KR20080047463A - 뉴클레오티드 변형에 의한 짧은 간섭 리보핵산(ｓｉｒｎａ)의 면역자극 특성의 조절 - Google Patents

뉴클레오티드 변형에 의한 짧은 간섭 리보핵산(ｓｉｒｎａ)의 면역자극 특성의 조절 Download PDF

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마리온 우르크
요르크 폴머
크리스티안 쉐터
마틴 베버
요안나 안드레오
스테판 피취
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콜리 파마슈티칼 게엠베하
키아겐 게엠베하
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Abstract

이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)은 그들의 유전자 침묵 효과를 유의하게 해치지 않으면서 그들의 면역자극 효과를 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 변형된 siRNA는 센스 가닥 상에 하나 이상의 2' 당 변형 및 임의로, 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 변형된 siRNA를 함유하는 조성물 및 변형된 siRNA를 제조하고 사용하는 방법을 개시한다. 새로이 및 이전에 특성화된 siRNA를 본 발명에 따른 변형을 포함하도록 합성할 수 있다.
짧은 간섭 리보핵산, 유전자 침묵, 면역자극, 변형, 2' 당 변형

Description

뉴클레오티드 변형에 의한 짧은 간섭 리보핵산 (ＳＩＲＮＡ)의 면역자극 특성의 조절 {MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES OF SHORT INTERFERING RIBONUCLEIC ACID (SIRNA) BY NUCLEOTIDE MODIFICATION}
리보핵산 (RNA)은 최근에 그의 새로 인지된 치료제로서의 가능성 때문에 광범한 관심을 받게 되었다. 예를 들어, 일반적으로 약 21-23개 뉴클레오티드 길이의 특정 서열-특이적 이중가닥 RNA가, RNA 간섭 (RNAi) 또는 전사후 유전자 침묵으로 불리는 과정에서 유전자 발현을 선택적인 방식으로 침묵시키기 위해 사용될 수 있음이 최근에 보고되었다. 상기 종류의 RNA 간섭에 사용된 이중가닥 RNA는 특히 소위 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 포함한다 (Hannon GJ (2002) Nature 418:244-51). 반대로, 서열-비특이적 이중가닥 RNA는 Toll-유사 수용체 3 (TLR3)을 통해 작용하여 면역자극 효과를 유도할 수 있음이 또한 최근에 보고되었다 (Alexopoulou L et al. (2001) Nature 413:732-8). 또한, 일반적으로 구아노신 (G) 및 우리딘 (U)을 포함하고, 특히 특정 서열 모티프를 포함하는 특정 단일가닥 RNA가 또한 면역자극성임이 또한 최근에 보고되었다 (립포드 (Lipford) 등의 US 2003/0232074 A1).
siRNA를 임상 용도로 개발하기 위한 노력에서, 적어도 일부 siRNA가 또한 면역자극성임이 최근에 명백해졌다. 일부 경우에, 유전자 침묵 및 면역자극을 모두 갖는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 다른 상황에서, 대신에 면역자극을 동반하 지 않으면서 유전자 침묵을 갖는 것이 바람직할 수 있다.
<발명의 개요>
본 발명은 변형을 갖는 생성되는 siRNA가 변형이 없는 대응하는 siRNA보다 면역자극성이 더 작도록, 센스 가닥 내의 특정 뉴클레오티드 변형을 특징으로 하는 siRNA에 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 센스 가닥에서 변형은 표적 유전자를 침묵시키는 siRNA의 능력에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 각각의 가닥이 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이고, 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 (locked) 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 각각의 가닥이 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)의 면역자극 능력을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이다. 상기 방법은 siRNA의 센스 가닥 내로 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 측면에 따른 방법은 표적 서열을 갖는 유전자를 포함하는 세포를, 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 유효량의, 각각의 가닥이 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이고, 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니다.
한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 하나의 변형된 뉴클레오티드만을 포함하는 센스 가닥이다.
한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥이고, 여기서 2' 변형을 갖는 당을 갖는 각각의 변형된 뉴클레오티드 는 서로 독립적으로 선택된다.
한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-O-알킬, 2'-O-알케닐, 및 2'-O-알키닐로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 단, 2'-O-알킬은 2'-O-메틸을 제외한다.
한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-프로피닐, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-프로필, 및 2'-O-부틸로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 및 2'-아미노로 이루 어지는 군 중에서 선택된다.
한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-플루오로이다.
한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-O-알케닐, 2'-O-알키닐, 2'-메톡시에틸, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 및 2'-아미노 중에서 선택된다.
한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 말단에서 발생한다. 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 임의의 오버행 (overhang)을 제외하고는 센스 가닥의 5' 말단에서 발생한다.
한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 3' 말단에서 발생한다. 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 임의의 오버행을 제외하고는 센스 가닥의 3' 말단에서 발생한다.
한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 관하여 내부에서 발생한다. 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 임의의 오버행을 제외하고는 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 관하여 내부에서 발생한다.
한 실시태양에서, 센스 가닥은 센스 가닥의 5' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를, 센스 가닥의 3' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시태양에서, 센스 가닥은 임의의 오버행을 제외하고는 센스 가닥의 5' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를, 센스 가닥의 3' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시태양에서, 센스 가닥은 포스포디에스테르 주쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 센스 가닥은 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는다.
한 실시태양에서, 센스 가닥은 티오포름아세탈, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스포네이트, 및 포름아세테이트로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는다.
도 1은 인간 말초혈 단핵세포 (PBMC)에 의한 사이토킨 생산을 보여주는 4개의 그래프이다. 표시된 농도의 표시된 이중가닥 siRNA (센스 (s):안티센스 (as))를 DOTAP의 존재 하에 인간 PBMC와 함께 인큐베이션하고, IFN-알파 (pg/ml; 패널 A 및 C) 또는 IL-12p40 (pg/ml; 패널 B 및 D)의 양을 상등액에서 24 h 후에 ELISA에 의해 결정하였다. 패널 A 및 B에 대한 RNA 서열은 다음과 같다: MAPK2 s, 서열 1; MAPK2 as, 서열 2; MAPK2 Exp27 s, 서열 3; MAPK2 Exp27 as, 서열 4; MAPK2 Exp30 s, 서열 3; MAPK2 Exp30 as, 서열 5. 패널 C 및 D에 대한 RNA 서열은 다음과 같다: Lamin AC s, 서열 6; Lamin AC as, 서열 7; Lamin AC Exp27 s, 서열 8; Lamin AC Exp27 as, 서열 9; Lamin AC Exp30 s, 서열 8; Lamin AC Exp30 as, 서열 10.
도 2는 인간 PBMC에 의한 사이토킨 생산을 보여주는 12개의 그래프이다. 표시된 농도의 표시된 종의 RNA (이중가닥 siRNA (센스 (s):안티센스 (as)); 센스 가닥 단독 (s); 및 안티센스 가닥 단독 (as))를 DOTAP의 존재 하에 인간 PBMC와 함께 인큐베이션하고, IFN-알파 (pg/ml; 패널 A 및 C) 또는 IL-12p40 (pg/ml; 패널 B 및 D)의 양을 상등액에서 24 h 후에 ELISA에 의해 결정하였다. 패널 A 및 B에 대한 RNA 서열은 다음과 같다: MAPK2 s, 서열 1; MAPK2 as, 서열 2; MAPK2 Exp27 s, 서열 3; MAPK2 Exp27 as, 서열 4; MAPK2 Exp30 s, 서열 3; MAPK2 Exp30 as, 서열 5. 패널 C 및 D에 대한 RNA 서열은 다음과 같다: Lamin AC s, 서열 6; Lamin AC as, 서열 7; Lamin AC Exp27 s, 서열 8; Lamin AC Exp27 as, 서열 9; Lamin AC Exp30 s, 서열 8; Lamin AC Exp30 as, 서열 10.
짧은 간섭 RNA (siRNA) 기술을 포함한 RNA 간섭은 특이적 유전자의 하향-조절을 위한 중요한 도구가 되었고, siRNA 치료제는 이미 개발 중이다. 합성 siRNA는 일반적으로 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 21-23개 뉴클레오티드 길이의 이중가닥 올리고리보뉴클레오티드로 이루어진다. 그러나, siRNA의 특이적 유전자-표적 효과 외에도, 상기 기술의 비특이적 효과가 최근에 설명되었다. siRNA는 특정 사이토킨, 예를 들어 타입 I 및/또는 타입 II 인터페론과 IL-12, IL-6 및/또는 TNF-알파 생산의 상향-조절을 포함하여 선천적인 면역계의 비특이적 활성화를 유도하는 것으로 나타났다. 상기 효과의 기원은 siRNA에 의한 Toll-유사 수용체, 예를 들어 TLR7, TLR8 및/또는 TLR3의 활성화인 것으로 생각된다.
면역계의 활성화는 종종 목적하는 효과를 갖지만, RNA 침묵의 문맥에서, 면역계의 비특이적 활성화는 siRNA의 실제 작용 방식을 간섭할 수 있고, 처리 결과를 유의하게 변경할 수 있다.
하기 설명되는 예에서, 특이적인 위치에서 2' 뉴클레오티드 당의 특정 변형을 특징으로 하는 특정 siRNA 구성체의 면역자극 활성은 놀랍게도 그들의 유전자 침묵 특성의 유의한 손상 없이 면역자극 특성이 감소하는 것으로 밝혀졌다. MAPK2 (Erk2) 및 Lamin AC 유전자의 서열로부터 유래된 siRNA (표 1)는 양이온성 지질 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모늄 (DOTAP; 도 1)의 존재 하에 인간 PBMC와 함께 인큐베이션할 때 유의한 사이토킨 생산을 유도하였다. 사이토킨의 유도는 siRNA의 안티센스 및/또는 센스 가닥에 존재하는 면역자극성 서열에 의해 유도되는 것으로 생각된다.
본 발명에 따라 센스 및 안티센스 가닥 내의 화학적 변형이 siRNA의 면역자극 활성을 유의하게 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 센스 가닥의 5' 및 3' 말단에 2' 당 변형 (도 1) 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 추가의 2' 당 변형의 도입하면 siRNA의 IL-12p40 및 TNF-알파 생산이 완전히 폐지되고, IFN-알파 생산이 유의하게 감소되었다.
놀랍게도, 본 발명에 따라, 도입된 변형은 센스 가닥 (s, 단일가닥 RNA), 및 센스 및 안티센스 가닥을 함유하는 이중가닥 siRNA의 면역자극 활성에만 영향을 미치고, 여전히 대부분의 면역자극 활성을 보유하는 안티센스 가닥 (as, 단일가닥 RNA)에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, dsRNA 또는 siRNA의 자극 활성의 억제는 센스 가닥을 변형시키고 안티센스 가닥을 변형시키지 않음으로써 가능한 것으로 보인다. 안티센스 가닥만이 siRNA 침묵 효과를 담당하여, 면역자극을 제어하기 위한 화학적 변형이 안티센스 가닥에 영향을 미치지 않고 따라서 침묵 효과에 영향을 미치지 않으면서 센스 가닥 내로 도입될 수 있는 것으로 생각되므로 이는 중요하다.
본 발명에 따르면, 특히, 잠재적인 면역자극성 서열에서가 아니라 바로 5' 및 3' 말단에서만 도입된 RNA 센스 가닥의 변형은 또한 놀랍게도 면역자극 활성의 강한 또는 완전한 억제를 계속 일으키는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 따르면, 면역자극성 단일 가닥에서 단일 2' 변형도 면역 반응을 강하게 손상시키는 것이 놀랍게도 밝혀졌고, 이는 센스 가닥에서 단일한 상기 변형이 siRNA 또는 dsRNA의 면역자극 활성에 영향을 미치기에 충분할 수 있음을 나타낸다.
호르눙 (Hornung) 등 (Nature Medicine 11: 263-70, 2005)의 최근의 문헌에서, 3' 말단에서 면역자극성 모티프의 잠금 핵산 (LNA) 변형이 siRNA의 면역자극 특성을 감소시켰음이 보고되었다. 호르눙 등의 보고와 반대로, 본 발명에 따르면, 예상외로, 변형이 면역자극성 모티프 내에 있을 필요가 없고, 비-자극성인 센스 가닥만의 변형이 면역자극 활성을 억제하기 위해 충분한 것으로 밝혀졌다.
한 측면에서, 본 발명은 일반적으로 특정 변형을 포함하는 이중가닥 siRNA를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특이적 변형은 변형이 없는 대응하는 siRNA에 비해 siRNA의 면역자극 능력을 감소시킨다. 본원에서 사용될 때 siRNA는 약 21-23개 뉴클레오티드의 길이, 단일가닥 센스 (s) 가닥 및 단일가닥 안티센스 (as) 가닥을 특징으로 하는 특정 종류의 단리된 이중가닥 리보핵산 (RNA) 분자를 나타낼 것이고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖고, 상기 RNA 분자는 표적 서열에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포 내로 전달될 때 세포 내의 표적 뉴클레오티드 서열 (및 코딩된 단백질)의 양을 감소시킨다.
siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 엄격히 또는 적어도 실질적으로 서로에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 가져서, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 적합한 조건 하에 안정한 이중체 구조를 형성할 수 있다. 특정 실시태양에서, 두 가닥의 말단 중 하나 또는 둘은 이중체 구조 내의 다른 가닥의 대응하는 말단(들)을 넘어 연장할 수 있어서, siRNA의 하나 또는 두 말단에서 짧은 오버행 서열 (일반적으로 1-2개 뉴클레오티드 길이)을 허용한다.
siRNA는 일반적으로 RNA에 공통적인 공식적인 (canonical) 핵염기, 예를 들어, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실을 갖지만 그로 제한되지 않는 뉴클레오티드 하위유닛을 포함할 것이다. 티민 및 하이포잔틴을 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 핵염기가 또한 일부 실시태양에서 존재할 수 있다.
임의의 RNA 분자를 참조하여 본원에서 사용될 때, 면역자극 능력은 면역 반응을 자극하는, 예를 들어, 면역계의 세포를 자극하여 증식, 분화하도록 활성화시키거나, 면역 세포 활성화와 연관된 분비된 산물의 발현을 증가시키거나, 면역 세포 활성화와 연관된 세포 표면 마커 또는 동시자극성 분자의 발현을 증가시키거나, 또는 그의 임의의 조합의 RNA 분자의 능력을 나타낸다. 면역 세포 활성화와 연관된 분비된 산물은 당업계에 잘 공지되고, 비제한적으로 사이토킨, 케모카인 및 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 특징으로서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니다. 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 단일 변형된 뉴클레오티드만을 포함할 수 있거나, 각각 서로 독립적으로 선택되는 2' 변형을 갖는 당을 갖는 2개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 한 실시태양에서, 센스 가닥은 각각 서로 독립적으로 선택되는 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드만을 포함한다. 보다 전형적으로, 센스 가닥은 각각 서로 독립적으로 선택되는 2' 변형을 갖는 당을 갖는 1 내지 6개의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 2' 변형을 갖는 당을 갖는 하나 초과의 변형된 뉴클레오티드가 존재하는 경우, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 그들의 수가 허용할 때 인접 뉴클레오티드로서, 비-인접 뉴클레오티드로서, 또는 인접 및 비-인접 뉴클레오티드의 조합으로서 발생할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 뉴클레오티드는 포스페이트기에, 및 치환 피리미딘 (예를 들어, 시토신, 티민, 또는 우라실) 또는 치환 퓨린 (예를 들어, 아데닌 또는 구아닌)인 교환가능한 유기 염기 (예를 들어, 핵염기)에 연결된 당 (예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스)을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 그들의 핵염기로서 시토신, 티민, 우라실, 아데닌, 또는 구아닌을 갖는 뉴클레오티드는 각각 그들의 통상적인 1 문자 부호인 C, T, U, A, 또는 G로 표시된다. 리보뉴클레오티드는 공식적인 C, U, A, 및 G 리보뉴클레오티드를 포함하지만 그로 제한되지 않는다.
임의의 종의 RNA에 관하여 본원에서 사용될 때, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 당이 리보뉴클레오티드에 대해 비-표준인 2' 위치에서 치환체를 갖는 뉴클레오티드를 나타낸다. 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당은 2' 데옥시리보스 당이어서, 대응하는 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-O-알킬, 2'-O-알케닐, 및 2'-O-알키닐로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 단, 2'-O-알킬은 2'-O-메틸을 제외한다. 한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-프로피닐, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-프로필, 및 2'-O-부틸로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-데옥시, 2'-플루오로-2'-데옥시 (즉, 2'-플루오로), 및 2'-아미노-2'-데옥시 (즉, 2'-아미노)로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-플루오로이다. 한 실시태양에서, 2' 변형은 2'-O-알케닐, 2'-O-알키닐, 2'-메톡시에틸, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 및 2'-아미노 중에서 선택된다.
본원에서 사용될 때, 잠금 핵산 (LNA)은 리보스 고리가 2'-산소와 4'-탄소 사이의 메틸렌 연결에 의해 구속되는 RNA 유도체를 나타낸다 (Wahlestedt C et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:5633-8).
일반적으로, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥을 따라 어디에나 발생할 수 있다. 특히, 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 말단에서 발생한다. 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 3' 말단에서 발생한다. 한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에서 발생한다. 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 말단에서 발생할 필요가 없고, 대신 센스 가닥의 말단들 사이에, 즉, 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 관하여 내부에서 발생할 수 있다. 특정 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두에서 발생하고, 또한 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 관하여 내부에서 발생한다.
센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 모두의 뉴클레오티드 서열은 임의로 면역자극성 서열 또는 모티프를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-RURGY-3'이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 퓨린 리보뉴클레오티드를 나타내고 Y는 피리미딘 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 다양한 실시태양에서, 5'-RURGY-3'은 구체적으로 5'-GUGGU-3', 5'-GUGGC-3', 5'-GUAGU-3', 5'-GUAGC-3', 5'-AUGGU-3', 5'-AUGGC-3', 5'-AUAGU-3', 및 5'-AUAGC-3'을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-GUAGUGU-3'이다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-GUUGB-3'이고, 여기서 B는 U, G, 또는 C를 나타낸다. 다양한 실시태양에서, 5'-GUUGB-3'은 구체적으로 5'-GUUGU-3', 5'-GUUGG-3', 및 5'-GUUGC-3'을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-GUGUG-3'이다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-GUGUUUAC-3'이다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-GUAGGCAC-3'이다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-CUAGGCAC-3'이다. 한 실시태양에서, 면역자극성 서열 또는 모티프는 5'-CUCGGCAC-3'이다.
한 실시태양에서, 센스 가닥이 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프를 포함할 때, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프 내에서 발생한다.
한 실시태양에서, 별법으로 및 유의하게, 센스 가닥이 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프를 포함할 때, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프 밖에서 발생한다. 한 실시태양에서, 센스 가닥이 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프를 포함하고, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드가 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프 밖에서 발생할 때, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프에 바로 인접하여 발생한다. 한 실시태양에서, "바로 인접한"은 면역자극성 서열 또는 모티프에 관하여 바로 5'에 존재한다는 것이다. 한 실시태양에서, "바로 인접한"은 면역자극성 서열 또는 모티프에 관하여 바로 3'에 존재한다는 것이다. 센스 가닥이 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프를 포함하고, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드가 확인가능한 면역자극성 서열 또는 모티프 밖에서 발생하는 다른 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 면역자극성 서열 또는 모티프로부터 적어도 하나의 뉴클레오티드가 제거되어 발생한다. 다양한 실시태양에서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드와 면역자극성 서열 또는 모티프 사이의 뉴클레오티드의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18일 수 있다.
상기에서 규정된 바와 같은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 임의의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥의 임의의 뉴클레오티드는 임의로 포스페이트기를 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 센스 가닥은 포스포디에스테르 주쇄를 갖고, 즉, 센스 가닥의 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결에 의해 하나가 다음 뉴클레오티드에 연결된다. 상기 포스포디에스테르 연결 및 포스포디에스테르 주쇄는 자연에서 발생하는 것처럼 핵산 분자에 전형적인 것이고, 생체 내에서 뉴클레아제 절단에 대해 비교적 감수성이다.
한 실시태양에서, 센스 가닥은 안정화된 주쇄를 갖는다. 안정화된 주쇄는 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하여, 포스포디에스테르 주쇄에 비해 생체내 또는 시험관내 뉴클레아제 절단에 대해 비교적 저항성인 주쇄를 생성시킨다. 한 실시태양에서, 안정화된 주쇄는 안정화된 뉴클레오티드간 연결만을 포함한다. 한 실시태양에서, 안정화된 뉴클레오티드간 연결은 티오포름아세탈, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스포네이트, 및 포름아세테이트로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 안정화된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
본 발명의 siRNA는 예를 들어, 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 사용하는 자동화 기술 및 장치를 이용하여 합성할 수 있다. 다른 핵산 주쇄 변형 및 치환을 만들기 위한 방법이 설명되었고, 본 발명에서 사용을 위해 고려된다 (Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165).
센스 및 안티센스 가닥은 따로 합성될 수 있다. 별법으로, 센스 및 안티센스 가닥은 단일 구성체로서 합성된 후, 개재하는 또는 외래의 뉴클레오티드 또는 연결 잔기를 잘라내거나 달리 제거하도록 처리될 수 있다. 어떠한 방식으로 합성되든지, 목적하는 siRNA 또는 성분 센스 및 안티센스 가닥은 바람직하게는 외래의 합성 시약으로부터 단리되고, 임의로, 사용 전에 정제된다.
본 발명의 조성물은 siRNA의 사용을 요구하는 임의의 상황에서 유용한 것으로 생각된다. 따라서, 표적 서열은 임의의 적합한 표적 서열일 수 있다. siRNA의 사용을 요구하는 임상 상황은 비제한적으로 암에 걸린 대상체의 치료, 감염성 질병에 걸린 대상체의 치료, 자가면역 질병에 걸린 대상체의 치료, 이식 거부가 있는 대상체의 치료, 및 알레르기 또는 천식에 걸린 대상체의 치료를 포함한다. 당업자는 적합한 표적 서열을 선택하고 그 표적에 대한 RNA 간섭의 효능을 평가하는 방법에 친숙할 것이다. 특정 표적에 대한 RNA 간섭의 효능을 평가하기 위한 방법은, 그 기술이 예를 들어 증폭 프라이머 및 항체의 적절한 선택을 통해 특정 표적에 적합하게 개조된다면, 뉴클레오티드 및 단백질 분석의 표준 기술, 예를 들어 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR), 면역블롯팅, 및 효소-연결 면역흡수 분석 (ELISA)을 사용하여 달성할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 siRNA의 면역자극 능력을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 이전에 특성화된 siRNA의 면역자극 능력을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 방법은 예를 들어, 처음으로 siRNA을 설계하고 합성하는데 있어서 이전에 특성화되지 않은 siRNA의 면역자극 능력을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥 siRNA의 센스 가닥 내로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니다. 본 발명의 본 측면에 관하여 본원에서 사용될 때, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 도입하는 것은 기존 또는 천연 발생 뉴클레오티드를 상기 정의한 바와 같은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드로 치환하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 기존 siRNA에서, 안티센스 가닥이 센스 가닥 상의 C에 대해 요구되는 G를 갖는 경우, 데옥시시티딘 (dC)이 C 대신에 치환된다. 따라서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 센스 가닥 내로 도입하는 단계는 대개 센스 가닥의 합성을 설계하고 수행하는 것을 포함하고, 상기 방식에서, 목적하는 변형된 뉴클레오티드는 생성되는 센스 가닥 내로 목적하는 위치에서 포함된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 siRNA를 사용하여 RNA 간섭을 실시하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용될 때, 한 실시태양에서, 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키는 것은 특정 관심 유전자로부터 전사된 메신저 RNA의 양을 감소시키는 것을 나타낸다. 또한 본원에서 사용될 때, 한 실시태양에서, 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키는 것은 특정 관심 유전자에 의해 코딩된 세포 내에 존재하는 단백질 산물의 양을 감소시키는 것을 나타낸다. 본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 표적 서열을 갖는 유전자를 포함하는 세포를, 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키기 위해 유효량의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이고, 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니다. 본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 시험관 내에서 및 생체 내에서 수행될 수 있다. 상기 방법을 생체 내에서 수행할 때, 접촉 단계는 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 수반한다.
본 발명의 siRNA는 암에 걸린 대상체, 감염성 질병에 걸린 대상체, 자가면역 질병에 걸린 대상체, 알레르기가 있는 대상체, 및 천식에 걸린 대상체의 치료에 특히 유용할 수 있지만, 그로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때 "암"은 신체 장기 및 계통의 정상 기능을 저해하는 세포의 비제어된 성장을 나타낸다. 원래의 위치로부터 이동하여 중요한 장기에 도입되는 암은 궁극적으로 침범된 장기의 기능적 퇴화를 통해 대상체의 사망을 일으킬 수 있다. 조혈계 암, 예를 들어 백혈병은 대상체에서 정상 조혈 구획을 능가할 수 있어서, 조혈 실패 (빈혈, 저혈소판증 및 호중구감소의 형태로)를 야기하고 결국 사망을 유발한다.
본원에서 사용될 때, 암에 걸린 대상체는 검출가능한 암성 세포를 갖는 대상체를 나타낸다.
전이는 원발 종양으로부터 신체의 다른 부분으로 암 세포의 전파로부터 생성되는, 원발 종양 위치와 구분되는 암 세포의 구역이다. 원발 종양 덩어리의 진단 시점에, 대상체는 전이의 존재에 대해 모니터링될 수 있다. 전이는 특이적인 증상의 모니터링에 추가로 자기 공명 영상 (MRI) 스캔, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 계수, 간 기능 연구, 흉부 X-선 및 뼈 스캔의 단독 또는 조합 사용을 통해 가장 종종 검출된다.
암은 기저 세포 암종, 담관암; 방광암; 뇌 및 CNS 암; 유방암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합조직암; 소화기계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암; 상피내 신생물; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암 (예를 들어, 소세포 및 비-소세포); 호지킨 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암 (예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 신암; 호흡기계의 암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨기계의 암, 및 다른 암종 및 육종을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, "감염성 질병"은 감염성 미생물에 의한 표면적인, 국소적인 또는 전신적인 숙주의 침입으로부터 발생하는 장애를 나타낸다. 감염성 미생물은 세균, 바이러스, 기생충 및 진균을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 감염성 질병에 걸린 대상체는 감염성 유기체에 노출되고 체내에 급성 또는 만성의 검출가능한 수준의 유기체를 갖는 대상체를 나타낸다. 감염성 유기체에 대한 노출은 일반적으로 대상체의 외부 표면, 예를 들어 피부 또는 점막에서 발생하고/하거나 감염성 유기체에 의한 대상체의 외부 표면의 투과를 나타낸다.
인간에서 발견된 바이러스의 예는 다음의 것들을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 레트로비리대 (Retroviridae) (예, 인간 면역결핍증 바이러스, 예를 들어 HIV-1 (HTLV-III, LAVE, 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III으로도 불림); 및 다른 단리체, 예를 들어 HIV-LP); 피코르나비리대 (Picornaviridae) (예, 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스; 장내바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리대 (Calciviridae) (예, 위장염을 일으키는 균주); 토가비리대 (Togaviridae) (예, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리대 (Flaviridae) (예, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리대 (Coronaviridae) (예, 코로나바이러스); 랍도비리대 (Rhabdoviradae) (예, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대 (Filoviridae) (예, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae) (예, 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae) (예, 인플루엔자 바이러스); 붕가비리대 (Bungaviridae) (예, 한탄 바이러스, 붕가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나 비리대 (Arena viridae) (출혈열 바이러스); 레오비리대 (Reoviridae) (예, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대 (Birnaviridae); 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보비리대 (Parvoviridae) (파르보바이러스); 파포바비리대 (Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대 (Herpesviridae) (단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스); 폭스비리대 (Poxviridae) (천연두 바이러스, 우두 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리대 (Iridoviridae) (예, 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 미분류 바이러스 (예, 델타 간염의 병인체 (B형 간염 바이러스의 결함있는 위성체인 것으로 생각됨), 비-A형, 비-B형 간염의 병인체 (클래스 1 = 내부로 전염됨; 클래스 2 = 비경구로 전염됨 (즉, C형 간염); 노르워크 (Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스).
그람 음성 및 그람 양성 세균이 모두 척추동물에서 항원으로서 역할을 한다. 상기 그람 양성 세균은 파스퇴렐라 (Pasteurella) 종, 포도상구균 (Staphylococci) 종 및 연쇄상구균 (Streptococcus) 종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 그람 음성 세균은 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 및 살모넬라 (Salmonella) 종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 감염성 세균의 구체적인 예는 헬리코박터 파일로리스 (Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리 (Borelia burgdorferi), 폐렴 레지오넬라 (Legionella pneumophilia), 미코박테리움 (Mycobacterium) 종 (예, 결핵균 (M. tuberculosis), 조류형 결핵균 (M. avium), 세포내형 결핵균 (M. intracellulare), 엠. 칸사이 (M. kansaii), 엠. 고르도내 (M. gordonae)), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 임균 (Neisseria gonorrhoeae), 수막염균 (Neisseria meningitidis), 단구성 리스테리아 (Listeria monocytogenes), 화농연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 연쇄상구균), 무유성 연쇄상구균 (S. agalactiae) (그룹 B 연쇄상구균), 연쇄상구균 (녹색연쇄구균 (viridans)), 대변연쇄상구균 (S. faecalis), 소연쇄상구균 (S. bovis), 연쇄상구균 (혐기성 종), 폐렴연쇄상구균 (S. pneumoniae), 병원성 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 장내구균 (Enterococcus) 종, 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 탄저균 (Bacillus antracis), 디프테리아균 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종, 단독균 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 펄프리젠스 (Clostridium perfringens), 파상풍균 (Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 물토시다 (Pasturella multocida), 박테로이데스 (Bacteroides) 종, 푸소박테륨 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 모닐리포르미스 연쇄상간균 (Streptobacillus moniliformis), 매독균 (Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누 (Treponema pertenue), 렙토스피라, 리켓차 및 악티노마이세스 이즈라엘리 (Actinomyces israelli)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
진균의 예는 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 임미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더매티디티스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)를 포함한다.
다른 감염성 유기체 (즉, 원생생물)는 열원충 (Plasmodium) 종, 예를 들어 열대열원충 (P. falciparum), 사일열원충 (P. malariae), 난형열원충 (P. ovale) 및 삼일열원충 (P. vivax) 및 톡소포자충 (Toxoplasma gondii)을 포함한다. 혈액감염성 및(또는) 조직 기생충은 열원충종, 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 바베시아 디베르젠스 (B. divergens), 피부리슈만편모충 (Leishmania tropica), 리슈만종, 피하리슈만편모충 (L. braziliensis), 내장리슈만편모충 (L. donovani), 감비아파동편모충 (Trypanosoma gambiense) 및 로데시아파동편모충 (T. rhodesiense) (아프리카 수면병), 크루즈파동편모충 (Trypanosoma cruzi) (샤가스 (Chagas) 병) 및 톡소포자충을 포함한다.
다른 의학적 관련 미생물은 문헌에 광범하게 설명되었고, 예를 들어 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983]을 참조한다.
또한, 본 발명의 siRNA는 자가면역 질병을 치료하고 예방하기 위해 유용하다. 자가면역 질병은 대상체 자신의 항체가 숙주 조직과 반응하거나, 면역 효과기 T 세포가 내인성 자가 펩티드에 자가반응성이고 조직의 파괴를 일으키는 질병의 클래스이다. 따라서, 면역 반응은 자가 항원으로 불리는 대상체 자신의 항원에 대해 상승한다. 자가면역 질병은 류마티스성 관절염, 크론 (Crohn) 병, 다발 경화증, 전신 홍반성 루프스 (SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증 근무력증 (MG), 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 굳파스쳐 (Goodpasture) 증후군, 천포창 (예, 심상성 천포창), 그레이브 (Grave) 병, 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 혈소판감소 자색반, 항-콜라겐 항체가 있는 피부경화증, 혼합 결합조직병, 다발근육염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨 (Addison) 병, 자가면역-연관 불임, 사구체신염 (예, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 수포성 유천포창, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 인슐린 저항성, 및 자가면역 당뇨병을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, 알레르기는 특정 물질 (알레르겐)에 대한 후천적인 과민성을 나타낸다. 알레르기성 질환에는 습진, 알레르기성 비염 또는 코감기, 알레르기성 결막염, 기관지 천식, 담마진 (두드러기) 및 식품 알레르기, 아토피 피부염을 포함하는 다른 아토피 질환; 아나필락시스; 약물 알레르기; 및 혈관부종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 알레르기성 질병은 비염 (건초열), 천식, 담마진, 및 아토피 피부염을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, 알레르기가 있는 대상체는 알레르겐에 반응하여 알레르기 반응을 일으키는 대상체이다.
알레르겐은 감수성 대상체에서 알레르기 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질 (항원)을 나타낸다. 알레르겐의 목록은 무궁무진하고, 꽃가루, 곤충독, 동물 비듬 먼지, 진균 포자 및 약물 (예, 페니실린)을 포함한다. 천연 동물 및 식물 알레르겐의 예는 다음 속에 특이적인 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 개속 (Canis) (개 (C. familiaris)); 더마토파고이데스속 (Dermatophagoides) (예, 집먼지진드기 (D. farinae)); 고양이속 (Felis) (고양이 (F. domesticus)); 돼지풀속 (Ambrosia) (돼지풀 (A. artemiisfolia); 호밀풀속 (Lolium) (예, 호밀풀 (L. perenne) 또는 쥐보리 (L. multiflorum)); 삼나무속 (Cryptomeria) (삼나무 (C. japonica)); 알터나리아 (Alternaria) (검은 무늬병 (A. alternata)); 오리나무; 오리나무속 (Alnus) (알누스 굴티노아사 (A. gultinoasa)); 자작나무속 (Betula) (자작나무 (B. verrucosa)); 참나무속 (Quercus) (미국백참나무 (Q. alba)); 올리브나무속 (Olea) (올리브나무 (O. europa)); 쑥속 (Artemisia) (쑥 (A. vulgaris)); 질경이속 (Plantago) (예, 참질경이 (P. lanceolata)); 개물통이속 (Parietaria) (예, 파리에타리아 오피시날리스 (P. officinalis) 또는 파리에타리아 주다이카 (P. judaica)); 바퀴속 (Blattella) (예, 바퀴 (B. germanica)); 꿀벌속 (Apis) (예, 아피스 멀티플로룸 (A. multiflorum)); 실측백나무속 (Cupressus) (예, 사이프러스 (C. sempervirens), 쿠프레수스 아리조니카 (C. arizonica) 및 윌마 (C. macrocarpa)); 향나무속 (Juniperus) (예, 주니페루스 사비노이데스 (J. sabinoides), 연필향나무 (J. virginiana), 곱향나무 (J. communis) 및 시더우드 (J. ashei)); 측백나무속 (Thuya) (예, 측백나무 (T. orientalis)); 편백속 (Chamaecyparis) (예, 편백 (C. obtusa)); 페리플라네타 (Periplaneta) (예, 미국 바퀴 (P. americana)); 개밀속 (Agropyron) (예, 구주개밀 (A. repens)); 호밀속 (Secale) (예, 호밀 (S. cereale)); 밀속 (Triticum) (예, 밀 (T. aestivum)); 오리새속 (Dactylis) (예, 오리새 (D. glomerata)); 김의털속 (Festuca) (예, 큰김의털 (F. elatior)); 포아풀속 (Poa) (예, 왕포아풀 (P. pratensis) 또는 좀포아풀 (P. compressa)); 귀리속 (Avena) (예, 귀리 (A. sativa)); 흰털새속 (Holcus) (예, 흰털새 (H. lanatus)); 향기풀속 (Anthoxanthum) (예, 향기풀 (A. odoratum)); 개나래새속 (Arrhenatherum) (예, 개나래새 (A. elatius)); 겨이삭속 (Agrostis) (예, 흰겨이삭 (A. alba)); 산조아재비속 (Phleum) (예, 큰조아재비 (P. pratense)); 갈풀속 (Phalaris) (예, 갈풀 (P. arundinacea)); 참새피속 (Paspalum) (예, 바이하그라스 (P. notatum)); 수수속 (Sorghum) (예, 시리아수수새 (S. halepensis)); 및 참새귀리속 (Bromus) (예, 좀참새귀리 (B. inermis)).
본원에서 사용될 때, 천식은 염증, 기도의 협소화 및 흡입된 물질에 대한 기도의 반응성 증가를 특징으로 하는 호흡기계의 장애를 나타낸다. 천식은 전적으로는 아니지만 흔히 아토피 또는 알레르기 병태와 연관된다. 천식 증상은 기류 폐쇄로 인한 천명, 호흡곤란, 및 흉부 압박감, 및 기침의 재발 에피소드를 포함한다. 천식과 연관된 기도 염증은 많은 생리학적 변화, 예를 들어 기도 상피의 박피, 기저막 아래의 콜라겐 침착, 부종, 비만 세포 활성화, 호중구, 호산구, 및 림프구를 포함한 염증 세포 침윤의 관찰을 통해 검출할 수 있다. 기도 염증의 결과로서, 천식 환자는 종종 기도 과민반응, 기류 제한, 호흡 증상, 및 만성 질병을 겪는다. 기류 제한은 급성 기관지 수축, 기도 부종, 점액전 (mucous plug) 형성, 및 기도 재형성을 포함하고, 상기 특징은 종종 기관지 폐쇄를 일으킨다. 천식의 일부 사례에서, 기저막하 섬유증이 일어날 수 있어서, 폐 기능에서 지속적인 이상을 일으킨다.
본원에서 사용될 때, 천식에 걸린 대상체는 염증, 기도의 협소화 및 흡입된 물질에 대한 기도의 반응성 증가를 특징으로 하는 호흡기계의 장애를 갖는 대상체이다. 천식은 전적으로는 아니지만 흔히 아토피 또는 알레르기 증상과 연관된다. 또한, 천식은 전적으로는 아니지만 흔히 개시인자와의 접촉과 연관된다. 본원에서 사용될 때 "개시인자"는 천식을 촉발하는 조성물 또는 환경 조건을 나타낸다. 개시인자는 알레르겐, 차가운 온도, 운동, 바이러스 감염, SO2를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 siRNA는 단독으로 또는 다른 치료제와 조합으로 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 다른 치료제는 본 발명의 다른 siRNA이다. siRNA 및 다른 치료제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료제가 동시에 투여될 때, 이들은 동일한 또는 별개의 제제로 투여될 수 있지만, 동시에 투여된다. 다른 치료제 및 siRNA의 투여가 일시적으로 분리될 때, 다른 치료제는 서로 및 siRNA와 순차적으로 투여되고. 상기 화합물의 투여 사이의 시간 분리는 분 단위일 수 있거나, 더 길 수 있다. 다른 치료제는 항미생물제, 항암제, 항알레르기제 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 siRNA는 항미생물제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 항미생물제는 감염성 미생물을 죽이거나 억제할 수 있는 자연발생 또는 합성 화합물을 의미한다. 본 발명에 따라 유용한 항미생물제의 종류는 대상체가 감염되거나 감염될 위험이 있는 미생물의 종류에 따를 것이다. 항미생물제는 항균제, 항바이러스제, 항진균제 및 항기생충제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. "항감염제", "항균제", "항바이러스제", "항진균제", "항기생충제" 및 "구충제"와 같은 구문은 당업자에게 확립된 의미를 갖고 표준 의학 문헌에 규정되어 있다. 간단히 설명하면, 항균제는 세균을 죽이거나 억제하고, 항생제 및 유사한 기능을 갖는 다른 합성 또는 천연 화합물을 포함한다. 항생제는 세포, 예를 들어 미생물에 의해 2차 대사체로서 생산되는 저분자량 분자이다. 일반적으로, 항생제는 미생물에 특이적이고 숙주 세포 내에 존재하지 않고, 하나 이상의 세균 기능 또는 구조를 저해한다. 항바이러스제는 천연 공급원으로부터 단리되거나 합성될 수 있고, 바이러스를 죽이거나 억제하기 위해 유용하다. 항진균제는 표재 진균 감염, 및 기회 및 원발성 전신 진균 감염을 치료하기 위해 사용된다. 항기생충제는 기생충을 죽이거나 억제한다.
인간 투여에 유용한, 구충제로도 불리는 항기생충제는 알벤다졸, 암포테리신 B, 벤즈니다졸, 비티오놀, 클로로퀸 HCl, 클로로퀸 포스페이트, 클린다마이신, 데히드로에메틴, 디에틸카르바마진, 딜록사니드 푸로에이트, 에플로니틴, 푸라졸리다온, 글루코코르티코이드, 할로판트린, 요오도퀴놀, 이베르멕틴, 메벤다졸, 메플로퀸, 메글루민 안티모니에이트, 멜라르소프롤, 메트리포네이트, 메트로니다졸, 니클로사미드, 니푸르티목스, 옥삼니퀸, 파로모마이신, 펜타미딘 이세티오네이트, 피페라진, 프라지쿠안텔, 프리마퀸 포스페이트, 프로구아닐, 피란텔 파모에이트, 피리메탄민-술폰아미드, 피리메탄민-술파독신, 퀴나크린 HCl, 퀴닌 술페이트, 퀴니딘 글루코네이트, 스피라마이신, 스티보글루코네이트 나트륨 (나트륨 안티몬 글루코네이트), 수라민, 테트라사이클린, 독시사이클린, 티아벤다졸, 티니다졸, 트리메트로프림-술파메톡사졸 및 트리파르사미드를 포함하고 이로 제한되지 않고, 이중 일부는 단독으로 또는 다른 약제와 조합되어 사용된다.
항균제는 세균의 성장 또는 기능을 억제하거나 죽인다. 큰 클래스의 항균제는 항생제이다. 광범위한 세균을 죽이거나 억제하는데 효과적인 항생제는 광범위 항생제로 불린다. 다른 종류의 항생제는 주로 그람 양성 또는 그람 음성 세균에 대해 효과적이다. 이들 종류의 항생제는 좁은 범위 항생제로 불린다. 단일 유기체 또는 질병에 대해 효과적이지만 다른 종류의 세균에는 효과적이지 않은 다른 항생제는 제한 범위 항생제로 불린다. 항균제는 때때로 주작용 방식을 기준으로 분류된다. 일반적으로, 항균제는 세포벽 합성 억제제, 세포막 억제제, 단백질 합성 억제제, 핵산 합성 또는 기능 억제제, 및 경쟁적 억제제이다.
항바이러스제는 바이러스에 의한 세포 감염 또는 세포 내에서 바이러스 복제를 방지하는 화합물이다. 바이러스 복제 과정은 숙주 세포 내의 DNA 복제와 밀접하게 관련되어 비특이적 항바이러스제는 종종 숙주에 독성이기 때문에, 항균 약물보다 항바이러스 약물의 수가 훨씬 더 적다. 바이러스 감염 과정에는 항바이러스제에 의해 차단되거나 억제될 수 있는 몇몇 단계가 존재한다. 이들 단계는 바이러스의 숙주 세포에 대한 부착 (면역글로불린 또는 결합 펩티드), 바이러스의 탈피 (예를 들어, 아만타딘), 바이러스 mRNA의 합성 또는 번역 (예를 들어, 인터페론), 바이러스 RNA 또는 DNA의 복제 (예를 들어, 뉴클레오티드 유사체), 새로운 바이러스 단백질의 성숙 (예를 들어, 프로테아제 억제제), 및 바이러스의 발아 및 방출을 포함한다.
뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드에 유사하지만 불완전 또는 비정상 데옥시리보스 또는 리보스 기를 가진 합성 화합물이다. 일단 뉴클레오티드 유사체가 세포 내에 있으면, 이들은 포스포릴화되고, 바이러스 DNA 또는 RNA 내로 혼입을 위해 정상 뉴클레오티드와 경쟁하는 트리포스페이트 형태를 생성한다. 뉴클레오티드 유사체의 트리포스페이트 형태가 일단 성장하는 핵산 사슬 내에 혼입되면, 바이러스 중합효소와 비가역적 결합을 일으키고, 따라서 사슬을 종결시킨다. 뉴클레오티드 유사체는 아시클로버 (단순 헤르페스 바이러스 및 수두 대상포진 바이러스의 치료에 사용됨), 간시클로버 (사이토메갈로바이러스의 치료에 유용함), 이독수리딘, 리바비린 (호흡 융합세포 바이러스의 치료에 유용함), 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘, 지도부딘 (아지도티미딘), 이미퀴모드, 및 레시미퀴모드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
인터페론은 바이러스 감염 세포뿐만 아니라 면역 세포에 의해 분비되는 사이토킨이다. 인터페론은 감염된 세포에 인접한 세포 상의 특이적 수용체에 결합함으로써 작용하여, 세포에서 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하는 변화를 일으킨다. α- 및 β-인터페론은 또한 감염된 세포의 표면 상에 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자의 발현을 유도하여, 숙주 면역 세포 인식을 위한 항원 제시를 증가시킨다. α- 및 β-인터페론은 재조합 형태로 이용가능하고, 만성 B형 간염 및 C형 간염의 치료에 사용되어 왔다. 항바이러스 요법에 효과적인 투여량에서, 인터페론은 열, 권태감 및 체중 감소와 같은 심각한 부작용이 있다.
본 발명에서 유용한 항바이러스제는 면역글로블린, 아만타딘, 인터페론, 뉴클레오티드 유사체 및 프로테아제 억제제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항바이러스제의 구체적인 예는 아세만난; 아시클로버; 아시클로버 나트륨; 아데포버; 알로부딘; 알비르셉트 수도톡스; 아만타딘 히드로클로라이드; 아라노틴; 아릴돈; 아테비르딘 메실레이트; 아브리딘; 시도포버; 시팜필린; 사이타라빈 히드로클로라이드; 델라비르딘 메실레이트; 데스시클로버; 디다노신; 디속사릴; 에독수딘; 엔비라덴; 엔비록심; 팜시클로버; 파모틴 히드로클로라이드; 피아시타빈; 피알루리딘; 포사릴레이트; 포스카르넷 나트륨; 포스포넷 나트륨; 간시클로버; 간시클로버 나트륨; 이독수리딘; 케톡살; 라미부딘; 로부카비르; 메모틴 히드로클로라이드; 메티사존; 네비라핀; 펜시클로버; 피로다버; 리바비린; 리만타딘 히드로클로라이드; 사퀴나버 메실레이트; 소만타딘 히드로클로라이드; 소리부딘; 스타톨론; 스타부딘; 티롤론 히드로클로라이드; 트리플루리딘; 발라시클로버 히드로클로라이드; 비다라빈; 비다라빈 포스페이트; 비다라빈 나트륨 포스페이트; 비록심; 잘시타빈; 지로부딘; 및 진비록심을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
항진균제는 감염성 진균의 치료 및 예방에 유용하다. 항진균제는 때때로 작용 메카니즘에 의해 분류된다. 일부 항진균제는 글루코스 합성효소를 억제함으로써 세포벽 억제제로서 작용한다. 이들은 바시운긴/ECB를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 항진균제는 막 통합성을 불안정화함으로써 작용한다. 이들은 이미다졸, 예를 들어 클로트리마졸, 세르타콘졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸 및 보리코나콜뿐만 아니라 FK463, 암포테리신 B, BAY 38-9502, MK991, 프라디미신, UK 292, 부테나핀 및 테르비나핀을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 항진균제는 키틴을 분해하거나 (예, 키티나제) 또는 면역억제 (501 크림)에 의해 작용한다.
본 발명의 siRNA는 또한 항암 치료와 함께 투여될 수 있다. 항암 치료는 항암제, 방사선 치료 및 외과적 수술을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "항암제"는 암 치료 목적으로 대상체에게 투여되는 약제를 나타낸다. 본원에서 사용될 때, "암을 치료하는"은 암의 발병을 예방하고/하거나, 암의 증상을 감소시키고/시키거나, 확립된 암의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 항암제는 암 발병의 위험을 감소시킬 목적으로 암을 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 다양한 종류의 암 치료용 의약이 본원에 설명되어 있다. 본 명세서의 목적에서, 항암제는 화학치료제, 면역치료제, 암 백신, 호르몬 요법 및 생물학적 반응 조정제로서 분류된다.
화학치료제는 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 당 비함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카르바진, 탁솔, 프라길린, 메글라민 GLA, 발루비신, 카르무스타인 및 폴리페르포산, MMI270, BAY 12-9566, RAS 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔, 글라몰렉, CI-994, TNP-470, 하이캄틴/토포테칸, PKC412, 발스포다르/PSC833, 노반트론/미트록산트론, 메타레트/수라민, 바티마스타트, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, 인셀/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트, BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날 DP 2202, FK 317, 피시바닐/OK-432, AD 32/발루비신, 메타스트론/스트론튬 유도체, 테모달/테모졸로미드, 에바세트/리포좀 독소루비신, 예탁산/파클리탁셀, 탁솔/파클리탁셀, 젤로아드/카페시타빈, 푸르톨론/독시플루리딘, 시클로팍스/경구 파클리탁셀, 경구 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 종양유전자 억제제, BMS-182751/경구 백금, UFT (테가푸르/우라실), 에르가미솔/레바미솔, 에닐우라실/776C85/5FU 증강제, 캄프토/레바미솔, 캄프토사르/이리노테칸, 투모덱스/랄리트렉세드, 류스타틴/클라드리빈, 팍섹스/파클리탁셀, 독실/리포좀 독소루비신, 카엘릭스/리포좀 독소루비신, 플루다라/플루다라빈, 파르마루비신/에피루비신, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈리미드, LU 103793/돌라스타인, 카에틱스/리포좀 독소루비신, 겜자르/겜시타빈, ZD 0473/아노르메드, YM 116, 요오드 씨드, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드, 이페스/메스넥스/이포사미드, 부몬/테니포시드, 파라플라틴/카르보플라틴, 플란티놀/시스플라틴, 베페시드/에토포시드, ZD 9331, 탁소테레/도세탁셀, 구아닌 아라비노시드의 전구약물, 탁산 유사체, 니트로소우레아, 알킬화제, 예를 들어 멜펠란 및 시클로포스파미드, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 클로롬부실, 시타라빈 HCl, 닥티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에토포시드 (VP16-213), 플록스우리딘, 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드, 히드록시우레아 (히드록시카르바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴 (CCNU), 메클로르에타민 HCl (질소 머스타드), 머캅토퓨린, 메스나, 미토탄 (o.p'-DDD), 미톡산트론 HCl, 옥트레오티드, 플리카마이신, 프로카르바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 술페이트, 암사크린 (m-AMSA), 아자시티딘, 에르트로포이에틴, 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터루킨 2, 미토구아존 (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴 (2'데옥시코포르마이신), 세무스틴 (메틸-CCNU), 테니포시드 (VM-26) 및 빈데신 술페이트로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고 이로 제한되지 않는다.
면역치료제는 리부탁신, 헤르셉틴, 쿠아드라메트, 파노렉스, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, 온콜림, SMART M195, 아트라겐, 오바렉스, 벡사르, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, 항-VEGF, 제나팍스, MDX-220, MDX-447, 멜리뮨 (MELIMMUNE)-2, 멜리뮨-1, 세아시드 (CEACIDE), 프레타겟, NovoMAb-G2, TNT, 글리오맙-H, GNI-250, EMD-72000, 림포시드, CMA 676, 모노팜-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, 항-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab 및 ImmuRAIT-CEA로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고 이로 제한되지 않는다.
암 백신은 EGF, 항-개별특이형 암 백신, Gp75 항원, GMK 흑색종 백신, MGV 강글리오시드 컨쥬게이트 백신, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL 테라토프 (theratope), BLP25 (MUC-1), 리포좀 개별특이형 백신, 멜라신, 펩티드 항원 백신, 독소/항원 백신, MVA-계 백신, PACIS, BCG 백신, TA-HPV, TA-CIN, DISC-바이러스 및 ImmuCyst/TheraCys로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 siRNA는 천식/알레르기 의약과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "천식/알레르기 의약"은 천식 또는 알레르기 반응의 증상을 감소시키거나, 천식 또는 알레르기 반응의 발생을 예방하거나, 천식 또는 알레르기 반응을 억제하는 조성물이다. 천식 및 알레르기 치료를 위한 각종 의약은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Guidelines For The Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel Report 2, NIH Publication No. 97/4051, Jul. 19, 1997]에 기재되어 있다. 상기 NIH 출판물에 기재된 의약의 개요를 아래에 제시한다. 대부분의 실시태양에서, 천식/알레르기 의약은 어느 정도까지는 천식과 알레르기 모두를 치료하는 데 유용하다.
천식 치료용 의약은 일반적으로 2개의 카테고리, 즉, 신속 회복 의약 및 장기 제어 의약으로 나누어진다. 천식 환자는 지속적인 천식의 제어를 달성하고 유지하기 위해 장기 제어 의약을 일 단위로 투여한다. 장기 제어 의약은 소염제, 예를 들어 코르티코스테로이드, 크로몰린 나트륨 및 네도크로밀; 지속성 기관지 확장제, 예를 들어 지속성 β2-작용제 및 메틸잔틴; 및 류코트리엔 조절제를 포함한다. 신속 회복 의약은 속효성 β2 작용제, 항콜린제 및 전신 코르티코스테로이드를 포함한다. 각각의 상기 약물과 연관된 많은 부작용이 존재하고, 단독으로 또는 조합으로 천식을 예방하거나 완전히 치료할 수 있는 약물은 없다.
천식 의약은 PDE-4 억제제, 기관지 확장제/베타-2 작용제, K+ 채널 개방제, VLA-4 길항제, 뉴로킨 길항제, 트롬복산 A2 (TXA2) 합성 억제제, 잔틴, 아라키돈산 길항제, 5-리폭시게나제 억제제, TXA2 수용체 길항제, TXA2 길항제, 5-리폭스 활성화 단백질의 억제제, 및 프로테아제 억제제로 이루어지는 군 중에서 선택되고 이로 제한되지 않는다.
기관지 확장제/β2 작용제는 기관지 확장 또는 평활근 이완을 야기하는 화합물 클래스이다. 기관지 확장제/β2 작용제는 살메테롤, 살부타몰, 알부테롤, 테트부탈린, D2522/포르모테롤, 페노테롤, 비톨테롤, 피르부에롤 메틸잔틴 및 오르시프레날린을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 지속성 β2 작용제 및 기관지 확장제는 소염 치료에 추가로 증상의 장기간 예방에 사용되는 화합물이다. 지속성 β2 작용제는 살메테롤 및 알부테롤을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 보통 코르티코스테로이드와 조합으로 사용되고, 일반적으로 임의의 염증 치료와 함께 사용되지 않는다. 이들은 빈맥, 골격근 진전, 저칼륨혈증, 및 과량에서 QTc 간격의 연장과 같은 부작용과 연관되었다.
예를 들어 테오필린을 포함하는 메틸잔틴은 증상의 장기 제어 및 예방을 위해 사용되고 있다. 상기 화합물은 포스포디에스테라제 억제 및 아마도 아데노신 길항작용으로 인한 기관지확장을 일으킨다. 용량-관련 급성 독성은 이들 종류의 화합물에 관련된 특정 문제이다. 그 결과, 대사 청소율에서 개인 차이로 인해 발생하는 독성 및 좁은 치료 범위를 해결하기 위해 일상적인 혈청 농도를 모니터링해야 한다. 부작용은 빈맥, 부정빈맥, 구역질 및 구토, 중추 신경계 자극, 두통, 발작, 토혈, 고혈당증 및 저칼륨혈증을 포함한다. 속효성 β2 작용제는 알부테롤, 비톨테롤, 피르부테롤 및 테르부탈린을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 속효성 β2 작용제의 투여와 연관된 일부 이상 작용은 빈맥, 골격근 진전, 저칼륨혈증, 증가된 락트산, 두통 및 고혈당증을 포함한다.
알레르기를 치료하거나 예방하기 위한 통상적인 방법은 항히스타민제 또는 탈감작 치료의 사용을 포함하였다. 항히스타민제 및 알레르기 반응의 화학 매개체의 효과를 차단하는 다른 약물은 알레르기 증상의 심도를 조절하는 것을 돕지만, 알레르기 반응을 예방하지 않고 후속적인 알레르기 반응에 효과가 없다. 탈감작 치료는 알레르겐에 대해 IgG형 반응을 유도하기 위해 보통 피부 아래 주사에 의해 소용량의 알레르겐을 제공함으로써 수행한다. IgG 항체의 존재는 IgE 항체의 유도로 생성되는 매개체의 생산을 중화시키는 것을 돕는 것으로 생각된다. 초기에, 대상체는 심한 반응을 유도하는 것을 피하기 위해 매우 저용량의 알레르겐으로 치료받고, 용량을 서서히 증가시킨다. 상기 종류의 요법은 대상체에게 알레르기 반응을 유발하는 화합물을 실제로 투여하기 때문에 위험하고, 심한 알레르기 반응이 일어날 수 있다.
알레르기 의약은 항히스타민제, 스테로이드 및 프로스타글란딘 유도제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항히스타민제는 비만 세포 또는 호염기구에서 방출되는 히스타민에 길항하는 화합물이다. 이들 화합물은 당업계에 잘 알려져 있고 알레르기 치료를 위해 흔히 사용된다. 항히스타민제는 아스테미졸, 아젤라스틴, 베타타스틴, 부클리진, 세테리진, 세티리진 유사체, CS 560, 데스로라타딘, 에바스틴, 에피나스틴, 펙소페나딘, HSR 609, 레보카바스틴, 로라티딘, 미졸라스틴, 노라스테미졸, 테르페나딘 및 트라닐라스트를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
프로스타글란딘 유도제는 프로스타글란딘 활성을 유도하는 화합물이다. 프로스타글란딘은 평활근 이완을 조절함으로써 작용한다. 프로스타글란딘 유도제는 S-5751을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
천식/알레르기 의약은 또한 스테로이드 및 면역조절제를 포함한다. 스테로이드는 베클로메타손, 플루티카손, 트리암시놀론, 부데소니드, 코르티코스테로이드 및 부데소니드를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
코르티코스테로이드는 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트 및 트리암시놀론 아세토니드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 덱사메타손은 소염 작용을 갖는 코르티코스테로이드이지만, 흡입 형태로 천식/알레르기의 치료를 위해 규칙적으로 사용되지 않고, 이는 유효 용량에서 고도로 흡수되고 장기간 억제 부작용이 있기 때문이다. 그러나, 덱사메타손은 본 발명에 따라 천식/알레르기의 치료를 위해 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 핵산과 조합으로 투여될 때, 부작용을 감소시키기 위해 저용량으로 투여될 수 있기 때문이다. 코르티코스테로이드와 연관된 일부 부작용은 기침, 발성장애, 아구창 (칸디다증)을 포함하고, 보다 고용량에서 전신 효과, 예를 들어 부신 억제, 골다공증, 성장 억제, 피부 박화 및 쉽게 멍드는 것을 포함한다 ([Barnes & Peterson (1993) Am Rev Respir Dis 148:S1-S26]; 및 [Kamada AK et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48]).
전신 코르티코스테로이드는 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프레드니손을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 코르티코스테로이드는 당 대사에서 가역적인 이상, 식욕 증가, 체액 저류, 체중 증가, 기분 변경, 고혈압, 소화 궤양, 및 뼈의 무균 괴사와 연관된다. 상기 화합물은 부적절하게 제어된 지속적인 천식에서 염증 반응의 단기간 (3-10일) 예방을 위해 유용하다. 이들은 또한 염증을 억제하고 제어하기 위해 중증 지속적인 천식에서 증상의 장기간 예방에서 작용하고, 실제로 염증을 역전시킨다. 장기간 사용과 연관된 일부 부작용은 부신계 억제, 성장 억제, 피부 박화, 고혈압, 당뇨, 쿠싱 (Cushing) 증후군, 백내장, 근육 약화, 및 드문 경우로 면역 기능 손상을 포함한다. 상기 종류의 화합물은 최저 유효 용량으로 사용되는 것이 권장된다 (Guidelines For The Diagnosis and Management of Asthma; Expert Panel Report 2; NIH Publication No. 97-4051, July, 1997).
면역조절제는 소염제, 류코트리엔 길항제, IL-4 뮤테인, 가용성 IL-4 수용체, 면역억제제 (예를 들어, 관용화 (tolerizing) 펩티드 백신), 항-IL-4 항체, IL-4 길항제, 항-IL-5 항체, 가용성 IL-13 수용체-Fc 융합 단백질, 항-IL-9 항체, CCR3 길항제, CCR5 길항제, VLA-4 억제제 및 IgE의 하향조절제로 이루어지는 군을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
류코트리엔 조절제는 종종 약한 지속적인 천식에서 증상의 장기 제어 및 예방을 위해 사용된다. 류코트리엔 조절제는 LTD-4 및 LTE-4 수용체에 대해 선택적으로 경쟁함으로써 류코트리엔 수용체 길항제로서 작용한다. 상기 화합물은 자피르루카스트 정제 및 질류톤 정제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 질류톤 정제는 5-리폭시게나제 억제제로서 작용한다. 상기 약물은 간 효소의 상승 및 일부 사례의 가역적인 간염 및 고빌리루빈혈증과 연관되었다. 류코트리엔은 천식에 걸린 환자의 기도에서 기도 평활근의 수축을 일으키고 혈관 투과성, 점액 분비를 증가시키고 염증 세포를 활성화시키는, 비만 세포, 호산구, 및 호염기구로부터 방출되는 생화학적 매개체이다.
다른 면역조절제는 면역조절 특성을 갖는 것으로 나타난 신경펩티드를 포함한다. 기능 연구에서는 예를 들어, 물질 (substance) P가 특이적 수용체-매개 메카니즘에 의해 림프구 기능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 물질 P는 또한 점막 비만 세포로부터 아라키돈산-유도 매개체의 생성을 자극함으로써 특유한 즉시 과민성 반응을 조절하는 것으로 나타났다 (McGillies J et al. (1987) Fed Proc 46:196-9 (1987)). 물질 P는 1931년에 처음 확인된 신경펩티드이다 (Von Euler and Gaddum J Physiol (London) 12:14-87 (1931)). 그의 아미노산 서열은 1971년에 문헌 [Chang MM et al. (1971) Nature New Biol 232:86-87]에 보고되었다. 물질 P의 단편의 면역조절 활성은 문헌 [Siemion IZ et al. (1990) Molec Immunol 27:887-890 (1990)]에서 연구되었다.
다른 클래스의 화합물은 IgE의 하향조절제이다. 상기 화합물은 IgE 수용체에 결합하여 항원-특이적 IgE의 결합을 방지하는 능력을 갖는 펩티드 또는 다른 분자를 포함한다. 다른 종류의 IgE의 하향조절제는 인간 IgE 분자의 IgE 수용체-결합 구역에 대해 지정된 모노클로날 항체이다. 따라서, 한 종류의 IgE의 하향조절제는 항-IgE 항체 또는 항체 단편이다. 항-IgE는 제넨테크 (Genentech)에서 개발 중이다. 당업자는 동일한 기능을 갖는 결합 펩티드의 기능상 활성을 갖는 항체 단편을 제조할 수 있다. 다른 종류의 IgE 하향조절제는 IgE 항체의 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 결합을 차단하고 IgE가 이미 결합된 결합 부위로부터 IgE를 교체할 수 있는 폴리펩티드이다.
IgE의 하향조절제과 연관된 하나의 문제는 많은 분자가 수용체에 대한 결합 강도가 천연 IgE 분자와 그의 수용체 사이의 매우 강한 상호작용에 상응하지 않는다는 점이다. 상기 강도를 갖는 분자는 수용체에 비가역적으로 결합하는 경향이 있다. 그러나, 상기 물질은 신체 내의 다른 구조상 유사한 분자에 공유 결합하여 차단할 수 있으므로 비교적 독성이다. 상기 맥락에서 IgE 수용체의 α 사슬이 예를 들어, 몇몇 상이한 IgG Fc 수용체가 포함되는 보다 큰 유전자 패밀리에 속한다는 것은 중요하다. 상기 수용체는 예를 들어, 세균 감염에 대한 신체의 방어를 위해 절대적으로 필요하다. 또한, 공유 결합을 위해 활성화된 분자는 종종 비교적 불안정하고, 따라서 비만 세포 및 호염기성 백혈구 상의 IgE 수용체의 연속적으로 회복하는 풀 (pool)을 완전히 차단할 수 있도록 하기 위해 이들은 아마도 매일 수회 및 이어서 비교적 높은 농도로 투여되어야 한다.
크로몰린 나트륨 및 네도크로밀은 주로 운동으로 발생하는 천식 증상 또는 알레르겐으로부터 발생하는 알레르기 증상을 예방하기 위해 장기 제어 의약으로서 사용된다. 상기 화합물은 클로라이드 채널 기능을 저해함으로써 알레르겐에 대한 초기 및 후기 반응을 차단하는 것으로 생각된다. 이들은 또한 비만 세포막을 안정화하고, 호산구 및 상피 세포로부터 매개체의 활성화 및 방출을 억제한다. 최대 이익을 달성하기 위해 4 내지 6주의 투여 기간이 일반적으로 요구된다.
항콜린제는 일반적으로 급성 기관지연축의 경감을 위해 사용된다. 상기 화합물은 무스카린 콜린성 수용체의 경쟁적 억제에 의해 작용하는 것으로 생각된다. 항콜린제는 이프라트로퓸 브로마이드를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 콜린신경 매개 기관지연축만을 역전시키고, 항원에 대한 임의의 반응을 변형시키지 않는다. 부작용은 입 및 호흡 분비의 건조, 몇몇 개인에서 천명 증가, 및 눈에 분무하는 경우 시야의 흐려짐을 포함한다.
시험관 내에서 및 생체 내에서 사용하기 위해, 본 발명의 siRNA는 일반적으로 유효량으로 사용된다. 본원에서 사용될 때, 유효량은 일반적으로 원하는 생물학적 효과를 달성하기 위해 충분한 양을 나타낸다. 한 실시태양에서, 유효량은 임상학상 유효량이고, 여기서 임상학상 유효량은 질병에 걸린 대상체를 치료하기 위해 충분한 임의의 양이다. 본원에서 사용될 때, '치료하다' 및 '치료하는'은 질병에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 대상체에서 질병의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 감소, 제거 또는 예방하는 것을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 대상체는 인간 또는 다른 포유동물을 나타낸다.
본원에 제공된 교시내용과 함께, 다양한 활성 화합물 및 가중 인자, 예를 들어 효력, 상대적 생체이용률, 환자 체중, 유해한 부작용의 심도 및 바람직한 투여 방식을 선택함으로써, 실질적인 독성을 유발하지 않으면서 특정 대상체를 치료하기 위해 효과적인 예방적 또는 치료적 처리 방법을 계획할 수 있다. 임의의 특정 용도에 대한 유효량은 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 특정 siRNA, 대상체의 체격, 또는 질병 또는 병태의 심도와 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 하지 않고도 특정 siRNA 및/또는 다른 치료제의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다. 최대 용량, 즉, 일부 의학적 판단에 따라 가장 높은 안전한 용량을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 화합물의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해 매일 다수 용량을 고려할 수 있다. 적절한 전신 수준은 예를 들어, 환자의 약물의 피크 또는 지속 혈장 수준의 측정에 의해 결정할 수 있다. "용량" 및 "투여량"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다.
일반적으로, 활성 화합물의 1일 경구 용량은 약 0.01 mg/kg/일 내지 1000 mg/kg/일일 것이다. 0.5 내지 50 mg/kg 범위의 경구 용량이 매일 1회 또는 수회 투여로 요구되는 결과를 얻을 것으로 예상된다. 투여량은 투여 방식에 따라 요구되는 약물 수준 (국소 또는 전신)을 달성하기 위해 적절하게 조정될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 투여는 1일당 1차수 내지 수차수 더 낮은 용량일 것으로 예상된다. 대상체의 반응이 상기 용량에서 불충분한 경우에, 훨씬 더 많은 용량 (또는 상이한, 보다 편재된 전달 경로에 의해 효과적인 보다 많은 용량)을 환자 내약성이 허용하는 정도로 사용할 수 있다. 매일 다수 용량이 화합물의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해 고려된다.
본원에 기재된 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량은 초기에 동물 모델로부터 결정할 수 있다. 치료 유효 용량도 인간에서 시험된 siRNA 및 유사한 약물학적 활성을 보이는 것으로 알려진 화합물, 예를 들어 다른 관련 활성제에 대한 인간 데이타로부터 결정할 수 있다. 비경구 투여를 위해 보다 많은 용량이 요구될 수 있다. 적용된 용량은 투여된 화합물의 상대적 생체이용률 및 효력을 기초로 조정할 수 있다. 상기 설명된 방법 및 다른 방법을 기초로 하여 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 당업계에 공지되어 있고, 보통의 숙련자가 쉽게 수행할 수 있다.
siRNA의 세포 내로의 전달을 촉진하기 위해, siRNA는 임의로 양이온성 지질과 함께 제공되거나, 제제화되거나, 다른 방식으로 조합될 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 양이온성 지질은 DOTAP이다.
치료법에 사용하기 위해, 유효량의 siRNA는 siRNA를 목적하는 표면에 전달하는 임의의 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 경구, 비경구, 근내, 비강내, 설하, 기관내, 흡입, 안내, 질내 및 직장내를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 siRNA는 벡터 (vector)의 도움으로 특정 조직, 세포 종류, 또는 면역계, 또는 둘 모두에 전달될 수 있다. 그의 가장 넓은 의미에서, "벡터"는 조성물의 표적 세포로의 전달을 용이하게 할 수 있는 임의의 비히클이다. 벡터는 일반적으로 벡터의 부재 하에 일어날 분해의 정도에 비해 분해를 감소시키면서 siRNA, 항체, 항원 및/또는 장애-특이적 의약을 표적 세포에 전달한다.
일반적으로, 본 발명에 유용한 벡터는 2개 클래스, 즉 생물학적 벡터 및 화학적/물리적 벡터로 나뉜다. 생물학적 벡터 및 화학적/물리적 벡터는 본 발명의 치료제의 전달 및/또는 흡수에서 유용하다.
본원에서 사용될 때, "화학적/물리적 벡터"는 siRNA 및/또는 다른 의약을 전달할 수 있는, 세균 또는 바이러스 공급원으로부터 유래된 것이 아닌 천연 또는 합성 분자를 의미한다.
본 발명의 바람직한 화학적/물리적 벡터는 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템은 지질-기반 시스템, 예를 들어 수-중-유 에멀젼, 미셀 (micelle), 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 전달 벡터로서 유용한 인공 막 베슬 (vessel)이다. 크기가 0.2-4.0 ㎛인 큰 단층 소포체 (LUV)가 큰 거대분자에 피막을 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. RNA, DNA 및 무손상 비리온은 수성의 내부 내에서 피막이 형성될 수 있고, 생물학적으로 활성을 갖는 형태로 세포에 전달될 수 있다 (Fraley et al. (1981) Trends Biochem Sci 6:77).
리포좀은 리포좀을 특이적 리간드, 예를 들어 모노클로날 항체, 당, 당지질, 또는 단백질에 커플링시킴으로써 특정 조직에 대해 표적화시킬 수 있다. 리포좀을 면역 세포에 대해 표적화시키기에 유용할 수 있는 리간드는 면역 세포 특이적 수용체 및 분자와 상호작용하는 분자, 예를 들어 면역 세포의 세포 표면 마커와 상호작용하는 항체 또는 그의 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 리간드는 당업자에게 공지된 결합 분석에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 리포좀은 상기 논의한 바 있는 면역치료 항체 중의 하나에 커플링시킴으로써 암에 대해 표적화시킬 수 있다. 추가로, 벡터는 벡터를 숙주 세포의 핵으로 유도하는 핵 표적화 펩티드에 커플링될 수 있다.
형질감염을 위한 지질 제제는 퀴아겐 (QIAGEN)으로부터, 예를 들어 이펙텐 (EFFECTENE)™ (특수한 DNA 축합 인핸서 (condensing enhancer)를 갖는 비-리포좀 지질) 및 수퍼펙트 (SUPERFECT)™ (신규한 작용성 덴드리머 (acting dendrimeric) 기술)로서 상업적으로 이용가능하다.
리포좀은 깁코 비알렐 (Gibco BRL)로부터, 예를 들어 양이온성 지질, 예를 들어 N-[1-(2,3-디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)로 형성된 리포펙틴 (LIPOFECTIN)™ 및 리포펙테이스 (LIPOFECTACE)™로서 상업적으로 이용가능하다. 리포좀 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 많은 간행물에 기재되어 있다. 또한, 리포좀은 문헌 [Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241]에서 검토된 바 있다.
한 실시태양에서, 비히클은 포유동물 수여자에게 이식 또는 투여하기 적합한 생체적합성 미세입자 또는 이식물이다. 이 방법에 유용한 예시적인 생체침식성 (bioerodible) 이식물은 국제 특허 출원 공개 WO 95/24929 (명칭: "Polymeric Gene Delivery System")에 기재되어 있다. WO 95/24929는 적절한 프로모터의 조절 하에 외인성 유전자를 포함하기 위한 생체적합성, 바람직하게는 생체분해성 중합체 매트릭스를 설명하고 있다. 중합체 매트릭스는 대상체에서 치료제의 지효성을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
중합체 매트릭스는 바람직하게는 미세입자, 예를 들어 미세구 (핵산 및/또는 다른 치료제가 고체 중합체 매트릭스 전체에 걸쳐 분산됨) 또는 미세캡슐 (핵산 및/또는 다른 치료제가 중합체 외피 (shell)의 코어 내에 저장됨)의 형태로 존재한다. 치료제를 포함하기 위한 다른 형태의 중합체 매트릭스는 필름, 코팅, 겔, 이식물 및 스텐트를 포함한다. 중합체 매트릭스 장치의 크기 및 조성은 그 내부로 매트릭스가 도입되는 조직에서 유리한 방출 동역학을 생성시키도록 선택된다. 중합체 매트릭스의 크기는 추가로 사용되는 전달 방법, 일반적으로 조직 내로의 주사 또는 에어로졸에 의한 현탁액의 코 및/또는 폐 영역 내로의 투여에 따라 선택된다. 바람직하게는, 에어로졸 경로가 사용될 때, 중합체 매트릭스 및 핵산 및/또는 다른 치료제는 계면활성제 비히클 내에 포함된다. 중합체 매트릭스 조성은 손상된 코 및/또는 폐 표면에 매트릭스가 투여될 때 전달 효과를 보다 증가시키기 위해 생체결합성인 물질로 형성되고 유리한 분해 속도를 갖도록 선택될 수 있다. 매트릭스 조성은 또한 분해되지 않고, 오히려 연장된 기간에 걸쳐 확산에 의해 방출되도록 선택될 수 있다. 일부 바람직한 실시태양에서, 핵산은 이식물을 통해 대상체에게 투여되는 반면에, 다른 치료제는 바로 투여된다. 경구 또는 점막 전달과 같은 전달에 적합한 생체적합성 미세구는 문헌 [Chickering et al. (1996) Biotech Bioeng 52:96-101 및 Mathiowitz E et al. (1997) Nature 386:410-414 및 PCT 특허 출원 공개 WO97/03702]에 개시되어 있다.
비-생체분해성 및 생체분해성 중합체 매트릭스 모두가 핵산 및/또는 다른 치료제를 대상체에게 전달하기 위해 사용할 수 있다. 생체분해성 매트릭스가 바람직하다. 상기 중합체는 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 방출이 요구되는 기간, 일반적으로 수시간 내지 1년 또는 그보다 긴 기간을 기초로 하여 선택된다. 일반적으로, 수시간 내지 3 내지 12개월의 기간에 걸친 방출이, 특히 핵산 물질에 대해 가장 바람직하다. 중합체는 임의로 물 중에서 그 중량의 약 90％ 이하를 흡수할 수 있는 히드로겔의 형태로 존재하고, 추가로 다가 이온 또는 다른 중합체와 임의로 가교결합된다.
특히 관심 있는 생체결합성 중합체는 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [H.S. Sawhney, C.P. Pathak and J.A. Hubell in Macromolecules, (1993) 26:581-587]에 기재된 생체침식성 히드로겔을 포함한다. 이들은 폴리히알루론산, 카제인, 젤라틴, 글루틴, 폴리안히드라이드, 폴리아크릴산, 알기네이트, 키토산, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트)를 포함한다.
또한, 압축제 (compaction agent)의 사용도 바람직할 수 있다. 압축제는 단독으로 사용되거나 또는 생물학적 또는 화학적/물리적 벡터와 조합하여 사용될 수도 있다. 본원에서 사용될 때, "압축제"는 핵산 상의 음전하를 중화시켜 핵산을 미세 과립으로 압축시키는 히스톤과 같은 물질을 의미한다. 핵산의 압축은 표적 세포에 의한 핵산의 흡수를 용이하게 한다. 압축제는 세포에 의해 보다 효율적으로 흡수되는 형태로 핵산을 전달하기 위해 단독으로 사용되거나, 보다 바람직하게는 상기 설명된 하나 이상의 벡터와 조합되어 사용될 수 있다.
핵산의 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 다른 예시적인 조성물은 인산칼슘 및 세포내 수송의 다른 화학적 매개체, 미세주사 조성물, 전기천공 (electroporation) 및 상동 재조합 조성물 (예를 들어, 핵산을 표적 세포 염색체 내의 기선택 위치 내에 통합시키기 위한)을 포함한다.
화합물은 단독으로 (예를 들어, 염수 또는 완충액으로) 또는 당업계에 공지된 임의의 전달 벡터를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 다음 전달 비히클이 문헌에 기개되어 있다: 코크리트 (cochleate) (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); 에멀좀 (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOM (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); 리포좀 (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); 살아있는 세균 벡터 (예, 살모넬라, 에스케리치아 콜라이, 바실러스 칼메트-구에린 (bacillus Calmette-Guerin), 시겔라 (Shigella), 락토바실러스 (Lactobacillus)) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al, 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); 살아있는 바이러스 벡터 (예, 박시니아, 아데노바이러스, 단순 헤르페스) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); 미세구 (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); 핵산 백신 (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); 중합체 (예, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); 중합체 고리 (Wyatt et al., 1998); 프로테오좀 (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); 불화나트륨 (Hashi et al., 1998); 트랜스제닉 (transgenic) 식물 (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); 비로좀 (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); 및 바이러스-유사 입자 (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998).
본 발명의 제제는 통상적으로 제약상 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 어쥬번트 (adjuvant), 및 임의로 다른 치료 성분을 포함할 수 있는 제약상 허용되는 용액으로 투여된다.
용어 제약상 허용되는 담체는 인간 또는 다른 척추동물에게 투여하기 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 피막 형성 물질을 의미한다. 용어 담체는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타내고, 그 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분이 담체와 조합된다. 또한, 제약 조성물의 성분은 요구되는 제약 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않는 방식으로 본 발명의 화합물과, 그리고 서로 혼합될 수 있다.
경구 투여를 위해, 화합물 (즉, siRNA 및 임의로 다른 치료제)은 활성 화합물(들)을 당업계에 공지된 제약상 허용되는 담체와 함께 배합함으로써 쉽게 제제화할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 화합물을 치료되는 대상체에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정제, 캡슐, 용액제, 겔제, 시럽, 슬러리 및 현탁액제 등으로 제제화되도록 할 수 있다. 경구 사용을 위한 제약 제제는 고체 부형제와 혼합하고, 임의로 생성되는 혼합물을 연마하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정제 코어를 얻음으로써 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예를 들어 당, 예를 들어 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨; 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및(또는) 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 원하는 경우, 붕해제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다. 임의로, 경구 제제는 내부 산성 상태를 중화시키기 위해 염수 또는 완충액, 예를 들어 EDTA 중에 제제화될 수 있거나, 임의의 담체 없이 투여될 수 있다.
또한, 상기 성분 또는 성분들의 경구 투여 형태가 특히 고려된다. 성분 또는 성분들은 유도체의 경구 전달이 효과적이도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학적 변형은 성분 분자 자체에 대한 적어도 하나의 잔기의 부착이고, 여기서 상기 잔기는 (a) 단백분해의 억제; 및 (b) 위 또는 장으로부터 혈류 내로의 흡수를 허용한다. 성분 또는 성분들의 전체 안정성의 증가 및 체내 순환 시간의 증가가 또한 요망된다. 상기 잔기의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린을 포함한다 (Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189). 사용될 수 있는 다른 중합체는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-트리옥소칸이다. 상기한 바와 같이 제약 용도에 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜 잔기이다.
성분 (또는 유도체)의 방출 위치는 위, 소장 (십이지장, 공장 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 당업자는 위에서 용해되지 않지만 십이지장 또는 장 내의 다른 위치에서 물질을 방출시키는 이용가능한 제제를 갖는다. 바람직하게는, 방출은 siRNA (또는 유도체)의 보호에 의해 또는 위 환경을 넘어, 예를 들어 장 내에 생물학적으로 활성을 갖는 물질의 방출에 의해 위 환경의 유해 효과를 피할 것이다.
충분한 위산 내성을 보장하기 위해, 적어도 pH 5.0에 불투과성인 코팅이 필수적이다. 장용 코팅으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), 유드라지트 (Eudragit) L30D, 아쿠아테릭, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 유드라지트 L, 유드라지트 S 및 셀락 (Shellac)이 있다. 이들 코팅은 혼합 필름으로 사용될 수 있다.
코팅 또는 코팅 혼합물은 또한 위에 대한 보호가 의도되지 않는 정제에도 사용될 수 있다. 이는 당 코팅, 또는 정제를 보다 삼키기 쉽게 만드는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 치료제, 즉, 분말의 전달을 위해 경질 외피 (예를 들어, 젤라틴)로 이루어질 수 있고; 액체 형태를 위해서는 연질 젤라틴 외피가 사용될 수 있다. 카세제의 외피 물질은 점조성 전분 또는 다른 식용 종이일 수 있다. 환제, 로젠지제, 성형 정제 또는 정제 연마분에 대해, 습식 매싱 (massing) 기술이 사용될 수 있다.
치료제는 제제 내에 약 1 mm 입자 크기의 과립 또는 펠렛 형태의 미세한 다수입자로서 포함될 수 있다. 캡슐 투여용 물질의 제제는 분말, 가볍게 압축된 플러그 (plug) 또는 심지어 정제로 존재할 수 있다. 치료제는 압축에 의해 제조될 수 있다.
착색제 및 향미제가 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, siRNA (또는 유도체)는 제제화된 후 (예를 들어 리포좀 또는 미세구 피막형성에 의해), 식용 제품, 예를 들어 착색제 및 향미제를 함유하는 냉장 음료 내에 포함될 수 있다.
불활성 물질을 사용하여 치료제를 희석하거나 부피를 증가시킬 수 있다. 이들 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, a-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 수크로스, 변형 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 특정 무기 염, 예를 들어, 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨이 또한 충전제로서 사용될 수 있다. 일부 시판 희석제로는 패스트-플로 (Fast-Flo), 엠덱스 (Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스 (Emcompress) 및 아비셀 (Avicell)이 있다.
치료제를 고체 투여 형태로 제제화할 때 붕해제가 포함될 수 있다. 붕해제로서 사용되는 물질은 전분, 예를 들어 전분 기재 시판 붕해제인 엑스플로탑 (Explotab)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 나트륨 전분 글리콜레이트, 앰버라이트, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 울트라마일로펙틴, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 오랜지 껍질, 산 카르복시메틸 셀룰로스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 모두 사용될 수 있다. 다른 형태의 붕해제는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말화 검이 붕해제 및 결합제로서 사용될 수 있고, 이들은 아가, 카라야 또는 트라가칸트와 같은 분말화 검을 포함할 수 있다. 알긴산 및 그의 나트륨염이 또한 붕해제로서 유용하다.
경질 정제를 형성하도록 치료제를 함께 유지하기 위해 결합제가 사용될 수 있고, 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 생성물로부터의 물질을 포함한다. 다른 것은 메틸 셀룰로스 (MC), 에틸 셀룰로스 (EC) 및 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC)가 모두 치료제를 과립화하기 위해 알콜 용액에서 사용될 수 있다.
제제화 공정 동안 점착을 방지하기 위해 항마찰제를 치료제의 제제에 포함시킬 수 있다. 윤활제는 치료제와 다이 벽 사이의 층으로서 사용될 수 있고, 스테아르산 및 그의 마그네슘 및 칼슘염, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액체 파라핀, 식물유 및 왁스를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 가용성 윤활제, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트, 마그네슘 라우릴 술페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카르보왁스 (Carbowax) 4000 및 6000이 또한 사용될 수 있다.
압축 동안 재배열을 돕기 위해 제제화 동안 약물의 유동성을 개선시킬 수 있는 활택제가 또한 첨가될 수 있다. 활택제는 전분, 활석, 발열원성 실리카 및 수화 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.
수성 환경 내로 치료제의 용해를 돕기 위해 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 음이온성 세제, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트를 포함할 수 있다. 양이온성 세제가 사용될 수 있고, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제제에 포함될 수 있는 가능한 비이온성 세제의 목록은 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 있다. 이들 계면활성제는 siRNA 또는 유도체의 제제 내에 단독으로 또는 상이한 비의 혼합물로서 존재할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 활성 성분을 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제 및(또는) 활석 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서는, 활성 화합물은 적절한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여용으로 제제화된 미세구가 사용될 수도 있다. 상기 미세구는 당업계에서 잘 규정되어 있다. 경구 투여용의 모든 제제는 상기 투여에 적합한 투여형으로 존재해야 한다.
구강 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 네뷸라이저 (nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이 제공 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 카트리지 및 캡슐은 화합물 및 적합한 분말 기제, 예를 들어 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화될 수 있다.
siRNA (또는 그의 유도체)의 폐 전달이 본원에서 또한 고려된다. siRNA (또는 유도체)는 흡입할 때 포유동물의 폐에 전달되고 폐 상피 내층을 가로질러 혈류로 들어간다. 흡입 물질에 대한 다른 보고는 문헌 [Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (류프롤리드 아세테이트); Braquet et al., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (엔도텔린-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, 111:206-212 (알파 1-항트립신); Smith et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a-1-프로테이나제); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March (재조합 인간 성장 호르몬); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (인터페론-감마 및 종양 괴사 인자) 및 플라츠 (Platz) 등의 미국 특허 5,284,656 (과립구 콜로니 자극 인자)]에 기재된 것을 포함한다. 전신 효과를 위한 약물의 폐 전달을 위한 방법 및 조성물은 미국 특허 5,451,569 (1995년 9월 19일 웡 (Wong) 등에게 허여됨)에 기재되어 있다.
치료 제품의 폐 전달을 위해 고안된 광범위한 기계 장치가 본 발명의 실시에서 사용하기 위해 고려되고, 네뷸라이저, 계량 용량 흡입기, 및 분말 흡입기를 포함하고, 이로 제한되지 않으며 이들은 모두 당업자에게 친숙하다.
본 발명의 실시에 적합한 시판되는 장치의 몇몇 특정한 예는 울트라벤트 (Ultravent) 네뷸라이저 (말린크로트, 인크. (Mallinckrodt, Inc., 미국 미주리주 세인트루이스) 제품); 아콘 (Acorn) II 네뷸라이저 (마르퀘스트 메디칼 프러덕츠 (Marquest Medical Products, 미국 콜로라도주 이글우드) 제품); 벤톨린 (Ventolin) 계량 용량 흡입기 (글락소 인크. (Glaxo Inc., 미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크) 제품); 및 스핀할러 (Spinhaler) 분말 흡입기 (피슨스 코퍼레이션 (Fisons Corp., 미국 매사추세츠주 베드포드))가 있다.
상기 모든 장치는 siRNA (또는 유도체)의 분배에 적합한 제제의 사용을 요구한다. 일반적으로, 각각의 제제는 사용된 장치의 종류에 특이적이고, 요법에 유용한 통상적인 희석제, 어쥬번트 및/또는 담체 이외에 적절한 추진제 물질의 사용을 수반할 수 있다. 또한, 리포좀, 미세캡슐 또는 미세구, 봉입체 (inclusion complex), 또는 다른 종류의 담체도 고려된다. 또한, 화학적으로 변형된 siRNA를, 화학적 변형의 종류 또는 사용된 장치의 종류에 따라 상이한 제제 중에 제조할 수 있다.
제트형 또는 초음파형 네뷸라이저에 사용하기 적합한 제제는 일반적으로 용액 1 mL당 약 0.1 내지 25 mg의 생물학적으로 활성을 갖는 siRNA의 농도로 물에 용해된 siRNA (또는 유도체)를 포함할 것이다. 또한, 제제는 완충액 및 간단한 당 (예를 들어, siRNA 안정화 및 삼투압 조절을 위해)을 포함할 수 있다. 또한, 네뷸라이저 제제는 에어로졸 형성시에 원자화 (atomization)에 의해 야기되는 siRNA의 표면 유도 응집을 감소시키거나 억제하기 위해 계면활성제를 포함할 수 있다.
계량 용량 흡입기 장치에 사용하기 위한 제제는 일반적으로 계면활성제의 도움으로 추진제 내에 현탁된 siRNA (또는 유도체)를 포함하는 미세 분할된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 상기 목적을 위해 사용되는 임의의 통상적인 물질, 예를 들어 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본, 또는 탄화수소, 예를 들어 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올, 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트리올레에이트 및 대두 레시틴을 포함한다. 올레산이 또한 계면활성제로서 유용할 수 있다.
분말 흡입기 장치로부터 분배하기 위한 제제는 siRNA (또는 유도체)를 포함하는 미세 분할된 건조 분말을 포함할 것이고, 장치로부터 분말의 분산을 용이하게 하는 양, 예를 들어 제제의 50 내지 90 중량％의 부피 형성제 (bulking agent), 예를 들어 락토스, 소르비톨, 수크로스, 또는 만니톨을 포함할 수 있다. siRNA (또는 유도체)는 가장 유리하게는 멀리 위치하는 폐까지 가장 효과적으로 전달하기 위해 평균 입자 크기가 10 ㎛ (미크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎛인 미립자 형태로 존재하여야 한다.
본 발명의 제약 조성물의 비강내 전달이 또한 고려된다. 비강내 전달은 치료 제품을 코로 투여한 직후에, 폐에서 제품 침착의 필요 없이 본 발명의 제약 조성물이 혈류로 직접 통과되도록 허용한다. 비강내 전달용 제제는 덱스트란 또는 시클로덱스트란을 갖는 것을 포함한다.
비강내 투여를 위해, 유용한 장치는 계량 용량 분무기가 부착된 작은 경질 병 (bottle)이다. 한 실시태양에서, 계량 용량은 본 발명의 제약 조성물을 한정된 부피의 챔버 내로 통하게 함으로써 전달되고, 상기 챔버는 챔버 내의 액체가 압축될 때 스프레이를 형성함으로써 에어로졸 제제를 에어로졸화하기 위한 크기의 천공을 갖는다. 챔버가 압축되어 본 발명의 제약 조성물을 투여한다. 특정 실시태양에서, 챔버는 피스톤 배열이다. 상기 장치는 상업적으로 이용가능하다.
별법으로, 압축될 때 스프레이를 형성함으로써 에어로졸 제제를 에어로졸화하기 위한 크기의 천공 또는 개구부를 갖는 플라스틱 압축 (squeeze) 병이 사용된다. 상기 개구부는 보통 병의 상단부에 존재하고, 상기 상단부는 일반적으로 에어로졸 제제의 효율적인 투여를 위해 비강 통로에 부분적으로 맞도록 끝이 가늘어진다. 바람직하게는, 코 흡입기는 계량된 약물 용량의 투여를 위해 계량된 양의 에어로졸 제제를 제공할 것이다.
전신 전달이 바람직한 경우, 화합물은 주사, 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들어, 앰플 또는 다중 투여 용기 내에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태일 수 있고, 제제화제, 예를 들어 현탁제, 안정화제 및(또는) 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제약 제제는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액이 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 물질을 함유할 수 있다.
별법으로, 활성 화합물은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 무발열원의 물에 재구성하는 분말 형태일 수 있다.
화합물은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 베이스를 함유하는 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장 또는 질내 조성물로 제제화할 수 있다.
상기 설명한 제제에 추가하여, 화합물은 또한 데포 (depot) 제제로서 제제화될 수 있다. 상기 지속성 제제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.
또한, 제약 조성물은 적합한 고체 또는 겔상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
적합한 액체 또는 고체 제약 제제 형태는 예를 들어 흡입용 수용액 또는 염수 용액, 미세캡슐화, 달팽이껍질화 (encochleated), 초소형 금 입자 상에 코팅된, 리포좀 내에 함유된, 분무된, 에어로졸, 피부 이식용 펠렛, 또는 피부를 긁기 위한 날카로운 물체 상에 건조된 형태가 있다. 제약 조성물은 또한 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, (미세)캡슐, 좌제, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 크림, 점적제 또는 활성 화합물을 지속 방출시키는 제제를 포함하며, 상기 제제에서 부형제 및 첨가제 및(또는) 보조제, 예를 들어 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제, 향미제, 감미제 또는 가용화제를 상기 설명된 바와 같이 통상적으로 사용한다. 제약 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 약물 전달 방법에 대한 간단한 검토를 위해 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Langer, Science 249:1527-1533, 1990]을 참조한다.
siRNA, 및 경우에 따라서는 다른 치료제는 그 자체로 (순수), 또는 제약상 허용되는 염 형태로 투여될 수 있다. 의약으로 사용되는 경우, 염은 제약상 허용되는 것이어야 하지만, 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해 제약상 허용되지 않는 염을 편리하게 사용할 수 있다. 이러한 염으로는 하기 산으로부터 제조되는 것들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산, 및 벤젠술폰산. 이러한 염은 또한 알칼리 금속염 또는 알칼리토금속염, 예를 들어 카르복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염으로서 제조할 수 있다.
적합한 완충제에는 다음의 것들이 포함된다: 아세트산 및 그의 염 (1-2％ w/v); 시트르산 및 그의 염 (1-3％ w/v); 붕산 및 그의 염 (0.5-2.5％ w/v); 및 인산 및 그의 염 (0.8-2％ w/v). 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03％ w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9％ w/v); 파라벤 (0.01-0.25％ w/v) 및 티메로살 (0.004-0.02％ w/v) 등이 있다.
본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 중에 포함된 유효량의 siRNA 및 임의로 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
구체적으로 siRNA를 포함하고 이로 제한되지 않는 치료제(들)이 입자에 제공될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 입자는 그 전체 또는 일부가 본원에 기재된 siRNA 또는 다른 치료제(들)로 구성될 수 있는 나노입자 또는 미세입자 (또는 일부 경우에, 보다 큰 입자)를 의미한다. 입자는 장용 코팅을 포함하고 이로 제한되지 않는 코팅으로 둘러싸인 코어 내에 치료제(들)을 포함할 수 있다. 또한, 치료제(들)은 입자 전체에 걸쳐 분산될 수 있다. 또한, 치료제(들)은 입자 내에 흡착될 수 있다. 입자는 0차 (zero order) 방출, 1차 (first order) 방출, 2차 (second order) 방출을 포함하는 임의의 차수의 방출 동역학, 지연방출, 지효성, 속효성, 및 이들의 임의의 조합 등을 보일 수 있다. 입자는 치료제(들) 이외에, 침식성, 비침식성, 생체분해성, 또는 비생체분해성 물질 또는 이들의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는, 약학 및 의약 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 입자는 용액 또는 반-고체 상태로 siRNA를 포함하는 미세캡슐일 수 있다. 입자는 실질적으로 임의의 형태일 수 있다.
비-생체분해성 및 생체분해성 중합체 물질 모두가 치료제(들)의 전달을 위한 입자 제조에 사용될 수 있다. 상기 중합체는 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 방출이 요구되는 기간을 기초로 하여 선택된다. 특히 관심의 대상이 되는 생체결합성 중합체는 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [H.S. Sawhney, CP. Pathak and J.A. Hubell in Macromolecules, (1993) 26:581-587]에 기재된 생체침식성 히드로겔을 포함한다. 이들은 폴리히알루론산, 카제인, 젤라틴, 글루틴, 폴리안히드라이드, 폴리아크릴산, 알기네이트, 키토산, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트)를 포함한다.
치료제(들)은 제어 방출 시스템에 포함될 수 있다. 용어 "제어 방출"은 제제로부터 약물이 방출되는 방식 및 프로필이 제어되는 임의의 약물-함유 제제를 의미하고자 한 것이다. 이것은 속효성 및 비-속효성 제제를 의미하고, 비-속효성 제제는 지효성 및 지연방출 제제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 용어 "지효성" ("서방성"으로도 언급됨)은 연장된 기간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 제공하고, 바람직하게는, 반드시 그런 것은 아니지만, 연장된 기간에 걸쳐 약물의 실질적으로 일정한 혈액 수준을 생성시키는 약물 제제를 의미하기 위해 그의 통상적인 의미로 사용된다. 용어 "지연 방출"은 제제의 투여와 그로부터 약물의 방출 사이에 시간 지연이 존재하는 약물 제제를 의미하기 위해 그의 통상적인 의미로 사용된다. "지연 방출"은 연장된 기간에 걸친 약물의 점진적인 방출을 수반하거나 수반하지 않을 수 있고, 따라서, "지효성"이거나 아닐 수 있다.
장기간 지효성 이식물의 사용은 만성 병태의 치료에 특히 적합할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "장기간" 방출은 이식물이 치료 수준의 활성 성분을 적어도 7일, 바람직하게는 30-60일 동안 전달하도록 제조되어 배치됨을 의미한다. 장기간 지효성 이식물은 당업자에게 공지되어 있고, 상기한 방출 시스템의 일부를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 생각하지 않아야 한다. 본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참조문 (학술 문헌, 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시계류 중의 특허 출원 포함)의 전체 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1
단일가닥 및 이중가닥 RNA 종의 제조
인간 MAPK2 (Erk2) 및 Lamin AC 유전자의 서열로부터 유도된 siRNA로서 사용하기 위해 선택된 일련의 합성 단일가닥 올리고리보뉴클레오티드 (ssORN)이 쌍을 통상적인 기술 및 시약을 사용하여 제조하였다. 이중가닥 siRNA로서 사용하기 위해, 각각의 쌍의 단일가닥 멤버를 적합한 열 조건 하에서 어닐링시킨 후, HPLC를 사용하여 잔류하는 ssORN로부터 이중가닥 siRNA를 단리하였다. 서열을 표 1에 나열하고, 여기서 각각의 뉴클레오티드는 비변형된 리보뉴클레오티드이고, 표시된 것을 제외하고 각각의 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르이다. 이중가닥 siRNA 구조체는 한 말단에 또는 두 말단 모두에 0-2개의 비페어링된 뉴클레오티드 (즉, 단일가닥 오버행)을 포함하는 것으로 예상될 것이다.
Figure 112008026615271-PCT00001
*굵게 표시한 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결은 변형된 것이고, 본원에 기재된 2' 당 변형 및 2개의 3'-말단 뉴클레오티드 사이의 안정화된 연결로부터 선택되었다.
실시예 2
이중가닥 siRNA 의 센스 가닥의 변형은 siRNA 에 의한 면역자극을 억제한다.
인간 PBMC는 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 개인의 전체 혈액으로부터 단리하였다. 이어서, 단리된 PBMC를 적합한 배양 배지 내에서 멀티웰 배양판의 개별 웰 내로 플레이팅하였다. 다양한 이중가닥 siRNA를 DOTAP의 존재 하에 일정 농도 (약 2 nM 내지 약 0.5 μM)에 걸쳐 개별 웰에 첨가하고, 세포를 24h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 배양 상등액을 수거하고, 적합한 ELISA를 사용하여 IFN-알파 및 IL-12p40에 대해 분석하였다. 시험된 다양한 이중가닥 siRNA는 MAPK2, MAPK2 Exp27, MAPK2 Exp30, Lamin AC, Lamin AC Exp27 및 Lamin AC Exp30이었다. 그 결과를 도 1에 제시한다. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 siRNA의 센스 가닥에 2' 당 변형을 갖는 뉴클레오티드를 포함시키면, siRNA와 함께 24 h 인큐베이션한 후에 PBMC에 의해 분비된 IFN-알파, 및 특히 IL-12p40의 양이 놀랍게도 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
실시예 3
이중가닥 siRNA 의 센스 가닥의 변형은 siRNA 에 의한
면역자극을 억제하기에 충분하다.
실시예 2에서와 같이 인간 PBMC를 단리하고 멀티웰 배양판 내로 플레이팅하였다. 다양한 종의 단일가닥 및 이중가닥 RNA를 DOTAP의 존재 하에 일정 농도 (약 2 nM 내지 약 0.5 μM)에 걸쳐 개별 웰에 첨가하고, 세포를 24h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 배양 상등액을 수거하고, 적합한 ELISA를 사용하여 IFN-알파 및 IL-12p40에 대해 분석하였다. 실험은 이중가닥 (s:as) siRNA를 대응하는 개별 센스 및 안티센스 단일가닥 RNA와 비교하도록 설계하였다. 시험된 다양한 이중가닥 siRNA는 MAPK2, MAPK2 Exp27, MAPK2 Exp30, Lamin AC, Lamin AC Exp27 및 Lamin AC Exp30이었다. 시험된 다양한 단일가닥 RNA는 MAPK2 s, MAPK2 as, MAPK2 Exp27 s, MAPK2 Exp27 as, MAPK2 Exp30 s, MAPK2 Exp30 as, Lamin AC s, Lamin AC as, Lamin AC Exp27 s, Lamin AC Exp27 as, Lamin AC Exp30 s 및 Lamin AC Exp30 as이었다. 그 결과를 도 2에 제시한다. 데이타는 평균 ± SEM으로 제시하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 상기 siRNA의 센스 가닥에 2' 당 변형을 갖는 뉴클레오티드를 포함시키면, 이중가닥 siRNA 또는 단일가닥 센스 가닥 단독과 함께 24 h 인큐베이션한 후에 PBMC에 의해 분비된 IFN-알파, 및 특히 IL-12p40의 양이 놀랍게도 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이와 대조적으로, 변형된 안티센스 가닥 단독의 경우에는 강한 면역자극성이 계속 유지되었다. 그러나, 상기 동일한 안티센스 가닥은 이중가닥 siRNA의 맥락 (context)에서 제시될 경우 면역자극성이 훨씬 더 작았고, 이것은 센스 가닥을 수반하는 변형만이 이중가닥 siRNA의 면역자극 능력 감소에 필요하고 충분하다는 개념과 일치하였다.
실시예 4
면역자극 능력이 감소한 변형된 siRNA 는 유전자 침묵 특성을 유지한다.
변형 siRNA의 유전자 침묵 특성을 평가하기 위해, 실시예 2에 설명된 바와 같이 단리되고 배양된 인간 PBMC를, 프로빙되는 각각의 전사체에 대해 적합한 프라이머쌍을 사용하는 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 방법을 이용하여 MAPK2 및 lamin AC 전사체에 대해 분석하였다. 측정치를 정규화하기 위해 하우스키핑 (housekeeping) 유전자에 대한 전사체도 측정하였다. 웨스턴 (Western) 블롯팅 및 면역세포화학을 사용하여 단백질 MAPK2의 대응하는 감소를 확인하였고, lamin AC 전사체 수준은 siRNA의 농도를 기준으로 용량-의존 방식으로, 변형된 siRNA 및 대응하는 대조군 siRNA에 대한 유사한 수준으로 유의하게 저하되었다.
실시예 5
siRNA 의 센스 가닥에서 다른 뉴클레오티드 2' 당 변형은
면역자극을 감소시키고 유전자 침묵을 보존한다.
siRNA의 센스 가닥 내의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 다음과 같은 다양한 임의의 2' 당 변형을 갖도록 하여 추가의 siRNA를 합성하였다: 2'-O-메틸, 2'-데옥시, 2'-플루오로-2'-데옥시, 2'-아미노-2'-데옥시, 2'-메톡시에틸 (MOE), 2'-O-알릴, 2'-프로피닐, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-프로필, 2'-O-부틸, 또는 일반적으로 2'-O-알킬, 2'-O-알케닐, 및 2'-O-알키닐. 또한, 잠금 핵산 (LNA) 및 아라비노시드를 사용하였다. 다양한 2' 당을 센스 가닥을 따라 다양한 위치에 다양한 수로 도입하였다. 면역자극 및 유전자 침묵 효과를 상기 실시예 2-4에 기재된 바와 유사한 방식으로 평가하였다.
실시예 6
센스 가닥에 안정한 뉴클레오티드간 연결의 도입
센스 가닥 내에 다음과 같은 적어도 하나의 임의의 뉴클레오티드간 연결을 갖도록, siRNA의 센스 가닥 내의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 다양한 2' 당 변형이 도입된 추가의 siRNA를 합성하였다: 티오포름아세탈, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스포네이트, 포름아세테이트, 및 다른 데포스포 유사체 (본원에 참고로 포함된 문헌 [Uhlmann and Peyman, 1993, Oligonucleotide analogs containing dephospho internucleotide linkages, Methods in Molecular Biology, 20:355, Humana Press]에 기재됨). 다양한 2' 당 및 뉴클레오티드간 연결 변형을 센스 가닥을 따라 다양한 위치에 다양한 수로 도입하였다. 면역자극 및 유전자 침묵 효과를 상기 실시예 2-4에 기재된 바와 유사한 방식으로 평가하였다.
균등물:
상기 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 실시예는 단지 본 발명의 한 측면에 대한 일례로서 의도되고 다른 기능적으로 균등한 실시태양이 본 발명의 범위 내에 포함되기 때문에, 본 발명은 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 제시되고 본원에서 설명된 것에 추가하여 당업자는 상기 상세한 설명을 통해 본 발명의 다양한 변형을 분명하게 알 수 있을 것이고, 상기 변형은 첨부된 청구의 범위에 포함된다. 본 발명의 잇점 및 목적이 본 발명의 각각의 실시태양에 의해 포함될 필요는 없다.
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Claims (45)

  1. 각각의 가닥이 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)을 포함하는 조성물로서, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이고 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 (locked) 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아닌 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 2' 변형을 갖는 당을 갖는 하나의 변형된 뉴클레오티드만을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 2' 변형을 갖는 당을 갖는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2' 변형을 갖는 당을 갖는 각각의 변형된 뉴클레오티드는 서로 독립적으로 선택되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 2' 변형이 2'-O-알킬, 2'-O-알케닐, 및 2'-O-알키닐로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 단, 2'-O-알킬은 2'-O-메틸을 제외하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 2' 변형이 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-프로피닐, 2'-아 미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-프로필, 및 2'-O-부틸로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 2' 변형이 2'-데옥시, 2'-플루오로, 및 2'-아미노로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 2' 변형이 2'-플루오로인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 2' 변형이 2'-O-알케닐, 2'-O-알키닐, 2'-메톡시에틸, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 및 2'-아미노로부터 선택되는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 말단에서 발생하는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 센스 가닥의 3' 말단에서 발생하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 대하여 내부에서 발생하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 센스 가닥이, 센스 가닥의 5' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 센스 가닥의 3' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 센스 가닥이 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 센스 가닥이, 티오포름아세탈, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스포네이트, 및 포름아세테이트로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는 것인 조성물.
  16. 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)의 센스 가닥 내로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아니고, 상기 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖고, 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성 인, 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)의 면역자극 능력을 감소시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 도입이 2' 변형을 갖는 당을 갖는 하나의 변형된 뉴클레오티드만을 도입하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 도입이 2' 변형을 갖는 당을 갖는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 도입하는 것이고, 여기서 2' 변형을 갖는 당을 갖는 각각의 변형된 뉴클레오티드는 서로 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 2' 변형이 2'-O-알킬, 2'-O-알케닐, 및 2'-O-알키닐로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 단, 2'-O-알킬은 2'-O-메틸을 제외하는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 2' 변형이 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-프로피닐, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-프로필, 및 2'-O-부틸로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 2' 변형이 2'-데옥시, 2'-플루오로, 및 2'-아미노로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 2' 변형이 2'-플루오로인 방법.
  23. 제16항에 있어서, 2' 변형이 2'-O-알케닐, 2'-O-알키닐, 2'-메톡시에틸, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 및 2'-아미노로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  24. 제16항에 있어서, 도입이 센스 가닥의 5' 말단에서 발생하는 것인 방법.
  25. 제16항에 있어서, 도입이 센스 가닥의 3' 말단에서 발생하는 것인 방법.
  26. 제16항에 있어서, 도입이 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 대하여 내부에서 발생하는 것인 방법.
  27. 제16항에 있어서, 도입이 센스 가닥의 5' 말단에서 및 센스 가닥의 3' 말단에서 발생하는 것인 방법.
  28. 제16항에 있어서, 센스 가닥이 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 것인 방법.
  29. 제16항에 있어서, 센스 가닥이 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는 것인 방법.
  30. 제16항에 있어서, 센스 가닥이 티오포름아세탈, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스포네이트, 및 포름아세테이트로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는 것인 방법.
  31. 표적 서열을 갖는 유전자를 포함하는 세포를, 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 유효량의, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중가닥의 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 5' 말단 및 3' 말단을 갖고, 안티센스 가닥은 표적 서열에 상보성이고, 센스 가닥은 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 단, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 아닌 것인, 표적 서열을 갖는 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 센스 가닥이 2' 변형을 갖는 당을 갖는 하나의 변형된 뉴클레오티드만을 포함하는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 센스 가닥이 2' 변형을 갖는 당을 갖는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2' 변형을 갖는 당을 갖는 각각의 변형된 뉴클레오티드가 서로 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 2' 변형이 2'-O-알킬, 2'-O-알케닐, 및 2'-O-알키닐로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 단, 2'-O-알킬은 2'-O-메틸을 제외하는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 2' 변형이 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-프로피닐, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 2'-O-프로필, 및 2'-O-부틸로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 2' 변형이 2'-데옥시, 2'-플루오로, 및 2'-아미노로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 2' 변형이 2'-플루오로인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 2' 변형이 2'-O-알케닐, 2'-O-알키닐, 2'-메톡시에틸, 2'-아미노프로파르길, 2'-O-(3-아미노프로필), 및 2'-아미노 중에서 선택되는 것인 방법.
  39. 제31항에 있어서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 말단에서 발생하는 것인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오 티드가 센스 가닥의 3' 말단에서 발생하는 것인 방법.
  41. 제31항에 있어서, 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단에 대하여 내부에서 발생하는 것인 방법.
  42. 제31항에 있어서, 센스 가닥이, 센스 가닥의 5' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및 센스 가닥의 3' 말단에 2' 변형을 갖는 당을 갖는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  43. 제31항에 있어서, 센스 가닥이 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 것인 방법.
  44. 제31항에 있어서, 센스 가닥이 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는 것인 방법.
  45. 제31항에 있어서, 센스 가닥이, 티오포름아세탈, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 보라노포스포네이트, 및 포름아세테이트로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 안정화된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 안정화된 주쇄를 갖는 것인 방법.
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