PL227938B1 - Immunostymulujące oligonukleotydy - Google Patents

Immunostymulujące oligonukleotydy Download PDF

Info

Publication number
PL227938B1
PL227938B1 PL375398A PL37539803A PL227938B1 PL 227938 B1 PL227938 B1 PL 227938B1 PL 375398 A PL375398 A PL 375398A PL 37539803 A PL37539803 A PL 37539803A PL 227938 B1 PL227938 B1 PL 227938B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
oligonucleotide
immunostimulatory
phosphodiester
oligonucleotides
Prior art date
Application number
PL375398A
Other languages
English (en)
Other versions
PL375398A1 (pl
Inventor
Arthur M. Krieg
Ulrike Samulowitz
Joerg Vollmer
Eugen Uhlmann
Marion Jurk
Grayson Lipford
Robert Rankin
Original Assignee
Coley Pharmaceutical Gmbh
Coley Pharmaceutical Group
Coley Pharmaceutical Group Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharmaceutical Gmbh, Coley Pharmaceutical Group, Coley Pharmaceutical Group Inc filed Critical Coley Pharmaceutical Gmbh
Publication of PL375398A1 publication Critical patent/PL375398A1/pl
Publication of PL227938B1 publication Critical patent/PL227938B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest klasa miękkich lub semi-miękkich immunostymulujących oligonukleotyelów CpG, które są przydatne do stymulacji odpowiedzi immunologicznej.

Description

Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest immunostymulujący oligonukleotyd zawierający co najmniej dwa wewnętrzne dinukleotydy CG, przy czym C jest niemetylowany; i chimerowy szkielet, przy czym co najmniej dwa wewnętrzne dinukleotydy CG posiadają internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe; i przy czym każdy dodatkowy wewnętrzny dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Opisano tu immunostymulujące kwasy nukleinowe, jak również immunostymulujące oligonukleotydy mające zmniejszony prozapalny wpływ na nerki, ich kompozycje oraz sposoby zastosowania immunostymulujących kwasów nukleinowych.
Stan techniki
Bakteryjny DNA wykazuje wpływ stymulujący układ odpornościowy, powodujący aktywację limfocytów B i komórek NK, lecz DNA kręgowców nie wykazuje takiego wpływu (Tokunaga, T. i in., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T. i in., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J. P. i in., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; oraz przegląd: Krieg, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, red. C. A. Stein i A. M. Krieg, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, str. 431-448). Obecnie wiadomo, że ten wpływ pobudzający układ odpornościowy bakteryjnego DNA jest wynikiem obecności niemetylowanych dinukleotydów CpG w kontekście konkretnych zasad (motywy CpG), które są powszechne w bakteryjnym DNA, lecz są one metylenowane i rzadko występują w DNA kręgowców (Krieg i in., 1995 Nature 374: 546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321: 1-10). Wpływ stymulujący układ odpornościowy bakteryjnego DNA można naśladować stosując syntetyczne oligod eoksynukleotydy (ODN) zawierające te motywy CpG. Takie ODN CpG wykazują silny stymulujący wpływ na ludzkie i mysie leukocyty, indukując proliferację limfocytów 3; sekrecję cytokin i immunoglobulin; aktywność lityczną komórek NK i wydzielanie IFN-γ; oraz działanie aktywujące komórki dendrytyczne (DC) i inne komórki prezentujące antygen do ekspresji cząsteczek kostymulatorów i wydzielania cytokin, szczególnie cytokin typu Th1, które są ważne dla promowania rozwoju odpowiedzi limfocytów T typu Th1. To działanie stymulujące układ odpornościowy natywnego fosfodiesterowego szkieletu ODN CpG jest wysoce CpG specyficzne w tym sensie, że jest ono znacznie zmniejszone, jeśli motyw CpG ulegnie metylacji, zamianie na GpC lub zostanie wyeliminowany, lub zmieniony w inny sposób (Krieg i in., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann i in., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9305-10).
We wczesnych badaniach przypuszczano, że stymulujący układ odpornościowy motyw CpG opisuje wzór puryna-puryna-CpG-pirymidyna-pirymidyna (Krieg i in., 1995 Nature 374: 546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker i in., 1998 EMBO J. 17: 6230-6240; Lipford i in., 1998 Trends in Microbiol. 6: 496-500). Jednakże, obecnie wiadomo, że mysie limfocyty dość dobrze odpowiadają na fosfodiesterowe motywy CpG, które nie są zgodne z tym „wzorem” (Yi i in., 1998 J. Immunol. 160: 5898-5906) i jest to również prawdą dla ludzkich limfocytów B i komórek dendrytycznych (Hartmann i in., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).
Ostatnio opisano kilka różnych klas kwasów nukleinowych CpG. Jedna klasa silnie aktywuje limfocyty B, lecz względnie słabo indukuje produkcję IFN-α i aktywację komórek NK; tę klasę określa się jako klasę B. Kwasy nukleinowe GpG klasy B są typowo całkowicie stabilizowane i obejmują niemetylowany dinukleotyd CpG w kontekście pewnych zalecanych zasad. Patrz, np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 6 194 388; 6 207 646; 6 214 806; 6 218 371; 6 239 116; i 6 339 068. Inna klasa kwasów nukleinowych GpG aktywuje limfocyty B i komórki NK oraz indukuje produkcję IFN -u; tę klasę określa się jako klasę G. Kwasy nukleinowe GpG klasy G, podobnie jak pierwsze opisane, typowo są całkowicie stabilizowane, obejmują sekwencję typu sekwencji klasy B i sekwencje palindromowe bogate w pary GC lub prawie palindromowe. Tę klasę opisano w będącym jednocześnie przedmiotem, postępowania patentowego tymczasowym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 60/313 273, złożonym 17 sierpnia 2001 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 10/224 523 złożonym 19 sierpnia 2002 i pokrewnym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US02/26 468 opublikowanym pod nr WO 03/015 711.
Przedmiotem wynalazku jest immunostymulujący oligonukleotyd, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej dwa wewnętrzne dinukleotydy CG, przy czym C jest niemetylowany i chimerowy szkielet, przy czym co najmniej dwa wewnętrzne dinukleotydy CG posiadają internukleotydowe wiązaPL 227 938 B1 nie fosfodiestrowe i przy czym każdy dodatkowy wewnętrzny dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub stabilizowane wiązanie internukleotydowe, i przy czym wszystkie inne wiązania internukleotydowe są stabilizowane, i przy czym stabilizowane wiązanie stanowi wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe lub metylotiofosforanowe.
Korzystnie, immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku zawiera dwa do sześciu wewnętrznych dinukleotydów CG posiadających internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
Korzystniej, w oligonukleotydzie według wynalazku każdy wewnętrzny dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
Korzystnie, immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku ma sekwencję: *A*C_G*T*C_G*T”T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 1), G*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*A*C_G*C (SEQ ID NO: 2),
G*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*C (SEQ ID NO: 3), oznaczoną (SEQ ID NO: 5, T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 6), T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 7),
T*C*G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 8), oznaczoną SEQ ID NO: 9, T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 10), T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 11), T*C_7*T*C_7*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*TG*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 12), T*C_7*T*C_G*T*T*T*T”G*T*C_G*T*T*T*TG*T*C_7*T*T (SEQ ID NO: 13), T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 14), oznaczoną SEQ ID
NO: 15, oznaczoną SEQ ID NO: 16, oznaczoną SEQ ID NO: 17, oznaczoną SEQ ID NO: 21, oznaczoną SEQ ID NO: 22,
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 23),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 24), oznaczoną SEQ ID NO: 25, oznaczoną SEQ ID NO: 26, oznaczoną SEQ ID NO: 27,
T*C_G*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 28), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T (SEQ ID NO: 29), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 30), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C*G (SEQ ID NO: 31), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T (SEQ ID NO: 32), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T*T (SEQ ID NO: 33), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 34),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 35), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 36), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 37), T*C_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C*G*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 38), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 39), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 40), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*G*G*T*T (SEQ ID NO: 41), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*C_G*C_G*G*C*G (SEQ ID NO: 42), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*GG*C*C*G (SEQ ID NO: 43), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*GG*T (SEQ ID NO: 44), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*GG*T*T (SEQ ID NO: 45), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*TG*T*T (SEQ ID NO: 46), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 47), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 48), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*TG*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 49), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 50), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 51), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T (SEQ ID NO: 52), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 53), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*G*G*T*T (SEQ ID NO: 54), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 55), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO: 56), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T (SEQ ID NO: 58), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 59),
PL 227 938 B1
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 60),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 61),
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 62),
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 63),
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 64),
T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 65),
T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 66),
T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 67),
T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T (SEQ ID NO: 68),
T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 69),
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 70),
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 71),
T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 72),
T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T (SEQ ID NO: 74),
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 75),
T*g*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 76),
T*g*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 77),
T*g*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 78),
T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T*C*T*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 79),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 80),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 81),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 82),
T*T*C_G*T*T*C*T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T (SEQ ID NO: 83),
T*T*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 84),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 85),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 86),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 87),
T*T*T*T*C_G*T*C_G* t*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 88),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 89),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 90),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ IDNO: 91),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T (SEQ ID NO: 92),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 93),
T*T*T*T*C_GT*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 94),
T*t*t*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 95),
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 96),
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 97),
T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 98) lub
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 241), przy czym * oznacza tiofosforan, _ oznacza fosfodiester, U oznacza 2'-deoksyuracyl, a 7 oznacza 7-deazaguaninę.
Korzystnie, immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku jest wybrany z grupy skład ającej się z: T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 102) i T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 104), przy czym * oznacza tiofosforan, a - oznacza fosfodiester.
Immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku korzystnie ma sekwencję cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy B.
Immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku również korzystnie ma sekwencję cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy C.
Korzystnie, immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku ma długość 4-100 nukleotydów.
Korzystnie, w immunostymulującym oligonukleotydzie według wynalazku kwas nukleinowy posiada szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę.
Immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku korzystnie występuje w kompozycji, która ponadto zawiera adiuwant albo antygen.
PL 227 938 B1
W immunostymulującym oligonukleotydzie według wynalazku stabilizowane wiązania internukleotydowe korzystnie są wybrane z grupy składającej się z: wiązania tiofosforanowego, ditiofosforanowego, metylofosfonianowego, metylotiofosforanowego i ich kombinacji, zaś w szczególności korzystne stabilizowane wiązania internukleotydowe są wiązaniami tiofosforanowymi.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że immunostymulujące właściwości kwasów nukleinowych CpG klasy B i C i innych stabilizowanych immunostymulujących kwasów nukleinowych można utrzymać lub nawet polepszyć przez selektywne wprowadzenie jednego lub więcej niestabilizowanych wiązań pomiędzy pewnymi nukleotydami. Niestabilizowane wiązania są dogodnie naturalnymi wiązaniami, tj. wiązaniami fosfodiestrowymi lub typu fosfodiestrowego. Nie stabilizowane wiązanie będzie typowo, choć niekoniecznie, względnie podatne na trawienie nukleazą. Opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe zawierają co najmniej jedno niestabilizowane wiązanie znajdujące się pomiędzy 5' pirymidyną (Y) i sąsiadującą 3' puryną (Z), korzystnie guaniną (G), przy czym zarówno 5' Y, jak i 3' Z są nukleotydami wewnętrznymi.
Podobnie jak całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe, opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe są przydatne do indukowania odpowiedzi immunologicznej typu Th1. Zgodnie z tym, opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe są przydatne jako środki wspomagające do szczepionek i są przydatne w leczeniu chorób, obejmujących takie jak rak, choroba zakaźna, alergia i astma. Uważa się, że mają one szczególne zastosowanie w schorzeniach, które z jakiegokolwiek powodu wymagają przedłużonego lub powtórnego podawania immunostymulujących kwasów nukleinowych.
Oprócz przydatności do dowolnego celu, dla którego całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe wykazują użyteczność, opisane tutaj immunostymulujące kwasy nukleinowe mogą w pewnych rozwiązaniach posiadać większe zalety niż całkowicie stabilizowane immunostym ulujące kwasy nukleinowe, takie jak zwiększona moc działania i obniżona toksyczność.
Wynalazek dotyczy immunostymulujących oligonukleotydów zawierających CpG, jak zdefiniowano w zastrzeżeniach.
Opisano tu także następujące oligonukleotydy o wzorze:
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 5),
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (sEQ ID NO: 9),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*T*C*G*C*G (SEQ ID NO: 15),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*T*G*G*T*G (SEQ ID NO: 16),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*G*G*C*C*G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 17),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*G*G*C*C*G (SEQ ID NO: 21),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 22),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*G*C*G*A*C*G*T*C*G*C*G (SEQ ID NO: 25),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G (SEQ ID NO: 26) i
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*A*C*G*T*C*G*C*G (SEQ ID NO: 27).
Opisano tu również oligonukleotydy o wzorze: T*C*C*A*T_G*A*C_G*T*T*C*C*T_G*A*T*G*C (SEQ ID NO: 4), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 73) i T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 99).
Opisano tu także oligonukleotyd o wzorze: 5' T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2*T*T3' (sekwencja SEQ ID NO: 296). W tym oligonukleotydzie N1 oznacza 0-6 nukleotydów i N2 oznacza 0-7 nukleotydów. Symbol * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być niestabilizowane lub stabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 2 fosfodiestrowe wiązania internukleotydowe. Stabilizowane wiązanie internukleotydowe może być wiązaniem tiofosforanowym. W pewnych rozwiązaniach N1 oznacza 0-2 nukleotydy. Oligonukleotyd dogodnie może mieć długość 16-24 nukleotydów.
W pewnym rozwiązaniu oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
5’T*C*G*T*C*G*TTTTGAN1C*G*N2*T*T3’ (SEQ ID NO: 296),
5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GAN1C*G*N2*T*T3’ (SEQ ID NO: 296) lub
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_N1C*G*N2*T*T3’ (SEQ ID NO: 296).
Symbol _ oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
Opisano tu także oligonukleotydy:
5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T3’ (SEQ ID NO: 297),
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’ (SEQ IDNO: 298),
5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T3’ (SEQ IDNO: 299) i
PL 227 938 B1
5’T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T3’ (SEQ ID NO: 300).
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu oligonukleotyd zawierający:
5’T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4CGN5*T*T3’ (SEQ ID NO: 301).
N3 oznacza 0-4 nukleotydów.
N4 oznacza 1-5 nukleotydów.
N5 oznacza 0-7 nukleotydów.
Symbol * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być niestabilizowane lub stabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 2 fosfodiestrowe wiązania internukleotydowe. Stabilizowane wiązanie internukleotydowe może być wiązaniem tiofosforanowym. W pewnych rozwiązaniach N4 oznacza 1-2 nukleotydy.
Oligonukleotyd dogodnie może mieć długość 16-24 nukleotydów.
W pewnym rozwiązaniu oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4C*G*N5*T*T 3’ (SEQ ID NO: 301),
5’T*C*G*A*T*N3C*G*TTTTN4C_G_*N5*T*T 3’ (SEQ ID NO: 302),
5’T*C*G*T*T*N3C_GTTTTN4CGN5*T*T 3’ (SEQ ID NO: 303).
Odpowiednim oligonukleotydem może być
5’T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T3 (SEQ ID NO: 304) lub
5’T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T3’(SEQ ID NO: 305).
Według innych aspektów opisano tu oligonukleotyd:
5’T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3’ (SEQ ID NO: 306).
N oznacza dowolny nukleotyd. Symbol * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być niestabilizowane lub stabilizowane, o ile oligonukleotyd zawiera co najmniej 3 internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe. Stabilizowane wiązanie internukleotydowe może być wiązaniem tiofosforanowym. W pewnych rozwiązaniach oligonukleotyd zawiera 5 internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych. Oligonukleotyd dogodnie może mieć długość 16-24 nukleotydów.
W pewnym rozwiązaniu oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 307),
5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 308) lub
5’T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 309).
W jednym rozwiązaniu oligonukleotydem jest 5’T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 310). Symbol _ oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd zawiera co najmniej jeden motyw CG z fosfodiestrowym wiązaniem internukleotydowym. W jeszcze innych rozwiązaniach oligonukleotyd nie zawiera żadnego motywu CG z fosfodiestrowym wiązaniem internukleotydowym.
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu oligonukleotyd o budowie 5'T*C_G(N6C_GN7)2.3T*C_G*T*T3' (SEQ ID NO: 311-312). N6 i N7 mają niezależnie długość pomiędzy 1 i 5 nukleotydów, a oligonukleotyd ma długość 16-40 nukleotydów.
W pewnych rozwiązaniach N6 oznacza jeden nukleotyd, na przykład N6 może oznaczać T lub A. N7 w pewnych rozwiązaniach oznacza pięć nukleotydów, np. N7 może oznaczać pięć pirymidyn lub TTTTG.
W pewnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma budowę:
5’T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3’ (SEQ ID NO: 313) lub
5’T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3’ (SEQ ID NO: 314).
W innych aspektach opisano tu oligonukleotyd o budowie 5’T*CGCGN8CGCGC*GN93’ (SEQ ID NO: 315). N8 ma długość pomiędzy 4 i 10 nukleotydów i zawiera co najmniej 1 motyw C_G. N9 ma długość pomiędzy 0 i 3 nukleotydów. Oligonukleotyd ma długość 15-40 nukleotydów.
W pewnych rozwiązaniach N8 posiada co najmniej 2 lub 3 motywy CG. W innych rozwiązaniach N8 oznacza PuCGPyPyCG lub PuCGPyPyCGCG. Ewentualnie, N8 oznacza ACGTTCG. N9 może zawierać co najmniej jeden motyw CG, taki jak CCG.
W pewnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma budowę:
5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’ (SEQ ID NO: 316) lub
5’T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G3’ (SEQ ID NO: 317).
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd o strukturze:
PL 227 938 Β1
5'T*t*GX1X2TGX3X4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO: 318). N10 ma długość pomiędzy 4 i 8 nukleozydów i zawiera co najmniej 1 motyw C_G. X^ X2, X3 i X4 oznaczają niezależnie C lub G. Taki oligonukleotyd ma długość 24-40 nukleotydów.
W pewnych rozwiązaniach N10 zawiera co najmniej 2 lub 3 motywy CG. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ma jedną spośród następujących struktur:
5’T*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3’ (SEQ ID NO: 319) lub
5’T*T*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T3’ (SEQ ID NO: 320).
Winnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma budowę:
5’T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3’ (SEQ ID NO: 321).
W pewnych aspektach ODN jest oligonukleotydem mającym sekwencję wybraną z grupy obejmującej:
CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO: 333), GTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 334),
TCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 335), CGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 336), GTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 337), TTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 338), TTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 339), TTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 340), TGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 341), GACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 342), ACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 343), GTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 344), GTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 345), TTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 346), TTTGTCGTT, TTGTCGTT, TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT (SEQ ID NO: 347),
TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCG (SEQ ID NO: 348),
TCGTCGTTTTGACGTTTTGTC (SEQ ID NO: 349), TCGTCGTTTTGACGTTTTGT (SEQ ID NO: 350), TCGTCGTTTTGACGTTTTG (SEQ ID NO: 351), TCGTCGTTTTGACGTTTT (SEQ ID NO: 352), TCGTCGTTTTGACGTTT (SEQ ID NO: 353), TCGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO: 354), TCGTCGTTTTGACGT (SEQ ID NO: 355), TCGTCGTTTTGACG (SEQ ID NO: 356), TCGTCGTTTTGAC (SEQ ID NO: 357), TCGTCGTTTTGA (SEQ ID NO: 358), TCGTCGTTTTG (SEQ ID NO: 359), TCGTCGTTTT (SEQ ID NO: 360), TCGTCGTTT, TCGTCGTT, CGTCGTTTTGACGTTTTGTCGT (SEQ ID NO: 361),
GTCGTTTTGACGTTTTGTCG (SEQ ID NO: 362), TCGTTTTGACGTTTTGTC (SEQ ID NO: 363), CGTTTTGACGTTTTGT (SEQ ID NO: 364), GTTTTGACGTTTTG (SEQ ID NO: 365), TTTTGACGTTTT (SEQ ID NO: 366), TTTGACGTTT (SEQ ID NO: 367) j TTGACGTT.
W innym aspekcie opisano tu oligonukleotyd zawierający oktamerową sekwencję zawierającą co najmniej jeden dinukleotyd YZ mający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego oraz co najmniej 4 nukleotydy T, przy czym Y oznacza pirymidynę lub zmodyfikowaną pirymidynę, przy czym Z oznacza guanozynę lub zmodyfikowaną guanozynę i w którym oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Y może oznaczać niemetylenowaną C. Z może oznaczać guanozynę. W pewnych rozwiązaniach Y oznacza cytozynę lub zmodyfikowane zasady cytozynowe wybrane z grupy obejmującej 5-metylocytozynę, 5-metyloizocytozynę, 5-hydroksycytozynę, 5-(fluorowco)cytozynę, uracyl, N4-etylocytozynę, 5-fluorouracyl i atom wodoru. W innych rozwiązaniach Z oznacza guaninę lub zmodyfikowaną zasadę guaninową wybraną z grupy obejmującej 7-deazaguaninę, 7-deaza-7-(podstawioną) guaninę (taką jak 7-deaza-7-(C2-C5)alkinyloguanina), 7-deaza-8-(podstawioną) guaninę, hipoksanty8
PL 227 938 B1 nę, 2,6-diaminopurynę, 2-aminopurynę, purynę, 8-podstawioną guaninę, taką jak 8-hydroksyguanina i 6-tioguanina, 2-aminopuryna, i atom wodoru.
W pewnych rozwiązaniach oktamerowa sekwencja obejmuje motyw TTTT. W innych rozwiązaniach oktamerowa sekwencja obejmuje dwa dinukleotydy YZ. Ewentualnie, oba dinukleotydy YZ posiadają internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego.
W pewnych rozwiązaniach oktamerowa sekwencja jest wybrana z grupy obejmującej:
T*C-G*T*C-G*T*T, C-G*T*C-G*T*T*T, G*T*C-G*T*T*T*T, T*C-G*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*A, T*T*T*T*G*A*C-G, T*T*T*G*A*C-G*T, T*T*G*A*C-G*T*T, T*G*A*C-G*T*T*T, G*A*C-G*T*T*T*T, A*CG*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*T, T*T*T*G*T*C*G*T, G*T*T*T*T*G*T*C i T*T*G*T*C-G*T*T, przy czym * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe i przy czym oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ma długość 8-40 nukleotydów.
Wiązanie typu fosfodiestrowego może być wiązaniem boranofosfonianowym lub diastereomerycznie czystym Rp tiofosforanowym. Ewentualnie, stabilizowane wiązania internukleotydowe oznaczają wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe lub ich dowolną kombinację.
Oligonukleotyd może posiadać wiązanie 3'-3' z jednym lub dwoma dostępnymi końcami 5'. W pewnych korzystnych rozwiązaniach oligonukleotyd ma dwa dostępne końce 5', z których wszystkie są 5'TCG.
W innym aspekcie opisano tu oligonukleotyd składający się z:
5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO: 368). Co najmniej jeden dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, przy czym oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu oligonukleotyd zawierający: 5'GNC3', przy czym N oznacza sekwencję kwasu nukleinowego o długości 4-10 nukleotydów i zawierającą co najmniej 50% T i nie zawierającą dinukleotydu CG i przy czym ten oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabil izowane wiązanie internukleotydowe. W jednym rozwiązaniu N obejmuje motyw TTTT. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd jest wybrany z grupy obejmującej G*T*T*T*T*G*A*C i G*T*T*T*T*G*A*C*, przy czym * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu cząsteczkę immunostymulującego kwasu nukleinowego posiadającą co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd pirymidyna-puryna (YZ) i ewentualnie dinukleotyd pirymidyna-guanozyna (YG) i chimerowy szkielet, w którymi co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YZ posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, w którym ewentualnie każdy dodatkowy wewnętrzny dinukleotyd YZ posiada wiązanie internukleotydowe fosfodiestrowe, typu fosfodiestrowego lub stabilizowane i w którym wszystkie inne wiązania internukleotydowe są stabilizowane. W jednym rozwiązaniu immunostymulujący kwas nukleinowy zawiera wiele wewnętrznych dinukleotydów YZ, każdy mający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego. W jednym rozwiązaniu każdy wewnętrzny dinukleotyd YZ posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego.
W korzystnym wykonaniu wynalazku immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z następujących oligonukleotydów:
*A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 1),
G*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*A*C_G*C (SEQ ID NO: 2),
G*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*C (SEQ ID NO: 3), oznaczoną SEQ ID NO: 5,
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 6),
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 7),
T*C*G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 8), oznaczoną SEQ ID NO: 9,
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 10),
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 11),
T*C_7*T*C_7*T*T*T*TG*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 12),
T*C_7*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_7*T*T (SEQ ID NO: 13),
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 14), oznaczoną SEQ ID NO: 15, oznaczoną SEQ ID NO: 16, oznaczoną SEQ ID NO: 17, oznaczoną SEQ ID NO: 21,
PL 227 938 B1 oznaczoną SEQ ID NO: 22,
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 23),
T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 24), oznaczoną SEQ ID NO: 25, oznaczoną SEQ ID NO: 26, oznaczoną SEQ ID NO: 27,
T*C_G*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 28), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T (SEQ ID NO: 29), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 30), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C*G (SEQ ID NO: 31), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T (SEQ ID NO: 32), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T*T (SEQ ID NO: 33), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ IDNO: 34), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 35), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 36), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 37), T*C_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C*G*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 38), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 39), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ IDNO: 40), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*G*G*T*T (SEQ ID NO: 41),
T*C_G*T*C
T*C_G*T*C T*C_G*T*C T*C_G*T*C T*C_G*T*C T*C_G*T*C T*C_G*T*C T*C_G*T*C T*c G*T*C
:_G*G*C_G*C_G*C_G*G*C*G (SEQ ID NO: 42), :_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 43), _G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 44), _G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 45), _G*t*T_G*T*T (SEQ ID NO: 46), _G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ IDNO: 47), _G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 48), _G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 49), _G*t*T_G*T*T (SEQ ID NO: 50), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 51), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T (SEQ ID NO: 52), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 53), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 54), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 55), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ IDNO: 56), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 241), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T (SEQ ID NO: 58), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 59), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 60), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 61), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C”G*T (SEQ ID NO: 62), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 63), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 64), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 65), T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 66), T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 67), T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T (SEQ ID NO: 68), T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 69), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 70), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 71), T*C_G*T*TG*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 72), T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T (SEQ ID NO: 74), T*g*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 75), T*g*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 76), T*g*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 77), T*g*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 78),
PL 227 938 B1
T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T*C*T*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 79),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 80),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 81),
T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 82),
T*T*C_G*T*T*C*T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T (SEQ ID NO: 83),
T*T*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 84),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 85),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 86),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 87),
T*T*T*T*C_G*T*C_G* t*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 88),
T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 89),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 90),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ IDNO: 91),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T (SEQ ID NO: 92),
T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 93),
T*T*T*T*C_GT*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 94),
T*t*t*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 95),
T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 96),
T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 97),
T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 98), przy czym * oznacza tiofosforan, _ oznacza fosfodiester, U oznacza 2'-deoksyuracyl, a 7 oznacza 7-dezaguanidynę.
W korzystnym rozwiązaniu immunostymulujący oligonukleotyd według wynalazku jest wybrany z grupy obejmującej: T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 102) i T*C_G*T*C_G*T*T*T*t*c*g*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 104), przy czym * oznacza tiofosforan, a _ oznacza fosfodiester.
Opisano tu także następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 100),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 101),
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 103), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu cząsteczkę immunostymulującego kwasu nukleinowego zawierającą chimerowy szkielet i co najmniej jedną sekwencję N1YGN2, w której niezależnie dla każdej sekwencji N1YGN2 YG oznacza wewnętrzny dinukleotyd pirymidyna-guanozyna (YG), N1 i N2 oznaczają za każdym razem niezależnie od siebie dowolny nukleotyd i przy czym dla co najmniej jednej sekwencji N1YGN2 i ewentualnie dla każdej dodatkowej sekwencji N1YGN2: dinukleotyd YG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego i N1 Y są związane przez internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego gdy N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd, G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem, fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd, lub N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd i G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowymi lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd, w którym wszystkie inne wiązania internukleotydowe są stabilizowane.
W jednym rozwiązaniu immunostymulujący kwas nukleinowy zawiera wiele sekwencji N1YGN2, przy czym dla każdej sekwencji N1YGN2: dinukleotyd YG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego i N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd, G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd lub N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd i G i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego gdy N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd.
Opisano tu także następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego:
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 105),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 106),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO 107),
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 108),
PL 227 938 B1
T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T*C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C_G*T_C_ T*C G*T C _G_T*T (SEQ ID NO: 109), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 110), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 111), _G*T*T (SEQ ID NO: 112), _G_T*T (SEQ ID NO:113), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 114), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 115), _G*T*T (SEQ ID NO: 116), _G_T*T (SEQ ID NO: 117), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 118), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 119), _G*T*T (SEQ ID NO: 120), _G_T*T (SEQ ID NO: 121), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 122), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 123), _G*T*T (SEQ ID NO: 124), _G_T*T (SEQ ID NO: 125), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 126), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 127), _G*T*T (SEQ ID NO: 128), _G_T*T (SEQ ID NO: 129), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 130), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 131), _G*T*T (SEQ ID NO: 132), ,_T*T (SEQ ID NO: 133), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 134), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 135), _G*T*T (SEQ ID NO: 136), _G_T*T (SEQ ID NO: 137), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 138), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 139), _G*T*T (SEQ ID NO:140), _G_T*T (SEQ ID NO: 141), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 142), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 143), _G*T*T (SEQ ID NO: 144), _G_T*T (SEQ ID NO: 145), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 146), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 147), _G*T*T (SEQ ID NO: 148), _G_T*T (SEQ ID NO: 149), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 150), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 151), _G*T*T (SEQ ID NO: 152), _G_T*T (SEQ ID NO: 153), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 154), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 155), _G*T*T (SEQ ID NO: 156), _G_T*T (SEQ ID NO: 157), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 158), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 159), _G*T*T (SEQ ID NO: 160), _G_T*T (SEQ ID NO: 161), *T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 162), *T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 163), _G*T*T (SEQ ID NO: 164),
PL 227 938 B1
T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 165), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 166), T*C_G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 167), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 168), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 169), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 170), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 171), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 172), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 173), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 174), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 175), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 176), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 177), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 178), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 179), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 180), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 181), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 182), T*C_G_T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 183), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_*G*T*T (SEQ ID NO: 184), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 185), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 186), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 187), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 188), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 189), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 190), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 191), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 192), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 193), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 194), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 195), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C*G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 196), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C G_T*T (SEQ ID NO: 197), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 198), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 199), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 200), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 201), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 202), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 203), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 204), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 205), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 206), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 207), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 208), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 209), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 210), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T'*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 211), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 212), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 213), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 214), T*C_G_T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 215), T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 216), T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 217), T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 218), T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 219), T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 220),
PL 227 938 B1
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 221),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 222),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 223),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 224),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 225),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 226),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C*G_T*T (SEQ ID NO: 227),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 228),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 229),
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 230) i
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 231), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Opisano tu również następujące oligonukleotydy:
T*C_G_T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T*T*T*G*T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 232),
T*C_G*T_C_G*T*T*T*T*G*T_C*G*T*T*T*T*G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 233) i
T*C_G_T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T*T*T*G*T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 234), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Opisano tu również następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego: T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T*T_T_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 235), T*C*G*T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T*T*T_G_T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 236), T*C*G*T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T*T_T_G_T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 237), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _ oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
Ponadto, opisano tu następujące cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego: T*C_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T*T_T_G*T_C_G*T*T (SEQ ID NO: 238), T*C_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T (SEQ ID NO: 239) i T*C_G_T_C_G_T*T*T*T_G_T_C_G_T*T*T*T_G_T_C_G_T*T (SEQ ID NO: 240), przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i _oznacza wiązanie fosfodiestrowe.
W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG posiadający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego oznacza CG.
W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG posiadający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego oznacza TG.
W jednym rozwiązaniu internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego jest wiązaniem fosfodiestrowym.
W jednym rozwiązaniu wiązanie typu fosfodiestrowego jest wiązaniem boranofosfonianowym lub diastereomerycznie czystym Rp tiofosforanowym.
W jednym rozwiązaniu stabilizowane wiązania internukleotydowe są wybrane z grupy obejmującej: wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe i ich dowolną kombinację.
W jednym rozwiązaniu stabilizowane wiązania internukleotydowe oznaczają wiązanie tiofosforanowe.
W jednymi rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy B.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy G.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego ma długość 4-100 nukleotydów.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego ma długość 640 nukleotydów.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego ma długość 619 nukleotydów.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego nie jest ant ysensownym oligonukleotydem, oligonukleotydem tworzącym potrójną helisę, czy rybozymem.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera N1-C_G-N2-C_G-N3, przy czym N1 i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 1-20 nukleotydów, w której oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodie14
PL 227 938 B1 strowego, w której N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów i w której G-N2-C zawiera 1 lub 2 stabilizowane wiązania.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera N1-C_G-N2-C_G-N3, przy czym N1 i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 1-20 nukleotydów, w której oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, N2 oznacza niezależnie sekwencję kwasu nukleinowego o długości 4-20 nukleotydów i w której G-N2-C zawiera co najmniej 5 stabilizowanych wiązań.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera N1-C_G-N2-C_G-N3, w którym N1, N2 i N3 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów i w której _ oznacza wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, przy czym oligonukleotyd nie jest oligonukleotydem antysensownym, oligonukleotydem tworzącym potrójną helisę lub rybozymem.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu oligonukleotyd, który zawiera X1-N1-(GTCGTT)n-N2-X2, (SEQ ID NO: 18-10 i 57), w którym N1 i N2 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego o długości 0-20 nukleotydów, w której n = 2 lub n = 4-6, przy czym X1 i X2 niezależnie od siebie oznaczają sekwencję kwasu nukleinowego posiadającą wiązania tiofosforanowe między 3-10 nukleotydami, przy czym N1-(GTCGTT)n-N2 obejmuje co najmniej jedno internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe i w którym nukleotydy 3' i 5' tego oligonukleotydu nie zawierają sekwencji poli-G, poli-A, poli-T lub poli-C.
W jednym rozwiązaniu kwas nukleinowy posiada szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę.
W jednym rozwiązaniu oligonukleotyd posiada szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę.
W jednym rozwiązaniu oligonukleotyd występuje w kompozycji farmaceutycznej, ewentualnie zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
W jednym rozwiązaniu kompozycja oligonukleotydu zawiera dodatkowo środek wspomagający lub cytokinę.
W jednymi rozwiązaniu kompozycja oligonukleotydu zawiera dodatkowo antygen, przy czym oligonukleotyd jest adiuwantem w szczepionce.
W jednym rozwiązaniu antygen jest wybrany z grupy obejmującej: antygen wirusowy, antygen bakteryjny, antygen grzybowy, antygen pasożyta oraz antygen nowotworowy.
W jednym rozwiązaniu antygen jest kodowany przez wektorowy kwas nukleinowy.
W jednym rozwiązaniu antygen jest antygenem peptydowym.
W jednym rozwiązaniu antygen jest kowalencyjnie związany z oligonukleotydem lub cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego.
W innym rozwiązaniu antygen nie jest kowalencyjnie związany z oligonukleotydem lub cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego.
Opisano tu również sposób służący do identyfikacji względnej mocy lub toksyczności badanej cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego. Sposób obejmuje wybranie immunostymulującego kwasu nukleinowego jako związku odniesienia, mającego sekwencję odniesienia, stabilizowany szkielet i moc immunostymulującą lub toksyczność; wybranie testowego immunostymulującego kwasu nukleinowego mającego sekwencję odniesienia, wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego zamiast stabilizowanego wiązania pomiędzy Y i N w co najmniej jednym wewnętrznymi dinukleotydzie YN w sekwencji odniesienia, przy czym Y oznacza pirymidynę i N oznacza dowolny nukleotyd, i mającego badaną immunostymulującą moc lub toksyczność; i porównanie badanej mocy immunostymulującj lub toksyczności z immunostymulującą mocą związku odniesienia lub toksycznością w celu zidentyfikowania względnej mocy lub toksyczności badanej cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy jest silniejszym induktorem aktywności sygnalizacyjnej TLR9 niż immunostymulujący kwas nukleinowy będący związkiem odniesienia.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy jest silniejszym induktorem produkcji interferonu typu 1 niż immunostymulujący kwas nukleinowy będący związkiem odniesienia.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy jest silniejszym induktorem IP-10 niż immunostymulujący kwas nukleinowy będący związkiem odniesienia.
W jednym rozwiązaniu YN oznacza YG.
W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG oznacza CG.
PL 227 938 B1
W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG oznacza TG.
W jednym rozwiązaniu badany immunostymulujący kwas nukleinowy zawiera wiele wewnętrznych dinukleotydów YG, każdy posiadający internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego.
W jednym rozwiązaniu co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YG oznacza każdy wewnętrzny dinukleotyd YG.
W jednymi rozwiązaniu wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego jest wiązaniem fo sfodiestrowym.
W jednym rozwiązaniu wiązanie typu fosfodiestrowego jest wiązaniem boranofosfonianowym lub diastereomerycznie czystym Rp tiofosforanowym.
W jednym rozwiązaniu stabilizowany szkielet zawiera wiele wiązań internukleotydowych wybr anych z grupy obejmującej: wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe i ich dowolną kombinację.
W jednym rozwiązaniu stabilizowany szkielet zawiera wiele internukleotydowych wiązań tiofosforanowych.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy B.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia jest cząsteczką immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy C.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia ma długość 4-100 nukleotydów.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia ma długość 6-40 nukleotydów.
W jednym rozwiązaniu cząsteczka immunostymulującego kwasu nukleinowego będącego związkiem odniesienia ma długość 6-19 nukleotydów.
Opisano tu również sposób projektowania stabilizowanej cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego o długości poniżej 20 nukleotydów. Sposób obejmuje wybranie sekwencji o długości 6-19 nukleotydów, przy czym ta sekwencja zawiera co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd CG; wybranie wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego pomiędzy C i G w co najmniej jednym, wewnętrznym dinukleotydzie CG; niezależne wybranie wiązania fosfodiestrowego, typu fosfodiestrowego lub stabilizowanego pomiędzy C i G w każdym, dodatkowym wewnętrznym dinukleotydzie CG; i wybranie stabilizowanego wiązania dla wszystkich innych wiązań internukleotydowych.
Opisano tu również sposób leczenia lub zapobiegania alergii lub astmie. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi opisanego tu immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości wystarczającej do leczenia lub zapobiegania alergii lub astmie.
W jednym rozwiązaniu oligonukleotyd ten podaje się na powierzchnię śluzówkowki.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd ten podaje się w preparacie aerozolowym. Ewentualnie oligonukleotyd podaje się donosowo.
W innym aspekcie opisano tu sposób indukowania produkcji cytokiny. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi opisanego tu immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości wystarczającej do indukcji syntezy cytokin wybranych z grupy 1 obejmującej IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, chemokiny i IFN-γ.
Zgodnie z innym aspektem przedstawiono tu kompozycję opisanych tu immunostymulujących oligonukleotydów CpG w połączeniu z antygenem lub innym związkiem terapeutycznym, takim jak środek przeciwdrobnoustrojowy. Środkiem przeciwdrobnoustrojowym może być na przykład środe k przeciwwirusowy, środek przeciwpasożytniczy, środek przeciwbakteryjny lub środek przeciwgrzybowy.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu środek terapeutyczny do przedłużonego uwalniania kompozycji zawierającej opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy CpG.
Kompozycja może ewentualnie zawierać farmaceutyczny nośnik i/lub można ją preparować w środek dostarczający.
W pewnych rozwiązaniach środek dostarczający jest wybrany z grupy obejmującej kationowe l ipidy, białka penetrujące komórkę i przyrządy do przedłużonego uwalniania.
W jednym rozwiązaniu środkiem do przedłużonego uwalniania jest biodegradowalny polimer lub mikrocząstka.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości powodującej
PL 227 938 B1 skuteczną indukcję odpowiedzi immunologicznej u pacjenta. Ten immunostymulujący oligonukleotyd CpG można podawać doustnie, miejscowo, w środku terapeutycznym, do przedłużonego uwalniania, na błonę śluzową, ogólnoustrojowo, pozajelitowo lub domięśniowo. Gdy immunostymulujący oligonukleotyd CpG podaje się na powierzchnię śluzówki, może być dostarczony w ilości wystarczającej do skutecznej indukcji odpowiedzi immunologicznej śluzówki lub ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej. W dogodnym rozwiązaniu powierzchnię śluzówki do zastosowania leku wybiera się z grupy obejmującej powierzchnię jamy ustnej, nosową, odbytniczą, pochwową i powierzchnię oka.
W pewnych rozwiązaniach sposób obejmuje podanie pacjentowi antygenu, przy czym odpowiedź immunologiczna jest antygenowo swoistą odpowiedzią immunologiczną.
W pewnych rozwiązaniach antygen wybiera się z grupy obejmującej antygen nowotworowy, antygen wirusowy, antygen bakteryjny, antygen pasożyta i antygen peptydowy.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są zdolne do wywoływania szerokiego spektrum odpowiedzi immunologicznej. Na przykład te immunostymulujące oligonukleotydy CpG można stosować w celu przekierowania odpowiedzi immunologicznej z Th2 na Th1. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także stosować do aktywacji komórki układu odpornościowego, takiej jak limfocyt (np. limfocyty B i T), komórka dendrytyczna, komórka NK. Aktywację można przeprowadzić in vivo, in vitro lub ex vivo, tj. przez pobranie komórki układu odpornościowego od pacjenta, kontaktowanie komórki układu odpornościowego z immunostymulującym oligonukleotydem CpG w ilości wystarczającej do aktywacji tej komórki układu odpornościowego i powtórnego podania zaktywowanej komórki układu odpornościowego pacjentowi. W pewnych rozwiązaniach komórka dendrytyczna prezentuje antygen nowotworowy. Tę komórkę dendrytyczną można kontaktować z antygenem nowotworowym ex vivo.
Odpowiedź immunologiczna wywoływana przez immunostymulujące oligonukleotydy CpG może także skutkować indukcją produkcji cytokiny, np. produkcją IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, chemokin i IFN-γ.
W jeszcze innym rozwiązaniu, immunostymulujące oligonukleotydy CpG są przydatne w leczeniu raka. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są także przydatne według innych opisanych tu aspektów w zapobieganiu nowotworowi (np. zmniejszając ryzyko rozwoju nowotworu) u pacjenta zagrożonego rozwojem nowotworu. Nowotwór może należeć do grupy składającej się z raka dróg żółciowych, raka sutka, raka szyjki macicy, nabłoniaka kosmówkowego, raka okrężnicy, raka endom etrium, raka żołądka, nowotworów śródnabłonkowych, chłoniaków, raka wątroby, raka płuca (np. drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego), czerniaka, nerwiaków, nowotworu jamy ustnej, raka jajnika, raka trzustki, raka stercza, raka odbytnicy, mięsaków, raka tarczycy i nowotworu nerek, jak również innych raków i mięsaków. W pewnych ważnych rozwiązaniach, nowotwór do leczenia wybiera się z grupy obejmującej nowotwór kości, nowotwór mózgu i OUN, nowotwór tkanki łącznej, nowotwór przełyku, nowotwór oka, chłoniaka Hodgkin'a, nowotwór krtani, nowotwór jamy ustnej, nowotwór skóry i nowotwór jąder.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także stosować w celu zwiększenia podatności komórki nowotworowej na terapię nowotworową (np. terapia przeciwnowotworowa), ewentualnie gdy Immunostymulujący oligonukleotyd CpG podaje się w połączeniu z leczeniem przeciwnowotworowym. Terapią przeciwnowotworową może być chemioterapia, szczepionka (np. przygotowana in vitro szczepionka zawierająca komórki dendrytyczne lub szczepionka zawierająca antygeny nowotworowe) lub terapia za pomocą przeciwciał. Ten drugi rodzaj leczenia może także obejmować podawanie przeciwciała swoistego dla antygenu powierzchniowego komórki, np. komórki nowotworowej, przy czym odpowiedź immunologiczna wywołuje cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC).
W jednym rozwiązaniu, przeciwciało można wybierać z grupy składającej się z następujących przeciwciał: Ributaxin, herceptyna, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDK-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anty-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anty-FLK-2, MDX-260, przeciwciała ANA, przeciwciała SMART ID10, przeciwciała SMART ABL 364 i ImmuRAIT-CEA.
Tak więc, zgodnie z pewnymi opisanymi tu aspektami pacjentowi mającemu raka lub zagrożonemu rakiem podaje się immunostymulujący oligonukleotyd CpG i stosuje terapię przeciwnowotworową. W pewnych rozwiązaniach terapię przeciwnowotworową wybiera się z grupy składającej się ze środka chemioterapeutycznego, środka immunoterapeutycznego i szczepionki przeciwnowotworowej.
PL 227 938 B1
W jeszcze innym rozwiązaniu sposobów zapobiegania lub leczenia raka, pacjentowi można następnie podawać interferon-a.
Inne opisane tu aspekty dotyczą sposobów zapobiegania chorobom u pacjenta. Sposób obejmuje regularne podawanie pacjentowi immunostymulującego oligonukleotydu CpG w celu polepszenia reaktywności układu odpornościowego przy zapobieganiu chorobie u pacjenta. Przykłady chorób lub schorzeń, którym można zapobiegać stosując profilaktyczne sposoby tu opisane obejmują infekcje bakteryjne (np. choroby przenoszone drogą płciową) i wstrząs anafilaktyczny spowodowany alergiami pokarmowymi.
Zgodnie z innymi aspektami opisano tu również sposób indukcji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przez podawanie pacjentowi immunostymulującego oligonukleotydu CpG w ilości wystarczającej do skutecznej aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób leczenia lub zapobiegania infekcji wirusowej lub retrowirusowej. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi przechodzącemu infekcję lub zagrożonem u infekcją wirusową lub retrowirusową dowolnej kompozycji tu opisanej w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiegania infekcji wirusowej lub retrowirusowej.
W pewnych rozwiązaniach wirus oznacza wirusa powodującego zapalenie wątroby, np. wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C, H, wirusa opryszczki lub wirusa broda wczaka.
Opisano tu również sposób leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej. Sposób obejmuje podawanie pacjentowi przechodzącemu infekcję bakteryjną lub zagrożonemu infekcją bakteryjną, dowolnej kompozycji według wynalazku w ilości wystarczającej do sk utecznego leczenia lub zapobiegania infekcji bakteryjnej. W jednym rozwiązaniu infekcja bakteryjna jest spowodowana przez bakterie wewnątrzkomórkowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób leczenia lub zapobiegania infekcji pasożytniczej przez podawanie pacjentowi przechodzącemu infekcję pasożytniczą lub nią zagrożonemu dowolnej opisanej tu kompozycji w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiega nia infekcji pasożytniczej. W jednym rozwiązaniu infekcja pasożytnicza jest spowodowana pasożytem wewnątrzkomórkowym. W innym rozwiązaniu infekcja pasożytnicza jest spowodowana przez pasożyta niebędącego robakiem.
W pewnych rozwiązaniach pacjentem jest człowiek, a w innych rozwiązaniach pacjentem jest kręgowiec nie będący człowiekiem, wybrany z grupy składającej się z następujących zwierząt: pies, kot, koń, krowa, świnia, indyk, koza, ryba, małpa, kura, szczur, mysz i owca.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób indukcji odpowiedzi immunologicznej Th1 przez podawanie pacjentowi dowolnej opisanej tu kompozycji w ilości wystarczającej do skutecznego wytworzenia odpowiedzi immunologicznej Th1.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób indukcji odpowiedzi immunologicznej przez podawanie potrzebującemu tego pacjentowi w skutecznej ilości immunostymulującego oligonukleotydu 5' T*C*G*T*X1*T*T 3', w którym X1 oznacza 3-30 nukleotydów, przy czym * oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe i przy czym oligonukleotyd zawiera co najmniej 2 fosfodiestrowe wiązania internukleotydowe.
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób leczenia choroby autoimmunologicznej przez p odawanie pacjentowi choremu na chorobę autoimmunologiczną lub nią zagrożonemu, dowolnej opisanej tu kompozycji w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej.
W innych rozwiązaniach oligonukleotyd jest podawany pacjentowi w ilości wystarczającej do skutecznej indukcji ekspresji cytokiny. Cytokinę można ewentualnie wybrać z grupy składającej się z IL-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10. W innych rozwiązaniach oligonukleotyd podaje się pacjentowi w ilości wystarczającej do skutecznego przesunięcia odpowiedzi immunologicznej na odpowiedź z przewagą Th1 z odpowiedzi z przewagą Th2.
Pewne opisane tu aspekty dotyczą sposobu leczenia przebudowy struktury dróg oddechowych, obejmującego: podawanie pacjentowi oligonukleotydu zawierającego dinukleotyd CG, w ilości wystarczającej do skutecznego leczenia przebudowy struktury dróg oddechowych u pacjenta. W jednym rozwiązaniu pacjent jest chory na astmę, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc lub jest palaczem. W innych rozwiązaniach pacjent nie wykazuje objawów astmy.
Opisano tu również zastosowanie oligonukleotydu do stymulacji odpowiedzi immunologicznej.
Opisano tu także sposób wytwarzania leku z oligonukleotydu immunostymulującego.
PL 227 938 B1
Zgodnie z innym aspektem opisano tu sposób stymulacji odpowiedzi immunologicznej, przez podawanie pacjentowi oligonukleotydu o długości co najmniej 5 nukleotydów w ilości wystarczającej do skutecznej stymulacji odpowiedzi immunologicznej, przy czym oligonukleotyd zawiera co najmniej jeden immunostymulujący motyw dinukleotydowy, w którym internukleotydowe wiązanie dinukleotydu wykazuje chiralność R i w którym co najmniej 70% pozostałych wiązań internukleotydowych oligonukleotydu wykazuje chiralność S.
Każde z ograniczeń wynalazku może obejmować różne rozwiązania według wynalazku.
Figura 1 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (pg/ml) wydzielanego przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów interferonu alfa wydzielonego przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym, kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 242. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328), i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną 5' TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT 3') (SEQ ID NO: 329). Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM). Przedstawione dane są średnią dla sześciu dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom interferonu alfa (pg/ml) wydzielonego przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłożem).
Figura 2 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy IL-10 (pg/ml) wydzielonej przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów IL-10 wydzielonej przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 2A obejmują (SEQ ID NO: 322), SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 242. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 2B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM). Przedstawione dane są średnią dla sześciu dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom IL-10 (pg/ml) wydzielonej przez potraktowane kontrolą negatywną (podłoże).
Figura 3 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy TNE-alfa (pg/ml) wydzielonego przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów TNL-alfa wydzielonego przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawione jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 3A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 3B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom TNF-alfa (pg/ml) wydzielonego przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłoże) i LPS.
Figura 4 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy IL-6 (pg/ml) wydzielonej przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów IL-6 wydzielonej przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 4A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329 (z całkowicie zmodyfikowanym szkieletem tiofosforanowym). Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 4B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom IL-6 (pg/ml) wydzielonej przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłoże) i LPS.
PL 227 938 B1
Figura 5 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu gamma (pg/ml) wydzielonego przez ludzkie komórki PBMC potraktowane oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów interferonu gamma wydzielonego przez komórki potraktowane oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 5A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 5B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328, i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom interferonu gamma (pg/ml) wydzielonego przez komórki potraktowane kontrolą negatywną (podłoże) i LPS.
Figura 6 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD69 (MFI) na komórkach NK jako wskaźnika aktywacji komórek NK po potraktowaniu oligonukleotydami, których numery wyszczególniono nad szczytami wykresów wzdłuż osi X, przedstawione jako ▲, względem poziomów ekspresji CD69 na komórkach potraktowanych oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną, przedstawionych jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 5A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 i SEQ ID NO: 324 i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328 i oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczony jako SEQ ID NO: 329. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (μΜ). Przedstawione dane są średnią dla trzech dawców. Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom ekspresji CD69 na komórkach NK potraktowanych środkiem odpowiednim dla kontroli negatywnej (podłoże) i LPS.
Figura 7 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (lEN-α) (7A) i IL-10 (7B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu oligonukleotydem SEQ ID NO:
313, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10, wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Figura 8 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (8A) i IL-10 (8B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO:
314, przedstawione jako , względem, poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Jako ODN będący negatywną kontrolą zastosowano SEQ ID NO: 330: tccaggacttctctcaggtt. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Figura 9 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (9A) i IL-10 (9B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 319, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Figura 10 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (10A) i IL-10 (10B) wytwarzanych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO:
316, przedstawione jako , względem poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
Figura 11 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (11A) i IL-11 (11B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO:
317, przedstawione jako , względem, poziomów interferonu alfa i IL-10, wytwarzanych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X ^M).
PL 227 938 B1
Figura 12 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (12A) i IL-10 (12B) wytworzonych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO:
320 i przedstawione jako względem, poziomów interferonu alfa i IL-10 wytworzonych po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 13 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B (13A) i ekspresji CD80 na monocytach (13B) po traktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO: 313, przedstawione jako , względem, poziomów ekspresji CD85 na limfocytach B i CDBO na monocytach, po potraktowaniu oligonukleotydem, będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 14 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B (14A) i ekspresji CD80 na monocytach (14B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 314 i przedstawione jako , względem, poziomów ekspresji CD86 na limfocytach 3 (14A) i CD80 na monocytach, po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242, przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 15 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy ekspresji CD86 na limfocytach B (15 A) i ekspresji CD80 na monocytach (15B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 319 i przedstawione jako względem poziomów ekspresji CD86 na limfocytach B (15A) i CD80 na monocytach, po potraktowaniu oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i przedstawionych jako ·. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 16 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (16A) i ekspresję CD80 na monocytach (16B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO:
316 i w porównaniu z poziomami ekspresji po potraktowaniu oligonukleotydem, będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem 5' TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT 3' SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 17 jest zestawem wykresów przedstawiających poziomy interferonu alfa (IFN-α) (17A) i IL-10 (17B) wytwarzanych przez ludzkie komórki PBMC po potraktowaniu ich oligonukleotydem SEQ ID NO:
321 w porównaniu z poziomami interferonu alfa i IL-10 po potraktowaniu kontrolnym oligonukleotydem SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 18 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (18A) i ekspresję CD80 na monocytach (ISB) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 321 i w porównaniu z potraktowaniem oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 19 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (19A) i ekspresję CD80 na monocytach (19B) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO:
317 i w porównaniu z oligonukleotydem będącym, kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 20 jest zestawem wykresów przedstawiających ekspresję CD86 na limfocytach B (20A) i ekspresję CD80 na monocytach (2GB) po potraktowaniu tych komórek oligonukleotydem SEQ ID NO: 320 i w porównaniu z potraktowaniem oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną SEQ ID NO: 242 i oligonukleotydem SEQ ID NO: 330. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Figura 21 jest graficznym przedstawieniem fragmentu cząsteczki kwasu nukleinowego, przedstawiającym cechy strukturalne obejmujące zasady (B), cukry i szkielet z wiązaniem fosfodiestrowym. (otoczonym kółkiem) pomiędzy 5' cytydyną i 3' guanozyną i sąsiadujące wiązania tiofosforanowe.
Figura 22 jest wykresem słupkowym, przedstawiającym względne ilości tiofosforanów (SEQ ID NO: 242), miękkich (SEQ ID NO: 294) i semi-miękkich (SEQ ID NO: 241) oligonukleotydów w tkance nerki, śledziony i wątroby, 48 godzin po podaniu myszom wstrzyknięcia podskórnego. Oligonukleotydy
PL 227 938 B1
SEQ ID NO: 242 i SEQ ID NO: 241 mają identyczną sekwencję zasad i różnią się pod względem budowy szkieletu.
Figura 23 przedstawia stymulację in vitro ludzkich komórek układu odpornościowego jako indukcję produkcji cytokin IL-6, IL-10, IFNa i IP-10.
Figura 24 przedstawia stymulację in vitro mysich splenocytów przez zwiększenie efektywności i/lub mocy jako induktora produkcji związanych z TLR9 cytokin IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa i IP-10, bez wykrywalnej sekrecji IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 lub GM-CSE.
Figura 25 przedstawia indukowaną ekspresję genów związanych z TLR9 (IL-6, TNFa, IFNa, IFN-γ i IP-10) w płucach przez ODN (SEQ ID NO: 313).
Figura 26 przedstawia wpływ ODN CpG na rozwój węzła chłonnego wywołanego antygenem in vivo u myszy.
Figura 27 wskazuje, że ODN CpG tłumi odpowiedź Th2 na uczulenie antygenem.
Figura 28 przedstawia wpływ na wywołaną antygenem produkcję IgE in vivo u myszy.
Figura 29 wskazuje, że prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów, w przeważającej mierze eozynofili, w świetle dróg oddechowych.
Figury 30 i 32 wskazują, że prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów, w przeważającej mierze eozynofilów, w świetle dróg oddechowych i że było ono hamowane przez ODN (SEQ ID NO: 313) w sposób zależny od dawki.
Figury 31 i 32 wskazują, że prowokacja antygenem spowodowała nadreaktywność dróg oddechowych i że nadreaktywność tę hamował ODN (SEQ ID NO: 313) w sposób zależny od dawki.
Figura 33 przedstawia stężenia ODN w osoczu szczura występującego po podawaniu dożylnym i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dotyczące osocza wskazują, że SEQ ID NO: 313 usuwany jest z osocza szybciej niż SEQ ID NO: 329, zarówno po podaniu dożylnym, jak i i.t.
Figura 34 przedstawia stężenia ODN w płucach szczura po podaniu dożylnym i i.t. w dawce 5 mg/kg. Po podaniu dożylnym przy takim samym poziomie dawkowania, stężenia SEQ ID NO: 313 w płucu są niższe niż stężenia SEQ ID NO: 329. Po podawaniu i.t. różnica jest mniej wyraźna. Dane dotyczące płuca dla SEQ ID NO: 329 można uzyskiwać tylko przed upływem 48 godzin po podaniu dawki.
Figura 35 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podaniu dożylnym i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dotyczące nerki wskazują, że bezwzględne poziomy SEQ ID NO: 313 w nerkach są niższe niż odpowiednie stężenia SEQ ID NO: 329 po podawaniu zarówno dożylnym, jak i i.t. Ekspozycja nerek na działanie SEQ ID NO: 313, w szczególności po podawaniu i.t. jest znacznie mniejsza w porównaniu z ekspozycją nerek na SEQ ID NO: 329 przy takim samym poziomie dawkowania.
Figura 36 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podaniu dożylnym w dawce 5 mg/kg.
Figura 37 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg.
Figura 38 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowwych metabolitów) w nerkach szczura po podaniu dożylnym SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg.
Figura 39 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podawaniu i.t. SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg.
Figura 40 jest wykresem przedstawiającym stopień stymulacji dla zestawów semi-miękkich ODN w porównaniu z zawierającym wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN o takiej samej sekwencji.
Figura 41 jest zestawem wykresów słupkowych przedstawiających indukcję wytwarzania cytokiny A i B (IP-10), C (IFN) i D & E (TNF) w odpowiedzi na podawanie miękkich (SEQ ID NO: 294), semi-miękkich (SEQ ID NO: 241) i zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN (SEQ ID NO: 242).
Figura 42 jest zestawem wykresów przedstawiających aktywność limfocytu T objawiającą się wydzielaniem przeciwciał i cytotoksycznością w odpowiedzi na podawanie miękkich (SEQ ID NO: 294), semimiękkich (SEQ ID NO: 241) i zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN (SEQ ID NO: 242).
Figura 43 jest zestawem wykresów przedstawiających leczenie przeciwnowotworowe myszy z zastosowaniem semi-miękkich (SEQ ID NO: 241) lub zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe ODN (SEQ ID NO: 242). Figury 43A i B przedstawiają wyniki na modelu raka komórek nerki. Figury 43C i D przedstawiają wyniki dla modelu mysiej neuroblastomy. Figury 43E i F przedstawiają wyniki dla modelu mysiego niedrobnokomórkowego raka płuc.
Szczegółowy opis
Zgodnie z wynalazkiem opisano tu semi-miękkie immunostymulujące kwasy nukleinowe. Opisano tutaj również miękkie immunostymulujące kwasy nukleinowe. Opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku w pewnych rozwiązaniach mają lepsze właściwości obejmujące
PL 227 938 B1 porównywalną lub zwiększoną moc, zmniejszoną ekspozycję układową nerek, wątroby i śledziony, mogą powodować mniejszą odpowiedź ze strony układu odpornościowego w miejscu wstrzyknięcia. Nie wiążąc się z mechanizmem działania przyjmuje się, że te ulepszone właściwości są związane ze strategicznym umiejscowieniem w immunostymulujących oligonukleotydach fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego „wiązań internukleotydowych”. Stosowany tu termin „wiązanie internukleotydowe” odnosi się do kowalencyjnego wiązania w łańcuchu głównym: łączącego dwa sąsiadujące nukleotydy w cząsteczce kwasu nukleinowego. Wiązanie kowalencyjne w łańcuchu głównym typowo jest zmod yfikowanym lub niezmodyfikowanym wiązaniem fosforanowym, lecz możliwe są inne modyfikacje. Tak więc, liniowy oligonukleotyd, który ma długość n nukleotydów posiada ogółem n-1 wiązań internukleotydowych. Te kowalencyjne wiązania w łańcuchu głównym w immunostymulujących oligonukleotydach mogą być zmodyfikowane lub niezmodyfikowane.
W szczególności, wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego obejmują „wewnętrzne dinukleotydy”. Wewnętrzny dinukleotyd na ogół powinien oznaczać dowolną parę sąsiadujących nukleotydów połączonych wiązaniem internukleotydowym, przy czym żaden nukleotyd w parze nukleotydów nie jest nukleotydem końcowym, tj. żaden nukleotyd w takiej parze nukleotydów nie jest nukleotydem definiującym koniec 5' lub 3' oligonukleotydu. Tak więc, liniowy oligonukleotyd mający długość n nukleotydów posiada ogółem n-1 dinukleotydów i tylko n-3 wewnętrznych dinukleotydów. Każde internukleotydowe wiązanie w wewnętrznym dinukleotydzie jest wewnętrznym wiązaniem internukleotydowym. Tak więc, liniowy oligonukleotyd mający długość n nukleotydów ma ogółem n-1 wiązań internukleotydowych i tylko n-3 wewnętrznych wiązań internukleotydowych. Strategiczne rozmieszczenie internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego oznacza zatem internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego umiejscowione pomiędzy dowolną parą nukleotydów w sekwencji kwasu nukleinowego. W pewnych rozwiązaniach wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego nie są umiejscowione pomiędzy obiema parami nukleotydów najbliższymi końca 5' lub 3'.
Wynalazek opiera się co najmniej w pewnych aspektach na nieoczekiwanymi stwierdzeniu, że opisane tu miękkie i semi-miękkie kwasy nukleinowe wykazują co najmniej taką samą lub w wielu przypadkach posiadają większą aktywność immunostymulującą, w wielu przykładach, niż odpowiednie całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy posiadające taką samą sekwencję nukleotydową. Jest to nieoczekiwane, ponieważ powszechnie przyjmuje się, że tiofosforanowe oligonukleotydy są na ogół bardziej immunostymulujące niż niestabilizowane oligonukleotydy. Wyniki były nieoczekiwane, ponieważ spodziewano się, że jeśli „zmiękczone” wiązanie umieści się pomiędzy krytycznym motywem immunostymulującym, którym, jest CG, taki kwas nukleinowy może mieć zmniejszoną aktywność, ponieważ kwas nukleinowy in vivo łatwo rozpadałby się na fragmenty nie zawierające CG. W przeciwieństwie do oczekiwań, wiele tych kwasów nukleinowych wykazywało właściwie równą lub wyższą aktywność in vitro i in vivo. Wydaje się, że miękkie i semi-miękkie oligonukleotydy mają działanie co najmniej równie silne, jeśli nie silniejsze, niż ich całkowicie stabilizowane odpowiedniki; efekt immunostymulujący netto miękkich i semi-miękkich oligonukleotydów jest wypadkową pomiędzy ich aktywnością i trwałością. Przy wysokich stężeniach, równowaga wydaje się przechylać na stronę aktywności, tzn. dominuje moc. Przy niskich stężeniach, ta równowaga wydaje się przechylać na stronę trwałości, tzn. dominuje względna nietrwałość związana z wrażliwością na nukleazę.
Jeden aspekt dotyczy miękkich oligonukleotydów. Miękki oligonukleotyd oznacza immunostymulujący oligonukleotyd posiadający częściowo stabilizowany szkielet, w którym internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego występuje tylko wewnątrz i w bezpośrednim sąsiedztwie z co najmniej jednym wewnętrznym dinukleotydem pirymidyna-puryna (YZ). YZ może oznaczać YG, dinukleotyd pirymidyna-guanozyna (YG). Co najmniej jeden wewnętrzny dinukleotyd YZ sam posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego. Internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego występujące w bezpośrednim sąsiedztwie co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ może znajdować się 5', 3' lub jednocześnie 5' i 3' względem co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ. Dogodnie, internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego występujące w bezpośrednim sąsiedztwie co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ jest samo wewnętrznym wiązaniem internukleotydowym. Tak więc, dla sekwencji N1YZN2, w której każdy N1 i N2, niezależnie od siebie, oznacza dowolny nukleotyd, dinukleotyd YZ posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego, i ponadto (a) N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego, przy czym N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd, (b) Z i N2 są związane internukleotydowym wiązaPL 227 938 B1 niem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego, przy czym N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd lub (c) N1 i Y są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego, przy czym N1 oznacza wewnętrzny nukleotyd i Z i N2 są związane internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego, przy czym N2 oznacza wewnętrzny nukleotyd.
Przykłady miękkich oligonukleotydów obejmują te opisane w sekwencjach oznaczonych jako SEQ ID NO: 105-231, SEQ ID NO: 232-234, SEQ ID NO: 235-237 i SEQ ID NO: 238-240.
Opisane tu miękkie oligonukleotydy uznaje się za względnie podatne na rozerwanie nukleazą w porównaniu z całkowicie stabilizowanymi oligonukleotydami. Niezależnie od powiązania z konkretną teorią lub mechanizmem, przyjmuje się, że te opisane miękkie oligonukleotydy można pociąć na fragmenty o zmniejszonej aktywności immunostymulującej lub nie posiadające aktywności immunostymulującej w stosunku do miękkich oligonukleotydów pełnej długości.
Wprowadzen ie co najmniej jednego wiązania internukleotydowego podatnego na nukleazę, szczególnie blisko środka oligonukleotydu, uznaje się za wywołujące „off switch”, co zmienia farmakokinetykę tego oligonukleotydu tak, że zmniejsza się czas trwania maksymalnej aktywności immunostymulującej oligonukleotydu. Może mieć to szczególne znaczenie dla tkanek i dla zastosowań klinicznych, w których pożądane jest uniknięcie uszkodzenia związanego z przewlekłym, miejscowym zapaleniem lub immunostymulacją, np. nerki.
Zgodnie z innym aspektem wynalazek dotyczy semi-miękkich oligonukleotydów. Semi-miękki oligonukleotyd oznacza immunostymulujący oligonukleotyd posiadający częściowo stabilizowany szkielet, w którym wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego w ystępują tylko wewnątrz co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu pirymdyna-puryna (YZ). Semi-miękkie oligonukleotydy na ogół posiadają zwiększoną moc immunostymulującą w stosunku do odpowiednich całkowicie stabiIizowanycn immunostymulujących oligonukleotydów. Przykładowo, moc immunostymulująca semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241 jest 2-5 razy większa niż zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, przy czym dwa oligonukleotydy mają taką samą sekwencję nukleotydową i różnią się tylko wewnętrznymi wiązaniami internukleotydowymi YZ, jak przedstawiono poniżej, przy czym * oznacza wiązanie tiofosforanowe i oznacza wiązanie fosfodiestrowe:
T*C_G*T*C_GT*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 241)
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 242).
SEQ ID NO: 241 zawiera wewnętrzne internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe obejmujące zarówno dinukleotydy CG, jak i TG (oba YZ). Dzięki większej mocy semi-miękkich oligonukleotydów, semi-miękkie oligonukleotydy można stosować w niższych skutecznych stężeniach i w niższych skutecznych dawkach niż typowe całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy, co pozwala osiągnąć pożądane działanie biologiczne.
Podczas gdy całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy mogą wykazywać maksima dawka-odpowiedź, semi-miękkie oligonukleotydy według wynalazku wydają się posiadać jednostajnie rosnące krzywe dawka-odpowiedz (tak jak zbadano przy zastosowaniu stymulacji TLR9) rozciągające się na większe stężenia poza optymalnym stężeniem dla odpowiednich całkowicie s tabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów. Tak więc, przyjmuje się, że semi-miękkie oligonukleotydy według wynalazku mogą powodować silniejszą immunostymulację niż całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy.
W wynalazku stwierdzono, że aktywność immunostymulującą słabo immunostymulujących, całkowicie stabilizowanych oligonukleotydów można zwiększyć przez wprowadzenie co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YZ z internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego. Tak więc, możliwe jest wyjście od słabo immunostymulującego oligonukleotydu, posiadającego całkowicie stabilizowany szkielet i podniesienie jego aktywności immunostymulującej przez podstawienie internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego Iub typu fosfodiestrowego stabilizowanym wiązaniem internukleotydowym co najmniej jednego wewnętrznego dinukleotydu YG. Stwierdzono np., że SEQ ID NO: 243 wykazuje silniejszą aktywność immunostymulującą niż jego całkowicie stabilizowany odpowiednik SEQ ID NO: 244, przy czym SEQ ID NO: 244 jest oligonukleotydem względnie słabo immunostymulującym w porównaniu z SEQ ID NO: 242:
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 243),
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 244).
Podczas gdy całkowicie stabilizowane immunostymulujące kwasy nukleinowe o długości poniżej 20 nukleotydów mogą wykazywać umiarkowaną aktywność immunostymulującą w porównaniu
PL 227 938 B1 z dłuższymi (np. długości 24 nukleotydów) całkowicie stabilizowanymi oligonukleotydami, stwierdzono, że semi-miękkie oligonukleotydy tak krótkie jak długości 16 nukleotydów wykazują aktywność immunostymulującą co najmniej równą aktywności immunostymulującej całkowicie stabilizowanych oligonukleotydów o długości ponad 20 nukleotydów. Np. SEQ ID NO: 245 i 5602 (obydwa 16-mery o częściowym podobieństwie sekwencji do SEQ ID NO: 242) wykazują immunosytmulacyjną aktywność porównywalną z aktywnością SEQ ID NO: 242 (24-mer).
T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 245),
5602 T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 56),
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 242).
W pewnych przypadkach, gdzie 6-merowy oligonukleotyd tiofosforanowy wydawał się nie posiadać aktywności immunostymulującej, podstawienie nawet jednego wewnętrznego internukleotydowego wiązania fosfodiesterowego YZ wiązaniem tiofosforanowym pozwalało na uzyskanie odpowiedniego 6-meru o aktywności immunostymulującej.
Przyjmuje się także, że powyższe właściwości semi-miękkich oligonukleotydów na ogół nasilają się wraz z rosnącą „dawką” wewnętrznych dinukleotydów YZ zawierających wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego. Zatem uważa się, że, na przykład, zwykle dla danej sekwencji oligonukleotydowej zawierającej pięć wewnętrznych dinukleotydów YZ, oligonukleotyd zawierający pięć wewnętrznych internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego YZ jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający cztery wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego YG, który z kolei jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający trzy wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego YZ, który z kolei jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający dwa wewnętrzne wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego YZ, który z kolei jest silniej immunostymulujący niż oligonukleotyd zawierający jedno wewnętrzne internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego YZ. Co ważne, wprowadzenie nawet jednego wewnętrznego internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego YZ przyjmuje się za bardziej zalecane niż brak wewnętrznego internukleotydowego wiązania fosfodiestrowego lub typu fosfodiestrowego YZ. Oprócz liczby internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego na moc może także wpływać pozycja w łańcuchu kwasu nukleinowego.
Nieograniczające przykłady semi-miękkich oligonukleotydów obejmują te opisywane przez sekwencje oznaczone jako SEQ ID NO: 1-99, 241 i SEQ ID NO: 100-104.
Immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku są na ogół zabezpieczone przed gwałtowną degradacją w osoczu. Immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku są także na ogół zabezpieczone przed gwałtowną degradacją w większości tkanek, za wyjątkiem szczególnych tkanek o specyficznej lub nadmiernej aktywności nukleazowej zdolnych do degradacji immunostymulujących oligonukleotydów. Powoduje to zmniejszenie ilości immunostymulujących oligonukleotydów w tych szczególnych tkankach, nagromadzenie których mogłoby w przeciwnym razie spowodować działania niepożądane przy długotrwałym leczeniu z zastawaniem oligonukleotydów odpornych na degradację. Opisane tu oligonukleotydy będą na ogół posiadać, oprócz internukleotydowych wiązań fosfodiestrowych lub typu fosfodiestrowego w zalecanych wewnętrznych pozycjach, końce 5' i 3', które są odporne na degradację. Takie końce odporne na degradację mogą zawierać dowolne odpowiednie modyfik acje, których skutkiem jest zwiększona oporność na trawienie egzonukleazą w porównaniu z odpowiednimi nie modyfikowanymi końcami. Na przykład, końce 5' i 3' mogą być stabilizowane przez wprowadzenie do nich co najmniej jednej fosforanowej modyfikacji szkieletu. W zalecanym rozwiązaniu, co najmniej jedna fosforanowa modyfikacja szkieletu na każdym końcu jest niezależnie tiofosforanowym, ditiofosforanowym, metylofosfonianowym lub metylotiofosforanowym wiązaniem internukleotydowym. W innym rozwiązaniu, koniec odporny na degradację zawiera jeden lub więcej nukleotydowych jednostek połączonych przez peptydowe lub amidowe wiązania na końcu 3'. Oprócz opisanych poniżęj stabilizowanych końców, również inne stabilizowane końce mogą być zastosowane.
Jak opisano powyżej, oligonukleotydy tu opisane zawierają wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego wewnątrz i ewentualnie w sąsiedztwie wewnętrznych dinukleotydów YG. Takie dinukleotydy YG są często częścią immunostymulujących motywów. Nie jest konieczne jednakże, by oligonukleotyd zawierał wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego wewnątrz każdego motywu immunostymulującego. Jako przykład, oligonukleotyd taki jak T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 242) zawierający cztery dinukleotydy CpG może posiadać wiązania fosfodiestrowe
PL 227 938 B1 pomiędzy C i G drugiego, trzeciego lub czwartego dinukleotydu GpG i ich dowolną kombinację. Dodatkowe wiązania fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego mogą także być zachowane lub ulec gwałtownemu rozpadowi w nerkach, pomimo tego, że są skądinąd „stabilizowanymi oligonukleotydami”. Przykładowo, SEQ ID NO: 242 ponadto zawiera dwa wewnętrzne dinukleotydy TG, z których jeden lub oba, samodzielnie lub w połączeniu z dowolnym wewnętrznym dinukleotydem CG lub kombinacją wewnętrznych dinukleotydów CG, mogą posiadać wiązania fosfodiestrowe lub wiązania internukleot ydowe typu fosfodiestrowego.
Internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe jest typem wiązania charakterystycznym dla kwasów nukleinowych występujących w naturze. Jak pokazano na fig. 20, internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe zawiera atom fosforu pomiędzy dwoma mostkującymi atomami tlenu i związany także przez dwa dodatkowe atomy tlenu, jeden naładowany i drugi nie posiadający ładunku. Internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe jest szczególnie dogodne, gdy istotne jest zmniejszenie okresu półtrwania oligonukleotydu w tkance.
Wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego stanowi zawierająca atom fosforu grupa mostkująca, która jest chemicznie i/lub diastereomerycznie podobna do fosfodiestru. O stopniu podobieństwa do fosfodiesteru świadczy wrażliwość na trawienie nukleazą i zdolność do aktywacji RNazy H. Tak więc, np. fosfodiestrowe, lecz nie tiofosforanowe, oligonukleotydy są podatne na trawienie nukleazą, podczas gdy zarówno fosfodiestrowe, jak i tiofosforanowe oligonukleotydy aktywują RNazę H. W dogodnym rozwiązaniu internukleotydowym wiązaniem typu fosfodiestrowego jest wiązanie boranofosforanowe (lub równoważnie, boranofosforanowe). Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 177 198; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 859 231; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 160 109; opis patentowy Stanów Zjednoczonych. Ameryki nr 6 207 819; Sergueev i in. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120: 9417-27.
W innym dogodnym rozwiązaniu internukleotydowe wiązanie typu fosfodiestrowego jest wiązaniem tiofosforanowym o diasteromerycznie czystej konfiguracji Rp. Przyjmuje się, że wiązanie tiofosforanowe o diasteromerycznie czystej konfiguracji Rp jest bardziej podatne na trawienie nukleazą i jest skuteczniejsze przy aktywacji RNazy H niż wiązanie tiofosforanowe o mieszanej lub d iastereomerycznie czystej konfiguracji Sp. Stereoizomery oligonukleotydów CpG są przedmiotem będącego jednocześnie przedmiotem postępowania opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 09/361 575 złożonego 27 lipca 1999 r. i opublikowanego zgłoszenia nr PCT/US99/17 100 (WO 00/06 588). Należy zauważyć, że dla celów według wynalazku, termin „wiązania internukleotydowe typu fosfodiestrowego” wyklucza konkretnie ditiofosforanowe i metylofosfonianowe wiązania internukleotydowe.
Cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego według wynalazku posiadają chimerowy szkielet. Dla celów niniejszego wynalazku chimerowy szkielet oznacza tu częściowo stabilizowany szkielet, w którym co najmniej jedno wiązanie internukleotydowe jest wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego i w którym co najmniej jedno inne wiązanie internukleotydowe jest stabilizowanym wiązaniem internukleotydowym, w którym co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego i co najmniej jedno stabilizowane wiązanie są różne. Ponieważ boranofosfonianowe wiązania opisano jako stabilizowane w odniesieniu do wiązania fosfodiestrowego, dla celów chimerowych własności szkieletu, wiązania boranofosfonianowe można sklasyfikować albo jako typu fosfodiestrowego, albo jako stabilizowane, zależnie od kontekstu. Przykładowo, chimerowy szkielet tu opisany może w jednym rozwiązaniu zawierać co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe (fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego) i co najmniej jedno wiązanie boranofosfonianowe (stabilizowane). W innym rozwiązaniu chimerowy szkielet tu opisany może zawierać wiązania boranofosfonianowe (fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego) i tiofosforanowe (stabilizowane). „Stabilizowane wiązanie internukleotydowe” używane jest w znaczeniu wiązania internukleotydowego, które jest względnie odporne na degradację in vivo (np. poprzez egzo- Iub endonukleazę), w porównaniu z fosfodiestrowym, wiązaniem internukleotydowym. Zgodnie z wynalazkiem, stabilizowane wiązania internukleotydowe obejmują, bez ograniczeń, tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe i metylotiofosforanowe. Inne stabilizowane wiązania internukleotydowe obejmują, bez ograniczeń: peptydowe, alkilowe, defosfo i inne, jak opisano powyżej.
Zmodyfikowane szkielety, takie jak tiofosforanowe można zsyntetyzować zautomatyzowanymi technikami chimerycznymi z zastosowaniem albo grup fosforoamidowych lub H-fosfonianowych. Arylo- i alkilofosfoniany można wytworzyć np. jak wskazano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 469 863; a fosfotriestry alkilowe (w których naładowana grupa tlenowa jest alkilowana jak wskazano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 023 243 i europejskim
PL 227 938 B1 zgłoszeniu patentowym nr 092 574) można wytworzyć przez zautomatyzowaną syntezę w fazie stałej stosując dostępne w handlu reagenty. Opisano metody wytwarzania innych modyfikacji i substytucji w szkielecie DNA. Uhlmann E. i in. (1990) Chem. Rev. 90: 544; Goodchild J. (1990) Bioconjugate Chem. 1: 165. Znane są także sposoby wytwarzania chimerowych oligonukleotydów. Takie techniki wskazano na przykład w opisach patentowych, Uhlmann i in.
Mieszany zmodyfikowany szkielet ODN można zsyntetyzować stosując dostępny w handlu syntetyzer DNA oraz standardową metodę amidofosforynową (F. E. Eckstein, „Oligonukleotides and Analogues - A Practical Approach” IRL Press, Oxford, UK, 1991 i M. D. Matteucci i M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)). Po reakcji sprzęgania, połączenia typu PS (atom P-atom S) wprowadza się poprzez siarkowanie, z zastosowaniem odczynnika Beaucage'ego (R. P. lyer, W. Egan, J. B. Regan i S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0,075 M w acetonitrylu) lub disulfidu acetylofenylowego (PADS) i następnie prowadzi się reakcję acetylowania, stosując bezwodnik octowy, 2,6-lutydynę w tetrahydrofuranie (1:1:8; v:v:v) i N-metyloimidazol (16% w tetrahydrofuranie). Etap acetylowania przeprowadza się po reakcji siarkowania w celu zminimalizowania powstawania niepożądanego wiązania fosfodiestrowego (PO) w pozycjach, w których powinno się znajdować wiązanie tiofosforanowe. W przypadku wprowadzenia wiązania fosfodiestrowego, np. w dinukleotydzie CpG, pośredni związek fosforu (III) utlenia się, w wyniku działania roztworem jodu w układzie woda/pirydyna. Po oderwaniu od stałego nośnika i końcowym odbezpieczeniu przez potraktowanie stężonym amoniakiem (15 godzin w temperaturze 50°C), ODN analizuje się metodą HPLC na kolumnie Gen-Pak Fax (Milipore-Waters), stosując gradient NaCl (np. bufor A: 10 mM NaH2PO4 w acetonitrylu/wodzie = 1:4/v:v pH 6,8; bufor B: 10 mM NaH2PO4, 1,5 M NaCl w actetonitrylu/wodzie = 1:4/v:v; 5 do 60% B w ciągu 30 minut przy 1 ml/minutę) lub metodą żelowej elektroforezy kapilarnej. ODN można oczyścić metodą HPLC lub metodą FPLC na kolumnie Source High Performance (Amersham Pharmacia). Homogenne frakcje HPLC łączy się i odsala na kolumnie C18 lub przez ultrafiltrację. W celu potwierdzenia obliczonej masy ODN analizowano stosując spektrometrię masową MALDI-TOF.
Opisane tu kwasy nukleinowe mogą także zawierać inne modyfikacje. Obejmują one niejonowe analogi DNA, takie jak alkilo- i arylofosforany (w których naładowany tlen w grupie fosforanowej jest zastąpiony przez alkil lub grupę arylową), fosfodiester i fosfotriestry alkilowe, w których naładowana grupa tlenowa jest alkilowana. Wykazano także, że kwasy nukleinowe, które zawierają diol, taki jak glikol tetraetylenowy lub glikol heksaetylenowy, na jednym lub obu końcach, są zasadniczo odporne na degradację nukleazą.
Wielkość (tj. liczba reszt nukleotydowych w kwasie nukleinowym) immunostymulującego oligonukleotydu może także przyczyniać się do stymulującej aktywności oligonukleotydu. Dla ułatwiania wychwytu przez komórki, zalecane immunostymulujące oligonukleotydy mogą mieć minimalną długość 6 reszt nukleotydowych. Kwasy nukleinowe dowolnej wielkości powyżej 6 nukleotydów (nawet długości wielu kb) są zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznej według wynalazku, o ile występuje wystarczająca ilość motywów immunostymulujących, jako że większe kwasy nukleinowe są degradowane wewnątrz komórek. Twórcy wynalazku przyjmują, że semi-miękkie oligonukleotydy, tak krótkie jak 4-nukleotydowe mogą także być immunostymulujące, jeśli mogą one być dostarczone do wnętrza komórki. W pewnych zalecanych rozwiązaniach według wynalazku, immunostymulujące oligonukleotydy mijają długość pomiędzy 4 i 100 nukleotydów. W typowych rozwiązaniach immunostymulujące oligonukleotydy mają długość pomiędzy 6 i 40 nukleotydów. W pewnych rozwiązaniach według wynalazku, immunostymulujące oligonukleotydy mogą mieć długość pomiędzy 6 i 19 nukleotydów.
Oligonukleotydy według wynalazku są kwasami nukleinowymi, które zawierają specyficzne sekwencje, o których wiadomo, że wywołują odpowiedź immunologiczną. Te specyficzne sekwencje, które wywołują odpowiedź immunologiczną określa się jako „motywy immunostymulujące”, a oligonukleotydy, które zawierają motywy immunostymulujące określa się jako „immunostymulujące cząsteczki kwasu nukleinowego” i równoważnie, „immunostymulujące kwasy nukleinowe” lub „immunostymulujące oligonukleotydy”. Immunostymulujące oligonukleotydy według wynalazku zawierają zatem co najmniej jeden motyw immunostymulujący. W zalecanym rozwiązaniu motyw immunostymulujący jest „wewnętrznym motywem immunostymulującym”. Termin „wewnętrzny motyw immunostymulujący” odnosi się do pozycji sekwencja motywu w dłuższej sekwencji kwasu nukleinowego, która jest dłuższa niż sekwencja motywu o co najmniej jeden nukleotyd związany z każdym z końców 5' i 3' sekwencji motywu immunostymulującego.
W pewnych rozwiązaniach według wynalazku immunostymulujące oligonukleotydy zawierają motywy immunostymulujące, które są „dinukleotydami CpG”. Dinukleotyd CpG może być metylowany
PL 227 938 B1 lub niemetylowany. Immunostymulujący kwas nukleinowy zawierający co najmniej jeden niemetylowany dinukleotyd CpG jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która zawiera niemetylowaną sekwencję dinukleotydową cytozyna-guanina (tj. niemetylowaną 5' cyrydynę, po której występuje 3' guanozyna, związane wiązaniem fosforanowym), która aktywuje układ odpornościowy; takim immunostymulującym kwasem nukleinowym jest kwas nukleinowy CpG. Kwasy nukleinowe CpG ujawniono w kilku opublikowanych opisach patentowych, opublikowanych zgłoszeniach patentowych i innych publikacjach, obejmujących opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 194 388; 6 207 646; 6 214 806; 6 218 371; 6 239 116 i 6 339 068. Immunostymulujący kwas nukleinowy zawierający co najmniej jeden metylowany dinukleotyd CpG jest kwasem nukleinowym, który zawiera metylowaną sekwencję dinukleotydową cytozyna-guanina (tj. metylowaną 5' cytydynę, po której występuje 3' guanozyna, związane wiązaniem. fosforanowym), aktywującym układ odpornościowy. W innych rozwiązaniach immunostymulujące oligonukleotydy nie zawierają dinukleotydów CpG. Te oligonukleotydy, które nie zawierają dinukleotydów CpG określa się jako oligonukleotydy bez sekwencji CpG i posiadają one motywy immunostymulujące nie będące CpG. Wynalazek obejmuje zatem także kwasy nukleinowe z innego typu motywami immunostymulującymi, które mogą być metylowane lub niemetylowane. Opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy mogą następnie obejmować dowolną kombinację metylowanych i niemetylowanych motywów immunostymulujących CpG oraz nie będących CpG.
Co do kwasów nukleinowych CpG, ostatnio stwierdzono, że istnieją różne klasy kwasów nukleinowych CpG. Jedna klasa ma zdolność aktywacji limfocytów B, lecz względnie słabo indukuje produkcję IFN-α i aktywację komórek NK; tę klasę określono jako klasę B. Kwasy nukleinowe CpG klasy B są zazwyczaj całkowicie stabilizowane i zawierają niemetylowany dinukleotyd CpG w pewnym dogodnym kontekście zasad. Patrz, np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 194 388; 6 207 646; 6 214 806; 6 218 371; 6 239 116 i 6 339 068. Inna klasa silnie indukuje produkcję IFN-a i aktywację komórek NK, lecz względnie słabo stymuluje limfocyty B; tę klasę nazwano klasą A. Kwasy nukleinowe CpG klasy A zazwyczaj posiadają stabilizowane sekwencje poli-G na końcach 5' i 3' i palindromową sekwencję co najmniej 6 nukleotydów, zawierającą fosfodiestrowy dinukleotyd CpG. Patrz, np. opublikowane zgłoszenie patentowe nr PCT/US 00/26 527 (nr WO 01/22 990). Jeszcze inna klasa kwasów nukleinowych CpG aktywuje limfocyty B i komórki NK i indukuje produkcję IFN-α; tę klasę nazwano klasą C. Kwasy nukleinowe CpG klasy C, jak pierwsze tu scharakteryzowane, zazwyczaj są całkowicie stabilizowane, obejmują sekwencje typu sekwencji klasy 3 i bogate w GC palindromowe lub prawie palindromowe. Tę klasę wskazano w będącym jednocześnie przedmiotem postępowania tymczasowymi zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 60/313 273, złożonym 17 sierpnia, 2001 i zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 10/224 523, złożonym 19 sierpnia 2002. Pewne, nieograniczające przykłady kwasów nukleinowych klasy C obejmują: SEQ ID NO
275
369
370
371
372
373
374
375
316
Tak więc, w immunostymulujących oligonukleotydów CpG posiadające chimerowe szkielety są bardzo skuteczne w wywieraniu stymulującego wpływu na układ odpornościowy. Te kwasy nukleinowe CpG są terapeutycznie i profilaktycznie przydatne do stymulacji układu odpornościowego w leczeniu raka, chorób zakaźnych, alergii, astmy, choroby autoimmunologicznej i innych zaburzeń i w celu poprawy ochrony przed zakażeniem drobnoustrojami oportunistycznymi występującymi po chemioterapii nowotworów. Silna, choć zrównoważona, komórkowa i humoralna odpowiedź immunologiczna, będąca skutkiem stymulacji CpG, jest odbiciem własnego, naturalnego systemu obrony organizmu przed atakującymi patogenami i komórkami rakowymi.
Wynalazek wykorzystuje, w jednym aspekcie, stwierdzenie, że podzbiór immunostymulujących oligonukleotydów CpG wykazuje ulepszone właściwości stymulujące układ odpornościowy i zmniejszony wpływ prozapalny na nerki. W pewnych przypadkach, zapalenie nerek obserwowano u pacjenSekwencja
T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C* ynalazek w jednym aspekcie wykorzystuje stwierdzenie, że specyficzne podklasy
PL 227 938 B1 tów, którym podawano oligonukleotydy zawierające wyłącznie grupy tiofosforanowe. Przyjmuje się, że opisane tu chimerowe kwasy nukleinowe wywołują mniejszą reakcję zapalną nerek niż oligonukleotydy zawierające wyłącznie grupy tiofosforanowe. Ponadto, te oligonukleotydy bardzo skutecznie stymulują odpowiedź immunologiczną. Tak więc, fosfodiestrowy region cząsteczki nie zmniejszył jej skuteczności.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG, które są zalecane, opisuje jeden spośród następujących 6 wzorów ogólnych:
5' T*C*G*T*CGTTTTGAN1CGN2*T*T 3' (SEQ ID NO: 296),
5' T*C*G*(T*/A*)TN3CGTTTTN4CGN5*T*T 3' (SEQ ID NO: 301),
5' T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T 3' (SEQ IDNO: 307),
5' T*C_G(N6C_GNy)2-3T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 311-312),
5' T*T*GX1X2TGX3X4T*T*T*T*N10T*T*T*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 331) i
5' T*CGCGN8CGCGC*GN9 3' (SEQ ID NO: 332).
W tych wzorach N oznacza dowolny nukleotyd, N1 oznacza 0-6 nukleotydów, N2 oznacza 0-7 nukleotydów, N3 oznacza 0-4 nukleotydów, N4 oznacza 1-5 nukleotydów, N5 oznacza 0-7 nukleotydów, N6 i N7 mają niezależnie długość pomiędzy 1 i 5 nukleotydów, N8 ma długość pomiędzy 4 i 10 nukleotydów, N9 ma długość pomiędzy 0 i 3 nukleotydów i, przy czym N10 ma długość pomiędzy 4 i 8 nukleotydów. X1, X2, X3 i X4 oznaczają niezależnie C lub G. Wzory przedstawiają podzbiory z klasy oligonukleotydów CpG, które wykazują doskonałe właściwości stymulujące układ odpornościowy i dodatkowo były wrażliwsze na degradację w organizmie niż oligonukleotydy zawierające wyłącznie grupy tiofosforanowe. Oznaczenie 5' we wzorze odnosi się do wolnego końca 5' oligonukleotydu, a 3' odnosi się do wolnego końca 3' oligonukleotydu.
Symbol * stosowany we wzorach oznacza stabilizowane wiązanie internukleotydowe. Wiązania internukleotydowe nie oznaczone symbolem * mogą być stabilizowane lub niestabilizowane, o ile ol igonukleotyd zawiera co najmniej 2-3 internukleotydowe wiązania fosfodiestrowe. W pewnych rozwiązaniach zalecane jest, by oligonukleotydy zawierały 3-6 wiązań fosfodiestrowych. W pewnych przypadkach wiązania pomiędzy motywami CG są fosfodiestrowe, a w innych przypadkach są one wiązaniami tiofosforanowymi lub innymi stabilizowanymi wiązaniami.
Inne wzory obejmują 5' TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 368), przy czym co najmniej jeden dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub typu fosfodiestrowego i oligonukleotyd zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe i 5' GNC 3', przy czym N oznacza sekwencję kwasu nukleinowego o długości 4-10 nukleotydów i zawiera co najmniej 50% T i nie zawiera dinukleotydu CG, i oligonukleotyd ten zawiera co najmniej jedno stabilizowane wiązanie internukleotydowe.
Oligonukleotyd może mieć strukturę wybraną spośród:
5' T*C*G*T*C*G*TTTTGAN1C*G*N2*T*T 3' (SEQ IDNO: 296),
5' T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_GAN1C*G*N2*T*T 3' (SEQ ID NO: 296),
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*GA_N1C*G*N2*T*T 3' (SEQ ID NO: 296),
5' T*C*G*(T*/A*)TN8CGTTTTN4C*G*N5*T*T 3' (SEQ ID NO: 301),
5' T*C*G*A*T*N8C*G*TTTTN4C_G*N5*T*T 3' (SEQ ID NO: 302),
5' T*C*G*T*T*N8C_G_TTTTN4CGN5*T*T 3' (SEQ ID NO: 303),
5' T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_N_C_G_N*N*N*C*G*N*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 307),
5' T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_N_C_G_T*T*A*C*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO: 308) lub
5' T*C*G*T*C*G*N*N*N*C_G_T_C_G_N*N*N*C*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 309). Symbol _ w tych strukturach oznacza internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe. Pewne dogodne przykłady struktur obejmują następujące:
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_C_G_G_T*T*C*G*T*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 327), 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G_A_C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 328),
5' T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 324), 5'
5' T*C*G*T*C*G*T*T_T_T_G*A*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 325),
5' T*C*G*A*T*C*G*T*T*T*T_T_C_G*T*G*C*G*T*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 323),
5' T*C*G*T*T*T*T*G*A_C_G_T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 326),
T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO: 322),
5' T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 313),
5' T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T3' (SEQ ID NO: 314),
PL 227 938 B1
5' t*T*G*C_G*T*G*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 319),
5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 316),
5' T*C*G*C*G*A*C_G*T*T*C*G*C*G*C_G*C*G*C*G 3' (SEQ ID NO:317),
5' t*T*G*G_C*T*G*G_C*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 320),
5' T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 321), T*C*G*T*C-G*T*T, C-G*T*C-G*T*T*T, G*T*C-G*T*T'T*T, T*C-G*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*A,
T*T*T*T*G*A*C-G, T*T*T*G*A*C-G*T, T*T*G*A*C-G*T*T, T*G*A*C-G*T*T*T, G*A*C-G*T*T*T*T, A*C-G*T*T*T*T*G, C-G*T*T*T*T*G*T, T*T*T*T*G*T*C-G, T*T*T*G*T*C-G*T, G*T*T*T*T*G*T*C lub T*T*G*T*C-G*T*T.
Immunostymulujące oligonukleotydy na ogół mają długość w zakresie pomiędzy 4 i 100, a w pewnych rozwiązaniach 10 i 40. Długość może mieścić się w zakresie pomiędzy 16 i 24 nukleotydów.
Terminy „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” obejmują także kwasy nukleinowe lub oligonukleotydy z podstawieniami lub modyfikacjami, takimi jak w zasadach i/lub cukrach. Na przykład obejmują one kwasy nukleinowe posiadające cukry szkieletu, które są kowalencyjnie przyłączone do grup org anicznych o małej masie cząsteczkowej, innych niż grupa hydroksylowa w pozycji 2' i innych niż grupa fosforanowa lub grupa hydroksylowa w pozycji 5'. Tak więc, zmodyfikowane kwasy nukleinowe mogą zawierać 2'-O-alkilowaną grupę rybozylową. Ponadto, zmodyfikowane kwasy nukleinowe mogą obejmować cukry, takie jak arabinoza lub 2-fIuoroarabinoza zamiast rybozy. Tak więc, kwasy nukleinowe mogą być heterogenne pod względem: składu szkieletu, tym samym zawierając dowolną możliwą kombinację polimerycznych jednostek związanych razem, taką jak kwasy peptydonukleinowe (które posiadają szkielet aminokwasowy z zasadami nukleotydowymi).
Kwasy nukleinowe zawierają także podstawione puryny i pirymidyny, takie jak zmodyfikowana C-5 propynopirymidyna i 7-deaza-(7-podstawiona)puryna. Wagner R. W. i in. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 840-4. Puryny i pirymidyny zawierają między innymi adeninę, cytozynę, guaninę, tyminę, S-metylocytozynę, 5-hydroksycytozynę, 5-fluorocytozynę, 2-aminopurynę, 2-amino-5-chloropurynę, 2,6-diaminopurynę, hipoksantynę i inne naturalnie występujące i nie występujące w naturze zasady kwasów nukleinowych, podstawione i nie podstawione grupami aromatycznymi. Inne tego typu modyfikacje są dobrze znane fachowcom w dziedzinie.
Opisane tu immunostymulujące oligonukleotydy mogą zawierać różne chemiczne modyfikacje i podstawienia, w porównaniu z występującymi w naturze RNA i DNA, dotyczące fosfodiestrowego mostka internukleotydowego, jednostki β-D-rybozy i/lub naturalnie występujących zasad nukleotydów (adenina, guanina, cytozyna, tymina, uracyl). Przykłady chemicznych modyfikacji są znane specjalistom i opisane, np. w Uhlmann E. i in. (1990) Chem. Rev. 90: 543; „Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, red. S. Agrawal, Humana Press, logs, USA 1993; Crooke S. T. i in. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; i Hunziker J. i in. (1995) Mod. Synth. Methods 7: 331 -417. Oligonukleotyd tu opisany może posiadać jedną lub więcej modyfikacji, przy czym każda modyfikacja znajduje się na określonym, internukleot ydowym mostku fosfodiestrowym i/lub na określonej jednostce β-D-rybozy, i/lub na naturalnie występującej zasadzie nukleotydowej w określonej pozycji w porównaniu z oligonukleotydem o takiej samej sekwencji i który składa się z naturalnego DNA lub RNA.
Przykładowo, opisano tu oligonukleotyd, który może zawierać jedną lub więcej modyfikacji i w którym każda modyfikacja jest niezależnie wybrana spośród takich jak:
a) zastąpienie internukleotydowego mostka fosfodiestrowego znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu przez zmodyfikowany mostek internukleotydowy,
b) zastąpienie fosfodiestrowego mostka znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu przez mostek defosfo,
c) zastąpienie jednostki fosforanu cukru ze szkieletu fosforanowo-węglowodanowego inną jednostką,
d) zastąpienie jednostki β-D-rybozowej zmodyfikowaną jednostką cukrową i
e) zastąpienie naturalnej zasady nukleotydowej zmodyfikowaną zasadą nukleotydową.
Bardziej szczegółowe przykłady chemicznych modyfikacji oligonukleotydu są takie, jak następuje.
Internukleotydowy mostek fosfodiestrowy znajdujący się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu można zastąpić zmodyfikowanym internukleotydowym mostkiem, przy czym zmodyfikowany mostek internukleotydowy jest np. wybrany spośród mostków, takich jak mostek tiofosforanowy, ditiofosforanowy, NR R -fosforoamidowy, boranofosforanowy, α-hydroksybenzylofosfonianowy, estrowy fosforano-(C1-C2)-O-alkilowy, estrowy fosforano-[(C6-C12)arylo-(C1-C21)-O-alkilowy], (C1-C8)alkilofosfonianowy
PL 227 938 B1 i/lub (C6-C12)arylofosfonianowy, (C7-C12)-a-hydroksymetyloarylowy (np. ujawniony w zgłoszeniu nr WO
95/01 363), w których (C6-C12)aryl, (C6-C20)aryl i (C6-C14)aryl są ewentualnie podstawione przez atom fluorowca, alkil, alkoksy, nitro, cyjano i w których R1 i R2 oznaczają, niezależnie od siebie, atom wodoru, (C1-C18)alkil, (C6-C20)aryl, (C6-C14)-arylo-(C1-C8)alkil, dogodnie atom wodoru, (C1-C8)alkil, dogodnie (C1-C4)alkil i/lub metoksyetyl, lub R i R tworzą razem z atomem azotu, do którego są przyłączone 5-6-członowy heterocykliczny pierścień, który może dodatkowo zawierać kolejne heteroatomy, takie jak atom O, S i N.
Zastąpienie fosfodiestrowego mostka znajdującego się na końcu 3' i/lub 5' nukleotydu przez defosfo mostek (defosfo mostki opisane np. w: Uhlmann E. i Peyman A. w „Methods in Molecular Biology”, tom 20, „Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, red. S. Agrawal, Humana Press, Totowa 1993, rozdział 16, str. 355 ff), przy czym defosfo mostek jest np. wybrany spośród takich jak defosfo mostki typu formacetalu, 3'-tioformacetalu, metylohydroksyloaminy, oksymu, metylenodimetylohydrazo, dimetylensulfonu i/lub sililu.
Jednostkę fosforanu cukru (tj. β-D-ryboza i fosfodiestrowy mostek internukleotydowy razem tworzące jednostkę fosforanu cukru) w szkielecie fosforanowo-cukrowym (tj. fosforowo-cukrowy szkielet składa się z jednostek fosforanu cukru) można zastąpić inną jednostką, przy czym inna jednostka jest np. odpowiednia do konstrukcji „morfolinowego” oligomeru (jak opisano np. w: Stirchak E. P. i in. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6129-41), tj. np. zastąpić jednostką pochodną morfolino; lub można skonstruować poliamid kwasu nukleinowego („PNA”; jak opisano np. w: Nielsen P. E. i in. (1994) Bioconjug. Chem. 5: 3-7), tj. np. zastąpienie jednostki szkieletu PNA, np. 2-aminoetyloglicyną.
Jednostkę β-rybozy lub jednostkę β-D-2'-deoksyrybozy można zastąpić zmodyfikowaną jednostką cukrową, przy czym zmodyfikowana jednostka cukrowa jest wybrana np. spośród takich jak β-D-ryboza, a-D-2'-deoksyryboza, L-2'-deoksyryboza, 2'-F-2'-deoksyryboza, 2'-F-arabinoza, 2'-O-(C1-C6)-alkiloryboza, dogodnie 2'-O-(C1-C6)alkilorybozą jest 2'-O-metyloryboza, 2'-O-(C2-C5)-alkenyloryboza, 2'-[O-(C1-C6)-alkiIo-O-(C1-C6)alkilo]ryboza, 2'-NH2-2'-deoksyryboza, β-D-ksylofuranoza, α-arabinofuranoza, 2,4-dideoksy^-D-erytroheksopiranoza i karbocykliczne (opisane np. przez Froehler'a J. (1992) Am. Chem. Soc. 114: 8320) i/lub otwartołańcuchowe analogi cukrowe (opisane, np. w: Vandendriessche i in. (1993) Tetrahedron 49: 7223) i/lub analogi cukrów bicyklicznych (opisane, np. w Tarkov M. i in. (1993) Helv. Chim. Acta 76: 481).
W pewnych dogodnych rozwiązaniach cukier oznacza 2'-O-metylorybozę, szczególnie dla jednego lub obu nukleotydów związanych internukleotydowym wiązaniem fosfodiestrowym lub typu fosfodiestrowego.
Kwasy nukleinowe zawierają także podstawione puryny i pirymidyny, takie jak zmodyfikowane zasady, jak C-5 propynopirymidyna i 7-deazo-7-(podstawiona) puryna, Wagner R. W. i in. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 840-4. Puryny i pirymidyny obejmują między innymi adeninę, cytozynę, guaninę, tyminę i inne naturalnie występujące i niewystępujące w naturze zasady nukleotydowe, podstawione i niepodstawione grupami aromatycznymi.
Zmodyfikowana zasada oznacza dowolną zasadę, która jest chemicznie różna od naturalnie występujących zasad zazwyczaj znajdowanych w DNA i RNA, takich jak T, C, G, A i U, lecz która ma takie same podstawowe struktury chemiczne jak te naturalnie występujące zasady. Zmodyfikowana zasada nukleotydowa może być wybrana np. spośród takich jak hipoksantyna, uracyl, dihydrouracyl, pseudouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-aminouracyl, 5-(C1-C6)-alkilouracyl, 5-(C2-C5)-alkenylouracyl, 5-(C2-C6)-alkinylouracyl, 5-(hydroksymetylo)uracyl, 5-chlorouracyl, 5-fIuorouracyl, 5-bromouracyl, 5-hydroksycytozyna, 5-(C2-C6)alkilocytozyna, 5-(C2-C5)-alkenylocytozyna, 5-(C2-C6)-alkinylocytozyna, 5-chlorocytozyna, 5-fluorocytozyna, 5-bromocytozyna, N2-dimetyloguanina, 2,4-diaminopuryna, 8-azapuryna, podstawiona 7-deazapuryna, zwłaszcza 7-deazo-7-(podstawiona) i/lub 7-deazo-8-(podstawiona)puryna, 5-hydroksymetylocytozyna, N4-alkilocytozyna, np. N4-etylocytozyna, 5-hydroksydeoksycytydyna, 5-hydroksymetylodeoksycytydyna, N4-alkilodeoksycytydyna, np. N4-etylodeoksycytydyna, 6-tiodeoksyguanozyna i deoksyrybonukleotydy nitropirolu, C5-propynylopirymidyna i diaminopuryna, np. 2,6-diaminopuryna, inozyna, 5-metylocytozyna, 2-aminopuryna, 2-amino-6-chloropuryna, hipoksantyna lub inne modyfikacje naturalnie występujących zasad nukleotydowych. Tę listę rozumie się jako przykładową i nie należy jej interpretować jako ograniczenie.
W poszczególnych opisanych tu wzorach określono szereg modyfikacji zasad. Na przykład literę Y stosuje się w odniesieniu do nukleotydu zawierającego cytozynę lub zmodyfikowaną cytozynę. Stosowana tu zmodyfikowana cytozyna jest naturalnie występującym lub nie występującym w naturze analogiem, cytozyny będącym zasadą pirymidynową, który może zastąpić tę zasadę bez osłabiania
PL 227 938 B1 aktywności immunostymulującej oligonukleotydu. Zmodyfikowane cytozyny obejmują między innym i takie jak 5-podstawione cytozyny (np. 5-metylocytozyna, 5-fluorocytozyna, 5-chlorocytozyna, 5-bromocytozyna, 5-jodocytozyna, 5-hydroksycytozyna, 5-hydroksymetylocytozyna, 5-difIuorometylocytozyna i niepodstawiona lub podstawiona 5-alkinylocytozyna), 6-podstawione cytozyny, N4-podstawione cytozyny (np. N4-etylocytozyna), 5-azacytozyna, 2-tiocytozyna, izocytozyna, pseudo-izocytozyna, cytozynowe analogi ze skondensowanymi układami pierścieniowymi (np. N,N'-propylenocytozyna lub fenoksazyna) oraz uracyl i jego pochodne (np. 5-fIuorouracyl, 5-bromouracyl, 5-bromowinylouracyl,
4- tiouracyl, 5-hydroksyuracyl, 5-propynylouracyl). Niektóre z dogodnych cytozyn obejmują 5-metylocytozynę, 5-fluorocytozynę, 5-hydroksycytozynę, 5-hydroksymetylocytozynę i N4-etylocytozynę. W innym rozwiązaniu, zasada cytozynowa jest podstawiona przez uniwersalną zasadę (np. 3-nitropirol, zasada P), aromatyczny układ pierścieniowy (np. fluorobenzen lub difluorobenzen) lub atom wodoru (dSpacer).
Literę Z stosuje się w odniesieniu do guaniny lub zmodyfikowanej zasady guaninowej. Stosowana tu zmodyfikowana guanina jest naturalnie występującym lub niewystępującym w naturze analogiem guaniny będącym zasadą purynową, który może zastąpić tą zasadę bez osłabiania aktywności immunostymulującej oligonukleotydu. Zmodyfikowane guaniny obejmują między innymi takie jak 7-deazaguanina, 7-deaza-7-podstawiona guanina (taka jak 7-deaza-7-(C2-C6)alkinyloguanina), 7-deaza-8-podstawiona guanina, hipoksantyna, N2-podstawione guaniny (np. N2-metyloguanina),
5- amino-3-metylo-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirymidyno-2,7-dion, 2,6-diaminopuryna, 2-arainopuryna, puryna, indol, adenina, podstawione adeniny (np. N6-metyloadenina, 8-oksoadenina), 8-podstawiona guanina (np. 8-hydroksyguanina i 8-bromoguanina) i 6-tioguanina. W innym rozwiązaniu, zasada guaninowa jest podstawiona przez uniwersalną zasadę (np. 4-metyloindol, 5-nitroindol i zasada K), aromatyczny układ pierścieniowy (np. benzoimidazol lub dichlorobenzoimidazol, amid kwasu 1-metylo-1H-[1,2,4]triazolo-3-karboksylowego) lub atom wodoru (dSpacer).
Oligonukleotydy mogą posiadać jeden lub więcej dostępnych końców 5'. Możliwe jest wytworzenie zmodyfikowanych oligonukleotydów posiadających dwa takie końce 5'. Można to osiągnąć na przykład przez połączenie dwóch oligonukleotydów poprzez wiązanie 3'-3' w celu wytworzenia oligonukleotydu mającego jeden lub dwa dostępne końce 5'. Wiązanie 3'-3' może być fosfodiestrowym, tiofosforanowym lub innym dowolnym zmodyfikowanym mostkiem internukleotydowym. Sposoby tworzenia takich wiązań są znane w dziedzinie. Na przykład takie wiązania opisano w Seliger, H. i in., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3' - and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of Viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10 (1-3), 469-77 i Jiang, i in., Pseudocyclic oligonucleotides: in vitro a Nucleotides and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7 (12), 2727-2735.
Ponadto, 3'-3'-połączone kwasy nukleinowe, w których wiązanie pomiędzy 3'-końcowymi nukleotydami nie jest fosfodiestrowym, tiofosforanowym lub innym zmodyfikowanym mostkiem, można w ytworzyć stosując dodatkową grupę dystansującą, taką jak grupa tri- lub tetraetylenoglikolofosforowa (Durand, M. i in., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA) 12 and two (dT) 12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204, opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 658 738 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 668 265). Alternatywnie, nienukleotydową grupę łączącą można wytworzyć z etanodiolu, propanodiolu lub z niezasadowej jednostki deoksyrybozowej (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence i in., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attache to oligonueleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22 (11), 2022-7) z zastosowaniem standardowej chemii związków fosforoamidowych. Nienukleotydowe grupy łączące można wprowadzać raz lub wiele razy, lub łączyć ze sobą umożliwiając dowolną pożądaną odległość pomiędzy końcami 3' dwóch łączonych ODN.
Ostatnio doniesiono, że oligonukleotydy CpG wydają się wywierać swój efekt immunostymulujący poprzez wzajemne oddziaływanie z receptorem. Toll-podobnym 9 (TLR9). Hemmi H. i in. (2000) Nature 408: 740-5. Aktywność sygnalizacyjną T1R9 można zatem zmierzyć w odpowiedzi na oligonukleotyd CpG lub inny immunostymulujący kwas nukleinowy przez pomiar NF-kB, sygnałów związanych z NF-kB oraz odpowiednich zdarzeń i związków pośrednich w górę względem NF-kB.
Aby można było zastosować oligonukleotydy według wynalazku, można je syntetyzować de novo, stosując dowolny z wielu sposobów dobrze znanych w dziedzinie. Przykładowo, sposób z zastosowaniem b-cyjanoetyloamidofosforowym (Beaucage, S. L. i Caruthers, M. H., Tet. Let. 22: 1859, 1981); sposób z zastosowaniem H-fosfonianu (Garegg in., Tet. Let. 27: 4051-4054, 1986; Froehler
PL 227 938 B1 in., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407, 1986; Garegg in., Tet. Let. 27: 4055-4058, 1986, Gaffney i in., Tet. Let. 29: 2619-2622, 1988). Te związki chemiczne można otrzymać z zastosowaniem rozmaitych zautomatyzowanych syntetyzerów kwasów nukleinowych dostępnych na rynku. Te oligonukleotydy określa się jako syntetyczne oligonukleotydy. Wyizolowany oligonukleotyd na ogół oznacza oligonukleotyd, który izoluje się ze składników, z którymi jest zazwyczaj związany w naturze. Jako przykład, wyizolowanym oligonukleotydem może być taki, który izoluje się z komórki, z jądra, z mitochondriów lub z chromatyny.
Te oligonukleotydy są częściowo odporne na degradację (np. są stabilizowane). Termin „cząsteczka stabilizowanego oligonukleotydu” oznacza oligonukleotyd, który jest względnie odporny na degradację in vivo (np. przez egzo- lub endonukleazę). Stabilizację kwasu nukleinowego można przeprowadzić przez modyfikacje szkieletu. Oligonukleotydy mające wiązania tiofosforanowe zapewniają maksymalną aktywność i chronią oligonukleotyd przed degradacją przez wewnątrzkomórkowe egzoi endonukleazy. Inne zmodyfikowane oligonukleotydy obejmują kwasy nukleinowe o zmodyfikowanych wiązaniach fosfodiestrowych, kombinacje kwasu nukleinowego zawierającego wiązania fosfodiestrowe i tiofosforanowe, metylofosfonianowe, metylotiofosforanowe, ditiofosforanowe, p-etoksy i ich kombinacje.
Zmodyfikowane szkielety, takie jak zawierające wiązania tiofosforanowe, można zsyntetyzować stosując zautomatyzowane techniki z zastosowaniem albo amidofosforanu, albo związków H-fosfonianowych. Arylo- i alkilofosfoniany można wytworzyć np. jak wskazano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 469 863; a fosfotriestry alkilowe (w których obdarzony ładunkiem atom tlenu jest alkilowany, jak wskazano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 023 243 i europejskim opisie patentowym nr 092 574) można wytworzyć metodą zautomatyzowanej syntezy w fazie stałej stosując dostępne w handlu reagenty. Opisano sposoby wprowadzania innych modyfikacji i podstawień DNA (np. Uhlmann, E. i Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).
Inne stabilizowane oligonukleotydy obejmują: niejonowe analogi DNA, takie jak alkilo- i arylofosforany (w których obdarzony ładunkiem tlen z grupy fosfonianowej jest zastąpiony przez alkil lub grupę arylową), fosfodiester i fosfotriestry alkilowe, w których obdarzony ładunkiem atomu tlenu jest alkilowany. Wykazano także, że kwasy nukleinowe, które zawierają diol, taki jak glikol tetraetylenowy lub glikol heksaetylenowy, na jednym lub obydwu końcach, są w zasadzie odporne na degradację nukleazą.
Podczas gdy działanie CpG u myszy jest dobrze zbadane, informacje dotyczące ludzkiego organizmu są ograniczone. Zawierające wiązania tiofosforanowe oligonukleotydy CpG o silnej stymulującej aktywności względem układu myszy wykazują niższą aktywność względem ludzkich i innych nie pochodzących od gryzoni komórek układu odpornościowego. W przykładach opisano tworzenie ludzkich motywów CpG i charakterystykę ich wpływu oraz mechanizmy działania na ludzkie komórki PBMC, np. limfocyty B i komórki NK. DNA zawierający te motywy CpG i częściowo zmodyfikowane szkielety silnie stymulował ludzkie komórki krwi obwodowej do produkcji IL-6, IL-10, IP-10, TNF-a, IFN -a i IFN-γ. Poziom IFN-γ zwiększył się ponad poziomy kontrolne. Komórki NK i T pobudzono także do ekspresji CD69 w większych ilościach.
Stwierdzono także, że podgrupa immunostymulujących oligonukleotydów CpG ma silny wpływ stymulujący układ odpornościowy na ludzkie komórki, takie jak komórki NK, co sugeruje, że te immunostymulujące oligonukleotydy CpG są skutecznymi środkami terapeutycznymi do szczepienia ludzi, w immunoterapii raka, immunoterapii astmy, do ogólnego wzmocnienia funkcji immunologicznych, ułatwienia regeneracji układu krwiotwórczego po napromieniowaniu lub chemioterapii, chorobie autoimmunologicznej i do innych zastosowań jako modulatory immunologiczne.
Tak więc, immunostymulujące oligonukleotydy CpG są przydatne w pewnych aspektach wynalazku jako szczepionka do leczenia pacjenta, u którego istnieje ryzyko rozwoju alergii lub astmy, infekcji organizmem zakaźnym lub nowotworu, w którym zidentyfikowano specyficzny antygen nowotworowy. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także podawać bez antygenu lub alergenu w celu zabezpieczenia przed infekcją, alergią lub nowotworem i w tym przypadku powtórzone dawki mogą umożliwić długoterminową ochronę. Pacjent zagrożony, w znaczeniu tu stosowanym, oznacza pacjenta, co do którego istnieje jakiekolwiek ryzyko ekspozycji na patogen wywołujący infekcję lub nowotwór, lub alergen, lub ryzyko rozwoju nowotworu. Na przykład, pacjent zagrożony może być pacjentem, który planuje podróż w obszar, na którymi występuje określony typ czynnika zakaźnego lub może być pacjentem, który poprzez styl życia lub postępowanie lecznicze jest narażony na kontakt z płynami ustrojowymi, które mogą zawierać organizmy wywołujące infekcje lub bezpośrednio na kontakt z takim organizmem, lub nawet dowolnym pacjentem żyjącym na obszarze, na którym zidentyfiPL 227 938 B1 kowano organizm, wywołujący infekcję lub alergen. Termin pacjenci zagrożeni wystąpieniem infekcji obejmuje także ogół populacji, której placówka medyczna zaleca szczepienie z zastosowaniem określonego antygenu organizmu wywołującego infekcję. Jeśli antygen oznacza alergen i u pacjenta rozwija się reakcja alergiczna na ten konkretny antygen i pacjent może być narażony na kontakt z ant ygenem, tj. podczas okresu pylenia, to taki pacjent jest narażony na ekspozycję na ten antygen. Termin pacjent zagrożony rozwojem alergii lub astmy obejmuje tych pacjentów, których zidentyfikowano jako mających alergię lub astmę, lecz którzy nie wykazują czynnej choroby podczas leczenia immunost ymulującymi oligonukleotydami CpG, jak również pacjentów, których określono jako zagrożonych wystąpieniem tych chorób ze względu na czynniki genetyczne lub środowiskowe.
Pacjent zagrożony rozwojem nowotworu oznacza takiego, u którego występuje duże prawdopodobieństwo rozwoju nowotworu. Termin ten obejmuje, na przykład, pacjentów wykazujących nieprawidłowość genetyczną, co do której wykazano, że jej obecność jest powiązana z większym pra wdopodobieństwem wystąpienia nowotworu i pacjentów narażonych na środki wywołujące raka, takie jak tytoń, azbest lub inne toksyny chemiczne, lub pacjenta, którego uprzednio leczono z powodu raka i u którego obecnie występuje remisja. Gdy pacjenta zagrożonego rozwojem nowotworu leczy się z zastosowaniem antygenu specyficznego dla typu nowotworu, którego rozwojem ten pacjent jest zagrożony i immunostymulującym oligonukleotydem CpG, organizm pacjenta może być zdolny do zniszczenia komórek nowotworowych w czasie ich rozwoju. Jeśli u pacjenta zaczyna rozwijać się n owotwór, powstanie u niego swoista odpowiedź immunologiczna na antygen tego nowotworu.
Oprócz zastosowania immunostymulujących oligonukleotydów CpG w leczeniu profilaktycznym, możliwe jest także ich zastosowanie w leczeniu pacjentów z infekcją, alergią, astmą lub nowotworem.
Pacjent z infekcją oznacza pacjenta, który został narażony na zakaźny patogen i u którego w organizmie nagle lub ciągle stwierdza się patogen na poziomie wykrywalnym. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można stosować w połączeniu z antygenem lub same, w celu nasilenia antygenowo swoistej odpowiedzi immunologicznej systemowej lub śluzówkowej zdolnej do obniżenia poziomu lub likwidacji zakaźnego patogenu. Stosowany tu termin choroba zakaźna oznacza chorobę będącą wynikiem obecności obcego mikroorganizmu w organizmie. Szczególnie ważne jest opracowanie skutecznych strategii szczepienia i leczenia w celu zabezpieczenia powierzchni śluzówek organizmu, które są głównym miejscem wnikania patogenu.
Pacjent z alergią oznacza pacjenta, u którego występuje reakcja alergiczna lub jest zagrożony rozwojem reakcji alergicznej w odpowiedzi na alergen. Termin alergia odnosi się do nabytej nadwrażliwości na substancję (alergen). Schorzenia alergiczne obejmują między innymi egzemę, katar sienny lub śluzówkowy nieżyt nosa, gorączkę sienną, zapalenie spojówek, astmę oskrzelową, pokrzywkę i alergie pokarmowe oraz inne schorzenia atopowe.
Alergie są na ogół spowodowane wytwarzaniem przeciwciał IgE przeciw nieszkodliwym alergenom. Cytokiny, których produkcja jest wywoływana przez systemowe lub naśluzówkowe podawanie immunostymulujących oligonukleotydów CpG należą w przeważającej mierze do klasy zwanej Th1 (przykładami są IL-12, IP-10, IFN-α i IFN-γ) i indukują one odpowiedź immunologiczną, zarówno humoralną, jak i komórkową. Inny główny typ odpowiedzi immunologicznej, który jest związany z produkcją cytokin IL-4 i IL-5, nazywa się odpowiedzią immunologiczną Th2. Wydaje się, że na ogół w chorobach alergicznych pośredniczą odpowiedzi immunologiczne typu Th2. Dzięki zdolności immunostymulujących oligonukleotydów CpG do przesunięcia odpowiedzi immunologicznej u pacjenta z dominacji Th2 (która jest związana z produkcją przeciwciał IgE i alergią) na zrównoważoną odpowiedź Th2/Th1 (która ma działanie chroniące przed reakcjami alergicznymi), w celu leczenia lub zapobiegania astmie i alergii, pacjentowi można podawać immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej dawce, wywołującej odpowiedź immunologiczną.
Zatem, immunostymulujące oligonukleotydy CpG wykazują znaczącą użyteczność terapeutyczną w leczeniu stanów alergicznych i niealergicznych, takich jak astma. Poziomy cytokin Th2, szczególnie IL-4 i IL-5, są podwyższone w drogach oddechowych pacjentów z astmą. Te cytokiny wzmagają ważne aspekty odpowiedzi zapalnej w astmie, obejmujące zmianę izotypu IgE, chemotaksję eozynofilów oraz aktywację i proliferację komórek tucznych. Cytokiny Th1, szczególnie IFN-γ i IL-12, mogą tłumić powstawanie klonów Th2 i produkcję cytokin Th2. Określenie astma odnosi się do zaburzenia układu oddechowego odznaczającego się zapaleniem, zwężeniem dróg oddechowych i zwiększoną reaktywnością dróg oddechowych na wdychane środki. Astma jest często, chociaż nie wyłącznie, związana z objawami atopowymi lub alergicznymi.
PL 227 938 B1
Pacjent z nowotworem oznacza pacjenta, u którego występują wykrywalne komórki nowotworowe. Nowotwór może być nowotworem złośliwym lub niezłośliwym. Te nowotwory lub guzy obejmują między innymi raka dróg żółciowych; nowotwór mózgu; raka sutka; raka szyjki macicy; nabłoniaka kosmówkowego; raka okrężnicy; raka endometrium; raka przełyku; raka żołądka; nowotwory śródnabłonkowe; chłoniaki; raka wątroby; raka płuc (np. drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego); czerniaka; nerwiaki niedojrzałe; raka jamy ustnej; raka jajnika; raka trzustki; raka stercza; raka odbytu; mięsaki; raka skóry; raka jąder; raka tarczycy; i nowotwór nerek, jak również inne raki i mięsaki. W jednym rozwiązaniu rakiem jest białaczka kosmatokomórkowa, przewlekła białaczka szpikowa, T-komórkowy chłoniak skórny, szpiczak mnogi, chłoniak grudkowy, czerniak złośliwy, rak płaskokomórkowy, rak nerkowokomórkowy, rak stercza, rak komórek przejściowych pęcherza moczowego lub rak okrężnicy.
Pacjent oznacza pacjenta będącego człowiekiem lub kręgowcem, między innymi psa, kota, k onia, krowę, świnię, owcę, kozę, indyka, kurę, naczelne, np. małpę oraz ryby (gatunki hodowlane), np. łososia. Zatem, oligonukleotydy według wynalazku można także stosować do leczenia raka i nowotworów, infekcji oraz alergii/astmy u pacjentów nie będących ludźmi. Rak jest jedną z wiodących przyczyn śmierci zwierząt domowych (tj. kotów i psów).
Stosowany tu termin leczyć, leczony lub leczenie, użyty w stosunku do zaburzenia, takiego jak choroba zakaźna, rak, alergia lub astma odnosi się do leczenia profilaktycznego, które zwiększa odporność pacjenta na rozwój choroby (np. infekcji patogenem) lub, innymi słowy, zmniejsza prawdopodobieństwo, że u pacjenta rozwinie się choroba (np. zostanie zainfekowany patogenemi), jak również leczenia po tym, jak u pacjenta rozwinęła się choroba, w celu zwalczenia choroby (np. złagodzenia lub usunięcia infekcji) lub zapobieżenia nasileniu choroby.
W przypadkach, gdy oligonukleotyd CpG podaje się z antygenemi, pacjent może być narażony na kontakt z antygenem. Stosowany tu termin, narażony na kontakt, odnosi się albo do aktywnego etapu kontaktowania pacjenta z antygenem lub do pasywnej ekspozycji pacjenta na antygen in vivo. Sposoby aktywnej ekspozycji pacjenta na antygen są dobrze znane w dziedzinie. Na ogół, antygen podaje się pacjentowi bezpośrednio dowolnym sposobem, takim jak podawanie dożylne, domięśniowe, doustne, przezskórne, naśluzówkowe, donosowe, dotchawicze lub podskórne. Antygen można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo. Sposoby podawania antygenu i immunostymulującego oligonukleotydu CpG opisano bardziej szczegółowo poniżej. Pacjent jest pasywnie eksponowany na antygen, jeśli antygen ulega ekspozycji na komórki układu odpornościowego w organizmie. Pacjent może być pasywnie eksponowany na antygen, na przykład przez wniknięcie obcego patogenu do organizmu lub przez rozwój komórki nowotworowej eksprymującej obcy antygen na swej powierzchni.
Sposoby, w których pacjent jest pasywnie narażony na kontakt z antygenem mogą w szczególności zależeć od czasu podawania immunostymulującego oligonukleotydu CpG. Na przykład, u pacjenta, u którego występuje ryzyko rozwoju raka lub choroby zakaźnej, lub odpowiedzi alergicznej, lub astmy, pacjentowi można podawać immunostymulujący oligonukleotyd CpG regularnie, gdy takie ryzyko jest największe, tj. podczas okresu nasilenia alergii lub po ekspozycji na czynniki kancerogenne. Ponadto, immunostymulujący oligonukleotyd CpG można podawać podróżnym przed ich podróżą do obcych krajów, gdzie mogą być zagrożeni ekspozycją na czynniki zakaźne. Podobnie, immunostymulujący oligonukleotyd CpG można podawać żołnierzom lub cywilom, zagrożonym ekspozycją na broń biologiczną w celu wywołania systemowej lub śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej na antygen, gdy i jeśli pacjent jest na nią narażony.
Antygen w stosowanymi tu znaczeniu jest cząsteczką zdolną do wywołania odpowiedzi imm unologicznej. Antygeny obejmują między innymi komórki, ekstrakty komórkowe, białka, polipeptydy, peptydy, polisacharydy, koniugaty polisacharydowe, peptydowe i niepeptydowe mimetyki polisacharydów i inne cząsteczki, małe cząsteczki, lipidy, glikolipidy, węglowodany, wirusy i ekstrakty wirusowe oraz organizmy wielokomórkowe, takie jak pasożyty i alergeny. Termin antygen oznacza w szerokim znaczeniu cząsteczkę dowolnego typu, rozpoznawaną przez układ odpornościowy gospodarza jako obcą. Antygeny obejmują między innymi antygeny nowotworowe, antygeny drobnoustrojowe oraz alergeny.
Antygen nowotworowy w stosowanym tu znaczeniu jest związkiem, takim jak peptyd lub białko, związanym z powierzchnią komórki nowotworowej lub rakowej i który jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej, gdy jest eksprymowany na powierzchni komórki prezentującej antygen, w kontekście cząsteczki MHC. Antygeny nowotworowe można wytworzyć z komórek rakowych albo przez przygotowanie nieoczyszczonych ekstraktów z komórek rakowych, np. jak opisano w: Cohen, i in., 1994, Cancer Research, 54: 1055, przez częściowe oczyszczenie antygenów, technologię rekombinacyjną lub na drodze syntezy de novo znanych antygenów. Antygeny nowotworowe obejmują
PL 227 938 B1 między innymi antygeny, które są eksprymowane rekombinacyjnie, immunogenną część lub całość nowotworu Iub raka. Takie antygeny można wyizolować lub wytworzyć rekombinacyjnie lub dowolnymi innymi sposobami znanymi w dziedzinie.
Antygen drobnoustrojowy w stosowanym tu znaczeniu jest antygenem mikroorganizmu i obejmuje między innymi wirusa, bakterie, pasożyty i grzyby. Takie antygeny obejmują nienaruszony m ikroorganizm, jak również naturalne izolaty i fragmenty lub ich pochodne, a także syntetyczne związki, które są identyczne z lub podobne do naturalnych antygenów mikroorganizmów i indukują odpowiedź immunologiczną swoistą dla tego mikroorganizmu. Związek jest podobny do naturalnego antygenu mikroorganizmu jeśli indukuje odpowiedź immunologiczną (humoralną i/lub komórkową) na naturalny antygen mikroorganizmu. Takie antygeny stosuje się rutynowo w dziedzinie i są dobrze znane fachowcom.
Przykłady wirusów, których występowanie stwierdzono u ludzi obejmują między innymi: Retroviridae (np. ludzki wirus niedoboru odporności, taki jak HIV-I (określany także jako HDTV-III, LAVE lub HTLV-III/LAV, lub HIV-III; i inne izolaty, takie jak HIV-LP); Picornaviridae (np. wirusy polio, wirus zapalenia wątroby typu A; enterowirusy, ludzkie wirusy Coxsackie, rinowirusy, echowirusy); Calciviridae (np. szczepy, które powodują zapalenie żołądka i jelit); Togaviridae (np. wirusy końskiego zapalenia mózgu, wirusy różyczki); Flaviridae (np. wirusy dengi, wirusy zapalenia mózgu, wirusy żółtej febry); Coronoviridae (np. koronawirusy); Rhabdoviradae (np. wirusy pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, wirusy wścieklizny); Filoviridae (np. wirusy Ebola); Paramyxoviridae (np. wirusy grypy rzekomej, wirus świnki, wirus odry, wirus syncytium: nabłonka oddechowego); Ortomyxoviridae (np. wirusy grypy); Bungaviridae (np. wirusy Hantaan, wirusy bunga, phlebowirusy i wirusy Nairo); Arenaviridae (wirusy gorączki krwotocznej); Reoviridae (np. reowirusy, orbiwirusy i rotawirusy); Birnaviridae; Hepadnaviridae (wirus zapalenia wątroby typu B); Parvovirida (parwowirusy); Papovaviridae (wirusy brodawczaka, wirusy polioma); Adenoviridae (głównie adenowirusy); Herpesviridae (wirus opryszczki pospolitej (HSV) 1 I 2, wirus ospy wietrznej, wirusa cytomegalii (CMV), wirusa opryszczki; Poxviridae (wirusy ospy, wirusy krowianki, poksowirusy); i Iridoviridae (np. wirus afrykańskiego pomoru świń); i niesklasyfikowane wirusy (np. wirus zapalenia wątroby typu delta (uważany za defektywny wirus satelitarny wirusa zapalenia wątroby typu B), wirusy zapalenia wątroby typu nie-A, nie-B (klasa 1 = przenoszony wewnętrznie; klasa 2 = przenoszony parenteralnie (tj. zapalenia wątroby typu C); wirus Norwalk i wirusy pokrewne, i astrowirusy).
Antygenami dla zwierząt kręgowych mogą być zarówno bakterie gram-ujemne, jak i gramdodatnie. Takie bakterie gram-dodatnie obejmują między innymi gatunki Pasteurella, gatunki Staphylococci oraz gatunki Streptococcus. Bakterie gram-ujemne obejmują między innymi Escherichia coli, gatunki Pseudomonas oraz gatunki Salmonella. Konkretne przykłady bakterii zakaźnych obejmują między innymi Helicobaeter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobaeteria sps (np. M. tuberculosis, M. avium, M. intraeellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococeus pyogenes (Streptococcus grupy A), Streptocoeeus agalaetiae (Streptoeoccus grupy B), Streptocoeeus (grupa viridans), Streptoeoeeus faeealis, Streptococcus bovis, Streptoeoeeus (gatunki beztlenowe), Streptoeoeeus pneumoniae, patogenne Campylobaeter sp., Enteroeoccus sp., Haemophilus influenzae, Baeillus antraeis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebaeterium sp., Erysipelothrix rhusiopatiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobaeter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multoeida, Baeteroides sp., Eusobaeterium nueleatum, Streptobaeillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia i Aetinomyces israelli.
Przykłady grzybów obejmuią Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coecidioides immitis, Blastomyees dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albieans.
Inne organizmy wywołujące infekcje (tj. Protista) obejmują Plasmodium spp., takie jak Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax i Toksoplasma gondii. Wszczepienne i/lub tkankowe pasożyty obejmują Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropiea, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense i Trypanosoma rhodesiense (śpiączka afrykańska), Trypanosoma eruzi (choroba Chagasa) i Toxoplasma gondii.
Inne mikroorganizmy istotne z medycznego punktu widzenia opisano obszernie w literaturze, patrz np. C. G. A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Wielka Brytania 1983.
Alergen stosuje się w odniesieniu do substancji (antygenu), która może indukować odpowiedź alergiczną lub stan astmatyczny u podatnego pacjenta. Lista alergenów jest ogromna i może obejm ować pyłki, jady owadów, złuszczony naskórek zwierząt, zarodniki grzybów i leki (np. penicylinę). Przy36
PL 227 938 B1 kłady występujących w naturze, zwierzęcych i roślinnych alergenów obejmują między innymi białka specyficzne dla następujących rodzajów: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (np. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium (np. Lolium perenne lub Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrueosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europea); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (np. Plantago lanceolata); Parietaria (np. Parietaria officinalis lub Parietaria judaica); Blattella (np. Blattella germaniea); Apis (np. Apis multiflorum); Cupressus (np. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica i Cupressus maeroearpa); Juniperus (np. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis i Juniperus ashei); Thuya (np. Thuya orientalis); Chamaecyparis (np. Chamaeeyparis obtusa); Periplaneta (np. Periplaneta amerieana); Agropyron (np. Agropyron repens); Secale (np. Secale cereale); Tritieum (np. Tritieum aestivum); Dactylis (np. Dactylis glomerata); Festuea (np. Festuca elatior); Poa (np. Poa pratensis lub Poa eompressa); Avena (np. Avena sativa); Holeus (np. Holeus lanatus); Anthoxanthum (np. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (np. Arrhenatherum elatius); Agrostis (np. Agrostis alba); Phleum (np. Phleum pratense); Phalaris (np. Phalaris arundinacea); Paspalum (np. Paspalum notatum); Sorghum (np. Sorghum halepensis); i Bromus (np. Bromus inermis).
Stosowany tu termin zasadniczo oczyszczony odnosi się do polipeptydu, który jest w zasadzie wolny od innych białek, lipidów, węglowodanów lub innych substancji, z którymi jest połączony w naturze. Fachowiec w dziedzinie może oczyścić wirusowe lub bakteryjne polipeptydy, stosując standard owe techniki oczyszczania białek. Zasadniczo oczyszczony polipeptyd będzie często dawać pojedynczy główny prążek na nieredukującym żelu poliakrylamidowym. W przypadku częściowo glikozylowanych polipeptydów lub takich, które posiadają kilka kodonów start, może występować kilka krążków na nie redukującym żelu poliakrylamidowym, lecz będą one tworzyć charakterystyczny wzór dla tego polipeptydu. Czystość wirusowego lub bakteryjnego polipeptydu można także określić przez analizę sekwencji aminokwasowej końca aminowego. Wynalazek obejmuje inne typy antygenów niekodowanych przez wektor będący kwasem nukleinowym, takie jak polisacharydy, małe cząsteczki, mimetyki, itd.
Opisane tu oligonukleotydy według wynalazku można podawać pacjentowi wraz ze środkiem przeciwdrobnoustrojowym. Środek przeciwdrobnoustrojowy, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do naturalnie występującego lub syntetycznego związku, który jest zdolny do zabicia lub hamowania rozwoju zakaźnych mikroorganizmów. Typ przydatnego środka przeciwdrobnoustrojowego będzie zależał od mikroorganizmu, którym pacjent jest zainfekowany lub zainfekowaniem , którym jest zagrożony. Środki przeciwdrobnoustrojowe obejmują między innymi środki przeciwbakteryjne, środki przeciwwirusowe, środki przeciwgrzybowe i środki przeciwpasożytnicze. Wyrażenia takie jak „środek przeciwzakaźny”, „środek przeciwbakteryjny”, „środek przeciwwirusowy”, „środek przeciwgrzybowy”, „środek przeciwpasożytniczy” i „środki pasożytobójcze” posiadają dobrze ustalone znaczenia dla fachowców w dziedzinie i są zdefiniowane w standardowych tekstach medycznych. W skrócie, środki przeciwbakteryjne zabijają lub hamują rozwój bakterii i obejmują one antybiotyki, jak również inne syntetyczne lub naturalne związki mające podobne funkcje. Antybiotyki są cząsteczkami o małej masie cząsteczkowej, które powstają jako metabolity wtórne komórek, takich jak mikroorganizmy. Na ogół antybiotyki zaburzają jedną lub więcej bakteryjnych funkcji lub struktur, które są specyficzne dla m ikroorganizmu i które nie występują w komórkach gospodarza. Środki przeciwwirusowe można wyizolować ze źródeł naturalnych lub zsyntetyzować i są one przydatne w zabijaniu lub hamowaniu rozwoju wirusów. Środki przeciwgrzybowe stosuje się do leczenia powierzchownych infekcji grzybiczych jak również oportunistycznych i pierwotnych układowych infekcji grzybiczych. Środki przeciwpasożytnicze zabijają lub hamują rozwój pasożytów.
Przykłady środków przeciwpasożytniczych, określanych także jako środki pasożytobójcze, przydatnych do podawania ludziom obejmują między innymi takie jak albendazol, amfoterycyna B, benznidazol, bitionol, chlorowodorek chlorochiny, fosforan chlorochiny, klindamycyna, dehydroemetyna, dietylokarbamazyna, furonian diIoksanidu, eflornityna, furazolidon, glukokortykoidy, halofantryna, jodochinol, iwermektyna, mebendazol, mefIochina, antymonian megluminy, melarsoprol, metrifonat, metronidazol, niklozamid, nifurtimoks, oksamnichina, paromomycyna, izetionian pentamidyny, piperazyna, prazykwantel, fosforan prymachiny, proguanil, pamoinian pyrantelu, pyrimetamina-sulfonoamidy, pyrimetamina-sulfadoksyna, kwinakryna HCl, siarczan chininy, glukonian chinidyny, spiramycyna, stiboglukonian sodu (glukonian sodowoantymonowy), suramina, tetracyklina, doksycyklina, tiabendazol, tynidazol, trimetroprimsulfametoksazol oraz tryparsamid, które stosuje się samodzielnie lub w kombinacjach z innymi.
PL 227 938 B1
Środki przeciwbakteryjne zabijają albo hamują wzrost lub funkcjonowanie bakterii. Są dużą klasą środków przeciwbakteryjnych. Antybiotyki, które skutecznie zabijają lub hamują szerokie spektrum bakterii, określa się jako antybiotyki o szerokim spektrum działania. Inne typy antybiotyków są skuteczne głównie przeciw bakteriom z klasy bakterii gram-dodatnich lub gram-ujemnych. Te typy antybiotyków określa się jako antybiotyki o wąskim spektrum działania. Inne antybiotyki, skuteczne przeciw pojedynczym organizmom lub chorobom, a nie przeciw innym typom bakterii, określa się jako antybiotyki o ograniczonym spektrum działania. Środki przeciwbakteryjne czasem klasyfikuje się na podstawie ich podstawowego działania. Na ogół, środki przeciwbakteryjne są inhibitorami syntezy ściany komórkowej, inhibitorami syntezy błony komórkowej, inhibitorami syntezy białek, inhibitorami syntezy lub funkcji kwasów nukleinowych oraz inhibitorami kompetycyjnymi.
Środki przeciwwirusowe są związkami, które zapobiegają zainfekowaniu komórek przez wirusy lub replikacji wirusa wewnątrz komórki. Leków przeciwwirusowych jest o wiele mniej niż leków przeciwbakteryjnych, ponieważ proces replikacji wirusa jest tak ściśle powiązany z replikacją DNA wewnątrz komórki gospodarza, że niespecyficzne środki przeciwwirusowe mogłyby często być toksyczne dla gospodarza. Istnieje kilka etapów, w ramach procesu infekcji wirusowej, które można zablokować lub hamować stosując środki przeciwwirusowe. Etapy te obejmują przyłączenie wirusa do komórki gospodarza (immunoglobuliny lub peptydy wiążące), odpłaszczenie wirusa (np. amantadyna), syntezę lub translację wirusowego mRNA (np. interferon), replikację wirusowego RNA lub DNA (np. analogi nukleotydów), dojrzewanie nowych białek wirusowych (np. inhibitory proteaz) oraz pączkowanie i uwalnianie wirusa.
Analogi nukleotydów są syntetycznymi związkami, które są podobne do nukleotydów, lecz które posiadają niekompletną lub nieprawidłową grupę deoksyrybozylową lub rybozylową. Gdy analogi nukleotydów znajdą się w komórce, są fosforylowane, tworząc trifosforan, który współzawodniczy z prawidłowymi nukleotydami o włączenie do wirusowego DNA lub RNA. Gdy trifosforan utworzony z analogu nukleotydu włącza się do wydłużającego się łańcucha kwasu nukleinowego, powoduje to nieodwracalne połączenie z wirusową polimerazą i w ten sposób terminację łańcucha. Analogi nukleotydów obejmują między innymi acyklowir (stosowany do leczenia infekcji wirusem opryszczki zwykłej i wirusem ospy wietrznej), gancyklowir (przydatny w leczeniu infekcji cytomegalowirusem), idoksurydynę, rybawirynę (przydatną w leczeniu infekcji wirusem syncytium nabłonka oddechowego), dideoksyin ozynę, dideoksycytydynę, zydowudynę (azydotymidynę), imikwimod i resimikwimod.
Interferony są cytokinami, które ulegają sekrecji przez komórki zainfekowane wirusem, jak również komórki układu odpornościowego. Interferony działają przez wiązanie do specyficznych receptorów na komórkach sąsiadujących z zainfekowanymi komórkami, wywołując w komórce zmianę, która chroni ją przed zainfekowaniem przez wirus, a i β-interferon także indukują ekspresję cząsteczek MHC klasy I i klasy II na powierzchni zainfekowanych komórek, prowadząc w efekcie do zwiększonej prezentacji antygenów w celu rozpoznania przez komórki układu odpornościowego gospodarza. Interferony a i β są dostępne w postaciach zrekombinowanych i używane do leczenia przewlekłej infekcji zapalenia wątroby typu B i C. W dawkach, które są skuteczne w terapii przeciwwirusowej, interferony wykazują poważne skutki uboczne, takie jak gorączka, złe samopoczucie i spadek masy ciała.
Przydatne środki przeciwwirusowe obejmują między innymi takie jak immunoglobuliny, amantadyna, interferony, analogi nukleotydów i inhibitory proteaz. Konkretne przykłady środków przeciwwirusowych obejmują między innymi takie jak acemannan; acyklowir; sól sodowa acyklowiru; adefowir, alowudyna; Alvircept Sudotox; chlorowodorek amantadyny; aranotyna; arildon; mesylan atewirdyny; awridyna (ang. avridine); cydofowir; cipamfilina; chlorowodorek cytarabiny; mesylan delawirdyny; descyklowir; didanozyna; disoksaryl; edoksudyna; enwiraden; enwiroksym; famcyklowir; chlorowodorek famotyny; fiacytabina; fialurydyna; fosarylat (ang. fosarylate); sól sodowa foskarnetu; sól sodowa fosfonetu (ang. fosfonet sodium); gancyklowir; sól sodowa gancyklowiru; idoksurydyna; ketoksal; Iamiwudyna; lobukawir; chlorowodorek memotyny; metisazon; newirapina; pencyklowir; pirodawir (ang. pirodavir); rybawiryna; chlorowodorek rymantadyny; mesylan sakwinawiru; chlorowodorek somantadyny; soriwudyna (ang. Sorivudine); statolon; stawudyna; chlorowodorek tiloronu; triflurydyna; chlorowodorek walacyklowiru; widarabina; fosforan widarabiny; sodofosforan widarabiny; wiroksym; zalcytabina; zydowudyna; i zinwiroksym.
Środki przeciwgrzybowe są przydatne w leczeniu i zapobieganiu infekcjom grzybami. Środki przeciwgrzybowe są czasem klasyfikowane według mechanizmu ich działania. Pewne środki przeciwgrzybowe działają jako inhibitory syntezy ściany komórkowej przez hamowanie syntazy g lukozy. Obejmują one między innymi basiungin/ECB. Inne środki przeciwgrzybowe działają przez destabiliza38
PL 227 938 B1 cję integralności błony. Obejmują one między innymi imidazole, takie jak klotrimazol, sertakonazol, fIukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol i worikonazol, jak również FK 463, amfoterycyna B, BAY 38-9502, MK 991, pradimycyna, UK 292, butenafina i terbinafina. Inne środki przeciwgrzybowe działają przez rozkładanie chityny (np. chitinaza) lub immunosupresję (501 krem).
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można łączyć z innymi środkami terapeutycznymi, takimi jak środki wspomagające, w celu wzmożenia odpowiedzi immunologicznej. Immunostymulujący oligonukleotyd CpG i inny środek terapeutyczny można podawać jednocześnie lub sekwencyjnie. Przy jednoczesnym podawaniu z innymi środkami terapeutycznymi można je podawać w jednym lub w oddzielnych preparatach, lecz podawanych jednocześnie. Inne środki terapeutyczne podaje się kolejno po sobie i z immunostymulującym oligonukleotydem CpG, gdy podawanie innych środków terapeutycznych i immunostymulującego oligonukleotydu CpG jest rozdzielone w czasie. Rozdzielanie w czasie pomiędzy podawaniem tych związków może być kwestią minut lub może być dłuższe. Inne terapeutyczne środki obejmują między innymi adiuwanty (środki wspomagające), cytokiny, przeciwciała, antygeny, itp.
Opisane tu kompozycje można także podawać z adiuwantami nie będącymi kwasami nukleinowymi. Adiuwant nie będący kwasem nukleinowym oznacza dowolną cząsteczkę lub związek oprócz opisanego tu immunostymulującego oligonukleotydu CpG, która może stymulować humoralną i/lub komórkową odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty nie będące kwasem nukleinowym obejmują, na przykład, adiuwanty powodujące przedłużone działanie, adiuwanty stymulujące układ odpornościowy i adiuwanty, które powodują przedłużone działanie i stymulują układ odpornościowy.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są także przydatne jako adiuwanty śluzówkowe. Uprzednio stwierdzono, że przez śluzówkowe dostarczanie kwasów nukleinowych CpG wywołuje się zarówno odporność układową, jak i śluzówkową. Zatem, te oligonukleotydy można podawać w połączeniu z innymi podawanymi naśluzówkowo środkami wspomagającymi.
Odpowiedź immunologiczną mnożna także wywołać lub wzmocnić przez jednoczesne podawanie lub kolinearną ekspresję cytokin (Bueler & Mulligan, 1996; Chow in., 1997; Geissler i in., 1997; Iwasaki i in., 1997; Kim i in., 1997) lub cząsteczek kostymulujących B-7 (Iwasaki i in., 1997; Tsuji i in., 1997) z immunostymulującymi oligonukleotydami CpG. Termin cytokina stosuje się jako ogólną nazwę dla różnych grup rozpuszczalnych białek i peptydów, które działają jako humoralne regulatory w stężeniach nano- do pikomolarnych i które, w prawidłowych lub patologicznych warunkach, modulują czynnościowe aktywności poszczególnych komórek i tkanek. Te białka pośredniczą także bezpośrednio we wzajemnych oddziaływaniach pomiędzy komórkami i regulują procesy zachodzące w środowisku pozakomórkowym. Przykłady cytokin obejmują między innymi IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący kolonie granulocytów (G-CSF), interferon-γ (γ-IFN), IFN-α, czynnik martwicy nowotworów (TNF), TGF-β, FLT-3 ligand i CD40 ligand.
Oligonukleotydy są także przydatne w zmianie odpowiedzi immunologicznej z odpowiedzi immunologicznej Th2 na odpowiedź immunologiczną Th1. Powoduje to uzyskanie względnie zrównoważonego środowiska Th1/Th2. Przełączenie odpowiedzi z immunologicznej z Th2 na odpowiedź imm unologiczną Th1 można oszacować przez pomiar poziomów cytokin wytwarzanych w odpowiedzi na kwas nukleinowy (np. przez indukowanie komórek monocytów i innych komórek do produkcji cytokin Th1, obejmujących IL-12, IFN-γ i GM-CSF). Przełączenie lub zmiana równowagi pomiędzy odpowiedzią immunologiczną Th2 a odpowiedzią Th1 jest szczególnie przydatne w leczeniu lub zapobieganiu astmie. Na przykład, ilość wystarczająca do skutecznego leczenia astmy może być ilością, która przełącza związaną z astmą odpowiedź immunologiczną typu Th2 na odpowiedź typu Th1 lub nadającą równowagę Th1/Th2. W drogach oddechowych pacjentów z astmą poziomy cytokin Th2, szczególnie IL-4 i IL-5, są podwyższone. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG tu opisane powodują wzrost poziomu cytokin Th1, co pomaga w przywróceniu równowagi w układzie odpornościowym, zapobiegając lub zmniejszając szkodliwe skutki związane z przewagą odpowiedzi immunologicznej Th2.
Oligonukleotydy tu opisane mogą także być przydatne w leczeniu przebudowy struktury dróg oddechowych. Przebudowa struktury dróg oddechowych jest skutkiem proliferacji komórek mięśni gładkich i/lub podśluzówkowych zgrubień w drogach oddechowych i ostatecznie powoduje zwężenie dróg oddechowych prowadząc do ograniczenia przepływu powietrza.
Oligonukleotydy tu opisane mogą zapobiegać dalszej przebudowie i prawdopodobnie nawet zmniejszać nawarstwianie tkanki, będące skutkiem procesu przebudowy. Oligonukleotydy są także przydatne w zwiększaniu przeżywalności, różnicowania, aktywacji i dojrzewania komórek dendrytyc zPL 227 938 B1 nych. Immunostymulujące oligonukleotydy CpG posiadają wyjątkową zdolność do wspomagania przeżywalności, różnicowania, aktywacji i dojrzewania komórek dendrytycznych.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG zwiększają także aktywność lityczną i zależną od przeciwciał komórkową cytotoksyczność (ADCC) komórek NK. ADCC można wywołać stosując immunostymulujący oligonukleotyd CpG w połączeniu z przeciwciałem swoistym dla komórki docelowej, takiej jak komórka nowotworowa. Gdy immunostymulujący oligonukleotyd CpG podaje się pacjentowi w połączeniu z przeciwciałem, układ odpornościowy pacjenta jest pobudzany do zabicia komórki nowotworowej. Przeciwciała przydatne w mechanizmie ADCC obejmują przeciwciała, które wchodzą w interakcję z komórką w organizmie. Wiele takich przeciwciał swoistych dla celów komórkowych opisano w dziedzinie i wiele jest dostępnych na rynku.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można także podawać w połączeniu z leczeniem przeciwnowotworowym. Terapie przeciwnowotworowe obejmują leki przeciwnowotworowe, napromienianie i metody chirurgiczne. Stosowany tu termin „leki przeciwnowotworowe” odnosi się do środków, które podaje się pacjentowi w celu leczenia raka. Stosowany tu termin „leczenie raka” obejmuje zapobieganie rozwojowi raka, zmniejszenie objawów raka i/lub hamowanie wzrostu określonego raka. Zgodnie z innymi aspektami, lek przeciwnowotworowy podaje się pacjentowi zagrożonemu rozwojem raka w celu zmniejszenia ryzyka rozwoju raka. Opisano tu różne typy leków do leczenia raka. Dla celów tego opisu, leki przeciwnowotworowe sklasyfikowano jako środki chemioterapeutyczne, środki immunoterapeutyczne, szczepionki przeciwnowotworowe, środki hormonalne i modyfikatory odpowiedzi biologicznej.
Ponadto, możliwe jest zastosowanie więcej niż jednego leku przeciwnowotworowego wraz z immunostymulującymi oligonukleotydami CpG. Jako przykład, gdy jest to właściwie, immunostym ulujące oligonukleotydy CpG można podawać zarówno ze środkiem chemioterapeutycznym, jak i ze środkiem immunoterapeutycznym. Alternatywnie, lek przeciwnowotworowy może zawierać środek immunoterapeutyczny i szczepionkę przeciwnowotworową lub środek chemioterapeutyczny i szczepionkę przeciwnowotworową, lub środek chemioterapeutyczny, środek immunoterapeutyczny i szczepionkę przeciwnowotworową, wszystkie podawane jednemu pacjentowi w celu leczenia pacjenta chorego na raka lub zagrożonego ryzykiem rozwoju raka.
Środek chemioterapeutyczny może być wybrany z grupy obejmującej takie jak metotreksat, winkrystyna, adriamycyna, cisplatyna, nie zawierające cukru chloroetylonitrozomocznikl, 5-fIuorouracyl, mitomycyna C, bleomycyna, doksorubicyna, dakarbazyna, taksol, fragylina (ang. fragyline), meglamina GLA (ang. meglamine GLA), walrubicyna, karmustyna i poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibitor transferazy farnezylu RAS, inhibitor transferazy farnezylu, MMP, MTA/LY231514, LY264518/Lometexol, glamolec, CI-994, TNP-470, Hycamtin/topotekan, PKC412, Walspodar/PSC833, Novantron/mitoksantron, Metaret/Suramin, batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZDO101, ISI641, ODN698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, picibanil/OK432, AD 32/walrubicyna, metastron/pochodne strontu, temodal/temozolomid, Evacet/liposomalna doksorubicyna, Yewtaxan/paklitaksel, taksol/paklitaksel, Xeload/kapecytabina, kapecyta-bina/doksyfIurydyna, Cyklo-pax/doustny paklitaksel, doustny taksoid, SPU-077/cisplatyna, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibitor onkogenu RAS, BMS-182751/doustne preparaty platyny, UFT (Tegafur/Uracilo), ergamisol/lewamizol, eniluracil/776C85/substancja wzmagająca działanie 5FU, Campto/lewamizol, Camptosar/irinotekan, Tumodex/ralitreksed, leustatyna/kladrybina, Paxex/paklitaksel, Doxil/liposomalna doksorubicyna, Caetyx/liposomalna doksorubicyna, Fludara/fIudarabina, farmarubicyna/epirubicyna, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimid, 103793/Dolastain, Caetyx/liposomalna doksorubicyna, gemzar/gemcytabina, ZD 047 3/Anormed, YM 116, nasiona Allenrolfea occidentalis, inhibitory CDK4 i CDK2, inhibitory PARP, D4809/DexIfosamid, Ifes/Mesnex/Ifosamid, Vumon/tenipozyd, Paraplatin/karboplatyna, Plantinol/cisplatyna, Vepeside/etopozyd, ZD 9331, Taxotere/docetaksel, prolek arabinozydu guaniny, analog taksanu, nitrozomoczniki, środki alkilujące, takie jak melfelan i cyklofosfamid, aminoglutetymid, asparaginaza, busulfan, karboplatyna, chlorambucyl, cytarabina HCl, daktynomycyna, chlorowodorek daunorubicyny, sól sodowa fosforanu estramustyny, etopozyd (VP16-213), floksurydyna, fluorouracyl (5-FU), flutamid, hydroksymocznik (hydroksykarbamid), ifosfamid, interferon alfa-2a, alfa-2b, octan leuprolidu (analog czynnika uwalniającego LHRH), Iomustyna (CCNU), mechloretamina HCl (iperyt azotowy), tiopuryna, Mesna, mitotan (o.p'-DDD), mitoksantron HCl, oktreotyd, plikamycyna, prokarbazyna HCl, streptozocyna, cytrynian tamoksyfenu, tioguanina, tiotepa, siarczan winblastyny, amsakryna (m-AMSA),
PL 227 938 B1 azacytydyna, erytropoetyna, heksametylomelamina (HMM), interleukina 2, mitoguazon (metylo-GAG; bis-guanylohydrazon metyloglioksalu; MGBG), Pentostatyna (2'deoksykoformycyna) , semustyna (metylo-CCNU), tenipozyd (VM-26) i siarczan windezyny, lecz nie ogranicza się do nich.
Środek immunoterapeutyczny można wybierać z grupy obejmującej między innymi takie jak ributaksyna, herceptyna, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, antiVEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf. r3, ior c5, BABS, anty- FLK-2, MDX-260, przeciwciało ANA, przeciwciało SMART IDIG, przeciwciało SMART ABL 364 i ImmuRAIT-CEA.
Szczepionkę przeciwnowotworową można wybierać z grupy obejmującej między innymi takie jak EGF, antyidiotypowe szczepionki przeciwnowotworowe, antygen Gp75, szczepionka GMK przeciwko czerniakowi, szczepionka MGV na bazie koniugatu gangilozydowego, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL teratop, BLP25 (MUC-I), idiotypowa szczepionka liposomaina, malacyna, szczepionki na bazie antygenu peptydowego, szczepionki toksyna/antygen, szczepionka na bazie MVA, PACIS, szczepionka BCG, TA-HPV, TA-CIN, wirus DISC oraz ImmuCyst/TheraCys.
Zastosowanie immunostymulujących oligonukleotydów CpG w połączeniu ze środkami immunoterapeutycznymi, takimi jak przeciwciała monoklonalne, może zwiększać długoterminowe przeżycie poprzez kilka mechanizmów obejmujących znaczące nasilenie ADCC (jak opisano powyżej), aktywację komórek NK i zwiększenie poziomu IFN a. Kwasy nukleinowe stosowane w połączeniu z przeciwciałami monoklonalnymi służą do zmniejszenia dawki przeciwciała potrzebnej do osiągnięcia biologicznego rezultatu.
Stosowane tu terminy „antygen rakowy” i „antygen nowotworowy” stosuje się wymiennie w odniesieniu do antygenów, które są w sposób różnicujący eksprymowane przez komórki nowotworowe i mogą tym samym być wykorzystane do namierzenia komórek nowotworowych. Antygeny nowotworowe oznaczają antygeny, które mogą potencjalnie stymulować widoczną odpowiedź immiunologiczną swoistą dla nowotworu. Niektóre z tych antygenów są kodowane, chociaż nie koniecznie eksprymowane, przez prawidłowe komórki. Te antygeny można scharakteryzować jako takie, które są normalnie wyciszone (tj. nie eksprymowane) w prawidłowych komórkach, takie, które ulegają ekspresji tylko na pewnych stadiach różnicowania i takie, które są czasowo eksprymowane, jak antygeny embrionalne i płodowe. Inne antygeny nowotworowe są kodowane przez zmutowane geny komórkowe, takie jak onkogeny (np. aktywowany onkogen ras), geny supresorowe (np. zmutowany p53), fuzyjne białka powstałe na skutek wewnętrznych delecji lub translokacji chromosomalnych. Jeszcze inne antygeny nowotworowe mogą być kodowane przez geny wirusowe takie jak te przenoszone na onkogennych RNA i DNA wirusach.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG są także przydatne w leczeniu i zapobieganiu chorobie autoimmunologicznej. Termin choroba autoimmunologiczna dotyczy klasy chorób, w których własne przeciwciała pacjenta reagują z tkanką gospodarza lub w których efektorowe limfocyty T układu odpornościowego są autoreaktywne względem własnych peptydów endogennych i powodują zniszczenie tkanki. Tak więc, odpowiedź immunologiczna jest skierowana przeciw własnym antygenom pacjenta, określanym jako własne antygeny. Choroby autoimmunologiczne obejmują między innymi choroby takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, miastenia (MG), choroba Hashimioro, zespół Goodpasture'a, pęcherzyca (np. pęcherzyca zwykła), choroba GravesaBasedowa, autoimmunologiczna niedokrwistość hemolityczna, autoimmunologiczna plamica małopłytkowa, twardzina z przeciwciałami przeciwko kolagenowi, mieszana choroba tkanki łącznej, zapalenie wielomięśniowe, niedokrwistość złośliwa, idiopatyczna choroba Addisona, bezpłodność w wyniku zaburzeń autoimmunologicznych, zapalenie kłębuszków nerkowych (np. zapalenie kłębuszków nerkowych z tworzeniem półksiężyców, proliferacyjne zapalenie kłębuszków nerkowych), pemfigoid klasyczny, zespół Sjogren'a, insulinooporność i cukrzyca autoimmunologiczna.
Termin „własny antygen w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do antygenu prawidłowej tkanki gospodarza. Prawidłowa tkanka gospodarza nie obejmuje komórek nowotworowych. Zatem, odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw własnemu antygenowi, w kontekście choroby autoimm unologicznej, jest niepożądaną odpowiedzią immunologiczną i przyczynia się do zniszczenia i uszkodzenia prawidłowej tkanki, podczas gdy odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw antygenowi nowotworowemu jest pożądaną odpowiedzią immunologiczną i przyczynia się do zniszczenia nowoPL 227 938 B1 tworu lub raka. Zatem w pewnych aspektach tu opisanych skierowanych na leczenie zaburzenia autoimmunologicznego nie zaleca się podawania immunostymulujących kwasów nukleinowych CpG z własnymi antygenami, szczególnie takimi, które są celami w zaburzeniu autoimmunologicznym.
W innych przypadkach, immunostymulujące kwasy nukleinowe CpG można dostarczać z antygenami własnymi w małych dawkach. W pewnych badaniach na zwierzętach wykazano, że naśluzó wkowe podawanie antygenu w małych dawkach może prowadzić do stanu zmniejszenia odpowiedzi immunologicznej lub „tolerancji”. Aktywny mechanizm wydaje się być wywołanym przez cytokiny odchyleniem od odpowiedzi immunologicznej z dominacją limfocytów Th1 w stronę przewagi odpowiedzi Th2 i Th3 (tj. zdominowanej przez TGF-β). Aktywna supresja poprzez podawanie małej dawki antygenu może także tłumić niezależną odpowiedź immunologiczną (efekt przygodnego widza, ang. bystander suppression), co jest bardzo istotne w leczeniu chorób autoimmunologicznych, np. reumatoidalnego zapalenie stawów i SLE. Efekt przygodnego widza polega na sekrecji supresyjnych cytokin regulujących liczbę limfocytów Th1 w środowisku, w którym uwalniane są cytokiny prozapalne i cytokiny Th1 w odpowiedzi zarówno swoistej, jak i nieswoistej. W odniesieniu do tego zjawiska stosuje się tu termin „tolerancja. Rzeczywiście, tolerancja przy podawaniu doustnym okazała się skuteczna w leczeniu wielu chorób autoimmunologicznych u zwierząt obejmujących: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), eksperymentalną autoimmunologiczną miastenię, zapalenie stawów indukowane kolagenem (CIA) i cukrzycę insulinozależną. W tych modelach, zapobieganie i hamowanie choroby autoimmunologicznej jest związane z przesunięciem antygenowo swoistej humoralnej i komórkowej odpowiedzi z Th1 w kierunku odpowiedzi Th2/Th3.
Opisano tu także sposób indukcji wrodzonej antygenowo nieswoistej aktywacji układu odporn ościowego oraz odporności na szerokie spektrum czynników zakaźnych z zastosowaniem immunostymulujących oligonukleotydów CpG tu opisanych. Stosowany tu termin wrodzona, nieswoista aktywacja układu odpornościowego odnosi się do aktywacji komórek układu odpornościowego, innych niż limfocyty B i na przykład może obejmować aktywację komórek NK, limfocytów T lub innych komórek układu odpornościowego, które mogą odpowiadać w sposób niezależny od antygenu lub pewnej kombinacji tych komórek. Odporność o szerokim spektrum na czynniki zakaźne powstaje ponieważ komórki układu odpornościowego są aktywne i przygotowane do reagowania na każdy wnikający związek lub mikroorganizm. Komórki nie muszą być specyficznie nastawione przeciwko danemu antygenowi. Jest to szczególnie ważne w przypadku zastosowania broni biologicznej i w innych okolicznościach opisanych powyżej takich jak to jest w przypadku podróżnych.
Opisane tu oligonukleotydy mogą posiadać chiralne wiązania internukleotydowe. Jak opisano powyżej miękkie i semi-miękkie oligonukleotydy tu opisane mogą zawierać wiązania typu wiązania fosfodiestrowego pomiędzy C i G. Jednym z przykładów wiązania typu wiązania fosfodiestrowego jest wiązanie tiofosforanowe w konformacji Rp.
Co najmniej w jednych badaniach sprawdzono wpływ p-chiralności na stymulujący wpływ oligonukleotydów CpG na układ odpornościowy. Yu i in. porównali diastereomerycznie wzbogacone (niediastereomerycznie czyste) (PS)-oligonukleotydy tiofosforanowe na ich zdolność do indukcji proliferacji komórek śledziony (Yu i in., 2000). W tych badaniach, 19-merowa sekwencja zawierająca pojedynczy motyw CpG okazała się indukować wysoką proliferację komórek mysiej śledziony jeśli oligonukleotyd syntetyzowano metodą prowadzącą do losowej p-chiralności lub wzbogacono w wiązania internukleotydowe Sp, lecz proliferacja była znacznie zmniejszona jeśli oligonukleotyd był wzbogacony w wiązania internukleotydowe Rp (Yu i in., 2000).
Jednakże, w badaniu tym nie sprawdzano specyficznej roli p-chiralności w dinukleotydzie CpG, ani nie określano, czy oligonukleotydy CpG Rp wykazywały aktywność w testach stymulacji krótkoterminowej.
Przy realizacji niniejszego wynalazku stwierdzono, że p-chiralność oligonukleotydu może mieć pozornie przeciwny wpływ na immunologiczną aktywność oligonukleotydu CpG, zależnie od momentu, w którym mierzy się aktywność. We wczesnym punkcie czasowym, 40 minut, stereoizomer Rp lecz nie Sp tiofosforanowego oligonukleotydu CpG indukuje fosforylację JNK w mysich komórkach śledziony (dyskusja w przykładach). Odwrotnie, w badaniu w późnym momencie, 44 godzin y, stereoizomer Sp lecz nie Rp aktywnie stymuluje proliferację komórek śledziony. Wykazano, że ta różnica w kinetyce i bioaktywności stereoizomerów Rp i Sp nie wynika z jakiejkolwiek różnicy w wychwycie przez komórki, lecz raczej jest najprawdopodobniej spowodowana dwiema przeciwnymi biologicznymi rolami p-chiralności. Pierwsza, wzmożona aktywność stereoizomeru Rp w porównaniu z Sp stymulującego komórki układu odpornościowego we wczesnych momentach wskazuje, że Rp może bardziej skutecznie wchodzić w interakcję z receptorem CpG, TLR9 lub indukować szlaki sygnalizacyjne w dół od re42
PL 227 938 B1 ceptora. Z drugiej strony, szybsza degradacja PS-oligonukleotydów Rp w porównaniu z Sp powoduje dużo krótszy czas trwania sygnalizacji, tak, że PS-oligonukleotydy Sp wydają się mieć wyższą biologiczną aktywność przy badaniu w późniejszych momentach.
Wynalazek w pewnych aspektach opiera się na nowym stwierdzeniu, że uprzednio stwierdzany względny brak immunologicznej stymulacji przez PS-oligonukleotydy Rp jest tylko efektem ich nukleazowej nietrwałości, nie ich niezdolności do stymulacji receptora CpG i szlaków w dół od receptora. Gdy badano ich zdolność do stymulacji fosforylacji JNK, co wskazuje na aktywację tej ścieżki kinazy białkowej aktywowanej mitogenem, oligonukleotyd Rp wydawał się być najbardziej aktywny, po nim oligomer o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej, lecz bez wykrywalnej aktywności oligonukleotydu Sp. Jednakże, gdy porównano zdolność tych oligonukleotydów do aktywacji ścieżki NF-kB, na podstawie pomiaru degradacji inhibitorowego białka kB-α, wszystkie oligonukleotydy CpG były aktywne, chociaż kontrola niezawierająca CpG nie powodowała indukcji degradacji kB-α. Zatem, oligonukleotyd Sp także jest aktywny biologicznie. Jego niezdolność do indukowania szlaku JNK może być związana z różnicą w kinetyce aktywacji szlaków JNK i NF-kB, lecz z uwagi na ograniczone ilości stereospecyficznych oligonukleotydów, dostępnych do badań, twórcy wynalazku nie mogli potwierdzić tej hipotezy.
Doświadczenia opisane w przykładach wykazały zaskakująco silny wpływ p-chiralności na sam dinukleotyd CpG. W porównaniu z oligonukleotydem CpG o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej, oligonukleotyd pokrewny, w którym pojedynczy dinukleotyd CpG był związany w Rp, był ni eznacznie bardziej aktywny, podczas gdy oligonukleotyd zawierający wiązanie Sp był prawie nieak tywny pod względem indukcji proliferacji komórek śledziony. Brak aktywności oligonukleotydu Sp wspiera hipotezę twórców wynalazku, że receptor TLR9 może nie być obojętny na chiralność dinukleotydu CpG w DNA, z którym wchodzi w interakcję, lecz może właściwie być stymulowany przez lepszy stereoizomer Rp. Tak więc, stymulujący wpływ oligomeru o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej jest prawdopodobnie nie tylko skutkiem obecności 50% wiązań Sp, które opóźniają degradację, lecz także faktu, że połowa cząsteczek oligomerowych będzie w dinukleotydzie CpG wykazywać chiralność Rp, która wydaje się zwiększać stymulujący wpływ na układ odpornościowy.
Wrażliwość wiązania PS Rp na nukleazy ma istotne znaczenie dla interpretacji farmakokinetyki (PK) i badań metabolizmu PS-oligomerów u ludzi lub zwierząt. Główną nukleazą aktywną w osoczu jest 3' egzonukleaza. W typowym roztworze PS-oligomeru o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej ostatnie wiązanie internukleotydowe 3' powinno mieć chiralność Rp w połowie cząsteczek. Zatem, w tych 50% cząsteczek PS-oligomeru, końcowa zasada 3' będzie odcinana stosunkowo szybko po wlewie dożylnym. Drugie od końca 3' wiązanie internukleotydowe powinno wykazywać chiralność Rp w połowie tych cząsteczek, a zatem w przypadku 25% spośród wyjściowych cząsteczek PS-oligomeru względnie szybko można oczekiwać skrócenia o 2 zasady na końcu 3'. Ten proces odcinania zasad in vivo obejmujący wiązania internukleotydowe Rp 3' jak można się spodziewać będzie kontynuowany aż do wiązania 3' wykazującego konfigurację Sp. Zatem, jeśli PS-oligomery zsyntetyzowano tak, by miały wiązanie 3' końcowe Sp, powinny być znacznie wolniej degradowane i mieć inny profil PK w porównaniu z PS-oligomerami o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej. Powinno to umożliwiać zastosowanie nieco krótszego oligonukleotydu do podawania in vivo. Przy projektowaniu zoptymalizowanych oligomerów do zastosowania jako oligomerów antysensownych, ułatwione wiązanie RNA stereoizomeru Rp wskazuje na celowość posiadania tak wielu oligonukleotydów z wewnętrznym rdzeniem o konfiguracji Rp jak to tylko możliwe. Z drugiej strony, zoptymalizowany oligonukleotyd CpG do zastosowania w immunostymulacji może być takim, w którym wszystkie z wiązań internukleotydowych oprócz CpG wykazywałyby chiralność Sp.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG można bezpośrednio podawać pacjentowi lub można podawać w połączeniu z kompleksem dostarczającym kwas nukleinowy. Kompleks dostarczający kwas nukleinowy oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego związaną (np. jonowo lub kowalencyjnie związaną z; lub umieszczoną w) ze środkiem nakierowującym (np. cząsteczką, która powoduje wiązanie z większym powinowactwem do komórki docelowej. Przykłady kompleksów dostarczających kwas nukleinowy obejmują kwasy nukleinowe związane ze sterolem (np. cholesterol), lipidem (np. lipid k ationowy, wirosom lub liposom), lub specyficzny środek wiążący się z komórką docelową, (np. ligand rozpoznawny przez specyficzny receptor komórki docelowej). Dogodne kompleksy mogą być dost atecznie trwałe in vivo, by zapobiegać znaczącemu rozsprzęganiu przed internalizacją przez komórkę docelową. Jednakże kompleks może być rozcinalny w odpowiednich warunkach wewnątrz komórki tak, aby oligonukleotyd był uwalniany w funkcjonalnej formie.
Opisano nośniki do dostarczania lub urządzenia dostarczające do dostarczania antygenu i oligonukleotydów na powierzchnie. Immunostymulujący oligonukleotyd CpG i/lub antygen, i/lub inne środki leczniPL 227 938 B1 cze można podawać same (np. w roztworze soli lub buforze) lub stosując dowolne nośniki do dostarczania znane w dziedzinie. Opisano na przykład następujące nośniki do dostarczania: kochleaty (ang. cochleates) (Gould-Fogerite i in., 1994, 1996); emulsomy (ang. emulsomes) (Vancott i in., 1998, Lowell i in., 1997); ISCOM (Mowat i in., 1993, Carlsson i in., 1991, Hu et., 1998, Morein i in., 1999); liposomy (Childers i in., 1999, Michałek i in., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); żywe wektory bakteryjne (np. Salmonella, Escherichia coli, Bacillus calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone i in., 1996, Pouwels i in., 1998, Chatfield i in., 1993, Stover i in., 1991, Nugent i in., 1998); żywe wektory wirusowe (np. Vaccinia, adenowirus, Herpes simplex) (Gallichan i in., 1993, 1995, Moss i in., 1996, Nugent i in., 1998, Flexner i in., 1988, Morrow i in., 1999); mikrosfery (Gupta i in., 1998, Jones i in., 1996, Maloy i in., 1994, Moore i in., 1995, O'Hagan i in., 1994, Eldridge i in., 1989); szczepionki na bazie kwasu nukleinowego (Fynan i in., 1993, Kuklin i in., Sasaki i in., 1998, Okada i in., 1997, Ishii i in., 1997); polimery (np. karboksymetyloceluloza, chitosan) (Hamajima i in., 1998, Jabbal-Gill i in., 1998); pierścienie polimerowe (Wyatt i in., 1998); proteosomy (Vancott i in., Lowell i. in., 1988, 1996, 1997); fluorek sodu (Hashi i in., 1998); rośliny transgeniczne (Tacket i in., 1998, Mason i in., 1998, Haq i in., 1995); wirosomy (Gluck .i in., 1992, Mengiardi i in., 1995, Cryz i in., 1998); cząstki wirusopodobne (Jiang i in., 1999, Leibi i in., 1998). W dziedzinie znane są inne nośniki do dostarczania i poniżej w omówieniu wektorów przedstawiono pewne dodatkowe przykłady.
Termin immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej ilości odnosi się do ilości koniecznej lub wystarczającej do osiągnięcia pożądanego efektu biologicznego. Przykładowo, immunostymulujący oligonukleotyd CpG podawany w ilości pozwalającej na skuteczne zaindukowanie odporności śluzówkowej z antygenem oznacza ilość konieczną do spowodowania produkcji IgA w odpowiedzi na antygen po ekspozycji na ten antygen, podczas gdy ilość wymagana do wywołania odporności systemowej oznacza ilość konieczną do spowodowania produkcji IgG w odpowiedzi na antygen po ekspozycji na ten antygen. W połączeniu z zamieszczonymi tu wskazaniami, wybierając spośród różnych aktywnych związków i biorąc pod uwagę czynniki takie jak moc, względna biodostępność, masa ciała pacjenta, szkodliwość efektów ubocznych i zalecany sposób podawania, można zaplanować efektywny reżim podawania profilaktycznego lub leczniczego, który nie powoduje zasadniczej toksyczności i dodatkowo jest całkowicie skuteczny w leczeniu danego pacjenta. Skuteczna ilość dla każdego konkretnego zastosowania może zmieniać się zależnie od takich czynników jak leczona choroba lub schorzenie, podawany określony immunostymulujący oligonukleotyd CpG, masa pacjenta lub stopień zaawansowania choroby lub schorzenia. Fachowiec w dziedzinie może doświadczalnie określić skuteczną ilość określonego immunostymulującego oligonukleotydu CpG i/lub antygenu i/lub innego środka terapeutycznego bez konieczności wykonywania dodatkowych badań.
Podawane pacjentom dawki opisanych tu związków do podawania śluzówkowo lub miejscowo typowo mieszczą się w zakresie od około 0,1 pq do 10 mg na dawkę jednorazową, która w zależności od podawania może być podawana raz dziennie, w tygodniu lub na miesiąc i na inny dowolny okres czasu. Bardziej typowo zakres dawek podawanych śluzówkowo lub miejscowo zawiera się między około 10 pg i 5 mg na dawkę jednorazową, a najbardziej typowo od około 100 pg do 1 mg, przy czym podaje się 2-4 dawki w odstępach kilkudniowych lub kilkutygodniowych. Zazwyczaj, dawki środka pobudzającego odpowiedź immunologiczną mieszczą się w zakresie od 1 pg do 10 mg na podanie, a najczęściej 10 pg do 1 mg, przy podawaniu codziennym lub raz w tygodniu. Podawane pacjentom dawki opisanych tu związków do podawania pozajelitowo w celu wywołania swoistej odpowiedzi immunologicznej, w jakich związki podaje się z antygenem, ale nie z innym środkiem terapeutycznym, są zazwyczaj od 5 do 10000 razy większe niż skuteczne dawki śluzówkowe przy zastosowaniu środka wspomagającego szczepionki lub środka pobudzającego odpowiedź immunologiczną, często od 10 do 1000 razy większe, a najczęściej od 20 do 100 razy większe. Dawki opisanych tu związków do podawania pozajelitowo w celu wywołania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej lub w celu zwiększenia ADCC lub wywołania swoistej odpowiedzi immunologicznej, gdy immunostymulujące oligonukleotydy CpG podaje się w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi lub wyspecjalizowanymi nośnikami do dostarczania, typowo mieszczą się w zakresie od około 0,1 pg do 10 mg na podanie, które zależnie od zastosowania można podawać raz dziennie, raz w tygodniu, na miesiąc i na dowolny inny okres czasu. Częściej, dawki pozajelitowe do tych celów mieszczą się w zakresie od około 10 pg do 5 mg na podanie, a najczęściej od około 100 pg do 1 mg, przy czym podaje się je w 2-4 dawkach w odstępie kilkudniowym lub kilkutygodniowym. W pewnych rozwiązaniach, jednakże, dawki pozajelitowe można stosować do tych celów w zakresie od 5 do 10000 razy większym niż typowe dawki opisane powyżej.
Dla dowolnego z opisanych tu związków terapeutycznie skuteczną ilość można wstępnie określić na modelach zwierzęcych. Terapeutycznie skuteczną dawkę można także określić na podstawie danych do44
PL 227 938 B1 tyczących oligonukleotydów CpG, które badano u ludzi (zapoczątkowano próby kliniczne z udziałem ludzi) i dotyczących związków wykazujących podobne działanie farmakologiczne, takich jak inne środki wspomagające, np. LT i inne antygeny do szczepień. Do podawania pozajelitowo mogą być konieczne większe dawki. Dawkę do zastosowania można ustalić na podstawie względnej biodostępności i siły działania podawanego związku. Dostosowanie dawki do maksymalnej skuteczności, na podstawie opisanych wyżej sposobów i innych metod dobrze znanych w dziedzinie, leży w zakresie kompetencji fachowca o przeciętnych umiejętnościach.
Preparaty tu opisane podaje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych roztworów, które mogą typowo zawierać sól, bufory, środki konserwujące, kompatybilne nośniki, adiuwanty i, ewentualnie, inne składniki terapeutyczne, w farmaceutycznie dopuszczalnych stężeniach.
Do zastosowania w leczeniu, immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej ilości można podawać pacjentowi w jakikolwiek sposób zapewniający dostarczenie oligonukleotydu na pożądaną powierzchnię, np. śluzówkową, ogólnoustrojowo. Podawanie kompozycji farmaceutycznej można przeprowadzić dowolnymi sposobami wiadomymi dla fachowca. Zalecane sposoby podawania obejmują między innymi podawanie doustne, pozajelitowe, domięśniowe, donosowe, podjęzykowe, dotchawicze, wziewne, do gałki ocznej, dopochwowe i doodbytnicze.
W przypadku podawania doustnego, związki (tj. immunostymulujące oligonukleotydy CpG, antygeny i inne środki terapeutyczne) można komponować łatwo przez połączenie aktywnego związku (aktywnych związków) z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami dobrze znanymi w dziedzinie. Takie nośniki umożliwiają skomponowananie związków według wynalazku w postać tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żeli, syropów, rzadkich zawiesin, zawiesin itp., do połknięcia przez leczonego pacjenta. Preparaty farmaceutyczne do podawania doustnego można otrzymać w postaci stałej z zaróbką, ewentualnie przez zmielenie uzyskanej mieszaniny i przetworzenie mieszaniny granulek, po dodaniu odpowiednich środków wspomagających, jeśli to pożądane, z uzyskaniem rdzeni tabletek lub drażetek. Odpowiednie zaróbki obejmują, w szczególności, wypełniacze takie jak cukry, obejmujące takie jak laktoza, sacharoza, mannitol, lub sorbitol; preparaty celulozy, takie jak np. skrobia kukurydziana, skrobia pszeniczna, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana, żelatyna, guma tragakantowa, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, sól sodowa karboksymetylocelulozy, i/lub poliwinylopirolidon (PVP). Jeśli to pożądane, dodawać można środki rozdrabniające, takie jak poprzecznie usieciowany poliwinylopirolidon, agar, lub kwas alginowy lub jego sól taką jak alginian sodu. Ewentualnie, preparaty doustne można także skomponować w fizjologicznym roztworze soli lub buforach, tj. w EDTA do zobojętnienia warunków kwaśnych we wnętrzu ciała lub można je podawać bez żadnych nośników.
Także rozważa się specyficznie doustne postacie dawkowania powyższego składnika lub składników. Składnik lub składniki można chemicznie zmodyfikować tak, aby skuteczne było doustne dostarczanie pochodnej. Na ogół, rozważaną modyfikacją chemiczną jest przyłączenie co najmniej jednej grupy do samej cząsteczki składowej, przy czym grupa ta umożliwia (a) hamowanie proteolizy; i (b) wychwyt z żołądka lub jelit do strumienia krwi. Pożądane jest także zwiększenie ogólnej stabiln ości składnika lub składników oraz wydłużenie okresu cyrkulacji w organizmie. Przykłady takich grup obejmują: glikol polietylenowy, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon i poliprolinę. Abuchowski i Davis, 1981, „Soluble Polymer-Enzyme Adducts” w: Enzymes as Drugs, red. Hocenberg i Roberts, Wiley-Interscience, New York, NY, str. 367-383; Newmark i in., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189. Inne polimery, które można stosować obejmują poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksokan. Zalecane do zastosowania w farmacji, jak wskazano powyżej, są grupy glikolu polietylenowego.
W przypadku składnika (lub pochodnej) miejscem uwalniania może być żołądek, jelito cienkie (dwunastnica, jelito czcze, lub jelito cienkie), lub jelito grube. Fachowiec w dziedzinie dysponuje preparatami, które nie rozpuszczają się w żołądku, chociaż uwalniają substancję w dwunastnicy lub w innym miejscu w jelitach. W przypadku uwalniania zalecane jest unikanie szkodliwego działania środowiska żołądka, przez zabezpieczenie oligonukleotydu (lub pochodnej) lub uwalnianie substancji biologicznie czynnej poza środowiskiem żołądka, jak np. w jelicie.
W celu zapewnienia pełnej odporności na działanie soków żołądkowych decydujące znaczenie ma otoczka nieprzepuszczalna do pH co najmniej 5,0. Przykłady bardziej powszechnych niedrażniących składników, które stosuje się jako otoczki dojelitowe obejmują octan trimelitanu celulozy (CAT), ftalan hydroksypropylometylocelulozy (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, poli(octan ftalanu winylu) (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, octanoftalan celulozy (CAP), Eudragit L, Eudragit S, i szelak. Otoczki te można stosować w postaci filmów mieszanych.
PL 227 938 B1
Otoczkę lub mieszaninę powłok można także zastosować do powlekania tabletek, które w zamierzeniu nie mają mieć zabezpieczenia przed działaniem soku żołądkowego. Mogą to być otoczki cukrowe, lub otoczki ułatwiające połknięcie tabletki. Kapsułki mogą składać się z twardej powłoki (takiej jak żelatyna) do dostarczania suchego środka terapeutycznego tj. proszku; w przypadku postaci ciekłych, można stosować miękkie powłoki żelatynowe. Materiałem na powłoki kapsułek z opłatka może być gęsta skrobia lub inna jadalna bibuła. W przypadku pigułek, pastylek do ssania, kształtowanych tabletek lub proszków tabletkowych, można stosować techniki rozdrabniania na mokro.
Środek terapeutyczny można umieścić w preparacie w postaci wielu drobnych cząstek, w postaci granulek lub peletek o wymiarze cząstki około 1 mm. Materiał na preparat do podawania w kapsułkach może być także w postaci proszku, lekko sprasowanych „pastylek” lub a nawet tabletek. Środek terapeutyczny można sprasować.
Można zastosować wszystkie barwniki i środki smakowe. Przykładowo, oligonukleotyd (lub pochodną) można komponować (jak np. zamykając w liposomach lub mikrosferach), po czym dodać do produktu spożywczego, takiego jak ochłodzony napój zawierający barwniki i środki smakowe.
Można rozcieńczyć lub zwiększyć objętość środka terapeutycznego stosując substancję obojętną. Rozcieńczalniki te mogą obejmować węglowodany, szczególnie mannitol, α-laktozę, bezwodną laktozę, celulozę, sacharozę, zmodyfikowane dekstrany i skrobię. Jako wypełniacze można także zastosować pewne nieorganiczne sole obejmujące trifosforan wapnia, węglan magnezu i chlorek sodu. Pewne dostępne w handlu rozcieńczalniki obejmują Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.
W celu skomponowania stałej postaci dawkowania do preparatu można dodać terapeutyczne substancje dezintegrujące. Substancje stosowane jako środki dezintegrujące obejmują między innymi takie jak skrobia, w tym dostępna na rynku substancja dezintegrująca na bazie skrobi, Explotab. Można także zastosować każdy środek spośród takich jak sól sodowa glikolanu skrobi, Amberlite, sól sodowa karboksymetylocelulozy, ultramylopektyna, alginian sodu, żelatyna, skórka pomarańczowa, kwasowa karboksymetyloceluloza, gąbka naturalna i bentonit. Inną formą substancji dezintegrujących są nierozpuszczalne żywice kationowymienne. Jako substancje dezintegrujące i jako spoiwa można stosować sproszkowane gumy, a te mogą obejmować sproszkowane gumy, takie jak agar, guma karaya lub guma tragankowa. Przydatne jako substancje dezintegrujące są także kwas alginowy i jego sól sodowa.
Do utrzymania środka terapeutycznego w całości można stosować spoiwa uzyskując twardą tabletkę i obejmują one substancje pochodzenia naturalnego, takie jak guma arabska, guma tragank owa, skrobia i żelatyna. Inne, obejmują takie jak metyloceluloza (MC), etyloceluloza (EC) i karboksymetyloceluloza (CMC). Zarówno poliwinylopirolidon (PVP), jak i hydroksypropylometylocelulozę (HPMC) można stosować w roztworach alkoholowych do zgranulowania środka terapeutycznego.
Aby zapobiec przyleganiu środka terapeutycznego podczas formulacji, do preparatu można dodać środek antystatyczny. Pomiędzy środkiem terapeutycznym a ścianą matrycy, jako warstwę można zastosować środki poślizgowe, a te mogą obejmować między innymi: kwas stearynowy w tym jego sole magnezu i wapnia, politetrafluoroetylen (PTFE), ciekłą parafinę, oleje roślinne i woski. Stosować można także rozpuszczalne środki poślizgowe, takie jak lauryIosiarczan sodu, IauryIosiarczan magnezu, glikol polietylenowy o różnych masach cząsteczkowych, Carbowax 4000 i 6000.
Dodać można środki poślizgowe, które mogą polepszać właściwości przepływu leku podczas formulacji i wspomagać przegrupowanie podczas sprasowywania. Środki poślizgowe mogą obejm ować takie jak skrobia, talk, wywołująca gorączkę krzemionka i hydratowany glinokrzemian.
Aby ułatwić rozpuszczanie środka terapeutycznego w środowisku wodnym jako środek zwilżający można dodać surfaktant. Surfaktanty mogą obejmować detergenty anionowe, takie jak laurylosiarczan sodu, sodowy sulfobursztynian dioktylu i sodowy sulfonian dioktylu. Zastosować można detergenty kationowe, a mogą one obejmować chlorek benzalkoniowy lub chlorek benzetoniowy. Lista potencjalnych niejonowych detergentów, które można zawrzeć w preparacie jako surfaktanty obejmuje Lauromacrogol 400, stearynian polioksylu 40, polioksyetylenowany uwodorniony olej rycynowy 10, 50 i 60, monostearynian glicerolu, Polysorbate 40, 60, 65 i 80, ester tłuszczowy sacharozy, metylocelulozę i karboksymetylocelulozę. Surfaktanty te mogą występować w preparacie oligonukleotydu lub pochodnej same lub w postaci mieszaniny w różnych proporcjach.
Preparaty farmaceutyczne, które można stosować doustnie obejmują kapsułki zatrzaskowe w ykonane z żelatyny, jak również miękkie, szczelnie zamknięte kapsułki wykonane z żelatyny i plastyf ikatora, takiego jak glicerol lub sorbitol. Kapsułki zatrzaskowe mogą zawierać aktywne składniki w mieszance z wypełniaczem takim jak laktoza, spoiwami takimi jak skrobie, i/lub środkami poślizgowymi, takimi jak talk lub stearynian magnezu i, ewentualnie, stabilizatorami. W miękkich kapsułkach, aktyw46
PL 227 938 B1 ne związki mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich cieczach, takich jak oleje tłuszczowe, ciekła parafina, lub ciekłe glikole polietylenowe. Ponadto, można dodawać stabilizatory. St osować można także mikrosfery skomponowane do podawania doustnego. Takie mikrosfery dobrze opisano w dziedzinie. Wszystkie preparaty do podawania doustnego powinny być w dawkach odpowiednich dla takiego podawania.
W przypadku podawania podpoliczkowego, kompozycje mogą występować w postaci tabletek lub pastylek do ssania skomponowanych w typowy sposób.
W przypadku podawania wziewnego, opisane tu związki można dogodnie dostarczać w postaci aerozolu w sprayu w opakowaniach ciśnieniowych lub rozpylaczu, z zastosowaniem odpowiedniego propelenta, np. dichlorodifluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu, ditlenku węgla lub innego odpowiedniego gazu. W przypadku sprężonego aerozolu jednostkową postać dawkowania można określić stosując zawór podający odmierzoną ilość. Kapsułki i zasobniki np. z żelatyny do zastosowania w inhalatorze lub insuflatorze, można komponować tak, aby zawierały sproszkowaną mieszaninę związku oraz odpowiednią podstawę proszku, taką jak laktoza lub skrobia.
Rozważa się tu także dopłucne dostarczanie oligonukleotydów (lub ich pochodnych). Oligonukleotyd (lub pochodna) dostaje się do płuc ssaka podczas wdychania i przenika przez wyściółkę nabłonka płuc do strumienia krwi. Inne doniesienia o wziewnych cząsteczkach obejmują takie jak: Adjei i in., 1990, Pharmaceutical Research, 7: 565-569; Adjei i in., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (octan leuprolidu); Braquet i in., 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5): 143-146 (endotelina-1); Hubbard i in., 1989, Annals of Internal Medicine, tom III, str. 206-212 (a1-antytrypsyna); Smith i in., 1989, J. Clin. Invest 84: 1145-1146 (a-1-proteaza); Oswein i in., 1990, „Aerosolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzec, (rekombinowany ludzki hormon wzrostu); Debs i in., 1988, J. Immunol. 140: 3482-3488 (interferon-g i czynnik martwicy nowotworów alfa) i Platz i in., opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5284656 (czynnik stymulujący kolonie granulocytów). Sposób i kompozycję dla dopłucnego dostarczania leków dla uzyskania działania ogólnoustrojowego ujawniono w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5451569, opublikowanym 19 września 1995, Wong i in.
W realizacji praktycznej wynalazku rozważa się wiele urządzeń mechanicznych zaprojektowanych do dopłucnego dostarczania produktów terapeutycznych, obejmujących między innymi nebulizatory, inhalatory podające odmierzone dawki, oraz inhalatory proszkowe, przy czym wszystkie one są znane fachowcom w dziedzinie.
Pewne specyficzne przykłady dostępnych w handlu urządzeń odpowiednich do realizacji praktycznej wynalazku obejmują nebulizator Ultravent, produkowany przez Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; nebulizator Acorn II, produkowany przez Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; inhalator podający odmierzone dawki Ventolin, produkowany przez Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i inhalator proszkowy Spinhaler, produkowany przez Fizons Corp., Bedford, Massachusetts.
Wszystkie takie urządzenia wymagają zastosowania preparatów odpowiednich do wydawania oligonukleotydu (lub pochodnej). Typowo, każdy preparat jest specyficzny dla typu stosowanego urządzenia i może się to wiązać ze stosowaniem odpowiedniego propelenta, oprócz typowych ro zcieńczalników, środków wspomagających i/iub nośników przydatnych w leczeniu. Rozważa się także, zastosowanie liposomów, mikrokapsułek lub mikrosfer, kompleksów inkluzyjnych lub innych typów nośników. W różnych preparatach można zastosować chemicznie zmodyfikowany oligonukleotyd, zależnie od typu chemicznej modyfikacji lub typu zastosowanego urządzenia.
Preparaty odpowiednie do zastosowania przy użyciu nebulizatora, dyszowego lub ultradźwiękowego, będą typowo zawierać oligonukleotyd (lub pochodną) rozpuszczoną w wodzie w stężeniu około 0,1 do 25 mg biologicznie czynnego oligonukleotydu na ml roztworu. Preparat może także zawierać bufor i cukier prosty (np. dla stabilizacji oligonukleotydu i regulacji ciśnienia osmotycznego). Preparat do zastosowania z nebulizatorem może także zawierać surfaktant, w celu zmniejszenia lub zapobiegania wywołanej przez powierzchnię agregacji oligonukleotydu, spowodowanej rozpylaniem roztworu podczas powstawania aerozolu.
Preparaty do zastosowania z inhalatorem podającym odmierzoną dawkę będą na ogół zawierać silnie rozdrobniony proszek wraz z oligonukleotydem (lub pochodną) zawieszonym, w propelencie za pomocą surfaktanta. Propelentem może być dowolna typowa substancja stosowana do tego celu, taka jak chlorofluorokarbon, hydrochlorofluorokarbon, hydrofluorokarbon, lub węglowodór, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol, i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, lub ich kombiPL 227 938 B1 nacje. Odpowiednie surfaktanty obejmują trioleinian sorbitolu i lecytynę sojową. Jako surfaktant może być także przydatny kwas oleinowy.
Preparaty do podawania za pomocą inhalatora proszkowego będą zawierać silnie rozdrobniony suchy proszek wraz z oligonukleotydem (lub pochodną) i mogą zawierać także środek pęczniejący, taki jak laktoza, sorbitol, sacharoza, lub mannitol, w ilościach ułatwiających usunięcie proszku z urządzenia, np. 50 do 90% wagowych preparatu. Oligonukleotyd (lub pochodną) należy najlepiej wytwarzać w postaci cząstek o średniej wielkości cząstki poniżej 10 mm (lub w mikronach), zwłaszcza 0,5 do 5 mm, dla najskuteczniejszego dostarczania do dolnych partii płuc.
Rozważa się także donosowe podawanie kompozycji farmaceutycznej tu opisanej. Podawanie donosowe umożliwia przejście kompozycji farmaceutycznej tu opisanej do strumienia krwi bezpośrednio po podaniu produktu terapeutycznego do nosa, bez potrzeby aby produkt zalegał w płucach. Pr eparaty do podawania donosowego obejmują preparaty z dekstranem lub cyklodekstranem.
W przypadku podawania donosowego, przydatnym urządzeniem jest mała, twarda butelka, do której podłączony jest spryskiwacz podający odmierzoną dawkę. W jednym rozwiązaniu, odmierzoną dawkę dostarcza się pobierając roztwór kompozycji farmaceutycznej tu opisanej do komory o określonej objętości, która to komora posiada otwór tak uformowany, aby generować aerozol preparatu produkując spray, gdy ciecz spręża się w komorze. W celu podania kompozycji farmaceutycznej ciecz spręża się w komorze. W specyficznym rozwiązaniu, komora zaopatrzona jest w tłok. Takie urządzenia dostępne są w handlu.
Alternatywnie, stosuje się plastikową butelkę, którą można ścisnąć, z otworem lub ujściem tak uformowanym, aby generować aerozol preparatu uzyskując, po ściśnięciu spray. Ujście znajduje się zazwyczaj na szczycie butelki, a szczyt na ogół ścięty jest częściowo tak, aby pasował do kanałów nosowych, dla efektywnego podawania preparatu aerozolowego. Dogodnie, inhalator donosowy będzie wydawał odmierzoną ilość preparatu aerozolowego zmierzonej dawki leku.
Związki, gdy pożądane jest ich podawanie ogólnoustrojowe, można komponować do podawania pozajelitowego we wstrzyknięciu, np. w iniekcji w jednej dużej dawce lub przez wlew ciągły. Preparaty do iniekcji mogą występować w jednostkowej postaci dawkowania, np. w ampułkach Iub w pojemnikach wielodawkowych, z dodatkiem środka konserwującego. Kompozycje mogą występować w takich postaciach jak zawiesiny, roztwory lub emulsje w nośnikach olejowych lub wodnych, i mogą zawierać środki pomocnicze, takie jak środek zawieszający, stabilizujący i/lub dyspergujący.
Preparaty farmaceutyczne do podawania pozajelitowego obejmują roztwory wodne aktywnych związków w formie rozpuszczalnej w wodzie. Ponadto, zawiesiny aktywnych związków można wytworzyć w postaci odpowiednich zawiesin olejowych do iniekcji. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub nośniki obejmują oleje tłuszczowe, takie jak olej sezamowy, lub syntetyczne estry kwasu tłuszczowego, takie jak oleinian etylu lub triglicerydy, lub liposomy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawi erać substancje zwiększające lepkość zawiesiny, takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, sorbitol, lub dekstran. Ewentualnie, zawiesina może zawierać także odpowiednie stabilizatory lub środki zwiększające rozpuszczalność związków w celu umożliwienia otrzymywania silnie zatężonych roztworów.
Alternatywnie, aktywne związki mogą być w postaci proszku do rozpuszczania przed użyciem w odpowiednim nośniku, np. jałowej pozbawionej pirogenów wodzie.
Związki można także komponować w postaci kompozycji doodbytniczych lub dopochwowych, takich jak czopki lub enemy retencyjne zawierające np. typowe bazy do czopków, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.
Oprócz opisanych uprzednio preparatów, związki można także skomponować w postaci depotu. Takie długo działające preparaty można komponować z odpowiednimi polimerycznymi lub hydrofobowymi substancjami (np. jako emulsję w dopuszczalnym oleju) lub żywicami jonowymiennymi, lub w postaci trudno rozpuszczalnych pochodnych, np. w postaci trudno rozpuszczalnej soli.
Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać także odpowiednie stałe lub żelowe nośniki lub zaróbki. Przykłady takich nośników lub zaróbek obejmują, między innymi węglan wapnia, fosforan wapnia, różne cukry, skrobie, pochodne celulozy, żelatynę, i polimery takie jak glikole polietylenowe.
Odpowiednie ciekłe lub stałe postacie preparatów farmaceutycznych obejmują, np. roztwory wodne lub fizjologiczne roztwory soli do inhalacji, cząstki w mikrokapsułkach, wprowadzone, naniesi one na mikroskopowe cząstki złota, zawarte w liposomach, rozpylane, w aerozolu, peletkach do implantacji pod skórę, lub wysuszone na ostrym przedmiocie do „wdrapania” w skórę. Kompozycje farmaceutyczne obejmują także granulki, proszki, tabletki, tabletki powlekane, (mikro)kapsułki, czopki, syropy, emulsje, zawiesiny, kremy, krople lub preparaty o przedłużonym uwalnianiu aktywnych związków,
PL 227 938 B1 w przypadku których zaróbki i dodatki i/lub środki wspomagające, takie jak substancje dezintegrujące, spoiwa, środki powlekające, środki spęczające, środki poślizgowe, środki aromatyzujące, środki słodzące lub solubilizatory stosuje się zwyczajowo, tak jak to opisano powyżej. Kompozycje farmaceutyczne są odpowiednie do zastosowania w różnych systemach dostarczania leku. Krótki przegląd sposobów dostarczania leku, patrz: Langer, Science 249: 1527-1533, 1990.
Immunostymulujące oligonukleotydy CpG i ewentualnie inne środki terapeutyczne i/lub antyg eny można podawać per se (czyste) lub w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Przy zastos owaniu w medycynie sole powinny być farmaceutycznie dopuszczalne, lecz można dogodnie stosować farmaceutycznie niedopuszczalne sole w celu uzyskania ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Takie sole obejmują między innymi te wytworzone z kwasów takich jak: kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy, maleinowy, octowy, salicylowy, p-toluenosulfonowy, winowy, cytrynowy, metanosulfonowy, mrówkowy, malonowy, bursztynowy, naftaleno-2-sulfonowy i benzenosulfonowy. Dodatkowo, można wytworzyć takie sole jak sole metali alkalicznych lub sole ziem alkalicznych, takie jak sole sodu, potasu lub wapnia kwasu karboksylowego.
Odpowiednie bufory obejmują: kwas octowy i sól (1-2% wag./obj.); kwas cytrynowy i sól (1-3% wag./obj.); kwas borowy i sól (0,5-2,5% wag./obj.); i kwas fosforowy i sól (0,8-2% wag./obj.). Odpowiednie środki konserwujące obejmują chlorek benzalkoniowy (0,003-0,03% wag./obj.); chlorobutanol (0,3-0,9% wag./obj.); parabeny (0,01-0,25% wag./obj.) i timerosal (0,004-0,02% wag./obj.).
Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać immunostymulujący oligonukleotyd CpG w skutecznej ilości oraz ewentualnie antygeny i/iub inne terapeutyczne środki zawarte ewentualnie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
Termin farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oznacza jeden lub więcej kompatybilnych stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji opłaszczających odpowiednich do podawania ludziom lub innym kręgowcom. Termin nośnik oznacza organiczny lub nieorganiczny składnik, naturalny lub syntetyczny, z którym, łączy się aktywny składnik w celu ułatwienia podawania. Składniki kompozycji farmaceutycznych można też mieszać z opisanymi tu związkami, i ze sobą, w taki sposób, że nie występuje oddziaływanie, które w znaczny sposób upośledzałoby pożądaną skuteczność farmaceutyczną.
Wynalazek zilustrowano następnie poniższymi przykładami, których w żaden sposób nie należy rozumieć jako ograniczenie.
Przykłady
Materiały i metody: oligodeoksynukleotydy (ODN)
Wszystkie ODN zakupiono w Biospring (Frankfurt, Niemcy) lub Sigma-Ark (Darmstadt, Niemcy) oraz przebadano kontrolnie ich identyczność i czystość w Coley Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Niemcy). ODN rozcieńczono buforowanym fosforanem roztworem soli (Sigma, Niemcy) i przechow ywano w temperaturze -20°C. Wszystkie rozcieńczenia prowadzono stosując reagenty pozbawione pirogenów.
Oczyszczanie komórek
Preparaty górnej, jaśniejszej warstwy skrzepu zawierającej włóknik i krwinki białe z krwi obwodowej od zdrowych dawców - mężczyzn i kobiet - otrzymano z Banku Krwi z University of Dusseldorf (Niemcy), a z nich wyizolowano PBMC przez odwirowanie z odczynnikiem Ficoll-Hypaque (Sigma). Oczyszczone PBMC albo użyto od razu (w większości testów) albo zawieszono w podłożu do mrożenia i przechowywano w temperaturze -70°C. W razie potrzeby próbki tych komórek odmrażano, przemywano i ponownie zawieszano w podłożu hodowlanym RPMI 1640 (BioWhittaker, Belgium) uzupełnionym 5% (objętościowo) inaktywowaną wysoką temperaturą surowicą ludzką AB (BioWhittaker, Belgia) lub 10% (objętościowo) inaktywowanej wysoka temperaturą FCS, 2 mM L-glutaminy (BioWhittaker), 100 U/ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny (Invitrogen (Karlsruhe, Niemcy)).
Wykrywanie cytokin
Rozmrożone lub świeże PBMC wysiano na 48 dołkowe płaskodenne płytki, lub 96 dołkowe okrągłodenne płytki, i inkubowano z ODN o stężeniach jak wskazano, w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C. Supernatanty z hodowli zebrano i jeśli nie użyto bezpośrednio, zamrożono w temperaturze -20°C aż do momentu użycia. Ilość cytokin w supernatantach oszacowano stosując dostępne w handlu zestawy ELISA (Diaclone, USA) lub zestawy ELISA utworzone na miejscu z zastosowaniem przeciwciał dostępnych na rynku (firmy Becton Dickinson/Pharmingen lub PBL).
PL 227 938 B1
Hodowle do cytometrycznej analizy aktywacji komórek NK
Przeciwciała monoklonalne sprzężone z fluorochromem skierowane przeciw CD3 (marker limfocytów T), CD56 (marker komórek NK) i CD69 (marker wczesnej aktywacji na komórkach NK i limf ocytach T) zakupiono od Becton Dickinson. PBMC inkubowano przez 24 godziny z dodatkiem lub bez ODN w różnych stężeniach w 96 dołkowych okrągłodennych płytkach. Komórki NK identyfikowano jako CD56-pozytywne i CD3-negatywne limfocyty metodą cytometrii przepływowej. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano z zastosowaniem cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson). Dane zanalizowano stosując program komputerowy CellQuest (Becton Dickinson).
Analiza powierzchniowych markerów aktywacji komórek z zastosowaniem cytometrii przepływowej
W celu pomiaru ekspresji cząsteczki kostymulującej CD86 jako markera aktywacji na limfoc ytach B, komórki PBMC inkubowano przez 48 godzin z ODN o stężeniach jak wskazano i komórki barwiono stosując mAb skierowane przeciw CD19 i CD86 (Pharmingen, Niemcy). Ekspresję CD86 na CD19 pozytywnych limfocytach B zmierzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
W celu pomiaru ekspresji cząsteczki kostymulującej CD80 jako markera aktywacji na monoc ytach, komórki PBMC inkubowano przez 48 godzin z ODN o stężeniach jak wskazano i komórki barwiono stosując mAb skierowane przeciw CD14, CD19 i CD80 (Pharmingen, Niemcy). Ekspresję CD80 na CD14-pozytywnych CD19-negatywnych monocytach zmierzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Wyniki obydwu pomiarów podano jako średnią intensywność fluorescencji (MFI).
Przykład 1
Poziomy interferonu alfa (IFN-α), IFN-γ, IL-10, IL-6 i TNF-α wydzielanych przez ludzkie komórki PBMC po ekspozycji tych komórek na opisane tu oligonukleotydy CpG przedstawiono na załączonych fig. 1-5. Badane oligonukleotydy testowe oznaczono na fig. przez ▲. Oligonukleotyd, który służył jako oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną oznaczono jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1A, 2A, 3A, 4A, i 5A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, i SEQ ID NO: 324. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 1B, 2B, 3B, 4B, i 5B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzym ania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM). Pod wykresami dla każdego doświadczenia wyszczególniono poziom cytokiny wydzielonej przez komórki potraktowane negatywną kontrolą (podłożem) i w pewnych przypadkach LPS wyszczególniono dla każdego doświadczenia.
Jak przedstawiono na fig. 1-5 oligonukleotydy badane w testach były zdolne do wywołania sekrecji cytokiny na poziomach w przybliżeniu takich samych lub wyższych niż oligonukleotydy stanowiące kontrolę pozytywną posiadające szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe. Negatywna kontrola wywołała znacznie mniejszą produkcję cytokin.
Przykład 2
Zbadano poziomy ekspresji CD69 (MFI) na komórkach NK w odpowiedzi na traktowanie badanymi oligonukleotydami w porównaniu z kontrolnymi oligonukleotydami. Ekspresja CD69 jest wskaźnikiem aktywacji limfocytów T i komórek NK. Komórki eksponowano na badane oligonukleotydy oznaczone na fig. 6 przez ▲ w porównaniu z potraktowaniem oligonukleotydem będącym kontrolą pozytywną oznaczonym jako . Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6A obejmują SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, i SEQ ID NO: 324. Badane oligonukleotydy przedstawione na fig. 6B obejmują SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 i SEQ ID NO: 328. Oligonukleotydem stanowiącym kontrolę pozytywną zastosowanym do tych badań jest SEQ ID NO: 329. Pod wykresami dla każdego doświa dczenia wyszczególniono poziom ekspresji CD69 na T i komórki NK potraktowanych negatywną kontrolą (pożywka) i LPS.
Jak przedstawiono na fig. 6 oligonukleotydy badane w testach były zdolne do indukcji ekspresji CD69 na poziomie w przybliżeniu takim samym lub wyższym niż oligonukleotydy stanowiące kontrolę pozytywną posiadające szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe. Kontrola negatywna wywołała znacznie mniejszą produkcję CD69.
Przykład 3
Poziomy interferonu alfa (IFN-α) i IL-10 wytwarzane przez ludzkie komórki PBMC po ekspozycji tych komórek na opisane tu oligonukleotydy CpG przedstawiono na załączonych fig. 7-12 i 17. Badane oligonukleotydy testowe oznaczono na fig. przez . Oligonukleotyd, który służył jako oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną SEQ ID NO: 242 oznaczono jako ·. Oligonukleotyd, który służył jako oligonukleotyd będący kontrolą negatywną oznaczono jako ♦ SEQ ID NO: 330. Testowym oligonukleotydem przedstwionym na fig. 7A i 7B jest SEQ ID NO: 313. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 8A i 8B jest SEQ ID NO: 314. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 9A
PL 227 938 B1 i 9B jest SEQ ID NO: 319. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 10A i 10B jest SEQ ID NO: 316. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 12A i 12B jest SEQ ID NO: 317. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 12A i 12B jest SEQ ID NO: 320. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 17A i 17B jest SEQ ID NO: 321. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Jak przedstawiono na fig. 7-12 i 17 każdy z oligonukleotydów badanych w testach był zdolny do wywołania różnych poziomów i wzorów sekrecji cytokin. Na przykład przy zastosowaniu w stężeniach w przybliżeniu równoważnych lub niższych, większość badanych ODN powodowała silniejszą indukcję jednej lub więcej cytokin niż oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną posiadający szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe. Substancja stosowana jako kontrola negatywna wywołała znacznie mniejszą produkcję cytokin.
Po inkubacji z SEQ ID NO: 313 PBMC wydzielają podobne poziomy interferonu alfa (IFNa) i interleukiny 10 (IL-10) jak po inkubacji z SEQ ID NO: 242. SEQ ID NO: 314 ma podobny wpływ na ilość IL-10 wydzielanej przez ludzkie komórki PBMC jak SEQ ID NO: 242, podczas gdy sekrecja IFNa znacznie wzrasta. W przeciwieństwie do SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 319 indukuje sekrecję IFNa przez ludzkie komórki PBMC tylko na niskich poziomach, podczas gdy ilość wydzielanej IL-10 dla tych dwóch oligonukleotydów jest porównywalna. SEQ ID NO: 316 był zdolny do spowodowania wydzielania kilkakrotnie większych poziomów IFNa przez ludzkie komórki PBMC niż SEQ ID NO: 242. Zaobserwowano także zwiększenie całkowitej ilości wydzielanej IL-10. SEQ ID NO: 317 wykazuje podobne właściwości do SEQ ID NO: 316, przy silnie zwiększonej sekrecji IFNa przez ludzkie komórki PBMC w porównaniu z SEQ ID NO: 242. Poziomy sekrecji IL-10 były nieznacznie podwyższone. Chociaż SEQ ID NO: 320 powodowało indukcję produkcji IFNa i IL-10 przez ludzkie PBMC, indukcja była mniejsza niż spowodowana przez SEQ ID NO: 242. SEQ ID NO: 321 ma zdolność do indukowania produkcji ponad dziesięciokrotnie większych poziomów IFNa przez ludzkie komórki PBMC niż SEQ ID NO: 242 (fig. 17A) . W porównaniu z SEQ ID NO: 242, sekrecja IL-10 przez ludzkie komórki PBMC wywołana przez SEQ ID NO: 321 jest nieznacznie zwiększona przy zastosowaniu większych stężeń tego oligonukleotydu (fig. 17B).
Przykład 4
Poziomy aktywacji limfocytów B i monocytów następującej w wyniku ekspozycji tych komórek na opisane tu oligonukleotydy CpG przedstawiono na załączonych fig. 13-15, 16 i 18-20. Badane oligonukleotydy testowe oznaczono na fig. jako . Oligonukleotyd służący jako oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną SEQ ID NO: 242 oznaczono jako ·. Oligonukleotyd służący jako oligonukleotyd będący negatywną kontrolą oznaczono jako ♦ SEQ ID NO: 330. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 13A i 13B jest SEQ ID NO: 313. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 14A i 14B jest SEQ ID NO: 314. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 15A i 15B jest SEQ ID NO: 319. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 16A i 16B jest SEQ ID NO: 316. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 18A i 18B jest SEQ ID NO: 321. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 19A i 19B jest SEQ ID NO: 317. Testowym oligonukleotydem przedstawionym na fig. 20A i 20B jest SEQ ID NO: 320. Stężenie oligonukleotydu zastosowane do otrzymania określonego punktu na wykresie umieszczono wzdłuż osi X (pM).
Jak przedstawiono na fig. 13-15, 16 i 18-20 każdy z oligonukleotydów badanych w testach był zdolny do spowodowania różnych poziomów i wzorów ekspresji markerów powierzchniowych na k omórkach. Na przykład przy zastosowaniu w stężeniach w przybliżeniu równoważnych lub niższych, większość badanych ODN powodowała silniejszą indukcję ekspresji markerów powierzchniowych na komórce niż oligonukleotyd stanowiący kontrolę pozytywną posiadający szkielet zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe.
Poziom ekspresji CD86 na limfocytach B i ekspresji CD80 na monocytach wywołany przez SEQ ID NO: 313 jest porównywalny z poziomem wywołanym przez SEQ ID NO: 242. W przeciwieństwie do SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 313 stymuluje komórki przy zastosowaniu w niższych stężeniach w porównaniu z SEQ ID NO: 242 co sugeruje zwiększoną moc. Poziomy ekspresji CD86 na limfoc ytach B i ekspresji CD80 na monocytach wywołane przez SEQ ID NO: 314 są porównywalne. Efekty działania SEQ ID NO: 314 obserwowuje się stosując SEQ ID NO: 314 w niższych stężeniach w porównaniu z SEQ ID NO: 242, wskazując na zwiększoną moc SEQ ID NO: 314. Na limfocytach B, powierzchniowa ekspresja CD86 jest silnie aktywowana przez SEQ ID NO: 319, przy sile sygnału porównywalnej z SEQ ID NO: 242. Stosując SEQ ID NO: 319 można wykryć jedynie nieznacznie podwyższone poziomy ekspresji CD86 na monocytach. Zdolność SEQ ID NO: 319 do indukowania
PL 227 938 B1 aktywacji ekspresji CD86 na limfocytach B jest nieznacznie zmniejszona w porównaniu z SEQ ID NO: 242. W porównaniu z SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 316 indukuje większą ekspresję markera aktywacji CD86 na limfocytach B (fig. 16A) i markera aktywacji CD80 na monocytach (fig. 16B). Limfocyty B są silnie aktywowane po inkubacji ludzkich komórek PBMC z SEQ ID NO: 321 jak udowodniono na podstawie ekspresji CD86 (fig. 18A). Ekspresja CD86 jest większa niż wywołana przez SEQ ID NO: 242. Także aktywacja monocytów, co określono na podstawie ekspresji CD80, jest większa przy zastosowaniu SEQ ID NO: 321 niż przy zastosowaniu SEQ ID NO: 242 (fig. 18B). SEQ ID NO: 317 indukuje ekspresję CD86 na limfocytach B porównywalną jak SEQ ID NO: 242 (fig. 19A), podczas gdy ekspresja markera aktywacji CD80 na monocytach jest zwiększona w porównaniu z ekspresją po SEQ ID NO: 242 (fig. 19B). SEQ ID NO: 320 indukuje ekspresję CD86 na limfocytach B w podobnym stopniu co SEQ ID NO: 2426 (fig. 20A).
P rz yk ła d 5 . Semi-miękkie oligonukleotydy mają działanie immunostymulujące na ludzkie komórki PBMC in vitro.
W tym przykładzie semi-miękkie oligonukleotydy badano pod kątem ich zdolności do indukowania produkcji cytokin i chemokin in vitro. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) otrzymano od trzech zdrowych osób i hodowano w obecności całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu CpG SEQ ID NO: 242 lub semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241 w różnych stężeniach (0,05, 0,1,0,2, 0,5, 1,0, i 5,0 pM). Po 6, 16, lub 48 godzinach, supernatanty znad hodowli zebrano i zmierzono ilość różnych cytokin (IFN-α, TNF-α, IL-10) i chemokiny IP-10 w supernatantach metodą ELISA. Przy zastosowaniu oligonukleotydu w niskich stężeniach, semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy indukowały produkcję IFN-α w podobnym stopniu po 16 lub 48 godzinach w hodowli. Jednakże maksymalną indukcję produkcji IFN-α z zastosowaniem ODN 5476 osiągnięto stosując oligonukleotyd w stężeniu około o połowę miejszym niż wymagane dla SEQ ID NO: 242. Przy zastosowaniu w pośrednich stężeniach, SEQ ID NO: 242 indukuje większą produkcję IFN-α niż SEQ ID NO: 241, a przy zastosowaniu w wysokich stężeniach, ani SEQ ID NO: 242 ani SEQ ID NO: 241 nie indukuje dużej produkcji IFN-α. Produkcja chemokiny IP-10 była stymulowana przez semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy w podobnym stopniu i z podobną zależnością od stężenia. W obu przypadkach, zaobserwowano produkcję około 700 pg/ml IP-10 przy zastosowaniu oligonukleotydu w niższych stężeniach, i mniejszą produkcję IP-10 wywołaną przy zastosowaniu oligonukleotydu w większych stężeniach. Podobne wzory zachowania do wzorów zachowania dla IP-10 zaobserwowano dla cytokiny IL-10, z tym wyjątkiem, że semi-miękki oligonukleotyd w stężeniu 0,05 μΜ wywoływał produkcję znaczących ilości IL-10, podczas gdy całkowicie stabilizowany oligonukleotyd w stężeniu 0,05 μM wywoływał niewielką produkcję IL-10 lub nie powodował jej wcale. Semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy miały podobną zdolność do indukowania produkcji TNF-α, tj. oba typy oligonukleotydów silnie indukowały produkcję TNF-α, szczególnie w dużym stężeniu.
Tabela 1. Cytokiny i chemokina (pg/ml)1, których produkcję indukowały oligonukleotydy ^M)
ODN 0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0
IFN-a SEQ ID 534,8 466,0 251,6 25,4 22,9 26,7
NO: 241 (3,5) (7,5) (22,9) (21,4) (26,3) (22,1)
SEQ ID 444,0 573,6 892,4 583,6 115,6 51,5
NO: 242 (23,9) (41,7) (58,0) (51,5) (2,5) (12,8)
IP-10 SEQ ID 5677,8 6221,5 4936,6 1493,6 121,9 0,0
NO: 241 (18,9) (22,4) (11,8) (5,5) (0,4) (0,0)
SEQ ID 7287,4 6685,8 6967,4 4422,7 361,7 0,0
NO: 242 (5,5) (12,8) (15,9) (11,0) (2,6) (0,0)
PL 227 938 Β1 cd. tabeli 1
IL-10 SEQ ID 447,6 —-- 385,3 257,3 92,9 46,5 17,3
NO : 241 (3,7) (4,9) (3,1) (1,6) (0,2) (1,5)
SEQ ID 73,4. 399,8 367,7 237,8 52,3 10,5
NO: 242 (1,0) (3,0) (9,8) (2,6) (1,3) (0,3)
TNF-(X SEQ ID 179,0 186,4 229,9 178,8 368,2 886,3
NO: 241 (18,3) (15,9) (23,4) (9,0) (22,3) (31,7)
SEQ ID 196,8 211,5 242,7 262,1 479,8 939,6
NO: 242 (25,9) (8,7) (5,5) (6,3) (33,5) (69,7)
1Wartości przedstawione jako średnia (odchylenie standardowe).
Przykład 6. Stymulacja makrofagów myszowatych in vitro przez semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 w porównaniu z całkowicie stabilizowanym ODN.
Linię makrofagów myszowatych (RAW264) inkubowano przez 16 godzin z semi-miękkim oligonukleotydem SEQ ID NO: 241, całkowicie stabilizowanym oligonukleotydem SEQ ID NO: 242, całkowicie stabilizowanym ODN 1826, lipopolisacharydem (LPS) lub PBS. Działanie semi-miękkiego i całkowicie stabilizowanego ODN badano w stężeniach 0,02, 0,05, i 0,1 μΜ. Supernatanty zebrano i metodą ELISA zmierzono ilość podjednostki p40 IL-12 (IL-12 40, pg/ml). Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Semi-miekki oligonukleotyd SEQ TD NO: 241 znacznie silniej indukował makrofagi do wydzielania IL-12p40 niż oba całkowicie stabilizowane ODN.
Tabela 2. Sekrecja IL-12p40 przez makrofagi myszowatych stymulowana przez semi-miękki oligonukleotyd SEOIDNO: 241
ODN Stężenie ODN (μΜ) IL-12p40,pg/ml średnia (S.D.)
SEQ ID NO: 0,02 148,8 (37,5)
241 0,05 149,8 (28,7)
0,1 162,3 (8,4)
SEQ ID NO: 0,02 41,4 (18,6)
242 0,05 42,0 (26,2)
0,1 23,0 (10,7)
SEQ ID NO: 0,02 43,5 (23,0)
3 86 0,05 38,3 (19,2)
0,1 54,4(4,1)
LPS _ 346,5 (20,5)
PBS 32,0 (12,1)
PL 227 938 B1
Przykład 7. Semi-miękkie oligonukleotydy klasy B o sekwencji zoptymalizowanej do stymulacji ludzkich komórek układu odpornościowego są silnymi immunostymulatorami komórek układu odpornościowego myszowatych.
Stwierdzono, że komórki układu odpornościowego ludzkiego i myszowatych reagują na różne ODN CpG. Całkowicie stabilizowany oligonukleotyd CpG SEQ ID NO: 242 uznano za „optymalny” do stymulacji ludzkich komórek układu odpornościowego, lecz nie uznano za „optymalny” do stymulacji komórek układu odpornościowego myszowatych. Odwrotnie, całkowicie stabilizowane ODN CpG 5890 (5'T*C*A*A*C*G*T*T3') uznano za „optymalny” do stymulacji komórek układu odpornościowego m yszowatych, lecz nie uznano za „optymalny” do stymulacji ludzkich komórek układu odpornościowego. Stwierdzono, że zarówno limfocyty B ludzkie, jak i limfocyty B myszowatych eksprymują TLR9. Eksprymujące TLR9 splenocyty myszowatych HEK293 hodowano w obecności całkowicie stabilizowan ego oligonukleotydu CpG SEQ ID NO: 242 w różnych stężeniach, całkowicie stabilizowanego ODN CpG 5890, lub semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, a aktywację TLR9 zmierzono jak następuje. Komórki stosowane do tego testu eksprymowały myszowatych TLR9 i zawierały konstrukt genu reporterowego. Komórki inkubowano z ODN przez 16 godzin w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze. Wszystkie badania przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Komórki zlizowano i oznaczono aktywność genu reporterowego. Obliczono indeksy stymulacji w odniesieniu do aktywności genu reporterowego w podłożu bez dodatku ODN. Semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 i całkowicie stabilizowany oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 posiadały identyczną sekwencję zasad. Wyniki przedstawiono w tabeli 3. SEQ ID NO: 241 i SEQ ID NO: 242 w najniższych stężeniach wykazywały minimalne działanie immunostymulujące. Jednakże, gdy stężenie zwiększono do 14 nM i więcej, SEQ ID NO: 241 miał wyraźnie większe działanie immunostymulujące niż SEQ ID NO: 242. W największym stężeniu badanym w tym doświadczeniu, SEQ ID NO: 241 działał co najmniej równie stymulująco jak zoptymalizowany dla myszowatych, całkowicie stabilizowany oligonukleotyd ODN 5890.
Tabela 3. Stopień stymulacji komórek HEK293 myszowatych eksprymujących TLR9 przez semi-miękki ODN o sekwencji zoptymalizowanej dla komórek ludzkich
Stężenie ODN
5890 SEQ ID NO: 241 SEQ ID NO: 242
0,9 nM 1,4 0,7 0,9
3,5 nM 2,4 1,1 1,2
14 nM 12,5 1,9 1,1
58 nM 21,4 4,3 2,0
0,23 μΜ 25,2 12,0 6,2
0,94 μΜ 28,6 18,3 8,0
3,75 μΜ 29,3 32,1 10,3
Przykład 8-9. Semi-miękkie oligonukleotydy indukują aktywację komórek NK.
Semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy porównano także pod kątem ich zdolności do stymulacji aktywacji komórek NK. Stosując standardowy test uwalniania chromu, 10x106 komórek śledziony myszy BALB/c hodowano przez 48 godzin w 2 ml RPMI uzupełnionego 10% FBS (inaktywowaną wysoką temperaturą do 65°C przez 30 minut), 50 pM 2-tioetanolu, 100 U/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny, i 2 mM L-glutaminianu, z dodatkiem lub bez albo semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241 albo całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, każdego z ODN dodając do końcowego stężenia 1, 3, lub 10 pg/ml. Komórki przemyto i następnie zastowowano jako komórki efektorowe w krótkoterminowym teście uwalniania Cr z zastosowaniem
PL 227 938 B1
YAC-1 i 2C11, dwie docelowe linie komórkowe wrażliwe na NK (Ballas ZK i in. (1993) J Immunol 150: 17-30). Komórki efektorowe dodano w różnych stężeniach do 10 Cr-znakowanych komórek docelowych w V-dennych płytkach do mikromiareczkowania w 0,2 ml, i inkubowano w 5% CO2 przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Badane proporcje komórki efektorowe:komórki docelowe (E:T) wynosiły 6,25:1, 25:1,50:1, i 100:1. Zawartość płytek następnie wirowano i w próbce supernatantu zmierzono radioaktywność. Procent specyficznej Iizy określono przez obliczenie stosunku Cr uwalnianego w obecności komórek efektorowych minus ilość 51Cr uwalnianego, gdy komórki docelowe hodowano same, do całkowitej liczby uwalnianego po lizie komórek w 2% kwasie octowym (100 procent lizy) minus wartość Cr cpm, gdy komórki hodowano same. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 5. Podsumowując, semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 i całkowicie stabilizowany oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 indukowały w istocie porównywalne poziomy aktywacji komórek NK dla wszystkich bad anych stężeń ODN i proporcji E:T.
Tabela 5. Specyficzna Iiza za pośrednictwem komórek NK
ODN pg/ml stosunek E:T
6,25:1 25 :1 50:1 100 : 1
SEQ ID NO: 241 1 8 17 17,5 27,5
3 2,5 5 8 15
10 4 12,5 20 28
SEQ ID NO: 242 1 7 8 12,5 22
3 3,5 4 11 18
10 5 12,5 23 32,5
Przykład 1 0. Semi-miękkie oligonukleotydy mają na ogół silniejsze działanie immunostym ulujące niż oligonukleotydy zawierające tylko wiązania tiofosforanowe o takiej samej lub podobnej s ekwencji.
Wszystkie badane semi-miękkie wersje były bardziej aktywne w teście z zastosowaniem ludzkiego TLR9 niż odpowiednie cząsteczki zawierające tylko wiązania tiofosforanowe (tabela 6). Średni stopień stymulacji obliczono na podstawie danych prób dla czterech stężeń (0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, i 8 pM). W tabeli U oznacza 2'-deoksyuracyl.
Tabela 6. Względne średnie indeksy stymulacji semi-miękkimi oligonukleotydami w porównaniu z oligonukleotydami zawierającymi tylko wiązania tiofosforanowe o takiej samej lub podobnej sekwencji
Sekwencja Względny średni indeks stymulacji
T*C*g*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO:247) 1.00
T*c*G*C*C*G*T*T*T*T*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:248) 0.74
T*C*G*C*C*G*T*T*T*T*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:249) 0.72
PL 227 938 B1 cd. tabeli 6
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*Cj3*G*C_G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:250) 1.37
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:251) 1.25
T*CJ3*C*CJ3*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:252) 2.99
T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO:253) 2.22
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO:254) 3.46
T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO:255) 4.08
T*C_G*T.*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*'C*C*G (SEQ ID NO: 256) 5.69
Τ*0 6*Τ*0 0*Τ*Τ·*Τ*Τ*0 σ*σ*0 0*β*0*0 0*0*0*0 (SEQ ID NO:257) 4.49
T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ id NO:244) 1.00
t*g*t*c g*t*t*g*t*c g*t*t*g*t*c g*t*t*g*t*c G*T*T (SEQ id NO:258) “ 4.23
T*G*T*C^G*T*T*G*T*C g*T*T G*T*C G*T*T G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:243) 4.74
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:259) 1.00
T*C G*T*C G*T*T*T*C G*T*C G*T*T*T*T*G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:260) 1.80
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*A*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:261) 1.00
T*C G*T*C G*T*T*T*C G*A*C G*T*T*T*T*G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:262) 2.71
T*C G*T*C G*T*T*T*T G*A*C G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO.-263) 3.01
T*CJ3*T*CJ3*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:264) 3.06
T*C G*T*C G*T*T*T*T G*A*C G*T*T*T*T (SEQ ID NO:265) 2.06
T*C G*T*C G*T*T*T*T G*A*C G*T*T (SEQ ID NO:266) 1.43
T*C G*T*C G*T*T*T*C G*A*C*G*T*T (SEQ ID NO:267) 0.91
G*T*T*C*T*C*G*C*T*G*G*T*G*A*G*T*T*T*C*A (SEQ ID NO:268) 1.00
G*T*T*C*T*C G*C*T G*G*T G*A*G*T*T*T*C*A (SEQ ID NO:269) 3.45
T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:270) 1.00
T*C G*T*C G*T*T*T*C G*T*C G*T*T*T*C G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:271) 2.49
T*C G*T*C G*T*T*T*U G*T*C G*T*T*T*T G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:272) . 2.51
T*C*G*T*C*G*T*T*T*U*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID 1.00
NO:273)
T*C G*T*C G*T*T*T*U G*T*C G*T*T*T*T G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:274) 2.62
PL 227 938 Β1 cd. tabeli 6
T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID 1.00
NO:242)
T*C G*T*C G*T*T*T*T G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C g*t*t (SEQ id NÓ:276) 1.95
T*c*G*U*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*U*G*U*C*G*T*T (SEQ ID 1.00
NO:277)
T*c G*U*C G*T*T*T*T G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C G*T*T (SEQ ID NO:278) 1.39
T*C*G*T*C*G*U*U*U*T*G*T*C*G*U*U*U*U*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:279) 1.00
T*C G*T*C_G*U*U*U*C G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:2 8 0) 2.05
A*&*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:281) 1.00
A*A*C G*T*C G*T*T*T*T*C G*T*C G*T*T (SEQ ID NO:282) 1.58
Przykład 1 1 . Zwiększona in vitro moc semi-miękkich wersji całkowicie stabilizowanych oligonukleotydów o słabym działaniu immunostymulującym /T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T
SEQ ID NO: 244) jest całkowicie stabilizowanym, zawierającym tylko wiązania tiofosforanowe oligonukleotydem CpG o małej mocy immunostymulującej w porównaniu z SEQ ID NO: 242.
Pokrewne semi-miękkie oligonukleotydy (T*G*T*C g*T*T*G*T*C g*T*T*G*T*C G*T*T*G*T*C g*T*T — „— f
SEQ ID NO: 258) i (T*G*T*C g*t*t*g*t*c g*t*t g*t*c g*t*t g*t*c g*t*t
SEQ ID NO: 243) miały wielokrotnie większą moc niż SEQ ID NO: 244 i nawet większą moc niż SEQ ID NO: 242.
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*4'*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:258)
T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T!,:C_G*T*T (SEQ id NO:243) T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T*G*T*C*G*T*T (§Eq iD NO:244)
PL 227 938 Β1
Tabela 7. Zwiększona stymulacja układu odpornościowego przez semi-miękkie warianty całkowicie stabilizowanego lecz słabo immunostymulującego oligonukleotydu
ODN Stężenie ODN, μΜ
0,1 0,5 2 8
SEQ ID NO: 244 16,0 47,5 71,4 68,5
SEQ ID NO: 243 19,3 40,5 78,2 77,9
SEQ ID NO: 241 2,6 9,5 12,9 14,0
SEQ ID NO: 242 10,6 34,2 38,3 40,8
Przykład 1 2 . Skrócone semi-miękkie oligonukleotydy wykazują działanie immunostymulujące in vitro.
Semi-miękki 16-mer, SEQ ID NO: 283, 16-mer, SEQ ID NO: 245, 17-mer, SEQ ID NO: 284, i 24-mer, SEQ ID NO: 241 porównano z całkowicie stabilizowanym 24-merem ODN, SEQ ID NO: 242, i 18-merem, SEQ ID NO: 285, pod kątem ich zdolności do stymulacji sygnalizacji TLR9. Każdy oligonukleotyd dodano do komórek HEK293 transfekowanych ludzkim TLR9 i konstruktem genu reporterowego w stężeniu 1,6, 12, lub 24 pg/ml i zmierzono aktywację TLR9 jak opisano powyżej.
(16-mer) T*C._G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO:283) (16-mer) T*CJ3*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:245) (17-mer) T:i:C CDT*C_G+l*'['+E*T*C_G*T*C_G;’:T*T (SEQ ID NO:284) (18-mer) A*A*C*G*T*C*G*T*TiiT*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:285) (24-mer)T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO:241) (24-mer)T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO:242)
Podczas gdy 18-merowy całkowicie stabilizowany oligonukleotyd ODN SEQ ID NO: 285 miał słabsze działanie immunostymulujące niż 24-merowy całkowicie stabilizowany oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 we wszystkich badanych stężeniach, 16-merowe i 17-merowe semi-miękkie oligonukleotydy były co najmniej tak stymulujące jak 24-mer SEQ ID NO: 242 w stężeniach 6 pg/ml i wyższych. Ponadto, 16-merowe i 17-merowe semi-miękkie oligonukleotydy miały działanie prawie tak immunostymulujące jak 24-merowy semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241.
PL 227 938 B1
Tabela 8. Immunostymulacyjna aktywność krótkich semi-miękkich oligonukleotydów w porównaniu z krótkimi i długimi całkowicie stabilizowanymi i semi-miękkimi oligonukleotydami
ODN Stężenie ODN, pg/ml
1 6 12 24
SEQ ID NO: 283 1,2 17,1 29,0 39,5
SEQ ID NO: 245 1,1 8,4 31,3 48,9
SEQ ID NO: 284 3,4 23,9 35,9 45,6
SEQ ID NO: 285 4,6 12,9 15,9 18,0
SEQ ID NO: 241 6,4 33,0 50,8 58,6
SEQ ID NO: 242 11,0 24,6 26,2 21,9
Przykład 1 3 . Semi-miękkie oligonukleotydy mają działanie immunostymulujące in vivo.
Myszy BALB/c podzielono na grupy i podawano im podskórnie 400 pg semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, całkowicie stabilizowanego immunostymulującego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu będącego negatywną kontrolą (TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT, SEQ ID NO: 286), lub równoważną objętość fizjologicznego roztworu soli b uforowanego fosforanem (PBS). Zwierzęta skrwawiono 3 godziny po wstrzyknięciu i określono osoczowe poziomy IP-10, IFN-γ i TNF-α stosując odpowiedni cytokinospecyficzny test ELISA. Poziom IP-10 w osoczu był około dwukrotnie wyższy u zwierząt otrzymujących semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 (8000-12000 pg/ml) niż u otrzymujących całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 (3500-8000 pg/ml). Poziom IP-10 w osoczu u zwierząt otrzymujących kontrolny oligonukleotyd SEQ ID NO: 286 był równie niski jak poziom IP-10 u zwierząt otrzymujących PBS. Semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 i całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 indukowały podobne ilości IFN-γ, około 150 pg/ml. Semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 indukował 30-45 procent więcej TNF-α niż całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 (około 1550 pg/ml) w porównaniu z około 1175 pg/ml w jednym doświadczeniu i około 710 pg/ml w porównaniu z 490 pg/ml w innym doświadczeniu.
W innym zestawie doświadczeń in vivo, semi-miękkie i całkowicie stabilizowane oligonukleotydy badano pod kątem ich zdolności do leczenia nowotworów u myszy BALB/c. Trzy grupy myszy BALB/c nastrzykiwano dootrzewnowo komórkami gruczolakoraka nerek myszowatych pochodzenia samorzutnego (Renca), stosując ustalony model nowotworowy. Salup RR i in. (1985) J Immunopharmacol 7: 417-36. Każda grupa myszy otrzymała także albo 100 mg semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, albo 100 mg całkowicie stabilizowanego immunostymulującego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242, albo równoważną objętość PBS. Myszy obserwowano pod kątem przeżywalności i pod kątem wymiaru guza w momencie śmierci. U myszy o pozornej terapii z zastosowaniem PBS średnia przeżywalność wynosiła 44 dni, a w ciągu 50 dni przeżywaność wynosiła 20 procent. Dla odmiany przeżywalność myszy otrzymujących semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 wynosiła 80 procent w ciągu 50 dni, a myszy otrzymujących całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 wynosiła 70 procent w ciągu 50 dni. W przeliczeniu na wielkość guza (milimetry sześcienne) po 52 dniach u myszy otrzymujących PBS objętości guzów wynosiły prawie 1200 mm3, podczas gdy u myszy otrzymujących semi-miękki oligonukleotyd SEQ ID NO: 241 lub całkowicie stabilizowany immunostymulujący oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 guzy miały objętość odpowiednio około
250 mm3 i 180 mm3. Zatem zarówno semi-miękki oligonukleotyd, jak i całkowicie stabilizowany oligonukleotyd były wysoce efektywne w zmniejszaniu obciążenia nowotworem i wydłużaniu przeżywalności w tym modelu doświadczalnym.
PL 227 938 Β1
Przykład 14. Miękkie lub semi-miękkie oligonukleotydy wykazują zmniejszoną nefrotoksyczność.
Obserwuje się, że podawanie małpom całkowicie stabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów może być związane z rozwojem zapalenia kłębuszków nerkowych, tj. zapalenia nerki. Zapalenie kłębuszków nerkowych można diagnozować i monitorować na podstawie obecności czerwonych krwinek i białka w moczu, czemu często towarzyszy zmniejszona szybkość przesączania kłębuszkowego (z azotemią), retencja soli i wody, nadciśnienie oraz obrzęk. W warunkach prawidłowych, w moczu zasadniczo nie występują komórki krwi i białka osocza. Diagnozę można także postawić na podstawie histologicznego badania tkanki nerki. Wiadomo, że tkanka nerki jest bogata w nukleazy, które powinny być bardziej aktywne w stosunku do miękkich oligonukleotydów niż w stosunku do całkowicie stabilizowanych immunostymulujących oligonukleotydów.
Małpy dzieli się na dwie grupy, jednej podaje się miękkie oligonukleotydy, a drugiej całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy. Miękkie oligonukleotydy i całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy mają identyczne sekwencje i różnią się jedynie wiązaniami internukleotydowymi. Obie grupy małp otrzymują immunostymulujący oligonukleotyd w takiej samej dawce. Przed potraktowaniem (linia odniesienia) i okresowo podczas traktowania wykonuje się pomiary co najmniej jednego parametru przydatnego do oceny występowania zapalenia kłębuszków nerkowych, obejmujące, np. analizę moczu za pomocą paska pod kątem białkomoczu i/lub krwiomoczu, mikroskopową analizę moczu na obecność czerwonych krwinek i/lub wałeczków erytrocytarnych, pomiar stężenia białka w moczu, pomiar azotu mocznikowego we krwi (BUN), kreatyniny w osoczu, ciśnienia krwi, pomiar masy ciała i biopsję nerki z analizą tkanki z zastosowaniem mikroskopu świetlnego i/lub elektronowego. Wyniki badań klinicznych zestawia się z typem immunostymulującego oligonukleotydu podawanego każdej małpie i porównuje się wyniki pomiędzy grupami w celu określenia istotności statystycznej.
Ewentualnie, dodatkowo sparowane grupy małp, którym podaje się albo miękkie lub semi-miękkie oligonukleotydy lub całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy jak powyżej, lecz z zastosowaniem oligonukleotydu w większej lub mniejszej dawce (dawkach), dołącza się następnie w celu oceny wyników jako funkcji dawki oligonukleotydu.
U małp otrzymujących miękkie oligonukleotydy występuje znacznie mniejsza skłonność do rozwoju zapalenia kłębuszków nerkowych niż u małp otrzymujących całkowicie stabilizowane immunostymulujące oligonukleotydy.
Przykład 1 5. Miękkie oligonukleotydy w dużym stężeniu wykazują zwiększoną moc immunostymulującą.
Miękkie oligonukleotydy porównano z SEQ ID NO: 242 pod kątem ich zdolności do indukowania aktywności TLR9. Miękkie ODN i kontrolny oligonukleotyd SEQ ID NO: 242 porównano w każdym z czterech stężeń, 1 pg/ml, 6 pg/ml, 12 pg/ml, i 24 pg/ml. Stosunki aktywacji w każdym stężeniu przez każdy miękki oligonukleotyd w porównaniu z aktywacją przez SEQ ID NO: 242 przedstawiono poniżej w tabeli 9. Wyniki te wskazują, że miękkie oligonukleotydy mają silniejsze działanie immunostymulujące niż SEQ ID NO: 242 w badanych wyższych stężeniach.
T*G*T*C_G_T*T*G*T*C_G_T*T*G*T*C_G_T*T*Gjr*C_G*T*T
TM:C G*T*C G*T*T*T*T*T*C G G*T*C G p*p*p*p
T*C„G_T*C_G_T*T*T*T*T*C_G_T*G*C_G_T*T+T*T*T T*C G T*C G ρ*ρ*ρ*ρ*(3 G p*p*p*p*p*p*p*c G+p+p+p
T*C G p*p*p*p*G*T*C G p*p*p*p*p*p*p*c G*A p*C_G_T*C__G_T*T*T*T_G_T*C_G_T*T*T!*!T_G*T_C_G*T*T
SEQ ID NO:287 SEQIDNO:288 SEQ ID NO:289 SEQ ID NO;290 SEQ ID NO:291 SEQ ID NO:292 SEQ ID NO:293
PL 227 938 Β1
Tabela 9. Względna moc miękkich oligonukleotydów w porównaniu z SEQ ID NO: 242 w każdym ze stężeń
ID Stężenie ODN, pg/ml
1 6 12 24
SEQ ID NO: 287 0,11 0,12 1,00 1,68
SEQ ID NO: 288 0,30 0,62 1,67 1,81
SEQ ID NO: 289 0,13 0,52 1,67 1,97
SEQ ID NO: 290 0,18 0,41 1,69 2,27
SEQ ID NO: 291 0,16 0,35 1,56 1,81
SEQ ID NO: 292 0,25 0,48 1,38 1,84
SEQ ID NO: 293 0,10 0,11 1,20 2,05
Przykład 16. Trwałość oligonukleotydu w osoczu i w tkankach.
Myszy nastrzykiwano podskórnie stosując 25 mg/kg semi-miękkiego oligonukleotydu SEQ ID NO: 241, miękkiego oligonukleotydu ęI*c*G*T*c*G*T*T*T*T_Q^T^c_G T*T*T*T*G*T*c*G*'r*T; SEQ ID NO:294) t lub całkowicie stabilizowanego oligonukleotydu SEQ ID NO: 242. Po upływie określonej liczby godzin pobrano próbki tkanki i osocza i zanalizowano je na obecność nienaruszonych oligonukleotydów i ich fragmentów.
Próbki tkanki lub osocza nastrzyknięto znaną ilością ODN będącego wewnętrznym standardem (1,25 pg poliT) i ODN wydzielono z próbek tkanki i osocza przez ekstrakcję w fazie stałej (SPE) sposobem opisanym poniżej. Uzyskane roztwory zawierające analit, metabolity, i wewnętrzny standard zanalizowano metodami żelowej elektroforezy kapilarnej (CGE) i MALDI-TOF także opisanymi poniżej. Całkowite ilości odzyskanego ODN (tj. analit plus metabolity) próbek z nerki, wątroby, śledziony i osocza określono przez zanalizowanie CGE. Obliczono odchylenie standardowe. Każdemu metabolitowi przypisano względną ilość w procentach całkowitej powierzchni piku.
SPE. W celu oddzielania ODN od osocza, 100 pg próbki nastrzyknięto 1,25 pg ODN będącego wewnętrznym standardem, wymieszano i rozpuszczono w 5 ml buforu SAX. Ten roztwór wprowadzono na kolumnę anionowymienną (SAX, Agilent), kolumnę przemyto i ODN eluowano stosując bufor o wzrastającej sile jonowej. Uzyskany eluat odsolono, stosując kolumnę w układzie faz odwróconych (RP) (Glen Research) lub porównywalną kolumnę (HLB, Waters). Eluaty z kolumny RP, zawierające tylko wodę i acetonitryl osuszono i rozpuszczono w tej samej probówce w 60 pl wody dejonizowanej. W celu dalszego odsolenia próbki przeprowadzono dializę z zastosowaniem błony dializującej. Próbki zanalizowano bezpośrednio metodą żelowej elektroforezy kapilarnej. Do MALDI-TOF MS, stosowano próbki nierozcieńczone albo zatężone, tj. 50 pl próbki ODN osuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie dejonizowanej i oznaczono jak opisano poniżej.
ODN z tkanki wydzielono według podobnego protokołu SPE. 100 mg tkanki zhomogenizowano stosując urządzenie FastPrep. Dodano proteazę K i przez 2 godziny hydrolizowano białka. Ekstrakcję z zastosowaniem fenolu przeprowadzono przed poddaniem rozpuszczalnej w wodzie frakcji opisanej powyżej procedurze SPE.
CGE. Odsolone próbki zawierające analit, jego metabolity i określoną ilość ODN będącego wewnętrznym standardem elektrokinetycznie wprowadzono do wypełnionej żelem kapilary (obojętna, 30 cm, kapilara DNA eCAP, Beckman # 477477) po stronie dla próbki z uprzednim nastrzyknięciem wody. Przyłożono napięcie 300 V/cm przy jednoczesnym monitorowaniu wykrywania przy 260 nm. Rozdzielanie prowadzono w temperaturze 25°C w buforze Tris/kwas borowy/EDTA zawierającym 7M mocznika. Analit zidentyfikowano na podstawie jego względnego czasu migracji (MTO|igo/MTwewn stand)
PL 227 938 Β1 w porównaniu z czasem dla standardu, który wytwarza się podobnie, a następnie analizuje. Rejestrowano względny czas migracji i względny procent powierzchni dowolnego piku elektroforetycznego, który jest >3x stosunku sygnału:zakłóceń (S:N). Wysokości pików pomiędzy 3x i 10x sygnał:zakłócenia rejestrowano jako takie, których nie dało się oznaczyć ilościowo.
% oligomeru = (powierzchnia piku/całkowita powierzchnia piku > 3 xS:N) x 100%
MALDI-TOF. Odsolone próbki, zawierające analit i jego metabolity zanalizowano z zastosowaniem spektrometru masowego Applied Biosystems MALDI-TOF o opóźnionym zakresie pobierania, zaopatrzonego w laser azotowy o długości fali 337 nm, i 1,2 metrową rurę przepływową. Ustawienia aparatury były następujące: napięcie 25 kV; napięcie siatki 95,4%; przewód prowadzący 0,1%; czas opóźnienia 1200 nanosekund. Jako matrycę zastosowano kwas 3-hydroksypikolinowy zawierający cytrynian diamonu. Widma próbek ODN kalibrowano zewnętrznie na takich samych płytkach, w identycznych warunkach, stosując zestaw wzorców ODN o znanych masach cząsteczkowych.
Wyniki otrzymane po 48 godzinach przedstawiono na fig. 20. Fig. 20 wskazuje, że w nerce poziom semi-miękkiego SEQ ID NO: 241 i miękkiego ODN SEQ ID NO: 294 spadł bardzo znacząco (odpowiednio, o 93 procent i o 87 procent) w porównaniu z oligonukleotydami zawierającymi wyłącznie grupy tiofosforanowe SEQ ID NO: 242.
Przykład 1 7. Oligonukleotydy C mają działanie immunostymulujące in vitro.
Wytworzono semi-miękkie oligonukleotydy klasy C zawierające wiązania fosfodiestrowe wewnątrz niepalindromowej części 5' (ODN SEQ ID NO: 255), palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 251), i wewnątrz zarówno niepalindromowej części 5', jak i 3' palindromowej części (ODN SEQ ID NO: 295). Ponadto wytworzono ODN SEQ ID NO: 252 zawierający wiązania podobne do ODN SEQ ID NO: 295 lecz z cukrami takimi jak 2'-0-Me-ryboza w tych nukleotydach tworzącymi palindromową część 3' (przedstawiona jako podkreślona poniżej). Te oligonukleotydy następnie oceniano stosując test TLR9 opisany powyżej.
T*C G*T*C G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G T*C*G*T*C*G*T*TłT*T*C_G*G*C_G*G1:C*C_G*C*C*G T*CJ3*T*CJj*T*T*T*T*CJj*G*CJ3*G*C*C_G*C*C*G T*C G*C*C G*T*T*T*T*C G*G*C G*G*C*C G*C*C*G (SEQ ID NO:255) (SEQ ID NO:251) (SEQ ID NO:295) (SEQ ID NO:252)
Oligonukleotydy klasy C o całkowicie stabilizowanych szkieletach na ogół wywołują względnie niską aktywność TLR9 w porównaniu z oligonukleotydami klasy B. Jak pokazano w tabeli 10 poniżej, wprowadzenie semi-miękkiej sekwencji tylko w niepalindromowej części 5' (ODN SEQ ID NO: 255) znacznie zwiększało aktywność TLR9 w porównaniu z wprowadzeniem semi-miękkiej sekwencji tylko w palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 251). Wprowadzenie semi-miękkiej sekwencji zarówno w niepalindromowej części 5', jak i palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 295) dawało w wyniku zwiększoną aktywność TLR9 w porównaniu z wprowadzeniem semi-miękkiej sekwencji tylko w palindromowej części 3' (ODN SEQ ID NO: 251).
Tabela 10. Stymulacja TLR9 semi-miękkimi oligonukleotydami klasy C
ODN Stężenie ODN, pg/ml
0,1 0,5 2,0 8,0
SEQ ID NO: 255 2,3 16,9 36,4 35,7
SEQ IDNO: 251 1,2 2,5 8,4 16,8
SEQ ID NO: 295 2,0 11,6 29,8 37,3
SEQ IDNO: 252 1,1 3,9 22,1 47,0
PL 227 938 B1
Semi-miękkie oligonukleotydy klasy C nie tylko zachowują swą zdolność do indukowania produkcji IFN-α przez ludzkie komórki PBMC, lecz także mają znacznie silniejsze działanie w niskich stężeniach. Zwiększona moc była najwyraźniejsza w tych oligonukleotydach klasy C, które zawierały semi-miękką sekwencję w niepalindromowej części 5' (ODN SEQ ID NO: 255 i ODN SEQ ID NO: 295). ODN SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 251, i SEQ ID NO: 295 oceniono z zastosowaniem testu ELISA i w porównaniu z SEQ ID NO: 242, całkowicie stabilizowaną formą tych trzech semi-miękkich oligonukleotydów i silnie działającym oligonukleotydowym induktorem produkcji IFN-α należącym do klasy C. Wyniki przedstawiono w tabeli 11.
Tabela 11. Indukcja produkcji IFN-α (pg/ml) z zastosowaniem semi-miękkich wersji oligonukleotydu klasy C
Przykład 1 8. Fizykochemiczne właściwości SEQ ID nr 313.
Metody:
Zapis dyfrakcyjny rentgenogramu proszkowego dla SEQ ID NO: 313 wykazał występowanie h alo, charakterystycznego dla fazy amorficznej. Analiza sorpcji pary wodnej pokazała, że związek o sekwencji SEQ ID NO: 313 jest silnie higroskopijny. Wskutek tendencji leku do wymiany wilgoci, w zależności od wilgotności środowiska, ilość wilgoci może się zmieniać. Związek charakteryzuje się dużą rozpuszczalnością w wodzie (>100 mg/ml), dzięki czemu wykazuje odpowiednią rozpuszczalność w stosowanych zakresach pH. Analiza roztworów wodnych leku w podwyższonej temperaturze pokazuje, że szybko ulega on degradacji w środowisku od łagodnie kwasowego do kwasowego, lecz roztwory buforowane o wartości pH > 6 wykazują odpowiednią trwałość roztworu.
Wyniki:
Stwierdzono, że związek o sekwencji SEQ ID NO: 313 jest substancją amorficzną i silnie higroskopijną. Związek charakteryzuje się dużą rozpuszczalnością w wodzie (> 100 mg/ml), dzięki czemu wykazuje odpowiednią rozpuszczalność w stosowanych zakresach pH. ODN ulega szybko degradacji w środowisku łagodnie kwaśnym oraz kwaśnym. Roztwory buforowane o wartości pH > 6 wydają się wykazywać odpowiednią trwałość roztworu.
Przykład 1 9. Stymulacja komórek transfekowanych TLR9 in vitro.
Metody:
Komórki HEK 293 transfekowane ludzkim TLR9 inkubowano z SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 przez 16 godzin. Sygnał określono na podstawie odczytu aktywności lucyferazy.
Wyniki:
W porównaniu z SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 był silniejszym stymulatorem docelowego receptora TLR9.
Przykład 20. Stymulacja ludzkich komórek układu odpornościowego in vitro.
Metody:
Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej od 6 dawców inkubowano z SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 przez 24 lub 48 godzin. Zmierzono sekrecję cytokin.
Wyniki:
Wyniki przedstawiono na fig. 23. W porównaniu z SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 wykazał zwiększoną lub co najmniej zbliżoną efektywność i/lub moc jako induktor produkcji związanych z TLR9 cytokin IL-6, IL-10, IFNa i IP-10.
PL 227 938 B1
P rz yk ła d 2 1 . Stymulacja splenocytów myszy in vitro.
Metody:
Splenocyty myszy (BALB/c) inkubowano przez 48 godzin z SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329. Zmierzono sekrecję cytokin i IP-10.
Wyniki
W porównaniu z SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 313 wykazał zwiększoną lub co najmniej zbliżoną efektywność i/lub moc jako induktor produkcji cytokin IL-6, IL-10, IL-12p40, IFNa, TNFa i IP-10. Dane przedstawiono na fig. 24. Te dane wskazują, że aktywność SEQ ID NO: 313 względem mysich komórek układu odpornościowego jest porównywalna z aktywnością względem komórek ludzkich (powyżej) i jest podobnie zgodna z aktywacją poprzez TLR9.
P rz yk ła d 2 2 . Indukcja genu cytokinowego u myszy in vivo.
Metody:
W tym badaniu oszacowano ekspresję cytokin w mysich płucach po podaniu SEQ ID NO: 313 do dróg oddechowych. W celu zbadania narażenia nerki, oszacowano także indukcję tych samych cytokin (jak opisano w przykładach 10 i 21) w tym organie. Myszom (samce, BALB/c) podawano SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 (obie 1 mg/kg) albo przez zakropienie donosowe albo przez i niekcję w jednej dużej dawce. Płuca i nerkę pobrano 8 lub 15 godzin po podaniu związku. RNA wyizolowano i poddano odwrotnej transkrypcji na cDNA. Docelowe fragmenty cDNA zamplifikowano i wykrywano metodą PCR w czasie rzeczywistym (Roche LightCycler z zastosowaniem metody detekcji SYBR Green). Startery dla GAPDH, IFN gamma, IL-6, IP-10, i TNF-alfa zaprojektowano stosując oprogramowanie LC PROBE DESIGN firmy Roche (wersja 1.0 nr kat. Roche 3 139 174). Startery dla IFN-alfa zaprojektowano stosując oprogramowanie PRIMER 3. Wydajność produktu znormalizowano jako stosunek ekspresji kontrolnego genu (GAPDH).
Wyniki:
Podawany do dróg oddechowych SEQ ID NO: 313 indukował w płucu ekspresję genów związanych z TLR9 (IL-6, TNFa, IFNa, IFNy i IP-10). Wyniki przedstawiono na fig. 25. Jednakże, za wyjątkiem IP-10, geny te nie podlegały ekspresji w nerkach myszy, którym podawano związek tą drogą. Ponieważ IP-10 jest typowo indukowana przez interferony, ekspresja tej chemokiny mogła wystąpić pośrednio jako wynik wydzielenia z płuca interferonów do krążenia ogólnoustrojowego. Gdy SEQ ID NO: 313 podawano dożylnie, w nerce była indukowana ekspresja każdego z tych genów oprócz genu na IFNy. Zatem brak wpływu SEQ ID NO: 313 na nerki po podawaniu do dróg oddechowych był pra wdopodobnie spowodowany niewielkim występowaniem w krążeniu ogólnoustrojowym.
Oligonukleotydy ODN CpG mogą wpływać na nerki poprzez kilka mechanizmów. Po poddaniu organizmu działaniu pewnych ODN CpG obserwowano ostre ziarniniakowe zapalenie nerek spowodowane mechanizmem zależnym od TLR9. Nasze wyniki sugerują, że układowa ekspozycja na działanie SEQ ID NO: 313 podawanego do dróg oddechowych nie jest wystarczająca do bezpośredniej indukcji genów związanych z TLR9 w nerce.
P rzykła d 2 3 . Wpływy na wywołany antygenem rozwój węzła chłonnego u myszy in vivo.
Metody:
W tym doświadczeniu badano zdolność SEQ ID NO: 313 do indukcji odstępstwa od odpowiedzi immunologicznej typu Th2 przy drenowaniu węzłów chłonnych u myszy. Myszy (samce, BALB/c) uczulano przez wstrzyknięcie antygenu w kompletnym adiuwancie Freund'a w prawą tylną poduszeczkę łapy (albumina jaja kurzego, 100 pg). Jednocześnie w tą samą poduszeczkę łapy myszom wstrzykiwano SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329 (1,5 mg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli). Sześć dni po wstrzyknięciu w poduszeczkę łapy, pobrano drenujący podkolanowy węzeł chłonny. Limfocyty T (CD3+) i limfocyty B (B220+) zliczono metodą cytometrii przepływowej. Test ex vivo na antygen przypominający przeprowadzono następująco 1x106 komórek (pochodzących z drenującego podkolanowego węzła chłonnego) inkubowano w 220 pl podłoża RPMI 1640 + 10% płodowa surowica bydlęca zawierająca albo albuminę jaja kurzego (100 pg/ml) albo rozcieńczalnik. Po 36 godzinach usunięto podłoże hodowlane i zmierzono stężenia IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, GM-CSF, IFN gamma, i TNF alfa stosując zestaw firmy LINCO Research, Inc. 14 Research Park Drive, St Diaries, Missouri 63304 i zanalizowano stosując układ Luminex multiplex system (Luminex Corporation, 12212 Technology Boulevard, Austin, Texas 78727-6115).
Wyniki:
Liczba komórek w podkolanowych węzłach chłonnych. Uczulanie spowodowało nagromadzenie limfocytów T i limfocytów B w drenujących podkolanowych węzłach chłonnych. Ta akumulacja wywo64
PL 227 938 B1 łana antygenem nie zwiększyła się dalej znacząco u myszy, które także otrzymały ODN CpG. Jednakże, każdy ODN CpG wstrzykiwany sam nieuczulanym myszom powodował akumulację zarówno limfocytów T, jak i limfocytów B. Dane przedstawiono na fig. 26.
Test na antygen przypominający. Komórki z drenującego węzła chłonnego pobrane od uczulanych antygenem myszy po powtórnej stymulacji ex vivo antygenem wydzielały IL-4, IL-5, IL-10 i IFN-γ. U uczulanych myszy, które także otrzymały ODN CpG, sekrecja IL-4, IL-5 i IL-10 będących cytokinami typu Th2 spadła, podczas gdy sekrecja IFN-γ będącego cytokiną typu Th1 wzrosła. Nasze dane, przedstawione na fig. 27, potwierdzają hipotezę, że SEQ ID NO: 313, podobnie jak SEQ ID NO: 329, hamuje odpowiedź Th2 na uczulanie antygenem. Wyniki podano jako średnią ± s.e.m. (n = 9-10). *P < 0,05 w porównaniu z grupą uczulaną, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal’a-Wallis’a).
P rzykła d 2 4 . Wpływy na wywołaną przez antygen produkcję IgE u myszy in vivo.
Metody:
Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 100 pg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Myszy otrzymały SEQ ID NO: 313 (0,15 lub 1,5 mg/kg, i.p.) lub SEQ ID NO: 17 (1,5 mg/kg, i.p.) dwa dni przed każdym uczulaniem i w dniu każdego uczulania. Osocze pobrano w 18 dniu badania. Miana antygenowo (albumina jaja kurzego) -swoistych IgE i IgG2a zmierzono stosując test ELISA. Podsumowanie tego protokołu przedstawiono w tabeli 12.
Tabela 12 podsumowanie protokołu badawczego
uczulanie uczulanie
ODN ODN ODN ODN
i i 18
Dzień: -2 0 5 7
punkt końcowy
Wyniki:
U myszy traktowanych SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329, całkowicie zapobieżono produkcji antygenowo swoistych IgE. Dla odmiany, produkcja IgG2a zwiększyła się. Ponieważ produkcja IgE i IgG2a jest charakterystyczna odpowiednio dla odpowiedzi typu Th2 i typu Th1, taki efekt jest kolejnym dowodem, że SEQ ID NO: 313 może tłumić odpowiedź typu Th2 na uczulanie antygenem. Alternatywnie oligonukleotydy ODN CpG mogą bezpośrednio indukować ekspresję T-beta i przełączanie klas z IgE w limfocytach B. Dane przedstawiono na fig. 28. Wyniki są średnią ± s.e.m. (n = 10-12, oprócz 5 dla grupy SEQ ID NO: 329). *P < 0,05 w porównaniu z grupą uczulaną, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal’a-Wallis’a).
Przykład 2 5. Efekty przeciw wywołanemu antygenem zapaleniu dróg oddechowych u myszy in vivo.
Metody:
Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 100 pg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. U myszy prowokowano reakcję odpornościową
PL 227 938 B1 na antygen dając im do wdychania albuminę jaja kurzego w aerozolu, dwukrotnie w każdym tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pierwszą prowokację przeprowadzono 21 dnia badania. SEQ ID NO: 313 (0,1-1000 pg/kg), SEQ ID NO: 329 (1-1000 pg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli, 20 pl) podawano do dróg oddechowych przez zakropienie donosowo jednokrotnie w każdym tygodniu, dwa dni przed pierwszą prowokacją antygenem w tygodniu. Dane dla punktów końcowych oszacowano 48 godzin po ostatniej prowokacji antygenem. Komórki z dróg oddechowych odzyskano przez płukanie pęcherzyków płucnych i przeprowadzono różnicowe zliczanie komórek. Liczby eozynofilów (gęstość objętościowa eozynofilów) i wydzielanie śluzu (barwienie PAS) w tkance płuca określono przez ocenę histopatologiczną. Protokół przedstawiono w tabeli 13.
Wyniki:
Prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów, w przeważającej mierze eozynofilów, w świetle dróg oddechowych. Dane przedstawiono na fig. 29. Eozynofilię istotnie hamował, w sposób zależny od dawki, SEQ ID NO: 313 lub SEQ ID NO: 329. Wartości ED50 przeciw eozynofilii wyniosły: SEQ ID NO: 313: 23 pg/kg; SEQ ID NO: 329: 47 pg/kg. Prowokacja także spowodowała nagromadzenie się limfocytów T CD4+ (komórki CD3+CD4+), które to gromadzenie istotnie hamował SEQ ID NO: 313. SEQ ID NO: 313 także istotnie hamował wywołane antygenem nagromadzenie eozynofilów w tkance płuca i sekrecję śluzu przez nabłonek. Wyniki na fig. 29 są średnią ± s.e.m. (n = 15). *P < 0,05 w porównaniu z grupą prowokowaną antygenem, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal’a-Wallis’a). Wyniki na fig. 30 są średnią ± s.e.m. (n = 6). *P < 0,05, **P < 0,001 w porównaniu z grupą prowokowaną antygenem, traktowaną nośnikiem (ANOVA, test porównania wielokrotnego Dunnett'a).
Przykład 26. Efekty przeciw indukowanej antygenem nadreaktywności dróg oddechowych u myszy in vivo.
Metody:
Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 100 pg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. U myszy prowokowano reakcję odpornościową na antygen dając im do wdychania albuminę jaja kurzego w aerozolu, dwa razy w tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pierwszą prowokację przeprowadzono w 19 dniu badania. SEQ ID NO: 313 (10-1000 pg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli, 20 pl) podawano donosowo jednokrotnie w każdym tygodniu, dwa dni przed pierwszą prowokacją antygenem w tygodniu. Nadreaktywność dróg oddechowych oceniono 24 godziny po ostatniej prowokacji antygenem przez pomiar zwężenia oskrzeli (zwiększenie oporu czynnego dróg oddechowych) w odpowiedzi na podaną dożylnie metacholinę. Dla każdego zwierzęcia wyznaczono krzywą dawka-odpowiedź na metacholinę, a reaktyw66
PL 227 938 B1 ność dróg oddechowych określono ilościowo jako powierzchnię pod krzywą. Protokół przedstawiono w tabeli 14.
Wyniki:
Prowokacja antygenem spowodowała nadreaktywność dróg oddechowych. SEQ ID NO: 313 hamował rozwój wywołanej antygenem nadreaktywności dróg oddechowych w sposób zależny od dawki. Dane przedstawiono na fig. 31 i 32 jako krzywe dawka-odpowiedź dla próbek na metacholinę, aby pokazać działanie SEQ ID NO: 313 (1000 pg/kg). Krzywe dawka-odpowiedź na metacholinę określa się ilościowo jako powierzchnię pod krzywą. Wyniki są średnią ± s.e.m. (n = 6-8). *P < 0,05 w porównaniu z grupą prowokowaną antygenem, traktowaną nośnikiem (test porównania wielokrotnego Kruskal’a-Wallis’a).
Analizę całkowitych krzywych dawka-odpowiedź (RL) dla myszy, które prowokowano antygenem, potraktowano nośnikiem i każdej z odpowiednich myszy, które prowokowano antygenem, potraktowanych SEQ ID NO: 313, prowadzono stosując powtarzane pomiary testem MANOVA. Choć wystąpiła znacząca różnica (P < 0,05) pomiędzy krzywymi dawka-odpowiedź dla grup traktowanych 100 i 1000 pg/kg SEQ ID NO: 313, nie wystąpiła znacząca różnica pomiędzy myszami prowokowanymi antygenem, traktowanymi nośnikiem i podobnie traktowanymi zwierzętami, którym podawano 10 pg/kg SEQ ID NO: 313.
Przykład 27 . Badanie farmakokinetyki (PK) in vivo u szczurów.
Badanie PK prowadzono na szczurach w celu określenia czy SEQ ID NO: 313, „semi-miękki” ODN, jest usuwany z osocza i tkanek, szczególnie z nerek, szybciej niż SEQ ID NO: 329, ODN zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe, który ma identyczną sekwencję zasad jak SEQ ID NO: 313.
Metody:
szczurom podano dożylnie (i.v.) i dotchawiczo (i.t.) 5 mg/kg (zarówno dla i.v. jak i dla i.t.) SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329. Pobrano osocze, płuca, nerki. Badanie trwało 5 dni, z 14 punkt ami czasowymi na grupę, w której podawano daną dawkę. Stosowano grupy po 3 szczury/punkt czasowy dla grupy i.v. (ogółem = 42 szczury) i po 4 szczury/punkt czasowy dla i.t.
Wyniki:
Fig. 33 przedstawia stężenia ODN w osoczu szczura po podawaniu i.v. i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dla osocza wskazują, że SEQ ID NO: 313 jest usuwany z osocza szybciej w porównaniu z SEQ ID NO: 329 zarówno po podawaniu i.v. jak i i.t.
Fig. 34 przedstawia stężenia ODN w płucach szczura po podawaniu i.v. i i.t. w dawce 5 mg/kg. Po podawaniu i.v. przy takiej samej wielkości dawki, stężenia SEQ ID NO: 313 w płucach są niższe niż stężenia SEQ ID NO: 329. Po podawaniu i.t. różnica jest mniej wyraźna. Dane dla płuca dla SEQ ID NO: 329 zbierano tylko do 48 godzin po podawaniu.
Fig. 35 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.v. i i.t. w dawce 5 mg/kg. Dane dla nerki wskazują, że bezwzględne stężenia SEQ ID NO: 313 w nerkach są niższe niż odpoPL 227 938 B1 wiednie stężenia SEQ ID NO: 329 zarówno po podawaniu i.v. jak i i.t. Ekspozycja nerek na SEQ ID NO: 313 w szczególności po podawaniu i.t., jest znacznie zmniejszona w porównaniu z ekspozycją na SEQ ID NO: 329 przy podawaniu w dawce o tej samej wielkości. Można to zobaczyć wyraźniej na fig. 36 i 37.
Fig. 36 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.v. w dawce 5 mg/kg. Fig. 37 przedstawia stężenia ODN w nerkach szczura po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg. Po pod awaniu i.t. zarówno SEQ ID NO: 313, jak i SEQ ID NO: 329 występują w ilości poniżej niższego lim itu oznaczenia ilościowego (0,4-0,6 pg/g) w nerkach przez czas aż do 1 godziny po podaniu. Po 1 godzinie, SEQ ID NO: 329 można wykryć we wszystkich próbkach pobranych z nerki podczas okresu badania (48 godzin). Z drugiej strony SEQ ID NO: 313, występuje w możliwych do zmierzenia poziomach przez czas do 7 godzin po podaniu.
Tabela 15. Podsumowanie średnich parametrów PK dla SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329 po podawaniu i.v. i i.t. szczurom w dawce 5 mg/kg
Grupa dawkowa Tkanka ODN Cmax (pg/ml) Tmax (godz.) Tl/2 (godz.) auco_inf (godz. pg/ml) ATTC rtUkO-48godz. (godz. pg/ml)
i . v. (5 mg/kg) osocze 10 na na 0,20 9,5 9,3
17 na na 0,62 62,8 62,2
płuca 10 1,4 0,25 0,17 0,47 0,35
17 14,4 0,083 2,5 23,7 20,8
nerki 10 6,6 0,083 24,9 184 123
17 11,4 0,083 nc nc 346
i.t. (5 mg/kg) osocze 10 1,9 0,75 1,20 2,68 2,35
17 2,1 2 2,3 9,01 7,46
płuca 10 632 0,25 28,1 5540 5350
17 692 1 (31)** (7908)** 6505
nerki 10 0,49 2 7,8 5,81 2,34
17 3 , 8 7 nc nc 134
na - Nie dotyczy.
nc - Nie obliczany. Nie można było dokładnie oszacować z uwagi na niewystarczającą częstość pobierania danych w końcowej fazie lub faza końcowej eliminacji nie została osiągnięta podczas okresu badania.
* - AUC0-48h lub AUC0-LaST, gdy ostatnie możliwe do zmierzenia stężenie występowało przed 48 godziną.
** - Bardzo przybliżone oszacowanie (na bazie 2 danych tylko w końcowej fazie).
- SEQ ID NO: 313
- SEQ ID NO: 329
PL 227 938 Β1
Tabela 1 6(a)-(c). Układowa i tkankowa ekspozycja na SEQ ID NO: 313 i SEQ ID NO: 329 po podawaniu i.t. i i.v. szczurom w dawce 5 mg/kg (a) - Dane dla osocza
ODN
SEQ ID NO
SEQ ID NO
Droga AjC 0_4g godz. stosunek SEQ ID
podawania (godzina. 313: SEQ ID NO:
dawki gg/ml)
313 i.t. 2,35 9,30 0,32 (i.t.)
i . v. 0,15 (i.v.)
stosunek 0,25
i.t.:i.v.
329 i.t. 7,46 62,2
i .V .
stosunek 0,12
i.t.:i.v.
(b) - Dane dla płuc
ODN Droga ATTC UkO-48godz. stosunek SEQ ID NO: 313
podawania (godzina. ID NO: 329
dawki pg/ral)
SEQ ID i.t. 5350 0,82 (i.t.)
NO: 313 i .v. 0,35 0,017 (i.v.)
stosunek 15286
i.t.:i.v.
SEQ ID i.t. 6505
NO: 329 i.v. 21
stosunek 313
i.t.:i.v.
(C) - Dane dla nerki
ODN Droga AtfC0-48godz. stosunek SEQ ID NO: 313
podawania (godzina. ID NO: 329
dawki pg/ml)
SEQ ID i.t. 2,34 0,0 17 (i.t.)
NO: 313 i ,v. 123 0,36 (i.v.)
stosunek 0,019
i.t.:i.v.
SEQ ID i.t. 134
No. 329 i . v. 346
stosunek 0,39
i.t.:i.v.
PL 227 938 B1
Ekspozycja układowa i ekspozycja nerek na SEQ ID NO: 313 okazała się znacznie mniejsza niż ekspozycja na SEQ ID NO: 329 po podawaniu 2 ODN zarówno drogą dożylną (i.v.), jak i dotchawiczą (i.t.).
Wartość AUC dla osocza dla SEQ ID NO: 313 po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg wyniosła 2,7 godziny.pg/ml. Odpowiednia wartość dla SEQ ID NO: 329 wynosiła 9,0 godzin.pg/ml. Tak więc, systemowa ekspozycja na SEQ ID NO: 313 stanowi jedną trzecią ekspozycji obserwowanej dla SEQ ID NO: 329.
Wartość AUC dla nerki dla SEQ ID NO: 313 po podawaniu i.t. w dawce 5 mg/kg wyniosła 2,35 godziny.pg/ml. Odpowiednia wartość dla SEQ ID NO: 329 wyniosła 134 godzin.pg/ml. Tak więc, przy stosowaniu w takiej samej dawce, ekspozycja nerek na SEQ ID NO: 313 stanowi tylko około 2% ek spozycji obserwowanej dla SEQ ID NO: 329.
Inaczej niż w przypadku osocza i nerki, ekspozycja płuca na SEQ ID NO: 313 po podawaniu i.t. nie była zmniejszona w tak dużym stopniu w porównaniu z ekspozycją na SEQ ID NO: 329. Wartość AUC dla płuca dla SEQ ID NO: 313 stanowiła w przybliżeniu 70-80% wartości AUC dla płuca dla SEQ ID NO: 329 przy stosowaniu w takiej samej dawce. Ponieważ płuco jest tkanką docelową, zalecane jest by klirens ODN z płuca wzrósł do takiego samego poziomu, jak klirens z osocza i nerek.
Fig. 38 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podawaniu i.v. SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg.
Fig. 39 przedstawia stężenia SEQ ID NO: 313 i jego 8-merowego metabolitu (merowych metabolitów) w nerkach szczura po podawaniu i.t. SEQ ID NO: 313 w dawce 5 mg/kg. Z powodów metodologicznych dane dla 8-merowego metabolitu SEQ ID NO: 313 w osoczu i tkankach są niepełne. Jednakże, dane dostępne są dla 8-meru dla niektórych próbek nerki po podawaniu i.v. i wszystkich próbek nerki po podawaniu i.t. Te dane wskazują, że w większości próbek nerki, w których stężenia 8-meru z powodzeniem zmierzono, poziomy metabolitów są wyższe niż poziomy SEQ ID NO: 313, co wskazuje, że aktywność endonukleazy jest ważnym sposobem metabolizmu SEQ ID NO: 313.
Wprowadzenie pewnej liczby wiązań fosfodiestrowych (SEQ ID NO: 313) do szkieletu zawierającego wyłącznie wiązania tiofosforanowe (SEQ ID NO: 329) wydaje się zwiększać stopień degradacji ODN, prowadząc w efekcie do szybszego klirensu, szczególnie z nerek.
P rzykła d 2 8 . Aktywacja TLR9 z zastosowaniem semi-miękkiego ODN w porównaniu z ODN zawierającym wyłącznie wiązania tiofosforanowe.
Metody:
Wcześniej opisano trwale transfekowane komórki HEK293 eksprymujące ludzki TLR9 [Bauer i in.; PNAS; 2001]. W skrócie, komórki HEK293 transfekowano przez elektroporację wektorami eksprymującymi ludzki TLR9 i plazmidem reporterowym 6xNFxB-lucyferaza. Trwałe transfektanty (3x104 komórek/studzienkę) inkubowano z ODN przez 16 godzin w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze. Wszystkie badania wykonano w trzech powtórzeniach. Komórki zlizowano i oznaczano aktywność genu lucyferazy (stosując zestaw Brightlite firmy Perkin-Elmer, Ueberlingen, Niemcy). Indeksy stymulacji obliczono w odniesieniu do aktywności genu reporterowego w podłożu bez dodatku ODN.
Wyniki
TLR9 jest łatwo aktywowany przez oligonukleotydy ODN zawierające optymalne immunostymulujące sekwencje CpG. Inkubowano linię komórkową nieprzerwanie eksprymującą ludzki TLR9 z zestawem semi-miękkich ODN i zestawem ODN zawierających wyłącznie wiązania tiofosforanowe mających taką samą sekwencję ODN, jak semi-miękkie ODN. Wyniki przedstawiono na fig. 40.
Wyniki wykazują, że każdy z semi-miękkich ODN przedstawionych w tabeli poniżej, SEQ ID NO: 376, 378, 380, 382, 384, 241, aktywował ekspresję TLR9 na wyższym poziomie niż ODN o takiej samej sekwencji mające szkielet, zawierający wyłącznie wiązania tiofosforanowe, odpowiednio o SEQ ID NO: 377, 379, 381,383, 385, i 242.
PL 227 938 B1
SEQ ID No. 376 T*G*T*C g*t*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
SEQ ID No. 377 T*G*T*G*G*T*T*T*T*T*T*T*T*I*T*T*T*T*T*T
SEQ ID No. 378 U*G*T*C G*T*T*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U
SEQ ID No. 379 U*G*T*C*G*T*T*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U*U
SEQ ID No. 380 D*G*T*C G*T*T*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*D*T
SEQ ID No. 381 d*g*t*c*g*t*t*d*d*d*d*d*d*d*d*d*d*d*d*t
SEQ ID No. 382 U*G*T*C G*T*T*U*U*U*U')rU G G G A G G*G*G
SEQID No. 383 □*g*t*g*g*t*t*u*u*u*u*u*g*g*g*a*g*g*g*g
SEQ ID No. 384 □*G*T*C G*T*T*C*C*U*U*U G G G A G G*G*G
SEQID No. 385 u*g*t*c*G*t*t*c*c*u*u*u*g*g*g*a*g*g*g*g
SEQ ID No. 241 T*C G*T*C G*T*T*T*T G*T*C 6*Τ*Τ*Τ*Τ*ΰ*Τ*0 G*T*T
SEQ ID No.
242 T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
Przykład 29. Wiązania internukleotydowe Rp jako wiązania typu wiązania fosfodiestrowego w semi-miękkich oligonukleotydach.
Metody:
Warunki hodowli komórkowej i reagenty
Do testów proliferacji limfocytów B, komórki śledziony pochodzące od myszy BALB/c (w wieku
4-18 tygodni) hodowano w gęstości 2-5 x 105-106 komórek/ml w RPMI przez 44 godziny w 96-stu3 dzienkowych płytkach do mikromiareczkowania, po czym traktowano jednokrotnie 1 μθ H tymidyny przez 4-6 godzin, przed zebraniem i określeniem cpm przez scyntylacyjne zliczenie jak opisano uprzednio (Krieg i in., 1995). W celu wykonania Western blotów, komórki WEHI-231 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) hodowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 nawilżanym inkubatorze i utrzymywano w RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) uzupełnionym 10% inaktywowaną wysoką temperaturą FCS (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 1,5 mM L-glutaminą, 50 μM 2-ME, 100 U/ml penicyliny, i 100 μg/ml streptomycyny.
Oligonukleotydy.
Oligodeoksynukleotydy (PO-oligomery) i oligomery deoksynukleozydo-tiofosforanowe o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej [Mix-PS]-oligomery zakupiono od Operon Technologies (Alameda, CA) lub wytworzono stosując standardową metodę amidofosforynową (Caruthers, 1985) (Stec i in., 1984). Oligonukleotydu [Mix-PS]-d(TCCATGACGTTCCTGACGTT) ([Mix-PS]-SEQ ID NO: 386) użyto jako kontroli pozytywnej, ponieważ uprzednio stwierdzono, że ma on silny wpływ immunostymulujący na mysie komórki (Yi i in., 1996). Dla PS-oligomeru CpG z minimalnym motywem stymulującym, sekwencję PS-d(TCAACGTT)-2066 wybrano do badania jako typowy motyw CpG o szerokim działaniu stymulującym, reprezentujący dużą rodzinę CpG DNA. Gdy do przygotowania tej sekwencji użyto szkieletu o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej wówczas sekwencję tę nazwano [Mix-PS]-2066. Gdy ta sekwencja oktameru zawierała szkielet o całkowicie lub częściowo określonej konfiguracji st ereochemicznej, to PS-oligomer określano jako [All-Rp-PS]-2066 lub [AlI-Sp-PS]-2066, gdy cały szkielet miał określoną konfigurację stereochemiczną, lub jako [CG-Rp-PS]-2066 lub [CG-Sp-PS]-2066, gdy
PL 227 938 B1 tylko dinukleotyd CpG miał określoną konfigurację stereochemiczną. Inne stosowane PS-oligomery obejmują CpG PS-d(TCAACGTTGA) ([Mix-PS]-SEQ ID NO: 387) i jego odpowiedniki All-Rp- i All-Spo określonej konfiguracji stereochemicznej, oraz kontrolujący PS-d(TCAAGCTTGA) [Mix-PS]-SEQ ID NO: 388 nie zawierający CpG.
Oligodeoksynukleotydy tiofosforanowe o określonej konfiguracji stereochemicznej wytworzono metodą oksatiafosfolanową jak opisano (Stec i in., 1995) (Stec i in., 1998). Syntezy przeprowadzono ręcznie. Pierwsze jednostki nukleozydowe od końca 3' zamocowano do stałego nośnika za pomocą DBU-odpornej łączącej grupy sarkozynylowej (Brown i in., 1989). Odpowiednio zabezpieczone monomery deoksynukleozydylowe, zawierające grupę taką jak 3'-O-(2-tio-„spiro”-4,4-pentametyleno-1,3,2-oksatiafosfolan) zsyntetyzowano i oddzielono chromatograficznie, uzyskując czyste P-diastereomery. Do syntezy [CG-Rp-PS]-2066 i [CG-Sp-PS]-2066, stosowano nie rozdzieloną mieszaninę obu P-diastereomerów (stosunek Rp:Sp około 1:1) (Stec i in., 1998) w celu złożenia wiązań międzynukleotydowych o przypadkowej konfiguracji atomów P. Wszystkie zsyntetyzowane oligomery oczyszczono metodą dwuetapową RP-HPLC: w obecności DMT (czasy retencji w zakresie 23-24 minut) i w nieobecności DMT (czasy retencji 14-16 minut); układ chromatograficzny: kolumna ODS Hypersil, 5 μm, 240x4,6 mm, 0-40% CH3CN w 0,1 M trietylowodorowęglanie amonu, pH 7,5, gradient 1%/minutę. Stopień czystości oszacowano metodą elektroforezy żelowej w żelu poliakrylamidowym.
W celu analizy retencji PS-oligomeru, wytworzono stereoregularne PS-oligomery sprzężone z fluoresceiną przez wydłużenie w fazie stałej ręcznie zsyntetyzowanych PS-oligomerów o określonej konfiguracji stereochemicznej. Po etapie detritylacji amidofosforynu fluoresceiny (Chem Genes Corporation, Ashland, MA; stężenie robocze 125 mg/ml), rutynowo dodano 1-H-tetrazol (czas sprzęgania 120 sekund), następnie siarkowano, stosując S-tetra odczynnik (Stec i in., 1993). Reakcje oderwania od nośnika i odbezpieczenia przeprowadzono, działając stężonym wodorotlenkiem amonu odpowiednio w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny oraz w temperaturze 55°C w ciągu 4 godzin. Wytworzone oligomery oczyszczono metodą jednoetapową RP-HPLC (jak powyżej). Ze względu na znaczącą hydrofobowość grupy fluoresceinowej, Rp- i Sp-oligomery eluowano z czasami retencji wynoszącymi odpowiednio 14,5, 14,8 i 14,7, 15,0 minut, tj. dla końca każdej sekwencji. W obu przypadkach dwa P-diastereomery eluowano z uwagi na niestereospecyficzność metody wydłużania poprzez amidofosforynowanie/siarkowanie, z zastosowaniem monomeru fluoresceiny.
Analiza Western Blot
Komórki zebrano i ponownie zawieszono w świeżym podłożu w stężeniu 2x106 komórek/ml. Komórki pozostawiono do odstania na cztery godziny przed 40-minutową stymulacją. Komórki zebrano i przemyto trzy razy zimnym PBS. Komórki zlizowano w 0,5 M Tris (pH 7,4), 14 M NaCl, 1% NP-40, 001M Na3VO4, 01 M NaF, 4,3 mg/ml β-glicerofosforanie, 002M DTT, 50 μg/ml PMSF, 12,5 ng/ml Antipain, 12,5 ng/ml aprotyniny, 12,5 μg/ml leupeptyny, 1,25 ng/ml pepstatyny, 19 μg/ml bestatyny, 10 μg/ml fosforamidonu, 12,5 μg/ml inhibitorze trypsyny przez zamrożenie i odmrożenie, a następnie 30-minutową inkubację na lodzie. Próbki następnie zwirowano przy 10,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatanty zachowano jako lizaty całych komórek do późniejszej analizy. Równe ilości lizatów całych komórek (20 μg) trzymano w temperaturze wrzenia w buforze SDS do próbek przez 5 minut przed poddaniem elektroforezie w 11% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Po elektroforezie, białka przeniesiono na błony nitrocelulozowe stosując pół-suchą bibułę (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Bloty zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem przed hybrydyzacją z fosfo-SAPK/JNK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), kB-α i JNK1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Bioty wywołano stosując odczynniki do nasilonej chemiluminescencji (ECL, Amersham International) według protokołu producenta.
Wyniki:
3
Indukcja włączania H tymidyny do komórek śledziony przez stereoizomer Sp CpG PS-oligomerów. W celu określenia stereo-specyficzności stymulującego układ odpornościowy działania DNA CpG, komórki śledziony BALB/c hodowano z oktanukleotydami PS-d(TCAACGTT)-2066 o określonej konfiguracji stereochemicznej, w których wszystkie z wiązań internukleotydowych mają konfigurację albo Rp albo Sp w stężeniach wskazanych w tabeli 17. Komórki hodowano przez 48 godzin, co zapewnia limfocytom B wystarczający czas do wywołania ich proliferacji przez motywy CpG (Krieg i in., 1995). [Mix-PS]-2066 o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej, posiadające motyw CpG, wywołały silną zależną od dawki proliferację komórek śledziony (tabela 17). Izomer Sp także wywołał proliferację, i wydawał się mieć nieznacznie silniejsze działanie niż [Mix-PS]-2066. Dla odmiany,
PL 227 938 B1 stereoizomer Rp nie indukował żadnej wykrywalnej proliferacji, co było zgodne z wynikami badań uzyskanymi przez Yu i in., (Yu i in., 2000).
Tabela 17. Indukcja proliferacji komórek śledziony przez stereoizomer Sp oktamerów CpG
oligomer Stężenie Cpm SI
brak (podłoże) 2170 1
2066 (CpG o przypadkowej 0,4 μΜ 3154 1,5
konfiguracji
stereochemicznej)
n 2,4 μΜ 16,525 7,6
H 4,8 μΜ 30,811 14,2
Rp (2066) 0,4 μΜ 1207 0,6
H 2,4 μΜ 985 0,5
U 4,8 μΜ 640 0,3
Sp (2066) 0,4 μΜ 9567 4,4
H 2,4 μΜ 35,372 16,3
n 4,8 μΜ 43,591 20,1
Rp (2066) + 20661 0,4 μΜ 1,597 0,7
H 2,4 μΜ 10,255 4,7
n 4,8 μΜ 15,841 7,3
SI = indeks stymulacji w porównaniu z kontrolą z podłożem 1 Każdy z dwóch PS-oligomerów dodano do wskazanego stężenia na początku hodowli
Poprzednie badania wskazują, że dekamer CpG PS-oligomerów ma zwiększony wpływ stymulujący układ odpornościowy w porównaniu z oktamerami stosowanymi w pierwszych doświadczeniach. Dlatego powtórzono te doświadczenia stosując konstrukt PS-SEQ ID NO: 387, który zsyntetyzowano albo jako [Mix-PS] o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej - SEQ ID NO: 387, lub w formie zawierającej wszystkie wiązania w koniguracji Rp lub wszystkie wiązania w koniguracji Sp. Z kolei zarówno [Mix-PS]-SEQ ID NO: 387, jak i [All-Sp-PS]-SEQ iD NO: 387 silnie indukowały włączanie 3H tymidyny w sposób zależny od dawki. Jednakże, w tym przypadku, [All-Rp-PS]-SEQ ID NO: 387 był także zdolny do indukcji istotnego zwiększenia proliferacji komórek w najwyższych stężeniach, wsk azując, że zachował co najmniej częściową aktywność stymulacyjną.
Uprzywilejowanie chiralności Rp w dinukleotydzie CpG w oktamerze PS-oligomerów. Pozostawało niejasne czy widoczne uprzywilejowanie stereoizomeru Sp w początkowych doświadczeniach wynikało z efektu wewnątrz samego dinukleotydu CG, czy też ten efekt może być niezależny od CG. W celu określenia tego zsyntetyzowano dwa oktamery PS-2066, w których szkielet miał przypadkową konfigurację stereochemiczną oprócz wiązania pomiędzy centralną parą CG, która była określona jako albo Sp, albo Rp. Nieoczekiwanie, wydawało się, że doświadczenie to dało wynik przeciwny od uzyskanego z zastosowaniem PS-oligomerów, w których cały szkielet był stereoregularny, ponieważ o
[CG-Rp-PS]-2066 spowodował równie duże zwiększenie włączania H tymidyny do komórek śledziony
PL 227 938 B1 jak kontrolny PS-oligomer o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej. Dla odmiany PS-oligomer [CG-Sp-PS]-2066 był zasadniczo nieaktywny.
Hamowanie włączania 3H tymidyny do komórek śledziony przez stereoizomer R CpG PS-oligomeru.
3
Poziom włączenia 3H tymidyny w studzienkach potraktowanych stereoizomerem Rp był niższy niż w studzienkach kontrolnych, sugerując możliwą aktywność hamującą, chociaż w mikroskopowym badaniu komórek nie zauważono cytotoksyczności. Rzeczywiście, gdy komórki hodowano w obecności równomolowej mieszaniny [Mix-PS]-2066 i stereoizomeru zawierającego wszystkie wiązania 3 o konfiguracji Rp, wystąpiło w przybliżeniu 50% zmniejszenie poziomu włączania 3H tymidyny w porównaniu z komórkami hodowanymi tylko z [Mix-PS]-2066 (tabela 17).
Uprzywilejowana stymulacja układu odpornościowego przez [Rp-PS]-oligomery na wczesnych etapach.
3
W testach włączania H3 tymidyny przeprowadzonych w poprzedzających doświadczeniach najprawdopodobniej mógł się pojawić artefakt wynikający z degradacji PS-oligomeru, powodując uwalnianie nieznakowanej tymidyny, która współzawodniczy ze znakowanym materiałem, sztucznie hamując jego włączanie (Matson i in., 1992). Poprzednie badania wykazały, że [Rp-PS]-oligomery są znacznie bardziej podatne na degradację nukleazą niż odpowiedniki Sp. Tak więc było możliwe, że 3 widoczny brak stymulującego wpływu [Rp-PS]-oligomeru w testach włączania H3 tymidyny mógł być mylącym artefaktem, który nie był odbiciem prawdziwego wpływu [Rp-PS]-oligomeru. W celu wykrycia stymulującego wpływu [Rp-PS]-oligomeru na wczesnych etapach, zanim PS-oligomer może ulec degradacji i jako niezależny biologiczny test na stymulację indukowaną CpG, zbadano zdolność tych PS-oligomerów do indukcji gwałtownej fosforylacji regulatorowej kinazy białkowej aktywowanej mitogenem, JNK. Nieoczekiwanie stwierdzono, że po traktowaniu sekwencjami CpG PS-SEQ ID NO: 386 i PS-SEQ ID NO: 387, przez czterdzieści minut fosforylację JNK silnie indukowały nie [Sp-PS]-izomery, lecz tylko [Mix-PS]-izomery o przypadkowej konfiguracji stereochemicznej i [Rp-PS]-izomery. Kontrolny nie-CpG [Mix-PS]-SEQ ID NO: 388 nie indukował wykrywalnej fosforylacji JNK. Wszystkie próbki zawierały porównywalną całkowitą ilość białka JNK.
Chociaż nie można było wykryć żadnego wpływu CpG [Sp-PS]-oligomeru w teście fosforylacji JNK, oligomer wykazał w tym doświadczeniu aktywność biologiczną, ponieważ poziom inhibitorowego białka kB-o był obniżany przez wszystkie z CpG PS-oligomerów, niezależnie od stereoizomerii, lecz nie przez kontrolny nie-CpG PS-SEQ ID NO: 388.
Stereo-niezależność wiązania PS-oligomeru na powierzchni komórki i jego wychwytu.
Jedno potencjalne wyjaśnienie, które może przyczyniać się do obserwowanych różnic w bioaktywności stereoizomerów PS-oligomerów jest związane ze stereo-zależnością wiązania przez komórki lub wychwytu PS-oligomerów. Aby sprawdzić tę możliwość, zsyntetyzowano PS-oligomery o konfiguracji stereochemicznej P ze znacznikami fluorescencyjnymi i inkubowano je z komórkami. Zgodne z wynikami poprzednich badań, PS-oligomery wykazały zależny od stężenia i zależny od temperatury wzór wychwytu przez komórki. W szczególności nie wystąpiła wykrywalna różnica w wiązaniu lub wychwycie PS-oligomerów Rp lub Sp.
Przykład 30. Semi-miękki oligonukleotyd ODN 316 klasy C i semi-miękki oligonukleotyd ODN 313 klasy B zmniejszają indukowane antygenem zapalenie dróg oddechowych in vivo.
W tym badaniu oszacowano wpływ in vivo ODN 316 na mysi model indukowanego antygenem zapalenia dróg oddechowych. ODN 313 klasy B włączono do badania w celach porównawczych.
Metody. Myszy (samce BALB/c) uczulano w 0 i 7 dniu badania antygenem (albumina jaja kurzego, 10 pg, i.p.) z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem (Pierce Alum).
Myszy prowokowano antygenem dając im do wdychania albuminę jaja kurzego w aerozolu, dwa razy w tygodniu przez dwa kolejne tygodnie. Pierwszą prowokację przeprowadzono w 21 dniu badania. Aerozol wytwarzano przez 1 godzinę z 1% roztworu albuminy jaja kurzego w PBS stosując neb ulizator DeVilbiss Ultraneb. Innymi myszami posłużono się jako nieprowokowaną kontrolą.
ODN 316, ODN 313 (1-100 pg/kg) lub nośnik (fizjologiczny roztwór soli, 20 pl) podano donosowo jednokrotnie w każdym tygodniu, dwa dni przed pierwszą prowokacją antygenem w tygodniu.
Dane dla punktów końcowych oszacowano w dniu badania 33 (tj. 48 godzin po ostatniej prowokacji antygenem). Komórki z dróg oddechowych pobrano przez płukanie pęcherzyków płucnych. Różnicowe zliczanie komórek przeprowadzono stosując automatyczny licznik komórek Advia sprawdzając wizualnie losowo wybrane próbki licząc komórki w preparatach z próbek odwirowanych barwione barwnikiem Wright-Giemsa. Liczby limfocytów T CD4+ (komórki CD3+CD4+) zliczono stosując cytometrię
PL 227 938 Β1 przepływową. Wyniki wyrażono jako średnią ± SEM dla każdej grupy. Istotność zmierzono stosując test z porównaniem wielokrotnym Kruskall’a-Wallis’a.
Wyniki. Prowokacja antygenem spowodowała zwiększenie całkowitej liczby leukocytów w świetle dróg oddechowych. To zwiększenie spowodowane było przede wszystkim nagromadzeniem eozynofilów (np. 3x105 eozynofilów/ml u myszy prowokowanych antygenem, traktowanych nośnikiem w porównaniu z <1x104 eozynofilów/ml u nieprowokowanych myszy). Eozynofilię znacznie hamowały ODN 316 lub ODN 313 (np. około 5x104 eozynofilów/ml (P < 0,05) u myszy prowokowanych antygenem, traktowanych 100 pg/ml obydwu z ODN).
Prowokacja antygenem także powodowała nagromadzenie limfocytów T CD4+ co było istotnie hamowane przez obydwa z ODN (np. około 2x104 limfocytów T CD4+/ml u myszy prowokowanych antygenem traktowanych 100 pg/ml obydwu z ODN, w porównaniu z około 1,3x105 limfocytów T CD4+/ml (P < 0,05) u myszy prowokowanych antygenem, traktowanych nośnikiem).
Wnioski. Zarówno semi-miękki ODN 316 klasy C, jak i semi-miękki oligonukleotyd ODN 313 klasy B hamowały indukowaną antygenem eozynofilię dróg oddechowych i nagromadzenie limfocytów T CD4+ in vivo.
Przykład 31 . Porównanie semi-miękkich ODN klasy B, C i T: Indukcja sekrecji cytokin przez mysie splenocyty in vitro.
W tym badaniu testowano zdolność semi-miękkich ODN klasy B, C i T do indukowania sekrecji cytokin przez mysie splenocyty in vitro.
Metody. Splenocyty pochodzące od myszy BALB/c zebrano i połączono. Splenocyty inkubowano w 48-studzienkowych płytkach hodowlanych w gęstości 1x107 komórek/1 ml w RPMI 1640 + 10% płodowa surowica bydlęca zawierająca poszczególne ODN (0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 lub 10 pg/ml). Badane ODN obejmowały semi-miękki ODN 20674 klasy B, semi-miękkie ODN 316 i ODN 317 klasy C oraz semi-miękkie ODN 319 i ODN 320 klasy T.
Po 48 godzinach inkubacji (37°C, 5% CO2), usunięto podłoże hodowlane i zmierzono stężenia IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ i TNF-α stosując układ Luminex cytokine multiplex system. Stężenia IL-12p40, IFN-α i IP-10 zmierzono stosując test ELISA. Dolne granice dokładnej wykrywalności wynosiły 3,2-10 pg/ml. Stan aktywacji komórek oszacowano przez pomiar ekspresji CD40, CD69 i CD86 na limfocytach CD3+ i B220+ z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Wyniki. Każdy z ODN indukował aktywację limfocytów B (komórki B220+) jak stwierdzono na podstawie pomiarów zwiększonej ekspresji CD40, CD69 i CD86, i aktywację limfocytów T (komórki CD3+) jak stwierdzono na podstawie pomiarów zwiększonej ekspresji CD69.
Wywołana ODN sekrecja IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN-α, TNF-a i IP-10. Miana innych mierzonych cytokin nie były zwiększone. Przykładowo, przy zastosowaniu ODN w stężeniu 1 pg/ml, poziomy sekrecji cytokin były następujące (wszystkie wyrażone w pg/ml):
Tabela 18. Sekrecja in vitro cytokin w odpowiedzi na semi-miękkie ODN klasy B, C i T
ODN IL-6 IL-10 IL- 12p40 IFN-OC TNF-a IP-10
313 4000 410 300 12 150 400
316 3600 820 820 90 400 780
317 2200 410 790 140 340 760
319 1200 200 300 nd 50 30
320 150 nd 160 nd 15 25 '
nd - nie wykryto
PL 227 938 B1
W porównaniu z semi-miękkim ODN 313 klasy B, dwa semi-miękkie ODN klasy C indukowały większe miana IL-10, IL-12p40, IFN-α, TNF-α i IP-10, lecz nie powodowały wyraźniejszej aktywacji limfocytów B. Dwa semi-miękkie ODN klasy T wydawały się być mniej skuteczne jako induktory produkcji cytokin niż semi-miękkie ODN klasy B i C.
Wnioski. Zarówno ODN klasy B, jak i klasy C indukowały profil indukcji cytokin zgodny z aktywacją TLR9, i każdy spowodował aktywację limfocytów B. ODN klasy T były mniej skutecznymi indu ktorami produkcji cytokin.
W porównaniu z semi-miękkim ODN 313 klasy B, semi-miękkie ODN, zarówno 316, jak i 317 klasy C, indukowały większe stężenia cytokin modyfikujących układ immunologiczny, lecz bez indukcji silniejszej aktywacji limfocytów B. Te dane sugerują terapeutyczną korzystność ODN klasy C.
Przykład 32. Indukcja produkcji cytokin, przeciwciał i CTL in vivo w odpowiedzi na ODN CpG.
Pomiary cytokin: myszom BALB/c podawano 400 mg ODN (SEQ ID NO: 294 (miękki), 241 (semi-miękki), 242, i 286) przez wstrzyknięcie s.c. Zwierzęta skrwawiono 3 godziny po wstrzyknięciu i zmierzono poziomy IP-10, IFN-gamma i TNF-α w osoczu stosując test ELISA. Wyniki przedstawiono na fig. 41A i B (IP-10), C (IFN), i D i E (TNF).
Odpowiedź humoralna: myszy BALB/c immunizowano stosując 1 mg HBsAg samodzielnie lub w połączeniu z ODN CpG przez wstrzyknięcie i.m. Zwierzętom podano dawkę przypominającą 4 tygodnie po głównej immunizacji. Miana przeciwciał zmierzono na końcu metodą ELISA. Miana izotypu IgG zmierzono na końcu, 2 tygodnie po podaniu dawki przypominającej, posługując się metodą ELISA. Wyniki przedstawiono na fig. 42A i B.
Odpowiedź z udziałem cytotoksycznych limfocytów T: myszy BALB/c immunizowano stosując 1 mg HBsAg samodzielnie lub w połączeniu z ODN CpG przez wstrzyknięcie i.m. Zwierzętom podano dawkę przypominającą 4 tygodnie po pierwszej immunizacji. Aktywność CTL zmierzono w 4 tygodniu po podaniu dawki przypominającej stosując test uwalniania Cr. Wyniki przedstawiono na fig. 42C.
Zatem miękkie i semi-miękkie ODN są podobne lub lepsze w aktywacji mysiego układu odpornościowego jak można stwierdzić na podstawie badań zarówno in vitro, jak i in vivo i mogą wzmacniać swoistą dla antygenu odpowiedź immunologiczną.
Przykład 33. Zastosowanie ODN CpG w leczeniu przeciwnowotworowym in vivo.
ODN według wynalazku badano pod kątem efektywności na trzech modelach nowotworowych w formie monoterapii. Początkowo ODN podawano myszom z rakiem nerki (renca). Doświadczenia 5 przeprowadzono następująco: tworzenie guzów indukowano przez wstrzykiwanie podskórne 2x10 komórek renca w lewy bok myszy w dniu 0. Leczenie prowadzono podając iniekcje s.c. z PBS, ODN CpG 241 lub 242 raz w tygodniu przez 5 tygodni zaczynając od 10 dnia po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Wyniki przedstawiono na fig. 43A i B.
Drugim badanym modelem był mysi niedrobnokomórkowy rak płuca (rak płuca Lewis'a). Tworzenie guzów indukowano przez wstrzykiwanie s.c. 2x106 komórek raka płuca Lewis'a w lewy bok myszy w dniu 0. Leczenie prowadzono podając iniekcje SC z PBS, 100 mg ODN CpG 241 lub 242 w 1,3 i 7 dniach tygodnia przez 2 miesiące. Wyniki przedstawiono na fig. 43E i F.
Trzecim badanym modelem była mysia neuroblastoma. 1x106 komórek Neuro2a wstrzykiwano SC w lewy bok w dniu 0. Iniekcje s.c. z PBS, 100 mg ODN CpG 241 lub 242 podawano każdego dnia od 10 dnia do 15 dnia. Wyniki przedstawiono na fig. 43C i D.
Zatem semi-miękki ODN może kontrolować wzrost raka (mysi renca, LLC, neuroblastoma) i zwiększać przeżywalność myszy chorych na te nowotwory.
P rz yk ła d 3 4 . Zapalenie okołonerkowe wywołane podawaniem miękkiego, semi-miękkiego i twardego ODN myszom BALB/c ze znokautowanym TLR-9.
U myszy BALB/c ze znokautowanym TLR-9 badano zapalenie okołonerkowe. Wyniki przedstawiono odpowiednio w tabeli 19 i 20. Semi-miękkie ODN (241) indukowały mniejszy odczyn zapalny w miejscu wstrzyknięcia, nie wywoływały (dawka 100 mg) lub wywoływały niewielkie (dawka 250 mg) zapalenie okołonerkowe, i były lepiej tolerowane przy wielokrotnym podawaniu ODN.
PL 227 938 B1
T a b ela 19
Grupa Zapalenie miąższu nerki Ziarniniakowe zapalenie torebki nerkowej Ziarniniakowe zapalenie tkanki tłuszczowej
PBS prawidłowe prawidłowe prawidłowe
5/5 5/5 5/5
242 łagodne łagodne do łagodne do
100 mg 2/5 umiarkowanego 5/5 umi arkowanego 4/5
242 łagodne łagodne do wyraźne
2 50 mg 1/4 umiarkowanego 4/4 4/4
241 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
100 mg 5/5 5/5 5/5
241 łagodne łagodne łagodne do
2 50 mg 2/5 2/5 umiarkowanego 3/5
T a b e l a 20
Grupa Zapalenie miąższu nerki Ziarniniakowe zapalenie torebki nerkowej Z i arnini akowe zapalenie tkanki tłuszczowej
PBS prawidłowe prawidłowe prawidłowe
5/5 5/5 5/5
242 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
100 mg 5/5 5/5 5/5
242 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
2 50 mg 5/5 5/5 5/5
241 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
10 0 mg 5/5 5/5 5/5
241 prawidłowe prawidłowe prawidłowe
25 0 mg 5/5 5/5 5/5
Powyższe zestawienie uważa się za wystarczające do umożliwienia fachowcom w dziedzinie praktycznej realizacji wynalazku. Zakres wynalazku nie ogranicza się do załączonych przykładów, ponieważ przykłady są w zamierzeniu pojedynczymi ilustracjami jednego aspektu wynalazku. Inne funkcjonalnie równoważne rozwiązania i różne modyfikacje wynalazku oprócz tych tu przedstawionych i opisanych staną się oczywiste dla fachowców w dziedzinie wynikając z powyższego opisu i mieszczą się w zakresie załączonych zastrzeżeń patentowych.
PL 227 938 B1
Lista sekwencji
<110> COLEY PHARMACEUTICAL GROUP, INC. COLEY PHARMACEUTICAL GmbH
<120> IMMUNOSTYMULUJĄCE KWASY NUKLEINOWE
<130> C01037.70048.US
<140> US 60/404820
<141> 2003-08-06
<150> US 60/404479
<151> 2002-08-19
<150> US 60/447377
<151> 2003-02-14
<150> US 60/404820
<151> 2002-08-19
<160> 368
<170> Patentln wersja 3.2
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 1
acgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
PL 227 938 B1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 6
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 7
tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 8
tcgtcgtttc gtcgtt 16 <210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 9
PL 227 938 B1
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 10
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 11
tcgtcgtttt cgtcgtt 17
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (3) .. (3)
<223> dezaguanina
<220>
<221> misc_feature
PL 227 938 B1
<222> (5) .. (6)
<223> dezaguanina
<400> 12
tcntcntttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (3) .. (3)
<223> dezaguanina
<220>
<221> misc_feature
<222> (22) .. (22)
<223> dezaguanina
<400> 13
tcntcgtttt gtcgttttgt cntt 24 <210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 14
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 15
PL 227 938 B1
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 15
tcgtcgtttt acgacgtcgc g 21 <210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 16
tcgtcgtttt acgacgtcgt g 21 <210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 17
tcgtcgtttt acggcgccgc gccg 24 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 227 938 B1 <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1) <223> Ν oznacza a, c, g, lub t z wiązaniem tiofosforanowym, 3-10 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (15) .. (15) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (16) .. (16) <223> N oznacza a, c, g, lub t z wiązaniem tiofosforanowym, 3-10 nukleotydów <400> 18 nngtcgttgt cgttnn 16 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1)
PL 227 938 B1 <223> Ν oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym, 3-10 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (21) .. (27) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (28) .. (28) <223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <400> 19 nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttnn 28 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1) <223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <220>
PL 227 938 B1 <221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> Ν oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (33) .. (33)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów
<220>
<221> misc_feature
<222> (34) .. (34)
<223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <400> 20 nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttgtcg ttnn 34 <210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 21
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 22
PL 227 938 B1 tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 23
tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 24
tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 25
tcgtcgtttt gcgacgtcgc g 21 <210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 26 tcgtcgtttt tcgacgtcga g 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 27 tcgtcgtttt tcgacgtcgc g 21 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (6) .. (6) <223> dezaguanina <220>
<221> misc_feature <222> (19) .. (19) <223> dezaguanina <400> 28 tcgtcntttt gtcgttttnt cgtt 24 <210> 29
PL 227 938 B1
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 29
tcgtcgtttc gacgtt 16 <210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 30
tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt 24 <210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 31
tcgtcgtttc gtcgacgtcg tttcgtcg 28 <210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
PL 227 938 B1
<400> 32
tdgtcgtttc gtcgat <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 33 16
tcgtcgtttc gtcgatt <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 34 17
tcgtcgtttc gtcgt <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 35 15
tcgtcgtttc gtcgtt <210> 36 <211> 24 <212> DNA 16
PL 227 938 B1
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 36
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24 <210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 37
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24 <210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 38
tcgtcgtttg tcgtcggcgg ccgccg 26 <210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 39
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
PL 227 938 B1
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleotyd
<400> 40
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 41
<211> 17
<212> DNA '
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 41
tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 42
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
PL 227 938 B1 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 43 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 44
tcgtcgtttt cgtcgt 16 <210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 45
tcgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 46 tcgtcgtttt cgttgtt 17 <210> 47 <211> 21
PL 227 938 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 47 tcgtcgtttt gtcgtcgttt t 21 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 48 tcgtcgtttt ttttcgtcgt ttt 23 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 49 tcgtcgtttt tgtcgtt 17 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 50
PL 227 938 B1 tcgtcgtttt tgttgtt 17 <210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> mi sc_feature
<222> (11) .. (11)
<223> dezaguanina
<220>
<221>. . misc_feature
<222> (14) .. (14)
<223> dezaguanina
<400> 51
tcgtcgtttt ntcnttttgt cgtt 24 <210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 52
tcgtcgtttt gacgtt 16 <210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 53 tcgtcgtttt gacgtttt 18 <210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01i godeoksynukleo tyd
<400> 54
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 55
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 56
tcgtcgtttt gtcgtt 16 <210> 57
PL 227 938 B1 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1) <223> Ν oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym, 3-10 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (2) .. (2) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (39) .. (39) <223> N oznacza a, c, g, lub t, 0-20 nukleotydów <220>
<221> misc_feature <222> (40) .. (40) <223> N oznacza a, c, g, lub t, z wiązaniem tiofosforanowym,
3-10 nukleotydów <400> 57 nngtcgttgt cgttgtcgtt gtcgttgtcg ttgtcgttnn 40 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
PL 227 938 Β1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (19) .. (19)
<223> dezaguanina
<220>
<221> misc_feature
<222> (22) .. (22)
<223> dezaguanina
<400> 58
tcgtcgtttt gtcgttttnt cntt 24 <210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 59
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 60
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
PL 227 938 B1 <223> 2'-deoksyuracyl <400> 60 tcgtcgtttn gtcgttt 17 <210> 61 <211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) ·. (10)
<223> 2 ' -deoksyuracyl
<400> 61
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24 <210> 62 <211> 16 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 62
tcgtcgtttg cgtcgt 16 <210> 63 <211> 17 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 227 938 B1 <400> 63 tcgtcgtttg cgtcgtt <210> 64 <211> 14 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 64 tcgtcgtttg tcgt <210> 65 <211> 15 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 65 tcgtcgtttg tcgtt <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9) <223> 2'-deoksyuracyi <220>
100
PL 227 938 B1
<221> misc_feature
<222> (15) .. (18)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 66
tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt 24 <210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 67
tcgttttgtc gtttt 15 <210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 68
tcgttttgtc gtttttttt 19 <210> 69
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 69 tcgttttttt tcgtttt 17
PL 227 938 B1
101
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 70
tcgttgtttt cgtcgtt 17 <210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 71
tcgttgtttt cgttgtt 17 <210> 72
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 72
tcgttgtttt tgtcgtt 17 <210> 73
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
102
PL 227 938 B1 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 73 tcgttgtttt tgttgtt 17 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (4) .. (4) <223> 2'-deoksyuracyl <220>
<221> misc_feature <222> (18) .. (18) <223> 2'-deoksyuracyl <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> 2'-deoksyuracyl <400> 74 tcgncgtttt gtcgtttcngn cgtt 24 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
PL 227 938 B1
103 <400> 75 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt <210> 76 <211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 76
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25 <210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 77
tgtcgtttcg tcgtt 15 <210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 78
tgtcgttttg tcgtt 15 <210> 79 <211> 20
104
PL 227 938 B1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 79
ttagttcgta gttcttcgtt 20 <210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 80
ttcgtcgttt cgtcgtt 17 <210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 81
ttcgtcgttt cgtcgttt 18 <210> 82
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 82
PL 227 938 B1
105 ttcgtcgttt tgtcgtt 17 <210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 83
ttcgttctta gttcgtagtt 20 <210> 84
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 84
tttcgacgtc gttt 14 <210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 85
ttttcgtcgt tttgtcgtcg t 21 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
106
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 86 ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 87 ttttcgtcgt tttttttcgt cgt <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 88 ttttcgtcgt tttttttcgt cgtttt <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 89 ttttcgtcgt tttgtcgtcg tttt <210> 90
PL 227 938 B1
107
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 90
ttttcgtttt gtcgt 15 <210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 91
ttttcgtttt gtcgtttt 18 <210> 92
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 92
ttttcgtttt ttttcgt 17 <210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja '
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
108
PL 227 938 B1 <400> 93 ttttcgtttt ttttcgtttt 20 <210> 94
<211> 18 .
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 94
ttttcgtttt gtcgtttt 18 <210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 95
ttttttttcg ttttgtcgt 19 <210> 96
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 96
ttgtcgtttt cgtcgtt 17 <210> 97 <211> 17 <212> DNA
PL 227 938 B1
109
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 97
ttgtcgtttt cgttgtt 17 <210> 98
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 98
ttgtcgtttt tgtcgtt 17 <210> 99
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 99
ttgtcgtttt tgttgtt 17 <210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 100 tcgtcgtttt gtcgtttgtc gtt 23
110
PL 227 938 B1 <210> 101 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 101 tcgtcgtttt gtcgtt 16 <210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 102
tcgtcgtttc gtcgtt 16 <210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 103
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25 <210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
111 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 104 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 105
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 106
-<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 106
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 107
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 108 <211> 24
112
PL 227 938 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 108 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 109
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 110
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 111
PL 227 938 B1
113 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 112 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 113 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 114 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
114
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 115 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 116
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 117
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 118
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 118
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 119
PL 227 938 B1
115
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 119
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 120
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 120
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 121
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 122
<2'_1> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
116
PL 227 938 B1 <400> 122 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 123
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 124
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 125
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 126 <211> 24 <212> DNA
PL 227 938 B1
117 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 126 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 127 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 128 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 129 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 129 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
118
PL 227 938 B1 <210> 130 <2ll> 24 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 130
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 131
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd .
<400> 132
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
119 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 133 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 134 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 135 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 136 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 137 <211> 24
120
PL 227 938 B1 <212> DNA <2'13> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 137 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 138
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 138
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 139
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 140
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 140
PL 227 938 B1
121 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 141
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 142
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 143
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
122
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 144 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 145
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 146
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 146
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 147
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 148
PL 227 938 B1
123 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 148 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 149 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 149 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 150 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 151 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
124
PL 227 938 B1 <400> 151 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 152 <211> 24 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 152
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 153 '
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 153
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 154
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 155 <211> 24 <212> DNA
PL 227 938 B1
125
126
PL 227 938 B1
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 159
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoks ynukleo tyd
<400> 160
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 161
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 161
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
127 <223> Oligodeoksynukleotyd <4Ό0> 162 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 163
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 164
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 164
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 165
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 166 <211> 24
128
PL 227 938 B1 <212> DNA <2l3> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 166 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 167
<211>, 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 167
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 168
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 169
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 169
PL 227 938 B1
129 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 170
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 171
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 171
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 172
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 173 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
130
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 173 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 174 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 175 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 175 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 176 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 176 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 177
PL 227 938 B1
131
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 177
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 178
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 178
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 179
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 180 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
132
PL 227 938 B1 <400> 180 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 181
<211> 24 .
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 181
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 182
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 183
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 183
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 184 <211> 24 <212> DNA
PL 227 938 B1
133 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 184 .
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 185
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 185
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 186
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 187
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 187
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
134
PL 227 938 B1 <210> 188 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 188
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 189
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 190
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 191
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
135 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 191 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 192 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 193 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 193 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 194 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 194 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 195 <211> 24
136
PL 227 938 B1
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 195
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 196
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 196
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 197
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 197
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 198
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> 01igodeoksynukleotyd
<400> 198
PL 227 938 B1
137 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 199
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 199
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 200
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 200
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 201
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
138
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 202 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 203 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 203 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 204 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 204 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 205 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 205 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 206
PL 227 938 B1
139 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 206 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 207 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 207 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 208 <2il> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 208 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 209 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
140
PL 227 938 B1 <400> 209 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 210
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 210
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 211
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 211
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 212
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 212
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 213 <211> 24 <212> DNA
PL 227 938 B1
141 <213> Sztuczna sekwencja <22 0>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 213 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 214
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 214
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 215
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 215
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 216 <211> 24 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 216
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
142
PL 227 938 B1
<210> 217
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja ,
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 217
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 218
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 218
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 219
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 219
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 220
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
143 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 220 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 221 ,
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 221
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 222
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 222
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 223
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 223
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 224 <211> 24
144
PL 227 938 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 224 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 225 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 225 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 226 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 226 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 227 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 227
PL 227 938 B1
145 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 228 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 228 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 229 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 229 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 230 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 230 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 231 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
146
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 231 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 232
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 232
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 233
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 233
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 234
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 234
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 235
PL 227 938 B1
147 <211> 24 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 235
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 236
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 236
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 237
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 237
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 238
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
148
PL 227 938 B1 <400> 238 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 239
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 239
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 240 .
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 240
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 241
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 241
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 242 <211> 23 <212> DNA
PL 227 938 B1
149 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 242 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgt <210> 243 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 243 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt <210> 244 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 244 tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt <210> 245 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 245 tcgtcgtttc gtcgtt
150
PL 227 938 B1
<210> 246
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 246
tcgtcgtttt gtcgtt 16 <210> 247
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 247
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 248
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 248
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 249
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
151 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 249 tcgccgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 250
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 250
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 251
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 251
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 252
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 252
tcgccgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 253 <211> 22
152
PL 227 938 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 253 tcgccgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 254
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 254
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 255
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 255
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 256
<211> 22
<212> DNA .
<213> Sztuczna sekwencja ·
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 256
PL 227 938 B1
153 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 257
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 257
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 258
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 258
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25 <210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 259
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24 <210> 260
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
154
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 260 tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt <210> 261 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 261 tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt <210> 262 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 262 tcgtcgtttc gacgttttgt cgtt <210> 263 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 263 tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt <210> 264
PL 227 938 B1
155
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 264
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 265
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 265
tcgtcgtttt gacgtttt 18 <210> 266
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 266
tcgtcgtttt gacgtt 16 <210> 267
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
156
PL 227 938 B1 <400> 267 tcgtcgtttc gacgtt 16 <210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 268
gttctcgctg gtgagtttca 20 <210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 269
gttctcgctg gtgagtttca 20 <210> 270
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 270
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24 <210> 271 <211> 24 <212> DNA
PL 227 938 B1
157
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 271
tcgtcgtttc gtcgtttcgt cgtt 24 <210> 272
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
<223> 2 ' -deoksyuracyl
<400> 272
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24 <210> 273
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (10)
<223> 2'-deoksyuracyl <400> 273 tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24
158
PL 227 938 B1
<210> 274
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc..f eature
<222> (10) .. (10)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 274
tcgtcgtttn gtcgttttgt cgtt 24 <210> 275
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 275
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 276
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 276
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 277
PL 227 938 B1
159
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (4)
<223> 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (18) .. (18)
<223> 2 ' -deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (20) .. (20)
<223> 2'-deoksyuracyl
<400> 277
tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt 24 <210> 278
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (4)
<223> 2'-deoksyuracyl
160
PL 227 938 B1 <220>
<221> misc_feature <222> (18) .. (18) <223> 2'-deoksyuracyi <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> 2'-deoksyuracyi <400> 278 tcgncgtttt gtcgtttngn cgtt <210> 279 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9) <2 2 3 > 2'-deoksyuracyi <220>
<221> misc_feature <222> (15) .. (18) <223> 2'-deoksyuracyi <400> 279 tcgtcgnnnt gtcgnnnngt cgtt <210> 280 <211> 24 <212> DNA
PL 227 938 B1
161 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9) <223> 2'-deoksyuracyl <220>
<221> misc_feature <222> (15) .. (18) <223> 2'-deoksyuracyl <400> 280 tcgtcgnnnc gtcgnnnngt cgtt <210> 281 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 281 aacgtcgttt tcgtcgtt <210> 282 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 282 aacgtcgttt tcgtcgtt
162
PL 227 938 B1 <210> 283 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 283 tcgtcgtttt cgtcgt <210> 284 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 284 tcgtcgtttt cgtcgtt <210> 285 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 285 aacgtcgttt tcgtcgtt <210> 286 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
PL 227 938 B1
163 <223> Oligodeoksynukleotyd <400> 286 tgctgctttt gtgcttttgt gett 24
<210> 287
<211> 25
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 287
tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25 <210> 288
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 288
tcgttttttt cgtttttttc gttt 24 <210> 289
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 289
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21 <210> 290 <211> 22
164
PL 227 938 B1 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 290
tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt 22 <210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 291
tcgtcgtttt cgtttttttc gttt 24 <210> 292
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 292
tcgttttgtc gtttttttcg a 21 <210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 293
PL 227 938 B1
165 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 294
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 294
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 295
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 295
tcgtcgtttt cggcggccgc cg <210> 296
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
166
PL 227 938 B1 <222> (16) .. (16) <223> Ν oznacza a, c, g, lub t <400> 296 tcgtcgtttt gancgntt <210> 297 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 297 tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt <210> 298 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 298 tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt <210> 299 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 299 tcgtcgtttt gacgtttt <210> 300
PL 227 938 B1
167 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <4C0> 300 tcgtcgtttt gacgtt <210> 301 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (7) <223> N oznacza a, c, g, lub <220>
<221> misc_feature <222> (14) .. (14) <223> N oznacza a, c, g, lub <220>
<221> misc_feature <222> (17) .. (17) <223> N oznacza a, c, g, lub <4C0> 301 tcgtatncgt tttncgntt <210> 302 <211> 18
168
PL 227 938 B1 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc ._.f eature
<222> (6) .. (6)
<223> Ν oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> mi sc_feature
<222> (16) .. (16)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 302
tcgatncgtt ttncgntt 18 <210> 303
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (6) .. (6)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
PL 227 938 B1
169
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16) .. (16)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 303
tcgttncgtt ttncgntt 18 <210> 304
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 304
tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23 <210> 305
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 305
tcgttttgac gttttgtcgt t 21 <210> 306
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
170
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9) <223> Ν oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (12) .. (12) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (15) .. (17) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 306 tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt 24 <210> 307 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (7) .. (9)
PL 227 938 B1
171 <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (12) .. (12) <223> Ń oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (15) . . (17) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 307 tcgtcgnnnc gncgnnncgn cgtt 24 <210> 308 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (12) .. (12) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (20) .. (20) <223> N oznacza a, c, g, lub t
172
PL 227 938 B1 <400> 308 tcgtcgttac gncgttacgn cgtt 24 <210> 309
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (9)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15) .. (17)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 309
tcgtcgnnnc gtcgnnncgt cgtt 24 <210> 310
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 310
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt 24 <210> 311 <211> 16 <212> DNA
PL 227 938 B1
173
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (4)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7) .. (8)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11) .. di)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 311
tcgncgnncg ntcgtt 16 <210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (4) .. (4)
<223> Ν oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature
174
PL 227 938 B1
PL 227 938 B1
175 <211> 13
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (6) .. (6)
<223> N oznacza a, c, g( lub t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 315
tcgcgncgcg cgn 13 <210> 316
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22D>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 316
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
176
PL 227 938 B1 <400> 317 tcgcgacgtt cgcgcgcgcg 20 <210> 318 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (4) .. (5) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (8) .. (9) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (14) .. (14) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 318 ttgnntgnnt tttntttttt t 21 <210> 319 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 319
PL 227 938 B1
177 ttgcgtgcgt tttgacgttt tttt 24 <210> 320
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 320
ttggctggct tttgacgttt tttt 24 <210> 321
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 321
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 322
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 322
tcgtcgttac gtcgttacgt cgtt 24 <210> 323 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
178
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 323 tcgatcgttt ttcgtgcgtt ttt 23 <210> 324
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 324
tcgtcgtttt gacgtttt 18 <210> 325
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 325
tcgtcgtttt gacgtt 16 <210> 326
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 326
tcgttttgac gttttgtcgt t <210> 327
PL 227 938 B1
179
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 327
tcgtcgtttt gaccggttcg tgtt 24 <210> 328
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 328
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 329
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
<400> 329
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 330
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oli godeoksynukleo tyd
180
PL 227 938 B1 <400> 330 tccaggactt ctctcaggtt 20 <210> 331 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (4) .. (5) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (8) .. (9) <223> N oznacza a, c, g, lub t <220>
<221> misc_feature <222> (14) .. (14) <223> N oznacza a, c, g, lub t <400> 331 ttgnntgnnt tttntttttt t 21 <210> 332 <211> 13 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
PL 227 938 B1
181
<221> misc_feature
<2'22> (6) .. (6)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<220>
<221> misc__f eature
<222> (13) .. (13)
<223> N oznacza a, c, g, lub t
<400> 332
tcgcgncgcg cgn 13 <210> 333
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd.
<400> 333
cgtcgttttg acgttttgtc gtt 23 <210> 334
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 334
gtcgttttga cgttttgtcg tt 22 <210> 335 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
182
PL 227 938 B1 <220>
<2'23> Oligodeoksynukleotyd <400> 335 tcgttttgac gttttgtcgt t 21 <210> 336
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 336
cgttttgacg ttttgtcgtt 20 <210> 337
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 337
gttttgacgt tttgtcgtt 19 <210> 338
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 338
ttttgacgtt ttgtcgtt 18 <210> 339
PL 227 938 B1
183 <211> 17 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 339
tttgacgttt tgtcgtt 17 <210> 340
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 340
ttgacgtttt gtcgtt 16 <210> 341
<211> 15
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 341
tgacgttttg tcgtt 15 <210> 342
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
184
PL 227 938 B1
<400> 342
gacgttttgt cgtt 14
<210> 343
<211> 13
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 343
acgttttgtc gtt 13
<210> 344
<211> 11
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 344
gttttgtcgt t 11
<210> 345
<211> 11
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 345
gttttgtcgt t 11
<210> 346
<211> 10
<212> DNA
PL 227 938 B1
185
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 346
ttttgtcgtt 10 <210> 347
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 347
tcgtcgtttt gacgttttgt cgt 23 <210> 348
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 348
tcgtcgtttt gacgttttgt cg 22 <210> 349
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 349
tcgtcgtttt gacgttttgt c 21
186
PL 227 938 B1 <210> 350 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 350 tcgtcgtttt gacgttttgt <210> 351 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 351 tcgtcgtttt gacgttttg <210> 352 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 352 tcgtcgtttt gacgtttt
<210> 353
<211> 17
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
PL 227 938 B1
187 <22 3> Oligodeoksynukleotyd <400> 353 tcgtcgtttt gacgttt <210> 354 <211> 16 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 354 tcgtcgtttt gacgtt <210> 355 <211> 15 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 355 tcgtcgtttt gacgt <210> 356 <211> 14 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 356 tcgtcgtttt gacg <210> 357 <211> 13
188
PL 227 938 B1 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 357
tcgtcgtttt gac 13 <210> 358
<211> 12
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 358
tcgtcgtttt ga 12 <210> 359
<211> 11
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd .
<400> 359
tcgtcgtttt g 11 <210> 360
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 360
PL 227 938 B1
189 tcgtcgtttt 10 <210> 361
<211> 22
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 361
cgtcgttttg acgttttgtc gt 22 <210> 362
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 362
gtcgttttga cgttttgtcg 20 <210> 363
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 363
tcgttttgac gttttgtc 18 <210> 364
<211> 16
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
190
PL 227 938 B1 <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 364 cgttttgacg ttttgt 16 <210> 365
<211> 14
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 365
gttttgacgt tttg 14 <210> 366
<211> 12
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 366
ttttgacgtt tt 12 <210> 367
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 367
tttgacgttt 10 <210> 368
PL 227 938 B1
191
<211> 24
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 368
tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24 <210> 369
<211> 23
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 369
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23 <210> 370
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 370
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21 <210> 371
<211> 19
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
192
PL 227 938 B1 <400> 371 tcggacgttc ggcgcgccg 19 <210> 372
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 372
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20 <210> 373
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 373
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20 <210> 374
<211> 18
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 374
tcgacgttcg gcgcgccg 18 <210> 375 <211> 18 <212> DNA
PL 227 938 B1
193 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <400> 375 tcgcgtcgtt cggcgccg 18 <210> 376
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 376
tgtcgttttt tttttttttt 20 <210> 377
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 377
tgtcgttttt tttttttttt 20 <210> 378
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
194
PL 227 938 B1
<222> (1) .. (1)
<223> N - uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (20)
<223> N = uracyl
<400> 378
ngtcgttnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 379
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) -· (1)
<223> N = uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (20)
<223> N = uracyl
<400> 379
ngtcgttnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 380 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
PL 227 938 B1
195
<223> Oligodeoksynukleotyd
<22 0>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> Ν oznacza 2'-deoksyuracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (20)
<223> Ν oznacza 2'-deoksyuracyl
<400> 380
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt 20
<210> 381
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> N oznacza 2 '-deoksyuracyl
<220>
<221> miscfeature
<222> (8) .. (19)
<223> N oznacza 2'-deoksyuracyl
<400> 381
ngtcgttnnn nnnnnnnnnt 20
196
PL 227 938 B1
<210> 382
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> mi sc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> Ν oznacza uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (8) .. (12)
<223> N oznacza uracyl
<400> 382
ngtcgttnnn nngggagggg 20
<210> 383
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (1)
<223> N oznacza uracyl
<220>
<221> misc_feature
PL 227 938 B1
197 <222> (8) .. (12) <223> Ν oznacza uracyl <400> 383 ngtcgttnnn nngggagggg 20 <210> 384 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (1) <223> Ν oznacza uracyl <220>
<221> misc_feature <222> (10) .. (12) <223> Ν oznacza uracyl <400> 384 ngtcgttccn nngggagggg 20 <210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Oligodeoksynukleotyd <220>
198
PL 227 938 B1
<221> misc_feature
<222> (1) · (1)
<223> N oznacza uracyl
<220>
<221> misc_feature
<222> (10) .. (12)
<223> N oznacza uracyl
<400> 385
ngtcgttccn nngggagggg 20
<210> 386
<211> 20
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 386
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 387
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 387
tcaacgttga 10
PL 227 938 B1
199
<210> 388
<211> 10
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Oligodeoksynukleotyd
<400> 388
tcaagcttga 10
Zastrzeżenia patentowe

Claims (2)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    Immunostymulujący oligonukleotyd, znamienny tym, że zawiera co najmniej dwa wewnętrzne dinukleotydy CG, przy czym C jest niemetylowany, i chimerowy szkielet, przy czym co najmniej dwa wewnętrzne i dinukleotydy CG posiadają internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe, i przy czym każdy dodatkowy wewnętrzny di nukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe lub stabilizowane wiązanie internukleotydowe, i przy czym wszystkie inne wiązania internukleotydowe są stabilizowane, i przy czym stabilizowane wiązanie stanowi wiązanie tiofosforanowe, ditiofosforanowe, metylofosfonianowe lub metylotiofosforanowe.
    Oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że immunostymulujący oligonukleotyd zawiera dwa do sześciu wewnętrznych dinukleotydów CG posiadających internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
    Oligonukleotyd według zastrz.
  2. 2, znamienny tym, że każdy wewnętrzny dinukleotyd CG posiada internukleotydowe wiązanie fosfodiestrowe.
    Oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że immunostymulujący oligonukleotyd ma sekwencję *A*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO: 1),
    G*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*A*C_G*C (SEQ ID NO: 2),
    G*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*C (SEQ ID NO: 3), oznaczoną SEQ ID NO: 5, T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 6), T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 7),
    T*C*G*T*C_G*T*T*T*C_G*t*C_G*T*T (SEQ ID NO: 8), oznaczoną SEQ ID NO: 9, T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 10), T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 11), T*C_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 12), T*C_7*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*C (SEQ ID NO: 13),
    T*C_G*C*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 14), oznaczoną SEQ ID NO: 15, oznaczoną SEQ ID NO: 16, oznaczoną SEQ ID NO: 17, oznaczoną SEQ ID NO: 21, oznaczoną SSQ ID NO: 22,
    T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 23),
    T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C_G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 24), oznaczoną SEQ ID NO: 25, oznaczoną SEQ ID NO: 26, oznaczoną SEQ ID NO: 27, T*C_G*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 28), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C*G*T*T (SEQ ID NO: 29), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 30),
    200
    PL 227 938 B1
    T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C*G (SEQ ID NO: 31), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T (SEQ ID NO: 32), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*A*T*T (SEQ ID NO: 33), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 34), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 35), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 36), T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 37), T*C_G*T*C_G*T*T*T*G*T*C*G*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 38), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G (SEQ IDNO: 39), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (sEQ ID NO: 40), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 41), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*C_G*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 42), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*G*C_G*G*C*C_G*C*C*G (SEQ ID NO: 43), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 44), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 45), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 46), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 47), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 48), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 49), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 50), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 51), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T (SEQ ID NO: 52), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 53), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T (SEQ ID NO: 54), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 55), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 56), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_7*T*C_7*T*T (SEQ ID NO: 58), T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 59), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 60), T*C_G*T*C_G*T*T*T*U_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 61), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 62), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 63), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 64), T*C_G*T*C_G*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 65), T*C_G*T*C_G*U*U*U*C_G*T*C_G*U*U*U*U_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 66), T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 67), T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T (SEQ ID NO: 68), T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 69), T*C_G*T*T_G*t*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 70), T*C_G*T*T_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 71), T*C_G*T*T_G*t*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 72), T*C_G*U*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*U_G*U*C_G*T*T (SEQ ID NO: 74), T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 75), T*G*T*C_G*T*T*G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 76), T*G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 77), T*G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 78), T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T*C*T*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 79), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 80), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 81), T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 82), T*T*C_G*T*T*C*T*T*A*G*T*T*C_G*T*A*G*T*T (SEQ ID NO: 83), T*T*T*C_G*A*C_G*T*C_G*T*T*T (SEQ ID NO: 84), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 85), T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 86), T*t*t*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 87), T*t*t*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 88),
    PL 227 938 B1
    201
    T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 89),
    T*t*t*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 90),
    T*t*t*T*C_G*T*T*T*T*G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 91),
    T*t*t*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T (SEQ ID NO: 92),
    T*t*t*T*C_G*T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 93),
    T*T*T*T*C_G_T*T*T*T_G*T*C_G*T*T*T*T (SEQ ID NO: 94),
    T*T*T*T*T*T*T*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T (SEQ ID NO: 95)
    T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 96),
    T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*C_G*T*T_G*T*T (SEQ ID NO: 97),
    T*T_G*T*C_G*T*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 98), lub
    T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T(SEQ ID NO: 241), przy czym * oznacza tiofosforan, _ oznacza fosfodiester, U oznacza 2'-deoksyuracyl, a 7 oznacza 7-deazaguaninę.
    Oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że immunostymulujący oligonukleotyd jest wybrany z grupy składającej się z:
    T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T (SEQ ID NO: 102) i
    T*C_G*T*C_G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 104), przy czym * oznacza tiofosforan a _ oznacza fosfodiester.
    Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -5, znamienny tym, że immunostymulujący oligonukleotyd ma sekwencję cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy B. Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -5, znamienny tym, że immunostymulujący oligonukleotyd ma sekwencję cząsteczki immunostymulującego kwasu nukleinowego klasy C. Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -5, znamienny tym, że immunostymulujący oligonukleotyd ma długość 4-100 nukleotydów.
    Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -8, znamienny tym, że kwas nukleinowy posiada szkielet zawierający deoksyrybozę lub rybozę.
    Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -8, znamienny tym, że oligonukleotyd występuje w kompozycji, która ponadto zawiera adiuwant albo antygen.
    Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -8, znamienny tym, że stabilizowane wiązania internukleotydowe wybrane są z grupy składającej się z: wiązania tiofosforanowego, ditiofosforanowego, metylofosfonianowego, metylotiofosforanowego, i ich kombinacji.
    Oligonukleotyd według jednego z zastrz. 1 -8, znamienny tym, że stabilizowane wiązania internukleotydowe są wiązaniami tiofosforanowymi.
PL375398A 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujące oligonukleotydy PL227938B1 (pl)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40447902P 2002-08-19 2002-08-19
US40482002P 2002-08-19 2002-08-19
US60/404,820 2002-08-19
US60/404,479 2002-08-19
US42970102P 2002-11-27 2002-11-27
US60/429,701 2002-11-27
US44737703P 2003-02-14 2003-02-14
US60/447,377 2003-02-14
PCT/US2003/025935 WO2004016805A2 (en) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostimulatory nucleic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL375398A1 PL375398A1 (pl) 2005-11-28
PL227938B1 true PL227938B1 (pl) 2018-01-31

Family

ID=31892263

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL375398A PL227938B1 (pl) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujące oligonukleotydy
PL414814A PL232260B1 (pl) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL414814A PL232260B1 (pl) 2002-08-19 2003-08-19 Immunostymulujący oligonukleotyd i kompozycja takiego oligonukleotydu

Country Status (27)

Country Link
US (2) US8283328B2 (pl)
EP (2) EP2290078B1 (pl)
JP (2) JP5414961B2 (pl)
KR (2) KR100969727B1 (pl)
AR (1) AR040996A1 (pl)
AU (2) AU2003259916B2 (pl)
BR (1) BR0313414A (pl)
CA (1) CA2493753C (pl)
DK (2) DK1538904T3 (pl)
EC (1) ECSP055687A (pl)
ES (2) ES2600553T3 (pl)
HU (2) HUE035336T2 (pl)
IL (1) IL166376A (pl)
MA (1) MA27468A1 (pl)
MX (1) MXPA05002014A (pl)
NO (1) NO20051469L (pl)
NZ (2) NZ560722A (pl)
OA (1) OA12906A (pl)
PE (2) PE20040900A1 (pl)
PL (2) PL227938B1 (pl)
PT (2) PT2290078T (pl)
RS (1) RS20050126A (pl)
SI (1) SI2290078T1 (pl)
SV (1) SV2008001602A (pl)
TW (1) TW200412981A (pl)
UY (1) UY27945A1 (pl)
WO (1) WO2004016805A2 (pl)

Families Citing this family (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
JP2002510644A (ja) * 1998-04-03 2002-04-09 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫治療用オリゴヌクレオチドおよびサイトカインを用いる免疫系刺激のための方法および産物
CA2328406A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
ATE464907T1 (de) * 1999-02-17 2010-05-15 Csl Ltd Immunogene komplexe und methoden in bezug auf diese
EP1176966B1 (en) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
TR200200797T2 (tr) * 1999-09-25 2002-10-21 University Of Iowa Research Foundation İmmünostimülatör nükleik asitler
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
CA2419894A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh Process for high throughput screening of cpg-based immuno-agonist/antagonist
AU2001297693A1 (en) * 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
US8114418B2 (en) * 2001-06-21 2012-02-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—IV
CN1604795B (zh) * 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
US20030139364A1 (en) * 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US20030125292A1 (en) * 2001-11-07 2003-07-03 Sean Semple Mucoscal vaccine and methods for using the same
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
AU2003230806B2 (en) * 2002-04-04 2009-05-07 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
JP2005532067A (ja) * 2002-07-03 2005-10-27 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 刺激性免疫応答用の核酸組成物
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
CN1753687A (zh) * 2002-10-29 2006-03-29 科勒制药集团股份有限公司 Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
WO2004053104A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
EP1608403A2 (en) * 2003-04-02 2005-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
CA2526212C (en) * 2003-05-16 2013-08-27 Hybridon, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with chemotherapeutic agents
EA200600069A1 (ru) * 2003-06-20 2006-08-25 Коли Фармасьютикал Гмбх Низкомолекулярные антагонисты toll-подобных рецепторов (tlr)
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
AU2004275876B2 (en) * 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
WO2005034979A2 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
SG122973A1 (en) * 2003-10-30 2006-06-29 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
US20050256073A1 (en) * 2004-02-19 2005-11-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
US20060019916A1 (en) * 2004-04-02 2006-01-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing IL-10 responses
CA2567789A1 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
CN101160401A (zh) * 2005-02-24 2008-04-09 科勒制药集团公司 免疫刺激寡核苷酸
WO2006110607A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20060241076A1 (en) * 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
US20090117132A1 (en) * 2005-07-07 2009-05-07 Pfizer, Inc. Anti-Ctla-4 Antibody and Cpg-Motif-Containing Synthetic Oligodeoxynucleotide Combination Therapy for Cancer Treatment
CN101310019A (zh) * 2005-09-16 2008-11-19 科利制药公司 具有磷酸二酯主链的免疫刺激性单链核糖核酸
WO2007031877A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (sirna) by nucleotide modification
US7662949B2 (en) * 2005-11-25 2010-02-16 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
CN101394857A (zh) * 2006-02-01 2009-03-25 爱吉恩公司 含有寡聚核苷酸和无毒lps的用于治疗癌症的组合物
DK1991678T4 (da) * 2006-02-15 2020-10-19 Rechtsanwalt Thomas Beck Sammensætninger og fremgangsmåder til oligonukleotid-formuleringer
WO2007143582A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-13 Baylor College Of Medicine Reversal of the suppressive function of specific t cells via toll-like receptor 8 signaling
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
US8377898B2 (en) * 2006-10-12 2013-02-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
US9370531B2 (en) * 2007-08-31 2016-06-21 New York University Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
KR20100068422A (ko) * 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체
WO2009105641A2 (en) 2008-02-20 2009-08-27 New York University Preventing and treating amyloid-beta deposition by stimulation of innate immunity
JP5746038B2 (ja) * 2008-11-04 2015-07-08 インデックス・ファーマシューティカルズ・アクチエボラーグ Ｃｎｓの炎症性疾患の治療のための化合物および方法
US9394333B2 (en) 2008-12-02 2016-07-19 Wave Life Sciences Japan Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
ES2534947T3 (es) 2009-03-25 2015-04-30 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Composiciones para la estimulación de resistencia inmunitaria innata de mamíferos a patógenos
MX342945B (es) 2009-07-06 2016-10-18 Ontorii Inc * Profármacos de ácido nucleico novedosos y métodos de uso de los mismos.
JP2013520498A (ja) 2010-02-25 2013-06-06 デューク ユニバーシティー 防御的抗ｈｉｖ−１抗体の産生を誘導する方法
CN103221428B (zh) 2010-09-09 2016-02-10 辉瑞公司 4-1bb结合分子
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
WO2012084991A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 Index Pharmaceuticals Ab Biologically active oligonucleotides capable of modulating the immune system ii
EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
JP6257607B2 (ja) 2012-06-08 2018-01-10 アデュロ バイオテック，インコーポレイテッド 癌免疫療法のための組成物および方法
AR091569A1 (es) 2012-06-28 2015-02-11 Intervet Int Bv Receptores de tipo toll
KR20240148947A (ko) 2012-07-13 2024-10-11 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
SG11201500243WA (en) * 2012-07-13 2015-04-29 Shin Nippon Biomedical Lab Ltd Chiral nucleic acid adjuvant
MX361680B (es) 2012-12-13 2018-12-13 Aduro Biotech Inc Composiciones que comprenden dinucleótidos de purina cíclicos que tienen estereoquímicas definidas y métodos para su preparación y uso.
ES2878749T3 (es) 2013-02-20 2021-11-19 Innate Pharma Un compuesto que se une específicamente a KIR3DL2 para el uso en el tratamiento de linfoma de células T periférico
SG10201708821RA (en) 2013-04-29 2017-12-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
JP2016518140A (ja) * 2013-05-03 2016-06-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｉ型インターフェロンの環状ジヌクレオチド誘導法
ES2754269T3 (es) 2013-05-18 2020-04-16 Aduro Biotech Inc Composiciones y métodos de activación de la señalización dependiente del "estimulador de los genes de interferón
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
JP6865582B2 (ja) * 2013-05-29 2021-04-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｋｉｒ３ｄｌ２は皮膚及び非皮膚末梢ｔ細胞リンパ腫のサブセットをそれぞれ予防及び治療するために有用なバイオマーカー及び治療標的である
US10176292B2 (en) 2013-07-31 2019-01-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center STING crystals and modulators
WO2015048635A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Mper-liposome conjugates and uses thereof
WO2015108048A1 (ja) * 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP3095460A4 (en) * 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
WO2015108047A1 (ja) * 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
AU2015269412B2 (en) 2014-06-04 2020-03-12 Exicure Operating Company Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
US11213593B2 (en) 2014-11-21 2022-01-04 Northwestern University Sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
LT3240801T (lt) 2014-12-31 2021-02-25 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Kombinuota navikų imunoterapija
EP3301179B1 (en) * 2015-07-09 2019-06-05 National Institute for Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
WO2017210647A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotides, compositions and methods thereof
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
US12460208B2 (en) 2017-04-18 2025-11-04 Parr Biotechnology Co., Ltd. Immunomodulatory polynucleotides and uses thereof
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
KR20200099556A (ko) * 2017-12-15 2020-08-24 바이엘 애니멀 헬스 게엠베하 면역자극성 조성물
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
US12246031B2 (en) 2018-02-13 2025-03-11 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for tumor immunotherapy
MX2020010410A (es) 2018-04-09 2021-01-15 Checkmate Pharmaceuticals Empaquetado de oligonucleotidos en particulas similares a virus.
BR112020020670A2 (pt) * 2018-04-12 2021-03-02 Wave Life Sciences Ltd. composição de oligonucleotídeo, composição farmacêutica, método para alterar o splicing de uma transcrição alvo, método para tratar distrofia muscular, método para preparar um oligonucleotídeo ou uma composição de oligonucleotídeo do mesmo e oligonucleotídeo
TWI844541B (zh) 2018-05-11 2024-06-11 新加坡商波濤生命科學有限公司 寡核苷酸組成物及其使用方法
EP3796983A2 (en) 2018-05-23 2021-03-31 Pfizer Inc. Antibodies specific for gucy2c and uses thereof
PL3797121T3 (pl) 2018-05-23 2024-09-23 Pfizer Inc. Przeciwciała swoiste dla CD3 i ich zastosowania
WO2020128893A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Pfizer Inc. Combination treatments of cancer comprising a tlr agonist
JP7369297B2 (ja) 2019-12-17 2023-10-25 ファイザー・インク Ｃｄ４７、ｐｄ－ｌ１に特異的な抗体、およびその使用
CN114981436A (zh) * 2020-01-10 2022-08-30 Sbi生物技术有限公司 新tlr9激动剂
CA3177717A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
WO2022034555A1 (en) * 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
JP2022161046A (ja) * 2021-04-08 2022-10-21 グラドコフ・アレクセイ Ｎｋ細胞能力アップ方法

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
ATE75483T1 (de) 1981-10-23 1992-05-15 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
AU643141B2 (en) 1991-03-15 1993-11-04 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
WO1994002499A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030050263A1 (en) 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
DE69535905D1 (de) 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
EP0930893B1 (en) 1996-10-11 2005-04-13 The Regents of The University of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
AU738513B2 (en) * 1997-02-28 2001-09-20 University Of Iowa Research Foundation, The Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
WO1998052581A1 (en) 1997-05-20 1998-11-26 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US20040006034A1 (en) 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6589940B1 (en) * 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
WO1999001154A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
EP1009413B1 (en) 1997-09-05 2007-02-14 The Regents Of The University Of California Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or treating asthma
JPH11209289A (ja) 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
JP2002510644A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫治療用オリゴヌクレオチドおよびサイトカインを用いる免疫系刺激のための方法および産物
AU3751299A (en) 1998-04-20 1999-11-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression
EP1077708A1 (en) 1998-05-06 2001-02-28 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
CA2328406A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
AU5337499A (en) 1998-08-03 2000-03-06 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide agent, composition, kit and treatments
WO2000014217A2 (en) 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
DE60013591T2 (de) 1999-04-29 2005-02-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna
EP1377554A1 (en) 1999-06-16 2004-01-07 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
JP5268214B2 (ja) 1999-08-13 2013-08-21 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ−媒体免疫刺激の変調
TR200200797T2 (tr) 1999-09-25 2002-10-21 University Of Iowa Research Foundation İmmünostimülatör nükleik asitler
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
NZ517928A (en) 1999-09-27 2004-09-24 Coley Pharm Gmbh Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
DE60131430T2 (de) 2000-01-14 2008-10-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
WO2001095935A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
AU783687B2 (en) 2000-01-26 2005-11-24 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
EP1267618A1 (en) 2000-03-28 2003-01-02 The Regents Of The University Of California Methods for increasing a cytotoxic t lymphocyte response in vivo
DE10016079A1 (de) * 2000-03-31 2001-10-04 Alstom Power Nv Verfahren zum Entfernen von Kohlendioxid aus dem Abgas einer Gasturbinenanlage sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
DE60100814T2 (de) 2000-06-08 2004-07-01 Intercell Biomedizinische Forschungs- Und Entwicklungs Gmbh Immunstimulierende oligodeoxynukleotide
WO2001097843A2 (en) 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
CA2419894A1 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh Process for high throughput screening of cpg-based immuno-agonist/antagonist
JP2004509970A (ja) 2000-09-26 2004-04-02 ハイブリドン・インコーポレイテッド 位置的化学変化による免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログの免疫刺激活性の調節
AU2001297693A1 (en) 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
US20030055014A1 (en) 2000-12-14 2003-03-20 Bratzler Robert L. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
US8114418B2 (en) 2001-06-21 2012-02-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—IV
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
WO2003014316A2 (en) 2001-08-07 2003-02-20 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
AU2002361468A1 (en) 2001-08-14 2003-03-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human S Method for rapid generation of mature dendritic cells
CN1604795B (zh) 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
WO2003027313A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SUPPRESSORS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS OF USE
WO2003031573A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
WO2003030934A2 (en) 2001-10-06 2003-04-17 Merial Limited Cpg formulations and related methods
US20030139364A1 (en) 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
AU2002366710A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
AU2003230806B2 (en) 2002-04-04 2009-05-07 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
MXPA04010415A (es) 2002-04-22 2005-02-17 Bioniche Life Sciences Inc Composiciones oligonucleotdias y su uso para la modulacion de respuestas inmunes.
AU2003243409A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
CN1753687A (zh) 2002-10-29 2006-03-29 科勒制药集团股份有限公司 Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
AU2003287332A1 (en) 2002-11-01 2004-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
WO2004053104A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
JP2006516099A (ja) 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
KR101123489B1 (ko) 2003-01-16 2012-03-28 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 개질된 면역자극성 디뉴클레오티드를 이용한 올리고뉴클레오티드-기재 화합물의 면역자극 특성의 조절
EP1608403A2 (en) 2003-04-02 2005-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
CA2526212C (en) 2003-05-16 2013-08-27 Hybridon, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with chemotherapeutic agents
EA200600069A1 (ru) 2003-06-20 2006-08-25 Коли Фармасьютикал Гмбх Низкомолекулярные антагонисты toll-подобных рецепторов (tlr)
MXPA06000619A (es) 2003-07-15 2006-04-11 Hybridon Inc Estimulacion sinergistica del sistema inmune usando oligonucleotidos inmunoestimuladores y/o compuestos inmunomeros en conjunto con citocinas y/o agentes quimioterapeuticos o terapia de radiacion.
AU2004275876B2 (en) 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
SG122973A1 (en) 2003-10-30 2006-06-29 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
KR101138131B1 (ko) 2003-12-08 2012-04-23 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극특성의 조절
US20050256073A1 (en) 2004-02-19 2005-11-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
AU2005222909B2 (en) 2004-03-12 2010-03-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Enhanced activity of HIV vaccine using a second generation immunomodulatory oligonucleotide
US20060019916A1 (en) 2004-04-02 2006-01-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing IL-10 responses
CA2567789A1 (en) 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
NZ552522A (en) 2004-06-15 2009-04-30 Idera Pharmaceuticals Inc Immunostimulatory oligonucleotide multimers
US7427405B2 (en) 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
US7283209B2 (en) * 2004-07-09 2007-10-16 Carl Zeiss Smt Ag Illumination system for microlithography
EP1776105A2 (en) 2004-07-18 2007-04-25 Coley Pharmaceutical Group, Ltd Methods and compositions for inducing innate immune responses
KR100958505B1 (ko) 2004-07-18 2010-05-17 씨에스엘 리미티드 면역자극 복합체 및 향상된 인터페론-감마 반응을 유도하기위한 올리고뉴클레오티드 제제
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
CN101160401A (zh) 2005-02-24 2008-04-09 科勒制药集团公司 免疫刺激寡核苷酸
WO2006110607A2 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20060241076A1 (en) 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
US20090117132A1 (en) 2005-07-07 2009-05-07 Pfizer, Inc. Anti-Ctla-4 Antibody and Cpg-Motif-Containing Synthetic Oligodeoxynucleotide Combination Therapy for Cancer Treatment
US7490795B2 (en) * 2005-08-31 2009-02-17 Goodrich Corporation Aircraft evacuation slide with primary gas relief valve
CN101310019A (zh) 2005-09-16 2008-11-19 科利制药公司 具有磷酸二酯主链的免疫刺激性单链核糖核酸
WO2007031877A2 (en) 2005-09-16 2007-03-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (sirna) by nucleotide modification
JP2009510096A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー アダプターオリゴヌクレオチドを用いたｔｌｒ媒介免疫応答の調節
US7776834B2 (en) 2005-11-07 2010-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
US7662949B2 (en) 2005-11-25 2010-02-16 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
DK1991678T4 (da) 2006-02-15 2020-10-19 Rechtsanwalt Thomas Beck Sammensætninger og fremgangsmåder til oligonukleotid-formuleringer
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
CA2664156A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Compositions of tlr ligands and antivirals
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
RU2009115687A (ru) 2006-10-26 2010-11-10 Коли Фармасьютикал Гмбх (De) Олигорибонуклеотиды и их применения
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
WO2008142509A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Class a oligonucleotides with immunostimulatory potency
KR20100068422A (ko) 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체

Also Published As

Publication number Publication date
HUE035336T2 (en) 2018-05-02
NZ538001A (en) 2008-05-30
PL414814A1 (pl) 2016-03-14
NZ560722A (en) 2009-10-30
US8304396B2 (en) 2012-11-06
AU2003259916B2 (en) 2010-01-21
SV2008001602A (es) 2008-02-27
PT1538904T (pt) 2016-11-08
EP1538904B1 (en) 2016-07-27
EP1538904A4 (en) 2008-03-05
US20070224210A1 (en) 2007-09-27
PE20040900A1 (es) 2004-12-29
MXPA05002014A (es) 2005-10-19
CA2493753A1 (en) 2004-02-26
MA27468A1 (fr) 2005-08-01
WO2004016805A9 (en) 2004-08-19
CA2493753C (en) 2014-07-08
AU2003259916A1 (en) 2004-03-03
JP2011004746A (ja) 2011-01-13
JP2006508693A (ja) 2006-03-16
DK1538904T3 (en) 2016-11-21
ECSP055687A (es) 2005-05-30
PL232260B1 (pl) 2019-05-31
ES2634328T3 (es) 2017-09-27
IL166376A0 (en) 2006-01-16
BR0313414A (pt) 2007-07-31
OA12906A (en) 2006-10-13
WO2004016805A3 (en) 2005-02-17
DK2290078T3 (en) 2017-07-31
RS20050126A (sr) 2007-06-04
EP2290078B1 (en) 2017-04-26
IL166376A (en) 2012-10-31
AU2009251186B2 (en) 2013-05-30
UY27945A1 (es) 2004-03-31
NO20051469L (no) 2005-05-19
EP2290078A2 (en) 2011-03-02
PL375398A1 (pl) 2005-11-28
SI2290078T1 (sl) 2017-08-31
PT2290078T (pt) 2017-07-31
EP2290078A3 (en) 2013-02-13
AR040996A1 (es) 2005-04-27
KR20080011247A (ko) 2008-01-31
JP5414961B2 (ja) 2014-02-12
PE20081155A1 (es) 2008-08-15
EP1538904A2 (en) 2005-06-15
ES2600553T3 (es) 2017-02-09
US8283328B2 (en) 2012-10-09
US20050059619A1 (en) 2005-03-17
KR20050034738A (ko) 2005-04-14
AU2009251186A1 (en) 2010-01-28
HUE030347T2 (en) 2017-05-29
TW200412981A (en) 2004-08-01
WO2004016805A2 (en) 2004-02-26
KR100969727B1 (ko) 2010-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2290078B1 (en) Immunostimulatory nucleic acids
KR101251707B1 (ko) 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
US20060211644A1 (en) Immunostimulatory oligonucleotides
JP2006508693A5 (pl)
JP2011500014A (ja) 修飾糖部分を含有する免疫刺激オリゴヌクレオチド類似体
TWI468166B (zh) 具有增強之免疫刺激活性之經磷酸鹽修飾之寡核苷酸類似物
CN1688192B (zh) 免疫刺激核酸
RU2338750C2 (ru) ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ФОСФОРТИОАТНЫЕ CpG-ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ФОСФОДИЭФИРНЫЕ СВЯЗИ, СПОСОБ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ, СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА
HK1154903A (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1076226A (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1076226B (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1154903B (en) Immunostimulatory nucleic acids