PL232260B1 - Immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu - Google Patents

Immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu

Info

Publication number
PL232260B1
PL232260B1 PL414814A PL41481403A PL232260B1 PL 232260 B1 PL232260 B1 PL 232260B1 PL 414814 A PL414814 A PL 414814A PL 41481403 A PL41481403 A PL 41481403A PL 232260 B1 PL232260 B1 PL 232260B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
oligonucleotide
immunostimulatory
oligonucleotides
phosphodiester
Prior art date
Application number
PL414814A
Other languages
English (en)
Other versions
PL414814A1 (pl
Inventor
Arthur M. Krieg
Ulrike Samulowitz
Joerg Vollmer
Eugen Uhlmann
Marion Jurk
Grayson Lipford
Robert Rankin
Original Assignee
Coley Pharm Gmbh
Coley Pharm Group Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharm Gmbh, Coley Pharm Group Inc filed Critical Coley Pharm Gmbh
Publication of PL414814A1 publication Critical patent/PL414814A1/pl
Publication of PL232260B1 publication Critical patent/PL232260B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest oligonukleotyd zawierający N1-C_G-N2-C_G-N3, przy czym N1 i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 1-20 nukleotydów, przy czym _ oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe, przy czym N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0 - 20 nukleotydów, i przy czym G-N2-C zawiera 1 lub 2 stabilizowane wiązania. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja oligonukleotydu, jak zdefiniowano powyżej, do zastosowania w stymulowaniu odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.

Description

Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu do zastosowania w stymulowaniu odpowiedzi immunologicznej.
Opisano tu immunostymulujące kwasy nukleinowe, jak również immunostymulujące oligonukleotydy mające zmniejszony prozapalny wpływ na nerki, ich kompozycje oraz sposoby zastosowania immunostymulujących kwasów nukleinowych.
Stan techniki
Bakteryjny DNA wykazuje wpływ stymulujący układ odpornościowy, powodujący aktywację limfocytów B i komórek NK, lecz DNA kręgowców nie wykazuje takiego wpływu (Tokunaga, T., i in., 198 8. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T., i in., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J.P., i in., 1991, J. Immunol 147: 1759-1764; oraz przegląd: Krieg, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, red. C.A. Stein i A.M. Krieg, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, str. 431-448). Obecnie wiadomo, że ten wpływ pobudzający układ odpornościowy bakteryjnego DNA jest wynikiem obecności niemetylowanych dinukleotydów CpG w kontekście konkretnych zasad (motywy CpG), które są powszechne w bakteryjnym DNA, lecz są one metylenowane i rzadko występują w DNA kręgowców (Krieg i in., 1995 Nature 374: 546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321: 1-10). Wpływ stymulujący układ odpornościowy bakteryjnego DNA można naśladować stosując syntetyczne oligodeoksynukleotydy (ODN) zawierające te motywy CpG. Takie ODN CpG wykazują silny stymulujący wpływ na ludzkie i mysie leukocyty, indukując proliferację limfocytów B; sekrecję cytokin i immunoglobulin; aktywność lityczną komórek NK i wydzielanie IFN-γ; oraz działanie aktywujące komórki dendrytyczne (DC) i inne komórki prezentujące antygen do ekspresji cząsteczek kostymulatorów i wydzielania cytokin, szczególnie cytokin typu Thl, które są ważne dla promowania rozwoju odpowiedzi limfocytów T typu Th1 . To działanie stymulujące układ odpornościowy natywnego fosfodiesterowego szkieletu ODN CpG jest wysoce CpG specyficzne w tym sensie, że jest ono znacznie zmniejszone, jeśli motyw CpG ulegnie metylacji, zamianie na GpC, lub zostanie wyeliminowany lub zmieniony w inny sposób (Krieg i in., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann i in., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 930-510).
We wczesnych badaniach przypuszczano, że stymulujący układ odpornościowy motyw CpG opisuje wzór puryna-puryna-CpG-pirymidyna-pirymidyna (Krieg i in., 1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker i in., 1998 EMBO J. 17: 6230-6240; Lipford i in., 1998 Trends in Microbiol. 6: 496-500). Jednakże obecnie wiadomo, że mysie limfocyty dość dobrze odpowiadają na fosfodiesterowe motywy CpG, które nie są zgodne z tym „wzorem” (Yi i in., 1998 J. Immunol. 160: 58985906) i jest to również prawdą dla ludzkich limfocytów B i komórek dendrytycznych (Hartmann i in., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).
Ostatnio opisano kilka różnych klas kwasów nukleinowych CpG. Jedna klasa silnie aktywuje limfocyty B, lecz względnie słabo indukuje produkcję IFN-a i aktywację komórek NK; tę klasę określa się jako klasę B. Kwasy nukleinowe CpG klasy B są typowo całkowicie stabilizowane i obejmują niemetylowany dinukleotyd CpG w kontekście pewnych zalecanych zasad. Patrz, np. opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; i 6339068. Inna klasa kwasów nukleinowych CpG aktywuje limfocyty B i komórki NK oraz indukuje produkcję IFN-a; tę klasę określa się jako klasę C. Kwasy nukleinowe CpG klasy C, podobnie jak pierwsze opisane, typowo są całkowicie stabilizowane, obejmują sekwencję typu sekwencji klasy B i sekwencje palindromowe bogate w pary GC lub prawie palindromowe. Tę klasę opisano w będącym jednocześnie przedmiotem postępowania patentowego tymczasowym zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 60/313273, złożonym 17 sierpnia 2001 i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 10/22452 3 złożonym 19 sierpnia 2002 i pokrewnym zgłoszeniu patentowym PCT/US02/26468 opublikowanym pod nr WO 03/015711.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest immunostymulujący oligonukleotyd, charakteryzujący się tym, że zawiera:
N1-C_G-N2-C_G-Ns przy czym N1 i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 1-20 nukleotydów, przy czym _ oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe, przy
PL 232 260 B1 czym N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów, i przy czym G-N2-C zawiera 1 lub 2 stabilizowane wiązania.
Korzystnie immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że:
a) kwas nukleinowy ma szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę;
b) stabilizowane wiązania internukleotydowe wybrane są z grupy składającej się z: wiązania tiofosforanowego, ditiofosforanowego, metylofosfonianowego, metylotiofosforanowego, i ich dowolnej kombinacji;
c) stabilizowane wiązania internukleotydowe stanowi wiązanie tiofosforanowe.
Korzystnie immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku występuje w kombinacji z adiuwantem, cytokiną lub antygenem.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w stymulowaniu odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.
Korzystnie w takim zastosowaniu podmiot jest chory na astmę, alergię, raka, chorobę zakaźną, chorobę autoimmunizacyjną lub przebudowę struktury dróg oddechowych.
Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według wynalazku korzystnie zawiera antygen.
Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według wynalazku korzystnie przeznaczona jest do podawania w ramach procedury terapeutycznej.
Korzystniej procedurę terapeutyczną stanowi zabieg operacyjny, napromienianie lub lek.
W kompozycji immunostymulującego. oligonukleotydu do zastosowania według wynalazku korzystnie oligonukleotyd jest formułowany w postać preparatu.
Korzystniej oligonukleotyd związany jest z cząsteczką nakierowującą.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że immunostymulujące właściwości kwasów nukleinowych CpG klasy B i C i innych stabilizowanych immunostymulujących kwasów nukleinowych można utrzymać lub nawet polepszyć przez selektywne wprowadzenie jednego lub więcej niestabilizowanych wiązań pomiędzy pewnymi nukleotydami. Niestabilizowane wiązania są dogodnie naturalnymi wiązaniami, tj. wiązaniami fosfodiestrowymi lub typu fosfodiestrowego. Niestabilizowane wiązanie będzie typowo, choć nie koniecznie, względnie podatne na trawienie nukleazą. Opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe zawierają co najmniej jedno niestabilizowane wiązanie znajdujące się pomiędzy 5' pirymidyną (Y) i sąsiadującą 3' puryną (Z), korzystnie guaniną (G), przy czym zarówno 5' Y jak i 3' Z są nu kleotydami wewnętrznymi.
Podobnie jak całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe, opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe są przydatne do indukowania odpowiedzi immunologicznej typu Th1. Zgodnie z tym, opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe są przydatne jako środki wspomagające do szczepionek i są przydatne w leczeniu chorób, obejmujących takie jak rak, choroba zakaźna, alergia i astma. Uważa się, że mają one szczególne zastosowanie w schorzeniach, które z jakiegokolwiek powodu wymagają przedłużonego lub powtórnego podawania immunostymulujących kwasów nukleinowych.
Oprócz przydatności do dowolnego celu, dla którego całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe wykazują użyteczność, opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe mogą w pewnych rozwiązaniach posiadać większe zalety niż całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe, takie jak, zwiększona moc działania i obniżona toksyczność.
Wynalazek dotyczy immunostymulujących oligonukleotydów jak zdefiniowano w zastrzeżeniach.
PL 232 260 Β1
Opisano tu również następujące oligonukleotydy o wzorze:
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T
T*C*G*T*C g*t*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T
(SEQ ID NO: 5),
(SEQ ID NO : 9) ,
;*C*G (SEQ ID NO:15),
:*T*G (SEQ ID NO:16),
;*c*g*c*c*g (SEQ ID
2*0 *0* 0*0*C* C*G (SEQ ID
0*T*T (SEQ ID NO:22),
;*c*g (SEQ ID NO:25),
;*A*G (SEQ ID NO:26) i
;*C*G (SEQ ID NO: 27) .
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*T*C*G
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*T*C*G
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C* rp*0 0*T *0 *G*T * G*T * C *
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*G*C*G*A*C*G*T*C*G
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A*C*G*T*C*G
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A*C*G*T*C*G
Opisano tu również oligonukleotydy o wzorze: T*C*C*A*T_G*A*C_G*T*T*C*C*T_G*A*T*G*C (SEQ ID NO: 4), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 73) i T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 99).
Opisano tu także oligonukleotyd o wzorze: 5'T*C*G*T*CGTTTTGANiCGN2*T*T3' (sekwencja SEQ ID NO: 296). W tym oligonukleotydzie Ni oznacza 0-6 nukleotydów i N2 oznacza 0-7 nukleotydów. Symbol * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być niestabilizowane lub stabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 2 fosfodiestrowe wiązania internukleotydowe. Stabilizowane wiązanie internukleotydowe może być wiązaniem tiofosforanowym. W pewnych rozwiązaniach Ni oznacza 0-2 nukleotydy. Oligonukleotyd dogodnie może mieć długość 16-24 nukleotydów.
W pewnym rozwiązaniu oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
5'T*C*G*T*C*G*TTTTGANiC*G*N2*T*T3' (SEQ ID NO: 296), 5'T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GANiC*G*N2*T*T3' (SEQ ID NO: 296), lub
5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_NiC*G*N2*T*T3' (SEQ ID NO: 296)
Symbol _ oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
Opisano tu także oligonukleotydy:
5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T3' (SEQ ID NO: 297),
298),
5'T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 299), i
5'T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 300).
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu oligonukleotyd zawierający: 5'T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4CGN5*T*T3' (SEQ ID NO: 301).
N3 oznacza 0-4 nukleotydów. N4 oznacza 1-5 nukleotydów. N5 oznacza 0-7 nukleotydów. Symbol * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być niestabilizowane lub stabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 2 fosfodiestrowe wiązania internukleotydowe. Stabilizowane wiązanie internukleotydowe może być wiązaniem tiofosforanowym. W pewnych rozwiązaniach N4 oznacza 1-2 nukleotydów. Oligonukleotyd dogodnie może mieć długość 16-24 nukleotydów.
W pewnym rozwiązaniu oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4C*G*N5*T*T3' (SEQ ID NO: 301),
5'T*C*G*A*T*N3C*G*TTTTN4C_G_*N5*T*T3' (SEQ ID NO: 302), 5'T*C*G*T*T*N3C_G_TTTTN4CGN5*T*T3' (SEQ ID NO: 303).
PL 232 260 B1
Odpowiednim oligonukleotydem może być
5'T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T3 (SEQ ID NO: 304) lub
5'T*c*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 305).
Według innych aspektów opisano tu oligonukleotyd: 5'T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 306).
N oznacza dowolny nukleotyd. Symbol * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być niestabilizowane lub stabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 3 internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe. Stabilizowane wiązanie internukleotydowe może być wiązaniem tiofosforanowym. W pewnych rozwiązaniach oligonukleotyd zawiera 5 internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych. Oligonukleotyd dogodnie może mieć długość 16-24 nukleotydów.
W pewnym rozwiązaniu oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur: 5'T*c*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 307), 5'T*c*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 308), lub
5'T*c*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 309). W jednym rozwiązaniu oligonukleotydem jest 5'T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 310). Symbol _ oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd zawiera co najmniej jeden motyw C_G z fosfodiestrowym wiązaniem internukleotydowym. W jeszcze innych rozwiązaniach oligonukleotyd nie zawiera żadnego motywu C_G z fosfodiestrowym wiązaniem internukleotydowym.
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu oligonukleotyd o budowie 5'T*C_G(N6C_GN7)2-3T*C_G*T*T3' (SEQ ID NO: 311-312).
N6 i N7 mają niezależnie długość pomiędzy 1 i 5 nukleotydów a oligonukleotyd ma długość 16-40 nukleotydów.
W pewnych rozwiązaniach N6 oznacza jeden nukleotyd, na przykład N6 może oznaczać T lub A. N7 w pewnych rozwiązaniach oznacza pięć nukleotydów, np. N7 może oznaczać pięć pirymidyn lub TTTTG.
W pewnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma budowę: 5'T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3' (SEQ ID NO: 313) lub 5'T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3' (SEQ ID NO: 314).
W innych aspektach opisano tu oligonukleotyd o budowie 5'T*CGCGN8CGCGC*GNg3' (SEQ ID NO: 315). N8 ma długość pomiędzy 4 i 10 nukleotydów i zawiera co najmniej 1 motyw C_G. N9 ma długość pomiędzy 0 i 3 nukleotydów. Oligonukleotyd ma długość 15-40 nukleotydów.
W pewnych rozwiązaniach N8 posiada co najmniej 2 lub 3 motywy CG. W innych rozwiązaniach N8 oznacza PuCGPyPyCG lub PuCGPyPyCGCG. Ewentualnie N8 oznacza ACGTTCG. N9 może zawierać co najmniej jeden motyw CG, taki jak CCG.
W pewnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma budowę: 5'T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3' (SEQ ID NO: 316) lub
5'T*c*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G3' (SEQ ID NO: 317).
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd o strukturze:
5'T*t*GX1X2TGXsX4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 318). N10 ma długość pomiędzy 4 i 8 nukleotydów i zawiera co najmniej 1 motyw C_G. X1, X2, X3 i, X4 oznaczają niezależnie C lub G. Taki oligonukleotyd ma długość 24-40 nukleotydów.
W pewnych rozwiązaniach N10 zawiera co najmniej 2 lub 3 motywy CG. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
5'T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 319) lub
5'T*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 320).
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ma budowę:
5'T*c*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3' (SEQ ID NO: 321).
W pewnych aspektach ODN jest oligonukleotydem mającym sekwencję wybraną z grupy obejmującej
PL 232 260 Β1
CGTCGTTTrGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 333), GTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 334), TCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 335), CGTTTTGACGTTITGTCGTT (SEQ ID NO: 336), GTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 337), TTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 338), TTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO; 339), TTGACGTfTTGTCGTT (SEQ ID NO: 340), TGACGTTTTGTCGIT (SEQ ID NO; 341), GACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 342), ACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 343), GTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 344), GTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 345), TTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 346), TTTGTCGTT, TTGTCGTT, TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT (SEQ ID NO: 347), TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCG (SEQID NO: 348), TCGTCGTTTTGACGTITTGTC (SEQ ID NO: 349), TCGTCGTTTTGACGTTTTGT (SEQ ID NO: 350), TCGTCGTTTTGACGTTTTG (SEQ ID NO: 351), TCGTCGTTTTGACGTTTT (SEQ ID NO: 352), TCGTCGTTTTGACGTTT (SEQ ID NO: 353), TCGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO: 354), TCGTCGTTTTGACGT (SEQ ID NO: 355), TCGTCGTTTTGACG (SEQ ID NO: 356), TCGTCGTTTTGAC (SEQ ID NO: 357), TCGTCGTTTTGA (SEQ ID NO: 358), TCGTCGTTTTG (SEQ ID NO: 359), TCGTCGTTTT (SEQ ID NO: 360), TCGTCGTTT, TCGTCGTT, CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT (SEQ ID NO: 361), GTCGTTTTGACGTTTTGTCG (SEQ ID NO: 362), TCGTTTTGACGTTTTGTC (SEQ ID NO: 363), CGTTTTGACGTTTTGT (SEQ ID NO: 364), GTTTTGACGTTTTG (SEQ ID ΝΌ: 365), TTTTGACGTTTT (SEQ ID NO: 366), TTTGACGTTT (SEQ ID NO: 367) i TTGACGTI’.
W innym aspekcie opisano tu oligonukleotyd zawierający oktamerową sekwencję zawierającą co najmniej jeden dinukleotyd YZ mający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego oraz co najmniej 4 nukleotydy T, przy czym Y oznacza pirymidynę lub zmodyfikowaną pirymidynę, przy czym Z oznacza guanozynę lub zmodyfikowaną guanozynę, i w którym oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Y może oznaczać niemetylenowaną C. Z może oznaczać guanozynę. W pewnych rozwiązaniach Y oznacza cytozynę lub zmodyfikowane zasady cytozynowe wybrane z grupy obejmującej 5-metylocytozynę, 5-metyloizocytozynę, 5-hydroksycytozynę, 5-(fluorowco)cytozynę, uracyl, N4-etylocytozynę, 5-fluorouracyl i atom wodoru. W innych rozwiązaniach Z oznacza guaninę lub zmodyfikowaną zasadę guaninową wybraną z grupy obejmującej 7-deazaguaninę, 7-deaza-7-(podstawioną)guaninę (taką jak 7-deaza-7-(C2-C6)alkinyloguanina), 7-deaza-8-(podstawioną)guaninę, hipoksantynę, 2,6-diaminopurynę, 2-aminopurynę, purynę, 8-podstawioną guaninę taką jak 8-hydroksyguanina, i 6-tioguanina, 2-aminopuryna, i atom wodoru.
W pewnych rozwiązaniach oktamerowa sekwencja obejmuje motyw TTTT. W innych rozwiązaniach oktamerowa sekwencja obejmuje dwa dinukleotydy YZ. Ewentualnie oba dinukleotydy YZ posiadają internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego.
W pewnych rozwiązaniach oktamerowa sekwencja jest wybrana z grupy obejmującej
T*C-G*T*C-G*T*T, C-G*T*C-G*T*T*T, G*T*C-G*T*T*T*T, T*CG*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*A, t*T*T*T*G*A*C-G, T*T*T*G*A*C-G*T,
T*T*G*A*C-G*T*T, T*G*A*C-G*T*T*T, G*A*C-G*T*T*T*T, A*C q*T*T*T*T*G C-G*T*T*T*T*G*T T*T*T*T*G*T*C-G T*T*T*G*T*C-G*T j T*T*G*T*C-G*T*T
PL 232 260 Β1 przy czym * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe, i przy czym _ oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ma długość 8-40 nukleotydów.
Wiązanie typu fosfodiestrowego może być wiązaniem boranofosfonianowym lub diastereomerycznie czystym Rp tiofosforanowym. Ewentualnie stabilizowane wiązania internukleotydowe oznaczają wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe, lub ich dowolną kombinację.
Oligonukleotyd może posiadać wiązanie 3'-3' z jednym lub dwoma dostępnymi końcami 5'. W pewnych dogodnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma dwa dostępne końce 5', z których wszystkie są 5'TCG.
W innym aspekcie opisano tu oligonukleotyd składający się z: 5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO: 368). Co najmniej jeden dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, przy czym oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu oligonukleotyd zawierający: 5'GNC3', przy czym N oznacza sekwencję kwasu nukleinowego o długości 4-10 nukleotydów i zawierającą co najmniej 50% T i nie zawierającą dinukleotydu CG, i przy czym ten oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe. W jednym rozwiązaniu N obejmuje motyw TTTT. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej G*T*T*T*T*G*T*C i G*T*T*T*T*G*A*C, przy czym * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu cząsteczkę immunostymulującego kwasu nukleinowego posiadającą co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd pirymidyna-puryna (YZ) i ewentualnie dinukleotyd pirymidyna-guanozyna (YG) i chimerowy szkielet, w którym co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YZ posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, w którym ewentualnie każdy dodatkowy wewnętrzny dinukleotyd YZ posiada wiązanie internukleotydowe fosfodiestrowe, typu fosfodiestrowego, lub stabilizowane, i w którym wszystkie inne wiązania internukleotydowe są stabilizowane. W jednym rozwiązaniu immunostymulujący kwas nukleinowy zawiera wiele wewnętrznych dinukleotydów YZ, każdy mający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego. W jednym rozwiązaniu każdy wewnętrzny dinukleotyd YZ posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego.
Opisano tu również następujące immunostymulujące oligonukleotydy:
*A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID
NO:l), G*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*A*C_G*C (SEQ IDNO:2), G*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*C (SEQ ID NO:3), oznaczoną SEQIDNO:5, T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO:6), T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:7), T*C*G*T*CG’T*T*T*C_G*T*CG*T*T (SEQ IDNO:8), oznaczoną SEQIDNO:9,
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 10),
T*C*G*T*C g*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 11),
PL 232 260 Β1
T*C_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*TG*T*CG*T*T (SEQ ID NO: 12), T*C_J7*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_7*T*T (SEQ ID NO: 13), T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C’C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 14), oznaczoną SEQIDNO:15, oznaczoną SEQ1DNO:16S oznaczoną $EQIDNO:17, oznaczoną SEQIDNO:21, oznaczoną SEQIDNO:22, T*C_G*T*C*G*T*T’T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:23), T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:24), oznaczoną SEQIDNO:25. oznaczoną SEQIDNO:26? oznaczoną SEQIDNO:27.
T*C_G*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_G*T*T(SEQ ID NO:28), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C„G*A*C’G*T*T (SEQ ID NO:29), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:30), T*C_G*T*C„G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C*G (SEQ ID NO:3l), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G* A*T (SEQ ID NO:32), T*C_G*T*C_G*T'T*T*C_G*T*C_G»A*T*T(SEQ ID NO:33), T*C_G*T*C„G*T*T*T*C__G*T*C_G*T (SEQ ID NO:34), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:35), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*TłC__G*T*T (SEQ ID NO:36, T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T'*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO.37), T*C_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C*G*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO:3«), T*C_G*T*CJj*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO-.39), τ*ο_α*τ*ε„ο*τ*τ·τ·τ·ο*α·α*£*ο·α*ε*ο·ο*ο*ο*ΰ (seq id NO:40), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ IDNO:41), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*C_G*C_G*C*C*G (SEQ ID NO:42), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ IDNO:43), TłC_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO:44), T*C_G*T*C_G*T*T*T’T*C_G*TłC_G*T*T (SEQ ID NO;45), T*C_G*T*C_G*T*T*TłT*C_G*T*T_G*T*T (SEQ IDNO:46).
PL 232 260 Β1
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:47), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:48), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:49), T»C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T(SEQ ID NO:50), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:51), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C„G*T*T (SEQ ID NO:52), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:53), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:54), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:55), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:56), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T‘T (SEQ ID NO;24l), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C„G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T (SEQ ID NO:58), T*C_G*T*CG*T*T*T*TG*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:59), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*TłT (SEQ ID NO:60), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:61), T‘CG*T*CG*T*T*TG*C_G*T*CG*T (SEQ ID NO:62), T*C G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO:63), T*C_G*T*C_G*T*TłT_G*T*C_G*T (SEQ ID NO:64), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G’T*T (SEQ ID NO: 65), T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*G*U*U_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:66), T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T’T*T*T (SEQ ID NO:67), T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T (SEQ JD NO:68), T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:69), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:70), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO:7l), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*T_G*T’C_G*T*T (SEQ ID NO:72), T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T (SEQ ID NO:74), T*G*T*C_G*T*T*G*TTC_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G+T*C_G*T*T (SEQ ID NO:75), T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:76), T*G*T’C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:77), T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:78),
PL 232 260 Β1
T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T*C*T*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:79),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:80), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*CjG*T*T*T (SEQ ID NO;81), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:82), T*T*C_G*T*T*C*T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T (SEQ ID NO:83), T*T*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO:84), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO:85), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:86), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO:87), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:88), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:89), T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T (SEQ ID NO:90),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:91),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T+T*T*C_G*T (SEQ ID NO:92)t T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO:93), T*T*T*T*C_GT*T*T*Tj3*TtC G*T*T*T+T (Seq ID NO:94), T*T*TtT*T*T*T*T*c^G*T*T*T*T*G*T*c_GłT (SEq ID Ν0.95^ T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:96), T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO:97), ż T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ LD NO:98),
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO;99): przy czym * oznacza tiofosforan, _ oznacza fosfodiester, U oznacza 2'-deoksyuracyl, a 7 oznacza 7-deazaguaninę.
Opisano tu także następujące immunostymulujące oligonukleotydy:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 102) i T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 104), przy czym * oznacza tiofosforan i _ oznacza fosfodiester.
Opisano tu także następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego: T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 100), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 101),
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 103), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu cząsteczkę immunostymulującego kwasu nukleinowego zawierającą chimerowy szkielet i co najmniej jedną sekwencję N1YGN2, w której niezależnie dla każdej sekwencji N1YGN2 YG oznacza wewnętrzny dinukleotyd pirymidyna-guanozyna (YG), Ni i N2 oznaczają za każdym razem niezależnie od siebie, dowolny nukleotyd, i przy czym dla co najmniej jednej sekwencji N1YGN2 i ewentualnie dla każdej dodatkowej sekwencji N1YGN2: dinukleotyd YG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, i Ni i Ysą związane przez internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego gdy Ni oznacza wewnętrzny nukleotyd, G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza
PL 232 260 Β1 wewnętrzny nukleotyd, lub Ni i Ysą związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy Ni oznacza wewnętrzny nukleotyd i G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd, w którym wszystkie inne wiązania internukleotydowe są stabilizowane.
W jednym rozwiązaniu immunostymulujący kwas nukleinowy zawiera wiele sekwencji N1YGN2, przy czym dla każdej sekwencji N1YGN2: dinukleotyd YG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, i Ni i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy Ni oznacza wewnętrzny nukleotyd, G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd, lub Ni i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy Ni oznacza wewnętrzny nukleotyd i G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd.
Opisano tu także następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T+T (SEQ ID NO: 105),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T,|,T (SEQ ID NO: 106), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T(SEQ ID NO: 107), T*Cjj*T*C_G*T*T*T*T*G*T*CJjJT*T*Tn*G*T*Cjj*T*T (SEQ ID NO: 108), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T(SEQ ID NO: 109), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T(SEQ IDNO:110), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C„G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:111), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:112),
PL 232 260 Β1
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ IDNO:113), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ IDNO:114), T*CJ3*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:115), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*TłC_G_T+T+T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:l 16), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 117), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 118), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ IDNOrl 19), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:12D), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ IDNO:I21), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G!*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 122), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_CGT*T (SEQ ID NO: 123), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T’|,C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 124), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 125), T*C_G*T*C_G_T*TtT*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 126), T*C_G,kT*C_G_T*T*T+T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 127), T*C_G*T+C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:128), T*C_G*T*C_G_T+T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G T*T (SEQ ID NO: 129), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G+T*T (SEQ ID NO:130), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:131), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:132), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:133), T*C_G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:134), T*C_G*T*C_GT*T*T*T*G*T_CG_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:135), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:136), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G+T*C_G_T*T (SEQ ID NO:137), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ IDNO:138), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:139), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:140), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:141), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:142), T*C_G*T_CłG*T,*T*T*T’,!G*T*C_G_T*T*T*T*G*T__C_G_T*T (SEQ ID NO:143), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:144), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:145), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 146), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 147),
PL 232 260 Β1
T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_TT*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 148), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 149), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 150), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*TC_G_T*T (SEQ ID NO:151), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:152), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:153), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*Ti_C_G*T*T (SEQ ID NO:154), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:155), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:156), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_GT*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:157), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:158), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:159), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:160), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:161), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G+T_C_G*T*T (SEQ IDNO:162), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C G_T*T (SEQ ID NO: 163), T*C_G*T_C_G_T*T*T*I*G*T_C_G_T*T+T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 164), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 165), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 166), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*TjC_G_T*T (SEQ IDNO:167), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:168), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ IDNO:169), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ IDNO:170), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ IDNO:17I), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 172), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ 1DNO:173), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T+T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:174), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ IDNO:I75), T*C_G„T*C_G*T*T*T*T*G*T„C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ 1DNO:176), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*Tł:T*G*T*C_G_T*T (SEQ IDNO:177), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:178), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ IDNO:179), T*C_G_T*C_G*T’lT*T+T+G*T_C_G_T*T*TłT*G’l‘T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 180), T*C_G_T*C_G*T*TłT*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 181), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T+T+T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 182),
PL 232 260 Β1
T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G„T’*T*T*T+G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:183),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 184),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:185),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 186),
T*CjG_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 187),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C„G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 188),
TłC_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 189),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:190),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 191),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 192),
T*C G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 193),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 194),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 195),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 196),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 197),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C„G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 198),
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 199),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:200),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ IDNO:20I),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:202),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:203), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO:204),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:205),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ IDNO:206),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:207),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T+T (SEQ ID NO:208),
T*C_G_T_C_G*T*T*TłT*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:209),
T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T„C_G*T*T (SEQ IDNO:210),
TtC_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T’*T'łT*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:211),
T*c_G_TC_G*T*T*T*T*G*T_c_G_r*T*T*T*G’,iT*c_G*T*T (seq id no.212),
T*C_G_T_C_G*TAT*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G:kT*C_G_T*T (SEQ ID NO;213),
Τ*ε_0_Τ_€_0*Τ*Τ*Τ*Τ*0*Τ_0_0_Τ*Τ*Τ*Τ*0*Τ_0_0*Τ*Τ (SEQ ID NO:2I4), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO:215), T*CG_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO:216), T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ IDNO:217),
PL 232 260 Β1
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:218),
T*C_G_TC_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO.219),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:220),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T»G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:221),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:222),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*GfT+C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO.223),
T*C_G_T_C_G„T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO :224),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO:225),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T»T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO:226),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO :227),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T'!T (SEQ ID NO:228),
T*C_G_T_C„G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_GraT*T (SEQ ID NO:229),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C__G*T*T (SEQ ID NO:230) £ T* C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T+T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 231), czym czym przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Opisano tu również następujące oligonukleotydy: T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 232), T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 233), i T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 234), przy * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Opisano tu również następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego:
T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 235), T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 236), i T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T, (SEQ ID NO: 237), przy * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Ponadto opisano tu następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego: T*C_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 238), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 239), i T*C_G_T_C_G_T*T*T_T_G_T_C_G_ T*T*T_T_G_T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 240), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG posiadający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego oznacza CG. W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG posiadający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego oznacza TG.
W jednym rozwiązaniu internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego jest wiązaniem fosfodiestrowym. W jednym rozwiązaniu wiązanie typu fosfodiestrowego jest wiązaniem boranofosfonianowym lub diastereomerycznie czystym Rp tiofosfo ran owym.
W jednym rozwiązaniu stabilizowane wiązania internukleotydowe są wybrane z grupy obejmującej: wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe, i ich dowolną kombinację. W jednym rozwiązaniu stabilizowane wiązania internukleotydowe oznaczają wiązanie tiofosforanowe.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy B. Wjednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy C.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego ma długość
4-100 nukleotydów. Wjednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego ma długość 6-40 nukleotydów. Wjednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego ma długość 6-19 nukleotydów.
Wjednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego nie jest antysensownym oligonukleotydem, oligonukleotydem tworzącym potrójną helisę, czy rybozymem.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera Ni-C_G-N2-C_G-N3
PL 232 260 B1 przy czym Ni i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 1-20 nukleotydów, w której _ oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, w której N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów, i w której G-N2-C zawiera 1 lub 2 stabilizowane wiązania.
Oligonukleotyd według wynalazku zawiera N1-C_G-N2-C_G-N3 przy czym N1 i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 1-20 nukleotydów, w której _ oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 4-20 nukleotydów, i w której G-N2-C zawiera co najmniej 5 stabilizowanych wiązań.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera N1-C_G-N2-C_G-N3 w którym N1, N2, i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów i w której _ oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, przy czym oligonukleotyd nie jest oligonukleotydem antysensownym, oligonukleotydem tworzącym potrójną helisę, lub rybozymem.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera
X1-N1-(GTCGTT)n-N2-X2 (SEQ ID NO: 18-20, 57), w którym N1 i N2 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów, w której n=2 lub n=4-6, przy czym X1 i X2 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego posiadającą wiązania tiofosforanowe między 3-10 nukleotydami, przy czym N1-(GTCGTT)n-N2 obejmuje co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe, i w którym nukleotydy 3' i 5' tego oligonukleotydu nie zawierają sekwencji poli-G, poli-A, poli-T, lub poli-C.
W jednym rozwiązaniu kwas nukleinowy posiada szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę.
W jednym rozwiązaniu oligonukleotyd posiada szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę.
W jednym rozwiązaniu oligonukleotyd występuje w kompozycji farmaceutycznej ewentualnie zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
W jednym rozwiązaniu kompozycja oligonukleotydu zawiera dodatkowo środek wspomagający lub cytokinę.
W jednym rozwiązaniu kompozycja oligonukleotydu zawiera dodatkowo antygen, przy czym oligonukleotyd jest adiuwantem w szczepionce.
W jednym rozwiązaniu antygen jest wybrany z grupy obejmującej: antygen wirusowy, antygen bakteryjny, antygen grzybowy, antygen posożyta oraz antygen nowotworowy. W jednym rozwiązaniu antygen jest kodowany przez wektorowy kwas nukleinowy. W jednym rozwiązaniu antygen jest antygenem peptydowym. W jednym rozwiązaniu antygen jest kowalencyjnie związany z oligonukleotydem lub cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego. W innym rozwiązaniu antygen nie jest kowalencyjnie związany z oligonukleotydem lub cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego.
Opisano tu również sposób służący do identyfikacji względnej mocy lub toksyczności badanej cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego. Sposób obejmuje wybranie immunostymulującego kwasu nukleinowego jako związku odniesienia, mającego sekwencję odniesienia, stabilizowan y szkielet, i moc immunostymulującą lub toksyczność; wybranie testowego immunostymulującego kwasu nukleinowego mającego sekwencję odniesienia, wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego zamiast stabilizowanego wiązania pomiędzy Y i N w co najmniej jednym wewnętrznym dinukleotydzie YN w sekwencji odniesienia, przy czym Y oznacza pirymidynę i N oznacza dowolny nukleotyd, i mającego badaną immunostymulującą moc lub toksyczność; i porównanie badanej mocy immunostymulującej lub toksyczności z immunostymulującą mocą związku odniesienia lub toksycznością w celu zidentyfikowania względnej mocy lub toksyczności badanej cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy jest silniejszym induktorem aktywności sygnalizacyjnej TLR9 niż immunostymulujący kwas nukleinowy będący związkiem odniesienia.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy jest silniejszym induktorem produkcji interferonu typu 1 niż immunostymulujący kwas nukleinowy będący związkiem odniesienia.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy jest silniejszym induktorem
IP-10 niż immunostymulujący kwas nukleinowy będący związkiem odniesienia.
W jednym rozwiązaniu YN oznacza YG. W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG oznacza CG. W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG oznacza TG.
PL 232 260 B1
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy zawiera wiele wewnętrznych dinukleotydów YG, każdy posiadający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego. W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG oznacza każdy wewnętrzny dinukleotyd YG.
W jednym rozwiązaniu wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego jest wiązaniem fosfodiestrowym. W jednym rozwiązaniu wiązanie typu fosfodiestrowego jest wiązaniem boranofosfonianowym lub diastereomerycznie czystym Rp tiofosforanowym.
W jednym rozwiązaniu stabilizowany szkielet zawiera wiele wiązań internukleotydowych wybranych z grupy obejmującej: wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe, i ich dowolną kombinację. W jednym rozwiązaniu stabilizowany szkielet zawiera wiele internukleotydowych wiązań tiofosforanowych.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy B. W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy C.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia ma długość 4-100 nukleotydów. W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia ma długość 6-40 nukleotydów. W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia ma długość 6-19 nukleotydów.
Opisano tu również sposób projektowania stabilizowanej cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego o długości poniżej 20 nukleotydów. Sposób obejmuje wybranie sekwencji o długości 6-19 nukleotydów, przy czym ta sekwencja zawiera co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd CG; wybranie wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego pomiędzy C i G w co najmniej jednym wewnętrznym dinukleotydzie CG; niezależne wybranie wiązania fosfodiestrowego, typu fosfodiestrowego, lub stabilizowanego pomiędzy C i G w każdym dodatkowym wewnętrznym dinukleotydzie CG; i wybranie stabilizowanego wiązania dla wszystkich innych wiązań internukleotydowych.
Opisano tu również sposób leczenia lub zapobiegania alergii lub astmie. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi opisanego tu immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości wystarczającej do leczenia lub zapobiegania alergii lub astmie. W jednym rozwiązaniu oligonukleotyd ten podaje się na powierzchnię śluzówkówki. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ten podaje się w preparacie aerozolowym. Ewentualnie oligonukleotyd podaje się donosowo.
W innym aspekcie opisano tu sposób indukowania produkcji cytokiny. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi opisanego tu immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości wystarczającej do indukcji syntezy cytokin wybranych z grupy obejmującej IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, chemokiny i IFN-γ.
Zgodnie z innym aspektem przedstawiono tu kompozycję opisanych tu immunostymulujących oligonukleotydów CpG w połączeniu z antygenem lub innym związkiem terapeutycznym, takim jak środek przeciwdrobnoustrojowy. Środkiem przeciwdrobnoustrojowym może być na przykład środek przeciwwirusowy, środek przeciwpasożytniczy, środek przeciwbakteryjny lub środek przeciwgrzybowy.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu środek terapeutyczny do przedłużonego uwalniania kompozycji zawierającej opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy CpG.
Kompozycja może ewentualnie zawierać farmaceutyczny nośnik i/lub można ją preparować w środek dostarczający. W pewnych rozwiązaniach środek dostarczający jest wybrany z grupy obejmującej kationowe lipidy, białka penetrujące komórkę i przyrządy do przedłużonego uwalniania. W jednym rozwiązaniu środkiem do przedłużonego uwalniania jest biodegradowalny polimer lub mikrocząstka.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób stymuluacji odpowiedzi immunologicznej. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości powodującej skuteczną indukcję odpowiedzi immunologicznej u pacjenta. Ten immunostymulujący oligonukleotyd CpG można podawać doustnie, miejscowo, w środku terapeutycznym do przedłużonego uwalniania, na błonę śluzową, ogólnoustrojowo, pozajelitowo, lub domięśniowo. Gdy immunostymulujący oligonukleotyd CpG podaje się na powierzchnię śluzówki, może być dostarczony w ilości wystarczającej do skutecznej indukcji odpowiedzi immunologicznej śluzówki lub ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej. W dogodnym rozwiązaniu powierzchnię śluzówki do zastosowania leku wybiera się z grupy obejmującej powierzchnię jamy ustnej, nosową, odbytniczą, pochwową, i powierzchnię oka.
PL 232 260 B1
W pewnych rozwiązaniach sposób obejmuje podanie pacjentowi antygenu, przy czym odpowiedź immunologiczna jest antygenowo swoistą odpowiedzią immunologiczną. W pewnych rozwiązaniach antygen wybiera się z grupy obejmującej antygen nowotworowy, antygen wirusowy, antygen bakteryjny, antygen pasożyta i antygen peptydowy.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są zdolne do wywoływania szerokiego spektrum odpowiedzi immunologicznej. Na przykład te immunostymulujące oligonukleotydy CpG można stosować w celu przekierowania odpowiedzi immunologicznej z Th2 na Th1. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także stosować do aktywacji komórki układu odpornościowego, takiej jak limfocyt (np. limfocyty B i T), komórka dendrytyczna, komórka NK. Aktywację można przeprowadzić in vivo, in vitro, lub ex vivo, tj. przez pobranie komórki układu odpornościowego od pacjenta, kontaktowanie komórki układu odpornościowego z immunostymulującym oligonukleotydem CpG w ilości wystarczającej do aktywacji tej komórki układu odpornościowego i powtórnego podania zaktywowanej komórki układu odpornościowego pacjentowi. W pewnych rozwiązaniach komórka dendrytyczna prezentuje antygen nowotworowy. Tę komórkę dendrytyczną można kontaktować z antygenem nowotworowym ex vivo.
Odpowiedź immunologiczna wywoływana przez immunostymulujące oligonukleotydy CpG może także skutkować indukcją produkcji cytokiny, np. produkcją IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, chemokin i IFN-γ.
W jeszcze innym rozwiązaniu, immunostymulujące oligonukleotydy CpG są przydatne w leczeniu raka. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są także przydatne według innych opisanych tu aspektów w zapobieganiu nowotworowi (np. zmniejszając ryzyko rozwoju nowotworu) u pacjenta zagrożonego rozwojem nowotworu. Nowotwór może należeć do grupy składającej się z raka dróg żółciowych, raka sutka, raka szyjki macicy, nabłoniaka kosmówkowego, raka okrężnicy, raka endometrium, raka żołądka, nowotworów śródnabłonkowych, chłoniaków, raka wątroby, raka płuca (np. drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego), czerniaka, nerwiaków, nowotworu jamy ustnej, raka jajnika, raka trzustki, raka stercza, raka odbytnicy, mięsaków, raka tarczycy i nowotworu nerek, jak również innych raków i mięsaków. W pewnych ważnych rozwiązaniach, nowotwór do leczenia wybiera się z grupy obejmującej nowotwór kości, nowotwór mózgu i OUN, nowotwór tkanki łącznej, nowotwór przełyku, nowotwór oka, chłoniaka Hodgkin'a, nowotwór krtani, nowotwór jamy ustnej, nowotwór skóry, i nowotwór jąder.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także stosować w celu zwiększenia podatności komórki nowotworowej na terapię nowotworową (np. terapia przeciwnowotworowa), ewentualnie gdy immunostymulujący oligonukleotyd CpG podaje się w połączeniu z leczeniem przeciwnowotworowym. Terapią przeciwnowotworową może być chemioterapia, szczepionka (np. przygotowana in vitro szczepionka zawierająca komórki dendrytyczne lub szczepionka zawierająca antygeny nowotworowe) lub terapia za pomocą przeciwciał. Ten drugi rodzaj leczenia może także obejmować podawanie przeciwciała swoistego dla antygenu powierzchniowego komórki, np. komórki nowotworowej, przy czym odpowiedź immunologiczna wywołuje cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). W jednym rozwiązaniu, przeciwciało można wybierać z grupy składającej się z następujących przeciwciał: Ributaxin, herceptyna, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anty-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anty-FLK-2, MDX-260, przeciwciała ANA, przeciwciała SMART 1D10, przeciwciała SMART ABL 364 i ImmuRAIT-CEA.
Tak więc, zgodnie z pewnymi opisanymi tu aspektami pacjentowi mającemu raka lub zagrożonemu rakiem podaje się immunostymulujący oligonukleotyd CpG i stosuje terapię przeciwnowotworową. W pewnych rozwiązaniach terapię przeciwnowotworową wybiera się z grupy składającej się ze środka chemioterapeutycznego, środka immunoterapeutycznego i szczepionki przeciwnowotworowej.
W jeszcze innym rozwiązaniu sposobów zapobiegania lub leczenia raka, pacjentowi można następnie podawać interferon-a.
Inne opisane tu aspekty dotyczą sposobów zapobiegania chorobom u pacjenta. Sposób obejmuje regularne podawanie pacjentowi immunostymulującego oligonukleotydu CpGw celu polepszenia reaktywności układu odpornościowego przy zapobieganiu chorobie u pacjenta. Przykłady chorób lub schorzeń, którym można zapobiegać stosując profilaktyczne sposoby tu opisane obejmują infekcje bakteryjne (np. choroby przenoszone drogą płciową) i wstrząs anafilaktyczny spowodowany alergiami pokarmowymi.
PL 232 260 B1
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu również sposób indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przez podawanie pacjentowi immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości wystarczającej do skutecznej aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób leczenia lub zapobiegania infekcji wirusowej lub retrowirusowej. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi przechodzącemu infekcję lub zagrożonemu infekcją wirusową lub retrowirusową dowolnej kompozycji tu opisanej w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiegania infekcji wirusowej lub retrowirusowej. W pewnych rozwiązaniach wirus oznacza wirusa powodującego zapalenie wątroby np. wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C, H, wirusa opryszczki, lub wirusa brodawczaka.
Opisano tu również sposób leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi przechodzącemu infekcję bakteryjną lub zagrożonemu infekcją bakteryjną, dowolnej kompozycji według wynalazku w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej. W jednym rozwiązaniu infekcja bakteryjna jest spowodowana przez bakterie wewnątrzkomórkowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób leczenia lub zapobiegania infekcji pasożytniczej przez podawanie pacjentowi przechodzącemu infekcję pasożytniczą lub nią zagrożonemu dowolnej opisanej tu kompozycji w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiegania infekcji pasożytniczej. W jednym rozwiązaniu infekcja pasożytnicza jest spowodowana pasożytem wewnątrzkomórkowym. W innym rozwiązaniu infekcja pasożytnicza jest spowodowana przez pasożyta niebędącego robakiem.
W pewnych rozwiązaniach pacjentem jest człowiek, a w innych rozwiązaniach pacjentem jest kręgowiec niebędący człowiekiem wybrany z grupy składającej się z następujących zwierząt: pies, kot, koń, krowa, świnia, indyk, koza, ryba, małpa, kura, szczur, mysz i owca.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób indukcji odpowiedzi immunologicznej Th1 przez podawanie pacjentowi dowolnej opisanej tu kompozycji w ilości wystarczającej do skutecznego wytworzenia odpowiedzi immunologicznej Th1.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób indukcji odpowiedzi immunologicznej przez podawanie potrzebującemu tego pacjentowi w skutecznej ilości immunostymulującego oligonukleotydu 5'T*C*G*T*X1*T*T3' w którym Χ1 oznacza 3-30 nukleotydów, przy czym * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe, i przy czym oligonukleotyd zawiera co najmniej 2 fosfodiestrowe wiązania internukleotydowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób leczenia choroby autoimmunologicznej przez podawanie pacjentowi choremu na chorobę autoimmunologiczną, lub nią zagrożonemu, dowolnej opisanej tu kompozycji w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd jest podawany pacjentowi w ilości wystarczającej do skutecznej indukcji ekspresji cytokiny. Cytokinę można ewentualnie wybrać z grupy składającej się z IL-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd podaje się pacjentowi w ilości wystarczającej do skutecznego przesunięcia odpowiedzi immunologicznej na odpowiedź z przewagą Th1 z odpowiedzi z przewagą Th2.
Pewne opisane tu aspekty dotyczą sposobu leczenia przebudowy struktury dróg oddechowych, obejmującego: podawanie pacjentowi oligonukleotydu zawierającego dinukleotyd CG, w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia przebudowy struktury dróg oddechowych u pacjenta. W jednym rozwiązaniu pacjent jest chory na astmę, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc, lub jest palaczem. W innych rozwiązaniach pacjent nie wykazuje objawów astmy.
Opisano tu również zastosowanie oligonukleotydu do stymulacji odpowiedzi immunologicznej.
Opisano tu także sposób wytwarzania leku z oligonukleotydu immunostymulującego.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób stymulacji odpowiedzi immunologicznej, przez podawanie pacjentowi oligonukleotydu o długości co najmniej 5 nukleotydów w ilości wystarczającej do skutecznej stymulacji odpowiedzi immunologicznej, przy czym oligonukleotyd zawiera co najmniej jeden immunostymulujący motyw dinukleotydowy, w którym internukleotydowe wiązanie dinukleotydu wykazuje chiralność R, i w którym co najmniej 70% pozostałych wiązań internukleotydowych oligonukleotydu wykazuje chiralność S.
Każde z ograniczeń wynalazku może obejmować różne rozwiązania według wynalazku.
PL 232 260 B1
Krótki opis rysunków
Fig. 1 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (pg/ml) wydzielanego przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów interferonu alfa wydzielonego przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, i SEQ ID NO: 324 i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 242. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, i SEQ ID NO: 328) i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną 5'TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT 3') (SEQ ID NO: 329). Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M). Przedstawione dane są średnią dla sześciu dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom interferonu alfa (pg/ml) wydzielonego przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłożem).
Fig. 2 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy IL-10 (pg/ml) wydzielonej przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów IL-10 wydzielonej przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 2A obejmują (SEQ ID NO: 322), SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 242. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 2B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M). Przedstawione dane są średnią dla sześciu dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom IL-10 (pg/ml) wydzielonej przez potraktowane kontrolą negatywną (podłoże).
Fig. 3 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy TNF-alfa (pg/ml) wydzielonego przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów TNF-alfa wydzielonego przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawione jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 3A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 3B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom TNF-alfa (pg/ml) wydzielonego przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłoże) i LPS.
Fig. 4 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy IL-6 (pg/ml) wydzielonej przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów IL-6 wydzielonej przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 4A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329 (z całkowicie zmodyfikowanym szkieletem tiofosforanowym). Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 4B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom IL-6 (pg/ml) wydzielonej przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłoże) i LPS.
Fig. 5 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu gamma (pg/ml) wydzielonego przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów interferonu gamma wydzielonego przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 5A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 5B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO:
PL 232 260 B1
326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom interferonu gamma (pg/ml) wydzielonego przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłoże) i LPS.
Fig. 6 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD69 (MFI) na komórkach NK jako wskaźnika aktywacji komórek NK po potraktowaniu oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów ekspresji CD69 na komórkach potraktowanych oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, i SEQ ID NO: 324 i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, i SEQ ID NO: 328 i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom ekspresji CD69 na komórkach NK potraktowanych środkiem odpowiednim dla kontroli negatywnej (podłoże) i LPS.
Fig. 7 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (7A) i IL-10 (7B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu oligonukleotydem SEQ ID NO: 313, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10, wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ).
Fig. 8 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (8A) i IL-10 (8B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 314, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Jako ODN będący negatywną kontrolą zastosowano SEQ ID NO: 330: tccaggacttctctcaggtt. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ).
Fig. 9 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (9A) i IL-10 (9B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 319, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ).
Fig. 10 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (10A) i IL-10 (10B) wytwarzanych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 316, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ).
Fig. 11 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (11A) i IL-10 (11B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 317, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10, wytwarzanych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ).
Fig. 12 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (12A) i IL-10 (12B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 320 i przedstawione jako względem poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ).
Fig. 13 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B (13A) i ekspresji CD80 na monocytach (13B) po traktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 313, przedstawione jako , względem poziomów ekspresji CD86 na limfocytach B i CD80 na monocytach,
PL 232 260 B1 po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Fig. 14 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B (14A) i ekspresji CD80 na monocytach (14B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 314 i przedstawione jako , względem poziomów ekspresji CD86 na limfocytach B (14A) i CD80 na monocytach, po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 15 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B (15A) i ekspresji CD80 na monocytach (15B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 319 i przedstawione jako względem poziomów ekspresji CD86 na limfocytach B (15A) i CD80 na monocytach, po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 16 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (16A) i ekspresję CD80 na monocytach (16B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO:
316 i w porównaniu z poziomami ekspresji po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, i oligonukleotydem 5'TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT 3') SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 17 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-a) (17A) i IL-10 (17B) wytwarzanych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 321 w porównaniu z poziomami interferonu alfa i IL-10 po potraktowaniu kontrolnym oligonukleotydem SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 18 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (18A) i ekspresję CD80 na monocytach (18B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 321 i w porównaniu z potraktowaniem oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 19 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (19A) i ekspresję CD80 na monocytach (19B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO:
317 i w porównaniu z oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 20 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (20A) i ekspresję CD80 na monocytach (20B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 320 i w porównaniu z potraktowaniem oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Fig. 21 jest graficznym przedstawieniem fragmentu cząsteczki kwasu nukleinowego, przedstawiającym cechy strukturalne obejmujące zasady (B), cukry, i szkielet z wiązaniem fosfodiestrowym (otoczonym kółkiem) pomiędzy 5' cytydyną i 3' guanozyną i sąsiadujące wiązania tiofosforanowe.
Fig. 22 jest wykresem słupkowym, przedstawiającym względne ilości tiofosforanów (SEQ ID NO: 242), miękkich (SEQ ID NO: 294) i semi-miękkich (SEQ ID NO: 241) oligonukleotydów w tkankce nerki, śledziony i wątroby, 48 godzin po podaniu myszom wstrzyknięcia podskórnego. Oligonukleotydy SEQ ID NO: 242 i SEQ ID NO: 241 mają identyczną sekwencję zasad i różnią się pod względem budowy szkieletu.
Fig. 23 przedstawia stymulację in vitro ludzkich komórek układu odpornościowego jako indukcję produkcji cytokin IL-6, IL-10, IFNa i IP-10.
Fig. 24 przedstawia stymulację in vitro mysich splenocytów przez zwiększenie efektywności i/lub mocy jako induktora produkcji związanych z TLR9 cytokin IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa i IP-10, bez wykrywalnej sekrecji IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 lub GM-CSF.
Fig. 25 przedstawia indukowaną ekspresję genów związanych z TLR9 (IL-6, TNFa, IFNa, IFN-γ i IP-10) w płucach przez ODN (SEQ ID NO: 313).
PL 232 260 B1
Fig. 26 przedstawia wpływ ODN CpG na rozwój węzła chłonnego wywołanego antygenem in vivo u myszy.
Fig. 27 wskazuje, że ODN CpG tłumi odpowiedź Th2 na uczulenie antygenem.
Fig. 28 przedstawia wpływ na wywołaną antygenem produkcję IgE in vivo u myszy.
Fig. 29 wskazuje, że prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów, w przeważającej mierze eozynofili, w świetle dróg oddechowych.
Fig. 30 i 32 wskazują, że prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów, w przeważającej mierze eozynofilów, w świetle dróg oddechowych i że było ono hamowane przez ODN (SEQ ID NO: 313) w sposób zależny od dawki.
Fig. 31 i 32 wskazują, że prowokacja antygenem spowodowała nadreaktywność dróg oddechowych, i że nadreaktywność tę hamował ODN (SEQ ID NO: 313) w sposób zależny od dawki.
Fig. 33 przedstawia stężenia ODN w osoczu szczura występującego po podawaniu dożylnym i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dotyczące osocza wskazują, że SEQ ID NO: 313 usuwany jest z osocza szybciej niż SEQ ID NO: 329, zarówno po podaniu dożylnym jak i i.t.
Fig. 34 przedstawia stężenia ODN w płucach szczura po podaniu dożylnym i i.t. w dawce 5 mg/kg. Po podaniu dożylnym przy takim samym poziomie dawkowania, stężenia SEQ ID NO: 313 w płucu są niższe niż stężenia SEQ ID NO: 329. Po podawaniu i.t. różnica jest mniej wyraźna. Dane dotyczące płuca dla SEQ ID NO: 329 można uzyskiwać tylko przed upływem 48 godzin po podaniu dawki.
Fig. 35 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podaniu dożylnym i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dotyczące nerki wskazują, że bezwzględne poziomy SEQ ID NO: 313 w nerkach są niższe niż odpowiednie stężenia SEQ ID NO: 329 po podawaniu zarówno dożylnym jak i i.t.
Ekspozycja nerek na działanie SEQ ID NO: 313 w szczególności po podawaniu i.t. jest znacznie mniejsza w porównaniu z ekspozycją nerek na SEQ ID NO: 329 przy takim samym poziomie dawkowania.
Fig. 36 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podaniu dożylnym w dawce 5 mg/kg.
Fig. 37 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg.
Fig. 38 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podaniu dożylnym SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg.
Fig. 39 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podawaniu i.t. SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg.
Fig. 40 jest wykresem przedstawiającym stopień stymulacji dla zestawów semi-miękkich ODN w porównaniu z zawierającym wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN o takiej samej sekwencji.
Fig. 41 jest zestawem wykresów słupkowych przedstawiających indukcję wytwarzania cytokiny A i B (IP-10), C (IFN), i D & E (TNF) w odpowiedzi na podawanie miękkich (SEQ ID NO: 294), semi-miękkich (SEQ ID NO: 241), i zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN (SEQ ID NO: 242).
Fig. 42 jest zestawem wykresów przedstawiających aktywność limfocytu T objawiającą się wydzielaniem przeciwciał i cytotoksycznością w odpowiedzi na podawanie miękkich (SEQ ID NO: 294), semimiękkich (SEQ ID NO: 241) i zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN (SEQ ID NO: 242).
Fig. 43 jest zestawem wykresów przedstawiających leczenie przeciwnowotworowe myszy z zastosowaniem semi- miękkich (SEQ ID NO: 241) lub zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN (SEQ ID NO: 242). Fig. 43A i B przedstawiają wyniki na modelu raka komórek nerki. Fig. 43C i D przedstawiają wyniki dla modelu mysiej neuroblastomy. Fig. 43E i F przedstawiają wyniki dla modelu mysiego niedrobnokomórkowego raka płuc.
Szczegółowy opis
Zgodnie z wynalazkiem opisano tu semi-miękkie immunostymulujące kwasy nukleinowe. Opisano tutaj również miękkie immunostymulujące kwasy nukleinowe. Opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku w pewnych rozwiązaniach mają lepsze właściwości obejmujące porównywalną lub zwiększoną moc, zmniejszoną ekspozycję układową nerek, wątroby i śledziony, mogą powodować mniejszą odpowiedź ze strony układu odpornościowego w miejscu wstrzyknięcia. Nie wiążąc się z mechanizmem działania przyjmuje się, że te ulepszone właściwości są związane ze strategicznym umiejscowieniem w immunostymulujących oligonukleotydach fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego „wiązań internukleotydowych”. Stosowany tu termin „wiązanie internukleotydowe” odnosi się do kowalencyjnego wiązania w łańcuchu głównym łączącego dwa sąsiadujące nukleotydy w cząsteczce kwasu nukleinowego. Wiązanie kowalencyjne w łańcuchu głównym typowo jest zmodyfikowanym lub niezmodyfikowanym wiązaniem fosforanowym, lecz możliwe są inne modyfikacje. Tak więc liniowy oli
PL 232 260 B1 gonukleotyd, który ma długość n nukleotydów posiada ogółem n-1 wiązań internukleotydowych. Te kowalencyjne wiązania w łańcuchu głównym w immunostymulujących oligonukleotydach mogą być zmodyfikowane lub niezmodyfikowane.
W szczególności, wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego obejmują „wewnętrzne dinukleotydy”. Wewnętrzny dinukleotyd na ogół powinien oznaczać dowolną parę sąsiadujących nukleotydów połączonych wiązaniem internukleotydowym, przy czym żaden nukleotyd w parze nukleotydów nie jest nukleotydem końcowym, tj. żaden nukleotyd w takiej parze nukleotydów nie jest nukleotydem definiującym koniec 5' lub 3' oligonukleotydu. Tak więc liniowy oligonukleotyd mający długość n nukleotydów posiada ogółem n-1 dinukleotydów i tylko n-3 wewnętrznych dinukleotydów. Każde internukleotydowe wiązanie w wewnętrznym dinukleotydzie jest wewnętrznym wiązaniem internukleotydowym. Tak więc liniowy oligonukleotyd mający długość n nukleotydów ma ogółem n-1 wiązań internukleotydowych i tylko n-3 wewnętrznych wiązań internukleotydowych. Strategiczne rozmieszczenie internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego oznacza zatem internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego umiejscowione pomiędzy dowolną parą nukleotydów w sekwencji kwasu nukleinowego. W pewnych rozwiązaniach wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego nie są umiejscowione pomiędzy obiema parami nukleotydów najbliższymi końca 5' lub 3'.
Wynalazek opiera się co najmniej w pewnych aspektach na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że opisane tu miękkie i semi-miękkie kwasy nukleinowe wykazują co najmniej taką samą lub w wielu przypadkach posiadają większą aktywność immunostymulującą, w wielu przykładach, niż odpowiednie całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy posiadające taką samą sekwencję nukleotydową. Jest to nieoczekiwane, ponieważ powszechnie przyjmuje się, że tiofosforanowe oligonukleotydy są na ogół bardziej immunostymulujące niż niestabilizowane oligonukleotydy. Wyniki były nieoczekiwane, ponieważ spodziewano się, że jeśli „zmiękczone” wiązanie umieści się pomiędzy krytycznym motywem immunostymulującym, którym jest CG, taki kwas nukleinowy może mieć zmniejszoną aktywność, ponieważ kwas nukleinowy in vivo łatwo rozpadałby się na fragmenty niezawierające CG. W przeciwieństwie do oczekiwań wiele tych kwasów nukleinowych wykazywało właściwie równą lub wyższą aktywność in vitro i in vivo. Wydaje się, że miękkie i semi-miękkie oligonukleotydy mają działanie co najmniej równie silne, jeśli nie silniejsze, niż ich całkowicie stabilizowane odpowiedniki; efekt immunostymulujący netto miękkich i semi-miękkich oligonukleotydów jest wypadkową pomiędzy ich aktywnością i trwałością. Przy wysokich stężeniach, równowaga wydaje się przechylać na stronę aktywności, tzn. dominuje moc. Przy niskich stężeniach, ta równowaga wydaje się przechylać na stronę trwałości, tzn. dominuje względna nietrwałość związana z wrażliwością na nukleazę.
Jeden aspekt dotyczy miękkich oligonukleotydów. Miękki oligonukleotyd oznacza immunostymulujący oligonukleotyd posiadający częściowo stabilizowany szkielet, w którym internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego wystąpuje tylko we wnętrzu i w bezpośrednim sąsiedztwie z co najmniej jednym wewnętrznym dinukleotydem pirymidyna-puryna (YZ). YZ może oznaczać YG, dinukleotyd pirymidyna-guanozyna (YG). Co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YZ sam posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego. Internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego występujące w bezpośrednim sąsiedztwie co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ może znajdować się 5', 3', lub jednocześnie 5' i 3' względem co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ. Dogodnie internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego występujące w bezpośrednim sąsiadztwie co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ jest samo wewnętrznym wiązaniem internukleotydowym. Tak więc dla sekwencji N1YZN2, w której każdy N1 i N2, niezależnie od siebie, oznacza dowolny nukleotyd, dinukleotyd YZ posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, i ponadto (a) N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego przy czym N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd, (b) Z i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego przy czym N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd, lub (c) N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego przy czym N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd i Z i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego przy czym N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd.
Przykłady miękkich oligonukleotydów obejmują te opisane przez w sekwencje oznaczone jako SEQ ID NO: 105-231, SEQ ID NO: 232-234, SEQ ID NO: 235-237 i SEQ ID NO: 238-240.
Opisane tu miękkie oligonukleotydy uznaje się za względnie podatne na rozerwanie nukleazą w porównaniu z całkowicie stabilizowanymi oligonukleotydami. Niezależnie od powiązania z konkretną
PL 232 260 B1 teorią lub mechanizmem, przyjmuje się, że te opisane miękkie oligonukleotydy można pociąć na fragmenty o zmniejszonej aktywności immunostymulującej lub nieposiadające aktywności immunostymulującej w stosunku do miękkich oligonukleotydów pełnej długości.
Wprowadzenie co najmniej jednego wiązania internukleotydowego podatnego na nukleazę, szczególnie blisko środka oligonukleotydu, uznaje się za wywołujące „off switch”, co zmienia farmakokinetykę tego oligonukleotydu tak, że zmniejsza się czas trwania maksymalnej aktywności immunostymulującej oligonukleotydu. Może mieć to szczególne znaczenie dla tkanek i dla zastosowań klinicznych, w których pożądane jest uniknięcie uszkodzenia związanego z przewlekłym miejscowym zapaleniem lub immunostymulacją, np. nerki.
Zgodnie z innym aspektem wynalazek dotyczy semi-miękkich oligonukleotydów. Semi-miękki oligonukleotyd oznacza immunostymulujący oligonukleotyd posiadający częściowo stabilizowany szkielet, w którym wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego występują tylko wewnątrz co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu pirymidyna-puryna (YZ). Semi-miękkie oligonukleotydy na ogół posiadają zwiększoną moc immunostymulującą w stosunku do odpowiednich całkowicie stabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów. Przykładowo, moc immunostymulującą semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241 jest 2-5 razy większa niż zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, przy czym dwa oligonukleotydy mają taką samą sekwencję nukleotydową i różnią się tylko wewnętrznymi wiązaniami internukleotydowymi YZ jak przedstawiono poniżej, przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 241) T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 242).
SEQ ID NO: 241 zawiera wewnętrzne internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe obejmujące zarówno dinukleotydy CG jak i TG (oba YZ). Dzięki większej mocy semi-miękkich oligonukleotydów, semi-miękkie oligonukleotydy można stosować w niższych skutecznych stężeniach i w niższych skutecznych dawkach niż typowe całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy, co pozwala osiągnąć pożądane działanie biologiczne.
Podczas gdy całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy mogą wykazywać maksima dawka-odpowiedź, semi-miękkie oligonukleotydy według wynalazku wydają się posiadać jednostajnie rosnące krzywe dawka-odpowiedź (tak jak zbadano przy zastosowaniu stymulacji TLR9) rozciągające się na większe stężenia poza optymalnym stężeniem dla odpowiednich całkowicie stabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów. Tak więc przyjmuje się, że semi-miękkie oligonukleotydy według wynalazku mogą powodować silniejszą immunostymulację niż całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy.
W wynalazku stwierdzono, że aktywność immunostymulującą słabo immunostymulujących całkowicie stabilizowanych oligonukleotydów można zwiększyć przez wprowadzenie co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ z internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego. Tak więc możliwe jest wyjście od słabo immunostymulującego oligonukleotydu, posiadającego całkowicie stabilizowany szkielet, i podniesienie jego aktywności immunostymulującej przez podstawienie internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego stabilizowanym wiązaniem internukleotydowym co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YG. Stwierdzono np. że SEQ ID NO: 243 wykazuje silniejszą aktywność immunostymulującą niż jego całkowicie stabilizowany odpowiednik SEQ ID NO: 244, przy czym SEQ ID NO: 244 jest oligonukleotydem względnie słabo immunostymulującym w porównaniu z SEQ ID NO: 242:
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T+T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 243) T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ IDNO: 244).
Podczas gdy całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe o długości poniżej 20 nukleotydów mogą wykazywać umiarkowaną aktywność immunostymulującą w porównaniu z dłuższymi (np. długości 24 nukleotydów) całkowicie stabilizowanymi oligonukleotydami, stwierdzono, że semi-miękkie oligonukleotydy tak krótkie jak o długości 16 nukleotydów wykazują aktywność immunostymulującą co najmniej równą aktywności immunostymulującej całkowicie stabilizowanych oligonukleotydów o długości ponad 20 nukleotydów. Na przykład, SEQ ID NO: 245 i 5602 (obydwa 16-mery o częściowym podobieństwie sekwencji do SEQ ID NO: 242) wykazują immunosytmulacyjną aktywność porównywalną z aktywnością SEQ ID NO: 242 (24-mer).
PL 232 260 Β1 t*c_g*t*c_g*t*t*t*c_g*t*c_g*t*t (SEQ ID NO: 245)
5602 T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 56)
T*C*G*T*C+G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T+C*G*T*T (SEQ ID NO: 242)
W pewnych przypadkach gdzie 6-merowy oligonukleotyd tiofosforanowy wydawał się nie posiadać aktywności immunostymulującej, podstawienie nawet jednego wewnętrznego internukleotydowego wiązania fosfodiesterowego YZ wiązaniem tiofosforanowym pozwalało na uzyskanie odpowiedniego 6-meru o aktywności immunostymulującej.
Przyjmuje się także, że powyższe właściwości semi- miękkich oligonukleotydów na ogół nasilają się wraz z rosnącą „dawką” wewnętrznych dinukleotydów YZ zawierających wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego. Zatem uważa się, że, na przykład, zwykle dla danej sekwencji oligonukleotydowej zawierającej pięć wewnętrznych dinukleotydów YZ, oligonukleotyd zawierający pięć wewnętrznych internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego YZ jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający cztery wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego YG, który z kolei jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający trzy wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego YZ, który z kolei jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający dwa wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego YZ, który z kolei jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający jedno wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego YZ. Co ważne, wprowadzenie nawet jednego wewnętrznego internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego YZ przyjmuje się za bardziej zalecane niż brak wewnętrznego internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego YZ. Oprócz liczby internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego na moc może także wpływać pozycja w łańcuchu kwasu nukleinowego.
Nieograniczające przykłady semi-miękkich oligonukleotydów obejmują te opisywane przez sekwencje oznaczone jako SEQ ID NO: 1-99, 241 i SEQ ID NO: 100-104.
Immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku są na ogół zabezpieczone przed gwałtowną degradacją w osoczu. Immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku są także na ogół zabezpieczone przed gwałtowną degradacją w większości tkanek, za wyjątkiem szczególnych tkanek o specyficznej lub nadmiernej aktywności nukleazowej zdolnych do degradacji immunostymulujących oligonukleotydów. Powoduje to zmniejszenie ilości immunostymulujących oligonukleotydów w tych szczególnych tkankach, nagromadzenie których mogłoby w przeciwnym razie spowodować działania niepożądane przy długotrwałym leczeniu z zastosowaniem oligonukleotydów odpornych na degradację. Opisane tu oligonukleotydy będą na ogół posiadać, oprócz internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego w zalecanych wewnętrznych pozycjach, końce 5' i 3', które są odporne na degradację. Takie końce odporne na degradację mogą zawierać dowolne odpowiednie modyfikacje, których skutkiem jest zwiększona oporność na trawienie egzonukleazą w porównaniu z odpowiednimi niemodyfikowanymi końcami. Na przykład, końce 5' i 3' mogą być stabilizowane przez wprowadzenie do nich co najmniej jednej fosforanowej modyfikacji szkieletu. W zalecanym rozwiązaniu, co najmniej jedna fosforanowa modyfikacja szkieletu na każdym końcu jest niezależnie tiofosforanowym, ditiofosforanowym, metylofosfonianowym lub metylotiofosforanowym wiązaniem internukleotydowym. W innym rozwiązaniu, koniec odporny na degradację zawiera jeden lub więcej nukleotydowych jednostek połączonych przez peptydowe lub amidowe wiązania na końcu 3'. Oprócz opisanych poniżej stabilizowanych końców, również inne stabilizowane końce mogą być zastosowane.
Jak opisano powyżej, oligonukleotydy tu opisane zawierają wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego wewnątrz i ewentualnie w sąsiedztwie wewnętrznych dinukleotydów YG. Takie dinukleotydy YG są często częścią immunostymulujących motywów. Nie jest konieczne jednakże, by oligonukleotyd zawierał wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego wewnątrz każdego motywu immunostymulującego. Jako przykład, oligonukleotyd taki jak T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*t*c*g*T*T (SEQ ID NO: 242) zawierający cztery dinukleotydy CpG może posiadać wiązania fosfodiestrowe pomiędzy C i G drugiego, trzeciego, lub czwartego dinukleotydu CpG, i ich dowolną kombinację. Dodatkowe wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego mogą także być zachowane lub
PL 232 260 B1 ulec gwałtownemu rozpadowi w nerkach, pomimo tego, że są skądinąd „stabilizowanymi oligonukleotydami”. Przykładowo, SEQ ID NO: 242 ponadto zawiera dwa wewnętrzne dinukleotydy TG, z których jeden lub oba, samodzielnie lub w połączeniu z dowolnym wewnętrznym dinukleotydem CG lub kombinacją wewnętrznych dinukleotydów CG, mogą posiadać wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego.
Internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe jest typem wiązania charakterystycznym dla kwasów nukleinowych występujących w naturze. Jak pokazano na fig. 20, internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe zawiera atom fosforu pomiędzy dwoma mostkującymi atomami tlenu i związany także przez dwa dodatkowe atomy tlenu, jeden naładowany i drugi nieposiadający ładunku. Internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe jest szczególnie dogodne, gdy istotne jest zmniejszenie okresu półtrwania oligonukleotydu w tkance.
Wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego stanowi zawierająca atom fosforu grupa mostkująca, która jest chemicznie i/lub diastereomerycznie podobna do fosfodiestru. O stopniu podobieństwa do fosfodiesteru świadczy wrażliwość na trawienie nukleazą i zdolność do aktywacji RNazy H. Tak więc, np., fosfodiestrowe, lecz nie tiofosforanowe, oligonukleotydy są podatne na trawienie nukleazą, podczas gdy zarówno fosfodiestrowe jak i tiofosforanowe oligonukleotydy aktywują RNazę H. W dogodnym rozwiązaniu internukleotydowym wiązaniem typu fosfodiestrowego jest wiązanie boranofosforanowe (lub równoważnie boranofosfonianowe). Opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5177198; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5859231; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 6160109; opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 6207819; Sergueev i in., (1998) J Am Chem Soc 120: 9417-27. W innym dogodnym rozwiązaniu internukleotydowe wiązanie typu fosfodiestrowego jest wiązaniem tiofosforanowym o diasteromerycznie czystej konfiguracji Rp. Przyjmuje się, że wiązanie tiofosforanowe o diasteromerycznie czystej konfiguracji Rp jest bardziej podatne na trawienie nukleazą i jest skuteczniejsze przy aktywacji RNazy H niż wiązanie tiofosforanowe o mieszanej lub diastereomerycznie czystej konfiguracji Sp. Stereoizomery oligonukleotydów CpG są przedmiotem będącego jednocześnie w toku postępowania zgłoszenia patentowego St. Zjedn. Ameryki nr. 09/361575 złożonego 27 lipca 1999, i opublikowanego zgłoszenia PCT/US99/17100 (WO 00/06588). Należy zauważyć, że dla celów według wynalazku, termin „wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego” wyklucza konkretnie ditiofosforanowe i metylofosfonianowe wiązania internukleotydowe.
Cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego według wynalazku posiadają chimerowy szkielet. Dla celów niniejszego wynalazku chimerowy szkielet oznacza tu częściowo stabilizowany szkielet, w którym co najmniej jedno wiązanie internukleotydowe jest wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego, i w którym co najmniej jedno inne wiązanie internukleotydowe jest stabilizowanym wiązaniem internukleotydowym, w którym co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego i co najmniej jedno stabilizowane wiązanie są różne. Ponieważ boranofosfonianowe wiązania opisano jako stabilizowane w odniesieniu do wiązania fosfodiestrowego, dla celów chimerowych własności szkieletu, wiązania boranofosfonianowe można sklasyfikować albo jak o typu fosfodiestrowego albo jako stabilizowane, zależnie od kontekstu. Przykładowo, chimerowy szkielet tu opisany może w jednym rozwiązaniu zawierać co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe (fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego) i co najmniej jedno wiązanie boranofosfonianowe (stabilizowane). W innym rozwiązaniu chimerowy szkielet tu opisany może zawierać wiązania boranofosfonianowe (fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego) i tiofosforanowe (stabilizowane). „Stabilizowane wiązanie internukleotydowe” używane jest w znaczeniu wiązania internukleotydowego, które jest względnie odporne na degradację in vivo (np. poprzez egzo- lub endonukleazę), w porównaniu z fosfodiestrowym wiązaniem internukleotydowym. Zgodnie z wynalazkiem stabilizowane wiązania internukleotydowe obejmują, bez ograniczeń, tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, i metylotiofosforanowe. Inne stabilizowane wiązania internukleotydowe obejmują, bez ograniczeń: peptydowe, alkilowe, defosfo, i inne jak opisano powyżej.
Zmodyfikowane szkielety takie jak tiofosforanowe można zsyntetyzować zautomatyzowanymi technikami chemicznymi z zastosowaniem albo grup fosforoamidowych lub H-fosfonianowych. Aryloi alkilofosfoniany można wytworzyć np. jak wskazano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4469863; a fosfotriestry alkilowe (w których naładowana grupa tlenowa jest alkilowana jak wskazano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5023243 i europejskim zgłoszeniu patentowym nr 092574) można wytworzyć przez zautomatyzowaną syntezę w fazie stałej stosując dostępne w handlu reagenty.
Opisano metody wytwarzania innych modyfikacji i substytucji w szkielecie DNA. Uhlmann E i in. (1990)
PL 232 260 B1
Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. Znane są także sposoby wytwarzania chimerowych oligonukleotydów. Takie techniki wskazano na przykład w opisach patentowych, Uhlmann i in.
Mieszany zmodyfikowany szkielet ODN można zsyntetyzować stosując dostępny w handlu syntetyzer DNA oraz standardową metodę amidofosforynową. (F. E. Eckstein, „Oligonukleotides and Analogues - A Practical Approach” IRL Press, Oxford, UK, 1991, i M. D. Matteucci i M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)). Po reakcji sprzęgania, połączenia typu PS (atom P-atom S) wprowadza się poprzez siarkowanie, z zastosowaniem odczynnika Beaucage'ego (R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan i S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0,075 M w acetonitrylu) lub disulfidu acetylofenylowego (PADS) i następnie prowadzi się reakcję acetylowania, stosując bezwodnik octowy, 2,6-lutydynę w tetrahydrofuranie (1:1:8; v:v:v) i N-metyloimidazol (16% w tetrahydrofuranie). Etap acetylowania przeprowadza się po reakcji siarkowania w celu zminimalizowania powstawania niepożądanego wiązania fosfodiestrowego (PO) w pozycjach, w których powinno się znajdować wiązanie tiofosforanowe. W przypadku wprowadzenia wiązania fosfodiestrowego, np. w dinukleotydzie CpG, pośredni związek fosforu (III) utlenia się, w wyniku działania roztworem jodu w układzie woda/pirydyna. Po oderwaniu od stałego nośnika i końcowym odbezpieczeniu przez potraktowanie stężonym amoniakiem (15 godzin w temperaturze 50°C), ODN analizuje się metodą HPLC na kolumnie Gen-Pak Fax (MiliporeWaters), stosując gradient NaCl (np. bufor A: 10 mM NaH2PO4 w acetonitrylu/wodzie = 1:4/v:v pH 6,8; bufor B: 10 mM NaH2PO4, 1,5 M NaCl w acetonitrylu/wodzie = 1:4/v:v; 5 do 60% B w ciągu 30 minut przy 1 ml/minutę) lub metodą żelowej elektroforezy kapilarnej. ODN można oczyścić metodą HPLC lub metodą FPLC na kolumnie Source High Performance (Amersham Pharmacia). Homogenne frakcje HPLC łączy się i odsala na kolumnie C18 lub przez ultrafiltrację. W celu potwierdzenia obliczonej masy ODN analizowano stosując spektrometrię masową MALDI-TOF.
Opisane tu kwasy nukleinowe mogą także zawierać inne modyfikacje. Obejmują one niejonowe analogi DNA, takie jak alkilo- i arylofosforany (w których naładowany tlen w grupie fosforanowej jest zastąpiony przez alkil lub grupę arylową), fosfodiester i fosfotriestry alkilowe, w których naładowana grupa tlenowa jest alkilowana. Wykazano także, że kwasy nukleinowe, które zawierają diol, taki jak glikol tetraetylenowy lub glikol heksaetylenowy, na jednym lub obu końcach, są zasadniczo odporne na degradację nukleazą.
Wielkość (tj. liczba reszt nukleotydowych w kwasie nukleinowym) immunostymulującego oligonukleotydu może także przyczyniać się do stymulującej aktywności oligonukleotydu. Dla ułatwiania wychwytu przez komórki, zalecane immunostymulujące oligonukleotydy mogą mieć minimalną długość 6 reszt nukleotydowych. Kwasy nukleinowe dowolnej wielkości powyżej 6 nukleotydów (nawet długości wielu kb) są zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznej według wynalazku o ile występuje wystarczająca ilość motywów immunostymulujących, jako że większe kwasy nukleinowe są degradowane wewnątrz komórek. Twórcy wynalazku przyjmują, że semi-miękkie oligonukleotydy tak krótkie jak 4 nukleotydowe mogą także być immunostymulujące jeśli mogą one być dostarczone do wnętrza komórki. W pewnych zalecanych tu rozwiązaniach immunostymulujące oligonukleotydy mają długość pomiędzy 4 i 100 nukleotydów. W typowych rozwiązaniach immunostymulujące oligonukleotydy mają długość pomiędzy 6 i 40 nukleotydów. W pewnych rozwiązaniach immunostymulujące oligonukleotydy mogą mieć długość pomiędzy 6 i 19 nukleotydów.
Oligonukleotydy według wynalazku są kwasami nukleinowymi, które zawierają specyficzne sekwencje o których wiadomo, że wywołują odpowiedź immunologiczną. Te specyficzne sekwencje, które wywołują odpowiedź immunologiczną określa się jako „motywy immunostymulujące”, a oligonukleotydy, które zawierają motywy immunostymulujące określa się jako „immunostymulujące cząsteczki kwasu nukleinowego” i równoważnie, „immunostymulujące kwasy nukleinowe” lub „immunostymulujące oligonukleotydy”. Immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku zawierają zatem co najmniej jeden motyw immunostymulujący. W zalecanym rozwiązaniu motyw immunostymulujący jest „wewnętrznym motywem immunostymulującym”. Termin „wewnętrzny motyw immunostymulujący” odnosi się do pozycji sekwencji motywu w dłuższej sekwencji kwasu nukleinowego, która jest dłuższa niż sekwencja motywu o co najmniej jeden nukleotyd związany z każdym z końców 5' i 3' sekwencji motywu immunostymulującego.
W pewnych rozwiązaniach według wynalazku immunostymulujące oligonukleotydy zawierają motywy immunostymulujące, które są „dinukleotydami CpG”. Dinukleotyd CpG może być metylowany lub niemetylowany. Immunostymulujący kwas nukleinowy zawierający co najmniej jeden niemetylowany diPL 232 260 Β1 nukleotyd CpG jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która zawiera niemetylowaną sekwencję dinukleotydową cytozyna-guanina (tj. niemetylowaną 5' cytydynę, po której występuje 3' guanozyna, związane wiązaniem fosforanowym), która aktywuje układ odpornościowy; takim immunostymulującym kwasem nukleinowym jest kwas nukleinowy CpG. Kwasy nukleinowe CpG ujawniono w kilku opublikowanych opisach patentowych, opublikowanych zgłoszeniach patentowych i innych publikacjach, obejmujących opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; i 6339068. Immunostymulujący kwas nukleinowy zawierający co najmniej jeden metylowany dinukleotyd CpG jest kwasem nukleinowym, który zawiera metylowaną sekwencję dinukleotydową cytozyna-guanina (tj. metylowaną 5' cytydynę, po której występuje 3' guanozyna, związane wiązaniem fosforanowym), aktywującym układ odpornościowy. W innych rozwiązaniach immunostymulujące oligonukleotydy nie zawierają dinukleotydów CpG. Te oligonukleotydy, które nie zawierają dinukleotydów CpG określa się jako oligonukleotydy bez sekwencji CpG, i posiadają one motywy immunostymulujące niebędące CpG. Wynalazek obejmuje zatem także kwasy nukleinowe z innego typu motywami immunostymulującymi, które mogą być metylowane lub niemetylowane. Opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy mogą następnie obejmować dowolną kombinację metylowanych i niemetylowanych motywów immunostymulujących CpG oraz niebędących CpG.
Co do kwasów nukleinowych CpG, ostatnio stwierdzono, że istnieją różne klasy kwasów nukleinowych CpG. Jedna klasa ma zdolność aktywacji limfocytów B, lecz względnie słabo indukuje produkcję IFN -a i aktywację komórek NK; tę klasę określono jako klasę B. Kwasy nukleinowe CpG klasy B są zazwyczaj całkowicie stabilizowane i zawierają niemetylowany dinukleotyd CpG w pewnym dogodnym kontekście zasad. Patrz, np. opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; i 6339068. Inna klasa silnie indukuje produkcję IFN-α i aktywację komórek NK, lecz względnie słabo stymuluje limfocyty B; tę klasę nazwano klasą A. Kwasy nukleinowe CpG klasy A zazwyczaj posiadają stabilizowane sekwencje poli-G na końcach 5' i 3' i palindromową sekwencję co najmniej 6 nukleotydów, zawierającą fosfodiestrowy dinukleotyd CpG. Patrz, np., opublikowane zgłoszenie patentowe PCT/US00/26527 (WO 01/22990). Jeszcze inna klasa kwasów nukleinowych CpG aktywuje limfocyty B i komórki NK i indukuje produkcję IFN-α; tę klasę nazwano klasą C. Kwasy nukleinowe CpG klasy C, jak pierwsze tu scharakteryzowane, zazwyczaj są całkowicie stabilizowane, obejmują sekwencje typu sekwencji klasy B i bogate w GC palindromowe lub prawie palindromowe. Tę klasę wskazano w będącym jednocześnie przedmiotem postępowania tymczasowym zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 60/313273, złożonym 17 sierpnia, 2001 i zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 10/224523, złożonym 19 sierpnia 2002. Pewne, nieograniczające przykłady kwasów nukleinowych klasy C obejmują:
SEQ ID Sekwencja
NO
275 T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
369 T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
370 T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C G*C*G*C*C*G
372
373
374
375
316
T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C’A'G*C*G*C*C*G T*C_G*A*CJ5*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G T*C_G*A*C_G*T+T*-C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
T*C G*C G*T*C G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G
T*C G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
Tak więc, wynalazek w jednym aspekcie wykorzystuje stwierdzenie, że specyficzne podklasy immunostymulujących oligonukleotydów CpG posiadające chimerowe szkielety są bardzo skuteczne
PL 232 260 Β1 w wywieraniu stymulującego wpływu na układ odpornościowy. Te kwasy nukleinowe CpG są terapeutycznie i profilaktycznie przydatne do stymulacji układu odpornościowego w leczeniu raka, chorób zakaźnych, alergii, astmy, choroby autoimmunologicznej, i innych zaburzeń i w celu poprawy ochrony przed zakażeniem drobnoustrojami oportunistycznymi występującym po chemioterapii nowotworów. Silna, choć zrównoważona, komórkowa i humoralna odpowiedź immunologiczna, będąca skutkiem stymulacji CpG, jest odbiciem własnego, naturalnego systemu obrony organizmu przed atakującymi patogenami i komórkami rakowymi.
Wynalazek wykorzystuje, w jednym aspekcie, stwierdzenie, że podzbiór immunostymulujących oligonukleotydów CpG wykazuje ulepszone właściwości stymulujące układ odpornościowy i zmniejszony wpływ prozapalny na nerki. W pewnych przypadkach, zapalenie nerek obserwowano u pacjentów, którym podawano oligonukleotydy zawierające wyłącznie grupy tiofosforanowe. Przyjmuje się, że opisane tu chimerowe kwasy nukleinowe wywołują mniejszą reakcję zapalną nerek niż oligonukleotydy zawierające wyłącznie grupy tiofosforanowe. Ponadto te oligonukleotydy bardzo skutecznie stymulują odpowiedź immunologiczną. Tak więc fosfodiestrowy region cząsteczki nie zmniejszył jej skuteczności.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG, które są zalecane, opisuje jeden spośród następujących 6 wzorów ogólnych:
5ł T*C*G*T*CGTnTGAN]CGN2*T*T 3’ (SEQ IDNO:296),
5’ T*C*G*(T*/A*)IN3CGTTTTN4CGNs*T*T 3’ (SEQ ID NO:301),
5’ T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO:307),
5’ T*C G(N6C_G N7)2-3T*C_G*T*T 3’ (SEQ ID NO:311-312),
5’ T*T*GXtX2TGX3X4T*T*T*T*NioT*T*T*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO:331) i 5’ T*CGCGNsCGCGC*GN9 3’ (SEQ IDNO:332).
W tych wzorach N oznacza dowolny nukleotyd, Ni oznacza 0-6 nukleotydów, N2 oznacza 0-7 nukleotydów, N3 oznacza 0-4 nukleotydów, N4 oznacza 1-5 nukleotydów, N5 oznacza 0-7 nukleotydów, Νθ i N7 mają niezależnie długość pomiędzy 1 i 5 nukleotydów, Ne ma długość pomiędzy 4 i 10 nukleotydów, Ng ma długość pomiędzy 0 i 3 nukleotydów I, przy czym N10 ma długość pomiędzy 4 i 8 nukleotydów. Χ1, Χ2, Χ3 i X4 oznaczają niezależnie C lub G. Wzory przedstawiają podzbiory z klasy oligonukleotydów CpG, które wykazują doskonałe właściwości stymulujące układ odpornościowy i dodatkowo były wrażliwsze na degradację w organizmie niż oligonukleotydy zawierające wyłącznie grupy tiofosforanowe. Oznaczenie 5' we wzorze odnosi się do wolnego końca 5' oligonukleotydu, a 3' odnosi się do wolnego końca 3' oligonukleotydu.
Symbol * stosowany we wzorach oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być stabilizowane lub niestabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 2-3 internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe. W pewnych rozwiązaniach zalecane jest, by oligonukleotydy zawierały 3-6 wiązań fosfodiestrowych. W pewnych przypadkach wiązania pomiędzy motywami CG są fosfodiestrowe, a w innych przypadkach są one wiązaniami tiofosforanowymi lub innymi stabilizowanymi wiązaniami.
Inne wzory obejmują 5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO: 368), przy czym co najmniej jeden dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe. lub typu fosfodiestrowego, i oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe i 5'GNC 3', przy czym N oznacza sekwencję kwasu nukleinowego o długości 4-10 nukleotydów i zawiera co najmniej 50% T i nie zawiera dinukleotydu CG, i oligonukleotyd ten zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
PL 232 260 Β1
Oligonukleotyd może mieć strukturę wybraną spośród:
5’ T*C*G*T*C*G*'rTTTGAN|C*G+N2*T*T 3’ (SEQ ID NO:296),
5’ T*C*G+T*C*G*T*T_T_T_GANlC*G*N1*T*T 3’ (SEQ ID NO:296),
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_N)C*G*N3*T*T 3’ (SEQ ID NO:296),
5’ T*C*G*(TVA*)TN1CGTTTTN4C*G*Ni*T*T 3’ (SEQ ID NO:301),
5’ T*C*G*A*T*N3C*G*TTTTN4C_G_*Ni*T*T 3’ (SEQ ID NO:302),
5’ T*C*G*T*T*N3C_G_TTTTN4CGN5*T*T 3’ (SEQ ID NO:303),
5’ T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T3’ (SEQ ID NO:307),
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T3’ (SEQ ID NO.-308), lub
5’ T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_GJT_C,G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO:309).
Symbol _ w tych strukturach oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
Pewne dogodne przykłady struktur obejmują następujące:
5‘ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T3’ (SEQ ID NO: 327),
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 328), 5’ T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T3’ (SEQ ID NO: 324), 5’
T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 325),
5’ T*C*G*A*T*C+G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 323),
5’ T*C*G*T*T*T*T*G*A C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 326),
5’ T*C*G*T’,!C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 322),
5’ T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 313),
5’ T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 314),
5’ T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C__G*T*T*T*T*T*T*T3’ (SEQ ID NO:
319),
5’ T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 316),
5’ T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G 3’ (SEQ IDNO:317),
5’ T*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T<IT*T*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 320), 5’ T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 321), T*CG*T*C-G*T*T, C-G*T*C-G*T*T*T, G*T*C-G*T*T*T*T, T*C-G*T*T*T*T*G, CG*T*T*T*T*G*A, T*T*T*T*G*A*C-G, T*T*T*G*A*C-G*T, T*T*G*A*C-G*T*T,
T*G*A*C-G*T*T*T, G*A*C-G*T*T*T*T, A*C-G*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*T,
T*T*T*T*G*T*C-G, T*T*T*G*T*C-G*T, G*T*T*T*T*G*T*C iufe T*T*G*T*C-G*T*T,
Immunostymulujące oligonukleotydy na ogół mają długość w zakresie pomiędzy 4 i 100, a w pewnych rozwiązaniach 10 i 40. Długość może mieścić się w zakresie pomiędzy 16 i 24 nukleotydów.
PL 232 260 B1
Terminy „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” obejmują także kwasy nukleinowe lub oligonukleotydy z podstawieniami lub modyfikacjami, takimi jak w zasadach i/lub cukrach. Na przykład obejmują one kwasy nukleinowe posiadające cukry szkieletu, które są kowalencyjnie przyłączone do grup organicznych o małej masie cząsteczkowej, innych niż grupa hydroksylowa w pozycji 2' i innych niż grupa fosforanowa lub grupa hydroksylowa w pozycji 5'. Tak więc zmodyfikowane kwasy nukleinowe mogą zawierać 2'-O-alkilowaną grupę rybozylową. Ponadto, zmodyfikowane kwasy nukleinowe mogą obejmować cukry takie jak arabinoza lub 2'-fluoroarabinoza zamiast rybozy. Tak więc kwasy nukleinowe mogą być heterogenne pod względem składu szkieletu, tym samym zawierając dowolną możliwą kombinację polimerycznych jednostek związanych razem, taką jak kwasy peptydonukleinowe (które posiadają szkielet aminokwasowy z zasadami nukleotydowymi).
Kwasy nukleinowe zawierają także podstawione puryny i pirymidyny, takie jak zmodyfikowana C-5 propynopirymidyna i 7-deaza-(7-podstawiona)puryna. Wagner RW i in. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Puryny i pirymidyny zawierają między innymi adeninę, cytozynę, guaninę, tyminę, 5-metylocytozynę, 5-hydroksycytozynę, 5-fluorocytozynę, 2-aminopurynę, 2-amino-6-chloropurynę, 2,6-diaminopurynę, hipoksantynę i inne naturalnie występujące i niewystępujące w naturze zasady kwasów nukleinowych, podstawione i niepodstawione grupami aromatycznymi. Inne tego typu modyfikacje są dobrze znane fachowcom w dziedzinie.
Opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy mogą zawierać różne chemiczne modyfikacje i podstawienia, w porównaniu z występującymi w naturze RNA i DNA, dotyczące fosfodiestrowego mostka internukleotydowego, jednostki β-D-rybozy i/lub naturalnie występujących zasad nukleotydów (adenina, guanina, cytozyna, tymina, uracyl). Przykłady chemicznych modyfikacji są znane specjalistom i opisane, np. w Uhlmann E i in. (1990) Chem Rev 90: 543; „Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, red. S. Agrawal, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST i in. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36: 107-129; i Hunziker J i in. (1995) Mod Synth Methods 7: 331-417. Oligonukleotyd tu opisany może posiadać jedną lub więcej modyfikacji, przy czym każda modyfikacja znajduje się na określonym internukleotydowym mostku fosfodiestrowym i/lub na określonej jednostce β-D-rybozy i/lub na naturalnie występującej zasadzie nukleotydowej w określonej pozycji w porównaniu z oligonukleotydem o takiej samej sekwencji, który składa się z naturalnego DNA lub RNA.
Przykładowo, opisano tu oligonukleotyd, który może zawierać jedną lub więcej modyfikacji i w którym każda modyfikacja jest niezależnie wybrana spośród takich jak:
a) zastąpienie internukleotydowego mostka fosfodiestrowego znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu przez zmodyfikowany mostek internukleotydowy,
b) zastąpienie fosfodiestrowego mostka znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu przez mostek defosfo,
c) zastąpienie jednostki fosforanu cukru ze szkieletu fosforanowo-węglowodanowego inną jednostką,
d) zastąpienie jednostki β-D-rybozowej zmodyfikowaną jednostką cukrową, i
e) zastąpienie naturalnej zasady nukleotydowej zmodyfikowaną zasadą nukleotydową.
Bardziej szczegółowe przykłady chemicznych modyfikacji oligonukleotydu są takie jak następuje. Internukleotydowy mostek fosfodiestrowy znajdujący się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu można zastąpić zmodyfikowanym internukleotydowym mostkiem, przy czym zmodyfikowany mostek internukleotydowy jest np. wybrany spośród mostków, takich jak mostek tiofosforanowy, ditiofosforanowy, NR1R2-fosforoamidowy, boranofosforanowy, α-hydroksybenzylofosfonianowy, estrowy fosforano-(C1-C21)-Oalkilowy, estrowy fosforano-[(C6-C12)arylo-(C6-C21)-O-alkilowy], (C1-C8)alkilofosfonianowy i/lub (C6-C12)arylofosfonianowy, (C7-C12)-a-hydroksymetyloarylowy (np. ujawniony w zgłoszeniu WO 95/01363), w których (C6-C12)aryl, (C6-C20)aryl i (C6-C14)aryl są ewentualnie podstawione przez atom fluorowca, alkil, alkoksy, nitro, cyjano, i w których R1 i R2 oznaczają, niezależnie od siebie, atom wodoru, (C1-C18)-alkil, (C6-C20)aryl, (C6-C14)-arylo-(C1-C8)-alkil, dogodnie atom wodoru, (C1-Cs)-alkil, dogodnie (C1-C4)-alkil i/lub metoksyetyl, lub R1 i R2 tworzą razem z atomem azotu, do którego są przyłączone 5-6-członowy heterocykliczny pierścień, który może dodatkowo zawierać kolejne heteroatomy, takie jak atom O, S i N.
Zastąpienie fosfodiestrowego mostka znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu przez defosfo mostek (defosfo mostki opisane np. w: Uhlmann E i Peyman A w „Methods in Molecular Biology”, tom 20, „Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, red. S. Agrawal, Humana Press, Totowa 1993, rozdział 16, str. 355 ff), przy czym defosfo mostek jest np. wybrany spośród takich jak defosfo mostki
PL 232 260 B1 typu formacetalu, 3'-tioformacetalu, metylohydroksyloaminy, oksymu, metylenodimetylohydrazo, dimetylensulfonu i/lub sililu.
Jednostkę fosforanu cukru (tj. β-D-ryboza i fosfodiestrowy mostek internukleotydowy razem tworzące jednostkę fosforanu cukru) w szkielecie fosforanowo-cukrowym (tj. fosforowo-cukrowy szkielet składa się z jednostek fosforanu cukru) można zastąpić inną jednostką, przy czym inna jednostka jest np. odpowiednia do konstrukcji „morfolinowego” oligomeru (jak opisano, np. w: Stirchak EP i in. (1989) Nucleic Acids Res 17: 6129-41), tj. np. zastąpić jednostką pochodną morfolino; lub można skonstruować poliamid kwasu nukleinowego („PNA”; jak opisano np. w: Nielsen PE i in. (1994) Bioconjug Chem 5: 3-7), tj. np. zastąpienie jednostki szkieletu PNA, np., 2-aminoetyloglicyną.
Jednostkę β-rybozy lub jednostkę β-D-2'-deoksyrybozy można zastąpić zmodyfikowaną jednostką cukrową, przy czym zmodyfikowana jednostka cukrowa jest wybrana np. spośród takich jak β-D-ryboza, a-D-2'-deoksyryboza, L-2'-deoksyryboza, 2'-F-2'-deoksyryboza, 2'-F-arabinoza, 2'-O-(C1-C6)alkilo-ryboza, dogodnie 2'-O-(C1-C6)alkilo-rybozą jest 2'-O-metyloryboza, 2'-O-(C2-C6)alkenyloryboza, 2'-[O-(C1-C6)alkilo-O-(C1-C6)alkilo]-ryboza, 2'-NH2-2'-deoksyryboza, β-D-ksylo-furanoza, a-arabinofuranoza, 2,4-dideoksy^-D-erytro-hekso-piranoza, i karbocykliczne (opisane np. przez Froehler'a J (1992) Am Chem Soc 114: 8320) i/lub otwartołańcuchowe analogi cukrowe (opisane, np. w: Vandendriessche i in. (1993) Tetrahedron 49: 7223) i/lub analogi cukrów bicyklicznych (opisane, np. w: Tarkov M i in. (1993) Helv Chim Acta 76: 481).
W pewnych dogodnych rozwiązaniach cukier oznacza 2'-O-metylorybozę, szczególnie dla jednego lub obu nukleotydów związanych internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego.
Kwasy nukleinowe zawierają także podstawione puryny i pirymidyny takie jak zmodyfikowane zasady, jak C-5 propynopirymidyna i 7-deazo-7-(podstawiona)puryna. Wagner RW i in. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Puryny i pirymidyny obejmują między innymi adeninę, cytozynę, guaninę, i tyminę i inne naturalnie występujące i niewystępujące w naturze zasady nukleotydowe, podstawione i niepodstawione grupami aromatycznymi.
Zmodyfikowana zasada oznacza dowolną zasadę, która jest chemicznie różna od naturalnie występujących zasad zazwyczaj znajdowanych w DNA i RNA, takich jak T, C, G, A, i U, lecz która ma takie same podstawowe struktury chemiczne jak te naturalnie występujące zasady. Zmodyfikowana zasada nukleotydowa może być, wybrana np. spośród takich jak hipoksantyna, uracyl, dihydrouracyl, pseudouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-aminouracyl, 5-(C1-C6)-alkilouracyl, 5-(C2-C6)-alkenylouracyl, 5-(C2-C6)-alkinylouracyl, 5-(hydroksymetylo)uracyl, 5-chlorouracyl, 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-hydroksycytozyna, 5-(C1-C6)-alkilocytozyna, 5-(C2-C6)-alkenylocytozyna, 5-(C2-C6)-alkinylocytozyna, 5-chlorocytozyna, 5-fluorocytozyna, 5-bromocytozyna, N2-dimetyloguanina, 2,4-diaminopuryna, 8-azapuryna, podstawiona 7-deazapuryna, zwłaszcza 7-deazo-7-(podstawiona) i/lub 7-deazo-8-(podstawiona)puryna, 5-hydroksymetylocytozyna, N4-alkilocytozyna, np. N4-etylocytozyna, 5-hydroksydeoksycytydyna, 5-hydroksymetylodeoksycytydyna, N4-alkilodeoksycytydyna, np. N4-etylodeoksycytydyna, 6-tiodeoksyguanozyna, i deoksyrybonukleotydy nitropirolu, C5-propynylopirymidyna, i diaminopuryna np. 2,6-diaminopuryna, inozyna, 5-metylocytozyna, 2-aminopuryna, 2-amino-6-chloropuryna, hipoksantyna lub inne modyfikacje naturalnie występujących zasady nukleotydowych. Tę listę rozumie się jako przykładową i nie należy jej interpretować jako ograniczenie.
W poszczególnych opisanych tu wzorach określono szereg modyfikacji zasad. Na przykład literę Y stosuje się w odniesieniu do nukleotydu zawierającego cytozynę lub zmodyfikowaną cytozynę. Stosowana tu zmodyfikowana cytozyna jest naturalnie występującym lub niewystępującym w naturze analogiem cytozyny będącym zasadą pirymidynową, który może zastąpić tę zasadę bez osłabiania aktywności immunostymulującej oligonukleotydu. Zmodyfikowane cytozyny obejmują między innymi takie jak 5-podstawione cytozyny (np. 5-metylocytozyna, 5-fluoro-cytozyna, 5-chloro-cytozyna, 5-bromocytozyna, 5-jodocytozyna, 5-hydroksycytozyna, hydroksymetylocytozyna, 5-difluorometylocytozyna, i niepodstawiona lub podstawiona 5-alkinylo-cytozyna), podstawione cytozyny, N4-podstawione cytozyny (np. N4-etylocytozyna), 5-aza-cytozyna, 2-tiocytozyna, izo-cytozyna, pseudo-izocytozyna, cytozynowe analogi ze skondensowanymi układami pierścieniowymi (np. N,N'-propyleno-cytozyna lub fenoksazyna) oraz uracyl i jego pochodne (np. 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-bromowinylouracyl, 4-tio-uracyl, 5-hydroksyuracyl, 5-propynylouracyl). Niektóre z dogodnych cytozyn obejmują 5-metylocytozynę, 5-fluorocytozynę, 5-hydroksycytozynę, 5-hydroksymetylocytozynę, i N4-etylocytozynę. W innym rozwiązaniu, zasada cytozynowa jest podstawiona przez uniwersalną zasadę (np. 3-nitropirol, zasada P), aromatyczny układ pierścieniowy (np. fluorobenzen lub difluorobenzen) lub atom wodoru (dSpacer).
PL 232 260 B1
Literę Z stosuje się w odniesieniu do guaniny lub zmodyfikowanej zasady guaninowej. Stosowana tu zmodyfikowana guanina jest naturalnie występującym lub niewystępującym w naturze analogiem guaniny będącym zasadą purynową, który może zastąpić tą zasadę bez osłabiania aktywności immunostymulującej oligonukleotydu. Zmodyfikowane guaniny obejmują między innymi takie jak 7-deazaguanina, 7-deaza-7-podstawiona guanina (taka jak 7-deaza-7-(C2-C6)alkinyloguanina), 7-deaza-8-podstawiona guanina, hipoksantyna, N2-podstawione guaniny (np. N2-metylo-guanina), 5-amino-3-metylo-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirymidyno-2,7-dion, 2,6-diaminopuryna, 2-arainopuryna, puryna, indol, adenina, podstawione adeniny (np. N6-metylo-adenina, 8-okso-adenina) 8-podstawiona guanina (np. 8-hydroksyguanina i 8-bromoguanina) i 6-tioguanina. W innym rozwiązaniu, zasada guaninowa jest podstawiona przez uniwersalną zasadę (np. 4-metyloindol, 5-nitroindol i zasada K), aromatyczny układ pierścieniowy (np. benzoimidazol lub dichlorobenzoimidazol, amid kwasu 1-metylo-1H-[1,2,4]triazolo-3-karboksylowego) lub atom wodoru (dSpacer).
Oligonukleotydy mogą posiadać jeden lub więcej dostępnych końców 5'. Możliwe jest wytworzenie zmodyfikowanych oligonukleotydów posiadających dwa takie końce 5'. Można to osiągnąć na przykład przez połączenie dwóch oligonukleotydów poprzez wiązanie 3'-3' w celu wytworzenia oligonukleotydu mającego jeden lub dwa dostępne końce 5'. Wiązanie 3'-3' może być fosfodiestrowym, tiofosforanowym lub innym dowolnym zmodyfikowanym mostkiem internukleotydowym. Sposoby tworzenia takich wiązań są znane w dziedzinie. Na przykład takie wiązania opisano w: Seliger, H.; i in., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77 i Jiang, i in., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro a Nucleotides and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.
Ponadto, 3'3'-połączone kwasy nukleinowe, w których wiązanie pomiędzy 3'-końcowymi nukleotydami nie jest fosfodiestrowym, tiofosforanowym lub innym zmodyfikowanym mostkiem, można wytworzyć stosując dodatkową grupę dystansującą, taką jak grupa tri- lub tetra-etylenoglikolofosforowa (Durand, M. i in., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5658738, i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5668265). Alternatywnie, nienukleotydową grupę łączącą można wytworzyć z etanodiolu, propanodiolu, lub z niezasadowej jednostki deoksyrybozowej (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence i in., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attache to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) z zastosowaniem standardowej chemii związków fosforoamidowych. Nienukleotydowe grupy łączące można wprowadzać raz lub wiele razy, lub łączyć ze sobą umożliwiając dowolną pożądaną odległość pomiędzy końcami 3' dwóch łączonych ODN.
Ostatnio doniesiono, że oligonukleotydy CpG wydają się wywierać swój efekt immunostymulujący poprzez wzajemne oddziaływanie z receptorem Toll-podobnym 9 (TLR9). Hemmi H i in. (2000) Nature 408: 740-5. Aktywność sygnalizacyjną TLR9 można zatem zmierzyć w odpowiedzi na oligonukleotyd CpG lub inny immunostymulujący kwas nukleinowy przez pomiar NF-kB, sygnałów związanych z NF-kB oraz odpowiednich zdarzeń i związków pośrednich w górę względem NF-kB.
Aby można było zastosować oligonukleotydy według wynalazku, można je syntetyzować de novo, stosując dowolny z wielu sposobów dobrze znanych w dziedzinie. Przykładowo, sposób z zastosowaniem b-cyjanoetyloamidofosforowym (Beaucage, S.L., i Caruthers, M.H., Tet. Let. 22: 1859, 1981); sposób z zastosowaniem H-fosfonianu (Garegg i in., Tet. Let. 27: 4051-4054, 1986; Froehler i in., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407, 1986; Garegg i in., Tet. Let. 27: 4055-4058, 1986, Gaffney i in., Tet. Let. 29: 2619-2622, 1988). Te związki chemiczne można otrzymać z zastosowaniem rozmaitych zautomatyzowanych syntetyzerów kwasów nukleinowych dostępnych na rynku. Te oligonukleotydy określa się jako syntetyczne oligonukleotydy. Wyizolowany oligonukleotyd na ogół oznacza oligonukleotyd, który izoluje się ze składników, z którymi jest zazwyczaj związany w naturze. Jako przykład, wyizolowanym oligonukleotydem może być taki, który izoluje się z komórki, z jądra, z mitochondriów lub z chromatyny.
Te oligonukleotydy są częściowo odporne na degradację (np. są stabilizowane). Termin „cząsteczka stabilizowanego oligonukleotydu” oznacza oligonukleotyd, który jest względnie odporny na degradację in vivo (np. przez egzo- lub endonukleazę). Stabilizację kwasu nukleinowego można przeprowadzić przez modyfikacje szkieletu. Oligonukleotydy mające wiązania tiofosforanowe zapewniają maksymalną aktywność i chronią oligonukleotyd przed degradacją przez wewnątrzkomórkowe egzo- i endonukleazy. Inne zmodyfikowane oligonukleotydy obejmują kwasy nukleinowe o zmodyfikowanych wiązaniach fosfodiestrowych, kombinacje kwasu nukleinowego zawierającego wiązania fosfodiestrowe i tiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe, ditiofosforanowe, p-etoksy, i ich kombinacje.
PL 232 260 B1
Zmodyfikowane szkielety, takie jak zawierające wiązania tiofosforanowe, można zsyntetyzować stosując zautomatyzowane techniki z zastosowaniem albo amidofosforanu albo związków H-fosfonianowych. Arylo- i alkilofosfoniany można wytworzyć np. jak wskazano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4469863; a fosfotriestry alkilowe (w których obdarzony ładunkiem atom tlenu jest alkilowany jak wskazano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5023243 i europejskim opisie patentowym nr 092574) można wytworzyć metodą zautomatyzowanej syntezy w fazie stałej stosując dostępne w handlu reagenty. Opisano sposoby wprowadzania innych modyfikacji i podstawień DNA (np. Uhlmann, E. i Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).
Inne stabilizowane oligonukleotydy obejmują: niejonowe analogi DNA, takie jak alkilo- i arylofosforany (w których obdarzony ładunkiem tlen z grupy fosfonianowej jest zastąpiony przez alkil lub grupę arylową), fosfodiester i fosfotriestry alkilowe, w których obdarzony ładunkiem atom tlenu jest alkilowany. Wykazano także, że kwasy nukleinowe, które zawierają diol, taki jak glikol tetraetylenowy lub glikol heksaetylenowy, na jednym lub obydwu końcach, są w zasadzie odporne na degradację nukleazą.
Podczas gdy działanie CpG u myszy jest dobrze zbadane, informacje dotyczące ludzkiego organizmu są ograniczone. Zawierające wiązania tiofosforanowe oligonukleotydy CpG o silnej stymulującej aktywności względem układu myszy wykazują niższą aktywność względem ludzkich i innych niepochodzących od gryzoni komórek układu odpornościowego. W przykładach opisano tworzenie ludzkich motywów CpG i charakterystykę ich wpływu oraz mechanizmy działania na ludzkie komórki PBMC, np. limfocyty B i komórki NK. DNA zawierający te motywy CpG i częściowo zmodyfikowane szkielety silnie stymulował ludzkie komórki krwi obwodowej do produkcji IL-6, IL-10, IP-10, TNF-α, IFN-a i IFN-γ. Poziom IFN-γ zwiększył się ponad poziomy kontrolne. Komórki NK i T pobudzono także do ekspresji CD69 w większych ilościach.
Stwierdzono także, że podgrupa immunostymulujących oligonukleotydów CpG ma silny wpływ stymulujący układ odpornościowy na ludzkie komórki, takie jak komórki NK, co sugeruje, że te immunostymulujące oligonukleotydy CpG są skutecznymi środkami terapeutycznymi do szczepienia ludzi, w immunoterapii raka, immunoterapii astmy, do ogólnego wzmocnienia funkcji immunologicznych, ułatwienia regeneracji układu krwiotwórczego po napromieniowaniu lub chemioterapii, chorobie autoimmunologicznej i do innych zastosowań jako modulatory immunologiczne.
Tak więc immunostymulujące oligonukleotydy CpG są przydatne w pewnych aspektach wynalazku jako szczepionka do leczenia pacjenta, u którego istnieje ryzyko rozwoju alergii lub astmy, infekcji organizmem zakaźnym lub nowotworu, w którym zidentyfikowano specyficzny antygen nowotworowy. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także podawać bez antygenu lub alergenu w celu zabezpieczenia przed infekcją, alergią lub nowotworem, i w tym przypadku powtórzone dawki mogą umożliwić długoterminową ochronę. Pacjent zagrożony, w znaczeniu tu stosowanym, oznacza p acjenta, co do którego istnieje jakiekolwiek ryzyko ekspozycji na patogen wywołujący infekcję lub nowotwór, lub alergen lub ryzyko rozwoju nowotworu. Na przykład, pacjent zagrożony może być pacjentem, który planuje podróż w obszar, na którym występuje określony typ czynnika zakaźnego lub może być pacjentem, który poprzez styl życia lub postępowanie lecznicze jest narażony na kontakt z płynami ustrojowymi, które mogą zawierać organizmy wywołujące infekcje lub bezpośrednio na kontakt z takim organizmem lub nawet dowolnym pacjentem żyjącym na obszarze, na którym zidentyfikowano organizm wywołujący infekcję lub alergen. Termin pacjenci zagrożeni wystąpieniem infekcji obejmuje także ogół populacji, której placówka medyczna zaleca szczepienie z zastosowaniem określonego antygenu organizmu wywołującego infekcję. Jeśli antygen oznacza alergen i u pacjenta rozwija się reakcja alergiczna na ten konkretny antygen i pacjent może być narażony na kontakt z antygenem, tj. podczas okresu pylenia, to taki pacjent jest narażony na ekspozycję na ten antygen. Termin pacjent zagrożony rozwojem alergii lub astmy obejmuje tych pacjentów, których zidentyfikowano jako mających alergię lub astmę, lecz którzy nie wykazują czynnej choroby podczas leczenia immunostymulującymi oligonukleotydami CpG, jak również pacjentów, których określono jako zagrożonych wystąpieniem tych chorób ze względu na czynniki genetyczne lub środowiskowe.
Pacjent zagrożony rozwojem nowotworu oznacza takiego, u którego występuje duże prawdopodobieństwo rozwoju nowotworu. Termin ten obejmuje, na przykład, pacjentów wykazujących nieprawidłowość genetyczną, co do której wykazano, że jej obecność jest powiązana z większym prawdopodobieństwem wystąpienia nowotworu i pacjentów narażonych na środki wywołujące raka, takie jak tytoń, azbest, lub inne toksyny chemiczne, lub pacjenta, którego uprzednio leczono z powodu raka i u którego obecnie występuje remisja. Gdy pacjenta zagrożonego rozwojem nowotworu leczy się z zastosowaniem antygenu specyficznego dla typu nowotworu, którego rozwojem ten pacjent jest zagrożony, i immuno36
PL 232 260 B1 stymulującym oligonukleotydem CpG, organizm pacjenta może być zdolny do zniszczenia komórek nowotworowych w czasie ich rozwoju. Jeśli u pacjenta zaczyna rozwijać się nowotwór, powstanie u niego swoista odpowiedź immunologiczna na antygen tego nowotworu.
Oprócz zastosowania immunostymulujących oligonukleotydów CpG w leczeniu profilaktycznym, możliwe jest także ich zastosowanie w leczeniu pacjentów z infekcją, alergią, astmą, lub nowotworem.
Pacjent z infekcją oznacza pacjenta, który został narażony na zakaźny patogen, i u którego w organizmie nagle lub ciągle stwierdza się patogen na poziomie wykrywalnym. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można stosować w połączeniu z antygenem lub same, w celu nasilenia antygenowo swoistej odpowiedzi immunologicznej systemowej lub śluzówkowej zdolnej do obniżenia poziomu lub likwidacji zakaźnego patogenu. Stosowany tu termin choroba zakaźna oznacza chorobę będącą wynikiem obecności obcego mikroorganizmu w organizmie. Szczególnie ważne jest opracowanie skutecznych strategii szczepienia i leczenia w celu zabezpieczenia powierzchni śluzówek organizmu, które są głównym miejscem wnikania patogenu.
Pacjent z alergią oznacza pacjenta, u którego występuje reakcja alergiczna lub jest zagrożony rozwojem reakcji alergicznej w odpowiedzi na alergen. Termin alergia odnosi się do nabytej nadwrażliwości na substancję (alergen). Schorzenia alergiczne obejmują między innymi egzemę, katar sienny lub śluzówkowy nieżyt nosa, gorączkę sienną, zapalenie spojówek, astmę oskrzelową, pokrzywkę i alergie pokarmowe, oraz inne schorzenia atopowe.
Alergie są na ogół spowodowane wytwarzaniem przeciwciał IgE przeciw nieszkodliwym alergenom. Cytokiny, których produkcja jest wywoływana przez systemowe lub naśluzówkowe podawanie immunostymulujących oligonukleotydów CpG należą w przeważającej mierze do klasy zwanej Th1 (przykładami są IL-12, IP-10, IFN -a i IFN-γ) i indukują one odpowiedź immunologiczną, zarówno humoralną jak i komórkową. Inny główny typ odpowiedzi immunologicznej, który jest związany z produkcją cytokin IL-4 i IL-5, nazywa się odpowiedzią immunologiczną Th2. Wydaje się, że na ogół w chorobach alergicznych pośredniczą odpowiedzi immunologiczne typu Th2. Dzięki zdolności immunostymulujących oligonukleotydów CpG do przesunięcia odpowiedzi immunologicznej u pacjenta z dominacji Th2 (która jest związana z produkcją przeciwciał IgE i alergią) na zrównoważoną odpowiedź Th2/Th1 (która ma działanie chroniące przed reakcjami alergicznymi), w celu leczenia lub zapobiegania astmie i alergii, pacjentowi można podawać immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej dawce, wywołującej odpowiedź immunologiczną.
Zatem immunostymulujące oligonukleotydy CpG wykazują znaczącą użyteczność terapeutyczną w leczeniu stanów alergicznych i niealergicznych takich jak astma. Poziomy cytokin Th2, szczególnie IL-4 i IL-5, są podwyższone w drogach oddechowych pacjentów z astmą. Te cytokiny wzmagają ważne aspekty odpowiedzi zapalnej w astmie, obejmujące zmianę izotypu IgE, chemotaksję eozynofilów oraz aktywację i proliferację komórek tucznych. Cytokiny Th1, szczególnie IFN-γ i IL-12, mogą tłumić powstawanie klonów Th2 i produkcję cytokin Th2. Określenie astma odnosi się do zaburzenia układu oddechowego odznaczającego się zapaleniem, zwężeniem dróg oddechowych i zwiększoną reaktywnością dróg oddechowych na wdychane środki. Astma jest często, chociaż nie wyłącznie, związana z objawami atopowymi lub alergicznymi.
Pacjent z nowotworem oznacza pacjenta, u którego występują wykrywalne komórki nowotworowe. Nowotwór może być nowotworem złośliwym lub niezłośliwym. Te nowotwory lub guzy obejmują między innymi raka dróg żółciowych; nowotwór mózgu; raka sutka; raka szyjki macicy; nabłoniaka kosmówkowego; raka okrężnicy; raka endometrium; raka przełyku; raka żołądka; nowotwory śródnabłonkowe; chłoniaki; raka wątroby; raka płuc (np. drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego); czerniaka; nerwiaki niedojrzałe; raka jamy ustnej; raka jajnika; raka trzustki; raka stercza; raka odbytu; mięsaki; raka skóry; raka jąder; raka tarczycy; i nowotwór nerek, jak również inne raki i mięsaki. W jednym rozwiązaniu rakiem jest białaczka kosmatokomórkowa, przewlekła białaczka szpikowa, T-komórkowy chłoniak skórny, szpiczak mnogi, chłoniak grudkowy, czerniak złośliwy, rak płaskokomórkowy, rak nerkowokomórkowy, rak stercza, rak komórek przejściowych pęcherza moczowego, lub rak okrężnicy.
Pacjent oznacza pacjenta będącego człowiekiem lub kręgowcem, między innymi psa, kota, konia, krowę, świnię, owcę, kozę, indyka, kurę, naczelne, np. małpę, oraz ryby (gatunki hodowlane), np. łososia. Zatem oligonukleotydy według wynalazku można także stosować do leczenia raka i nowotworów, infekcji oraz alergii/astmy u pacjentów nie będących ludźmi. Rak jest jedną z wiodących przyczyn śmierci zwierząt domowych (tj. kotów i psów).
Stosowany tu termin leczyć, leczony, lub leczenie użyty w stosunku do zaburzenia, takiego jak choroba zakaźna, rak, alergia, lub astma odnosi się do leczenia profilaktycznego, które zwiększa odPL 232 260 B1 porność pacjenta na rozwój choroby (np. infekcji patogenem) lub, innymi słowy, zmniejsza prawdopodobieństwo, że u pacjenta rozwinie się choroba (np. zostanie zainfekowany patogenem) jak również leczenia po tym, jak u pacjenta rozwinęła się choroba, w celu zwalczenia choroby (np. złagodzenia lub usunięcia infekcji) lub zapobieżenia nasileniu choroby.
W przypadkach, gdy oligonukleotyd CpG podaje się z antygenem, pacjent może być narażony na kontakt z antygenem. Stosowany tu termin, narażony na kontakt, odnosi się albo do aktywnego etapu kontaktowania pacjenta z antygenem lub do pasywnej ekspozycji pacjenta na antygen in vivo. Sposoby aktywnej ekspozycji pacjenta na antygen są dobrze znane w dziedzinie. Na ogół, antygen podaje się pacjentowi bezpośrednio dowolnym sposobem, takim jak podawanie dożylne, domięśniowe, doustne, przezskórne, naśluzówkowe, donosowe, dotchawicze, lub podskórne. Antygen można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo. Sposoby podawania antygenu i immunostymulującego oligonukleotydu CpG opisano bardziej szczegółowo poniżej. Pacjent jest pasywnie eksponowany na antygen jeśli antygen ulega się ekspozycji na komórki układu odpornościowego w organizmie. Pacjent może być pasywnie eksponowany na antygen, na przykład, przez wniknięcie obcego patogenu do organizmu lub przez rozwój komórki nowotworowej eksprymującej obcy antygen na swej powierzchni.
Sposoby, w których pacjent jest pasywnie narażony na kontakt z antygenem mogą w szczególności zależeć od czasu podawania immunostymulującego oligonukleotydu CpG. Na przykład, u pacjenta, u którego występuje ryzyko rozwoju raka lub choroby zakaźnej lub odpowiedzi alergicznej lub astmy, pacjentowi można podawać immunostymulujący oligonukleotyd CpG regularnie, gdy takie ryzyko jest największe, tj. podczas okresu nasilenia alergii lub po ekspozycji na czynniki kancerogenne. Ponadto immunostymulujący oligonukleotyd CpG można podawać podróżnym przed ich podróżą do obcych krajów, gdzie mogą być zagrożeni ekspozycją na czynniki zakaźne. Podobnie immunostymulujący oligonukleotyd CpG można podawać żołnierzom lub cywilom zagrożonym ekspozycją na broń biologiczną w celu wywołania systemowej lub śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej na antygen, gdy i jeśli pacjent jest na nią narażony.
Antygen w stosowanym tu znaczeniu jest cząsteczką zdolną do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Antygeny obejmują między innymi komórki, ekstrakty komórkowe, białka, polipeptydy, peptydy, polisacharydy, koniugaty polisacharydowe, peptydowe i niepeptydowe mimetyki polisacharydów i inne cząsteczki, małe cząsteczki, lipidy, glikolipidy, węglowodany, wirusy i ekstrakty wirusowe oraz organizmy wielokomórkowe, takie jak pasożyty i alergeny. Termin antygen oznacza w szerokim znaczeniu cząsteczkę dowolnego typu, rozpoznawaną przez układ odpornościowy gospodarza jako obcą. Antygeny obejmują między innymi antygeny nowotworowe, antygeny drobnoustrojowe oraz alergen y.
Antygen nowotworowy w stosowanym tu znaczeniu jest związkiem, takim jak peptyd lub białko, związanym z powierzchnią komórki nowotworowej lub rakowej, i który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej, gdy jest eksprymowany na powierzchni komórki prezentującej antygen w kontekście cząsteczki MHC. Antygeny nowotworowe można wytworzyć z komórek rakowych albo przez przygotowanie nieoczyszczonych ekstraktów z komórek rakowych, np. jak opisano w: Cohen, i in., 1994, Cancer Research, 54: 1055, przez częściowe oczyszczenie antygenów, technologię rekombinacyjną, lub na drodze syntezy de novo znanych antygenów. Antygeny nowotworowe obejmują między innymi antygeny, które są eksprymowane rekombinacyjnie, immunogenną część, lub całość nowotworu lub raka. Takie antygeny można wyizolować lub wytworzyć rekombinacyjnie lub dowolnymi innymi sposobami znanymi w dziedzinie.
Antygen drobnoustrojowy w stosowanym tu znaczeniu jest antygenem mikroorganizmu i obejmuje między innymi wirusa, bakterie, pasożyty i grzyby. Takie antygeny obejmują nienaruszony mikroorganizm jak również naturalne izolaty i fragmenty lub ich pochodne, a także syntetyczne związki, które są identyczne z lub podobne do naturalnych antygenów mikroorganizmów i indukują odpowiedź immunologiczną swoistą dla tego mikroorganizmu. Związek jest podobny do naturalnego antygenu mikroorganizmu jeśli indukuje odpowiedź immunologiczną (humoralną i/lub komórkową) na naturalny antygen mikroorganizmu. Takie antygeny stosuje się rutynowo w dziedzinie i są dobrze znane fachowcom.
Przykłady wirusów, których występowanie stwierdzono u ludzi obejmują między innymi: Retroviridae (np. ludzki wirus niedoboru odporności, taki jak HIV-1 (określany także jako HDTV-III, LAVE lub HTLV-III/LAV, lub HIV-III; i inne izolaty, takie jak HIV-LP; Picornaviridae (np. wirusy polio, wirus zapalenia wątroby typu A; enterowirusy, ludzkie wirusy Coxsackie, rinowirusy, echowirusy); Calciviridae (np. szczepy, które powodują zapalenie żołądka i jelit); Togaviridae (np. wirusy końskiego zapalenia mózgu, wirusy różyczki); Flaviridae (np. wirusy dengi, wirusy zapalenia mózgu, wirusy żółtej febry); Coronoviridae (np. koronawirusy); Rhabdoviradae (np. wirusy pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, wirusy wścieklizny); Filoviridae (np. wirusy Ebola); Paramyxoviridae (np. wirusy grypy rzekomej, wirus świnki,
PL 232 260 B1 wirus odry, wirus syncytium nabłonka oddechowego); Ortomyxoviridae (np. wirusy grypy); Bungaviridae (np. wirusy Hantaan, wirusy bunga, phlebowirusy i wirusy Nairo); Arenaviridae (wirusy gorączki krwotocznej); Reoviridae (np. reowirusy, orbiwirusy i rotawirusy); Birnaviridae; Hepadnaviridae (wirus zapalenia wątroby typu B); Parvovirida (parwowirusy); Papovaviridae (wirusy brodawczaka, wirusy polioma); Adenoviridae (głównie adenowirusy); Herpesviridae (wirus opryszczki pospolitej (HSV) 1 i 2, wirus ospy wietrznej, wirusa cytomegalii (CMV), wirusa opryszczki; Poxviridae (wirusy ospy, wirusy krowianki, poksowirusy) ; i Iridoviridae (np. wirus afrykańskiego pomoru świń); i niesklasyfikowane wirusy (np. wirus zapalenia wątroby typu delta (uważany za defektywny wirus satelitarny wirusa zapalenia wątroby typu B), wirusy zapalenia wątroby typu nie-A, nie-B (klasa 1 = przenoszony wewnętrznie; klasa 2 = przenoszony parenteralnie (tj. zapalenia wątroby typu C); wirus Norwalk i wirusy pokrewne, i astrowirusy).
Antygenami dla zwierząt kręgowych mogą być zarówno bakterie gram-ujemne jak i gram-dodatnie. Takie bakterie gram-dodatnie obejmują między innymi gatunki Pasteurella, gatunki Staphylococci oraz gatunki Streptococcus. Bakterie gram-ujemne obejmują między innymi Escherichia coli, gatunki Pseudomonas, oraz gatunki Salmonella. Konkretne przykłady bakterii zakaźnych obejmują między innymi Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (np. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus grupy A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus grupy B), Streptococcus (grupa viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (gatunki beztlenowe), Streptococcus pneumoniae, patogenne Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopatiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, i Actinomyces israelli.
Przykłady grzybów obejmują Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.
Inne organizmy wywołujące infekcje (tj. Protista) obejmują Plasmodium spp., takie jak Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, i Plasmodium vivax i Toksoplasma gondii. Wszczepienne i/lub tkankowe pasożyty obejmują Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense i Trypanosoma rhodesiense (śpiączka afrykańska), Trypanosoma cruzi (choroba Chagasa) i Toxoplasma gondii.
Inne mikroorganizmy istotne z medycznego punktu widzenia opisano obszernie w literaturze, patrz np. C.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Wielka Brytania 1983.
Alergen stosuje się w odniesieniu do substancji (antygenu), która może indukować odpowiedź alergiczną lub stan astmatyczny u podatnego pacjenta. Lista alergenów jest ogromna i może obejmować pyłki, jady owadów, złuszczony naskórek zwierząt, zarodniki grzybów i leki (np. penicylinę). Przykłady występujących w naturze, zwierzęcych i roślinnych alergenów obejmują między innymi białka specyficzne dla następujących rodzajów: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (np. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium (np. Lolium perenne lub Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europea); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (np. Plantago lanceolata); Parietaria (np. Parietaria officinalis lub Parietaria judaica); Blattella (np. Blattella germanica); Apis (np. Apis multiflorum); Cupressus (np. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica i Cupressus macrocarpa); Juniperus (np. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis i Juniperus ashei); Thuya (np. Thuya orientalis); Chamaecyparis (np. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (np. Periplaneta americana); Agropyron (np. Agropyron repens); Secale (np. Secale cereale); Triticum (np. Triticum aestivum); Dactylis (np. Dactylis glomerata); Festuca (np. Festuca elatior); Poa (np. Poa pratensis lub Poa compressa); Avena (np. Avena sativa); Holcus (np. Holcus lanatus); Anthoxanthum (np. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (np. Arrhenatherum elatius); Agrostis (np. Agrostis alba); Phleum (np. Phleum pratense); Phalaris (np. Phalaris arundinacea); Paspalum (np. Paspalum notatum); Sorghum (np. Sorghum halepensis); i Bromus (np. Bromus inermis).
Stosowany tu termin zasadniczo oczyszczony odnosi się do polipeptydu, który jest w zasadzie wolny od innych białek, lipidów, węglowodanów lub innych substancji, z którymi jest połączony w naturze. Fachowiec w dziedzinie może oczyścić wirusowe lub bakteryjne polipeptydy, stosując standardowe techniki oczyszczania białek. Zasadniczo oczyszczony polipeptyd będzie często dawać pojedynczy główny prążek na nieredukującym żelu poliakrylamidowym. W przypadku częściowo glikozylowanych
PL 232 260 B1 polipeptydów, lub takich, które posiadają kilka kodonów start, może występować kilka prążków na nieredukującym żelu poliakrylamidowym, lecz będą one tworzyć charakterystyczny wzór dla tego polipeptydu. Czystość wirusowego lub bakteryjnego polipeptydu można także określić przez analizę sekwencji aminokwasowej końca aminowego. Wynalazek obejmuje inne typy antygenów niekodowanych przez wektor będący kwasem nukleinowym, takie jak polisacharydy, małe cząsteczki, mimetyki itd.
Opisane tu oligonukleotydy według wynalazku można podawać pacjentowi wraz ze środkiem przeciwdrobnoustrojowym. Środek przeciwdrobnoustrojowy, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do naturalnie występującego lub syntetycznego związku, który jest zdolny do zabicia lub hamowania rozwoju zakaźnych mikroorganizmów. Typ przydatnego środka przeciwdrobnoustrojowego będzie zależał od typu mikroorganizmu, którym pacjent jest zainfekowany lub zainfekowaniem którym jest zagrożony. Środki przeciwdrobnoustrojowe obejmują między innymi środki przeciwbakteryjne, środki przeciwwirusowe, środki przeciwgrzybowe i środki przeciwpasożytnicze. Wyrażenia takie jak „środek przeciwzakaźny”, „środek przeciwbakteryjny”, „środek przeciwwirusowy”, „środek przeciwgrzybowy”, „środek przeciwpasożytniczy” i „środki pasożytobójcze” posiadają dobrze ustalone znaczenia dla fachowców w dziedzinie i są zdefiniowane w standardowych tekstach medycznych. W skrócie, środki przeciwbakteryjne zabijają lub hamują rozwój bakterii, i obejmują one antybiotyki jak również inne syntetyczne lub naturalne związki mające podobne funkcje. Antybiotyki są cząsteczkami o małej masie cząsteczkowej, które powstają jako metabolity wtórne komórek, takich jak mikroorganizmy. Na ogół antybiotyki zaburzają jedną lub więcej bakteryjnych funkcji lub struktur, które są specyficzne dla mikroorganizmu i które nie występują w komórkach gospodarza. Środki przeciwwirusowe można wyizolować ze źródeł naturalnych lub zsyntetyzować i są one przydatne w zabijaniu lub hamowaniu rozwoju wirusów. Środki przeciwgrzybowe stosuje się do leczenia powierzchownych infekcji grzybiczych jak również oportunistycznych i pierwotnych układowych infekcji grzybiczych. Środki przeciwpasożytnicze zabijają lub hamują rozwój pasożytów.
Przykłady środków przeciwpasożytniczych, określanych także jako środki pasożytobójcze, przydatnych do podawania ludziom obejmują między innymi takie jak albendazol, amfoterycyna B, benznidazol, bitionol, chlorowodorek chlorochiny, fosforan chlorochiny, klindamycyna, dehydroemetyna, dietylokarbamazyna, furonian diloksanidu, eflornityna, furazolidon, glukokortykoidy, halofantryna, jodochinol, iwermektyna, mebendazol, meflochina, antymonian megluminy, melarsoprol, metrifonat, metronidazol, niklozamid, nifurtimoks, oksamnichina, paromomycyna, izetionian pentamidyny, piperazyna, prazykwantel, fosforan prymachiny, proguanil, pamoinian pyrantelu, pyrimetamina-sulfonoamidy, pyrimetaminasulfadoksyna, kwinakryna HCl, siarczan chininy, glukonian chinidyny, spiramycyna, stiboglukonian sodu (glukonian sodowoantymonowy), suramina, tetracyklina, doksycyklina, tiabendazol, tynidazol, trimetroprim sulfametoksazol oraz tryparsamid, które stosuje się samodzielnie lub w kombinacjach z innymi.
Środki przeciwbakteryjne zabijają albo hamują wzrost lub funkcjonowanie bakterii. Są dużą klasą środków przećiwbakteryjnych. Antybiotyki, które skutecznie zabijają lub hamują szerokie spektrum bakterii, określa się jako antybiotyki o szerokim spektrum działania. Inne typy antybiotyków są skuteczne głównie przeciw bakteriom z klasy bakterii gram-dodatnich lub gram-ujemnych. Te typy antybiotyków określa się jako antybiotyki o wąskim spektrum działania. Inne antybiotyki, skuteczne przeciw pojedynczym organizmom lub chorobom, a nie przeciw innym typom bakterii, określa się jako antybiotyki o ograniczonym spektrum działania. Środki przeciwbakteryjne czasem klasyfikuje się na podstawie ich podstawowego działania. Na ogół, środki przeciwbakteryjne są inhibitorami syntezy ściany komórkowej, inhibitorami syntezy błony komórkowej, inhibitorami syntezy białek, inhibitorami syntezy lub funkcji kwasów nukleinowych, oraz inhibitorami kompetycyjnymi.
Środki przeciwwirusowe są związkami, które zapobiegają zainfekowaniu komórek przez wirusy lub replikacji wirusa wewnątrz komórki. Leków przeciwwirusowych jest o wiele mniej niż leków przeciwbakteryjnych, ponieważ proces replikacji wirusa jest tak ściśle powiązany z replikacją DNA wewnątrz komórki gospodarza, że niespecyficzne środki przeciwwirusowe mogłyby często być toksyczne dla gospodarza. Istnieje kilka etapów, w ramach procesu infekcji wirusowej, które można zablokować lub hamować stosując środki przeciwwirusowe. Etapy te obejmują przyłączenie wirusa do komórki gospodarza (immunoglobuliny lub peptydy wiążące), odpłaszczenie wirusa (np. amantadyna), syntezę lub translację wirusowego mRNA (np. interferon), replikację wirusowego RNA lub DNA (np. analogi nukleotydów), dojrzewanie nowych białek wirusowych (np. inhibitory proteaz) oraz pączkowanie i uwalnianie wirusa.
Analogi nukleotydów są syntetycznymi związkami, które są podobne do nukleotydów, lecz które posiadają niekompletną lub nieprawidłową grupę deoksyrybozylową lub rybozylową. Gdy analogi
PL 232 260 B1 nukleotydów znajdą się w komórce, są fosforylowane, tworząc trifosforan, który współzawodniczy z prawidłowymi nukleotydami o włączenie do wirusowego DNA lub RNA. Gdy trifosforan utworzony z analogu nukleotydu włącza się do wydłużającego się łańcucha kwasu nukleinowego, powoduje to nieodwracalne połączenie z wirusową polimerazą i w ten sposób terminację łańcucha. Analogi nukleotydów obejmują między innymi acyklowir (stosowany do leczenia infekcji wirusem opryszczki zwykłej i wirusem ospy wietrznej), gancyklowir (przydatny w leczeniu infekcji cytomegalowirusem), idoksurydynę, rybawirynę (przydatną w leczeniu infekcji wirusem syncytium nabłonka oddechowego), dideoksyinozynę, dideoksycytydynę, zydowudynę (azydotymidynę), imikwimod i resimikwimod.
Interferony są cytokinami, które ulegają sekrecji przez komórki zainfekowane wirusem jak również komórki układu odpornościowego. Interferony działają przez wiązanie do specyficznych receptorów na komórkach sąsiadujących z zainfekowanymi komórkami, wywołując w komórce zmianę, która chroni ją przed zainfekowaniem przez wirus, α i β-interferon także indukują ekspresję cząsteczek MHC klasy I i klasy II na powierzchni zainfekowanych komórek, prowadząc w efekcie do zwiększonej prezentacji antygenów w celu rozpoznania przez komórki układu odpornościowego gospodarza. Interferony α i β są dostępne w postaciach zrekombinowanych i używane do leczenia przewlekłej infekcji zapalenia wątroby typu B i C. W dawkach, które są skuteczne w terapii przeciwwirusowej, interferony wykazują poważne skutki uboczne, takie jak gorączka, złe samopoczucie i spadek masy ciała.
Przydatne środki przeciwwirusowe obejmują między innymi takie jak immunoglobuliny, amantadyna, interferony, analogi nukleotydów, i inhibitory proteaz. Konkretne przykłady środków przeciwwirusowych obejmują między innymi takie jak acemannan; acyklowir; sól sodowa acyklowiru; adefowir, alowudyna; Alvircept Sudotox; chlorowodorek amantadyny; aranotyna; arildon; mesylan atewirdyny; awridyna (ang. avridine); cydofowir; cipamfilina; chlorowodorek cytarabiny; mesylan delawirdyny; descyklowir; didanozyna; disoksaryl; edoksudyna; enwiraden; enwiroksym; famcyklowir; chlorowodorek famotyny; fiacytabina; fialurydyna; fosarylat (ang. fosarylate); sól sodowa foskarnetu; sól sodowa fosfonetu (ang. fosfonet sodium); gancyklowir; sól sodowa gancyklowiru; idoksurydyna; ketoksal; lamiwudyna; lobukawir; chlorowodorek memotyny; metisazon; newirapina; pencyklowir; pirodawir (ang. pirodavir); rybawiryna; chlorowodorek rymantadyny; mesylan sakwinawiru; chlorowodorek somantadyny; soriwudyna (ang. sorivudine); statolon; stawudyna; chlorowodorek tiloronu; triflurydyna; chlorowodorek walacyklowiru; widarabina; fosforan widarabiny; sodofosforan widarabiny; wiroksym; zalcytabina; zydowudyna; i zinwiroksym.
Środki przeciwgrzybowe są przydatne w leczeniu i zapobieganiu infekcjom grzybami. Środki przeciwgrzybowe są czasem klasyfikowane według mechanizmu ich działania. Pewne środki przeciwgrzybowe działają jako inhibitory syntezy ściany komórkowej przez hamowanie syntazy glukozy. Obejmują one między innymi basiungin/ECB. Inne środki przeciwgrzybowe działają przez destabilizację integralności błony. Obejmują one między innymi imidazole, takie jak klotrimazol, sertakonazol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol i worikonazol, jak również FK 463, amfoterycyna B, BAY 38-9502, MK 991, pradimycyna, UK 292, butenafina i terbinafina. Inne środki przeciwgrzybowe działają przez rozkładanie chityny (np. chitynaza) lub immunosupresję (501 krem).
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można łączyć z innymi środkami terapeutycznymi, takimi jak środki wspomagające, w celu wzmożenia odpowiedzi immunologicznej. Immunostymulujący oligonukleotyd CpG i inny środek terapeutyczny można podawać jednocześnie lub sekwencyjnie. Przy jednoczesnym podawaniu z innymi środkami terapeutycznymi można je podawać w jednym lub w oddzielnych preparatach, lecz podawanych jednocześnie. Inne środki terapeutyczne podaje się kolejno po sobie i z immunostymulującym oligonukleotydem CpG, gdy podawanie innych środków terapeutycznych i immunostymulującego oligonukleotydu CpG jest rozdzielone w czasie. Rozdzielanie w czasie pomiędzy podawaniem tych związków może być kwestią minut lub może być dłuższe. Inne terapeutyczne środki obejmują między innymi adiuwanty (środki wspomagające), cytokiny, przeciwciała, antygeny, itp.
Opisane tu kompozycje można także podawać z adiuwantami niebędącymi kwasem nukleinowym. Adiuwant niebędący kwasem nukleinowym oznacza dowolną cząsteczkę lub związek oprócz opisanego tu immunostymulującego oligonukleotydu CpG, która może stymulować humoraIną i/lub komórkową odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty niebędące kwasem nukleinowym obejmują, na przykład, adiuwanty powodujące przedłużone działanie, adiuwanty stymulujące układ odpornościowy i adiuwanty, które powodują przedłużone działanie i stymulują układ odpornościowy.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są także przydatne jako adiuwanty śluzówkowe. Uprzednio stwierdzono, że przez śluzówkowe dostarczanie kwasów nukleinowych CpG wywołuje się zarówno odporność układową jak i śluzówkową. Zatem te oligonukleotydy można podawać w połączeniu z innymi podawanymi naśluzówkowo środkami wspomagającymi.
PL 232 260 B1
Odpowiedź immunologiczną można także wywołać lub wzmocnić przez jednoczesne podawanie lub kolinearną ekspresję cytokin (Bueler & Mulligan, 1996; Chow i in., 1997; Geissler i in., 1997; Iwasaki i in., 1997; Kim i in., 1997) lub cząsteczek kostymulujących B-7 (Iwasaki i in., 1997; Tsuji i in., 1997) z immunostymulującymi oligonukleotydami CpG. Termin cytokina stosuje się jako ogólną nazwę dla różnych grup rozpuszczalnych białek i peptydów, które działają jako humoralne regulatory w stężeniach nano- do pikomolarnych i które, w prawidłowych lub patologicznych warunkach, modulują czynnościowe aktywności poszczególnych komórek i tkanek. Te białka pośredniczą także bezpośrednio we wzajemnych oddziaływaniach pomiędzy komórkami i regulują procesy zachodzące w środowisku pozakomórkowym. Przykłady cytokin obejmują między innymi IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF), interferon-γ (γ-IFN), IFN -a, czynnik martwicy nowotworów (TNF), TGF-β, FLT-3 ligand, i CD40 ligand.
Oligonukleotydy są także przydatne w zmianie odpowiedzi immunologicznej z odpowiedzi immunologicznej Th2 na odpowiedź immunologiczną Th1. Powoduje to uzyskanie względnie zrównoważonego środowiska Th1/Th2. Przełączenie odpowiedzi z immunologicznej z Th2 na odpowiedź immunologiczną Th1 można oszacować przez pomiar poziomów cytokin wytwarzanych w odpowiedzi na kwas nukleinowy (np. przez indukowanie komórek monocytów i innych komórek do produkcji cytokin Th1, obejmujących IL-12, IFN-γ i GM-CSF). Przełączenie lub zmiana równowagi pomiędzy odpowiedzią immunologiczną Th2 a odpowiedzią Th1 jest szczególnie przydatne w leczeniu lub zapobieganiu astmie. Na przykład, ilość wystarczająca do skutecznego leczenia astmy może być ilością, która przełącza związaną z astmą odpowiedź immunologiczną typu Th2 na odpowiedź typu Th1 lub nadającą równowagę Th1/Th2. W drogach oddechowych pacjentów z astmą poziomy cytokin Th2, szczególnie IL-4 i IL-5, są podwyższone. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG tu opisane powodują wzrost poziomu cytokin Th1 co pomaga w przywróceniu równowagi w układzie odpornościowym, zapobiegając lub zmniejszając szkodliwe skutki związane z przewagą odpowiedzi immunologicznej Th2.
Oligonukleotydy tu opisane mogą także być przydatne w leczeniu przebudowy struktury dróg oddechowych. Przebudowa struktury dróg oddechowych jest skutkiem proliferacji komórek mięśni gładkich i/lub podśluzówkowych zgrubień w drogach oddechowych, i ostatecznie powoduje zwężenie dróg oddechowych prowadząc do ograniczenia przepływu powietrza. Oligonukleotydy tu opisane mogą zapobiegać dalszej przebudowie i prawdopodobnie nawet zmniejszać nawarstwianie tkanki, będące skutkiem procesu przebudowy.
Oligonukleotydy są także przydatne w zwiększaniu przeżywalności, różnicowania, aktywacji i dojrzewania komórek dendrytycznych. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG posiadają wyjątkową zdolność do wspomagania przeżywalności, różnicowania, aktywacji i dojrzewania komórek dendrytycznych.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG zwiększają także aktywność lityczną i zależną od przeciwciał komórkową cytotoksyczność (ADCC) komórek NK. ADCC można wywołać stosując immunostymulujący oligonukleotyd CpG w połączeniu z przeciwciałem swoistym dla komórki docelowej, takiej jak komórka nowotworowa. Gdy immunostymulujący oligonukleotyd CpG podaje się pacjentowi w połączeniu z przeciwciałem, układ odpornościowy pacjenta jest pobudzany do zabicia komórki nowotworowej. Przeciwciała przydatne w mechanizmie ADCC obejmują przeciwciała, które wchodzą w interakcję z komórką w organizmie. Wiele takich przeciwciał swoistych dla celów komórkowych opisano w dziedzinie i wiele jest dostępnych na rynku.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także podawać w połączeniu z leczeniem przeciwnowotworowym. Terapie przeciwnowotworowe obejmują leki przeciwnowotworowe, napromienianie i metody chirurgiczne. Stosowany tu termin „leki przeciwnowotworowe” odnosi się do środków, który podaje się pacjentowi w celu leczenia raka. Stosowany tu termin „leczenie raka” obejmuje zapobieganie rozwojowi raka, zmniejszenie objawów raka, i/lub hamowanie wzrostu określonego rak a. Zgodnie z innymi aspektami, lek przeciwnowotworowy podaje się pacjentowi zagrożonemu rozwojem raka w celu zmniejszenia ryzyka rozwoju raka. Opisano tu różne typy leków do leczenia raka. Dla celów tego opisu, leki przeciwnowotworowe sklasyfikowano jako środki chemioterapeutyczne, środki immunoterapeutyczne, szczepionki przeciwnowotworowe, środki hormonalne, i modyfikatory odpowiedzi biologicznej.
Ponadto, możliwe jest zastosowanie więcej niż jednego leku przeciwnowotworowego wraz z immunostymulującymi oligonukleotydami CpG. Jako przykład, gdy jest to właściwie, immunostymulujące oligonukleotydy CpG można podawać zarówno ze środkiem chemioterapeutycznym jak i ze środkiem immunoterapeutycznym. Alternatywnie, lek przeciwnowotworowy może zawierać środek immunoterapeutyczny i szczepionkę przeciwnowotworową, lub środek chemioterapeutyczny i szczepionkę przeciw42
PL 232 260 B1 nowotworową, lub środek chemioterapeutyczny, środek immunoterapeutyczny i szczepionkę przeciwnowotworową, wszystkie podawane jednemu pacjentowi w celu leczenia pacjenta chorego na raka lub zagrożonego ryzykiem rozwoju raka.
Środek chemioterapeutyczny może być wybrany z grupy obejmującej takie jak metotreksat, winkrystyna, adriamycyna, cisplatyna, nie zawierające cukru chloroetylonitrozomoczniki, 5-fluorouracyl, mitomycyna C, bleomycyna, doksorubicyna, dakarbazyna, taksol, fragylina (ang. fragyline), meglamina GLA (ang. meglamine GLA), walrubicyna, karmustyna i poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibitor transferazy farnezylu RAS, inhibitor transferazy farnezylu, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/topotekan, PKC412, Walspodar/PSC833, Novantron/mitoksantron, Metaret/Suramin, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, picibanil/OK-432, AD 32/walrubicyna, metastron/pochodne strontu, temodal/temozolomid, Evacet/liposomalna doksorubicyna, Yewtaxan/paklitaksel, taksol/pakiitaksel, Xeload/kapecytabina, kapecytabina/doksyflurydyna, Cyklopax/doustny paklitaksel, doustny taksoid, SPU-077/cisplatyna, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibitor onkogenu RAS, BMS-18275 I/doustne preparaty platyny, UFT (Tegafur/Urac-ilo), ergamisol/lewamizol, eniluracil/776C85/substancja wzmagająca działanie 5FU, Campto/lewamizol, Camptosar/irinotekan, Tumodex/ralitreksed, leustatyna/kladrybina, Paxex/paklitaksel, Doxil/liposomalna doksorubicyna, Caelyx/liposomalna doksorubicyna, Fludara/fludarabina, farmarubicyna/epirubicyna, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimid, LU 103793/Dolastain, Caetyx/liposomalna doksorubicyna, gemzar/gemcytabina, ZD 0473/Anormed, YM 116, nasiona Allenrolfea occidentalis, inhibitory CDK4 i CDK2, inhibitory PARP, D4809/Dexlfosamid, Ifes/Mesnex/Ifosamid, Vumon/tenipozyd, Paraplatin/karboplatyna, Plantinol/cisplatyna, Vepeside/etopozyd, ZD 9331, Taxotere/docetaksel, prolek arabinozydu guaniny, analog taksanu, nitrozomoczniki, środki alkilujące takie jak melfelan i cyklofosfamid, aminoglutetymid, asparaginaza, busulfan, karboplatyna, chlorambucyl, cytarabina HCl, daktynomycyna, chlorowodorek daunorubicyny, sól sodowa fosforanu estramustyny, etopozyd (VP16-213), floksurydyna, fluorouracyl (5-FU), flutamid, hydroksymocznik (hydroksykarbamid), ifosfamid, interferon alfa-2a, alfa-2b, octan leuprolidu (analog czynnika uwalniającego LHRH), lomustyna (CCNU), mechloretamina HCl (iperyt azotowy), tiopuryna, Mesna, mitotan (o.p'-DDD), mitoksantron HCl, oktreotyd, plikamycyna, prokarbazyna HCl, streptozocyna, cytrynian tamoksyfenu, tioguanina, tiotepa, siarczan winblastyny, amsakryna (m-AMSA), azacytydyna, erytropoetyna, heksametylomelamina (HMM), interleukina 2, (metylo-GAG; bis-guanylohydrazon metyloglioksalu; MGBG), Pentostatyna (2'-deoksykoformycyna), semustyna (metylo-CCNU), tenipozyd (VM-26) i siarczan windezyny, lecz nie ogranicza się do nich.
Środek immunoterapeutyczny można wybierać z grupy obejmującej między innymi takie jak ributaksyna, herceptyna, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf. r3, ior c5, BABS, anty-FLK-2, MDX-260, przeciwciało ANA, przeciwciało SMART 1D10, przeciwciało SMART ABL 364 i ImmuRAIT-CEA.
Szczepionkę przeciwnowotworową można wybierać z grupy obejmującej między innymi takie jak EGF, antyidiotypowe szczepionki przeciwnowotworowe, antygen Gp75, szczepionka GMK przeciwko czerniakowi, szczepionka MGV na bazie koniugatu gangliozydowego, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratop, BLP25 (MUC-1), idiotypowa szczepionka liposomalna, melacyna, szczepionki na bazie antygenu peptydowego, szczepionki toksyna/antygen, szczepionka na bazie MVA, PACIS, szczepionka BCG, TA-HPV, TA-CIN, wirus DISC oraz ImmuCyst/TheraCys.
Zastosowanie immunostymulujących oligonukleotydów CpG w połączeniu ze środkami immunoterapeutycznymi, takimi jak przeciwciała monoklonalne, może zwiększać długoterminowe przeżycie poprzez kilka mechanizmów obejmujących znaczące nasilenie ADCC (jak opisano powyżej), aktywację komórek NK i zwiększenie poziomu IFN a. Kwasy nukleinowe stosowane w połączeniu z przeciwciałami monoklonalnymi służą do zmniejszenia dawki przeciwciała potrzebnej do osiągnięcia biologicznego rezultatu.
Stosowane tu terminy „antygen rakowy” i „antygen nowotworowy” stosuje się wymiennie w odniesieniu do antygenów, które są w sposób różnicujący eksprymowane przez komórki nowotworowe i mogą tym samym być wykorzystane do namierzenia komórek nowotworowych. Antygeny nowotworowe oznaczają antygeny, które mogą potencjalnie stymulować widoczną odpowiedź immunologiczną swoistą dla nowotworu. Niektóre z tych antygenów są kodowane, chociaż nie koniecznie eksprymowane, przez
PL 232 260 B1 prawidłowe komórki. Te antygeny można scharakteryzować jako takie, które są normalnie wyciszone (tj. nie eksprymowane) w prawidłowych komórkach, takie, które ulegają ekspresji tylko na pewnych stadiach różnicowania i takie, które są czasowo eksprymowane, jak antygeny embrionalne i płodowe. Inne antygeny nowotworowe są kodowane przez zmutowane geny komórkowe, takie jak onkogeny (np. aktywowany onkogen ras), geny supresorowe (np. zmutowany p53), fuzyjne białka powstałe na skutek wewnętrznych delecji lub translokacji chromosomalnych. Jeszcze inne antygeny nowotworowe mogą być kodowane przez geny wirusowe takie jak te przenoszone na onkogennych RNA i DNA wirusach.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są także przydatne w leczeniu i zapobieganiu chorobie autoimmunologicznej. Termin choroba autoimmunologiczna dotyczy klasy chorób, w których własne przeciwciała pacjenta reagują z tkanką gospodarza lub, w których efektorowe limfocyty T układu odpornościowego są autoreaktywne względem własnych peptydów endogennych i powodują zniszczenie tkanki. Tak więc odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciw własnym antygenom pacjenta, określanym jako własne antygeny. Choroby autoimmunologiczne obejmują między innymi choroby takie jak: reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, miastenia (MG), choroba Hashimoto, zespół Goodpasture'a, pęcherzyca (np. pęcherzyca zwykła), choroba Gravesa-Basedowa, autoimmunologiczna niedokrwistość hemolityczna, autoimmunologiczna plamica małopłytkowa, twardzina z przeciwciałami przeciwko kolagenowi, mieszana choroba tkanki łącznej, zapalenie wielomięśniowe, niedokrwistość złośliwa, idiopatyczna choroba Addisona, bezpłodność w wyniku zaburzeń autoimmunologicznych, zapalenie kłębuszków nerkowych (np. zapalenie kłębuszków nerkowych z tworzeniem półksiężyców, proliferacyjne zapalenie kłębuszków nerkowych), pemfigoid klasyczny, zespół Sjogren'a, insulinooporność i cukrzyca autoimmunologiczna.
Termin „własny antygen” w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do antygenu prawidłowej tkanki gospodarza. Prawidłowa tkanka gospodarza nie obejmuje komórek nowotworowych. Zatem odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw własnemu antygenowi, w kontekście choroby autoimmunologicznej, jest niepożądaną odpowiedzią immunologiczną i przyczynia się do zniszczenia i uszkodzenia prawidłowej tkanki, podczas gdy odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw antygenowi nowotworowemu jest pożądaną odpowiedzią immunologiczną i przyczynia się do zniszczenia nowotworu lub raka. Zatem w pewnych aspektach tu opisanych skierowanych na leczenie zaburzenia autoimmunologicznego nie zaleca się podawania immunostymulujących kwasów nukleinowych CpG z własnymi antygenami, szczególnie takimi, które są celami w zaburzeniu autoimmunologicznym.
W innych przypadkach, immunostymulujące kwasy nukleinowe CpG można dostarczać z antygenami własnymi w małych dawkach. W pewnych badaniach na zwierzętach wykazano, że naśluzówkowe podawanie antygenu w małych dawkach może prowadzić do stanu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej lub „tolerancji”. Aktywny mechanizm wydaje się być wywołanym przez cytokiny odchyleniem od odpowiedzi immunologicznej z dominacją limfocytów Th1 w stronę przewagi odpowiedzi Th2 i Th3 (tj. zdominowanej przez TGF-β). Aktywna supresja poprzez podawanie małej dawki antygenu może także tłumić niezależną odpowiedź immunologiczną (efekt przygodnego widza, ang. bystander suppression), co jest bardzo istotne w leczeniu chorób autoimmunologicznych, np. reumatoidalnego zapalenia stawów i SLE. Efekt przygodnego widza polega na sekrecji supresyjnych cytokin regulujących liczbę limfocytów Th1 w środowisku, w którym uwalniane są cytokiny prozapalne i cytokiny Th1 w odpowiedzi zarówno swoistej jak i nieswoistej. W odniesieniu do tego zjawiska stosuje się tu termin „tolerancja”. Rzeczywiście, tolerancja przy podawaniu doustnym okazała się skuteczna w leczeniu wielu chorób autoimmunologicznych u zwierząt obejmujących: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), eksperymentalną autoimmunologiczną miastenię, zapalenie stawów indukowane kolagenem (CIA) i cukrzycę insulinozależną. W tych modelach, zapobieganie i hamowanie choroby autoimmunologicznej jest związane z przesunięciem antygenowo swoistej humoralnej i komórkowej odpowiedzi z Th1 w kierunku odpowiedzi Th2/Th3.
Opisano tu także sposób indukcji wrodzonej antygenowo nieswoistej aktywacji układu odpornościowego oraz odporności na szerokie spektrum czynników zakaźnych z zastosowaniem immunostymulujących oligonukleotydów CpG tu opisanych. Stosowany tu termin wrodzona, nieswoista aktywacja układu odpornościowego odnosi się do aktywacji komórek układu odpornościowego, innych niż limfocyty B, i na przykład może obejmować aktywację komórek NK, limfocytów T lub innych komórek układu odpornościowego, które mogą odpowiadać w sposób niezależny od antygenu lub pewnej kombinacji tych komórek. Odporność o szerokim spektrum na czynniki zakaźne powstaje ponieważ komórki układu odpornościowego są aktywne i przygotowane do reagowania na każdy wnikający związek lub mikroor
PL 232 260 B1 ganizm. Komórki nie muszą być specyficznie nastawione przeciwko danemu antygenowi. Jest to szczególnie ważne w przypadku zastosowania broni biologicznej i w innych okolicznościach opisanych powyżej takich jak to jest w przypadku podróżnych.
Opisane tu oligonukleotydy mogą posiadać chiralne wiązania internukleotydowe. Jak opisano powyżej miękkie i semi-miękkie oligonukleotydy tu opisane mogą zawierać wiązania typu wiązania fosfodiestrowego pomiędzy C i G. Jednym z przykładów wiązania typu wiązania fosfodiestrowego jest wiązanie tiofosforanowe w konformacji Rp.
Co najmniej w jednych badaniach sprawdzono wpływ p-chiralności na stymulujący wpływ oligonukleotydów CpG na układ odpornościowy. Yu i in. porównali diastereomerycznie - wzbogacone (niediastereomerycznie czyste) (PS)-oligonukleotydy tiofosforanowe na ich zdolność do indukcji proliferacji komórek śledziony (Yu i in., 2000). W tych badaniach, 19-merowa sekwencja zawierająca pojedynczy motyw CpG okazała się indukować wysoką proliferację komórek mysiej śledziony jeśli oligonukleotyd syntetyzowano metodą prowadzącą do losowej p-chiralności lub wzbogacono w wiązania internukleotydowe Sp, lecz proliferacja była znacznie zmniejszona jeśli oligonukleotyd był wzbogacony w wiązania internukleotydowe Rp (Yu i in., 2000).
Jednakże, w badaniu tym nie sprawdzano specyficznej roli p-chiralności w dinukleotydzie CpG, ani nie określano, czy oligonukleotydy CpG Rp wykazywały aktywność w testach stymulacji krótkoterminowej.
Przy realizacji niniejszego wynalazku stwierdzono, że p-chiralność oligonukleotydu może mieć pozornie przeciwny wpływ na immunologiczną aktywność oligonukleotydu CpG, zależnie od momentu, w którym mierzy się aktywność. We wczesnym punkcie czasowym, 40 minut, stereoizomer Rp lecz nie Sp tiofosforanowego oligonukleotydu CpG indukuje fosforylację JNK w mysich komórkach śledziony (dyskusja w przykładach). Odwrotnie, w badaniu w późnym momencie, 44 godzin, stereoizomer Sp lecz nie Rp aktywnie stymuluje proliferację komórek śledziony. Wykazano, że ta różnica w kinetyce i bioaktywności stereoizomerów Rp i Sp nie wynika z jakiejkolwiek różnicy w wychwycie przez komórki, lecz raczej jest najprawdopodobniej spowodowana dwiema przeciwnymi biologicznymi rolami p-chiralności. Pierwsza, wzmożona aktywność stereoizomeru Rp w porównaniu z Sp stymulującego komórki układu odpornościowego we wczesnych momentach wskazuje, że Rp może bardziej skutecznie wchodzić w interakcję z receptorem CpG, TLR9, lub indukować szlaki sygnalizacyjne w dół od receptora. Z drugiej strony, szybsza degradacja PS-oligonukleotydów Rp w porównaniu z Sp powoduje dużo krótszy czas trwania sygnalizacji, tak, że PS-oligonukleotydy Sp wydają się mieć wyższą biologiczną aktywność przy badaniu w późniejszych momentach.
Wynalazek w pewnych aspektach opiera się na nowym stwierdzeniu, że uprzednio stwierdzany względny brak immunologicznej stymulacji przez PS-oligonukleotydy Rp jest tylko efektem ich nukleazowej nietrwałości, nie ich niezdolności do stymulacji receptora CpG i szlaków w dół od receptora. Gdy badano ich zdolność do stymulacji fosforylacji JNK, co wskazuje na aktywację tej ścieżki kinazy białkowej aktywowanej mitogenem, oligonukleotyd Rp wydawał się być najbardziej aktywny, po nim oligomer o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej, lecz bez wykrywalnej aktywności oligonukleotydu Sp. Jednakże, gdy porównano zdolność tych oligonukleotydów do aktywacji ścieżki NF-kB, na podstawie pomiaru degradacji inhibitorowego białka kB-α, wszystkie oligonukleotydy CpG były aktywne, chociaż kontrola niezawierająca CpG nie powodowała indukcji degradacji kB-α. Zatem oligonukleotyd Sp także jest aktywny biologicznie. Jego niezdolność do indukowania szlaku JNK może być związana z różnicą w kinetyce aktywacji szlaków JNK i NF-kB, lecz z uwagi na ograniczone ilości stereo-specyficznych oligonukleotydów, dostępnych do badań, twórcy wynalazku nie mogli potwierdzić tej hipotezy.
Doświadczenia opisane w przykładach wykazały zaskakująco silny wpływ p-chiralności na sam dinukleotyd CpG. W porównaniu z oligonukleotydem CpG o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej, oligonukleotyd pokrewny, w którym pojedynczy dinukleotyd CpG był związany w Rp, był nieznacznie bardziej aktywny, podczas gdy oligonukleotyd zawierający wiązanie Sp był prawie nieaktywny pod względem indukcji proliferacji komórek śledziony. Brak aktywności oligonukleotydu Sp wspiera hipotezę twórców wynalazku, że receptor TLR9 może nie być obojętny na chiralność dinukleotydu CpG w DNA, z którym wchodzi w interakcję, lecz może właściwie być stymulowany przez lepszy stereoizomer Rp. Tak więc, stymulujący wpływ oligomeru o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej jest prawdopodobnie nie tylko skutkiem obecności 50% wiązań Sp, które opóźniają degradację, lecz także faktu, że połowa cząsteczek oligomerowych będzie w dinukleotydzie CpG wykazywać chiralność Rp, która wydaje się zwiększać stymulujący wpływ na układ odpornościowy.
Wrażliwość wiązania PS Rp na nukleazy ma istotne znaczenie dla interpretacji farmakokinetyki (PK) i badań metabolizmu PS-oligomerów u ludzi lub zwierząt. Główną nukleazą aktywną w osoczu jest 3' egzonukleaza. W typowym roztworze PS-oligomeru o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej
PL 232 260 B1 ostatnie wiązanie internukleotydowe 3' powinno mieć chiralność Rp w połowie cząsteczek. Zatem w tych 50% cząsteczek PS-oligomeru, końcowa zasada 3' będzie odcinana stosunkowo szybko po wlewie dożylnym. Drugie od końca 3' wiązanie internukleotydowe powinno wykazywać chiralność Rp w połowie tych cząsteczek, a zatem w przypadku 25% spośród wyjściowych cząsteczek PS-oligomeru względnie szybko można oczekiwać skrócenia o 2 zasady na końcu 3'. Ten proces odcinania zasad in vivo obejmujący wiązania internukleotydowe Rp 3' jak można się spodziewać będzie kontynuowany aż do wiązania 3' wykazującego konfigurację Sp. Zatem jeśli PS-oligomery zsyntetyzowano tak, by miały wiązanie 3' końcowe Sp, powinny być znacznie wolniej degradowane i mieć inny profil PK w porównaniu z PS-oligomerami o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej. Powinno to umożliwiać zastosowanie nieco krótszego oligonukleotydu do podawania in vivo. Przy projektowaniu zoptymalizowanych oligomerów do zastosowania jako oligomerów antysensownych, ułatwione wiązanie RNA stereoizomeru Rp wskazuje na celowość posiadania tak wielu oligonukleotydów z wewnętrznym rdzeniem o konfiguracji Rp jak to tylko możliwe. Z drugiej strony, zoptymalizowany oligonukleotyd CpG do zastosowania w immunostymulacji może być takim, w którym wszystkie z wiązań internukleotydowych oprócz CpG wykazywałyby chiralność Sp.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można bezpośrednio podawać pacjentowi lub można podawać w połączeniu z kompleksem dostarczającym kwas nukleinowy. Kompleks dostarczający kwas nukleinowy oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego związaną (np. jonowo lub kowalencyjnie związaną z; lub umieszczoną w) ze środkiem nakierowującym (np. cząsteczką, która powoduje wiązanie z większym powinowactwem do komórki docelowej. Przykłady kompleksów dostarczających kwas nukleinowy obejmują kwasy nukleinowe związane ze sterolem (np. cholesterol), lipidem (np. lipid kationowy, wirosom lub liposom), lub specyficzny środek wiążący się z komórką docelową (np. ligand rozpoznawny przez specyficzny receptor komórki docelowej). Dogodne kompleksy mogą być dostatecznie trwałe in vivo, by zapobiegać znaczącemu rozsprzęganiu przed internalizacją przez komórkę docelową. Jednakże kompleks może być rozcinalny w odpowiednich warunkach wewnątrz komórki tak, aby oligonukleotyd był uwalniany w funkcjonalnej formie.
Opisano nośniki do dostarczania lub urządzenia dostarczające do dostarczania antygenu i oligonukleotydów na powierzchnie. Immunostymulujący oligonukleotyd CpG i/lub antygen i/lub inne środki lecznicze można podawać same (np. w roztworze soli lub buforze) lub stosując dowolne nośniki do dostarczania znane w dziedzinie. Opisano na przykład następujące nośniki do dostarczania: kochleaty (ang. cochleates) (Gould-Fogerite i in,, 1994, 1996); emulsomy (ang. emulsomes) (Vancott i in., 1998, Lowell i in., 1997); ISCOM (Mowat i in., 1993, Carlsson i in., 1991, Hu et., 1998, Morein i in., 1999); liposomy (Childers i in., 1999, Michalek i in., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); żywe wektory bakteryjne (np. Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone i in., 1996, Pouwels i in., 1998, Chatfield i in., 1993, Stover i in., 1991, Nugent i in., 1998); żywe wektory wirusowe (np. Vaccinia, adenowirus, Herpes simplex) (Gallichan i in., 1993, 1995, Moss i in., 1996, Nugent i in., 1998, Flexner i in., 1988, Morrow i in., 1999); mikrosfery (Gupta i in., 1998, Jones i in., 1996, Maloy i in., 1994, Moore i in., 1995, O'Hagan i in., 1994, Eldridge i in., 1989); szczepionki na bazie kwasu nukleinowego (Fynan i in., 1993, Kuklin i in., Sasaki i in., 1998, Okada i in., 1997, Ishii i in., 1997); polimery (np. karboksymetyloceluloza, chitosan) (Hamajima i in., 1998, Jabbal-Gill i in., 1998); pierścienie polimerowe (Wyatt i in., 1998); proteosomy (Vancott i in., Lowell i in., 1988, 1996, 1997); fluorek sodu (Hashi i in., 1998); rośliny transgeniczne (Tacket i in., 1998, Mason i in., 1998, Haq i in., 1995); wirosomy (Gluck i in., 1992, Mengiardi i in., 1995, Cryz i in., 1998); cząstki wirusopodobne (Jiang i in., 1999, Leibi i in., 1998). W dziedzinie znane są inne nośniki do dostarczania i poniżej w omówieniu wektorów przedstawiono pewne dodatkowe przykłady.
Termin immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej ilości odnosi się do ilości koniecznej lub wystarczającej do osiągnięcia pożądanego efektu biologicznego. Przykładowo, immunostymulujący oligonukleotyd CpG podawany w ilości pozwalającej na skuteczne zaindukowanie odporności śluzówkowej z antygenem oznacza ilość konieczną do spowodowania produkcji IgA w odpowiedzi na antygen po ekspozycji na ten antygen, podczas gdy ilość wymagana do wywołania odporności systemowej oznacza ilość konieczną do spowodowania produkcji IgG w odpowiedzi na antygen po ekspozycji na ten antygen. W połączeniu z zamieszczonymi tu wskazaniami, wybierając spośród różnych aktywnych związków i biorąc pod uwagę czynniki takie jak moc, względna biodostępność, masa ciała pacjenta, szkodliwość efektów ubocznych i zalecany sposób podawania, można zaplanować efektywny reżim podawania profilaktycznego lub leczniczego, który nie powoduje zasadniczej toksyczności i dodatkowo jest całkowicie skuteczny w leczeniu danego pacjenta. Skuteczna ilość dla każdego konkret
PL 232 260 B1 nego zastosowania może zmieniać się zależnie od takich czynników jak leczona choroba lub schorzenie, podawany określony immunostymulujący oligonukleotyd CpG, masa pacjenta, lub stopień zaawansowania choroby lub schorzenia. Fachowiec w dziedzinie może doświadczalnie określić skuteczną ilość określonego immunostymulującego oligonukleotydu CpG i/lub antygenu i/lub innego środka terapeutycznego bez konieczności wykonywania dodatkowych badań.
Podawane pacjentom dawki opisanych tu związków do podawania śluzówkowo lub miejscowo typowo mieszczą się w zakresie od około 0,1 μg do 10 mg na dawkę jednorazową, która w zależności od podawania może być podawana raz dziennie, raz w tygodniu, lub raz na miesiąc i na inny dowolny okres czasu. Bardziej typowo zakres dawek podawanych śluzówkowo lub miejscowo zawiera się między około 10 μg i 5 mg na dawkę jednorazową, a najbardziej typowo od około 100 μg do 1 mg, przy czym podaje się 2-4 dawki w odstępach kilkudniowych lub kilkutygodniowych. Zazwyczaj, dawki środka pobudzającego odpowiedź immunologiczną mieszczą się w zakresie od 1 μg do 10 mg na podanie, a najczęściej 10 μg do 1 mg, przy podawaniu codziennym lub raz w tygodniu. Podawane pacjentom dawki opisanych tu związków do podawania pozajelitowo w celu wywołania swoistej odpowiedzi immunologicznej, w jakich związki podaje się z antygenem, ale nie z innym środkiem terapeutycznym, są zazwyczaj od 5 do 10000 razy większe niż skuteczne dawki śluzówkowe przy zastosowaniu środka wspomagającego szczepionki lub środka pobudzającego odpowiedź immunologiczną, często od 10 do 1000 razy większe, a najczęściej od 20 do 100 razy większe. Dawki opisanych tu związków do podawania pozajelitowo w celu wywołania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej lub w celu zwiększenia ADCC lub wywołania swoistej odpowiedzi immunologicznej, gdy immunostymulujące oligonukleotydy CpG podaje się w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi lub wyspecjalizowanymi nośnikami do dostarczania, typowo mieszczą się w zakresie od około 0,1 μg do 10 mg na podanie, które zależnie od zastosowania można podawać raz dziennie, raz w tygodniu, na miesiąc i na dowolny inny okres czasu. Częściej, dawki pozajelitowe do tych celów mieszczą się w zakresie od około 10 μg do 5 mg na podanie, a najczęściej od około 100 μg do 1 mg, przy czym podaje się je w 2-4 dawkach w odstępie kilkudniowym lub kilkutygodniowym. W pewnych rozwiązaniach jednakże, dawki pozajelitowe można stosować do tych celów w zakresie od 5 do 10000 razy większym niż typowe dawki opisane powyżej.
Dla dowolnego z opisanych tu związków terapeutycznie skuteczną ilość można wstępnie określić na modelach zwierzęcych. Terapeutycznie skuteczną dawkę można także określić na podstawie danych dotyczących oligonukleotydów CpG, które badano u ludzi (zapoczątkowano próby kliniczne z udziałem ludzi) i dotyczących związków wykazujących podobne działanie farmakologiczne, takich jak inne środki wspomagające, np. LT i inne antygeny do szczepień. Do podawania pozajelitowo mogą być konieczne większe dawki. Dawkę do zastosowania można ustalić na podstawie względnej biodostępności i siły działania podawanego związku. Dostosowanie dawki do maksymalnej skuteczności, na podstawie opisanych wyżej sposobów i innych metod dobrze znanych w dziedzinie, leży w zakresie kompetencji fachowca o przeciętnych umiejętnościach.
Preparaty tu opisane podaje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych roztworów, które mogą typowo zawierać sól, bufory, środki konserwujące, kompatybilne nośniki, adiuwanty i, ewentualnie, inne składniki terapeutyczne, w farmaceutycznie dopuszczalnych stężeniach.
Do zastosowania w leczeniu, immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej ilości można podawać pacjentowi w jakikolwiek sposób zapewniający dostarczenie oligonukleotydu na pożądaną powierzchnię, np. śluzówkową, ogólnoustrojowo. Podawanie kompozycji farmaceutycznej można przeprowadzić dowolnymi sposobami wiadomymi dla fachowca. Zalecane sposoby podawania obejmują między innymi podawanie doustne, pozajelitowe, domięśniowe, donosowe, podjęzykowe, dotchawicze, wziewne, do gałki ocznej, dopochwowe i doodbytnicze.
W przypadku podawania doustnego, związki (tj. immunostymulujące oligonukleotydy CpG, antygeny i inne środki terapeutyczne) można komponować łatwo przez połączenie aktywnego związku (aktywnych związków) z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami dobrze znanymi w dziedzinie. Takie nośniki umożliwiają skomponowananie związków według wynalazku w postać tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żeli, syropów, rzadkich zawiesin, zawiesin itp., do połknięcia przez leczonego pacjenta. Preparaty farmaceutyczne do podawania doustnego można otrzymać w postaci stałej z zaróbką, ewentualnie przez zmielenie uzyskanej mieszaniny i przetworzenie mieszaniny granulek, po dodaniu odpowiednich środków wspomagających, jeśli to pożądane, z uzyskaniem rdzeni tabletek lub drażetek. Odpowiednie zaróbki obejmują, w szczególności, wypełniacze takie jak cukry, obejmujące takie jak laktoza, sacharoza, mannitol, lub sorbitol; preparaty celulozy, takie jak np. skrobia kukuryPL 232 260 B1 dziana, skrobia pszeniczna, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana, żelatyna, guma tragakantowa, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy, i/lub poliwinylopirolidon (PVP). Jeśli to pożądane, dodawać można środki rozdrabniające, takie jak poprzecznie usieciowany poliwinylopirolidon, agar, lub kwas alginowy lub jego sól taką jak alginian sodu. Ewentualnie, preparaty doustne można także skomponować w fizjologicznym roztworze soli lub buforach, tj. w EDTA do zobojętnienia warunków kwaśnych we wewnętrzu ciała lub można je podawać bez żadnych nośników.
Także rozważa się specyficznie doustne postacie dawkowania powyższego składnika lub składników. Składnik lub składniki można chemicznie zmodyfikować tak, aby skuteczne było doustne dostarczanie pochodnej. Na ogół, rozważaną modyfikacją chemiczną jest przyłączenie co najmniej jednej grupy do samej cząsteczki składowej, przy czym grupa ta umożliwia (a) hamowanie proteolizy; i (b) wychwyt z żołądka lub jelit do strumienia krwi. Pożądane jest także zwiększenie ogólnej stabilności składnika lub składników oraz wydłużenie okresu cyrkulacji w organizmie. Przykłady takich grup obejmują: glikol polietylenowy, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon i poliprolinę. Abuchowski i Davis, 1981, „Soluble Polymer-Enzyme Adducts” w: Enzymes as Drugs, red. Hocenberg i Roberts, Wiley-Interscience, New York, NY, str. 367-383; Newmark, i in., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189. Inne polimery, które można stosować obejmują poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksokan. Zalecane do zastosowania w farmacji, jak wskazano powyżej, są grupy glikolu polietylenowego.
W przypadku składnika (lub pochodnej) miejscem uwalniania może być żołądek, jelito cienkie (dwunastnica, jelito czcze, lub jelito cienkie), lub jelito grube. Fachowiec w dziedzinie dysponuje preparatami, które nie rozpuszczają się w żołądku, chociaż uwalniają substancję w dwunastnicy lub w innym miejscu w jelitach. W przypadku uwalniania zalecane jest unikanie szkodliwego działania środowiska żołądka, przez zabezpieczenie oligonukleotydu (lub pochodnej) lub uwalnianie substancji biologicznie czynnej poza środowiskiem żołądka, jak np. w jelicie.
W celu zapewnienia pełnej odporności na działanie soków żołądkowych decydujące znaczenie ma otoczka nieprzepuszczalna do pH co najmniej 5,0. Przykłady bardziej powszechych niedrażniących składników, które stosuje się jako otoczki dojelitowe obejmują octan trimelitanu celulozy (CAT), ftalan hydroksypropylometylocelulozy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, poli(octan ftalanu winylu) (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, octanoftalan celulozy (CAP), Eudragit L, Eudragit S, i szelak. Otoczki te można stosować w postaci filmów mieszanych.
Otoczkę lub mieszaninę powłok można także zastosować do powlekania tabletek, które w zamierzeniu nie mają mieć zabezpieczenia przed działaniem soku żołądkowego. Mogą to być otoczki cukrowe, lub otoczki ułatwiające połknięcie tabletki. Kapsułki mogą składać się z twardej powłoki (takiej jak żelatyna) do dostarczania suchego środka terapeutycznego tj. proszku; w przypadku postaci ciekłych, można stosować miękkie powłoki żelatynowe. Materiałem na powłoki kapsułek z opłatka może być gęsta skrobia lub inna jadalna bibuła. W przypadku pigułek, pastylek do ssania, kształtowanych tabletek lub proszków tabletkowych, można stosować techniki rozdrabniania na mokro.
Środek terapeutyczny można umieścić w preparacie w postaci wielu drobnych cząstek, w postaci granulek lub peletek o wymiarze cząstki około 1 mm. Materiał na preparat do podawania w kapsułkach może być także w postaci proszku, lekko sprasowanych „pastylek” lub a nawet tabletek. Środek terapeutyczny można sprasować.
Można zastosować wszystkie barwniki i środki smakowe. Przykładowo, oligonukleotyd (lub pochodną) można komponować (jak np. zamykając w liposomach lub mikrosferach) po czym dodać do produktu spożywczego, takiego jak ochłodzony napój zawierający barwniki i środki smakowe.
Można rozcieńczyć lub zwiększyć objętość środka terapeutycznego stosując substancję obojętną. Rozcieńczalniki te mogą obejmować węglowodany, szczególnie mannitol, α-laktozę, bezwodną laktozę, celulozę, sacharozę, zmodyfikowane dekstrany i skrobię. Jako wypełniacze można także zastosować pewne nieorganiczne sole obejmujące trifosforan wapnia, węglan magnezu i chlorek sodu. Pewne dostępne w handlu rozcieńczalniki obejmują Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.
W celu skomponowania stałej postaci dawkowania do preparatu można dodać terapeutyczne substancje dezintegrujące. Substancje stosowane jako środki dezintegrujące obejmują między innymi takie jak skrobia, w tym dostępna na rynku substancja dezintegrująca na bazie skrobii, Explotab. Można także zastosować każdy środek spośród takich jak sól sodowa glikolanu skrobii, Amberlite, sól sodowa karboksymetylocelulozy, ultramylopektyna, alginian sodu, żelatyna, skórka pomarańczowa, kwasowa karboksymetyloceluloza, gąbka naturalna i bentonit. Inną formą substancji dezintegrujących są nierozpuszczalne żywice kationowymienne. Jako substancje dezintegrujące i jako spoiwa można stosować
PL 232 260 B1 sproszkowane gumy a te mogą obejmować sproszkowane gumy, takie jak agar, guma karaya lub guma tragankowa. Przydatne jako substancje dezintegrujące są także kwas alginowy i jego sól sodowa.
Do utrzymania środka terapeutycznego w całości można stosować spoiwa uzyskując twardą tabletkę i obejmują one substancje pochodzenia naturalnego, takie jak guma arabska, guma tragankowa, skrobia i żelatyna. Inne, obejmują takie jak metyloceluloza (MC), etyloceluloza (EC) i karboksymetyloceluloza (CMC). Zarówno poliwinylopirolidon (PVP) jak i hydroksypropylometylocelulozę (HPMC) można stosować w roztworach alkoholowych do zgranulowania środka terapeutycznego.
Aby zapobiec przyleganiu środka terapeutycznego podczas formulacji, do preparatu można dodać środek antystatyczny. Pomiędzy środkiem terapeutycznym a ścianą matrycy, jako warstwę można zastosować środki poślizgowe, a te mogą obejmować między innymi; kwas stearynowy w tym jego sole magnezu i wapnia, politetrafluoroetylen (PTFE), ciekłą parafinę, oleje roślinne i woski. Stosować można także rozpuszczalne środki poślizgowe takie jak laurylosiarczan sodu, laurylosiarczan magnezu, glikol polietylenowy o różnych masach cząsteczkowych, Carbowax 4000 i 6000.
Dodać można środki poślizgowe, które mogą polepszać właściwości przepływu leku podczas formulacji i wspomagać przegrupowanie podczas sprasowywania. Środki poślizgowe mogą obejmować takie jak skrobia, talk, wywołująca gorączkę krzemionka i hydratowany glinokrzemian.
Aby ułatwić rozpuszczanie środka terapeutycznego w środowisku wodnym jako środek zwilżający można dodać surfaktant. Surfaktanty mogą obejmować detergenty anionowe, takie jak laurylosiarczan sodu, sodowy sulfobursztynian dioktylu i sodowy sulfonian dioktylu. Zastosować można detergenty kationowe a mogą one obejmować chlorek benzalkoniowy lub chlorek benzetoniowy. Lista potencjalnych niejonowych detergentów, które można zawrzeć w preparacie jako surfaktanty obejmuje Lauromacrogol 400, stearynian polioksylu 40, polioksyetylenowany uwodorniony olej rycynowy 10, 50 i 60, monostearynian glicerolu, Polysorbate 40, 60, 65 i 80, ester tłuszczowy sacharozy, metylocelulozę i karboksymetylocelulozę. Surfaktanty te mogą występować w preparacie oligonukleotydu lub pochodnej same lub w postaci mieszaniny w różnych proporcjach.
Preparaty farmaceutyczne, które można stosować doustnie obejmują kapsułki zatrzaskowe wykonane z żelatyny, jak również miękkie, szczelnie zamknięte kapsułki wykonane z żelatyny i plastyfikatora, takiego jak glicerol lub sorbitol. Kapsułki zatrzaskowe mogą zawierać aktywne składniki w mieszance z wypełniaczem takim jak laktoza, spoiwami takimi jak skrobie, i/lub środkami poślizgowymi, takimi jak talk lub stearynian magnezu i, ewentualnie, stabilizatorami. W miękkich kapsułkach, aktywne związki mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich cieczach, takich jak oleje tłuszczowe, ciekła parafina, lub ciekłe glikole polietylenowe. Ponadto, można dodawać stabilizatory. Stosować można także mikrosfery skomponowane do podawania doustnego. Takie mikrosfery dobrze opisano w dziedzinie. Wszystkie preparaty do podawania doustnego powinny być w dawkach odpowiednich dla takiego podawania.
W przypadku podawania podpoliczkowego, kompozycje mogą występować w postaci tabletek lub pastylek do ssania skomponowanych w typowy sposób.
W przypadku podawania wziewnego, opisane tu związki można dogodnie dostarczać w postaci aerozolu w sprayu w opakowaniach ciśnieniowych lub rozpylaczu, z zastosowaniem odpowiedniego propelenta, np. dichlorodifluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu, ditlenku węgla lub innego odpowiedniego gazu. W przypadku sprężonego aerozolu jednostkową postać dawkowania można określić stosując zawór podający odmierzoną ilość. Kapsułki i zasobniki np. z żelatyny do zastosowania w inhalatorze lub insuflatorze, można komponować tak, aby zawierały sproszkowaną mieszaninę związku oraz odpowiednią podstawę proszku, taką jak laktoza lub skrobia.
Rozważa się tu także dopłucne dostarczanie oligonukleotydów (lub ich pochodnych). Oligonukleotyd (lub pochodna) dostaje się do płuc ssaka podczas wdychania i przenika przez wyściółkę nabłonka płuc do strumienia krwi. Inne doniesienia o wziewnych cząsteczkach obejmują takie jak: Adjei i in., 1990, Pharmaceutical Research, 7: 565-569; Adjei i in., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (octan leuprolidu); Braquet i in., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5): 143-146 (endotelina-1); Hubbard i in., 1989, Annals of Internal Medicine, tom III, str. 206-212 (a1antytrypsyna); Smith i in., 1989, J. Clin. Invest 84: 1145-1146 (a-1-proteaza); Oswein i in., 1990, „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzec, (rekombinowany ludzki hormon wzrostu); Debs i in., 1988, J. Immunol. 140: 3482-3488 (interferon-g i czynnik martwicy nowotworów alfa) i Platz i in., opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5284656 (czynnik stymulujący kolonie granulocytów). Sposób i kompozycję do dopłucnego dostarczania leków w celu uzyskania działania ogólnoustrojowego ujawniono w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5451569, opublikowanym 19 września 1995, Wong i in.
PL 232 260 B1
W realizacji praktycznej wynalazku rozważa się wiele urządzeń mechanicznych zaprojektowanych do dopłucnego dostarczania produktów terapeutycznych, obejmujących między innymi nebulizatory, inhalatory podające odmierzone dawki, oraz inhalatory proszkowe, przy czym wszystkie one są znane fachowcom w dziedzinie.
Pewne specyficzne przykłady dostępnych w handlu urządzeń odpowiednich do realizacji praktycznej wynalazku obejmują nebulizator Ultravent, produkowany przez Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; nebulizator Acorn II, produkowany przez Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; inhalator podający odmierzone dawki Ventolin, produkowany przez Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i inhalator proszkowy Spinhaler, produkowany przez Fizons Corp., Bedford, Massachusetts.
Wszystkie takie urządzenia wymagają zastosowania preparatów odpowiednich do wydawania oligonukleotydu (lub pochodnej). Typowo, każdy preparat jest specyficzny dla typu stosowanego urządzenia i może się to wiązać ze stosowaniem odpowiedniego propelenta, oprócz typowych rozcieńczalników, środków wspomagających i/lub nośników przydatnych w leczeniu. Rozważa się także, zastosowanie liposomów, mikrokapsułek lub mikrosfer, kompleksów inkluzyjnych lub innych typów nośników. W różnych preparatach można zastosować chemicznie zmodyfikowany oligonukleotyd, zależnie od typu chemicznej modyfikacji lub typu zastosowanego urządzenia.
Preparaty odpowiednie do zastosowania przy użyciu nebulizatora, dyszowego lub ultradźwiękowego, będą typowo zawierać oligonukleotyd (lub pochodną) rozpuszczoną w wodzie w stężeniu około 0,1 do 25 mg biologicznie czynnego oligonukleotydu na ml roztworu. Preparat może także zawierać bufor i cukier prosty (np. dla stabilizacji oligonukleotydu i regulacji ciśnienia osmotycznego). Preparat do zastosowania z nebulizatorem może także zawierać surfaktant, w celu zmniejszenia lub zapobiegania wywołanej przez powierzchnię agregacji oligonukleotydu, spowodowanej rozpylaniem roztworu podczas powstawania aerozolu.
Preparaty do zastosowania z inhalatorem podającym odmierzoną dawkę będą na ogół zawierać silnie rozdrobniony proszek wraz z oligonukleotydem (lub pochodną) zawieszonym w propelencie za pomocą surfaktanta. Propelentem może być dowolna typowa substancja stosowana do tego celu, taka jak chlorofluorokarbon, hydrochlorofluorokarbon, hydrofluoro-karbon, lub węglowodór, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol, i 1,1,1,2-tetra-fluoroetan, lub ich kombinacje. Odpowiednie surfaktanty obejmują trioleinian sorbitolu i lecytynę sojową. Jako surfaktant może być także przydatny kwas oleinowy.
Preparaty do podawania za pomocą inhalatora proszkowego będą zawierać silnie rozdrobniony suchy proszek wraz z oligonukleotydem (lub pochodną) i mogą zawierać także środek pęczniejący, taki jak laktoza, sorbitol, sacharoza, lub mannitol, w ilościach ułatwiających usunięcie proszku z urządzenia, np. 50 do 90% wagowych preparatu. Oligonukleotyd (lub pochodną) należy najlepiej wytwarzać w postaci cząstek o średniej wielkości cząstki poniżej 10 mm (lub w mikronach), zwłaszcza 0,5 do 5 mm, dla najskuteczniejszego dostarczania do dolnych partii płuc.
Rozważa się także donosowe podawanie kompozycji farmaceutycznej tu opisanej. Podawanie donosowe umożliwia przejście kompozycji farmaceutycznej tu opisanej do strumienia krwi bezpośrednio po podaniu produktu terapeutycznego do nosa, bez potrzeby aby produkt zalegał w płucach. Preparaty do podawania donosowego obejmują preparaty z dekstranem lub cyklodekstranem.
W przypadku podawania donosowego, przydatnym urządzeniem jest mała, twarda butelka, do której podłączony jest spryskiwacz podający odmierzoną dawkę. W jednym rozwiązaniu, odmierzoną dawkę dostarcza się pobierając roztwór kompozycji farmaceutycznej tu opisanej do komory o określonej objętości, która to komora posiada otwór tak uformowany, aby generować aerozol preparatu produkując spray gdy ciecz spręża się w komorze. W celu podania kompozycji farmaceutycznej ciecz spręża się w komorze. W specyficznym rozwiązaniu, komora zaopatrzona jest w tłok. Takie urządzenia dostępne są w handlu.
Alternatywnie, stosuje się plastikową butelkę, którą można ścisnąć, z otworem lub ujściem tak uformowanym, aby generować aerozol preparatu uzyskując, po ściśnięciu spray. Ujście znajduje się zazwyczaj na szczycie butelki, a szczyt na ogół ścięty jest częściowo tak, aby pasował do kanałów nosowych, dla efektywnego podawania preparatu aerozolowego. Dogodnie, inhalator donosowy będzie wydawał odmierzoną ilość preparatu aerozolowego zmierzonej dawki leku.
Związki, gdy pożądane jest ich podawanie ogólnoustrojowe, można komponować do podawania pozajelitowego we wstrzyknięciu, np. w iniekcji w jednej dużej dawce lub przez wlew ciągły. Preparaty do iniekcji mogą występować w jednostkowej postaci dawkowania, np. w ampułkach lub w pojemnikach
PL 232 260 B1 wielodawkowych, z dodatkiem środka konserwującego. Kompozycje mogą występować w takich postaciach jak zawiesiny, roztwory lub emulsje w nośnikach olejowych lub wodnych, i mogą zawierać środki pomocnicze, takie jak środek zawieszający, stabilizujący i/lub dyspergujący.
Preparaty farmaceutyczne do podawania pozajelitowego obejmują roztwory wodne aktywnych związków w formie rozpuszczalnej w wodzie. Ponadto, zawiesiny aktywnych związków można wytworzyć w postaci odpowiednich zawiesin olejowych do iniekcji. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub nośniki obejmują oleje tłuszczowe takie jak olej sezamowy, lub syntetyczne estry kwasu tłuszczowego, takie jak oleinian etylu lub triglicerydy, lub liposomy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje zwiększające lepkość zawiesiny, takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, sorbitol, lub dekstran. Ewentualnie, zawiesina może zawierać także odpowiednie stabilizatory lub środki zwiększające rozpuszczalność związków w celu umożliwienia otrzymywania silnie zatężonych roztworów.
Alternatywnie, aktywne związki mogą być w postaci proszku do rozpuszczania przed użyciem w odpowiednim nośniku, np. jałowej pozbawionej pirogenów wodzie.
Związki można także komponować w postaci kompozycji doodbytniczych lub dopochwowych, takich jak czopki lub enemy retencyjne zawierające np. typowe bazy do czopków, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.
Oprócz opisanych uprzednio preparatów, związki można także skomponować w postaci depotu. Takie długo działające preparaty można komponować z odpowiednimi polimerycznymi lub hydrofobowymi substancjami (np. jako emulsję w dopuszczalnym oleju) lub żywicami jonowymiennymi, lub w postaci trudno rozpuszczalnych pochodnych, np. w postaci trudno rozpuszczalnej soli.
Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać także odpowiednie stałe lub żelowe nośniki lub zarobki. Przykłady takich nośników lub zaróbek obejmują, między innymi węglan wapnia, fosforan wapnia, różne cukry, skrobie, pochodne celulozy, żelatynę, i polimery takie jak glikole polietylenowe.
Odpowiednie ciekłe lub stałe postacie preparatów farmaceutycznych obejmują, np. roztwory wodne lub fizjologiczne roztwory soli do inhalacji, cząstki w mikrokapsułkach, wprowadzone, naniesione na mikroskopowe cząstki złota, zawarte w liposomach, rozpylane, w aerozolu, peletkach do implantacji pod skórę, lub wysuszone na ostrym przedmiocie do „wdrapania” w skórę. Kompozycje farmaceutyczne obejmują także granulki, proszki, tabletki, tabletki powlekane, (mikro)kapsułki, czopki, syropy, emulsje, zawiesiny, kremy, krople lub preparaty o przedłużonym uwalnianiu aktywnych związków, w przypadku których zaróbki i dodatki i/lub środki wspomagające, takie jak substancje dezintegrujące, spoiwa, środki powlekające, środki spęczające, środki poślizgowe, środki aromatyzujące, środki słodzące lub solubilizatory stosuje się zwyczajowo, tak jak to opisano powyżej. Kompozycje farmaceutyczne są odpowiednie do zastosowania w różnych systemach dostarczania leku. Krótki przegląd sposobów dostarczania leku, patrz: Langer, Science 249: 1527-1533, 1990.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG i ewentualnie inne środki terapeutyczne i/lub antygeny można podawać per se (czyste) lub w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Przy zastosowaniu w medycynie sole powinny być farmaceutycznie dopuszczalne, lecz można dogodnie stosować farmaceutycznie niedopuszczalne sole w celu uzyskania ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Takie sole obejmują między innymi te wytworzone z kwasów takich jak: kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy, maleinowy, octowy, salicylowy, p-toluenosulfonowy, winowy, cytrynowy, metanosulfonowy, mrówkowy, malonowy, bursztynowy, naftaleno-2-sulfonowy i benzenosulfonowy. Dodatkowo, można wytworzyć takie sole jak sole metali alkalicznych lub sole ziem alkalicznych, takie jak sole sodu, potasu lub wapnia kwasu karboksylowego.
Odpowiednie bufory obejmują: kwas octowy i sól (1-2% wag./obj.); kwas cytrynowy i sól (1-3% wag./obj.); kwas borowy i sól (0,5-2,5% wag./obj.); i kwas fosforowy i sól (0,8-2% wag./obj.). Odpowiednie środki konserwujące obejmują chlorek benzalkoniowy (0,003-0,03% wag./obj.); chlorobutanol (0,3-0,9% wag./obj.); parabeny (0,01-0,25% wag./obj.) i timerosal (0,004-0,02% wag./obj.).
Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej ilości oraz ewentualnie antygeny i/lub inne terapeutyczne środki zawarte ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
Termin farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oznacza jeden lub więcej kompatybilnych stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji opłaszczających odpowiednich do podawania ludziom lub innym kręgowcom. Termin nośnik oznacza organiczny lub nieorganiczny składnik, naturalny lub syntetyczny, z którym łączy się aktywny składnik w celu ułatwienia podawania. Składniki kompozycji farmaceutycznych można też mieszać z opisanymi tu związkami, i ze sobą, w taki sposób, że nie występuje oddziaływanie, które w znaczny sposób upośledzałoby pożądaną skuteczność farmaceutyczną.
PL 232 260 B1
Wynalazek zilustrowano następnie poniższymi przykładami, których w żaden sposób nie należy rozumieć jako ograniczenie.
Przykłady
Materiały i metody: oligodeoksynukleotydy (ODN)
Wszystkie ODN zakupiono w Biospring (Frankfurt, Niemcy) lub Sigma-Ark (Darmstadt, Niemcy) oraz przebadano kontrolnie ich identyczność i czystość w Coley Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Niemcy). ODN rozcieńczono buforowanym fosforanem roztworem soli (Sigma, Niemcy) i przechowywano w temperaturze -20°C. Wszystkie rozcieńczenia prowadzono stosując reagenty pozbawione pirogenów.
Oczyszczanie komórek
Preparaty górnej, jaśniejszej warstwy skrzepu zawierającej włóknik i krwinki białe z krwi obwodowej od zdrowych dawców - mężczyzn i kobiet - otrzymano z Banku Krwi z University of Dusseldorf (Niemcy) a z nich wyizolowano PBMC przez odwirowanie z odczynnikiem Ficoll-Hypaque (Sigma). Oczyszczone PBMC albo użyto od razu (w większości testów) albo zawieszono w podłożu do mrożenia i przechowywano w temperaturze -70°C. W razie potrzeby próbki tych komórek odmrażano, przemywano i ponownie zawieszano w podłożu hodowlanym RPMI 1640 (BioWhittaker, Belgium) uzupełnionym 5% (objętościowo) inaktywowaną wysoką temperaturą surowicą ludzką AB (BioWhittaker, Belgia) lub 10% (objętościowo) inaktywowanej wysoką temperaturą FCS, 2 mM L-glutaminy (BioWhittaker), 100 U/ml penicyliny i 100 gg/ml streptomycyny (Invitrogen (Karlsruhe, Niemcy)).
Wykrywanie cytokin
Rozmrożone lub świeże PBMC wysiano na 48 dołkowe płaskodenne płytki, lub 96 dołkowe okrągłodenne płytki, i inkubowano z ODN o stężeniach jak wskazano, w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C. Supernatanty z hodowli zebrano i jeśli nie użyto bezpośrednio, zamrożono w temperaturze -20°C aż do momentu użycia. Ilość cytokin w supernatantach oszacowano stosując dostępne w handlu zestawy ELISA (Diaclone, USA) lub zestawy ELISA utworzone na miejscu z zastosowaniem przeciwciał dostępnych na rynku (firmy Becton Dickinson/Pharmingen lub PBL).
Hodowle do cytometrycznej analizy aktywacji komórek NK
Przeciwciała monoklonalne sprzężone z fluorochromem skierowane przeciw CD3 (marker limfocytów T), CD56 (marker komórek NK) i CD69 (marker wczesnej aktywacji na komórkach NK i limfocytach T) zakupiono od Becton Dickinson. PBMC inkubowano przez 24 godziny z dodatkiem lub bez ODN w różnych stężeniach w 96 dołkowych okrągłodennych płytkach. Komórki NK identyfikowano jako CD56-pozytywne i CD3-negatywne limfocyty metodą cytometrii przepływowej. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano z zastosowaniem cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson). Dane zanalizowano stosując program komputerowy CellQuest (Becton Dickinson).
Analiza powierzchniowych markerów aktywacji komórek z zastosowaniem cytometrii przepływowej
W celu pomiaru ekspresji cząsteczki kostymulującej CD86 jako markera aktywacji na limfocytach B, komórki PBMC inkubowano przez 48 godzin z ODN o stężeniach jak wskazano i komórki barwiono stosując mAb skierowane przeciw CD19 i CD86 (Pharmingen, Niemcy). Ekspresję CD86 na CD19 pozytywnych limfocytach B zmierzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
W celu pomiaru ekspresji cząsteczki kostymulującej CD80 jako markera aktywacji na monocytach, komórki PBMC inkubowano przez 48 godzin z ODN o stężeniach jak wskazano i komórki barwiono stosując mAb skierowane przeciw CD14, CD19 i CD80 (Pharmingen, Niemcy). Ekspresję CD80 na CD14-pozytywnych CD19-negatywnych monocytach zmierzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Wyniki obydwu pomiarów podano jako średnią intensywność fluorescencji (MFI).
P r z y k ł a d 1:
Poziomy interferonu alfa (IFN-a), IFN-γ, IL-10, IL-6 i TNF-a wydzielanych przez ludzkie komórki PBMC po ekspozycji tych komórek na opisane tu oligonukleotydy CpG przedstawiono na załączonych fig. 1-5. Badane oligonukleotydy testowe oznaczono na fig. przez ▲. Oligonukleotyd, który służył jako oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczono jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1A, 2A, 3A, 4A, i 5A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, i SEQ ID NO: 324. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1B, 2B, 3B, 4B, i 5B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (gM). Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom cytokiny wydzielonej przez komórki potraktowane negatywną kontrolą (podłożem) i w pewnych przypadkach LPS wyszczególniono dla każdego doświadczenia.
PL 232 260 B1
Jak przedstawiono na fig. 1-5 oligonukleotydy badane w testach były zdolne do wywołania sekrecji cytokiny na poziomach w przybliżeniu takich samych lub wyższych niż oligonukleotydy stanowiące kontrolę pozytywną posiadające szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe. Negatywna kontrola wywołała znacznie mniejszą produkcję cytokin.
P r z y k ł a d 2:
Zbadano poziomy ekspresji CD69 (MFI) na komórkach NK w odpowiedzi na traktowanie badanymi oligonukleotydami w porównaniu z kontrolnymi oligonukleotydami. Ekspresja CD69 jest wskaźnikiem aktywacji limfocytów T i komórek NK. Komórki eksponowano na badane oligonukleotydy oznaczone na fig. 6 przez ▲ w porównaniu z potraktowaniem oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną oznaczonym jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, i SEQ ID NO: 324. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328. Oligonukleotydem stanowiącym kontrolę pozytywną zastosowanym do tych badań jest SEQ ID NO: 329. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom ekspresji CD69 na T i komórki NK potraktowanych negatywną kontrolą (pożywka) i LPS.
Jak przedstawiono na fig. 6 oligonukleotydy badane w testach były zdolne do indukcji ekspresji CD69 na poziomie w przybliżeniu takim samym lub wyższym niż oligonukleotydy stanowiące kontrolę pozytywną posiadające szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe. Kontrola negatywna wywołała znacznie mniejszą produkcję CD69.
P r z y k ł a d 3:
Poziomy interferonu alfa (IFN-α) i IL-10 wytwarzane przez ludzkie komórki PBMC po ekspozycji tych komórek na opisane tu oligonukleotydy CpG przedstawiono na załączonych fig. 7-12 i 17. Badane oligonukleotydy testowe oznaczono na fig. przez . Oligonukleotyd, który służył jako oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną SEQ ID NO: 242 oznaczono jako ·. Oligonukleotyd, który służył jako oligonukleotyd będący kontrolą negatywną oznaczono jako ♦ SEQ ID NO: 330. Testowym oligonukleotydem przedstwionym na fig. 7A i 7B jest SEQ ID NO: 313. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 8A i 8B jest SEQ ID NO: 314. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 9 A i 9B jest SEQ ID NO: 319. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 10A i 10B jest SEQ ID NO: 316. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 11A i 11B jest SEQ ID NO: 317. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 12A i 12B jest SEQ ID NO: 320. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 17A i 17B jest SEQ ID NO: 321. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (gM).
Jak przedstawiono na fig. 7-12 i 17 każdy z oligonukleotydów badanych w testach był zdolny do wywołania różnych poziomów i wzorów sekrecji cytokin. Na przykład przy zastosowaniu w stężeniach w przybliżeniu równoważnych lub niższych, większość badanych ODN powodowała silniejszą indukcję jednej lub więcej cytokin niż oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną posiadający szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe. Substancja stosowana jako kontrola negatywna wywołała znacznie mniejszą produkcję cytokin.
Po inkubacji z SEQ ID NO: 313 PBMC wydzielają podobne poziomy interferonu alfa (IFNa) i interleukiny 10 (IL-10) jak po inkubacji z SEQ ID NO: 242. SEQ ID NO: 314 ma podobny wpływ na ilość IL-10 wydzielanej przez ludzkie komórki PBMC jak SEQ ID NO: 242, podczas gdy sekrecja IFNa znacznie wzrasta. W przeciwieństwie do SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 319 indukuje sekrecję IFNa przez ludzkie komórki PBMC tylko na niskich poziomach, podczas gdy ilość wydzielanej IL-10 dla tych dwóch oligonukleotydów jest porównywalna. SEQ ID NO: 316 był zdolny do spowodowania wydzielania kilkakrotnie większych poziomów IFNa przez ludzkie komórki PBMC niż SEQ ID NO: 242. Zaobserwowano także zwiększenie całkowitej ilości wydzielanej IL-10. SEQ ID NO: 317 wykazuje podobne właściwości do SEQ ID NO: 316, przy silnie zwiększonej sekrecji IFNa przez ludzkie komórki PBMC w porównaniu z SEQ ID NO: 242. Poziomy sekrecji IL-10 były nieznacznie podwyższone. Chociaż SEQ ID NO: 320 powodował indukcję produkcji IFNa i IL-10 przez ludzkie PBMC, indukcja była mniejsza niż spowodowana przez SEQ ID NO: 242. SEQ ID NO: 321 ma zdolność do indukowania produkcji ponad dziesięciokrotnie większych poziomów IFNa przez ludzkie komórki PBMC niż SEQ ID NO: 242 (fig. 17A). W porównaniu z SEQ ID NO: 242, sekrecja IL-10 przez ludzkie komórki PBMC wywołana przez SEQ ID NO: 321 jest nieznacznie zwiększona przy zastosowaniu większych stężeń tego oligonukleotydu (fig. 17B).
PL 232 260 B1
P r z y k ł a d 4:
Poziomy aktywacji limfocytów B i monocytów następującej w wyniku ekspozycji tych komórek na opisane tu oligonukleotydy CpG przedstawiono na załączonych fig. 13-15, 16 i 18-20. Badane oligonukleotydy testowe oznaczono na fig. jako . Oligonukleotyd służący jako oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną SEQ ID NO: 242 oznaczono jako ·. Oligonukleotyd służący jako oligonukleotyd będący negatywną kontrolą oznaczono jako ♦ SEQ ID NO: 330. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 13A i 13B jest SEQ ID NO: 313. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 14A i 14B jest SEQ ID NO: 314. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 15A i 15B jest SEQ ID NO: 319. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 16A i 16B jest SEQ ID NO: 316. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 18A i 18B jest SEQ ID NO: 321. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 19A i 19B jest SEQ ID NO: 317. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 20A i 20B jest SEQ ID NO: 320. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Jak przedstawiono na fig. 13-15, 16 i 18-20 każdy z oligonukleotydów badanych w testach był zdolny do spowodowania różnych poziomów i wzorów ekspresji markerów powierzchniowych na komórkach. Na przykład przy zastosowaniu w stężeniach w przybliżeniu równoważnych lub niższych, większość badanych ODN powodowała silniejszą indukcję ekspresji markerów powierzchniowych na komórce niż oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną posiadający szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe.
Poziom ekspresji CD86 na limfocytach B i ekspresji CD80 na monocytach wywołany przez SEQ ID NO: 313 jest porównywalny z poziomem wywołanym przez SEQ ID NO: 242. W przeciwieństwie do SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 313 stymuluje komórki przy zastosowaniu w niższych stężeniach w porównaniu z SEQ ID NO: 242 co sugeruje zwiększoną moc. Poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B i ekspresji CD80 na monocytach wywołane przez SEQ ID NO: 314 są porównywalne. Efekty działania SEQ ID NO: 314 obserwuje się stosując SEQ ID NO: 314 w niższych stężeniach w porównaniu z SEQ ID NO: 242, wskazując na zwiększoną moc SEQ ID NO: 314. Na limfocytach B, powierzchniowa ekspresja CD86 jest silnie aktywowana przez SEQ ID NO: 319, przy sile sygnału porównywalnej z SEQ ID NO: 242. Stosując SEQ ID NO: 319 można wykryć jedynie nieznacznie podwyższone poziomy ekspresji CD80 na monocytach. Zdolność SEQ ID NO: 319 do indukowania aktywacji ekspresji CD86 na limfocytach B jest nieznacznie zmniejszona w porównaniu z SEQ ID NO: 242. W porównaniu z SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 316 indukuje większą ekspresję markera aktywacji CD86 na limfocytach B (fig. 16A) i markera aktywacji CD80 na monocytach (fig. 16B). Limfocyty B są silnie aktywowane po inkubacji ludzkich komórek PBMC z SEQ ID NO: 321 jak udowodniono na podstawie ekspresji CD86 (fig. 18A). Ekspresja CD86 jest większa niż wywołana przez SEQ ID NO: 242. Także aktywacja monocytów, co określono na podstawie ekspresji CD80, jest większa przy zastosowaniu SEQ ID NO: 321 niż przy zastosowaniu SEQ ID NO: 242 (fig. 18B). SEQ ID NO: 317 indukuje ekspresję CD86 na limfocytach B porównywalną jak SEQ ID NO: 242 (fig. 19A), podczas gdy ekspresja markera aktywacji CD80 na monocytach jest zwiększona w porównaniu z ekspresją po SEQ ID NO: 242 (fig. 19B). SEQ ID NO: 320 indukuje ekspresję CD86 na limfocytach B w podobnym stopniu co SEQ ID NO: 2426 (fig. 20A).
P r z y k ł a d 5. Semi-miękkie oligonukleotydy mają działanie immunostymulujące na ludzkie komórki PBMC in vitro.
W tym przykładzie semi-miękkie oligonukleotydy badano pod kątem ich zdolności do indukowania produkcji cytokin i chemokin in vitro. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) otrzymano od trzech zdrowych osób i hodowano w obecności całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu CpG SEQ ID NO: 242 lub semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241 w różnych stężeniach (0,05, 0,1,0,2, 0,5, 1,0, i 5,0 μM). Po 6, 16, lub 48 godzinach, supernatanty znad hodowli zebrano i zmierzono ilość różnych cytokin (IFN-α, TNF-a, IL-10) i chemokiny IP-10 w supernatantach metodą ELISA. Przy zastosowaniu oligonukleotydu w niskich stężeniach, semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy indukowały produkcję IFN-α w podobnym stopniu po 16 lub 48 godzinach w hodowli. Jednakże maksymalną indukcję produkcji IFN-α z zastosowaniem ODN 5476 osiągnięto stosując oligonukleotyd w stężeniu około o połowę miejszym niż wymagane dla SEQ ID NO: 242. Przy zastosowaniu w pośrednich stężeniach, SEQ ID NO: 242 indukuje większą produkcję IFN-α niż SEQ ID NO: 241, a przy zastosowaniu w wysokich stężeniach, ani SEQ ID NO: 242 ani SEQ ID NO: 241 nie indukuje dużej produkcji IFN -α. Produkcja chemokiny IP-10 była stymulowana przez semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy w podobnym stopniu i z podobną zależnością od stężenia. W obu przypadkach, zaobserwowano produkcję około 700 μg/ml IP-10 przy zastowowaniu oligonukleotydu w niższych stężeniach,
PL 232 260 Β1 i mniejszą produkcję IP-10 wywołaną przy zastosowaniu oligonukleotydu w większych stężeniach. Podobne wzory zachowania do wzorów zachowania dla IP-10 zaobserwowano dla cytokiny IL-10, z tym wyjątkiem, że semi-miękki oligonukleotyd w stężeniu 0,05 μΜ wywoływał produkcję znaczących ilości IL-10, podczas gdy całkowicie stabilizowany oligonukleotyd w stężeniu 0,05 μΜ wywoływał niewielką produkcję IL-10 lub nie powodował jej wcale. Semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy miały podobną zdolność do indukowania produkcji TNF-α, tj. oba typy oligonukleotydów silnie indukowały produkcję TNF-α, szczególnie w dużym stężeniu.
Tabela 1. Cytokiny i chemokina (pg/ml)1 których produkcję indukowały oligonukleotydy (μΜ)
ODN 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0
IFN-a SEQ ID 534,8 466,0 251,6 25,4 22,9 26,7
NO: 241 (3,5) (7,5) (22,9) (21,4) (26,3) (22,1)
SEQ ID 444,0 573,6 892,4 583,6 115,6 51,5
NO: 242 (23,9) (41,7) (58,0) (51,5) (2,5) (12,8)
IP-10 SEQ ID 5677,8 6221,5 4936,6 1493,6 121,9 0,0
NO: 241 (18,9) (22,4) (11,8) (5,5) (0,4) (0,0)
SEQ ID 7287,4 6685,8 6967,4 4422,7 361,7 0,0
NO: 242 (5,5) (12,8) (15,9) (11,0) (2,6) (0,0)
IL-10 SEQ ID 447,6 385,3 257,3 92,9 46,5 17,3
NO: 241 (3,7) (4,9) (3,1) (1,6) (0,2) (1,5)
SEQ ID 73,4 399,8 367,7 237,8 52,3 10,5
NO: 242 (1,0) (3,0) (9,8) (2,6) (1,3) (0,3)
TNF-a SEQ ID 179,0 186,4 229,9 178,8 368,2 886,3
NO: 241 (18,3) (15,9) (23,4) (9,0) (22,3) (31,7)
SEQ ID 196,8 211,5 242,7 2 62,1 479,8 939,6
NO: 242 (25,9) (8,7) (5,5) (6,3) (33,5) (69,7)
'Wartości przedstawione jako średnia (odchylenie standardowe).
Przykład 6. Stymulacja makrofagów myszowatych in vitro przez semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 w porównaniu z całkowicie stabilizowanym ODN.
Linię makrofagów myszowatych (RAW264) inkubowano przez 16 godzin z semi-miękkim oligonukleotydem SEQ ID NO: 241, całkowicie stabilizowanym oligonukleotydem SEQ ID NO: 242, całkowicie stabilizowanym ODN 1826, lipopolisacharydem (LPS) lub PBS. Działanie semi-miękkiego i całkowicie stabilizowanego ODN badano w stężeniach 0,02, 0,05, i 0,1 μΜ. Supernatanty zebrano i metodą
ELISA zmierzono ilość podjednostki p40 IL-12 (IL-12p40, pg/ml). Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Semimiękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 znacznie silniej indukował makrofagi do wydzielania IL-12p40 niż oba całkowicie stabilizowane ODN.
PL 232 260 Β1
Tabela 2. Sekrecja IL-l2p40 przez makrofagi myszowatych stymulowana przez semi-miękki oligonukleotd SEQ ID NO: 241
ODN Stężenie ODN (μΜ) IL-12p40,pg/ml średnia (S.D.)
SEQ ID NO: 0,02 148,8 (37,5)
241 0,05 149,8 (28,7)
0,1 162,3 (8,4)
SEQ ID NO: 0,02 41,4 (18,6)
242 0,05 42,0 (26,2)
0,1 23,0 (10,7)
SEQ ID NO: 0,02 43,5 (23,0)
3 96 0,05 38,3 (19,2)
0,1 54,4(4,1)
LPS 346,5 (20,5)
ΡΒΞ 32,0 (12,1)
Przykład 7. Semi-miękkie oligonukleotydy klasy B o sekwencji zoptymalizowanej do stymulacji ludzkich komórek układu odpornościowego są silnymi immunostymulatorami komórek układu odpornościowego myszowatych.
Stwierdzono, że komórki układu odpornościowego ludzkiego i myszowatych reagują na różne ODN CpG. Całkowicie stabilizowany oligonukleotyd CpG SEQ ID NO: 242 uznano za „optymalny” do stymulacji ludzkich komórek układu odpornościowego, lecz nie uznano za „optymalny” do stymulacji komórek układu odpornościowego myszowatych. Odwrotnie, całkowicie stabilizowane ODN CpG 5890 (5'T*C*A*A*C*G*T*T3') uznano za „optymalny” do stymulacji komórek układu odpornościowego myszowatych, lecz nie uznano za „optymalny” do stymulacji ludzkich, komórek układu odpornościowego. Stwierdzono, że zarówno limfocyty B ludzkie jak i limfocyty B myszowatych eksprymują TLR9. Eksprymujące TLR9 splenocyty myszowatych HEK293 hodowano w obecności całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu CpG SEQ ID NO: 242 w różnych stężeniach, całkowicie stabilizowanego ODN CpG 5890, lubsemi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, a aktywację TLR9 zmierzono jak następuje. Komórki stosowane do tego testu eksprymowały myszowatych TLR9 i zawierały konstrukt genu reporterowego. Komórki inkubowano z ODN przez 16 godzin w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze. Wszystkie badania przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Komórki zlizowano i oznaczono aktywność genu reporterowego. Obliczono indeksy stymulacji w odniesieniu do aktywności genu reporterowego w podłożu bez dodatku ODN. Semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 i całkowicie stabilizowany oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 posiadały identyczną sekwencję zasad. Wyniki przedstawiono w tabeli 3. SEQ ID NO: 241 i SEQ ID NO: 242 w najniższych stężeniach wykazywały minimalne działanie immunostymulujące. Jednakże, gdy stężenie zwiększono do 14 nM i więcej, SEQ ID NO: 241 miał wyraźnie większe działanie immunostymulujące niż SEQ ID NO: 242. W największym stężeniu badanym w tym doświadczeniu, SEQ ID NO: 241 działał co najmniej równie stymulująco jak zoptymalizowany dla myszowatych, całkowicie stabilizowany oligonukleotyd ODN 5890.
PL 232 260 Β1
Tabela 3. Stopień stymulacji komórek HEK293 myszowatych eksprymujących TLR9 przez semi-miękki ODN o sekwencji zoptymalizowanej dla komórek ludzkich
Stężenie ODN
5890 SEQ ID NO: 241 SEQ ID NO: 242
0,9 nM 1,4 0, 7 0,9
3,5 nM 2,4 1,1 1, 2
14 T1M 12,5 1,9 1, i
58 nM 21, 4 4,3 2, 0
0,23 μΜ 25,2 12,0 6,2
0, 94 μΜ 28, 6 18,3 8, 0
3,75 μΜ 29,3 32,1 10,3
Przykład 8-9. Semi-miękkie oligonukleotydy indukują aktywację komórek NK.
Semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy porównano także pod kątem ich zdolności do stymulacji aktywacji komórek NK. Stosując standardowy test uwalniania chromu, 10x106 komórek śledziony myszy BALB/c hodowano przez 48 godzin w 2 ml RPMI uzupełnionego 10% FBS (inaktywowaną wysoką temperaturą do 65°C przez 30 minut), 50 μΜ 2-tioetanolu, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, i 2 mM L-glutaminianu, z dodatkiem lub bez albo semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241 albo całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, każdego z ODN dodając do końcowego stężenia 1, 3, lub 10 μg/ml. Komórki przemyto i następnie zastosowano jako komórki efektorowe w krótkoterminowym teście uwalniania 51Cr z zastosowaniem YAC-1 i 2C11, dwie docelowe linie komórkowe wrażliwe na NK (Ballas ZK i in. (1993) J Immunol 150: 17-30). Komórki efektorowe dodano w różnych stężeniach do 104 51Cr-znakowanych komórek docelowych w V-dennych płytkach do mikromiareczkowania w 0,2 ml, i inkubowano w 5% CO2 przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Badane proporcje komórki efektorowe: komórki docelowe (E:T) wynosiły 6,25:1,25:1, 50:1, i 100:1. Zawartość płytek następnie żwirowano i w próbce supernatantu zmierzono radioaktywność. Procent specyficznej lizy określono przez obliczenie stosunku 51Cr uwalnianego w obecności komórek efektorowych minus ilość 51Cr uwalnianego gdy komórki docelowe hodowano same, do całkowitej liczby uwalnianego po lizie komórek w 2% kwasie octowym (100 procent lizy) minus wartość 51Cr cpm gdy komórki hodowano same. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 5. Podsumowując, semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 i całkowicie stabilizowany oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 indukowały w istocie porównywalne poziomy aktywacji komórek NK dla wszystkich badanych stężeń ODN i proporcji E:T.
Tabela 5. Specyficzna liza za pośrednictwem komórek NK
ODN pg/ml stosunek E:T
6,25:1 25:1 50:1 100:1
SEQ ID NO: 241 1 8 17 17,5 27,5
3 2,5 5 8 15
10 4 12,5 20 28
SEQ ID NO: 242 1 7 8 12,5 22
3 3 r 5 4 11 18
10 5 12,5 23 32,5
Przykład 10. Semi-miękkie oligonukleotydy mają na ogół silniejsze działanie immunostymulujące niż oligonukleotydy zawierające tylko wiązania tiofosforanowe o takiej samej lub podobnej sekwencji.
Wszystkie badane semi-miękkie wersje były bardziej aktywne w teście z zastosowaniem ludzkiego TLR9 niż odpowiednie cząsteczki zawierające tylko wiązania tiofosforanowe (tabela 6). Średni
PL 232 260 Β1 stopień stymulacji obliczono na podstawie danych prób dla czterech stężeń (0,1 μΜ, 0,5 μΜ, 2 μΜ, i 8 μΜ). W tabeli U oznacza 2'-deoksyuracyl.
Tabela 6. Względne średnie indeksy stymulacji semi-miękkimi oligonukleotydami w porównaniu z oligonukleotydami zawierającymi tylko wiązania tiofosforanowe o takiej samej lub podobnej sekwencji
Sekwencja Względny średni indeks stymulacji
r*CłG*T*C*G*TłT*T*T*C*G*G*C*G*G*C‘C‘GłC*CłG (SEQ ID NO: 247) 1.00
r*C4G*C*C*G*T*T*T*T‘C G*G4C G*G*C*C G*C*CłG (SEQ ID NO:248) 0.74
T4C*G*C‘G4G*T'*T*T4T*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NÓ:249) 0.72
T*C*G*T*C*G*TłT*T*T*C G*G*C GłG*C*C GłC*C*G (SEQ ID NO:250) 1.37
r*CłG*T*C*G*T*T*TłT*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:251) 1.25
T*C G*C*C G*T*T*T*T*C G*G+C G*G*C*C GłC*C*G (SEQ ID NO:252) 2.99
T*C G*C‘C G*TłT*I*T*C G+G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:253) 2.22
TiC GłT*C GłT*TłT*T*C*G*G*C'‘'G*G*C*C*G''C:4C*G (SEQ ID NO: 254) 3.46
r*C G*T‘C G*TJ'T*T4,T‘C‘G4G*C*G*G*CiC*G*C*C*G (SEQ ID NO; 255) 4.08
7*C G*T*C G*T*T*TłT4C G*GłC G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:256 | 5.69
T*C G*T*C g*t*T*T*T*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:257> 4.49
T*GłT*C*G*T*T*G*T*C*S*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:244) 1.00
TłG*T*C GłT*T*G*T4C_G*T*T+G*T*C_G*T+T*G+T*C GłT*T {SEQ ID 90:258) 4.23
T*G*T,kC g*T*T*G*T*C g*t*t g*t*c g*t*t G*T*C G*T*T (SEQ id NOt243) 4.74
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*TłT (5EQ ID NO r 259) 1.00
T4C_G*T*C G*T*T’ŁT*C_G*T*C_G*T*T‘T‘T,'GłT*C_G*T‘T (SEQ ID NO:260) 1.80
TłC*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A*C*G*T*T*T*TłG*TłC*-G*TłT (SEQ ID 90:261) 1.00
T*ę G*T*C G*T*T*T*C G*A*C g*t*t*t*t*g*t*c G*T*T (SEQ id NO:262} 2.71
T*C G*T*C G*T47*T*T_G*A*C_G4T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ id NO:263) 3.01
T*C G*T*C G‘TłT*T*T G*A*C G*T*T*T*T*G*T*C G*TłT (SEQ ID 90:264) 3.06
T*C G*T*C G*TłT‘T‘T G*A*C Gł,r*IłT‘T (5EQ ID N0:265) 2.06
I*C_G*T4C_G*T*T*T*T_G*A*C_G+T*T (SEQ ID NO:265) 1.43
I'C G*TJ-C GiT*T*T*C G*AłC*GłT*T |SEQ ID NO: 267) 0.91
Ε*Τ»Τ*σ*Τ*0*β*0*Τ*β*·β*Τ*θ*Α*β*Τ*Τ*Τ*0*Α (SEQ ID NO: 268) 1.00
G*T‘T‘C*T*C G‘C4T G*G*T G4A4G’‘T‘T4T‘C*A (SEQ ID NO:269) 3.45
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T {SEQ id NO:270) 1.00
T*C G4T*C G*T*T*T*C G*T*C_G*T*T4T*C_G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:271) 2.49
T4C G*T*C G*T*TłT*U G*T*C g*t*t*t*t G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:272) 2.51
T*C*G*T*C*8*T*T*T*U*S*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*’T (SEQ ID 1.00
NO:273)
T*C G*TłC_G*T*T*T*U G*T‘C G4T*T*T*I G*T*C G*T‘T (SEQ ID 90:274) 2.62
PL 232 260 Β1
r*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEO ID 1.00
NO;242)
T*C G*T+C g*t*t*T*T G*T*C G*T*T*T*T G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:276) 1.95
T*C*G*U*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*U*G*U*C*G*T*T (SEO ID 1.00
NO:277)
T*c G*D*C_G*T*T*T*T G*T*C G*T*T*T*U G*U*C G*T*T (SEQ ID NO:278) 1.39
T*C*G*T*C*G*U*U+U*T*G*T*C*G*U*U*G*V*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:279) 1.00
T*C G*T*C G*U*D*U*C G*T*C G*U*U*Uł'U G*T*C G^T*! (SEQ ID NO:280) 2.05
A*a*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:281) 1.00
A*A*C_GiT*C_G*T*T*T’lT*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 282) 1.58
Przykład 11. Zwiększona in vitro moc semi-miękkich wersji całkowicie stabilizowanych oligonukleotydów o słabym działaniu immunostymulującym (T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T, SEQ ID NO: 244) jest całkowicie stabilizowanym, zawierającym tylko wiązania tiofosforanowe oligonukleotydem CpG o małej mocy immunostymulującej w porównaniu z SEQ ID NO: 242.
Pokrewne semi-miękkie oligonukleotydy (T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T, SEQ ID NO: 258) i (T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T, SEQ ID NO: 243) miały wielokrotnie większą moc niż SEQ ID NO: 244 i nawet większą moc niż SEQ ID NO: 242.
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID
NO:258)
T*g*T*CJ3*T*T*G*T*CG*T*T_CFT*C_G*T*Tj3*T*C_G*T*T (SEQ id
NO:243)
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID
NO.244)
Tabela 7. Zwiększona stymulacja układu odpornościowego przez semi-miękkie warianty całkowicie stabilizowanego lecz słabo immunostymulującego oligonukleotydu
ODN Stężenie ODN, μΜ
0,1 0,5 2 8
SEQ ID NO: 244 16,0 47,5 71,4 68,5
SEQ ID NO; 243 19,3 40, 5 78,2 77,9
SEQ ID NO: 241 2,6 9,5 12,9 14,0
SEQ ID NO: 242 10,6 34,2 38,3 40, 8
Przykład 12. Skrócone semi-miękkie oligonukleotydy wykazują działanie immunostymulujące in vitro.
PL 232 260 Β1
Semi-miękki 16-mer, SEQ ID NO: 283, 16-mer, SEQ ID NO: 245, 17-mer, SEQ ID NO: 284, i 24-mer, SEQ ID NO: 241 porównano z całkowicie stabilizowanym 24-merem ODN, SEQ ID NO: 242, i 18-merem, SEQ ID NO: 285, pod kątem ich zdolności do stymulacji sygnalizacji TLR9. Każdy oligonukleotyd dodano do komórek HEK293 transfekowanych ludzkim TLR9 i konstruktem genu reporterowego w stężeniu 1,6, 12, lub 24 μg/ml i zmierzono aktywację TLR9 jak opisano powyżej.
(16-mer) T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO:283) (16-mer) T*C_G*T*C_G*T*T*T’C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:245) (17-mer) T*Cjj*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:284) (18-mer) A*A*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:285) (24-mer)T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID
NO:241) (24-mer)T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID
NO:242)
Podczas gdy 18-merowy całkowicie stabilizowany oligonukleotyd ODN SEQ ID NO: 285 miał słabsze działanie immunostymulujące niż 24-merowy całkowicie stabilizowany oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 we wszystkich badanych stężeniach, 16-merowe i 17-merowe semi-miękkie oligonukleotydy były co najmniej tak stymulujące jak 24-mer SEQ ID NO: 242 w stężeniach 6 μg/ml i wyższych. Ponadto, 16-merowe i 17-merowe semi-miękkie oligonukleotydy miały działanie prawie tak immunostymulujące jak 24-merowy semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241.
Tabela 8. Immunostymulacyjna aktywność krótkich semi-miękkich oligonukleotydów w porównaniu z krótkimi i długimi całkowicie stabilizowanymi i semi-miękkimi oligonukleotydami
ODN Stężenie ODN, pg/ml
1 6 12 24
SEQ ID NO: 283 1,2 17,1 29,0 39,5
SEQ ID NO: 245 1,1 8,4 31,3 48,9
SEQ ID NO: 284 3,4 23,9 35,9 45,6
SEQ ID NO: 285 4,6 12,9 15,9 18,0
SEQ ID NO: 241 6,4 33, 0 50,8 58,6
SEQ ID NO: 242 11,0 24,6 26,2 21,9
Przykład 13. Semi-miękkie oligonukleotydy mają działanie immunostymulujące in vivo.
Myszy BALB/c podzielono na grupy i podawano im podskórnie 400 μg semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, całkowicie stabilizowanego immunostymulującego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu będącego negatywną kontrolą (TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT, SEQ ID NO: 286), lub równoważną objętość fizjologicznego roztworu soli buforowanego fosforanem (PBS). Zwierzęta skrwawiono 3 godziny po wstrzyknięciu i określono osoczowe poziomy IP-10, IFN-γ i TNF-α stosując odpowiedni cytokinospecyficzny test ELISA. Poziom IP-10 w osoczu był około dwukrotnie wyższy u zwierząt otrzymujących semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 (8000-12000 pg/ml) niż u otrzymujących całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligo
PL 232 260 B1 nukleotyd SEQ ID NO: 242 (3500-8000 pg/ml). Poziom IP-10 w osoczu u zwierząt otrzymujących kontrolny oligonukleotyd SEQ ID NO: 286 był równie niski jak poziom IP-10 u zwierząt otrzymujących PBS. Semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 i całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 indukowały podobne ilości IFN-γ, około 150 pg/ml. Semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 indukował 30-45 procent więcej TNF-a niż całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 (około 1550 pg/ml) w porównaniu z około 1175 pg/ml w jednym doświadczeniu i około 710 pg/ml w porównaniu z 490 μg/ml w innym doświadczeniu.
W innym zestawie doświadczeń in vivo, semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy badano pod kątem ich zdolności do leczenia nowotworów u myszy BALB/c. Trzy grupy myszy BALB/c nastrzykiwano dootrzewnowo komórkami gruczolakoraka nerek myszowatych pochodzenia samorzutnego (Renca), stosując ustalony model nowotworowy. Salup RR i in. (1985) J Immunopharmacol 7: 417-36. Każda grupa myszy otrzymała także albo 100 mg semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, albo 100 mg całkowicie stabilizowanego immunostymulującego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, albo równoważną objętość PBS. Myszy obserwowano pod kątem przeżywalności i pod kątem wymiaru guza w momencie śmierci. U myszy o pozornej terapii z zastosowaniem PBS średnia przeżywalność wynosiła 44 dni a w ciągu 50 dni przeżywalność wynosiła 20 procent. Dla odmiany przeżywalność myszy otrzymujących semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 wynosiła 80 procent w ciągu 50 dni, a myszy otrzymujących całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 wynosiła 70 procent w ciągu 50 dni. W przeliczeniu na wielkość guza (milimetry sześcienne) po 52 dniach u myszy otrzymujących PBS objętości guzów wynosiły prawie 1200 mm3, podczas gdy u myszy otrzymujących semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 lub całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 guzy miały objętość odpowiednio około 250 mm3 i 180 mm3. Zatem zarówno semi-miękki oligonukleotyd jak i całkowicie stabilizowany oligonukleotyd były wysoce efektywne w zmniejszaniu obciążenia nowotworem i wydłużaniu przeżywalności w tym modelu doświadczalnym.
P r z y k ł a d 14. Miękkie lub semi-miękkie oligonukleotydy wykazują zmniejszoną nefrotoksyczność. Obserwuje się, że podawanie małpom całkowicie stabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów może być związane z rozwojem zapalenia kłębuszków nerkowych, tj. zapalenia nerki. Zapalenie kłębuszków nerkowych można diagnozować i monitorować na podstawie obecności czerwonych krwinek i białka w moczu, czemu często towarzyszy zmniejszona szybkość przesączania kłębuszkowego (z azotemią), retencja soli i wody, nadciśnienie oraz obrzęk. W warunkach prawidłowych, w moczu zasadniczo nie występują komórki krwi i białka osocza. Diagnozę można także postawić na podstawie histologicznego badania tkanki nerki. Wiadomo, że tkanka nerki jest bogata w nukleazy, które powinny być bardziej aktywne w stosunku do miękkich oligonukleotydów niż w stosunku do całkowicie stabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów.
Małpy dzieli się na dwie grupy, jednej podaje się miękkie oligonukleotydy, a drugiej całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy. Miękkie oligonukleotydy i całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy mają identyczne sekwencje i różnią się jedynie wiązaniami internukleotydowymi. Obie grupy małp otrzymują immunostymulujący oligonukleotyd w takiej samej dawce. Przed potraktowaniem (linia odniesienia) i okresowo podczas traktowania wykonuje się pomiary co najmniej jednego parametru przydatnego do oceny występowania zapalenia kłębuszków nerkowych, obejmujące, np., analizę moczu za pomocą paska pod kątem białkomoczu i/lub krwiomoczu, mikroskopową analizę moczu na obecność czerwonych krwinek i/lub wałeczków erytrocytarnych, pomiar stężenia białka w moczu, pomiar azotu mocznikowego we krwi (BUN), kreatyniny w osoczu, ciśnienia krwi, pomiar masy ciała i biopsję nerki z analizą tkanki z zastosowaniem mikroskopu świetlnego i/lub elektronowego. Wyniki badań klinicznych zestawia się z typem immunostymulującego oligonukleotydu podawanego każdej małpie i porównuje się wyniki pomiędzy grupami w celu określenia istotności statystycznej.
Ewentualnie, dodatkowo sparowane grupy małp, którym podaje się albo miękkie lub semi-miękkie oligonukleotydy lub całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy jak powyżej, lecz z zastosowaniem oligonukleotydu w większej lub mniejszej dawce (dawkach), dołącza się następnie w celu oceny wyników jako funkcji dawki oligonukleotydu.
U małp otrzymujących miękkie oligonukleotydy występuje znacznie mniejsza skłonność do rozwoju zapalenia kłębuszków nerkowych niż u małp otrzymujących całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy.
P r z y k ł a d 15. Miękkie oligonukleotydy w dużym stężeniu wykazują zwiększoną moc immunostymulującą.
PL 232 260 Β1
Miękkie oligonukleotydy porównano z SEQ ID NO: 242 pod kątem ich zdolności do indukowania aktywności TLR9. Miękkie ODN i kontrolny oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 porównano w każdym z czterech stężeń, 1 gg/ml, 6 gg/ml, 12 gg/ml, i 24 gg/ml. Stosunki aktywacji w każdym stężeniu przez każdy miękki oligonukleotyd w porównaniu z aktywacją przez SEQ ID NO: 242 przedstawiono poniżej w tabeli 9. Wyniki te wskazują, że miękkie oligonukleotydy mają silniejsze działanie immunostymulujące niż SEQ ID NO: 242 w badanych wyższych stężeniach.
T*G*T*C_G_TłT*G*T*C_G_T*T*G*T*C_G_T*T*G_T*C_G+T*T SEQIDNO:287
T*C G T*T*T*T*T*T*TłC G T*T*T*T*T*T*T*C G T*T*T SEQ ID NO:288
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*C_G_G*T*C_G_T*T*T*T SEQ ID NO:289
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*T*C„G_T*G*C_G_T*T*T*T*T SEQ ID NO:290
T*C_G_T*C_GT*T*T*T*C_G_T*T*T*T*T*T*T*C G*T*T*T SEQIDNO:291
T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G T*T*T*T*T*T*T*C G*A SEQ ID NO:292
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T*T_G*T_C_G*T*T SEQIDNO:293
Tabela 9. Względna moc miękkich oligonukleotydów w porównaniu z SEQ ID NO: 242 w każdym ze stężeń
ID Stężenie ODN, pg/ml
1 6 12 24
SEQ ID NO; 287 0,11 0,12 1,00 1,68
SEQ ID NO: 288 0,30 0,62 1,67 1,81
SEQ ID NO: 289 0,13 0,52 1,67 1,97
SEQ ID NO: 290 0,18 0,41 1,69 2,27
SEQ ID NO: 291 0,16 0,35 1,56 1,81
SEQ ID NO: 292 0,25 0,48 1,38 1,84
SEQ ID NO: 293 0,10 0,11 1,20 2,05
Przykład 16. Trwałość oligonukleotydu w osoczu i w tkankach.
Myszy nasktrzykiwano podskórnie stosując 25 mg/kg semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, miękkiego oligonukleotydu (T*c*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T; SEQ ID NO: 294), lub całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242. Po upływie określonej liczby godzin pobrano próbki tkanki i osocza i zanalizowano je na obecność nienaruszonych oligonukleotydów i ich fragmentów.
Próbki tkanki lub osocza nastrzyknięto znaną ilością ODN będącego wewnętrznym standardem (1,25 gg poliT) i ODN wydzielono z próbek tkanki i osocza przez ekstrakcję w fazie stałej (SPE) sposobem opisanym poniżej. Uzyskane roztwory zawierające analit, metabolity, i wewnętrzny standard zanalizowano metodami żelowej elektroforezy kapilarnej (CGE) i MALDI-TOF także opisanymi poniżej. Całkowite ilości odzyskanego ODN (tj. analit plus metabolity) próbek z nerki, wątroby, śledziony i osocza określono przez zanalizowanie CGE. Obliczono odchylenie standardowe. Każdemu metabolitowi przypisano względną ilość w procentach całkowitej powierzchni piku.
SPE. W celu oddzielania ODN od osocza, 100 gg próbki nastrzyknięto 1,25 gg ODN będącego wewnętrznym standardem, wymieszano i rozpuszczono w 5 ml buforu SAX. Ten roztwór wprowadzono
PL 232 260 Β1 na kolumnę anionowymienną (SAX, Agilent), kolumnę przemyto i ODN eluowano stosując bufor o wzrastającej sile jonowej. Uzyskany eluat odsolono, stosując kolumnę w układzie faz odwróconych (RP) (Glen Research) lub porównywalną kolumnę (HLB, Waters). Eluaty z kolumny RP, zawierające tylko wodę i acetonitryl osuszono i rozpuszczono w tej samej probówce w 60 μΙ wody dejonizowanej. W celu dalszego odsolenia próbki przeprowadzono dializę z zastosowaniem błony dializującej. Próbki zanalizowano bezpośrednio metodą żelowej elektroforezy kapilarnej. Do MALDI-TOF MS, stosowano próbki nierozcieńczone albo zatężone, tj.50 μΙ próbki ODN osuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie dejonizowanej i oznaczono jak opisano poniżej.
ODN z tkanki wydzielono według podobnego protokołu SPE. 100 mg tkanki zhomogenizowano stosując urządzenie FastPrep. Dodano proteazę K i przez 2 godziny hydrolizowano białka. Ekstrakcję z zastosowaniem fenolu przeprowadzono przed poddaniem rozpuszczalnej w wodzie frakcji opisanej powyżej w procedurze SPE.
CGE. Odsolone próbki zawierające analit, jego metabolity i określoną ilość ODN będącego wewnętrznym standardem elektrokinetycznie wprowadzono do wypełnionej żelem kapilary (obojętna, 30 cm, kapilara DNA eCAP, Beckman # 477477) po stronie dla próbki z uprzednim nastrzyknięciem wody. Przyłożono napięcie 300 V/cm przy jednoczesnym monitorowaniu wykrywania przy 260 nm. Rozdzielanie prowadzono w temperaturze 25°C w buforze Tris/kwas borowy/EDTA zawierającym 7M mocznika. Analit zidentyfikowano na podstawie jego względnego czasu migracji (MToiigo/MTwewn stand.) w porównaniu z czasem dla standardu, który wytwarza się podobnie, a następnie analizuje. Rejestrowano względny czas migracji i względny procent powierzchni dowolnego piku elektroforetycznego, który jest >3x stosunku sygnału : zakłóceń (S:N). Wysokości pików pomiędzy 3x i 10x sygnał: zakłócenia rejestrowano jako takie, których nie dało się oznaczyć ilościowo.
% oligomeru = (powierzchnia piku/całkowita powierzchnia piku > 3 xS:N) x 100%
MALDI-TOF. Odsolone próbki zawierające analit i jego metabolity zanalizowano z zastosowaniem spektrometru masowego Applied Biosystems MALDI-TOF o opóźnionym zakresie pobierania, zaopatrzonego w laser azotowy o długości fali 337 nm, i 1,2 metrową rurę przepływową. Ustawienia aparatury były następujące: napięcie 25 kV; napięcie siatki 95,4%; przewód prowadzący 0,1%; czas opóźnienia 1200 nanosekund. Jako matrycę zastosowano kwas 3-hydroksypikolinowy zawierający cytrynian diamonu. Widma próbek ODN kalibrowano zewnętrznie na takich samych płytkach, w identycznych warunkach, stosując zestaw wzorców ODN o znanych masach cząsteczkowych.
Wyniki otrzymane po 48 godzinach przedstawiono na fig. 20. Fig. 20 wskazuje, że w nerce poziom semi-miękkiego SEQ ID NO: 241 i miękkiego ODN SEQ ID NO: 294 spadł bardzo znacząco (odpowiednio, o 93 procent i o 87 procent) w porównaniu z oligonukleotydami zawierającymi wyłącznie grupy tiofosforanowe SEQ ID NO: 242.
Przykład 17. Oligonukleotydy C mają działanie immunostymulujące in vitro.
Wytworzono semi-miękkie oligonukleotydy klasy C zawierające wiązania fofodiestrowe wewnątrz niepalindromowej części 5' (ODN SEQ ID NO: 255), palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 251), i wewnątrz zarówno niepalindromowej części 5' jak i 3' palindromowej części (ODN SEQ ID NO: 295). Ponadto wytworzono ODN SEQ ID NO: 252 zawierający wiązania podobne do ODN SEQ ID NO: 295 lecz z cukrami takimi jak 2'-0-Me-ryboza w tych nukleotydach tworzącymi palindromową część 3' (przedstawiona jako podkreślona poniżej). Te oligonukleotydy następnie oceniano stosując test TLR9 opisany powyżej.
T*CJj*T*CJj*TH'*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G T*C G*C*C G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:255) (SEQ ID NO:251) (SEQ ID NO:295) (SEQ ID NO:252)
Oligonukleotydy klasy C o całkowicie stabilizowanych szkieletach na ogół wywołują względnie niską aktywność TLR9 w porównaniu z oligonukleotydami klasy B. Jak pokazano w tabeli 10 poniżej, wprowadzenie semi-miękkiej sekwencji tylko w niepalindromowej części 5' (ODN SEQ ID NO: 255) znacznie zwiększało aktywność TLR9 w porównaniu z wprowadzeniem semi-miękkiej sekwencji tylko w palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 251). Wprowadzenie semi-miękkiej sekwencji zarówno w niepalindromowej części 5' jak i palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 295) dawało w wyniku
PL 232 260 Β1 zwiększoną aktywność TLR9 w porównaniu z wprowadzeniem semi-miękkiej sekwencji tylko w palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 251).
Tabela 10. Stymulacja TLR9 semi-miękkimi oligonukleotydami klasy C
ODN Stężenie ODN, pg/ml
0,1 0,5 2,0 8,0
SEQ ID NO: 255 2,3 16, 9 36,4 35,7
SEQ IDNO: 251 1,2 2,5 8,4 16,8
SEQ ID NO: 295 2,0 11,6 29,8 37,3
SEQ IDNO: 252 1,1 3,9 22,1 47,0
Semi-miękkie oligonukleotydy klasy C nie tylko zachowują swą zdolność do indukowania produkcji IFN -a przez ludzkie komórki PBMC, lecz także mają znacznie silniejsze działanie w niskich stężeniach. Zwiększona moc była najwyraźniejsza w tych oligonukleotydach klasy C, które zawierały semimiękką sekwencję w niepalindromowej części 5' (ODN SEQ ID NO: 255 i ODN SEQ ID NO: 295). ODN SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 251, i SEQ ID NO: 295 oceniono z zastosowaniem testu ELISA i w porównaniu z SEQ ID NO: 242, całkowicie stabilizowaną formą tych trzech semi-miękkich oligonukleotydów i silnie działającym oligonukleotydowym induktorem produkcji IFN-α należącym do klasy C. Wyniki przedstawiono w tabeli 11.
Tabela 11. Indukcja produkcji IFN-α (pg/ml) z zastosowaniem semi-miękkich wersji oligonukleotydu klasy C
ODN Stężenie ODN, μΜ
0,1 0,2 0,5 1,0 2,0
SEQ ID NO: 255 3202 7429 937 64 3
SEQ ID NO: 251 688 3033 3083
SEQ ID NO: 295 2560 3363 3246 930 41
50 504 3247 2114 1789
Przykład 18: Fizykochemiczne właściwości SEQ ID NO: 313
Metody:
Zapis dyfrakcyjny rentgenogramu proszkowego dla SEQ ID NO: 313 wykazał występowanie halo, charakterystycznego dla fazy amorficznej. Analiza sorpcji pary wodnej pokazała, że związek o sekwencji SEQ ID NO: 313 jest silnie higroskopijny. Wskutek tendencji leku do wymiany wilgoci, w zależności od wilgotności środowiska, ilość wilgoci może się zmieniać. Związek charakteryzuje się dużą rozpuszczalnością w wodzie (> 100 mg/ml), dzięki czemu wykazuje odpowiednią rozpuszczalność w stosowanych zakresach pH. Analiza roztworów wodnych leku w podwyższonej temperaturze pokazuje, że szybko ulega on degradacji w środowisku od łagodnie kwasowego do kwasowego lecz roztwory buforowane o wartości pH > 6 wykazują odpowiednią trwałość roztworu.
Wyniki:
Stwierdzono, że związek o sekwencji SEQ ID NO: 313 jest substancją amorficzną i silnie higroskopijną. Związek charakteryzuje się dużą rozpuszczalnością w wodzie (> 100 mg/ml), dzięki czemu wykazuje odpowiednią rozpuszczalność w stosowanych zakresach pH. ODN ulega szybko degradacji
PL 232 260 B1 w środowisku łagodnie kwaśnym oraz kwaśnym. Roztwory buforowane o wartości pH > 6 wydają się wykazywać odpowiednią trwałość roztworu.
P r z y k ł a d 19: Stymulacja komórek transfekowanych TLR9 in vitro
Metody:
Komórki HEK 293 transfekowane ludzkim TLR9 inkubowano z SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 przez 16 godzin. Sygnał określono na podstawie odczytu aktywności lucyferazy.
Wyniki:
W porównaniu z SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 był silniejszym stymulatorem docelowego receptora TLR9.
P r z y k ł a d 20: Stymulacja ludzkich komórek układu odpornościowego in vitro.
Metody:
Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej od 6 dawców inkubowano z SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 przez 24 lub 48 godzin. Zmierzono sekrecję cytokin.
Wyniki:
Wyniki przedstawiono na fig. 23. W porównaniu z SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 wykazał zwiększoną lub co najmniej zbliżoną efektywność i/lub moc jako induktor produkcji związanych z TLR9 cytokin IL-6, IL-10, IFNa i IP-10.
P r z y k ł a d 21: Stymulacja splenocytów myszy in vitro.
Metody:
Splenocyty myszy (BALB/c) inkubowano przez 48 godzin z SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329. Zmierzono sekrecję cytokin i IP-10.
Wyniki:
W porównaniu z SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 wykazał zwiększoną lub co najmniej zbliżoną efektywność i/lub moc jako induktor produkcji cytokin IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa i IP-10. Dane przedstawiono na fig. 24. Te dane wskazują, że aktywność SEQ ID NO: 313 względem mysich komórek układu odpornościowego jest porównywalna z aktywnością względem komórek ludzkich (powyżej) i jest podobnie zgodna z aktywacją poprzez TLR9.
P r z y k ł a d 22: Indukcja genu cytokinowego u myszy in vivo.
Metody:
W tym badaniu oszacowano ekspresję cytokin w mysich płucach po podaniu SEQ ID NO: 313 do dróg oddechowych. W celu zbadania narażenia nerki, oszacowano także indukcję tych samych cytokin (jak opisano w przykładach 10 i 21) w tym organie. Myszom (samce, BALB/c) podawano SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 (obie 1 mg/kg) albo przez zakropienie donosowe albo przez iniekcję w jednej dużej dawce. Płuca i nerkę pobrano 8 lub 15 godzin po podaniu związku. RNA wyizolowano i poddano odwrotnej transkrypcji na cDNA. Docelowe fragmenty cDNA zamplifikowano i wykrywano metodą PCR w czasie rzeczywistym (Roche LightCycler z zastosowaniem metody detekcji SYBR Green). Startery dla GAPDH, IFN gamma, IL-6, IP-10, i TNF-alfa zaprojektowano stosując oprogramowanie LC PROBE DESIGN firmy Roche (wersja 1.0 nr kat. Roche 3 139 174). Startery dla IFN-alfa zaprojektowano stosując oprogramowanie PRIMER 3. Wydajność produktu znormalizowano jako stosunek ekspresji k ontrolnego genu (GAPDH).
Wyniki:
Podawany do dróg oddechowych SEQ ID NO: 313 indukował w płucu ekspresję genów związanych z TLR9 (IL-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10). Wyniki przedstawiono na fig. 25. Jednakże, za wyjątkiem IP-10, geny te nie podlegały ekspresji w nerkach myszy, którym podawano związek tą drogą. Ponieważ IP-10 jest typowo indukowana przez interferony, ekspresja tej chemokiny mogła wystąpić pośrednio jako wynik wydzielenia z płuca interferonów do krążenia ogólnoustrojowego. Gdy SEQ ID NO: 313 podawano dożylnie, w nerce była indukowana ekspresja każdego z tych genów oprócz genu na IFNy. Zatem brak wpływu SEQ ID NO: 313 na nerki po podawaniu do dróg oddechowych był prawdopodobnie spowodowany niewielkim występowaniem w krążeniu ogólnoustrojowym.
Oligonukleotydy ODN CpG mogą wpływać na nerki poprzez kilka mechanizmów. Po poddaniu organizmu działaniu pewnych ODN CpG obserwowano ostre ziarniniakowe zapalenie nerek spowodowane mechanizmem zależnym od TLR9. Nasze wyniki sugerują, że układowa ekspozycja na działanie
SEQ ID NO: 313 podawanego do dróg oddechowych nie jest wystarczająca do bezpośredniej indukcji genów związanych z TLR9 w nerce.
P r z y k ł a d 23: Wpływy na wywołany antygenem rozwój węzła chłonnego u myszy in vivo
PL 232 260 Β1
Metody:
W tym doświadczeniu badano zdolność SEQ ID NO: 313 do indukcji odstępstwa od odpowiedzi immunologicznej typu Th2 przy drenowaniu węzłów chłonnych u myszy. Myszy (samce, BALB/c) uczulano przez wstrzyknięcie antygenu w kompletnym adiuwancie Freund'a w prawą tylną poduszeczkę łapy (albumina jaja kurzego, 100 pg). Jednocześnie w tą samą poduszeczkę łapy myszom wstrzykiwano SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 (1,5 mg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli). Sześć dni po wstrzyknięciu w poduszeczkę łapy, pobrano drenujący podkolanowy węzeł chłonny. Limfocyty T (CD3+) i limfocyty B (B220+) zliczono metodą cytometrii przepływowej. Test ex vivo na antygen przypominający przeprowadzono następująco 1 χ 106 komórek (pochodzących z drenującego podkolanowego węzła chłonnego) inkubowano w 220 pi podłoża RPMI 1640 + 10% płodowa surowica bydlęca zawierająca albo albuminę jaja kurzego (100 pg/ml) albo rozcieńczalnik. Po 36 godzinach usunięto podłoże hodowlane i zmierzono stężenia IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, GM-CSF, IFN gamma, i TNF alfa stosując zestaw firmy LINCO Research, Inc. 14 Research Park Drive, St Diaries, Missouri 63304 i zanalizowano stosując układ Luminexmultiplexsystem (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).
Wyniki:
Liczba komórek w podkolanowych węzłach chłonnych. Uczulanie spowodowało nagromadzenie limfocytów T i limfocytów B w drenujących podkolanowych węzłach chłonnych. Ta akumulacja wywołana antygenem nie zwiększyła się dalej znacząco u myszy, które także otrzymały ODN CpG. Jednakże, każdy ODN CpG wstrzykiwany sam nieuczulanym myszom powodował akumulację zarówno limfocytów T jak i limfocytów B. Dane przedstawiono na fig. 26.
Test na antygen przypominający. Komórki z drenującego węzła chłonnego pobrane od uczulanych antygenem myszy po powtórnej stymulacji ex vivo antygenem wydzielały IL-4, IL-5, IL-10 i IFNy. U uczulanych myszy, które także otrzymały ODN CpG, sekrecja IL-4, IL-5 i IL-10 będących cytokinami typu Th2 spadła, podczas gdy sekrecja IFNy będącego cytokiną typu Th1 wzrosła. Nasze dane, przedstawione na fig. 27, potwierdzają hipotezę, że SEQ ID NO: 313, podobnie jak SEQ ID NO: 329, hamuje odpowiedź Th2 na uczulanie antygenem. Wyniki podano jako średnią ± s.e.m. (n = 9-10). * P < 0,05 w porównaniu z grupą uczulaną, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal'a-Wallis'a).
Przykład 24: Wpływy na wywołaną przez antygen produkcję IgE u myszy in vivo.
Metody:
Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 100 pg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Myszy otrzymały SEQ ID NO: 313 (0,15 lub 1,5 mg/kg, i.p.) lub SEQ ID NO: 17 (1,5 mg/kg, i.p.) dwa dni przed każdym uczulaniem i w dniu każdego uczulania. Osocze pobrano w 18 dniu badania. Miana antygenowo (albumina jaja kurzego) - swoistych IgE i lgG2a zmierzono stosując test ELISA. Podsumowanie tego protokołu przedstawiono w tabeli 12.
Tabela 12
podsumowanie protokołu badawczego
uczulanie uczulanie
4
ODN ODN ODN ODN
4 4 18
Dzień: -2 0 5 7
4
punkt końcowy
PL 232 260 Β1
Wyniki:
U myszy traktowanych SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329, całkowicie zapobieżono produkcji antygenowo swoistych IgE. Dla odmiany, produkcja lgG2a zwiększyła się. Ponieważ produkcja IgE i lgG2a jest charakterystyczna odpowiednio dla odpowiedzi typu Th2 i typu Th1, taki efekt jest kolejnym dowodem, że SEQ ID NO: 313 może tłumić odpowiedź typu Th2 na uczulanie antygenem. Alternatywnie oligonukleotydy ODN CpG mogą bezpośrednio indukować ekspresję T-beta i przełączanie klas z IgE w limfocytach B. Dane przedstawiono na fig. 28. Wyniki są średnią ± s.e.m. (n = 10-12, oprócz 5 dla grupy SEQ ID NO: 329). * P < 0,05 w porównaniu z grupą uczulaną, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal'a-Wallis'a).
Przykład 25: Efekty przeciw wywołanemu antygenem zapaleniu dróg oddechowych u myszy in vivo
Metody:
Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 100 μg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. U myszy prowokowano reakcję odpornościową na antygen dając im do wdychania albuminę jaja kurzego w aerozolu, dwukrotnie w każdym tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pierwszą prowokację przeprowadzono 21 dnia badania. SEQ ID NO: 313 (0,1-1000 μg/kg), SEQ ID NO: 329 (1-1000 μg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli, 20 μΙ) podawano do dróg oddechowych przez zakropienie donosowo jednokrotnie w każdym tygodniu, dwa dni przed pierwszą prowokacją antygenem w tygodniu. Dane dla punktów końcowych oszacowano 48 godzin po ostatniej prowokacji antygenem. Komórki z dróg oddechowych odzyskano przez płukanie pęcherzyków płucnych i przeprowadzono różnicowe zliczanie komórek. Liczby eozynofilów (gęstość objętościowa eozynofilów) i wydzielanie śluzu (barwienie PAS) w tkance płuca określono przez ocenę histopatologiczną. Protokół przedstawiono w tabeli 13.
Tabela 13
podsumawnie protokołu badawczego
uczulanie prowoi <acja prowo kac ja
1 i i i
ODN ODN
Ψ
Dzień: 0 7 19 21 24 26 28 31 33
punkty końcowe
Wyniki:
Prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów, w przeważającej mierze eozynofilów, w świetle dróg oddechowych. Dane przedstawiono na fig. 29. Eozynofilię istotnie hamował, w sposób zależny od dawki, SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329. Wartości ED50 przeciw eozynofilii wyniosły: SEQ ID NO: 313: 23 μg/kg; SEQ ID NO: 329: 47 μg/kg. Prowokacja także spowodowała nagromadzenie się limfocytów T CD4+ (komórki CD3+CD4+), które to gromadzenie istotnie hamował SEQ ID NO: 313. SEQ ID NO: 313 także istotnie hamował wywołane antygenem nagromadzenie eozynofilów w tkance płuca i sekrecję śluzu przez nabłonek. Wyniki na fig. 29 są średnią ± s.e.m. (n = 15). * P < 0,05 w porównaniu z grupą prowokowaną antygenem, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal'a-Wallis'a). Wyniki na fig. 30 są średnią ± s.e.m. (n = 6). * P < 0,05,
PL 232 260 Β1 ** p < 0,001 w porównaniu z grupą prowokowaną antygenem, traktowaną nośnikiem (ANOVA, test porównania wielokrotnego Dunnetfa).
Przykład 26: Efekty przeciw indukowanej antygenem nadreaktywności dróg oddechowych u myszy in vivo
Metody:
Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 100 μg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. U myszy prowokowano reakcję odpornościową na antygen dając im do wdychania albuminę jaja kurzego w aerozolu, dwa razy w tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pierwszą prowokację przeprowadzono w 19 dniu badania. SEQ ID NO: 313 (ΙΟΙ 000 μg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli, 20 μΙ) podawano donosowo jednokrotnie w każdym tygodniu, dwa dni przed pierwszą prowokacją antygenem w tygodniu. Nadreaktywność dróg oddechowych oceniono 24 godziny po ostatniej prowokacji antygenem przez pomiar zwężenia oskrzeli (zwiększenie oporu czynnego dróg oddechowych) w odpowiedzi na podaną dożylnie metacholinę. Dla każdego zwierzęcia wyznaczono krzywą dawka - odpowiedź na metacholinę, a reaktywność dróg oddechowych określono ilościowo jako powierzchnię pod krzywą. Protokół przedstawiono w tabeli 14.
Tabela 14
podsumawnie protokołu badawczego
Uczulanie Prowokacja Prowokacja
1 1
ODN ODN
Φ 4
Dzień: 0 7 17 19 22 24 26 29 30
punkty końcowe
Wyniki:
Prowokacja antygenem spowodowała nadreaktywność dróg oddechowych. SEQ ID NO: 313 hamował rozwój wywołanej antygenem nadreaktywności dróg oddechowych w sposób zależny od dawki. Dane przedstawiono na fig. 31 i 32 jako krzywe dawka-odpowiedź dla próbek na metacholinę, aby pokazać działanie SEQ ID NO: 313 (1000 μg/kg). Krzywe dawka-odpowiedź na metacholinę określa się ilościowo jako powierzchnię pod krzywą. Wyniki są średnią ± s.e.m. (n=6-8). * P < 0,05 w porównaniu z grupą prowokowaną antygenem, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal'a-Wallis'a).
Analizę całkowitych krzywych dawka-odpowiedź (RL) dla myszy, które prowokowano antygenem, potraktowano nośnikiem i każdej z odpowiednich myszy, które prowokowano antygenem, potraktowanych SEQ ID NO: 313, prowadzono stosując powtarzane pomiary testem MANOVA. Choć wystąpiła znacząca różnica (P < 0,05) pomiędzy krzywymi dawka-odpowiedź dla grup traktowanych 100 i 1000 μg/kg SEQ ID NO: 313, nie wystąpiła znacząca różnica pomiędzy myszami prowokowanymi antygenem, traktowanymi nośnikiem i podobnie traktowanymi zwierzętami, którym podawano 10 μg/kg SEQ ID NO: 313.
Przykład 27: Badanie farmakokinetyki (PK) in vivo u szczurów
Badanie PK prowadzono na szczurach w celu określenia czy SEQ ID NO: 313, „semi-miękki” ODN, jest usuwany z osocza i tkanek, szczególnie z nerek, szybciej niż SEQ ID NO: 329, ODN zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe, który ma identyczną sekwencję zasad jak SEQ ID NO: 313.
Metody:
szczurom podano dożylnie (i.v.) i dotchawiczo (i.t.) 5 mg/kg (zarówno dla i.v. jak i dla i.t.) SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329. Pobrano osocze, płuca, nerki. Badanie trwało 5 dni, z 14 punktami
PL 232 260 Β1 czasowymi na grupę, w której podawano daną dawkę. Stosowano grupy po 3 szczury/punkt czasowy dla grupy i.v. (ogółem = 42 szczury) i po 4 szczury/punkt czasowy dla i.t.
Wyniki:
Fig. 33 przedstawia stężenia ODN w osoczu szczura po podawaniu i.v. i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dla osocza wskazują, że SEQ ID NO: 313 jest usuwany z osocza szybciej w porównaniu z SEQ ID NO: 329 zarówno po podawaniu i.v. jak i i.t.
Fig. 34 przedstawia stężenia ODN w płucach szczura po podawaniu i.v. i i.t. w dawce 5 mg/kg. Po podawaniu i.v. przy takiej samej wielkości dawki, stężenia SEQ ID NO: 313 w płucach są niższe niż stężenia SEQ ID NO: 329. Po podawaniu i.t. różnica jest mniej wyraźna. Dane dla płuca dla SEQ ID NO: 329 zbierano tylko do 48 godzin po podawaniu.
Fig. 35 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.v. i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dla nerki wskazują, że bezwzględne stężenia SEQ ID NO: 313 w nerkach są niższe niż odpowiednie stężenia SEQ ID NO: 329 zarówno po podawaniu i.v. jak i i.t. Ekspozycja nerek na SEQ ID NO: 313 w szczególności po podawaniu i.t., jest znacznie zmniejszona w porównaniu z ekspozycją na SEQ ID NO: 329 przy podawaniu w dawce o tej samej wielkości. Można to zobaczyć wyraźniej na fig. 36 i 37.
Fig. 36 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.v. w dawce 5 mg/kg. Fig. 37 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg. Po podawaniu i.t. zarówno SEQ ID NO: 313 jak i SEQ ID NO: 329 występują w ilości poniżej niższego limitu oznaczenia ilościowego (0,4-0,6 gg/g) w nerkach przez czas aż do 1 godziny po podaniu. Po 1 godzinie, SEQ ID NO: 329 można wykryć we wszystkich próbkach pobranych z nerki podczas okresu badania (48 godzin). Z drugiej strony SEQ ID NO: 313, występuje w możliwych do zmierzenia poziomach przez czas do 7 godzin po podaniu.
Tabela 15: Podsumowanie średnich parametrów PK dla SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329 po podawaniu i.v. i i.t. szczurom w dawce 5 mg/kg
Grupa dawkowa Tkanka ODN Cmax (pg/ml) Tmax (godz.) Tl/2 (godz.) AUCo-iKF (godz. pg/ml) AUC0-46godz. (godz. pg/ml)
i .v. (5 mg/kg) osocze 10 na na 0,20 9,5 9,3
17 na na 0,62 62,8 62,2
płuca 10 1,4 0,25 0,17 0,47 0,35
17 14,4 0,083 2,5 23,7 20,8
nerki 10 6,6 0,083 24,9 184 123
17 11,4 0,083 nc nc 346
i.t. (5 mg/kg) osocze 10 1,9 0,75 1,20 2,68 2,35
17 2,1 2 2,3 9,01 7,46
płuca 10 632 0,25 28,1 5540 5350
17 692 1 (31)** (7908)** 6505
nerki 10 0,49 2 7,8 5,81 2,34
17 3,8 7 nc nc 134
na - Nie dotyczy nc - Nie obliczany. Nie można było dokładnie oszacować z uwagi na niewystarczającą częstość pobierania danych w końcowej fazie lub faza końcowej eliminacji nie została osiągnięta podczas okresu badania.
* - AUCo-48h lub AUCo-last gdy ostatnie możliwe do zmierzenia stężenie występowało przed 48 godziną.
** - Bardzo przybliżone oszacowanie (na bazie 2 danych tylko w końcowej fazie).
10-SEQ ID NO: 313
17-SEC! ID NO: 329
PL 232 260 Β1
Tabele 16(a)-(c): układowa i tkankowa ekspozycja na SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329 po podawaniu i.t. i i.v. szczurom w dawce 5 mg/kg.
a) - Dane dla osocza ODN Droga podawania dawki
SEQ ID NO: 313 i.t.
i .v.
AUC 0 48 gudz. stosunek SEQ ID NO:
(godzina. 313: SEQ ID NO: 329
pg/ml)
2,35 9,30 0,32 (i.t.)
0,15 (i.v.)
SEQ ID NO: 329 stosunek 0,25
i.t.: i. v.
i.t. 7,46 62,2
i. v.
stosunek 0,12
i.t.:i.v.
(b) - Dane dla płuc
ODN Droga AU(0-48godz. stosunek SEQ ID NO: 313: SEQ
podawania (godzina. ID NO: 329
dawki pg/ml)
SEQ ID i.t. 5350 0,82 (i.t.)
NO: 313 i 0,35 0,017 (i.v.)
stosunek 15286
i . t. : i . v .
SEQ ID i.t. 6505
NO: 329 i. v. 21
stosunek 313
i.t.:i.v.
(c) - Dane dla nerki
ODN Droga ΑΠΓ rtU<J0-48godz. stosunek SEQ ID NO: 313 : : SEQ
podawania (godzina. ID NO: 329
dawki gg/ml)
SEQ ID i.t. 2,34 0,0 17 (i.t.)
NO: 313 i.v. 123 0,36 (i.v.)
stosunek 0,019
i.t.:i.V.
SEQ ID i.t. 134
No. 329 i .v. 346
stosunek 0,39
i.t.:i.v.
PL 232 260 B1
Ekspozycja układowa i ekspozycja nerek na SEQ ID NO: 313 okazała się znacznie mniejsza niż ekspozycja na SEQ ID NO: 329 po podawaniu 2 ODN zarówno drogą dożylną (i.v.) jak i dotchawiczą (i.t.).
Wartość AUC dla osocza dla SEQ ID NO: 313 po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg wyniosła 2,7 godziny. μg/ml. Odpowiednia wartość dla SEQ ID NO: 329 wynosiła 9,0 godzin.μg/ml. Tak więc, systemowa ekspozycja na SEQ ID NO: 313 stanowi jedną trzecią ekspozycji obserwowanej dla SEQ ID NO: 329.
Wartość AUC dla nerki dla SEQ ID NO: 313 po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg wyniosła 2,35 godziny. ng/ml. Odpowiednia wartość dla SEQ ID NO: 329 wyniosła 134 godzin.μg/ml. Tak więc, przy stosowaniu w takiej samej dawce, ekspozycja nerek na SEQ ID NO: 313 stanowi tylko około 2% ekspozycji obserwowanej dla SEQ ID NO: 329.
Inaczej niż w przypadku osocza i nerki, ekspozycja płuca na SEQ ID NO: 313 po podawaniu i.t. nie była zmniejszona w tak dużym stopniu w porównaniu z ekspozycją na SEQ ID NO: 329. Wartość AUC dla płuca dla SEQ ID NO: 313 stanowiła w przybliżeniu 70-80% wartości AUC dla płuca dla SEQ ID NO: 329 przy stosowaniu w takiej samej dawce. Ponieważ płuco jest tkanką docelową, zalecane jest by klirens ODN z płuca wzrósł do takiego samego poziomu jak klirens z osocza i nerek.
Fig. 38 Przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podawaniu i.v. SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg.
Fig. 39 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podawaniu i.t. SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg. Z powodów metodologicznych dane dla 8-merowego metabolitu SEQ ID NO: 313 w osoczu i tkankach są niepełne. Jednakże, dane dostępne są dla 8-meru dla niektórych próbek nerki po podawaniu i.v. i wszystkich próbek nerki po podawaniu i.t. Te dane wskazują, że w większości próbek nerki, w których stężenia 8-meru z powodzeniem zmierzono, poziomy metabolitów są wyższe niż poziomy SEQ ID NO: 313, co wskazuje, że aktywność endonukleazy jest ważnym sposobem metabolizmu SEQ ID NO: 313.
Wprowadzenie pewnej liczby wiązań fosfodiestrowych (SEQ ID NO: 313) do szkieletu zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe (SEQ ID NO: 329) wydaje się zwiększać stopień degradacji ODN, prowadząc w efekcie do szybszego klirensu, szczególnie z nerek.
P r z y k ł a d 28: Aktywacja TLR9 z zastosowaniem semi-miękkiego ODN w porównaniu z ODN zawierającym wyłącznie wiązania tiofosforanowe
Metody:
Wcześniej opisano trwale transfekowane komórki HEK293 eksprymujące ludzki TLR9 [Bauer i in.; PNAS; 2001]. W skrócie, komórki HEK293 transfekowano przez elektroporację wektorami eksprymującymi ludzki TLR9 i plazmidem reporterowym 6xNFKB-lucyferaza. Trwałe transfektanty (3x104 komórek/studzienkę) inkubowano z ODN przez 16 godzin w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze. Wszystkie badania wykonano w trzech powtórzeniach. Komórki zlizowano i oznaczano aktywność genu lucyferazy (stosując zestaw Brightlite firmy Perkin-Elmer, Ueberlingen, Niemcy). Indeksy stymulacji obliczono w odniesieniu do aktywności genu reporterowego w podłożu bez dodatku ODN.
Wyniki:
TLR9 jest łatwo aktywowany przez oligonukleotydy ODN zawierające optymalne immunostymulujące sekwencje CpG. Inkubowano linię komórkową nieprzerwanie eksprymującą ludzki TLR9 z zestawem semi-miękkich ODN i zestawem ODN zawierających wyłącznie wiązania tiofosforanowe mających taką samą sekwencję ODN jak semi-miękkie ODN. Wyniki przedstawiono na fig. 40.
Wyniki wykazują, że każdy z semi-miękkich ODN przedstawionych w tabeli poniżej, SEQ ID NO:
376, 378, 380, 382, 384, 241, aktywował ekspresję TLR9 na wyższym poziomie niż ODN o takiej samej sekwencji mające szkielet, zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe, odpowiednio o SEQ ID NO:.
377, 379, 381,383, 385, i 242.
PL 232 260 Β1
SEQ ID No. 376 Q+,p+ir*,p*T*TJfT*T*T*T*T*T*'T*T:tT*T
SEQ ID No. 377 T*G*T*C't g+t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t*t
SEQ ID No. 378 U*G*T*C G*T*T*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U
SEQ ID No. 379 υ*ο*τ*ΰ*ο*τ*τ*υ*υ*υ*υ*ο^υ*υ*υ*υ*υ*υ*υ*υ
SEQ ID No. 380 D*G*T*C G*T*T*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*rD*T
SEQ ID No. 381 D*G*T*C*G*T*T*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*T
SEQ ID No. 382 U*G*T*C G*T*T*U*U*U*U*U G G G A G G*G*G
SEQ ID No. 383 u*G*T*C*G*T*T*U*U*O*U*O*G*G*G*A*G*GiG*G
SEQ ID No. 384 g*G*T*C G*T*T*C*C*U*U*U G G G A G G*G*G
SEQ ID No. 385 □*g*t*c*g*t*t*c*c*u*u*u*g*g*g*a*g*g*g*g
SEQ ID No. 241 SEQ ID No. 242 T*C G*T*C G*T*T*T*T G*T*C g*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T T*G*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T'*T
Przykład 29: wiązania internukleotydowe Rp jako wiązania typu wiązania fosfodiestrowego w semi-miękkich oligonukleotydach
Metody:
Warunki hodowli komórkowej i reagenty
Do testów proliferacji limfocytów B, komórki śledziony pochodzące od myszy BALB/c (w wieku 4-18 tygodni) hodowano w gęstości 2-5 x 105—106 komórek/ml w RPMI przez 44 godziny w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania, po czym traktowano jednokrotnie 1 gCi 3H tymidyny przez 4-6 godzin, przed zebraniem i określeniem cpm przez scyntylacyjne zliczenie jak opisano uprzednio (Krieg i in., 1995). W celu wykonania Western biotów, komórki WEHI-231 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) hodowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 nawilżanym inkubatorze i utrzymywano w RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) uzupełnionym 10% inaktywowaną wysoką temperaturą FOS (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 1,5 mM L-glutaminą, 50 μΜ 2-ME, 100 U/ml penicyliny, i 100 μg/ml streptomycyny.
Oligonukleotydy.
Oligodeoksynukleotydy (PO-oligomery) i oligomery deoksynukleozydo-tiofosforanowe o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej [Mix-PS]-oligomery zakupiono od Operon Technologies (Alameda, CA) lub wytworzono stosując standardową metodę amidofosforynową (Caruthers, 1985) (Stec i in., 1984). Oligonukleotydu [Mix-PS]-d(TCCATGACGTTCCTGACGTT) ([Mix-PS]-SEQ ID NO: 386) użyto jako kontroli pozytywnej, ponieważ uprzednio stwierdzono, że ma on silny wpływ immunostymulujący na mysie komórki (Yi i in., 1996). Dla PS-oligomeru CpG z minimalnym motywem stymulującym, sekwencję PS-d(TCAACGTT)-2066 wybrano do badania jako typowy motyw CpG o szerokim działaniu stymulującym, reprezentujący dużą rodzinę CpG DNA. Gdy do przygotowania tej sekwencji użyto szkieletu o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej wówczas sekwencję tę nazwano [Mix-PS]-2066. Gdy ta sekwencja oktameru zawierała szkielet o całkowicie lub częściowo określonej konfiguracji stereochemicznej, to PS-oligomer określano jako [AII-Rp-PS]-2066 lub [AII-Sp-PS]-2066 gdy cały szkielet miał określoną konfigurację stereochemiczną, lub jako [CG-Rp-PS]-2066 lub [CG-Sp-PS]-2066, gdy tylko dinukleotyd CpG miał określoną konfigurację stereochemiczną. Inne stosowane PS-oligomery obejmują
PL 232 260 B1
CpG PS-d(TCAACGTTGA) ([Mix-PS] - SEQ ID NO: 387) i jego odpowiedniki All-Rp- i All-Sp- o określonej konfiguracji stereochemicznej, oraz kontrolujący PS-d(TCAAGCTTGA) [Mix-PS] - SEQ ID NO: 388 nie zawierający CpG.
Oligodeoksynukleotydy tiofosforanowe o określonej konfiguracji stereochemicznej wytworzono metodą oksatiafosfolanową jak opisano (Stec i in., 1995) (Stec i in., 1998). Syntezy przeprowadzono ręcznie. Pierwsze jednostki nukleozydowe od końca 3' zamocowano do stałego nośnika za pomocą DBU-odpornej łączącej grupy sarkozynylowej (Brown i in., 1989). Odpowiednio zabezpieczone monomery deoksynukleozydylowe, zawierające grupę taką jak 3'-O-(2-tio- „spiro”-4,4-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolan) zsyntetyzowano i oddzielono chromatograficznie, uzyskując czyste P-diastereomery. Do syntezy [CG-Rp-PS]-2066 i [CG-Sp-PS]-2066, stosowano nie rozdzieloną mieszaninę obu P-diastereomerów (stosunek Rp:Sp około 1:1) (Stec i in., 1998) w celu złożenia wiązań międzynukleotydowych o przypadkowej konfiguracji atomów P. Wszystkie zsyntetyzowane oligomery oczyszczono metodą dwuetapową RP-HPLC: w obecności DMT (czasy retencji w zakresie 23-24 minut) i w nieobecności DMT (czasy retencji 14-16 minut); układ chromatograficzny: kolumna ODS Hypersil, 5 μm, 240x 4,6 mm, 0-40% CH3CN w 0,1 M trietylowodorowęglanie amonu, pH 7,5, gradient 1%/minutę. Stopień czystości oszacowano metodą elektroforezy żelowej w żelu poliakrylamidowym.
W celu analizy retencji PS-oligomeru, wytworzono stereoregularne PS-oligomery sprzężone z fluoresceiną przez wydłużenie w fazie stałej ręcznie zsyntetyzowanych PS-oligomerów o określonej konfiguracji stereochemicznej. Po etapie detritylacji amidofosforynu fluoresceiny (Chem Genes Corporation, Ashland, MA; stężenie robocze 125 mg/ml), rutynowo dodano 1-H-tetrazol (czas sprzęgania 120 sekund), następnie siarkowano, stosując S-tetra odczynnik (Stec i in., 1993). Reakcje oderwania od nośnika i odbezpieczenia przeprowadzono, działając stężonym wodorotlenkiem amonu odpowiednio w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny oraz w temperaturze 55°C w ciągu 4 godzin. Wytworzone oligomery oczyszczono metodą jednoetapową RP-HPLC (jak powyżej). Ze względu na znaczącą hydrofobowość grupy fluoresceinowej, Rp- i Sp-oligomery eluowano z czasami retencji wynoszącymi odpowiednio 14,5, 14,8 i 14,7, 15,0 minut, tj. dla końca każdej sekwencji. W obu przypadkach dwa P-diastereomery eluowano z uwagi na niestereospecyficzność metody wydłużania poprzez amidofosforynowanie/siarkowanie, z zastosowaniem monomeru fluoresceiny.
Analiza Western Blot:
Komórki zebrano i ponownie zawieszono w świeżym podłożu w stężeniu 2x106 komórek/ml. Komórki pozostawiono do odstania na cztery godziny przed 40-minutową stymulacją. Komórki zebrano i przemyto trzy razy zimnym PBS. Komórki zlizowano w 0,5 M Tris (pH 7,4), 14 M NaCl, 1%NP-40,001M Na3VO4, 0,1 M NaF, 4,3 mg/ml β-glicerofosforanie, 002 M DTT, 50 μg/ml PMSF, 12,5 ng/ml Antipain, 12,5 ng/ml aprotyniny, 12,5 μg/ml leupeptyny, 1,25 ng/ml pepstatyny, 19 μg/ml bestatyny, 10 μg/ml fosforamidonu, 12,5 μg/ml inhibitorze trypsyny przez zamrożenie i odmrożenie, a następnie 30 minutową inkubację na lodzie. Próbki następnie zwirowano przy 10,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatanty zachowano jako lizaty całych komórek do późniejszej analizy. Równe ilości lizatów całych komórek (20 μg) trzymano w temperaturze wrzenia w buforze SDS do próbek przez 5 minut przed poddaniem elektroforezie w 11% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Po elektroforezie, białka przeniesiono na błony nitrocelulozowe stosując pół-suchą bibułę (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Bloty zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem przed hybrydyzacją z fosfo-SAPK/JNK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), kB-α i JNK1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Bloty wywołano stosując odczynniki do nasilonej chemiluminescencji (ECL, Amersham International) według protokołu producenta.
Wyniki:
Indukcja włączania 3H tymidyny do komórek śledziony przez stereoizomer Sp CpG PS-oligomerów. W celu określenia stereo-specyficzności stymulującego układ odpornościowy działania DNA CpG, komórki śledziony BALB/c hodowano z oktanukleotydami PS-d(TCAACGTT)-2066 o określonej konfiguracji stereochemicznej, w których wszystkie z wiązań internukleotydowych mają konfigurację albo Rp albo Sp w stężeniach wskazanych w tabeli 17. Komórki hodowano przez 48 godzin, co zapewnia limfocytom B wystarczający czas do wywołania ich proliferacji przez motywy CpG (Krieg i in., 1995). [MixPS]-2066 o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej, posiadające motyw CpG, wywołały silną zależną od dawki proliferację komórek śledziony (tabela 17). Izomer Sp także wywołał proliferację, i wydawał się mieć nieznacznie silniejsze działanie niż [Mix-PS]-2066. Dla odmiany, stereoizomer Rp nie indukował żadnej wykrywalnej proliferacji, co było zgodne z wynikami badań uzyskanymi przez Yu i in., (Yu i in., 2000).
PL 232 260 Β1
Tabela 17. Indukcja proliferacji komórek śledziony przez stereoizomer Sp oktamerów CpG.
oligomer Stężenie Cpm SI
brak (podłoże) 2170 1
2066 (CpG o przypadkowej 0,4 μΜ 3154 1,5
konfiguracji
stereochemicznej)
ff 2,4 μΜ 16,525 7,6
ff 4,8 μΜ 30,811 14,2
Rp (2066) 0,4 μΜ 1207 0,6
ff 2,4 μΜ 985 0,5
ff 4,8 μΜ 640 0,3
Sp (2066) 0,4 μΜ 9567 4,4
ff 2,4 μΜ 35,372 16,3
rt 4,8 μΜ 43,591 20,1
Rp (2066) + 20661 0,4 μΜ 1,597 0,7
ff 2,4 μΜ 10,255 4,7
ff 4,8 μΜ 15,841 7,3
SI = indeks stymulacji w porównaniu z kontrolą z podłożem 1 Każdy z dwóch PS-oligomerów dodano do wskazanego stężenia na początku hodowli
Poprzednie badania wskazują, że dekamer CpG PS-oligomerów ma zwiększony wpływ stymulujący układ odpornościowy w porównaniu z oktamerami stosowanymi w pierwszych doświadczeniach. Dlatego powtórzono te doświadczenia stosując konstrukt PS-SEQ ID NO: 387, który zsyntetyzowano albo jako [Mix-PS] o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej - SEQ ID NO: 387, lub w formie zawierającej wszystkie wiązania w koniguracji Rp lub wszystkie wiązania w koniguracji Sp. Z kolei zarówno [Mix-PSj- SEQ ID NO: 387 jak i [All-Sp-PSj- SEQ ID NO: 387 silnie indukowały włączanie 3H tymidyny w sposób zależny od dawki. Jednakże, w tym przypadku, [AII-Rp-PSj- SEQ ID NO: 387 był także zdolny do indukcji istotnego zwiększenia proliferacji komórek w najwyższych stężeniach, wskazując, że zachował co najmniej częściową aktywność stymulacyjną.
Uprzywilejowanie chiralności Rp w dinukleotydzie CpG w oktamerze PS-oligomerów. Pozostawało niejasne czy widoczne uprzywilejowanie stereoizomeru Sp w początkowych doświadczeniach wynikało z efektu wewnątrz samego dinukleotydu CG, czy też ten efekt może być niezależny od CG. W celu określenia tego zsyntetyzowano dwa oktamery PS-2066, w których szkielet miał przypadkową konfigurację stereochemiczną oprócz wiązania pomiędzy centralną parą CG, która była określona jako albo Sp albo Rp. Nieoczekiwanie, wydawało się, że doświadczenie to dało wynik przeciwny od uzyskanego z zastosowaniem PS-oligomerów, w których cały szkielet był stereoregularny, ponieważ [CG-RpPS]-2066 spowodował równie duże zwiększenie włączania 3H tymidyny do komórek śledziony jak kontrolny PS-oligomer o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej. Dla odmiany PS-oligomer [CG-SpPS]-2066 był zasadniczo nieaktywny.
Hamowanie włączania 3H tymidyny do komórek śledziony przez stereoizomer R CpG PS-oligomeru.
PL 232 260 B1
Poziom włączenia 3H tymidyny w studzienkach potraktowanych stereoizomerem Rp był niższy niż w studzienkach kontrolnych, sugerując możliwą aktywność hamującą, chociaż w mikroskopowym badaniu komórek nie zauważono cytotoksyczności. Rzeczywiście, gdy komórki hodowano w obecności równomolowej mieszaniny [Mix-PS]-2066 i stereoizomeru zawierającego wszystkie wiązania o konfiguracji Rp, wystąpiło w przybliżeniu 50% zmniejszenie poziomu włączania 3H tymidyny w porównaniu z komórkami hodowanymi tylko z [Mix-PS]-2066 (tabela 17).
Uprzywilejowana stymulacja układu odpornościowego przez [Rp-PS]-oligomery na wczesnych etapach.
W testach włączania 3H tymidyny przeprowadzonych w poprzedzających doświadczeniach najprawdopodobniej mógł się pojawić artefakt wynikający z degradacji PS-oligomeru, powodując uwalnianie nieznakowanej tymidyny, która współzawodniczy ze znakowanym materiałem, sztucznie hamując jego włączanie (Matson i in., 1992). Poprzednie badania wykazały, że [Rp-PS]-oligomery są znacznie bardziej podatne na degradację nukleazą niż odpowiedniki Sp. Tak więc było możliwe, że widoczny brak stymulującego wpływu [Rp-PS]-oligomeru w testach włączania tymidyny mógł być mylącym artefaktem, który nie był odbiciem prawdziwego wpływu [Rp-PS]-oligomeru. W celu wykrycia stymulującego wpływu [Rp-PS]-oligomeru na wczesnych etapach, zanim PS-oligomer może ulec degradacji i jako niezależny biologiczny test na stymulację indukowaną CpG, zbadano zdolność tych PS-oligomerów do indukcji gwałtownej fosforylacji regulatorowej kinazy białkowej aktywowanej mitogenem, JNK. Nieoczekiwanie stwierdzono, że po traktowaniu sekwencjami CpG PS-SEQ ID NO: 386 i PS- SEQ ID NO: 387, przez czterdzieści minut fosforylację JNK silnie indukowały nie [Sp-PS]-izomery lecz tylko [Mix-PS]izomery o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej i [Rp-PS]-izomery. Kontrolny nie-CpG [Mix-PS]SEQ ID NO: 388 nie indukował wykrywalnej fosforylacji JNK. Wszystkie próbki zawierały porównywalną całkowitą ilość białka JNK.
Chociaż nie można było wykryć żadnego wpływu CpG [Sp-PS]-oligomeru w teście fosforylacji JNK, oligomer wykazał w tym doświadczeniu aktywność biologiczną, ponieważ poziom inhibitorowego białka kB-a był obniżany przez wszystkie z CpG PS-oligomerów, niezależnie od stereoizomerii, lecz nie przez kontrolny nie-CpG PS-SEQ ID NO: 388.
Stereo-niezależność wiązania PS-oligomeru na powierzchni komórki i jego wychwytu.
Jedno potencjalne wyjaśnienie, które może przyczyniać się do obserwowanych różnic w bioaktywności stereoizomerów PS-oligomerów jest związane ze stereo-zależnością wiązania przez komórki lub wychwytu PS-oligomerów. Aby sprawdzić tę możliwość, zsyntetyzowano PS-oligomery o konfiguracji stereochemicznej P ze znacznikami fluorescencyjnymi i inkubowano je z komórkami. Zgodne z wynikami poprzednich badań, PS-oligomery wykazały zależny od stężenia i zależny od temperatury wzór wychwytu przez komórki. W szczególności nie wystąpiła wykrywalna różnica w wiązaniu lub wychwycie PS-oligomerów Rp lub Sp.
P r z y k ł a d 30: Semi-miękki oligonukleotyd ODN 316 klasy C i semi-miękki oligonukleotyd ODN 313 klasy B zmniejszają indukowane antygenem zapalenie dróg oddechowych in vivo.
W tym badaniu oszacowano wpływ in vivo ODN 316 na mysi model indukowanego antygenem zapalenia dróg oddechowych. ODN 313 klasy B włączono do badania w celach porównawczych.
Metody. Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 10 μg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem (Pierce Alum).
Myszy prowokowano antygenem dając im do wdychania albuminę jaja kurzego w aerozolu, dwa razy w tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pierwszą prowokację przeprowadzono w 21 dniu badania. Aerozol wytwarzano przez 1 godzinę z 1% roztworu albuminy jaja kurzego w PBS stosując nebulizator DeVilbiss Ultraneb. Innymi myszami posłużono się jako nieprowokowaną kontrolą.
ODN 316, ODN 313 (1-100 μg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli, 20 ul) podano donosowo jednokrotnie w każdym tygodniu, dwa dni przed pierwszą prowokacją antygenem w tygodniu.
Dane dla punktów końcowych oszacowano w dniu badania 33 (tj. 48 godzin po ostatniej prowokacji antygenem). Komórki z dróg oddechowych pobrano przez płukanie pęcherzyków płucnych. Różnicowe zliczanie komórek przeprowadzono stosując automatyczny licznik komórek Advia sprawdzając wizualnie losowo wybrane próbki licząc komórki w preparatach z próbek odwirowanych barwione barwnikiem Wright-Giemsa. Liczby limfocytów T CD4+ (komórki CD3+CD4+) zliczono stosując cytometrię przepływową. Wyniki wyrażono jako średnią ± SEM dla każdej grupy. Istotność zmierzono stosując test z porównaniem wielokrotnym Kruskall'a-Wallis'a.
PL 232 260 Β1
Wyniki. Prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów w świetle dróg oddechowych. To zwiększenie spowodowane było przede wszystkim nagromadzeniem eozynofilów (np. 3x105 eozynofilów/ml u myszy prowokowanych antygenem, traktowanych nośnikiem w porównaniu z <1x104 eozynofilów/ml u nieprowokowanych myszy). Eozynofilię znacznie hamowały ODN 316 lub ODN 313 (np. około 5x104 eozynofilów/ml (P < 0,05) u myszy prowokowanych antygenem, traktowanych 100 μg/ml obydwu z ODN).
Prowokacja antygenem także powodowała nagromadzenie limfocytów T CD4+ co było istotnie hamowane przez obydwa z ODN (np. około 2x104 limfocytów T CD4+/ml u myszy prowokowanych antygenem traktowanych 100 μg/ml obydwu z ODN, w porównaniu z około 1,3x105 limfocytów T CD4+/ml (P < 0,05) u myszy prowokowanych antygenem, traktowanych nośnikiem).
Wnioski. Zarówno semi-miękki ODN 316 klasy C jak i semi-miękki oligonukleotyd ODN 313 klasy B hamowały indukowaną antygenem eozynofilię dróg oddechowych i nagromadzenie limfocytów T CD4+ in vivo.
Przykład 31: Porównanie semi-miękkich ODN klasy B, C i T: Indukcja sekrecji cytokin przez mysie splenocyty in vitro W tym badaniu testowano zdolność semi-miękkich ODN klasy B, C i T do indukowania sekrecji cytokin przez mysie splenocyty in vitro.
Metody. Splenocyty pochodzące od myszy BALB/c zebrano i połączono. Splenocyty inkubowano w 48-studzienkowych płytkach hodowlanych w gęstości 1x107 komórek/1 ml w RPMI 1640 + 10% płodowa surowica bydlęca zawierająca poszczególne ODN (0,0,001, 0,01, 0,1, 1 lub 10 μg/ml). Badane ODN obejmowały semi-miękki ODN 20674 klasy B, semi-miękkie ODN 316 i ODN 317 klasy C oraz i semi-miękkie ODN 319 i ODN 320 klasy T.
Po 48 godzinach inkubacji (37°C, 5% CO2), usunięto podłoże hodowlane i zmierzono stężenia IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ i TNF-α stosując układ Luminex cytokine multiplex system. Stężenia IL-12p40, IFN-α i IP-10 zmierzono stosując test ELISA. Dolne granice dokładnej wykrywalności wynosiły 3,2-10 pg/ml. Stan aktywacji komórek oszacowano przez pomiar ekspresji CD40, CD69 i CD86 na limfocytach CD3+ i B220+ z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Wyniki. Każdy z ODN indukował aktywację limfocytów B (komórki B220+) jak stwierdzono na podstawie pomiarów zwiększonej ekspresji CD40, CD69 i CD86, i aktywację limfocytów T (komórki CD3+) jak stwierdzono na podstawie pomiarów zwiększonej ekspresji CD69.
Wywołana ODN sekrecja IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN-α, TNF-a i IP-10. Miana innych mierzonych cytokin nie były zwiększone. Przykładowo, przy zastosowaniu ODN w stężeniu 1 μg/ml, poziomy sekrecji cytokin były następujące (wszystkie wyrażone w μg/ml):
Tabela 18. Sekrecjajn vitro cytokin w odpowiedzi na semi-miękkie ODN klasy B, C i T
ODN IL-6 IL-10 IL- 12p40 IFN-a TNF-a ip-10
313 4000 410 300 12 150 400
316 3600 820 820 90 400 780
317 2200 410 790 140 340 760
319 1200 200 300 nd 50 30
320 150 nd 160 nd 15 25 '
nd - nie wykryto
W porównaniu z semi-miękkim ODN 313 klasy B, dwa semi-miękkie ODN klasy C indukowały większe miana IL-10, IL-12p40, IFN-α, TNF-a i IP-10, lecz nie powodowały wyraźniejszej aktywacji limfocytów B. Dwa semi-miękkie ODN klasy T wydawały się być mniej skuteczne jako induktory produkcji cytokin niż semi-miękkie ODN klasy B i C.
PL 232 260 B1
Wnioski. Zarówno ODN klasy B jak i klasy C indukowały profil indukcji cytokin zgodny z aktywacją TLR9, i każdy spowodował aktywację limfocytów B. ODN klasy T były mniej skutecznymi induktorami produkcji cytokin.
W porównaniu z semi-miękkim ODN 313 klasy B, semi-miękkie ODN, zarówno 316 jak i 317 klasy C, indukowały większe stężenia cytokin modyfikujących układ immunologiczny, lecz bez indukcji silniejszej aktywacji limfocytów B. Te dane sugerują terapeutyczną korzyść ODN klasy C.
P r z y k ł a d 32: Indukcja produkcji cytokin, przeciwciał i CTL in vivo w odpowiedzi na ODN CpG Pomiary cytokin: myszom BALB/c podawano 400 mg ODN (SEQ ID NO: 294 (miękki), 241 (semimiękki), 242, i 286) przez wstrzyknięcie s.c. Zwierzęta skrwawiono 3 godziny po wstrzyknięciu i zmierzono poziomy IP-10, IFN-gamma i TNF-α w osoczu stosując test ELISA. Wyniki przedstawiono na fig. 41A i B (IP-10), C (IFN), i D i E (TNF)
Odpowiedź humoralna: myszy BALB/c immunizowano stosując 1 mg HBsAg samodzielnie lub w połączeniu z ODN CpG przez wstrzyknięcie i.m. Zwierzętom podano dawkę przypominającą 4 tygodnie po głównej immunizacji. Miana przeciwciał zmierzono na końcu metodą ELISA. Miana izotypu IgG zmierzono na końcu, 2 tygodnie po podaniu dawki przypominającej, posługując się metodą ELISA. Wyniki przedstawiono na fig. 42A i B.
Odpowiedź z udziałem cytotoksycznych limfocytów T: myszy BALB/c immunizowano stosując 1 mg HBsAg samodzielnie lub w połączeniu z ODN CpG przez wstrzyknięcie i.m. Zwierzętom podano dawkę przypominającą 4 tygodnie po pierwszej immunizacji. Aktywność CTL zmierzono w 4 tygodniu po podaniu dawki przypominającej stosując test uwalniania 51Cr. wyniki przedstawiono na fig. 42C.
Zatem miękkie i semi-miękkie ODN są podobne lub lepsze w aktywacji mysiego układu odpornościowego jak można stwierdzić na podstawie badań zarówno in vitro jak i in vivo i mogą wzmacniać swoistą dla antygenu odpowiedź immunologiczną.
P r z y k ł a d 33: Zastosowanie ODN CpG w leczeniu przeciwnowotworowym in vivo
ODN według wynalazku badano pod kątem efektywności na trzech modelach nowotworowych w formie monoterapii. Początkowo ODN podawano myszom z rakiem nerki (renca). Doświadczenia przeprowadzono następująco: tworzenie guzów indukowano przez wstrzykiwanie podskórne 2x105 komórek renca w lewy bok myszy w dniu 0. Leczenie prowadzono podając iniekcje s.c. z PBS, ODN CpG 241 lub 242 raz w tygodniu przez 5 tygodni zaczynając od 10 dnia po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Wyniki przedstawiono na fig. 43A i B.
Drugim badanym modelem był mysi niedrobnokomórkowy rak płuca (rak płuca Lewis'a). Tworzenie guzów indukowano przez wstrzykiwanie s.c. 2x106 komórek raka płuca Lewis'a w lewy bok myszy w dniu 0. Leczenie prowadzono podając iniekcje SC z PBS, 100 mg ODN CpG 241 lub 242 w 1, 3 i 7 dniach tygodnia przez 2 miesiące. Wyniki przedstawiono na fig. 43E i F.
Trzecim badanym modelem była mysia neuroblastoma. 1x106 komórek Neuro2a wstrzykiwano SC w lewy bok w dniu 0. Iniekcje s.c. z PBS, 100 mg ODN CpG 241 lub 242 podawano każdego dnia od 10 dnia do 15 dnia. Wyniki przedstawiono na fig. 43C i D.
Zatem semi-miękki ODN może kontrolować wzrost raka (mysi renca, LLC, neuroblastoma) i zwiększać przeżywalność myszy chorych na te nowotwory.
P r z y k ł a d 34: Zapalenie okołonerkowe wywołane podawaniem miękkiego, semi-miękkiego i twardego ODN myszom BALB/c ze znokautowanym TLR-9
U myszy BALB/c ze znokautowanym TLR-9 badano zapalenie okołonerkowe. Wyniki przedstawiono odpowiednio w tabeli 19 i 20. Semi-miękkie ODN (241) indukowały mniejszy odczyn zapalny w miejscu wstrzyknięcia, nie wywoływały (dawka 100 mg) lub wywoływały niewielkie (dawka 250 mg) zapalenie okołonerkowe, i były lepiej tolerowane przy wielokrotnym podawaniu ODN.
PL 232 260 Β1
Tabela 19
Grupa Zapalenie miąższu nerki Ziarniniakowe zapalenie torebki nerkowej Ziarniniakowe zapalenie tkanki tłuszczowej
PBS prawidłowe prawidłowe prawidłowe
5/5 5/5 5/5
242 łagodne łagodne do łagodne do
100 mg 2/5 umiarkowanego 5/5 umiarkowanego 4/5
242 łagodne łagodne do wyraźne
25 0 mg 1/4 umiarkowanego 4/4 4/4
241 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
100 mg 5/5 5/5 5/5
241 łagodne łagodne łagodne do
2 50 mg 2/5 2/5 umiarkowanego 3/5
PL 232 260 Β1
Tabela 20
Grupa Zapalenie miąższu nerki Ziaminiakowe zapalenie torebki nerkowej Z i arni n i akowe zapalenie tkanki tłuszczowej
PBS prawidłowe 5/5 prawidłowe 5/5 prawidłowe 5/5
242 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
100 mg 5/5 5/5 5/5
242 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
250 mg 5/5 5/5 5/5
241 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
10 0 mg 5/5 5/5 5/5
241 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
250 mg 5/5 5/5 5/5
Powyższe zestawienie uważa się za wystarczające do umożliwienia fachowcom w dziedzinie praktycznej realizacji wynalazku. Zakres wynalazku nie ogranicza się do załączonych przykładów, ponieważ przykłady są w zamierzeniu pojedynczymi ilustracjami jednego aspektu wynalazku. Inne funkcjonalnie równoważne rozwiązania i różne modyfikacje wynalazku oprócz tych tu przedstawionych i opisanych staną się oczywiste dla fachowców w dziedzinie wynikając z powyższego opisu i mieszczą się w zakresie załączonych zastrzeżeń patentowych.
PL 232 260 Β1
Lista sekwencji
<110> COLEY PHARMACEUTICAL GROUP, INC. COLEY PHARMACEUTICAL GmbH
<120> IMMUNOSTYMULUJĄCE KWASY NUKLEINOWE
<130> C01037.70048.US
<140> US 60/404820
<141> 2003-08-06
<150> US 60/404479
<151> 2002-08-19
<150> US 60/447377
<151> 2003-02-14
<150> US 60/404820
<151> 2002-08-19
<160> 368
<170> Patentln wersja 3.2
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 1
acgtcgtttt cgtcgtt
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
PL 232 260 Β1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 2 gcgtcgacgt cgacgc 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 3
gcgtcgtttt cgtcgc 16
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 4
tccatgacgt tcctgatgc 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22 0>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 5
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
PL 232 260 Β1
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 6
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 7
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 8
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
PL 232 260 Β1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 9 tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 10
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleo tyd
<400> 11
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
PL 232 260 Β1
<222> (3) .. (3)
<223> de z aguan i na
<220>
<221> misc_feature
<222> (6) ·. (6)
<223> dezaguanina
<400> 12
tcntcntttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (3) .. (3)
<223> dezaguanina
<220>
<221> misc_feature
<222> (22) .. (22)
<223> dezaguanina
<400> 13
tcntcgtttt gtcgttttgt cntt 24
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
PL 232 260 Β1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 14 tcgccgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 15
tcgtcgtttt acgacgtcgc g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 16
tcgtcgtttt acgacgtcgt g 21
<210> 17
<2U> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 17
tcgtcgtttt acggcgccgc gccg 24
PL 232 260 Β1
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) -- (1)
<223> N oznacza a, c, g, lub t z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <220>
<221> misc_feature
<222> (2) .. (2)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów
<220>
<221> misc_feature
<222> (15) .. (15)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów
<220>
<221> misc_feature
<222> (16) .. (16)
<223> N oznacza a, c, g, lub t z wiązaniem tiofosforanowym.
3-L0 nukleotydów <400> 18 nngtcgttgt cgttnn 16 <210> 19 <211> 28
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> N oznacza a, c, g. Lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <220>
<221> misc_feature
<222> (2) .. (2)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów
<220>
<221> misc_feature
<222> (21) .. (27)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów
<220>
<221> misc_feature
<222> (28) .. (28)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym.
3-10 nukleotydów <400> 19 nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttnn 28
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
PL 232 260 Β1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1) <223> n oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <22 0>
<221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (33) .. (33) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (34) .. (34) <223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <400> 20 nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttgtcg ttnn 34 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1 <400> 2L tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 22
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 23
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 24
tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 25 <211> 21
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 25
tcgtcgtttt gcgacgtcgc g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 26
tcgtcgtttt tcgacgtcga g 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 27
tcgtcgtttt tcgacgtcgc g 21
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1 <220>
<221> misc_feature
<222> (6) .. (6)
<223> dezaguanina
<220>
<221> misc_feature
<222> (19) .. (19)
<223> dezaguanina
<400> 28
tcgtcntttt gtcgttttnt cgtt 24
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 29
tcgtcgtttc gacgtt 16
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 30
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt 24 <210> 31 <211> 28
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 31
tcgtcgtttc gtcgacgtcg tttcgtcg 28
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 32
tcgtcgtttc gtcgat 16
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 33
tcgtcgtttc gtcgatt 17
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1 <400> 34 tcgtcgtttc gtcgt 15
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 35
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 36
<2L1> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 36
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 37
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24 <210> 38 <211> 26
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 39
tcgtcgtttg tcgtcggcgg ccgccg 26
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 39
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 40
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1 <400> 41 tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 42
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 43
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 44
tcgtcgtttt cgtcgt 16 <210> 45 <211> 17
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 45
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynuk1eo tyd
<400> 46
tcgtcgtttt cgttgtt 17
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 47
tcgtcgtttt gtcgtcgttt t 21
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1 <400> 48 tcgtcgtttt ttctcgtcgt ttt 23
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 49
tcgtcgtttt tgtcgtt 17
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 50
tcgtcgtttt tgttgtt 17
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynuk1eo tyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (11) (U)
<223> dezaguanina
PL 232 260 Β1 <220>
<221>. misc_feature <222> (14) .. (14) <223> dezaguanina <400> 51 tcgtcgtttt ntcnttttgt cgtt 24 <210 52 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Oligodeoksynukleotyd <400 52 tcgtcgtttt gacgtt 16 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 53 tcgtcgtttt gacgtttt 18 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1 <400> 54 tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 55
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 56
tcgtcgtttt gtcgtt 16
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22D>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_£eature
<222> (i) .. (1)
PL 232 260 Β1 <223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowyiu,
3-10 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (39) .. (39) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (40) .. (40) <223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <400> 57 nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttgtcg ttgtcgttnn 40 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (19) .. (19) <223> dezaguanina <220>
100
PL 232 260 Β1
<221> misc_feature
<222> (22) .. (22)
<223> dezaguanina
<400> 58
tcgtcgtttt gtcgttttnt cntt 24
<21Q> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 59
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 60
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 60
tcgtcgtttn gtcgttt 17 <210> 61 <211> 24 <212> DNA
PL 232 260 Β1
101
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<22Q>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 61
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 62
tcgtcgtttg cgtcgt 16
<210> 63
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 63
tcgtcgtttg cgtcgtt 17 <210> 64 <211> 14 <212> DNA
102
PL 232 260 Β1
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 64
tcgtcgtttg tcgt 14
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213* Sztuczna sekwencja
<220*
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 65
tcgtcgtttg tcgtt 15
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (9)
<223> 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (15) .. (18)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 66
PL 232 260 Β1
103 tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt 24
<210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 67
tcgttttgtc gtttt 15
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 68
tcgttttgtc gtttttttt 19
<210> 69
<211?· 17
<212> DNA
<213?· Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 69
tcgttttttt tcgtttt 17 <210> 70 <211> 17 <212> DNA
104
PL 232 260 Β1
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 70
tcgttgtttt cgtcgtt 17
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 71
tcgttgtttt cgttgtt 17
<210> 72
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 72
tcgttgtttt tgtcgtt 17
<210> 73
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 73
PL 232 260 Β1
105 tcgttgtttt tgttgtt 17 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22Q>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2'-deoksyuracyl <220>
<221> misc_feature <222> (18) .. (18) <223> 2'-deoksyuracyl <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> 2'-deoksyuracyl <400> 74 tcgncgtttt gtcgtttcngn cgtt 24 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 75
106
PL 232 260 Β1 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 76
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 77
tgtcgtttcg tcgtt 15
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 78
tgtcgttttg tcgtt 15 <210> 79 <211> 20
PL 232 260 Β1
107
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoks ynuk1eo tyd
<400> 79
ttagttcgta gttcttcgtt 20
<210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 80
ttcgtcgttt cgtcgtt 17
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01i godeoksynukleotyd
<400> 81
ttcgtcgttt cgtcgttt 18
<210> 82
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
108
PL 232 260 Β1 <400> 82 ttcgtcgttt tgtcgtt 17
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<22 3> Oli godeoksynukleotyd
<400> 83
ttcgttctta gttcgtagtt 20
<210> 84
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22Q>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 84
tttcgacgtc gttt 14
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 85
ttttcgtcgt tttgtcgtcg t 21 <210> 86 <211> 24
PL 232 260 Β1
109
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 86
ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt 24
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 87
ttttcgtcgt tttttttcgt cgt 23
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 88
ttttcgtcgt tttttttcgt cgtttt 26
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
110
PL 232 260 Β1 <400> 89 ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt 24
<210> 90
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeo ks ynuk1eo tyd
<400> 90
ttttcgtttt gtcgt 15
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 91
ttttcgtttt gtcgtttt 18
<210> 92
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 92
<211> 20 ttttcgtttt ttttcgt 17 <210> 93
PL 232 260 Β1
111
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 93
ttttcgtttt ttttcgtttt 20
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 94
ttttcgtttt gtcgtttt 18
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 95
ttttttttcg ttttgtcgt 19
<210> 96
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
112
PL 232 260 Β1 <400> 96 ttgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 97
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 97
ttgtcgtttt cgttgtt 17
<210> 98
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 98
ttgtcgtttt tgtcgtt 17
<210> 99
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 99
<211> 23 ttgtcgtttt tgttgtt 17 <210> 100
PL 232 260 Β1
113
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 100
tcgtcgtttt gtcgtttgtc gtt 23
<210> 101
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 101
tcgtcgtttt gtcgtt 16
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 102
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleo tyd
114
PL 232 260 Β1 <400> 103 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 104
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 105
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 106
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<22 3> Oligodeoksynukleotyd
<400> 106
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 107 <211> 24
PL 232 260 Β1
115
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 107
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 108
<211> 24 -
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 108
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 109
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeo ksvnuk1eo tvd
116
PL 232 260 Β1 <400> 110 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 111
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 112
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoks ynukleo tyd
<400> 113
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 114 <211> 24
PL 232 260 Β1
117
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 114
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 115
<211> 24
<212> □NA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<22 3> Oligodeoksynukleotyd
<400> 115
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 116
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
118
PL 232 260 Β1 <400> 117 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 118
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 118
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220^
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 119
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210 120
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 120
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 121 <211> 24
PL 232 260 Β1
119
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 121
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 122
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 122
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 123
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
120
PL 232 260 Β1 <400> 124 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<2L0> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 125
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 126
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<2 L 0> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 127
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 123 <211> 24
PL 232 260 Β1
121
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 128
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 129
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 129
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 130
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 130
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
122
PL 232 260 Β1 <400> 131 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 132
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 133
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 134
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 134
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 135 <211> 24
PL 232 260 Β1
123
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 135
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 136
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 136
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 137
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 137
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 138
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
124
PL 232 260 Β1 <400> 138 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 139
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 140
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 140
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 141
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 142 <211> 24
PL 232 260 Β1
125
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01i godeoks ynuk1eotyd
<400> 142
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 143
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 144
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
126
PL 232 260 Β1 <400* 145 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 146
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 147
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 148
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 149 <211> 24
PL 232 260 Β1
127
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220*
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 149
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 150
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleo tyd
<400> 150
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01igodeoksynukleotyd
<400> 151
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
128
PL 232 260 Β1 <400> 152 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 153
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 154
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja-
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 155
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 156 <211> 24
PL 232 260 Β1
129
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 156
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 157
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 157
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 158
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
130
PL 232 260 Β1 <400> 159 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 160
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 161
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 161
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 162
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 163 <211> 24
PL 232 260 Β1
131
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 163
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 164
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 164
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<2 23> Oligodeoksynukleotyd
<400> 165
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 166
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
132
PL 232 260 Β1 <400> 166 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 167
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 167
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 168
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 169
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 169
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 170 <211> 24
PL 232 260 Β1
133
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 170
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 171
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 171
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 172
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 173
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
134
PL 232 260 Β1 <400> 173 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 174
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 174
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 175
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 175
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 176
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoks ynuk1eo tyd
<400> 176
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 177 <211> 24
PL 232 260 Β1
135
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 177
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 178
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 178
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 179
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 180
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
136
PL 232 260 Β1 <400> 180 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<40C> 181
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 182
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 183
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 183
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 184 <211> 24
PL 232 260 Β1
137
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 184
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 185
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 185
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 186
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 187
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
138
PL 232 260 Β1 <400> 187 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 188
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 188
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 189
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 190
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 191 <211> 24
PL 232 260 Β1
139
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 191
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 192
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 192
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 193
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<2 23> Oligodeoksynukleotyd
<400> 193
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 194
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
140
PL 232 260 Β1 <400> 194 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 195
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 196
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 196
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<21Q> 197
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 197
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 198 <211> 24
PL 232 260 Β1
141
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 198
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210 199
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 199
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 200
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 200
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<2 2 3> Oligodeoksynukleotyd
142
PL 232 260 Β1 <400> 201 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 202
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210 203
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 203
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210 204
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 204
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 205 <211> 24
PL 232 260 Β1
143
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 205
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 206
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 206
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 207
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 207
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 208
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
144
PL 232 260 Β1 <400> 208 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 209
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 209
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 210
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 210
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 211
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 211
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 212 <211> 24
PL 232 260 Β1
145
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 212
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 213
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 214
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<40D> 214
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 215
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
146
PL 232 260 Β1 <400> 215 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 216
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 216
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 217
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 217
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 218
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 218
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 219 <211> 24
PL 232 260 Β1
147 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <40G> 219 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 220 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 220 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 221 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400* 221 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 222 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
148
PL 232 260 Β1 <400> 222 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 223
<211> 24
<212> □NA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 223
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 224
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 224
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210 225
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd '
<400 225
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 226 <211> 24
PL 232 260 Β1
149
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 226
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 227
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 228
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoks ynuk1eo tyd
<400> 228
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 229
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
150
PL 232 260 Β1 <400> 229 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 230
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleo tyd
<400> 230
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 231
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 231
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 232
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 232
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 233 <211> 24
PL 232 260 Β1
151
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 233
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 234
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 234
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 235
<211> 24
<212> DNA
<213=> Sztuczna sekwencja
<220
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 235
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 236
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<2 2 0>
<223> Oligodeoksynukleotyd
152
PL 232 260 Β1 <400> 236 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 237
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 237
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 238
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 238
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 239
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 239
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 240 <211> 24
PL 232 260 Β1
153
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 240
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 241
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 241
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 242
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 242
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt 23
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
154
PL 232 260 Β1 <400> 243 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 244
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 245
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01igodeoksynukleotyd
<400> 245
tcgtcgtttc gtcgtt 16
<210> 246
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 246
tcgtcgtttt gtcgtt 16 <210> 247 <211> 22
PL 232 260 Β1
155
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 247
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 248
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 248
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 249
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 249
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 250
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
156
PL 232 260 Β1 <400> 250 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 251
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 251
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 252
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 252
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 253
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 253
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 254 <211> 22
PL 232 260 Β1
157
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 254
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 255
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 255
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210 256
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 256
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 257
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoks ynukleo tyd
158
PL 232 260 Β1 <400> 257 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 258
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 258
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<2 2 3> Oligodeoksynukleotyd
<400> 259
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 260
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 260
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24 <210> 261 <211> 24
PL 232 260 Β1
159
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 261
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 262
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 262
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt 24
<210> 263
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220*
<223> 01i godeoks ynuk1eo tyd
<400> 263
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 264
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
160
PL 232 260 Β1 <400> 264 tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 265
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 265
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 266
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 266
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 267
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 267
tcgtcgtttc gacgtt 16 <21Q> 268 <211> 20
PL 232 260 Β1
161
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 268
gttctcgctg gtgagtttca 20
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 269
gttctcgctg gtgagtttca 20
<210> 270
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 270 tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24
<210> 271
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
162
PL 232 260 Β1 <400> 271 tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24 <210> 272 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222;> (10) .. (10) <223> 2'-deoksyuracyl <400> 272 tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24 <210> 273 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (10) .. (10) <223> 2'-deoksyuracyl <400> 273 tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24 <210> 274 <211> 24
PL 232 260 Β1
163
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 274
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
<210> 275
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 275
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 276
<211> 24
<212;» DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 276
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 277 <211> 24
164
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<22 0>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (4)
<223> 2'-deoksyuracyl
<22 0>
<221> misc_feature
<222> (18) .. (18)
<223> 2'-deoksyuracyl
<22 0>
<221> mi sc_feature
<222> (20) .. (20)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 277
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt 24
<210> 278
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (4)
<223> 2' -deoksyuracyl
PL 232 260 Β1
165 <220>
<221> misc_feature
<222> (18) .. (18)
<223> 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (20) .. (20)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 278
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt 24
<210> 279
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (9)
<223> 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (15) .. (18)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 279
tcgtcgnnnt gtcgnnnngt cgtt 24 <210> 280 <211> 24
166
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01i godeoksynukleo tyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (9)
<223> 2’-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (15) .. (18)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 280
tcgtcgnnnc gtcgimnngt cgtt 24
<210> 281
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 281
aacgtcgttt tcgtcgtt 18
<210> 282
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01igodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
167 <400> 282 aacgtcgttt tcgtcgtt 18
<210> 283
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 283
tcgtcgtttt cgtcgt 16
<210> 284
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 284
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 285
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 285 aacgtcgttt tcgtcgtt 18 <210> 286 <211> 24
168
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 286
tgctgctttt gtgcttttgt gett 24
<210> 287
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 287
tgtcgttgtc gttgtcgttg tegtt 25
<210> 288
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 288
tcgttttttt cgtttttttc gttt 24
<210> 289
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
169 <400> 289 tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 290
<2ll> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 290
tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt 22
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynuk1eo tyd
<400> 291
tcgtcgtttt cgtttttttc gttt 24
<210> 292
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli gode oksynuk1eo tyd
<400> 292
tcgttttgtc gtttttttcg a 21 <210> 293 <211> 24
170
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 293
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 294
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 294
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 295
<211? 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400 295
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210 296
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
171 <220>
<221> misc_feature <222> (13) .. (13) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (16) .. (16) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 296 tcgtcgtttt gancgntt 18 <210> 297 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 297 tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt 24 <210> 298 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 298 tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 299 <211> 18
172
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01igodeoksynukleotyd
<400> 299
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 300
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 300
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 301
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (7)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14) .. (14)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
PL 232 260 Β1
173 <220>
<221> misc_feature <222> (17) .. (17)
<223> N oznacza a. c. g, lub
<400> 301
tcgtatncgt tttncgntt
<210> 302
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (6) .. (6)
<223> N oznacza a, c, g, lub
<220>
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, C, g. lub
<220>
<221> raisc_feature
<222> (16) .. (16)
<223> N oznacza a, c. g- lub
<400> 302
tcgatncgtt ttncgntt 18 <210> 303 <211> 18
174
PL 232 260 Β1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (6) .. (6) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (13) .. (13) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc.feature <222> (16) .. (16) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 303 tcgttncgtt ttncgntt 18 <210> 304 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 304 tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23 <210> 305 <211> 21
PL 232 260 Β1
175 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 305 tcgttttgac gttttgtcgt t 21 <210> 306 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (12) .. (12) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (15) .. (17) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> N oznacza a, c, g, lub t
176
PL 232 260 Β1 <400> 306 tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt <210> 307 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (12) .. (12) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (15)..(17) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> raisc_feature <222> (20) .. (20) <223> N oznacza a, c, g, Lub t <400> 307 tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt <210> 308 <211> 24
PL 232 260 Β1
177
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (12) .. (12)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20) .. (20)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 308
tcgtcgttac gncgttacgn cgtt 24
<210> 309
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (9)
<223> N oznacza a, c, g, lub t <22C>
<221> misc_feature
<222> (15) .. (17)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
178
PL 232 260 Β1 <400> 309 tcgtcgnnnc gtcgnnncgt cgtt <210> 310 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 310 tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt <210> 311 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (4) .. (4) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220 <221> misc_feature <222> (7) .. (8) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (11) .. (11) <223> N oznacza a, c, g, lub t
PL 232 260 Β1
179 <400> 311 tcgncgnncg ntcgtt 16 <210> 312 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (4) .. (4) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (8) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (11) .. (12) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (15) .. (15) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 312 tcgncgnncg nncgntcgtt 20 <210> 313 <211> 24
180
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 313
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 314
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleo tyd
<400> 314
tcgacgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 315
<211> 13
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (6) .. (6)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
PL 232 260 Β1
181 <400> 315 tcgcgncgcg cgn 13
<210> 316
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22D>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 316
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 317
<211;* 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 317
tcgcgacgtt cgcgcgcgcg 20
<210> 318
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (5)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
182
PL 232 260 Β1 <220>
<221> misc_feature <222> (8) .. (9) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (14) .. (14) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 318 ttgnntgnnt tttntttttt t 21 <210> 319 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 319 ttgcgtgcgt tttgacgttt tttt 24 <210> 320 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 320 ttggctggct tttgacgttt tttt 24 <210> 321 <211> 22
PL 232 260 Β1
183
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 321
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 322
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22 0>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 322
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt 24
<210> 323
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01i godeoksynukleotyd
<400> 323
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23
<210> 324
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
184
PL 232 260 Β1 <400> 324 tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 325
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22 0>
<22 3> Oli godeoksynukleotyd
<400> 325
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 326
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 326
tcgttttgac gttttgtcgt t 21
<210> 327
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 327
tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt 24 <210> 328 <211> 24
PL 232 260 Β1
185
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 328
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 329
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 329
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 330
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 330
tccaggactt ctctcaggtt 20
<210> 331
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
186
PL 232 260 Β1 <220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (5)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (9)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14) .. (14)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 331
ttgnntgnnt tttntttttt t 21
<210> 332
<211> 13
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (6) .. (6)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
PL 232 260 Β1
187 <400> 332 tcgcgncgcg cgn 13
<210> 333
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 333
cgtcgttttg acgttttgtc gtt 23
<210> 334
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 334
gtcgttttga cgttttgtcg tt 22
<210> 335
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 335 tcgttttgac gttttgtcgt t 21 <210> 336 <211> 20
188
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 336
cgttttgacg ttttgtcgtt 20
<210> 337
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 337
gttttgacgt tttgtcgtt 19
<210> 338
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 338
ttttgacgtt ttgtcgtt 18
<210> 339
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
189 <400> 339 tttgacgttt tgtcgtt 17
<210> 340
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 340
ttgacgtttt gtcgtt 16
<210> 341
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 341
tgacgttttg tegtt 15
<210> 342
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 342
gacgttttgt cgtt 14 <210> 343 <211> 13
190
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 343
acgttttgtc gtt 13
<210> 344
<211> 11
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 344
gttttgtcgt t 11
<210> 345
<211> 11
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 345
gttttgtcgt t 11
<210> 346
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
191 <400> 346 ttttgtcgtt 10
<210> 347
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 347
tcgtcgtttt gacgttttgt cgt 23
<210> 348
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 348
tcgtcgtttt gacgttttgt cg 22
<210> 349
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 349
tcgtcgtttt gacgttttgt c 21 <210> 350 <211> 20
192
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<22 3> Oligodeoksynukleotyd
<400> 350
tcgtcgtttt gacgttttgt 20
<210> 351
<211> 19 '
<212> DNA
<213? Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 351
tcgtcgtttt gacgttttg 19
<210> 352
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22 0>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 352
tcgtcgtttt gacgtttt 18
<210> 353
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
193 <400> 353 tcgtcgtttt gacgttt 17
<210> 354
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 354
tcgtcgtttt gacgtt 16
<210> 355
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 355
tcgtcgtttt gacgt 15
<210> 356
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 356
tcgtcgtttt gacg 14 <210> 357 <211> 13
194
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 357
tcgtcgtttt gac 13
<210> 358
<211> 12
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 358
tcgtcgtttt ga 12
<210> 359
<211> 11
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 359
tcgtcgtttt g 11
<210> 360
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
195 <400> 360 tcgtcgtttt 10
<210> 361
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01i go deoksynuk 1eotyd
<400> 361
cgtcgttttg acgttttgtc gt 22
<210> 362
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 3 62
gtcgttttga cgttttgtcg 20
<210> 363
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 363 tcgttttgac gttttgtc 18 <210> 364 <211> 16
196
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 364
cgttttgacg ttttgt 16
<210> 365
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 365
gttttgacgt tttg 14
<210> 366
<211> 12
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 366
ttttgacgtt tt 12
<210> 367
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
197 <400> 367 tttgacgttt 10
<210> 368
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 368
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24
<210> 369
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 369
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 370
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynuk1eo tyd
<4Q0> 370
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21 <210> 371 <211> 19
198
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 371
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 372
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 372
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20
<210> 373
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 373
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 374
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 232 260 Β1
199 tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 375
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 375
tcgcgtcgtt cggcgccg 18
<210> 376
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleo tyd
<400> 376
tgtcgttttt tttttttttt 20
<210> 377
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<2 23> Oligodeoksynukleotyd
<400> 377
tgtcgttttt tttttttttt 20 <210> 378
200
PL 232 260 Β1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) - (1)
<223> N = uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (20)
<223> N = uracyl
<400> 378
ngtcgttnnn nnnnnnmnn 20
<210> 379
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> N = uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (20)
<223> N = uracyl
PL 232 260 Β1
201 <400> 379 ngtcgttnnn nnnnnnnnnn 2 0
<210> 380
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> N oznacza 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misC—feature
<222> (8) .. (20)
<223> N oznacza 2'-deoksyuracyl
<400> 380
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt 20
<210> 381
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
202
PL 232 260 Β1
<223> N oznacza 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (19}
<223> N oznacza 2'-deoksyuracyl
<400> 381
ngtcgttnnn nnnnnimnnt 20
<210> 382
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> G1i godeoks ynuk1eo tyd
<220>
<221> misc_feature
<222> ¢1) .. (1)
<223> N oznacza uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) ·· (12)
<223> N oznacza uracyl
<400> 382
ngtcgttnnn nngggagggg 20 <210> 383 <211> 20 <212> DNA
PL 232 260 Β1
203 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_ _f eature
<222> (1) . . (1)
<223> N oznacza uracyl
<220>
<22L> misc_ _f eature
<222> (8) . (12)
<223> N oznacza uracyl
<400> 383
ngtcgttnnn nngggagggg
<210> 384
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc. _feature
<222> (1) .. (1)
<223> N oznacza uracyl
<220>
<221> misc_ _f eature
<222> (10) .. (12)
<223> N oznacza uracyl
204
PL 232 260 Β1 <400> 384 ngtcgttccn nngggagggg 20
<210^ 385
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> N oznacza uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (12)
<223> N oznacza uracyl
<400> 385
ngtcgttccn nngggagggg 20
<210> 386
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 386 tccatgacgt tcctgacgtt 20
PL 232 260 Β1
205
<210> 387
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 387
tcaacgttga
<210> 388
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 388
tcaagcttga

Claims (10)

1. Immunostymulujący oligonukleotyd, znamienny tym, że zawiera:
Ni-C_G-N2-C_G-N3 przy czym Ni i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości
1-20 nukleotydów, przy czym oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe, przy czym N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów, i przy czym G-N2-C zawiera 1 lub 2 stabilizowane wiązania.
2. Immunostymulujący oligonukleotyd według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że:
a) kwas nukleinowy ma szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę;
b) stabilizowane wiązania internukleotydowe wybrane są z grupy składającej się z: wiązania tiofosforanowego, ditiofosforanowego, metylofosfonianowego, metylotiofosforanowego, i ich dowolnej kombinacji;
c) stabilizowane wiązania internukleotydowe stanowi wiązanie tiofosforanowe.
3. Immunostymulujący oligonukleotyd według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że oligonukleotyd występuje w kombinacji z adiuwantem, cytokiną lub antygenem.
4. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu, jak zdefiniowano w jednym z zastrzeżeń
1 do 3, do zastosowania w stymulowaniu odpowiedzi immunologicznej u podmiotu.
5. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według zastrzeżenia 4, znamienna tym, że podmiot jest chory na astmę, alergię, raka, chorobę zakaźną, chorobę autoimmunizacyjną lub przebudowę struktury dróg oddechowych.
6. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według zastrzeżenia 4, znamienna tym, że kompozycja zawiera antygen.
7. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według zastrzeżenia 4, znamienna tym, że kompozycja przeznaczona jest do podawania w ramach procedury terapeutycznej.
8. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według zastrzeżenia 7, znamienna tym, że procedurę terapeutyczną stanowi zabieg operacyjny, napromienianie lub lek.
9. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według zastrzeżenia 4, znamienna tym, że oligonukleotyd jest formułowany w postać preparatu.
10. Kompozycja immunostymulującego oligonukleotydu do zastosowania według zastrzeżenia 9, znamienna tym, że oligonukleotyd związany jest z cząsteczką nakierowującą.
PL414814A 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu PL232260B1 (pl)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40482002P 2002-08-19 2002-08-19
US40447902P 2002-08-19 2002-08-19
US60/404,479 2002-08-19
US60/404,820 2002-08-19
US42970102P 2002-11-27 2002-11-27
US60/429,701 2002-11-27
US44737703P 2003-02-14 2003-02-14
US60/447,377 2003-02-14
PCT/US2003/025935 WO2004016805A2 (en) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostimulatory nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL414814A1 PL414814A1 (pl) 2016-03-14
PL232260B1 true PL232260B1 (pl) 2019-05-31

Family

ID=31892263

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL375398A PL227938B1 (pl) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujące oligonukleotydy
PL414814A PL232260B1 (pl) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL375398A PL227938B1 (pl) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujące oligonukleotydy

Country Status (27)

Country Link
US (2) US8283328B2 (pl)
EP (2) EP2290078B1 (pl)
JP (2) JP5414961B2 (pl)
KR (2) KR100969727B1 (pl)
AR (1) AR040996A1 (pl)
AU (2) AU2003259916B2 (pl)
BR (1) BR0313414A (pl)
CA (1) CA2493753C (pl)
DK (2) DK2290078T3 (pl)
EC (1) ECSP055687A (pl)
ES (2) ES2634328T3 (pl)
HU (2) HUE035336T2 (pl)
IL (1) IL166376A (pl)
MA (1) MA27468A1 (pl)
MX (1) MXPA05002014A (pl)
NO (1) NO20051469L (pl)
NZ (2) NZ538001A (pl)
OA (1) OA12906A (pl)
PE (2) PE20040900A1 (pl)
PL (2) PL227938B1 (pl)
PT (2) PT1538904T (pl)
RS (1) RS20050126A (pl)
SI (1) SI2290078T1 (pl)
SV (1) SV2008001602A (pl)
TW (1) TW200412981A (pl)
UY (1) UY27945A1 (pl)
WO (1) WO2004016805A2 (pl)

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
DE69935507T2 (de) * 1998-04-03 2007-12-06 University Of Iowa Research Foundation Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
CA2328406A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
AU783344B2 (en) * 1999-02-17 2005-10-20 Csl Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
EP1176966B1 (en) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
DK1221955T3 (da) * 1999-09-25 2006-01-30 Univ Iowa Res Found Immunstimulerende nukleinsyre
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
PT1296714E (pt) * 2000-06-22 2009-10-15 Coley Pharm Gmbh Combinação de cpg e anticorpos dirigidos contra cd19, cd20, cd22 ou cd40 para o tratamento ou prevenção do cancro
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
JP2005500806A (ja) * 2000-09-15 2005-01-13 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス
AU2001297693A1 (en) * 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
CN100334228C (zh) * 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
DK1446162T3 (da) * 2001-08-17 2008-12-08 Coley Pharm Gmbh Kombinationsmotiv-immunstimulatoriske oligonukleotider med forbedret aktivitet
US20030139364A1 (en) * 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
EP1441763A2 (en) * 2001-11-07 2004-08-04 Inex Pharmaceuticals Corp. Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
AU2003230806B2 (en) 2002-04-04 2009-05-07 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
SG167667A1 (en) * 2002-07-03 2011-01-28 Coley Pharm Group Inc Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) * 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US7998492B2 (en) * 2002-10-29 2011-08-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products related to treatment and prevention of hepatitis C virus infection
JP2006512927A (ja) * 2002-12-11 2006-04-20 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド ５’ｃｐｇ核酸およびその使用方法
AU2004226605A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
US7569554B2 (en) * 2003-05-16 2009-08-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with therapeutic agents
MXPA05013922A (es) * 2003-06-20 2006-02-24 Coley Pharm Group Inc Antagonistas de receptor tipo toll de molecula pequena.
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
WO2005034979A2 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
KR101107818B1 (ko) 2003-10-30 2012-01-31 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 향상된 면역자극 효능을 가진 ｃ-부류 올리고뉴클레오티드유사체
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
TW200533750A (en) * 2004-02-19 2005-10-16 Coley Pharm Group Inc Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
EP1730281A2 (en) * 2004-04-02 2006-12-13 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
AU2005326144A1 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US20080009455A9 (en) * 2005-02-24 2008-01-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
AU2006235284A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20060241076A1 (en) * 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
NZ565311A (en) * 2005-07-07 2009-10-30 Pfizer Anti-ctla-4 antibody and cpg-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
EP1924692A2 (en) * 2005-09-16 2008-05-28 Coley Pharmaceutical GmbH Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (sirna) by nucleotide modification
EP1945766A2 (en) * 2005-09-16 2008-07-23 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
KR20080072934A (ko) * 2005-11-25 2008-08-07 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역자극성 올리고리보뉴클레오티드
CN101394857A (zh) * 2006-02-01 2009-03-25 爱吉恩公司 含有寡聚核苷酸和无毒lps的用于治疗癌症的组合物
JP5473336B2 (ja) * 2006-02-15 2014-04-16 アディウタイド・ファーマスーティカルズ・ゲーエムベーハー オリゴヌクレオチドの処方に関する組成物および方法
WO2007143582A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-13 Baylor College Of Medicine Reversal of the suppressive function of specific t cells via toll-like receptor 8 signaling
MX2009003398A (es) * 2006-09-27 2009-08-12 Coley Pharm Gmbh Analogos de oligonucleotidos cpg que contienen analogos t hidrofobos con actividad inmunoestimuladora mejorada.
US8377898B2 (en) * 2006-10-12 2013-02-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
EP2185160B1 (en) * 2007-08-31 2019-02-13 Neurimmune Holding AG Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
CN101820908A (zh) * 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
WO2009105641A2 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 New York University Preventing and treating amyloid-beta deposition by stimulation of innate immunity
AU2009311753B2 (en) 2008-11-04 2015-01-15 Index Pharmaceuticals Ab Compounds and methods for the treatment of inflammatory diseases of the CNS
CN102282155B (zh) 2008-12-02 2017-06-09 日本波涛生命科学公司 磷原子修饰的核酸的合成方法
CA3033133C (en) 2009-03-25 2021-11-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions for stimulation of mammalian innate immune resistance to pathogens
US9744183B2 (en) 2009-07-06 2017-08-29 Wave Life Sciences Ltd. Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
CA2791025A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Duke University Method of inducing the production of protective anti-hiv-1 antibodies
CN105481983B (zh) 2010-09-09 2021-09-03 辉瑞公司 4-1bb结合分子
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
WO2012084991A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Index Pharmaceuticals Ab Biologically active oligonucleotides capable of modulating the immune system ii
EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
DK2734208T3 (en) 2011-07-19 2017-06-19 Wave Life Sciences Ltd PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS
CA2876150A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 The Johns Hopkins University Compostions and methods for cancer immunotherapy
AR091569A1 (es) 2012-06-28 2015-02-11 Intervet Int Bv Receptores de tipo toll
EP2872485B1 (en) 2012-07-13 2020-12-16 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
CN104684923B (zh) * 2012-07-13 2018-09-28 株式会社新日本科学 手性核酸佐剂
RU2015104762A (ru) 2012-07-13 2018-08-31 Уэйв Лайф Сайенсес Лтд. Хиральный контроль
SG10201704611WA (en) 2012-12-13 2017-07-28 Aduro Biotech Inc Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
US20160002345A1 (en) 2013-02-20 2016-01-07 Innate Pharma A compound that specifically binds to kir3dl2 for use in the treatment of peripheral t cell lymphoma
US9840533B2 (en) 2013-04-29 2017-12-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
EP2992000B1 (en) * 2013-05-03 2020-07-08 The Regents of The University of California Cyclic di-nucleotide induction of type i interferon
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
PL2996473T3 (pl) * 2013-05-18 2020-06-01 Aduro Biotech, Inc. Kompozycje i sposoby aktywacji sygnałowania zależnego od „stymulatora genu interferonu”
US20160130346A1 (en) 2013-05-29 2016-05-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Kir3dl2 is a biomarker and a therapeutic target useful for respectively preventing and treating a subset of cutaneous and non-cutaneous peripheral t-cell lymphomas
EP3027227A4 (en) 2013-07-31 2018-05-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators
WO2015048635A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Mper-liposome conjugates and uses thereof
JPWO2015108047A1 (ja) * 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
WO2015108048A1 (ja) * 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
PT3094728T (pt) 2014-01-16 2022-05-19 Wave Life Sciences Ltd Desenho quiral
EP3508198A1 (en) 2014-06-04 2019-07-10 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
CA2968531A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
AU2015374385B2 (en) 2014-12-31 2020-08-06 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Combination tumor immunotherapy
JP6840332B2 (ja) * 2015-07-09 2021-03-10 国立研究開発法人物質・材料研究機構 免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体
CN109562122A (zh) * 2016-06-03 2019-04-02 波涛生命科学有限公司 寡核苷酸、组合物及其方法
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
AU2018385257A1 (en) * 2017-12-15 2020-06-18 Elanco Animal Health Gmbh Immunostimulatory oligonucleotides
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
AU2019251421A1 (en) 2018-04-09 2020-10-29 Checkmate Pharmaceuticals Packaging oligonucleotides into virus-like particles
WO2019200185A1 (en) * 2018-04-12 2019-10-17 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
SG11202010580TA (en) 2018-05-23 2020-12-30 Pfizer Antibodies specific for cd3 and uses thereof
CN113286634A (zh) 2018-05-23 2021-08-20 辉瑞公司 对gucy2c特异性的抗体及其用途
US20220370606A1 (en) 2018-12-21 2022-11-24 Pfizer Inc. Combination Treatments Of Cancer Comprising A TLR Agonist
CN115397853A (zh) 2019-12-17 2022-11-25 辉瑞大药厂 对cd47、pd-l1具特异性的抗体及其用途
KR20220125218A (ko) * 2020-01-10 2022-09-14 에스비아이 바이오테크 가부시키가이샤 신규한 tlr9 작용제
WO2022034555A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
DE3280400D1 (de) 1981-10-23 1992-06-04 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4958013A (en) * 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
CA2082951C (en) 1991-03-15 1999-12-21 Robert M. Platz Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
RU95104940A (ru) 1992-07-27 1997-01-10 Хайбрайдон Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) * 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) * 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US20030050263A1 (en) * 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
EP0930893B1 (en) 1996-10-11 2005-04-13 The Regents of The University of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6214806B1 (en) 1997-02-28 2001-04-10 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CPC dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
CA2301575C (en) 1997-05-20 2003-12-23 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6589940B1 (en) * 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
EP1009440B1 (en) * 1997-07-03 2008-09-17 MacFarlane, Donald E. Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
DK1009413T3 (da) 1997-09-05 2007-06-11 Univ California Anvendelse af immunstimulerende oligonukleotider til forebyggelse eller behandling af astma
JPH11209289A (ja) 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
DE69935507T2 (de) * 1998-04-03 2007-12-06 University Of Iowa Research Foundation Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
EP1071753A2 (en) 1998-04-20 2001-01-31 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
EP1077708A1 (en) 1998-05-06 2001-02-28 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
CA2328406A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
US6562798B1 (en) * 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
AU764532B2 (en) 1998-07-27 2003-08-21 University Of Iowa Research Foundation, The Stereoisomers of CpG oligonucleotides and related methods
WO2000009525A2 (en) 1998-08-03 2000-02-24 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide agent, composition, kit and treatments
AU777225B2 (en) 1998-09-03 2004-10-07 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
US6207819B1 (en) * 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
DE60013591T2 (de) 1999-04-29 2005-02-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna
CA2412345A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
KR100651294B1 (ko) 1999-08-13 2006-11-28 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 누클레오시드의 위치적 변형에 의한 올리고누클레오티드ＣｐＧ-매개된 면역 자극의 조절
DK1221955T3 (da) * 1999-09-25 2006-01-30 Univ Iowa Res Found Immunstimulerende nukleinsyre
CA2386019C (en) 1999-09-27 2011-06-21 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ATE378348T1 (de) * 2000-01-14 2007-11-15 Us Health Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
EP1311288A1 (en) 2000-01-20 2003-05-21 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
EP1252307B1 (en) 2000-01-26 2008-01-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
AU2001249609A1 (en) * 2000-03-28 2001-10-08 Department Of Veterans Affairs Methods for increasing a cytotoxic T lymphocyte response in vivo
DE10016079A1 (de) * 2000-03-31 2001-10-04 Alstom Power Nv Verfahren zum Entfernen von Kohlendioxid aus dem Abgas einer Gasturbinenanlage sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
IL152959A0 (en) 2000-06-08 2003-06-24 Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Gmbh Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
PT1296714E (pt) * 2000-06-22 2009-10-15 Coley Pharm Gmbh Combinação de cpg e anticorpos dirigidos contra cd19, cd20, cd22 ou cd40 para o tratamento ou prevenção do cancro
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
JP2005500806A (ja) 2000-09-15 2005-01-13 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧに基づく免疫アゴニスト／免疫アンタゴニストの高スループットスクリーニングのためのプロセス
KR100865706B1 (ko) 2000-09-26 2008-10-28 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 화학적인 위치 변화에 의해 면역자극 올리고누클레오티드유사체의 면역자극 활성을 조절하는 방법
AU2001297693A1 (en) 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
WO2002053141A2 (en) * 2000-12-14 2002-07-11 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7176296B2 (en) * 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
CN100334228C (zh) 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
AU2002318944A1 (en) 2001-08-01 2003-02-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
JP4607452B2 (ja) 2001-08-07 2011-01-05 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫調節性組成物、製剤およびその使用方法
WO2003020884A2 (en) 2001-08-14 2003-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
DK1446162T3 (da) 2001-08-17 2008-12-08 Coley Pharm Gmbh Kombinationsmotiv-immunstimulatoriske oligonukleotider med forbedret aktivitet
US7514414B2 (en) 2001-09-24 2009-04-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Suppressors of CpG oligonucleotides and methods of use
WO2003031573A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
CN100438908C (zh) * 2001-10-06 2008-12-03 梅瑞尔有限公司 CpG制剂及相关方法
US20030139364A1 (en) 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
AU2002366710A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
AU2003230806B2 (en) 2002-04-04 2009-05-07 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
JP2006515266A (ja) * 2002-04-22 2006-05-25 バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド組成物および免疫応答の調節のためのそれらの使用
WO2003103586A2 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
WO2004026888A2 (en) 2002-09-19 2004-04-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
US7998492B2 (en) * 2002-10-29 2011-08-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products related to treatment and prevention of hepatitis C virus infection
WO2004041183A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 The Regents Of The University Of California Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
JP2006512927A (ja) 2002-12-11 2006-04-20 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド ５’ｃｐｇ核酸およびその使用方法
CA2508985A1 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
US7851453B2 (en) 2003-01-16 2010-12-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
AU2004226605A1 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
US7569554B2 (en) * 2003-05-16 2009-08-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with therapeutic agents
MXPA05013922A (es) 2003-06-20 2006-02-24 Coley Pharm Group Inc Antagonistas de receptor tipo toll de molecula pequena.
AU2004259204B2 (en) * 2003-07-15 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
CA2536139A1 (en) 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
KR101107818B1 (ko) 2003-10-30 2012-01-31 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 향상된 면역자극 효능을 가진 ｃ-부류 올리고뉴클레오티드유사체
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
EP2060269A3 (en) 2003-12-08 2009-08-19 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
TW200533750A (en) 2004-02-19 2005-10-16 Coley Pharm Group Inc Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
WO2005089231A2 (en) 2004-03-12 2005-09-29 Hybridon, Inc. Enhanced activity of hiv vaccine using a second generation immunomodulatory oligonucleotide
EP1730281A2 (en) * 2004-04-02 2006-12-13 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
AU2005326144A1 (en) 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US7498425B2 (en) * 2004-06-15 2009-03-03 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
BRPI0512110A (pt) * 2004-06-15 2007-10-23 Idera Pharmaceutical Inc multìmeros de oligonucleotìdeos imunoestimulatórios
US7283209B2 (en) * 2004-07-09 2007-10-16 Carl Zeiss Smt Ag Illumination system for microlithography
WO2006134423A2 (en) * 2004-07-18 2006-12-21 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
CA2572427A1 (en) 2004-07-18 2006-01-18 Heather L. Davis Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US20080009455A9 (en) * 2005-02-24 2008-01-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
AU2006235284A1 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20060241076A1 (en) 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
NZ565311A (en) * 2005-07-07 2009-10-30 Pfizer Anti-ctla-4 antibody and cpg-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment
US7490795B2 (en) * 2005-08-31 2009-02-17 Goodrich Corporation Aircraft evacuation slide with primary gas relief valve
EP1945766A2 (en) 2005-09-16 2008-07-23 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
EP1924692A2 (en) 2005-09-16 2008-05-28 Coley Pharmaceutical GmbH Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (sirna) by nucleotide modification
JP2009510096A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー アダプターオリゴヌクレオチドを用いたｔｌｒ媒介免疫応答の調節
US7776834B2 (en) * 2005-11-07 2010-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
KR20080072934A (ko) 2005-11-25 2008-08-07 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역자극성 올리고리보뉴클레오티드
JP5473336B2 (ja) 2006-02-15 2014-04-16 アディウタイド・ファーマスーティカルズ・ゲーエムベーハー オリゴヌクレオチドの処方に関する組成物および方法
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
MX2009003398A (es) 2006-09-27 2009-08-12 Coley Pharm Gmbh Analogos de oligonucleotidos cpg que contienen analogos t hidrofobos con actividad inmunoestimuladora mejorada.
EP2068912A2 (en) 2006-09-27 2009-06-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Compositions of tlr ligands and antivirals
KR20090058584A (ko) 2006-10-26 2009-06-09 콜리 파마슈티칼 게엠베하 올리고리보뉴클레오티드 및 그의 용도
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
CN101678098A (zh) 2007-05-17 2010-03-24 科勒制药集团公司 具有免疫刺激效力的a类寡核苷酸
CN101820908A (zh) * 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物

Also Published As

Publication number Publication date
PE20040900A1 (es) 2004-12-29
JP5414961B2 (ja) 2014-02-12
PE20081155A1 (es) 2008-08-15
AU2003259916A1 (en) 2004-03-03
EP1538904A2 (en) 2005-06-15
SI2290078T1 (sl) 2017-08-31
NO20051469L (no) 2005-05-19
US8283328B2 (en) 2012-10-09
DK1538904T3 (en) 2016-11-21
HUE030347T2 (en) 2017-05-29
UY27945A1 (es) 2004-03-31
AU2009251186B2 (en) 2013-05-30
AR040996A1 (es) 2005-04-27
NZ538001A (en) 2008-05-30
WO2004016805A2 (en) 2004-02-26
PT1538904T (pt) 2016-11-08
AU2009251186A1 (en) 2010-01-28
CA2493753C (en) 2014-07-08
KR100969727B1 (ko) 2010-07-13
PL227938B1 (pl) 2018-01-31
EP2290078B1 (en) 2017-04-26
US20050059619A1 (en) 2005-03-17
PL375398A1 (pl) 2005-11-28
US8304396B2 (en) 2012-11-06
IL166376A0 (en) 2006-01-16
JP2006508693A (ja) 2006-03-16
AU2003259916B2 (en) 2010-01-21
EP1538904B1 (en) 2016-07-27
JP2011004746A (ja) 2011-01-13
KR20080011247A (ko) 2008-01-31
CA2493753A1 (en) 2004-02-26
IL166376A (en) 2012-10-31
ECSP055687A (es) 2005-05-30
KR20050034738A (ko) 2005-04-14
WO2004016805A3 (en) 2005-02-17
DK2290078T3 (en) 2017-07-31
MXPA05002014A (es) 2005-10-19
EP1538904A4 (en) 2008-03-05
BR0313414A (pt) 2007-07-31
MA27468A1 (fr) 2005-08-01
WO2004016805A9 (en) 2004-08-19
TW200412981A (en) 2004-08-01
ES2634328T3 (es) 2017-09-27
PT2290078T (pt) 2017-07-31
SV2008001602A (es) 2008-02-27
US20070224210A1 (en) 2007-09-27
EP2290078A2 (en) 2011-03-02
EP2290078A3 (en) 2013-02-13
ES2600553T3 (es) 2017-02-09
PL414814A1 (pl) 2016-03-14
OA12906A (en) 2006-10-13
HUE035336T2 (en) 2018-05-02
NZ560722A (en) 2009-10-30
RS20050126A (en) 2007-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2290078B1 (en) Immunostimulatory nucleic acids
US9382545B2 (en) CpG oligonucleotide analogs containing hydrophobic T analogs with enhanced immunostimulatory activity
EP2197488B1 (en) Immune stimulatory oligonucleotide analogs containing modified sugar moieties
US20080009455A9 (en) Immunostimulatory oligonucleotides
JP2006508693A5 (pl)
AU2003300919A1 (en) 5&#39; cpg nucleic acids and methods of use
EP2170353B1 (en) Phosphate-modified oligonucleotide analogs with immunostimulatory activity
ZA200500963B (en) Immunostimulatory nucleic acids
RU2338750C2 (ru) ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ФОСФОРТИОАТНЫЕ CpG-ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ФОСФОДИЭФИРНЫЕ СВЯЗИ, СПОСОБ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ, СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА