ES2585239T3

ES2585239T3 - Nuevos agonistas sintéticos de TLR9

Info

Publication number: ES2585239T3
Application number: ES14183548.8T
Authority: ES
Inventors: Ekambar R. Kandimalla; Mallikarjuna Reddy Putta; Daqing Wang; Dong Yu; Lakshmi Bhagat; Sudhir Agrawal
Original assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2016-10-04
Anticipated expiration: 2028-07-31
Also published as: RU2010107207A; CN105177014A; RU2468819C2; CA2693266C; EP2821488B1; WO2009018431A3; IN2010KN00195A; EP2821488A2; HK1216430A1; JP5816720B2; CN102864151B; EP2173912A2; EP2173912A4; US20090053206A1; EP2650369A1; JP5563455B2; EP2821488A3; AU2008282172B2; KR20100053598A; CN101878311A

Abstract

El compuesto inmunomodulador 5'-TCG1AACG1TTCG1-Y3-TGTTG1CTGTCTTG1CT-5' [5'-SEC ID N.º: 45-3'-Y3-3'-SEC ID N.º: 178-5']; en donde G1 >= 7-deaza-dG; C >= 2-O-metilribonucleótidos; Y3 >= enlazador 1,5-pentanediol.

Description

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Nuevos agonistas sintéticos de TLR9

Campo de la invención

[001] La invención se refiere a composiciones químicas sintéticas que son útiles para la

5 modulación de respuestas inmunitarias mediadas por receptores tipo toll (TLR). En particular, la invención se refiere a agonistas de receptores tipo toll (TLR9) que generan perfiles únicos de citoquinas y quimioquinas.

Sumario de la técnica relacionada

[002] Los receptores tipo toll (TLR) están presentes en muchas células del sistema

10 inmunitario y se ha demostrado que participan en la respuesta inmunitaria innata (Hornung, V. et al. (2002) J. Immunol. 168:4531-4537). En los vertebrados, esta familia consiste en once proteínas llamadas de TLR1 a TLR11 que se sabe que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos a partir de bacterias, hongos, parásitos y virus (Poltorak, A. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815; Hayashi, F. et al. (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004)

15 Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:15291531; Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943).

[003] Los TLR son un medio clave por el que los vertebrados reconocen y generan una

20 respuesta inmunitaria a las moléculas extrañas y proporcionan también un medio por el cual las respuestas inmunitarias innata y adaptativa están vinculadas (Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145). Algunos TLR están ubicados en la superficie celular para detectar e iniciar una respuesta a patógenos extracelulares y otros TLR están ubicados dentro de la célula para detectar e iniciar una respuesta a patógenos intracelulares.

25 [004] Se sabe que el TLR9 reconoce motivos CpG no metilados en el ADN bacteriano y en oligonucleótidos sintéticos. (Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745). Otras modificaciones de oligonucleótidos de fosforotioato que contienen CpG pueden afectar también a su capacidad para actuar como moduladores de la respuesta inmunitaria a través del TLR9 (véase, p. ej., Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al. (1997)

30 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; y Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813). Se ha demostrado que los agonistas de origen natural del TLR9 producen actividad antitumoral (por ejemplo, en el crecimiento del tumor y la angiogénesis) que resulta en

35 una respuesta eficaz contra el cáncer (por ejemplo, contra la leucemia) (Smith, JB y Wickstrom, E. (1998)

J. Natl. Cancer Inst. 90:1146-1154). Además, se ha demostrado que los agonistas del TLR9 actúan sinérgicamente con otros compuestos antitumorales conocidos (por ejemplo cetuximab, irinotecán) (Vincenzo, D., et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(2):577-583).

[005] Ciertos agonistas del TLR9 se componen de estructuras de ADN 3’-3’ enlazado que

40 contienen un dinucleótido CpR de núcleo, en el que R es una guanina modificada (patente de EE. UU. n.º 7,276,489). Además, ciertas modificaciones químicas específicas han permitido la preparación de En particular, los estudios de relaciones entre la actividad y la estructura han permitido identificar motivos sintéticos y compuestos novedosos basados en ADN que generan modulaciones específicas de la respuesta inmunitaria, distintas de las generadas por los dinucleótidos CpG sin metilar. (Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308; Cong, Y. et al. (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139; Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90; Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13:966-974; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238).

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[006] WO 2008/073959 describe compuestos basados en oligonucleótidos que individualmente proporcionan perfiles de respuesta inmunitaria distintos a través de sus interacciones como agonistas con TLR9. Kandimalla, E.R. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930 describe tres compuestos que comprenden dos oligonucleótidos unidos a través de un solo enlazador de glicerol. WO 2007/055704 describe compuestos que comprenden dos oligonucleótidos unidos a través de un solo enlazador de glicerol. WO 2005/001055 describe oligonucleótidos inmunoestimulantes que tienen estructura secundaria (por ejemplo, bucles en horquilla de 5' o 3').

[007] Sorprendentemente, los inventores han descubierto que modificar de forma única la secuencia que flanquea el dinucleótido CpR de núcleo, los enlaces entre nucleótidos o los enlaces que conectan los oligonucleótidos produce novedosos agonistas de TLR9 que generan perfiles distintos de citoquina y quimioquina in vitro e in vivo. Esta capacidad de “adaptar a medida” la respuesta de citoquina y quimioquina a un oligonucleótido que contenga CpR permite prevenir o tratar diversas dolencias de manera específica en función de la enfermedad e incluso del paciente. Por lo tanto, se necesita que los nuevos compuestos análogos de oligonucleótidos proporcionen dichas respuestas personalizadas.

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[008] La invención describe compuestos basados en oligonucleótidos que individualmente proporcionan perfiles de respuesta inmunitaria distintos a través de sus interacciones como agonistas con TLR9. Los agonistas de TLR9 descritos en el presente documento se caracterizan por modificaciones químicas específicas y únicas, que proporcionan sus distintivos perfiles de activación de la respuesta inmunitaria.

[009] Los agonistas de TLR9 descritos en el presente documento inducen respuestas inmunitarias en diversos tipos de células y en diversos modelos experimentales in vitro e in vivo, y cada agonista proporciona un perfil distinto de respuesta inmunitaria. Los agonistas de TLR9 descritos en el presente documento también son útiles para la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades, por sí solos o combinados o administrados junto con otros fármacos, o bien como adyuvantes para antígenos utilizados como vacunas. En este sentido, son útiles como herramientas para estudiar el sistema inmunológico y para comparar los sistemas inmunitarios de diferentes especies animales, como los seres humanos y los ratones.

[010] En un primer aspecto, la invención proporciona el compuesto inmunomodulador 5’TCG1AACG1TTCG1-Y3-TGTTG1CTGTCTTG1CT-5' [SEC ID 5' N.º: 45-3'-Y3-3'-SEC ID N.º: 178-5']; en donde G1 = 7-deaza-dG; C = 2'-0-metilribonucleótidos; Y3 = enlazador 1,5-pentanediol.

[011] En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición como, por ejemplo, una formulación farmacéutica que comprende un compuesto inmunomodulador de acuerdo con la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.

[012] La invención también proporciona una vacuna que comprende una formulación farmacéutica de acuerdo con la invención y que comprende además un antígeno.

[013] En un tercer aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención para usar en un método que genere una respuesta inmunitaria en un individuo. La generación de una respuesta inmunitaria mediada por TLR9 en un individuo puede incluir la administración al individuo de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención.

[014] En un cuarto aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención y utilizable en un método para tratar terapéuticamente a un individuo afectado de una enfermedad o trastorno en el que la modulación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. El tratamiento terapéutico de un paciente afectado de una enfermedad o trastorno puede incluir la administración al paciente de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención.

[015] En un quinto aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención y utilizable en un método para tratar profilácticamente a un individuo afectado de una enfermedad o trastorno en el que la modulación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. La prevención de una enfermedad o trastorno puede incluir la administración al paciente de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención.

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[016] La Figura 1 es un esquema sintético para la síntesis lineal de los compuestos inmunomoduladores descritos en el presente documento. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.

[017] La Figura 2 es un esquema sintético para la síntesis paralela de los compuestos 5 inmunomoduladores descritos en el presente documento. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.

[018] Las figuras 3A-3C representan gráficamente la actividad NF-kB de las células HEK293 que expresan TLR9 y que se cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 2. Brevemente, se estimularon las células HEK293 con 10 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 18 horas, y los niveles de NF-κB se determinaron utilizando ensayos de

10 SEAP (forma secretada de fosfatasa alcalina embrionaria humana).

[019] Las figuras 3D-3G representan gráficamente la actividad NF-kB de las células HEK293 que expresan TLR9 y que se cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 2. Brevemente, se estimularon las células HEK293 con 0 (PBS/Media), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10,0 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 18 horas, y los niveles de NF-κB se

15 determinaron utilizando ensayos de SEAP (forma secretada de fosfatasa alcalina embrionaria humana). Las Figuras 3A-3G demuestran de manera más general que la administración de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de activación de TLR9.

[020] Las Figuras 4A y 4B representan gráficamente concentraciones de citocina

20 y quimioquina a partir de PBMC humanas que se aislaron, cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 3. Brevemente, las PBMC se aislaron de sangre humana recién extraída de voluntarios sanos y se cultivaron con una dosis de 10 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citoquinas y quimioquinas mediante ensayo múltiplex con el sistema Luminex. Las Figuras 4A y 4B

25 demuestran de manera más general que la administración de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de citoquina y quimioquina.

[021] Las Figuras 4C-4H representan gráficamente concentraciones de citocina y quimioquina a partir de PBMC humanas que se aislaron, cultivaron, trataron y analizaron como se verá 30 en el Ejemplo 3. Brevemente, se aislaron las PBMC de sangre humana recién extraída de voluntarios sanos, y se cultivaron con una dosis de 0 (PBS), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10,0 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citoquinas y quimioquinas mediante ensayo múltiplex con el sistema Luminex. Las Figuras 4C-4H demuestran de manera más general que la administración de

35 oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de citoquina y quimioquina.

[022] Las Figuras 4I-4N representan gráficamente concentraciones de citocina y quimioquina a partir de PBMC humanas que se aislaron, cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 3. Brevemente, se aislaron las PBMC de sangre humana recién extraída de voluntarios

40 sanos, y se cultivaron con una dosis de 0 (PBS), 1,0 ó 10,0 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron 4I-4N demuestran de manera más general que la administración de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de citoquina y quimioquina.

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[023] Las Figuras 4O-4FF representan gráficamente concentraciones de citocina y quimioquina a partir de PBMC humanas que se aislaron, cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 3. Brevemente, se aislaron las PBMC de sangre humana recién extraída de voluntarios sanos, y se cultivaron con una dosis de 0 (PBS), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10,0 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citoquinas y quimioquinas mediante ensayo múltiplex con el sistema Luminex. Las Figuras 4O-4FF demuestran de manera más general que la administración de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de citoquina y quimioquina.

[024] Las Figuras 5A y 5B representan gráficamente concentraciones de citocina y quimioquina a partir de células dendríticas plasmacitoides humanas (pDC) que se aislaron, cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 3. Brevemente, se aislaron las pDC de PBMC de sangre humana recién extraída de voluntarios sanos, y se cultivaron con una dosis de 10 µg/ml de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron los niveles de citoquinas y quimioquinas mediante ensayo múltiplex con el sistema Luminex. Las Figuras 5A y 5B demuestran de manera más general que la administración de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de citoquina y quimioquina.

[025] Las Figuras 6A-6F representan gráficamente la proliferación de células B humanas inducida por oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento. Las células B humanas se aislaron, cultivaron, trataron y analizaron como se verá en el Ejemplo 4. Brevemente, se cultivaron las células B humanas aisladas de PBMC recién extraídas de voluntarios sanos con diferentes dosis de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento durante 68 horas y se pulsaron con 3H-timidina durante 6-8 horas. La absorción de 3H-timidina se determinó usando un contador de centelleo en medio líquido. Las Figuras 6A-6F demuestran de manera más general que la administración de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de proliferación de células, que varían con la composición de bases, la modificación única y la cantidad del oligonucleótido administrado.

[026] La Figura 7A representa gráficamente la inducción de citocina y quimioquina en suero en ratones C57BL/6 que se trataron como se verá en el Ejemplo 5. Brevemente, dos horas después de que se inyectara a los ratones por vía subcutánea una dosis de 1 mg/kg de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento, se recogió suero y se analizaron los niveles de citoquinas y quimioquinas mediante ensayo múltiplex con el sistema Luminex.

[027] La Figura 7B representa gráficamente la inducción de citoquina en suero en ratones BALB/c que se trataron como se verá en el Ejemplo 5. Brevemente, dos horas después de que se inyectara a los ratones por vía subcutánea una dosis de 1 mg/kg de oligonucleótidos ELISA los niveles IL-12.

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[028] Las Figuras 7C-7F representan gráficamente la inducción de citoquina en ratones BALB/c que se trataron como se verá en el Ejemplo 5. Brevemente, dos horas después de que se 5 inyectara a los ratones por vía subcutánea una dosis de 0,25 ó 1 mg/kg de oligonucleótidos inmunomoduladores descritos en el presente documento, se recogió suero y se analizaron mediante ELISA los niveles IL-12. Las Figuras 7A-7F demuestran de manera más general que la administración in vivo de oligonucleótidos inmunomoduladores que contienen novedosas bases, enlaces o modificaciones únicas descritas en el presente documento, genera perfiles distintos de activación de TLR9, que

10 encontrarán aplicación en diversas enfermedades.

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[029] La invención describe compuestos basados en oligonucleótidos que individualmente proporcionan perfiles de respuesta inmunitaria distintos a través de sus interacciones como agonistas con TLR9. Los agonistas de TLR9 descritos en el presente documento se caracterizan por modificaciones químicas únicas, que proporcionan sus distintos perfiles de activación de la respuesta inmunitaria.

[030] Los agonistas de TLR9 descritos en el presente documento inducen respuestas inmunitarias en diversos tipos de células y en diversos modelos experimentales in vivo e in vitro, y cada agonista proporciona un perfil distinto de respuesta inmunitaria. En este sentido, son útiles como herramientas para estudiar el sistema inmunológico y para comparar los sistemas inmunitarios de diferentes especies animales, como los seres humanos y los ratones. Los agonistas de TLR9 descritos en el presente documento también son útiles para la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades, por sí solos o combinados o administrados junto con otros fármacos, o bien como adyuvantes para antígenos utilizados como vacunas.

DEFINICIONES

[031] El término “nucleósido sustituido en 2'” o “arabinósido sustituido en 2'” incluye generalmente nucleósidos o arabinonucleósidos en los que el grupo hidroxilo en la posición 2' del resto de una pentosa o arabinosa se sustituye para producir un ribonucleósido sustituido en 2' o nucleósido sustituido en 2'-O. En determinadas realizaciones, dicha sustitución es con un grupo hidrocarbilo inferior que contiene 1-6 átomos de carbono saturados o no saturados, con un átomo de halógeno, o con un grupo arilo que tiene 6-10 átomos de carbono, en el que dicho hidrocarbilo, o un grupo arilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido, por ejemplo, con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carboalcoxi, o amino. Los ejemplos de ribonucleósidos sustituidos en 2'-O o arabinósidos sustituidos en 2'-O incluyen, entre otros, 2'-amino, 2'-fluoro, 2’-alilo, 2'-O-alquil y 2'-propargil ribonucleósidos o arabinósidos, 2'-O-metilribonucleósidos o 2'-O-metilarabinósidos y 2'-O metoxietoxirribonucleósidos o 2'-O-metoxietoxiarabinósidos.

[032] El término “ 3' ”, cuando se usa direccionalmente, se refiere generalmente a una región

o posición de un polinucleótido u oligonucleótido situado en 3' (hacia la posición 3’ del oligonucleótido) respecto de otra región o posición del mismo polinucleótido u oligonucleótido.

[033] El término “ 5' ”, cuando se usa direccionalmente, se refiere generalmente a una región

o posición de un polinucleótido u oligonucleótido situado en 5' (hacia la posición 5’ del oligonucleótido) respecto de otra región o posición del mismo polinucleótido u oligonucleótido.

[034] El término “aproximadamente” significa generalmente que el número exacto no es crítico. De esta manera, el número de restos nucleósidos en los oligonucleótidos no es crítico, y los oligonucleótidos que tienen uno o dos restos nucleósidos menos, o de uno a varios restos nucleósidos adicionales, se consideran equivalentes de cada una de las realizaciones descritas anteriormente.

[035] El término “inflamación de las vías respiratorias” incluye generalmente, sin limitación, inflamación en el tracto respiratorio producida por alérgenos, incluyendo asma.

[036] El término “alérgeno” se refiere generalmente a un antígeno o porción antigénica de una molécula, usualmente una proteína, que estimula una respuesta alérgica tras exposición a un sujeto.

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solo un pequeño subconjunto de sujetos presente una respuesta inmunitaria alérgica (por ejemplo, IgE) tras su exposición a la molécula.

[037] El término “alergia” incluye generalmente, sin limitación, alergias alimentarias, alergias respiratorias y alergias cutáneas.

[038] El término “antígeno” se refiere generalmente a una sustancia que es reconocida y se une selectivamente a un anticuerpo o a un receptor de antígenos de los linfocitos T. Los antígenos pueden incluir, entre otros, péptidos, proteínas, nucleósidos, nucleótidos y sus combinaciones. Los antígenos pueden ser naturales o sintéticos e inducen generalmente una respuesta inmunitaria que es específica de cada antígeno.

[039] El término “trastorno autoinmunitario” se refiere generalmente a trastornos en los que el antígeno “propio” sufre el ataque del sistema inmunitario. Dicho término incluye, entre otros, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo I, síndrome del intestino irritable, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, choque septicémico, alopecia universal, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, penfigoide ampolloso, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad celíaca, dermatomiositis, endometriosis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurativa, púrpura trombocitopénica idiopática, cistitis intersticial, morfea, miastenia gravis, narcolepsia, neuromiotonía, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, esquizofrenia, síndrome de Sjögren, arteritis de la temporal (“arteritis de células gigantes”), vasculitis, vitíligo, vulvodinia y granulomatosis de Wegener, asma autoinmunitaria, choque septicémico, psoriasis y malaria.

[040] El término “cáncer” se refiere generalmente, entre otras cosas, a cualquier neoplasia o tumor maligno causado por la proliferación o la división celular anormal o incontrolada. Los cánceres pueden ocurrir en seres humanos o animales y pueden surgir en cualquier tejido. El tratamiento de un paciente de cáncer con la invención puede incluir la administración de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna, de acuerdo con la invención, de modo que afecte la proliferación o división celular anormal o incontrolada.

[041] El término “transportador” abarca generalmente cualquier excipiente, diluyente, carga, sal, tampón, estabilizante, solubilizante, aceite, lípido, vesícula contenedora de lípidos, microesferas, encapsulamiento liposómico, u otro material bien conocido en la materia para el uso en formulaciones farmacéuticas. Se entenderá que las características del transportador, excipiente, o diluyente dependerán de la ruta de administración para una aplicación concreta. La preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables que contienen estos materiales se describe, p. ej., en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

[042] El término “farmacéuticamente aceptable” o “fisiológicamente aceptable” se refiere generalmente a un material que no afecta a la eficacia de un compuesto de acuerdo con la invención y que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo de células, tejido u organismo. Preferiblemente, el sistema biológico es un organismo vivo, tal como un vertebrado.

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a la administración de al menos dos sustancias diferentes suficientemente próximas en el tiempo para modular una respuesta inmunitaria. Preferentemente, la coadministración se refiere a la administración simultánea de al menos dos sustancias diferentes.

[044] El término una “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere generalmente a una cantidad suficiente para influir en un efecto biológico deseado, tal como un resultado beneficioso. De esta manera, una “cantidad farmacéuticamente eficaz” dependerá del contexto en el que se está administrando. Una cantidad farmacéuticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones profilácticas o terapéuticas.

[045] El término “en combinación con” significa generalmente administrar un compuesto descrito en el presente documento y otro agente útil para tratar la enfermedad o afección que no suprima el efecto antagonista de TLR9 del compuesto en el curso del tratamiento de un paciente. Dicha administración puede realizarse en cualquier orden, incluyendo la administración simultánea y la espaciada temporalmente desde unos pocos segundos hasta varios días. Dicho tratamiento combinado puede incluir también más de una única administración del compuesto de acuerdo con la invención y/o independientemente del otro agente. La administración del compuesto descrito en el presente documento y del otro agente puede ser mediante rutas iguales o diferentes.

[046] El término “individuo” o “sujeto” se refiere generalmente a un mamífero, tal como un ser humano. Los mamíferos incluyen generalmente, entre otros, seres humanos, primates no humanos, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ganado, vacas, cerdos, ovejas y conejos.

[047] El término “inhibidor de quinasa” generalmente se refiere a moléculas que antagonizan

o inhiben la señalización celular dependiente de la fosforilación o las vías de crecimiento en una célula. Los inhibidores de la quinasa pueden ser de origen natural o sintético e incluyen pequeñas moléculas administrables por vía oral como productos terapéuticos. Los inhibidores de la quinasa tienen la capacidad de inhibir rápida y específicamente la activación de las moléculas de quinasa dirigidas. Las proteínas de quinasas son objetivos de fármacos atrayentes, en parte porque regulan una amplia variedad de vías de señalización y crecimiento e incluyen muchas proteínas diferentes. En este sentido, tienen un gran potencial en el tratamiento de enfermedades que implican la señalización de la quinasa, entre ellas el cáncer, enfermedades cardiovasculares, trastornos inflamatorios, diabetes, degeneración macular y trastornos neurológicos. Ejemplos de inhibidores de la quinasa incluyen sorafenib (Nexavar®), Sutent®, dasatinib, Dasatinib™, Zactima™, Tykerb™ y ST1571.

[048] El término “síntesis lineal” se refiere generalmente a una síntesis que se inicia en un extremo del oligonucleótido y progresa linealmente hasta el otro extremo. La síntesis lineal permite incorporar unidades monoméricas idénticas o no idénticas (en cuanto a longitud, composición de bases y/o modificaciones químicas incorporadas) en un oligonucleótido.

[049] Con el término “mamífero” se pretende abarcar expresamente a los animales vertebrados de sangre caliente, entre otros y sin limitación a los seres humanos.

[050] El término “nucleósido modificado” es generalmente un nucleósido que incluye una base heterocíclica modificada, un resto azucarado modificado, o cualquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, el nucleósido modificado es un nucleósido de pirimidina o purina no natural, como se describe en el presente documento. Para los fines de la invención, se puede utilizar de forma indistinta resto azucarado que no se produce naturalmente. Para los fines de la invención, se considera que una base no es natural si no es guanina, citosina, adenina, timina o uracilo.

imagen10

[051] El término “modulación” o “modulador” se refiere generalmente a un cambio, tal como un aumento en la respuesta o diferencia cualitativa en una respuesta mediada por TLR9.

[052] El término “enlazador” se refiere generalmente a cualquier resto que se puede unir a un oligonucleótido por medio de enlaces covalentes o no covalentes mediante un azúcar, una base, o la estructura. El enlazador puede utilizarse para unir dos o más nucleósidos o se puede unir al nucleótido final en los extremos 5’ y/o 3’ del oligonucleótido. En ciertas realizaciones de la invención, dicho enlazador puede ser un enlazador no nucleotídico.

[053] El término “enlazador no nucleotídico” se refiere generalmente a un resto químico diferente de un enlace nucleotídico que se puede unir a un oligonucleótido por medio de un enlace covalente o no covalente. Preferiblemente, dicho enlazador no nucleotídico tiene de aproximadamente 2 angstromios a aproximadamente 200 angstromios de longitud, y puede ser de orientación tanto en cis como en trans.

[054] El término “enlace nucleotídico” se refiere generalmente a un enlace químico que une dos nucleósidos a través de sus azúcares (por ejemplo, 3’-3’, 2’-3’, 2’-5’, 3’-5’) consistente en un átomo de fósforo y un grupo cargado o neutro (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato o fosforoditioato) entre nucleósidos adyacentes.

[055] El término “compuesto basado en oligonucleótidos” se refiere a un polinucleósido formado a partir de múltiples unidades de nucleósido enlazadas. Las unidades de nucleósidos pueden ser parte o convertirse en parte de virus, bacterias, residuos celulares, ARN de pequeña interferencia siRNA o micro ARN. Dichos oligonucleótidos también pueden obtenerse a partir de fuentes de ácidos nucleicos existentes, con inclusión de ADN genómico o ADNc, pero se producen preferiblemente mediante métodos sintéticos. En realizaciones preferidas, cada unidad de nucleósido incluye una base heterocíclica y un pentofuranosilo, trehalosa, arabinosa, nucleósido sustituido en 2’-desoxi-2’, arabinosa sustituida en 2’desoxi-2’, arabinosa sustituida en 2’-O o un grupo de azúcar hexosa. Los restos nucleósidos pueden acoplarse entre sí mediante cualquiera de los numerosos enlaces internucleósidos conocidos. Dichos enlaces internucleósidos incluyen, entre otros, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidita, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioéter, fosforamidita en forma de puente, metilenfosfonato en forma de puente, fosforotioato en forma de puente, y enlaces internucleósidos de sulfona. El término “compuesto basado en oligonucleótidos” abarca también polinucleósidos que tienen uno o más enlaces internucleósidos estereoespecíficos (por ejemplo, enlaces (RP)-fosforotioato o (SP)-fosforotioato, alquilfosfonato, o fosfotriéster). Tal como se usan en el presente documento, se pretende expresamente que los términos “oligonucleótido” y “dinucleótido” incluyan polinucleósidos y dinucleósidos que tengan cualquiera de dichos enlaces internucleósidos, tanto si el enlace comprende un grupo fosfato como si no. En determinadas realizaciones preferidas, estos enlaces internucleósidos pueden ser enlaces fosfodiéster, fosforotioato, o fosforoditioato, o sus combinaciones.

[056] El término “péptido” se refiere generalmente a polipéptidos que tienen longitud y composición suficientes para influir en una respuesta biológica, por ejemplo, producción de anticuerpos o sin limitación, fosforilación, glicosilación, pegilación, lipidización y metilación.

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[057] El término “agonista de TLR9” generalmente se refiere a un compuesto basado en

5 oligonucleótidos que es capaz de mejorar, inducir o modular una estimulación inmunitaria mediada por TLR9.

[058] El término “tratamiento” se refiere generalmente a un enfoque previsto para obtener un resultado beneficioso o deseado, que puede incluir el alivio de los síntomas,

o el retraso o la mejora en la progresión de una enfermedad.

10 [059] Los agonistas de TLR9 se muestran en la Tabla I siguiente. Los agonistas de TLR9 no abarcados por el contenido de las reivindicaciones se describen solo con fines comparativos. En esta tabla, los agonistas de TLR9 basados en oligonucleótidos tienen todos los enlaces de fosforotioato (PS), excepto donde se indique. Los expertos en la técnica reconocerán, sin embargo, que pueden emplearse enlaces de fosfodiéster (PO) o una mezcla de enlaces PS y PO. Excepto cuando se

15 indique, todos los nucleótidos son desoxirribonucleótidos.

Tabla I

Sec. ID. N.º/Compuesto n.º: Secuencia y modificación

1 (1): 5’-TCG1TACG1TACG1–X-G1CATG1CATG1CT -5’

2 (2): 5’-TCTGTOCG2TTGT-X-TGTTG2COTGTCT -5’

3 (3): 5’-TCAGTOCG2TTAC-Z-CATTG2COTGACT -5’

4 (4 & 170): 5’-TCTGOTOCG2TAG-M-GATTG2COTOGTCT -5’

5 (5): 5’-TCG1TCG1TTT-L-M-L-TTTG1CTG1CT -5’

6 (6): 5’-TCG1TCG1TTT-L-X-L-TTTG1CTG1CT -5’

7 (7): 5’-TCG1AACG1TTCOG-Z-GOCTTG1CAAG1CT -5’

8 (8 & 18): 5’-TCG1TCG1TTL-Y-G1CTTG1CAAG1CT -5’

9 (9): 5’-TCTGTCG2TTCU-X-UCTTG2CTGTCT -5’

10 (10): 5’-TCG1TCG1TTTUU-X-UUTTTG1CTG1CT -5’

11 (11): 5’-TCG1TCG1TTU1Y-Z-YU1TTG1CTG1CT -5’

12 (12): 5’-TCG2TCG2TTU1Y-M-YU1TTG2CTG2CT -5’

13 (13): 5’-TAGTCG1TTCTC-X-CTCTTG1CTGAT-5’

14 (14): 5’-TCUTGTCG1TTC-X-CTTG1CTGTUCT-5’

15 (15 & 171): 5’ -TCG1TCG1TTTTT-Y-TCTTG1CTGUCT-5’

16 (16 & 172): 5’-TCG1TCG1TTTTT-Y-TCTTG1CTGTCTTG1CT-5’

17 (17 & 192): 5’-TCTGTCG1TTCT-Y-TCTTG1CTGYYTTG1CT-5’

18 (18 & 172): 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTG1CTGTCTTG1CT-5’

19 (19 & 193): 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTG1CTGLLTTG1CT-5’

20 (20 & 171): 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-TCTTG1CTGUCT-5’

21 (21 & 173): 5’-TCG1AACG1TTCG1-Y-GACAG1CTGTCT-5’

22 (22): 5’-TCTGTCG1TTCT-m-TCTTG1CTGTCT-5’

23 (23): 5’-CAGTCOG2TTCAG-M-GACTTG2OCTGAC-5’

24 (24 & 18): 5’-CAGTCOG2TTCAG-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’

25 (25): 5’-TCG1AACG1TTCG-Z-GCTTG1CAAG1CT-5’

26 (26 & 174): 5’-TCG1TCG1TTTTT-Y-TCTTG1CTGUCT-5’

27 (27): 5’-TCG2TCOG2TTU1Y-X-YU1TTG2OCTG2CT-5’

28 (28): 5’-TCG1AACG1U1U1CG-X-GcU1U1G1CAAG1CT-5’

29 (29): 5’-TCTGTCG1TTCT-L1-TCTTG1CTGTCT-5’

30 (30 & 18): 5’-CAGTCG2TTCAG-Y-G1CTTG1CAAG1CT-5’

31 (31): 5’-CAGTCOG2TTCAG-Z-GACTTG2OCTGAC-5’

32 (32 & 175): 5’-TCTGTCG1TTCT-Y-TCTTG1CTGUCTTG1CT-5’

33 (33): 5’-TCG1AACG1U1U1COG-M-GOCU1U1G1CAAG1CT-5’

34 (34): 5’-TCG1AACG1TOTCOG-m-GOCTOTG1CAAG1CT-5’

35 (35): 5’-TCG1AACG1TTCG1-L1-G1CTTG1CAAG1CT-5’

36 (36): 5’-CAGTCG2TTCAG-X1-GACTTG2CTGAC-5’

imagen12

imagen13

165 (165): 5’-TCG1AACG1TTCG1-m-G1CTTG1CAAG1CT-5’

166 (166): 5’-TCG1AACG1TOTCOG-m-GOCTOTG1CAAG1CT-5’

167 (167): 5’-TCG1AACG1dUdUCOG-M-GCodUdUG1CAAG1CT-5’

168 (168): 5’-TCG1TCG1ACG1AT-X-TAG1CAG1CTG1CT-5’

169 (169): 5’-TCG1ATCG1ATCG1-X-G1CTAG1CTAG1CT-5’

G1 = 7-deaza-dG; G2 = AraG; G3 = 7-deaza-araG; A/G/C/U = 2’-O-metilribonucleótidos; dU = U1 = 2’-desoxi-U; o = enlace fosfodiéster; po = 5’ –monofosfato; ps = enlace 5’fosforotiato; pm = metilfosfonato (enlace no iónico); L = enlazador 1,5-pentanodiol; L = 1,2-didesoxirribosa; L1 = enlazador trietilenglicol; L2 = enlazador tetraetilenglicol;

5 L3 = enlazador hexaetilenglicol M = enlazador cis,cis-1,3,5-ciclohexanetriol; m = enlazador cis,trans-1,3,5ciclohexanetriol; X = enlazador glicerol; X1 = enlazador 1,2,4-butanetriol; X2 = enlazador ácido 1,3,5-tris(2hidroxietil)cianúrico; X3 = enlazador isobutanotriol; Y = enlazador 1,3-propanodiol; Y1 = enlazador 1,2etilenediol; Y2 = enlazador 1,4-butanodiol; Y3 = enlazador 1,5-pentanodiol; Z = enlazador 1,3,5pentanotriol.

10 [060] Se analizó la actividad inmunoestimuladora de los ejemplares agonistas de TLR9 de la Tabla I en células HEK293 que expresan TLR9, tal como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados mostrados en las Figuras 3A, 3B, 3C, 3D y 3E demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados alteran su perfil de activación de NF-kB mediado por TLR9 18 horas después de la administración. Más generalmente, estos datos demuestran que las

15 modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados se pueden utilizar para aumentar o disminuir la activación de NF-kB.

[061] Se analizó la actividad inmunoestimuladora de los ejemplares agonistas TLR9 de la Tabla I en el ensayo de PBMC humana para IL-12, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-IRα, IL-2R y MCP-1, tal como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados mostrados en las Figuras 4A a 4FF 20 demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados alteran su perfil de activación de TLR9 mediada de IL-12, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-IRα, IL-2R y MCP-1 en las PBMC humanas. Más generalmente, estos datos demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados se pueden utilizar para aumentar o disminuir la activación de IL-12, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP -1α, MIP-1β, IL-IRα, IL-2R

25 y MCP-1.

[062] Se analizó la actividad inmunoestimuladora de los ejemplares agonistas de TLR9 de la Tabla I en los ensayos de pDC humanas en IL-12, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β y TNFα, tal como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados mostrados en las Figuras 5A y 5B demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados alteran su perfil de

30 activación inmunitaria mediada por TLR9 en pDC humanas. Más generalmente, estos datos demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados se pueden utilizar para aumentar o disminuir la activación de IL-12, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β y TNFα.

[063] Se analizó la actividad inmunoestimuladora de los ejemplares agonistas de TLR9 de la Tabla I en el ensayo de proliferación de células B humanas, tal como se describe en el Ejemplo 4. Los

35 resultados mostrados en las Figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E y 6F muestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados alteran su actividad de proliferación de células B mediada por TLR9 y que este perfil de activación puede depender de la dosis en función de la modificación química. Más generalmente, estos datos demuestran que las modificaciones químicas [064] Se analizó la actividad inmunoestimuladora de los ejemplares agonistas de TLR9 de la Tabla I in vivo en ratones C57B1/6 y BALB/c, tal como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados

imagen14

5 mostrados en las Figuras 7A, 7B, 7D, 7E y 8F demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados alteran su perfil de activación inmunitaria mediada por TLR9 in vivo en modelos de ratón. Más generalmente, estos datos demuestran que las modificaciones químicas específicas para los oligonucleótidos 3’-3’ enlazados pueden alterar concentraciones de quimioquina y/o citoquina in vivo, que encontrarán aplicación en diversas enfermedades.

10 [065] La invención describe agonistas sintéticos de TLR9 basados en oligonucleótidos. Tomando como base determinadas modificaciones químicas a la base, azúcar, enlace o enlazador, los agonistas de TLR9 pueden poseer una estabilidad incrementada cuando se asocian y/o forman dúplex con otras de las moléculas agonistas de TLR9, mientras retienen un extremo 5’ accesible.

[066] Los enlazadores no nucleotídicos incluyen, entre otros, los relacionados en la Tabla II.

15

imagen15

HO OH O2N OH

HO imagen16

OH

1,1,1-Tris(hidroximetil)nitrometano

Glicerol (1,2,3-Propanotriol)

HO imagen17OH

OH

imagen18OH

OH

HO

1,1,1-Tris(hidroximetil)propano

1,2,4-Butanotriol

imagen19OH

HO HO imagen20OH 1,2,6-Hexanotriol

OH -

2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

HO imagen21OH OH

imagen22OH -

3-Metil-1,3,5-pentanotriol

OH

HO 2-(hidroximetil)-1,4-butanodiol

HO imagen23

-

1,2,3-Heptanotriol

HO imagen24OH

HO imagen25OH

1,3,5-Pentanotriol

OH

-

2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol

HO imagen26OH OH

imagen27HO OH

1,1,1-Tris(hidroximetil)etano O NH

OH

-N-[Tris(hidroximetil)metil]acrilamida

Tabla II: Continuación

imagen28

imagen29

OH

HO imagen30

OH

HO

OH

1,3-Di(hidroxietoxi)-2-hidroxil-propano

-

cisimagen311,3,5-Ciclohexanotriol

OH

HO imagen32

O OH

1,3-Di(hidroxipropoxi)imagen332imagen34hidroxil-propano

imagen35OH

cis-1,3,5-Tri(hidroximetil)ciclohexano

H imagen36

OH

HO imagen37OH

2-Desoxi-D-ribosa

1,3,5-Trihidroxil-benceno

imagen38OH

imagen39OH

HO

1,2,4,-Trihidroxilimagen40benceno

-

3,5,-Di(hidroximetil)fenol

-

imagen41O HO imagen42

OH

OH -

D-GalactalOH

-

1,3,5,-Tri(hidroximetil)benceno

Tabla II: Continuación

imagen43

1,6-anhidro-βimagen44Dimagen45Glucosa

-

4,6-Nitropirogalol

imagen46

Ácido 1,3,5-Tris(2-hidroxietil)-cianúrico

imagen47

Ácido gálico

imagen48

3,5,7-Trihidroxiflavona

-

Tabla II: Continuación

imagen49

Etilenglicol

HO OH 1,3-Propanodiol

imagen50

2,4-Pentanodiol

HO imagen51 imagen52OH HO

1,2-Propanodiol 1,6-Hexanodiol

imagen53OH HO imagen54

HO 1,4-Butanodiol 1,2-Hexanodiol

HO imagen55HO imagen56

1,3-Butanodiol 1,5-Hexanodiol

imagen57

2,3-Butanodiol

imagen58

imagen59

2,5-Hexanodiol

1,4-Butanodiol

Tabla II: Continuación

imagen60

2-(1-Aminopropil)-1,3-propanodiol

1,8-Octanodiol

HO imagen61

HO imagen62

O

1,2-Octanodiol

HO imagen63OH 1,2-Didesoxirribosa 1,9-Nonanodiol

imagen64

1,12-Dodecanodiol

imagen65

Trietilenglicol

imagen66

Tetraetilenglicol

imagen67

Hexaetilenglicol

imagen68

[067] En un primer aspecto, la invención proporciona el compuesto inmunomodulador 5’

TCG1AACG1TTCG1-Y3-TGTTG1CTGTCTTG1CT-5' [SEC ID 5' N.º: 45-3'-Y3-3'-SEC ID N.º: 178-5']; en 5 donde G1 = 7-deaza-dG; C = 2-O-metilribonucleótidos; Y3 = enlazador 1,5-pentanediol.

[068] En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición como, por ejemplo, una formulación farmacéutica que comprende un compuesto inmunomodulador de acuerdo con la invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.

[069] El compuesto activo se incluye en el transportador o diluyente farmacéuticamente

10 aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz sin causar efectos tóxicos graves en el paciente tratado. El intervalo de dosificación eficaz de los derivados farmacéuticamente aceptables puede calcularse tomando como base el peso del compuesto parental que se va a administrar, o por otros medios conocidos para los expertos en la técnica. Si el derivado presenta actividad en

15 sí mismo, la dosificación eficaz puede estimarse como anteriormente usando el peso del derivado, o por otros medios conocidos para los expertos en la técnica.

[070] La invención también proporciona una vacuna que comprende una formulación farmacéutica de acuerdo con la invención y que comprende además un antígeno. Un antígeno es una molécula que provoca una respuesta inmunitaria específica. Dichos antígenos incluyen, entre otros,

20 proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y complejos o combinaciones de cualquiera de los mismos. Cualquiera de estos antígenos puede unirse opcionalmente a una proteína o péptido inmunógeno, tal como hemocianina de lapa (KLH), la subunidad B de la toxina del cólera o cualquier otra proteína transportadora inmunógena.

[071] Las vacunas según la invención pueden incluir además cualquiera de la plétora de adyuvantes conocidos, incluyendo, entre otros, adyuvante completo de Freund, hemocianina de lapa (KLH), monofosforil lípido A (MPL), alumbre y saponinas, que incluyen QS-21, imiquimod, R848, agonistas de TLR o combinaciones de éstos.

[072] En un tercer aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención para usar en un método que genere una respuesta inmunitaria en un individuo. La generación de una respuesta inmunitaria mediada por TLR9 en un individuo puede incluir la administración al individuo de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención. En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero. En realizaciones preferidas, el compuesto, formulación farmacéutica o vacuna se administra a un individuo necesitado de estimulación inmunitaria.

[073] La administración de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención puede seguir cualquier ruta adecuada, incluidas, entre otras, parenteral, oral, intratumoral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, mucosal, vaginal, por pistola genética, parche dérmico o en forma de colirios o colutorios. La administración del compuesto, formulación farmacéutica o vacuna puede llevarse a cabo usando procedimientos conocidos a dosificaciones y durante periodos eficaces para reducir los síntomas o marcadores indirectos de la enfermedad. Cuando se administra de manera sistémica, el compuesto, formulación farmacéutica o vacuna se administra preferiblemente a una dosificación suficiente para conseguir un nivel sanguíneo de un compuesto de acuerdo con la invención de aproximadamente 0,0001 micromolar a aproximadamente 10 micromolar. Para una administración localizada, pueden ser eficaces concentraciones mucho más bajas que esta, y se pueden tolerar concentraciones mucho más altas sin efectos tóxicos graves. Preferiblemente, la dosificación total de un compuesto de acuerdo con la invención varía entre aproximadamente 0,001 mg por paciente y día y aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por día. Puede ser deseable administrar simultánea o secuencialmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo en un único episodio de tratamiento.

[074] En ciertas realizaciones preferidas, un compuesto, formulación farmacéutica

o vacuna de acuerdo con la invención se administra conjuntamente o en combinación con otro agente, incluidos, entre otros, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótidos antisentido, ARN de pequeña interferencia siRNA, aptámeros, ribozimas, terapias dirigidas, inhibidores de quinasa, péptidos, proteínas, vectores de terapia génica, vacunas de ADN y/o adyuvantes para mejorar la especificidad o magnitud de la respuesta inmunitaria.

[075] El compuesto de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad humana o animal. Por ejemplo, el compuesto es útil para aplicaciones de vacunas infantiles y veterinarias. El compuesto también es útil para estudios modelo del sistema inmunitario.

[076] En un cuarto aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención y utilizable en un método para tratar terapéuticamente a un individuo afectado de una enfermedad o trastorno en el que la modulación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. El tratamiento terapéutico de un paciente afectado de una enfermedad o trastorno puede incluir la administración al paciente de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención. En diversas realizaciones, la enfermedad o trastorno que se va a tratar es cáncer, un trastorno alergia, asma, o una enfermedad producida por un patógeno o alérgeno. Los patógenos incluyen, por ejemplo, bacterias, parásitos, hongos, virus, viroides y priones. La administración se lleva a cabo como se describe para el tercer aspecto de la invención.

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[077] En un quinto aspecto, la invención proporciona un compuesto de acuerdo con la invención y utilizable en un método para tratar profilácticamente a un individuo afectado de una enfermedad o trastorno en el que la modulación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. La prevención de una enfermedad o trastorno puede incluir la administración al paciente de un compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención. En diversas realizaciones, la enfermedad

o el trastorno que se va a prevenir es cáncer, un trastorno autoinmunitario, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, una enfermedad infecciosa, alergia, asma o una enfermedad producida por un patógeno. Los patógenos incluyen, entre otros, bacterias, parásitos, hongos, virus, viroides y priones. La administración se lleva a cabo como se describe para el tercer aspecto de la invención.

[078] El compuesto, la formulación farmacéutica o la vacuna de acuerdo con la invención se pueden administrar conjuntamente o en combinación con cualquier otro agente útil para prevenir o tratar la enfermedad o afección que no suprima el efecto inmunoestimulador del compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención. El agente útil para prevenir o tratar la enfermedad o afección incluye, entre otros, vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótidos antisentido, agonistas de TLR, inhibidores de quinasa, péptidos, proteínas, vectores de terapia génica, vacunas de ADN y/o adyuvantes para aumentar la especificidad o magnitud de la respuesta inmunitaria o moléculas coestimuladoras como citoquinas, quimioquinas, ligandos de proteína, factores transactivadores, péptidos y péptidos que comprenden aminoácidos modificados. Por ejemplo, en la prevención o el tratamiento del cáncer, se contempla que el compuesto, formulación farmacéutica o vacuna de acuerdo con la invención pueda administrarse conjuntamente o en combinación con un compuesto quimioterapéutico o un anticuerpo monoclonal. Los agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen, entre otros, gemcitabina metotrexato, vincristina, adriamicina, cisplatino, cloroetilnitrosoureas sin contenido de azúcar, 5-fluorouracilo, mitomicina C, bleomicina, doxorrubicina, dacarbazina, Taxol®, fragilina, Meglamina GLA, valrrubicina, carmustaína y poliferposán, MMI270, BAY 12-9566, inhibidor de famesil transferasa RAS, inhibidor de famesil transferasa, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, hicamtina/topotecán, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone®/Mitroxantrona, Metaret/Suramina, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951 f, Lemonal DP 2202, FK 317, imatinib mesilato/Gleevec®, Picibanil/OK-432, AD 32/valrubicina, Metastron®/derivado de estroncio, Temodal/Temozolomida, Evacet/ doxorrubicina liposomal, Yewtaxan/Placlitaxel, Taxol®/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, furtulón/doxifluridina, Ciclopax/paclitaxel oral, Taxoide oral, SPU077/cisplatino, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774) /EGFR, CP-609 (754) /inhibidor del oncogén RAS, BMS-182751/platino oral, UFT™ (Tegafur/Uracilo), Ergamisol®/Levamisol, Eniluracil/776C85/5FU potenciador, Campto/Levamisol, Camptosar®/Irinotecán, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin®/Cladribina, Paxex/Paclitaxel, Doxil®/doxorrubicina liposomal, Caelyx/doxorrubicina liposomal, Fludara®/fludarabina, farmarrubicina/ epirrubicina, DepoCyt®, ZD1839, LU 79553/bis-naftalimida, LU 103793/Dolastaína, Caelyx/doxorrubicina liposomal, Gemzar®/Gemcitabina, ZD 0473/Anormed®, YM 116, semillas de yodo, inhibidores de CDK4 y CDK2, inhibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex®/Ifosamida, Taxotere®/Docetaxel, profármaco de guanina arabinósido, análogo de taxano, nitrosoureas, agentes alquilantes como melfelán y ciclofosfamida, aminoglutetimida, asparaginasa, busulfán, carboplatino, clorombucilo, citarabina HCl, dactinomicina, daunorrubicina HCl, fosfato sódico de estramustina, etopósido (VP16-213), floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida, hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón alfa-2a, alfa-2b, acetato de leuprolido (análogo del factor de liberación de LHRH), lomustina (CCNU), mecloretamina HCl (mostaza de nitrógeno), mercaptopurina, mesna, mitotano (o.p'-DDD), mitoxantrona HCl, octreótido, plicamicina, procarbazina HCl, estreptozocina, citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina, amsacrina (m-AMSA), azacitidina, eritropoyetina, hexametilmelamina (HMM), interleuquina 2, mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG), pentostatina (2'desoxicoformicina), semustina (metil-CCNU), tenipósido (VM-26) y sulfato de vindesina. Los anticuerpos monoclonales preferidos incluyen, entre otros, Panorex® (Glaxo-Welicome), Rituxan® (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), Mylotarg® (Wyeth), Campath® (Millennium), Zevalin® (IDEC y Schering AG), Bexxar® (Corixa/GSK), Erbitux® (Imclone/BMS), Avastin® (Genentech) Herceptin® (Genentech/Hoffman la Roche), Tarceva® (OSI Pharmaceuticals/Genentech).

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[079] Alternativamente, el agente útil para prevenir o tratar la enfermedad o afección puede incluir vectores de ADN que codifican antígenos o alérgenos. En estas realizaciones, el compuesto, la formulación farmacéutica o la vacuna de acuerdo con la invención pueden actuar de diversas maneras como adyuvantes o producir efectos inmunomoduladores directos.

[080] Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar adicionalmente determinadas realizaciones preferidas de la invención. Los compuestos no abarcados por el contenido de las reivindicaciones se describen solo con fines comparativos.

Ejemplo 1:

La síntesis de compuestos basados en oligonucleótidos que contienen restos inmunoestimuladores

[081] Las entidades químicas de acuerdo con la invención se sintetizaron en una escala de 1 µmol a 0,1 mM usando un sintetizador automatizado de ADN (OligoPilot II, AKTA, (Amersham) y/o Expedite 8909 (Applied Biosystem)), según los procedimientos de síntesis lineal o síntesis paralela mostrados en las Figuras 1 y 2.

[082] Las 5’-DMT dA, dG, dC y T fosforamiditas se adquirieron en Proligo (Boulder, CO). Las 5’-DMT 7-deaza-dG y araG fosforamiditas se obtuvieron de Chemgenes (Wilmington, MA). El soporte sólido del enlazador DiDMT-glicerol se obtuvo de Chemgenes. La 1-(2’-desoxi-β-D-ribofuranosil)-2-oxo-7deaza-8-metil-purina amidita se obtuvo de Glen Research (Sterling, VA), las 2'-O-metilribonucleósido amiditas se obtuvieron de Promega (Obispo, CA). Todos los compuestos de acuerdo con la invención tenían la estructura con fosforotioato modificada.

[083] Todas las nucleósido fosforamiditas se caracterizaron por espectros de RMN de 31P y 1H. Los nucleósidos modificados se incorporaron en sitios específicos usando ciclos de acoplamiento normales recomendados por el proveedor. Después de la síntesis, los compuestos se desprotegieron usando hidróxido de amonio concentrado y se purificaron por HPLC de fase reversa, destritilación, seguido de diálisis. Los compuestos purificados como forma de sal de sodio se liofilizaron antes del uso.

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Ejemplo 2:

Condiciones y reactivos para el cultivo de células

5 [084] Se cultivaron células HEK293 o HEK293XL que expresaban TLR9 de ratón (Invivogen, San Diego, CA) en placas de 48 pocillos en 250 µl/pocillo de DMEM suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10 % en una estufa incubadora con CO2 al 5 %. A una confluencia del 80 %, los cultivos se transfectaron transitoriamente con 400 ng/ml del plásmido indicador SEAP (secretado a partir de fosfatasa alcalina de embrión humano) (pNifty2-Seap) (Invivogen) en presencia de 4

10 µl/ml de Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) en medio de cultivo. El ADN plásmido y la Lipofectamine se diluyeron por separado en medio exento de suero y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Tras la incubación, el ADN diluido y la Lipofectamine se mezclaron y las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron alícuotas de 25 µl de la mezcla de ADN/Lipofectamine que contenían 100 ng de ADN plásmido y 1 µl de Lipofectamine a cada pocillo de la

15 placa de cultivo de células, y se prosiguió con el cultivo durante 4 horas.

Inducción de citoquinas por compuestos ejemplares de la Tabla I en células HEK293 que expresan TLR9 de ratón

[085] Tras la transfección, se sustituyó el medio por un medio de cultivo reciente, se añadieron compuestos ejemplares de la Tabla I a los cultivos a concentraciones de 0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, ó

20 10,0 µg/ml, y se prosiguió con el cultivo durante 18 horas. Al final del tratamiento con los compuestos, se determinaron los niveles de NF-κB usando el ensayo SEAP (forma secretada de fosfatasa alcalina embrionaria humana) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invivogen). Brevemente, se tomaron 30 µl del sobrenadante del cultivo de cada tratamiento, se incubaron con sustrato p-nitrofinil fosfato y el color amarillo generado se midió con un lector de placas a 405 nm (Putta MR et al, Nucleic Acids Res., 2006,

25 34:3231-8).

Ejemplo 3:

Inducción de citoquinas por compuestos ejemplares de la Tabla I en PBMC humanas, pDC humanas y esplenocitos de ratón

Aislamiento de PBMC humanas

30 [086] Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de sangre de voluntarios sanos extraída recientemente (CBR Laboratories, Boston, MA) mediante el método de centrifugación en gradiente de densidad Ficoll (Histopaque-1077, Sigma).

Aislamiento de pDC humanas

[087] Se aislaron células dendríticas plasmacitoides (pDC) humanas de PBMC de sangre

35 humana recién extraída de voluntarios sanos por selección positiva, usando los kits de aislamiento celular BDCA4 (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de esplenocitos de ratón 5x106 células/ml. Se plaquearon pDC humanas en placas de 96 pocillos usando 1X106 células/ml. Los compuestos ejemplares de la Tabla I disueltos en DPBS (pH 7,4; Mediatech) se añadieron a los cultivos celulares en dosis de 0, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, ó 10, 0 µg/ml. A continuación se incubaron las células a 37 °C durante 24 horas y se recogieron los sobrenadantes para los ensayos múltiplex con el sistema Luminex o ELISA. En ciertos experimentos, se midieron los niveles de IFN-α, IL-6 o IL-12 mediante ELISA de fase doble. Los reactivos necesarios, incluidos los anticuerpos de las citoquinas y los patrones, se adquirieron a PharMingen.

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Múltiplex de citoquinas con el sistema Luminex

[089] En ciertos experimentos, se midieron los niveles de IL-1Rα, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, MIP-1α, MIP-β, MCP-1 e IL-12p40p70 en sobrenadantes del cultivo mediante ensayos multiplexados Luminex, que se llevaron a cabo utilizando kits de ensayos multiplexados de citoquinas humanas de Biosource en un instrumento Luminex 100, y se analizaron los datos utilizando el software StarStation suministrado por Applied Cytometry Systems (Sacramento, CA).

Activación de células inmunitarias humanas.

[090] Se aislaron células dendríticas plasmacitoides (pDC) humanas de PBMC de sangre humana sana recién extraída y se cultivaron con 50 µg/ml de agonistas de TLR9 o control durante 24 horas. Las células se tiñeron con Abs conjugados fluorescentemente (CD123, CD80, CD86) y los datos se recogieron en un citómetro FC500 MPL. La intensidad media de fluorescencia de CD80 y CD86 en células CD123+ se analizó usando software FlowJo y se expresa como veces de cambio sobre control de PBS.

[091] Se aislaron células dendríticas mieloides (mDC) humanas de PBMC de sangre humana sana recién extraída y se cultivaron con 50 µg/ml de agonistas de TLR9 o control durante 24 horas. Las células se tiñeron con Abs conjugados fluorescentemente (CD11c, CD80, CD40) y los datos se recogieron en un citómetro FC500 MPL. La intensidad media de fluorescencia de CD80 y CD40 en células CD11c+ se analizó usando software FlowJo y se expresa como veces de cambio sobre control de PBS.

Ejemplo 4:

Ensayo de proliferación de células B humanas en presencia de compuestos ejemplares de la Tabla I

[092] Se aislaron células B humanas de PBMC por selección positiva usando el kit de aislamiento de células CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[093] El medio de cultivo usado para el ensayo consistió en un medio RPMI 1640 suplementado con 1,5 mM glutamina, 1 mM piruvato de sodio, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 50 µM 2-mercaptoetanol, 100 IU/ml mezcla de penicilina-estreptomicina y 10 % suero bovino fetal inactivado con calor.

[094] Se estimuló un total de 0,5 X 106 células B por ml (es decir, 1 X 105/ 200 µl/pocillo) en placas de fondo redondo de 96 pocillos con diferentes concentraciones de compuestos ejemplares de la Tabla I en triplicado durante un periodo total de 68 horas. Después de 68 horas, las células se pulsaron con 0,75 µCi de [3H]-timidina (1Ci = 37 GBq; Perkin Elmer Life Sciences) en 20 µl de medio RPMI 1640 (sin suero) por pocillo y se recogieron 6-8 horas después. Las placas se recogieron usando un recolector de células en filtro y la incorporación radiactiva se determinó usando la

Claims

imagen1

1. El compuesto inmunomodulador

5'-TCG1AACG1TTCG1-Y3-TGTTG1CTGTCTTG1CT-5'

[5'-SEC ID N.º: 45-3'-Y3-3'-SEC ID N.º: 178-5'];

en donde G1 = 7-deaza-dG; C = 2-O-metilribonucleótidos; Y3 = enlazador 1,5-pentanediol.
2.

Composición que comprende el compuesto inmunomodulador de la reivindicación 1 y un transportador fisiológicamente aceptable.
3.

Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 utilizable en un método para generar una respuesta inmunitaria en un individuo.
4.

Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 utilizable en un método para tratar terapéuticamente a un individuo afectado de una enfermedad o trastorno en el que sería beneficioso modular una respuesta inmunitaria.
5.

El compuesto de la reivindicación 4 en la que la enfermedad o trastorno es cáncer, un trastorno autoinmunitario, inflamación de las vías respiratorias, trastorno inflamatorio, enfermedad infecciosa, trastorno cutáneo, alergia, asma o una enfermedad causada por un patógeno o alérgeno.
6.

El compuesto de la reivindicación 4, en el que el método comprende además administrar uno o más compuestos quimioterapéuticos, agentes terapéuticos dirigidos, vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótidos antisentido, agonistas de TLR, inhibidores de quinasa, péptidos, proteínas, vacunas de ADN, adyuvantes, moléculas coestimuladoras o combinaciones de éstos.
7.

Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 utilizable en un método para tratar profilácticamente a un individuo afectado de una enfermedad o trastorno en el que sería beneficioso modular una respuesta inmunitaria.
8.

El compuesto de la reivindicación 7, en el que la enfermedad o trastorno es cáncer, un trastorno autoinmunitario, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, trastornos de la piel, alergia, asma, o una enfermedad producida por un patógeno o alérgeno.
9.

El compuesto de la reivindicación 7, en el que el método comprende además administrar uno o más compuestos quimioterapéuticos, agentes terapéuticos dirigidos, vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleótidos antisentido, agonistas de TLR, inhibidores de quinasa, péptidos, proteínas, vacunas de ADN, adyuvantes, moléculas coestimuladoras o combinaciones de éstos.

100