JP2014205691A - Tlr9の新規な合成アゴニスト - Google Patents
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Abstract
【解決手段】固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすトール様受容体9(TLR9)のアゴニストであって、特定の化学的修飾によって特徴付けられるオリゴヌクレオチドベースからなる免疫調節化合物。
【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2007年8月1日に出願された米国仮出願第60/953,251号、2007年10月30日に出願された米国仮出願第60/983,601号、2007年11月12日に出願された米国仮出願第60/987,151号、および2007年12月20日に出願された米国仮出願第61/015,292号の利益を主張し、その全内容は、本明細書に参照として組込まれる。
本発明は、トール様受容体(TLR)媒介性免疫応答の調節に有用な合成化学組成物に関する。特に、本発明は、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすトール様受容体9(TLR9)のアゴニストに関する。
トール様受容体(TLR)は多くの免疫系細胞上に存在し、先天性免疫応答に関与することが示されている(Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537)。脊椎動物において、このファミリーは、細菌、真菌、寄生生物、およびウィルスからの病原体関連分子パターンを認識することで知られる、TLR1からTLR11と呼ばれる11のタンパク質からなる(Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815; Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531; Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943)。
本発明は、アゴニストとしてのTLR9との相互作用を通じて個別に特異な免疫応答プロファイルを提供する、新規なオリゴヌクレオチドベース化合物を提供する。本発明によるTLR9アゴニストは、特定のおよび固有の化学的修飾によって特徴付けられ、それによりその特異な免疫応答活性化プロファイルを提供する。
また、本発明は以下の内容を含む。
(1) 化合物番号1〜169から選択される、免疫調節化合物。
(2) (1)に記載の免疫調節化合物および生理学的に許容可能な担体を含む、組成物。
(3) 個体において免疫応答を起こす方法であって、該方法が、薬学的に効果的な量の(1)に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
(4) 免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を治療的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に効果的な量の(1)に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
(5) 疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、(4)に記載の方法。
(6) さらに、1または2以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、DNAワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを投与することを含む、(4)に記載の方法。
(7) 免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を予防的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に効果的な量の(1)に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
(8) 疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは個体中の病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、(7)に記載の方法。
(9) さらに、1または2以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、DNAワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを投与することを含む、(7)に記載の方法。
本発明は、アゴニストとしてのTLR9との相互作用を通して独立して特異な免疫応答プロファイルを提供する、新規なオリゴヌクレオチドベース化合物を提供する。本発明のTLR9アゴニストは、固有の化学的修飾によって特徴付けられ、それにより特異な免疫応答活性化プロファイルを提供する。本明細書で参照される全ての公表文献は、当業者の技術レベルを反映し、その全体が参照として本明細書に組込まれる。それらの参考文献の教示と本明細書との間のあらゆる競合は、後者を支持することにより解決される。
「2’−置換ヌクレオシド」または「2’−置換アラビノシド」という語は、一般的に、ペントースまたはアラビノース部分の2’位のヒドロキシル基が置換されて2’−置換または2’−O−置換リボヌクレオシドを産生するヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、かかる置換は、1〜6の飽和または不飽和炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基によって、ハロゲン原子によって、または6〜10の炭素原子を含むアリール基によってなされ、ここでかかるヒドロカルビルまたはアリール基は非置換であってよく、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、もしくはアミノ基によって置換されていてよい。2’−O−置換リボヌクレオシドまたは2’−O−置換アラビノシドの例は、限定されずに、2’−アミノ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−アルキルおよび2’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、2’−O−メチルリボヌクレオシドまたは2’−O−メチルアラビノシドおよび2’−O−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは2’−O−メトキシエトキシアラビノシドを含む。
免疫刺激部分を含有するオリゴヌクレオチドベース化合物の合成
本発明の化学的実体は、1μmolから0.1mMのスケールで、自動化DNA合成機(OligoPilot II, AKTA, (Amersham)および/またはExpedite 8909 (Applied Biosystem))を用いて、図1および2に概説したリニア合成またはパラレル合成手順にしたがって合成した。
細胞培養条件および試薬
マウスTLR9を発現するHEK293またはHEK293XL細胞(Invivogen, San Diego, CA)を48ウェルプレート中の250μl/ウェルの10%加熱不活性化FBS添加DMEM中で、5%CO2インキュベーターに入れて培養した。80%コンフルエンス時点で、培養物を、SEAP(分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ)レポータープラスミド(pNifty2−Seap)(Invivogen)400ng/mlで、4μl/mlのリポフェクタミン(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下、培養培地中で一時的にトランスフェクトした。プラスミドDNAおよびリポフェクタミンを、血清フリーの培地中で個別に希釈し、室温で5分インキュベートした。インキュベートの後、希釈DNAおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で20分インキュベートした。100ngのプラスミドDNAおよび1μlのリポフェクタミンを含有するDNA/リポフェクタミン混合物25μlのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を4時間継続した。
トランスフェクション後、培地を新鮮な培養培地と取り替え、表Iからの代表的な化合物を、0、0.1、0.3、1.0、3.0または10.0μg/mlの濃度で培地に添加し、培養を18時間継続した。化合物処理の最後に、NF−κBのレベルを、製造者のプロトコル(Invitrogen)にしたがってSEAP(分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ)アッセイを用いて決定した。簡潔には、30μlの培養上清をを各処置物から採取し、p−ニトロフィニルホスフェート基質とともにインキュベートし、発生した黄色を405nmでプレートリーダーで計測した(Putta MR et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8)。
表Iからの代表的な化合物による、ヒトPBMC、pDCおよびマウス脾臓細胞におけるサイトカイン誘導
ヒトPBMCの単離
新しく収集した健康なボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)からの末梢血単核細胞(PBMC)を、フィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-107, Sigma)により単離した。
ヒト形質細胞様樹状細胞(pDC)を、新たに採取した健康なヒト献血者の血液PBMCを、製造者の使用説明書にしたがってBDCA4細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いた陽性選択により単離した。
ヒトPBMCを、48ウェルプレートに5×106細胞/mlでプレートした。ヒトpDCを、96ウェルディシュに1×106細胞/mlでプレートした。DPBS(pH7.4;Mediatech)中に溶解した表Iの例示の化合物を、細胞培養物に、0、0.1、0.3、1.0、3.0または10μg/ml加えた。細胞を次に37℃で24時間インキュベーションし、上清をLuminex Multiplex用またはELISAアッセイ用に収集した。ある実験においては、IFN−α、IL−6および/またはIL−12のレベルを、サンドイッチELISAで測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
ある実験においては、培養物上清中のIL−1Rα、IL−6、IL−10、IL−12、IFN−α、IFN−γ、MIP−1α、MIP−β、MCP−1およびIL−12p40p70のレベルを、Luminex Multiplexアッセイにより測定した;これは、Luminex 100装置上でBiosource製ヒトマルチプレクスサイトカインアッセイキットを用いて実施し、データをApplied Cytometry Systems(Sacramento, CA)が供給するStarStationソフトウェアを用いて解析した。
ヒト形質細胞様樹状細胞(pDC)を新たに採取した健康なヒト献血者の血液PBMCから単離し、50μg/mlのTLR9アゴニストまたはコントロールとともに24時間培養した。細胞を蛍光物質抱合Abs(CD123、CD80、CD86)で染色し、データをFC500 MPLサイトメーターで採取した。CD123+細胞におけるCD80およびCD86平均蛍光強度を、FlowJoソフトウェアを用いて分析し、PBSコントロールに対する変化倍率として表現した。
表Iからの代表的な化合物の存在下でのヒトB細胞増殖アッセイ
ヒトB細胞を、PBMCから、製造業者の指示に従ってCD19 Cell Isolation Kit(Mitenyi Biotec, Auburn, CA)を用いた陽性選択により単離した。
アッセイに用いた培養培地は、1.5mMのグルタミンを補ったRPMI1640培地、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸、50μMの2−メルカプトエタノール、100IU/mlのペニシリン−ストレプトマイシン混合物および10%の熱非活性化ウシ胎仔血清からなる。
全体で1ml当たり0.5×106のB細胞(すなわち、1×105/200μl/ウェル)を、96ウェルの平底プレートで、表Iからの代表的な化合物の異なる濃度で、トリプリケートで、全68時間刺激した。68時間後、細胞を、1ウェル当たり、20μlのRPMI1640培地(血清なし)中の0.75μCiの[3H]−チミジン(1Ci=37GBq;Perkin Elmer Life Sciences)でパルスし、6〜8時間後に収穫した。次にプレートを細胞収穫器により収穫し、放射性混入物を標準の液体シンチレーション技術により決定した。いくつかのケースでは、対応する[3H]−T(cpm)を増殖指数に変換し、これを用いて報告した。
TLR9アゴニスト化合物で処置されたマウスモデルにおけるin vivoサイトカイン分泌
C57BL/6マウスおよびBALB/cマウス、5〜6週齢、をTaconic Farms, Germantown, NYから得、Idera PharmaceuticalのIACUC認可動物プロトコルにしたがって維持した。マウス(n=3)に、表Iからのそれぞれの免疫調節化合物0.25または1.0mg/kg(単一投与量)皮下注射(s.c.)した。免疫調節化合物の投与2時間後に血清を後眼窩出血により採取し、IL−12、IL−10、IL−6、IP−10、KC、MCP1MIG、MIP−1αおよびTNF−α濃度をサンドイッチELISAまたはLuminex multiplexアッセイによって決定した。結果を7A、7B、7C、7D、7Eおよび7Fに示し、新規化学組成物を含む免疫調節化合物のin vivo投与が、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを実証する。サイトカインおよびケモカイン抗体および標準を含むすべての試薬は、PharMingen(San Diego, CA)から購入した。
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
Claims (5)
- 5’−TCG2TCG2TTU1Y−M−YU1TTG2CTG2CT−5’、
ここで、
G2=AraG、
U1=2’−デオキシ−U、
M=cis,cis−1,3,5−シクロヘキサントリオールリンカー、
Y=1,3−プロパンジオールリンカーである、
で表される、免疫調節化合物。 - 免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を治療的に処置するための医薬組成物であって、薬学的に効果的な量の請求項1に記載の化合物を含み、前記疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、前記医薬組成物。
- さらに、1または2以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、DNAワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を予防的に処置するための医薬組成物であって、薬学的に効果的な量の請求項1に記載の化合物を含み、前記疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは個体中の病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である前記医薬組成物。
- さらに、1または2以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、TLRアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、DNAワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを含む、請求項4に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (8)
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---|---|---|---|
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