ES2487645T3 - Compuestos inmunomoduladores quiméricos y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un compuesto inmunomodulador quimérico (CIQ) que comprende tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico, en el que el CIQ comprende una estructura central con la fórmula: [Nv]x---Sp en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a X restos de ácido nucleico seleccionados independientemente, Nv, y en la que X es al menos 3, en el que dicho espaciador no es un polipéptido, en el que al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-TCG-3', en el que dicho CIQ tiene actividad inmunomoduladora.

Description


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E11182593
30-07-2014
DESCRIPCIÓN
Compuestos inmunomoduladores quiméricos y métodos de uso de los mismos
Campo técnico
La presente invención se refiere a compuestos inmunomoduladores quiméricos ("CIQs") que contienen restos de ácido nucleico y restos distintos de ácido nucleico, y al uso de tales compuestos para modular una respuesta inmunitaria. La invención tiene utilidad en los campos de la biomedicina y la inmunología.
Antecedentes
La referencia a una publicación en esta sección no se debería considerar una indicación de que la publicación sea la técnica anterior para la presente invención.
El tipo de respuesta inmunitaria generada por una infección u otra exposición antigénica se puede distinguir en general por el subgrupo de células T cooperadoras (Th) implicadas en la respuesta. El subgrupo Th1 es responsable de las funciones clásicas mediadas por células, tales como la hipersensibilidad de tipo retardado y la activación de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), mientras que las funciones del subgrupo Th2 son más eficaces como auxiliares para la activación de las células B. El tipo de respuesta inmunitaria hacia un antígeno está influido en general por las citocinas, producidas por las células que responden al antígeno. Se cree que las diferencias en las citocinas secretadas por las células Th1 y Th2 reflejan diferentes funciones biológicas de estos dos subgrupos. Véase, por ejemplo, Romagnani (2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18.
El subgrupo Th1 puede ser particularmente adecuado para responder a las infecciones virales, a los patógenos intracelulares y a las células tumorales, porque secreta IL-2 e IFN-γ, que activan los CTLs. El subgrupo Th2 puede ser más adecuado para responder a las bacterias que viven libremente y a los parásitos helmínticos, y puede mediar en reacciones alérgicas, ya que se sabe que IL-4 e IL-5 inducen la producción de IgE y la activación de eosinófilos, respectivamente. En general, las células Th1 y Th2 secretan patrones diferentes de citocinas, y así, un tipo de respuesta puede moderar la actividad del otro tipo de respuesta. Un desplazamiento en el equilibrio de Th1/Th2 puede dar como resultado una respuesta alérgica, por ejemplo, o, de manera alternativa, una respuesta incrementada de CTLs.
Se ha reconocido durante cierto tiempo que se puede inducir una respuesta inmunitaria de tipo Th1 en mamíferos mediante la administración de ciertos polinucleótidos inmunomoduladores. Los polinucleótidos inmunomoduladores incluyen secuencias denominadas secuencias inmunoestimuladoras ("ISS"), que incluyen a menudo un dinucleótido CG. Véanse, p.ej., las publicaciones PCT WO 98/55495, WO 97/28259, las pat. de EE.UU. Nºs 6.194.388 y 6.207.646; Krieg et al. (1995) Nature 374:546-49 y Krieg, Antisense Oligonucleotide Technology, (1998), 431-448. Para numerosas enfermedades infecciosas, tales como la tuberculosis y la malaria, las respuestas de tipo Th2 tienen poco valor protector contra la infección. Las vacunas basadas en proteínas inducen en general respuestas inmunitarias de tipo Th2, caracterizadas por títulos elevados de anticuerpos neutralizantes, pero sin una inmunidad significativa mediada por células. Además, algunos tipos de respuestas de anticuerpos son inadecuadas en ciertas indicaciones, muy notablemente en la alergia, en la que una respuesta de anticuerpos IgE puede dar como resultado un choque anafiláctico.
Los documentos WO 01/83503, WO 02/26757 y WO 01/12804 describen métodos para incrementar el efecto inmunoestimulador de oligonucleótidos que contienen CpG mediante la introducción de carbohidratos o bases modificadas en 2' o 3', mediante la introducción de uniones internucleosídicas modificadas, mediante la introducción de análogos de dinucleótidos o mediante la introducción de un nucleósido sustituido en 2'.
En vista de la necesidad de métodos mejorados de inmunoterapia, existe la necesidad de identificación de compuestos útiles para la modulación de una respuesta inmunitaria.
Descripción de la invención
En un aspecto, la invención se dirige a un compuesto quimérico que tiene actividad inmunomoduladora. El compuesto inmunomodulador quimérico ("CIQ") comprende en general tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos distintos de ácido nucleico. Los restos de ácido nucleico de un CIQ pueden ser iguales o diferentes. Los restos distintos de ácido nucleico de un CIQ con más de un resto distinto de ácido nucleico pueden ser iguales o diferentes. Así, en una realización, el CIQ comprende tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico, en el que al menos un resto espaciador distinto de ácido nucleico está unido de manera covalente a tres restos de ácido nucleico. Al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-TCG-3'.
Así, la presente invención proporciona un compuesto inmunomodulador quimérico (CIQ) que comprende tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico,
en el que el CIQ comprende una estructura central con la fórmula:
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[Nv]x---Sp en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a X restos de ácido nucleico seleccionados independientemente, Nv, y en la que X es al menos 3,
en el que dicho espaciador no es un polipéptido,
en el que al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-TCG-3',
en el que dicho CIQ tiene actividad inmunomoduladora.
En un aspecto, la invención proporciona un CIQ que tiene una estructura central con la fórmula [Nv]A---Sp, en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a la cantidad "A" de restos de ácido nucleico seleccionados independientemente, Nv, en la que A es al menos 3, y en la que el CIQ exhibe actividad inmunomoduladora. En una realización, el CIQ tiene la secuencia central [Sv-Nv]A---Sp en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a la cantidad "A" de elementos [Sv-Nv] seleccionados independientemente, y el elemento [Sv-Nv] seleccionado independientemente incluye un resto espaciador unido de manera covalente a un resto de ácido nucleico, y en la que A es al menos 3. En una realización, A es de 3 a 50. En una realización diferente, A es mayor de 50. En una realización, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 restos de ácido nucleico del CIQ tienen secuencias diferentes.
En un aspecto, el CIQ comprende una estructura central con la fórmula [Nv]A-Sp o [Sv-Nv]A-Sp (en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a la cantidad "A" de restos de ácido nucleico seleccionados independientemente, Nv, o elementos [Sv-Nv] seleccionados independientemente, y cada elemento [Sv-Nv] seleccionado independientemente comprende un resto espaciador unido de manera covalente a un resto de ácido nucleico, en la que A es al menos 3. En ciertas realizaciones, A es de 3 a alrededor de 50 o de alrededor de 50 a alrededor de 500. En una realización, Sp comprende un dendrímero. En una realización, un resto de ácido nucleico del CIQ tiene una secuencia seleccionada de TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, TGTCGTT, TCGXXX, TCGAXX, TCGTCG, AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, GACGTT, TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, TCGTC, TCGA, TCGT, TCGX, o TCG (en las que "X" es cualquier nucleótido).
El CIQ puede comprender restos espaciadores no nucleotídicos que comprenden, por ejemplo, trietilen glicol, hexaetilen glicol, un polímero que comprende restos de oligoetilen glicol unidos mediante enlaces fosfodiéster y/o fosforotioato, alquilo C2-C10 (p.ej., propilo, butilo, hexilo), glicerol o un glicerol modificado (p.ej., glicerol derivatizado en la posición 1, 2 ó 3 hidroxi; p.ej., 3-levulinil-glicerol), pentaeritritol o pentaeritritol modificado (pentaeritritol modificado en cualquier posición(es) hidroxi, p.ej., "triplicador"), 2-(hidroximetil)etilo, 1,3-diamino-2-propanol, un nucleótido abásico, un polisacárido (p.ej., un polisacárido reticulado), un dendrímero, y/u otros componentes de restos espaciadores descritos en la presente memoria, en diversas combinaciones.
En diversas realizaciones, un CIQ descrito anteriormente tiene una o más de las características siguientes: (i) el CIQ incluye al menos un resto de ácido nucleico de una longitud menor de 8 nucleótidos (o pares de bases), o, de manera alternativa, de una longitud menor de 7 nucleótidos (ii) todos los restos de ácido nucleico del CIQ tienen una longitud menor de 8 nucleótidos, o, de manera alternativa, una longitud menor de 7 nucleótidos, (iii) el CIQ incluye al menos un resto de ácido nucleico que incluye la secuencia 5'-CG-3' (p.ej., 5'-TCG-3'), (iv) el CIQ incluye al menos dos restos de ácido nucleico que tienen secuencias diferentes, (v) todos los restos de ácido nucleico del CIQ tienen la misma secuencia, (vi) el CIQ incluye al menos un resto espaciador distinto de ácido nucleico que es o que comprende trietilen glicol, hexaetilen glicol, propilo, butilo, hexilo, glicerol o un glicerol modificado (p.ej., glicerol derivatizado en la posición 1, 2 ó 3 hidroxi; p.ej., 3-levulinil-glicerol), pentaeritritol o pentaeritritol modificado (pentaeritritol modificado en cualquier posición hidroxi, p.ej., "triplicador"), 2-(hidroximetil)etilo, 1,3-diamino-2propanol, un nucleótido abásico, un polisacárido (p.ej., un polisacárido reticulado), o un dendrímero. En ciertas realizaciones, el resto espaciador no es un polipéptido.
En diversas realizaciones, un CIQ descrito en la presente memoria tiene una o más de las características siguientes:
(vii) el CIQ incluye al menos un resto de ácido nucleico del CIQ que no tiene una "actividad inmunomoduladora aislada", (viii) el CIQ no incluye ningún resto de ácido nucleico con una "actividad inmunomoduladora aislada", (ix) el CIQ incluye al menos un resto de ácido nucleico del CIQ que tiene una "actividad inmunológica aislada inferior". La "actividad inmunomoduladora aislada" y la "actividad inmunológica aislada inferior" se describen en la presente memoria. En diversas realizaciones, un CIQ descrito en la presente memoria incluye al menos un resto de ácido nucleico que es bicatenario o parcialmente bicatenario. Los CIQs se pueden diseñar con restos de ácido nucleico auto-complementarios, de forma que se pueden formar moléculas dobles. Véanse, p.ej., C-84, C-85, y C-87.
Así, en diversos aspectos, la invención proporciona un CIQ que comprende tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico, en el que al menos un resto espaciador está unido de manera covalente a tres restos de ácido nucleico y al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-TCG-3', y en el que dicho CIQ tiene actividad inmunomoduladora. El CIQ puede comprender al menos tres restos de ácido nucleico, en el que cada resto de ácido nucleico está unido de manera covalente a al menos un resto espaciador distinto de ácido nucleico. El CIQ puede tener al menos una actividad inmunomoduladora, tal como (a) la
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capacidad de estimular la producción de IFN-γ por las células mononucleares de sangre periférica humana; (b) la capacidad de estimular la producción de IFN-α por las células mononucleares de sangre periférica humana; y/o (c) la capacidad de estimular la proliferación de células B humanas.
Uno o más restos de ácido nucleico del CIQ pueden comprender una secuencia tal como 5'-TCGA-3', 5'-TCGACGT3', 5'-TCGTCGA-3' y 5'-ACGTTCG-3'. En una realización, uno o más restos de ácido nucleico del CIQ pueden tener la secuencia 5'-X1X2CGX3X4-3' (en la que X1 es cero a diez nucleótidos; X2 no está presente o es A, T, o U; X3 no está presente o es A; y X4 es cero a diez nucleótidos, y en el que el resto de ácido nucleico está conjugado a un resto espaciador, por ejemplo en el extremo 3'). En una realización, la suma de nucleótidos en X1, X2, X3, y X4 puede ser menor de 8, menor de 7, menor de 6, menor de 5 o menor de 4. En ciertas realizaciones, uno o más restos de ácido nucleico del CIQ puede tener una secuencia de ácido nucleico tal como TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, TGTCGTT, TCGXXX, TCGAXX, TCGTCG, AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, GACGTT, TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, TCGTC, TCGA, TCGT, TCGX, o TCG (en las que "X" es cualquier nucleótido).
En una realización, uno o más restos de ácido nucleico comprenden 3 a 7 bases. En una realización, el resto de ácido nucleico comprende 3 a 7 bases y tiene la secuencia 5'-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3', o 5'-TCG[(X)2-4]-3', o 5'TCG(A/T)[(X)1-3]-3', o 5'-TCG(A/T)CG(A/T)-3', o 5'-TCGACGT-3' o 5'-TCGTCGA-3', en las que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente. En ciertas realizaciones, el CIQ contiene al menos 3, al menos 10, al menos 30 o al menos 100 restos de ácido nucleico que tienen una secuencia descrita anteriormente.
El CIQ puede incluir al menos un resto de ácido nucleico que tiene una longitud menor de 8 nucleótidos. Opcionalmente, todos los restos de ácido nucleico del CIQ tienen una longitud menor de 8 nucleótidos. En ciertas realizaciones, todos los restos de ácido nucleico del CIQ que comprenden la secuencia 5'-CG-3' tienen una longitud menor de 8 nucleótidos. El CIQ puede incluir al menos 2 restos de ácido nucleico que tienen secuencias diferentes. El CIQ puede contener al menos un resto de ácido nucleico que no comprende la secuencia 5'-CG-3'. El CIQ puede incluir al menos un resto de ácido nucleico que no tiene actividad inmunológica aislada o que tiene una actividad inmunológica aislada inferior. Opcionalmente, ningún resto de ácido nucleico del CIQ tiene actividad inmunomoduladora aislada. Las uniones entre los nucleótidos de los restos de ácido nucleico pueden incluir fosfodiéster, éster de fosforotioato, éster de fosforoditioato, otras uniones covalentes, y mezclas de las mismas. De forma similar, las uniones entre restos de ácido nucleico y restos espaciadores o entre componentes de restos espaciadores pueden incluir fosfodiéster, éster de fosforotioato, éster de fosforoditioato, otras uniones, y mezclas de las mismas.
En una realización, el CIQ incluye un grupo de unión reactivo (p.ej., un grupo reactivo tiol). El CIQ puede estar unido
o asociado de manera no covalente a un polipéptido, p.ej., un antígeno polipeptídico.
La invención también proporciona composiciones que comprenden un CIQ junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un antígeno y/o un microsoporte catiónico (tal como un polímero de ácido láctico y ácido glicólico). La composición puede estar esencialmente exenta de endotoxinas.
En un aspecto, la invención proporciona una composición que contiene un CIQ descrito en la presente memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable, un antígeno (p.ej., un antígeno hacia el que se desea una respuesta inmunitaria), o ambos. En una realización, la composición se formula siguiendo la normativa PCF. En una realización, la composición se prepara mediante un procedimiento que incluye ensayar en la composición la presencia de una endotoxina. En una realización, la composición está esencialmente exenta de endotoxinas. En una realización, la composición no contiene liposomas.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un CIQ como se describe en la presente memoria para la fabricación de un medicamento.
En un aspecto, la invención proporciona un CIQ para el uso en un método de modulación de una respuesta inmunitaria en un individuo mediante la administración de un compuesto inmunomodulador quimérico o composición como se describe en la presente memoria en una cantidad suficiente para modular una respuesta inmunitaria en el individuo. En una realización, el individuo padece un trastorno asociado a una respuesta inmunitaria de tipo Th2, por ejemplo, una alergia o asma inducida por alergia. En una realización, el individuo tiene una enfermedad infecciosa.
En un aspecto, la invención proporciona un CIQ para el uso en un método para incrementar el interferón-gamma (IFN-γ) en un individuo mediante la administración de un CIQ o composición como se describe en la presente memoria, en una cantidad suficiente para incrementar el IFN-γ en el individuo. En una realización, el individuo tiene un trastorno inflamatorio. En una realización, el individuo tiene fibrosis pulmonar idiopática.
En un aspecto, la invención proporciona un CIQ para el uso en un método para incrementar el interferón-alfa (IFN-α) en un individuo mediante la administración de un CIQ o composición como se describe en la presente memoria, en una cantidad suficiente para incrementar el IFN-α en el individuo. En una realización, el individuo tiene una infección viral.
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En un aspecto, la invención proporciona un CIQ para el uso en un método para mejorar un síntoma de una enfermedad infecciosa en un individuo, mediante la administración de una cantidad eficaz de un CIQ o composición, como se describe en la presente memoria, al individuo, en el que la cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar un síntoma de la enfermedad infecciosa.
En un aspecto, la invención proporciona un CIQ para el uso en un método para mejorar un trastorno relacionado con IgE en un individuo, mediante la administración de una cantidad eficaz de un CIQ o composición descrita en la presente memoria a un individuo que tiene un trastorno relacionado con IgE, en el que una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar un síntoma del trastorno relacionado con IgE. En una realización, el trastorno relacionado con IgE es alergia o un trastorno relacionado con alergia.
La invención proporciona además un CIQ para el uso en un método para modular una respuesta inmunitaria en un individuo mediante la administración de un CIQ a un individuo en una cantidad suficiente para modular una respuesta inmunitaria en dicho individuo. En ciertas realizaciones, el individuo tiene cáncer y/o padece un trastorno asociado a una respuesta inmunitaria de tipo Th2 (p.ej., una alergia o asma inducida por alergia) y/o tiene una enfermedad infecciosa.
Descripción breve de las figuras
La Figura 1 muestra la estructura de ciertos reactivos útiles para la síntesis de restos espaciadores distintos de ácido nucleico de los CIQs. Se muestran precursores de restos espaciadores de fosforamidita protegidos con dimetoxitritilo para los restos espaciadores HEG, propilo, TEG, HME, butilo, y abásicos.
La Figura 2 muestra la estructura de ciertos reactivos útiles para la síntesis de restos espaciadores distintos de ácido nucleico simétricos o asimétricos de CIQs. Se muestran precursores de restos espaciadores de fosforamidita protegidos con dimetoxitritilo para los restos espaciadores de glicerol [2] ("ramificado simétrico"), levulinil-glicerol [3] ("ramificado asimétrico"), "triplicador" [9] y "doblador simétrico" [10].
Las Figuras 3A y 3B esquematizan la síntesis de un CIQ ramificado.
La Figura 4 muestra el esquema sintético de C-105.
La Figura 5 muestra la inducción de genes inmunoasociados en el pulmón de ratón tras tratamiento intranasal con CIQs.
Las Figuras 6A-C muestran el efecto de CIQs sobre los niveles de IL-12 p40 (Fig. 6A), IL-6 (Fig. 6B), y TNF-alfa (Fig. 6C).
Las Figuras 7A-B muestran las estructuras de C-8 (Fig. 7A) y C-101 (Fig. 7B).
Modos para llevar a cabo la invención
I. Métodos Generales
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos, e inmunología, que se hallan dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001), (conjuntamente e individualmente mencionados en la presente memoria como "Sambrook"). Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, que incluye los suplementos de todo el año 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, y
N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, y Harlow y Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (conjuntamente e individualmente mencionados en la presente memoria como "Harlow y Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000); y Agrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press Inc., Nueva Jersey, 1993).
II. Definiciones
Tal como se usa en la presente memoria, la forma singular "un/una", y "el/la", incluye las referencias en plural, a menos que se indique de otra manera o sea evidente a partir del contexto. Por ejemplo, como será evidente a partir del contexto, "un" compuesto inmunoestimulador quimérico ("CIQ") puede incluir uno o más CIQs. De forma similar, la referencia en la forma singular de un elemento componente de un CIQ (es decir, resto de ácido nucleico o resto
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espaciador distinto de ácido nucleico) puede incluir múltiples elementos. Por ejemplo, una descripción de "un resto de ácido nucleico" de un CIQ puede describir también dos o más "restos de ácido nucleico" del CIQ.
Tal como se usa en la presente memoria de forma intercambiable, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" incluyen ADN monocatenario (ssADN), ADN bicatenario (dsADN), ARN monocatenario (ssARN) y ARN bicatenario (dsARN), oligonucleótidos y oligonucleósidos modificados, o combinaciones de los mismos. El ácido nucleico puede tener una configuración lineal o circular, o el oligonucleótido puede contener tanto segmentos lineales como circulares. Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleósidos unidos, p.ej., por medio de enlaces fosfodiéster o enlaces alternativos, tales como ésteres de fosforotioato. Un nucleósido consiste en una base de purina (adenina (A) o guanina (G) o un derivado de las mismas) o pirimidina (timina (T), citosina (C) o uracilo (U), o un derivado de las mismas) unida a un carbohidrato. Las cuatro unidades de nucleósidos (o bases) en el ADN se denominan desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina y desoxicitidina. Un nucleótido es un éster de fosfato de un nucleósido.
El término "3'" se refiere en general a una región o posición en un polinucleótido o un oligonucleótido en 3' (en posición posterior) de otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido.
El término "5'" se refiere en general a una región o posición en un polinucleótido o un oligonucleótido en 5' (en posición anterior) de otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido.
Un elemento, p.ej., región, porción, resto espaciador distinto de ácido nucleico, resto de ácido nucleico, o secuencia es "adyacente" a otro elemento, p.ej., región, porción, resto espaciador distinto de ácido nucleico, resto de ácido nucleico, o secuencia, cuando está contiguo directamente a esa región, porción, espaciador o secuencia.
El término "conjugado CIQ-antígeno" se refiere a un complejo en el que un CIQ y un antígeno están unidos. Tales uniones de conjugados incluyen las uniones covalentes y/o no covalentes.
El término "antígeno" significa una sustancia que es reconocida y se une específicamente a un anticuerpo o a un receptor del antígeno de una célula T. Los antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, hidratos de carbono complejos, azúcares, gangliósidos, lípidos y fosfolípidos; las porciones de los mismos y las combinaciones de los mismos. Los antígenos pueden ser los hallados en la naturaleza, o pueden ser sintéticos. Los antígenos adecuados para la administración con un CIQ incluyen cualquier molécula capaz de provocar una respuesta específica del antígeno de células B o de células T. Preferiblemente, los antígenos provocan una respuesta de anticuerpos específicos del antígeno. Los haptenos están incluidos en el alcance de "antígeno". Un hapteno es un compuesto de bajo peso molecular que no es inmunógeno por sí mismo, pero que se vuelve inmunógeno cuando se conjuga con una molécula inmunógena que contiene determinantes antigénicos. Puede ser necesario haptenizar las moléculas pequeñas para que se vuelvan antigénicas. Preferiblemente, los antígenos de la presente invención incluyen péptidos, lípidos (p.ej., esteroles, ácidos grasos y fosfolípidos), polisacáridos, tales como los usados en las vacunas de Haemophilus influenzae, gangliósidos y glicoproteínas.
"Adyuvante" se refiere a una sustancia que, cuando se añade a un agente inmunógeno tal como un antígeno, aumenta o potencia de manera inespecífica una respuesta inmunitaria hacia el agente en el hospedador receptor, tras la exposición a la mezcla.
El término "péptido" son polipéptidos que tienen una longitud y una composición suficientes para conseguir una respuesta biológica, p.ej., la producción de anticuerpos o la actividad de citocinas, sea o no el péptido un hapteno. En general, los péptidos tienen una longitud de al menos seis residuos de aminoácidos. El término "péptido" incluye además los aminoácidos modificados (estén presentes o no de manera natural), y tales modificaciones incluyen, pero sin limitación, la fosforilación, glicosilación, pegilación, lipidación y metilación.
Los "péptidos antigénicos" pueden incluir péptidos nativos purificados, péptidos sintéticos, péptidos recombinantes, extractos peptídicos en bruto, o péptidos en un estado activo parcialmente purificados o sin purificar (tales como los péptidos que son parte de virus atenuados o inactivados, células, microorganismos), o fragmentos de tales péptidos. Un "péptido antigénico" o un "polipéptido antigénico" significa, por lo tanto, todo o una porción de un polipéptido que exhibe una o más propiedades antigénicas. Así, por ejemplo, un "polipéptido antigénico Amb a 1" o un "antígeno del polipéptido Amb a 1" es una secuencia de aminoácidos de Amb a 1, ya sea la secuencia completa, una porción de la secuencia, y/o una modificación de la secuencia, que exhibe una propiedad antigénica (es decir, que se une específicamente a un anticuerpo o a un receptor de células T).
Una "molécula de administración" o un "vehículo de administración" es un resto químico que facilita, permite y/o aumenta la administración de un CIQ, mezcla CIQ-antígeno, o conjugado CIQ-antígeno en un sitio particular y/o con respecto a una sincronización particular. Un vehículo de administración puede estimular o no adicionalmente una respuesta inmunitaria.
Una "respuesta alérgica al antígeno" significa una respuesta inmunitaria caracterizada en general por la generación de eosinófilos (normalmente en el pulmón) y/o IgE específica del antígeno y sus efectos resultantes. Tal como se conoce bien en la técnica, la IgE se une a los receptores de IgE de los mastocitos y los basófilos. Tras una exposición posterior al antígeno reconocido por la IgE, el antígeno entrecruza la IgE de los mastocitos y los
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basófilos, lo que provoca la desgranulación de estas células, lo que incluye, pero sin limitación, la liberación de histamina. Se entiende y se pretende que las expresiones "respuesta alérgica al antígeno", "alergia" y "afección alérgica" son igualmente apropiadas para la aplicación de algunos de los métodos de la invención. Además, se entiende y se pretende que los métodos de la invención incluyan aquellos que son igualmente adecuados para la prevención de una respuesta alérgica, así como para el tratamiento de una afección alérgica preexistente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "alérgeno" significa un antígeno o porción antigénica de una molécula, normalmente una proteína, que provoca una respuesta alérgica tras la exposición a un sujeto. En general, el sujeto es alérgico al alérgeno tal como se indica, por ejemplo, mediante el ensayo de eritema y formación de habón o mediante cualquier método conocido en la técnica. Se dice que una molécula es un alérgeno incluso si solamente un pequeño subgrupo de sujetos muestra una respuesta inmunitaria alérgica (p.ej., IgE), tras la exposición a la molécula. Se conocen en la técnica varios alérgenos aislados. Estos incluyen, pero sin limitación, los proporcionados en la Tabla 1 de la presente memoria.
El término "desensibilización" se refiere al proceso de la administración de dosis crecientes de un alérgeno frente al cual el paciente ha mostrado sensibilidad. Los ejemplos de las dosis de alérgeno usadas para la desensibilización se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127.
La "inmunoterapia específica del antígeno" se refiere a cualquier forma de inmunoterapia que implique al antígeno y genere una modulación específica del antígeno de la respuesta inmunitaria. En el contexto de la alergia, la inmunoterapia específica del antígeno incluye, pero sin limitación, la terapia de desensibilización.
El término "microsoporte" se refiere a una composición particulada que es insoluble en agua y que tiene un tamaño menor de aproximadamente 150, 120 o 100 µm, más habitualmente menor de aproximadamente 50-60 µm, y puede ser menor de aproximadamente 10 µm o aún menor de 5 µm. Los microsoportes incluyen "nanosoportes", que son microsoportes que tienen un tamaño menor de aproximadamente 1 µm, preferiblemente menor de aproximadamente 500 nm. Los microsoportes incluyen partículas de fase sólida, tales como las partículas formadas a partir de polímeros naturales biocompatibles, polímeros sintéticos o copolímeros sintéticos, aunque los microsoportes formados a partir de agarosa o de agarosa reticulada se pueden incluir o excluir de la definición de microsoportes en la presente memoria, así como otros materiales biodegradables conocidos en la técnica. Los microsoportes de fase sólida están formados por polímeros u otros materiales que no son erosionables y/o que no son degradables en condiciones fisiológicas en mamíferos, tales como poliestireno, polipropileno, sílice, materiales cerámicos, poliacrilamida, oro, látex, hidroxiapatita, y materiales ferromagnéticos y paramagnéticos. Los microsoportes biodegradables de fase sólida pueden estar formados por polímeros que son degradables (p.ej., poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de los mismos, tales como poli(D, L-lactida-co-glicolida) o erosionables (p.ej., poliortoésteres, tales como 3,9-dietiliden-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU) o polianhídridos, tales como poli(anhídridos de ácido sebácico) en condiciones fisiológicas en mamíferos. Los microsoportes también pueden estar en fase líquida (p.ej., basados en aceites o lípidos), tales como liposomas, iscoms (complejos inmunoestimuladores, que son complejos estables de colesterol, fosfolípido y saponina activadora adyuvante) sin antígeno, o en gotitas o micelas halladas en emulsiones de aceite-en-agua o agua-en-aceite. Los microsoportes de fase líquida biodegradables incorporan en general un aceite biodegradable, varios de los cuales se conocen en la técnica, que incluyen escualeno y aceites vegetales. Los microsoportes tienen en general forma esférica, pero también son aceptables los microsoportes que se desvían de la forma esférica (p.ej., elipsoidales, en forma de varilla, etc.). Debido a su naturaleza insoluble, los microsoportes de fase sólida se pueden filtrar del agua y de disoluciones (acuosas) basadas en agua.
El término "no biodegradable", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un microsoporte que no se degrada o desgasta en condiciones fisiológicas normales en mamíferos. En general, un microsoporte se considera no biodegradable si no se degrada (es decir, pierde menos del 5% de su masa o de la longitud media del polímero) después de una incubación de 72 horas a 37°C en suero humano normal.
Un microsoporte se considera "biodegradable" si es degradable o desgastable en condiciones fisiológicas normales en mamíferos. Generalmente, un microsoporte se considera biodegradable si se degrada (es decir, si pierde al menos un 5% de su masa o de la longitud media del polímero) después de una incubación de 72 horas a 37°C en suero humano normal.
La expresión "complejo CIQ/microsoporte" o "complejo CIQ/MS" se refiere a un complejo de un CIQ y un microsoporte. Los componentes del complejo pueden estar unidos de manera covalente o no covalente. Los enlaces no covalentes pueden estar mediados por cualquier fuerza de atracción no covalente, que incluye la interacción hidrófoba, el enlace iónico (electrostático), enlaces por puentes de hidrógeno y/o las fuerzas de van der Waals. En el caso de uniones hidrófobas, la unión generalmente es por medio de un resto hidrófobo (p.ej., colesterol) unido de manera covalente al CIQ.
Un "individuo" o "sujeto" es un vertebrado, tal como un ave, preferentemente un mamífero, tal como un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, los seres humanos, los primates no humanos, los animales de granja, los animales para deporte, los animales experimentales (p.ej., ratones y ratas) y los animales domésticos.
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Una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" de una sustancia es la cantidad suficiente para conseguir un efecto biológico deseado, tales como resultados beneficiosos, que incluyen los resultados clínicos, y, como tal, una "cantidad eficaz" depende del contexto en el cual se está aplicando. En el contexto de la administración de una composición que modula una respuesta inmunitaria hacia un antígeno coadministrado, una cantidad eficaz de un CIQ y un antígeno es una cantidad suficiente para conseguir tal modulación, en comparación con la respuesta inmunitaria obtenida cuando el antígeno se administra solo. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones.
El término "coadministración", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la administración de al menos dos sustancias diferentes, suficientemente próximas en el tiempo para modular una respuesta inmunitaria. Preferiblemente, la coadministración se refiere a la administración simultánea de al menos dos sustancias diferentes.
La "estimulación" de una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta Th1, significa un incremento de la respuesta, que puede surgir de la provocación y/o el aumento de una respuesta. De forma similar, la "estimulación" de una citocina o de un tipo celular (tal como CTLs) significa un incremento de la cantidad o del nivel de citocina o del tipo celular.
Un "trastorno asociado a IgE" es una afección fisiológica que se caracteriza, en parte, por unos niveles elevados de IgE, que pueden ser o no persistentes. Los trastornos asociados a IgE incluyen, pero sin limitación, la alergia y las reacciones alérgicas, los trastornos relacionados con la alergia (descritos más adelante), asma, rinitis, conjuntivitis, urticaria, choque anafiláctico, alergias a picaduras de himenópteros, alergias a fármacos e infecciones por parásitos. La expresión también incluye las manifestaciones relacionadas de estos trastornos. En general, la IgE en tales trastornos es específica del antígeno.
Un "trastorno relacionado con la alergia" significa un trastorno que es el resultado de los efectos de una respuesta inmunitaria de IgE específica del antígeno. Tales efectos pueden incluir, pero sin limitación, hipotensión y choque anafiláctico. La anafilaxia es un ejemplo de un trastorno relacionado con la alergia durante el cual la histamina liberada en la circulación provoca una vasodilatación y una permeabilidad incrementada de los capilares, lo que da como resultado una pérdida notable de plasma de la circulación. La anafilaxia puede tener lugar de forma sistémica, con efectos asociados que se experimentan en todo el cuerpo, y puede tener lugar de forma local, con una reacción limitada a un tejido u órgano objetivo específico.
La expresión "enfermedad viral", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una enfermedad que tiene un virus como agente etiológico. Los ejemplos de enfermedades virales incluyen la hepatitis B, la hepatitis C, la gripe, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el herpes zóster.
Tal como se usa en la presente memoria, y como se entiende en la técnica, el "tratamiento" es una aproximación para obtener resultados beneficiosos o deseados, lo que incluye los resultados clínicos. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, el alivio o la mejora de uno o más síntomas, la disminución del grado de la enfermedad, un estado patológico estabilizado (es decir, sin empeoramiento), la prevención de la propagación de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o el alivio del estado patológico, y la remisión (parcial o total), ya sea detectable o indetectable. El "tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia, en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
"Paliar" una enfermedad o trastorno significa que se disminuye el grado y/o las manifestaciones clínicas indeseables de un trastorno o de un estado patológico, y/o se ralentiza o se alarga el curso temporal de la progresión, en comparación con la ausencia de tratamiento para el trastorno. Especialmente en el contexto de la alergia, tal como entienden los expertos en la técnica, la paliación puede tener lugar tras la modulación de la respuesta inmunitaria hacia un(os) alérgeno(s). Además, la paliación no ocurre necesariamente por la administración de una dosis, sino que con frecuencia ocurre tras la administración de una serie de dosis. Así, una cantidad suficiente para paliar una respuesta o un trastorno se puede administrar en una o más administraciones.
Un "título de anticuerpo", o una "cantidad de anticuerpo", que es "provocada" por un CIQ y un antígeno se refiere a la cantidad de un anticuerpo dado, medida en un momento tras la administración del CIQ y del antígeno.
Un "anticuerpo asociado a Th1" es un anticuerpo cuya producción y/o incremento está asociado con una respuesta inmunitaria de tipo Th1. Por ejemplo, IgG2a es un anticuerpo asociado a Th1 en el ratón. Para los fines de esta invención, la medida de un anticuerpo asociado a Th1 puede ser la medida de uno o más de tales anticuerpos. Por ejemplo, en seres humanos, la medida de un anticuerpo asociado a Th1 podría implicar la medida de IgG1 y/o IgG3.
Un "anticuerpo asociado a Th2" es un anticuerpo cuya producción y/o incremento está asociado a una respuesta inmunitaria de tipo Th2. Por ejemplo, IgG1 es un anticuerpo asociado a Th2 en el ratón. Para los fines de esta invención, la medida de un anticuerpo asociado a Th2 puede ser la medida de uno o más de tales anticuerpos. Por ejemplo, en el ser humano, la medida de un anticuerpo asociado a Th2 podría implicar la medida de IgG2 y/o IgG4.
"Atenuar" o "inhibir" una función o actividad, tal como la producción de citocinas, la producción de anticuerpos o la liberación de histamina, es reducir la función o la actividad en comparación, por otro lado, con las mismas
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condiciones, a excepción de una condición o parámetro de interés, o, alternativamente, en comparación con otra condición. Por ejemplo, una composición que comprende un CIQ y un antígeno que inhibe la liberación de histamina reduce la liberación de histamina en comparación, por ejemplo, con la liberación de histamina inducida por el antígeno solo. Como otro ejemplo, una composición que comprende un CIQ y un antígeno que inhibe la producción de anticuerpos reduce el grado y/o los niveles de anticuerpo en comparación, por ejemplo, con el grado y/o los niveles de anticuerpo producidos por el antígeno solo.
Tal como se usa en la presente memoria, fabricado o formulado "bajo la normativa PCF", cuando hace referencia a una composición farmacéutica, significa que la composición se formula en forma estéril, sustancialmente isotónica y en completa conformidad con toda la normativa de Prácticas Correctas de Fabricación (PCF) de la Agencia de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "inmunógeno" tiene el significado normal en la técnica, y se refiere a un agente (p.ej., polipéptido) que provoca una respuesta inmunitaria adaptativa tras la inyección en una persona o animal. La respuesta inmunitaria puede ser de células B (humoral) y/o de células T (celular).
Todos los intervalos pretenden incluir los valores terminales. Así, un polímero "de 2 a 7 nucleótidos" o "entre 2 y 7 nucleótidos" incluye los polímeros de 2 nucleótidos y los polímeros de 7 nucleótidos. Cuando se describe un límite inferior y un límite superior seleccionado independientemente, se entiende que el límite superior es mayor que el límite inferior.
III. Compuestos Inmunomoduladores Quiméricos
La invención proporciona compuestos inmunomoduladores quiméricos ("CIQs") útiles, entre otros, para modular una respuesta inmunitaria en individuos tales como mamíferos, lo que incluye los seres humanos. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que ciertas moléculas quiméricas que contienen restos de ácido nucleico unidos de manera covalente a restos espaciadores distintos de ácido nucleico tienen actividad inmunomoduladora, en particular en las células humanas. Sorprendentemente, esta actividad se manifiesta incluso en casos en los que los restos de ácido nucleico tienen una secuencia que, si se presenta como un polinucleótido aislado, no exhibe una actividad inmunomoduladora significativa.
Así, la invención proporciona nuevos reactivos y métodos para modular una respuesta inmunitaria, que incluye el tratamiento y la profilaxis de una enfermedad en seres humanos y otros animales.
Las siguientes secciones describen la estructura y las propiedades de los CIQs de la invención, así como la estructura y las propiedades de los restos de ácido nucleico componentes y de los restos espaciadores distintos de ácido nucleico.
1. Estructura Central de CIQ
Los CIQs de la presente invención contienen tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico. Se contemplan CIQs que tienen una diversidad de estructuras. Como ilustración, los CIQs ejemplares tienen las estructuras centrales descritas en las fórmulas IV-VI, más adelante. Las fórmulas IV-VI muestran las secuencias centrales de "CIQs ramificados".
En cada fórmula proporcionada más adelante, "N" designa un resto de ácido nucleico (orientado en una orientación 5'→3' o 3'→5') y "S" designa un resto espaciador distinto de ácido nucleico. Un guión ("-") designa un enlace covalente entre un resto de ácido nucleico y un resto espaciador distinto de ácido nucleico. Un guión doble ("--") designa enlaces covalentes entre un resto espaciador distinto de ácido nucleico y al menos 2 restos de ácido nucleico. Un guión triple ("---") designa enlaces covalentes entre un resto espaciador distinto de ácido nucleico y múltiples (es decir, al menos 3) restos de ácido nucleico. Los subíndices se usan para designar restos de ácido nucleico o restos espaciadores distintos de ácido nucleico colocados de manera diferente. Sin embargo, el uso de subíndices para distinguir diferentes restos de ácido nucleico no pretende indicar que los restos tengan necesariamente una estructura o secuencia diferentes. De forma similar, el uso de subíndices para distinguir diferentes restos espaciadores no pretende indicar que los restos tengan necesariamente estructuras diferentes.
B. CIQs Ramificados
En una realización, el CIQ comprende la estructura central
[Nv]A---Sp (IV)
en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a la cantidad "A" de restos de ácido nucleico seleccionados independientemente Nv, y en la que A es al menos 3, p.ej., exactamente 3, 4, 5, 6, o 7 o mayor de 7. En diversas realizaciones, A es un número entero entre 3 y 100 (ambos incluidos). En ciertas realizaciones, A es un número entero en un intervalo definido por un límite inferior de alrededor de 3, 5, 10, 50, o 100 y un límite superior seleccionado independientemente de alrededor de 5, 7, 10, 50, 100, 150, 200, 250, o 500. También se contempla que, en ciertas realizaciones, A es mayor de alrededor de 500.
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En una realización relacionada, el CIQ comprende la estructura central
[Sv-Nv]A---Sp (V)
en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a la cantidad "A" de elementos seleccionados independientemente, Sv-Nv, que comprende un resto espaciador unido de manera covalente a un resto de ácido nucleico, y en la que A es al menos 3. En diversas realizaciones, A es un número entero entre 3 y 100 (ambos incluidos). En ciertas realizaciones, A es un número entero en un intervalo definido por un límite inferior de 5, 10, 50,
o 100 y un límite superior seleccionado independientemente de 10, 50, 100, 250, o 500. También se contempla que, en ciertas realizaciones, A es mayor de 500. En una realización relacionada, el CIQ comprende la estructura central:
(S1-N1)-Sp--(Nv)A (VI)
en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a la cantidad "A" de restos de ácido nucleico seleccionados independientemente, Nv, y al menos un resto de ácido nucleico N1 unido a un resto espaciador S1, en la que A es al menos 2. En una realización, A es 2. En diversas realizaciones, A es 3, es 4, es 5, o es un número entero entre 3 y 100 (ambos incluidos). En ciertas realizaciones, A es un número entero en un intervalo definido por un límite inferior de 5, 10, 50, o 100 y un límite superior seleccionado independientemente de 10, 50, 100, 150, 200, 250, o 500. También se contempla que, en ciertas realizaciones, A es mayor de 500. Según la invención, los CIQs ramificados comprenden, pero sin limitación, las estructuras proporcionadas en las fórmulas IV, V y VI. Es decir, las fórmulas IV, V y VI definen estructuras centrales en las que un resto espaciador multivalente (Sp) está unido de manera covalente a al menos tres (3) restos de ácido nucleico. Se contempla que, en ciertas realizaciones, hay restos químicos adicionales (p.ej., fosfato, mononucleótido, restos de ácido nucleico adicionales y/o restos espaciadores) unidos de manera covalente en los extremos de las estructuras centrales. Por ejemplo, si todos los restos de ácido nucleico en un CIQ son 5'TCGTCGA 3' y todos los restos espaciadores son glicerol o HEG, los CIQs que tienen una estructura central de fórmula IV incluyen:
(TCGTCGA)2-glicerol-TCGTCGA (IVa)
(TCGTCGA-HEG)2-glicerol-TCGTCGA (IVb)
(TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-glicerol-TCGTCGA (IVc)
[(TCGTCGA)2-glicerol-TCGTCGA]2-glicerol-TCGTCGA (IVd)
Será inmediatamente evidente, por ejemplo, que el género de los CIQs que comprenden una estructura central de fórmula IV abarca los CIQs que comprenden una estructura central de fórmula V o VI. En una realización preferida de la invención, el CIQ comprende al menos dos restos de ácido nucleico diferentes (es decir, secuencias diferentes).
En ciertas realizaciones, uno o más espaciadores comprenden unidades más pequeñas (p.ej., HEG, TEG, glicerol, alquilo C3, y similares) unidas entre sí. En una realización, la unión es una unión éster (p.ej., fosfodiéster o éster de fosforotioato).
2. Actividad Inmunomoduladora de los CIQs
Los CIQs de la invención tienen actividad inmunomoduladora. Los términos "inmunomodulador", "actividad inmunomoduladora", o "que modula una respuesta inmunitaria", tal como se usan en la presente memoria, incluyen los efectos inmunoestimuladores e inmunosupresores. Una respuesta inmunitaria que está inmunomodulada de acuerdo con la presente invención es en general una que se desplaza hacia una respuesta inmunitaria de "tipo Th1", en contraposición a una respuesta inmunitaria de "tipo Th2". Las respuestas de tipo Th1 se consideran en general respuestas del sistema inmunitario celular (p.ej., linfocitos citotóxicos), mientras que las respuestas de tipo Th2 son generalmente "humorales", o basadas en anticuerpos. Las respuestas inmunitarias de tipo Th1 se caracterizan normalmente por reacciones de "hipersensibilidad de tipo retardado" hacia un antígeno. Las respuestas de tipo Th1 se pueden detectar a nivel bioquímico por niveles incrementados de citocinas asociadas a Th1, tales como IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12 y TNF-β, así como IL-6, aunque la IL-6 también puede estar asociada a respuestas de tipo Th2. Las respuestas inmunitarias de tipo Th2 están asociadas en general a niveles más altos de producción de anticuerpos, lo que incluye la producción de IgE, en ausencia de CTL o con una producción mínima de CTL, así como la expresión de citocinas asociadas a Th2, tales como IL-4 e IL-5.
La inmunomodulación de acuerdo con la invención se puede reconocer mediante medidas (ensayos) in vitro, in vivo y/o ex vivo. Los ejemplos de respuestas inmunitarias medibles indicativas de actividad inmunomoduladora incluyen, pero sin limitación, la producción de anticuerpos específicos del antígeno, la secreción de citocinas, la activación o expansión de poblaciones de linfocitos tales como células NK, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos B, y similares. Véanse, p.ej., los documentos WO 97/28259; WO 98/16247; WO 99/11275; Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-4076; Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-1845; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158:3635-3639; Sato et al. (1996) Science 273:352-354; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423; Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816; Cowdery et al. (1996) J. Immunol.
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156:4570-4575; Roman et al. (1997) Nat Med. 3:849-54; Lipford et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:2340-2344; los documentos WO 98/55495, WO 00/61151, Pichyangkul et al. (2001) J. Imm. Methods 247:83-94. Véanse también los Ejemplos, más adelante. Ciertos ensayos útiles se describen más adelante en la presente memoria con fines ilustrativos, y no como limitación.
Los ensayos se llevan a cabo en general administrando o poniendo en contacto una célula, tejido, animal o similar con una muestra de ensayo (p.ej., que contiene un CIQ, polinucleótido, y/u otro agente) y midiendo una respuesta. Las muestras de ensayo que contienen CIQs o polinucleótidos pueden estar en una diversidad de formas o concentraciones, que los expertos habituales entenderán que son adecuadas para el tipo de ensayo. Por ejemplo, para un ensayo basado en células, los CIQs o polinucleótidos se usan a menudo a una concentración de 20 µg/ml o 10 µg/ml o 2 µg/ml. En general, para el ensayo, la concentración se determina midiendo la absorbancia a 260 nm y mediante el uso de la conversión 0,5 DO260/ml = 20 µg/ml. Esto normaliza la cantidad de ácido nucleico total en la muestra de ensayo, y se puede usar, por ejemplo, cuando el resto espaciador no tiene una absorbancia significativa a 260 nm. De manera alternativa, se puede medir la concentración o el peso mediante otros métodos conocidos en la técnica. Si se desea, se puede determinar la cantidad de resto de ácido nucleico midiendo la absorbancia a 260 nm, y el peso del CIQ se calcula mediante el uso de la fórmula molecular del CIQ. Este método se usa a veces cuando la proporción de peso aportada por el/los resto(s) espaciador(es) respecto del peso aportado por los restos de ácido nucleico en un CIQ es elevada (es decir, mayor de 1).
Se entenderá de forma similar que los controles positivos y negativos son útiles en los ensayos de actividad inmunomoduladora. Un control positivo adecuado para la actividad inmunomoduladora es el ADN de fosforotioato inmunomodulador que tiene la secuencia 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:2), aunque otros controles positivos adecuados con actividad inmunomoduladora serán evidentes para el experto. Un control negativo adecuado es la ausencia de agente de ensayo (es decir, excipiente o medio solo, también denominado "células solas" para ciertos ensayos in vitro). De manera alternativa, se usa un ADN de fosforotioato que tiene la secuencia 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:3) como control negativo en ciertas realizaciones. El experto puede diseñar otros controles negativos utilizando como guía la descripción de la presente memoria y el diseño habitual de ensayos.
Una clase útil de ensayos son los "ensayos de respuesta a citocinas". Un ensayo ejemplar de actividad inmunomoduladora mide la respuesta de citocinas de células mononucleares de sangre periférica humana ("PBMCs") (p.ej., como se describe en Bohle et al. [1999], Eur. J. Immunol. 29:2344-53; Verthelyi et al. [2001] J. Immunol. 166:2372-77). En una realización de este ensayo, se recoge sangre periférica de uno o más voluntarios humanos sanos y se aíslan las PBMCs. En general se recoge sangre mediante punción venosa con el uso de una jeringa heparinizada, se deposita sobre una capa de FICOLL® (Amersham Pharmacia Biotech) y se centrifuga. Las PBMCs se recogen después de la interfase de FICOLL® y se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría. Las células se resuspenden y se cultivan (p.ej., en placas de 48 o 96 pocillos) a 2 x 106 células/mL en RPMI 1640 con suero AB humano inactivado térmicamente del 10%, 50 unidades/mL de penicilina, 50 µg/mL de estreptomicina, 300 µg/mL de glutamina, piruvato sódico 1 mM, y aminoácidos no esenciales (NEAA) 1 x MEM en presencia y ausencia de muestras de ensayo o controles durante 24 horas.
El medio exento de células se recoge de cada pocillo y se analiza la concentración de IFN-γ y/o IFN-α. La actividad inmunomoduladora se detecta cuando la cantidad de IFN-γ secretada por las PBMCs puestas en contacto con el compuesto de ensayo es significativamente mayor (p.ej., al menos alrededor de 3 veces mayor, normalmente al menos alrededor de 5 veces mayor) que la cantidad secretada por las PBMCs en ausencia del compuesto de ensayo o, en ciertas realizaciones, en presencia de un compuesto de control inactivo (p.ej., 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:3)). A la inversa, un compuesto de ensayo no tiene actividad inmunomoduladora si la cantidad de IFN-γ secretada por las PBMCs puestas en contacto con el compuesto de ensayo no es significativamente mayor (p.ej., menos de 2 veces mayor) que en ausencia del compuesto de ensayo o, de manera alternativa, en presencia de un compuesto de control inactivo (p.ej., 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:3)).
Cuando se ensaya la concentración de IFN-α, la cantidad de IFN-α secretada por las PBMCs puestas en contacto con el compuesto de ensayo es significativamente mayor (p.ej., en el caso de IFN-α a veces al menos alrededor de 2 veces o al menos alrededor de 3 veces mayor) que la cantidad secretada por las PBMCs en ausencia del compuesto de ensayo o, en ciertas realizaciones, en presencia de un compuesto de control inactivo (p.ej., 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:3)). En ciertas realizaciones, el nivel de secreción de IFN-α significativamente incrementado es al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 10 veces, o incluso al menos alrededor de 20 veces mayor que los controles. A la inversa, un compuesto de ensayo no tiene actividad inmunomoduladora si la cantidad de IFN-α secretada por las PBMCs puestas en contacto con el compuesto de ensayo no es significativamente mayor (p.ej., menos de 2 veces mayor) que en ausencia del compuesto de ensayo o, de manera alternativa, en presencia de un compuesto de control inactivo (p.ej., 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:3)).
Tal como se ilustra en los ejemplos, más adelante, la administración de ciertos CIQs da como resultado la secreción significativa tanto de IFN-γ como de IFN-α, mientras la administración de otros CIQs tiene un efecto menor sobre la secreción de IFN-α o, a la inversa, un efecto menor sobre la secreción de IFN-γ. Véase, p.ej., el Ejemplo 49.
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Otra clase útil de ensayos son los ensayos de proliferación celular, p.ej., ensayos de proliferación de células B. El efecto de un agente (p.ej. un CIQ) sobre la proliferación de células B se puede determinar mediante el uso de cualquiera de una diversidad de ensayos conocidos en la técnica. Se proporciona un ensayo ejemplar de proliferación de células B en el Ejemplo 41.
Para tener en cuenta la variación de donantes, p.ej., en los ensayos basados en células, tales como los ensayos de citocinas y de proliferación, preferiblemente los ensayos se llevan a cabo mediante el uso de células (p.ej., PBMCs) procedentes de múltiples donantes diferentes. El número de donantes es normalmente al menos 2 (p.ej. 2), preferiblemente al menos 4 (p.ej. 4), a veces al menos 10 (p.ej. 10). La actividad inmunomoduladora se detecta cuando la cantidad de IFN-γ secretada en presencia del compuesto de ensayo (p.ej. en al menos la mitad de los donantes sanos ensayados, preferiblemente en al menos un 75%, lo más preferiblemente en al menos un 85%) es al menos alrededor de 3 veces mayor o al menos alrededor de 5 veces mayor que la secretada en ausencia del compuesto de ensayo, o, en ciertas realizaciones, que en presencia de un compuesto de control inactivo tal como se describió anteriormente.
Los ensayos in vitro se pueden llevar a cabo también mediante el uso de células de ratón, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 42, más adelante, y en otras células de mamífero.
Los ensayos ejemplares in vivo se describen en los Ejemplos 43, 44, y 46 (ratones) y en el Ejemplo 45 (primates no humanos).
Excepto cuando se indique o sea evidente de otra manera, los ensayos de citocinas descritos en los Ejemplos, más adelante, se llevan a cabo mediante el uso de PBMCs humanas usando esencialmente el protocolo descrito en el Ejemplo 28. Se puede ensayar simultáneamente un gran número de compuestos de ensayo, p.ej., mediante el uso de placas multi-pocillo u otros materiales de ensayo multi-cámara. Si se desea, los ensayos se pueden llevar a cabo mediante mecanismos robóticos controlados por ordenador muy conocidos en la técnica.
3. Restos de Ácido Nucleico
Los CIQs de la invención comprenden tres o más restos de ácido nucleico. La expresión "resto de ácido nucleico", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un monómero de nucleótido (es decir, un mononucleótido) o polímero (es decir, que comprende al menos 2 nucleótidos contiguos). Tal como se usa en la presente memoria, un nucleótido comprende (1) una base de purina o pirimidina unida a un carbohidrato que tiene una unión éster a un grupo fosfato, o (2) un análogo en el que la base y/o el carbohidrato y/o el éster de fosfato están sustituidos por análogos, p.ej., como se describe más adelante. En un CIQ de la invención los restos de ácido nucleico pueden ser iguales o diferentes.
Las siguientes tres secciones describen las características de los restos de ácido nucleico tales como la longitud, la presencia, y la posición de secuencias o motivos de secuencia en el resto, así como la descripción (sin pretender limitar la invención) de las propiedades y la estructura de los restos de ácido nucleico y CIQs que contienen los restos.
A. Longitud
Normalmente, un resto de ácido nucleico tiene una longitud de 1 a 100 nucleótidos; aunque son posibles los restos más largos en ciertas realizaciones. En ciertas realizaciones, la longitud de uno o más de los restos de ácido nucleico en un CIQ es menor de 8 nucleótidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 nucleótidos). En diversas realizaciones, un resto de ácido nucleico (tal como un resto de ácido nucleico de una longitud menor de 8 nucleótidos) tiene una longitud de al menos 2 nucleótidos, a menudo una longitud de al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, o al menos 7 nucleótidos. En otras realizaciones, el resto de ácido nucleico tiene una longitud de al menos 10, al menos 20, o al menos 30 nucleótidos.
Como se muestra en los Ejemplos más adelante, los CIQs que contienen solamente restos de ácido nucleico heptaméricos, hexaméricos, pentaméricos, tetraméricos, y triméricos fueron activos en los ensayos de actividad inmunoestimuladora (p.ej., Ejemplos 36 y 37). Así, se contempla que, en ciertas realizaciones, un CIQ comprenderá al menos un resto de ácido nucleico más corto de 8 nucleótidos. En ciertas realizaciones, todos los restos de ácido nucleico de un CIQ serán más cortos de 8 nucleótidos (p.ej., tienen una longitud en un intervalo definido por un límite inferior de 2, 3, 4, 5, o 6 y un límite superior seleccionado independientemente de 5, 6, o 7 nucleótidos, en el que el límite superior es mayor que el límite inferior). Por ejemplo, en una realización, los restos de ácido nucleico especificados en un CIQ (que incluyen todos los restos de ácido nucleico del CIQ) pueden tener una longitud de 6 ó 7 nucleótidos. En una realización, el CIQ comprende dos restos espaciadores y un resto de ácido nucleico intermedio que tiene una longitud menor de 8 bases (p.ej., una longitud de 5, 6, o 7 bases).
Se contempla que en un CIQ que comprende múltiples restos de ácido nucleico, los restos de ácido nucleico pueden tener longitudes iguales o diferentes. En una realización, la longitud de uno o más, o la mayoría (p.ej., al menos alrededor de 2, al menos alrededor de 4, o al menos alrededor del 25%, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 75%) o todos los restos de ácido nucleico de un CIQ es menor de 8 nucleótidos, en ciertas realizaciones menor de 7 nucleótidos, en ciertas realizaciones menor de 6 nucleótidos, en ciertas realizaciones entre
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2 y 6 nucleótidos, en ciertas realizaciones entre 2 y 7 nucleótidos, en ciertas realizaciones entre 3 y 7 nucleótidos, en ciertas realizaciones entre 4 y 7 nucleótidos, en ciertas realizaciones entre 5 y 7 nucleótidos, y en ciertas realizaciones entre 6 y 7 nucleótidos.
Como se discute con más detalle más adelante, al menos un resto de ácido nucleico de un CIQ incluye la secuencia TCG. En una realización, al menos un resto de ácido nucleico comprende un motivo de ácido nucleico que contiene CG y tiene una longitud menor de 8 nucleótidos (p.ej., tiene una longitud especificada como se describió anteriormente menor de 8 nucleótidos). En una realización relacionada, ninguno de los restos de ácido nucleico de un CIQ que sean más largos de 8 nucleótidos comprende la secuencia "CG" u opcionalmente la secuencia "TCG" o "ACG" (es decir, todos los restos de ácido nucleico del CIQ que comprenden la secuencia CG tienen una longitud menor de 8 nucleótidos). En una realización, al menos un resto de ácido nucleico del CIQ no comprende una secuencia CG.
B. Secuencias y Motivos
Como se indicó anteriormente, un resto de ácido nucleico particular puede tener una diversidad de longitudes. En una realización, el resto de ácido nucleico tiene una longitud menor de 8 nucleótidos. En una realización, el resto de ácido nucleico tiene una longitud de 8 nucleótidos o mayor. En diversas realizaciones, al menos un resto de ácido nucleico de un CIQ de la invención comprende una secuencia como se describe más adelante.
En las fórmulas proporcionadas más adelante, todas las secuencias están en la dirección 5'→3', y se usan las abreviaturas siguientes: B = 5-bromocitosina; bU = 5-bromouracilo; a-A = 2-amino-adenina; g = 6-tio-guanina; t = 4tio-timina. H = una citosina modificada que comprende un grupo atractor de electrones, tal como halógeno en la posición 5. En diversas realizaciones, una citosina (C) en una secuencia mencionada más adelante se sustituye con N4-etilcitosina o N4-metilcitosina o 5-hidroxicitosina. En diversas realizaciones, una guanosina (G) de la fórmula se sustituye con 7-desazaguanosina.
En los CIQs ensayados hasta ahora, la presencia de CG se correlaciona con la actividad inductora de citocinas. Así, en una realización, al menos un resto de ácido nucleico de un CIQ comprende al menos una secuencia 5'-citosina, guanina-3' (5'-CG-3'). La citosina no está metilada en la posición C-5 y, preferiblemente, no está metilada en ninguna posición. El CIQ comprende al menos un resto de ácido nucleico que comprende la secuencia 5'-TCG-3'.
En una realización, uno o más restos de ácido nucleico comprenden 3 a 7 bases. En una realización, el resto de ácido nucleico comprende 3 a 7 bases y tiene la secuencia 5'-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3', o 5'-TCG[(X)2-4]-3', o 5'TCG(A/T)[(X)1-3]-3', o 5'-TCG(A/T)CG(A/T)-3', o 5'-TCGACGT-3' o 5'-TCGTCGA-3', en las que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente. En ciertas realizaciones, el CIQ contiene al menos 3, al menos 10, al menos 30 o al menos 100 restos de ácido nucleico que tienen una secuencia mencionada anteriormente.
En una realización, el resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-timidina, citosina, guanina-3' (5'-TCG-3'), por ejemplo (sin limitación), el 3-mero TCG, el 4-mero TCGX (p.ej., TCGA), los 5-meros TCGXX (p.ej., TCGTC y TCGAT), los 6-meros TCGXXX, XTCGXX y TCGTCG, y los 7-meros TCGXXXX, XTCGXXX, XXTCGXX y TCGTCGX, en los que X es cualquier base. A menudo, al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-timidina, citosina, guanina, adenosina-3' (5'-TCGA-3'), p.ej., comprende una secuencia 5'-TCGACGT-3'.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-ACGTTCG-3'; 5'-TCGTCG-3'; 5'-AACGTTC-3'; 5'-AACGTT-3'; 5'-TCGTT-3'; 5'-CGTTCG-3'; 5'-TCGTCGA-3'; 5'-TCGXXX-3'; 5'-XTCGXX-3'; 5'-XXTCGX-3; 5'-TCGAGA-3'; 5'-TCGTTT-3'; 5'-TTCGAG-3'; 5'-TTCGT-3'; 5'-TTCGC-3'; 5'-GTCGT-3'; 5'-ATCGT-3'; 5'-ATCGAT-3'; 5'-GTCGTT-3'; 5'-GTCGAC-3'; 5'-ACCGGT-3'; 5'-AABGTT-3'; 5'-AABGUT-3', 5'-TCGTBG-3' en las que X es cualquier nucleótido.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-X1X2CGX3X4-3', en la que X1 es cero a diez nucleótidos; X2 no está presente o es A, T, o U; X3 no está presente o es A y X4 es cero a diez nucleótidos. En una realización, el resto de ácido nucleico está conjugado a un resto espaciador en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, X1 es cero a cinco nucleótidos, de manera alternativa cero a dos nucleótidos, y X4 es cero a cinco nucleótidos, de manera alternativa cero a dos nucleótidos.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende una secuencia que es 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina-3'; 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, G-3'; o 5'-purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, C, C-3'; por ejemplo (todos 5'→3'), GACGCT; GACGTC; GACGTT; GACGCC; GACGCU; GACGUC; GACGUU; GACGUT; GACGTU; AGCGTT; AGCGCT; AGCGTC; AGCGCC; AGCGUU; AGCGCU; AGCGUC; AGCGUT; AGCGTU; AACGTC; AACGCC; AACGTT; AACGCT; AACGUC; AACGUU; AACGCU; AACGUT; AACGTU; GGCGTT; GGCGCT; GGCGTC; GGCGCC; GGCGUU; GGCGCU; GGCGUC; GGCGUT; GGCGTU, AACGTT, AGCGTC, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT, GGCGTT, y AACGCC. En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: 5'-purina, purina, citosina, guanina, pirimidina, pirimidina, citosina, citosina-3' o 5'purina, purina, citosina, guanina, pirimidina, pirimidina, citosina, guanina-3'.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende una secuencia (todos 5'→3') AACGTTCG;
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AACGTTCC; AACGUTCG; AABGTTCG; AABGUTCG y/o AABGTTBG. En diversas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende el motivo 5'-X1 X2 A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:4) en el que X1 es T, G, C o B, en el que X2 es T, G, A o U, en el que X3 es T, A o C, en el que X4 es T, G o U y en el que la secuencia no es 5'-TGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:5) o 5'-GGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:6). Los ejemplos incluyen (todos 5'→3'): TGAACGUTCG (SEQ ID Nº:7); TGACCGTTCG (SEQ ID Nº:8); TGATCGGTCG (SEQ ID Nº:9); TGATCGTTCG (SEQ ID Nº:10); TGAACGGTCG (SEQ ID Nº:11); GTAACGTTCG (SEQ ID Nº:12); GTATCGGTCG (SEQ ID Nº:13); GTACCGTTCG (SEQ ID Nº:14); GAACCGTTCG (SEQ ID Nº:15); BGACCGTTCG (SEQ ID Nº:16); CGAACGTTCG (SEQ ID Nº:17); CGACCGTTCG (SEQ ID Nº:18); BGAACGTTCG (SEQ ID Nº:19); TTAACGUTCG (SEQ ID Nº:20); TUAACGUTCG (SEQ ID Nº:21) y TTAACGTTCG (SEQ ID Nº:22). En diversas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende una secuencia: 5'-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:23); 5'-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:24); 5'-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3' (SEQ ID Nº:25); 5 '-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3' (SEQ ID Nº:26); 5'-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3' (SEQ ID Nº:27); 5'-TCGTCGAa-ACGUTCGTTAACGUTCG-3' (SEQ ID Nº:28); 5'-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3 (SEQ ID Nº:29); 5'-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:30); 5'-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:31); 5'-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:32); 5'-TCGTCGAACGTTCGTT-3' (SEQ ID Nº:33); 5'-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:34); 5'-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:35); 5'-CTTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:36); 5'-CTGTGATCGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:37); 5'-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:38); 5'-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:39); 5'-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:40); 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:41); 5'-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:42); 5'-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:43); 5'-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:44); 5'-TBGTBGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:45); 5'-TCGTBGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:46); 5'-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:47); 5'-TBGTBGACCGTTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:48); 5'-TCGTBGACCGTTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:49); 5'-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:50); 5'-CTTBGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:51); 5'-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:52).
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En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: 5'-X1 X2 A X3 B G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:53), en la que X1 es T, G, C o B, en la que X2 es T, G, A o U, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U. En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico no es 5'-TGAABGTTCG-3' (SEQ ID Nº:54). Los ejemplos incluyen (todos 5'→3'): TGAABGUTCG (SEQ ID Nº:55); TGACBGTTCG (SEQ ID Nº:56); TGATBGGTCG (SEQ ID Nº:57); GTATBGGTCG (SEQ ID Nº:58); GTACBGTTCG (SEQ ID Nº:59); GAACBGTTCG (SEQ ID Nº:60); GAAABGUTCG (SEQ ID Nº:61); BGACBGTTCG (SEQ ID Nº:62); CGAABGTTCG (SEQ ID Nº:63); BGAABGTTCG (SEQ ID Nº:64); BGAABGUTCG (SEQ ID Nº:65); TTAABGUTCG (SEQ ID Nº:66); TUAABGUTCG (SEQ ID Nº:67) y TTAABGTTCG (SEQ ID Nº:68). En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: 5'-TGACTGTGAABGUTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:69); 5'-TCGTCGAABGTTCGTTAABGTTCG-3' (SEQ ID Nº:70); 5'-TGACTGTGAABGUTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:71); 5'-TGACTGTGAABGUTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:72); 5'-TCGTCGGAAABGUTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:73); 5'-TCGTBGAABGUTCGGAATGA-3' (SEQ ID Nº:74). En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: 5'-X1 X2 A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:75) en la que X1 es T, C o B, en la que X2 es T, G, A o U, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U. En ciertas realizaciones, la fórmula no es 5'-TGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:5) En otras realizaciones, el resto de ácido nucleico comprende la secuencia: 5'-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:76); 5'-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:77); 5'-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3' (SEQ ID Nº:78); 5'-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:79); 5'-TGACTGTGAACGbUTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:80); 5'-TGACTGTGAABGTTCGTUATGA-3' (SEQ ID Nº:81); 5'-TGACTGTGAABGTTCGGTATGA-3' (SEQ ID Nº:82); 5'-CTGTGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:83); 5'-TBGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:84); 5'-TCGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:85); 5'-TGACTGTGAACGtTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:86); 5'-TGACTGTGAACgTTCgAGATGA-3' (SEQ ID Nº:87); 5'-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3' (SEQ ID Nº:88); 5'-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3' (SEQ ID Nº:89); 5'-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:90); 5'-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:91); 5'-CTGTCAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:92); 5'-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:93); 5'-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:94); 5'-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:95); 5'-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:96).
En ciertas realizaciones, con respecto a cualquiera de las secuencias descritas anteriormente, el resto de ácido 10
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nucleico comprende además una, dos, tres o más secuencias TCG y/o TBG y/o THG, preferiblemente en 5' respecto de la secuencia proporcionada anteriormente. Las TCG(s) y/o TBG(s) pueden estar o no directamente adyacentes respecto de la secuencia mostrada. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico incluye cualquiera de lo siguiente: 5'-TCGTGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:97); 5'-TCGTCGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:98); 5'-TBGTGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:99); 5-TBGTBGAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:100); 5'-TCGTTAACGTTCG-3' (SEQ ID Nº:101). En ciertas realizaciones, la(s) secuencia(s) adicional(es) TCG y/o TBG está(n) inmediatamente en 5' y adyacente(s) respecto de la secuencia de referencia. En otras realizaciones, existe una separación de una o dos bases.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico tiene la secuencia: 5'-(TCG)w Ny A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:102) en la que w es 1-2, en la que y es 0-2, en la que N es cualquier base, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U.
En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: TCGAACGTTCG (SEQ ID Nº:103); TCGTCGAACGTTCG (SEQ ID Nº:104); TCGTGAACGTTCG (SEQ ID Nº:105); TCGGTATCGGTCG (SEQ ID Nº:106); TCGGTACCGTTCG (SEQ ID Nº:107); TCGGAACCGTTCG (SEQ ID Nº:108); TCGGAACGTTCG (SEQ ID Nº:109); TCGTCGGAACGTTCG (SEQ ID Nº:110); TCGTAACGTTCG (SEQ ID Nº:111); TCGACCGTTCG (SEQ ID Nº:112); TCGTCGACCGTTCG (SEQ ID Nº:113); TCGTTAACGTTCG (SEQ ID Nº:114).
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 5'-(TBG)z Ny A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:115) en la que z es 1-2, en la que y es 0-2, en la que B es 5-bromocitosina, en la que N es cualquier base, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende: TBGTGAACGTTCG (SEQ ID Nº: 116); TBGTBGTGAACGTTCG (SEQ ID Nº:117); TBGAACGTTCG (SEQ ID Nº:118); TBGTBGAACGTTCG (SEQ ID Nº:100); TBGACCGTTCG (SEQ ID Nº:119); TBGTBGACCGTTCG (SEQ ID Nº:120).
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 5'-T C G T B G Ny A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:121) en la que y es 0-2, en la que B es 5-bromocitosina, en la que N es cualquier base, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U. En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: TCGTBGTGAACGTTCG (SEQ ID Nº:122); TCGTBGAACGTTCG (SEQ ID Nº:123); TCGTBGACCGTTCG (SEQ ID Nº:124).
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 5'-(TCG)w Ny A X3 B G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:125) en la que w es 1-2, en la que y es 0-2, en la que N es cualquier base, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U. En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: TCGGAAABGTTCG (SEQ ID Nº:126) o TCGAABGTTCG (SEQ ID Nº:127).
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 5'-(TBG)z Ny A X3 B G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:128) en la que z es 1-2, en la que y es 0-2, en la que B es 5-bromocitosina, en la que N es cualquier base, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U. En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: TBGAABGUTCG (SEQ ID Nº:129) o TBGAABGTTCG (SEQ ID Nº:130).
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 5'-T C G T B G Ny A X3 B G X4 T C G-3' (SEQ ID Nº:131) en la que y es 0-2, en la que B es 5-bromocitosina, en la que N es cualquier base, en la que X3 es T, A o C, en la que X4 es T, G o U. En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias siguientes: TCGTBGAABGUTCG (SEQ ID Nº:132) o TCGTBGAABGTTCG (SEQ ID Nº:133).
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: AACGTTCC, AACGTTCG, GACGTTCC, GACGTTCG.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: GGCGTTCG; GGCGCTCG; GGCGTCCG; GGCGCCCG; GACGTTCC; GACGCTCC; GACGTCCC; GACGCCCC; AGCGTTCC; AGCGCTCC; AGCGTCCC; AGCGCCCC; AACGTTCC; AACGCTCC; AACGTCCC; AACGCCCC; GGCGTTCC; GGCGCTCC; GGCGTCCC; GGCGCCCC; GACGTTCG; GACGCTCG; GACGTCCG; GACGCCCG; AGCGTTCG; AGCGCTCG; AGCGTCCG; AGCGCCCG; AACGTTCG; AACGCTCG; AACGTCCG; AACGCCCG; GACGCTCC; GACGCCC; AGCGTTCC; AGCGCTCC; AGCGTCCC; AGCGCCCC; AACGTCCC; AACGCCCC; GGCGTTCC; GGCGCTCC; GGCGTCCC; GGCGCCCC; GACGCTCG; GACGTCCG; GACGCCCG; AGCGTTCG; AGCGTCCG; AGCGCCCG; AACGTCCG; AACGCCCG.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: (5'→3') TCGTCGA; TCGTCG; TCGTTT; TTCGTT; TTTTCG; ATCGAT; GTCGAC; GTCGTT; TCGCGA; TCGTTTT; TCGTC; TCGTT; TCGT; TCG; ACGTTT; CCGTTT; GCGTTT; AACGTT; TCGAAAA; TCGCCCC; TCGGGGG.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico comprende un ARN de secuencia AACGUUCC, AACGUUCG, GACGUUCC, y GACGUUCG.
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En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico tiene una secuencia que comprende una secuencia o motivo de secuencia descrito en las solicitudes de patente de EE.UU. cedidas junto con la presente y pendientes junto con la presente 09/802.685 (publicada como la publicación de solicitud de EE.UU. nº 20020028784A1 el 7 de marzo de 2002 y como el documento WO 01/68077 el 20 de septiembre de 2001); 09/802.359 (publicada como el documento WO 01/68144 el 20 de septiembre 2001), y la solicitud de EE.UU. pendiente junto con la presente de nº de serie 10/033.243, o en las publicaciones PCT WO 97/28259, WO 98/16247; WO 98/55495; WO 99/11275; WO 99/62923; y WO 01/35991. El resto de ácido nucleico puede tener también una secuencia que comprende cualquiera o varias de las secuencias que se ha informado previamente que se correlacionan con la actividad inmunoestimuladora cuando se administran en forma de un polinucleótido con una longitud mayor (a menudo sustancialmente mayor) de 8 nucleótidos, p.ej., Kandimalla et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. 9:807-13; Krieg et al. (1989) J. Immunol. 143:24482451; Tokunaga et al. (1992) Microbiol. Immunol. 36:55-66; Kataoka et al. (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83:244-247; Yamamoto et al. (1992) J. Immuol. 148:4072-4076; Mojcik et al. (1993) Clin. Immuno. and Immunopathol. 67:130136; Branda et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 45:2037-2043; Pisetsky et al. (1994) Life Sci. 54(2):101-107; Yamamoto et al. (1994a) Antisense Research and Development. 4:119-122; Yamamoto et al. (1994b) Jpn. J. Cancer Res. 85:775-779; Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523; Kimura et al. (1994) J. Biochem. 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Immunol. 161:2428-2434; Krieg et al. (1998c) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12631-12636; Spiegelberg et al. (1998) Allergy 53(45S):93-97; Homer et al. (1998) Cell Immunol. 190:77-82; Jakob et al. (1998) J. Immunol. 161:3042-3049; Redford et al. (1998) J. Immunol. 161:3930-3935; Weeratna et al. (1998) Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8:351-356; McCluskie et al. (1998) J. Immunol. 161(9):4463-4466; Gramzinski et al. (1998) Mol. Med. 4:109-118; Liu et al. (1998) Blood 92:3730-3736; Moldoveanu et al. (1998) Vaccine 16:1216-1224; Brazolot Milan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15553-15558; Briode et al. (1998) J. Immunol. 161:7054-7062; Briode et al. (1999) Int. Arch. Allergy Immunol. 118:453-456; Kovarik et al. (1999) J. Immunol. 162:1611-1617; Spiegelberg et al. (1999) Pediatr. Pulmonol. Suppl. 18:118-121; Martin-Orozco et al. (1999) Int. Immunol. 11:11111118; los documentos EP 468.520; WO 96/02555; WO 97/28259; WO 98/16247; WO 98/18810; WO 98/37919; WO 98/40100; WO 98/52581; WO 98/55495; WO 98/55609 y WO 99/11275. Véase también Elkins et al. (1999) J. Immunol. 162:2291-2298, los documentos WO 98/52962, WO 99/33488, WO 99/33868, WO 99/51259 y WO 99/62923. Véase también Zimmermann et al. (1998) J. Immunol. 160:3627-3630; Krieg (1999) Trends Microbiol. 7:64-65 y las patentes de EE.UU. nºs 5.663.153, 5.723.335 y 5.849.719. Véase también Liang et al. (1996) J. Clin. Invest. 98:1119-1129; Bohle et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2344-2353 y el documento WO 99/56755. Véase también los documentos WO 99/61056; WO 00/06588; WO 00/16804; WO 00/21556; WO 00/54803; WO 00/61151; WO 00/67023; WO 00/67787 y la patente de EE.UU. nº 6.090.791. En una realización, al menos un resto de ácido nucleico de un CIQ comprende una secuencia TG o una secuencia rica en pirimidina (p.ej., rica en T o rica en C), tal como se describe en la publicación PCT WO 01/22972.
En ciertas realizaciones, el resto de ácido nucleico es distinto de uno o más de los hexámeros 5'-GACGTT-3', 5'-GAGCTT-3', 5'-TCCGGA-3', 5'-AACGTT-3', 5'-GACGTT-3', 5'-TACGTT-3, 5'-CACGTT-3', 5'-AGCGTT-3', 5'-ATCGTT-3', 5'-ACCGTT-3', 5'-AACGGT-3', 5'-AACGAT-3', 5'-AACGCT-3', 5'-AACGTG-3', 5'-AACGTA-3', y 5'-AACGTC-3'.
En ciertas realizaciones, el CIQ contiene al menos 3, al menos 10, al menos 30 o al menos 100 restos de ácido nucleico que tienen una secuencia descrita anteriormente.
C. Secuencias de los Restos de Ácido Nucleico: Heterogeneidad y Efecto de la Posición
Se contempla que en un CIQ que comprende múltiples restos de ácido nucleico, los restos de ácido nucleico pueden ser iguales o diferentes.
En una realización, todos los restos de ácido nucleico de un CIQ tienen la misma secuencia. En una realización, un CIQ comprende restos de ácido nucleico con al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 6 o más secuencias diferentes. En una realización, un CIQ tiene menos de 10 restos de ácido nucleico diferentes. En una
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realización, cada uno de los restos de ácido nucleico de un CIQ tiene una secuencia diferente.
En ciertas realizaciones, un único resto de ácido nucleico contiene más de una iteración de un motivo de secuencia enumerado anteriormente en §3(B), o dos o más motivos de secuencia diferentes. Los motivos en un único resto de ácido nucleico pueden ser adyacentes, solapantes, o estar separados por bases nucleotídicas adicionales en el resto de ácido nucleico. En una realización, un resto de ácido nucleico incluye una o más regiones palindrómicas. En el contexto de los oligonucleótidos monocatenarios, el término "palindrómico" se refiere a una secuencia que sería palindrómica si el oligonucleótido se complejase con una secuencia complementaria para formar una molécula bicatenaria. En otra realización, un resto de ácido nucleico tiene una secuencia que es palindrómica o parcialmente palindrómica en relación a un segundo resto de ácido nucleico del CIQ. En una realización de la invención, la secuencia de uno o más de los restos de ácido nucleico de un CIQ no es palindrómica. En una realización de la invención, la secuencia de uno o más de los restos de ácido nucleico de un CIQ no incluye una secuencia palindrómica mayor de cuatro bases, opcionalmente mayor de 6 bases.
Como se describió anteriormente, en diversas realizaciones, uno o más (p.ej., todos) los restos de ácido nucleico de un CIQ comprenden una secuencia 5'-CG-3', de manera alternativa una secuencia 5'-TCG-3'. En una realización, el resto de ácido nucleico tiene una longitud de 5, 6 ó 7 bases. En una realización, el resto de ácido nucleico tiene la fórmula 5'-TCG[(X)2-4]-3' o 5'-TCG(A/T)[(X)1-3] o 5'-TCG(A/T)CG(A/T)-3' o 5'-TCGACGT-3' (en las que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente). En una realización, el resto de ácido nucleico anteriormente mencionado es un resto de 5-prima.
En una realización, un resto de ácido nucleico comprende una secuencia 5'-TCGTCGA-3'. En una realización, un resto de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de (todas 5'→3): TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, TGTCGTT, TCGXXX, TCGAXX, GTCGTT, GACGTT, ATCGAT, TCGTCG; TCGTTT; TCGAGA; TTCGAG; TTCGTT; AACGTT; AACGTTCG; AACGUTCG, ABGUTCG, TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, TCGTC; TCGA, TCGT, y TCGX (en las que X es A, T, G o C; U es 2'-desoxiuridina y B es 5-bromo-2'-desoxicitidina).
En una realización, el resto de ácido nucleico es un 7-mero que tiene la secuencia TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, o TGTCGTT; o es un 6-mero que tiene la secuencia TCGXXX, TCGAXX, TCGTCG, AACGTT; ATCGAT, GTCGTT, o GACGTT; o es un 5-mero que tiene la secuencia TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, o TCGTC; o es un 4-mero que tiene la secuencia TCGA, TCGT, o TCGX, o es un 3-mero que tiene la secuencia TCG, en la que X es A, T, G o C.
En una realización, al menos alrededor del 25%, preferiblemente al menos alrededor del 50%, o al menos alrededor del 75%, y a veces todos los restos de ácido nucleico del CIQ comprenden al menos una de las secuencias anteriormente mencionadas. En una realización, al menos un resto de ácido nucleico no comprende un motivo CG. En otras realizaciones, al menos alrededor del 25%, a veces al menos alrededor del 50%, y a veces al menos alrededor del 75% de los restos de ácido nucleico del CIQ son restos de ácido nucleico que no tienen un motivo CG o, de manera alternativa, un motivo TCG.
La posición de una secuencia o motivo de secuencia en un CIQ puede influir en la actividad inmunomoduladora del CIQ, como se ilustra en los Ejemplos, más adelante. Al referirse a la posición de un motivo de secuencia en un resto de ácido nucleico de un CIQ, es útil la siguiente terminología: (1) En un CIQ que contiene múltiples restos de ácido nucleico, un resto con un extremo 5' libre se denomina "un resto de 5-prima". Se apreciará que un único CIQ puede tener múltiples restos de 5-prima. (2) En cualquier resto de ácido nucleico particular, una secuencia o motivo está en "la posición 5-prima" del resto cuando no hay bases nucleotídicas en 5' respecto de la secuencia de referencia en ese resto. Así, en el resto con la secuencia 5'-TCGACGT-3', las secuencias T, TC, TCG y TCGA, están en "la posición 5-prima", mientras que la secuencia GAC no lo está. A modo de ilustración, un CIQ que contiene la secuencia TCG en la posición 5-prima de un resto de ácido nucleico puede hacer que el CIQ sea más activo que otro CIQ similar con un motivo TCG posicionado de manera diferente. Un CIQ con una secuencia TCG en un resto de 5-prima, p.ej. en la posición 5-prima del resto de 5-prima, puede hacer que un CIQ sea especialmente activo. Véase, p.ej., el Ejemplo 38. Un resto de ácido nucleico con un extremo 5' libre se puede designar mediante el uso del símbolo "5'F" a la izquierda de la fórmula para la secuencia de bases del resto de ácido nucleico (p.ej., 5'F-TACG3'). Tal como se usa en la presente memoria, el término "extremo 5' libre" en el contexto de un resto de ácido nucleico tiene su significado habitual, y significa que el extremo 5' del resto de ácido nucleico no está conjugado a un grupo bloqueante o a un resto espaciador no nucleotídico.
La actividad inmunoestimuladora se puede ver influida también por la posición de un motivo CG en un resto de ácido nucleico (p.ej., en un resto de 5'). Por ejemplo, en una realización útil, el CIQ contiene al menos un resto de ácido nucleico con la secuencia 5'-X-CG-Y-3' en la que X es cero, uno, o dos nucleótidos e Y tiene una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más de 15 nucleótidos. En una realización, la secuencia 5'-X-CG-Y-3' está en un resto de 5' del CIQ, p.ej., en la posición 5-prima del CIQ. En una realización, el CIQ contiene 2, 3 o más restos de ácido nucleico con una secuencia que tiene la fórmula de la secuencia 5'-X-CG-Y-3'. Por ejemplo, en una
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realización, todos los restos de ácido nucleico del CIQ tienen secuencias de la fórmula de la secuencia 5'-X-CG-Y-3'.
De forma similar, un CIQ que incluye la secuencia TCGA (p.ej., una secuencia que incluye TCGACGT) en un resto de ácido nucleico tiene actividad inmunomoduladora, y es eficaz en la inducción de IFN-α. Una TCGA (p.ej., una secuencia que incluye TCGACGT) en un resto de 5-prima, p.ej., en la posición 5-prima del resto de 5-prima, hace que el CIQ sea especialmente activo. Véanse los Ejemplos 38 y 49. Así, en una realización, un CIQ comprende una estructura central con la fórmula (5'-N1-3')-S1-N2 (Ia) en la que N1 tiene la secuencia 5'-TCGAX-3' y X es 0 a 20 bases nucleotídicas, a menudo 0 a 3 bases. En una realización, X es CGT. La secuencia TCGTCGA también es especialmente eficaz en la inducción de IFN-α.
Además, la presencia de extremos 5' libres (sin conjugar) de ácido nucleico puede afectar a la actividad inmunoestimuladora. Véase, p.ej., el Ejemplo 39. En diversas realizaciones, un CIQ de la invención comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 extremos 5' libres. En ciertas realizaciones, el número de extremos 5' libres es de 1 a 10, de 2 a 6, de 3 a 5, o de 4-5. En una realización, el número de extremos 5' libres es al menos alrededor de 50 o al menos alrededor de 100.
D. "Actividad Inmunomoduladora Aislada"
Una propiedad de un resto de ácido nucleico es la "actividad inmunomoduladora aislada" asociada a la secuencia de nucleótidos del resto de ácido nucleico. Como se indicó anteriormente, los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, los CIQs exhiben actividad inmunomoduladora incluso cuando ninguno de los restos de ácido nucleico del CIQ tiene una secuencia que, si se presenta como un polinucleótido solo, exhiba una actividad inmunomoduladora comparable.
En ciertas realizaciones, un resto de ácido nucleico de un CIQ no tiene "actividad inmunomoduladora aislada", o tiene una "actividad inmunomoduladora aislada inferior", (es decir, en comparación con el CIQ), como se describe más adelante.
La "actividad inmunomoduladora aislada" de un resto de ácido nucleico se determina midiendo la actividad inmunomoduladora de un polinucleótido aislado que tiene la secuencia primaria del resto de ácido nucleico, y que tiene el mismo esqueleto de ácido nucleico (p.ej., fosforotioato, fosfodiéster, quimérico). Por ejemplo, un CIQ que tiene la estructura "5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3"' contiene tres restos de ácido nucleico. Para determinar la actividad inmunomoduladora independiente, por ejemplo, del primer resto de ácido nucleico del CIQ, se sintetiza un polinucleótido de ensayo que tiene la misma secuencia (es decir, 5'-TCGTCG-3') y la misma estructura del esqueleto (p.ej., fosforotioato) mediante el uso de métodos rutinarios, y se mide su actividad inmunomoduladora (si la tiene). La actividad inmunomoduladora se puede determinar mediante el uso de ensayos habituales que indican diversos aspectos de la respuesta inmunitaria, tales como los descritos en §2, anteriormente. Preferiblemente, se usa el ensayo de PBMC humanas descrito en §2, anteriormente. Como se discutió anteriormente, para tener en cuenta la variación de donantes, en general el ensayo se lleva a cabo mediante el uso de células obtenidas de múltiples donantes. Un polinucleótido no tiene actividad inmunomoduladora (y el resto de ácido nucleico correspondiente no tiene "actividad inmunomoduladora aislada") cuando la cantidad de IFN-γ secretada por las PBMCs puestas en contacto con el polinucleótido no es significativamente mayor (p.ej., menor de alrededor de 2 veces mayor) en la mayoría de donantes que en ausencia del compuesto de ensayo o, (en ciertas realizaciones) en presencia de un compuesto de control inactivo (p.ej., 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:3)).
Para comparar la actividad inmunomoduladora de un CIQ y un polinucleótido aislado, se mide la actividad inmunomoduladora, preferiblemente mediante el uso del ensayo de PBMC humanas descrito en §2, anteriormente. Normalmente, la actividad de dos compuestos se compara ensayándolos en paralelo en las mismas condiciones (p.ej., mediante el uso de las mismas células), normalmente a una concentración de alrededor de 20 µg/ml. Como se indicó anteriormente, en general, la concentración se determina midiendo la absorbancia a 260 nm y mediante el uso de la conversión 0,5 DO260/ml = 20 µg/ml. Esto normaliza la cantidad de ácido nucleico total en la muestra de ensayo. De manera alternativa, se puede medir la concentración o el peso mediante otros métodos conocidos en la técnica. Si se desea, se puede determinar la cantidad de resto de ácido nucleico midiendo la absorbancia a 260 nm, y el peso del CIQ se calcula mediante el uso de la fórmula molecular del CIQ. Este método se usa a veces cuando la proporción de peso aportada por el/los resto(s) espaciador(es) respecto del peso aportado por los restos de ácido nucleico en un CIQ es elevada (es decir, mayor de 1).
De manera alternativa, se puede usar una concentración de 3 µM, en particular cuando los pesos moleculares calculados de dos muestras que se están comparando difieren en más del 20%.
Un resto de ácido nucleico de un CIQ se caracteriza por tener una "actividad inmunomoduladora inferior" cuando el polinucleótido de ensayo tiene menos actividad que el CIQ con el que se compara. Preferiblemente, la actividad inmunomoduladora aislada del polinucleótido de ensayo no es mayor de alrededor del 50% de la actividad del CIQ, más preferiblemente no más de alrededor del 20%, lo más preferiblemente no más de alrededor del 10% de la actividad del CIQ, o en ciertas realizaciones, incluso menor.
Para los CIQs con múltiples restos de ácido nucleico (p.ej., múltiples y diferentes), también es posible determinar la
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actividad inmunomoduladora (si la hay) de una mezcla de polinucleótidos de ensayo que corresponden a los múltiples restos de ácido nucleico. El ensayo se puede llevar a cabo mediante el uso de una cantidad total de polinucleótido de ensayo (es decir, en la mezcla) que iguala la cantidad de CIQ usada. De manera alternativa, una cantidad de cada polinucleótido de ensayo, o de cada polinucleótido de ensayo diferente, en la mezcla puede ser igual a la cantidad del CIQ en el ensayo. Como se indicó en §2, para tener en cuenta la variación de donantes, preferiblemente los ensayos y análisis usan PMBCs de múltiples donantes.
En una realización, uno o más (p.ej., al menos alrededor de 2, al menos alrededor de 4, o al menos alrededor del 25%, al menos alrededor del 50%, o todos, medidos individualmente o, de manera alternativa, en combinación) de los restos de ácido nucleico de un CIQ no tienen actividad inmunomoduladora aislada. En una realización, uno o más (p.ej., al menos alrededor de 2, al menos alrededor de 4, o al menos alrededor del 25%, al menos alrededor del 50%, o todos, medidos individualmente o, de manera alternativa, en combinación) tienen una actividad inmunomoduladora aislada inferior en comparación con el CIQ.
En una realización relacionada, un CIQ comprende uno o más restos de ácido nucleico con actividad inmunomoduladora aislada. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, todos o casi todos (p.ej., al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%) los restos de ácido nucleico tienen actividad inmunomoduladora aislada. Por ejemplo, un CIQ que comprende un/varios espaciador(es) multivalente(s) puede comprender más de 4, a menudo más de 10, con frecuencia al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 400 o al menos alrededor de 1000 restos de ácido nucleico (p.ej., al menos alrededor de 2500) con actividad inmunoestimuladora aislada (p.ej., que tienen la secuencia 5'-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A-3' (SEQ ID Nº:2)).
Así, en un CIQ particular, el número de restos de ácido nucleico que tienen actividad inmunomoduladora aislada puede ser cero (0), uno (1), 2 o más, 3 o más, menos de 3, 4 o más, menos de 4, 5 o más, menos de 5, al menos 10, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 400 o al menos alrededor de 1000, todos, o menos de todos, de los restos de ácido nucleico del CIQ.
E. Estructura del Resto de Ácido Nucleico
Un resto de ácido nucleico de un CIQ puede contener modificaciones estructurales respecto de los ácidos nucleicos que se dan de manera natural. Las modificaciones incluyen cualquiera conocida en la técnica para polinucleótidos, pero sin limitación, modificaciones de los grupos 3'OH o 5'OH, modificaciones de la base nucleotídica, modificaciones del componente de carbohidrato, y modificaciones del grupo fosfato. Más adelante se describen varias de tales modificaciones.
El resto de ácido nucleico puede ser ADN, ARN o ADN/ARN mezclados, monocatenarios, bicatenarios o parcialmente bicatenarios, y puede contener otros polinucleótidos modificados. Se contemplan los restos de ácido nucleico bicatenarios y CIQs, y la referencia al término "base" o "nucleótido" pretende abarcar los pares de bases o nucleótidos emparejados por bases, a menos que se indique de otra manera. Un resto de ácido nucleico puede contener bases que se dan de manera natural o modificadas, bases que no se dan de manera natural, y puede contener carbohidratos, fosfato, y/o extremos modificados. Por ejemplo, las modificaciones del fosfato incluyen, pero sin limitación, metil fosfonato, fosforotioato, fosforamidato (con puentes o sin puentes), fosfotriéster y fosforoditioato, y se pueden usar en cualquier combinación. También se pueden usar otras uniones sin fosfato. Preferiblemente, los CIQs y los restos de ácido nucleico de la presente invención comprenden esqueletos de fosforotioato. También se pueden hacer modificaciones de carbohidratos conocidas en este campo, tales como análogos de 2'-alcoxi-ARN, análogos de 2'-amino-ARN y quimeras 2'-alcoxi- o amino-ARN/ADN y otras descritas en la presente memoria, y combinarlas con cualquier modificación del fosfato. Los ejemplos de modificaciones de bases (discutidas adicionalmente más adelante) incluyen, pero sin limitación, la adición de un resto atractor de electrones en C-5 y/o C-6 de una citosina (p.ej., 5-bromocitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-yodocitosina) y C-5 y/o C-6 de un uracilo (p.ej., 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-yodouracilo). Véase, por ejemplo, la solicitud PCT Nº WO 99/62923.
El resto de ácido nucleico puede contener también nucleótidos modificados con fosfato. La síntesis de ácidos nucleicos que contienen uniones con fosfato modificado o uniones sin fosfato también se conoce en la técnica. Para una revisión, véase Matteucci (1997) "Oligonucleotide Analogs: an Overview" en Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J. Chadwick y G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, Nueva York, NY. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que se puede unir al carbohidrato o resto de análogo de carbohidrato en los ácidos nucleicos de la presente invención puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato o similares. La preparación de los análogos de fosfato anteriormente indicados, y su incorporación en los nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, por sí misma, también se conoce y no es necesario describirla con detalle en la presente memoria. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; y Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973. Por ejemplo, la síntesis de oligonucleótidos de fosforotioato es similar a la descrita anteriormente para los oligonucleótidos naturales, excepto que la etapa de oxidación se sustituye por una etapa de sulfuración (Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates" en Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, págs. 165-190). De forma similar, también se ha descrito la síntesis de otros análogos de fosfato, tales como
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fosfotriéster (Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665), fosforamidatos que no forman puentes (Jager et al. (1988) Biochem. 27:7247-7246), fosforamidiatos N3' a P5' (Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287) y fosforoditioatos (patente de EE.UU. Nº 5.453.496). También se pueden usar otros ácidos nucleicos modificados que no se basan en fósforo (Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141). Los ácidos nucleicos con esqueletos de fosforotioato parecen ser más resistentes a la degradación tras la inyección en el hospedador. Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; y Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064.
Los restos de ácido nucleico usados en la invención pueden comprender ribonucleótidos (que contienen ribosa como único o principal componente de carbohidrato), y/o desoxirribonucleótidos (que contienen desoxirribosa como componente principal de carbohidrato). Se pueden incorporar carbohidratos modificados o análogos de carbohidratos en el resto de ácido nucleico. Así, además de ribosa y desoxirribosa, el resto de carbohidrato puede ser pentosa, desoxipentosa, hexosa, desoxihexosa, glucosa, arabinosa, xilosa, lixosa, y un grupo ciclopentilo "análogo" a un carbohidrato. El carbohidrato puede estar en forma de piranosilo o de furanosilo. El resto de carbohidrato es preferiblemente el furanósido de ribosa, desoxirribosa, arabinosa o 2'-O-alquilribosa, y el carbohidrato se puede unir a las bases heterocíclicas respectivas en una configuración anomérica α o β. Las modificaciones de carbohidratos incluyen, pero sin limitación, análogos de 2'-alcoxi-ARN, análogos de 2'-amino-ARN y quimeras 2'-alcoxi- o amino-ARN/ADN. Por ejemplo, una modificación de carbohidrato en el CIQ incluye, pero sin limitación, 2'-amino-2'-desoxiadenosina. La preparación de estos carbohidratos o análogos de carbohidratos y los "nucleósidos" respectivos en los que tales carbohidratos o análogos están unidos a una base heterocíclica (base de ácido nucleico) ya se conoce, y no es necesario describirla en la presente memoria, excepto en el sentido de que tal preparación pueda estar relacionada con cualquier ejemplo específico. Las modificaciones de los carbohidratos también se pueden hacer y combinar con cualquier modificación del fosfato en la preparación de un CIQ.
Las bases heterocíclicas, o bases de ácido nucleico, que se incorporan en el resto de ácido nucleico pueden ser las bases de purina y pirimidina principales naturales (concretamente uracilo, timina, citosina, adenina y guanina, como se mencionó anteriormente), así como las modificaciones naturales y sintéticas de dichas bases principales.
Los expertos en la técnica reconocerán que hay disponible un gran número de nucleósidos "sintéticos" que no son naturales que comprenden diversas bases heterocíclicas y diversos restos de carbohidrato (y análogos de carbohidratos) en la técnica, y que con tal de que se satisfagan otros criterios de la presente invención, el resto de ácido nucleico puede incluir una o varias bases heterocíclicas distintas de los cinco componentes de las bases principales de los ácidos nucleicos naturales. Preferiblemente, sin embargo, la base heterocíclica es, sin limitación, los grupos uracil-5-ilo, citosin-5-ilo, adenin-7-ilo, adenin-8-ilo, guanin-7-ilo, guanin-8-ilo, 4-aminopirrolo [2.3-d] pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirrolo [2.3-d] pirimidin-5-ilo, o 2-amino-4-oxopirrolo [2,3-d] pirimidin-3-ilo, en los que las purinas están unidas al resto de carbohidrato del resto de ácido nucleico por medio de la posición 9, las pirimidinas por medio de la posición 1, las pirrolopirimidinas por medio de la posición 7 y las pirazolopirimidinas por medio de la posición 1.
El resto de ácido nucleico puede comprender al menos una base modificada. Tal como se usa en la presente memoria, el término "base modificada" es sinónimo de "análogo de base", por ejemplo, "citosina modificada" es sinónimo de "análogo de citosina". De forma similar, nucleósidos o nucleótidos "modificados" se definen en la presente memoria como sinónimos de "análogos" de nucleósidos o nucleótidos. Los ejemplos de modificaciones de bases incluyen, pero sin limitación, la adición de un resto atractor de electrones en C-5 y/o C-6 de una citosina del resto de ácido nucleico. Preferiblemente, el resto atractor de electrones es un halógeno. Tales citosinas modificadas pueden incluir, pero sin limitación, azacitosina, 5-bromocitosina, 5-clorocitosina, citosina clorada, ciclocitosina, arabinósido de citosina, 5-fluorocitosina, fluoropirimidina, 5,6-dihidrocitosina, 5-yodocitosina, 5-nitrocitosina, y cualquier otro análogo de pirimidina o pirimidina modificada. Otros ejemplos de modificaciones de bases incluyen, pero sin limitación, la adición de un resto atractor de electrones en C-5 y/o C-6 de un uracilo del resto de ácido nucleico. Preferiblemente, el resto atractor de electrones es un halógeno. Tales uracilos modificados pueden incluir, pero sin limitación, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-yodouracilo. Véase además, Kandimalla et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. 9:807-13.
Otros ejemplos de modificaciones de bases incluyen la adición de uno o más grupos tiol a la base, lo que incluye, pero sin limitación, 6-tio-guanina, 4-tio-timina y 4-tio-uracilo.
La preparación de nucleósidos con modificación de las bases, y la síntesis de oligonucleótidos modificados mediante el uso de dichos nucleósidos con modificación de las bases como precursores, se ha descrito, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 4.910.300, 4.948.882, y 5.093.232. Estos nucleósidos con modificación de las bases se han diseñado de manera que se pueden incorporar mediante síntesis química en las posiciones terminales o internas de un oligonucleótido. Tales nucleósidos con modificación de las bases, presentes en las posiciones terminales o internas de un oligonucleótido, pueden servir como sitios para la unión de un péptido u otro antígeno. También se han descrito nucleósidos modificados en su resto de carbohidrato (lo que incluye, pero sin limitación, p.ej., las patentes de EE.UU. 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, 5.118.802), y se pueden usar de forma similar.
4. Restos Espaciadores Distintos de Ácido Nucleico
Los compuestos de CIQ de la invención comprenden uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico
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unidos de manera covalente a los restos de ácido nucleico. Por comodidad, los restos espaciadores distintos de ácido nucleico se denominan a veces en la presente memoria simplemente como "espaciadores" o "restos espaciadores".
Los espaciadores tienen en general un peso molecular de alrededor de 50 a alrededor de 500.000 (p.ej. alrededor de 50 a alrededor de 50.000), a veces de alrededor de 75 a alrededor de 5000, a veces de alrededor de 75 a alrededor de 500, y están unidos de manera covalente, en diversas realizaciones, a uno, dos, tres, o más de tres restos de ácido nucleico. Una diversidad de agentes son adecuados para conectar los restos de ácido nucleico. Por ejemplo, se puede usar una diversidad de compuestos denominados en la bibliografía científica "enlazadores distintos de ácido nucleico", "enlazadores no nucleotídicos", o "moléculas plataforma de valencia" como espaciadores en un CIQ. Se dice que un resto espaciador comprende un componente espaciador particular (p.ej., hexaetilen glicol) cuando el espaciador incluye el componente (o un derivado sustituido) como una subunidad o porción del espaciador. Por ejemplo, se puede describir que el espaciador mostrado en el Ejemplo 49 comprende un componente de polisacárido, un componente de hexaetilen glicol, y un componente de enlazador de tioéter derivatizado. Como se describe más adelante, en ciertas realizaciones, un espaciador comprende múltiples subunidades conectadas de manera covalente, y puede tener una estructura homopolimérica o heteropolimérica. A menudo las subunidades se conectan mediante un enlazador, unión fosfodiéster, y/o unión de éster de fosforotioato. Véanse los Ejemplos, más adelante. Los restos espaciadores no nucleotídicos de un CIQ que comprenden o que proceden de tales unidades múltiples se pueden denominar "compuestos espaciadores". En una realización, como ilustración y no como limitación, el CIQ comprende un compuesto espaciador que comprende dos o más (p.ej., 3 o más, 4 o más, o 5 o más) de los siguientes compuestos en unión fosfodiéster y/o unión de éster de fosforotioato: unidad de oligoetilen glicol (p.ej., espaciador de trietilen glicol; espaciador de hexaetilen glicol); unidad alquilo (p.ej., espaciador de propilo; espaciador de butilo; espaciador de hexilo); espaciador ramificado (p.ej., espaciador de 2-(hidroximetil)etilo; espaciador de glicerol; espaciador triplicador; espaciador doblador simétrico).
Se apreciará que los mononucleótidos y polinucleótidos no están incluidos en la definición de espaciadores distintos de ácido nucleico, sin cuya exclusión no habría diferencia entre el resto de ácido nucleico y un resto espaciador distinto de ácido nucleico adyacente.
Se describe una diversidad de espaciadores en la presente memoria, como ilustración y no como limitación. El lector apreciará que, por comodidad, un resto espaciador (o componente de un resto espaciador) se denomina a veces mediante el nombre químico del compuesto (p.ej., hexaetilen glicol) del que procede el resto espaciador o componente, con la comprensión de que el CIQ comprende realmente el conjugado de el/los compuesto(s) a los restos de ácido nucleico. Como entenderá el técnico de experiencia habitual (y como se describe con más detalle más adelante en la presente memoria), el espaciador distinto de ácido nucleico puede estar (y normalmente está) formado por uno/varios precursor(es) de resto espaciador que incluye(n) grupos reactivos para permitir el acoplamiento de uno o más ácidos nucleicos (p.ej., oligonucleótidos) al precursor del resto espaciador para formar el CIQ, y se pueden incluir grupos protectores. Los grupos reactivos del precursor de espaciador pueden ser iguales o diferentes.
Los espaciadores distintos de ácido nucleico ejemplares comprenden espaciadores de oligo-etilen glicol (p.ej., trietilen glicol, tetraetilen glicol, hexaetilen glicol, y otros polímeros que comprenden hasta alrededor de 10, alrededor de 20, alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 100 o alrededor de 200 unidades de etilen glicol), espaciadores alquilo (p.ej., espaciadores propilo, butilo, hexilo, y otros alquilo C2 - C12, p.ej., normalmente alquilo C2 - C10, más a menudo alquilo C2 - C6), espaciadores simétricos o asimétricos derivados de glicerol, pentaeritritol, 1,3,5-trihidroxiciclohexano o 1,3-diamino-2-propanol (p.ej., los restos espaciadores triplicadores y dobladores simétricos descritos en la presente memoria). Opcionalmente, estos componentes espaciadores están sustituidos. Por ejemplo, como entenderá una persona de experiencia habitual en la técnica, glicerol y 1,3-diamino-2-propanol pueden estar sustituidos en la posición 1, 2, y/o 3 (p.ej., sustitución de uno o más hidrógenos unidos a carbono con uno de los grupos enumerados más adelante). De forma similar, el pentaeritritol puede estar sustituido en cualquiera,
o todas, las posiciones metileno con cualquiera de los grupos descritos más adelante. Los sustituyentes incluyen alcohol, alcoxi (tales como metoxi, etoxi, y propoxi), alquilo de cadena lineal o ramificada (tales como alquilo C1-C12), amina, aminoalquilo (tal como aminoalquilo C1-C12), fosforamidita, fosfato, fosforamidato, fosforoditioato, tiofosfato, hidrazida, hidrazina, halógeno (tal como F, Cl, Br, o I), amida, alquilamida (tal como amida-alquilo C1-C12), ácido carboxílico, éster carboxílico, anhídrido carboxílico, haluro de ácido carboxílico, éter, haluro de sulfonilo, éster de imidato, isocianato, isotiocianato, haloformiato, aducto de carbodiimida, aldehídos, cetona, sulfhidrilo, haloacetilo, haluro de alquilo, sulfonato de alquilo, NR1R2 en el que R1R2 es -C(=O)CH=CHC(=O) (maleimida), tioéter, ciano, carbohidrato (tal como manosa, galactosa, y glucosa), carbonilo α,β-insaturado, alquilo mercúrico, sulfona α,β-insaturada.
En una realización, un espaciador puede comprender uno o más nucleótidos abásicos (es decir, que carecen de una base nucleotídica, pero que tienen las porciones de carbohidrato y fosfato). Los nucleótidos abásicos ejemplares incluyen 1'2'-didesoxirribosa, 1'-desoxirribosa, 1'-desoxarabinosa y los polímeros de las mismas.
Los espaciadores pueden comprender oligómeros y polímeros heteroméricos u homoméricos de los componentes distintos de ácido nucleico descritos en la presente memoria (p.ej., unidos mediante una unión fosfodiéster o fosforotioato o, de manera alternativa, una unión amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, fosforamidato, fosfotriéster,
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fosforoditioato, metil fosfonato u otra). Por ejemplo, en una realización, el resto espaciador comprende un componente espaciador ramificado (p.ej., glicerol) conjugado por medio de una unión fosfodiéster o fosforotioato a un oligoetilen glicol tal como HEG (véase, p.ej., C-94). En otro ejemplo, es un espaciador que comprende un componente espaciador multivalente conjugado a un oligoetilen glicol tal como HEG.
Otros espaciadores adecuados comprenden alquilo sustituido, poliglicol sustituido, poliamina sustituida opcionalmente, polialcohol sustituido opcionalmente, poliamida sustituida opcionalmente, poliéter sustituido opcionalmente, poliimina sustituida opcionalmente, polifosfodiéster sustituido opcionalmente (tal como poli(1-fosfo-3propanol), y similares. Los sustituyentes opcionales incluyen alcohol, alcoxi (tales como metoxi, etoxi, y propoxi), alquilo de cadena lineal o ramificada (tales como alquilo C1-C12), amina, aminoalquilo (tal como aminoalquilo C1-C12), fosforamidita, fosfato, tiofosfato, hidrazida, hidrazina, halógeno (tal como F, Cl, Br, o I), amida, alquilamida (tal como amida-alquilo C1-C12), ácido carboxílico, éster carboxílico, anhídrido carboxílico, haluro de ácido carboxílico, éter, haluro de sulfonilo, éster de imidato, isocianato, isotiocianato, haloformiato, aducto de carbodiimida, aldehídos, cetona, sulfhidrilo, haloacetilo, haluro de alquilo, sulfonato de alquilo, NR1R2 en el que R1R2 es -C(=O)CH=CHC(=O) (maleimida), tioéter, ciano, carbohidrato (tal como manosa, galactosa, y glucosa), carbonilo α,βinsaturado, alquilo mercúrico, sulfona α,β-insaturada.
Otros espaciadores adecuados pueden comprender moléculas policíclicas, tales como las que contienen anillos fenilo o ciclohexilo. El espaciador puede ser un poliéter tal como polifosfopropanodiol, polietilen glicol, polipropilen glicol, una molécula policíclica bifuncional tal como un pentaleno bifuncional, indeno, naftaleno, azuleno, heptaleno, bifenileno, asimindaceno, sim-indaceno, acenaftileno, fluoreno, fenaleno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, acefenatrileno, aceantrileno, trifenileno, pireno, criseno, naftaceno, tiantreno, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiína, que pueden estar sustituidos o modificados, o una combinación de los poliéteres y las moléculas policíclicas. La molécula policíclica puede estar sustituida o polisustituida con grupos alquilo C1-C5, alquilo C6, alquenilo, hidroxialquilo, halógeno o haloalquilo. Las moléculas poliheterocíclicas que contienen nitrógeno (p.ej., indolizina) en general no son espaciadores adecuados. El espaciador puede ser también un polialcohol, tal como glicerol o pentaeritritol. En una realización, el espaciador comprende (1-fosfopropano)3-fosfato o (1-fosfopropano)4fosfato (también denominados tetrafosfopropanodiol y pentafosfopropanodiol). En una realización, el espaciador comprende 2,2'-etilendioxidietilamina (EDDA) derivatizada.
Otros ejemplos de espaciadores distintos de ácido nucleico útiles en los CIQs incluyen los "enlazadores" descritos por Cload y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991), 113:6324; Richardson y Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991), 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Research (1993), 21:2585; Ma et al., Biochemistry (1993), 32:1751; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides (1991), 10:287; Jaschke et al., Tetrahedron Lett. (1993), 34:301; Ono et al., Biochemistry (1991), 30:9914; y Arnold et al., publicación internacional Nº WO 89/02439 y documento EP0313219B1 titulado "Reactivos de Unión Distintos de Ácidos Nucleicos para Sondas Nucleotídicas", los enlazadores descritos por Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114:8768; Nelson et al., Biochemistry 35:5339-5344 (1996); Bartley et al., Biochemistry 36:14502-511 (1997); Dagneaux et al. Nucleic Acids Research 24:4506-12 (1996); Durand et al., Nucleic Acids Research 18:6353-59 (1990); Reynolds et al., Nucleic Acids Research, 24:760-65 (1996); Hendry et al. Biochemica et Biophysica Acta, 1219:405-12 (1994); Altmann et al., Nucleic Acids Research, 23:4827-35 (1995), y la patente de EE.UU. Nº 6.117.657 (Usman et al.).
Los restos espaciadores adecuados pueden aportar carga y/o hidrofobicidad al CIQ, aportar propiedades farmacocinéticas favorables (p.ej., estabilidad mejorada, tiempo de estancia más largo en la sangre) al CIQ, y/o dar como resultado el transporte del CIQ a células u órganos particulares. Los restos espaciadores se pueden seleccionar o modificar para adaptar el CIQ a propiedades farmacocinéticas deseadas, para la inducción de una respuesta inmunitaria particular, o de manera adecuada para los modos deseados de administración (p.ej., administración oral).
En un CIQ que comprende más de un resto espaciador, los espaciadores pueden ser iguales o diferentes. Así, en una realización, todos los restos espaciadores distintos de ácido nucleico de un CIQ tienen la misma estructura. En una realización, un CIQ comprende restos espaciadores distintos de ácido nucleico con al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 6 o más estructuras diferentes.
En ciertas realizaciones contempladas de la invención, el resto espaciador de un CIQ se define para excluir ciertas estructuras. Así, en ciertas realizaciones de la invención, un espaciador es distinto de un nucleótido abásico o polímero de nucleótidos abásicos. En ciertas realizaciones de la invención, un espaciador es distinto de un oligo(etilenglicol) (p.ej., HEG, TEG y similares) o poli(etilenglicol). En ciertas realizaciones, un espaciador es distinto de un espaciador alquilo C3. En ciertas realizaciones, un espaciador es distinto de un espaciador alquilo o sustituido. En ciertas realizaciones, un espaciador es distinto de un polipéptido. Así, en ciertas realizaciones, una molécula inmunógena, p.ej., una proteína o polipéptido, no es adecuada como componente de los restos espaciadores. Sin embargo, como se discute más adelante, se contempla que en ciertas realizaciones, un CIQ sea un "CIQ proteico", es decir, que comprenda un resto espaciador que comprende un polipéptido (es decir, oligómero o polímero de aminoácidos). Por ejemplo, como se discute más adelante, en ciertas realizaciones, se puede usar un antígeno polipeptídico como plataforma (espaciador multivalente) a la que se conjuga una diversidad de restos de ácido nucleico. Sin embargo, en ciertas realizaciones, el resto espaciador no es proteico, y/o no es un antígeno (es decir, el resto espaciador, si está aislado del CIQ, no es un antígeno).
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Los restos espaciadores adecuados no hacen que el CIQ del cual son un componente sea insoluble en una disolución acuosa (p.ej., PBS, pH 7,0). Así, la definición de espaciadores excluye los microsoportes o nanosoportes. Además, no se prefiere un resto espaciador que tenga una solubilidad baja, tal como un espaciador de dodecilo (solubilidad < 5 mg/ml cuando se mide como su precursor de dialcohol 1,12-dihidroxidodecano) porque puede reducir la hidrofilicidad y la actividad del CIQ. Preferiblemente, los restos espaciadores tienen una solubilidad mucho mayor de 5 mg/ml (p.ej., solubilidad de al menos alrededor de 20 mg/ml, al menos alrededor de 50 mg/ml o al menos alrededor de 100 mg/ml), p.ej., cuando se mide como los precursores de dialcohol. La forma del resto espaciador usada para ensayar su solubilidad en agua es en general su molécula precursora del espaciador inactivada y desprotegida más estrechamente relacionada. Por ejemplo, C-19 contiene un resto espaciador que incluye un grupo dodecilo con uniones diéster de fosforotioato en las posiciones C-1 y C-12, por lo que conecta el resto espaciador a los restos de ácido nucleico. En este caso, se ensayó la solubilidad en agua de la versión dialcohol del espaciador de dodecilo, 1,12-dihidroxidodecano, y se descubrió que era menor de 5 mg/ml. Los espaciadores con una solubilidad en agua mayor, cuando se ensayaron como sus precursores de dialcohol, dieron como resultado CIQs más inmunoestimuladores. Estos espaciadores de solubilidad mayor en agua incluyen, sin limitación, propano-1,3diol; glicerol; butano-1,4-diol; pentano-1,5-diol; hexano-1,6-diol; trietilen glicol, tetraetilen glicol y HEG.
A. Restos Espaciadores Cargados y Multiunidad
La carga de un CIQ puede ser aportada por el fosfato, tiofosfato, u otros grupos de los restos de ácido nucleico, así como por los grupos de los restos espaciadores distintos de ácido nucleico. En ciertas realizaciones de la invención, un resto espaciador distinto de ácido nucleico porta una carga neta (p.ej., una carga neta positiva o carga neta negativa cuando se mide a pH 7). En una realización útil, el CIQ tiene una carga neta negativa. En ciertas realizaciones, la carga negativa de un resto espaciador de un CIQ se incrementa derivatizando una subunidad espaciadora descrita en la presente memoria para incrementar su carga. Por ejemplo, se puede unir de manera covalente glicerol a dos restos de ácido nucleico y el alcohol restante se puede hacer reaccionar con una fosforamidita activada, seguido de oxidación o sulfuración para formar un fosfato o tiofosfato, respectivamente. En ciertas realizaciones, la carga negativa aportada por los restos espaciadores distintos de ácido nucleico en un CIQ (es decir, la suma de las cargas cuando hay más de un espaciador) es mayor que la carga negativa aportada por los restos de ácido nucleico del CIQ. La carga se puede calcular basándose en la fórmula molecular, o se puede determinar experimentalmente, p.ej., mediante electroforesis capilar (Li, ed., 1992, Capillary Electrophoresis, Principles, Practice and Application Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Países Bajos, págs. 202-206).
Como se indicó anteriormente, los espaciadores adecuados pueden ser polímeros de compuestos distintos de ácido nucleico pequeños (p.ej., no nucleotídicos), tales como los descritos en la presente memoria, que son útiles por sí mismos como espaciadores, que incluyen los compuestos mencionados habitualmente como "enlazadores" no nucleotídicos. Tales polímeros (es decir, "espaciadores multiunidad") pueden ser heteroméricos u homoméricos, y a menudo comprenden unidades monoméricas (p.ej., HEG, TEG, glicerol, 1'2'-didesoxirribosa, y similares) unidos mediante una unión éster (p.ej., fosfodiéster o éster de fosforotioato). Así, en una realización, el espaciador comprende una estructura polimérica (p.ej., heteropolimérica) de unidades no nucleotídicas (p.ej., de 2 a alrededor de 100 unidades, de manera alternativa 2 a alrededor de 50, p.ej., 2 a alrededor de 5, de manera alternativa p.ej., alrededor de 5 a alrededor de 50, p.ej., alrededor de 5 a alrededor de 20).
Como ilustración, los CIQs que contienen espaciadores multiunidad incluyen
5'-TCGTCG-(C3)15-T
5'-TCGTCG-(glicerol)15-T
5'-TCGTCG-(TEG)8-T
5'-TCGTCG-(HEG)4-T
en los que (C3)15 significa 15 enlazadores de propilo conectados por medio de ésteres de fosforotioato; (glicerol)15 significa 15 enlazadores de glicerol conectados por medio de ésteres de fosforotioato; (TEG)8 significa 8 enlazadores de trietilenglicol conectados por medio de ésteres de fosforotioato; y (HEG)4 significa 4 enlazadores de hexaetilenglicol conectados por medio de ésteres de fosforotioato. Se apreciará que ciertos espaciadores multiunidad tienen una carga neta negativa, y que la carga negativa se puede incrementar incrementando el número, p.ej., de unidades monoméricas unidas mediante éster.
B. Resto Espaciador Multivalente
En los CIQs de la invención, un resto espaciador es un resto espaciador distinto de ácido nucleico multivalente (es decir, un "espaciador multivalente"). Tal como se usa en este contexto, un CIQ que contiene un espaciador multivalente contiene un espaciador unido de manera covalente a tres (3) o más restos de ácido nucleico. Los espaciadores multivalentes se denominan a menudo en la técnica "moléculas plataforma". Los espaciadores multivalentes pueden ser poliméricos o no poliméricos. Los ejemplos de moléculas adecuadas incluyen glicerol o glicerol sustituido (p.ej., 2-hidroximetil glicerol, levulinil-glicerol); tetraaminobenceno, heptaaminobetaciclodextrina, 1,3,5-trihidroxiciclohexano, pentaeritritol y derivados de pentaeritritol, tetraaminopentaeritritol, 1,4,8,11-tetraazaciclo
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tetradecano (Ciclam), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (Ciclen), polietilenimina, 1,3-diamino-2-propanol y derivados sustituidos (p.ej., "doblador simétrico"), compuestos de [propiloximetil]etilo (p.ej., "triplicador"), derivados de polietilen glicol tales como los denominados "PEGs estrella" y "bPEG" (véase, p.ej., Gnanou et al., 1988, Makromol. Chem. 189:2885; Rein et al., 1993, Acta Polymer 44:225, Merrill et al., pat. de EE.UU. nº 5.171.264; Shearwater Polymers Inc., Huntsville AL), dendrímeros y polisacáridos.
Los dendrímeros se conocen en la técnica, y son moléculas globulares químicamente definidas, en general se preparan mediante reacción por etapas o reiterativa de monómeros multifuncionales para obtener una estructura ramificada (véase, p.ej., Tomalia et al., 1990, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-75). Se conoce una diversidad de dendrímeros, p.ej., dendrímeros de poliamidoamina terminados en amina, polietilenimina y polipropilenimina. Los dendrímeros ejemplares útiles en la presente invención incluyen polímeros en forma de "estrella densa" o polímeros "Starburst" tales como los descritos en las pat. de EE.UU. Nºs 4.587.329; 5.338.532; y 6.177.414, que incluyen los denominados "dendrímeros poli(amidoamina) ("PAMAM")". Aún otras moléculas espaciadoras multiméricas adecuadas para el uso en la presente invención incluyen las moléculas plataforma de valencia químicamente definidas, no poliméricas, tales como las descritas en la patente de EE.UU. 5.552.391; y las solicitudes PCT PCT/US00/15968 (publicada como el documento WO 00/75105); PCT/US96/09976 (publicada como el documento WO 96/40197), PCT/US97/10075 (publicada como el documento WO 97/46251); PCT/US94/10031 (publicada como el documento WO 95/07073); y PCT/US99/29339 (publicada como el documento WO 00/34231). Se pueden usar muchos otros espaciadores multivalentes adecuados, y serán conocidos para los expertos en la técnica.
La conjugación de un resto de ácido nucleico a una molécula plataforma se puede llevar a cabo de cualquier número de maneras, y en general implica uno o más agentes de reticulación y grupos funcionales del resto de ácido nucleico y de la molécula plataforma. Los grupos de unión se añaden a las plataformas mediante el uso de las técnicas de química sintética habituales. Los grupos de unión se pueden añadir a los restos de ácido nucleico mediante el uso de las técnicas sintéticas habituales.
Los espaciadores multivalentes con una diversidad de valencias son útiles en la práctica de la invención, y en diversas realizaciones el espaciador multivalente de un CIQ se une a entre alrededor de 3 y alrededor de 400 restos de ácido nucleico, a veces alrededor de 100 a alrededor de 500, a veces alrededor de 150 a alrededor de 250, a veces 3-200, a veces de 3 a 100, a veces de 3-50, con frecuencia de 3-10, y a veces más de 400 restos de ácido nucleico. En diversas realizaciones, el espaciador multivalente se conjuga a más de 10, más de 25, más de 50, más de 100 o más de 500 restos de ácido nucleico (que pueden ser iguales o diferentes). Se apreciará que, en ciertas realizaciones en las que un CIQ comprende un espaciador multivalente, la invención proporciona una población de CIQs con estructuras moleculares ligeramente diferentes. Por ejemplo, cuando un CIQ se prepara mediante el uso de un dendrímero, polisacárido u otro espaciador multivalente con una valencia elevada, se produce una mezcla de moléculas algo heterogénea, es decir, que comprende números diferentes (dentro o predominantemente dentro de un intervalo determinable) de restos de ácido nucleico unidos al resto espaciador multivalente. Cuando se usa un dendrímero, polisacárido o similar como elemento de un espaciador multivalente, los restos de ácido nucleico pueden estar unidos directamente o indirectamente al elemento (p.ej., dendrímero). Por ejemplo, un CIQ puede comprender restos de ácido nucleico unidos a un dendrímero por medio de un elemento de oligoetilenglicol (en el que el dendrímero + oligoetilenglicol constituye el resto espaciador). Se reconocerá que los restos de ácido nucleico pueden estar conjugados a más de un resto espaciador, como se describe en § III(1)B, anteriormente.
Se pueden usar polisacáridos derivatizados para permitir la unión a restos de ácido nucleico como espaciadores multivalentes en los CIQs. Los polisacáridos adecuados pueden ser polisacáridos naturales o polisacáridos sintéticos. Los polisacáridos ejemplares incluyen, p.ej., dextrano, manina, quitosano, agarosa, y almidón. Se puede usar manina, por ejemplo, porque hay receptores de manina (manosa) en los tipos celulares inmunológicamente relevantes, tales como monocitos y macrófagos alveolares, y así el resto espaciador de polisacárido se puede usar para seleccionar como objetivo tipos celulares particulares. En una realización, el polisacárido está reticulado. Un compuesto adecuado es sacarosa reticulada con epiclorohidrina (p.ej., FICOLL®). Se sintetiza FICOLL® reticulando sacarosa con epiclorohidrina, lo que da como resultado una estructura sumamente ramificada. Por ejemplo, tal como se muestra en el Ejemplo 49, se puede preparar aminoetilcarboximetil-ficoll (AECM-Ficoll) mediante el método de Inman, 1975, J. Imm. 114:704-709. El número de restos de ácido nucleico en un CIQ que comprende un polisacárido puede ser cualquier intervalo descrito en la presente memoria para un CIQ (p.ej., un CIQ multivalente). Por ejemplo, en una realización, el polisacárido comprende entre alrededor de 150 y alrededor de 250 restos de ácido nucleico. AECM-Ficoll se puede hacer reaccionar después con un reactivo de reticulación heterobifuncional, tal como éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 6-maleimido-caproico, y después se puede conjugar con un resto de ácido nucleico derivatizado con tiol (véase Lee, et al., 1980, Mol. Imm. 17:749-56). Otros polisacáridos se pueden modificar de forma similar.
5. Síntesis de CIQs
Estará dentro de la capacidad de un experto, guiado por esta memoria descriptiva y el conocimiento de la técnica, la preparación de CIQs mediante el uso de métodos rutinarios. Se conocen las técnicas para producir restos de ácido nucleico (p.ej., oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados). Se pueden sintetizar restos de ácido nucleico mediante el uso de técnicas que incluyen, pero sin limitación, métodos enzimáticos y métodos químicos y combinaciones de aproximaciones enzimáticas y químicas. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente ADN o
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ARN que contiene uniones fosfodiéster acoplando secuencialmente la fosforamidita del nucleósido adecuado al grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido en crecimiento unido a un soporte sólido en el extremo 3', seguido de oxidación del intermedio de triéster de fosfito hasta un triéster de fosfato. Los soportes sólidos útiles para la síntesis de ADN incluyen vidrio de poro controlado (Applied Biosystems, Foster City, CA), matriz de microesferas de poliestireno (Primer Support, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) y TentGel (Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Alemania). Una vez que se ha sintetizado la secuencia oligonucleotídica deseada, el oligonucleótido se retira del soporte, los grupos triéster de fosfato se desprotegen hasta diésteres de fosfato y las bases de nucleósidos se desprotegen mediante el uso de amoniaco acuso u otras bases.
Por ejemplo, se sintetizan en general polinucleótidos de ADN o ARN (restos de ácido nucleico) que contienen uniones fosfodiéster mediante iteraciones repetitivas de las etapas siguientes: a) eliminación del grupo protector del grupo 5'-hidroxilo del nucleósido o ácido nucleico unido al soporte sólido en 3', b) acoplamiento de la fosforamidita del nucleósido activado al grupo 5'-hidroxilo, c) oxidación del triéster de fosfito hasta el triéster de fosfato, y d) bloqueo de los grupos 5'-hidroxilo sin reaccionar. Se prepara ADN o ARN que contiene uniones fosforotioato como se describió anteriormente, excepto porque la etapa de oxidación se sustituye por una etapa de sulfuración. Una vez que se ha sintetizado la secuencia oligonucleotídica deseada, el oligonucleótido se retira del soporte, los grupos triéster de fosfato se desprotegen hasta diésteres de fosfato y las bases de nucleósidos se desprotegen mediante el uso de amoniaco acuso u otras bases. Véase, por ejemplo, Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" en PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS, SYNTHESIS AND PROPERTIES (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3:401; Tang et al. (2000) Org. Process Res. Dev. 4:194-198; Wyrzykiewica et al. (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4:1519-1522; Radhakrishna et al. (1989) J. Org. Chem. 55:4693-4699, y la patente de EE.UU. Nº 4.458.066. Hay disponibles aparatos programables que sintetizan automáticamente restos de ácido nucleico de secuencias especificadas. Los ejemplos incluyen el sintetizador de ADN automatizado Expedite 8909 (Perseptive Biosystem, Framington MA); el ABI 394 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA); y el OligoPilot II (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Los polinucleótidos se pueden ensamblar en la dirección 3' a 5', p.ej., mediante el uso de nucleósidos con bases protegidas (monómeros) que contienen un grupo protector en 5' sensible a ácidos y una 3'-fosforamidita. Los ejemplos de tales monómeros incluyen 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-nucleósido protegido-3'-O-(N,N-diisopropilamino) 2cianoetil fosforamidita, en los que los ejemplos de los nucleósidos protegidos incluyen, pero sin limitación, N6benzoiladenosina, N4-benzoilcitidina, N2-isobutirilguanosina, timidina, y uridina. En este caso, el soporte sólido usado contiene un nucleósido protegido unido por 3'. De manera alternativa, los polinucleótidos se pueden ensamblar en la dirección 5' a 3' mediante el uso de nucleósidos con bases protegidas que contienen un grupo protector en 3' sensible a los ácidos y una 5'-fosforamidita. Los ejemplos de tales monómeros incluyen 3'-O-(4,4'dimetoxitritil)-nucleósido protegido-5'-O-(N,N-diisopropilamino) 2-cianoetil fosforamidita, en los que los ejemplos de los nucleósidos protegidos incluyen, pero sin limitación, N6-benzoiladenosina, N4-benzoilcitidina, N2isobutirilguanosina, timidina, y uridina (Glen Research, Sterling, VA). En este caso, el soporte sólido usado contiene un nucleósido protegido unido por 5'. Se pueden aislar componentes de ácido nucleico circular, sintetizarlos por medio de métodos recombinantes, o sintetizarlos químicamente. La síntesis química se puede llevar a cabo mediante el uso de cualquier método descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029 y Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333.
La conjugación de los restos de ácido nucleico y los restos espaciadores se puede llevar a cabo de una diversidad de maneras, dependiendo del CIQ particular a preparar. Los métodos para la adición de restos espaciadores particulares se conocen en la técnica y, por ejemplo, se describen en las referencias citadas anteriormente. Véase, p.ej., Durand et al., Nucleic Acids Research 18:6353-59 (1990). La unión covalente entre un resto espaciador y un resto de ácido nucleico puede ser cualquiera de varios tipos, que incluyen las uniones fosfodiéster, fosforotioato, amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, fosforamidato, fosfotriéster, fosforoditioato, metil fosfonato y otras. Como se indicó anteriormente, los precursores del resto espaciador se pueden modificar opcionalmente con grupos activantes terminales para el acoplamiento a los ácidos nucleicos. Los ejemplos de restos espaciadores activados se pueden observar en la Figura 1, en la que se han añadido grupos protectores adecuados para la síntesis automatizada. Otros precursores del resto espaciador incluyen, por ejemplo y sin limitación, (1) HOCH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2OH, en la que n= 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ó 45 o es mayor de 45;
(2) HOCH2CHOHCH2OH; (3) HO(CH2)nOH, en la que n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o 11.
En una realización, se usa un precursor del resto espaciador que incluye primeros y segundos grupos reactivos para permitir la conjugación a restos de ácido nucleico por etapas, en el que el primer grupo reactivo tiene la propiedad de poderse acoplar de manera eficaz al extremo de una cadena en crecimiento de ácidos nucleicos, y el segundo grupo reactivo es capaz de prolongar adicionalmente, por etapas, la cadena en crecimiento de restos nucleotídicos y no nucleotídicos mezclados en el CIQ. A menudo será conveniente combinar uno/varios resto(s) espaciador(es) y uno/varios resto(s) de ácido nucleico mediante el uso de la misma química de tipo fosforamidita usada para la síntesis del resto de ácido nucleico. Por ejemplo, los CIQs de la invención se pueden sintetizar de manera conveniente mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (p.ej., Expedite 8909; Perseptive Biosystems, Framington, MA) mediante el uso de la química de fosforamidita (véase, p.ej., Beaucage, 1993, anteriormente mencionado; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, anteriormente mencionado). Sin embargo, un experto entenderá que las mismas etapas de síntesis (o equivalentes) llevadas a cabo mediante un sintetizador de ADN
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automatizado también se pueden llevar a cabo manualmente, si se desea. La unión resultante entre el ácido nucleico y los precursores del espaciador pueden ser una unión fosforotioato o fosfodiéster. En tal síntesis, en general, un extremo del espaciador (o subunidad del espaciador para los espaciadores multiméricos) se protege con un grupo 4,4'-dimetiloxitritilo, mientras el otro extremo contiene un grupo fosforamidita.
Hay disponible comercialmente una diversidad de espaciadores con grupos protectores y reactivos útiles, por ejemplo:
espaciador de trietilen glicol o "espaciador TEG" 9-O-(4,4'-dimetoxitritil)trietilenglicol-1-O-[(2-cianoetil) N,Ndiisopropilfosforamidita] (Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, VA);
espaciador de hexaetilen glicol o "espaciador HEG" 18-O-(4,4'-dimetoxitritil)hexaetilenglicol-1-O-[(2-cianoetil) N,Ndiisopropilfosforamidita] (Glen Research, Sterling, VA);
espaciador de propilo 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propiloxi-1-O-[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Glen Research, Sterling, VA);
espaciador de butilo 4-(4,4'-dimetoxitritiloxi)butiloxi-1-O-[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Chem Genes Corporation, Ashland Technology Center, 200 Homer Ave, Ashland, MA);
espaciador de hexilo: 6-(4,4'-dimetoxitritiloxi)hexiloxi-1-O-[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Biosearch Technologies, Novoto, CA)
espaciador de 2-(hidroximetil)etilo o "espaciador HME" 1-(4,4'-dimetoxitritiloxi)-3-(levuliniloxi)-propiloxi-2-O-[(2cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita]; también denominado espaciador "ramificado asimétrico" (véase la Fig. 2) (Chem Genes Corp., Ashland Technology Center, Ashland MA.);
"espaciador nucleotídico abásico" o "espaciador abásico" 5-O-(4,4'-dimetoxitritil)-1,2-didesoxirribosa-3-O-[(2cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Glen Research, Sterling, VA);
"espaciador ramificado simétrico" o "espaciador de glicerol" 1,3-O,O-bis(4,4'-dimetoxitritil)glicerol-2-O-[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Chem Genes, Ashland, MA) (véase la Fig. 2);
"espaciador triplicador" (véase la Fig. 2) 2,2,2-O,O,O-tris[3-O-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propiloximetil]etil-1-O-[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Glen Research, Sterling, VA);
"espaciador doblador simétrico" (véase la Fig. 2) 1,3-O,O-bis[5-O-(4,4'-dimetoxitritiloxi)pentilamido]propil-2-O-[(2cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Glen Research, Sterling, VA);
"espaciador de dodecilo" 12-(4,4'-dimetoxitritiloxi)dodeciloxi-1-O-[(2-cianoetil) N,N-diisopropilfosforamidita] (Glen Research, Sterling, VA).
Estos y una gran diversidad de otros precursores de restos espaciadores protegidos (p.ej., que comprenden grupos protectores de grupos DMT y fosforamidita) se pueden adquirir o se pueden sintetizar mediante el uso de métodos rutinarios para el uso en la preparación de los CIQs descritos en la presente memoria. El instrumento se programa según las instrucciones del fabricante para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores en el orden deseado.
Los CIQs preparados "in situ" en un sintetizador de ADN requieren monómeros de nucleósidos protegidos y de espaciadores protegidos, y ambos contienen grupos funcionales reactivos o activables. La forma reactiva y/o protegida del resto espaciador se puede describir como un "componente de un precursor del espaciador". Los expertos en la técnica apreciarán que los grupos reactivos de los precursores de espaciadores forman uniones estables tras el acoplamiento, y los grupos protectores del precursor de espaciador se eliminan del resto espaciador resultante del CIQ. Los grupos protectores se eliminan en general durante la síntesis por etapas del CIQ, para permitir la reacción en ese sitio. En los casos en los que haya grupos protectores en grupos reactivos adicionales, los grupos protectores se eliminan tras la síntesis por etapas del CIQ (tal como el grupo levulinilo en el precursor de espaciador mostrado en la Figura 2, estructura 3, usado para producir C-25).
Un ejemplo de un precursor de espaciador sin ninguna funcionalidad reactiva adicional es 18-O-(4,4'dimetoxitritil)hexaetilenglicol-1-O-[(2-cianoetil)N,N-diisopropilfosforamidita], que contiene un grupo protector, el grupo 4,4'-dimetoxitritilo, y un grupo reactivo, el grupo (2-cianoetil)N,N-diisopropilfosforamidita. Durante la preparación del CIQ mediante el uso de la química de fosforamidita en un sintetizador de ADN, el grupo (2-cianoetil)N,Ndiisopropilfosforamidita del precursor de espaciador se activa mediante un ácido débil, tal como 1H-tetrazol, y se hace reaccionar con el 5'-hidroxilo libre del resto de ácido nucleico con la nucleobase protegida para formar un triéster de fosfito. El grupo triéster de fosfito se oxida o se sulfura después hasta un grupo fosfotriéster o triéster de fosforotioato estable, respectivamente. El grupo triéster resultante es estable durante el resto de la síntesis de CIQ, y permanece en esa forma hasta la desprotección final. Para acoplar otro precursor de espaciador o un monómero de nucleósido activado, que se convertirá en parte del siguiente resto de ácido nucleico, se elimina el grupo 4,4'dimetoxitritilo del precursor de espaciador. Después del acoplamiento y la oxidación o sulfuración, este grupo
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también se convierte en un grupo fosfotriéster o triéster de fosforotioato estable, respectivamente. Una vez que el CIQ protegido está completamente ensamblado, el CIQ se escinde del soporte sólido, se eliminan los grupos cianoetilo del fosfotriéster o triéster de fosforotioato, y se elimina la protección de las nucleobases. En este ejemplo, el CIQ contiene restos espaciadores que incluyen uniones fosfodiéster o diéster de fosforotioato estables a los restos de ácido nucleico. Tanto el grupo de fosforamidita reactivo como el grupo hidroxilo protegido del precursor de espaciador se convierten en uniones fosfodiéster o diéster de fosforotioato estables en el resto espaciador. Debido a que la reacción de cada extremo del espaciador puede ser independiente, una unión puede ser fosfodiéster y la otra unión diéster de fosforotioato, o cualquier combinación de las mismas. También se pueden preparar de esta manera CIQs con otras modificaciones de fosfatos, tales como fosforoditioato, metil fosfonato, y fosforamidato, mediante el uso de un precursor de espaciador con el grupo reactivo adecuado, los reactivos adicionales correctos, y los protocolos diseñados para ese tipo de unión. Estos protocolos son análogos a los descritos para preparar restos de ácido nucleico con uniones fosfato modificadas.
Aunque el uso de la química de fosforamidita es útil para la preparación de ciertos CIQs, se apreciará que los CIQs de la invención no se limitan a los compuestos preparados mediante cualquier método particular de síntesis o preparación. Por ejemplo, se pueden preparar restos de ácido nucleico que contienen grupos que no son compatibles con la síntesis de ADN y las condiciones de desprotección, tales como (pero sin limitación) hidrazina o maleimida, haciendo reaccionar un resto de ácido nucleico que contiene un enlazador amino con el reactivo de reticulación heterobifuncional adecuado, tal como SHNH (hidrazinionicotinato de succinimidilo) o sulfo-SMCC (4-[Nmaleimidometil]-ciclohexame-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo).
Los métodos para conjugar proteínas, péptidos, oligonucleótidos, y moléculas pequeñas en diversas combinaciones se describen en la bibliografía, y se pueden adaptar para conseguir la conjugación de un resto de ácido nucleico que contiene un grupo de unión reactivo a un precursor de resto espaciador. Véase, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996. En ciertas realizaciones, se sintetiza(n) un/varios resto(s) de ácido nucleico, y se añade un grupo de unión reactivo (p.ej., amino, carboxilato, tiol, disulfuro, y similares) mediante el uso de técnicas de química sintética habituales. El grupo de unión reactivo (que se considera que forma una porción del resto espaciador resultante) se conjuga a compuestos distintos de ácido nucleico adicionales (por ejemplo, sin limitación, un compuesto enumerado en §4, anteriormente) para formar una porción del resto espaciador. Se añaden grupos de unión reactivos a ácidos nucleicos mediante el uso de métodos habituales para la síntesis de ácidos nucleicos, mediante el empleo de una diversidad de reactivos conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen reactivos que contienen un grupo amino protegido, grupo carboxilato, grupo tiol, grupo disulfuro, grupo aldehído, grupo diol, grupo dieno y un grupo fosforamidita. Una vez que estos compuestos se incorporan a los ácidos nucleicos, por medio del grupo fosforamidita activado, y se desprotegen, proporcionan ácidos nucleicos con reactividad de amino, carboxilato, aldehído, diol, dieno o tiol. Los ejemplos de grupos reactivos para conjugar un resto de ácido nucleico que contiene un grupo enlazador reactivo a un precursor de resto espaciador que contiene un grupo reactivo se muestran a continuación.
Grupo reactivo del ácido Grupo reactivo del precursor de resto Unión estable formada
nucleico espaciador
tiol
maleimida, haloacetilo tioéter
maleimida
tiol tioéter
tiol
disulfuro de piridina disulfuro
disulfuro de piridina
tiol disulfuro
amina
NHS u otro éster activo amida
amina
carboxilato amida
carboxilato
Amina amida
aldehído, cetona
hidrazina, hidrazida hidrazona, hidrazida
hidrazina, hidrazida
aldehído, cetona hidrazona, hidrazida
dieno
dienófilo alifático o anillo heterocíclico

El grupo de unión reactivo y el precursor del espaciador reaccionan para formar un enlace estable y todo el grupo de átomos entre los dos (o más) restos de ácido nucleico se define como el resto espaciador. Por ejemplo, un resto de ácido nucleico sintetizado con un grupo mercaptohexilo unido al resto de ácido nucleico por medio de un grupo fosforotioato se puede hacer reaccionar con un precursor de espaciador que contiene uno (o más) grupo(s) maleimida, por lo que se forma una/varias unión(es) tioéter. El resto espaciador de este CIQ incluye el grupo fosforotioato y el grupo hexilo del enlazador en el resto de ácido nucleico, la nueva unión tioéter, y el resto del espaciador que fue parte del precursor del espaciador.
Aunque se pueden producir CIQs lineales mediante el uso de estas estrategias de conjugación, estos métodos se
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aplican más a menudo para la preparación de CIQs ramificados. Además, se pueden preparar moléculas de precursor de espaciador con varios grupos reactivos ortogonales para permitir la adición de más de un tipo de resto de ácido nucleico (p.ej., un motivo de secuencia diferente).
En una realización, se preparan CIQs con espaciadores multivalentes conjugados a más de un tipo de resto de ácido nucleico. Por ejemplo, se han descrito plataformas que contienen dos grupos maleimida (que pueden reaccionar con polinucleótidos que contienen tiol), y dos grupos éster activados (que pueden reaccionar con ácidos nucleicos que contienen amino) (véase, p.ej., el documento PCT/US94/10031, publicado como WO 95/07073). Estos dos grupos activados se pueden hacer reaccionar independientemente el uno del otro. Esto daría como resultado un CIQ que contiene un total de 4 restos de ácido nucleico, dos de cada secuencia.
También se pueden preparar CIQs con espaciadores multivalentes que contienen dos secuencias de ácido nucleico diferentes mediante el uso del espaciador ramificado simétrico, descrito anteriormente, y la química de fosforamidita convencional (p.ej., mediante el uso de métodos manuales o automatizados). El espaciador ramificado simétrico contiene un grupo fosforamidita y dos grupos protectores que son iguales y se eliminan simultáneamente. En una aproximación, por ejemplo, se sintetiza un primer ácido nucleico y se acopla al espaciador ramificado simétrico, y los grupos protectores se eliminan del espaciador. Después, se sintetizan dos ácidos nucleicos adicionales (de la misma secuencia) en el espaciador (mediante el uso del doble de la cantidad de reactivos usada para la síntesis de un único resto de ácido nucleico en cada etapa). Este procedimiento se describe con detalle en el Ejemplo 15, más adelante.
Se puede usar un método similar para conectar tres restos de ácido nucleico diferentes (denominados más adelante Ácidos nucleicos I, II, y III) a una plataforma multivalente (p.ej., un espaciador ramificado asimétrico). Esto se lleva a cabo de manera muy conveniente mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado. En una realización, el espaciador ramificado asimétrico contiene un grupo fosforamidita y dos grupos protectores ortogonales que se pueden eliminar independientemente. Primero, se sintetiza el ácido nucleico I, después el espaciador ramificado asimétrico se acopla al ácido nucleico I, y después se añade el ácido nucleico II tras la extracción selectiva de uno de los grupos protectores. Se desprotege el ácido nucleico II, y se bloquea, y después se elimina el otro grupo protector del espaciador. Finalmente, se sintetiza el ácido nucleico III. Este procedimiento se describe con detalle en el Ejemplo 17, más adelante.
Son útiles los enlazadores hidrófilos de longitudes variables, por ejemplo para unir restos de ácido nucleico y moléculas plataforma. Se conoce una diversidad de enlazadores adecuados. Los enlazadores adecuados incluyen, sin limitación, oligómeros lineales o polímeros de etilen glicol. Tales enlazadores incluyen enlazadores con la fórmula R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O (CH2)mCO2R2 en la que n = 0-200, m = 1 ó 2, R1 = H o un grupo protector tal como tritilo, R2 = H o alquilo o arilo, p.ej., éster de 4-nitrofenilo. Estos enlazadores son útiles para conectar una molécula que contiene un grupo reactivo tiol tal como haloaceílo, maleiamida, etc., por medio de un tioéter a una segunda molécula que contiene un grupo amino por medio de un enlace amida. El orden de unión puede variar, es decir, el enlace tioéter se puede formar antes o después de haber formado el enlace amida. Otros enlazadores útiles incluyen Sulfo-SMCC (4-[N-maleimidometil]-ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo) Pierce Chemical Co., producto 22322; Sulfo-EMCS (éster de N-[ε-maleimidocaproiloxil sulfosuccinimida) Pierce Chemical Co., producto 22307; Sulfo-GMBS (éster de N-[γ-maleimidobutiriloxi] sulfosuccinimida) Pierce Chemical Co., producto 22324 (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), y compuestos similares de la fórmula general éster de maleimido-R-C(O)NHS, en la que R = alquilo, alquilo cíclico, polímeros de etilen glicol, y similares.
Los métodos especialmente útiles para unir de manera covalente restos de ácido nucleico a espaciadores multivalentes se describen en las referencias citadas anteriormente, y en los ejemplos.
Así, se describe un método para la preparación de un CIQ útil para modular una respuesta inmunitaria en un mamífero uniendo de manera covalente un/varios polinucleótido(s) a un compuesto, por lo que se da como resultado un compuesto quimérico que comprende un resto de ácido nucleico y una región de resto espaciador, y que tiene actividad inmunomoduladora. En diversas realizaciones, la región de ácido nucleico puede tener la estructura y secuencia de cualquier resto de ácido nucleico descrito en la presente memoria, y la región espaciadora puede tener la estructura de cualquier resto espaciador descrito en la presente memoria. A menudo, hay más de una etapa de unión, p.ej., la unión se repite al menos una vez para proporcionar dos polinucleótidos unidos de manera covalente a uno o dos espaciadores, y se repite a menudo al menos dos veces o tres veces. El método comprende además combinar el CIQ con un excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición. En una realización, la composición es estéril, p.ej., adecuada para la administración a un paciente humano, p.ej., fabricada o formulada siguiendo la normativa PCF. En una realización, el CIQ se combina con un microsoporte y/o antígeno, como se describe en la presente memoria. También se contempla que, en ciertas realizaciones, una formulación de CIQ de la invención estará exenta de uno o más de (i) un sistema de dispersión coloidal, (ii) liposomas, (iii) microsoportes, (iv) polipéptidos, (v) antígenos, y (vi) endotoxinas.
6. CIQs proteicos
En ciertas realizaciones, se usa un polipéptido, tal como un antígeno o fragmento de antígeno proteico, como resto espaciador multivalente al que está conjugado de manera covalente una diversidad de restos de ácido nucleico,
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directamente o por medio de enlazadores, para formar un "CIQ proteico". El polipéptido puede ser un antígeno o inmunógeno para el que se desea una respuesta inmunitaria adaptativa, o un vehículo (p.ej., albúmina). En general, un CIQ proteico comprende al menos tres restos de ácido nucleico que (a) tienen una longitud entre 2 y 7, más a menudo entre 4 y 7 nucleótidos, de manera alternativa una longitud entre 2 y 6, 2 y 5, 4 y 6, o 4 y 5 nucleótidos y/o
(b) tienen una actividad inmunomoduladora aislada inferior o no tienen actividad inmunomoduladora aislada. Los métodos para producir un CIQ proteico serán evidentes para un experto tras la revisión de la presente descripción. Un ácido nucleico, por ejemplo, se puede conjugar de manera covalente a un resto espaciador polipeptídico mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen uniones entre un extremo 3' o 5' de un resto de ácido nucleico (o en una base modificada de manera adecuada en una posición interna en un resto de ácido nucleico) y un polipéptido con un grupo reactivo adecuado (p.ej., un éster de N-hidroxisuccinimida, que se puede hacer reaccionar directamente con el grupo amino N4 de los residuos de citosina). Como ejemplo adicional, se puede unir un polipéptido al extremo 5' libre de un resto de ácido nucleico por medio de un grupo amina, tiol, o carboxilo que se ha incorporado en el resto de ácido nucleico. De manera alternativa, el polipéptido se puede conjugar con un resto espaciador, como se describe en la presente memoria. Además, se puede unir de manera covalente un grupo de unión que comprende una amina, tiol, o carboxilo protegido a un extremo, y una fosforamidita a un grupo hidroxilo de un polinucleótido, y, tras la desprotección, la funcionalidad se puede usar para unir de manera covalente el CIQ a un péptido.
7.
Purificación
Los CIQs de la invención se purifican mediante el uso de cualquier medio convencional, tal como cromatografía líquida de alto rendimiento, métodos electroforéticos, cromatografía de afinidad de ácido nucleico, cromatografía de exclusión por tamaños, y cromatografía de intercambio iónico. En ciertas realizaciones, un CIQ es sustancialmente puro, p.ej., al menos alrededor del 80% puro en peso, a menudo al menos alrededor del 90% puro en peso, más a menudo al menos alrededor del 95% puro, muy a menudo al menos alrededor del 85% puro.
8.
Composiciones

En diversas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden uno o más CIQs, (es decir, un único CIQ o una combinación de dos o más CIQs) opcionalmente junto con otro agente inmunomodulador, tal como un péptido, un antígeno (descrito más adelante) y/o un adyuvante adicional. Las composiciones de la invención pueden comprender un CIQ y un excipiente farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, y no perjudicial para el receptor del mismo. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica, e incluyen agua estéril, soluciones isotónicas tales como solución salina y solución salina tamponada con fosfato, y otros excipientes conocidos en la técnica. Véase, p.ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19ª edición, 1995, Gennavo, ed.). Los adyuvantes (por ejemplo, alumbre) se conocen en la técnica. Se pueden preparar formulaciones de CIQ con otros agentes inmunoterapéuticos, tales como citocinas y anticuerpos. En ciertas realizaciones, la composición es isotónica y/o estéril, p.ej., adecuada para la administración a un paciente humano, p.ej., se fabrica o se formula siguiendo la normativa PCF.
A. Complejos CIQ/MS
Los CIQs se pueden administrar en forma de complejos CIQ/microsoporte (CIQ/MS). Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden complejos CIQ/MS.
Los complejos CIQ/MS comprenden un CIQ unido a la superficie de un microsoporte (es decir, el CIQ no está encapsulado en el MS), y preferiblemente comprenden múltiples moléculas de CIQ unidas a cada microsoporte. En ciertas realizaciones, una mezcla de diferentes CIQs se pueden complejar con un microsoporte, de forma que el microsoporte está unido a más de una especie de CIQ. El enlace entre el CIQ y MS puede ser covalente o no covalente (p.ej., mediado por interacciones iónicas y/o hidrófobas). Como entenderá un experto en la técnica, el CIQ se puede modificar o derivatizar, y la composición del microsoporte se puede seleccionar y/o modificarla para adaptarse al tipo deseado de unión deseada para la formación del complejo CIQ/MS.
Los complejos CIQ/MS unidos de manera covalente se pueden unir mediante el uso de cualquier tecnología de reticulación covalente conocida en la técnica. En general, la porción de CIQ se modificará para incorporar un resto adicional (p.ej., un grupo amina, carboxilo o sulfhidrilo libre) o para incorporar bases nucleotídicas modificadas (p.ej., fosforotioato) para proporcionar un sitio en el que se pueda unir la porción de CIQ al microsoporte. La unión entre las porciones de CIQ y MS del complejo se puede hacer en el extremo 3' o 5' del CIQ, o en una base modificada de manera adecuada en una posición interna del CIQ. El microsoporte también se modifica en general para incorporar restos a través de los cuales se puede formar un enlace covalente, aunque también se pueden utilizar los grupos funcionales presentes normalmente en el microsoporte. El CIQ/MS se forma incubando el CIQ con un microsoporte en condiciones que permiten la formación de un complejo covalente (p.ej., en presencia de un agente de reticulación
o mediante el uso de un microsoporte activado que comprende un resto activado que formará un enlace covalente con el CIQ).
Se conoce una amplia diversidad de tecnologías de reticulación en la técnica, e incluyen moléculas de reticulación
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reactivas con grupos amino, carboxilo y sulfhidrilo. Como será evidente para un experto en la técnica, la selección de un agente de reticulación y del protocolo de reticulación dependerá de la configuración del CIQ y el microsoporte, así como de la configuración final deseada del complejo CIQ/MS. El reticulador puede ser homobifuncional o heterobifuncional. Cuando se usa un reticulador homobifuncional, el reticulador aprovecha el mismo resto del CIQ y MS (p.ej., se puede usar un reticulador de aldehído para unir de manera covalente un CIQ y MS en los que tanto el CIQ como el MS comprenden una o más aminas libres). Los reticuladores heterobifuncional utilizan restos diferentes del CIQ y MS, (p.ej., se puede usar un éster de maleimido-N-hidroxisuccinimida para unir de manera covalente un sulfhidrilo libre del CIQ y una amina libre del MS), y se prefieren para minimizar la formación de enlaces intermicrosoporte. En la mayoría de los casos, es preferible reticular a través de un primer resto de reticulación del microsoporte y un segundo resto de reticulación del CIQ, en los que el segundo resto de reticulación no está presente en el microsoporte. Un método preferido para producir el complejo CIQ/MS es "activando" el microsoporte mediante incubación con un agente de reticulación heterobifuncional, después formando el complejo CIQ/MS incubando el CIQ y el MS activado en condiciones adecuadas para la reacción. El reticulador puede incorporar un brazo "espaciador" entre los restos reactivos, o los dos restos reactivos del reticulador pueden estar unidos directamente.
En una realización preferida, la porción de CIQ comprende al menos un sulfhidrilo libre (p.ej., proporcionado por una base o enlazador modificado en 5'-tiol) para la reticulación con el microsoporte, mientras el microsoporte comprende grupos amino libres. Se usa un reticulador heterobifuncional reactivo con estos dos grupos (p.ej., un reticulador que comprende un grupo maleimida y un NHS-éster), tal como 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo para activar el MS, y después ser reticula de manera covalente el CIQ para formar el complejo CIQ/MS.
Los complejos CIQ/MS no covalentes pueden estar unidos por cualquier unión o interacción no covalente, que incluye los enlaces iónicos (electroestáticos), interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, atracciones de van der Waals, o una combinación de dos o más interacciones diferentes, como es el caso normalmente cuando un par de unión es para unir el CIQ y el MS.
Los complejos CIQ/MS no covalentes preferidos se complejan en general mediante interacciones hidrófobas o electroestáticas (iónicas), o una combinación de las mismas, (p.ej., por medio del emparejamiento de bases entre un CIQ y un polinucleótido unido a un MS). Debido a la naturaleza hidrófila del esqueleto de polinucleótidos, los complejos CIQ/MS que se basan en las interacciones hidrófobas para formar el complejo requieren en general la modificación de la porción de CIQ del complejo para incorporar un resto muy hidrófobo. Preferiblemente, el resto hidrófobo es biocompatible, no inmunógeno, y se da de manera natural en el individuo al que se destina la composición (p.ej., se halla en mamíferos, en particular seres humanos). Los ejemplos de restos hidrófobos preferidos incluyen lípidos, esteroides, esteroles tales como colesterol, y terpenos. El método de unión del resto hidrófobo al CIQ dependerá, por supuesto, de la configuración del CIQ y la identidad del resto hidrófobo. El resto hidrófobo se puede añadir en cualquier sitio conveniente del CIQ, preferiblemente en el extremo 5' o 3'; en el caso de la adición de un resto de colesterol a un CIQ, el resto de colesterol se añade preferiblemente en el extremo 5' del CIQ, mediante el uso de reacciones químicas convencionales (véase, por ejemplo, Godard et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410). Preferiblemente, los microsoportes para el uso en los complejos CIQ/MS unidos mediante enlaces hidrófobos están hechos de materiales hidrófobos, tales como gotículas de aceite o polímeros hidrófobos, aunque también se pueden utilizar materiales hidrófilos modificados para incorporar restos hidrófobos. Cuando el microsoporte es un liposoma u otro microsoporte de fase líquida que comprende un espacio interior, el complejo CIQ/MS se forma mezclando el CIQ y el MS tras la preparación del MS, para evitar la encapsulación del CIQ durante el procedimiento de preparación del MS.
Los complejos CIQ/MS no covalentes unidos mediante unión electrostática aprovechan en general la carga muy negativa del esqueleto del polinucleótido. Por lo tanto, los microsoportes para el uso en complejos CIQ/MS unidos de manera no covalente en general están cargados positivamente a pH fisiológico (p.ej., alrededor de pH 6,8-7,4). El microsoporte puede poseer intrínsecamente una carga positiva, pero los microsoportes hechos de compuestos que normalmente no poseen una carga positiva se pueden derivatizar o modificar de otra manera para pasar a estar cargados positivamente. Por ejemplo, el polímero usado para producir el microsoporte se puede derivatizar para añadir grupos cargados positivamente, tales como aminas primarias. De manera alternativa, se pueden incorporar compuestos cargados positivamente en la formulación del microsoporte durante la fabricación (p.ej., se pueden usar tensioactivos cargados positivamente durante la fabricación de copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico) para conferir una carga positiva a las partículas del microsoporte resultante). Véanse, p.ej., los Ejemplos 28 y 34, más adelante.
Se pueden producir complejos CIQ/MS no covalentes unidos mediante emparejamiento de bases nucleotídicas mediante el uso de metodologías convencionales. En general, se producen complejos CIQ/MS con emparejamiento de bases mediante el uso de un microsoporte que comprende un polinucleótido, preferiblemente unido de manera covalente (el "polinucleótido de captura"), que es al menos parcialmente complementario al CIQ. El segmento de complementariedad entre el CIQ y el nucleótido de captura es de preferiblemente al menos 6, 8, 10 ó 15 pares de bases contiguas, más preferiblemente al menos 20 pares de bases contiguas. El nucleótido de captura se puede unir al MS mediante cualquier método conocido en la técnica, y preferiblemente se une de manera covalente al CIQ en el extremo 5' o 3'.
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En otras realizaciones, se puede usar un par de unión para unir el CIQ y MS en un complejo CIQ/MS. El par de unión puede ser un receptor y un ligando, un anticuerpo y un antígeno (o epítopo), o cualquier otro par de unión que se una con una afinidad elevada (p.ej., Kd menor de alrededor de 10-8). Un tipo de par de unión preferido es biotina y estreptavidina o biotina y avidina, que forman complejos muy fuertes. Cuando se usa un par de unión para mediar en la unión de complejos CIQ/MS, el CIQ se derivatiza, en general mediante una unión covalente, con un miembro del par de unión, y el MS se derivatiza con el otro miembro del par de unión. La mezcla de los dos compuestos derivatizados da como resultado la formación del complejo CIQ/MS.
Muchas realizaciones del complejo CIQ/MS no incluyen un antígeno, y ciertas realizaciones excluyen antígeno(s) asociado(s) a la enfermedad o el trastorno que es el objetivo de la terapia con el complejo CIQ/MS. En realizaciones adicionales, el CIQ también está unido a una o más moléculas de antígeno. El antígeno se puede acoplar a la porción de CIQ de un complejo CIQ/MS de una diversidad de maneras, que incluyen las interacciones covalentes y/o no covalentes. De manera alternativa, el antígeno se puede unir al microsoporte. La unión entre el antígeno y el CIQ en los complejos CIQ/MS que comprenden un antígeno unido al CIQ se puede hacer mediante los métodos descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica.
B. Antígeno Coadministrado
En ciertas realizaciones, el CIQ se coadministra con un antígeno. Se puede coadministrar cualquier antígeno con un CIQ y/o usarlo para la preparación de composiciones que comprenden un CIQ y un antígeno.
En ciertas realizaciones, el antígeno es un alérgeno. Los ejemplos de alérgenos recombinantes se proporcionan en la Tabla 1. La preparación de muchos alérgenos se conoce bien en la técnica, lo que incluye, pero sin limitación, la preparación de Antígeno E de alérgeno de polen de ambrosía (Amb aI) (Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229-1236), alérgeno de hierba Lol p 1 (Tamborini et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249:886-894), alérgenos principales de los ácaros del polvo Der pI y Der PII (Chua et al. (1988) J. Exp. Med. 167:175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129), alérgeno de gato doméstico Fel d I (Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30:559-568), polen de abedul Bet v1 (Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8:1935-1938), alérgenos de cedro japonés Cry j 1 y Cry j 2 (Kingetsu et al. (2000) Immunology 99:625-629), y antígenos proteicos de otros pólenes de árboles (Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Supl. 204:17-31). Se ha informado de la preparación de antígenos proteicos de polen de hierba para la administración in vivo.
En ciertas realizaciones, el alérgeno es un alérgeno de los alimentos, lo que incluye, pero sin limitación, el alérgeno de cacahuete, por ejemplo Ara h I (Stanley et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409:213-216); alérgeno de nuez, por ejemplo, Jug r I (Tueber et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101:807-814); alérgeno de la nuez de Brasil, por ejemplo, albúmina (Pastorello et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:1021-1027; alérgeno de gamba, por ejemplo, Pen a I (Reese et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:240-242); alérgeno de huevo, por ejemplo, ovomucoide (Crooke et al. (1997) J. Immunol. 159:2026-2032); alérgeno de leche, por ejemplo, β-lactoglobina bovina (Selot al. (1999) Clin. Exp. Allergy 29:1055-1063); alérgeno de peces, por ejemplo, parvalbúminas (Van Do et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:619-625; Galland et al. (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706:63-71). En ciertas realizaciones, el alérgeno es un alérgeno del látex, que incluye, pero sin limitación, Hev b 7 (Sowka et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255:213-219). La Tabla 1 muestra una lista de alérgenos que se pueden usar.
Tabla 1
Alérgenos recombinantes
Grupo
Alérgeno Referencia
Animales:
Crustáceos
Gamba/langosta
tropomiosina Pan s I Leung et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 98:954-961 Leung et al. (1998) Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 7:12-20
Insectos
Hormiga
Sol i 2 (veneno) Schmidt et al. J Allergy Clin Immunol., 1996, 98:82-8
Abeja
Fosfolipasa A2 (PLA) Hialuronidasa (Hya) Muller et al. J Allergy Clin Immunol, 1995, 96:395-402 Forster et al. J Allergy Clin Immunol, 1995, 95:1229-35 Muller et al. Clin Exp Allergy, 1997, 27:915-20 Soldatova et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:691-8

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Grupo
Alérgeno Referencia
Cucaracha
Bla g Bd9OK Bla g 4 (calicina a) Glutation S-transferasa Per a 3 Helm et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:172-180 Vailes et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:274-280 Arruda et al. J Biol Chem, 1997, 272:20907-12 Wu et al. Mol Immunol, 1997, 34:1-8
Ácaro del polvo
Der p 2 (alérgeno principal) variante Der p2 Der f2 Der p10 Tyr p2 Lynch et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:562-4 Hakkaart et al. Clin Exp Allergy, 1998, 28:169-74 Hakkaart et al. Clin Exp Allergy, 1998, 28:45-52 Hakkaart et al. Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115 (2):1 150-6 Mueller et al. J Biol Chem, 1997, 272:26893-8 Smith et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:423-5 Yasue et al. Clin Exp Immunol, 1998, 113:1-9 Yasue et al. Cell Immunol, 1997, 181:30-7 Asturias et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1397:27-30 Eriksson et al. Eur J Biochem, 1998
Avispón
Antígeno 5, también Dol m V (veneno) Tomalski et al. Arch Insect Biochem Physiol, 1993, 22:303-13
Mosquito
Aed a I (apirasa salivar) Xu et al. Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115:245-51
Avispa
antígeno 5, hialuronidasa y fosfolipasa (veneno) King et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:588-600
Mamíferos
Gato
Fel d I Slunt et al. J Allergy Clin Immunol, 1995, 95:1221-8 Hoffmann et al. (1997) J Allergy Clin Immunol 99:227-32 Hedlin Curr Opin Pediatr, 1995, 7:676-82
Vaca
Bos d 2 (dander; una lipocalina) β-lactoglobulina (BLG, alérgeno principal de la leche de vaca) Zeiler et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:721-7 Rautiainen et al. Biochem Bioph. Res Comm., 1998, 247:74650 Chatel et al. Mol Immunol, 1996, 33:1113-8 Lehrer et al. Crit Rev Food Sci Nutr, 1996, 36:553-64
Perro
Can f I y Can f 2, lipocalinas salivares Konieczny et al. Immunology, 1997, 92:577-86 Spitzauer et al. J Allergy Clin Immunol, 1994, 93:614-27 Vrtala et al. J Immunol, 1998, 160:6137-44
Caballo
Equ c 1 (alérgeno principal, una lipocalina) Gregoire et al. J Biol Chem, 1996, 271:32951-9

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Grupo
Alérgeno Referencia
Ratón
proteína urinaria de ratón (MUP) Konieczny et al. Immunology, 1997, 92:577-86
Otros alérgenos de mamíferos
Insulina
Ganz et al. J Allergy Clin Immunol, 1990, 86:45-51 Grammer et al. J Lab Clin Med, 1987, 109:141-6 Gonzalo et al. Allergy, 1998, 53:106-7
Interferones
interferón alfa 2c Detmar et al. Contact Dermatis, 1989, 20:149-50
Moluscos
topomiosina Leung et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:954-61
Alérgenos vegetales:
Cebada
Hor v 9 Astwood et al. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:269-77
Abedul
alérgeno del polen, Bet v 4 rBet v 1 Bet v 2: (profilina) Twardosz et al. Biochem Bioph. Res Comm., 1997, 23 9:197 Pauli et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 97:1100-9 van Neerven et al. Clin Exp Allergy, 1998, 28:423-33 Jahn-Schmid et al. Immunotechnology, 1996, 2:103-13 Breitwieser et al. Biotechniques, 1996, 21:918-25 Fuchs et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:3 56-64
Nuez de Brasil
globulina Bartolome et al. Allergol Immunopathol, 1997,25:135-44
Cereza
Pru a I (alérgeno principal) Scheurer et al. Mol Immunol, 1997, 34:619-29
Maíz
Zm13 (polen) Heiss et al. FEBS Lett, 1996, 381:217-21 Lehrer et al. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 113:122-4
Hierba
Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 (polen de Phleum pratense) Hol l 5 polen de Holcus lanatus Alérgeno de pasto azul Cyn d 7 grama Cyn d 12 (una profilina) Bufe et al. Am J Respir Crit Care Med, 1998,157:1269-76 Vrtala et al. J Immunol Jun 15, 1998, 160:6137-44 Niederberger et al. J Allergy Clin Immun., 1998, 101:258-64 Schramm et al. Eur J Biochem, 1998, 252:200-6 Zhang et al. J Immunol, 1993, 151:791-9 Smith et al. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 114:265-71 Asturias et al. Clin Exp Allergy, 1997, 27:1307-13 Fuchs et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:356-64
Cedro japonés
Jun a 2 (Juniperus ashei) Cry j 1, Cry j 2 (Cryptomeria japonica) Yokoyama et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 275:195-202 Kingetsu et al. Immunology, 2000, 99:625-629
Enebro
Jun o 2 (polen) Tinghino et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:772-7

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Grupo
Alérgeno Referencia
Látex
Hev b 7 Sowka et al. Eur J Biochem, 1998, 255:213-9 Fuchs et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:3 56-64
Mercurialis
Mer a I (profilina) Vallverdu et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:3 63-70
Mostaza (amarilla)
Sin a I (semilla) Gonzalez de la Pena et al. Biochem Bioph. Res Comm., 1993, 190:648-53
Semilla de colza
Bra r I alérgeno del polen Smith et al. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 114:265-71
Cacahuete
Ara h I Stanley et al. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:213-6 Burks et al. J Clin Invest, 1995, 96:1715-21 Burks et al. Int Arch Allergy Immunol, 1995, 107:248-50
Poa pratensis
Poa p9 Parronchi et al. Eur J Immunol, 1996, 26:697-703 Astwood et al. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:269-77
Ambrosía
Amb a I Sun et al. Biotechnology Aug, 1995, 13:779-86 Hirschwehr et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:196-206 Casale et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:110-21
Centeno
Lol p I Tamborini et al. Eur J Biochem, 1997, 249:886-94
Nuez
Jug r I Teuber et al. J Allergy Clin Immun., 1998, 101:807-14
Trigo
Alérgeno Fuchs et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:356-64 Donovan et al. Electrophoresis, 1993, 14:917-22
Hongos:
Aspergillus
Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, rAsp f 6 Manganeso superóxido dismutasa (MNSOD) Crameri et al. Mycoses, 1998, 41 Supl 1:56-60 Hemmann et al. Eur J Immunol, 1998, 28:1155-60 Banerjee et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99:821-7 Crameri Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115:99-114 Crameri et al. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:111-6 Moser et al. J Allergy Clin Immunol, 1994, 93: 1-11 Mayer et al. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 113:213-5
Blomia
alérgeno Caraballo et al. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:81-3
Penicillinium
alérgeno Shen et al. Clin Exp Allergy, 1997, 27:682-90
Psilocybe
Psi c 2 Homer et al. Int Arch Allergy Immunol, 1995, 107:298-300

En ciertas realizaciones, el antígeno es de un agente infeccioso, que incluye agentes infecciosos protozoarios, bacterianos, fúngicos (que incluye unicelulares y multicelulares), y virales. Los ejemplos de antígenos virales adecuados se describen en la presente memoria y se conocen en la técnica. Las bacterias incluyen Haemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis y Bordetella pertussis. Los agentes infecciosos protozoarios incluyen plasmodios de la malaria, la especie Leishmania, la especie Trypanosoma y la especie Schistosoma. Los hongos incluyen Candida albicans.
En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno viral. Los antígenos polipeptídicos virales incluyen, pero sin limitación, proteínas del VIH tales como las proteínas gag de VIH (que incluyen, pero sin limitación, la proteína de
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anclaje a la membrana (MA), la proteína de la cápside del núcleo (CA) y la proteína de la nucleocápside (NC)), la polimerasa del VIH, la proteína de la matriz del virus de la gripe (M) y la proteína de la nucleocápside (NP) del virus de la gripe, el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), la proteína del núcleo de la hepatitis B (HBcAg), la proteína e de la hepatitis B (HBeAg), la ADN polimerasa de la hepatitis B, antígenos de la hepatitis C, y similares. Las referencias que discuten la vacunación contra la gripe incluyen Scherle y Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450; Scherle y Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128; Granoff et al. (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71:3391-3396; Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen et al. (1999) Vaccine 17:653-659; Govorkova y Smirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257; Koide et al. (1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura et al. (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8:595-599. Otros ejemplos de polipéptidos antigénicos son los antígenos específicos de grupo o de subgrupo, los cuales se conocen para varios agentes infecciosos, que incluyen, pero sin limitación, adenovirus, virus del herpes simplex, virus del papiloma, virus respiratorio sincitial y poxvirus.
Se conocen muchos péptidos y proteínas antigénicas, y están disponibles en la técnica; se puede identificar otros mediante el uso de las técnicas convencionales. Para la inmunización contra la formación de tumores o el tratamiento de tumores existentes, los péptidos inmunomoduladores pueden incluir células tumorales (vivas o irradiadas), extractos de células tumorales o subunidades proteicas de antígenos tumorales, tales como Her-2/neu, Mart1, antígeno carcinoembrionario (CEA), gangliósidos, glóbulo de grasa de la leche humana (HMFG), mucina (MUC1), antígenos MAGE, antígenos BAGE, antígenos GAGE, gp100, antígeno prostático específico (PSA), y tirosinasa. Se pueden formar vacunas para la anticoncepción con base inmune incluyendo proteínas del esperma administradas con CICs. Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263.
Los virus atenuados e inactivados son adecuados para el uso en la presente memoria como antígeno. La preparación de estos virus se conoce bien en la técnica, y muchos están disponibles comercialmente (véase, p.ej., Physicians' Desk Reference (1998) 52ª edición, Medical Economics Company, Inc.). Por ejemplo, el virus de la poliomielitis está disponible como IPOL® (Pasteur Merieux Connaught) y ORIMUNE® (Lederle Laboratories), el virus de la hepatitis A como VAQTA® (Merck), el virus del sarampión como ATTENUVAX® (Merck), el virus de las paperas como MUMPSVAX® (Merck) y el virus de la rubeola como MERUVAX®II (Merck). Además, los virus atenuados e inactivados tales como VIH-1, VIH-2, virus de herpes simplex, virus de la hepatitis B, rotavirus, virus del papiloma humano y no humano y virus lento del cerebro, pueden proporcionar antígenos peptídicos.
En ciertas realizaciones, el antígeno comprende un vector viral, tal como virus vaccinia, adenovirus y el poxvirus de los canarios.
Los antígenos se pueden aislar de su fuente, mediante el uso de técnicas de purificación conocidas en la técnica o, más convenientemente, se pueden producir mediante el uso de métodos recombinantes.
Los péptidos antigénicos pueden incluir péptidos nativos purificados, péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, extractos proteicos en bruto, virus atenuados o inactivados, células, microorganismos, o fragmentos de tales péptidos. Los péptidos inmunomoduladores pueden ser nativos o se pueden sintetizar químicamente o enzimáticamente. Cualquier método de síntesis química conocido en la técnica es adecuado. Se puede utilizar la síntesis de péptidos en fase de disolución para construir péptidos de tamaño moderado o, para la construcción química de péptidos, se puede emplear la síntesis en fase sólida. Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833-839. También se pueden utilizar enzimas proteolíticas para acoplar aminoácidos para producir péptidos. Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. De manera alternativa, se puede obtener el péptido mediante el uso de la maquinaria bioquímica de una célula, o mediante el aislamiento de una fuente biológica. Se pueden emplear técnicas de ADN recombinante para la producción de péptidos. Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press. Los péptidos también se pueden aislar mediante el uso de técnicas convencionales tales como la cromatografía de afinidad.
Preferiblemente, los antígenos son péptidos, lípidos (p.ej., esteroles que excluyen el colesterol, ácidos grasos y fosfolípidos), polisacáridos tales como los usados en las vacunas contra el H. influenza, gangliósidos y glicoproteínas. Estos se pueden obtener por medio de distintos métodos conocidos en la técnica, que incluyen el aislamiento y la síntesis mediante el uso de métodos químicos y enzimáticos. En ciertos casos, como para muchos esteroles, ácidos grasos y fosfolípidos, las porciones antigénicas de las moléculas están disponibles comercialmente.
Los ejemplos de antígenos virales útiles en las presentes composiciones y métodos que usan las composiciones incluyen, pero sin limitación, los antígenos del VIH. Tales antígenos incluyen, pero sin limitación, los antígenos obtenidos a partir de las glicoproteínas de la envoltura del VIH que incluyen, pero sin limitación, gp160, gp120 y gp41. Se conocen numerosas secuencias para los genes y antígenos del VIH. Por ejemplo, la base de datos de la secuencia del VIH del Laboratorio Nacional de Los Alamos, recoge, organiza y anota las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del VIH. Esta base de datos es accesible a través de Internet, en http://hiv-web.lanl.gov/, y en una publicación anual, véase Human Retroviruses and AIDS Compendium (por ejemplo, la edición del año 2000).
Los antígenos que proceden de agentes infecciosos se pueden obtener mediante el uso de métodos conocidos en la
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técnica, por ejemplo, a partir de extractos virales o bacterianos naturales, a partir de células infectadas con el agente infeccioso, a partir de polipéptidos purificados, a partir de polipéptidos producidos de manera recombinante y/o como péptidos sintéticos.
Los CIQs se pueden administrar en combinación con un antígeno en una diversidad de maneras. En ciertas realizaciones, un CIQ y un antígeno se administran próximos espacialmente entre sí. Como se describe más adelante, la proximidad espacial se puede conseguir de varias maneras, que incluyen la conjugación, encapsulación, por medio de la fijación a una plataforma o la adsorción sobre una superficie. En una realización, se administra un CIQ y un antígeno en forma de una mezcla (p.ej., en disolución). Se contempla específicamente que, en ciertas realizaciones, el CIQ no esté conjugado a un inmunógeno o antígeno.
En ciertas realizaciones, el CIQ está unido a un polipéptido, p.ej., un antígeno. La porción de CIQ se puede unir a la porción de antígeno de un conjugado de varias maneras, que incluyen las interacciones covalentes y/o no covalentes, por medio del resto de ácido nucleico o del resto espaciador distinto de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la unión es por medio de un grupo reactivo tal como, sin limitación, tiol, amina, carboxilato, aldehído, hidrizina, hidrizona, disulfuro y similares.
La unión entre las porciones se puede hacer en el extremo 3' o 5' de un resto de ácido nucleico, o en una base modificada de manera adecuada en una posición interna en un resto de ácido nucleico. Por ejemplo, si el antígeno es un péptido y contiene un grupo reactivo adecuado (p.ej., un éster de N-hidroxisuccinimida) se puede hacer reaccionar directamente con el grupo amino N4 de los residuos de citosina. Dependiendo del número y la localización de los residuos de citosina del CIQ, se puede conseguir un acoplamiento específico en uno o más residuos.
De manera alternativa, se pueden incorporar oligonucleósidos modificados, tal como se conoce en la técnica, en cualquier extremo, o en posiciones internas del CIQ. Éstos pueden contener grupos funcionales bloqueados que, cuando se desbloquean, son reactivos con una diversidad de grupos funcionales que pueden estar presentes en, o unidos a, el antígeno de interés.
Cuando el antígeno es un péptido, esta porción del conjugado se puede unir al resto de ácido nucleico o resto espaciador a través de la química de soportes sólidos. Por ejemplo, se puede añadir una porción de ácido nucleico de un CIQ a una porción de polipéptido que se ha pre-sintetizado en un soporte. Haralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:493-499; y Haralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:501-505.
De manera alternativa, el CIQ se puede sintetizar de forma que esté conectado a un soporte sólido a través de un enlazador escindible que se prolongue desde el extremo 3' de un resto de ácido nucleico. Tras la escisión química del CIQ del soporte, se deja un grupo tiol terminal o un grupo amino terminal en el extremo 3' del resto de ácido nucleico (Zuckermann et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; Corey et al., 1987, Science 238:1401-1403; Nelson et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:781-1794). La conjugación del CIQ con el amino modificado a los grupos amino del péptido se puede llevar a cabo como se describe en Benoit et al. (1987) Neuromethods 6:43-72. La conjugación del CIQ con el tiol modificado a los grupos carboxilo del péptido se puede llevar a cabo como se describe en Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press. También se ha descrito el acoplamiento de un resto de ácido nucleico o espaciador que porta una maleimida añadida a la cadena lateral de tiol de un residuo de cisteína de un péptido. Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465.
La porción peptídica del conjugado se puede unir a un extremo 5' libre de un resto de ácido nucleico por medio de un grupo amina, tiol, o carboxilo que se ha incorporado en el resto de ácido nucleico o espaciador (p.ej., por medio de un extremo 5' libre, un extremo 3' libre, por medio de una base modificada, y similares).
De manera conveniente, un grupo de unión que comprende una amina, tiol, o carboxilo protegidos en un extremo, y una fosforamidita se pueden unir de manera covalente a un grupo hidroxilo de un CIQ. Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; y las patentes de EE.UU. Nºs 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, y 5.118.802. Tras la desprotección, las funciones amina, tiol, y carboxilo se pueden usar para unir de manera covalente el CIQ a un péptido. Benoit et al. (1987); y Sinah et al. (1991).
También se puede formar un conjugado CIQ-antígeno por medio de interacciones no covalentes, tales como enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y/o atracciones de van der Waals.
Los conjugados con uniones no covalentes pueden incluir una interacción no covalente tal como un complejo biotinaestreptavidina. Se puede unir un grupo biotinilo, por ejemplo, en una base modificada de un CIQ. Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. La incorporación de un resto de estreptavidina en la porción peptídica permite la formación de un complejo con unión no covalente del péptido conjugado a estreptavidina y el oligonucleótido biotinilado.
Las asociaciones no covalentes también se pueden dar por medio de interacciones iónicas que implican un CIQ y residuos dentro del antígeno, tales como aminoácidos cargados, o a través del uso de una porción enlazadora que
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comprende residuos cargados que pueden interaccionar con el oligonucleótido y con el antígeno. Por ejemplo, la conjugación no covalente se puede dar entre un CIQ en general cargado negativamente y los residuos de aminoácidos cargados positivamente de un péptido, p.ej., residuos de polilisina, poliarginina y polihistidina.
La conjugación no covalente entre el CIQ y los antígenos se puede dar por medio de motivos de unión al ADN de las moléculas que interaccionan con el ADN como sus ligandos naturales. Por ejemplo, tales motivos de unión al ADN se pueden hallar en factores de transcripción y en anticuerpos anti-ADN.
La unión del CIQ a un lípido se puede llevar a cabo mediante el uso de métodos habituales. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, la síntesis de conjugados oligonucleótido-fosfolípido (Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), conjugados oligonucleótido-ácido graso (Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; y Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222), y conjugados oligonucleótido-esterol. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.
La unión del oligonucleótido a un oligosacárido se puede llevar a cabo mediante el uso de métodos conocidos habituales. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, la síntesis de conjugados oligonucleótido-oligosacárido, en los que el oligosacárido es un resto de una inmunoglobulina. O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7:347
355.
Los métodos adicionales para la unión de péptidos y otras moléculas a oligonucleótidos se pueden hallar en la patente de EE.UU. Nº 5.391.723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids" en Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; y Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146.
Un CIQ puede estar asociado de manera próxima con un/varios antígeno(s) de otras maneras. En ciertas realizaciones, un CIQ y un antígeno están asociados de manera próxima mediante encapsulación. En otras realizaciones, un CIQ y un antígeno están asociados de manera próxima mediante la unión a una molécula plataforma. Una "molécula plataforma" (también denominada "plataforma") es una molécula que contiene sitios que permiten la unión de un CIQ y antígeno(s). En otras realizaciones, un CIQ y un antígeno están asociados de manera próxima mediante adsorción sobre una superficie, preferiblemente una partícula de soporte.
En ciertas realizaciones, los métodos de la invención emplean un agente de encapsulación que puede mantener la asociación próxima de un CIQ y un primer antígeno hasta que el complejo está disponible para el objetivo (o composiciones que comprenden tales agentes de encapsulación). Preferiblemente, la composición que comprende un CIQ, el antígeno y el agente de encapsulación está en forma de emulsiones adyuvantes aceite-en-agua, micropartículas y/o liposomas. Más preferiblemente, las emulsiones adyuvantes aceite-en-agua, las micropartículas y/o los liposomas que encapsulan un CIQ están en forma de partículas de un tamaño de alrededor de 0,04 µm a alrededor de 100 µm, preferiblemente cualquiera de los intervalos siguientes: de alrededor de 0,1 µm a alrededor de 20 µm; de alrededor de 0,15 µm a alrededor de 10 µm; de alrededor de 0,05 µm a alrededor de 1,00 µm; de alrededor de 0,05 µm a alrededor de 0,5 µm.
Los sistemas de dispersión coloidal, tales como microesferas, esferas, complejos macromoleculares, nanocápsulas y sistemas basados en lípidos, tales como emulsiones aceite-en-agua, micelas, micelas mixtas y liposomas pueden proporcionar una encapsulación eficaz de las composiciones que contienen CIQ.
La composición de encapsulación comprende además cualquiera de una amplia diversidad de componentes. Estos incluyen, pero sin limitación, alumbre, lípidos, fosfolípidos, estructuras de membranas lipídicas (LMS), polietilen glicol (PEG) y otros polímeros, tales como polipéptidos, glicopéptidos, y polisacáridos.
Los polipéptidos adecuados para los componentes de encapsulación incluyen cualquiera de los conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, proteínas de unión a ácidos grasos. Los polipéptidos modificados contienen cualquiera de una diversidad de modificaciones, que incluyen, pero sin limitación, la glicosilación, fosforilación, miristilación, sulfuración e hidroxilación. Tal como se usa en la presente memoria, un polipéptido adecuado es uno que protegerá a una composición que contiene un CIQ para conservar la actividad inmunomoduladora de la misma. Los ejemplos de proteínas de unión incluyen, pero sin limitación, albúminas tales como albúmina de suero bovino (BSA) y albúmina de guisante.
Otros polímeros adecuados pueden ser cualquiera de los conocidos en la técnica de productos farmacéuticos, e incluyen, pero sin limitación, los polímeros naturales tales como los dextranos, hidroxietil almidón, y polisacáridos, y los polímeros sintéticos. Los ejemplos de polímeros naturales incluyen proteínas, glicopéptidos, polisacáridos, dextrano y lípidos. El polímero adicional puede ser un polímero sintético. Los ejemplos de polímeros sintéticos que son adecuados para el uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, polialquil glicoles (PAG) tales como PEG, polioles polioxietilados (POP), tales como glicerol polioxietilado (POG), politrimetilen glicol (PTG), polipropilen glicol (PPG), poli(metacrilato de hidroxietilo), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico), polietiloxazolina, poliacrilamida, polivinilpirrolidona (PVP), poliaminoácidos, poliuretano y polifosfazeno. Los polímeros sintéticos pueden ser también lineales o ramificados, sustituidos o sin sustituir, homopoliméricos, co-polímeros, o co-polímeros en bloque de dos o más monómeros sintéticos diferentes.
Los PEGs para el uso en las composiciones de encapsulación de la presente invención se adquieren de
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proveedores de productos químicos o se sintetizan mediante el uso de técnicas conocidas para los expertos en la técnica.
El término "LMS", tal como se usa en la presente memoria, significa partículas lipídicas lamelares en las que los grupos de las cabezas polares de un lípido polar están dispuestos para estar frente a una fase acuosa de una interfase para formar estructuras de membrana. Los ejemplos de LMSs incluyen liposomas, micelas, cocleatos (es decir, liposomas generalmente cilíndricos), microemulsiones, vesículas unilamelares, vesículas multilamelares, y similares.
Un sistema de dispersión coloidal útil en la administración de los CIQs es un liposoma. En ratones inmunizados con un antígeno encapsulado en liposomas, los liposomas parecieron aumentar la respuesta inmunitaria de tipo Th1 hacia el antígeno. Aramaki et al. (1995) Vaccine 13:1809-1814. Tal como se usa en la presente memoria, un "liposoma" o "vesícula lipídica" es una pequeña vesícula limitada por al menos una y posiblemente más de una membrana lipídica en forma de bicapa. Los liposomas se producen de manera artificial a partir de fosfolípidos, glicolípidos, lípidos, esteroides tales como colesterol, moléculas relacionadas, o una combinación de las mismas mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitación, la sonicación, extrusión, o eliminación de detergentes de complejos lípido-detergente. Un liposoma también puede comprender opcionalmente componentes adicionales, tales como un componente de selección del tejido. Se entiende que no es necesario que una "membrana lipídica" o "bicapa lipídica" consista exclusivamente en lípidos, sino que puede contener además cualquier otro componente adecuado, lo que incluye, pero sin limitación, colesterol y otros esteroides, productos químicos solubles en lípidos, proteínas de cualquier longitud, y otras moléculas anfipáticas, con tal de que la estructura general de la membrana sea una lámina de dos superficies hidrófilas que tienen intercalado un núcleo hidrófobo. Para una discusión general de la estructura de membranas, véase The Encyclopedia of Molecular Biology, de J. Kendrew (1994). Para los lípidos adecuados véase, p.ej., Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications" Elsevier, Amsterdam.
Los procedimientos para la preparación de liposomas que contienen composiciones que contienen CIQ se conocen en la técnica. Se pueden preparar vesículas lipídicas mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los métodos incluyen, pero sin limitación, la microencapsulación, microfluidización, método LLC, inyección de etanol, inyección de freón, el método de la "burbuja", diálisis de detergente, hidratación, sonicación, y evaporación en fase inversa. Se revisan en Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68:715-724. Se pueden combinar las técnicas para proporcionar vesículas con las propiedades más deseables.
La invención abarca el uso de LMSs que contienen componentes de selección tisular o celular. Tales componentes de selección del objetivo son componentes de una LMS que aumentan su acumulación en ciertos sitios tisulares o celulares con preferencia respecto de otros sitios tisulares o celulares cuando se administran a un animal intacto, órgano, o cultivo celular. Un componente de selección del objetivo es accesible en general desde el exterior del liposoma, y por lo tanto está unido preferiblemente a la superficie externa o insertado en la bicapa lipídica externa. Un componente de selección del objetivo puede ser, entre otros, un péptido, una región de un péptido mayor, un anticuerpo específico para una molécula o marcador de la superficie celular, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, un ácido nucleico, un carbohidrato, una región de un carbohidrato complejo, un lípido especial, o una molécula pequeña tal como un fármaco, hormona, o hapteno, unido a cualquiera de las moléculas anteriormente mencionadas. Los anticuerpos con especificidad hacia marcadores de la superficie celular específicos del tipo celular se conocen en la técnica, y se preparan fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica.
Las LMSs se pueden dirigir a cualquier tipo celular hacia el que se dirige un tratamiento terapéutico, p.ej., un tipo celular que puede modular y/o participar en una respuesta inmunitaria. Tales células y órganos objetivo incluyen, pero sin limitación, APCs, tales como macrófagos, células dendríticas y linfocitos, estructuras linfáticas, tales como nódulos linfáticos y el bazo, y estructuras no linfáticas, en particular las que se hallan en las células dendríticas.
Las composiciones de LMS de la presente invención pueden comprender además tensioactivos. Los tensioactivos pueden ser catiónicos, aniónicos, anfifílicos, o no iónicos. Una clase preferida de tensioactivos son los tensioactivos no iónicos; se prefieren en particular los que son hidrosolubles.
En ciertas realizaciones, un CIQ y un antígeno están asociados de forma próxima mediante la unión a una molécula plataforma, tal como una plataforma de valencia proteica o no proteica (p.ej., sintética). Los ejemplos de plataformas adecuadas se describieron anteriormente, en la discusión de las plataformas de valencia usadas como resto espaciador en un CIQ. La unión de antígenos a las plataformas de valencia se puede llevar a cabo mediante el uso de métodos rutinarios. Como ejemplo, los polipéptidos contienen restos de cadenas laterales de aminoácidos con grupos funcionales tales como grupos amino, carboxilo o sulfhidrilo que sirven como sitios para el acoplamiento del polipéptido a la plataforma. Se pueden añadir residuos que tienen tales grupos funcionales al polipéptido si el polipéptido todavía no contiene estos grupos. Tales residuos se pueden incorporar mediante técnicas de síntesis en fase sólida o técnicas recombinantes, las cuales se conocen bien en las técnicas de síntesis de péptidos. Cuando el polipéptido tiene una/varias cadena(s) lateral(es) de carbohidrato (o si el antígeno es un carbohidrato), se pueden incorporar grupos funcionales amino, sulfhidrilo y/o aldehído en ellas mediante procedimientos químicos convencionales. Por ejemplo, se pueden incorporar grupos amino primarios mediante reacción del carbohidrato oxidado con etilendiamina en presencia de cianoborohidruro sódico, se pueden introducir sulfhidrilos mediante
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reacción de dihidrocloruro de cisteamina seguido de reducción con un agente reductor de disulfuro estándar, mientras los grupos aldehído se pueden generar tras oxidación con peryodato. De una manera similar, la molécula plataforma se puede derivatizar también para que contenga grupos funcionales si todavía no posee grupos funcionales adecuados.
En otra realización, un CIQ y un antígeno se coadministran adsorbiéndolos en una superficie, tal como una nanopartícula o microsoporte. La adsorción de un CIQ y/o un antígeno en una superficie se puede dar por medio de interacciones no covalentes, que incluyen interacciones iónicas y/o hidrófobas. La adsorción de polinucleótidos y polipéptidos en una superficie con el propósito de administración de las moléculas adsorbidas a células se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Douglas et al. (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3:233-261; Hagiwara et al. (1987) In Vivo 1:241-252; Bousquet et al. (1999) Pharm. Res. 16:141-147; y Kossovsky et al., patente de EE.UU. 5.460.831. Preferiblemente, el material que comprende la superficie adsorbente es biodegradable.
En general, las características de las nanopartículas, tales como la carga superficial, el tamaño de partícula y el peso molecular, dependen de las condiciones de polimerización, la concentración de monómero y la presencia de estabilizantes durante el procedimiento de polimerización (Douglas et al., 1987, anteriormente mencionado). La superficie de las partículas de soporte se puede modificar, por ejemplo, con un revestimiento superficial, para permitir o aumentar la adsorción del CIQ y/o el antígeno. Las partículas de soporte con CIQ y/o antígeno adsorbidos se pueden revestir adicionalmente con otras sustancias. La adición de tales sustancias, por ejemplo, puede prolongar la semivida de las partículas una vez que se administran al sujeto, y/o pueden dirigir las partículas a un tipo de célula o tejido específico, como se describe en la presente memoria.
Se han descrito las superficies nanocristalinas en las que se puede adsorber un CIQ y un antígeno (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.460.831). Las partículas de núcleos nanocristalinos (con diámetros de 1 µm o menores) están revestidas con una capa que modifica la energía superficial que estimula la adsorción de polipéptidos, polinucleótidos y/u otros agentes farmacéuticos. Tal como se describe en la patente de EE.UU. 5.460.831, por ejemplo, una partícula de núcleo se reviste con una superficie que estimula la adsorción de un oligonucleótido y se reviste posteriormente con una preparación de antígeno, por ejemplo, en forma de una mezcla lípido-antígeno. Tales nanopartículas son complejos autoensamblables de partículas con tamaños de nanometros, en general del orden de 0,1 µm, que portan una capa interna de CIQ y una capa externa de antígeno.
Otra superficie adsorbente son las nanopartículas producidas mediante la polimerización de cianoacrilatos de alquilo. Los cianoacrilatos de alquilo se pueden polimerizar en medios acuosos acidificados mediante un procedimiento de polimerización aniónica. Dependiendo de las condiciones de polimerización, las partículas pequeñas tienden a tener tamaños en el intervalo de 20 a 3000 nm, y es posible producir nanopartículas con características superficiales específicas y con cargas superficiales específicas (Douglas et al., 1987, anteriormente mencionado). Por ejemplo, los oligonucleótidos se pueden adsorber en nanopartículas de poli(cianoacrilato de isobutilo e isohexilo) en presencia de cationes hidrófobos, tales como cloruro de tetrafenilfosfonio o sales de amonio cuaternario, tales como bromuro de cetiltrimetilamonio. La adsorción de oligonucleótidos sobre estas nanopartículas parece estar mediada por la formación de pares iónicos entre los grupos fosfato cargados negativamente de la cadena de ácido nucleico y los cationes hidrófobos. Véanse, por ejemplo, Lambert et al. (1998) Biochimie 80:969-976, Chavany et al. (1994) Pharm. Res. 11:1370-1378; Chavany et al. (1992) Pharm. Res. 9:441-449. Los polipéptidos también se pueden adsorber en las nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquilo). Véase, por ejemplo, Douglas et al.,1987; Schroeder et al. (1998) Peptides 19:777-780.
Otra superficie adsorbente son las nanopartículas producidas mediante la polimerización de malonato de metilideno. Por ejemplo, tal como se describe en Bousquet et al., 1999, los polipéptidos que se adsorben en nanopartículas de poli(malonato de metilideno 2.1.2) parecen hacerlo inicialmente por medio de fuerzas electrostáticas, seguido por la estabilización por medio de fuerzas hidrófobas.
C. Adyuvantes Adicionales
Un CIQ se puede administrar también junto con un adyuvante. La administración de un antígeno con un CIQ y un adyuvante conduce a una potenciación de una respuesta inmunitaria hacia el antígeno y, así, puede dar como resultado una respuesta inmunitaria aumentada en comparación con la que resulta de una composición que comprende el CIQ y el antígeno solamente. Los adyuvantes se conocen en la técnica e incluyen, pero sin limitación, emulsiones aceite-en-agua, emulsiones agua-en-aceite, alumbre (sales de aluminio), liposomas y micropartículas, que incluyen, pero sin limitación, poliestireno, almidón, polifosfaceno y polilactida/poliglicósidos. Otros adyuvantes adecuados también incluyen, pero sin limitación, MF59, DETOX™ (Ribi), mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de la pared celular de micobacterias, monofosforil lípido A, derivados de ácido micólico, tensioactivos no iónicos de copolímeros en bloque, Quil A, subunidad B de la toxina del cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimuladores (ISCOMs), tales como los descritos por Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875, así como los adyuvantes basados en lípidos y otros descritos en la presente memoria. Para uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales, se pueden utilizar componentes mitógenos del adyuvante de Freund (completo e incompleto).
IV. CIQs para el uso en los métodos de la invención
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La invención proporciona CIQs para el uso en métodos para la modulación de una respuesta inmunitaria en un individuo, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, que comprende administrar al individuo un CIQ como se describe en la presente memoria. La inmunomodulación puede incluir estimular una respuesta inmunitaria de tipo Th1 y/o inhibir o reducir una respuesta inmunitaria de tipo Th2. El CIQ se administra en una cantidad suficiente para modular una respuesta inmunitaria. Como se describe en la presente memoria, la modulación de una respuesta inmunitaria puede ser humoral y/o celular, y se mide mediante el uso de métodos habituales en la técnica y como se describe en la presente memoria.
Son adecuados varios individuos para recibir el/los CIQ(s) descrito(s) en la presente memoria. Preferiblemente, pero no necesariamente, el individuo es un ser humano.
En ciertas realizaciones, el individuo padece un trastorno asociado a una respuesta inmunitaria de tipo Th2, tal como (sin limitación) alergias, asma inducida por alergia, dermatitis atópica, inflamación gastrointestinal eosinofílica, esofagitis eosinofílica, y aspergilosis broncopulmonar alérgica. La administración de un CIQ da como resultado la inmunomodulación, niveles crecientes de una o más citocinas asociadas a una respuesta de tipo Th1, lo que puede dar como resultado una reducción de las características de la respuesta de tipo Th2 asociada a la respuesta del individuo al alérgeno. La inmunomodulación de individuos con trastornos asociados a una respuesta de tipo Th2 da como resultado una reducción o mejora de uno o más de los síntomas del trastorno. Cuando el trastorno es alergia o asma inducida por alergia, la mejora de uno o más de los síntomas incluye una reducción de uno o más de lo siguiente: rinitis, conjuntivitis alérgica, niveles circulantes de IgE, niveles circulantes de histamina y/o necesidad de terapia "de rescate" con inhalador (p.ej., albuterol inhalado administrado mediante un inhalador o nebulizador de dosis medida).
En realizaciones adicionales, el individuo sometido a la terapia inmunomoduladora de la invención es un individuo que recibe una vacuna. La vacuna puede ser una vacuna profiláctica o una vacuna terapéutica. Una vacuna profiláctica comprende uno o más epítopos asociados con un trastorno que el individuo tiene riesgo de padecer (p.ej., antígenos de M tuberculosis como vacuna para la prevención de la tuberculosis). Las vacunas terapéuticas comprenden uno o más epítopos asociados a un trastorno particular que afecta al individuo, tal como los antígenos superficiales de M. tuberculosis o M. bovis en pacientes de tuberculosis, antígenos hacia los cuales el individuo es alérgico (es decir, terapia de desensibilización de la alergia) en individuos con alergias, células tumorales de un individuo con cáncer (p.ej., como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.484.596), o antígenos asociados a tumores en pacientes de cáncer. El CIQ se puede administrar junto con la vacuna (p.ej., en la misma inyección o en una inyección simultánea, pero separada), o el CIQ se puede administrar por separado (p.ej., al menos 12 horas antes o después de la administración de la vacuna). En ciertas realizaciones, el/los antígeno(s) de la vacuna es/son parte del CIQ, mediante unión covalente o no covalente al CIQ. La administración de la terapia de CIQ a un individuo que recibe una vacuna da como resultado una respuesta inmunitaria hacia la vacuna que se desplaza hacia una respuesta de tipo Th1 en comparación con los individuos que reciben una vacuna que no contiene un CIQ. El desplazamiento hacia una respuesta de tipo Th1 se puede reconocer mediante una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a el/los antígeno(s) de la vacuna, IFN-γ incrementado y otras citocinas asociadas a una respuesta de tipo Th1, la producción de CTLs específicos de el/los antígeno(s) de la vacuna, niveles bajos o reducidos de IgE específicos de el/los antígeno(s) de la vacuna, una reducción de los anticuerpos asociados a Th2 específicos de el/los antígeno(s) de la vacuna, y/o un incremento de los anticuerpos asociados a Th1 específicos de el/los antígeno(s) de la vacuna. En el caso de las vacunas terapéuticas, la administración del CIQ y la vacuna también da como resultado una mejora de uno o más síntomas del trastorno que se pretende tratar con la vacuna. Como será evidente para un experto en la técnica, los síntomas exactos y la manera de mejorarlos dependerán del trastorno que se va a tratar. Por ejemplo, cuando la vacuna terapéutica es para la tuberculosis, el tratamiento con CIQ con la vacuna da como resultado una reducción de la tos, del dolor pleural o de la pared torácica, la fiebre y/u otros síntomas conocidos en la técnica. Cuando la vacuna es un alérgeno usado en la terapia de desensibilización de la alergia, el tratamiento da como resultado una reducción de los síntomas de la alergia (p.ej., reducción de la rinitis, conjuntivitis alérgica, niveles circulantes de IgE y/o niveles circulantes de histamina).
Otras realizaciones de la invención se refieren a la terapia inmunomoduladora de individuos que tienen una enfermedad o trastorno preexistente, tal como cáncer o una enfermedad infecciosa. El cáncer es un objetivo atractivo para la inmunomodulación, porque la mayoría de los cánceres expresan antígenos asociados al tumor y/o específicos del tumor que no se hallan en otras células del cuerpo. La estimulación de una respuesta de tipo Th1 contra las células tumorales da como resultado una destrucción directa y/o pasiva de las células tumorales por el sistema inmunitario, lo que conduce a una reducción de las células cancerosas y a una reducción de los síntomas. La administración de un CIQ a un individuo que tiene cáncer da como resultado la estimulación de una respuesta inmunitaria de tipo Th1 contra las células tumorales. Tal respuesta inmunitaria puede destruir las células tumorales, por la acción directa de las células del sistema inmunitario celular (p.ej., CTLs) o de componentes del sistema inmunitario humoral, o por efecto pasivo sobre las células próximas a las células seleccionadas como objetivo por el sistema inmunitario, lo que incluye los macrófagos y las células citolíticas naturales (NK). Véase, por ejemplo, Cho et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:509-514. En el tratamiento de una enfermedad o trastorno preexistente, el CIQ se puede administrar junto con otros agentes inmunoterapéuticos tales como citocinas, adyuvantes y anticuerpos. Por ejemplo, se puede administrar un CIQ como parte de un régimen terapéutico que incluye la administración de un agente de unión que se une a un antígeno expresado por las células tumorales. Los agentes de unión ejemplares incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales. Los ejemplos de antígenos objetivo incluyen CD20, CD22, HER2 y
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otros conocidos en la técnica o que se descubrirán en el futuro. Sin pretender limitarse por la teoría, se cree que el CIQ aumenta la destrucción de las células tumorales a las que se asocia el agente de unión (p.ej., aumentando la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o la función efectora). El agente de unión se puede marcar opcionalmente, p.ej., con un radioisótopo o toxina que daña la célula a la que se une el agente de unión. El CIQ se puede administrar junto con el agente (p.ej., al mismo tiempo) o antes o después (p.ej., menos de 24 horas antes o después de la administración del agente). Por ejemplo, en el caso del cáncer, el CIQ se puede administrar junto con un agente quimioterápico conocido o que se sospecha que es útil para el tratamiento del cáncer. Como otro ejemplo, el CIQ se puede administrar junto con radioterapia, terapia génica, o similares. El CIQ puede ser cualquiera de los descritos en la presente memoria.
La terapia inmunomoduladora de acuerdo con la invención también es útil para individuos con enfermedades infecciosas, en particular enfermedades infecciosas que son resistentes a las respuestas inmunitarias humorales (p.ej., enfermedades causadas por infecciones micobacterianas y por patógenos intracelulares). La terapia inmunomoduladora se puede usar para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por patógenos celulares (p.ej., bacterias o protozoos) o por patógenos subcelulares (p.ej., virus). La terapia con CIQ se puede administrar a individuos que padecen enfermedades micobacterianas, tales como tuberculosis (p.ej., infecciones por
M. tuberculosis y/o M. bovis), lepra (es decir, infecciones por M. leprae), o infecciones por M. marinum o M. ulcerans. La terapia con CIQ también es útil para el tratamiento de infecciones virales, que incluyen infecciones por el virus de la gripe, virus respiratorio sincitial (RSV), virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, herpesvirus, en particular los virus herpes simplex, y los virus de papiloma. Las enfermedades provocadas por parásitos intracelulares, tales como malaria (p.ej., infección por plasmodium vivax, P. ovale, P. falciparum y/o P. malariae), leishmaniasis (p.ej., infección por Leishmania donovani, L. tropica, L. mexicana, L. braziliensis, L. peruviana, L. infantum, L. chagasi, y/o L. aethiopica), y toxoplasmosis (es decir, infección por Toxoplasmosis gondii) también se benefician de la terapia con CIQ. La terapia con CIQ también es útil para el tratamiento de enfermedades parasitarias, tales como la esquistosomiasis (es decir, la infección por trematodos del género Schistosoma, tales como S. haematobium, S. mansoni, S. japonicum y S. mekongi) y clonorquiasis (es decir, la infección por Clonorchis sinensis). La administración de un CIQ a un individuo que padece una enfermedad infecciosa da como resultado una mejora de los síntomas de la enfermedad infecciosa. En ciertas realizaciones, la enfermedad infecciosa no es una enfermedad viral.
La invención proporciona además CIQs para el uso en métodos para incrementar o estimular al menos una citocina asociada a Th1 en un individuo, que incluye IL-2, IL-12, TNF-β, IFN-γ e IFN-α. En ciertas realizaciones, la invención proporciona CIQs para el uso en métodos para incrementar o estimular el IFN-γ en un individuo, en particular en un individuo que necesita niveles incrementados de IFN-γ, mediante la administración de una cantidad eficaz de un CIQ al individuo, tal como IFN-γ. Los individuos que necesitan un IFN-γ incrementado son los que tienen trastornos que responden a la administración de IFN-γ. Tales trastornos incluyen varios trastornos inflamatorios que incluyen, pero sin limitación, colitis ulcerosa. Tales trastornos también incluyen varios trastornos fibróticos, que incluyen, pero sin limitación, la fibrosis pulmonar idiopática (IPF), esclerodermia, fibrosis cutánea inducida por radiación, fibrosis hepática que incluye fibrosis hepática inducida por esquistosomiasis, fibrosis renal, así como otras afecciones que se pueden mejorar mediante la administración de IFN-γ. La administración de un CIQ de acuerdo con la invención da como resultado un incremento de los niveles de IFN-γ, y da como resultado la mejora de uno o más síntomas, la estabilización de uno o más síntomas, o la prevención de la progresión (p.ej., la reducción o la eliminación de lesiones o síntomas adicionales) del trastorno que responde a IFN-γ. Los CIQs para el uso en los métodos de la invención se pueden poner en práctica en combinación con otras terapias que constituyen la norma asistencial del trastorno, tales como la administración de agentes anti-inflamatorios tales como la terapia sistémica con corticosteroides (p.ej., cortisona) en IPF.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona CIQs para el uso en métodos para incrementar el IFN-α en un individuo, en particular en un individuo que necesita niveles incrementados de IFN-α, mediante la administración de una cantidad eficaz de un CIQ al individuo, de forma que se incrementan los niveles de IFN-α. Los individuos que necesitan IFN-α incrementado son aquellos que tienen trastornos que responden a la administración de IFN-α, lo que incluye el IFN-α recombinante, que incluyen, pero sin limitación, las infecciones virales y el cáncer.
La administración de un CIQ de acuerdo con la invención da como resultado un incremento de los niveles de IFN-α, y da como resultado la mejora de uno o más síntomas, la estabilización de uno o más síntomas, o la prevención de la progresión (p.ej., la reducción o la eliminación de lesiones o síntomas adicionales) del trastorno que responde a IFN-α. Los CIQs para el uso en los métodos de la invención se pueden poner en práctica en combinación con otras terapias que constituyen la norma asistencial del trastorno, tales como la administración de agentes anti-virales para las infecciones virales.
Como será evidente tras la revisión de esta descripción, la composición del espaciador de un CIQ puede afectar a la respuesta inmunitaria generada por la administración del CIQ. Prácticamente todos los espaciadores ensayados (con la excepción de dodecilo) se pueden usar en los CIQs para inducir de manera eficaz IFN-γ en PBMCs humanas. Sin embargo, se ha observado que la composición del espaciador de los CIQs lineales tiene efectos diferenciales sobre la inducción de IFN-α. Por ejemplo, los CIQs que contienen, por ejemplo, espaciadores HEG, TEG o C6 tienden a provocar una inducción mayor de IFN-α (y una proliferación reducida de células B) en PBMCs que los CIQs que contienen espaciadores C3, C4 o abásicos (véase, p.ej., el Ejemplo 34, más adelante).
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También se proporcionan CIQs para el uso en métodos para reducir los niveles, en particular los niveles en suero, de IgE en un individuo que tiene un trastorno relacionado con IgE mediante la administración de una cantidad eficaz de un CIQ al individuo. En tales métodos, el CIQ se puede administrar solo (p.ej., sin antígeno) o se puede administrar con antígeno, tal como un alérgeno. Un trastorno relacionado con IgE es una afección, trastorno, o grupo de síntomas que mejoran mediante una reducción de los niveles de IgE. La reducción de IgE da como resultado una mejora de los síntomas del trastorno relacionado con IgE. Tales síntomas incluyen síntomas de alergia, tales como rinitis, conjuntivitis, una sensibilidad disminuida a alérgenos, una reducción de los síntomas de alergia en un individuo con alergias, o una reducción de la gravedad de una respuesta alérgica.
Los CIQs para el uso en los métodos de la invención incluyen las realizaciones en las que los CIQs se administran en forma de un/varios complejo(s) CIQ/microsoporte.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona CIQs para el uso en métodos para estimular la producción de CTL en un individuo, que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un CIQ al individuo, de manera que se incrementa la producción de CTL.
Como será evidente para un experto en la técnica, los CIQs para el uso en los métodos de la invención se pueden poner en práctica en combinación con otras terapias para la indicación particular para la que se administra el CIQ. Por ejemplo, la terapia con CIQ se puede administrar junto con fármacos anti-malaria, tales como cloroquina para los pacientes con malaria, junto con fármacos contra la leishmania, tales como pentamidina y/o alopurinol para los pacientes con leishmaniosis, junto con fármacos anti-micobacterianos, tales como isoniacida, rifampicina y/o etambutol en pacientes con tuberculosis, o junto con una terapia de desensibilización a alérgenos en pacientes atópicos (alérgicos).
A. Administración y Determinación de la Respuesta Inmunitaria
El CIQ se puede administrar en combinación con agentes farmacéuticos y/o inmunógenos y/u otros agentes inmunoestimuladores, tal como se describe en la presente memoria, y se puede combinar con un vehículo fisiológicamente aceptable de los mismos.
Por ejemplo, se puede administrar un CIQ o composición de la invención junto con otros agentes inmunoterapéuticos tales como citocinas, adyuvantes y anticuerpos. El CIQ se puede administrar junto con el agente (p.ej., al mismo tiempo), o antes o después (p.ej., menos de 24 horas antes o después de la administración del agente). El CIQ puede ser cualquiera de los descritos en la presente memoria.
Como con todas las composiciones inmunoestimuladoras, las cantidades inmunológicamente eficaces y el método de administración de la formulación particular de CIQ pueden variar dependiendo del individuo, de la afección a tratar y de otros factores evidentes para una persona experta en la técnica. Los factores a considerar incluyen la presencia de un antígeno coadministrado, si se administra o no el CIQ con o unido de manera covalente a un adyuvante o molécula de administración, la vía de administración y el número de dosis de inmunización a administrar. Tales factores se conocen en la técnica, y un experto en la técnica puede hacer tales determinaciones sin una experimentación excesiva. Un intervalo de dosis adecuado es uno que proporciona la modulación deseada de la respuesta inmunitaria hacia el antígeno. En general, la dosis se determina mediante la cantidad de CIQ administrada al paciente, más que por la cantidad total de CIQ. Los intervalos de dosis útiles del CIQ, proporcionados en cantidades de CIQ administrado, pueden ser, por ejemplo, desde aproximadamente cualquiera de los siguientes: 1 a 500 µg/kg, 100 a 400 µg/kg, 200 a 300 µg/kg, 1 a 100 µg/kg, 100 a 200 µg/kg, 300 a 400 µg/kg, 400 a 500 µg/kg. La cantidad absoluta dada a cada paciente depende de las propiedades farmacológicas, tales como la biodisponibilidad, la velocidad de eliminación y la vía de administración.
La cantidad eficaz y el método de administración de la formulación particular de CIQ pueden variar basándose en el paciente individual y la etapa de la enfermedad y otros factores evidentes para un experto en la técnica. La(s) vía(s) de administración útil(es) en una aplicación particular es/son evidente(s) para un experto en la técnica. Las vías de administración incluyen, pero sin limitación, las vías tópica, dérmica, transdérmica, transmucosa, epidérmica, parenteral, gastrointestinal, y nasofaríngea y pulmonar, que incluye transbronquial y transalveolar. Un intervalo de dosis adecuado es uno que proporciona suficiente composición que contiene CIQ para alcanzar una concentración tisular de aproximadamente 1-10 µM tal como se mide mediante los niveles sanguíneos. La cantidad absoluta dada a cada paciente depende de las propiedades farmacológicas, tales como la biodisponibilidad, la velocidad de eliminación y la vía de administración.
Como se describe en la presente memoria, las APCs y los tejidos con concentraciones elevadas de APCs son objetivos preferidos para el CIQ. Así, se prefiere la administración de CIQ a la piel y/o las mucosas de mamíferos, en las que las APCs están presentes en una concentración relativamente elevada.
La presente invención proporciona formulaciones de CIQ adecuadas para la aplicación tópica que incluyen, pero sin limitación, implantes fisiológicamente aceptables, pomadas, cremas, enjuagues y geles. La administración tópica es, por ejemplo, mediante vendajes o vendas que tienen dispersado en ellas un sistema de administración, mediante la administración directa de un sistema de administración dentro de incisiones o de heridas abiertas, o mediante un dispositivo de administración transdérmica dirigido a un sitio de interés. Las cremas, enjuagues, geles o pomadas
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que tienen dispersado en ellas un CIQ son adecuadas para el uso como pomadas tópicas o como agentes de relleno para heridas.
Las vías preferidas de administración dérmica son aquellas que son menos invasivas. Entre estos medios se prefiere la transmisión transdérmica, la administración epidérmica y la inyección subcutánea. De estos medios, se prefiere la administración epidérmica por las concentraciones mayores de APCs que se espera que haya en el tejido intradérmico.
La administración transdérmica se lleva a cabo mediante la aplicación de una crema, enjuague, gel, etc., capaz de permitir que el CIQ penetre en la piel y entre en el torrente sanguíneo. Las composiciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen, pero sin limitación, las suspensiones, aceites, cremas y pomadas farmacéuticamente aceptables, aplicados directamente sobre la piel o incorporados en un soporte protector, tal como un dispositivo transdérmico (denominado "parche"). Los ejemplos de cremas, pomadas etc., adecuadas se pueden hallar, por ejemplo, en el Physician's Desk Reference.
Para la transmisión transdérmica, la iontoforesis es un método adecuado. La transmisión iontoforética se puede llevar a cabo mediante el uso de parches disponibles comercialmente que administran el producto continuamente a través de la piel intacta durante periodos de varios días o más. El uso de este método permite la transmisión controlada de composiciones farmacéuticas en concentraciones relativamente grandes, permite la infusión de una combinación de fármacos y permite el uso simultáneo de un promotor de la absorción.
Un producto de parche ejemplar para el uso en este método es el producto de marca registrada LECTRO PATCH de General Medical Company de Los Angeles, CA. Este producto mantiene electrónicamente los electrodos del depósito a un pH neutro, y se puede adaptar para proporcionar dosis de concentraciones diferentes, para dosificar de manera continua y/o periódica. La preparación y el uso del parche se deberían realizar según las instrucciones impresas del fabricante que acompañan al producto LECTRO PATCH. También son adecuados otros sistemas de parches oclusivos.
Para la transmisión transdérmica, también es un método adecuado la administración ultrasónica a baja frecuencia. Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853. La aplicación de frecuencias ultrasónicas de baja frecuencia (alrededor de 1 MHz) permite la administración controlada de composiciones terapéuticas, que incluyen las de peso molecular elevado.
La administración epidérmica implica esencialmente la irritación mecánica o química de la capa más externa de la epidermis, lo suficiente para provocar una respuesta inmunitaria hacia el agente irritante. De manera específica, la irritación debería ser suficiente para atraer las APCs al sitio de irritación.
Un medio irritante mecánico ejemplar emplea una diversidad de púas cortas de diámetro muy estrecho, que se pueden usar para irritar la piel y para atraer las APCs al sitio de irritación, para tomar el CIQ transferido desde el extremo de las púas. Por ejemplo, la prueba de tuberculina antigua MONO-VACC, fabricada por Pasteur Merieux de Lyon, Francia, contiene un dispositivo adecuado para la introducción de composiciones que contienen CIQ.
El dispositivo (que se distribuye en los EE.UU. por Connaught Laboratories, Inc. de Swiftwater, PA) consiste en un recipiente de plástico que tiene un émbolo de jeringa en un extremo y un disco con púas en el otro. El disco de púas mantiene una diversidad de púas de diámetro estrecho con una longitud que solamente arañará la capa más externa de las células epidérmicas. Cada una de las púas del equipo MONO-VACC está revestida con tuberculina antigua; en la presente invención, cada aguja está revestida con una composición farmacéutica de una formulación de CIQ. El uso del dispositivo es preferiblemente según las instrucciones escritas del fabricante, incluidas con el producto del dispositivo. Los dispositivos similares que también se pueden usar en esta realización son los que se usan actualmente para realizar pruebas de alergia.
Otra aproximación adecuada para la administración epidérmica del CIQ es mediante el uso de un producto químico que irrita las células más exteriores de la epidermis, lo que provoca una respuesta inmunitaria suficiente para atraer las APCs hacia la zona. Un ejemplo es un agente queratinolítico, tal como el ácido salicílico usado en la crema depilatoria tópica, disponible comercialmente, vendida por Noxema Corporation, con la marca comercial NAIR. Esta aproximación se puede usar también para conseguir la administración epitelial en la mucosa. El agente irritante químico también se puede aplicar junto con el agente irritante mecánico (tal como, por ejemplo, ocurriría si la púa del tipo MONO-VACC también estuviera revestida con el agente irritante químico). El CIQ se puede suspender en un vehículo que también contiene el agente irritante químico, o se puede administrar junto con el mismo.
Las vías parenterales de administración incluyen, pero sin limitación, la inyección eléctrica (iontoforesis) o la inyección directa, tal como la inyección directa en una línea venosa central, la inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. Las formulaciones de CIQ adecuadas para la administración parenteral se formulan en general en agua USP o en agua para inyección, y pueden comprender además tampones de pH, agentes de carga salinos, agentes conservantes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Los CIQs para inyección parenteral se pueden formular en soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina y solución salina tamponada con fosfato, para inyección.
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Las vías de administración gastrointestinales incluyen, pero sin limitación, la ingestión y la vía rectal. La invención incluye las formulaciones de CIQ adecuadas para la administración gastrointestinal que incluyen, pero sin limitación, polvos, píldoras o líquidos farmacéuticamente aceptables para ingestión, y supositorios para administración rectal. Como será evidente para un experto en la técnica, las píldoras o supositorios comprenderán además sólidos farmacéuticamente aceptables, tales como almidón, para proporcionar la carga para la composición.
La administración nasofaríngea y pulmonar se lleva a cabo mediante inhalación, e incluyen vías de administración tales como las vías intranasal, transbronquial y transalveolar. La invención incluye formulaciones de CIQ adecuadas para la administración mediante inhalación que incluyen, pero sin limitación, las suspensiones líquidas para formar aerosoles, así como las formas en polvo para los sistemas de administración mediante inhalación de polvo seco. Los dispositivos adecuados para la administración mediante inhalación de las formulaciones de CIQ incluyen, pero sin limitación, los atomizadores, vaporizadores, nebulizadores y dispositivos de administración por inhalación de polvo seco.
La elección de las vías de administración se puede usar para modular la respuesta inmunitaria provocada. Por ejemplo, los títulos de IgG y las actividades de CTL fueron idénticos cuando se administró un vector del virus de la gripe por vía intramuscular o epidérmica (pistola de genes); sin embargo, la inoculación muscular produjo principalmente IgG2a, mientras que la vía epidérmica produjo principalmente IgG1. Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. Así, un experto en la técnica puede aprovechar las ligeras diferencias en la inmunogenicidad provocadas por las diferentes vías de administración de los oligonucleótidos inmunomoduladores de la presente invención.
Las composiciones y los métodos de administración anteriormente mencionados pretenden describir, pero no limitar, los métodos de administración de las formulaciones de CIQ de la invención. Los métodos para producir las diversas composiciones y dispositivos están dentro de la capacidad de una persona experta en la técnica, y no se describen con detalle en la presente memoria.
El análisis (tanto cualitativo como cuantitativo) de la respuesta inmunitaria hacia CIQ puede ser mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitación, la medición de la producción de anticuerpos específicos del antígeno (lo que incluye medir subclases del anticuerpo específicas), la activación de poblaciones específicas de linfocitos tales como células T CD4+, células NK o CTLs, la producción de citocinas tales como IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-12 y/o la liberación de histamina. Los métodos para medir las respuestas específicas de anticuerpos incluyen el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), y se conocen bien en la técnica. La medición del número de tipos específicos de linfocitos, tales como células T CD4+, se puede conseguir, por ejemplo, con separación de células activada por fluorescencia (FACS). La citotoxicidad y los ensayos de CTL se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523 y Cho et al. (2000). Las concentraciones de citocinas se pueden medir, por ejemplo, mediante ELISA. Estos y otros ensayos para estudiar la respuesta inmunitaria hacia un inmunógeno se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (1980) Mishell y Shiigi, eds., W.H. Freeman and Co.
Preferiblemente, se estimula, es decir, se provoca y/o se potencia una respuesta de tipo Th1. Con respecto a la invención, la estimulación de una respuesta inmunitaria de tipo Th1 se puede determinar in vitro o ex vivo midiendo la producción de citocinas de las células tratadas con un CIQ, en comparación con las que no se han tratado con CIQ. Los métodos para determinar la producción de citocinas de las células incluyen los métodos descritos en la presente memoria y cualquiera conocido en la técnica. El tipo de citocinas producidas en respuesta al tratamiento con CIQ indica una respuesta inmunitaria con tendencia hacia el tipo Th1 o el tipo Th2 por las células. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión producción de citocinas "con tendencia hacia el tipo Th1" se refiere a la producción incrementada medible de citocinas asociada a una respuesta inmunitaria de tipo Th1 en presencia de un estimulador, en comparación con la producción de tales citocinas en ausencia de estimulación. Los ejemplos de tales citocinas con tendencia hacia el tipo Th1 incluyen, pero sin limitación, IL-2, IL-12, IFN-γ e IFN-α. En contraste, "citocinas con tendencia hacia el tipo Th2" se refiere a las asociadas a una respuesta inmunitaria de tipo Th2, e incluyen, pero sin limitación, IL-4, IL5, e IL-13. Las células útiles para la determinación de la actividad de CIQ incluyen las células del sistema inmunitario, células primarias aisladas a partir de un hospedador y/o líneas celulares, preferiblemente APCs y linfocitos, aún más preferiblemente macrófagos y células T.
La estimulación de una respuesta inmunitaria de tipo Th1 se puede medir también en un hospedador tratado con un CIQ, y se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica que incluye, pero sin limitación: (1) una reducción de los niveles de IL-4 o IL-5 medidos antes y después de la exposición al antígeno; o la detección de niveles más bajos (o incluso inexistentes) de IL-4 o IL-5 en un hospedador tratado con CIQ, en comparación con un control sensibilizado con un antígeno, o sensibilizado y expuesto, tratado sin CIQ; (2) un incremento de los niveles de IL-12, de IL-18 y/o de IFN (α, β o γ) antes y después de la exposición al antígeno; o la detección de niveles más elevados de IL-12, IL-18 y/o IFN (α, β o γ) en un hospedador tratado con CIQ en comparación con un control sensibilizado con un antígeno, o sensibilizado y expuesto, tratado sin CIQ; (3) una producción de anticuerpos "con tendencia hacia el tipo Th1" en un hospedador tratado con CIQ, en comparación con un control tratado sin CIQ; y/o
(4) una reducción de los niveles de IgE específica del antígeno, tal como se mide antes y después de la exposición al antígeno; o la detección de niveles menores (o incluso inexistentes) de IgE específica del antígeno en un
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hospedador tratado con CIQ en comparación con un control sensibilizado con un antígeno, o sensibilizado y expuesto, tratado sin CIQ. Se puede realizar una diversidad de estas determinaciones midiendo las citocinas producidas por las APCs y/o los linfocitos, preferiblemente macrófagos y/o células T, in vitro o ex vivo mediante el uso de métodos descritos en la presente memoria o cualquiera conocido en la técnica. Algunas de estas determinaciones se pueden realizar midiendo la clase y/o la subclase de anticuerpos específicos del antígeno, mediante el uso de métodos descritos en la presente memoria o cualquiera conocido en la técnica.
La clase y/o la subclase de los anticuerpos específicos del antígeno producidos en respuesta a un tratamiento con CIQ indica una respuesta inmunitaria con tendencia hacia el tipo Th1 o el tipo Th2 por las células. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión producción de anticuerpos "con tendencia hacia el tipo Th1" se refiere a la producción incrementada y medible de anticuerpos asociada a una respuesta inmunitaria de tipo Th1 (es decir, anticuerpos asociados a Th1). Se puede medir uno o más anticuerpos asociados a Th1. Los ejemplos de tales anticuerpos con tendencia hacia el tipo Th1 incluyen, pero sin limitación, la IgG1 y/o la IgG3 humanas (véase, p.ej., Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581 y de Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160164) y la IgG2a murina. En contraste, los "anticuerpos con tendencia hacia el tipo Th2" se refieren a los asociados a una respuesta inmunitaria de tipo Th2, e incluyen, pero sin limitación, IgG2, IgG4 y/o IgE humanas (véase, p.ej., Widhe et al. (1998) y de Martino et al. (1999)) e IgG1 y/o IgE murinas.
La inducción de citocinas con tendencia hacia el tipo Th1 que se da como resultado de la administración de CIQ produce respuestas inmunitarias celulares aumentadas, tales como las que llevan a cabo las células NK, las células citotóxicas asesinas, las células cooperadoras Th1 y de memoria. Estas respuestas son especialmente beneficiosas para el uso en la vacunación protectora o terapéutica contra virus, hongos, parásitos protozoos, bacterias, enfermedades alérgicas y asma, así como tumores.
En ciertas realizaciones, se inhibe una respuesta Th2. La inhibición de una respuesta Th2 se puede determinar, por ejemplo, mediante la reducción de los niveles de citocinas asociadas a Th2, tales como IL-4 e IL-5, así como la reducción de IgE y la reducción de la liberación de histamina en respuesta a un alérgeno.
V. Equipos
Se describen equipos. En ciertas realizaciones, se describen equipos que comprenden uno o más recipientes que comprenden un CIQ. Los equipos pueden comprender además una serie adecuada de instrucciones, en general instrucciones escritas, relacionadas con el uso del CIQ para el tratamiento deseado (p.ej., la inmunomodulación, la mejora de los síntomas de una enfermedad infecciosa, el incremento de los niveles de IFN-γ, el incremento de los niveles de IFN-α, o la mejora de un trastorno relacionado con IgE).
Los equipos pueden comprender un CIQ envasado en cualquier envase conveniente y adecuado. Por ejemplo, si el CIQ es una formulación seca (p.ej., liofilizada o un polvo seco), se usa normalmente un vial con un tapón elástico, de forma que el CIQ se puede resuspender fácilmente inyectando líquido a través del tapón elástico. Se utilizan de manera más conveniente ampollas con cierres no elásticos ni extraíbles (p.ej., vidrio sellado) o tapones elásticos para las formulaciones líquidas de CIQ. También se contemplan los envases para el uso junto con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo para la administración nasal (p.ej., un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba.
Las instrucciones relacionadas con el uso de un CIQ incluyen en general información en cuanto a la dosis, el calendario de dosis y la vía de administración para el tratamiento deseado. Los recipientes del CIQ pueden ser dosis unitarias, envases a granel (p.ej., paquetes multidosis) o dosis de subunidades. Las instrucciones suministradas en los equipos de la invención en general son instrucciones escritas en una etiqueta o un folleto en el paquete (p.ej., una hoja de papel incluida en el equipo), pero también son aceptables las instrucciones legibles por una máquina (p.ej., instrucciones almacenadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
En ciertas realizaciones, los equipos comprenden además un antígeno (o uno o más antígenos), que pueden o no estar envasados en el mismo recipiente (formulación) que el/los CIQ(s). El antígeno se ha descrito en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, se describen equipos que comprenden un CIQ en forma de un complejo CIQ/microsoporte (CIQ/MS), y pueden comprender además una serie de instrucciones, en general instrucciones escritas, relacionadas con el uso del complejo CIQ/MS para el tratamiento deseado (p.ej., la inmunomodulación, la mejora de los síntomas de una enfermedad infecciosa, el incremento de los niveles de IFN-γ, el incremento de los niveles de IFN-α, o la mejora de un trastorno relacionado con IgE).
En ciertas realizaciones, se describen equipos que comprenden los materiales para la producción de complejos CIQ/MS e incluyen en general recipientes distintos de CIQ y de MS, aunque en ciertas realizaciones se suministran los materiales para producir MS en vez del MS formado previamente. El CIQ y el MS se suministran preferiblemente en una forma que permite la formación del complejo CIQ/MS después de mezclar el CIQ y el MS suministrados. Esta configuración se prefiere cuando el complejo CIQ/MS está unido mediante enlaces no covalentes. Esta configuración también se prefiere cuando el CIQ y el MS se van a reticular por medio de un reticulador heterobifuncional; el CIQ o el MS se suministran en una forma "activada" (p.ej., unido al reticulador heterobifuncional, de modo que hay
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disponible un resto reactivo con el CIQ).
Los equipos para los complejos CIQ/MS que comprenden un MS en fase líquida comprenden preferiblemente uno o más recipientes que incluyen materiales para la producción de MS en fase líquida. Por ejemplo, un equipo de CIQ/MS para una emulsión de MS de aceite-en-agua puede comprender uno o más recipientes que contienen una
5 fase oleosa y una fase acuosa. El contenido del recipiente se emulsiona para producir el MS, que a continuación se puede mezclar con el CIQ, preferiblemente un CIQ que se ha modificado para incorporar un resto hidrófobo. Tales materiales incluyen aceite y agua para la producción de emulsiones de aceite-en-agua, o recipientes de componentes de liposomas liofilizados (p.ej., una mezcla de fosfolípido, colesterol y un tensioactivo) más uno o más recipientes de una fase acuosa (p.ej., un tampón acuoso farmacéuticamente aceptable).
10 VI. Ejemplos
Los Ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invención.
Ejemplo 1: Estructura de los Polinucleótidos y los Compuestos Quiméricos
La Tabla 2 muestra las estructuras de los polinucleótidos y las moléculas quiméricas mencionadas en los Ejemplos. "HEG" es un resto espaciador de hexa(etilen glicol); "TEG" es trietilen glicol; "C3" es un resto espaciador de propilo;
15 "C4" es un espaciador de butilo; "C6" es un espaciador de hexilo; "C12" es un espaciador de dodecilo; "HME" es 2hidroximetiletilo; "abásico" o "ab" es 1'2'-didesoxirribosa. Otros espaciadores se describen en esta memoria descriptiva y en las figuras.
Excepto cuando se indique en la Tabla 2 o en ejemplos específicos, todas las uniones de nucleótidos y las uniones entre restos de ácido nucleico y restos espaciadores son éster de fosforotioato. Por ejemplo, en los CIQs que 20 comprenden restos espaciadores compuestos (múltiples subunidades) con múltiples unidades de HEG o C3 (p.ej., C-13, C-14, C-15, C-15, C-91, C-92, C-36, C-37, y C-38), las unidades C3 o HEG están unidas con un enlazador de fosforotiato. De forma similar, los CIQs ramificados mostrados (p.ej., C-93, C-94, C-95, C-96, C-97, C-98, C-100, C101, C-103, C-104, C-121, C-122, C-123, C-124, C-125, C-126, C-127, C-129, C-130) comprenden enlazadores de fosforotioato entre la subunidad de ramificación y la subunidad lineal del espaciador. Otros CIQs ramificados
25 mostrados (p.ej., C-26, C-99, C-102, C-105, y C-137) se preparan mediante estrategias de conjugación, y tienen grupos de unión como se describe en los Ejemplos.
La Tabla 2 incluye además CIQs (p.ej., C-128, C-106- C-113) con un grupo de unión en el extremo (p.ej., HS(CH2)6y HO(CH2)6SS(CH2)6) útil para unir estas moléculas con restos espaciadores ramificados para crear CIQs ramificados. Véase, p.ej., el Ejemplo 18. Estos grupos de unión se conectan al CIQ con una unión fosforotioato.
30 Tabla 2
Compuestos de ensayo y polinucleótidos
Número(s) de Denominación del Compuesto
Estructura
P-1
5'-TCGTCGA-3'
P-2
5'-TCGTCG-3'
P-3
5'-ACGTTCG-3'
P-4
5'-AGATGAT-3'
P-5
5'-ATCTCGA-3'
P-6
5'-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A-3' (SEQ ID Nº:134)
P-7
5'-TGA CTG TGA ACC TTA GAG ATG A-3' (SEQ ID Nº:135)
P-8
5'-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:136)
P-9
5'-CTGTGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:83)
P-10
5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:41)
P-11
5'-AACGTT-3'
P-12
5'-TCGTCGT-3'
P-13
5'-TCGAGAT-3'
P-14
5'-TCGACGT-3'

E11182593
30-07-2014 E11182593
Compuestos de ensayo y polinucleótidos
Número(s) de Denominación del Compuesto
Estructura
P-15
HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:137)
P-16
HS(CH2)6-5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:138)
M-1
5'-TGCTGC-3'-HEG-5'-AGCTTGC-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-8
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-9
5'-TCGTCGA-3'- C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-10
5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-11
5'-TCGTCG-3'- C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-12
(5'-TCGTCGA-3')2-glicerol-3'-AGCTGCT-5'
C-13
5'-TCGTCG-3'-(C3)15-5'-T-3'
C-14
5'-TCGTCG-3'-(HME)15-5'-T-3'
C-15
5'-TCGTCG-3'-(TEG)8-5'-T-3'
C-16
5'-TCGTCG-3'-(HEG)4-5'-T-3'
C-17
5'-TCGTCG-3'-C4-5'-ACGTTCG-3'-C4-5'-AGATGAT-3'
C-18
5'-TCGTCG-3'-TEG-5'-ACGTTCG-3'-TEG-5'-AGATGAT-3'
C-19
5'-TCGTCG-3'-C12-5'-ACGTTCG-3'-C12-5'-AGATGAT-3'
C-20
5'-TCGTCG-3'-abásico-5'-ACGTTCG-3'-abásico-5'-AGATGAT-3'
C-21
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-22
5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-TCGTCG-3'
C-23
5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-AACGTT-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-24
5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-25
5'-TCGTCG-3'-HME-5'-ACGTTCG-3'-HME-5'-AGATGAT-3'
C-26
(5'-TCGTCGA-3')4-R en la que R = dendrímero Starburst® (véase el Ej. 18)
C-27
(5'-TCGTCGA-3')2-glicerol-5'-AACGTTC-3'
C-28
(5'-TCGTCGA-3')2-glicerol-5'-TCGTCGA-3'
C-29
5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
C-30
HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
C-31
HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG (uniones fosfodiéster)
C-32
5'-TCG-3'-HEG-5'-TCG-3'-HEG-5'-TCG-3'-HEG-5'-TCG-3'-HEG-5'-TCG-3'-HEG-5'-TCG-3'
C-33
5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-TCGTCGA-3' todas uniones fosforotioato
C-34
HS(CH2)6-5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-35
imagen1
C-36
5'-TCGTCGA-3'-(HEG)6-5'-TCGTCGA-3' (uniones fosfodiéster)
C-37
5'-TCGTCGA-3'-(HEG)4-3'-AGCTGCT-5'

30-07-2014 E11182593
Compuestos de ensayo y polinucleótidos
Número(s) de Denominación del Compuesto
Estructura
C-38
5'-TCGTCGA-3'-(HEG)4-5'-TCGTCGA-3'
C-39
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-40
5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-TCGA-3'
C-41
5'-TCGTTTT-3'-HEG-5'-TCGTTTT-3'-HEG-5'-TCGTTTT-3'
C-42
5'-TCGTCGT-3'-HEG-5'-TCGTCGT-3'-HEG-5'-TCGTCGT-3'
C-43
5'-TCGTC-3'-HEG-5'-TCGTC-3'-HEG-5'-TCGTC-3'-HEG-5'-TCGTC-3'
C-44
5'-TCGT-3'-HEG-5'-TCGT-3'-HEG-5'-TCGT-3'-HEG-5'-TCGT-3'-HEG-5'-TCGT-3'
C-45
5'-TCGAGAT-3'-HEG-5'-TCGAGAT-3'-HEG-5'-TCGAGAT-3'
C-46
5'-TTCGTTT-3'-HEG-5'-TTCGTTT-3'-HEG-5'-TTCGTTT-3'
C-47
5'-TCGTCGT-3'-HEG-5'-TGTCGTT-3'-HEG-5'-TGTCGTT-3'
C-48
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-49
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-GGGGGG-3'
C-50
5'-TCGAACG-3'-HEG-5'-TCGAACG-3'-HEG-5'-TCGAACG-3'
C-51
5'-TCGACGT-3'-HEG-5'-TCGACGT-3'-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-52
5'-CGTTCGA-3'-HEG-5'-CGTTCGA-3'-HEG-5'-CGTTCGA-3'
C-53
5'-TGACTGTGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-54
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-55
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-56
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'
C-57
5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-58
5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-59
5'-AGATGAT-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'
C-60
5'-AGATGAT-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-61
5'-TCCATTT-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TGACGTT-3'
C-62
5'-TGACGTT-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCCATTT-3'
C-63
5'-TCGACTC-3'-HEG-5'-TCGAGCG-3'-HEG-5'-TTCTCTT-3'
C-64
5'-CTGTGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:83)-HEG-5'-CTGTGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:83)
C-65
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'-HEG-3'-AGCTGCT-5'
C-66
5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:41)-HEG-5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:41)
C-67
5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3' (SEQ ID Nº:41)-HEG-3'-GTAGAGCTTGCAAGCTGCT-5' (SEQ ID Nº:41)
C-68
5'-TCG-3'-HEG-5'-T-3'
C-69
5'-TCGAT-3'-HEG-5'-TCGAT-3'-HEG-5'-TCGAT-3'-HEG-5'-TCGAT-3'
C-70
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-AGAT-3'
C-71
5'-TCGACGT-3'-HEG-5'-TCGACGT-3'-HEG-5'-TCGACGT-3'-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-72
5'-TCCTCCA-3'-HEG-5'-ACCTTAG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3' (sin CG)

30-07-2014 E11182593
Compuestos de ensayo y polinucleótidos
Número(s) de Denominación del Compuesto
Estructura
C-73
5'-ACGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTCGA-3'
C-74
5'-TCGATTT-3'-HEG-5'-TCGATTT-3'-HEG-5'-TCGATTT-3'
C-75
5'-TTCGATT-3'-HEG-5'-TTCGATT-3'-HEG-5'-TTCGATT-3'
C-76
5'-TTTCGAT-3'-HEG-5'-TTTCGAT-3'-HEG-5'-TTTCGAT-3'
C-77
5'-TTTTCGA-3'-HEG-5'-TTTTCGA-3'-HEG-5'-TTTTCGA-3'
C-78
5'-TCGCTTT-3'-HEG-5'-TCGCTTT-3'-HEG-5'-TCGCTTT-3'
C-79
5'-TCGGTTT-3'-HEG-5'-TCGGTTT-3'-HEG-5'-TCGGTTT-3'
C-80
5'-ACGATTT-3'-HEG-5'-ACGATTT-3'-HEG-5'-ACGATTT-3'
C-81
5'-ATCGAT-3'-HEG-5'-ATCGAT-3'-HEG-5'-ATCGAT-3'
C-82
5'-ATCGATT-3'-HEG-5'-ATCGATT-3'-HEG-5'-ATCGATT-3'
C-83
5'-AACGTT-3'-HEG-5'-AACGTT-3'-HEG-5'-AACGTT-3'
C-84
C397: 5'-GsGs-3'-C3-5'-TGC-3'-C3-5'-ATCGAT-3'-C3-5'-GCA-3'-C3-5'-GGsGsGsGsG-3' (s = uniones fosforotioato, de lo contrario las uniones son fosfodiéster)
C-85
5'-GsGs-3'-C3-5'-TCGTGC-3'-C3-5'-ATCGAT-3'-C3-5'-GCACGA-3'-C3-5'-GGsGsGsGsG-3' (s = uniones fosforotioato, de lo contrario las uniones son fosfodiéster)
C-86
5'-TGCTGCA-3'-C3-5'-AGCTTGC-3'-C3-5'-AGATGAT-3' (sin CG)
C-87
5'-GsGsGsGs-3'-C3-5'-ATCGAT-3'-C3-5'-TGATGCATCA-3'-C3-5'-ATCGAT-3'-C3-5'-GsGsGsGsGsG-3' (s = uniones fosforotioato, de lo contrario las uniones son fosfodiéster)
C-88
5'-TCCA-3'-C3-5'-TGACGTT-3'-C3-5'-CCTGATGCT-3'
C-89
5'-TGACTGTGA-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-AGATGAT-3'
C-90
5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-TCGTCGA-3'
C-91
5'-TCG-3'-(ab)3-5'-T-3'
C-92
(ab)-5'-TCG-3'-(ab)2-5'-T-3'
C-93
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-TCGTCGA-3' (fosfodiéster)
C-94
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-95
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-3'-AGCTGCT-5'
C-96
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-AACGTTC-3'
C-97
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGA-3'
C-98
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)3-triplicador-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGA-3'
C-99
TMEA-(5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3')3 (SEQ ID Nº:139) (véase el Ej. 23)
C-100
(5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-101
(5'-TCGACGT-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-102
Dendrímero Starburst®-(5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3')x (X intervalo = 3-16) (SEQ ID Nº:2) (Véase el Ej. 24)
C-103
(5'-TCGTCGA-3'-TEG)2-glicerol-TEG-5'-TCGTCGA-3'
C-104
(5'-TCGTCGA-3'-C3)2-glicerol-C3-5'-TCGTCGA-3'

30-07-2014
Compuestos de ensayo y polinucleótidos
Número(s) de Denominación del Compuesto
Estructura
C-105
TMEA-(S-(CH2)3-3'-TAGTAGA-5'-HEG-3'-GCTTGCA-5'-HEG-3'-AGCTGCT-5')3 (véase el Ej. 23)
C-106
HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:140)
C-107
HS(CH2)6-5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID Nº:141)
C-110
HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TCGTCG-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-111
HS(CH2)6-5'-TCGTCG-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-112
HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-113
HS(CH2)6-5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-114
5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'-C3-(CH2)3SS(CH2)3OH
C-115
5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'-C3-(CH2)3SH
C-116
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-(CH2)3SS(CH2)3OH
C-117
5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-(CH2)3SH
C-118
5'-TCGTCGA-3'-HEG-C3-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
C-119
5'-TCGA-3'-HEG-5'-TCGA-3'-HEG-5'-TCGA-3'-HEG-5'-TCGA-3'-HEG-5'-TCGA-3'
C-120
5'-TCGTCG-3'-C6-5'-ACGTTCG-3'-C6-5'-AGATGAT-3'
C-121
(5'-AACGTT-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-AACGTT-3'
C-122
(5'-TCAACGTT-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-TCAACGTT-3'
C-123
(5'-TCGTCGA-3'-HEG-HEG)2-glicerol-HEG-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-124
(5'-TCGACGT-3'-HEG)2-doblador simétrico-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-125
(5'-TCGACGT-3'-HEG)3-triplicador-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-126
((5'-TCGACGT-3'-HEG)2-glicerol-HEG)2-glicerol-HEG-5'-TCGACGT-3'
C-127
(5'-TCGACGT-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-AACGTTC-3'
C-128
HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TCGTCGA-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-129
((5'-TCGACGT-3'-HEG)2-glicerol-HEG)2-glicerol-HEG-5'-T-3'
C-130
(5'-TCGACGT-3'-HEG)3-triplicador-HEG-5'-T-3'
C-131
5'-TCGTCGA-3'-C4-5'-ACGTTCG-3'-C4-5'-AGATGAT-3'
C-132
5'-TCGTCGA-3'-C6 -5'-ACGTTCG-3'-C6-5'-AGATGAT-3'
C-133
5'-TCGTCGA-3'-TEG-5'-ACGTTCG-3'-TEG-5'-AGATGAT-3'
C-134
5'-TCGTCGA-3'-PEG-5'-ACGTTCG-3'-PEG-5'-AGATGAT-3' [PEG=(CH2CH2O)45]
C-135
5'-TCGACGT-3'-HEG-(CH2)3SS(CH2)3OH
C-136
5'-TCGACGT-3'-HEG-(CH2)3SH
C-137
(5'-TCGACGT-3'-HEG)x-Ficoll400 (X intervalo = 150-250, media 185) Véase el ejemplo 49

Ejemplo 2: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Hexaetilen Glicol
Se sintetizó C-10, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son hexaetilen glicol (HEG), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-10: 5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'
E11182593
30-07-2014
La molécula de C-10 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritilhexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. (Como será evidente para el lector experto, los términos "monómero de nucleósido" o "resto espaciador" se usan a veces en la presente memoria, p.ej., en el contexto de la síntesis de CIQs, para referirse a los reactivos precursores que cuando se desprotegen y se unen a otros componentes mediante el uso de métodos sintéticos tales como los descritos en la presente memoria, dan lugar al ácido nucleico y a restos distintos de ácido nucleico de los CIQs). El precursor del espaciador HEG se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores HEG en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador HEG
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador HEG
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

El ciclo de síntesis consistió en una etapa de destritilación, una etapa de acoplamiento (monómero de fosforamidita más 1H-tetrazol), una etapa de bloqueo, una etapa de sulfuración mediante el uso de 1,1-dióxido de 3H-1,2benzoditiol-3-ona 0,05 M (reactivo de Beaucage), y una etapa final de bloqueo. Al final del ensamblaje, el compuesto "sin tritilo" se escindió del vidrio de poro controlado y las bases se desprotegieron con amoniaco acuoso concentrado a 58°C durante 16 horas. El compuesto se purificó mediante electroforesis preparativa en poliacrilamida, se desaló con un cartucho Sep-pak Plus (Waters, Milford, MA), y se precipitó a partir de cloruro sódico acuoso 1 M con 2,5 volúmenes de etanol del 95%. La molécula se disolvió en agua Milli Q y se determinó el rendimiento a partir de la absorbancia a 260 nm. Finalmente, el compuesto se liofilizó hasta proporcionar un polvo. El compuesto se caracterizó mediante electroforesis capilar en gel, espectrometría de masas por electronebulización, y RP-HPLC para confirmar la composición y la pureza. También se llevó a cabo un ensayo de contenido de endotoxinas (ensayo LAL, Bio Whittaker), que demostró que los niveles de endotoxinas fueron <5 UE/mg de compuesto (es decir, esencialmente sin endotoxinas).
Se sintetizaron C-8, C-21, C-22, C-23, C-24, C-32 y M-1 y otros HEG-CIQs lineales de manera análoga.
Ejemplo 3: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Propilo
Se sintetizó C-11, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son propilo (C3), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-11: 5'-TCGTCG-3'- C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
La molécula de C-11 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritil-propilO-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El precursor del espaciador C3 se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores C3 en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador C3
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador C3
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

50 La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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Se sintetizaron C-9 y otros CIQs que contienen C3 de manera análoga.
Ejemplo 4: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y con Espaciadores de Butilo
Se sintetizó C-17, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son butilo (C4), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-17: 5'-TCGTCG-3'-C4-5'-ACGTTCG-3'-C4-5'-AGATGAT-3'
La molécula de C-17 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritil-butilO-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de ChemGenes, Ashland, MA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El precursor del espaciador C4 se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores C4 en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador C4
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador C4
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 5: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Trietilen Glicol
Se sintetizó C-18, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son trietilen glicol (TEG), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-18: 5'-TCGTCG-3'-TEG-5'-ACGTTCG-3'-TEG-5'-AGATGAT-3'
La molécula de C-18 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritiltrietilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El precursor del espaciador TEG se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores TEG en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador TEG
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador TEG
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3' La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2. Ejemplo 6: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Dodecilo Se sintetizó C-19, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones

fosforotioato, y los restos espaciadores son dodecilo (C12), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato. C-19: 5'-TCGTCG-3'-C12-5'-ACGTTCG-3'-C12-5'-AGATGAT-3' La molécula de C-19 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN
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automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritildodecil-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El precursor del espaciador C12 se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores C12 en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador C12
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador C12
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 7: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores Abásicos
Se sintetizó C-20, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son 1', 2'-didesoxirribosa (abásico), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-20: 5'-TCGTCG-3'-abásico-5'-ACGTTCG-3'-abásico-5'-AGATGAT-3'
La molécula de C-20 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)1',2'-didesoxirribosa-3'-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El precursor del espaciador abásico se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores abásicos en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador abásico
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador abásico
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 8: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Hexaetilen Glicol y Trietilen Glicol
Se sintetizó C-29, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, los restos espaciadores son hexaetilen glicol (HEG), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato, y el grupo del extremo 3' es trietilen glicol (TEG), conectado al resto de ácido nucleico por medio de una unión fosforotioato.
C-29: 5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
La molécula de C-29 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. El trietilen glicol-vidrio de poro controlado, usado como soporte sólido para la síntesis, fue de Glen Research (Sterling, VA). Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-Odimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El espaciador HEG se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores HEG en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
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1.
Uso de un soporte sólido de trietilen glicol
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGAT-3'
3.
Adición del espaciador HEG
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador HEG
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 9: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Hexaetilen Glicol y Trietilen Glicol
Se sintetizó C-30, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, los restos espaciadores y el grupo del extremo 5' son hexaetilen glicol (HEG), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato, y el grupo del extremo 3' es trietilen glicol (TEG), conectado al resto de ácido nucleico por medio de una unión fosforotioato.
C-30: HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
La molécula de C-30 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. El trietilen glicol-vidrio de poro controlado, usado como soporte sólido para la síntesis, fue de Glen Research (Sterling, VA). Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-Odimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El precursor del espaciador HEG se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores HEG en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido de trietilen glicol
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGAT-3'
3.
Adición del espaciador HEG
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador HEG
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'
7.
Adición del espaciador HEG

La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 10: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de Hexaetilen Glicol y Trietilen Glicol, y con Uniones Fosfodiéster
Se sintetizó C-31, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosfodiéster, los restos espaciadores y el grupo del extremo 5' son hexaetilen glicol (HEG), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosfodiéster, y el grupo del extremo 3' es trietilen glicol (TEG), conectado al resto de ácido nucleico por medio de una unión fosfodiéster.
C-31: HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
La molécula de C-31 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosfodiéster. El trietilen glicol-vidrio de poro controlado, usado como soporte sólido para la síntesis, fue de Glen Research (Sterling, VA). Los monómeros de nucleósidos y el resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El espaciador HEG se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores HEG en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1. Uso de un soporte sólido de trietilen glicol
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Síntesis del resto 5'-AGATGAT-3'
3.
Adición del espaciador HEG
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador HEG
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'
7.
Adición del espaciador HEG

El ciclo de síntesis consistió en una etapa de destritilación, una etapa de acoplamiento (monómero de fosforamidita más 1H-tetrazol), una etapa de bloqueo, una etapa de oxidación, y una etapa de bloqueo final. Al final del ensamblaje, el compuesto "sin tritilo" se escindió del vidrio de poro controlado y las bases se desprotegieron con amoniaco acuoso concentrado a 58°C durante 16 horas. El compuesto se purificó mediante electroforesis preparativa en poliacrilamida, se desaló con un cartucho Sep-pak Plus (Waters, Milford, MA), y se precipitó a partir de cloruro sódico acuoso 1 M con 2,5 volúmenes de etanol del 95%. El compuesto se disolvió en agua Milli Q y se determinó el rendimiento a partir de la absorbancia a 260 nm. Finalmente, el compuesto se liofilizó hasta proporcionar un polvo. El compuesto se caracterizó mediante electroforesis capilar en gel, espectrometría de masas por electronebulización, y RP-HPLC para confirmar la composición y la pureza. También se llevó a cabo un ensayo del contenido de endotoxinas (ensayo LAL, Bio Whittaker), que demostró que los niveles de endotoxinas fueron <5 UE/mg de compuesto.
Ejemplo 11: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y Espaciadores de 2-(Hidroximetil)etilo
Se sintetizó C-25, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son 2-(hidroximetil)etilo (HME), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-25: 5'-TCGTCG-3'-HME-5'-ACGTTCG-3'-HME-5'-AGATGAT-3'
La molécula de C-25 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 1-O-(4,4'-dimetoxitritil)-3O-levulinil-glicerol-2-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de ChemGenes, Ashland, MA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El espaciador HME se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores HME en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición del espaciador HME
4.
Síntesis del resto 5'-ACGTTCG-3'
5.
Adición del espaciador HME
6.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2. El grupo levulinilo se elimina durante el tratamiento con amoniaco.
Ejemplo 12: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y un Resto Espaciador Cargado Negativamente
Se sintetizó C-13, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y el resto espaciador es un polímero de propilo (C3) unido por medio de uniones fosforotioato.
C-13: 5'-TCGTCG-3'-(C3)15-5'-T-3'
La molécula de C-13 se sintetizó en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritil-propil-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,1 M. El espaciador C3 se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores C3 en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
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1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Adición de 15 espaciadores C3
3.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'

El ciclo de síntesis consistió en una etapa de destritilación, una etapa de acoplamiento (monómero de fosforamidita más 1H-tetrazol), una etapa de bloqueo, una etapa de sulfuración mediante el uso de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ADTT) 0,02 M en 9:1 de acetonitrilo:piridina, y una etapa de bloqueo final. Al final del ensamblaje, el compuesto "con tritilo" se escindió del vidrio de poro controlado y las bases se desprotegieron con amoniaco acuoso concentrado a 58°C durante 16 horas. El compuesto se purificó mediante HPLC en una columna Hamilton PRP-1 con el uso de un gradiente creciente de acetonitrilo en acetato de trietilamonio 0,1 M. El compuesto purificado se concentró hasta sequedad, se eliminó el grupo 4,4'-dimetoxitritilo con un 80% de ácido acético acuoso, y después el compuesto se precipitó dos veces a partir de cloruro sódico acuoso 1 M con 2,5 volúmenes de etanol del 95%. El compuesto se disolvió en agua Milli Q y se determinó el rendimiento a partir de la absorbancia a 260 nm. Finalmente, el compuesto se liofilizó hasta proporcionar un polvo.
El compuesto se caracterizó mediante electroforesis capilar en gel, espectrometría de masas por electronebulización, y RP-HPLC para confirmar la composición y la pureza. También se llevó a cabo un ensayo del contenido de endotoxinas (ensayo LAL, Bio Whittaker), que demostró que los niveles de endotoxinas fueron <5 UE/mg de compuesto.
C-14, C-15 y C-16 se sintetizaron de manera análoga.
Ejemplo 13: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y un Resto Espaciador Cargado Negativamente
Se sintetizó C-38, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son hexaetilen glicol (HEG), conectados por medio de uniones fosforotioato.
C-38: 5'-TCGTCGA-3'-(HEG)4-5'-TCGTCGA-3'
La molécula de C-38 se sintetizó como se describió en el Ejemplo 2. El precursor del resto espaciador es 4,4'-Odimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA). La síntesis se realizó llevando a cabo las etapas siguientes:
1.
Uso de un soporte sólido "A" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'
3.
Adición de 4 espaciadores HEG
4.
Síntesis del resto 5'-TCGTCGA-3'

El compuesto se purificó mediante el uso de HPLC como se describió en el Ejemplo 12. El compuesto se caracterizó, y se determinó el contenido de endotoxinas como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 14: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Lineal y un Resto Espaciador Cargado Negativamente con Ambos Restos de Ácido Nucleico Unidos por Medio del Extremo 3'
Se sintetizó C-37, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son hexaetilen glicol (HEG), conectados por medio de uniones fosforotioato.
C-37: 5'-TCGTCGA-3'-(HEG)-3'-AGCTGCT-5'
La molécula de C-37 se sintetizó como se describió en el Ejemplo 2, excepto porque se usó un nucleósido unido al soporte en 5' y 3'-O-(4,4'-dimetiloxitritil)-nucleósido protegido-5'-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamiditas (Glen Research, Sterling, VA) para sintetizar el primer resto de ácido nucleico. El precursor del resto espaciador es 4,4'-Odimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA). La síntesis se realizó llevando a cabo las etapas siguientes:
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 5' al soporte
2.
Síntesis del resto 3'-AGCTGC-5' con 3'-O-(4,4'-dimetiloxitritil)-nucleósido protegido-5'-O-(N,N-diisopropil) 2cianoetilfosforamiditas (síntesis de 5' a 3')
3.
Adición de 4 espaciadores HEG
4.
Síntesis del resto 5'-TCGTCGA-3' con 5'-O-(4,4'-dimetiloxitritil)-nucleósido protegido-3'-O-(N,N-diisopropil) 2cianoetilfosforamiditas (síntesis de 3' a 5')

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El compuesto se purificó mediante el uso de HPLC como se describió en el Ejemplo 12. El compuesto se caracterizó, y se determinó el contenido de endotoxinas como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 15: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada
Se sintetizó C-27, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y el resto espaciador es glicerol, conectado a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-27: (5'-TCGTCGA-3')2-glicerol-5'-AACGTTC-3'
La molécula de C-27 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 1,3-di-(4,4'-Odimetoxitritil)-glicerol-2-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (fosforamidita ramificada simétrica obtenida de ChemGenes, Ashland, MA, Figura 2) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El espaciador de glicerol se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y el espaciador de glicerol en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "C" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AACGTT-3'
3.
Adición de la fosforamidita ramificada simétrica basada en glicerol
4.
Síntesis de dos restos de 5'-TCGTCGA-3' de manera simultánea

La preparación de este compuesto ramificado siguió el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 2, excepto porque en la etapa 4 cada administración de reactivo en el ciclo de síntesis fue doble debido a que las dos cadenas de ácido nucleico se construyeron de manera simultánea. La fosforamidita ramificada simétrica mostrada en la Figura 2 requiere que las secuencias de ácido nucleico sintetizadas tras la adición de la fosforamidita ramificada simétrica sean iguales, aunque la secuencia de ácido nucleico sintetizada antes de su adición puede ser igual o diferente de estas últimas secuencias.
El compuesto ramificado se purificó y se caracterizó como se describió en el Ejemplo 2.
C-28 se sintetizó de manera análoga.
Ejemplo 16: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada y con Todos los Restos de Ácido Nucleico Unidos por Medio del Extremo 3'
Se sintetizó C-95, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y los restos espaciadores son glicerol y HEG, conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-95: (5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-3'-AGCTGCT-5'
La molécula de C-95 se sintetizó como se describió en el Ejemplo 2, excepto porque se usó un nucleósido unido al soporte en 5' y 3'-O-(4,4'-dimetiloxitritil)-nucleósido protegido-5'-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamiditas (Glen Research, Sterling, VA) para sintetizar el primer resto de ácido nucleico. El precursor del resto espaciador ramificado es 1,3-di-(4,4'-O-dimetoxitritil)-glicerol-2-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (fosforamidita ramificada simétrica obtenida de ChemGenes, Ashland, MA, Figura 2). La síntesis se realizó llevando a cabo las etapas siguientes:
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 5' al soporte
2.
Síntesis del resto 3'-AGCTGC-5' con 3'-O-(4,4'-dimetiloxitritil)-nucleósido protegido-5'-O-(N,N-diisopropil) 2cianoetil fosforamiditas (síntesis de 5' a 3')
3.
Adición de un espaciador HEG
4.
Adición de la fosforamidita ramificada simétrica basada en glicerol
5.
Adición de dos espaciadores HEG de manera simultánea
6.
Síntesis de dos restos 5'-TCGTCGA-3' de manera simultánea con 5'-O-(4,4'-dimetiloxitritil)-nucleósido protegido3'-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamiditas (síntesis de 3' a 5')

La preparación de este compuesto ramificado siguió el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 2, excepto porque en
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las etapas 5 y 6 cada administración de reactivo en el ciclo de síntesis fue doble debido a que las dos cadenas de ácido nucleico se construyeron de manera simultánea. La fosforamidita ramificada simétrica mostrada en la Figura 2 requiere que las secuencias de ácido nucleico sintetizadas tras la adición de la fosforamidita ramificada simétrica sean iguales, aunque la secuencia de ácido nucleico sintetizada antes de su adición puede ser igual o diferente de estas últimas secuencias.
El compuesto se purificó mediante el uso de HPLC como se describió en el Ejemplo 12. El compuesto se caracterizó, y se determinó el contenido de endotoxinas como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 17: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada, Que Contiene Tres Restos de Ácido Nucleico Diferentes
Se sintetiza C-35, que tiene la fórmula mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y el resto espaciador es glicerol, conectado a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato. imagen2
La molécula de C-35 se sintetiza como se describió en el Ejemplo 2. Los monómeros de nucleósidos y el precursor del resto espaciador, 1-(4,4'-O-dimetoxitritil)-3-O-levulinil-glicerol-2-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (fosforamidita ramificada asimétrica obtenida de ChemGenes, Ashland, MA, Figura 2) se disuelven en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El espaciador de glicerol se coloca en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programa para añadir los monómeros de nucleótidos y el espaciador de glicerol en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se da en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "T" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-AGATGA-3'
3.
Adición de la fosforamidita ramificada asimétrica basada en glicerol
4.
Síntesis del resto 5'-AACGTTC-3' en el extremo de dimetoxitritilo
5.
Destritilación y bloqueo del resto AACGTTC
6.
Eliminación del grupo protector levulinilo
7.
Síntesis del resto 5'-TCGTCGA-3'

La síntesis tiene lugar básicamente como se describió en el Ejemplo 2, excepto porque después de la etapa 4, el resto 5'-AACGTTC-3' se destritila y se bloquea con anhídrido acético/N-metilimidazol para terminar ese resto de ácido nucleico. A continuación, el grupo protector levulinilo se elimina con hidrato de hidrazina 0,5 M en 3:2 de piridina:ácido acético/pH 5,1 durante 5 min. El soporte sólido que contiene el compuesto se lava bien con acetonitrilo anhidro, y se añade el resto 5'-TCGTCGA-3' mediante el uso del protocolo descrito en el Ejemplo 2.
El compuesto ramificado se purifica y se caracteriza como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 18: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada Mediante una Estrategia de Conjugación
Se sintetiza C-36 como se muestra en la Figura 3. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y el resto espaciador se basa en un dendrímero STARBURST®. El resto de ácido nucleico se sintetiza con un espaciador 5'-C6-disulfuro (modificador tiol C6 S-S, Glen Research, Sterling, VA producto nº 10-1926-xx), que tras la reducción, proporciona un grupo tiol que puede reaccionar con los grupos maleimida del dendrímero.
Síntesis de 5'-C6-disulfuro-TCGTCGA (4):
El 5'-C6-disulfuro-TCGTCGA se sintetiza mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 con el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y el modificador tiol C6 S-S (Glen Research, Sterling, VA) se disuelven en acetonitrilo anhidro hasta una concentración final de 0,1 M. El modificador tiol se coloca en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programa para añadir los monómeros de nucleótidos y el modificador tiol en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se da en la dirección 3' a 5'.
1. Uso de un soporte sólido "A" con unión en 3' al soporte
5
10
15
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35
40
45
50
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2.
Síntesis del resto 5'-TCGTCG-3'
3.
Adición del precursor del modificador tiol (S-tritil-6-mercaptohexil)-(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforamidita)

El ciclo de síntesis consiste en una etapa de destritilación, una etapa de acoplamiento (monómero de fosforamidita más 1H-tetrazol), una etapa de bloqueo, una etapa de sulfuración mediante el uso de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ADTT) 0,02 M en 9:1 de acetonitrilo:piridina, y una etapa de bloqueo final. Al final del ensamblaje, el compuesto "con tritilo" se escinde del vidrio de poro controlado y las bases se desprotegen con amoniaco acuoso concentrado a 58°C durante 16 horas. El compuesto se purifica mediante HPLC en una columna Hamilton PRP-1 con el uso de un gradiente creciente de acetonitrilo en acetato de trietilamonio 0,1 M. El compuesto purificado se concentra hasta sequedad, se elimina el grupo 4,4'-dimetoxitritilo con un 80% de ácido acético acuoso, y después el compuesto se precipita dos veces a partir de cloruro sódico acuoso 1 M con 2,5 volúmenes de etanol del 95%. El compuesto se disuelve en agua Milli Q y se determina el rendimiento a partir de la absorbancia a 260 nm. Finalmente, el compuesto se liofiliza hasta proporcionar un polvo.
El compuesto se caracteriza mediante electroforesis capilar en gel, espectrometría de masas por electronebulización, y RP-HPLC para confirmar la composición y la pureza. También se lleva a cabo un ensayo del contenido de endotoxinas (ensayo LAL, Bio Whittaker), que demuestra que los niveles de endotoxinas fueron <5 UE/mg de compuesto.
Síntesis de 5'-tiol-C6-TCGTCGA (5):
El ácido nucleico modificado con disulfuro (4) se reduce hasta un tiol mediante el uso de hidrocloruro de tris(2carboxietil)fosfina (TCEP; Pierce, Rockford, IL). El ácido nucleico se disuelve a una concentración de 20 mg/ml en un tampón que contiene fosfato sódico 0,1 M/cloruro sódico 0,15 M/pH 7,5. En un vial distinto, se disuelve TCEP a una concentración de 0,17 M en fosfato sódico 0,1 M/cloruro sódico 0,15 M/pH 7,5. Se añaden 5 equivalentes de TCEP al ácido nucleico y se mezcla suavemente. Se incuba la disolución durante 120 min a 40°C y después se purifica mediante cromatografía de exclusión por tamaños (columna Pharmacia P2) para proporcionar el 5'-tiol-C6-TCGTCGA (5).
Síntesis del dendrímero STARBURST® modificado con maleimida (7):
Hay disponibles dendrímeros STARBURST® con diversos números de aminas (4, 8, 16, 32, 64, etc.) de Aldrich (Milwaukee, WI). Se disuelve un dendrímero Starburst® (6), que tiene cuatro grupos amino, en dimetilformamida (DMF) a una concentración de 0,2 M. Después se añade trietilamina (10 equivalentes) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC; Pierce, Rockford, IL, 8 equivalentes) y la disolución se agita durante 2 horas o hasta la finalización, tal como se determina mediante cromatografía en capa fina (CCF; 10% de metanol/diclorometano). La reacción se para con agua durante 30 min y después se elimina la DMF a vacío. El residuo se disuelve en diclorometano y se lava dos veces con bicarbonato sódico acuoso saturado y después agua. La fase orgánica se seca sobre MgSO4, se filtra, y se concentra hasta sequedad a vacío. El producto se purifica mediante cromatografía en gel de sílice para proporcionar 7.
Síntesis del dendrímero STARBURST®-(5'-TCGTCGA-3')4 (8):
El dendrímero STARBURST® modificado con maleimida (6) se disuelve en DMSO (5 mg/ml) y el 5'-C6-tiol-TCGTCGA (5) (10 equivalentes) purificado, disuelto a una concentración de 10 mg/ml en fosfato sódico 0,1 M/cloruro sódico 0,15 M/pH 7,5, se añade gota a gota. La mezcla resultante se agita a 40 ºC durante la noche. El conjugado se purifica mediante cromatografía de exclusión por tamaños (Sephadex G-25) para proporcionar el compuesto 8.
Ejemplo 19: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada
Se sintetizó C-94, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y el resto espaciador es glicerol, conectado a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-94: (5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-glicerol-HEG-5'-TCGTCGA-3'
La molécula de C-94 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y los precursores de los restos espaciadores [1,3-di-(4,4'-Odimetoxitritil)-glicerol-2-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (fosforamidita ramificada simétrica obtenida de ChemGenes, Ashland, MA, Figura 2) y 4,4'-O-dimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA)] se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. Los espaciadores de glicerol y HEG se colocaron en sitios de monómeros auxiliares en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos, los espaciadores HEG y el espaciador de glicerol en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
5
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25
30
35
40
45
E11182593
30-07-2014
1.
Uso de un soporte sólido "A" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-TCGTCGA-3'
3.
Adición del espaciador HEG
4.
Adición de la fosforamidita ramificada simétrica basada en glicerol
5.
Adición de dos espaciadores HEG de manera simultánea
6.
Síntesis de dos restos de 5'-TCGTCGA-3' de manera simultánea

La preparación de este compuesto ramificado siguió el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 2, excepto porque en las etapas 5 y 6 cada administración de reactivo en el ciclo de síntesis fue doble debido a que las dos cadenas de ácido nucleico se construyeron de manera simultánea. La fosforamidita ramificada simétrica mostrada en la Figura 2 requiere que las secuencias de ácido nucleico sintetizadas tras la adición de la fosforamidita ramificada simétrica sean iguales, aunque la secuencia de ácido nucleico sintetizada antes de su adición puede ser igual o diferente de estas últimas secuencias.
El compuesto ramificado se purificó mediante HPLC como se describió en el Ejemplo 12 y se caracterizó como se describió en el Ejemplo 2.
C-96 y C-101 se sintetizaron de manera análoga.
También se sintetizaron C-103 y C-104 mediante el mismo método, excepto porque se usaron espaciadores de trietilen glicol o propilo, respectivamente, en lugar de los espaciadores de hexaetilen glicol.
Ejemplo 20: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada
Se sintetizó C-98, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, y el resto espaciador es glicerol, conectado a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosforotioato.
C-98: (5'-TCGTCGA-3'-HEG)3-triplicador-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGA-3'
La molécula de C-98 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Los monómeros de nucleósidos y los restos espaciadores [fosforamidita triplicadora (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) y 4,4'-O-dimetoxitritil-hexaetilen glicol-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA)] se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. Los espaciadores de HEG y triplicador se colocaron en sitios de monómeros auxiliares en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos, el espaciador HEG y el espaciador triplicador en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
1.
Uso de un soporte sólido "A" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis del resto 5'-TCGA-3'
3.
Adición del espaciador HEG
4.
Síntesis del resto 5'-AACGTTC-3'
5.
Adición del espaciador HEG
6.
Adición de la fosforamidita triplicadora (véase la Fig. 2)
7.
Adición de tres espaciadores HEG de manera simultánea
8.
Síntesis de tres restos de 5'-TCGTCGA-3' de manera simultánea

La preparación de este compuesto ramificado siguió el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 2, excepto porque en las etapas 7 y 8 cada administración de reactivo en el ciclo de síntesis fue triple debido a que las 3 cadenas de ácido nucleico se construyeron de manera simultánea. La fosforamidita triplicadora simétrica mostrada en la Figura 2 requiere que las secuencias de ácido nucleico sintetizadas tras la adición de la fosforamidita triplicadora simétrica sean iguales, aunque la secuencia de ácido nucleico sintetizada antes de su adición puede ser igual o diferente de estas últimas secuencias.
El compuesto ramificado se purificó mediante HPLC como se describió en el Ejemplo 12, y se caracterizó como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 21: Síntesis de un Compuesto Quimérico Lineal con Espaciadores de Hexaetilen Glicol y un Enlazador de 3'-Tiol
Los CIQs que contienen enlazadores de 3'-tiol se sintetizan y se purifican primero en forma de sus derivados disulfuro. El grupo disulfuro se reduce después para proporcionar el grupo tiol reactivo. Por ejemplo, para sintetizar C-116, se sintetizó C-8 como en el Ejemplo 2, excepto porque se usó el Modificador 3'-Tiol C3 S-S CPG (Glen Research, Sterling, VA) como soporte sólido en vez del soporte sólido "T".
C-116: 5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-(CH2)3SS(CH2)3OH
Se apreciará que C-116 se puede describir como [C-8]-3'-disulfuro. El CIQ se purificó mediante HPLC como se describió en el Ejemplo 12. El compuesto se caracterizó como se describió en el Ejemplo 2.
C-116 se redujo hasta el tiol mediante el uso de hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP; Pierce, Rockford, IL). Se disolvió C-116 a una concentración de 30,5 mg/ml (0,8 ml, 24,4 mg; 3,14 µmol) en tampón de fosfato sódico 100 mM/cloruro sódico 150 mM/EDTA 1 mM/pH 7,4. En un vial distinto, se disolvió TCEP a una concentración de 0,167 M en tampón de fosfato sódico 100 mM/cloruro sódico 150 mM/EDTA 1 mM/pH 7,4. Se añadieron 5 equivalentes (100 ul, 4,8 mg, 17 µmol) de la disolución de reserva de TCEP a la disolución de CIQ. La disolución se mezcló suavemente, se incubó durante 120 min a 40°C, y se purificó en una columna de Sephadex G-25 (5 ml, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) para proporcionar C-117 (13,2 mg). Se apreciará que C-117 se puede describir como [C-8]-3'-tiol. El CIQ se purificó mediante HPLC como se describió en el Ejemplo 12.
C-115 se sintetizó de manera análoga a partir de C-114.
Ejemplo 22: Síntesis de un Compuesto Quimérico Lineal con Espaciadores de Propilo y un Enlazador de 5'-Tiol
Los CIQs que contienen enlazadores de 5'-tiol se sintetizan y se purifican primero en forma de sus derivados disulfuro. El grupo disulfuro se reduce después para proporcionar el grupo tiol reactivo. El compuesto C-110 (más adelante) se puede describir como 5'-disulfuro-C-11. El compuesto C-111 se puede describir como 5'-tiol-C-11.
C-110: HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TCGTCG-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-110 se sintetizó como se describió en el Ejemplo 3, excepto porque el acoplamiento final fue con el modificador tiol C6 S-S (Glen Research, Sterling, VA). El CIQ se purificó mediante HPLC como se describió en el Ejemplo 12. El compuesto se caracterizó como se describió en el Ejemplo 2. C-110 se redujo hasta el tiol mediante el uso de hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP; Pierce, Rockford, IL) como se describió en el Ejemplo 22.
C-107, C-113 y P-16 se sintetizaron de manera análoga.
Ejemplo 23: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada Mediante una Estrategia de Conjugación
Se sintetizó C-105 como se muestra en la Figura 4. Se disolvió tris(2-maleimidoetil)amina (TMEA, Pierce, Rockford, IL) a una concentración de 4,3 mg/ml en dimetilformamida (DMF). La disolución de TMEA (12 ul, 52 µg, 1,0 eq) se añadió a una disolución de C-117 (237 ul, 4,0 mg, 4,0 eq) en tampón de fosfato sódico 100 mM/cloruro sódico 150 mM/EDTA 1 mM/pH 7,4 y se mezcló bien. La disolución se dejó a temperatura ambiente durante la noche y se purificó en una columna Superdex 200 (24 ml, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) en tampón de fosfato sódico 10 mM/cloruro sódico 141 mM/pH 7,0. El producto se secó a vacío, se disolvió en 0,4 ml de agua Milli Q, y se precipitó con 1,0 ml de etanol del 95%. Después de congelar a -20°C durante 1 hora, la mezcla se centrifugó (2 min a 14 K RPM), y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. El sedimento se disolvió en 0,35 ml de agua Milli Q y se midió la concentración de C-105 (0,4 mg aislados). El compuesto se analizó como se describió en el Ejemplo 2.
C-99 se sintetizó de manera análoga.
Ejemplo 24: Síntesis de un Compuesto Quimérico con una Estructura Ramificada Mediante una Estrategia de Conjugación
A. Síntesis de Maleimido-Dendrímero STARBURST®, Generación 2
El dendrímero STARBURST®, generación 2, que contiene 16 grupos hidroxilo, se adquirió en forma de una disolución del 20% en metanol de Aldrich (Milwaukee, WI). El dendrímero (191 ul, 38,2 mg, 11,7 µmol) se secó a vacío, se redisolvió en 200 ul de DMF y se volvió a secar a vacío para eliminar las últimas trazas de metanol. Para preparar el maleimido-dendrímero, se disolvió N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI, 50 mg, 233,5 µmol) en 200 ul de DMF en un vial de vidrio distinto y después se añadió rápidamente al dendrímero. La mezcla se agitó en vórtex hasta que se disolvió el dendrímero. La disolución se colocó en un mezclador rotatorio durante la noche a temperatura ambiente. La disolución se concentró a vacío, se disolvió en un 20% de metanol/diclorometano (1 ml), y se purificó en una columna de gel de sílice de 7,5 g (malla 70-230, 60 A) en un 20% de metanol/diclorometano. El producto de maleimido-dendrímero eluyó de la columna en la primera fracción (debido a la presencia de DMF residual) y no contuvo subproductos de PMPI. El producto se concentró hasta un sólido marrón (10 mg, 13% de rendimiento).
B. Síntesis de dendrímero STARBURST®-(5'-TGACTGTGAACGT TCGAGATGA)x=3-16 (SEQ ID Nº:2) (C-102)
El maleimido-dendrímero (5,7 mg) se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para formar una disolución de reserva a una concentración de 2,5 mg/ml. La disolución de reserva de maleimido-dendrímero (100 ul, 0,25 mg, 0,0375 5 µmol) se añadió a una disolución de C-107 (9,1 mg, 1,2 µmol) en tampón de fosfato sódico 100 mM/cloruro sódico 150 mM/EDTA 1 mM/pH 7,4 (0,7 ml). La disolución se colocó en un mezclador rotatorio durante la noche a temperatura ambiente, y el producto se purificó en una columna Superdex 200 (24 ml, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) en un tampón de fosfato sódico 10 mM/cloruro sódico 141 mM/pH 7,0. El producto eluyó en el volumen vacío a los 10,4 min (1,3 mg). Se descubrió que el producto era una mezcla de especies de peso molecular
10 elevado, que representaban diferentes cargas de polinucleótido en el dendrímero, mediante análisis en un gel de agarosa E del 1,2% (Invitrogen, Carlsbad, CA). C-102 se desplazó como una mezcla de productos entre 1 kb hasta más de 15 kb (tamaño efectivo comparado con los marcadores de ADN bicatenario).
Ejemplo 25: Síntesis de un Compuesto Quimérico Lineal con Espaciadores de Propilo y Uniones Mixtas Fosfodiéster/Fosforotioato
15 Se sintetizó C-84, que tiene la estructura mostrada más adelante. Los restos de ácido nucleico son ADN con uniones fosforotioato, indicadas mediante una "s" en minúscula, o uniones fosfodiéster (todas las demás uniones), y los restos espaciadores son propilo (C3), conectados a los restos de ácido nucleico por medio de uniones fosfodiéster.
C-84: 5'-GsGs-3'-C3-5'-TGC-3'-C3-5'-ATCGAT-3'-C3-5'-GCA-3'-C3-5'-GGsGsGsGsG-3'
(en la que una "s" en minúscula indica una unión fosforotioato y las otras uniones son fosfodiéster)
20 La molécula de C-84 fue sintetizada por TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909 mediante el uso del protocolo del fabricante para 1 µmol de ADN de fosforotioato. Las uniones fosforotioato se programaron mediante el uso de letras mayúsculas para las bases, y las uniones fosfodiéster se programaron mediante el uso de letras minúsculas para las bases y las posiciones auxiliares que contenían el espaciador de propilo de fosforamidita. Los monómeros de nucleósidos y el
25 precursor del resto espaciador, 4,4'-O-dimetoxitritil-propil-O-(N,N-diisopropil) 2-cianoetilfosforamidita (obtenida de Glen Research, Sterling, VA) se disolvieron en acetonitrilo anhidro a una concentración final de 0,05 M. El espaciador C3 se colocó en un sitio de monómero auxiliar en el instrumento. El instrumento se programó para añadir los monómeros de nucleótidos y los espaciadores C3 en el orden deseado, y la síntesis de los restos de ácido nucleico se dio en la dirección 3' a 5'.
30 1. Uso de un soporte sólido "G" con unión en 3' al soporte
2.
Síntesis de 5'-GGsGsGsGsG-3'
3.
Adición del espaciador C3
4.
Síntesis de 5'-GCA-3'
5.
Adición del espaciador C3
35 6. Síntesis de 5'-ATCGAT-3'
7.
Adición del espaciador C3
8.
Síntesis de 5'-TGC-3'
9.
Adición del espaciador C3
10.
Síntesis de 5'-GsGs-3'

40 La síntesis, desprotección, tratamiento, y análisis se llevaron a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
C-85 y C-87 se sintetizaron de manera análoga.
Ejemplo 26: Síntesis de Oligonucleótidos que Contienen Menos de Ocho (8) Nucleótidos
Se sintetizaron polinucleótidos que contenían menos de ocho bases y que contenían uniones fosforotioato en un sintetizador de ADN automatizado Perseptive Biosystems Expedite 8909. Los polinucleótidos se purificaron mediante 45 RP-HPLC en una columna Polymer Labs PLRP-S con el uso de un gradiente creciente de acetonitrilo en acetato de trietilamonio 0,1 M. Los polinucleótidos purificados se concentraron hasta sequedad, se eliminó el grupo 4,4'dimetoxitritilo con ácido acético acuoso del 80%, y después los compuestos se precipitaron dos veces de acetato sódico acuoso 0,6 M/pH 5,0 con 3 volúmenes de isopropanol. Los polinucleótidos se disolvieron en agua Milli Q y se determinó el rendimiento a partir de la absorbancia a 260 nm. Finalmente, los polinucleótidos se liofilizaron hasta
proporcionar un polvo. Los polinucleótidos se caracterizaron, y se determinó el contenido de endotoxinas, como se describió en el Ejemplo 2.
Ejemplo 27: Preparación de Microsoportes Biodegradables Catiónicos
Se prepararon microsoportes de poli(ácido láctico, ácido glicólico) catiónicos (cPLGA) como sigue. Se disolvieron 0,875 g de polímero poli(D,L-lactida-co-glicolida) 50:50 (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) con una viscosidad intrínseca de 0,41 dl/g (0,1%, cloroformo, 25°C) en 7,875 g de cloruro de metileno a una concentración del 10% p/p, junto con 0,3 g de DOTAP. La fase orgánica clara se emulsionó después en 500 ml de solución acuosa de PVA (0,35% p/v) mediante homogeneización a 4000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente mediante el uso de un mezclador de laboratorio (Silverson L4R, Silverson Instruments). La temperatura del sistema se elevó después hasta 40°C haciendo circular agua caliente a través de la camisa del recipiente de mezcla. A la vez, se redujo la velocidad de agitación a 1500 rpm, y estas condiciones se mantuvieron durante 2 horas para extraer y evaporar el cloruro de metileno. La suspensión de microesferas se dejó enfriar hasta temperatura ambiente con ayuda de agua fría circulante.
Los microsoportes se separaron mediante centrifugación a 8000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (Beckman Instruments) y se resuspendieron en agua desionizada mediante sonicación en baño suave. El lavado mediante centrifugación se repitió dos veces más para eliminar el exceso de PVA de la superficie de las partículas. Los sedimentos de la centrifugación final de las partículas se suspendieron en aproximadamente 10 ml de agua, y se liofilizaron durante la noche. El polvo seco de microsoportes catiónicos se caracterizó según el tamaño y la carga superficial: tamaño medio (número ponderado, µ) = 1,4; potencial zeta (mV) = 32,4.
Ejemplo 28: Inmunomodulación de Células Humanas mediante CIQs
Se llevaron a cabo ensayos para determinar la actividad inmunomoduladora de (1) moléculas quiméricas que contenían restos espaciadores y (2) polinucleótidos.
Los compuestos quiméricos y los polinucleótidos se sintetizaron como se describió anteriormente o mediante la química convencional de fosforotioato. Los polinucleótidos P-6 y P-7 fueron sintetizados por Hybridon Specialty Products (Milford MA). Se determinó la actividad inmunomoduladora mediante ensayos rutinarios tal como se describe en la presente memoria.
Se recogió sangre periférica de voluntarios mediante venopunción con el uso de jeringas heparinizadas. La sangre se depositó sobre una capa de FICOLL® (Amersham Pharmacia Biotech) y se centrifugó. Las PBMCs, localizadas en la interfase de FICOLL®, se recogieron, y después se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se resuspendieron y se cultivaron en placas de 48 pocillos (Ejemplos 29-32) o de 96 pocillos (Ejemplos 33-40) a 2 x 106 células/mL a 37°C en RPMI 1640 con suero AB humano inactivado térmicamente del 10%, más 50 unidades/mL de penicilina, 50 µg/mL de estreptomicina, 300 µg/ml de glutamina, piruvato sódico 1 mM, y aminoácidos no esenciales (NEAA) 1 x MEM.
Las células se cultivaron en ausencia de muestras de ensayo, en presencia de muestras de ensayo a 20 µg/ml (0,5 DO/ml), o en presencia de muestras de ensayo a 20 µg/ml premezcladas con 100 µg/ml de cPLGA (si se usó) durante 24 horas. El medio exento de células se recogió después de cada pocillo y se ensayaron las concentraciones de IFN-γ e IFN-α. Se usó SAC (Pansorbin CalBiochem, dilución 1/5000) como control positivo. SAC contiene material celular de Staph. aureus (Cowan).
Se ensayó IFN-γ e IFN-α mediante el uso de equipos CYTOSCREEN™ ELISA de BioSource International, Inc., según las instrucciones del fabricante.
En el ensayo de PBMC humanas, los niveles iniciales de IFN-γ pueden variar, incluso de manera significativa, con el donante. Los niveles de IFN-α exhiben en general unos niveles iniciales bajos en ausencia de estimulación.
Los ejemplos de los resultados de tales ensayos se muestran en los Ejemplos 29-40 siguientes.
En cada uno de los experimentos mostrados, "medio solo" y "P-7" son controles negativos. "P-7" se ha demostrado previamente que no tiene actividad inmunoestimuladora. SAC y "P-6" son controles positivos. Se ha demostrado previamente que P-6 tiene una actividad inmunoestimuladora significativa.
Ejemplo 29 Actividad Inmunoestimuladora de CIQs
Este ejemplo demuestra que cuatro CIQs diferentes tuvieron una actividad inmunomoduladora significativa, tal como se demuestra mediante la estimulación de la secreción de IFN-γ e IFN-α (Tabla 3). Como era de esperar, P-7 no tuvo actividad. Además, P-1, un 7-mero que contiene TCG, no tuvo actividad. De manera interesante, los CIQs con restos espaciadores HEG y propilo mostraron diferentes grados de estimulación de la secreción de IFN-α. Aunque ambos tipos de CIQs estimularon la secreción de IFN-α, el efecto fue más notable para los CIQs que contenían HEG.
Tabla 3
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
Compuesto de ensayo
Donante 1 Donante 2 media Donante 1 Donante 2 media
medio solo
8 0 4 0 0 0
P-7
410 51 231 0 0 0
SAC
2040 1136 1588 393 43 218
P-6
2180 669 1425 401 39 220
P-1
8 0 4 0 0 0
C-8
1916 696 1306 1609 44 827
C-9
2157 171 1164 142 0 71
C-10
1595 952 1273 1662 50 856
C-11
2308 270 1289 119 0 59


Ejemplo 30 Actividad de Polinucleótidos
Este ejemplo demuestra que los polinucleótidos P-1, P-2, P-3, P-4 y P-5 no tuvieron actividad inmunomoduladora (Tabla 4). Estos polinucleótidos tienen las secuencias de los restos de ácido nucleico de C-10 y C-11, que en el Ejemplo 29 se demostró que tenían actividad inmunomoduladora.
Tabla 4
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
Compuesto de ensayo
Donante 3 Donante 4 media Donante 3 Donante 4 media
medio solo
0 3 2 0 18 9
P-7
3 8 5 0 31 15
SAC
1179 2000 1589 50 969 510
P-6
99 223 161 28 106 67
P-1
1 4 2 0 32 16
P-3
1 3 2 0 32 16
P-4
0 3 1 0 58 29
P-5
0 3 2 0 57 29
P-2
0 4 2 0 40 20


Ejemplo 31 Actividad de Mezclas de Polinucleótidos
Este ejemplo demuestra que una mezcla de polinucleótidos P-1 y P-3, o P-1, P-3, P-4 y P-5 no tuvieron actividad inmunomoduladora (Tabla 5). Estos polinucleótidos tienen las secuencias de los restos de ácido nucleico de C-10 y 10 C-11 que sí tuvieron actividad inmunomoduladora. Las mezclas contuvieron cantidades iguales de cada polinucleótido, a una concentración total de 20 µg/ml de polinucleótido total.
Tabla 5
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
Compuesto de ensayo
Donante 5 Donante 6 media Donante 5 Donante 6 media
medio solo
3 52 28 20 20 20
P-7
7 66 37 20 94 57
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
Compuesto de ensayo
Donante 5 Donante 6 media Donante 5 Donante 6 media
SAC
903 284 593 458 8215 4337
P-6
73 1170 621 54 482 268
(P-1) + (P-3)
3 36 19 20 40 30
(P-1)+(P-3)+(P-4)+(P-5)
1 99 50 70 65 68
C-10
102 806 454 91 1700 896
C-11
25 792 409 76 175 126


Ejemplo 32 Actividad Inmunomoduladora de CIQs Este ejemplo demuestra la actividad inmunomoduladora de C-10 y C-11, en un ensayo con donantes diferentes de los Ejemplos 29 y 31 (Tabla 6). Tabla 6
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
Compuesto de ensayo
Donante 7 Donante 8 media Donante 7 Donante 8 media
medio solo
1 0 1 0 0 0
P-7
2 2 2 0 0 0
SAC
594 1100 847 22 303 163
P-6
15 367 191 4 59 32
C-10
23 198 111 46 539 293
C-11
5 419 212 6 56 31


Ejemplo 33 Actividad Inmunomoduladora de CIQs Este ejemplo demuestra la actividad inmunomoduladora de C-8 y C-9, en un ensayo con donantes diferentes del Ejemplo 29 (Tabla 7). P-2, un 6-mero que contiene TCG, no tuvo actividad. Tabla 7
IFN-γ
IFN-α
Donante 9
Donante 10 Donante 11 Donante 12 media Donante 9 Donante 10 Donante 11 Donante 12 media
medio solo
17 1 1 10 7 4 2 2 15 6
P-7
5 2 3 2 3 0 3 1 5 2
SAC
380 688 159 73 325 2246 364 1129 1029 1192
P-6
66 20 72 23 45 12 28 12 12 16
P-2
2 3 1 2 2 0 2 1 4 2
C-8
312 35 31 28 102 58 30 18 49 39
C-9
134 7 56 30 56 8 10 1 15 8

Ejemplo 34 Actividad Inmunomoduladora de CIQs Los ensayos mostrados en la Tabla 8 demuestran la actividad inmunoestimuladora de varios CIQs de la invención, es decir, CIQs caracterizados por una diversidad de restos de ácido nucleico cortos y diferentes y una diversidad de restos espaciadores diferentes. La Tabla 8 también demuestra que el compuesto M-1, que tiene una estructura mixta 5 HEG/ácido nucleico pero que carece de secuencia 5'-C,G-3' (véase la Tabla 2), así como algunos otros compuestos (C-19), no mostraron actividad. La formulación de los CIQs con cPLGA aumentó significativamente la inducción de IFN-α. Los niveles de IFN-γ se incrementaron también en ciertos casos. Los números "28---" representan donantes individuales. Tabla 8 Conc. IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml) estim. µg/ml 28065 28066 28067 28068 media 28065 28066 28067 28068 media
células solas 096 2 1 225 0 4 0 6 3 P-6 20439 12 28906346 14 17 45126 50 P-7 203971815105 0 8 0 33 P-2 207911 020 0 3 0 01 P-3 2094271 031 0 0 5 01 P-4 209311 124 0 0 9 02
P-2 + P-3 + P-4 20 tot; 99 0 1 0 25 0 0 8 0 2 6,7 c.u. C-8 20 1000 19 56 419 373 123 6 96 358 146 C-9 201000 8 57 510 394 13 0 22 64 25 C-10 20 1000 9 51 559 405 116 6 107 340 142 C-17 201000 6 32 459 374 21 0 22 95 34 C-18 20 1000 102 27 695 456 51 9 16 162 59 C-19 208481 224 0 1 0134 C-20 20354 13 16505222 21 5 13 64 26 C-21 20 653 16 24 960 413 227 24 183 769 300 C-23 20438 5 6238172 52 3 19137 53 C-24 20337 2 4116115 28 0 8 67 26 C-25 20541 6 19337226 11 0 22 79 28 M-1 20157140 250 0 0 3 01 C-27 20475 3 24226182 3 0 24 16 11 C-28 201082 5 42 410 385 3 0 29 52 21 PLGA 055115160212106 P-6 + PLGA 20 975 191 287 573 506 388 194 565 2000 787 P-7 + PLGA 201927 61115 0 5 0 0 1 P-2 + PLGA 20 357 138 104 443 261 982 708 2100 2336 1532 P-3 + PLGA 20134 1 1 4 35307 0 0 0 77 P-4 + PLGA 2019 1 0 3 634 5 0 010
5
10
15
20
Conc. IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml) estim. µg/ml 28065 28066 28067 28068 media 28065 28066 28067 28068 media P-2 + P-3 + P-4 20 tot; 122 4 14 70 53 1820 0 435 106 590
+PLGA 6,7 c.u.
C-8 + PLGA 20 527 280 245 357 352 2395 538 4380 4625 2985
C-9 + PLGA 20 334 139 343 456 318 1093 130 1686 2045 1239
C-10 + PLGA 20 619 152 557 420 437 2049 369 3515 3586 2380
C-17 + PLGA 20 508 184 587 355 408 1914 240 2729 2774 1914
C-18 + PLGA 20 732 108 355 448 411 2188 375 3513 7141 3304
C-19 + PLGA 20 1000 780 730 466 744 5997 3753 14359 7079 7797
C-20 + PLGA 20 1055 256 270 488 517 1044 191 1265 2000 1125
C-21 + PLGA 20 682 874 390 481 607 2468 784 3372 4962 2897
C-23 + PLGA 20 216 161 120 377 219 789 189 1573 2000 1138
C-24 + PLGA 20 236 47 188 707 295 31 20 772 340 291
C-25 + PLGA 20 427 179 289 499 348 414 87 1082 1335 730
M-1 + PLGA 20 713 54 0 0 8 53
C-27 + PLGA 20 888 205 235 466 448 136 44 388 259 207
C-28 + PLGA 20 860 88 489 415 463 216 73 401 520 303
SAC 0 1000 339 511 355 551 284 156 1544 350 583
Será evidente a partir de una revisión de la Tabla 8 que el Donante 28065 exhibió un valor inicial elevado en el ensayo de IFN-gamma. Los valores representados como "1000" indican una medida fuera de los límites de sensibilidad del ensayo.
Ejemplo 42: Inmunomodulación de Células de Ratón mediante CIQ
Se ensayó la actividad inmunoestimuladora de los polinucleótidos y de los compuestos quiméricos en esplenocitos de ratón. La inmunoestimulación se determinó mediante la medida de la secreción de citocinas en el medio de cultivo. Se determinaron los niveles de citocinas en el sobrenadante de cultivo mediante ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA).
Las células se aislaron y se prepararon mediante el uso de técnicas habituales. Se recogieron los bazos de ratones BALB/c de 8 a 20 semanas de edad y los esplenocitos se aislaron mediante el uso de dispersión y tratamiento habitual con tampón de lisis ACK de BioWhittaker, Inc. Se mezclaron cuatro bazos en este experimento. Las células aisladas se lavaron en medio RPMI 1640 complementado con un 2% de suero bovino fetal (FCS) inactivado térmicamente, 2-mercaptoetanol 50 µM, 1% de penicilina-estreptomicina, y L-glutamina 2 mM, y se resuspendieron hasta aproximadamente 7 x 105 células/ml en un 10% de FCS/RPMI (medio RPMI 1640 con un 10% de FCS inactivado térmicamente, 2-mercaptoetanol 50 µM, 1% de penicilina-estreptomicina, y L-glutamina 2 mM).
Los cultivos celulares se establecieron por triplicado con aproximadamente 7 x 105 células/pocillo en una placa de microtitulación plana de 96 pocillos en 100 µl de 10% de FCS/RPMI, y las células se dejaron reposar durante al menos 1 hora después de su colocación en las placas. Los compuestos de ensayo indicados se incubaron (a las concentraciones indicadas) durante 24 horas a 37°C. Los sobrenadantes celulares se recogieron y se congelaron a 80°C. Se determinó la producción de citocinas por las células mediante ELISAs, como se muestra en la Tabla 9.
Tabla 9
Compuesto de ensayo
Dosis IL-6 IL-12 IFNγ
P-6
5,0 µg/ml 1,0 µg/ml 0,1 µg/ml 9311 5760 121 5374 4565 1665 2505 2175 187
C-10
5,0 µg/ml 1,0 µg/ml 0,1 µg/ml 3342 1761 9 2329 1738 122 199 104 9
C-11
5,0 µg/ml 1,0 µg/ml 0,1 µg/ml 10098 11814 458 4279 4914 3359 3342 3220 960
P-7
5,0 µg/ml 1,0 µg/ml 9 7 177 143 23 30
SAC
734 1343 18843
medio solo
9 124 9


Ejemplo 35 Actividad de CIQ que Contiene Restos de Ácido Nucleico de 3 Nucleótidos y Aumento de la Actividad mediante cPLGA
Este ejemplo demuestra la actividad inmunoestimuladora de varios CIQs en presencia y ausencia de cPLGA tal
5 como se ensaya mediante el uso de PBMCs humanas. De manera interesante, la versión fosfodiéster de C-30 (C31) fue inactiva como CIQ solo, pero tuvo una buena actividad cuando se formuló con cPLGA. De hecho, la tendencia general fue que mientras los CIQs que contenían todas las uniones fosfodiéster (C-31, C-36, y C-93) fueron inactivos como CIQs solos, pasaron a ser significativamente más activos cuando se formularon con cPLGA.
C-32, un CIQ que contiene solamente restos de ácido nucleico trimérico, tuvo actividad cuando se usó solo y mostró 10 más actividad cuando se formuló con cPLGA. Véase la Tabla 10.
Tabla 10
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
estim.
28089 28090 28098 28099 media 28089 28090 20988 28099 media
células solas
0 0 0 4 1 25 79 33 28 41
P-6
84 255 745 125 302 0 62 105 105 68
P-7
0 4 0 2 1 0 27 19 37 21
C-10
35 44 174 140 98 17 61 187 304 142
C-21
61 68 218 124 118 56 157 286 466 241
C-22
31 15 110 91 62 0 46 97 247 97
C-8
62 52 205 116 109 21 124 314 362 205
C-9
12 7 10 10 67 39
C-29
63 50 150 177 110 75 92 359 332 214
C-30
0 6 12 20 9 134 29 52 47 65
C-31
0 0 0 2 0 158 26 62 29 69
C-32
0 5 11 35 13 285 31 46 59 106
C-33
0 0 0 3 1 56 22 34 30 36
C-93
0 0 0 3 1 0 30 25 29 21
C-28
14 15 183 45 64 0 64 42 67 43
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
estim.
28089 28090 28098 28099 media 28089 28090 20988 28099 media
PLGA
15 2 16 10 11 8 38 39 49 33
P-6 + PLGA
606 144 3277 160 1047 197 103 340 91 183
P-7 + PLGA
121 3 91 5 55 7 85 36 47 44
C-10 + PLGA
804 373 1501 301 745 523 256 509 1317 651
C-21 + PLGA
1138 454 1612 630 958 1347 1020 1001 2302 1418
C-22 + PLGA
772 244 1271 357 661 619 386 604 1339 737
C-8 + PLGA
668 332 1863 506 842 1005 683 934 1680 1075
C-9 + PLGA
1036 330 683 308 363 335
C-29 + PLGA
825 477 1536 341 795 909 711 855 1419 973
C-30 + PLGA
97 233 447 41 205 44 116 49 33 60
C-31 + PLGA
256 327 1597 406 647 696 912 1028 1361 999
C-32 + PLGA
454 192 259 57 240 281 289 218 131 230
C-33 + PLGA
171 186 249 96 176 658 1220 1764 1304 1237
C-93 + PLGA
427 628 1707 323 771 990 1738 2681 4000 2352
C-28 + PLGA
683 306 2252 224 866 136 155 141 70 126
SAC
195 489 101 306 273 67 239 92 70 117


Ejemplo 36 Actividad Inmunoestimuladora de CIQs que Contienen 5' TCG.
Este ejemplo demuestra la inmunomodulación mediante CIQs que contienen diversos restos de ácido nucleico (véase la Tabla 11). En general, las secuencias que contienen un 5'-TCG-3' (C-8, C-21, C-50, C-51, etc.) o 5'-NTCG (C-46), en los que N es cualquier nucleósido, fueron más activos que otros CIQs que contienen CG (C-24, C-52).
5 Además, aunque la mayoría de los CIQs indujeron una cantidad significativa de IFN-γ, los resultados fueron más variables para la inducción de IFN-α, lo que sugiere que las necesidades de los motivos para la inducción de IFN-α pueden ser más rigurosas que aquellas para la inducción de IFN-γ. En particular, los CIQs que contienen un 5'-TCGA-3' (C-50, C-51, C-45) generaron más IFN-α que los CIQs que contienen un 5'-TCGT-3' (C-41, C-42, C-52).
Con la excepción de C-8 y C-21 (que incluyen el motivo 5'-TCGTCGA-3'), la mejor inducción de IFN-α se generó 10 mediante CIQs con TCGA en la posición 5'.
Se descubrió que los CIQs que contienen solamente restos de ácido nucleico hexaméricos (C-22), pentaméricos (C43), y tetraméricos (C-44) indujeron IFN-γ cuando se usaron solos. Además, cada uno de estos CIQs, así como C32, que contiene solamente restos de ácido nucleico triméricos, indujeron una cantidad considerable de IFN-γ e IFNα cuando se formularon con cPLGA. C-39, un CIQ con dos restos de ácido nucleico heptamérico, fue activo cuando
15 se usó solo, mientras C-40, un CIQ con un resto de ácido nucleico hexamérico y uno tetramérico, fue inactivo en este experimento. Estos dos CIQs exhibieron una actividad significativa cuando se formularon con cPLGA.
Tabla 11
IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml)
estim. 28042 28043 28044 28045 media 28042 28043 28044 28045 media
células solas15 4 3 5 7 044 9 013
P-6 495 1189 925 212 705 27 85 36 21 42
P-7 6676261345 011222013
C-8 468 939 1000 234 660 20 51 32 5 27
C-24 148156312 26161 0 0 8 0 2
C-21 790 1519 1198 177 921 57 72 79 15 56
C-42 198 1067 4000 37 1326 0 29 24 0 13
IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml)
estim. 28042 28043 28044 28045 media 28042 28043 28044 28045 media C-41 1741075 841 45 534 0 3 23 0
7 C-45 590 1466 984 253 823 62 123 152 14
88 C-46 399 814 480 63 439 24 73 26 3
31 C-47 112537142 17202 20 0 0 0
5 C-50 1324 1292 509 192 829 36 137 193 35 100 C-51 795 1349 1114 411 917 112 245 240 36 158 C-52 238214212 28173 0 3 35 48 22
M-1 4529 7 321 0 013 2 4 C-22 206 343 736 40 331 12 18 67 30 32 C-43 128536566 16312 0 14 20 0 8 C-44 238359484 51283 0 12 60 1 18 C-32 9119781751 0 0 8 0 2 C-39 343 488 281 137 312 31 187 46 36 75 C-40 2655202331 02631 215
PLGA1928255 383 0 0 0 8 2 P-6 + PLGA 1382 1538 2581 178 1420 106 387 371 38 226 P-7 + PLGA 152 324 174 12 166 0 2 0 2 1 C-8 + PLGA 1367 2547 1490 286 1423 2182 2193 716 211 1325
C-24 + PLGA 1017 1380 1362 52 953 0 31 65 0 24 C-21 + PLGA 4000 1204 1870 325 1850 2959 2024 886 191 1515 C-42 + PLGA 1515 1417 2190 372 1374 425 1081 295 69 468 C-41 + PLGA 710 1940 1910 496 1264 535 1987 534 119 794 C-45 + PLGA 1380 2292 1920 634 1557 2408 4000 1693 642 2186 C-46 + PLGA 2201 2352 1432 472 1614 502 1309 257 100 542 C-47 + PLGA 3579 4000 1137 161 2219 46 271 30 0 87 C-50 + PLGA 2969 1209 1465 402 1511 1548 2818 1242 327 1484 C-51 + PLGA 2018 4000 1000 463 1870 1837 3241 1154 536 1692 C-52 + PLGA 1172 1726 1551 117 1142 12 34 34 0 20
M-1+PLGA 215159 23 3100 0 1 0 0 0 C-22 + PLGA 4000 2975 1085 136 2049 325 1186 226 42 445 C-43 + PLGA 2210 2594 1354 194 1588 358 1293 402 49 526 C-44 + PLGA 1452 4000 2006 276 1934 986 4000 1768 192 1736 C-32 + PLGA 2211 4000 2759 133 2276 204 1142 771 12 532 C-39 + PLGA 1800 4000 2275 274 2087 2167 4000 2613 736 2379 C-40 + PLGA 1438 498 1813 160 977 2758 4000 1556 370 2171
SAC 1618 1271 1053 123 1016 285 110 57 0 113
Ejemplo 37 Actividad Inmunoestimuladora de CIQs
Este ejemplo muestra los ensayos de inmunomodulación para CIQs lineales (algunos de los cuales contienen uniones tanto fosforotioato (PS) como fosfodiéster (PO)) y CIQs ramificados adicionales (Tablas 12 y 13). La comparación de C-94, un CIQ ramificado, con C-21, un CIQ lineal que contiene los mismos restos de ácido nucleico, demostró que el CIQ ramificado indujo 4 veces más IFN-α que el CIQ lineal. Las cantidades de IFN-γ e IFN-α inducidas se incrementaron significativamente para cada CIQ mediante la formulación con cPLGA. Las versiones de fosfodiéster de C-94 y C-93 fueron activas solamente cuando se formularon. C-87 mostró una inducción notable de
IFN-α.
5
Tabla 12
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
estim.
28042 28043 28044 28045 media 28042 28043 28044 28045 media
células solas
11 4 0 13 7 8 2 3 64 19
P-6
324 1036 529 653 636 9 34 22 108 43
P-7
34 19 48 35 34 0 0 4 54 15
C-8
623 753 646 604 656 78 25 52 256 103
C-53
39 27 38 26 32 0 0 0 5 1
C-49
367 433 767 353 480 30 8 100 88 57
C-84
29 23 69 232 88 0 0 5 222 57
C-85
17 13 315 134 120 0 0 28 24 13
C-94
443 198 1417 888 736 302 252 664 1855 768
C-93
8 1 41 17 17 7 3 81 61 38
C-21
572 460 4000 1644 1669 146 94 191 349 195
C-9
691 268 590 1306 714 39 0 11 64 29
PLGA
9 5 59 72 36 7 0 98 112 54
P-6 + PLGA
601 358 1474 1941 1093 115 116 515 1298 511
P-7 + PLGA
13 13 46 65 34 5 0 0 43 12
C-8 + PLGA
284 551 1781 3113 1432 595 396 1013 2259 1066
C-53 + PLGA
21 12 217 210 115 19 0 0 42 15
C-49 + PLGA
1471 1219 4000 2061 2188 904 460 4000 1040 1601
C-84 + PLGA
235 232 291 956 428 1777 914 4000 3641 2583
C-85 + PLGA
313 294 554 1167 582 2116 921 4000 2413 2362
C-94 + PLGA
2412 755 4000 3379 2637 1883 1640 4000 4000 2881
C-93 + PLGA
880 316 869 1251 829 778 471 2045 988 1071
C-21 + PLGA
4000 690 4000 2533 2806 712 577 2572 1571 1358
C-9 + PLGA
1451 763 4000 1804 2005 389 199 397 477 366
Tabla 13
IFN-g
IFN-a
(pg/ml)
(pg/ml)
estim.
28218 28219 28220 28221 media 28218 28219 28220 28221 media
células solas
5 5 5 5 5 32 32 32 32 32
P-6
13 7 25 141 47 32 32 32 32 32
P-7
5 5 5 5 5 32 32 32 32 32
C-87
83 24 38 977 281 3075 32 4269 265 1910
C-94
15 39 44 269 92 32 167 633 412 311
SAC
2552 621 1383 647 1301 483 105 32 452 268

5
10
15
Ejemplo 38 Efecto de la Posición del Motivo de Secuencia en CIQ
Este ejemplo describe ensayos de inmunomodulación para varios CIQs (algunos de los cuales se ensayaron en donantes diferentes en los ejemplos previos) e ilustra el efecto de la posición de la secuencia de ácido nucleico en un CIQ.
Los CIQs ensayados incluyeron CIQs que contienen dos secuencias de ácido nucleico que contienen CG diferentes en los restos de ácido nucleico (TCGTCGA y ACGTTCG) junto con un resto de ácido nucleico que no contiene una secuencia CG (AGATGAT). De las secuencias de ácido nucleico que contienen CG, los CIQs que contienen una secuencia TCGTCGA tienen más actividad que los CIQs que contienen solamente ACGTTCG. De estos dos, los CIQs con TCGTCGA fueron más activos. La estructura general de los CIQs usados en este ejemplo, N1-S1-N2-S2-N3, se puede usar para describir la colocación de los motivos en el CIQ. La colocación del motivo más activo, TCGTCGA, en la posición N1 condujo a los CIQs más activos (C-8, C-56). La colocación en la posición N2 también confirió actividad. Por ejemplo, C-57 con el TCGTCGA en la posición N2 fue algo más activo que C-58, con el TCGTCGA en la posición N3. Un CIQ con una secuencia ACGTTCG en la posición N1, aunque es menos activo que un CIQ similar con una secuencia TCGTCGA, fue más activo que un CIQ con la secuencia AGATGAT, en la posición N1 (compárense C-57 y C-58 respecto de C-59 y C-60). En este experimento, C-61, que contenía restos de ácido nucleico que comprenden motivos CG, pero no motivos TCG, indujo IFN-γ cuando se formuló con cPLGA. Véase la Tabla 14.
Tabla 14
IFN-γ (pg/ml)
IFN-α (pg/ml)
estim.
28156 28157 28158 28159 media 28156 28157 28158 28159 media
células solas
125 3 4 5 34 3 3 1 8 4
P-6
1132 872 207 231 611 52 484 7 32 144
P-8
255 20 31 31 84 16 9 24 8 14
C-8
1612 742 340 197 723 102 755 61 160 270
C-9
1162 729 192 329 603 26 142 78 20 67
C-23
733 576 202 295 452 26 235 59 169 122
C-54
297 378 88 218 245 8 96 8 13 31
C-55
511 566 55 186 329 9 5 63 3 20
C-56
1223 543 203 563 633 98 415 57 131 175
C-57
419 323 67 262 268 5 52 61 42 40
C-58
404 288 59 84 209 13. 30 29 23 24
C-60
304 209 26 38 144 5 22 3 1 8
C-61
92 179 35 63 92 3 0 47 0 13
PLGA
43 63 5 11 30 85 246 0 3 83
P-6 + PLGA
1070 2643 251 496 1115 582 2948 418 359 1077
P-8 + PLGA
95 115 26 34 67 43 8 2 23 19
C-8 + PLGA
1083 1862 269 1129 1086 4000 4877 857 1573 2827
C-9 + PLGA
814 1412 307 992 881 1398 1778 418 483 1019
C-23 + PLGA
825 865 182 1423 824 1020 1621 240 597 869
C-54 + PLGA
838 1150 157 1751. 974 752 1265 147 278 611
C-55 + PLGA
1048 960 247 2356 1153 505 801 78 211 399
C-56 + PLGA
792 604 321 4000 1429 4000 4000 852 2433 2821
C-57 + PLGA
1027 814 101 3056 1250 555 1476 10 252 573
C-58 + PLGA
804 1065 135 1021 756 179 932 3 139 313
C-60 + PLGA
650 858 56 1014 645 71 118 32 50 68
C-61 + PLGA
1265 1508 238 864 969 4 80 1 63 37
SAC
780 1184 83 659 677 208 55 6 34 76

Este experimento también comparó la actividad inmunomoduladora de dos tipos de CIQs ramificados: C-94 tiene restos HEG entre el componente de ramificación de glicerol y los restos de ácido nucleico, mientras C-28 tiene los restos de ácido nucleico unidos directamente al espaciador de glicerol. Véase la Tabla 15. De manera interesante, mientras la inducción de IFN-γ fue similar para ambos CIQs ramificados, la inducción de IFN-α fue drásticamente 5 mayor para el CIQ que contiene los espaciadores HEG. Un CIQ ramificado, que contiene tres secuencias P-6 unidas por medio de sus extremos 5 a un espaciador de trietilamina activado con maleimida (C-99), indujo IFN-γ solamente cuando se formuló con cPLGA, y no indujo IFN-α. En general, la mayor producción de IFN-α se produjo mediante el uso de CIQs con restos de ácido nucleico unidos por medio de una estructura ramificada y que tienen múltiples extremos 5' sin unir o "libres" de restos de ácido nucleico, y que incluyen espaciadores que proporcionaron
10 flexibilidad conformacional y distancia entre los restos de ácido nucleico.
Tabla 15
IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml) estim. 110 112 119 120 media 110 112 119 120 media
células solas 44 24 20 28 29 20 200 2 2 56 P-6 1508 344 144 104 525 50 172 234 72 132 P-7 124 24 16 40 51 2 32474 2 128 C-8 1152 540 136 48 469 196 30 264 42 133 C-59 256522840942622 3 C-63 1536 376 80 60 513 294 38 464 228 256 C-50 1096 264 52 48 365 716 84 838 636 569 C-51 1528 240 52 40 465 1408 72 2200 622 1076 C-45 880 192 52 36 290 446 130 1074 428 520 C-41 512 100 32 32 169 58 2182 6 62 C-42 1508 204 56 56 456 250 26 156 36 117 C-46 1224 400 68 36 432 58 2 208 48 79 C-52 472 48 40 28 147 2 2292 2 75 C-39 604 116 108 32 215 674 26 444 250 349 C-40 180 12 4 20 54 6198152 2 90 C-94 5168 284 104 120 1419 1608 144 2610 878 1310 C-28 5564 52 44 60 1430 38 4 56 26 31 C-99 276 12 1640 86 22 486 2 29 PLGA32 8 72120 58 10 26092 41 P-6 + PLGA 1640 968 960 2300 1467 948 260 1298 1470 994 P-7 + PLGA 72 16 32 316 109 14 14 22 2 13 C-8 + PLGA 1948 1220 1188 2384 1685 6674 1138 2130 2650 3148 C-59 + PLGA 680 824 620 1828 988 234 2 76 278 148 C-63 + PLGA 1208 1580 2340 2092 1805 4148 738 2796 2298 2495 C-50 + PLGA 812 3684 1432 992 1730 3768 1414 4161 3402 3186 C-51 + PLGA 1240 11216 2896 924 4069 5244 1260 5104 6148 4439 C-45 + PLGA 2736 3024 3056 2472 2822 5532 1544 5474 4206 4189 C-41 + PLGA 3168 1808 16000 3656 6158 3542 746 2074 2094 2114 C-42 + PLGA 1612 2032 10212 1908 3941 3462 1030 2118 2054 2166 C-46 + PLGA 3048 2012 3720 3608 3097 2372 638 2372 2682 2016 C-52 + PLGA 1032 1236 2344 1724 1584 64 20 252 206 136
IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml)
estim. 110 112 119 120 media 110 112 119 120 media
C-39 + PLGA 2024 1332 8228 1244 3207 3764 846 3078 2658 2587
C-40 + PLGA 1360 1244 5364 1864 2458 2362 684 3794 2616 2364
C-94 + PLGA 2668 3188 8840 3396 4523 5658 1838 8000 6346 5461
C-28 + PLGA 2104 2568 3572 1320 2391 302 2 284 198 197
C-99 + PLGA 768 672 5316 472 1807 114 80 344 260 200
Ejemplo 39 Actividad de CIQs Ramificados
Este ejemplo demuestra que los CIQs ramificados con múltiples extremos 5' libres y flexibilidad conformacional proporcionada por los espaciadores HEG indujeron más IFN-α respecto de los CIQs lineales con espaciadores HEG (compárense C-94 con C-21 y C-96 con C-23) o de los CIQs ramificados sin espaciadores (HEG) adicionales
5 (compárense C-94 con C-28 y C-96 con C-27). La adición de otro espaciador HEG y un resto de ácido nucleico de 4 bases a C-96 provocó una reducción de la inducción de IFN-α (compárese C-96 con C-97). Véase la Tabla 16.
Se ensayó la actividad inmunoestimuladora de dos CIQs que contienen motivos 5'-TCG-3' triméricos (C-91 y C-68). Mientras ningún CIQ fue activo por sí solo, C-91 tuvo una actividad significativa cuando se formuló con cPLGA.
Un dendrímero STARBURST® que contiene poliamida hidrófila con múltiples secuencias P-6 conjugadas a él (C
10 102), tuvo significativamente más actividad de IFN-α que la secuencia P-6 sola, en comparación con una cantidad igual de P-6 (cadena a cadena de P-6). Este resultado confirma, mediante el uso de una composición diferente y protocolo sintético del demostrado anteriormente, la utilidad de una administración multimérica de restos de ácido nucleico que contienen 5'-CG-3' en un núcleo hidrófilo flexible para una inducción significativamente incrementada de IFN-α.
Tabla 16
IFN-g (pg/ml)
IFN-a (pg/ml)
estim.
28185 28186 28187 28188 media x4 28185 28186 28187 28188 media x2
células solas
5 1 13 1 5 20 36 4 32 4 19 38
P-6
205 17 148 8 94 378 120 41 4 4 42 84
P-7
0 4 19 2 6 25 4 25 5 31 16 32
C-8
154 25 123 9 78 311 196 31 202 4 108 217
C-94
181 61 384 17 161 644 1895 239 136 13 571 1142
C-28
162 24 75 5 66 266 14 4 0 4 6 11
C-21
244 37 125 7 103 413 443 64 1 4 128 256
C-23
42 14 29 3 22 88 83 27 59 55 56 112
C-27
49 3 21 3 19 75 4 4 39 4 13 25
C-96
163 22 195 12 98 392 2550 446 118 40 788 1577
C-97
259 16 125 5 101 405 307 71 4 2 96 192
C-9
189 24 95 11 80 319 25 16 4 146 48 95
C-86
1 4 30 5 10 40 7 4 4 31 11 22
C-91
3 4 6 7 5 20 9 46 37 4 24 48
C-68
0 4 2 1 2 7 4 13 25 4 11 23
C-102
158 43 101 6 77 307 1880 187 109 4 545 1090
PLGA
10 4 13 4 8 30 4 4 0 4 3 6
P-6 + PLGA
315 64 128 39 137 546 710 116 78 4 227 454
P-7 + PLGA
7 3 15 2 7 27 4 4 4 9 5 10
C-8 + PLGA
319 127 242 24 178 712 1599 646 601 35 720 1441
C-94 + PLGA
391 118 280 34 206 823 6761 19553 3949 207 7618 15235
C-28 + PLGA
395 65 175 13 162 649 84 145 15 13 64 128

76
IFN-g (pg/ml)
IFN-a (pg/ml)
estim.
28185 28186 28187 28188 media x4 28185 28186 28187 28188 media x2
C-21 + PLGA
333 49 177 20 145 579 3581 3169 1340 64 2038 4077
C-23 + PLGA
199 67 102 15 96 382 599 250 110 21 245 490
C-27 + PLGA
292 170 95 14 142 570 54 58 4 39 39 78
C-96 + PLGA
400 186 244 41 218 872 27504 5572 2464 173 8928 17857
C-97 + PLGA
356 177 124 39 174 696 2264 668 285 48 816 1632
C-9 + PLGA
384 82 93 19 145 579 479 451 193 35 290 579
C-86 + PLGA
11 3 84 4 25 101 33 4 4 4 11 22
C-91 + PLGA
161 101 114 1 94 377 880 494 316 4 423 847
C-68 + PLGA
31 8 24 4 17 67 14 51 4 4 18 37
C-102 + PLGA
774 132 380 7 323 1293 2094 397 221 26 684 1369
SAC
195 22 274 15 127 506 73 4 151 102 82 165

77
Ejemplo 40
Este experimento examinó la actividad de una serie de CIQs que contienen un motivo de ácido nucleico hexamérico, 5'-TCGTCG-3', y múltiples espaciadores unidos en el extremo 3' del resto de ácido nucleico (C-13, C-14, C-15 y C16). Véase la Tabla 17. Ninguno de los CIQs fue activo cuando se usó solo, sin embargo todos tuvieron una
5 actividad significativa cuando se formularon con cPLGA.
Tabla 17
IFN-γ (pg/ml) IFN-α (pg/ml) estim. 28057 28058 28059 28060 media 28057 28058 28059 28060 media
células solas 1 2 13911 0 0 0 0 0 P-6 83 103 1230 85 375 621 396 145 123 321 P-7 12342 00000 C-13 231256 310249070 C-14 31132 00000 C-15 53012 00000 C-16 12062 00000 PLGA 40 32 49254 94 35222 41 0 74 P-6 + PLGA 2000 2000 2000 452 1613 2000 2000 1747 403 1537 P-7+PLGA 40 271 16 40 92 0 527 161 108 199 C-13 + PLGA 2000 262 221 168 663 5865 7994 5912 1437 5302 C-14 + PLGA 2000 359 732 2000 1273 3937 6871 6371 2953 5033 C-15 + PLGA 2000 585 2000 258 1211 2991 6282 4138 1731 3786 C-16 + PLGA 172 207 277 71 182 1842 2529 2333 1362 2017 SAC 673 2000 2000 2000 1668 920 2000 387 146 863
Ejemplo 41: Efecto de los CIQs en un Ensayo de Proliferación de Células B
Se aislaron PBMCs humanas de sangre heparinizada de dos sujetos normales. Algunas PBMCs se mantuvieron como reserva, mientras el resto se incubó con microesferas MACS CD19+ (Miltenyi Biotec). Estas células se 10 hicieron pasar después a través de un imán, separando las células B CD19+ por medio de la selección positiva. Esta población fue >98% CD19+, tal como se determina mediante análisis FACS. Las células B se cultivaron después a 1 x 105/200 µl/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. En ciertos casos, las PBMCs también se cultivaron, pero a 2 x 105/200 µl/pocillo. Las células se estimularon por triplicado con 2 µg/ml de polinucleótido o CIQ. El periodo de cultivo fue de 48 horas a 37°C. Al final del periodo de cultivo, las placas se sometieron a un pulso con 3H-timidina,
15 1 µCi/pocillo, y se incubaron durante otras 8 horas. Después, las placas se recogieron mediante el uso de técnicas habituales de centelleo líquido, y los datos se recogieron en cuentas por minuto (cpm).
Experimento A: Los resultados del Experimento A (Tabla 18) demuestran que los polinucleótidos (P-6) y CIQs (C-8, C-9, C-21, C-28) que contienen motivos 5'-C,G-3' provocan que las células B proliferen. Los compuestos de control, P-7 y M-1, y un polinucleótido heptamérico, P-1, generaron poca o ninguna proliferación de células B. El CIQ
20 ramificado, C-28, y el CIQ que contiene espaciadores de propilo, C-9, indujeron más proliferación de células B que los CIQs que contienen espaciadores de hexaetilen glicol, C-8 y C-21. La proliferación de las PBMCs reflejó la de las células B.
Tabla 18
Donante 146
Donante 147 media
tipo celular
estim. cpm1 cpm2 cpm3 media cpm1 cpm2 cpm3 media de ambos
Células B
células solas 538 481 795 605 482 360 296 379 492
Células B
P-6 29280 33430 30056 30922 35729 18032 21166 24976 27949
Células B
P-7 4858 5810 7079 5916 4364 4066 2774 3735 4825
Donante 146
Donante 147 media
tipo celular
estim. cpm1 cpm2 cpm3 media cpm1 cpm2 cpm3 media de ambos
Células B
P-1 761 608 721 697 569 460 687 572 634
Células B
C-8 23815 30066 22969 25617 20914 22370 23659 22314 23966
Células B
C-9 35365 42705 45231 41100 55543 49035 44985 49854 45477
Células B
C-21 28467 16074 19258 21266 17604 18851 19887 18781 20024
Células B
M-1 1514 2815 1173 1834 1679 1667 1436 1594 1714
Células B
C-28 50999 54630 46418 50682 65593 51040 50357 55663 53173
PBMCs
células solas 2744 2303 2284 2444 1301 2402 2143 1949 2196
PBMCs
P-6 22067 23740 28099 24635 26436 23830 17531 22599 23617
PBMCs
P-7 7620 8362 9686 8556 9783 9841 10476 10033 9295
PBMCs
P-1 9724 3041 2425 5063 1706 1960 324 1330 3197
PBMCs
C-8 47202 40790 44811 44268 38845 39733 27981 35520 39894
PBMCs
C-9 55348 24857 39953 40053 88106 65413 90665 81395 60724
PBMCs
C-21 30338 22685 22383 25135 28819 530 370888 22146 23641
PBMCs
M-1 8753 5203 4496 6151 1034 3298 1674 2002 4076
PBMCs
C-28 94977 121595 84977 100516 103916 91439 100905 98753 99635

Experimento B: El Experimento B (Tabla 19) estudió los efectos de la composición de espaciador, así como la estructura del CIQ (lineal frente a ramificado), sobre la proliferación de células B. Los CIQs lineales que contienen espaciadores de propilo, butilo, abásicos, e hidroximetiletilo tienden a inducir más proliferación de células B que los CIQs correspondientes que contienen espaciadores de hexaetilen glicol o trietilen glicol (compárense C-10, C-11, C17, C-18, C-20, C-25). El espaciador de dodecilo hizo que el CIQ fuera inactivo (C-19). En particular, los datos de proliferación de células B no reflejan necesariamente los datos de citocinas mostrados anteriormente, con diferencias particulares observadas entre la proliferación de células B y la inducción de IFN-α.
Tabla 19
121
Ensayo de proliferación 194 media
muestra
célula estim. cpm1 cpm2 cpm3 media cpm1 cpm2 cpm3 media de ambos
1
Células B células solas 451 757 297 502 203 228 151 194 348
2
Células B P-6 19996 15031 19804 18277 13678 12732 9003 11804 15041
3
Células B P-7 1623 1821 2901 2115 1992 1593 1686 1757 1936
4
Células B C-8 2604 12078 17696 10793 9333 9391 7602 8775 9784
5
Células B C-9 21938 35400 23877 27072 13660 16717 17866 16081 21576
6
Células B C-10 15142 14136 16158 15145 7480 5458 5943 6294 10720
7
Células B C-11 30367 30412 18528 26436 16967 20898 11253 16373 21404
8
Células B C-22 17147 14014 6844 12668 6472 5540 3894 5302 8985
9
Células B C-94 11418 14406 11110 12311 7361 8505 5349 7072 9692
10
Células B C-28 35393 26954 26780 29709 21588 13691 15691 16990 23350
11
Células B C-17 27975 30426 9895 22765 17467 14890 10518 14292 18529
121
Ensayo de proliferación 194 media
muestra
célula estim. cpm1 cpm2 cpm3 media cpm1 cpm2 cpm3 media de ambos
12
Células B C-18 17085 14653 15869 10028 12217 10538 10928 13398
13
Células B C-19 858 1099 926 961 371 403 312 362 662
14
Células B C-20 31276 30851 28532 30220 18082 18705 17481 18089 24155
15
Células B C-23 10628 16221 20087 15645 8730 6532 9596 8286 11966
16
Células B C-24 8206 6789 2799 5931 3979 3407 3468 3618 4775
17
Células B C-25 34360 35016 26480 31952 16060 19509 17384 17651 24802


Ejemplo 43: Inducción de Genes Inmuno-Asociados en el Pulmón de Ratón tras Tratamiento Intranasal con CIQs.
Se investigó la capacidad de C-9, C-23, y P-6 (control positivo) de inducir la expresión de mARN de 75 genes diferentes en el pulmón de ratón. Los genes estudiados incluyeron los genes que codifican las citocinas, quimiocinas, moléculas de la superficie celular, factores de transcripción, metaloproteasas, y otras moléculas. El 5 estudio se llevó a cabo en Northview Pacific Laboratories (Hercules, CA) con ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad de Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Se trataron de manera intranasal cinco ratones por grupo bajo anestesia ligera con isoflurano con 20 µg de C-9, C-23, P-6 (control positivo) o P-7 (control negativo) en 50 uL de solución salina. Los experimentos previos demostraron que la inducción óptima de la mayoría de genes fue a las 6 hrs tras el tratamiento. Por lo tanto, a las 6 hrs se recogieron los pulmones y se congelaron instantáneamente en 10 nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C para su uso posterior. Se aisló el ARN total mediante el uso de equipos RNeasy mini (Qiagen Inc., Valencia, CA). Las muestras de ARN se trataron con ADNsa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y se convirtieron en cADN mediante el uso de Rnasa H-Transcriptasa Inversa Superscript II (Invitrogen, Rockville MD) como se describe en Scheerens et al., 2001, Eur. J. of Immunology 31:1465-74. Las muestras de cADN se mezclaron por grupos, y en cada muestra mezclada se midió la expresión de mARN de 75 15 genes mediante el uso de PCR cuantitativa en tiempo real (ABI Prism 5700, Perkin Elmer Applied Biosystems) y SYBR-Green (Qiagen Inc.). Además de los genes de interés, en cada muestra se midió la expresión del mARN de un gen constitutivo (HPRT o ubiquitina). Para corregir la cantidad de ARN en cada muestra, todos los datos se calcularon respecto de la expresión del gen constitutivo. Se muestra una selección de los genes más activados en la Figura 5, y los datos se expresan como la proporción de inducción sobre la respuesta en los ratones tratados con el
20 control (P-7). Los datos demuestran que C-9, C-23, y P-6 inducen intensamente la expresión de una diversidad de genes, que incluyen IL-6, IL-12p40, IFN-alfa, IP-10, e IL-10. El tratamiento de los ratones con C-9, sin embargo, indujo una expresión de mARN considerablemente superior de IFN-alfa en comparación con el grupo tratado con C23 o P-6.
Ejemplo 44: Actividad In Vivo de CIQs
25 Se llevó a cabo un estudio in vivo inyectando de manera subcutánea a ratones (10 ratones/grupo) en la nuca 20 µg (volumen de 200 ul) de P-6 (control positivo), P-7 (control negativo), C-9, C-23, P-1 o P-11. Se recogió sangre 2 horas más tarde. Para el grupo de control positivo de LPS, se inyectó a los ratones de manera intraperitoneal un volumen de 200 ul, y se recogió sangre 1,5 horas más tarde (es decir, en el máximo de actividad de TNF-α inducida por LPS). La sangre se coaguló y se preparó el suero y se almacenó a -80°C hasta el ensayo. Se ensayaron las
30 citocinas séricas mediante el uso de equipos Biosource Cytoscreen para TNF-α y pares de anticuerpos de Pharmingen para mIL-6 y mIL-12. Todas las muestras se ensayaron por duplicado.
P-6 y los dos CIQs, C-9 y C-23, indujeron cada uno IL-12 p40, IL-6, y TNF-α, mientras el oligonucleótido de control, P-7, fue inactivo (Figura 6A-C). El CIQ C-23 fue más potente que C-9 y P-6 en este ensayo. Como se esperaba, el hexámero (P-11: 5'-AACGTT) y el heptámero (P-1: 5'-TCGTCGA) fueron inactivos.
35 Ejemplo 45: Respuesta Inmunitaria en Primates hacia Antígeno y CIQs
Se examinaron las respuestas inmunitarias a la administración del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en presencia de CIQs en babuinos.
El HBsAg fue HBsAg recombinante producido en levadura. Los grupos de babuinos (ocho animales por grupo) incluyeron babuinos macho y hembra con pesos que oscilaron en 8-31 kg (pesos medios por grupo de 13-16 kg) al
40 comienzo del estudio.
Los babuinos se inmunizaron dos veces, a un intervalo de dos meses (0 y 2 meses), mediante inyección intramuscular (IM) de 20 µg de HBsAg en un volumen de 1 ml. Como se resume más adelante, algunos de los grupos también recibieron CIQs (C-8 o C-9) o un control positivo (P-6) con el HBsAg.
Se recogió sangre de todos los animales antes de la inmunización y 2 semanas tras la inmunización. Se midieron los títulos de IgG anti-HBsAg como sigue. Las muestras de suero de los babuinos se analizaron mediante el equipo comercial AUSAB EIA (Abbott Labs Nº de cat. 9006-24 y 1459-05) mediante el uso de microesferas revestidas con HBsAg derivado de plasma humano. Las muestras se analizaron junto con un panel de patrones positivos y 5 negativos de HBsAg derivado de plasma humano que oscilaron en el intervalo de 0-150 mUI/ml. Se usó HBsAg conjugado con biotina y anticuerpo anti-biotina de conejo conjugado a HRP como complejo de anticuerpos secundarios para la detección. El ensayo se reveló con orto-fenilendiamina (OPD), y se determinaron los valores de absorbancia a 492 nm restando el valor de fondo a 600 nm (espectrofotómetro Quantum II, Abbott Labs). Mediante el uso del valor de absorbancia de la muestra, se expresa la concentración correspondiente de anti-HBsAg en mili
10 unidades internacionales por ml (mUI/ml) tal como se determina a partir de la curva patrón según los parámetros establecidos por el fabricante. Para las muestras diluidas, la cuantificación se basó en la absorbancia de la muestra que dio como resultado un valor entre 0-150 mUI/ml, multiplicando por el factor de dilución para llegar a la concentración final.
Se realizó el análisis estadístico con los datos transformados logarítmicamente mediante el análisis de la varianza
15 (programa estadístico NCSS97, Kaysville, UT) con el uso de la comparación de valores previstos por ANOVA unidireccional (α = 0,05). p ≤ 0,05 se consideró significativo.
Los grupos de animales ensayados se inmunizaron como sigue:
Grupo 1 - 20 µg de HBsAg;
Grupo 2 - 20 µg de HBsAg + 1000 µg de P-6;
20 Grupo 3 - 20 µg de HBsAg + 1000 µg de C-8;
Grupo 4 - 20 µg de HBsAg + 1000 µg de C-9
Los resultados del estudio se muestran en la Tabla 20 más adelante. La administración de los CIQs o del control positivo P-6, junto con HBsAg dio como resultado títulos incrementados de anticuerpos anti-HBsAg en comparación con la administración de HBsAg solo. En una comparación por parejas, la respuesta inmunitaria detectada en los
25 Grupos 2, 3, y 4 fue significativamente diferente de la detectada en el Grupo 1 (p<0,05 para el Grupo 2 y p<0,005 para los Grupos 3 y 4, después de la segunda inmunización). No se halló ninguna diferencia estadística entre los grupos 2, 3, y 4.
Tabla 20
Respuesta de Anticuerpos de Babuinos (AUSAB EIA) HBsAg + CIQ
Nº
Grupo Nº Vacuna Anti-HBsAg (mUI/ml) tras primero tras segundo
B339 B340 B341 B342 B343 B344 B345 B346
1 0 0 VHB 0 (20 µg) 0 0 0 0 0 7 63 15 80 55 50 28 24
Media 0 Desv. est. 0
40 26
B347 B348 B349 B350 B351 B352 B353
2 0 6 VHB 0 (20 µg) 17 P-6 0 (1000 µg) 0 15 329 121 108 13.569 315 38 1.446
Respuesta de Anticuerpos de Babuinos (AUSAB EIA) HBsAg + CIQ
Nº Grupo Nº Vacuna Anti-HBsAg (mUI/ml) tras primero
tras segundo
B354 21
1.675
Media 7 Desv. est. 9
2200* 4.637
B379 3 2 B380 0 B381 VHB 0 B382 (20 µg) 125 B383 C-8 0 B384 (1000 µg) 52 B385 0 B386 0
184 3.038 41.706 3.718 250 13.750 11.626 79
Media 22 Desv. est. 45
9294** 14.121
B387 4 0 B388 42 B389 VHB 0 B390 (20 µg) 0 B391 C-9 405 B392 (1000 µg) 26 B393 75 B394 0
5.605 8.978 312 2.992 12.663 112 2.364 52
Media 68 Desv. est. 139
4135** 4.633
p<0,05, ** p<0,005 comparado con HBV solo (Grupo 1)


Ejemplo 46: Respuestas In Vivo Generadas Mediante un Conjugado CIQ-Antígeno
Este ejemplo demuestra la inducción de una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos en ratones mediante la administración de un conjugado CIQ-antígeno.
Como se describe más adelante, se inmunizaron 10 ratones/grupo dos veces de manera intradérmica (en la cola) a
5 intervalos de dos semanas con conjugado C-11/Amb a 1 sintetizado como se describe más adelante (1 µg o 10 µg), P-6/Amb a 1 (1 µg) o Amb a 1 (1 µg). Se determinaron los títulos de IgG1 e IgG2a Anti-Amb a 1 a partir de sueros extraídos 2 semanas tras cada inyección. Se llevaron a cabo reestimulaciones in vitro con células de bazo 6 semanas tras la 2ª inmunización para determinar las respuestas de IFNγ e IL-5 específicas de Amb a 1.
Los ratones inmunizados con el conjugado C-11-Amb a 1 mostraron el patrón de respuesta inmunitaria característico
10 observado con el material de referencia P-6-Amb a 1, en concreto, un cambio de la respuesta inmunitaria específica hacia Amb a 1 desde un tipo Th2 hacia un tipo Th1. Los ratones inmunizados con los conjugados C-11 o P-6 desarrollaron respuestas de IgG2a intensas y respuestas de IgG1 reducidas. Los grupos tratados con conjugado mostraron también una inactivación de la respuesta de IL-5 y la elevación de la respuesta de IFN-γ. Además, las respuestas inmunitarias hacia el conjugado C-11-Amb a 1 parecieron incrementarse de una manera dependiente de
15 la dosis, tal como se demuestra comparando los grupos de dosis de 1 µg y 10 µg. El conjugado C-11-Amb a 1 provoca una respuesta inmunitaria de calidad similar a la observada con P-6-Amb a 1.
Los resultados se muestran en las Tablas 21-23.
Procedimiento General El estudio con animales se llevó a cabo en Northview Pacific Laboratories (Hercules, CA) mediante el uso de ratones BALB/c hembra de 8-12 semanas de edad de Charles River Laboratories (Hollister, CA). Se inyectó a 10 ratones/grupo dos veces de manera intradérmica en la cola (ID) a intervalos de dos semanas uno de los materiales siguientes: conjugado C-11/Amb a 1 (1 µg), conjugado C-11/Amb a 1 (10 µg), conjugado P-6/Amb a 1 (1 µg) o antígeno Amb a 1 (1 µg). Se recogió sangre a través de la vía retro-orbital dos semanas después de cada una de las inyecciones y se preparó el suero para la determinación de anticuerpos. Seis semanas después de la 2ª inyección se recogieron los bazos para los ensayos de re-estimulación in vitro para determinar la respuesta de citocinas de IFNγ e IL-5. Los bazos se ensayaron individualmente. Se usó Amb a 1 a 25 y 5 µg/ml para la re-estimulación con 5x105 células/pocillo, y los sobrenadantes se recogieron en el Día 4 y se almacenaron a -80°C hasta el ensayo. Los controles para el ensayo in vitro incluyeron SAC al 0,01% y PMA/IO de 10 ng/ml y 1 uM, respectivamente.
Ensayos de IgG1 e IgG2a anti-Amb a 1 de Ratón
Las muestras de suero de ratón se analizaron mediante ELISA en placas de fondo redondo de 96 pocillos que se revistieron con 50 µl/pocillo de antígeno Amb a 1 a 1 µg/ml. Se usó un anticuerpo de cabra conjugado a biotina anti-IgG1 (o IgG2a) de ratón como anticuerpo secundario. Se usó un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano para la detección. El ensayo se reveló con TMB, y los valores de absorbancia se determinaron a 450 nm restando el valor de fondo a 650 nm (lector de microplacas de precisión Emax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El título se definió como la recíproca de la dilución del suero que proporcionó una absorbancia en el ELISA de 0,5 DO mediante el uso de un análisis de 4 parámetros (Softmax Pro97, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todas las muestras se ensayaron en pocillos por duplicado en placas diferentes, y los títulos se informaron como la media de los dos valores.
Ensayos de IL-5 e IFN-gamma de Ratón
Se ensayaron en los sobrenadantes los niveles de IL-5 e IFNγ mediante ELISA de captura en placas revestidas con anticuerpos monoclonales anti-citocina. Se usaron MAbs anti-citocina biotinilados como anticuerpos secundarios. Se usó un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano para la detección, y el ensayo se reveló con TMB. La concentración se calculó a partir de una curva patrón ensayada en cada placa. Los valores de absorbancia se determinaron a 450 nm restando el valor de fondo a 650 nm (lector de microplacas de precisión Emax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Todas las muestras se ensayaron en pocillos por duplicado en placas diferentes, y las concentraciones se informaron como la media de los dos valores.
Se realizaron estadísticas con los datos transformados logarítmicamente con el programa NCSS97 (programa estadístico NCSS, Kaysville, Utah) mediante el uso de ANOVA unidireccional con comparaciones de valores previstos, α = 0,05. Para el siguiente estudio, p<0,05 se considera estadísticamente significativo.
Síntesis del Conjugado C-11/Amb a 1
Síntesis de C-11 activado (C-111):
El 5'-disulfuro-C-11 (C-110) se disolvió en tampón de activación (fosfato sódico 100 mM/cloruro sódico 150 mM/pH 7,5) y se activó mediante reducción con TCEP. El CIQ activado (C-111) se purificó mediante el uso de una columna de Sephadex G25 de 5 ml (Pharmacia) con el uso del mismo tampón de activación como fase móvil. Las fracciones se recogieron manualmente a intervalos de 0,5 minutos comenzando cuando se elevó el valor inicial. Tras la purificación, se determinó la concentración de las diversas fracciones mediante el uso de A260 y un coeficiente de extinción de 25,6 DO/mg.
Síntesis de Amb a 1 activado:
Amb a 1 se activó bloqueando primero los sulfhidrilos libres, y después añadiendo un reticulador hetero-funcional. Los reactivos en exceso se eliminaron mediante desalación con el uso de una columna de desalación HiTrap G-25 (Pharmacia, nº de catálogo 17-1408-01). El Amb a 1 activado resultante tuvo una media de 9,3 sitios por proteína activada.
Síntesis del Conjugado C-11/Amb a 1:
El C-11 activado (C-111) y Amb a 1 activado se combinaron, y el conjugado C-11/Amb a 1 resultante se fraccionó mediante el uso de una columna de cromatografía de exclusión por tamaños Superdex 200 (Pharmacia, nº de cat. 17-1088-01; 1 cm x 30 cm). Se usó tampón de formulación (fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) como fase móvil. Las fracciones se recogieron a intervalos de 1 minuto, comenzando cuando el valor inicial comenzó a elevarse.
Las muestras de conjugado se analizaron mediante SDS-PAGE con el uso de un gel NuPAGE del 4-12% (Invitrogen, nº de catálogo NP0322) mediante el uso de tampón MOPS (Invitrogen, nº de catálogo NP0001), y mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC-HPLC) con el uso de una columna BioSep SEC-S3000 (Phenomenex, nº de catálogo 00H-2146-E0). Tras la SDS-PAGE, la proteína se visualizó mediante el uso de tinción con azul de Coomassie (GelCode, Pierce nº de catálogo 24596). La presencia del CIQ se confirmó mediante el uso de tinción de ADN-Plata (Pharmacia, nº de catálogo 17-6000-30). Se usó la SDS-PAGE y la SEC-HPLC para definir los criterios de mezcla, y para la caracterización de la mezcla obtenida. La concentración de proteína se midió mediante el método de ácido bicinconínico (BCA, Sigma, nº de catálogo BCA-1).
Tabla 21 Tabla 22
Actividad del Conjugado C-11/Amb a 1 en Ratones Títulos de IgG1 e IgG2a anti-Amb a 1
Grupo Animal Nº Inmunización
2 semanas tras la 1ª Inm. IgG1 IgG2a 2 semanas tras la 2ª Inm. IgG1 IgG2a
1 1 conjugado C-11 / Amb a 1
30 148 7.900 19.886
2
30 221 13.037 19.735
3
30 943 946 23.918
4
30 64 5.485 10.487
5 (1 µg)
38 1.894 3.805 9.945
6
30 943 600 5.249
7
30 570 10.337 20.156
8 ID
30 259 600 8.350
9
56 30 2.575 5.747
10
30 30 8.381 28.971
media desv. est.
33** 510 8 599 5.367** 15.244* 4.400 8.285
2 11
51 345 8.982 27.877
12 conjugado C-11 / Amb a 1
30 667 201.008 612.739
13
77 445 6.739 86.672
14
30 1.662 22.578 121.770
15 (10 µg)
30 67 190.835 88.745
16
30 450 5.971 17.600
17
55 1.137 29.646 105.398
18 ID
99 1.119 70.159 183.152
19
99 8.227 80.052 250.206
20
30 1.613 6.235 63.616
media desv. est.
53* 1.573 29 2.399 62.221 155.778* 75.298 174.925
3 21
30 37 3.437 65.306
22 conjugado de referencia P-6/Amb a 1
1.422 303 15.652 6.198
23
485 265 84.927 177.281
24
170 1.182 37.379 56.074
25 (1 µg)
903 2.027 38.121 76.572
26
88 2.298 32.499 240.098
27
33 321 3.011 24.404
28 ID
30 55 24.307 20.796
29
113 89 43.060 19.586
30
30 39 37.116 7.317
Actividad del Conjugado C-11/Amb a 1 en Ratones Títulos de IgG1 e IgG2a anti-Amb a 1
Grupo Animal Nº Inmunización
2 semanas tras la 1ª Inm. IgG1 IgG2a 2 semanas tras la 2ª Inm. IgG1 IgG2a
media desv. est.
330 662 475 862 31.951 69.363 23.568 78.697
4 31
3.405 349 172.827 6.244
32 Amb a 1
7.331 30 164.673 1.003
33
2.847 35 112.766 7.174
34
4.021 30 100.281 1.399
35 (1 µg)
8.333 212 156.037 4.969
36
1.214 286 118.407 2.125
37
1.279 30 396.404 600
38 ID
4.332 80 187.335 4.599
39
569 30 63.536 600
40
2.696 30 161.039 902
media desv. est.
3.603** 111* 2.554 123 163.331** 2.962** 90.406 2.530
se usó un valor de 30 para las muestras <30 tras la 1ª inmunización se usó un valor de 600 para las muestras <600 tras la 2ª inmunización *p<0,05, **p<0,005 comparado con P-6/Amb a 1
Actividad del Conjugado C-11/Amb a 1 en Ratones
Respuesta de IFNγ in vitro (pg/ml)
Amb a 1
Medio solo
Animal
Inmunización 25 µg/ml 5 µg/ml PMA
1
22501 16320 12505 45
2
conjugado C-11 / Amb a 1 16291 10054 8433 45
3
(1 µg) 8534 5084 5835 45
4
16925 8322 3796 45
5
23136 11298 9225 45
6
ID 24900 25489 21525 185
7
4383 2716 8855 45
8
MUERTO MUERTO MUERTO MUERTO
9
16088 6285 27722 45
10
25067 12431 28201 45
Media
17536 10889 14011 61
Desv. est.
7289 6839 9353 47
11
19994 13466 33702 45
12
conjugado C-11 / Amb a 1 50732 25103 36467 45
13
(10 µg) 54752 28422 21770 123
Actividad del Conjugado C-11/Amb a 1 en Ratones Respuesta de IFNγ in vitro (pg/ml)
Animal
Inmunización Amb a 1 25 µg/ml 5 µg/ml PMA Medio solo
14
96417 78017 24601 1305
15
83356 43505 20021 151
16
ID 88018 51299 40604 829
17
87839 59079 31562 83
18
49763 28468 58062 211
19
102646 60332 32669 3366
20
61939 29505 53393 756
Media Desv. est.
65868** 24860 39652 20160 35576 13331 394 455
21
4275 3083 36550 45
22
conjugado de referencia P6/Amb a 1 4307 996 23742 45
23
(1 µg) 40761 16956 15407 45
24
40764 23643 8961 118
25
35645 30164 15915 209
26
ID 40895 31027 13355 308
27
25538 14349 15515 73
28
15884 12432 11623 45
29
4215 4608 71066 45
30
63276 46897 43680 734
Media Desv. est.
27556 20099 18416 14603 25581 19548 167 218
31
3016 2585 108000 452
32
Amb a 1 1193 277 94345 104
33
(1 µg) 5112 6239 97567 461
34
1301 251 89623 49
35
6879 2972 77808 56
36
ID 1187 673 77299 89
37
4492 2840 89253 282
38
6170 3765 70169 187
39
2099 1152 108000 132
40
2209 3895 103131 309
Media Desv. est.
3366** 2143 2465 1915 91520 13239 212 156

se usó un valor de 18 para los valores <18 los valores
no se incluyeron en los cálculos, ya que el valor para el medio solo fue >3 desv. est. + media de todos los valores del medio solo (es decir, 2014 pg/ml) **p<0,005 comparado con P-6/Amb a 1 para la reestimulación con 25 µg/ml
Tabla 23
Actividad del Conjugado C-11/ Amb a 1 en Ratones Respuesta de IL-5 in vitro (pg/ml)
Animal
Inmunización Amb a 1 25 µg/ml 5 µg/ml PMA Medio solo
1
67 106 2202 41
2
conjugado C-11 / 49 53 2406 24
3
Amb a 1 264 24 968 24
4
(1 µg) 24 24 2979 24
68
45 2851 46
6
ID 104 121 2547 129
7
24 24 3935 24
8
MUERTO MUERTO MUERTO MUERTO
9
24 24 24 203 1383 1837 24 53
Media Desv. est.
68 86 63 63 2320 948 33 12
11
24 33 1655 24
12
conjugado C-11 / 41 73 2258 84
13
Amb a 1 169 137 892 24
14
(10 µg) 261 221 918 33
134
221 658 24
16
ID 253 187 778 29
17
72 109 966 24
18
24 35 3656 24
19
334 231 1238 145
213
55 751 24
Media Desv. est.
153 111 130 80 1377 940 44 40
21
24 24 1514 24
22
conjugado de referencia P 24 60 3725 24
23
6/Amb a 1 157 277 1702 24
24
(1 µg) 96 152 4473
24
88
36 1414 24
26
ID 39 372 1235 24
27
218 176 1037 24
28
103 54 1382 24
29
24 459 2194 24
110
102 2990 24
Media Desv. est.
88 64 171 151 2167 1174 24 0

Actividad del Conjugado C-11/ Amb a 1 en Ratones Respuesta de IL-5 in vitro (pg/ml) Amb a 1 Animal
Medio solo 31
Inmunización 25 µg/ml 5 µg/ml PMA
724 331 1332
24 32
91 57 3186 24
Amb a 1
33 930 1259 1574 56
(1 µg)34 375 674 2506
24 35
1093 763 2197
24 36
ID 1206 490 3715
27 37
2808 2115 1727
67 38
1441 909 1655
58 39
1240 1228 1367
24 40
1373 481 1683
68 Media 1128**
831 2094
40 Desv. est.
734 588 808 20
se usó un valor de 24 para los valores <24 los valores
no se incluyeron en los cálculos, ya que el valor para el medio
solo fue >3 desv. est. + media de todos los valores del medio solo (es decir, 124
pg/ml)
*p<0,05, **p<0,005 comparado con P-6/Amb a 1 para la reestimulación con 25 µg/ml
Ejemplo 47: Efecto del Resto Espaciador sobre la Actividad del CIQ
Este ejemplo demuestra el efecto de diferentes restos espaciadores sobre la inducción de IFN-α. La comparación de C-90 (CIQ con C3) y C-51 (CIQ con HEG) demostró que C-51 indujo 8 veces más IFN-α que C-90, aunque la cantidad de IFN-γ inducida por cada CIQ fue similar. De forma similar, la comparación de CIQs ramificados que
5 contienen enlazadores diferentes demostró que para la inducción de IFN-α, HEG (C-94) > TEG (C-103) > C3 (C-104) = sin enlazador (C-28).
Tabla 24
IFN-g IFN-g (pg/ml) (pg/ml) estim. 28234 28235 28236 28237 media 28234 28235 28236 28237 media
células solas 4 4 4 4 4 16 16 16 16 16 P-6 15 52 511167 321 58 16 16 74 41 P-7 13 4 7 4 7 6216161628 C-90 7 118 497 1586 552 16 46 117 345 131 C-51 17 123 193 1580 478 16 77 352 3798 1061 C-71 30 168 448 1663 577 17 30 538 1665 563 C-101 14 205 627 2612 865 16 249 1354 8566 2546 C-96 21 239 354 1396 503 16 120 608 993 434 C-97 10 119 269 980 345 16 16 140 16 47 C-100 27 183 490 1907 652 16 16 398 193 156 C-88 5 21 17 477 130 95 16 212 111 109
IFN-g IFN-g (pg/ml) (pg/ml)
estim. 28234 28235 28236 28237 media 28234 28235 28236 28237 media C-33 23 86 247 2076 608 16 16 16 91 35 C-21 4 107 308 1645 516 16 16 73 678 196 C-28 10 14 88 1229 335 16 16 16 16 16 C-94 7 161 239 1116 381 16 118 548 3631 1078 C-103 21 44 250 1854 542 16 21 126 213 94 C-104 14 4 87125 58 16 29 16 16 19
PLGA 4 31 18 10 16 16122157 35 83 P-6 + PLGA 57 514 1052 3775 1350 16 694 1163 3444 1329 P-7+PLGA 4 41113 8 1616161616 C-90 + PLGA 139 673 831 4618 1565 1175 696 4544 5103 2880 C-51+PLGA 88 644 1064 3748 1386 3257 2168 8000 8000 5356 C-71 + PLGA 101 797 1254 3899 1513 3085 2244 8000 8000 5332 C-101 + PLGA 110 659 879 6944 2148 4679 4488 8000 8000 6292 C-96 + PLGA 143 1070 1167 5471 1963 4107 3237 6660 8000 5501 C-97 + PLGA 68 737 988 5327 1780 4742 4216 8000 8000 6240 C-100 + PLGA 176 1299 1742 7804 2755 1520 1092 4074 3777 2616 C-88 + PLGA 102 512 1148 5055 1704 803 613 2409 6412 2559 C-33 + PLGA 118 444 968 3947 1369 551 566 3514 6727 2840 C-21 + PLGA 159 411 1089 4056 1429 1369 1561 5366 8000 4074 C-28+PLGA 28 131 1005 3868 1258 16 16 184 134 88 C-94 + PLGA 174 623 1352 4034 1546 4145 4653 7197 8000 5999 C-103 + PLGA 192 643 1388 5063 1822 895 1486 4456 5405 3061 C-104+PLGA 40 73 641 4930 1421 16 16 128 92 63 SAC 1845 1250 924 5350 2342 2374 327 1149 3744 1899
Ejemplo 48: Determinación de la Actividad Inmunomoduladora Aislada de Polinucleótidos Cuya Secuencia Corresponde a los Restos de Ácido Nucleico de CIQ
Este ejemplo ilustra adicionalmente la actividad inmunoestimuladora de CIQs que contienen restos de ácido nucleico que no tienen actividad inmunomoduladora aislada. La actividad de los polinucleótidos cuya secuencia corresponde 5 a los restos de ácido nucleico de CIQ se ensayó sola o en combinación con espaciadores libres, y se comparó con la actividad de un CIQ que contiene la misma cantidad de ácido nucleico y espaciador. Por ejemplo, se compararon 3 uM del CIQ C-101 con 9 uM de P-14 o una mezcla de 9 uM de P-14 y 9 uM de hexaetilen glicol y 3 uM de glicerol (porque C-101 contiene tres equivalentes de P-14, tres equivalentes de hexaetilen glicol, y un equivalente de glicerol). En todos los casos, los CIQs fueron activos, mientras los polinucleótidos cortos, tanto solos como
10 mezclados con los espaciadores, fueron inactivos. Véase la Tabla 25. La actividad de los espaciadores solos se ensayó a una concentración de 9 uM, y todos fueron completamente inactivos.
Tabla 25
IFN-g IFN-a (pg/ml) (pg/ml) estim. 28250 28251 28252 28253 media 28250 28251 28252 28253 media células solas 18 5 9 1 8 16 16 30 19 20
IFN-g IFN-a (pg/ml) (pg/ml)
estim. 28250 28251 28252 28253 media 28250 28251 28252 28253 media P-6 12118343752 1616161616 P-7 104 139 136 1616161616
espaciador de propilo 13 1 1 1 4 16 16 16 16 16 Espaciador de butilo 8 5 1 1 4 16 16 16 16 16 Trietilen glicol 15 1 7 1 6 16 16 16 16 16 Hexaetilen glicol 12 1 1 15 7 16 16 16 35 21 Glicerol 1612 2 1 8 1616161616
C-51 135 45 164 167 128 181 246 95 1226 437 C-101 224 63 180 146 153 540 1472 509 2645 1291 P-14 1034111016 1616161616
P-14/HEG/glicerol 14 19 10 10 13 16 16 16 16 16
C-21 122 51 155 203 133 31 69 41 264 101 C-94 340 60 287 128 204 245 645 323 1198 603 P-1 542156 133 1616161616 P-1/HEG/glicerol 15 9 19 1 11 16 16 16 16 16
C-45 107 26 95 8 59 16 109 55 382 140 P-13 181322 114 1616161616 P-13/HEG 40 28 45 1 28 16 16 16 16 16
C-10 337 163 776 898 544 16 23 25 124 47 P-2 72553 122 1616251618 P-3 322172 131 1629383129 P-4 72 143 129 1616161616
P-2/P-3/P-4/HEG 68 1 38 1 27 16 16 16 16 16
Ejemplo 49: Preparación de (5'-TCGACGT-3'-HEG)med=185-Ficoll400 (C-137)
A. Preparación de Maleimido-Ficoll400
Se preparó aminoetilcarboximetilo (AECM)180-Ficoll400 mediante el método de Inman (J. Immunology, 1975, 114: 704-709). De media, hubo 180 grupos aminoetilo por mol de Ficoll (PM = 400.000 Da). 27,6 mg (62,6 µmol) de 4-[N
5 maleimidometil]-ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo disuelto en 300 ul de DMSO se añadió gota a gota, con agitación constante en vórtex, a 23,2 mg (0,058 µmol) de AECM180-Ficoll400 disuelto en 1,0 ml de tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 6,66). La mezcla de reacción se colocó en un agitador durante 2 h, y después se desaló en una columna de Sephadex G-25 para proporcionar 20 mg de maleimido-Ficoll400. De media, hubo aproximadamente 165 grupos maleimida por mol de Ficoll.
10 B. Preparación de 5'-TCGACGT-3'-HEG-(CH2)3-SH (C-136)
Se sintetizó 5'-TCGACGT-3'-HEG-(CH2)3-SS-(CH2)3-OH (C-135) de manera análoga a C-116. A 10 mg (3,57 µmol) de C-135 disuelto en 0,4 mL de tampón de fosfato sódico 0,1 M/cloruro sódico 150 mM/pH 7,5 se le añadieron 5,7 mg (20 µmol) de TCEP disuelto en 0,7 ml del mismo tampón. La mezcla se agitó bien en vórtex y se colocó en un baño de agua a 40°C durante 2 h. El tiol (C-136) se purificó mediante RP-HPLC (columna PLRP-S de Polymer Labs) con el uso de un gradiente creciente de acetonitrilo en tampón de acetato de trietilamonio (TEAA)/pH 7,0, y se usó inmediatamente en la siguiente reacción.
C. Preparación de (5'-TCGACGT-3'-HEG)x-Ficoll400 (C-137)
5 A 5,5 mg (0,014 µmol) de maleimido-Ficoll400 disuelto en 0,7 ml de fosfato sódico 0,1 M/pH 6,66 se le añadieron 6,8 mg (2,5 µmol) de C-136 disuelto en 3,45 mL de aproximadamente un 30% de tampón de acetonitrilo/TEAA/pH 7,0. La mezcla se colocó en el agitador a TA durante la noche, y el producto se purificó en una columna Superdex 200 (Pharmacia). Los cálculos que usaron el peso total del producto aislado y los valores de absorbancia a 260 nm demostraron que el producto contuvo, de media, aproximadamente 185 oligonucleótidos por mol de Ficoll. También
10 se obtuvo una segunda fracción que contuvo una carga inferior de oligonucleótidos por mol de Ficoll.
D. Actividad de C-137
Como se muestra en la Tabla 26, el CIQ basado en polisacáridos tuvo una actividad notable en los ensayos de respuesta de citocinas, y mostró en particular una estimulación significativa de IFN-α.
Tabla 26
Compuesto IFN-g (pg/ml) IFN-a (pg/ml)
estim. 28313 28314 28315 28316 media x4 28313 28314 28315 28316 media
células solas 1 9 11 11 8 32 31 122 100 98 88
P6 1 38 47 309 99395 31 130 122 134 104
P7 1 11 12 20 1143 31176107121109
C-137 1 22 13 54 22 90 3612 5468 624 4000 3426
SAC 87 77 56 4000 1055 4220 346 192 114 1172 456 15
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Fearon, Karen Dina, Dino Tuck, Stephen
<120> COMPUESTOS INMUNOMODULADORES QUIMÉRICOS Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS
<130> 377882002040
<140> Para ser asignado
<141> Adjunto
<150> 60/299.883
<151> 21-06-2001
<150> 60/375.253
<151> 23-04-2002
<160> 141
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<221> variación
<222> (5)...(24)
<223> n = cualquier nucleótido
<221> variación
<222> (5)...(24)
<223> n's puede estar o no presente
<400> 1 tcgannnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24
<210> 2
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 2
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 3
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 3
tgactgtgaa ccttagagat ga 22
<210> 4
<211> 10
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1 n = t, g, c, o 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 2 n = t, g, a, o u
<221> <222> <223>
variación 4 n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación 7 n = t, g, o u
<400> 4 nnancgntcg
10
<210> <211> <212> <213>
5 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 5 tgaacgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
6 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 6 ggaacgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
7 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 7 tgaacgutcg
10
<210> <211> <212> <213>
8 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 8 tgaccgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
9 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 9 tgatcggtcg
10
<210> <211> <212> <213>
10 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 10 tgatcgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
11 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 11 tgaacggtcg
10
<210> <211> <212> <213>
12 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 12 gtaacgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
13 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 13 gtatcggtcg
10
<210> <211> <212> <213>
14 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 14 gtaccgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
15 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 15 gaaccgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
16 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1 n = 5-bromocitosina
<400> 16 ngaccgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
17 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 17 cgaacgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
18 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 18 cgaccgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
19 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1 n = 5-bromocitosina
<400> 19 ngaacgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
20 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 20 ttaacgutcg
10
<210> <211> <212>
21 10 ADN

<213> Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 21 tuaacgutcg
10
<210> <211> <212> <213>
22 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 22 ttaacgttcg
10
<210> <211> <212> <213>
23 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 23 tcgtcgaacg ttcgttaacg ttcg
24
<210> <211> <212> <213>
24 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 24 tgactgtgaa cgutcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
25 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 25 tcgtcgaucg utcgttaacg utcg
24
<210> <211> <212> <213>
26 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 26 tcgtcgaucg ttcgtuaacg utcg
24
<210> <211> <212> <213>
27 24 ADN Secuencia Artificial
<220>
<223>
Constructo sintético
<400> 27 tcgtcguacg utcgttaacg utcg
24
<210> <211> <212> <213>
28 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 7 n = 2-amino-adenina
<400> 28 tcgtcgnacg utcgttaacg utcg
24
<210> <211> <212> <213>
29 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 29 tgatcgaacg ttcgttaacg ttcg
24
<210> <211> <212> <213>
30 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 30 tgactgtgaa cgutcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
31 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 31 tgactgtgac cgttcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
32 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 32 tgactgtgat cggtcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
33 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 33 tcgtcgaacg ttcgtt
16
<210> <211> <212> <213>
34 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 34 tcgtcgtgaa cgttcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
35 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 35 tcgtcggtat cggtcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
36 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 36 cttcgaacgt tcgagatg
18
<210> <211> <212> <213>
37 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 37 ctgtgatcgt tcgagatg
18
<210> <211> <212> <213>
38 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 38 tgactgtgaa cggtcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
39 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 39 tcgtcggtac cgttcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
40 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 40 tcgtcggaac cgttcggaat ga
22
<210> <211> <212> <213>
41 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 41 tcgtcgaacg ttcgagatg
19
<210> <211> <212> <213>
42 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 42 tcgtcgtaac gttcgagatg
20
<210> <211> <212> <213>
43 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 43 tgactgtgac cgttcggaat ga
22
<210> <211> <212> <213>
44 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 44 tcgtcgaacg ttcgaacgtt cg
22
<210> <211> <212> <213>
45 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 45 tngtngaacg ttcgagatg
19
<210> <211> <212> <213>
46 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 46 tcgtngaacg ttcgagatg
19
<210> <211> <212> <213>
47 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 47 tcgtcgaccg ttcggaatga
20
<210> <211> <212> <213>
48 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2,5 n = 5-bromocitosina
<400> 48 tngtngaccg ttcggaatga
20
<210> <211> <212> <213>
49 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 49 tcgtngaccg ttcggaatga
20
<210> <211> <212> <213>
50 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 50 ttcgaacgtt cgttaacgtt cg
22
<210> <211> <212> <213>
51 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 4 n = 5-bromocitosina
<400> 51 cttngaacgt tcgagatg
18
<210> <211> <212> <213
52 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 52 tgatcgtcga acgttcgaga tg
22
<210> <211> <212> <213>
53 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1 n = t, g, c, o 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 2 n = t, g, a, o u
<221> <222> <223>
variación 4 n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 7 n = t, g, o u
<400> 53 nnanngntcg
10
<210> <211> <212> <213>
54 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 54 tgaangttcg
10
<210> <211> <212> <213>
55 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 55 tgaangutcg
10
<210> <211> <212> <213>
56 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 56 tgacngttcg
10
<210> <211> <212> <213>
57 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 57 tgatnggtcg
10
<210> <211> <212> <213>
58 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 58 gtatnggtcg
10
<210> <211> <212> <213>
59 10 ADN Secuencia Artificial
<220>

<223> Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 59 gtacngttcg
10
<210> <211> <212> <213>
60 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 60 gaacngttcg
10
<210> <211> <212> <213>
61 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 61 gaaangutcg
10
<210> <211> <212> <213>
62 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 62 ngacngttcg
10
<210> <211> <212> <213>
63 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 63 cgaangttcg
10
<210> <211> <212> <213>
64 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 64 ngaangttcg
10
<210> <211> <212> <213>
65 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 65 ngaangutcg
10
<210> <211> <212> <213>
66 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 66 taangutcg
10
<210> <211> <212> <213>
67 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 67 tuaangutcg
10
<210> <211> <212> <213>
68 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221>
variación
<222> <223>
5 n = 5-bromocitosina
<400> 68 ttaangttcg
10
<210> <211> <212> <213>
69 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 69 tgactgtgaa ngutcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
70 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 9, 19 n= 5-bromocitosina
<400> 70 tcgtcgaang ttcgttaang ttcg
24
<210> <211> <212> <213>
71 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 71 tgactgtgaa ngutcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
72 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 72 tgactgtgaa ngutcggaat ga
22
<210> <211> <212>
73 22 ADN
<213>
Secuencia Artificial
<213>
Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 73 tcgtcggaaa ngutcggaat ga
22
<210> <211> <212> <213>
74 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5, 9 n = 5-bromocitosina
<400> 74 tcgtngaang utcggaatga
20
<210> <211> <212> <213>
75 10 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 1 n = t, c, o 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 2 n = t, g, a, o u
<221> <222> <223>
variación 4 n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación 7 n = t, g, o u
<400> 75 nnancgntcg
10
<210> <211> <212> <213>
76 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 76 tgactgtgaa ngttcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
77 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11, 15 n = 5-bromocitosina
<400> 77 tgactgtgaa ngttngagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
78 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 78 tgactgtgaa ngttccagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
79 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 79 tgactgtgaa cgtucgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
80 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 13 n = 5-bromouracilo
<400> 80 tgactgtgaa cgntcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
81 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400>
81
tgactgtgaa ngttcgtuat ga
22
<210> <211> <212> <213>
82 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<400> 82 tgactgtgaa ngttcggtat ga
22
<210> <211> <212> <213>
83 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 83 ctgtgaacgt tcgagatg
18
<210> <211> <212> <213>
84 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 84 tngtngtgaa cgttcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
85 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 85 tcgtngtgaa cgttcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
86 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 13 n = 4-tio-timina
<400> 86 tgactgtgaa cgntcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
87 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 12, 16 n = 6-tio-guanina
<400> 87 tgactgtgaa cnttcnagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
88 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 88 tgactgtgaa cgttcgtuat ga
22
<210> <211> <212> <213>
89 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 89 tgactgtgaa cgttcgttat ga
22
<210> <211> <212> <213>
90 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 90 tcgttcaacg ttcgttaacg ttcg
24
<210> <211> <212> <213>
91 24 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 91 tgattcaacg ttcgttaacg ttcg
24
<210> <211> <212> <213>
92 18 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 92 ctgtcaacgt tcgagatg
18
<210> <211> <212> <213>
93 20 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 93 tcgtcggaac gttcgagatg
20
<210> <211> <212> <213>
94 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 94 tcgtcggacg ttcgagatg
19
<210> <211> <212> <213>
95 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 95 tcgtcgtacg ttcgagatg
19
<210> <211> <212> <213>
96 19 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 96 tcgtcgttcg ttcgagatg
19
<210> <211> <212> <213>
97 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 97 tcgtgaacgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
98 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 98 tcgtcgaacg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
99 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2 n = 5-bromocitosina
<400> 99 tngtgaacgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
100 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 100 tngtngaacg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
101 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 101 tcgttaacgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
102 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
característica miscelánea (4)...(6) tcg puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n = cualquier nucleótido
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n's puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 10 n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación 13 n = t, g, o u
<400> 102 tcgtcgnnan cgntcg
16
<210> <211> <212> <213>
103 11 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 103 tcgaacgttc g
11
<210> <211> <212> <213>
104 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 104 tcgtcgaacg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
105 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 105 tcgtgaacgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
106 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 106 tcggtatcgg tcg
13
<210> <211> <212> <213>
107 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 107 tcggtaccgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
108 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 108 tcggaaccgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
109 12 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 109 tcggaacgtt cg
12
<210> <211> <212> <213>
110 15 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 110 tcgtcggaac gttcg
15
<210> <211> <212> <213>
111 12 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 111 tcgtaacgtt cg
12
<210> <211> <212> <213>
112 11 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 112 tcgaccgttc g
11
<210> <211> <212> <213>
113 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 113 tcgtcgaccg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
114 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 114 tcgttaacgt tcg
13
<210> <211> <212>
115 16 ADN
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 4-6 tng puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n = cualquier nucleótido
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n's puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación (10)...(10) n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación (13)...(13) n = t, g, o u
<400> 115 tngtngnnan cgntcg
16
<210> <211> <212> <213>
116 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2 n = 5-bromocitosina
<400> 116 tngtgaacgt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
117 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 117 tngtngtgaa cgttcg
16
<210> <211> <212>
118 11 ADN
<213>
Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2 n = 5-bromocitosina
<400> 118 tngaacgttc g
11
<210> <211> <212> <213>
119 11 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2 n = 5-bromocitosina
<400> 119 tngaccgttc g
11
<210> <211> <212> <213>
120 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 5 n = 5-bromocitosina
<400> 120 tngtngaccg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
121 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n = cualquier nucleótido
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n's puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 10 n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación 13 n = t, u, o g
<400> 121 tcgtngnnan cgntcg
16
<210> <211> <212> <213>
122 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 122 tcgtngtgaa cgttcg
16
<210> <211> <212> <213>
123 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 123 tcgtngaacg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
124 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<400> 124 tcgtngaccg ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
125 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
característica_miscelánea (4)...(6) tcg puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n = cualquier nucleótido
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n's puede estar o no presente
<221>
variación
<222> <223>
10 n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación 11 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación (13) ... (13) n = t, g, o u
<400> 125 tcgtcgnnan ngntcg
16
<210> <211> <212> <213>
126 13 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 8 n = 5-bromocitosina
<400> 126 tcggaaangt tcg
13
<210> <211> <212> <213>
127 11 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 6 n = 5-bromocitosina
<400> 127 tcgaangttc g
11
<210> <211> <212> <213>
128 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación (4)...(6) tng puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n = cualquier nucleótido
<221>
variación
<222> <223>
7,8 n's puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación (10)...(10) n = t, a, o c
<221> <222> <223>
variación (13)...(13) n = t, g, o u
<400> 128 tngtngnnan ngntcg
16
<210> <211> <212> <213>
129 11 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 6 n = 5-bromocitosina
<400> 129 tngaangutc g
11
<210> <211> <212> <213>
130 11 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 2, 6 n = 5-bromocitosina
<400> 130 tngaangttc g
11
<210> <211> <212> <213>
131 16 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n = cualquier nucleótido
<221> <222> <223>
variación 7, 8 n's puede estar o no presente
<221> <222> <223>
variación 10 n = t, a, c
<221>
variación
<222> <223>
11 n = 5-bromocitosina
<221> <222> <223>
variación (13)...(13) n = t, g, o u
<400> 131 tcgtngnnan ngntcg
16
<210> <211> <212> <213>
132 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5, 9 n = 5-bromocitosina
<400> 132 tcgtngaang utcg
14
<210> <211> <212> <213>
133 14 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<221> <222> <223>
variación 5, 9 n = 5-bromocitosina
<400> 133 tcgtngaang ttcg
14
<210> <211> <212> <213>
134 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 134 tgactgtgaa cgttcgagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
135 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<400> 135 tgactgtgaa ccttagagat ga
22
<210> <211> <212> <213>
136 22 ADN Secuencia Artificial
<220> <223>
Constructo sintético

<400> 136 tgactgtgaa ggttagagat ga 22
<210> 137
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<221> base modificada
<222> 1
<223> n = timina unida a un grupo de unión reactivo
<400> 137 ngactgtgaa ccttagagat ga 22
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<221> base modificada
<222> 1
<223> n = timina unida a un grupo de unión reactivo
<400> 138 ngactgtgaa ccttagagat ga 22
<210> 139
<211> 66
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 139 imagen3
<210> 140
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<221> base modificada
<222> 1
<223> n = timina unida a un grupo de unión reactivo
<400> 140 ngactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 141
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<221> base modificada
<222> 1
<223> n = timina unida a un grupo de unión reactivo
<400> 141 ngactgtgaa cgttcgagat ga 22
5

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un compuesto inmunomodulador quimérico (CIQ) que comprende tres o más restos de ácido nucleico y uno o más restos espaciadores distintos de ácido nucleico, en el que el CIQ comprende una estructura central con la fórmula:
    [Nv]x---Sp en la que Sp es un espaciador multivalente unido de manera covalente a X restos de ácido nucleico seleccionados independientemente, Nv, y en la que X es al menos 3, en el que dicho espaciador no es un polipéptido, en el que al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-TCG-3', en el que dicho CIQ tiene actividad inmunomoduladora.
  2. 2.
    El CIQ de la reivindicación 1, en el que el resto de ácido nucleico comprende la secuencia 5'-TCG-3' en la posición 5 prima.
  3. 3.
    El CIQ de la reivindicación 1 ó 2, en el que el CIQ tiene al menos una actividad inmunomoduladora seleccionada del grupo que consiste en:
    (a)
    la capacidad de estimular la producción de IFN-gamma por las células mononucleares de sangre periférica humana;
    (b)
    la capacidad de estimular la producción de IFN-alfa por las células mononucleares de sangre periférica humana;
    (c)
    la capacidad de estimular la proliferación de células B.
  4. 4.
    El CIQ de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el CIQ comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 extremos 5' libres, al menos alrededor de 50 o al menos alrededor de 100 extremos 5' libres.
  5. 5.
    El CIQ de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que X es de 3 a alrededor de 50, o en el que X es de alrededor de 50 a alrededor de 500.
  6. 6.
    El CIQ de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Sp comprende un dendrímero, un polisacárido, un polisacárido reticulado, glicerol, o pentaeritritol.
  7. 7.
    El CIQ de cualquier reivindicación previa que comprende un resto espaciador no nucleotídico que comprende oligoetilen glicol, glicerol, un alquilo C2-C10, un nucleótido abásico, pentaeritritol, 1,3-diamino-2-propanol, 2(hidroximetil)etilo, un polisacárido, o un dendrímero y/o en el que el espaciador no nucleotídico comprende una subunidad HEG.
  8. 8.
    El CIQ de la reivindicación 1, que comprende una primera subunidad espaciadora que comprende un dendrímero, un polisacárido, glicerol, pentaeritritol, o 2-(hidroximetil) etilo y que comprende además al menos una subunidad HEG, en la que dicha subunidad HEG está unida de manera covalente a la primera subunidad espaciadora y a un resto de ácido nucleico.
  9. 9.
    El CIQ de cualquier reivindicación previa, en el que: al menos un resto de ácido nucleico comprende la secuencia: 5'-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3' en la que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente;
    o 5'-TCG[(X)2-4]-3' en la que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente;
    o 5'-TCGA-3';
    o al menos un resto de ácido nucleico tiene la secuencia 5'-TCG[(X)2-4]-3'o 5'-TCG(A/T)[(X)1-3]-3' en la que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente;
    o al menos un resto de ácido nucleico tiene la secuencia 5'-TCGACGT-3' o 5'-TCGTCGA-3';
    o todos los restos de ácido nucleico del CIC tienen una secuencia de fórmula 5'-TCG[(X)2-4]-3' o TCG(A/T)[(X)1-3]-3' en la que cada X es un nucleótido seleccionado independientemente; o
    un resto de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de (todos 5'→3'):
    TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, TGTCGTT, TCGXXX, TCGAXX, GTCGTT, GACGTT, ATCGAT, TCGTCG; TCGTTT; TCGAGA; TTCGAG; TTCGTT; AACGTT; AACGTTCG; AACGUTCG, ABGUTCG, TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, TCGTC; TCGA, TCGT, y TCGX (en las que X es A, T, G o C; U es 2'-desoxiuridina y B es 5-bromo-2'desoxicitidina).
  10. 10.
    El CIQ de cualquier reivindicación previa, en el que las uniones entre los nucleótidos de los restos de ácido nucleico se seleccionan de uniones fosfodiéster y uniones de éster de fosforotioato, y/o las uniones entre los nucleótidos de los restos de ácido nucleico, los restos de ácido nucleico y restos espaciadores, y entre subunidades de restos espaciadores son fosfodiéster y/o éster de fosforotioato.
  11. 11.
    Un CIQ según la reivindicación 1, en el que el CIQ tiene la estructura (TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-glicerol-TCGTCGA.
  12. 12.
    Una composición que comprende un CIQ según cualquier reivindicación precedente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  13. 13.
    Una composición que comprende un CIQ según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un antígeno.
  14. 14.
    Una composición según la reivindicación 13, en la que el antígeno es de un agente infeccioso, un alérgeno, o es un antígeno tumoral.
  15. 15.
    Una composición según la reivindicación 13 ó 14, en la que el CIQ y el antígeno están en proximidad espacial mediante conjugación, encapsulación, por medio de la fijación a una plataforma o adsorción sobre una superficie, o en la que el CIQ y el antígeno están en una mezcla.
  16. 16.
    Un CIQ de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición de las reivindicaciones 12 a 15 para el uso en la modulación de una respuesta inmunitaria en un individuo.
  17. 17.
    Un CIQ de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición de las reivindicaciones 12 a 15 para el uso para incrementar el interferón-gamma (IFN-γ) en un individuo; incrementar el interferón-alfa (IFN-α) en un individuo; incrementar los anticuerpos asociados a Th1 específicos de el/los antígeno(s) de la vacuna, mejorar un síntoma de una enfermedad infecciosa en un individuo; mejorar un trastorno relacionado con IgE en un individuo; o tratar el cáncer.
  18. 18.
    Un CIQ de las reivindicaciones 1 a 11 o una composición según las reivindicaciones 12 a 15 para el uso como una composición de vacuna en el tratamiento o la profilaxis de la alergia, una enfermedad infecciosa o el cáncer.
    imagen1
    1',2'-didesoxirribosa
    FIGURA 1
    imagen2
    DMT = 4,4'-dimetoxitritiloLev = Levulinilo
    FIGURA 2
    imagen3
    FIGURA 3A
    imagen4
    imagen5
    FIGURA 4
    Inducción de Genes en Pulmón de Ratón medianteISS P-6, CIQ C-9 o CIQ C-23
    imagen6
    Inducción Respecto del Control, DON (P-7)
    FIGURA 5
    Citocinas In vivo de RatónIL-12 p40
    imagen7
    Todas las dosis de ISS/CIQ 20 μg
    FIGURA 6A
    Citocinas In vivo de Ratón
    FIGURA 6B
    TNFα
    imagen8
    imagen9
    Citocinas In vivo de RatónIL-6
    FIGURA 6C
    Todas las dosis de ISS/CIQ 20 μg
    imagen10
    Figura 7A
    imagen11
    Figura 7B
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