JP4874801B2 - 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
関連出願
本願は、2003年6月11日提出の米国仮出願No. 60/477,608、2003年8月29日提出の米国仮出願No. 60/499,038、および2003年9月18日提出の米国仮出願60/504,279の利益を請求し、これらの全体は参照として組み込まれる。
本発明は、分子生物学、免疫学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫賦活(immunostimulatory)オリゴヌクレオチドおよびそれらの治療的使用に関する。
免疫系は、細菌やウイルスなどの病原体のDNAに一般的に生じる非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含むDNAを特異的に認識するように進化してきた。結果として、非メチル化CpG含有DNAは、脊椎動物の免疫系の強力な賦活因子(stimulator)である。DNAによる免疫賦活の最初の報告は、細菌のDNAおよび回文配列を含むDNAの短い断片を用いた研究に発し、これら両方ともホスホジエステル骨格を有する二本鎖構造であった。Tokunaga, T., et al., (J Natl. Cancer Inst. 72: 955-962 (1984))は、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)BCGから単離されたDNAに対して強力な抗腫瘍活性を示した。Kataoka, T, et al., (Jpn. J. Cancer Res. 83: 244-247 (1992))、Hartmann et al. (European. Journal of Immunology 33: 1673-1641 (2003))、Marshall et al. Journal of Leukocyte Biology 73: 781-792 (2003)は、ウシ型結核菌BCGのcDNA配列に基づいて設計した、合成オリゴデオキシヌクレオチドに対して同種の抗腫瘍活性を示した。
本発明は、増大または低減した免疫賦活特性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む内容の新規組成物を提供する。本発明はまた、増大または低減した免疫賦活特性を備えた、または増大した代謝安定性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドの設計を可能にする方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端への二次構造の導入によって、免疫賦活活性およびこれらのオリゴヌクレオチドの安定性に有意な影響が与えられることを見出した。
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、シチジン、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、CpGではない。
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはCpGではない。
DomainA−DomainB−DomainC (I)
各Domainは、約2〜約12ヌクレオチド長であってもよい。DomainAは、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドであって、
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、グアノシンまたは2-デオキシグアノシン、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'DNA、RNA、RNA−DNA、DNA−RNAであってもよい。ある態様において、DomainAは、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される2以上のジヌクレオチドを有する。
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'DNA、RNA、RNA−DNA、DNA−RNA Poly I-Poly Cであってもよい。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、CpGではない。ある好ましい態様において、DomainCは、ジヌクレオチドCpG、C*pG、C*pG*またはCpG*を有さない。
本発明は、増大または低減した免疫賦活特性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドを含む内容の新規組成物を提供する。本発明はまた、増大または低減した免疫賦活特性を備えた、または増大した代謝安定性を備えた免疫賦活オリゴヌクレオチドの設計を可能にする方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端への二次構造の導入によって、免疫賦活活性およびこれらのオリゴヌクレオチドの安定性に有意な影響が与えられることを見出した。
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、ここでオリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の3'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、CpGではない。
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖であり、ここで、オリゴヌクレオチド配列は、該オリゴヌクレオチド配列の5'末端に二次構造を有する。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはCpGではない。
DomainA−DomainB−DomainC (I)
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
前記ジヌクレオチドを含んでいるか、または含んでない、回文または自己相補的なドメインを有しているか、有していない5'-3'または3'-5'または2'-5'DNA、RNA、RNA−DNA、DNA−RNAであってもよく、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはCpGでない。
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他のピリミジンヌクレオシド類縁体であり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他のプリンヌクレオシド類縁体であり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、または有することができず、回文または自己相補的な配列を有するか、または有しない5'-3'または3'-5'、2'-5'DNA、RNA、RNA−DNA、DNA−RNA Poly I-Poly Cであってもよい。ある好ましい態様において、免疫賦活ジヌクレオチドは、CpGではない。ある態様において、DomainBは、好ましくは、DomainAおよびDomainCのオリゴヌクレオチドを連鎖する非ヌクレオチドリンカーであり、「イムノマー(immunomers)」という。ある好ましい態様において、DomainCは、ジヌクレオチドCpG、C*pG、C*pG*またはCpG*を有さない。
Dは、水素結合供与体(hydrogen bond donor)であり;
D’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体(hydrogen bond acceptor)、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され;
Aは、水素結合受容体または親水基であり;
A’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され;
Xは、炭素または窒素であり;そして
S’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−NH−、−NH2、−SHおよび−OHを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、C=O、C=S、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのN3を含む。
Dは、水素結合供与体であり;
D’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され;
Aは、水素結合受容体または親水基であり;
Xは、炭素または窒素であり;
各Lは、独立してC、O、NおよびSからなる群から選択され;そして、
S’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−NH−、−NH2、−SHおよび−OHを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、C=O、C=S、−NO2、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのN1を含む。
b:全ての配列は8を除いてホスホロチオエート修飾した。7においてイタリックで示したヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチドを示し、8において下線のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を示す;
c:ND−測定せず
例1:オリゴヌクレオチド合成、精製および末端融解プロフィール
CpGオリゴは、シアノエチルホスホルアミデートをPerSeptive Biosystem's 8909 Expedite DNA synthesizer (PerSeptive Biosystem, Boston, MA)を用いて、1〜2μmolのスケールで合成した。dA、dG、dCおよびTのホスホルアミデートは、PE Biosystems (Foster City, CA)から得た。Iyer R. P., et al. (J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990))に記載のように、イオジン酸化剤をホスホロチオエート骨格の修飾を得るために用いた。全てのオリゴを、標準のプロトコールを用いて脱保護し、HPLCによって精製し、そして洗浄のためUSP品質の滅菌水に対して透析した。オリゴを凍結乾燥し、蒸留水に再び溶解し、そして濃度を260nmでのUV吸光度から測定した。すべてのオリゴは、純度および分子量の夫々をCGEおよびMALDI−TOF質量分析計(Applied Biosystem's Voyager-DETM STR BiospectrometryTM Workstation)によって特徴付けた。全長のオリゴの純度は90〜96%の範囲であり、残りは、CGEおよび/または変性PAGEによって測定すると、1または2ヌクレオチド短い(n−1およびn−2)。全てのオリゴは、Limulus assay (Bio-Whittaker now known as Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MD)によって測定し、<0.1EU/mLよりも少ないエンドトキシンを含んでいた。
4〜8週齢のBALB/c、C57BL/6またはC3H/HeJマウス由来の脾臓細胞を、Zhao,Q.,et al.(Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996))およびBranda,R.F.,etal.(Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993))に記載のとおり、RPMI完全培地にて培養した。マウスJ774マクロファージ(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を10%(v/v)ウシ胎仔血清および抗生物質(ペニシリンG/ストレプトマイシン 100IU/mL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。他のすべての試薬は、Mediatech (Gaithersburg, MD)から入手した。
典型的には、マウス(Balb-C)脾臓細胞を、0.1、1.0および10.0μg/mlの濃度のCpGオリゴと共に48時間培養し、細胞増殖をZhao,Q.,et al.(Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996))に記載のとおり、3H−ウリジン取り込みにより測定される。
マウス脾臓細胞またはJ774細胞を、それぞれ5×106または1×106細胞/mLを用いて、24ウェルディッシュに播いた。TEバッファー(10mM Tris−HCl、pH7.5、1mM EDTA)に溶解したCpGオリゴを、細胞培養に対し、終濃度0.03、0.1、0.3、1.0、3.0または10.0μg/mLで添加した。次いで細胞を37℃で24時間インキュベートし、上清をELISAアッセイ用に集めた。実験は、各CpGオリゴに対し2または3回行い、各濃度で3回行った。IL−2およびIL−6の分泌は、Bhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))に記載のとおり、サンドイッチELISAで測定した。サイトカイン抗体および標品を含む必要な試薬は、BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)から入手した。
雌BALB/cマウス(4〜6週齢、19〜21gm)を3匹のマウスのグループに分けた。CpGオリゴを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、マウスに5mg/kgの用量で皮下(SC)投与した。Zhao,Q.,et al.(BiochemPharmacol. 51: 173-182 (1996))およびBranda, R.F.,et al.(Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993))に記載のとおり、マウスを48時間後に安楽死させ、脾臓を回収し、重さを量った。
トール様レセプター9(TLR9)は、細菌のプラスミドおよび合成DNAで非メチル化CpGジヌクレオチド(Hemmi H. , et al. Nature 408 : 740-745 (2000))、および活性ストレスキナーゼ(Yi A. K., et al. J. Immunol. 161: 4493- 4497 (1998))、およびNF−κB経路(Stacey K. J., et al. J. Immunol. 157: 2116-2122 (1996))を認識することが示されてきた。CpG DNAで処理したJ774細胞におけるNF−κB活性は、Yu D., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002))およびBhagat L., et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003))に記載のとおり、EMSAで行われ、分析された。
約0.2ODのCpG DNAおよび他のマーカーを25μLの100mM NaCl、10mMリン酸ナトリウムpH7.2バッファーに溶解し、90℃で15分間加熱し、室温まで放置し、ゲルで分析するまで4℃で貯蔵した。調製したDNAサンプルをグリセロールバッファーと混合し、15%非変性ポリアクリルアミドゲルに溶解した。ゲルを260nmUV光で可視化した。
新鮮に採取された健常なボランティアの血液のPBMC(CBR Laboratories, Boston, MA)をフィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)で単離し、PBMCからB細胞を、製造者の説明書にしたがいCD19細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、ポジティブ選択によって単離した。
1×105B細胞/200μlの全量を0.3、1.0、3.0または10.0μg/mLのCpG DNA濃度で64時間賦活化し、次いで0.75μCiの[3H]−チミジンを添加し、8時間後に回収した。放射線の取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。表4は、終濃度10.0μg/mLでの6CpG DNAに対するB細胞増殖の平均±SDを示す。
pDCは、BDCA-4細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用い、製造者の説明書にしたがい、ヒトPBMCから単離した。pDCを1×106細胞/mLを用いて200μL/ウェルで、96ウェルプレートに播いた。オリゴヌクレオチドは、終濃度0.3、1.0、3.0または10.0μg/mLで細胞培養に添加し、37℃で24時間インキュベートした。次いで上清を回収し、IFN−α、IL−6およびIL−10をELISAキット(PBL)を用いてアッセイした。表5Aおよび5Bは、10.0μg/mLの濃度での6オリゴヌクレオチドに対する平均±SDを示す。
脊椎動物細胞、好ましくはBALB/cマウス脾臓細胞またはヒトPBMCにおけるINF−2およびIL−6の分泌は、サンドイッチELISAにより測定した。サイトカイン抗体およびサイトカイン標品を含む必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAから入手した。ELISAプレート(Costar)を、PBSNバッファー(PBS/0.05%アジ化ナトリウム、pH9.6)中、5μg/mLの適当な抗体と4℃で一晩インキュベートし、次いで、37℃で30分間PBS/1%BSAでブロックした。細胞培養上清およびサイトカイン標品をPBS/10%FBSで適当に希釈し、3つプレートに添加し、そして25℃で2時間インキュベートした。1μg/mLで適当なビオチン化抗体を重ね、25℃で1.5時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS−Tバッファー(PBS/0.05% Tween 20)で広範に洗浄し、ペルオキシダーゼ(Sigma, St. Louis, MO)を結合したストレプトアビジンを添加後、さらに25℃で1.5時間インキュベートした。プレートを発色試薬を含むSure Blue(登録商標)(Kirkegaard and Perry)で現像し、反応を停止液(Kirkegaard and Perry)を添加することにより止まった。色の変化をCeres 900 HDI Spectrophotometer (Bio-Tek Instruments)で測定した。
B細胞を、1×106細胞/mL、200μL/ウェルで96ウェルプレートに播いた。オリゴヌクレオチドを終濃度0.3、1.0、3.0または10.0μg/mLで細胞培養物に添加し、37℃で24時間インキュベートした。次いで、上清を採取し、ELISAキット(PBL提供)を用いてIL−6に対してアッセイした。表7は、終濃度10.0μg/mLでオリゴヌクレオチドを加えたドナー5〜10に対する平均±SDを示す。
細胞表面マーカーのCD69およびCD86をBD Pharmingen (San Diego, USA)から購入した抗ヒトCD69−FitcおよびCD86−Fitcを用いて、Coulter Epics- XL Flow Cytometerで検出した。染色方法を次に簡単に示す。活性化した培養細胞を、染色バッファー(1%BSAおよび0.1%NaN3のPBS)中、10%ヒトAB血清(Sigma)で、4℃1時間ブロックし、抗体で4℃一晩染色した。PBMC(4×105)をCD69−FitcおよびCD86−Fitcで染色した。PDC(2×105)をCD86−Fitcで染色した。細胞染色データは、Coulter System IIソフトウェアで取得し、分析した。
前述の発明を、明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明の真の範囲および付属のクレームから乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。
Claims (12)
- 2つのオリゴヌクレオチド化合物間の分子間水素結合によって形成される二次構造を有する免疫賦活核酸であって、
夫々のオリゴヌクレオチド化合物が、
一般構造:
DomainA−DomainB−DomainC (I)
を含み、
式中、DomainAは、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドであって、
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2'-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを含んでいる、回文または自己相補的なドメインを有していない5'-3'DNAであり、
DomainBは、DomainAおよびDomainCを結びつける非ヌクレオシドリンカーであり、
DomainCは、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを有することができ、回文または自己相補的なドメインを有する3'-5'DNAまたはRNAである、前記免疫賦活核酸。 - DomainAが、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドを含む、請求項1に記載の免疫賦活核酸。
- DomainCが、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドを含む、請求項1に記載の免疫賦活核酸。
- 2つのオリゴヌクレオチド化合物間の分子間水素結合によって形成される二次構造を有する免疫賦活核酸であって、
夫々のオリゴヌクレオチド化合物が、
一般構造:
DomainA−DomainB−DomainC (I)
を含み、
式中、DomainAは、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドであって、
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを含んでいる、分子間水素結合を可能にする回文または自己相補的なドメインを有する5'-3'DNAであり、
DomainBは、DomainAおよびDomainCを結びつける非ヌクレオシドリンカーであり、
DomainCは、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択されるジヌクレオチドであって、
式中、Cは、シチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、
Gは、グアノシンまたは2'-デオキシグアノシンであり、
C*は、2'-デオキシチミジン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-2-オキソ-7-デアザ-8-メチル-プリン、2'-ジデオキシ-5-ハロシトシン、2'-ジデオキシ-5-ニトロシトシン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、
G*は、2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
pは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートからなる群から選択されるヌクレオシド間連鎖である、前記ジヌクレオチドを少なくとも1つ含むことができ、分子間水素結合を可能にする回文または自己相補的なドメインを有する3'-5'DNAである、前記免疫賦活核酸。 - 夫々のオリゴヌクレオチド化合物が、約12〜約50ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の免疫賦活核酸。
- 夫々のオリゴヌクレオチド化合物が、約12〜約26ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の免疫賦活核酸。
- 夫々のオリゴヌクレオチド化合物が、約12〜約50ヌクレオチドを含む、請求項4に記載の免疫賦活核酸。
- 夫々のオリゴヌクレオチド化合物が、約12〜約26ヌクレオチドを含む、請求項4に記載の免疫賦活核酸。
- 請求項1に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- 請求項4に記載の免疫賦活核酸および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- DomainCが、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドを含む、請求項4に記載の免疫賦活核酸。
- DomainAおよびDomainCが、CpG、C*pG、C*pG*およびCpG*からなる群から選択される少なくとも1つのジヌクレオチドを含む、請求項4に記載の免疫賦活核酸。
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