PT1733735T - Métodos e produtos para induzir imunidade mucosal - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS E PRODUTOS PARA INDUZIR IMUNIDADE MUCOSAL

Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com métodos e produtos para induzir imunidade mucosal. Em particular, a invenção relaciona-se com a utilização de oligonucleótidos imunoestimuladores que contêm um motivo CpG sós ou em combinação com outros adjuvantes mucosais para induzir a imunidade mucosal.

Antecedentes da Invenção

Foram identificados dois compartimentos distintos do sistema imunológico: (i) o sistémico, que compreende a medula óssea, o baço e os nódulos linfáticos, e (ii) o mucosal que compreende o tecido linfóide associado com as superficies mucosais e glândulas de secreção externa (McGhee et al., 1992). As superficies mucosais são associadas com os tractos gastrointestinal (GI), génito-urinário (GU) e respiratório. Cada compartimento está associado tanto com as respostas humorais (anticorpos) como as mediadas por células (células T citotóxicas), no entanto, há diferenças na natureza das respostas imunológicas induzidas em cada compartimento. Os anticorpos associados com o compartimento sistémico são predominantemente do isotipo IgG, que funcionam para neutralizar os agentes patogénicos no sistema circulatório. Em contraste, os anticorpos nas mucosas são principalmente os anticorpos secretórios IgA (S-IgA) , que funcionam para evitar a entrada do agente patogénico no organismo por meio da superfície da mucosa (Lamm et al., 1992) . A imunidade sistémica não pode impedir a entrada de organismos patogénicos nas superfícies das mucosas. A imunização sistémica eficaz (isto é, a administração de antigénio ao compartimento sistémico) induzirá a imunidade sistémica mas, de um modo geral, não produz respostas de imunidade mucosal. Em contraste, os antigénios administrados nas superficies mucosais desencadeiam respostas tanto mucosais (em sítios locais e, algumas vezes, em sítios distantes) como sistémicas (Haneberg et al., 1994, Gallichan e Rosenthal, 1995). A maior parte das vacinas desenvolvidas até a presente data são administradas por via parentérica, por exemplo, por meio de injecções intramusculares (IM) ou intradérmicas (ID) e, como tal, induzem principalmente a imunidade sistémica. No entanto, a área combinada da superfície mucosal é mais de 200 vezes maior do que a da pele e é o sítio principal de transmissão de inúmeras doenças infecciosas. Deste modo, as estratégias actuais de vacinação permitem que o agente patogénico penetre no organismo e só o combate quando o mesmo está em circulação. As taxas de infecção e de morbidade poderiam ser reduzidas se pudesse ser induzida a imunidade mucosal eficaz. Além disso, há indícios de que as vacinas mucosais podem ter uma gama de idade de recipientes mais ampla. Finalmente, as vacinas mucosais são administradas, muitas vezes, por meios não invasivos (por exemplo, gotas nasais, pulverizador nasal, nebulizador inalado), deste modo, as mesmas são mais fáceis e menos dispendiosas para administrar, têm menos necessidade de pessoal treinado e nenhum risco de ferimento por agulha ou contaminação cruzada (para apreciações ver Mestecky et al., 1992, Staats et al., 1994, O. Hagan, 1994).

Conforme mencionado acima, a marca de qualidade da imunidade mucosal é a produção local de anticorpos S-IgA. Estes constituem >80% de todos os anticorpos em tecidos associados a mucosas e são induzidos, transportados e regulados por mecanismos bastante diferentes daqueles da resposta sistémica. O IgA é de suprema importância para a defesa do hospedeiro porque actua não apenas para resistir aos agentes patogénicos estritamente mucosais como também a muitos microrganismos que inicialmente colonizam as superfícies das mucosas porém, subsequentemente, provocam doença sistémica. Parece haver três sítios de defesa mucosal mediados por IgA: (i) no lúmen, onde o S-IgA pode neutralizar os vírus, toxinas bacterianas e enzimas e actuar como uma barreira mucosal para evitar ligação virai, aderência microbiana e adsorção de antigénio; (ii) no interior de células epiteliais onde o IgA dimérico pode ligar-se ao antigénio intracelular; (iii) no interior da lâmina própria onde o IgA dimérico pode complexar com o antigénio e o complexo imunológico assim formado, transportado para o lúmen (Lamm et al., 1992).

Muitas vacinas em desenvolvimento são compostas de antigénios sintéticos ou recombinantes (péptidos ou polipéptidos). Estes são considerados mais seguros do que os agentes patogénicos tradicionais atenuados ou inteiros desactivados, porém os mesmos são frequentemente imunogénicos deficientes e necessitam de adjuvantes para intensificar a imunidade específica. Para a administração sistémica, os precipitados de alumínio (alúmen) podem ser adicionados aos antigénios para aumentar as respostas imunológicas. O alúmen é actualmente o único adjuvante licenciado para utilização em seres humanos na maior parte dos países, incluindo os EUA, no entanto, não é adequado para administração a superfícies mucosais. Deste modo, a maioria das vacinas mucosais utilizadas na actualidade contêm organismos vivos atenuados, e tem-se obtido pouco sucesso com a administração mucosal de vacinas de subunidades. A toxina da cólera (CT) é o adjuvante mucosal mais vulgarmente utilizado em modelos animais. A CT é a enterotoxina principal produzida pelo Vibrio cholerae. É uma proteína polimérica de 84 kilodalton consistindo em duas subunidades, uma subunidade monomérica A e uma subunidade B em forma de anel pentamérico. A subunidade B liga os gangliósidos GM1 na superfície de células eucarióticas e permite a inserção da subunidade A no interior do citosol, onde este ADP-ribosila as proteínas reguladoras ligantes de GTP associadas com a adenilato ciclase (Spangler, 1992). A CT intensifica a apresentação de antigénio por macrófagos, células epiteliais e células B, promove a diferenciação e troca de isotipo em células B e tem efeitos inibitórios e estimulatórios complexos sobre a proliferação das células Tea produção da linfocina (Snider, 1995) . Alguns grupos informam que a CT pode activar, de forma selectiva, células T CD4+ do tipo Th2 ao mesmo tempo que inibem as células do tipo Thl (Takahashi et al., 1996,) ao passo que outros registam a activação tanto das células T CD4+ do tipo Thl como Th2 (Hornquist e Lycke, 1993) . As diferenças podem ser devido a inúmeros factores incluindo a via de imunização e a natureza do antigénio. A endotoxina termolábil Escherichia coli (toxina lábil, LT) é estreitamente relacionada do ponto de vista estrutural e funcional à CT e tem propriedades adjuvantes semelhantes (Lycke et al., 1992). A LT pode conferir imunidade a antigénios co-administrados que por si só não são imunogénicos quando administrados por vias mucosais; este efeito adjuvante é observado quer a LT seja simplesmente misturada quer seja fisicamente acoplada com o antigénio I (Holmgren et al., 1993).

Embora muito eficazes como adjuvantes mucosais em modelos animais, a CT e a LT são altamente tóxicas, e especialmente em seres humanos. Foram desenvolvidos mutantes geneticamente destoxifiçados tanto da CT como da LT, utilizando mutagénese sítio dirigida, que, pelo menos em modelos animais parecem ser menos tóxicas e, no entanto, retêm alguma adjuvanticidade (por exemplo, a LTK63 é a LT com uma única substituição na serina-63) (Rappuoli et al., 1995, Douce et al., 1994, Pizza et al., 1994, De Haan et al., 1996) . No entanto, o nível de adjuvanticidade parece ser proporcional ao nível de toxicidade retida e, assim sendo, há uma necessidade evidente para um adjuvante mucosal seguro e eficaz.

Sumário da Invenção A presente invenção relaciona-se com um oligonucleótido CpG imunoestimulador, para utilização como adjuvante mucosal para induzir uma resposta imunológica contra um antigénio administrado a um tecido mucosal. As formas de realização preferidas da invenção são descritas nas reivindicações 2-7 apensas.

Numa forma de realização o antigénio não é codificado num vector de ácido nucleico. Numa outra forma de realização o antigénio é codificado por um vector de ácido nucleico, que opcionalmente pode ser o vector plasmídeo. Ainda noutra forma de realização o vector plasmídeo inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica operacionalmente uma citocina. De preferência, o antigénio e o vector plasmídeo são administrados por via oral ou intranasal. Em algumas formas de realização pelo menos 50 pg do vector plasmídeo são administrados ao indivíduo.

Em algumas formas de realização da invenção o oligonucleótido tem um esqueleto seleccionado do grupo que consiste num esqueleto de fosfodiéster e um esqueleto quimérico. Noutras formas de realização o oligonucleótido tem um esqueleto de fosforotioato. Nas formas de realização em que o oligonucleótido tem um esqueleto de fosforotioato e em que o antigénio é codificado por um vector de ácido nucleico é uma forma de realização preferida, mas não limitada, que o plasmídeo e os oligonucleótidos são administrados com um sistema de dispersão coloidal. Nalgumas formas de realização o sistema de dispersão coloidal é seleccionado do grupo que consiste em complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, esférulas e sistemas à base de lipidos. Noutras formas de realização o plasmideo e o oligonucleótido são revestidos com partículas de ouro de são administrados com uma pistola para injecção de gene (gene-gun) .

Numa forma de realização o antigénio e o oligonucleótido são administrados a uma superfície mucosal do indivíduo.

Nalgumas formas de realização o antigénio é administrado por via oral, intranasal, ocular, vaginal ou rectal. Noutras formas de realização o antigénio é administrado simultaneamente com o oligonucleótido. A invenção pode envolver uma indução da imunidade mucosal. A imunidade mucosal pode ser induzida num sítio local e/ou remoto. Nalgumas formas de realização a imunidade mucosal é induzida num sítio local e noutras a imunidade mucosal é induzida num sítio remoto, ou ambos. A fim de induzir uma resposta imunológica mucosal o oligonucleótido CpG pode ser administrado com uma dose inicial, uma dose de reforço ou ambas. Por exemplo, o oligonucleótido CpG pode ser administrado com uma dose preparatória de antigénio. Noutra forma de realização o oligonucleótido CpG é administrado com uma dose de reforço do antigénio. Nalgumas formas de realização o indivíduo é administrado com uma dose preparatória do antigénio e oligonucleótido CpG antes da dose de reforço. Ainda noutras formas de realização o indivíduo é administrado com uma dose de reforço de antigénio e oligolucleótido CpG depois da dose preparatória. 0 oligonucleótido CpG pode ter uma sequência que inclui pelo menos a seguinte fórmula: 5' X1X2CGX3X43' em que C e G são não metilados, em que Χχ, X2, X3 e X4 são nucleótidos. 0 indivíduo pode ser activamente exposto ao antigénio ou passivamente exposto ao antigénio. Numa forma de realização da invenção o indivíduo é activamente exposto ao antigénio e o antigénio é administrado a uma superfície mucosal. Noutras formas de realização o antigénio é administrado simultaneamente com o oligonucleótido. O antigénio pode ser administrado só ou em associação com um sistemas de dispersão coloidal. Nalgumas formas de realização o sistema de dispersão coloidal é seleccionado do grupo que consiste em complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, esférulas e sistemas à base de lípidos. Os sistemas à base de lípidos incluem, opcionalmente, emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas ou lipossomas.

Noutras formas de realização o indivíduo é passivamente exposto ao antigénio através do contacto ambiental. 0 indivíduo que é passivamente exposto ao antigénio em alguns ambientes é um indivíduo em risco de desenvolver uma reacção alérgica, uma doença infecciosa ou um cancro. Noutras formas de realização o indivíduo tem uma doença infecciosa, um cancro, uma alergia ou é um asmático. 0 antigénio que é passiva ou activamente administrado ao indivíduo é qualquer tipo de antigénio conhecido na técnica e inclui, por exemplo, células, extractos de células, proteínas, polipéptidos, péptidos, polissacáridos, conjugados de polissacáridos, péptidos imitadores de polissacáridos, lípidos, glicolípidos, hidratos de carbono, alergénios, vírus e extractos virais e organismos multicelulares, tais como parasitas. Numa forma de realização o antigénio é derivado de um organismo infeccioso seleccionado do grupo que consiste em bactérias infecciosas, vírus infecciosos, parasitas infecciosos e fungos infecciosos.

Um adjuvante mucosal não-oligonuclétido pode ser administrado em associação com o antigénio. Os adjuvantes mucosais não oligonucleótidos podem incluir, por exemplo, a toxina da cólera, derivados da toxina da cólera, toxina lábil, derivados de toxina lábil, alúmen, MLP, MDP, saponinas, tais como QS21, citocinas, formulações de emulsões óleo-em-água e outras, tais como MF59, SAF, Montanide ISA 720 e PROVAX, polímeros PCPP e ISCOMS.

Noutras formas de realização uma citocina ou uma molécula co-estimulatória B-7 pode ser administrada ao indivíduo.

Nalgumas formas de realização, o oligonucleótido é administrado a um indivíduo por via oral, mucosal, ocular, vaginal, rectal ou por inalação. O oligonucleótido pode ser modificado. Por exemplo, nalgumas formas de realização, pelo menos um nucleótido tem uma modificação no esqueleto de fosfato. A modificação no esqueleto de fosfato pode ser uma modificação do fosforotioato ou do fosforoditioato. Nalgumas formas de realização a modificação do esqueleto de fosfato ocorre no lado 5' do oligonucleótido ou no lado 3' do oligonucleótido. O oligonucleótido pode ser de qualquer tamanho. De preferência, o oligonucleótido tem 8 a 100 nucleótidos. Noutras formas de realização o oligonucleótido tem 8 a 40 nucleótidos de comprimento.

Nalgumas formas de realização XiX2 são nucleótidos seleccionados do grupo que consiste em: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, Cp A, CpG, TpA, TpT e TpG; e X3X4 são nucleótidos seleccionados do grupo que consiste em: TpT, CpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA e CpA. De preferência, XiX2 são GpA ou GpT e X3 e X4 são TpT. Noutras formas de realização preferidas Xi ou X2 ou ambos são purinas e X3 ou X4 são ambos pirimidinas ou XiX2 são GpA e X3 ou X4 são ambos pirimidinas. Numa forma de realização X2 é um T e X3 é uma pirimidina. O nucleótido pode ser isolado ou sintético.

Nalgumas formas de realização o oligonucleótido tem uma sequência que inclui pelo menos a seguinte fórmula: 5 ' TCNTXiX2CGX3X43 ' em que Xi, X2, X3 e X4 são nucleótidos, N é uma sequência de ácido nucleico composta de cerca de 0-25 nucleótidos.

Outras formas de realização englobam composições farmacêuticas para a administração de oligonucleótidos CpG por via oral, intranasal, ocular, vaginal ou rectal. Num aspecto a composição é uma formulação oral de um oligonucleótido CpG num tampão para neutralizar os ácidos biológicos. Num outro aspecto a composição é uma formulação intranasal de um oligonucleótido CpG num aerossol. Noutros aspectos a composição é uma formulação vaginal ou rectal de um oligonucleótido CpG num supositório ou outro veiculo adequado para administração ao tecido vaginal ou rectal. Noutro aspecto a composição é uma formulação ocular de um oligonucleótido CpG numa solução compatível com o olho. Tais formulações estão aqui descritas, bem como em Remingtons Pharmaceutical Sciences, que é aqui incorporado por referência.

Cada uma das limitações da invenção pode englobar várias formas de realização da invenção. Deste modo, é levado em consideração que cada uma das limitações da invenção que engloba qualquer um elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspecto da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes adjuvantes em titulações totais de IgG anti-HBS, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 ou 10 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou adjuvantes de oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90). A Figura 2 é um gráfico que representa o efeito de diferentes adjuvantes sobre as titulações totais de IgG anti-HBS, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou adjuvantes de oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e às 8 semanas os murganhos receberam doses de reforço da mesma maneira que as doses preparatórias . A Figura 3 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes adjuvantes sobre o isotipo IgG anti-HBs, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou adjuvantes de oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) (1 pg) e às 8 semanas os murganhos receberam doses de reforço da mesma maneira que as doses preparatórias. A Figura 4 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes adjuvantes sobre a resposta CTL específica para HBsAg, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (10 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou adjuvantes de oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) em doses diferentes (1 ou 10 pg) e quatro semanas depois da imunização os murganhos foram mortos por overdose de Halotano, os esplenócitos foram isolados e a actividade CTL especifica para HBsAg foi medida. A Figura 5 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes adjuvantes sobre as titulações de IgA anti-HBs em lavagens de pulmões, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 ou 10 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou adjuvantes de oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) em doses diferentes (1 ou 10 pg) e quatro semanas depois da imunização (ou depois do reforço para o grupo marcado com *) os murganhos foram mortos por overdose de Halotano e os pulmões foram lavados com 1 mL de TBS. A Figura 6 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes adjuvantes sobre as titulações de IgA anti-HBs em soluções de sedimentos fecais, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 ou 10 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou adjuvantes de oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) em doses diferentes (1 ou 10 pg) e quatro semanas depois da imunização (ou depois do reforço para o grupo marcado com *) os murganhos foram isolados durante 24 horas e os sedimentos fecais foram colhidos e re-suspensos em TBS a 0,1 mg/mL. A Figura 7 é um gráfico que representa o efeito de diferentes adjuvantes sobre as titulações totais de IgA anti-HBs, em que murganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 ou 10 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT), a enterotoxina termolábil (LT) Escherichia coli, a subunidade B da toxina da cólera (CTB), um mutante destoxifiçado da enterotoxina termolábil Escherichia coli (LTK63), o oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) ou oligonucleótidos de controlo não CpG (motivo #1982, SEQ. ID NO. 90) como adjuvantes (1, 10 ou 500 pg). Nos grupos que responderam, todos os murganhos deram titulações >10, excepto no caso de 10 pg de LT onde apenas 1/5 dos murganhos responderam. A Figura 8 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes estratégias de preparação/reforço sobre as titulações totais de IgG anti-HBs em que murganhos BALB/c foram imunizados: (i) por injecção IM com HBsAg (1 pg) em associação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO.); ou (ii) por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por injecção IM com HBsAg (1 pg) em combinação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) . Os números em cima de cada barra representam a proporção entre IgGa/IgGl. A Figura 9 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes estratégias de preparação/reforço com adjuvantes diferentes sobre a resposta CTL especifica para HBsAg, em que murganhos BALB/c foram imunizados: (i) por injecção IM com HBsAg (1 pg) em associação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90); ou (ii) por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO.90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por injecção IM com HBsAg (1 pg) em combinação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e 4 semanas depois do reforço os murganhos foram mortos por overdose de Halotano, os esplenócitos foram isolados e a actividade CTL especifica para HBsAg foi medida. A Figura 10 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes estratégias de preparação/reforço com adjuvantes diferentes sobre a proliferação de células T especifica para HBsAg, em que murganhos BALB/c foram imunizados: (i) por injecção IM com HBsAg (1 pg) em associação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90); ou (ii) por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO.90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por injecção IM com HBsAg (1 pg) em combinação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e 4 semanas depois do reforço os murganhos foram mortos por overdose de Halotano, os esplenócitos foram isolados e a proliferação de células T especifica para HBsAg foi medida. A Figura 11 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes estratégias de preparação/reforço com adjuvantes diferentes sobre titulações de IgA anti-HBs em lavagens de pulmão, em que murganhos BALB/c foram imunizados: (i) por injecção IM com HBsAg (1 pg) em associação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90); ou (ii) por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO.90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por injecção IM com HBsAg (1 pg) em combinação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) . Quatro semanas depois do reforço os murganhos foram mortos por overdose de Halotano e os pulmões foram lavados com 1 mL de TBS. A Figura 12 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes estratégias de preparação/reforço com adjuvantes diferentes sobre titulações de IgA anti-HBs em saliva, em que murganhos BALB/c foram imunizados: (i) por injecção IM com HBsAg (1 pg) em associação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90); ou (ii) por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por injecção IM com HBsAg (1 pg) em combinação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #182 6, SEQ. ID NO. 90) . Quatro semanas depois do reforço os murganhos foram injectados com 100 pL de solução de cloridrato de Policarpina a 0,5% e a saliva foi colhida. A Figura 13 é um gráfico de barras que representa o efeito de diferentes estratégias de preparação/reforço com adjuvantes diferentes sobre titulações de IgA anti-HBs em soluções de sedimento fecal, em que murganhos BALB/c foram imunizados: (i) por injecção IM com HBsAg (1 pg) em associação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) ; ou (ii) por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO.90) e receberam dose de reforço às 4 semanas como as doses preparatórias ou por injecção IM com HBsAg (1 pg) em combinação com alúmen mais oligonucleótido CpG (motivo #182 6, SEQ. ID NO. 90) . Quatro semanas depois do reforço os murganhos foram isolados durante 24 horas e os sedimentos fecais foram colhidos e re-suspensos em TBS a 0,1 mg/mL.

Breve Descrição das Tabelas A Tabela 1 enumera as seguências de oligonucleótidos imunoestimulatórios. A Tabela 2 enumera o efeito de diferentes adjuvantes sobre isotipos de anticorpos específicos para HBsAg. aMurganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT), a enterotoxina termolábil (LT) Escherichia coli, a subunidade B da toxina da cólera (CTB), um mutante destoxifiçado da enterotoxina termolábil (LT) Escherichia coli (LTK63) e/ou o oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) (1 a 10 pg) como adjuvantes. b0s valores representam a média geométrica do grupo (GMT) da titulação de diluição do ponto final de ELISA para os anticorpos IgGl ou IgG2a específicos para HBsAg em plasma colhido 4 semanas depois da imunização. As titulações foram definidas como a diluição mais alta no plasma resultando num valor de absorvância duas vezes aquela do plasma não imunizado com um valor de corte de 0,05. cSão registadas as proporções entre IgG2a e IgGl (IgG2a:IgGl) com um valor >1 indicando uma resposta predominantemente semelhante a Th-1. dN/A: Não aplicável, uma vez que não foram detectadas quaisquer respostas ao anticorpo. e=: Todos os murganhos imunizados com estas combinações de adjuvantes morreram em 96 horas. A Tabela 3 enumera o efeito de diferentes adjuvantes sobre as respostas IgA especificas para HBsAg. aMurganhos BALB/c foram imunizados por inalação IN com HBsAg (1 pg) sem ou em combinação com toxina da cólera (CT) a enterotoxina termolábil (LT) Escherichia coli, a subunidade B da toxina da cólera (CTB), um mutante destoxifiçado da enterotoxina termolábil (LT) Escherichia coli (LTK63) , e/ou oligonucleótido CpG (motivo #1826, SEQ. ID NO. 90) (1 a 10 pg) como adjuvantes. Todos os grupos continham 5 murganhos, salvo indicado em contrário. bOs valores representam a média geométrica das titulações ± o erro padrão da média (GMT ± SEM) da titulação de diluição do ponto final de ELISA para os anticorpos IgA específicos para HBsAg em lavagem de pulmão ou soluções fecais colhidas 4 semanas depois da imunização. cAs titulações de IgA em lavagens de pulmão foram definidas como a diluição mais alta no plasma que resultou num valor de absorvância (OD 450) duas vezes aquela das lavagens de pulmão não imunizadas com um valor de corte de 0,05. dAs titulações de IgA em extractos fecais foram expressas como OD 450 x 103 acima da base (extracto fecal não imunizado). A seroconversão foi definida como uma titulação do ponto final para IgG total >100. e=: Todos os murganhos imunizados com estas combinações de adjuvantes morreram em 96 horas. A Tabela 4 apresenta as diferentes estratégias mucosais/parentéricas para a dose preparatória/reforço utilizadas para imunizar murganhos BALB/c e resume os resultados relativos a qual método induziu as resposta imunológicas sistémicas e mucosais especificas para o antigénio.

Descrição Pormenorizada da Invenção A invenção relaciona-se com produtos para induzir a imunidade utilizando oligonucleótidos CpG imunoestimulatórios. Um aspecto da invenção é baseado na verificação de que os oligonucleótidos CpG actuam como adjuvantes mucosais potentes para induzir respostas imunológicas tanto em sítios locais como remotos contra um antigénio administrado ao tecido mucosal. Esta verificação é impressionante mesmo tendo em vista as verificações anteriores de que o oligonucleótido CpG é um adjuvante potente para a administração sistémica, uma vez que com a administração sistémica só a proteína induz respostas imunológicas detectáveis, mas com a administração mucosal só a proteína não induz uma resposta imunológica. Conforme demonstrado nos Exemplos adiante, tanto a imunidade sistémica como a mucosal são induzidas pela administração de oligonucleótidos CpG. A imunidade sistémica induzida em resposta aos oligonucleótidos CpG incluíram tanto respostas humorais como respostas mediadas por célula para antigénios específicos que não eram capazes de induzir a imunidade sistémica quando administrados sós à mucosa. Além disso, tanto os oligonucleótidos CpG como a toxina da cólera (CT, um adjuvante mucosal que induz uma resposta semelhante a Th2) induziram a CTL. Isto é surpreendente, uma vez que com a imunização sistémica, a presença de anticorpos semelhantes a Th2 é normalmente associada com uma falta de CTL (Schirmbeck et al., 1995.).

Além disso, verificou-se que os oligonucleótidos CpG induzem uma resposta mucosal tanto em sítios locais (por exemplo, o pulmão) como remotos (por exemplo, o tracto intestinal inferior). Embora o oligonucleótido CpG fosse semelhante à CT para a indução dos anticorpos sistémicos (IgG) e anticorpos mucosais locais (IgA), níveis significativos de anticorpos IgA foram induzidos a um sítio mucosal distante apenas por oligonucleótido CpG e não por CT. Isto foi surpreendente, uma vez que a CT é geralmente considerada como sendo um adjuvante mucosal altamente eficaz. Uma outra maneira em que o oligonucleótido CpG foi superior à CT foi no que diz respeito à resposta do tipo Th. Conforme foi indicado anteriormente (Snider, 1995), a CT induz, de forma predominante, o isotipo IgGl de anticorpos, que são indicativos da resposta do tipo Th2. Em contraste, o oligonucleótido CpG era mais Thl com anticorpos predominantemente IgG2a, especialmente depois do reforço ou quando os dois adjuvantes eram combinados. De um modo geral, os anticorpos do tipo Thl têm melhores capacidades neutralizantes e, além disso, a resposta Th2 no pulmão é altamente indesejável, uma vez que esta é associada à asma (Kay, 1996, Hogg, 1997). Deste modo, a utilização do oligonucleótido CpG como adjuvante mucosal tem benefícios que outros adjuvantes mucosais não conseguem obter. 0 descobrimento do oligonucleótido CpG como um adjuvante mucosal seguro e eficaz é também vantajoso pelo facto de que, embora a CT seja um adjuvante mucosal altamente eficaz, é muito tóxica para utilização em seres humanos. Um murganho (~20 g de peso corporal) pode tolerar o efeito tóxico de até 10 pg de CT, no entanto, uma dose tão pequena quanto 1-5 pg causará grave diarreia num ser humano (~70 Kg de peso corporal) (Jertborn et al., 1992). Os animais que inalam o oligonucleótido CpG não apresentaram, a curto prazo, sinais de sofrimento em relação àqueles que receberam só HBsAg e todos recuperaram rapidamente sem qualquer efeito duradouro aparente. O oligonucleótido CpG é bem tolerado em altas doses (por exemplo, superior a 100 pg) , quando administrado de forma sistémica ou mucosal. O oligonucleótido CpG é particularmente útil como uma vacina profilática para a indução da imunidade mucosal de um indivíduo em risco de desenvolver uma infecção com um organismo infeccioso ou um indivíduo em risco de desenvolver uma alergia ou cancro. Um "indivíduo em risco", conforme utilizado neste contexto, é um indivíduo que tem qualquer risco de exposição a um agente patogénico ou alergénio infeccioso causador de infecção ou de desenvolver cancro. Por exemplo, um indivíduo em risco pode ser quem está a planear viajar para um área onde é encontrado um tipo em particular de agente infeccioso ou alergénio ou pode ser um indivíduo que, pelo seu estilo de vida ou procedimentos médicos, está exposto a fluidos corporais que podem conter organismos infecciosos ou mesmo qualquer indivíduo que vive numa área onde foi identificado um organismo infeccioso ou um alergénio. Os indivíduos em risco de desenvolver infecção também incluem as populações em geral às quais uma entidade médica recomenda a vacinação com um antigénio de organismo infeccioso em particular. Se o antigénio for um alergénio e o indivíduo desenvolve respostas alérgicas àquele antigénio em particular e o indivíduo é exposto ao antigénio, isto é, durante a estação do pólen, então aquele indivíduo está em risco de exposição ao antigénio. Os indivíduos em risco de desenvolver cancro incluem aqueles com uma predisposição genética ou previamente tratados contra o cancro e aqueles expostos a agentes carcinogéneos, tais como o tabaco, o amianto e outras toxinas químicas ou excessiva luz solar e outros tipos de radiação.

Para além da utilização do oligonucleótido CpG para o tratamento profilático, a invenção também abrange a utilização do oligonucleótido CpG para o tratamento de um indivíduo que tem uma infecção, uma alergia ou um cancro.

Um "indivíduo que tem uma infecção" é um indivíduo que foi exposto a um agente patogénico infeccioso e tem níveis agudos ou crónicos do patogénio no organismo. O oligonucleótido CpG pode ser utilizado com um antigénio para construir uma resposta imunológica mucosal específica ao antigénio, que é capaz de reduzir o nível ou erradicar o patogénio infeccioso. Uma doença infecciosa, conforme utilizado neste contexto, é uma doença que surge da presença de um microrganismo estranho no corpo. É particularmente importante desenvolver estratégias de vacina e tratamentos eficazes para proteger as superficies mucosais do corpo, que são os sítios principais de entrada do agente patogénico.

Um "indivíduo que tem uma alergia" é um indivíduo que tem ou está em risco de desenvolver uma reacção alérgica em resposta a um alergénio. Uma "alergia" refere-se à hipersensibilidade adquirida a uma substância (o alergénio). As condições alérgicas incluem, mas não se limitam a eczema, rinite alérgica ou coriza, febre do feno, conjuntivite, asma brônquica, urticária (erupções da pele) e alergia a alimentos, e outros estados atópicos.

Actualmente, as doenças alérgicas são geralmente tratadas pela injecção de pequenas doses de antigénio seguida pelo subsequente aumento da dosagem de antigénio. Crê-se que este procedimento induz à tolerância ao alergénio para evitar reacções alérgicas futuras. Estes métodos, no entanto, podem levar vários anos para tornarem-se eficazes e são associados com o risco de efeitos secundários tais como choque anafilático. Os métodos da invenção evitam estes problemas.

As alergias são causadas, de um modo geral, pela geração de anticorpo IgE contra alergénios inofensivos. As citocinas que são induzidas pela administração mucosal de oligonucleótido CpG não metilado são, predominantemente, de uma classe chamada "Thl" (exemplos são IL-12 e IFN-γ) e estes induzem respostas imunológicas tanto humorais quanto celulares. Os tipos de anticorpos associados com a resposta Thl são geralmente mais protectores porque os mesmos têm altas capacidades de neutralização e opsonização. O outro tipo importante de resposta imunológica, que está associada com a produção das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10, é chamada de resposta imunológica Th2. As respostas Th2 abrangem unicamente os anticorpos e estes têm menos efeito protector contra a infecção e alguns isotipos Th2 (por exemplo, IgE) estão associados com a alergia. De um modo geral, parece que as doenças alérgicas são mediadas pelas respostas imunológicas do tipo Th2, enquanto as respostas do tipo Thl proporcionam a melhor protecção contra infecção, embora as respostas Thl excessivas sejam associadas com doenças autoimunes. Com base na capacidade dos oligonucleótidos CpG de deslocarem a resposta imunológica num indivíduo de uma resposta Th2 (que está associada com a produção de anticorpos IgE e alergia) para uma resposta Thl (que é protectora contra as reacções alérgicas), uma dose eficaz para induzir uma resposta imunológica mucosal de um oligonucleótido CpG pode ser administrada a um indivíduo para tratar ou evitar uma alergia.

Desde modo, o oligonucleótido CpG tem uma utilidade terapêutica significativa no tratamento de estados alérgicos, tais como a asma. As citocinas Th2, especialmente a IL-4 e a IL-5 são elevadas nas vias aéreas de indivíduos asmáticos. Estas citocinas promovem aspectos importantes da resposta inflamatória asmática, incluindo a troca do isotipo IgE, quimiotaxia de eosinófilo e activação e crescimento de mastócitos. As citocinas Thl, especialmente o IFN-γ e a IL-12, podem suprimir a formação de clones de Th2 e a produção de citocinas Th2. O termo "asma" refere-se a uma patologia do sistema respiratório caracterizada por inflamação, estreitamento das vias aéreas e reactividade aumentada das vias aéreas a agentes inalados. A asma é frequentemente, embora não exclusivamente, associada com sintomas atópicos ou alérgicos.

Um "indivíduo com cancro" é um indivíduo que tem células cancerosas detectáveis. 0 cancro pode ser um cancro maligno ou não maligno. Os cancros ou tumores incluem, mas não se limitam ao cancro do tracto biliar; cancro do cérebro; cancro da mama; cancro cervical; coriocarcinoma; cancro do cólon; cancro endometrial; cancro esofageano; cancro gástrico; neoplasmas intraepiteliais; linfomas; cancro do fígado; cancro do pulmão (por exemplo, da célula pequena e da células não pequena); melanoma; neuroblastomas; cancro oral; cancro ovariano; cancro do pâncreas; cancro da próstata; cancro rectal; sarcomas; cancro da pele; cancro testicular; cancro da tiróide; e cancro renal, bem como outros carcinomas e sarcomas.

Um "indivíduo" pode significar um ser humano, um animal vertebrado incluindo mas não limitado a um cão, gato, cavalo, vaca, porco, ovelha, cabra, galinha, primata, por exemplo, o macaco, peixe (da espécie de aquacultura), por exemplo o salmão, rato e murganho.

Um oligonucleótido CpG é um oligonucleótido que inclui, pelo menos, um dinucleótido CpG não metilado. Um oligonucleótido que contém pelo menos um dinucleótido CpG não metilado é uma molécula de ácido nucleico que contém uma sequência de dinucleótido citosina-guanina não metilada (isto é, "Cpg ADN" ou ADN contendo uma citosina 5' seguida por guanosina 3' e ligada por uma ligação fosfato) e activa o sistema imunológico. Os oligonucleótidos CpG podem ser de fita dupla ou de fita simples. De um modo geral, as moléculas de fita dupla são mais estáveis in vivo, ao passo que as moléculas de fita simples têm actividade imunológica aumentada.

Os termos "ácido nucleico" e "oligonucleótido" são utilizados de forma alternada para significar nucleótidos múltiplos (isto é, moléculas que compreendem um açúcar (por exemplo, ribose ou desoxirribose) ligados a um grupo fosfato e a uma base orgânica permutável, que é uma piramidina substituída (por exemplo, citosina (C) , timina (T) ou uracil (U) ) ou uma purina substituída (por exemplo, adenina (A) ou guanina (G) ) . Conforme utilizado neste contexto, os termos referem-se a oligorribonucleótidos bem como oligodesoxirribonoucleótidos. Os termos incluirão também polinucleósidos (isto é, um polinucleótido menos o fosfato) e qualquer outro polímero contendo base orgânica. As moléculas de ácido nucleico podem ser obtidas de fontes de ácido nucleico existentes (por exemplo, genómico ou cADN) mas, de preferência, são sintéticas (por exemplo, produzidas por síntese de oligonucleótido). A totalidade do oligonucleótido CpG pode ser não metilada ou porções podem ser não metiladas mas, pelo menos o C do 5'CG 3' tem de ser não metilado.

Os métodos da invenção podem ser conseguidos por meio da administração de um oligonucleótido contendo CpG ou um vector plasmídeo contendo CpG ao indivíduo para induzir uma resposta imunológica mucosal. Conforme utilizado neste contexto, um "oligonucleótido CpG" e um "vector de expressão plasmídeo" são mutuamente exclusivos. Os termos "oligonucleótido CpG" ou "ácido nucleico CpG" são utilizados para referir a qualquer ácido nucleico contendo CpG excepto para um vector plasmídeo contendo CpG. Um vector de expressão de plasmídeo é uma molécula de ácido nucleico que inclui, pelo menos, um promotor e um gene que codifica um péptido ou fragmento de péptido. 0 vector de expressão de plasmídeo inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica o péptido que é operativamente ligado a uma sequência de expressão de gene que dirige a expressão do péptido no interior de uma célula eucariótica. A "sequência de expressão de gene" é qualquer sequência reguladora de nucleótido, tal como uma sequência promotora ou a combinação promotora-intensificadora, que facilita a transcrição e tradução eficiente do péptido ao qual está operativamente ligada. A sequência de expressão de gene pode, por exemplo, ser um promotor de mamífero ou virai, tal como um promotor constitutivo ou induzível. Tais construções são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Numa forma de realização preferida a invenção proporciona um oligonucleótido CpG representado, pelo menos pela fórmula: 5 'NiXiCGX2N23 ’ em que, pelo menos um nucleótido separa CpGs consecutivos; X2 é adenina, guanina ou timina; X2 é citosina, adenina ou timina; N é qualquer nucleótido e N2 e N2 são sequências de ácido nucleico compostas de cerca de 0-25 Ns cada uma.

Numa outra forma de realização a invenção proporciona um oligonucleótido CpG isolado representado, pelo menos, pela fórmula: 5'NiXiX2CGX3X4N23' em que, pelo menos um nucleótido separa CpGs consecutivos; ΧχΧ2 são nucleótidos seleccionados do grupo que consiste em: GpT, GpG, GpA,

ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT e TpG; e X3X4 são nucleótidos seleccionados do grupo que consiste em: TpT, CpT, ApT,

TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA e CpA; N é qualquer nucleótido e N2 e N2 são sequências de ácido nucleico compostas de cerca de 0-25 Ns cada uma. De preferência, XiX2 são GpA ou GpT e X3X4 são TpT. Noutras formas de realização preferidas X2 ou X2 ou ambos são purinas e X3 ou X4 ou ambos are pirimidinas ou XiX2 são GpA e X3 ou X4 ou ambos são pirimidinas. Numa forma de realização preferida o N4 e N2 do ácido nucleico não contêm um quadmer CCGG ou CGCG ou mais de um trimero CCG ou CGG. O efeito de um quadmer CCGG ou CGCG ou mais de um trimero CCG ou CGG depende, em parte, do status do esqueleto do oligonucleótido. Por exemplo, se o oligonucleótido tiver um esqueleto de fosfodiéster ou um esqueleto quimérico a inclusão destas sequências no oligonucleótido terão apenas um efeito mínimo, se tiverem algum efeito sobre a actividade biológica do oligonucleótido. Se o esqueleto for completamente de fosforotioato ou significativamente de fosfotioato, então, a inclusão destas sequências pode ter mais influência sobre a actividade biológica ou a cinética da actividade biológica. No caso em que o oligonucleótido CpG é administrado em associação com um antigénio que é codificado num vector de ácido nucleico, é preferido que o esqueleto do oligonucleótido CpG seja de fosfodiéster ou quimérico. Pode ser completamente de fosfotioato se o oligonucleótido for administrado directamente à célula. A célula pode ter um problema em captar um oligonucleótido completamente de fosfotioato na presença de um vector plasmideo. Deste modo, quando tanto um vector como um oligonucleótido são administrados a um indivíduo, é preferido que o oligonucleótido tenha um esqueleto de fosfodiéster ou quimérico ou que tenha um esqueleto de fosfotioato mas que seja associado a um veículo que o administre directamente à célula. Tais veículos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, lipossomas e pistolas para injecção de genes.

Numa outra forma de realização preferida o oligonucleótido CpG tem a sequência 5 ' TCN1TX1X2CGX3X43 ' .

De preferência, os oligonucleótidos CpG da invenção incluem X1X2 seleccionados do grupo que consiste em GpT, GpG, GpA e ApA e X3X4 é seleccionado do grupo que consiste em TpT, CpT e TpC. Para facilitar a captação dentro das células, os oligonucleótidos que contêm CpG, de preferência, têm na gama de 8 a 30 bases de comprimento. No entanto, os ácidos nucleicos de qualquer tamanho maior de 8 nucleótidos (mesmo de muitos kb de comprimento) são capazes de induzir uma resposta imunológica de acordo com a invenção se estiverem presentes suficientes motivos imunoestimulatórios, uma vez que ácidos nucleicos maiores são degradados em oligonucleótidos no interior das células. Os oligonucleótidos sintéticos preferidos não incluem um quadmer CCGG ou CGCG ou mais de um trímero CCG ou CGG próximo ou nos terminais 5' e/ou 3'. São também preferidos os oligonucleótidos estabilizados, em que o oligonucleótido incorpora uma modificação de esqueleto de fosfato, conforme discutido em mais pormenor adiante. A modificação pode ser, por exemplo, uma modificação de fosforotioato ou fosforoditioato. De preferência, a modificação do esqueleto de fosfato ocorre na extremidade 5' do ácido nucleico, por exemplo, nos dois primeiros nucleótidos da extremidade 5' do oligonucleótido. Além disso, a modificação do esqueleto de fosfato pode ocorrer na extremidade 3' do ácido nucleico, por exemplo, nos últimos cinco nucleótidos da extremidade 3' do ácido nucleico. Alternativamente, o oligonucleótido pode ser completa ou parcialmente modificado.

De preferência, o oligonucleótido CpG está na gama compreendida entre 8 e 100 e, mais preferencialmente, entre 8 e 30 nucleótidos de tamanho. Alternativamente, os oligonucleótidos CpG podem ser produzidos em larga escala em plasmideos e degradados em oligonucleótidos. O oligonucleótido CpG pode ser administrado directamente ao indivíduo ou pode ser administrado em associação com um complexo de administração de ácido nucleico. Um "complexo de administração de ácido nucleico" terá o significado de uma molécula de ácido nucleico associada a (por exemplo, ligada de forma iónica ou covalente; ou encapsulada no interior de) um meio selectivo (por exemplo, uma molécula que resulta em ligação de afinidade mais alta à célula alvo (por exemplo, as superfícies de células dendríticas e/ou a captação celular aumentada pelas células alvo). Exemplos de complexos de administração de ácido nucleico incluem ácidos nucleicos associados a: um esterol (por exemplo, colesterol), um lípido (por exemplo, um lípido catiónico, virossoma ou lipossoma) ou um agente de ligação específico para a célula alvo (por exemplo, um ligando reconhecido pelo receptor especifico para a célula alvo) . Os complexos preferidos podem ser suficientemente estáveis in vivo a fim de evitar o desacoplamento significativo antes da internalização pela célula alvo. No entanto, o complexo pode ser clivável sob certas condições no interior da célula, de modo que o ácido nucleico seja libertado numa forma funcional.

Foram descritos veículos de administração para administrar o antigénio às superfícies mucosais. 0 oligonucleótido CpG e/ou o antigénio pode ser administrado só (por exemplo, em solução salina ou tampão) ou utilizando quaisquer veículos de administração conhecidos na técnica. Por exemplo, foram descritos os seguintes veículos de administração: Cocleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomas (Vancott et al.r 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); Lipossomas (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); Vectores bacterianos vivos (por exemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); Vectores virais vivos (por exemplo, Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); Micro esferas (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); Vacinas de ácido nucleico (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); Polímeros (por exemplo, carboximetilcelulose, chitosano) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); Anéis poliméricos (Wyatt et al., 1998); Proteossomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); Fluoreto de sódio (Hashi et al., 1998); Plantas transgénicas (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al. , 1995); Virossomas (Gluck et al., 1992,

Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); Partículas semelhantes a virus (Jiang et al.r 1999, Leibl et al.r 1998). Outros veículos de administração são conhecidos da técnica e alguns exemplos adicionais são fornecidos adiante na discussão dos vectores.

Uma "sequência palindrómica" significará uma repetição invertida (isto é, uma sequência tal como ABCDEE'D'C'B'A' em que A e A' são bases capazes de formar os pares de bases usuais Watson-Crick. Estas sequências podem formar estruturas de fita dupla in vivo. Numa forma de realização o oligonucleótido CpG contém uma sequência palindrómica. Uma sequência palindrómica, conforme utilizado neste contexto, refere-se a um palíndromo em que o CpG é parte do palíndromo e, de preferência, é o centro do palíndromo. Numa outra forma de realização o oligonucleótido CpG é livre de um palíndromo. Um oligonucleótido CPG que é livre de um palíndromo é um em que o dinucleótido CpG não é parte de um palíndromo. Tal oligonucleótido pode incluir um palíndromo em que o CpG não é parte do palíndromo.

Uma "molécula de ácido nucleico estabilizada" significará uma molécula de ácido nucleico que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, via uma exo ou endo-nuclease) . A estabilização pode ser uma função do comprimento ou esqueleto secundário. Os oligonucleótidos CpG não metilados que têm dezenas a centenas de kbs de comprimento são relativamente resistentes à degradação in vivo. Para oligonucleótidos CpG mais curtos, a estrutura secundária pode estabilizar e aumentar o seu efeito. Por exemplo, se a extremidade 3' de um oligonucleótido tem auto-complementaridade com uma região a montante, de modo que possa dobrar-se e formar um tipo de estrutura em "stem-loop," então, o oligonucleótido torna-se estabilizado e, deste modo, exibe mais actividade.

Os oligonucleótidos estabilizados preferidos da presente invenção têm um esqueleto modificado. Foi demonstrado que a modificação do esqueleto do oligonucleótido proporciona actividade acentuada dos oligonucleótidos CpG quando administrados in vivo. As construções CpG, incluindo pelo menos duas ligações de fosforotioato na extremidade 5' do oligonucleótido em ligações múltiplas de fosforotioato na extremidade 3', de preferência 5, proporciona actividade máxima e protege o oligonucleótido de degradação por exo e endo-nucleases intracelulares. Outros nucleótidos modificados incluem oligonucleótido de fosfodiéster modificado, combinações de oligonucleótido de fosfodiéster e fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, combinações destas. Cada uma destas combinações e seus efeitos em particular sobre células imunocompetentes está discutido em mais pormenor no Pedido de Publicação de Patente Publicado PCT, que reivindica prioridade aos documentos Número de Série U.S. 08/738,652 e 08/960,774, depositados em 30 de Outubro de 1996 e 30 de Outubro de 1997, respectivamente, cujo teor aqui é dado como integralmente incorporado por citação. Crê-se que estes oligonucleótidos modificados podem demonstrar mais actividade estimulatória devido à resistência intensificada à nuclease, captação celular aumentada, ligação proteica aumentada e/ou localização intracelular alterada.

Tantos os oligonucleótidos de fosforotioato como de fosfodiéster contendo motivos CpG são activos na células imunocompetentes. No entanto, com base na concentração necessária para induzir os efeitos CpG-especificos, os oligonucleótidos CpG de esqueleto de fosforotioato resistentes à nuclease são mais potentes (2 pg/mL para o fosforotioato vs. um total de 90 pg/mL para fosfodiéster).

Outros oligonucleótidos estabilizados incluem: análogos de ADN não iónicos, tais como fosfatos de alquilo e arilo (em que o oxigénio fosfonato carregado é substituído por um grupo alquilo ou arilo), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, em que a unidade oxigénio carregada é alquilada. Foi também demonstrado que os oligonucleótidos que contêm diol, tais como tetraetilenoglicol ou hexaetilenoglicol, em cada ou em ambos os terminais são substancialmente resistentes à degradação por nuclease.

As sequências de ácido nucleico da invenção que são úteis como adjuvantes mucosais são aquelas amplamente descritas acima e divulgadas no Pedido de Publicação de Patente Publicado PCT que reivindica prioridade aos documentos Número de Série U.S. 08/738,652 e 08/960,774, depositados em 30 de Outubro de 1996 e 30 de Outubro de 1997, respectivamente. As sequências exemplificativas incluem, mas não são limitadas àquelas sequências imunoestimulatórias ilustradas na Tabela 1.

Tabela 1 - sequências GCTAGACGTTAGCGT; (SEQ ID NO: 1) GCTAGATGTTAGCGT; (SEQ ID NO: 2) GCTAGACGTTAGCGT; (SEQ ID NO: 3) GCTAGACGTTAGCGT; (SEQ ID NO: 4) GCATGACGTTGAGCT; (SEQ ID NO: 5) ATGGAAGGTCCAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 6) ATCGACTCTCGAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 7) ATCGACTCTCGAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 8) ATCGACTCTCGAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 9) ATGGAAGGTCCAACGTTCTC; (SEQ ID NO: 10) GAGAACGCTGGACCTTCCAT; (SEQ ID NO: 11) GAGAACGCTCGACCTTCCAT; (SEQ ID NO: 12) GAGAACGCTCGACCTTCGAT; (SEQ ID NO: 13) GAGAACGCTGGACCTTCCAT; (SEQ ID NO: 14) GAGAACGATGGACCTTCCAT; (SEQ ID NO: 15) GAGAACGCTCCAGCACTGAT; (SEQ ID NO: 16) TCCATGTCGGTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 17) TCCATGTCGGTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 18) TCCATGACGTTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 19) TCCATGTCGGTCCTGCTGAT; (SEQ ID NO: 20) TCAACGTT; (SEQ ID NO: 21) TCAGCGCT; (SEQ ID NO: 22) TCATCGAT; (SEQ ID NO: 23) TCTTCGAA; (SEQ ID NO: 24) CAACGTT; (SEQ ID NO: 25) CCAACGTT; (SEQ ID NO: 26) AACGTTCT; (SEQ ID NO: 27) TCAACGTC; (SEQ ID NO: 28) ATGGACTCTCCAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 29) ATGGAAGGTCCAACGTTCTC; (SEQ ID NO: 30) ATCGACTCTCGAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 31) ATGGAGGCTCCATCGTTCTC; (SEQ ID NO: 32) ATCGACTCTCGAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 33) ATCGACTCTCGAGCGTTCTC; (SEQ ID NO: 34) TCCATGTCGGTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 35) TCCATGCCGGTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 36) TCCATGGCGGTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 37) TCCATGACGGTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 38) TCCATGTCGATCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 39) TCCATGTCGCTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 40) TCCATGTCGTCCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 41) TCCATGACGTGCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 42) TCCATAACGTTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 43) TCCATGACGTCCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 44) TCCATCACGTGCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 45) GGGGTCAACGTTGACGGGG; (SEQ ID NO: 46) GGGGTCAGTCGTGACGGGG; (SEQ ID NO: 47) GCTAGACGTTAGTGT; (SEQ ID NO: 48) TCCATGTCGTTCCTGATGCT; (SEQ ID NO: 49) ACCATGGACGATCTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 50) TCTCCCAGCGTGCGCCAT; (SEQ ID NO: 51) ACCATGGACGAACTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 52) ACCATGGACGAGCTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 53) ACCATGGACGACCTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 54) ACCATGGACGTACTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 55) ACCATGGACGGTCTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 56) ACCATGGACGTTCTGTTTCCCCTC; (SEQ ID NO: 57) CACGTTGAGGGGCAT; (SEQ ID NO: 58) TCAGCGTGCGCC; (SEQ ID NO: 59) ATGACGTTCCTGACGTT; (SEQ ID NO: 60) TCTCCCAGCGGGCGCAT; (SEQ ID NO: 61) TCCATGTCGTTCCTGTCGTT; (SEQ ID NO: 62) TCCATAGCGTTCCTAGCGTT; (SEQ ID NO: 63) TCGTCGCTGTCTCCCCTTCTT; (SEQ ID NO: 64) TCCTGACGTTCCTGACGTT; (SEQ ID NO: 65) TCCTGTCGTTCCTGTCGTT; (SEQ ID NO: 66) TCCATGTCGTTTTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 67) TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 68) TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT; (SEQ ID NO: 69) TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 70) TCGTCGCTGTCTGCCCTTCTT; (SEQ ID NO: 71) TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT; (SEQ ID NO: 72) TCCATGCGTGCGTGCGTTTT; (SEQ ID NO: 73) TCCATGCGTTGCGTTGCGTT; (SEQ ID NO: 74) TCCACGACGTTTTCGACGTT; (SEQ ID NO: 75) TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 76) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 77) TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 78) GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 79) TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 80) TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 81) TGTCGTTGTCGTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 82) TCGTCGTCGTCGTT; (SEQ ID NO: 83) TGTCGTTGTCGTT; (SEQ ID NO: 84) TCCATAGCGTTCCTAGCGTT; (SEQ ID NO: 85) TCCATGACGTTCCTGACGTT; (SEQ ID NO: 86) GTCGYT; (SEQ ID NO: 87) TGTCGYT; (SEQ ID NO: 88) AGCTATGACGTTCCAAGG; (SEQ ID NO: 89) TCCATGACGTTCCTGACGTT; (SEQ ID NO: 90) ATCGACTCTCGAACGTTCTC; (SEQ ID NO: 92) TCCATGTCGGTCCTGACGCA; (SEQ ID NO: 93) TCTTCGAT; (SEQ ID NO: 94) ATAGGAGGTCCAACGTTCTC; (SEQ ID NO: 95) O índice de estimulação de um ADN CpG imunoestimulatdrio em particular pode ser testado em vários ensaios de células imunocompetentes. De preferência, o indice de estimulação do oligonucleótido CpG no que diz respeito à proliferação de células B é de, pelo menos 5, de preferência, pelo menos 10, mais preferencialmente, pelo menos 15 e mais preferencialmente, pelo menos cerca de 20, conforme determinado pela incorporação de 3H uridina numa cultura de célula B de murino, que tenha sido contactada com 20 μΜ de oligonucleótido durante 20 h a 37 °C e tenha sido pulsada com 1 pCi de 3H uridina; e colhida e contada 4 h mais tarde, conforme descrito em pormenor no Pedido de Publicação de Patente Publicado PCT, que reivindica prioridade aos documentos Número de Série U.S. 08/738,652 e 08/960,774, depositados em 30 de Outubro de 1996 e 30 de Outubro de 1997, respectivamente. Para utilização in vivo, por exemplo, é importante que o oligonucleótido CpG seja capaz de induzir, de forma efectiva, a expressão de IgA. O oligonucleótido CpG pode ser administrado em associação com outro adjuvante mucosal. Foi verificado, de acordo com a invenção que a combinação de um oligonucleótido CpG e um adjuvante mucosal produziu uma resposta imunológica sinérgica. Quando o oligonucleótido CpG é administrado em associação com outro adjuvante, o oligonucleótido CpG pode ser administrado antes, depois e/ou simultaneamente com o outro adjuvante mucosal. Por exemplo, o oligonucleótido CpG pode ser administrado com uma dose preparatória de antigénio. Cada ou ambos os adjuvantes podem, então, ser administrados com a dose de reforço. Alternativamente, o oligonucleótido pode ser administrado com uma dose de reforço de antigénio. Cada ou ambos os adjuvantes podem, então, ser administrados com a dose preparatória.

Verificou-se, além disso, que a imunidade mucosal pode ser induzida desde que uma das dosagens de oligonucleótido CpG seja administrada a uma superfície mucosal. Outras doses podem ser administradas por via sistémica ou mucosal, sem afectar a indução da resposta imunológica. Por exemplo, o indivíduo pode ser administrado com uma dose de preparação por meio da administração mucosal do antigénio e oligonucleótido CpG, com ou sem outros adjuvantes mucosais e administrado com uma dose de reforço por uma via parentérica (por exemplo, intramuscular, intradérmica ou subcutânea) de administração só do antigénio, com os oligonucleótidos CpG, com um adjuvante não oligonucleótido ou uma combinação de adjuvantes que pode ou não incluir o oligonucleótido CpG. Alternativamente, a dose preparatória pode ser dada por via parentérica e o reforço por via mucosal, utilizando a invenção. Todas estas abordagens podem induzir fortes respostas imunológicas sistémicas e mucosais. Desse modo, os métodos da invenção abrangem a administração de, pelo menos, uma dose, seja preparatória ou de reforço ou ambas, à superfície mucosal. As outras doses de oligonucleótido CpG podem ser administradas por via mucosal ou sistémica.

Uma "dose de preparação" é a primeira dose do antigénio administrada ao indivíduo. No caso de um indivíduo que tem uma infecção a dose preparatória pode ser a exposição inicial do indivíduo ao micróbio infeccioso (exposição passiva) e, deste modo, a administração intencional subsequente do antigénio (exposição activa) com oligonucleótido CpG torna-se a dose de reforço. Uma "dose de reforço" é uma segunda ou terceira, etc., dose de antigénio administrada a um indivíduo que já tenha sido exposto ao antigénio. Em alguns casos a dose preparatória administrada com o oligonucleótido CpG é tão eficaz que não é necessária uma dose de reforço para proteger um indivíduo em risco de infecção de ser infectado. 0 indivíduo é exposto ao antigénio. Conforme utilizado neste contexto, o termo "exposto" refere-se tanto ao passo activo de pôr o indivíduo em contacto com um antigénio como a exposição passiva do indivíduo ao antigénio in vivo. Os métodos para a exposição activa de um indivíduo a um antigénio são bem conhecidos na técnica. De um modo geral, um antigénio é administrado directamente ao indivíduo por qualquer meio, tal como por administração intravenosa, intramuscular, oral, transdérmica, mucosal, intranasal, intratraqueal ou subcutânea. 0 antigénio pode ser administrado sistémica ou localmente. Os métodos para a administração do antigénio e do oligonucleótido CpG estão descritos em mais pormenor adiante. Um indivíduo é exposto passivamente a um antigénio se o antigénio ficar disponível para exposição nas células imunocompetentes no organismo. Um indivíduo pode ser exposto passivamente a um antigénio, por exemplo, pela entrada de um patogénio estranho no organismo ou pelo desenvolvimento de uma célula tumoral que expressa um antigénio estranho sobre a sua superfície. Quando um indivíduo é exposto passivamente a um antigénio, é preferido, em algumas formas de realização, que o oligonucleótido CpG seja um oligonucleótido de 8-100 nucleótidos de comprimento e/ou tenha um esqueleto de fosfato modificado.

Os métodos em que um indivíduo é exposto passivamente a um antigénio podem ser particularmente dependentes do sincronismo do oligonucleótido CpG. Por exemplo, num indivíduo em risco de desenvolver um cancro ou uma doença infecciosa ou uma resposta alérgica ou asmática, o indivíduo pode ser administrado com o oligonucleótido CpG regularmente quando o risco for maior, isto é, durante a estação de alergia ou depois de exposição a um agente causador de cancro. Além disso, o oligonucleótido CpG pode ser administrado a viajantes antes dos mesmos viajarem para terras estrangeiras onde estejam em risco de exposição a agentes infecciosos. Do mesmo modo, o oligonucleótido CpG pode ser administrado a soldados ou civis em riscos de exposição a armas biológicas para induzir uma resposta imunológica mucosal ao antigénio quando e se o indivíduo for exposto às mesmas.

Um "antigénio" conforme utilizado neste contexto, é uma molécula capaz de provocar uma resposta imunológica. Os antigénios incluem, mas não se limitam a células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polissacáridos, conjugados de polissacáridos, péptidos imitadores de polissacáridos, lípidos, glicolípidos, hidratos de carbono, vírus e extractos virais e organismos multicelulares, tais como parasitas e alergénios. 0 termo antigénio inclui, de forma ampla, qualquer tipo de molécula que é reconhecida por um sistema imunológico hospedeiro como sendo estranha. Os antigénios incluem, mas não se limitam a antigénios do cancro, antigénios microbianos e alergénios.

Um "antigénio do cancro", conforme utilizado neste contexto, é um composto, tal como um péptido ou proteína, associado a um tumor ou superfícies de células de cancro e que é capaz de provocar uma resposta imunológica quando expresso na superfície de uma célula que apresenta antigénio no contexto de uma molécula MHC. Os antigénios do cancro podem ser preparados a partir de células de cancro, seja pela preparação de extractos de células de cancro em bruto, por exemplo, conforme descrito em Cohen, et al. , 1994, Cancer Research, 54:1055, purificando parcialmente os antigénios, por meio de tecnologia recombinante, seja pela síntese de novo de antigénios conhecidos. Os antigénios do cancro incluem antigénios que são recombinantemente uma porção imunogénica ou um tumor inteiro ou cancro. Tais antigénios podem ser isolados ou preparados de forma recombinante ou por qualquer outro meio conhecido na técnica.

Um "antigénio microbiano", conforme utilizado neste contexto, é um antigénio de um microrganismo e inclui, mas não se limita a vírus infecciosos, bactérias infecciosas, parasitas infecciosos e fungos infecciosos. Tais antigénios incluem o microrganismo intacto, bem como isolados naturais e fragmentos ou derivados do mesmo e também compostos sintéticos que são idênticos ou semelhantes aos antigénios de microrganismos naturais e induzem uma resposta imunológica especifica para aquele microrganismo. Um composto é semelhante a um antigénio de microrganismo natural se o mesmo induzir uma resposta imunológica (humoral e/ou celular) a um antigénio de microrganismo natural. Tais antigénios são utilizados na técnica, de forma rotineira, e são bem conhecidos daqueles com conhecimento corrente da técnica.

Exemplos de virus infecciosos que foram encontrados em seres humanos incluem, mas não se limitam a: Retroviridae (por exemplo, os virus da imunodeficiência humana, tais como o HIV-1 (também referidos como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV ou HIV-III; e outros isolados, tais como o HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, os virus da poliomielite, vírus da hepatite A; enterovirus, vírus de Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exemplo, estirpes que provocam a gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola); Flaviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela); Coronoviridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdoviradae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus da ébola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da parainfluenza, vírus da parotidite epidémica, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza); Bungaviridae (por exemplo, vírus Hantaan, vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo); Arena viridae (vírus da febre hemorrágica) ; Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus da Hepatite B) ; Parvovirida (parvovirus); Papovaviridae (vírus do papiloma, vírus do polioma); Adenoviridae (a maioria dos adenovirus); Herpesviridae (virus herpes simplex (HSV) 1 e 2, virus varicella-zoster, citomegalovirus (CMV), herpes virus; Poxviridae (virus da variola, virus da vaccinia, pox virus); e Iridoviridae (por exemplo, virus da febre do suíno Africano); e virus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicos das encefalopatias espongiformes, o agente da hepatite delta (que se crê seja um satélite defeituoso do vírus da hepatite B), os agentes da hepatite não A, não B (classe 1 = transmitida internamente; classe 2 = transmitida parentericamente (isto é, a Hepatite C) ; vírus de Norwalk, vírus relacionados e astrovírus).

Tanto as bactérias gram-negativas como as gram-positivas servem como antigénios em animais vertebrados. Tais bactérias gram-positivas incluem, mas não se limitam à espécie Pasteurella, espécie Staphylococci e espécie Streptococcus. As bactérias gram-negativas incluem, mas não se limitam a Escherichia coli, espécie Pseudomonas e espécie Salmonella. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluem mas não se limitam a: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por exemplo, M. tuberculosis, Μ. avium, Μ. intracellulare, Μ. kansaii, Μ. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus Grupo B) , Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (sps. anaerdbica), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patogénica, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perffingers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia e Actinomyces israelii.

Exemplos de fungos infecciosos incluem: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Outros organismos infecciosos (isto é, protistas) incluem: Plasmodium tal como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium vivax e Toxoplasma gondii.

Outros microrganismos relevantes do ponto de vista médico foram extensamente descritos na literatura, por exemplo, ver, C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Grã Bretanha 1983, cujo teor é aqui integralmente incorporado por citação.

Embora muitos dos antigénios microbianos descritos acima relacionem-se a patologias humanas, a invenção é também útil para tratar outros vertebrados não humanos. Os vertebrados não humanos são também capazes de desenvolver infecções que podem ser evitadas ou tratadas com os oligonucleótidos CpG aqui descritos. Por exemplo, para além do tratamento e doenças infecciosas humanas, os métodos da invenção são úteis para tratar infecções de animais.

Conforme utilizado neste contexto, o termo "tratar", "tratado" ou "tratamento", quando utilizado em relação a uma doença infecciosa, refere-se a um tratamento profilático que aumenta a resistência de um indivíduo (um indivíduo em risco de infecção) à infecção com um patogénio ou, em outras palavras, diminui a possibilidade do indivíduo ficar infectado com o patogénio, bem como um tratamento depois do indivíduo (um indivíduo que tenha sido infectado) ter sido infectado a fim de combater a infecção, por exemplo, reduzir ou eliminar a infecção ou evitar que a mesma se torne pior.

Muitas vacinas para o tratamento de vertebrados não humanos são descritas em Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995. Conforme discutido acima, os antigénios incluem micróbios infecciosos tais como virus, bactérias e fungos e fragmentos destes, derivados de fontes naturais ou sinteticamente. Os vírus infecciosos tanto dos vertebrados humanos como não humanos incluem os retrovirus, vírus ARN e vírus ADN. Este grupo de retrovirus inclui tanto retrovirus simples como retrovirus complexos. Os retrovirus simples incluem os subgrupos de retrovirus tipo B, retrovirus tipo C e retrovirus tipo D. Um exemplo de um retrovirus tipo B é o vírus do tumor mamário em murganho (MMTV). Os retrovirus tipo C incluem subgrupos do grupo A tipo C (incluindo o vírus do sarcoma de Rous (RSV) , o vírus da leucemia aviária (ALV) e o vírus da mieloblastose aviária (AMV)) e grupo B tipo C (incluindo o vírus da leucemia murina (MLV) , vírus da leucemia felina (FeLV), vírus do sarcoma murino (MSV), vírus da leucemia do macaco gibão (GALV), vírus da necrose do baço (SNV), vírus da reticuloendoteliose (RV) e vírus de sarcoma de símio (SSV)). Os retrovirus tipo D incluem vírus Mason-Pfizer de macaco (MPMV) e retrovirus símio tipo 1 (SRV-1). Os retrovirus complexos incluem os subgrupos de lentivírus, vírus da leucemia de células T e os vírus espumantes. Os lentivírus incluem o HIV-1, mas incluem também o HIV-2, SIV, o Visna vírus, o vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus da anemia infecciosa equina (EIAV). Os vírus da leucemia de células T incluem HTLV-1, HTLV-II, o vírus da leucemia de células T símia (STLV) e o vírus da leucemia bovina (BLV) . Os vírus espumantes incluem o vírus espumante humano (HFV), o vírus espumante símio (SFV) e o vírus espumante bovino (BFV).

Exemplos de outros vírus ARN que são antigénios em animais vertebrados incluem, mas não se limitam aos seguintes: membros da família Reoviridae, incluindo o género Orthoreovírus (serotipos múltiplos tanto de retrovirus de mamíferos como aviários), o género

Orbivirus (virus da lingua azul, virus Eugenangee, virus Kemerovo, virus da doença equina Africana e virus da febre do carrapato do Colorado), o género Rotavirus (rotavirus humano, virus da diarreia viral bovina, rotavirus murino, rotavirus simio, rotavirus bovino ou ovino, rotavirus aviário); a familia Picornaviridae, incluindo o género Enterovirus (poliovirus, virus Coxsackie A e B, virus entérico citopático humano órfão (ECHO), virus da hepatite A, enterovirus simios, virus da encefalomielite murina (ME), poliovirus muris, enterovirus bovino, enterovirus porcino, o género Cardiovirus (virus da encefalomiocardite (EMC), mengovirus), o género Rinovirus (rinovirus humano incluindo pelo menos 113 subtipos; outros rinovirus), o género Aptovirus (Febre aftosa (FMDV); a familia Calciviridae, incluindo o vírus da exantema vesicular suína, vírus do leão marinho de São Miguel, picornavírus felino e vírus de Norwalk; a família Togaviridae, incluindo o género Alfavírus (vírus da encefalite equina oriental, vírus da floresta de Semliki, vírus Sindbis, vírus Chikungunya, vírus 0'Nyong-Nyong, vírus do rio Ross, vírus da encefalite equina Venezuelana, vírus da encefalite equina oriental), o género Flavirius (vírus da febre amarela transmitido por mosquito, vírus da dengue, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da encefalite do Vale Murray, vírus do Oeste do Nilo, vírus Kunjin, vírus transmitido por carrapatos da Europa Central, vírus transmitidos por carrapatos do Extremo Oriente, vírus da floresta de Kyasanur, vírus Louping III, vírus Powassan, vírus da febre hemorrágica de Omsk), o género Rubivírus (vírus da Rubéola), o género Pestivírus (vírus da doença Mucosal, vírus hog-cólera, vírus da doença de Border); a família Bunyaviridae, incluindo o género Bunyvirus (vírus Bunyamwera e vírus relacionados, vírus da encefalite da Califórnia), o género Flebovírus (vírus siciliano da febre de papatasii, vírus da febre do vale do Rift) , o género Nairovírus (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, vírus da doença do carneiro de Nairobi) e o género Uukuvírus (Uukuniemi e

vírus relacionados); a família Orthomyxoviridae, incluindo o género influenzavírus (influenzavírus tipo A, muitos subtipos humanos); influenzavírus de suínos e influenzavírus aviários e equinos; influenza tipo B (muitos subtipos humanos) e influenza tipo C (possível género separado); a família Paramyxoviridae, incluindo o género Paramyxovirus (parainfluenzavírus tipo 1, vírus Sendai, vírus por Hemadsorption, parainfluenzavírus tipos 2 a 5, vírus da doença de Newcastle, vírus da parotidite epidémica), o género Morbillivírus (vírus do sarampo, vírus da panencefalite esclerosante subaguda, vírus da raiva, vírus Rinderpest), o género Pneumovírus (vírus sincicial respiratório (RSV), vírus sincicial respiratório bovino e vírus da pneumonia de murganhos); vírus da floresta, vírus Sindbis, vírus Chikungunya, vírus 0'Nyong-Nyong, vírus do rio Ross, vírus da encefalite equina Venezuelana, vírus da encefalite equina oriental), o género Flavirius (vírus da febre amarela transmitido por mosquito, vírus da dengue, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da encefalite do Vale Murray, vírus do Oeste do Nilo, vírus Kunjin, vírus transmitido por carrapatos da Europa Central, vírus transmitidos por carrapatos do Extremo Oriente, vírus da floresta de Kyasanur, vírus Louping III, vírus Powassan, vírus da febre hemorrágica de Omsk), o género Rubivírus (vírus da Rubéola), o género Pestivírus (vírus da doença Mucosal, vírus hog-cólera, vírus da doença de Border); a família Bunyaviridae, incluindo o género Bunyvirus (vírus Bunyamwera e vírus relacionados, vírus da encefalite da Califórnia), o género Flebovírus (vírus siciliano da febre de papatasii, vírus da febre do vale do Rift) , o género Nairovírus (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, vírus da doença do carneiro de Nairobi) e o género Uukuvírus (Uukuniemi e vírus relacionados); a família Orthomyxoviridae, incluindo o género influenzavírus (influenzavírus tipo A, muitos subtipos humanos); influenzavírus de suínos e influenzavírus aviários e equinos; influenza tipo B (muitos subtipos humanos) e influenza tipo C (possível género separado); a família Paramyxoviridae, incluindo o género Paramyxovirus (parainfluenzavírus tipo 1, vírus Sendai, vírus por Hemadsorption, parainfluenzavírus tipos 2 a 5, vírus da doença de Newcastle, vírus da parotidite epidémica), o género Morbillivírus (vírus do sarampo, vírus da panencefalite esclerosante subaguda, vírus da raiva, vírus Rinderpest), o género Pneumovírus (vírus sincicial respiratório (RSV), vírus sincicial respiratório bovino e vírus da pneumonia de murganhos); a família Rhabdoviridae, incluindo o género Vesiculovirus (VSV), Chandipura vírus vírus, Flanders-Hart Park), o género Lyssavírus (vírus da raiva), Rhabdovírus de peixes e dois Rhabdovírus prováveis (vírus Marburg e vírus Ebola); a família Arenaviridae, incluindo o vírus da coriomeningite linfocítica (LCM), vírus do complexo Tacaribe e vírus Lassa; a família Coronoaviridae, incluindo o vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus da hepatite do murganho, coronavírus entérico humano e peritonite infecciosa felina (coronavírus felino).

Os vírus ADN ilustrativos que são antigénios em animais vertebrados incluem, mas não se limitam a: família Poxviridae, incluindo o género Orthopoxvirus (varíola maior, varíola menor, varíola do macaco, varíola da vaca, varíola do búfalo, varíola do coelho, Ectromelia), o género Leporipoxvírus (Mixoma, Fibroma), o género Avipoxvírus (pox aviária, outros poxvirus aviário), o género Capripoxvírus (varíola do carneiro, varíola da cabra), o género Suipoxvírus (varíola do suíno), o género Parapoxvírus (vírus da dermatite postular contagiosa, pseudo-varíola bovina, vírus da estomatite papular bovina); a família Iridoviridae (vírus da febre suína africana, vírus de sapo 2 e 3, vírus Lymphocystis de peixe) ; a família Herpesviridae, incluindo os alfa-herpesvírus (herpes simplex tipos 1 e 2, varicela-zóster, vírus do aborto equino, herpesvirus equino 2 e 3, vírus da pseudo-raiva, vírus da ceratoconjuntivite infecciosa bovina, vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina, virus da rinotraqueite felina, virus da laringotraquite infecciosa), os beta-herpesvirus (citomegalovirus humano e citomegalovirus de suinos, macacos e roedores); os gama-herpesvirus (virus Epstein-Barr (EBV), virus da doença de Marek, herpes saimiri, herpesvirus de ateles, herpesvirus sylvilagus, herpesvirus do porquinho-da-india, virus do tumor de Lucke); a familia Adenoviridae, incluindo o género Mastadenovirus (subgrupos humanos A,B,C,D,E e não agrupados; adenovirus simios (pelo menos 23 serotipos), hepatite canina infecciosa e adenovirus bovino, de porcos, carneiros, sapos e muitas outras espécies, o género Aviadenovirus (adenovirus aviário); e adenovirus não cultiváveis; a familia Papoviridae, incluindo o género Papilomavirus (virus do papiloma humano, vírus do papiloma bovino, vírus do papiloma Shope de coelho e vários vírus de papilomas patogénicos de outras espécies), o género Poliomavírus (poliomavírus, agente "vacuolating" símio (SV-40), agente vacuolante de coelho (RKV), vírus K, vírus BK, vírus JC e outros vírus de polioma de primatas, tais como vírus do papiloma Linfotrófico); a família Parvoviridae incluindo o género de vírus adeno-associados, o género Parvovirus (vírus da panleucopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, vírus da doença aleutiana da marta, etc.). Finalmente, os vírus ADN podem incluir vírus que não se encaixam nas famílias acima, tais como os vírus das doenças de Kuru e Creutzfeldt-Jacob e agentes neuropáticos infecciosos crónicos (vírus CHINA).

Cada uma das listas anteriores são ilustrativas e não pretendem ser limitativas.

Para além da utilização dos oligonucleótidos CpG para induzir uma resposta imunológica específica para o antigénio em humanos, os produtos ou composições das formas de realização preferidas são particularmente bem adequados para o tratamento de aves, tais como galinhas, frangos, perus, patos, gansos, codornízes e faisões. As aves são alvos primários para muitos tipos de infecções.

As aves chocadas são expostas a microrganismos patogénicos logo depois do nascimento. Embora estas aves sejam inicialmente protegidas com patogénios por anticorpos maternos, esta protecção é apenas temporária e o sistema imunológico imaturo da própria ave tem de começar a proteger a ave contra os agentes patogénicos. Geralmente, é desejável evitar infecção em aves jovens quando as mesmas são mais susceptiveis. É também desejável prevenir contra infecção em aves mais velhas, especialmente quando as aves estão abrigadas em lugares fechados, que levam à rápida propagação da doença. Deste modo, é desejável administrar às aves o oligonucleótido CpG e o adjuvante não ácido nucleico da invenção para aumentar uma resposta imunológica específica para o antigénio quando o antigénio está presente.

Um exemplo de uma infecção comum em galinhas é o vírus da anemia infecciosa das galinhas (CIAV). 0 CIAV foi isolado pela primeira vez no Japão em 1979 durante uma investigação de uma interrupção de vacinação contra a doença de Marek (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23:366-385). Desde aquele tempo, o CIAV foi detectado em aviários comerciais na maior parte dos países produtores de aves (van Bulow et al., 1991, pp.690-699) em Diseases of Poultry, 9th edition, Iowa State University Press). A infecção por CIAV resulta numa doença clínica, caracterizada pela anemia, hemorragia e imunossupressão em galinhas jovens susceptiveis. A atrofia do timo e da medula óssea e lesões consistentes de galinhas infectadas com CIAV são também características da infecção por CIAV. A depleção de linfócitos no timo e, ocasionalmente, na bursa de Fabricius, resulta em imunossupressão e aumentada susceptibilidade a infecções virais, bacterianas ou fúngicas secundárias que, então, complicam o curso da doença. A imunossupressão pode provocar doença agravada depois da infecção com um ou mais dos vírus da doença de Marek (MDV) , vírus da doença bursal infecciosa, vírus da reticuloendoteliose, adenovirus ou reovírus. Foi registado que a patogénese do MDV é intensificada pelo CIAV (DeBoer et al., 1989, p. 28 em Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.). Além disso, foi registado que o CIAV agrava os sinais da doença bursal infecciosa (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713). As galinhas desenvolvem uma resistência com a idade à doença induzida experimentalmente devido a CAA. Isto é essencialmente completo em torno da idade de 2 semanas, porém, aves mais velhas são ainda susceptíveis a infecção (Yuasa, N. et al., 1979 supra; Yuasa, N. et al., Arian Diseases 24, 202-209, 1980). No entanto, se as aves forem infectadas duplamente com CAA e um agente imunossupressor (IBDV, MDV, etc.) a resistência com a idade contra a doença é retardada (Yuasa, N. et al., 1979 e 1980 supra; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93-116, 1986). As características do CIAV que podem potenciar a transmissão da doença incluem a alta resistência à desactivação ambiental e alguns desinfectantes comuns. O impacto económico da infecção por CIAV na indústria de aves é clara a partir do facto de que 10% a 30% das aves infectadas em surtos de doença, morrem. A vacinação de aves, como de outros animais vertebrados, pode ser realizada em qualquer idade. Normalmente, as vacinações são realizadas até 12 semanas de idade para um microrganismo vivo e entre 14-18 semanas para um microrganismo desactivado ou outro tipo de vacina. Para a vacinação in ovo, a vacinação pode ser realizada na última quarta parte do desenvolvimento do embrião. A vacina pode ser administrada por via subcutânea, por pulverização, por via oral, intraocular, intratraqueal, nasal ou por meio de outros métodos de administração mucosal aqui descritos. Deste modo, o oligonucleótido CpG da invenção pode ser administrado a aves e outros vertebrados não humanos utilizando esquemas de vacinação de rotina e o antigénio é administrado depois de um período de tempo apropriado conforme aqui descrito.

Bovídeos e gado são também susceptíveis a infecção. A doença que afecta estes animais pode produzir graves perdas económicas, especialmente entre os bovídeos. Os métodos da invenção podem ser utilizados para proteger contra infecção em gado, tal como vacas, cavalos, porcos, ovelhas e cabras.

As vacas podem ser infectadas com vírus de bovídeos. 0 vírus da diarreia virai bovina (BVDV) é um pequeno vírus ARN envelopado de fita positiva e é classificado, juntamente com o vírus da cólera suína (HOCV) e o vírus da doença de fronteira de ovinos (BDV) , no género pestivírus. Embora os Pestivírus tenham sido anteriormente classificados na família Togaviridae, alguns estudos sugerem a sua reclassificação na família Flaviviridae, juntamente como os flavivírus e grupos de vírus da Hepatite C (HCV) (Francki, et al., 1991) . 0 BVDV, que é um importante agente patogénico de bovídeos que pode ser distinguido, com base em análise de cultura de célula, nos biótipos citopatogénicos (CP) e não citopatogénicos (NCP). 0 biótipo NCP é mais disseminado, embora ambos os biotipos possam ser encontrados em gado. Se uma vaca grávida torna-se infectada com uma estirpe de NCP, a vaca por dar a luz a um vitelo persistentemente infectado e especificamente imunotolerante que espalhará o vírus durante toda a sua vida. 0 bovídeo persistentemente infectado pode sucumbir à doença mucosal e ambos os biótipos podem, então, ser isolados do animal. As manifestações clínicas podem incluir aborto, teratogénese e problemas respiratórios, doença mucosal e diarreia suave. Além disso, tem sido descrita grave trombocitopenia associada com a epidemia do rebanho que pode resultar na morte do animal e as estirpes associadas com esta doença parecem mais virulentas do que o BVDV clássico. 0 herpesvirus equino (EHV) compreende um grupo de agentes biologicamente distintos do ponto de vista antigénico que provocam uma diversidade de infecções em cavalos que variam de doença subclinica a fatal. Estas incluem o herpesvirus Equino-1 (EHV-1), um agente patogénico sempre presente em cavalos. 0 EHV-1 está associado com a epidemia de abortos, doença do tracto respiratório e patologias do sistema nervoso central. A infecção primária do tracto respiratório superior de cavalos jovens resulta numa doença febril que persiste por 8 a 10 dias. As éguas imunologicamente experientes podem ser reinfectadas através do tracto respiratório sem que a doença se torne evidente, de modo que o aborto ocorre, geralmente, sem aviso. A sindrome imunológica é associada com doença respiratória ou aborto e pode afectar animais de qualquer sexo em qualquer idade, levando à descoordenação, fraqueza e posterior paralisia (Telford, E.A.R. et al., Virology 189, 304-316, 1992). Outros EHVs incluem EHV-2 ou citomegalovirus equino, EHV-3, virus do exantema coital equino e EHV-4, anteriormente classificado como EHV-1 do subtipo 2.

Ovelhas e cabras podem ser infectadas por uma variedade de microrganismos perigosos incluindo visna-maedi.

Os primatas, tais como os símios e macacos podem ser infectados pelo vírus da imunodeficiência dos símios. Foi registado que vacinas de vírus de célula desactivada e de célula livre inteira contra a imunodeficiência dos símios oferecem protecção em macacos (Stott et al., (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers et al., PNAS EUA (1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb et al., (1989) Science 24 6:12 93-12 97; e Carlson et al., (1990) AIDS Res. Human

Retroviruses 6:1239-1246). Uma vacina recombinante de HIV gpl20 foi registada por oferecer protecção em chimpanzés (Berman et ai., (1990) Nature 345:622-625).

Os gatos, tanto domésticos como selvagens, são susceptiveis à infecção com uma variedade de microrganismos. Por exemplo, a peritonite infecciosa felina é uma doença que ocorre tanto em gatos domésticos como selvagens, tais como leões, leopardos, chitas e jaguares. Quando é desejável evitar infecções com este e outros tipos de organismos patogénicos em gatos, os produtos e composições da invenção podem ser utilizados para vacinar os gatos para os proteger contra infecção.

Os gatos domésticos podem tornar-se infectados com vários retrovirus, incluindo, mas não limitado ao vírus da leucemia felina (FeLV), vírus do sarcoma felino (FeSV), oncornavirus endógeno tipo C (RD-114) e vírus formador de sincícia felina (FeSFV). Destes, o FeLV é o patogénio mais significativo, provocando diversos sintomas, incluindo neoplasmas linfo-reticulares e mielóides, anemias, patologias imunomediadas e uma síndrome de imunodeficiência que é semelhante à síndrome da imunodeficiência adquirida humana (SIDA). Recentemente, um mutante de replicação defeituosa particular, designado como FeLV-SIDA foi mais particularmente associado às propriedades imunosupressoras. A descoberta do lentivírus T-linfotrópico felino (também referido como imunodeficiência felina) foi primeiro registada em Pedersen et al., (1987) Science 235:790-793. As características do FIV foram registadas em Yamamoto et al., (1988) Leukemia, December Supplement 2:204S-215S; Yamamoto et al., (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; e Ackley et al., (1990) J. Virol. 64:5652-5655. A clonagem e a análise das sequências do FIV foram registadas em

Olmsted et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:2448-2452 e 86:43554360. A peritonite infecciosa felina (FIP) é uma doença esporádica que ocorre de forma imprevisível em Felidae domésticos e selvagens. Embora a FIP seja, principalmente, uma doença de gatos domésticos, foi diagnosticada em leões, leopardos, chitas e jaguares. Os gatos selvagens menores que foram afligidos com a FIP incluem o lince e o caracal, o gato das areias e o gato de Palias. Nos gatos domésticos, a doença ocorre, predominantemente, em animais jovens, embora gatos de todas as idades sejam susceptíveis. Uma incidência de pico ocorre entre 6 e 12 meses de idade. Um declínio em incidência é observado de 5 a 13 anos de idade, seguido por uma incidência aumentada em gatos de 14 a 15 anos de idade.

As doenças virais, bacterianas e parasíticas em peixes de barbatanas, moluscos ou outras formas de vida aquática representam um sério problema para a indústria de aquacultura. Devido à alta densidade de animais nos tanques de incubação ou áreas de produção de formas marinhas encerradas, as doenças infecciosas podem erradicar uma grande porção da população, por exemplo, das dependências de peixes de barbatanas, moluscos ou outras formas de vida aquática. A prevenção da doença é um remédio mais desejável às ameaças aos peixes do que a intervenção, uma vez que a doença está em progresso. A vacinação dos peixes é o único método preventivo que pode oferecer protecção a longo prazo através da imunidade. As vacinações à base de ácido nucleico estão descritas na Patente US N° 5,780,448 publicada por Davis. O sistema imunológico dos peixes tem muitas características semelhantes ao sistema imunológico dos mamíferos, tais como a presença de células B, células T, linfocinas, complemento e imunoglobulinas. Os peixes têm subclasses de linfócitos com funções que, em muitos aspectos, parecem semelhantes àquelas das células B e T dos mamíferos. As vacinas podem ser administradas por imersão ou por via oral.

As espécies em aquacultura incluem, mas não se limitam a peixes de barbatana, moluscos e outros animais aquáticos. Os peixes de barbatanas incluem todos os peixes vertebrados que podem ser peixes de ossos ou cartilagem, tais como, por exemplo, os salmonídeos, a carpa, o peixe-gato, o cantarilho rabo-amarelo, a dourada e o robalo. Os salmonídeos são uma família de peixes de barbatanas que inclui a truta (incluindo a truta arco-íris), o salmão, e o salvelino árctico. Exemplos de moluscos incluem, mas não se limitam a amêijoas, lagostas, camarões, caranguejos e ostras. Outros animais aquáticos cultivados incluem, mas não se limitam a enguias, lulas e polvos.

Os polipéptidos de patogénios virais de aquacultura incluem, mas não se limitam a glucoproteína (G) ou nucleoproteína (N) de vírus da septicemia hemorrágica viral (VHSV); proteínas G ou N do vírus da necrose hematopoiética infecciosa (IHNV); proteínas estruturais VP1, VP2, VP3 ou N do vírus da necrose pancreática infecciosa (IPNV); proteína G da viremia de primavera da carpa (SVC); e uma proteína associada a membrana, proteína tegumina ou da cápside ou glicoproteína do vírus do peixe-gato do canal (CCV).

Os péptidos de patogénios bacterianos incluem, mas não se limitam a uma proteína de membrana externa regulada com ferro, (IROMP) , ou uma proteína de membrana externa (OMP) e uma proteína A de Aeromonas salmonicida que provoca furunculose, a proteína p57 de Renibacterium salmonarum que provoca a doença bacteriana do fígado (BKD) , antigénio associado à superfície principal (msa), uma citotoxina expressa na superfície (mpr), uma hemolisina expressa na superfície (ish,) e um antigénio flagelar de Yersiniosis; uma proteína extracelular (EPC), uma proteína de membrana externa regulada com ferro (IROMP) e uma proteína estrutural de Pasteurellosis; uma proteína OMP e flagelar de Vibrosis anguillarum e V. ordalii; uma proteína flagelar, uma proteína OMP, aroA e purA de Edwardsiellosis ictaluri e E. tarda; e antigénio de superfície de Ichthyophthirius; e uma proteína estrutural e reguladora de Cytophaga columnari; e uma proteína estrutural e reguladora de Rickettsia.

Os polipéptidos de um patogénio parasítico incluem, mas não se limitam ao antigénio de superfície de Ichthyophthirius.

Um "alergénio" refere-se a uma substância (antigénio) que pode induzir uma reposta alérgica ou asmática num indivíduo susceptível. A lista de alergénios é enorme e pode incluir pólenes, insectos venenosos, pó de dander de animal, esporos fungais e fármacos (por exemplo, a penicilina). Exemplos de alergénios naturais, animais e plantas incluem, mas não se limitam a proteínas específicas aos seguintes géneros: Canine {Canis familiaris); Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domestícus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por exemplo, Lolium perenne ou Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Bétula (Bétula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (por exemplo, Parietaria officinalis ou Parietaria judaica); Blattella (por exemplo, Blattella germanica); Apis (por exemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por exemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica e Cupressus macrocarpa); Juniperus (por exemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis e Juniperus ashei); Thuya (por exemplo, Thuya orientalis) ; Chamaecyparis (por exemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por exemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por exemplo, Agropyron repens); Secale (por exemplo, Secale cereale); Triticum (por exemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por exemplo, Dactylis glomerata); Festuca (por exemplo, Festuca elatior); Poa (por exemplo, Poa pratensis ou Poa compressa); Avena (por exemplo, Avena sativa); Holcus (por exemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por exemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis (por exemplo, Agrostis alba); Phleum (por exemplo, Phleum pratense); Phalaris (por exemplo, Phalaris arundinacea); Paspalúmen (por exemplo, Paspalúmen notatum); Sorghum (por exemplo, Sorghum halepensis); e Bromus (por exemplo, Bromus inermis) . 0 antigénio pode ser um antigénio que é codificado por um vector de ácido nucleico ou pode não ser codificado num vector de ácido nucleico. No primeiro caso, o vector de ácido nucleico é administrado ao indivíduo e o antigénio é expresso in vivo. No segundo caso, o antigénio é administrado directamente ao indivíduo. Um "antigénio não codificado num vector de ácido nucleico" conforme utilizado neste contexto, refere-se a qualquer tipo de antigénio que não é um ácido nucleico. Por exemplo, em alguns aspectos da invenção, o antigénio não codificado num vector de ácido nucleico é um polipéptido. Modificações mínimas das sequências de aminoácido primárias também podem resultar num polipéptido que tem actividade antigénica substancialmente equivalente em comparação com o polipéptido equivalente não modificado. Tais modificações podem ser deliberadas, tais como a mutagénese dirigida pelo sítio, ou podem ser espontâneas. Todos os polipéptidos produzidos por estas modificações estão incluídas aqui, desde que ainda exista antigenicidade. O polipéptido pode ser, por exemplo, um polipéptido virai. Um exemplo não limitativo de um antigénio útil de acordo com a invenção é o antigénio de superfície da hepatite B. Experiências utilizando este antigénio estão descritas nos Exemplos adiante. 0 termo "substancialmente purificado", conforme utilizado neste contexto refere-se a um polipéptido que é substancialmente livre de outras proteínas, lípidos, hidratos de carbono e outros materiais com os quais está naturalmente associado. Um especialista na técnica pode purificar polipéptidos virais ou bacterianos utilizando técnicas padrão para purificação de proteínas. 0 polipéptido substancialmente puro muitas vezes produzirá uma única banda principal sobre um gel de poliacrilamida não redutor. No caso de polipéptidos parcialmente glicosilados ou aqueles que têm vários codões de iniciação, pode haver várias bandas sobre um gel de poliacrilamida não redutor, mas estes formarão um padrão distinto para aquele péptido. A pureza do polipéptido virai ou bacteriano também pode ser determinada por meio da análise de sequência de aminoácido do terminal amino. A invenção também utiliza polinucelótidos que codificam os polipéptidos antigénicos. É previsto que o antigénio possa ser administrado ao indivíduo numa molécula de ácido nucleico que codifique para o antigénio, de tal modo que o antigénio tem de ser expresso in vivo. Tais antigénios administrados ao indivíduo num vector de ácido nucleico são referidos como "antigénios codificados por um vector de ácido nucleico". 0 ácido nucleico que codifica o antigénio está ligado operativamente a uma sequência de expressão de gene que dirige a expressão do ácido nucleico do antigénio no interior de uma célula eucariótica. A "sequência de expressão de gene" é qualquer sequência nucleotídica reguladora, tal como uma sequência promotora ou combinação de promotora-intensificadora, que facilita a transcrição e a tradução eficiente do ácido nucleico do antigénio ao qual está ligada operativamente. A sequência de expressão do gene pode, por exemplo, ser um promotor mamífero ou virai, tal como um promotor constitutivo ou indutível. Os promotores mamíferos constitutivos incluem, mas não se limitam aos promotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforibosil transferase (HPTR), adenosina deaminase, piruvato cinase, o promotor β-actina e outros promotores constitutivos. Os promotores virais exemplificativos que funcionam de forma constitutiva em células eucarióticas incluem, por exemplo, os promotores de citomegalovirus (CMV), vírus símio (por exemplo SV40), vírus do papiloma, adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovirus, repetições do terminal longo (LTR) do vírus da leucemia de Moloney e outros retrovirus e a timidina cinase promotora do vírus herpes simplex. Outros promotores constitutivos são conhecidos daqueles com conhecimento corrente da técnica. Os promotores úteis como sequências de expressão de gene da invenção também incluem os promotores indutíveis. Os promotores indutíveis são expressos na presença de um agente de indução. Por exemplo, o promotor metalotioneína é induzido a promover a transcrição e a tradução na presença de certos iões de metal. Outros promotores indutíveis são conhecidos daqueles com conhecimento corrente da técnica.

De um modo geral, a sequência de expressão do gene inclui, conforme necessário, as sequências não transcritoras 5' e não tradutoras 5' envolvidas com a iniciação de transcrição e tradução, respectivamente, tal como um TATA-box, sequência de coroamento (capping), sequência CAAT e outras. Especialmente, tais sequências não transcritoras 5' incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controlo transcripcional do ácido nucleico do antigénio unido funcionalmente. As sequências de expressão de gene, opcionalmente, incluem sequências intensificadoras ou sequências activadoras a montante, conforme desejado. 0 ácido nucleico do antigénio é funcionalmente ligado à sequência de expressão do gene. Conforme utilizado neste contexto, a sequência do ácido nucleico do antigénio e a sequência de expressão do gene são referidas como sendo "ligadas funcionalmente" quando as mesmas estão ligadas de forma covalente, de tal modo a colocar a expressão ou transcrição e/ou tradução da sequência de codificação de antigénio sob a influência ou controlo da sequência de expressão de gene. Duas sequências de ADN são referidas como funcionalmente ligadas se a indução de um promotor na sequência de expressão de gene 5' resulta na transcrição da sequência do antigénio e se a natureza da ligação entre as duas sequências de ADN não (1) resulta na introdução de uma mutação de deslocação de estrutura, (2) interfere com a capacidade da região promotora de dirigir a transcrição da sequência do antigénio, ou (3) interfere com a capacidade do transcrito de ARN correspondente de ser traduzido numa proteína. Deste modo, uma sequência de expressão de gene seria ligada funcionalmente a uma sequência de ácido nucleico do antigénio se a sequência de expressão do gene fosse capaz de efectuar a transcrição daquela sequência de ácido nucleico do antigénio de tal modo que o transcrito resultante é traduzido na proteína ou polipéptido desejado. 0 ácido nucleico do antigénio da invenção pode ser administrado ao sistema imunológico só ou em associação com um vector. No seu sentido mais lato, um "vector" é qualquer veículo capaz de facilitar a transferência do ácido nucleico do antigénio para as células do sistema imunológico de modo que o antigénio possa ser expresso e apresentado sobre a superfície da célula imunológica. De um modo geral, o vector transporta o ácido nucleico para as células imunológicas com degradação reduzida em relação ao grau de degradação que resultaria na ausência do vector. Opcionalmente, o vector inclui a sequência de expressão de gene acima descrita para aumentar a expressão do ácido nucleico do antigénio nas células imunocompetentes. De um modo geral, os vectores úteis na invenção incluem, mas não se limitam a plasmídeos, fagemideos, vírus, outros veículos derivados de fontes virais ou bacterianas que foram manipulados pela inserção ou incorporação das sequências de ácido nucleico do antigénio. Os vectores virais são um tipo preferido de vector e incluem, mas não se limitam a sequências de ácido nucleico dos seguintes vírus: retrovirus, tal como o vírus da leucemia murina de Monoley, vírus do sarcoma murino de Harvey, vírus do tumor mamário murino e vírus do sarcoma de Rous; adenovirus, vírus adeno-associados; vírus do tipo SV40; vírus polioma; vírus Epstein-Barr; vírus papiloma; vírus herpes; vírus vaccinia; vírus pólio; e vírus ARN, tais como um retrovirus. Pode-se prontamente utilizar outros vectores não indicados, mas conhecidos na técnica.

Os vectores virais preferidos têm como base os vírus eucarióticos não citopáticos nos quais os genes não essenciais foram substituídos pelo gene de interesse. Os vírus não citopáticos incluem os retrovirus, cujo ciclo de vida envolve a transcrição reversa de ARN virai genómica em ADN com a subsequente integração proviral no ADN celular hospedeiro. Os retrovirus foram aprovados para ensaios terapêuticos em gene humano. Os mais úteis são aqueles retrovirus que têm replicação deficiente (isto é, capazes de dirigir a síntese dos proteínas desejadas, mas incapazes de fabricar uma partícula infecciosa). Tais vectores de expressão virai geneticamente alterados têm utilidade geral para a transdução de genes in vivo de alta eficiência. Protocolos padrão para produzir retrovirus de replicação deficiente (incluindo os passos da incorporação de material genético exógeno num plasmídeo, transferência de uma embalagem de células revestida com plasmídeo, produção de retrovirus recombinantes pela embalagem da linha de célula, recolha de partículas virais de meios de cultura de tecido e infecção da célula alvo com partículas virais) são proporcionados em Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory-Manual", W.H: Freeman Co.0., Nova Iorque (19990) e Murry, E.J. ed. "Methods in Molecular Biology", vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, Nova Jérsia (1991).

Um virus preferido para certas aplicações é o virus adeno-associado, um virus de ADN de fita dupla. 0 virus adeno-associado pode ser geneticamente modificado para ser de replicação deficiente e é capaz de infectar uma ampla variedade de tipos de células e espécies. Tem outras vantagens, tais como a estabilidade térmica e de solvente lípido; alta frequência de transdução em células de linhagens diversas, incluindo células hemopoiéticas; e falta de inibição a superinfecção permitindo, deste modo séries múltiplas de transduções. Alegadamente, o virus adeno-associado pode integrar-se ao ADN celular humano de uma maneira especifica para o sitio, minimizando, deste modo, a possibilidade de mutagénese insercional e variabilidade de expressão de gene inserido caracteristica da infecção retroviral. Além disso, as infecções por virus adeno-associados do tipo selvagem foram seguidas em cultura de tecido para mais de 100 passagens na ausência de pressão selectiva, implicando que a integração genómica do vírus adeno-associado é um evento relativamente estável. O vírus adeno-associado também pode funcionar de uma maneira extracromossomal.

Outros vectores incluem vectores plasmídeos. Os vectores plasmídeos foram extensamente descritos na técnica e são bem conhecidos dos especialistas. Ver, Por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Nos últimos anos, verificou-se que os vectores plasmídeos são particularmente vantajosos para administrar genes a células in vivo, devido à sua incapacidade de replicar no interior de um genoma hospedeiro e integrar-se a ele. Estes plasmídeos, no entanto, tendo um promotor compatível com a célula hospedeira, podem expressar um péptido a partir de um gene funcionalmente codificado no interior do plasmídeo. Alguns plasmideos geralmente utilizados incluem pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 e pBlueScript. Outros plasmideos são bem conhecidos daqueles com conhecimento corrente da técnica. Além disso, os plasmideos podem ser concebidos à medida utilizando enzimas de restrição e reacções de ligação para remover e adicionar fragmentos específicos de ADN.

Foi descoberto, recentemente, que os plasmideos portadores de gene podem ser administrados ao sistema imunológico utilizando bactérias. Formas modificadas de bactéria, tais como a Salmonella podem ser transfectadas com o plasmídeo e utilizadas como veículos de administração. Os veículos de administração de bactérias podem ser administrados a um indivíduo hospedeiro por via oral ou por outros meios de administração. As bactérias administram o plasmídeo às células imunológicas, por exemplo, as células dendríticas, provavelmente atravessando a barreira intestinal. Foram estabelecidos altos níveis de protecção imunológica utilizando esta metodologia. Tais métodos de administração são úteis para os aspectos da invenção que utilizam a administração sistémica de antigénio, oligonucleótido CpG e/ou hormona. 0 oligonucleótido CpG pode actuar de uma maneira sinérgica com outros adjuvantes mucosais para intensificar as respostas imunológicas. 0 oligonucleótido CpG e o adjuvante mucosal podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente. Quando os adjuvantes são administrados simultaneamente, os mesmos podem ser administrados na mesma formulação ou em formulações separadas, mas são administrados ao mesmo tempo. Os adjuvantes são administrados sequencialmente quando a administração de pelo menos dois adjuvantes é temporalmente separada. A separação no tempo entre a administração dos dois adjuvantes pode ser uma questão de minutos ou pode ser mais prolongada.

Conforme ilustrado na secção de Exemplos, as titulações de soro IgG anti-HBs, que está associado com à imunidade sistémica em murganhos imunizados com oligonucleótido CpG mais CT foram pelo menos 50 vezes maiores do que só com CT ou só com oligonucleótido CpG (Figura 1). Além disso, titulações com 1 pg dos dois adjuvantes juntos produziram resultados melhores do que 10 pg de cada adjuvante isolado. Estes resultados indicam uma acção sinérgica dos dois adjuvantes. Resultados semelhantes também foram obtidos com CpG e LT. Tal sinergia foi verificada tanto para as respostas humorais (Figuras 1-3) como para as respostas mediadas por célula (CTL e proliferação de célula T) (Figura 4) . Do mesmo modo, a proporção do isotipo de anticorpos IgG2a foi de cerca de 10 vezes maior com CpG ODN do que CT, indicando uma influência maior de Thl de CpG ODN em comparação com CT. Além disso, a combinação de CpG ODN e CT deu uma proporção 50 vezes maior de IgG2a:IgGl do que a CT isolada. Tomados em conjunto, estes resultados indicam uma forte sinergia das respostas imunológicas humorais da combinação de adjuvantes, no que diz respeito tanto à resistência e Thl-bias como das respostas imunológicas celulares (Figura 3). A marca de qualidade da imunidade mucosal é a presença de anticorpos secretórios IgA em associação com as superficies mucosais. Os anticorpos IgA são essenciais para evitar a entrada do agente patogénico no corpo. A imunização IN de murganhos só com HBsAg, 1 ou 10 pg, não conseguiu induzir qualquer IgA detectável em lavagens de pulmões. Nem foi encontrado qualquer IgA significativo com uma alta dose de antigénio e baixa dose (1 pg) de CT ou CpT ODN. No entanto, havia IgA significativo com uma alta dose de antigénio e baixa dose tanto de CT como de CpG ODN ou uma baixa dose de antigénio e uma baixa dose dos adjuvantes combinados. De facto, os níveis de IgA com 1 pg de cada um de CpG ODN e CT combinados foram mais elevados do que com 10 pg de cada um deles isolados, quando administrados com 10 pg de HBsAg (Figura 5) . Além disso, o IgA em extractos fecais, que indica a indução da imunidade mucosal em sitios distantes, foi detectado apenas com os adjuvantes combinados (Figura 6). Estes resultados indicam que o CpG ODN é um adjuvante potente para a indução da imunidade mucosal e que há uma forte resposta sinérgica quando utilizado com outro adjuvante mucosal, tal como a CT.

Foram encontrados resultados semelhantes quando a LT foi utilizada no lugar da CT (Figura 7, Tabelas 2 e 3) . A CT e a LT, que têm relação próxima com considerável homologia estrutural e funcional, são ambas excessivamente tóxicas para utilização em serem humanos. No entanto, há inúmeras derivações de CT e LT que retêm alguma actividade do adjuvante e, no entanto, são muito menos tóxicas. Um exemplo é a subunidade B da CT (CTB) que é não tóxica, uma vez que a toxicidade está associada à subunidade A. Outro exemplo é a LTK63, um mutante geneticamente destoxifiçado de LT sem actividade enzimática tóxica. Embora estes adjuvantes estejam a ser utilizados em ensaios clínicos humanos, nenhum foi tão forte quanto o CpG ODN para a indução de imunidade sistémica (soro IgG) quando utilizou-se 1 pg de cada (Figura 7). Houve também um efeito sinérgico quando o CpG ODN e a CTB ou LTK63 foram utilizados em conjunto, no entanto, isto foi mais observável em relação ao Thl-bias do que à força da resposta do anticorpo (Figura 7 e Tabela 2). A combinação de CpG ODN e LTK63 também incluía IgA em lavagens de pulmões, embora nenhum adjuvante, por si só, induzisse IgA a concentrações baixas (Tabela 3). A forte adjuvanticidade e a baixa toxicidade do oligonucleótido CpG quando administrado a uma superfície mucosal tem implicações importantes. Permitirá que muitos antigénios sejam administrados às superfícies mucosais para a indução de fortes respostas imunológicas sistémicas. A administração não invasiva de vacina é desejável para a imunização de crianças, animais, programas de vacinação em massa e também para evitar o risco de ferimento com picada de agulha. Tais vacinas deveriam ser administradas por via intranasal, por meio de gotas nasais ou pulverização nasal ou com um sistema de administração, ou deveriam ser administradas por outras vias (oral, rectal, ocular) a outras superficies mucosais, incluindo com sistemas de administração diferentes. A interacção sinérgica do oligonucleódito CpG com os adjuvantes mucosais tem importantes implicações no desenvolvimento das vacinas. Devido à resposta sinérgica é agora possível utilizar doses mais baixas e menos tóxicas de adjuvantes mucosais, tais como a CT, ou outras toxinas relacionadas ou suas subunidades, em conjunto com o oligonucleódito CpG para obter respostas imunológicas ainda melhores com menos toxicidade. Por exemplo, seria possível utilizar o oligonucleódito CpG em combinação com mutantes geneticamente modificados menos tóxicos de CT ou LT, para uma vacina altamente eficaz de toxicidade aceitável. Não só poderia a abordagem de adjuvante combinado ser utilizada vantajosamente com toxinas diferentes, como também com formas de antigénio diferentes e sistemas de administração diferentes a várias vias mucosais. Uma quantidade eficaz, conforme utilizado em relação a este aspecto da invenção, é uma quantidade que produz uma resposta imunológica sinérgica. Uma quantidade sinérgica é aquela quantidade que produz uma resposta imunológica contra um antigénio específico que é maior do que a soma dos efeitos individuais tanto do CpG como do adjuvante mucosal isoladamente. A invenção também pode ser utilizada em combinação com estratégias de imunização parentérica (por exemplo, injecção intramuscular, intradérmica ou subcutânea) que são normalmente utilizadas para a indução de respostas imunológicas sistémicas. Extraordinariamente, os murganhos imunizados com HBsAg e tendo o oligonucleótido CpG como pelo menos um adjuvante, quando administrados com uma dose de preparação por via parentérica (IM) e com uma dose de reforço por uma via mucosal (IN) ou com dose de preparação IN e de reforço IM tinham IgG até 10 vezes mais alto (isto é, a resposta humoral sistémica) do que quando tanto a dose de preparação como a de reforço foram pela via IM (Figura 8) . As respostas imunológicas celulares também foram mais fortes com as abordagens combinadas parentérica/mucosal do que só IN ou só IM, conforme indicado por CTL mais forte (Figura 9) e proliferação mais elevada de células T (Figura 10) . Enquanto a dose de preparação e de reforço IN produz boas respostas mucosais a dose de preparação e de reforço IM não produz respostas mucosais detectáveis (Figuras 11-13) . A abordagem da dose de preparação IM e dose de reforço IN também produz IgA significativo em lavagens de pulmões (Figura 11) e saliva (Figura 12), mas não nas fezes (Figura 13).

Os adjuvantes mucosais úteis de acordo com a invenção são os adjuvantes mucosais não oligonucleótidos. Um "adjuvante mucosal não oligonucleótido", conforme utilizado neste contexto, é um adjuvante que não seja o oligonucleótido CpG que é capaz de induzir uma resposta imunológica mucosal num indivíduo quando administrado a uma superfície mucosal em associação com um antigénio. Os adjuvantes mucosais incluem, mas não se limitam a toxinas bacterianas: por exemplo, a toxina da cólera (CT), derivados da CT incluindo, mas não limitado a CT subunidade B (CTB) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Vai a Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Vai a Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (Tyr a Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (Vai a Asp, Ser a Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (Arg a His) (Fontana et al., 1995); CTN107 (His a Asn) (Fontana et al., 1995); CTE114 (Ser a Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu a Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser a Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro a Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al. , 1995); e CTK63 (Ser a Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), toxina Zonula occludens, zot, a enterotoxina termolábil Escherichia coli, Toxina Lábil (LT), derivados da LT incluindo mas não limitado a LT subunidade B (LTB) (Verweij et al., 1998); LT7K (Arg a Lys) (Komase et al. , 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser a Phe) (Komase et al., 1998); LT112K (Glu a Lys) (Komase et al., 1998); LT118E (Gly a Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg a Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (Arg a Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser a Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); e LTR72 (Ala a Arg) (Giuliani et al., 1998), toxina Pertussis, PT. (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag e Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995) incluindo PT-9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); Derivados de toxina (ver adiante) (Holmgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag e Clements, 1999); Derivados do lipido A (por exemplo, o lipido monofosforilo A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998; Derivados de dipéptido muramilo (MDP) (Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989,

Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); Proteínas da membrana externa bacteriana (por exemplo, proteína A da superfície externa (OspA) lipoproteina de Borrelia burgdorferi, proteína da membrana externa de Neisseria meningitidis) (Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); Emulsões óleo-em-água (por exemplo, MF59) (Barchfield et al., 1999, Verschoor et al., 1999, 0'Hagan, 1998); Sais de alúmenínio (Isaka et al., 1998, 1999); e Saponinas (por exemplo, QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA) (Sasaki et al., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOMS, MF-59 (uma emulsão de esqualeno-em-água estabilizada com Span 85 e Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA.); a série Seppic ISA de adjuvantes Montanide (por exemplo, Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, França); PROVAX (uma emulsão óleo-em-água contendo um detergente estabilizador e um agente formador de micelas; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA) ; Syntext Adjuvant

Formulation (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO.); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno (polímero PCPP; Virus Research Institute, EUA) e factor de alongamento de Leishmania (Corixa Corporation, Seattle, WA).

Embora a administração mucosal de antigénio seja considerada um pré-requisito para a indução de fortes respostas imunológicas mucosais, é possível induzir forte imunidade mucosal a antigénios administrados sistemicamente, modulando a resposta imune com hormonas esteróides, tais como as descritas para 1,25-di-hidroxi vitamina D3 [1,25 (OH) 2D3] (Daynes et al.r 1996). A invenção inclui também métodos para a administração de oligonucleótido CpG só ou em combinação com outros adjuvantes mucosais e antigénio a indivíduos tratados com hormonas. Cada um dos compostos pode ser administrado em conjunto ou separadamente, por via sistémica ou mucosal. Nalgumas formas de realização o oligonucleótido CpG e o antigénio e, opcionalmente, outros adjuvantes mucosais são administrados por via mucosal e a hormona é administrada por via sistémica. A hormona pode ser dada por via parentérica (por exemplo, injecção subcutânea) ou por via mucosal (por exemplo, por via oral).

As respostas imunológicas mucosais também podem ser induzidas com a co-administração de citocinas com os oligonucleótidos CpG. As respostas imunológicas também podem ser aumentadas por meio da expressão co-linear de citocinas (Bueler & Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) ou moléculas co-estimulatórias B-7 (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997). As citocinas podem ser administradas directamente com os oligonucleótidos CpG ou podem ser administradas na forma de um vector de ácido nucleico que codifica a citocina, de tal modo que a citocina pode ser expressa in vivo. Numa forma de realização, quando o CpG é administrado na forma de um vector de expressão de plasmídeo, o vector pode codificar a citocina e uma administração separada de citocina não é necessária. 0 termo "citocina" é utilizado como um nome genérico para um variado grupo de proteínas e péptidos solúveis que actuam como reguladores humorais em concentrações nano a picomolar e que, seja sob condições normais ou patológicas, modulam as actividades funcionais de células e tecidos individuais. Estas proteínas também mediam as interacções directamente entre as células e regulam os processos que têm lugar no ambiente extracelular. Exemplos de citocinas incluem, mas não se limitam a IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, factor estimulador de colónia granulócito-macrófago (GCSF) , interferão-γ (γ-INF) , factor de necrose tumoral (TNF) TGF-β, ligando FLT-3 e ligando CD40.

As citocinas desempenham um papel em dirigir a resposta da célula T. As células auxiliares (CD4+) conduzem a resposta imunológica de mamíferos através da produção de factores solúveis que actuam sobre outras células do sistema imunológico, incluindo outras células T. A maior parte das células auxiliares CD4+ maduras expressam um de dois perfis de citocinas: Thl ou Th2. As células Thl expressam IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF e baixos níveis de TNF-α. O subconjunto TH1 promove a hipersensibilidade retardada, imunidade mediada por célula e troca de classe de imunoglobulina para IgG2a· 0 subconjunto Th2 induz a imunidade humoral activando as células B, promovendo a produção de anticorpos e incluindo a troca de classe para IgGi e IgE. Em algumas formas de realização é preferido que a citocina seja uma citocina Thl.

Surpreendentemente, verificou-se que os oligonucleótidos CpG induzem a imunidade mucosal em sítios remotos bem como em sítios locais. Um "sítio remoto", conforme utilizado neste contexto, é um tecido mucosal que está situado numa região do corpo diferente do tecido mucosal à qual o oligonucleótido CpG foi administrado. Por exemplo, se o oligonucleótido CpG for administrado por via intranasal, um sitio remoto seria o revestimento mucosal do intestino.

Para utilização na presente invenção, os ácidos nucleicos podem ser sintetizados de novo utilizando qualquer um de uma série de procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, o método de b-cianoetil fosforamidite (Beaucage, S. L., e Caruthers, Μ. H., Tet. Let. 22:1859, 1981); o método nucleósido H-fosfonato (Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al. , Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Estas químicas podem ser realizadas por meio de uma variedade de sintetizadores automáticos de oligonucleótido disponíveis no mercado. Alternativamente, os dinucleótidos CpG podem ser produzidos em larga escala em plasmídeos (ver Sambrook, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989) e separados em pedaços menores ou administrados inteiros. Depois de ser administrado a um indivíduo o plasmídeo pode ser degradado em oligonucleótidos. Os oligonucleótidos podem ser preparados a partir de sequências de ácido nucleicos existentes (por exemplo, genómico ou cADN) utilizando técnicas conhecidas, tais como aquelas que utilizam enzima de restrição, exonucleases e endonucleases.

Para utilização in vivo, os ácidos nucleicos são, de preferência, relativamente resistentes à degradação (por exemplo, por meio de endo e exo-nucleases). As estruturas secundárias, tais como stem loops, podem estabilizar os ácidos nucleicos contra a degradação. Alternativamente, a estabilização do ácido nucleico pode ser conseguida por meio de modificações do esqueleto de fosfato. Um tipo de ácido nucleico estabilizado tem, pelo menos, um esqueleto de fosforotioato modificado. Os fosforotioatos podem ser sintetizados utilizando técnicas automáticas que utilizam seja a química de fosforamidato seja de H-fosfonato. Os fosfonatos de arilo e alquilo podem ser feitos, por exemplo, conforme descrito na Patente US N° 4,469,863; e os alquilfosfotriésteres (em que o a unidade do oxigénio carregado é alquilada conforme descrito na Patente US No. 5,023,243 e na Patente Europeia No. 092,574) podem ser preparados por meio de síntese automática da fase sólida utilizando reagentes disponíveis comercialmente. Foram descritos métodos para fazer outras modificações e substituições ao esqueleto do ADN (Uhlmann, E. e Peyman, A., Chem. Rev. _90:544, 1990;

Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990).

Os ácidos nucleicos que contêm um CpG não metilado apropriado podem ser eficazes em qualquer vertebrado. Os ácidos nucleicos diferentes que contêm um CpG não metilado podem provocar uma estimulação imunológica óptima dependendo da espécie de mamífero. Deste modo, um oligonucleótido que provoca estimulação óptima em seres humanos pode não causar estimulação óptima num murganho e vice-versa. Um especialista na matéria pode identificar os oligonucleótidos óptimos, úteis para uma espécie em particular de mamíferos de interesse utilizando os ensaios de rotina aqui descritos e/ou conhecidos na técnica, utilizando a orientação aqui fornecida. O termo "quantidade eficaz" de um oligonucleótido CpG refere-se à quantidade necessária ou suficiente para realizar um efeito biológico desejado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um oligonucleótido que contém, pelo menos, um CpG não metilado para induzir a imunidade mucosal é aquela quantidade necessária para provocar o desenvolvimento de IgA em resposta a um antigénio após exposição ao antigénio. Em combinação com os ensinamentos aqui proporcionados, seleccionando entre os vários compostos activos e ponderando factores, tais como a potência, biodisponibilidade relativa, peso corporal do doente, gravidade dos efeitos secundários e modo de administração preferido, pode-se planear um regime de tratamento profiláctico ou terapêutico eficaz que não provoca toxicidade substancial e, ainda assim, é totalmente eficaz para tratar o indivíduo em particular. A quantidade eficaz para qualquer aplicação em particular pode variar dependendo de factores, tais como a doença ou estado a ser tratado, o oligonucleótido Cpg específico a ser administrado (por exemplo, o número de motivos de CpG não metilados ou a sua localização no ácido nucleico), o antigénio, o tamanho do indivíduo ou a gravidade da doença ou estado. Um especialista na técnica pode determinar, de forma empírica, a quantidade eficaz de um oligonucleótido CpG e antigénio em particular sem necessitar experimentação indevida. A posologia dos compostos aqui descritos, tipicamente, varia de cerca de 80 mg/dia a 16.000 mg/dia, mais tipicamente, de cerca de 800 mg/dia a 8000 mg/dia e, mais tipicamente, de cerca de 800 mg/dia a 4000 mg/dia. Definido em termos de peso corporal do indivíduo, as dosagens típicas variam de cerca de 1 a 200 mg/kg/dia, mais tipicamente, de cerca de 10 a 100 mg/kg/dia e, mais tipicamente, de cerca de 10 a 50 mg/kg/dia. Definido em termos de áreas de superfície corporal do indivíduo, as dosagens típicas variam de cerca de 40 a 8000 mg/m2/dia, mais tipicamente, de cerca de 400 a 4000 mg/m2/dia e, mais tipicamente, de cerca de 400 a 2000 mg/m2/dia.

Em algumas formas de realização, particularmente quando o CpG está num vector plasmídeo, pelo menos 50 pg do CpG são administrados a um indivíduo. Em outras formas de realização, pelo menos 75 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, e cada número inteiro entre estes, do CpG é administrado ao indivíduo.

Para qualquer composto aqui descrito a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente determinada a partir de ensaios de cultura de células. Por exemplo, a quantidade eficaz de oligonucleótido CpG útil para induzir a imunidade mucosal pode ser avaliada por meio dos ensaios in vitro descritos acima, no que diz respeito ao índice de estimulação. 0 índice de estimulação pode ser utilizado para determinar como a quantidade eficaz do oligonucleótido em particular, para o indivíduo em particular e a dosagem podem ser ajustadas para cima e para baixo para atingir os níveis desejados no indivíduo. As quantidades terapeuticamente eficazes também podem ser determinadas a partir de dados humanos para oligonucleótidos CpG que foram testados em seres humanos (ensaios clínicos com humanos foram iniciados) e para os compostos que são conhecidos por exibirem actividades farmacológicas semelhantes, tais como outros adjuvantes mucosais, por exemplo, a LT e outros antigénios com a finalidade de vacinação. A dose aplicada pode ser ajustada com base na biodisponibilidade relativa e potência do composto administrado. Ajustar a dose para atingir a eficácia máxima com base nos métodos descritos acima e outros métodos, conforme são bem conhecidos na técnica, está bem nas habilidades do técnico com conhecimento corrente.

As formulações da invenção são administradas em soluções farmaceuticamente aceitáveis, que podem conter, rotineiramente, concentrações de sal farmaceuticamente aceitáveis, agentes tamponizantes, conservantes, veículos compatíveis, adjuvantes e, opcionalmente, outras substâncias terapêuticas.

Para utilização em terapêutica, uma quantidade eficaz do oligonucleótido CpG pode ser administrada a um indivíduo por qualquer modo que administre o oligonucleótido a uma superfície mucosal. A "administração" da composição farmacêutica da presente invenção pode ser realizada por qualquer meio conhecido do técnico qualificado. As vias de administração preferidas incluem, mas não se limitam à via oral, intranasal, intratraqueal, inalação, ocular, vaginal e rectal.

Para a administração oral, os compostos (isto é, os oligonucleótidos CpG, antigénio, adjuvante mucosal) podem ser prontamente formulados combinando o(s) composto(s) activo(s) com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões espessas, suspensões e outros semelhantes, para a ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas como excipientes sólidos, opcionalmente moendo uma mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adicionar auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Os excipientes adequados são, em particular, enchimentos tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose tais como, for exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, pode-se adicionar agentes desintegrantes, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um seu sal, tal como o alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações orais também podem ser formuladas em solução salina ou tampões para neutralizar as condições ácidas internas.

Os núcleos das drageias são proporcionados com revestimentos adequados. Para esta finalidade, pode-se utilizar soluções de açúcar concentrado que, opcionalmente, podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos dos comprimidos ou drageias ou para caracterizar as combinações diferentes de doses do composto activo.

As preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas com vedação de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas vedadas, macias feitas de gelatina e um plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas com vedação de encaixe podem conter a substância activa em mistura com enchimento tal como lactose, ligantes, tais como amidos e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Nas cápsulas macias, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, pode-se adicionar estabilizantes. Pode-se também utilizar microesferas formuladas para a administração oral. Tais microesferas foram bem definidas na técnica. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para tal administração.

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de modo convencional.

Para administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com a presente invenção podem ser convenientemente administrados na forma de uma apresentação de pulverizador de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com a utilização de propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para administrar uma quantidade medida. Podem ser formuladas cápsulas e cartuchos, por exemplo de gelatina, para utilização num inalador ou insuflador contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, tal como lactose ou amido.

Quando é desejável a administração sistémica, os compostos podem ser formulados para administração parentérica por meio de injecção, por exemplo, por injecção bolus ou perfusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas em recipientes múltiplos com um conservante adicionado. As composições pode tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão.

As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos em forma solúvel em água. Além disso, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões oleosas apropriadas para injecções. Os solventes ou veículos lipófilos adequados incluem óleos gordos como óleo de sésamo ou ésteres de ácido gordo sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos ou lipossomas. As suspensões aquosas para injecções podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Alternativamente, os compostos activos podem ser na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo água estéril livre de pirogénio, antes da utilização.

Os compostos também podem ser formulados em composições rectais ou vaginais, tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases para supositórios convencionais, tais como manteiga de cacau e outros glicéridos.

Além das formulações descritas anteriormente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de actuação prolongada podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de troca de iões ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, como sais pouco solúveis.

As composições farmacêuticas também podem compreender veículos ou excipientes de fase sólida ou gel adequados. Exemplos de tais veículos ou excipientes incluem, mas não se limitam a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros, tais como polietileno glicóis.

As formas adequadas de preparação farmacêutica líquida ou sólida são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, microencapsuladas, espirais, revestidas em partículas microscópicas de ouro, contidas em lipossomas, nebulizadas, aerossóis, grânulos para implantação na pele ou secos sobre um objecto afiado para serem arranhados na pele. As composições farmacêuticas também incluem grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, gotas ou preparações com libertação prolongada dos compostos activos, em cuja preparações os excipientes e aditivos e/ou auxiliares tais como desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimento, agentes de dilatação, lubrificantes, aromatizantes, edulcorantes ou solubilizantes são habitualmente utilizados, conforme descrito acima. As composições farmacêuticas são adequadas para utilização numa variedade de sistemas de administração de fármaco. Para uma breve análise dos presentes métodos para administração de fármaco, ver Langer, Science, 249:1527-1533, 1990.

Os oligonucleótidos CpG e antigénios podem ser administrados per se (como tal) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando utilizados em medicamentos os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados de forma conveniente para preparar os seus sais f armaceuticamente aceitáveis. Tais sais incluem, mas não se limitam àqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno sulfónico, tartárico, cítrico, metano sulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico e benzeno sulfónico. Além disso, tais sais podem ser preparados como sais de metal alcalino ou alcalino terrosos, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo do ácido carboxílico.

Os agentes tamponizantes adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2% p/v); ácido cítrico e um sal (1-3% p/v); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% p/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% p/v). Os conservantes adequados incluem cloreto de benzalcónio (0,003-0,03% p/v); clorobutanol (0,3-0,9% p/v); parabenos (0,01-0,25% p/v) e timerosal (0,004-0,02% p/v).

As composições farmacêuticas da invenção contêm uma quantidade eficaz de um oligonucleótido CpG e antigénios incluídos num veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um ou mais enchimentos compatíveis, sólidos ou líquidos, diluentes ou substâncias encapsulantes que são adequadas para a administração a um ser humano ou outro animal vertebrado. O termo "veículo" indica uma substância orgânica ou inorgânica, natural ou sintética com a qual a substância activa é combinada para facilitar a aplicação. Os componentes para as composições farmacêuticas são também capazes de ser misturadas com os compostos da presente invenção e uns com os outros de uma maneira tal que não haja interacção, o que reduziria, de forma substancial, a eficácia farmacêutica desejada.

Os oligonucleótidos CpG ou antigénios úteis na invenção podem ser administrados em misturas com adjuvante(s) mucosal(is) adicional(is). Uma mistura pode consistir em várias adjuvantes mucosais para além do oligonucleótido CpG ou vários antigénios.

Estão disponíveis várias vias de administração. 0 modo seleccionado, em particular, dependerá, naturalmente, dos adjuvantes ou antigénios em particular seleccionados, o estado em particular a ser tratado e a dosagem necessária para a eficácia terapêutica. Os métodos desta invenção, de um modo geral, podem ser praticados utilizando qualquer modo de administração que seja aceitável do ponto de vista médico, significando qualquer modo que produza níveis eficazes de uma resposta imunológica sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Os modos preferidos de administração estão discutidos acima.

As composições podem ser apresentadas, convenientemente, em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por meio de quaisquer métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos incluem o passo de pôr os compostos em associação com um veículo que constitui uma ou mais substâncias acessórias. De um modo geral, as composições são preparadas pondo os compostos de forma uniforme e íntima em associação com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e, depois, se necessário, modelar o produto. As unidades de doses líquidas são frascos ou ampolas. As unidades de dose sólidas são comprimidos, cápsulas e supositórios. Para o tratamento de um doente, dependendo da actividade do composto, maneira de administração, finalidade da imunização (isto é, profilática ou terapêutica), natureza e gravidade da doença, idade e peso corporal do doente, podem ser necessárias doses diferentes. A administração de uma certa dose pode ser realizada por administração única na forma de uma unidade de dose individual ou então várias unidades de dose menores. A administração múltipla de doses a intervalos específicos de semanas ou meses de diferença é normal para reforçar as respostas específicas para o antigénio.

Outros sistemas de administração podem incluir sistemas de administração de libertação programada, libertação retardada ou libertação sustentada. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas dos compostos, aumentando a conveniência para o doente e para o médico. Muitos tipos de sistemas de administração de libertação estão disponíveis e são conhecidos daqueles com conhecimento corrente da técnica. Estes incluem sistemas à base de polímeros, tais como poli(láctido-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésters, ácido poli-hidroxibutírico e polianidridos. As microcápsulas para os polímeros mencionados que contêm fármacos estão descritas, por exemplo, na Patente US N° 5,075,109. Os sistemas de administração também incluem sistemas não poliméricos que são: lípidos que incluem esteróis, tais como colesterol, éster de colesterol e ácidos gordos ou gorduras neutras, tais como, mono, di e triglicéridos; sistemas de libertação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas à base de péptidos; revestimentos de cera; comprimidos prensados utilizando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos e outros. Exemplos específicos incluem, mas não se limitam a: (a) sistemas erosionais, em que um agente da invenção é contido no interior de uma matriz, tais como aqueles descrito nas Patentes US Nos. 4,452,775, 4,675,189 e 5,736,152 e (b) sistemas difusionais, em que um componente activo penetra a uma taxa controlada a partir de um polímero, tal como descrito nas Patentes US Nos. 3,854,480, 5,133,974 e 5,407,686. Além disso, pode-se utilizar hardware de sistemas de administração à base de bomba, alguns dos quais estão adaptados para implante. A presente invenção é ilustrada, adicionalmente, por meio dos seguintes Exemplos, os quais, de modo algum, devem ser interpretados como mais limitativos.

Exemplos

Exemplo 1: Materiais e Métodos 1. Materiais e Animais

Murganhos. Todas as experiências foram realizadas utilizando murganhos fêmeas BALB/c de 6-8 semanas de idade com 5-10 murganhos por experiência ou grupo de controlo. Para as imunizações intranasais, os murganhos foram ligeiramente anestesiados com Halothane® (Halocarbon Laboratories, River Edge, N.J.).

Adjuvantes: Os murganhos foram imunizados por administração IN de 1 pg de HBsAg (proteína HBV S derivada de plasma, subtipo ad, Genzyme Diagnostics, San Carlos, CA), isoladamente ou combinada com 1 ou 10 pg de CT (purificada de Vibrio cholerae, Sigma, St. Louis, MO) , LT (purificada de Escherichia coli, Sigma), CTB (purificada de Vibrio cholerae, Sigma), LTK63 (mutante de LT portando um Ser —> Lys na posição 63, generosamente fornecida pelo Dr. Rino Rappuoli, IRIS, Chiron S.p.A., Itália) e/ou CpG ODN (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3', CpG ODN #182 6 SEQ ID NO. 90) ou ODN de controlo não CpG (5'TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3', CpG ODN #1982 SEQ ID NO. 91) (Hybridon Specialty Products, Milford, MA). O antigénio e adjuvante(s) perfizeram um volume total de 150 pL com NaCl 0,15 M e foram administrados por inalação IN. Os ODN foram re-suspensos em Tris 10 mM (pH 7,0), EDTA 1 mM para armazenagem a +4EC antes da diluição em solução salina para imunização. O nivel de LPS no ODN era indetectável (<1 ng/mg) por teste de Limulus (Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD). 2. Imunização Mucosal

Cada animal foi imunizado com 1 ou 10 Fg de proteína HBV S derivada de plasma (HBsAg, subtipo ad, Genzyme Diagnostics, San Carlos, CA) , que foi administrada isoladamente ou em combinação com 1 ou 10 pg de CT ou LT ou derivado destas e/ou oligonucleótido CpG #182 6. Os derivados de CT eram a subunidade B de CT (CTB) . Os derivados destoxifiçados de LT foram todos produzidos por mutações genéticas que afectaram a subunidade A ou a actividade enzimática e incluíam a LTK63. Todas as vacinas foram administradas num volume total de 150 pL, que foram aplicados como gotículas directamente sobre ambas as narinas externas de murganhos ligeiramente anestesiados. A alguns murganhos foram dadas doses de reforço de maneira idêntica, 8 semanas depois da dose de preparação. Todos os grupos experimentais continham 5 ou 10 murganhos. 3. Colheita de amostras

Plasma: O plasma foi recuperado dos murganhos em tempos variados depois da imunização (1, 2, 4 e 8 semanas depois da dose de preparação e 1, 2 e 4 semanas depois do reforço) por sangramento retro-orbital e armazenado a -20°C até testado.

Sedimentos fecais: Os sedimentos fecais foram colhidos dos murganhos em tempos variados depois da imunização (1, 2, 4 e 8 semanas depois da dose de preparação e 1, 2 e 4 semanas depois do reforço). Os murganhos foram isolados em gaiolas individuais sem dormir durante um período de 24 horas, a seguir ao qual os sedimentos fecais foram colhidos e pesados em alíquotas de 0,1 mg. Um mL de TBS (Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5) e 0,1 Fg de azeto de sódio (Sigma) foram adicionados por 0,1 mg de material fecal. Deixou-se que as amostras re-hidratassem durante 30 minutos à TA, depois foram centrifugadas a 6000 rpm durante 15 minutos para remover os detritos fecais e os sobrenadantes foram colhidos e armazenados a -20E C até testadas para avaliação de S-IgA por ELISA.

Lavagens de pulmões: As lavagens de pulmões foram realizadas em murganhos 4 semanas depois da dose de preparação de imunização ou reforço. Uma seringa de 0,33 cc de insulina com uma agulha 29G12/2 acoplada (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ) foi utilizada para realizar a lavagem dos pulmões. Um mL de TBS foi aspirado para dentro da seringa e um pedaço de tubo de polietileno (PE) que era 1 cm mais longo do que a agulha foi acoplado (PE20, ID=0,38 mm, Becton Dickenson). 0 murganho foi morto por sobredose de anestésico e a traqueia foi imediatamente exposta por meio de uma incisão anterior na linha mediana feita utilizando uma tesoura cirúrgica de ponta fina (Fine Science Tools Inc., North Vancouver, BC) . Uma pequena incisão foi, então, feita na traqueia e um grampo (Fine Science Tools Inc., North Vancouver, BC) foi colocado acima da mesma. 0 tubo de PE foi passado alguns mm abaixo da traqueia pela incisão e um segundo grampo foi colocado imediatamente abaixo da incisão para manter o tubo de PE em posição na traqueia. A solução de TBS foi instilada lentamente aos pulmões, depois, retirada três vezes (80% de recuperação esperada). As amostras recuperadas foram centrifugadas a 13.000 rpm durante 7 minutos e os sobrenadantes foram colhidos e armazenados a -20E C até serem testados por ELISA. 4. Avaliação das respostas imunológicas

Resposta humoral sistémica: Foram detectados anticorpos específicos para HBsAg (anti-HBs) no plasma do murganho e quantificados por ensaio ELISA de diluição de ponto final (em triplicata) para os animais individuais descritos anteriormente (Davis et al., 1998). Em resumo, placas de 96 poços de poliestireno (Corning) revestidas de um dia para o outro (TA) com plasma derivado de partículas de HBsAg (conforme utilizado para a imunização) (100 F1 de 1 Fg/mL em carbonato de sódio-tampão bicarbonato 0,05 M, pH 9,6) foram incubados com o plasma durante 1 hora a 37 E C. Os anticorpos capturados foram, então, detectados com IgG, IgGl ou IgG2a anti-murganho de cabra conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (1:4000 em PBS-Tween, PBS a 10%: 100 Fl/poço; Southern Biotechnology Inc., Birmingham, AL) , seguido pela adição de solução de dicloridrato de o-fenilenodiamina (PPD, Sigma), 100 Fl/poço durante 30 minutos à TA no escuro. A reacção foi interrompida pela adição de H2SC>4 4 N, 50 Fl/poço.

As titulações da diluição de ponto final foram definidas como a diluição no plasma mais alta que resultou de um valor de absorvância (OD 450) duas vezes maior do que a do plasma não imune com um valor de corte de 0,05. As titulações anti-HBs de murganhos sensíveis (titulações de ponto final >10) foram expressas como a média SEM de valores de animais individuais, que eram, eles mesmos, a média de ensaios em triplicata.

Resposta humoral mucosal: Isto foi realizado nos sobrenadantes fecais ou lavagens de pulmão recuperadas como para o plasma (acima) excepto que as amostras foram incubadas em placas revestidas durante duas horas a 37 °C e os anticorpos capturados foram detectados com IgA anti-murganho de cabra conjugado com HRP (1:1000 em PBS-Tween, PBS a 10%: 100 Fl/poço; Southern Biotechnology Inc.) . Os sedimentos fecais ou as soluções de lavagem de pulmão não imunes foram utilizadas para determinar os valores de controlo negativo. Para as soluções de lavagens de pulmão foram registadas titulações de diluição de ponto final (conforme descrito acima), ao passo que para as soluções de sedimentos fecais, os valores de absorvância (OD 450) superiores aos da solução de sedimentos fecais não imunes foram calculados e expressos como a média SEM dos valores OD 450 individuais, que eram, eles próprios, a média de ensaios em triplicata.

Avaliação das respostas CTL: foram removidos os baços dos murganhos 4 semanas após a imunização de preparação ou reforço. Foi realizado ensaio in vitro da actividade citolitica especifica para HBsAg, conforme descrito anteriormente (Davis et al. , 1998). Em resumo, foram preparadas suspensões de células únicas e suspensas em meio de cultura de tecido (RPMI 1640, FBS a 10%, Life Technologies, Grand Island, NY, suplementado com solução de penicilina-estreptomicina, 1000 U/mL, 1 mg das concentrações finais, respectivamente, Sigma). Os esplenócitos (3 x 107) foram co-cultivados durante 5 dias (37EC, C02 a 5%) com 1,5 x 106 células estimuladoras da expressão de HBsAg singenésico (P815-preS, generosamente fornecido por F. V. Chisari, Scripps Institute, La Jolla, CA) que tinham sido anteriormente desactivados por irradiação (20.000 rad) . Células efectoras foram colhidas, lavadas, diluídas serialmente e cultivadas com 5 x 104 de células alvo (P815S) que expressam HBsAg marcadas com 51Cr em placas de cultura de 96 poços de fundo redondo (37EC, C02 a 5%, 4 horas) . O sobrenadante (100 Fl) foi removido para contagem da radiação (gama). A libertação espontânea foi determinada incubando as células alvo sem células efectoras e a libertação total pela adição de 100 Fl de HC1 2 N para as células alvo. A percentagem da lise foi calculada como [(libertação experimental - libertação espontânea)/ (libertação total - libertação espontânea)] x 100. A percentagem específica de lise foi calculada como % de lise com P815S - % de lise com células P815. A actividade da CTL para murganhos sensíveis [% da lise específica > 10 em efectora:alvo (E:T) de 25:1] foi expressa como a média SEM dos valores de animais individuais, que eram, eles próprios, a média de ensaios em triplicata. 5. Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando o programa GraphPAD InStat (Graph PAD Sofware, San Diego). O significado estatístico da diferença entre dois grupos foi determinado a partir da média e desvios padrão pelo ensaio-1 de duas vias de Student e entre três ou mais grupos por análise de 1 factor de variância (ANOVA) seguido pelo ensaio de Tukey para teste de comparação múltipla. As diferenças não foram consideradas significativas com p > 0,05.

Exemplo 2. Respostas humorais sistémicas após a imunização mucosal

Murganhos BALB/c imunizados numa única ocasião por inalação IN de HBsAg sem adjuvante não tiveram anticorpos IgG anti-HBs detectáveis no seu plasma com 1 pg de HBsAg e apenas titulações extremamente baixas (<2 0) em alguns murganhos com 10 pg de antigénio (Figura 1) .

Em contraste, as titulações de IgG anti-HBs foram consideravelmente superiores quando o HBsAg foi administrado em combinação seja com oligonucleótido CpG, seja com CT como adjuvante (Figura 1). Com uma baixa dose de adjuvante (1 pg) e uma dose baixa ou alta de antigénio (1 ou 10 pg de HBsAg) verificou-se que o CpG oligonucleótido é equivalente à CT para a indução de IgG anti-HBs no plasma (p = 0,73 com 1 pg de HBsAg e 0,13 com 10 pg de HBsAg). O oligonucleótido CpG e a CT também eram equivalentes com uma alta dose de adjuvante (10 μg) e alta dose de antigénio (10 μg de HBsAg) (p = 0,08), no entanto, com uma dose maior de antigénio, a dose maior de CT foi superior para o oligonucleótido CpG (p = 0,01) (Figura 1) . Estes resultados indicam que o oligonucleótido CpG é essencialmente igual à CT para a intensificação das respostas imunológicas sistémicas com a administração mucosal (IN) de um antigénio proteína.

Uma baixa dose combinada de oligonucleótido CpG e CT (1 pg de cada) produziu uma resposta humoral sistémica melhor do que 10 pg de oligonucleótido CpG isolado (p = 0,01) e era igual àquela com 10 pg de CT isolada (p = 0,22), quando adicionada a uma dose de 1 pg de HBsAg. Além disso, com uma dose de 10 pg de HBsAg, os adjuvantes combinados (1 pg de cada) induziram as titulações de IgG anti-HBs tão altas quanto aquelas com 10 pg de cada adjuvante isolado (CT, p = 0,27; oligonucleótido CpG, p = 0,09) (Figura 1). Estas descobertas indicam que o oligonucleótido CpG pode actuar de forma sinérgica com a CT quando administrado a tecido mucosal para induzir fortes respostas humorais sistémicas e, deste modo, permitir que seja administrada uma dose mais baixa de adjuvante.

As titulações de anticorpos foram também aumentadas em cerca de 10 vezes pela administração de uma dose de reforço às 8 semanas. As titulações pós-reforço de IgG no plasma eram equivalentes para CT e oligonucleótido CpG utilizados isoladamente, e eram 5-10 vezes mais altas do que com ambos os adjuvantes juntos (Figura 2). Estes resultados indicam que o efeito do adjuvante de oligonucleótido CpG isolado ou em combinação com CT pode ser intensificado pelo reforço. A avaliação do plasma para isotipos de anticorpos IgG depois de uma única imunização mucosal demonstrou predominantemente anticorpos IgGl (semelhantes a Th2) com CT e anticorpos IgGl/IgG2a misturados (ThO) com o oligonucleótido CpG isolado ou em combinação com CT. A proporção de isotipos de anticorpos IgG2a era de cerca de 10 vezes maior com CpG ODN do que CT, indicando uma maior influência de Thl de CpG ODN em comparação com CT. Além disso, a combinação de CpG ODN e CT produziu uma proporção 50 vezes maior de IgG2a:IgGl do que a CT isolada (Figura 3) . A seguir ao reforço, os anti-HBs ainda eram predominantemente IgGl com CT e misturados com oligonucleótido CpG, embora neste último caso, a proporção de IgG2a era agora mais elevada. Surpreendentemente, os anti-HBs no plasma depois do reforço com o oligonucleótido CpG e CT eram agora predominantemente IgG2a (semelhante a Th-1) (Figura 3). Estas descobertas indicam que o oligonucleótido CpG como um adjuvante mucosal estimula uma resposta semelhante a Thl, mesmo na presença de um forte adjuvante semelhante a Th2 como a CT.

Foram encontrados resultados semelhantes quando se utilizou LT em lugar da CT (Figura 7, Tabelas 2 e 3) . A CT e a LT, que têm relação próxima com considerável homologia estrutural e funcional são ambas excessivamente tóxicas para utilização em seres humanos. No entanto, há várias derivações de CT e LT que retêm alguma actividade adjuvante, e no entanto, são muito menos tóxicas. Um exemplo é a subunidade B da CT (CTB) que é não tóxica, uma vez que a toxicidade está associada à subunidade A. Outro exemplo é a LTK63, um mutante geneticamente destoxifiçado da LT com actividade enzimática não tóxica. Embora estes adjuvantes sejam utilizados em ensaios clínicos humanos, nenhum era tão forte quanto o CpG ODN para a indução da imunidade sistémica (IgG no soro) quando cada uma foi utilizada a 1 pg (Figura 7) . Houve também um efeito sinérgico quando o CpG ODN e a CTB ou LTJ63 foram utilizados em conjunto, no entanto, isto foi mais evidente para o Thl-bias do que para a força da resposta do anticorpo (Figura 7 e Tabela 2).

Exemplo 3: Respostas CTL sistémicas após a imunização mucosal

Apenas baixos niveis de CTL foram induzidos com HBsAg isolado, no entanto a adição seja do oligonucleótido CpG seja da CT aumentou, de forma significativa, a actividade da CTL especifica para HBsAg. As respostas CTL foram equivalentes para CT e oligonucleótido CpG, independentemente da dose. No entanto, a combinação de CT e oligonucleótido CpG (1 pg de cada) aumentou as respostas CTL em aproximadamente duas vezes (Figura 4).

Exemplo 4: Respostas humorais mucosais após a imunização mucosal Não foram detectados anticorpos S-IgA anti-HBs nas lavagens de pulmão dos murganhos imunizados com 1 ou 10 pg de HBsAG isolado. Do mesmo modo não foram detectados IgA anti-HBs com a dose baixa de antigénio combinado com uma dose baixa (1 pg) de oligonucleótido CpG ou CT ou com uma dose alta de oligonucleótido CpG; apenas titulações baixas foram detectadas com a dose baixa do antigénio e dose alta de CT (Figura 5) . No entanto, quando baixas doses tanto do oligonucleótido CpG como da CT (1 pg de cada) foram utilizadas em conjunto com a dose baixa do antigénio, puderam ser detectados niveis significativos de S-IgA especifico para HBsAg nas lavagens de pulmão (Figura 5).

Com uma dose de antigénio mais alta (10 pg) , o S-IgA foi detectado nas lavagens de pulmão de murganhos administrados tanto com a dose baixa como a dose alta de CT e/ou oligonucleótido CpG. As titulações de IgA foram significativamente mais altas com 1 pg dos dois adjuvantes juntos do que com 10 pg de CT ou oligonucleótido CpG isolados (p = 0,0003 e <0,0001, respectivamente) (Figura 5). As titulações de IgA aumentaram aproximadamente dez vezes depois do reforço com ambos os adjuvantes. Deste modo, o oligonucleótido CpG pode induzir a imunidade mucosal local especifica contra o antigénio administrado por via intranasal. Além disso, de forma semelhante ao verificado para a resposta sistémica (acima), o oligonucleótido CpG actua de uma maneira sinérgica com a CT para a indução da imunidade mucosal.

Detectou-se IgA também nos sedimentos fecais dos murganhos imunizados com HBsAg e 10 pg de oligonucleótido CpG. Em contraste, apenas níveis muito baixos foram detectados nos murganhos imunizados com HBsAg em combinação com CT (1 ou 10 pg), (Figura 6). Deste modo, o oligonucleótido CpG pode induzir a imunidade mucosal em sítios mucosais distantes.

Exemplo 5: Resposta Imunológica Mucosal e Sistémica a outros Adjuvantes Mucosais

Respostas imunológicas sistémicas A administração IN de HBsAg (1 pg) sem adjuvante não induziu anticorpos IgG anti-HBs detectáveis no plasma de quaisquer murganhos (0/15) . Em contraste, as titulações elevadas de IgG anti-HBs foram induzidas em todos os murganhos quando o HBsAg foi administrado em combinação com CpG, CT ou LT como adjuvante (Figura 7, Tabela 2) . A uma baixa dose (1 pg) LT, CT e CpG produzem titulações equivalentes de IgG anti-HBs (p = 0,22). A uma dose alta (10 pg) LT e CT produzem titulações mais altas do que CpG, no entanto 5/10 murganhos que receberam esta dose de LT morreram em 10 dias. Não foi detectado IgG anti-HBs detectável com uma dose baixa (1 pg) de CTB ou LTK63, no entanto, uma dose alta (10 pg) de CTB produziu baixo IgG anti-HBs nas titulações por ELISA de ponto final e uma dose alta (10 pg) de LTK produziu níveis tão bons de IgG anti-HBs quanto uma dose alta (10 pg) de CpG (P = 0,97) (Figura 7, Tabelas 2 e 3).

Quando utilizados juntos, o CpG e tanto a LT como a CT (1 pg cada), parecem ter um efeito sinérgico, uma vez que as titulações anti-HBs foram de 5 a 10 vezes mais altas do que com qualquer um dos três adjuvantes isolados (Figura 7). De facto, o CpG mais a LT (1 pg de cada) produziram uma resposta melhor do que 10 pg de CpG ou LT isolados (p = 0,007, 0,015 respectivamente) e a resposta com CpG mais CT (1 pg de cada) foi igual àquela com 10 pg de CT isolada (p = 0,65) . Em contraste, não houve efeito sinérgico com LYK63 mais CpG (1 pg de cada) para titulações de IgG anti-HBs, que foram equivalentes àquelas com 1 pg de CpG isolado (p = 0,40) . Surpreendentemente, a CTB mais o CpG (1 pg de cada) produziram titulações mais baixas de anti-HBs do que 1 pg de CpG isolado (p = 0,0079 (Figura 7) . Os efeitos dos adjuvantes com CpG ODN foram devidos ao motivo CpG, em vez de um efeito não especifico do esqueleto ODN, uma vez que os murganhos imunizados com 1 pg de HBsAg mais 10 pg de ODN não CpG não tiveram titulações (7/10) de anticorpo IgG anti-HBs ou tiveram titulações muito baixas (3/10) (dados não ilustrados).

Os anticorpos eram predominantemente IgGl (semelhante a Th2) com CT, CTB e LT e IgGl/IgG2a (Thl/Th2) misturados com LTK63. A uma dose baixa (1 pg) as respostas com CpG foram IgGl/IgG2a (Thl/Th2) misturados, mas a uma dose mais alta (10 pg) forma mais Thl (IgG2a »IgGl). As respostas foram Thl/Th2 misturados com CT/CpG ou CTB/CpG e mais Thl com LT/CpG. A uma dose baixa (1 pg) as respostas de LTK63/CpG foram Thl/Th2, mas a uma dose mais alta (10 pg de cada) foram mais Thl (Tabela 3) . Deste modo, a co-administração de CpG com outros adjuvantes deslocaram as respostas na direcção de uma resposta mais semelhante a Thl, conforme indicado por uma maior proporção de anticorpos IgG2a.

Respostas imunológicas mucosais

Quando os adjuvantes foram utilizados isoladamente, apenas os murganhos que receberam LT ou LTK63 tiveram IgA detectável nas lavagens de pulmão, no entanto, quando o CpG ODN foi também incluído com a CT ou LT um número maior de animais respondeu ou as titulações foram mais altas do que com doses comparáveis isoladas, sugerindo um efeito sinérgico. 0 CpG isolado não induziu o IgA. Nem a CTB isolada ou combinada com CpG (Tabela 3).

Apenas poucos adjuvantes por si mesmos (LT e CpG) induziram IgA nas fezes e apenas em alguns animais. Não foi detectado IgA significativo com CT, CTB, LTK63 ou ODN não CpG. O CpG e a LT em conjunto, resultaram em IgA nas fezes de uma proporção maior de animais do que qualquer adjuvante isolado sugerindo um efeito aditivo e sinérgico. Nenhum destes efeitos ficou evidente com outras combinações (Tabela 3).

Tabela 2: Efeito do adjuvante sobre isotipos de anticorpo especifico para HBsAg

Tabela 3: Efeito de adjuvante sobre respostas IgA especificas para HBsAg

Tabela 4: Sumários dos efeitos de estratégias de dose de preparação/reforço diferentes em respostas imunológicas especificas para HBsAg

REFERÊNCIAS

Alpar H. 0., Ozsoy Y., Bowen J., Eyles J. E., Conway B. R., Williamson E. D. Potential of particulate carriers for the mucosal delivery of DNA vaccines. Biochemical Society Transactions 1997; 25(2):337S.

Balias, Z. K., W. L. Rasmussen, e A. M. Krieg. 1996. Induction of natural killer activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J. Immunol. 157, 1840.

Bird, A. P. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus. 1987. Trends in Genetics 3:342.

Bowersock T L. Shalaby W. S. Levy M. Samuels M. L. Lallone R. White M. R. Borie D L. Lehmeyer J. Park K. Evaluation of an orally administered vaccine, using hydrogels containing bacterial exotoxins of Pasteurella haemolytica, in cattle. Am. J. Vet. Res. 1994; 55: 502-9.

Bueler H. e Mulligan R. C. Induction of antigen-specific tumor immunity by genetic and cellular vaccines against MAGE: enhanced tumor protection by coexpression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and B7-1. 1996; 2; 545-555.

Chace, J. Η., N. A. Hooker, K. L. Mildenstein, A. M. Krieg e J. S. Cowdery. 1997. Bacterial DNA-induced NK cell IFN-[gamma] production is dependent on macrophage secretion of IL-12. Clin. Immunol. Immunopath., 84:185.

Chow Y. H., Huang W. L., Chi W. K., Chu Y. D., Tao Μ. H. Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2. Journal of Virology 1997; 71(1):169-78.

Cong Y. Weaver C. T. Elson C. 0. The mucosal adjuvanticity of cholera toxin involves enhancement of costimulatory activity by selective up-regulation of B7.2 expression. J. Immunol. 1997; 159: 5301-8.

Constant S. L. Bottomly K. Induction of Thl and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Ann. Rev. Immunol. 1997; 15: 297-322.

Cowdery, J. S., J. H. Chace e A. M. Krieg. 1996. Bacterial DNA induces in vivo interferon-[gamma] production by NK cells and increases sensitivity to endotoxin. J. Immunol. 156:4570.

Davis H. L., Weeratna R, Waldschmidt T J, Schorr J and Krieg A M. CpG DNA is a potent adjuvant in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998; 160: 870-876. de Haan L. Verweij W. R. Feil I. K. Lijnema T. H. Hoi W. G. Agsteribbe E. Wilschut J. Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin with reduced ADP-ribosylation activity or no activity retain the immunogenic properties of the native holotoxin. Infect. Immun. 1996; 64: 5413-6.

Delong R. Stephenson K. Loftus T. Fisher M. Alahari S. Nolting A. Juliano R L. Characterization of complexes of oligonucleotides with polyamidoamine starburst dendrimers and effects on intracellular delivery. J. Pharmac. Sci. 1997; 86: 762-4 .

Douce G. Turcotte C. Cropley I. Roberts M. Pizza M. Domenghini M. Rappuoli R. Dougan G. Mutants of Escherichia coli heat-labile toxin lacking ADP-ribosyltransferase activity act as nontoxic, mucosal adjuvants. PNAS. 1995; 92: 1644-8.

Eldridge J., Staas J K., Meulbroek J. A., McGhee J. R. Biodegradable microspheres as a vaccine delivery system. Molecular Immunology 1991; 28: 287-294.

Gallichan W. S., Rosenthal K. L. Specific secretory immune responses in the female genital tract following intranasal immunization with a recombinant adenovirus expressing glycoprotein B of herpes simplex virus. Vaccine 1995; 13(16):1589-95.

Geissler M., Gesien A., Tokushige K., Wands J. R. Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids. J Immunol 1997; 158(3):1231-7.

Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems. Trends Biotech. 1995; 13: 527-537.

Halpern, M. D., R. J. Kurlander e D. S. Pisetsky. 1996. Bacterial DNA induces murine interferon-[gamma] production by stimulation ofinterleukin-12 and tumor necrosis factor-[alpha]. Cell. Immunol. 167:72.

Haneberg B., Kendall D., Amerongen Η. M., Apter F. M., Kraehenbuhl J. P. e Neutra M. R. Induction of specific immunoglobulin A in the small intestine, colon-rectum, and vagina measured by a new method for collection of secretions from local mucosal surfaces. Infect. Immun. 1994; 15-23.

Hogg J. C. The pathology of asthma. APMIS. 1997; 105; 10: 735-45 .

Holmgren J., Lycke N., Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine 1993; 11:1179-1184.

Homquist E. Lycke N. Cholera toxin adjuvant greatly promotes antigen priming of T cells. Eur. J. Immunol. 1993; 23: 213643.

Kay A. B. TH2-type cytokines in asthma. Ann. NY Acad. Sci. 1996; 796: 1-8.

Kim J. J., Ayyavoo V., Bagarazzi M. L., Chattergoon M. A., Dang K., Wang B., Boyer J. D. e Weiner D. B. In vivo engineering of a cellular immune response by coadministration of IL-12 expression vector with a DNA immunogen. J. Immunol. 1997; 158: 816-26.

Klinman D. M., Yamshchikov G. e Ishigatsubo Y. Contribution of CpG motifs to the immunogenicity of DNA vaccines. J. Immunol. 1997; 158: 3635-3659.

Klinman, D., A. K. Yi, S. L. Beaucage, J. Conover e A. M. Krieg. 1996. CpG motifs expressed by bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete IL-6, IL-12 and IFN. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA USA 93:2879.

Krieg, A. M. , A. K. Yi, S. Matson, T. J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky, and D. Klinman. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. 1995. Nature 374:546.

Krieg, A. M. 1996An innate immune defense mechanism based on the recognition of CpG motifs in microbial DNA. J. Lab. Clin. Med. 128:128.

Kukowska-Latallo J. F. Bielinska A. U. Johnson J. Spindler R. Tomalia D. A. Baker J. R. Jr. Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers. PNAS. 1996; 93: 4897-902.

Lamm Μ. E., Mazanec Μ. B., Nedrud J. G., Kaetzel C. S. Mechanisms of IgA-mediated mucosal defense. Vaccine Res. 1992; 1:169-173.

Lycke N., Tsuji T. e Holmgren J. The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferase activity. Eur. J. immunol. 1992; 22: 2277-2281.

Maloy K. J. Donachie A. M. Mowat A. M. Induction of Thl and Th2 CD4+ T cell responses by oral or parenteral immunization with ISCOMS. Eur. J. Immunol. 1995; 25: 2835-41.

Mannino R. J. e Gould-Fogerite S. Lipid matrix-based vaccines for mucosal and systemic immunization. In: Vaccine Design; The subunit and adjuvant approach. (ed. Powell M F and Newman M J) Plenum Press, N.Y. 1995; 363-387.

McGhee J. R. , Mestecky J., Dertzbaugh Μ. T., Eldridge J. H., Hirasawa M., Kiyono H. The mucosal immune system: from fundamental concepts to vaccine development. Vaccine 1992; 10:75-88.

Messina, J. P., G. S. Gilkeson e D. S. Pisetsky. 1991. Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA. J. Immunol. 147:1759.

Mestecky J., McGhee J. R. Prospects for human mucosal vaccines. In: Ciardi J E, ed. Genetically Engineered vaccines. N.Y.: Plenum Press, 1992:13-23. O'Hagan D. T. Oral immunization and the common mucosal immune system. In: O'Hagan D T, ed. Novel Delivery Systems for Oral Vaccines. Boca Raton: CRC Press, 1994:1-24. 0'Hagan D. T., Rahman D., Jeffery H., Sharif S., Challacombe S. J. Controlled release microparticles for oral immunization. Int. J. Pharm. 1994; 108: 133-139.

Pizza M. Fontana M. R. Giuliani Μ. M. Domenighini M. Magagnoli C. Giannelli V. Nucci D. Hoi W. Manetti R. Rappuoli R. A genetically detoxified derivative of heat-labile Escherichia coli enterotoxin induces neutralizing antibodies against the A subunit. J. Exp. Med. 1994; 180: 2147-53.

Rappuoli R. Douce G. Dougan G. Pizza M. Genetic detoxification of bacterial toxins: a new approach to vaccine development. Int Arch Allergy Immunol. 1995; 108: 327-33.

Sato Y. Roman M. Tighe H. Lee D. Corr M. Nguyen M. D. Silverman G. J. Lotz M. Carson D. A. Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science. 1996; 273: 352-4.

Schirmbeck R., Melber K., Kuhrober A., Janowicz Z. A. e Reimann J. Immunization with soluble hepatitis B virus surface protein elicits murine H-2 class I-restricted CD8+ cytotoxic T lymphocyte responses in vivo. J. Immunol. 1994; 152: 1110-1119.

Sjolander A., Lovgren Bengtsson K., Johansson M., Morein B. Kinetics, localization and isotype profile of antibody responses to immune stimulating complexes (ISCOMS) containing human influenza virus envelope glycoproteins. Scand. J. Immunol. 1996; 43:164-72.

Sjolander A. van't Land B. Lovgren Bengtsson K. Iscoms containing purified Quillaja saponins upregulate both Thl-like and Th2-like immune responses. Cell. Immunol. 1997; 177: 69-76.

Snider D. P. The mucosal adjuvant activities of ADP-ribosylating bacterial enterotoxins. Crit. Rev. Immunol. 1995; 15: 317-48 .

Spangler B. D. Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol. Rev. 1992; 56: 622-647.

Staats H. F., Jackson R J, Marinaro M, Takahashi I, Kiyono H, McGhee J R. Mucosal immunity to infection with implications for vaccine development. Current Biology. 1994; 6:572-583.

Tokunaga, T, H. Yamamoto, S. Shimada, H. Abe, T. Fukuda, Y. Fujisawa, Y. Furutani, 0. Yano, T. Kataoka, T. Sudo, N. Makiguchi e T. Suganuma. 1984. Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from mycobacterium bovis GCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity. JNCI 72:955 .

Tsuji T., Hamajima K., Ishii N., Aoki I., Fukushima J., Xin K. Q., Kawamoto S., Sasaki S., Matsunaga K., Ishigatsubo Y., Tani K., Okubo Τ. e Okuda K. Immunomodulatory effects of a plasmid expressing B7-2 on human immunodeficiency virus-l-specific cell-mediated immunity induced by a plasmid encoding the viral antigen. Eur. J. Immunol. 1997; 27: 782-7.

Valodas, J., Davies, J. K., Wright, P. J., Strugnell R. A. Intranasal immunization with liposomes induces strong mucosal immune responses in mice. Eur. J. Immunol. 1995; 25: 969-975.

Weeratna R., Brazolot Millan C. L., Krieg A. M. e Davis H. L. Reduction of antigen expression from DNA vaccines by coadministered oligodeoxynucleotides. Anti. Nucl. Acid Res. {in press) .

Yamamoto, S., T. Yamamoto, S. Shimada, E. Kuramoto, 0. Yano, T. Kataoka e T. Tokunaga. 1992. DNA from bacteria, but not from vertebrates, induces interferons, activates natural killer cells and inhibits tumor growth. Microbiol. Immunol 36:983.

Yi, A. K., Cowdery, J. S., J. H. Chace e A. M. Krieg. 1996. IFN-[gamma] promotes IL-6 and Ig-M secretion in response to CpG motifs in bacterial DNA and ODN. J. Immunol., 156:558. A memória descritiva escrita precedente é considerada como suficiente para permitir que um especialista na técnica pratique a invenção. A presente invenção não é para ser limitada em âmbito pelos exemplos fornecidos, uma vez que os exemplos destinam-se como uma simples ilustração de um aspecto da invenção. Várias modificações da invenção além daquelas apresentadas e descritas neste documento ficarão evidentes àqueles com conhecimento corrente na técnica a partir da descrição anterior e que se enquadram no âmbito das reivindicações apensas. As vantagens e objectos da invenção não estão necessariamente abrangidos por cada forma de realização da invenção.

Lisboa, 5 de junho de 2017

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Oligonucleótido CpG imunoestimulador, para utilização como adjuvante mucosal para induzir uma resposta imunológica contra um antigénio administrado a um tecido mucosal.
2. 2. Oligonucleótido CpG imunoestimulador para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a resposta imunológica é mucosal.
3. 3. Oligonucleótido CpG imunoestimulador para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a resposta imunológica é também sistémica.
4. 4. Oligonucleótido CpG imunoestimulador para utilização de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a resposta imunológica mucosal é tanto local como distante em relação ao local de administração do oligonucleótido.
5. 5. Oligonucleótido CpG imunoestimulador para utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o antigénio é uma proteína.
6. 6. Oligonucleótido CpG imunoestimulador para utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o oligonucleótido destina-se a ser administrado com um outro adjuvante mucosal.
7. 7. Oligonucleótido CpG imunoestimulador para utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o referido oligonucleótido é ADN. Lisboa, 5 de junho de 2017