionalmente está na forma de um hidrogel que podeabsorver até cerca de 90% de seu peso em água e ainda, op-cionalmente está reticulado com íons multi-valentes ou ou-tros polímeros.Polímeros bioadesivos de particular interesse in-cluem hidrogéis bioerodiveis descritos por H.S. Sawhney,C.P. Pathak e J.A. Hubell em Macromolecules, (1993) 26:581-587, os ensinamentos dos quais são aqui incorporados. Estes5 incluem ácidos poli hialurônicos, caseina, gelatina, gluti-na, polianidridos, ácido poliacrilico, alginato, quitosano,poli(metacrilatos de metila), poli (metacrilatos de etila),poli (metacrilato de butila), poli (metacrilato de isobuti-la), poli (metacrilato de hexila), poli (metacrilato de iso-10 decila), poli (metacrilato de laurila), poli (metacrilato defenila), poli (acrilato de metila), poli (acrilato de iso-propila), poli (acrilato de isobutila), e poli (acrilato deocta decila).

O uso de agnetes de compactação também pode ser15 desejável. Agentes de compactação também podem ser usadossozinhos, ou em combinação com, um vetor biológico ou quími-co / físico. Um "agente de compactação", como aqui usado,refere-se a um agente, tal como uma histona, que neutralizaas cargas negativas sobre o ácido nucléico e pelo que permi-20 te compactação do ácido nucléico em um grânulo fino. Compac-tação do ácido nucléico facilita a tomada do ácido nucléicopela célula alvo. Os agentes de compactação podem ser usadossozinhos, isto é, para liberação de um ácido nucléico em umaforma que é mais eficientemente tomada pela célula ou, mais25 preferivelmente, em combinação com um ou mais dos vetoresdescritos acima.

Outras composições exemplares que podem ser usadaspara facilitação de tomada de um ácido nucléico incluem fos-fato de cálcio e outros mediadores químicos de transporteintracelular, composições de microinjeção, eletroporação ecomposições de recombinação homóloga (por exemplo, para in-tegração de um ácido nucléico em uma localização pré-selecionada dentro de cromossoma de célula alvo).

Os compostos podem ser administrados sozinhos (porexemplo, em solução salina ou tampão) ou usando quaisquervetores de liberação conhecidos na técnica. Por exemplo, osseguintes veículos de liberação foram descritos: cochleates(Gould_Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomes (Vancott etal., 1998, Lowell et al,, 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993,Carlsson et al., 1991, Hu et al.,1998, Morein et al., 1999);lipossomas (Childers et al., 1999, Michalek et al. , 1989,1992, de Haan 1995a, 1995b); vetores bacterianos vivos (porexemplo, Salmonella, Escherichia coli, bacillus Calmette -Guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Poul-wels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al.,1991, Nugent et al., 1998); vetores virais vivos (por exem-plo, Vaccinia, adenovírus, Herpes Simplex) (Gallichan etal., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998,Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); micro-esferas(Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994,Moore et al., 1995, 0'Hagan et al., 1994, Eldridge et al.,1989); vacinas de ácido nucléico (Fynanet al., 1993, Kuklinet al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishiiet al., 1997); polímeros (por exemplo, carboxi metil celulo-se, quitosano) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al.,1998); anéis de polímeros (Wyatt et al., 1998); proteossomas(Vancott et al. , 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997);fluoreto e sódio (Hashi et al., 1998); plantas transgênicas(Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995);virossomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryzet al., 1998); e, partículas semelhantes a vírus (Jiang etal., 1999, Leibl et al., 1998).

As formulações da invenção são administradas emsoluções farmaceuticamente aceitáveis, que rotineiramentepodem conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis desal, agente tamponante, preservativos, carreadores compatí-veis, adjuvantes, e opcionalmente outros ingredientes tera-pêuticos .

O termo carreador farmaceuticamente aceitável sig-nifica um ou mais materiais de enchimento, diluentes ousubstância encapsulantes sólidas ou líquidas compatíveis quesão apropriadas para administração a um humano ou outro ani-mal vertebrado. O termo carreador representa um ingredienteorgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual oingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Oscomponentes das composições farmacêuticas também são capazesde serem misturados com os compostos da presente invenção, euns com os outros, em uma maneira de modo que não haja ne-nhuma interação que possa prejudicar substancialmente a de-sejada eficiência farmacêutica.

Para administração oral, os compostos (isto é,siRNA, e opcionalmente outros agentes terapêuticos) podemser facilmente formulados através de combinação de compos-to (s) ativo com carreadores farmaceuticamente aceitáveis bemconhecidos na técnica. Tais carreadores permitem que os com-postos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílu-las, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas,suspensões e semelhantes para ingestão oral por um sujeito aser tratado. Preparações farmacêuticas para uso oral podemser obtidas como excipiente sólido, opcionalmente triturandouma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos,após adição de apropriados auxiliares, se desejado, para ob-ter comprimidos ou núcleos de drágeas. Apropriados excipien-tes são, em particular, materiais de enchimento tais comoaçúcares, incluindo lactose, sucrose, manitol, ou sorbitol;preparações de celulose como, por exemplo, amido de milho,amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina,goma tragacanto, metil celulose, hidroxi propil metil celu-lose, sódio carboxi metil celulose e/ou polivinil pirrolido-na (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adi-cionados, tais como polivinil pirrolidona reticulada, agar,ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio.Opcionalmente as formulações orais também podem ser formula-das em soluções salinas ou tampões, por exemplo, EDTA, paraneutralização de condições ácidas internas ou podem ser ad-ministradas sem quaisquer carreadores.

Também especificamente contempladas são formas dedosagem oral do componente acima ou componentes. O componen-te ou componentes podem ser quimicamente modificados de modoque liberação oral do derivado é eficaz. Genericamente, amodificação química contemplada é a ligação de pelo menosuma metade à própria molécula componente, onde a dita metadepermite (a) inibição de proteólise; e (b) tomada na correntesangüínea a partir do estômago ou intestino, é desejado oaumento em estabilidade total do componente ou componentes eaumento em tempo de circulação no corpo. Exemplos de taismetades incluem: polietileno glicol, copolímeros de etilenoglicol e propileno glicol, carboxi metil celulose, dextrano,álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e poli prolina.Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts"In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Intersciences, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al. ,1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Outros polímeros que po-dem ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano. Preferidas para utilização farmacêutica, como in-dicado acima, são metades polietileno glicol.

Para o componente (ou derivado) a localização deliberação pode ser o estômago, o intestino delgado (o duode-no, o jejuno, ou o íleo), ou o intestino grosso. Aquelesversados na técnica tem formulações disponíveis que não dis-solverão no estômago, ainda liberarão o material no duodenoou em outro local no intestino. Preferivelmente, a liberaçãoevitará os efeitos prejudiciais do ambiente de estômago,tanto através de proteção do siRNA (ou derivado) como atra-vés de liberação do material biologicamente ativo além doambiente de estômago, tal como o intestino.

Para assegurar inteira resistência gástrica um re-vestimento impermeável a pelo menos pH 5,0 é essencial. E-xemplos dos ingredientes inertes mais comuns que são usadoscomo revestimentos entéricos acetato trimelitato de celulose(CAT), ftalato de hidroxi propil metil celulose (HPMCP),HPMCP 50, HPMCP 55, acetato ftalato de polivinila (PVAP),Eudragit L30D, Aquateric, acetato ftalato de celulose (CAP),Eudragit L, Eudragit S, e Shellac. Estes revestimentos podemser usados como filmes mistos.

Um revestimento ou mistura de revestimentos tambémpode ser usada sobre comprimidos, que não é pretendido paraproteção contra o estômago. Este pode incluir revestimentosde açúcar, ou revestimentos que tornam o comprimido mais fá-cil de ser engolido. Cápsulas podem consistir em uma conchadura (tal como gelatina) para liberação de composto terapêu-tico seco, isto é, pulverizado; para formas líquidas, umaconcha de gelatina mole pode ser usada. O material de conchade cápsulas pode ser amido espesso ou outro papel comestí-vel. Para pílulas, losangos, comprimidos moldados ou tritu-rados de comprimidos, técnicas de formação de massa úmidapodem ser usadas.

O composto terapêutico pode ser incluído na formu-lação como multi-partículas finas na forma de grânulos oupelotas de tamanho de partícula de 1 mm. A formulação do ma-terial para administração em cápsulas também pode ser comoum pulverizado, plugs levemente comprimidos ou mesmo comocomprimidos. O composto terapêutico também pode ser prepara-do através de compressão.

Agentes corantes e aromatizantes podem ser incluí-dos. Por exemplo, o siRNA (ou derivado) pode ser formulado(tal como através de encapsulação em microesfera ou liposso-ma) e então ainda contido em um produto comestível, tal comouma bebida refrigerada contendo corantes e agentes aromati-zantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do compostoterapêutico com um material inerte. Estes diluentes podemincluir carboidratos, especialmente manitol, a-lactose, Iac-tose anidra, celulose, sucrose, dextranos modificados e ami-do. Certos sais inorgânicos também podem ser usados como ma-teriais de enchimento incluindo trifosfato de cálcio, carbo-nato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comer-cialmente disponíveis são Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Em-compress e Avicell.

Desintegrantes podem ser incluídos na formulaçãodo composto terapêutico em uma forma de dosagem sólida. Ma-teriais usados como desintegrantes incluem mas não são Iimi-tados a, amido, incluindo o desintegrante comercial baseadoem amido, Explotab. Amido glicolato de sódio, Amberlite, só-dio carboxi metil celulose, ultra milopectina, alginato desódio, gelatina, casca de laranja, ácido de carboxi metilcelulose, esponja natural e bentonita podem ser usadas. Umaoutra forma dos desintegrantes são as resinas de troca cati-ônica insolúveis. Gomas pulverizadas podem ser usadas comodesintegrantes e como ligantes e estas podem incluir gomaspulverizadas como agar, Karaya ou tragacanto. Ácido algínicoe seu sal de sódio também são úteis como desintegrantes.

Ligantes podem ser usados para manterem o agenteterapêutico junto para formar um comprimido duro e incluemmateriais a partir de produtos naturais como acácia, traga-canto, amido e gelatina. Outros incluem metil celulose (MC),etil celulose (EC), e carboxi metil celulose (CMC). Polivi-nil pirrolidona (PVP) e hidroxi propil metil celulose (HPMC)podem ser ambas usadas em soluções alcoólicas para granularo agente terapêutico.

Um agente anti-fricção pode ser incluído na formu-lação do agente terapêutico para prevenir pegajosice duranteo processo de formulação. Lubrificantes podem ser usados co-mo uma camada entre o agente terapêutico e a parede de cos-sinete, e estes incluem, mas não são limitados a, ácido es-teárico incluindo seus sais de magnésio e cálcio, poli tetraflúor etileno (PTFE), parafina líquida, óleos vegetais e ce-ras. Lubrificantes solúveis também podem ser usados tais co-mo lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de magnésio, po-lietileno glicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4000e 6000.

Glidantes que podem aperfeiçoar as propriedades defluxo da droga durante formulação e auxiliar rearranjo dur-rante compressão podem ser adicionados. Os glidantes podemincluir amido, talco, sílica pirogênica e sílico-aluminatohidratado.

Para auxiliar dissolução do agente terapêutico noambiente aquoso um tensoativo pode ser adicionado como umagente umectante. Tensoativos podem incluir detergentes ani-ônicos como lauril sulfato de sódio, dioctil sulfo succinatode sódio, e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiôni-cos podem ser usados e podem incluir cloreto de benzalcônioou cloreto de benzetônio. A lista de potenciais detergentesnão-iônicos que podem ser incluídos na formulação como ten-soativos são lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40,óleo de mamona hidrogenado polioxietileno 10,50 e 60, mono-estearato de glicerol, poli sorbato 40, 60, 65 e 80, ésterde ácido graxo de sucrose, metil celulose e carboxi metilcelulose. Estes tensoativos podem estar presentes na formu-lação do siRNA ou derivado sozinhos ou como uma mistura emdiferentes razões.

Preparações farmacêuticas que podem ser usadas o-ralmente incluem cápsulas de empurrar - adaptar feitas degelatina, assim como cápsulas seladas, macias fabricadas degelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol.As cápsulas de empurrar - adaptar podem conter os ingredien-tes ativos em mistura com material de enchimento tal comolactose, ligantes tais como amidos, e/ou lubrificantes comotalco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabiliza-dores. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dis-solvidos ou suspensos em líquidos apropriados, tais como ó-leos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líqui-dos. Em adição, estabilizadores podem ser adicionados. Mi-cro-esferas formuladas para administração oral também podemser usadas. Tais microesferas foram bem definidas na técni-ca. Todas as formulações para administração oral devem estarem dosagens apropriadas para tal administração.

Para administração bucal, as composições podem to-mar a forma de comprimidos ou losangos formulados em maneiraconvencional.

Para administração por inalação, os compostos parauso de acordo com a presente invenção podem ser conveniente-mente liberados na forma de uma apresentação de espargimentode aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebu-lizador, com o uso de um propelente apropriado, por exemplo,dicloro diflúor metano, tri cloroflúor metano, dicloro tetraflúor etano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. Nocaso de um aerossol pressurizado a dose unitária pode serdeterminada através de provimento de uma válvula para libe-rar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por e-xemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podemser formuladas contendo uma mistura pulverizada do compostoe uma apropriada base pulverizada tal como lactose ou amido.

Também é aqui contemplada uma liberação pulmonardo siRNA (ou seus derivados) . 0 siRNA (ou derivado) é libe-rado para os pulmões de um mamífero enquanto inalando e a-travessa o forro epitelial do pulmão para a corrente sangüí-nea. Outros relatos de moléculas inaladas incluem Adjei etal., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al.,1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (a-cetato de leuprolídeo); Braquet et al., 1989, Journal ofCardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5):143-146 (endote-lina-1); Hubbard et al. , 1989, Annals of Internai Medicine,111:206-212 (alfa 1-antitripsina); Smith et al., 1989, J.Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-l-proteinase); Oswein et al. ,1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposiumon Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(hormônio de crescimento humano recombinante); Debs et al.,1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (interferon-gama e fator al-fa de necrose de tumor) e Platz et al., patente US 5 284 656(fator de estimulação de colônia de granulócito). Um proces-so e composição para liberação pulmonar de drogas para efei-to sistêmico são descritos na patente US 5 451 569, expedidaem 19 de setembro de 1995 para Wong et al.

São contemplados para uso na prática desta inven-ção uma ampla faixa de dispositivos mecânicos desenhados pa-ra liberação pulmonar de produtos terapêuticos, incluindomas não limitado a nebulizadores, inaladores de dose medida,e inaladores de pulverizado, todos os quais são familiarespara aqueles versados na técnica.

Alguns exemplos específicos de dispositivos comer-cialmente disponíveis apropriados para a prática desta in-venção são o nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinc-krodt, Inc., St. Louis, Missouri; o nebulizador Acorn II,fabricado por Marquest Medicai Products, Englewood, Colora-do; o inalador de dose medida Ventolin, fabricado por GlaxoInc., Research Triangle Park, North Carolina; e o inaladorde pulverizado Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bed-ford, Massachusetts.

Todos tais dispositivos requerem o uso de formula-ções apropriadas para a dispersão de siRNA (ou derivado).Tipicamente, cada formulação é específica para o tipo dedispositivo empregado e pode envolver o uso de um apropriadomaterial propelente, em adição aos diluentes usuais, adju-vantes e;ou carreadores úteis em terapia. Também, o uso delipossomas, microcápsulas ou microesferas, complexos de in-clusão, ou outros tipos de carreadores é contemplado. siRNAquimicamente modificado também pode ser preparado em dife-rentes formulações dependendo do tipo de modificação químicaou o tipo de dispositivo empregado.

Formulações apropriadas para uso com um nebuliza-dor, tanto jato como ultrassônico, tipicamente compreenderãosiRNA (ou derivado) dissolvido em água em uma concentraçãode cerca de 0,1 a 25 mg de siRNA biologicamente ativo por mLde solução. A formulação também pode incluir um tampão e umaçúcar simples (por exmeplo, para estabilização de siRNA eregulação de pressão osmótica). A formulação de nebulizadortambém pode conter um tensoativo, para reduzir ou preveniragregação induzida por superfície do siRNA causada por ato-mização da solução na formação de aerossol.

Formulações para uso com um dispositivo inaladorde dose medida genericamente compreendem pulverizado fina-mente dividido contendo o siRNA (ou derivado) suspenso em umpropelente com o auxílio de um tensoativo. 0 propelente podeser qualquer material convencional empregado para este pro-pósito, tal como um cloro flúor carboneto, um hidro cloroflúor carboneto, um hidro flúor carboneto, ou um hidrocarbo-neto, incluindo tricloro flúor metano, dicloro diflúor meta-no, dicloro tetra flúor etanol, e 1, 1,1,2-tetra flúor etano,ou suas combinações. Tensoativos apropriados incluem triole-ato de sorbitano e lecitina de soja. oléico também pode serútil como um tensoativo.

Formulações para dispensamento a partir de um dispositivoinalador de pulverizado compreenderão um pulverizado secofinamente dividido contendo siRNA (ou derivado) e também po-dem incluir um agente de volume, como lactose, sorbitol, su-crose, ou manitol em quantidades que facilitem dispersão dopulverizado a partir do dispositivo, por exemplo, 50 a 90%em peso da formulação. 0 siRNA (ou derivado) mais vantajosa-mente deve ser preparado em forma de partículas com um tama-nho de partícula médio de menos que 10 μπι (micra) , mais pre-ferivelmente 0,5 a 5 μπι, para liberação mais efetiva para opulmão distai.

Liberação nasal de uma composição farmacêutica dapresente invenção também é contemplada. Liberação nasal per-mite a passagem de uma composição farmacêutica da presenteinvenção para a corrente sangüínea diretamente após adminis-tração de produto terapêutico para o nariz, sem a necessida-de de deposição do produto no pulmão. Formulações para libe-ração nasal incluem aquelas com dextrano ou ciclo dextrano.

Para administração nasal, um dispositivo útil éuma garrafa dura, pequena à qual um espargidor de dose medi-da está ligado. Em uma realização, a dose medida é liberadaatravés de retirada de composição farmacêutica da presenteinvenção em uma câmara de volume definido, cuja câmara temuma abertura dimensionada para obter aerossol e formulaçãode aerossol através de formação de um espargimento quando umlíquido na câmara é comprimido. A câmara é comprimida paraadministrar a composição farmacêutica da presente invenção.Em uma realização específica, a câmara é um arranjo de pis-tão. Tais dispositivos são comercialmente disponíveis.

Alternativamente, uma garrafa plástica de espremercom uma abertura dimensionada para formar aerossol de umaformulação aerossol através de formação de um espargimentoquando espremida, é usada. A abertura é usualmente encontra-da na parte superior da garrafa, e a parte superior é gene-ricamente afilada para adaptar-se parcialmente nas passagensnasais para eficiente administração da formulação de aeros-sol. Preferivelmente, o inalador nasal proverá uma quantida-de medida da formulação de aerossol, para administração deuma dose medida da droga.

Os compostos, quando é desejável liberar os mesmossistemicamente, podem ser formulados para administração pa-renteral através de injeção, por exemplo, através de injeçãode quantidade relativamente grande ou infusão continua. For-mulações para injeção podem ser apresentadas em forma de do-sagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientesmulti - doses, com um preservativo adicionado. As composi-ções podem tomar formas tais como suspensões, soluções ouemulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter a-gentes de formulação como agentes de suspensão, estabiliza-ção e/ou dispersão.

Formulações farmacêuticas para administração pa-renteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos emforma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos com-postos ativos podem ser preparadas como apropriadas suspen-sões de injeção oleosa. Apropriados solventes lipofilicos ouveículos incluem óleos graxos como óleo de sésamo, ou éste-res de ácido graxo sintético, como oleato de etila ou tri-glicerídeos, ou lipossomas. Suspensões de injeção aquosa po-dem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspen-são, tal como sódio carboxi metil celulose, sorbitol, oudextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter es-tabilizadores ou agentes que aumentam a solubilidade doscompostos para permitir preparação de soluções altamenteconcentradas.

Alternativamente, os compostos ativos podem estarem forma pulverizada para constituição com um veiculo apro-priado, por exemplo, água estéril livre de pirogêneo, antesde uso.

Os compostos também podem ser formulados em compo-sições retais ou vaginais tais como supositórios ou enemasde retenção, por exemplo, contendo convencionais bases desupositório como manteiga de cacau ou outros glicerideos.

Em adição às formulações descritas anteriormente,os compostos também podem ser formulados como uma preparaçãodepósito. Tais formulações de longa atuação podem ser formu-ladas com apropriados materiais poliméricos ou hidrofóbicos(por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou re-sinas de troca de ions, ou como derivados pobremente solú-veis, por exemplo, como um sal pobremente solúvel.

As composições farmacêuticas também podem compre-ender apropriados carreadores ou excipientes de fase sólidaou gel. Exemplos de tais carreadores ou excipientes incluem,mas não são limitados a, carbonato de cálcio, fosfato decálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, ge-latina, e polímeros tais como polietileno glicóis.

Apropriadas formas de preparação farmacêutica lí-quida ou sólida são, por exemplo, soluções aquosas ou sali-nas para inalação, micro-encapsuladas, encochleated, reves-tidas sobre partículas microscópicas de ouro, contidas emlipossomas, nebulizadas, aerossóis, pelotas para implante napele, ou secas sobre um objeto agudo para ser arranhado napele. As composições farmacêuticas também incluem grânulos,pulverizados, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, cre-mes, gotas ou preparações com liberação prolongada de com-postos ativos, em cuja preparação excipientes e aditivose/ou auxiliares como desintegrante, materiais de enchimento,agentes de revestimento, agentes de intumescimento, lubrifi-cantes, aromatizantes, adoçantes, ou solubilizantes são usu-almente usados como descrito acima. As composições farmacêu-ticas são apropriadas para uso em uma variedade de sistemasde liberação de droga. Para uma breve revisão de processospara liberação de droga, ver Langer, Science 249;1527-1533,1990, que é aqui incorporada por referência.

0 siRNA e opcionalmente outros agentes terapêuti-cos podem ser administrados per se (puros) ou na forma de umsal farmaceuticamente aceitável. Quando usados em medicinaos sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não- aceitáveis farmaceuticamente podem ser convenientementeusados para preparação de seus sais farmaceuticamente acei-táveis. Tais sais incluem, mas não são limitados àquelespreparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromí-drico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maléico, acético, sa-licílico, p-tolueno sulfônico, tartárico, cítrico, metanosulfônico, fórmico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, e ben-zeno sulfônico. Também, tais sais podem ser prpearados comosais de metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como sais depotássio ou cálcio do grupo de ácido carboxilico.

Apropriados agentes tamponantes incluem: ácido a-cético e um sal (1-2% peso / volume); ácido citrico e um sal(1-3% peso / volume); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% peso /volume); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% peso / volume).Apropriados preservativos incluem cloreto de belzalcônio(0,003-0,03% peso / volume); cloro butanol (0,3-0,9% peso /volume); parabenos (0,01-0,25% peso / volume) e timerosal(0,004-0,02% peso / volume).

Composições farmacêuticas da invenção contêm umaquantidade efetiva de um siRNA e opcionalmente um ou maisagentes terapêuticos adicionais incluídos em um carreadorfarmaeuticamente aceitável.

O agente(s) terapêutico, incluindo especificamentemas não limitado ao siRNA, pode ser provido em partículas.Partículas como aqui usado significam nano ou micro-partículas (ou em alguns exemplos maiores) que podem consis-tir no todo ou em parte do siRNA ou o outro agente(s) tera-pêutico como aqui descrito. As partículas podem conter o a-gente(s) terapêutico em um núcleo circundado por um revesti-mento, incluindo, mas não limitado a, um revestimento enté-rico. O agente (s) terapêutico também pode ser disperso portodas as partículas. O agente(s) terapêutico também pode seradsorvido nas partículas. As "partículas podem ser de qual-quer ordem de cinéticas de liberação, incluindo liberação deordem zero, liberação de primeira ordem, liberação de segun-da ordem, liberação retardada, liberação sustentada, libera-ção imediata, e qualquer combinação das mesmas, etc. A par-tícula pode incluir, em adição ao agente(s) terapêutico,qualquer um dos materiais comumente usados na técnica defarmácia e medicina, incluindo, mas não limitado a, materialerodível, não-erodivel, biodegradável, ou não-biodegradávelou suas combinações. As partículas podem ser microcápsulasque contêm o siRNA em uma solução ou em um estado semi - só-lido. As partículas podem ser de virtualmente qualquer forma.

Ambos materiais poliméricos não-biodegradáveis ebiodegradáveis podem ser usados na fabricação de partículaspara liberação de agente (s) terapêutico. Tais polímeros po-dem ser polímeros naturais ou sintéticos. O polímero é sele-cionado baseado no período de tempo sobre o qual é desejadaliberação. Polímeros bioadesivos de particular interesse in-cluem hidrogéis bioerodíveis descritos por H.S. Sawhney,C.P. Pathak e J.A. Hubell em Macromolecule, (1993) 26:581-587, os ensinamentos do qual são aqui incorporados. Estesincluem ácidos poli hialurônicos, caseína, gelatina, gluti-na, polianidridos, ácido poli acrílico, alginato, quitosano,poli (metacrilato de metila), poli (metacrilato de etila),poli (metacrilato de butila), poli (metacrilato de isobuti-la), poli (metacrilato de hexila), poli (metacrilato de iso-decila), poli (metacrilato de laurila), poli (metacrilato defenila), poli (acrilato de metila), poli (acrilato de iso-propila), poli (acrilato de isobutila), e poli (acrilato deoctadecila).O agente(s) terapêutico pode estar contido em sis-temas de liberação controlada. 0 termo "liberação controla-da" é pretendido referir-se a qualquer formulação contendodroga onde a maneira e perfil de liberação de droga a partirda formulação são controlados. Isto refere-se a formulaçõesde liberação imediata assim como não-imediata, com formula-ções de liberação não-imediata incluindo mas não limitadas aformulações de liberação sustentada e liberação retardada. 0termo "liberação sustentada" (também referida como "libera-ção estendida") é usado em seu sentido convencional para re-ferir-se a uma formulação de droga que proporciona gradualliberação de uma droga sobre um período estendido de tempo,e que preferivelmente, embora não necessariamente, resultaem níveis substancialmente constantes no sangue de uma drogasobre um período de tempo estendido. 0 termo "liberação re-tardada" é usado em seu sentido convencional para referir-sea uma formulação de droga na qual há um retardo de tempo en-tre administração da formulação e a liberação da droga apartir da mesma. "Liberação retardada" pode ou não envolvergradual liberação de droga sobre um período de tempo esten-dido, e assim pode ou não ser "liberação sustentada".

Uso de um implante de liberação sustentada de lon-go termo pode ser particularmente apropriado para tratamentode condições crônicas. Liberação de "longo termo", como aquiusado, significa que o implante é construído e arranjado pa-ra liberar níveis terapêuticos do ingrediente ativo por pelomenos 7 dias, e preferivelmente 30-60 dias. Implantes de li-beração sustentada de longo termo são bem conhecidos por a-queles versados na técnica e incluem alguns dos sistemas deliberação descritos acima.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos exem-plos que seguem, os quais não devem ser construídos como Ii-mitantes. Os inteiros conteúdos de todas as referências (in-cluindo referências de literatura, patentes expedidas, pedi-dos de patente publicados, e pedidos de patente co-pendentes) citados por todo este pedido de patente são aquiexpressamente incorporados por referência.

Exemplos

Exemplo 1

Preparação de Espécies de RNA de Fita simples efita dupla

Uma série de pares de oligo ribonucleotídeos defita simples sintéticos (ssORN) selecionados para uso comosiRNA derivado de seqüências de genes Lamin AC e MAPK2(Erk2)humanos, foram preparados usando técnicas e reagentes con-vencionais. Para uso como siRNA de fita dupla, membros defita simples de cada par foram anelados sob apropriadas con-dições térmicas, seguido por isolamento usando HPLC de siRNAde fita dupla a partir de ssORN residual. Seqüências sãolistadas na Tabela 1, onde cada nucleotídeo é um ribonucleo-tídeo não-modifiçado e cada ligação inter-nucleotídeo é fos-fodiéster, exceto quando indicado. Será apreciado que estru-turas de siRNA de fita dupla incluíram 0-2 nucleotídeos de-semparelhados (isto é, projeções de fita simples) em uma ouambas extremidades.

Tabela I .Seqüências de RNA para siRNA<table>table see original document page 74</column></row><table>

*Nucleotídeos e/ou ligações de inter-nucleotídeosentre nucleotídeos mostradas em negrito foram modificadas eselecionadas a partir de: modificação açúcar 2' como aquidescrito e ligação estabilizada entre os dois nucleotídeosterminais 3'.

Exemplo 2

Modificação da Fita Senso de siRNA de Fita DuplaInibe Imunoestimulação através de siRNA

PBMC humanas foram isoladas de sangue integral deindivíduos saudáveis através de centrifugação de gradientede densidade Ficoll-Hypaque. PBMC isoladas foram então re-vestidas em cavidades individuais de placas de cultura mult-cavidades em apropriado meio de cultura. Vários siRNA de fi-ta dupla foram adicionados a cavidades individuais sobre umafaixa de concentração (ca. 2 nM a aproximadamente 0,5 μΜ) ,na presença de DOTAP, e as células foram incubadas por 24horas. Sobrenadantes de cultura foram colhidos seguindo aincubação e ensaiados para IFN-alfa e IL-12p40 usando ELISAapropriado. Os vários siRNA de fita dupla testados foramMAPK2, MAPK2 Exp2 7, MAPK2 Exp30, Lamin AC, Lamin AAC Exp27,e Lamin AC Exp30. Resultados são mostrados na Fig. 1. dadossão apresentados como médias + /- SEM.

Como mostrado na Fig. 1, inclusão de nucleotideostendo modificação açúcar 2' na fita senso destes siRNA im-pressionantemente e significantemente reduziu as quantidadesde IFN-alfa e, especialmente, IL-12p40 secretadas por PBMCapós 24 horas de incubação com siRNA, comparado a controle.

Exemplo 3

Modificação da fita senso de siRNA de fita dupla ésuficiente para inibir imunoestimulação através de siRNA

PBMC humanas foram isoladas e revestidas em placasde cultura multicavidades como no Exemplo 2. Várias espécies20 de RNA de fita simples e fita dupla foram adicionadas a ca-vidades individuais sobre uma faixa de concentração (aproxi-madamente 2 nM a aproximadamente 0,5 μΜ) , na presença deD0TAP, e as células foram incubadas por 24 horas. Sobrena-dantes de cultura foram colhidos seguindo a incubação e en-25 saiados para IFN-alfa e IL-12p40 usando ELISA apropriado.Experimentos foram desenhados para compararção de siRNA defita dupla (s:as) a correspondente RNA de fita simples sensoe anti-senso individual. Os vários siRNA de fita dupla tes-tados foram MAPK2, MAPK2 Exp27, MAPK2 Exp30, Lamin AC, Lami-na AC Exp27, e Lamin AC Exp30. Os vários RNA de fita simplestestados foram MAPK2 s, MAPK2 as, MAPK2 Exp27 s, MAPK2 Exp27as, MAPK2 Exp30 s, MAPK2 Exp30 as, Lamin AC s, Lamin AC as,Lamin AC Exp27 s, Lamin AC Exp27 as, Lamin AC Exp30 s, e La-min AC Exp30 as. Resultados são mostrados na Fig. 2. Dadossão apresentados como média + /- SEM.

Como mostrado na Fig. 2, inclusão de nucleotideostendo modificação açúcar 2' na fita senso deste siRNA im-pressionante e significantemente reduziu as quantidades deIFN-alfa e, especialmente, IL-12p40 secretadas por PBMC após24 horas de incubação com siRNA de fita dupla ou fita sensofita simples sozinho, comparado a controle. Em contraste,fitas anti-senso modificadas sozinhas permaneceram fortemen-te imunoestimuladoras. Estas mesmas fitas anti-senso, quandoapresentadas no contexto de siRNA de fita dupla, entretanto,foram muito menos imunoestimuladoras, consistente com a no-ção de que modificação envolvendo a fita senso sozinha é ne-cessária e suficiente para reduzir o potencial imunoestimu-lador de siRNA de fita dupla.

Exemplo 4

siRNA modificado com reduzido potencial imunoesti-mulador retém propriedades de silenciamento de gene

De modo a avaliar as propriedades de silenciamentode gene de siRNA modificado, PBMC humanas isoladas e culti-vadas como descrito no Exemplo 2 são ensaiadas para trans-critos de MAPK2 e lamin AC usando processo de cadeia polime-rase - transcriptase reversa quantitativo com apropriadospares iniciadores para cada transcrito sendo sondado. Trans-critos para um gene doméstico também são medidos para norma-lizar medições. Western blotting e imunocitoquímica são usa-dos para confirmar correspondente diminuição em proteínaMAPK2 e níveis de transcrito de lamin AC são reduzidos emuma maneira dependente de dose baseado na concentração desiRNA, e, significantemente, para grau similar para siRNAmodificado e correspondente siRNA controle.

Exemplo 5

Outras modificações de açúcar 2' de nucleotídeo nafita senso de siRNA reduzem imunoestimulação e preservam si-lenciamento de gene

Adicionais siRNA são sintetizados com qualquer umadas seguintes várias modificações de açúcar 2' de pelo menosum nucleotídeo na fita senso do siRNA: 2'-0-metila, 2'-desoxi, 2'-flúor-2'-desoxi, 2'-amino-2'-desoxi, 2'-metoxietila (MOE), 2'-0-alila, 2'-propinila, 2'-amino propargila,2'-0-(3-amino propila), 2'-0-propila, 2'-0-butila, ou gene-ricamente 2'-0-alquila, 2'-O-alquenila, e 2'-O-alquinila. Emadição, ácidos nucléicos fechados (LNA) e arabinosídeo sãousados. As várias modificações açúcar 2' são inteorudizdasem várias posições e vários números ao longo da fita senso.Efeitos de silenciamento de gene e imunoestimuladores sãoavaliados em uma maneira similar àquela descrita em Exemplos2-4 acima.

Exemplo 6

Inclusão de ligações de inter-nucleotídeos estabi-lizantes em fita sensoAdicionais siRNA incorporando qualquer uma das vá-rias modificações açúcar 2' de pelo menos um nucleotideo nafita senso do siRNA são sintetizados com pelo menos uma dequalquer das seguintes ligações de inter-nucleotideos na fi-ta senso: tioformacetal, fosforotioato, metil fosfonato, bo-rano fosfonato, formacetato, e outros análogos defosfo (comodescrito em Uhlmann and Peyman, 1993, Oligonucleotide ana-Iogs containing dephospho internucleotide linkages, Methodsin Molecular Biology, 20:355, Humana Press, o inteiro conte-údo do qual é aqui incorporado por referência) . As váriasmodificações de ligação inter-nucleotideos e açúcar 2' sãointroduzidas em várias posições e vários números ao longo defita senso. Efeitos de silenciamento de gene e imunoestimu-ladores são avaliados em uma maneira similar àquela descritaem Exemplos 2-4 acima.

Equivalentes

0 relatório descritivo anterior é considerado sersuficiente para permitir aqueles versados na técnica prati-carem a invenção. A presente invenção não é para ser limita-da em escopo pelos exemplos providos, uma vez que os exem-plos são pretendidos como uma simples ilustração de um as-pecto da invenção e outras realizações funcionalmente equi-valentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modifi-cações da invenção em adição àquelas aqui mostradas e des-critas tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na téc-nica a partir da descrição anterior e caem dentro do escopodas reivindicações apostas. As vantagens e objetos da inven-ção não são necessariamente abrangidas por cada realizaçãoda invenção.<110> Coley Pharmaceutical Group, Inc.Qiagen GmbH

<120> "Modulação de propriedades imunomoduladoras de ácido ribonucléico interferentepequeno (siRNA) através de modificação de nucleotídeo"

<130> C1041.70049

<150> OS 60/717,597

<151> 2005-09-16

<160> 10

<170> PatentXn version 3.2

<210> 1

<211> 21

<2'12> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> OIigonucIeotide sintético<220> .

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<223> Oligonucleotídeo sintético

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Claims (23)

1. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de compre-ender um ácido ribonucléico interferente pequeno de fita du-pla (siRNA) tendo uma fita senso e uma fita anti-senso, cadafita tendo uma extremidade 5' e uma extremidade 3' , onde afita anti-senso é complementar para uma seqüência alvo e on-de a fita senso compreende pelo menos um nucleotideo modifi-cado tendo um açúcar com uma modificação 2', com a condiçãode que o nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modifi-cação 2' não é um ácido nucléico fechado (LNA) ou um nucleo-tideo 2'-0-metila.

2. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fa-to de reduzir a expressão de um gene tendo uma seqüência al-vo, compreendendo uma quantidade eficaz de um ácido ribonu-cléico interferente pequeno de fita dupla (siRNA) tendo umafita senso e uma fita anti-senso, cada fita tendo uma extre-midade 5' e uma extremidade 3' , onde a fita anti-senso écomplementar à seqüência alvo e onde a fita senso compreendepelo menos um nucleotideo modificado tendo um açúcar com umamodificação 2', com a condição de que o nucleotideo modifi-cado tendo o açúcar com a modificação 2' não é um ácido nu-cléico fechado (LNA) ou um nucleotideo 2'-0-metila, para re-duzir a expressão do gene tendo a seqüência alvo.

3. Processo in vitro para reduzir o potencial imu-noestimulador de um ácido ribonucléico interferente pequenode fita dupla (siRNA), o dito siRNA tendo uma fita senso euma fita anti-senso, cada fita tendo uma extremidade 5' euma extremidade 3' , onde a fita anti-senso é complementar àuma seqüência alvo, o processo CARACTERIZADO pelo fato decompreender introdução na fita senso do siRNA de pelo menosum nucleotideo modificado tendo um açúcar com uma modifica-ção 2' , com a condição de que o nucleotideo modificado tendoo açúcar com a modificação 2' não é um ácido nucléico fecha-do (LNA) ou um nucleotideo 2'-0-metila.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, oua composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADAS pelo fato de que a fita senso compreende so-mente um nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modifi-cação 2' .

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, oua composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADAS pelo fato de que a fita senso compreende umapluralidade de nucleotideos modificados tendo o açúcar com amodificação 2', onde cada nucleotideo modificado tendo o a-çúcar com a modificação 2' é selecionado independentementede qualquer outro.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a modificação 2' é selecionada do grupoconsistindo em 2'-0-alquila, 2'-0-alquenila, e 2'-0-alquinila, com a condição de que 2'-0-alquila exclui 2'-O-metila.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a modificação 2' é selecionada do grupoconsistindo em 2'-metoxi etila, 2'-0-alila, 2'-propinila,-2'-amino propargila, 2' -0-(3-amino propila), 2'-0-propila, e-2' -0-butila.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a modificação 2' é selecionada do grupoconsistindo em 2'-deoxi, 2'-flúor, e 2'-amino.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a modificação 2' é 2'-flúor.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a modificação 2' é selecionada de 2'-O-alquenila, 2'-O-alquinila, 2'-metoxi etila, 2'-amino propar-gila, 2'-O-(3-amino propila), e 2'-amino.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1,ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-2, CARACTERIZADAS pelo fato de que o pelo menos um nucleotí-deo modificado tendo o açúcar com a modificação 2' ocorre naextremidade 5' da fita senso.

12. Composição, de acordo com a reivindicação If oua composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADAS pelo fato de que o pelo menos um nucleotideomodificado tendo o açúcar com a modificação 2' ocorre na ex-tremidade 3' da fita senso.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1,ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-2, CARACTERIZADAS pelo fato de que o pelo menos um nucleotí-deo modificado tendo o açúcar com a modificação 2' ocorreinterno com relação à extremidade 5' e à extremidade 3' dafita senso.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1,ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-2, CARACTERIZADAS pelo fato de que a fita senso compreendepelo menos um nucleotideo modificado tendo o açúcar com amodificação 2' na extremidade 5' da fita senso e pelo menosum nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modificação-2' na extremidade 3' da fita senso.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a fita senso tem uma cadeia principal fos-fodiéster.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a fita senso tem uma cadeia principal esta-bilizada compreendendo pelo menos uma ligação de inter-nucleotideo estabilizada.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 1, acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, ouo processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOSpelo fato de que a fita senso tem uma cadeia principal esta-bilizada compreendendo pelo menos uma ligação de inter-nucleotideo estabilizada selecionada do grupo consistindo emtioformacetal, fosforotioato, metil fosfonato, borano fosfo-nato, e formacetato.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a introdução é introdução desomente um nucleotideo modificado tendo o açúcar com a modi-ficação 2' .

19. Processo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a introdução é introdução deuma pluralidade de nucleotideos modificados tendo o açúcarcom a modificação 2', onde cada nucleotideo modificado tendoo açúcar com a modificação 2' é selecionado independentemen-te de qualquer outro.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a introdução ocorre na extre-midade 5' da fita senso.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a introdução ocorre na extre-midade 3' da fita' senso.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a introdução ocorre internacom relação à extremidade 5' e à extremidade 3' da fita sen-so .

23. Processo, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a introdução ocorre na extre-midade 5' da fita senso e na extremidade 3' da fita senso.