KR20040018286A - 키메라 면역조절 화합물 및 그것들의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역조절 화합물 및 이 면역조절 화합물을 사용하여 개체에서 면역조절을 하는 방법을 제공한다.

Description

키메라 면역조절 화합물 및 그것들의 사용 방법{CHIMERIC IMMUNOMODULATORY COMPOUNDS AND METHODS OF USING THE SAME}
이 섹션에서 공보에 대한 언급이 본 발명의 선행기술이라는 표시로 해석되어서는 안된다.
감염 또는 다른 항원 콜라겐에 의해 발생되는 면역반응의 종류는 일반적으로 그 반응에 연루된 T 헬퍼(Th) 세포의 서브셋에 의해 구별될 수 있다. Th1 서브셋은 지연-형 과민 및 세포독성 T 림프구(CTL) 활성화와 같은 고전적인 세포-매개 기능을 초래하는 반면, Th2 서브셋은 B-세포 활성화를 위한 헬퍼로서 더 효과적으로 기능한다. 항원에 대한 면역반응의 종류는 일반적으로 항원에 대해 반응하는 세포에 의해 야기된 사이토카인에 의해 영향 받는다. Th1 및 Th2 세포에 의해 분비된 사이토카이들의 차이점들은 이들 두 서브셋의 상이한 생물학적 기능을 반영하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, Romagnani(2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18 참조.
Th1 서브셋은 CTL을 활성화시키는 IL-2와 IFN-γ를 분비하기 때문에 특히 바이러스 감염, 세포내 병원체, 및 종양 세포에 반응하도록 적합해질 수 있다. IL-4 및 IL-5가 IgE 생성 및 호산구 활성화를 각각 유도한다고 알려져 있으므로, Th2 서브셋은 자유-생활 박테리아 및 기생충에 반응하도록 더 적합해질 수 있으며, 알레르기 반응을 매개할 수 있다. 일반적으로, Th1 및 Th2 세포는 서로 다른 패턴의 사이토카인들을 분비하며, 그로써 한 종류의 반응이 나머지 종류의 반응의 활성을 조절할 수 있다. Th1/Th2 균형의 이동은, 예를 들어 항원반응을 가져오거나, 또는 달리 증가된 CTL 반응을 가져올 수 있다.
Th1-형 면역반응이 어떤 면역조절 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해 포유류에서 유도될 수 있다는 것이 때로 인정되었다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 면역자극 서열("ISS")로서 언급된 서열들을 포함하며, 주로 CG 디뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, PCT 공보 WO 98/55495, WO 97/28259, 미국특허 번호 6,194,388 및 6,207,646; 및 Krieg 등(1995) Nature 374:546-49 참조. 결핵 및 말라리아와 같은 많은 감염성 질환에 대해서, Th2-형 반응은 감염에 대한 보호값을 거의 갖지 않는다. 전형적으로 단백질-기제 백신은 항체중화에 대한 역가는 높지만 유의한 세포-매개 면역성은 없는 것을 특징으로 하는 Th2-형 면역반응을 유도한다. 더욱이, 어떤 종류의 항체반응은 어떤 징후들에서, 가장 두드러지게는 IgE 항체반응이 아나필락시스 쇼크를 가져올 수 있는 알레르기에서 부적합할 수 있다.
개선된 면역치료법에 대한 필요성의 관점에서, 면역반응의 조절에 유용한 화합물을 확인할 필요성이 존재한다.
발명의 개시
한 양태로서, 본 발명은 면역조절 활성을 갖는 키메라 화합물에 관한 것이다. 키메라 면역조절 화합물("CIC")은 일반적으로 1개 이상의 핵산 부분 및 1개 이상의 비-핵산 부분을 포함한다. 1개 이상의 핵산 부분을 갖는 CIC의 핵산 부분들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, CIC는 2개 이상의 핵산 부분 및 1개 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 포함하며, 여기서 적어도 1개의 비-핵산 스페이서 부분이 2개의 핵산 부분에 공유결합된다. 한 구체예에서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-CG-3'을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-TCG-3'을 포함한다.
한 양태로서, 본 발명은 식 "N1-S1-N2"의 코어 구조를 갖는 키메라 면역조절 화합물을 제공하며, 여기서 N1및 N2는 핵산 부분이고, S1은 비-핵산 스페이서 부분이며, CIC는 면역조절 활성을 나타낸다. 한 구체예에서, 코어 구조는 "N1-S1-N2-S2-N3"이며, 여기서 N3은 핵산 부분이고, S2는 비-핵산 스페이서 부분이다. 한 구체예에서, CIC는 코어 구조 "N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A"를 가지며, 여기서 A는 1에서 100 사이의 정수이고, [Nv-Sv]A는 비-핵산 스페이서 부분에 콘쥬게이트된 핵산 부분의 A개의 추가 반복을 나타내며, S 및 N은 "[Nv-Sv]"의 각 반복에서 독립적으로 선택된다. 한 구체예에서, A는 적어도 2이며, CIC에서 적어도 4개 핵산 부분은 상이한 서열을 가진다.
한 양태로서, CIC는 식 NS1-N2또는 N1-S1-N2-S2-N3(여기서, N1, N2, 및 N3은 핵산 부분이고, S1및 S2는 비-핵산 스페이서 부분이며, S1과 S2는 정확히 2개 핵산 부분에 공유결합된다)를 갖는 코어 구조를 포함한다. 그러한 CIC의 예들은 식 (5'-N1-3')-S1-N2의 코어 구조를 갖는 CIC들이다. 한 구체예에서, N1은 서열 5'-TCGAX-3'을 가지며, 여기서 X는 0 내지 20 뉴클레오티드 염기(SEQ ID NO:1)이다. 한 구체예에서, X는 0 내지 3 뉴클레오티드 염기이다. 한 구체예에서, X는 CGT이다. 다른 구체예에서, N1은 서열 5'-TCGTCGA-3'를 가진다. 한 구체예에서, CIC는 구조 N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A(여기서, A는 1에서 100 사이의 정수이고, [Nv-Sv]A는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분에 콘쥬게이트된 핵산 부분의 "A"개의 추가 반복을 나타내며, S 및 N은 [Nv-Sv]의 각 반복에서 독립적으로 선택된다)를 가진다. 한 구체예에서, A는 1 내지 3이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 식 [Nv]A---Sp의 코어 구조를 가지며, 여기서 Sp는 A개의 독립적으로 선택된 핵산 부분 Nv에 공유결합된 다가 스페이서이고, A는 적어도 3이며, CIC는 면역조절 활성을 나타낸다. 한 구체예에서, CIC는 코어 서열 [Sv-Nv]A---Sp를 가지며, 여기서 SP는 "A"개의 독립적으로 선택된 요소 [Sv-Nv]에 공유결합된 다가 스페이서이고, 독립적으로 선택된 요소 [Sv-Nv]는 핵산 부분에 공유결합된 스페이서 부분이며, A는 적어도 3이다. 한 구체예에서, A는 3 내지 50이다. 다른 구체예에서, A는 50 이상이다. 한 구체예에서, CIC의 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 핵산 부분들은 상이한 서열을 가진다.
한 양태로서, CIC는 식 [Nv]A-Sp또는 [Sv-Nv]A-Sp(여기서, Sp는 "A"개의 독립적으로 선택된 핵산 부분 Nv또는 독립적으로 선택된 요소 [Sv-Nv]에 공유결합된 다가 스페이서이고, 독립적으로 선택된 각 요소 [Sv-Nv]는 핵산 부분에 공유결합된 스페이서 부분을 포함하며, A는 적어도 3이다)을 갖는 코어 구조를 포함한다. 구체예에서, A는 3 내지 약 50이거나 또는 약 50 내지 약 500이다. 한 구체예에서, Sp는 덴드리머(dendrimer)를 포함한다. 한 구체예에서, CIC의 핵산 부분은 TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, TGTCGTT, TCGXXX, TCGAXX, TCGTCG, AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, GACGTT, TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, TCGTC, TCGA, TCGT, TCGX, 또는 TCG(여기서, "X"는 어떤 뉴클레오티드이다)로부터 선택된 서열을 가진다.
다른 구체예에서, 본 발명은 식 "N1-S1"의 코어 구조를 갖는 CIC를 제공하며, 여기서 N1은 핵산 부분이고, S1은 비-핵산 스페이서 부분이며, CIC는 면역조절 활성을 나타낸다.
CIC는, 예를 들어 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 연결 올리고에틸렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체, C2-C10알킬(예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실), 글리세롤 또는 변형 글리세롤(예를 들어, 1, 2 또는 3 히드록시-위치에서 유도된 글리세롤; 예를 들어 3-레불리닐-글리세롤), 펜타에리트리톨 또는 변형 펜타에리트리톨(어떤 히드록시 위치(들)에서 변형된 펜타에리트리톨, 예를 들어 "트레블러"), 2-(히드록시메틸)에틸, 1,3-디아미노-2-프로판올, 무염기성(abasic) 뉴클레오티드, 다당류(예를 들어, 교차연결 다당류), 덴드리머, 및/또는 다양한 조합의 본원에 개시된 다른 스페이서 부분 성분들을 포함하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함할 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 설명된 CIC는 다음 특징들 중 하나 이상을 가진다: (i) CIC는 8 뉴클레오티드(또는 염기쌍) 길이 미만, 또는 달리 7 뉴클레오티드 길이 미만의 적어도 1개의 핵산 부분을 포함한다, (ii) CIC의 모든 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 길이 미만, 또는 달리 7 뉴클레오티드 길이 미만이다, (iii) CIC는 서열 5'-CG-3'(예를 들어, 5'-TCG-3')을 포함하는 적어도 1개의 핵산 부분을 포함한다, (iv) CIC는 상이한 서열들을 갖는 적어도 2개의 핵산 부분을 포함한다, (v) CIC의 모든 핵산 부분은 동일한 서열을 가진다, (vi) CIC는 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, 프로필, 부틸, 헥실, 글리세롤 또는 변형 글리세롤(예를 들어, 1, 2 또는 3 히드록시-위치에 유도된 글리세롤; 예를 들어 3-레불리닐-글리세롤), 펜타에리트리톨 또는 변형 펜타에리트리톨(어떤 히드록시 위치(들)에서 변형된 펜타에리트리톨, 예를 들어 "트레블러"), 2-(히드록시메틸)에틸, 1,3-디아미노-2-프로판올, 무염기성 뉴클레오티드, 다당류(예를 들어, 교차연결 다당류), 또는 덴드리머이거나 또는 이들을 포함하는 적어도 1개의 비-핵산 스페이서 부분을 포함한다. 어떤 구체예에서, 스페이서 부분은 폴리펩티드가 아니다.
다양한 구체예에서, 본원에 설명된 CIC는 다음 특징들 중 하나 이상을 가진다: (vii) CIC는 "분리된 면역조절 활성"을 갖지 않는 CIC의 적어도 1개의 핵산 부분을 포함한다, (viii) CIC는 "분리된 면역조절 활성"을 갖는 어떤 핵산 부분을 포함하지 않는다, (ix) CIC는 "열등한 분리된 면역학적 활성"을 갖는 CIC의 적어도 1개의 핵산 부분을 포함한다. "분리된 면역조절 활성" 및 "열등한 분리된 면역학적 활성"이 본원에서 설명된다. 다양한 구체예에서, 본원에 설명된 CIC는 이중가닥 또는 부분 이중가닥인 적어도 1개의 핵산 부분을 포함한다. CIC는 자기-상보성 핵산 부분으로 디자인되어 듀플렉스를 형성할 수 있다. 예를 들어, C-84, C-85, 및 C-87 참조.
따라서, 다양한 양태로서, 본 발명은 2개 이상의 핵산 부분 및 1개 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 포함하는 CIC를 제공하며, 여기서 적어도 1개의 스페이서 부분은 2개의 핵산 부분에 공유결합되고, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-CG-3'을 포함하며, 상기 CIC는 면역조절 활성을 나타낸다. CIC는 적어도 3개의 핵산 부분을 포함하며, 여기서 각 핵산 부분은 적어도 1개의 비-핵산 스페이서 부분에 공유결합된다. CIC는 (a) 사람 말초혈 단핵세포에 의한 IFN-γ 생성을 자극하는 능력; (b) 사람 말초혈 단핵세포에 의한 IFN-α 생성을 자극하는 능력; 및/또는 (c) 사람 B 세포의 증식을 자극하는 능력과 같은 적어도 하나의 면역조절 활성을 가질 수 있다.
CIC의 1개 이상의 핵산 부분은 5'-TCGA-3', 5'-TCGACGT-3', 5'-TCGTCGA-3' 및 5'-ACGTTCG-3'과 같은 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, CIC의 1개 이상의 핵산 부분은 서열 5'-X1X2CGX3X4-3'(여기서, X1은 0 내지 10 뉴클레오티드이고; X2는 부재하거나 또는 A, T 또는 U이고; X3은 부재하거나 또는 A이고; X4는 0 내지 10 뉴클레오티드이며, 핵산 부분은, 예를 들어 3' 단부에서 스페이스 부분에 콘쥬게이트된다)을 가질 수 있다. 한 구체예에서, X1, X2, X3, 및 X4에서 뉴클레오티드들의 합은 8 미만, 7 미만, 6 미만, 5 미만 또는 4 미만일 수 있다. 어떤 구체예에서, CIC의 1개 이상의 핵산 부분은 TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, TGTCGTT, TCGXXX, TCGAXX, TCGTCG, AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, GACGTT, TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, TCGTC, TCGA, TCGT, TCGX, 또는 TCG(여기서, "X"는 어떤 뉴클레오티드이다)와 같은 핵산 서열을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 1개 이상의 핵산 부분은 3 내지 7 염기를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 3 내지 7 염기를 포함하며, 서열 5'-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3' 또는 5'-TCG[(X)2-4]-3' 또는 5'-TCG(A/T)[(X)1-3]-3' 또는 5'-TCG(A/T)CG(A/T)-3' 또는 5'-TCGACGT-3' 또는 5'-TCGTCGA-3'를 가지고, 여기서 X는 독립적으로 선택된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, CIC는 상기 설명된 서열을 갖는 적어도 3, 적어도 10, 적어도 30 또는 적어도 100 핵산 부분을 함유한다.
CIC는 8 뉴클레오티드 길이 미만인 적어도 1개의 핵산 부분을 포함할 수 있다. 선택적으로 CIC의 모든 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 미만이다. 어떤 구체예에서, 서열 5'-CG-3'을 포함하는 CIC의 모든 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 길이 미만이다. CIC는 상이한 서열들을 갖는 적어도 2개의 핵산 부분을 포함할 수 있다. CIC는 서열 5'-CG-3'을 포함하지 않는 적어도 1개의 핵산 부분을 함유할 수 있다. CIC는 분리된 면역학적 활성을 갖지 않거나 또는 열등한 분리된 면역학적 활성을 갖는 적어도 1개의 핵산 부분을 포함할 수 있다. 선택적으로 CIC의 어떤 핵산 부분도 분리된 면역조절 활성을 갖지 않는다. 핵산 부분의 뉴클레오티드들의 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 에스테르, 포스포로디티오에이트 에스테르, 다른 공유결합, 및 그들의 혼합체를 포함할 수 있다. 유사하게, 핵산 부분과 스페이서 부분 사이의 결합 또는 스페이서 부분의 성분들 사이의 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 에스테르, 포스포로디티오에이트 에스테르, 다른 결합, 및 그들의 혼합체를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, CIC는 반응성 연결기(예를 들어, 반응성 티오기)를 포함한다. CIC는 폴리펩티드, 예를 들어 폴리펩티드 항원에 연결되거나 또는 비공유적으로 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 항원 및/또는 양이온계 마이크로캐리어(락트산과 글리콜산의 중합체와 같은)와 함께 CIC를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 본질적으로 내독소를 함유하지 않는다.
한 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 CIC 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 항원(예를 들어, 그에 대한 면역반응이 바람직한 항원), 또는 이 둘을 모두 함유하는 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 조성물은 GMP 표준에 따라 조제된다. 한 구체예에서, 조성물은 내독소의 존재에 대해 조성물을 분석하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된다. 한 구체예에서, 조성물은 본질적으로 내독소를 함유하지 않는다. 한 구체예에서, 조성물은 리포솜을 함유하지 않는다.
한 양태로서, 본 발명은 의약의 제조에 대해 본원에 설명된 바에 따른 CIC의 사용을 제공한다.
한 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 키메라 면역조절 화합물 또는 조성물을 개체에서 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 투여함에 의한, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 개체는 Th2-형 면역반응에 관련된 장애, 예를 들어 알레르기 또는 알레르기-유발 천식으로 고통받는다. 한 구체예에서, 개체는 감염성 질환을 가진다.
한 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 CIC 또는 조성물을 개체에서 IFN-γ를 증가시키기에 충분한 양으로 투여함에 의한, 개체에서 인터페론-감마(IFN-γ)를증가시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 개체는 염증성 장애를 가진다. 한 구체예에서, 개체는 특발성 폐섬유증을 가진다.
한 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 CIC 또는 조성물을 개체에서 IFN-α를 증가시키기에 충분한 양으로 투여함에 의한, 개체에서 인터페론-알파(IFN-α)를 증가시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 개체는 바이러스 감염을 가진다.
한 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 CIC 또는 조성물의 유효량을 개체에게 투여함에 의한, 개체에서 감염성 질환의 증상을 개선하는 방법을 제공하며, 여기서 유효량은 감염성 질환의 증상을 개선하기에 충분한 양이다.
한 양태로서, 본 발명은 본원에 설명된 CIC 또는 조성물의 유효량을 IgE-관련 장애를 갖는 개체에게 투여함에 의한, 개체에서 IgE-관련 장애를 개선하는 방법을 제공하며, 여기서 유효량은 IgE-관련 장애의 증상을 개선하기에 충분한 양이다. 한 구체예에서, IgE-관련 장애는 알레르기 또는 알레르기-관련 장애이다.
본 발명은 개체에게 상기 개체에서 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 CIC를 투여함에 의한, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 구체예에서, 개체는 암을 가지거나 및/또는 Th2-형 면역반응에 관련된 장애(예를 들어, 알레르기 또는 알레르기-유발 천식)으로 고통받거나 및/또는 감염성 질환을 가진다.
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2001년 6월 21일자 제출된 가특허출원번호 60/299,883 및 2002년 4월 23일자 제출된 가특허출원번호 60/375,253의 이득을 주장하며, 이들의 전체 내용은 모든 목적을 위한 참조로 본원에 수록된다.
기술분야
본원 발명은 핵산 및 비핵산 부분들을 함유하는 키메라 면역조절 화합물(ch-imeric immunomodulatory compound: "CIC"), 및 면역반응을 조절하기 위한 그러한 화합물의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 생물의학 및 면역학의 분야에서 사용된다.
도 1은 CIC의 비-핵산 스페이서 부분의 합성에 유용한 어떤 시약의 구조를 나타낸다. 나타낸 것은 HEG, 프로필, TEG, HMH, 부틸, 및 무염기성 스페이서 부분을 위한 디메톡시트리틸-보호 포스포라미다이트 부분 전구체이다.
도 2는 CIC의 대칭 또는 비대칭 비-핵산 스페이서 부분의 합성에 유용한 어떤 시약의 구조를 나타낸다. 나타낸 것은 글리세롤[2]("대칭 분기"), 레불리닐-글리세롤[3]("비대칭 분기"), "트레블러"[9] 및 "대칭 더블러"[10]를 위한 디메톡시트리틸-보호 포스포라미다이트 스페이서 부분이다.
도 3A 및 3B는 분기 CIC의 합성을 그림으로 나타낸 것이다.
도 4는 C-105의 합성 스킴을 나타낸다.
도 5는 CIC로 비강내 치료한 후의 마우스 폐에서 면역-관련 유전자의 유도를 나타낸다.
도 6A-C는 IL-12 p40(도 6A), IL-6(도 6B), 및 TNF-알파(도 6C)의 수준에 대한 CIC의 효과를 나타낸다.
도 7A-B는 C-8(도 7A) 및 C-101(도 7B)의 구조를 나타낸다.
본 발명을 수행하는 방식
I.일반적 방법
본 발명의 실시에는 다른 지시가 없다면 분자생물학(재조합 기술을 포함하는), 미생물학, 세포생물학, 생화학, 핵산화학, 및 면역학의 종래 기술을 사용할 것이며 이들은 본 분야의 기술 범위이다. 그러한 기술은 다음과 같은 문헌들에 충분히 설명된다:
II.정의
본원에 사용된 단수형 "한" 및 "그"는 달리 나타내지 않거나 내용으로부터 분명하다면 복수를 표시하기도 한다. 예를 들어, 내용으로부터 명백한 대로, "한" 키메라 면역조절 분자("CIC")는 1개 이상의 CIC들을 포함한다. 유사하게, CIC의 성분 요소의 단수형 표시도 다수 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, CIC에 있는 "핵산 부분"의 설명은 또한 CIC에 있는 2개 이상의 "핵산 부분"을 설명할 수 있다.
본원에서 상호교환하여 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 단일가닥 DNA(ssDNA), 이중가닥 DNA(dsDNA), 단일가닥 RNA(ssRNA) 및 이중가닥 RNA(dsRNA), 변형 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드, 또는 그들의 조합을 포함한다. 핵산은 선형으로 또는 원형으로 배열될 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드는 선형 및 원형 세그먼트를 모두 함유할 수 있다. 핵산은, 예를 들어 포스포로티오에이트 에스테르와 같은 포스포디에스테르 결합 또는 다른 결합을 통해 연결된 뉴클레오시드들의 중합체이다. 뉴클레오시드는 당에 결합된 푸린(아데닌(A) 또는 구아닌(G), 또는 그들의 유도체) 또는 피리미딘(티미딘(T), 시토신(C) 또는 우라실(U), 또는 그들의 유도체) 염기로 구성된다. DNA에 있는 4개의 뉴클레오티드 유닛(또는 염기)는 디옥시아데노신, 디옥시구아노신, 디옥시티미딘, 및 디옥시시티딘이라 명명된다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이다.
용어 "3'"은 일반적으로 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 또 다른 영역 또는 위치에서부터 동일한 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 3'(하류)의 영역 또는 위치로 간주한다.
용어 "5'"는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 또 다른 영역 또는 위치에서부터 동일한 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 5'(상류)의 영역 또는 위치로 간주한다.
요소, 예를 들어 영역, 일부, 비-핵산 스페이서 부분, 핵산 부분, 또는 서열은, 그것이 다른 영역, 일부, 스페이서 또는 서열에 직접 접해있을 때, 다른 요소, 예를 들어 영역, 일부, 비-핵산 스페이서 부분, 핵산 부분, 또는 서열에 "인접"해있다.
용어 "CIC-항원 콘쥬게이트"는 CIC와 항원이 연결되어 있는 복합체로 간주한다. 그러한 콘쥬게이트 결합은 공유 및/또는 비-공유 결합을 포함한다.
용어 "항원"은 항체 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되어 결합되는 물질을 의미한다. 항원은 펩티드, 단백질, 당단백질, 다당류, 복합 탄수화물, 당, 강글리오시드, 지질 및 인지질; 그들의 일부들 및 그들의 조합을 포함할 수 있다. 항원은 자연에서 발견된 것들일 수 있거나 또는 합성될 수 있다. CIC와 함께 투여하는데 적합한 항원은 B 세포 또는 T 세포 항원-특이적 반응을 도출할 수 있는 어떤 분자를 포함한다. 바람직하게, 항원은 항원에 대한 특이적 항체반응을 도출한다. 합텐이 "항원"의 범위 내에 포함된다. 합텐은 그 자체로는 면역원성이 아니지만 항원 결정인자를 함유하는 면역원성 분자와 콘쥬게이트되었을 때는 면역원성으로 되는 저분자량 화합물이다. 소분자는 항원으로 되기 위해 헵텐화될 필요가 있을 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항원은 펩티드, 지질(예를 들어, 스테롤, 지방산, 및 인지질), 헤모필루스 인플루엔자 백신에 사용된 것들과 같은 다당류, 강글리오시드 및 당단백질을 포함한다.
"애쥬번트"는 항원과 같은 면역원성 제제에 첨가되었을 때, 이 혼합물에의 노출시 수용자 숙주에서 그 제제에 대한 면역반응을 비특이적으로 증진 또는 증강시키는 물질로 간주한다.
용어 "펩티드"는 생물학적 반응, 예를 들어 항체 생성 또는 사이토카인 활성을 달성하는데 충분한 길이 및 조성을 갖는 폴리펩티드이며, 이 펩티드는 헵텐일수도 있고 아닐 수도 있다. 전형적으로, 펩티드는 적어도 6개 아미노산 잔기 길이이다. 용어 "펩티드"는 변형 아미노산(자연발생일 수도 있고 비-자연발생일 수도 있음)을 더 포함하며, 제한은 없으나 그러한 변형은 인산화, 당화, 페길화, 지질화 및 메틸화를 포함한다.
"항원 펩티드"는 정제된 자생 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 펩티드, 가공하지 않은 펩티드 추출물, 또는 부분 정제되거나 또는 정제되지 않은 활성 상태(약화되거나 또는 비활성화된 바이러스, 세포, 미생물의 일부분인 펩티드와 같은), 또는 그러한 펩티드의 단편들을 포함할 수 있다. 따라서, "항원 펩티드" 또는 "항원 폴리펩티드"는 하나 이상의 항원성을 나타내는 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 의미한다. 따라서, 예를 들어 "Amb a 1 항원 폴리펩티드" 또는 "Amb a 1 폴리펩티드 항원"은 Amb a 1으로부터의 아미노산 서열이며, 항원성을 나타내는(즉, 항체 또는 T 세포 수용체와 특이적으로 결합하는) 전체 서열일 수도, 서열의 일부일 수도, 및/또는 서열의 변형일 수도 있다.
"송달 분자" 또는 "송달 비히클"은 특정한 부위로 및/또는 특정한 타이밍에 관련하여 CIC, CIC-항원 혼합체, 또는 CIC-항원 콘쥬게이트의 송달을 용이하게 하고, 허가하며, 및/또는 증진시키는 화학적 부분이다. 송달 비히클은 추가적으로 면역반응을 자극하거나 또는 그렇지 않을 수도 있다.
"항원에 대한 알레르기 반응"은 호산구(통상적으로 폐에서) 및/또는 항원-특이적 IgE의 발생과 그들의 결과로서 생기는 효과를 일반적인 특징으로 하는 면역반응을 의미한다. 본 분야에 잘 공지된 대로, IgE는 비만세포 및 호염기구 상에서IgE 수용체와 결합한다. 이후 IgE에 의해 인식된 항원에의 노출시 항원은 비만세포 및 호염기구 상에서 IgE를 교차연결하여 이들 세포의 탈과립화를 일으켜서 히스타민을 방출한다(이것에 제한되는 것은 아니다). 용어 "항원에 대한 알레르기 반응", "알레르기" 및 "알레르기 상태"는 본 발명의 방법들 중 일부의 적용에 동등하게 적합한 것으로 이해되며 그렇게 의도된다. 더 이상으로, 본 발명의 방법은 알레르기 반응의 예방 뿐만 아니라 이미 존재하고 있는 알레르기 상태를 치료하는데도 동등하게 적합하다고 이해되며 그렇게 의도된다.
본원에 사용된 용어 "알레르겐"은 분자의 항원 또는 항원 부분, 통상적으로 단백질을 의미함, 이것은 피험자에의 노출시 알레르기 반응을 도출한다. 전형적으로 피험자는, 예를 들어 두드러기 및 발적 시험 또는 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해 나타나는 대로 알레르겐에 대해 알레르기성이다. 심지어 단지 피험자들 중의 적은 서브셋만이 분자에의 노출시 알레르기(예를 들어, IgE) 면역반응을 나타내는 경우에도 이 분자는 알레르겐이라고 한다. 많은 분리된 알레르겐이 본 분야에 공지되어 있다. 이들은 제한은 없으나 본원의 표 1에서 제공된 것들을 포함한다.
용어 "탈민감"은 피험자가 민감성을 나타냈던 알레르겐의 분량을 증가시켜 투여하는 과정으로 간주한다. 탈민감에 사용된 알레르기항원 분량의 예들은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127를 참조한다.
"항원-특이적 면역치료법"은 항원을 수반하며 면역반응의 항원-특이적 조절을 발생시키는 어떤 형태의 면역치료법으로 간주한다. 알레르기에 관해서, 항원-특이적 면역치료법은 제한은 없으나 탈민감 치료법을 포함한다.
용어 "마이크로캐리어"는 물에서 불용성이며 약 150, 120 또는 100㎛ 미만, 더 통상적으로 약 50-60㎛ 미만, 그리고 약 10㎛ 미만 또는 심지어 약 5㎛ 미만일 수 있는 크기를 갖는 미립자 조성물로 간주한다. 마이크로캐리어는 "나노캐리어"를 포함하는데, 이것은 약 1㎛ 미만, 바람직하게는 약 500nm 미만의 크기를 갖는 마이크로캐리어이다. 마이크로캐리어는 생체적합성 자연발생 중합체, 합성 중합체 또는 합성 공중합체로부터 형성된 입자들과 같은 고상 입자들을 포함하지만, 그럼에도 불구하고, 아가로스 또는 교차연결 아가로스로부터 형성된 마이크로캐리어는 본원에서의 마이크로캐리어의 정의 뿐만 아니라 본 분야에 공지된 다른 생분해성 물질에 포함되거나 또는 그로부터 배제될 수 있다. 고상 마이크로캐리어는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 실리카, 세라믹, 폴리아크릴아미드, 금, 라텍스, 히드록시아파타이트, 및 페로마그네틱 및 파라마그네틱 물질과 같은, 포유류의 생리학적 조건하에서 비-침식성 및/또는 비-분해성인 중합체 또는 다른 물질로부터 형성된다. 생분해성 고상 마이크로캐리어는, 포유류의 생리학적 조건하에서 분해될 수 있거나(예를 들어, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)와 같은 그들의 공중합체) 또는 침식될 수 있는(예를 들어, 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(DETOSU)과 같은 폴리(오르토에스테르) 또는 세박산의 폴리(무수물)과 같은 폴리(무수물))로부터 형성될 수 있다. 또한, 마이크로캐리어는 리포솜, 항원 없는 이즈컴(면역-자극 복합체, 이것은 콜레스테롤, 인지질 및 애쥬번트-활성 사포닌의 안정한 복합체이다), 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼에서 발견된 작은 방울 또는 미셀과 같은 액상(예를 들어, 오일 또는 지질 기제)일 수 있다. 생분해성 액상 마이크로캐리어는 전형적으로, 스쿠알렌 및 식물성 오일을 포함하여 본 분야에 많이 공지되어 있는 생분해성 오일과 결합한다. 마이크로캐리어는 전형적으로 구형 모양이지만, 구형 모양에서 벗어난 마이크로캐리어도 허용된다(예를 들어, 타원체, 막대 모양 등). 그들의 불용성으로 인해, 고상 마이크로캐리어는 물 및 수-기제(수성) 용액으로부터 여과될 수 있다(예를 들어, 0.2 마이크론 필터를 사용하여).
본원에 사용된 용어 "비-생분해성"은 정상적인 포유류 생리학적 조건하에서 분해되거나 또는 침식되지 않는 마이크로캐리어로 간주한다. 일반적으로, 마이크로캐리어는 37℃의 정상 사람 혈청에서 72시간 인큐베이션한 후에 분해되지 않는다면(즉, 그것의 질량 또는 평균 중합체 길이의 5% 미만의 손실) 비-생분해성인 것으로 여긴다.
마이크로캐리어는 정상적인 포유류 생리학적 조건하에서 분해되거나 또는 침식될 수 있다면 "생분해성"으로 여긴다. 일반적으로, 마이크로캐리어는 37℃의 정상 사람 혈청에서 72시간 인큐베이션한 후에 분해된다면(즉, 그것의 질량 또는 평균 중합체 길이의 적어도 5%의 손실) 생분해성인 것으로 여긴다.
용어 "CIC/마이크로캐리어 복합체" 또는 "CIC/MC 복합체"는 CIC와 마이크로캐리어의 복합체로 간주한다. 이 복합체의 성분들은 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유결합은 소수성 상호작용, 이온(정전기)결합, 수소결합및/또는 반데르발스 인력을 포함하는 어떤 비-공유결합력에 의해 매개될 수 있다. 소수성 결합의 경우, 결합은 일반적으로 CIC에 공유연결된 소수성 부분(예를 들어, 콜레스테롤)에 의한다.
"개체" 또는 "피험자"는 척추동물, 예를 들어 조류, 바람직하게는 포유류, 예를 들어 사람이다. 포유류는 제한은 없으나 사람, 비-사람 유인원, 농장동물, 스포츠용 동물, 실험용 동물, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트) 및 애완동물을 포함한다.
물질의 "유효량" 또는 "충분량"은 임상적 결과를 포함하여 이로운 결과와 같은 원하는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 양이며, 이와 같은 "유효량"은 그것이 적용되는 환경에 좌우된다. 공동-투여된 항원에 대한 면역반응을 조절하는 조성물을 투여하는 것에 관하여, CIC 및 항원의 유효량은 항원만 투여되었을 때 얻어진 면역반응과 비교하여 그러한 조절을 달성하는데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여에서 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "공동-투여"는 면역반응을 조절할 만큼 충분히 가까운 시간에 적어도 2개의 상이한 물질을 투여하는 것으로 간주한다. 바람직하게, 공동-투여는 적어도 2개의 상이한 물질의 동시 투여로 간주한다.
Th1 반응과 같은 면역반응의 "자극"은 반응의 증가를 의미하며, 이것은 반응의 도출 및/또는 증진으로부터 일어날 수 있다. 유사하게, 사이토카인 또는 세포 타입(CTL과 같은)의 "자극"은 사이토카인 또는 세포 타입의 양 또는 수준의 증가를 의미한다.
"IgE 관련 장애"는 상승된 IgE 수준을 일부 특징으로 하는 생리학적 상태이며, 이것은 영구적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. IgE 관련 장애는 제한은 없으나 알레르기 및 알레르기 반응, 알레르기-관련 장애(하기 설명됨), 천식, 관절염, 결막염, 두드러기, 쇼크, 막시류의 곤충에게 쏘인 경우의 알레르기, 및 약물 알레르기, 및 기생충 감염을 포함한다. 또한, 이 용어는 이들 장애의 관련된 징후들을 포함한다. 일반적으로, 그러한 장애에서 IgE는 항원-특이적이다.
"알레르기-관련 장애"는 항원-특이적 IgE 면역반응의 효과로 인한 장애를 의미한다. 그러한 효과는 제한은 없으나 저혈압 및 쇼크를 포함한다. 아나필락시스가 알레르기-관련 장애의 예이며, 이 동안 순환으로 방출된 히스타민은 혈관확장을 일으킬 뿐만 아니라, 모세관의 투과성을 증가시키며, 그 결과 순환으로부터 혈장의 현저한 손실을 가져온다. 아나필락시스는 전신적으로 일어날 수 있으며, 이 때는 관련 효과가 전신체에 걸쳐 경험되고, 국소적으로 일어날 수도 있으며, 이 때는 반응이 특정한 표적 조직 또는 기관에 제한된다.
본원에 사용된 용어 "바이러스 질환"은 그것의 원인체로서 바이러스를 갖는 질환으로 간주한다. 바이러스 질환의 예들은 B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 후천성 면역결핍증후군(AIDS), 및 대상포진을 포함한다.
본원에 사용되며 본 분야에서 잘 이해된 용어인 "치료"는 임상적 결과를 포함하여 이로운 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이로운 또는 바람직한 임상적 결과는 제한은 없으나 한 가지 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 전파의 예방, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 회복(부분적인지 또는 전체적인지에 무관함)을 포함하며, 이들은 검출될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않은 경우의 예상된 생존과 비교하여 생존의 연장을 의미한다.
"완화"는 장애를 치료하지 않았을 때와 비교하여, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후들이 줄어들거나, 및/또는 진행의 시간 추이가 느려지거나 또는 길어진다는 의미이다. 특히 알레르기에 관하여, 당업자에게 잘 이해된 대로, 완화는 알레르겐(들)에 대한 면역반응의 조절시에 일어날 수 있다. 더 이상으로, 완화는 1회 분량의 투여에 의해 반드시 일어나지는 않지만, 연속 분량의 투여시에는 흔히 일어난다. 따라서, 반응 또는 장애를 완화하는데 충분한 양이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
CIC 및 항원에 의해 "도출"되는 "항체 역가" 또는 "항체량"은 CIC 및 항원의 투여 후 어떤 시간 지점에서 측정된 주어진 항체의 양으로 간주한다.
"Th1-관련 항체"는 그의 생성 및/또는 증가가 Th1 면역반응에 관련된 항체이다. 예를 들어, IgG2a는 마우스의 Th1-관련 항체이다. 본 발명의 목적을 위하여, Th1-관련 항체의 측정은 하나 이상의 그러한 항체들의 측정일 수 있다. 예를 들어, 사람에서 Th1-관련 항체의 측정은 IgG1 및/또는 IgG3의 측정을 수반할 수 있다.
"Th2-관련 항체"는 그의 생성 및/또는 증가가 Th2 면역반응에 관련된 항체이다. 예를 들어, IgG1은 마우스의 Th2-관련 항체이다. 본 발명의 목적을 위하여,Th2-관련 항체의 측정은 하나 이상의 그러한 항체들의 측정일 수 있다. 예를 들어, 사람에서 Th2-관련 항체의 측정은 IgG2 및/또는 IgG4의 측정을 수반할 수 있다.
사이토카인 생성, 항체 생성, 또는 히스타민 방출과 같은 기능 또는 활성을 "억제" 또는 "저해"함으로써, 관심의 조건 또는 파라미터를 제외하고 다른 것은 동일한 조건과 비교하거나, 또는 달리 또 다른 조건과 비교했을 때, 기능 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, CIC 및 히스타민 방출을 억제하는 항원을 포함하는 조성물은, 예를 들어 항원만에 의해 유도된 히스타민 방출과 비교하여 히스타민 방출을 감소시킨다. 다른 예로서, CIC 및 항체 생성을 억제하는 항원을 포함하는 조성물은, 예를 들어 항원만에 의해 생성된 항체의 정도 및/또는 수준과 비교하여, 항체의 정도 및/또는 수준을 감소시킨다.
본원에 사용된 "GMP 표준에 따라" 제조 또는 조제된은, 제약 조성물에 관해 언급되었을 때, 그 조성물이 미국식약청의 모든 Good Manufacturing Practice(GMP)에 충분히 따라서 멸균 상태로, 실질적으로는 등장 상태로 조제된 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 본 분야에서 통상 의미하는 바이며, 사람 또는 동물에 주사시에 적응할 수 있는 면역반응을 도출하는 제제(예를 들어, 폴리펩티드)로 간주한다. 면역반응은 B 세포(체액성) 및/또는 T 세포(세포성)일 수 있다.
모든 범위들은 말단 값들을 포함하도록 의도된다. 따라서, "2 내지 7 뉴클레오티드" 또는 "2에서 7 사이의 뉴클레오티드"의 중합체는 2 뉴클레오티드의 중합체 및 7 뉴클레오티드의 중합체를 포함한다. 하한 및 독립적으로 선택된 상한이 설명된 경우, 상한은 하한보다 더 높다는 것이 이해된다.
III.키메라 면역조절 화합물
본 발명은 사람을 포함하여 포유류와 같은 개체에서 면역반응을 조절하는데 있어 그 중에서도 유용한 키메라 면역조절 화합물("CIC")를 제공한다. 본 발명은 비-핵산 스페이서 부분에 공유결합된 핵산 부분을 함유하는 어떤 키메라 분자가, 특히 사람 세포에서 면역조절 활성을 가진다는 발견에 일부 기초한다. 놀랍게도, 이런 활성은 심지어 핵산 부분들이, 만일 분리된 폴리뉴클레오티드로 존재하는 경우에 유의한 면역조절 활성을 나타내지 않는 서열을 갖는 경우에도 명백하다.
따라서, 본 발명은 사람 및 다른 동물에서의 질환의 치료 및 예방을 포함하여, 면역반응을 조절하기 위한 새로운 시약 및 방법을 제공한다.
다음 섹션은 본 발명의 CIC의 구조 및 특성 뿐만 아니라, 성분 핵산 부분 및 비-핵산 스페이서 부분의 구조 및 특성을 설명한다.
1.CIC의 코어 구조
본 발명의 CIC는 1개 이상의 핵산 부분 및 1개 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 함유한다. 다양한 구조를 갖는 CIC가 고찰된다. 예를 들어, 전형적인 CIC는 하기 식 I 내지 VII에 설명된 코어 구조를 가진다. 식 I 내지 III는 "선형 CIC"의 코어 서열을 나타낸다. 식 IV 내지 VI는 "분기 CIC"의 핵샘 서열을 나타낸다. 식 VII는 "단일-스페이서 CIC"의 코어 구조를 나타낸다.
하기 제공된 각 식에서, "N"은 핵산 부분(5'→3' 또는 3'→5' 방향으로 배향됨)을 지정하며, "S"는 비-핵산 스페이서 부분을 지정한다. 대쉬("-")는 핵산 부분과 비-핵산 스페이서 부분 간의 공유결합을 지정한다. 이중 대쉬("--")는 비-핵산 스페이서 부분과 적어도 2개 핵산 부분들 사이의 공유결합을 지정한다. 삼중 대쉬("---")는 비-핵산 스페이서 부분과 다수(즉, 적어도 3개) 핵산 부분들 사이의 공유결합을 지정한다. 하첨자는 상이하게 위치된 핵산 또는 비-핵산 스페이서 부분들을 지정하기 위해 사용된다. 그러나, 상이한 핵산 부분들을 구별하기 위한 하첨자의 사용이 그 부분들이 반드시 상이한 구조 또는 서열을 갖는다는 것을 나타내지는 않는다. 유사하게, 상이한 스페이서 부분들을 구별하려는 하첨자의 사용이 그 부분들이 반드시 상이한 구조를 갖는다는 것을 나타내지는 않는다. 예를 들어, 하기 식 II에서, N1과 N2로 지정된 핵산 부분들은 동일하거나 또는 상이한 서열을 가질 수 있으며, S1과 S2로 지정된 스페이서 부분들은 동일하거나 또는 상이한 서열을 가질 수 있다.
A.선형 CIC
한 구체예에서, CIC는 코어 구조
N1-S1-N2(I)
를 포함한다.
한 구체예에서, CIC는 코어 구조
N1-S1-N2-S2-N3(II)
를 포함한다.
한 구체예에서, CIC는 코어 구조
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A(III)
를 포함한다.
상기 식들에서, A는 1에서 약 100 사이의 정수이고, [Nv-Sv]는 비-핵산 스페이서 부분에 콘쥬게이트된 핵산 부분의 A개의 추가 반복을 나타낸다. 하첨자 "v"는 N 및 S가 "[Nv-Sv]"의 각 반복에서 독립적으로 선택되는 것을 나타낸다. "A"는 때로 1에서 약 10 사이이며, 때로 1에서 3 사이이고, 때로 정확하게는 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 어떤 구체예에서, A는 1, 2, 3, 4, 또는 5의 하한, 및 10, 20, 50 또는 100의 독립적으로 선택된 상한에 의해 한정된 범위 내의 정수이다(예를 들어, 3에서 10 사이).
본 발명의 어떤 구체예에서, CIC는 식 I, II 또는 III의 구조를 가진다. 그러나, 본 발명에 따르는 어떤 구체예에서, 선형 CIC는 반드시 그렇게 제한되는 것은 아니나 식 I 내지 III에 의해 제공된 구조를 포함한다. 즉, 식 I, II 및 III는 코어 구조 내의 비-핵산 스페이서 부분이 2개 이상의 핵산 부분에 공유결합된코어구조를 한정한다. 그러나, 많은 구체예에서는 추가의 화학적 부분들(예를 들어, 포스페이트, 모노뉴클레오티드, 추가 핵산 부분, 알킬, 아미노, 티오 또는 디술피드 기 또는 연결기, 및/또는 스페이서 부분)이 코어 구조의 말단에서 공유결합되는 것이 고찰된다. 예를 들어, 만일 CIC의 모든 핵산 부분이 5'-TCGTCGA-3'이고, 스페이서 부분이 헥사에틸렌 글리콜("HEG"), HEG의 포스포로티오에이트-연결 다량체,및 글리세롤로부터 선택된다면, 식 I의 코어 구조를 갖는 CIC는 다음의 각 식들을 포함한다:
식 I의 코어 구조를 포함하는 CIC의 부류가 식 II 또는 III의 코어 구조를 포함하는 CIC를 포함한다는 것이 즉각 분명해질 것이다.
어떤 구체예에서, 1개 이상의 스페이서는 서로 연결된 더 작은 유닛들(예를 들어, HGE, TEG, 글리세롤, C3 알킬 등)을 포함한다. 한 구체예에서, 그 결합은 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르) 또는 예를 들어 하기 설명된 바와 같은 다른 결합이다.
어떤 구체예에서, CIC의 말단 구조는 공유결합(예를 들어, 핵산 부분-대-비-핵산 부분, 스페이서 부분-대-스페이서 부분, 또는 핵산 부분-대-스페이서 부분)되어 그 결과 원형의 입체구조를 가져온다.
B.분기 CIC
한 구체예에서, CIC는 코어 구조
[Nv]A---Sp(IV)
를 포함하며, 여기서 Sp는 "A"개의 독립적으로 선택된 핵산 부분 Nv에 공유결합된 다가 스페이서이고, A는 적어도 3, 예를 들어 정확히 3, 4, 5, 6 또는 7 또는 7 이상이다. 다양한 구체예에서, A는 3에서 100(포함) 사이의 정수이다. 어떤 구체예에서, A는 약 3, 5, 10, 50, 또는 100의 하한 및 약 5, 7, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 500의 독립적으로 선택된 상한에 의해 한정된 범위 내의 정수이다. 또한, 어떤 구체예에서, A는 약 500 이상인 것이 고찰된다.
관련 구체예에서, CIC는 코어 구조
[Sv-Nv]A---Sp(V)
를 포함하며, 여기서 Sp는 핵산 부분에 공유결합된 스페이서 부분을 포함하는 "A"개의 독립적으로 선택된 요소 Sv-Nv에 공유결합된 다가 스페이서이고, A는 적어도 3이다. 다양한 구체예에서, A는 3에서 100(포함) 사이의 정수이다. 어떤 구체예에서, A는 5, 10, 50, 또는 100의 하한 및 10, 50, 100, 250, 또는 500의 독립적으로 선택된 상한에 의해 한정된 범위 내의 정수이다. 또한, 어떤 구체예에서, A는 500 이상인 것이 고찰된다. 관련 구체예에서, CIC는
(S1-N1)-Sp--(Nv)A(VI)
를 포함하며, 여기서 Sp는 "A"개의 독립적으로 선택된 핵산 부분 Nv, 및 스페이서 부분 S1에 결합된 적어도 1개의 핵산 부분 N1에 공유결합된 다가 스페이서, A는 적어도 2이다. 한 구체예에서, A는 2이다. 다양한 구체예에서, A는 3, 4, 5, 또는 3에서 100(포함) 사이의 정수이다. 어떤 구체예에서, A는 5, 10, 50, 또는 100의 하한 및 10, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 500의 독립적으로 선택된 상한에 의해 한정된 범위 내의 정수이다. 또한, 어떤 구체예에서, A는 500 이상인 것이 고찰된다. 본 발명의 어떤 구체예에서, CIC는 식 I, II 또는 III의 구조를 가진다. 그러나, 본 발명에 따르면, 분기 CIC는 그렇게 제한되는 것은 아니나 식 IV, V 및 VI에 제공된 구조를 포함한다. 즉, 식 IV, V 및 VI는 다가 스페이서 부분(Sp)이 적어도 3개의 핵산 부분에 공유결합된 코어 구조를 한정한다. 어떤 구체예에서, 추가의 화학적 부분들(예를 들어, 포스페이트, 모노뉴클레오티드, 추가 핵산 및/또는 스페이서 부분)이 코어 구조의 말단에서 공유결합되는 것이 고찰된다. 예를 들어, 만일 CIC의 모든 핵산 부분이 5'-TCGTCGA-3'이고, 모든 스페이서 부분이 글리세롤 또는 HEG라면, 식 IV의 코어 구조를 갖는 CIC는 다음의 것들을 포함한다:
예를 들어, 식 IV의 코어 구조를 포함하는 CIC의 부류가 식 V 또는 VI의 코어 구조를 포함하는 CIC를 포함한다는 것이 즉각 분명해질 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, CIC는 적어도 2개의 상이한(즉, 상이한 서열) 핵산 부분을 포함한다.
어떤 구체예에서, 1개 이상의 스페이서는 서로 연결된 더 작은 유닛들(예를 들어, HGE, TEG, 글리세롤, C3 알킬 등)을 포함한다. 한 구체예에서, 그 결합은 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)이다.
C.단일-스페이서 CIC
본 발명의 상이한 양태로서, CIC는 단일 스페이서 부분에 공유적으로 콘쥬게이트된 단일 핵산인 구조를 포함하며, 이 구조는 다음과 같다:
N1-S1(VII)
한 구체예에서, S1은 전형적으로, 예를 들어 하기 설명된 바와 같은 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 연결된 더 작은 유닛들(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디디옥시리보스, C2 알킬 내지 C12 알킬 서브유닛 등)을 포함하는 다량체의 구조를 가진다. 예를 들어, 하기 식 VIIa를 참조한다. 다량체는 이종체 또는 동종체일 수 있다. 한 구체예에서, 스페이서는 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 연결된 단량체 유닛들(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디디옥시리보스, C2 알킬 내지 C12 알킬 링커 등)의 이종체이다. 예를 들어, 하기 식 VIIb를 참조한다.
예를 들어, 만일 핵산 부분이 5'TCGTCGA3'이고, 스페이서 부분이 헥사에틸렌 글리콜의 포스포로티오에이트-연결 다량체 ["(HEG)15"]라면, 식 VII의 코어 구조를갖는 CIC는 다음을 포함한다:
TCGTCGA-(HEG)15(VIIa)
유사하게, 만일 핵산 부분이 5'TCGTCGA3'이고, 스페이서 부분이 헥사에틸렌 글리콜과 프로필렌 서브유닛이 교호하는 포스포로티오에이트-연결 다량체라면, 식 VI의 코어 구조를 갖는 CIC는 다음을 포함한다:
TCGTCGA-HEG-프로필-HEG-프로필-HEG (VIIb)
2.CIC의 면역조절 활성
본 발명의 CIC는 면역조절 활성을 가진다. 본원에 사용된 용어 "면역조절", "면역조절 활성" 또는 "면역반응을 조절하는"은 면역자극 뿐만 아니라 면역억제 효과를 포함한다. 본 발명에 따라서 면역조절되는 면역반응은 일반적으로, "Th2-형" 면역 반응과 반대로, "Th1-형" 면역 반응을 향해 이동되는 것이다. Th1-형 반응은 전형적으로 세포 면역 시스템(예를 들어, 세포독성 림프구)으로 생각되는 반면, Th2-형 반응은 일반적으로 "체액" 또는 항체-기제이다. Th1-형 면역반응은 보통 항원에 대한 "지연-형 과민" 반응을 특징으로 한다. Th1-형 반응은 IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12, 및 TNF-β, 뿐만 아니라 IL-6과 같은 관련 사이토카인의 증가된 수준에 의해 생화학적 수준에서 검출될 수 있으며, IL-6은 또한 Th2-형 반응에도 관련될 수 있다. Th2-형 면역반응은 일반적으로 IgE 생성을 포함하는 더 높은 수준의 항체 생성, 최소 CTL 생성의 부재, 뿐만 아니라 IL-4 및 IL-5와 같은 Th2-관련 사이토카인의 발현에 관련된다.
본 발명에 따르는 면역조절은 시험관내, 생체내 및/또는 생체외 측정(분석)에 의해 인식될 수 있다. 면역조절 활성의 표시인 측정가능한 면역반응의 예들은, 제한은 없으나 항원-특이적 항체 생성, 사이토카인 분비, NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 림프구와 같은 림프구 집단들의 활성화 또는 팽창 등을 포함한다.
또한, 예를 들어 아래를 참조한다. 어떤 유용한 분석이 예시를 위해 하기 설명되나 이것에 제한되는 것은 아니다.
분석은 일반적으로 세포, 조직, 동물 등에 시험 샘플(예를 들어, CIC, 폴리뉴클레오티드, 및/또는 다른 제제를 함유하는)을 투여하거나 또는 접촉시키고, 반응을 측정함에 의해 수행된다. CIC 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 시험 샘플은 여러 가지 형태나 농도일 수 있으며, 이것은 분석 종류에 대해 적합하도록 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 세포-기제 분석을 위하여, CIC 또는 폴리뉴클레오티드는 주로 20㎍/ml 또는 10㎍/ml 또는 2㎍/ml의 농도로 사용된다. 전형적으로, 분석을 위해서, 농도는 260nm에서 흡광도를 측정하고, 0.5OD260/ml=20㎍/ml의 전환률을 사용함에 의해 결정된다. 이것은 시험 샘플에 있는 총핵산량을 정규화하며, 예를 들어 스페이서 부분이 260nm에서 유의한 흡광도를 갖지 않을 때 사용될 수 있다. 또는 달리, 농도 또는 중량은 본 분야에 공지된 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 원한다면, 핵산 부분의 양은 260nm에서 흡광도를 측정함에 의해 결정될 수 있으며, CIC의 중량은 CIC의 분자식을 사용하여 계산될 수 있다. 이 방법은 때로 CIC에 있는 스페이서 부분(들)에 의해 기여된 중량 대 핵산 부분에 의해 기여된 중량의 비가 높을 때(즉, 1 이상) 사용된다.
유사하게, 양성 및 음성 대조군이 면역조절 활성에 대한 분석에서 유용하다고 이해될 것이다. 서열 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'(SEQ ID NO:2)을 갖는 면역조절 포스포로티오에이트 DNA가 면역조절 활성에 대한 적합한 양성 대조군이지만, 면역조절 활성을 갖는 다른 적합한 양성 대조군들도 당업자에게 분명할 것이다. 한 적합한 음성 대조군은 시험 제제가 아닌 것이다(예를 들어, 부형제 또는 매질 단독, 또는 어떤 시험관내 분석에서는 "세포 단독"으로서 언급되기도 함). 또는 달리, 서열 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3)을 갖는 포스포로티오에이트 DNA가 어떤 구체예에서 음성 대조군으로 사용된다. 다른 음성 대조군들이 본원 명세서에 의해 안내 받은 당업자 및 통상의 분석 디자인에 의해 디자인된다.
한 유용한 부류의 분석은 "사이토카인 반응 분석"이다. 면역조절 활성에 대한 전형적인 분석은 사람 말초혈 단핵세포("PBMC")의 사이토카인 반응을 측정한다(예를 들어, Bohle 등[1999], Eur.J. Immunol. 29:2344-53; Verthelyi 등[2001] J. Immunol. 166:2372-77에 설명됨). 이 분석의 한 구체예에서, 말초혈은 1명 이상의 건강한 사람 지원자로부터 수집되고 PBMC가 분리된다. 전형적으로 혈액은 헤파린첨가 주사기를 사용한 정맥천자에 의해 수집되고, FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech) 쿠션 위에 층으로 만들어져 원심분리된다. 다음에, PBMC가 FICOLL계면으로부터 수집되고, 차가운 인산 완충 식염수(PBS)로 2번 세척된다. 세포는 24시간 동안 시험 샘플 또는 대조군의 존재 및 부재하에 10% 열-비활성화된 사람 AB 혈청, 50유닛/ml 페니실린, 50㎍/mL 스트렙토마이신, 300㎍/ml 글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 및 1xMEM 비-필수 아미노산(NEAA)를 갖는 RPMI 1640 중에서 2x106세포/ml로 재현탁되고 배양된다(예를 들어, 48- 또는 96-웰 플레이트에서).
세포-프리 배지가 각 웰로부터 수집되고, IFN-γ 및/또는 INF-α 농도에 대해 분석된다. 면역조절 활성은, 시험 화합물과 접촉된 PBMC에 의해 분비된 INF-γ의 양이 시험 화합물의 부재하에, 또는 어떤 구체예에서는 비활성 대조군 화합물(예를 들어, 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3))의 존재하에 PBMC에 의해 분비된 양보다 유의하게 더 클 때(예를 들어, 적어도 약 3-배 이상, 통상적으로 적어도 약 5-배 이상) 검출된다. 반대로, 만일 시험 화합물과 접촉된 PBMC에 의해 분비된 INF-γ의 양이 시험 화합물의 부재하에, 또는 달리 비활성 대조군 화합물(예를 들어, 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3)의 존재하에서보다 유의하게 더 크지 않다면 시험 화합물은 면역조절 활성을 갖지 않는다.
IFN-α 농도가 분석될 때, 시험 화합물과 접촉된 PBMC에 의해 분비된 IFN-α의 양은 주로 시험 화합물의 부재하에, 또는 어떤 구체예에서는 비활성 대조군 화합물(예를 들어, 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3))의 존재하에 PBMC에의해 분비된 양보다 유의하게 더 크다(예를 들어, IFN-α의 경우 때로 적어도 약 2-배 또는 적어도 약 3-배 이상). 어떤 구체예에서, 유의하게 증가된 IFN-α 분비 수준은 대조군 보다 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 심지어 적어도 약 20-배 이상이다. 반대로, 만일 시험 화합물과 접촉된 PBMC에 의해 분비된 IFN-α의 양이 시험 화합물의 부재하에, 또는 달리 비활성 대조군 화합물(예를 들어, 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3))의 존재하에서보다 유의하게 더 크지 않다면(예를 들어, 2-배 이상 미만) 시험 화합물은 면역조절 활성을 갖지 않는다.
하기 실시예에서 예시된 대로, 어떤 CIC의 투여는 IFN-γ 및 IFN-α의 유의한 분비를 가져오는 반면, 다른 CIC의 투여는 IFN-α의 분비에 대한 효과가 더 적거나, 또는 반대로 IFN-γ의 분비에 대한 효과가 더 적다.
다른 유용한 부류의 분석은 세포 증식 분석, 예를 들어 B 세포 증식 분석이다. B 세포 증식에 대해 제제(예를 들어, CIC)의 효과가 본 분야에 공지된 여러 가지 분석들 중 어느 것을 사용하여 결정될 수 있다. 전형적인 B 세포 증식 분석이 실시예 41에 제공된다.
예를 들어, 사이토카인 및 증식 분석과 같은 세포-기제 분석에서, 제공자의 편차를 고려하기 위하여, 바람직하게 분석은 다수의 상이한 제공자로부터의 세포(예를 들어, PBMC)를 사용하여 수행된다. 제공자의 수는 통상 적어도 2(예를 들어, 2), 바람직하게는 적어도 4(예를 들어, 4), 때로는 적어도 10(예를 들어, 10)이다. 시험 화합물의 존재하에 분비된 IFN-γ의 양이(예를 들어, 시험된 건강한 제공자의 적어도 반에서, 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 85%에서) 시험 화합물의 부재하에, 또는 어떤 구체예에서는 상기 설명된 비활성 대조군 화합물의 존재하에 분비된 것보다 적어도 약 3-배 이상 또는 적어도 약 5-배 이상일 때 면역조절 활성이 검출된다.
또한, 시험관내 분석은, 예를 들어 하기 실시예 42에 설명된 대로 마우스 세포를 사용하여, 그리고 다른 포유류 세포에서 수행될 수 있다.
전형적인 생체내 분석은 실시예 43, 44 및 46(마우스) 그리고 실시예 45(비-사람 영장류)에서 설명된다.
달리 나타내거나 분명한 경우를 제외하고, 하기 실시예들에 설명된 사이토카인 분석은 실시예 28에서 설명된 프로토콜을 필수적으로 사용하여 사람 PBMC를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 멀티-웰 플레이트 또는 다른 멀티-챔버 분석 재료를 사용하여 다수의 시험 화합물이 동시에 분석될 수 있다. 원한다면, 분석은 본 분야에 잘 공지된 컴퓨터-제어 로보트 메카니즘에 의해 수행될 수 있다.
3.핵산 부분
본 발명의 CIC는 1개 이상의 핵산 부분을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "핵산 부분"은 뉴클레오티드 단량체(즉, 모노뉴클레오티드) 또는 중합체(즉, 적어도 2 연속 뉴클레오티드를 포함하는)로 간주한다. 본원에 사용된 바와 같은 뉴클레오티드는 (1) 포스페이트기와 에스테르 결합된 상태인 당에 연결된 푸린 또는 피리미딘, 또는 (2) 염기 및/또는 당 및/또는 포스페이트 에스테르가, 예를 들어 하기 설명된 바와 같은 유사체들로 대체된 유사체를 포함한다. 1개 이상의 핵산 부분을 포함하는 CIC에서 핵산 부분들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
다음의 세 섹셕은 핵산 부분에 존재하는 서열 또는 서열 모티프의 길이, 존재, 및 위치와 같은 핵산 부분의 특징을 설명할 뿐만 아니라, 핵산 부분 및 이 부분을 함유하는 CIC의 특성 및 구조를 설명한다(본 발명을 제한하는 의도는 없다).
A.길이
통상적으로, 핵산 부분은 1 내지 100 뉴클레오티드 길이이지만, 어떤 구체예에서는 더 긴 부분도 가능하다. 어떤 구체예에서, CIC의 핵산 부분들 중 1개 이상의 길이는 8 뉴클레오티드 미만(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 뉴클레오티드)이다. 다양한 구체예에서, 핵산 부분(8 뉴클레오티드 길이보다 적은 핵산 부분과 같은)은 적어도 2 뉴클레오티드 길이, 흔히 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 뉴클레오티드 길이이다. 다른 구체예에서, 핵산 부분은 적어도 10, 적어도 20, 또는 적어도 30 뉴클레오티드 길이이다.
하기 실시예들에 나타낸 대로, 단지 7량체, 6량체, 5량체, 4량체 및 3량체 핵산 부분만을 함유하는 CIC가 면역자극 활성에 대한 분석에서 활성이었다(예를 들어, 실시예 36 및 37). 따라서, 어떤 구체예에서는 CIC가 8 뉴클레오티드보다 더 짧은 적어도 1개의 핵산 부분을 포함하는 것이 고찰된다. 어떤 구체예에서, CIC의 모든 핵산 부분은 8뉴클레오티드보다 더 짧을 것이다(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 하한 및 5, 6, 또는 7 뉴클레오티드의 독립적으로 선택된 상한에 의해 한정된 범위 내의 길이를 가지며, 여기서 상한은 하한보다 더 높다). 예를 들어, 한 구체예에서, CIC의 특정한 핵산 부분(CIC의 모든 핵산 부분을 포함함)은 6 또는 7 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 한 구체예에서, CIC는 2개의 스페이서 부분 및 8 염기길이(예를 들어, 5, 6 또는 7 염기 길이)인 개재 핵산 부분을 포함한다.
다수 핵산 부분을 포함하는 CIC에서 핵산 부분들은 동일하거나 또는 상이한 길이일 수 있는 것이 고찰된다. 한 구체예에서, CIC의 핵산 부분들의 1개 이상, 또는 대부분(예를 들어, 적어도 약 2, 적어도 약 4, 또는 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%) 또는 전부는 8 뉴클레오티드보다 더 적으며, 어떤 구체예에서는 7 뉴클레오티드보다 적고, 어떤 구체예에서는 6 뉴클레오티드보다 적고, 어떤 구체예에서는 2에서 6 뉴클레오티드 사이, 어떤 구체예에서는 2에서 7 뉴클레오티드 사이, 어떤 구체예에서는 3에서 7 뉴클레오티드 사이, 어떤 구체예에서는 4에서 7 뉴클레오티드 사이, 어떤 구체예에서는 5에서 7 뉴클레오티드 사이, 어떤 구체예에서는 6에서 7 뉴클레오티드 사이이다.
하기 더 상세히 설명된 대로, CIC의 적어도 1개 핵산 부분은 주로 서열, CG, 예를 들어 TCG, 또는 본원에 설명된 CG-함유 모티프를 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 1개의 핵산 부분은 CG-함유 핵산 모티프를 포함하며, 8 뉴클레오티드 길이 미만이다(예를 들어, 8 뉴클레오티드 미만의 상기 설명된 특정한 길이를 가진다). 관련 구체예에서, 8 뉴클레오티드보다 더 긴 CIC의 핵산 부분들 중 어느 것도 서열 "CG" 또는 선택적으로 서열 "TCG" 또는 "ACG"를 포함하지 않는다(즉, 서열 CG를 포함하는 CIC의 핵산 부분 전부는 8 뉴클레오티드 길이 미만이다). 한 구체예에서, CIC의 적어도 1개의 핵산 부분은 CG 서열을 포함하지 않는다.
B.서열 및 모티프
상기 주목한 대로, 특정한 핵산 부분은 다양한 길이를 가질 수 있다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 8 뉴클레오티드보다 더 짧은 길이를 가진다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 또는 더 긴 길이를 가진다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 CIC의 적어도 1개의 핵산 부분은 하기 개시된 서열을 포함한다.
하기 제공된 식들에서, 모든 서열은 5'→3' 방향이며, 다음의 약자들이 사용된다: B = 5-브로모시토신; bU = 5-브로모우라실; a-A = 2-아미노-아데닌; g = 6-티오-구아닌; t = 4-티오-티미딘. H는 5위치에 있는 할로겐과 같은 전자끄는기를 포함하는 변형된 시토신이다. 다양한 구체예에서, 하기 언급된 서열 중 시토신(C)은 N4-에틸시토신 또는 N4-메틸시토신 또는 5-히드록시시토신으로 대체된다. 다양한 구체예에서, 식 중 구아노신(G)은 7-디아자구아노신으로 대체된다.
지금까지 시험된 CIC에서, CG의 존재는 사이토카인-유도 활성과 상호관련있었다. 따라서, 한 구체예에서, CIC의 적어도 1개의 핵산 부분은 적어도 1개의 5'-시토신,구아닌-3'(5'-CG-3') 서열을 포함한다. 시토신은 C-5 위치에서 메틸화되지 않으며, 바람직하게는 어느 위치에서도 메틸화되지 않는다.
한 구체예에서, 1개 이상의 핵산 부분은 3 내지 7 염기를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 3 내지 7 염기를 포함하며, 서열 5'-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3', 또는 5'-TCG[(X)2-4]-3', 또는 5'TCG(A/T)[(X)1-3]-3', 또는 5'-TCG(A/T)CG(A/T)-3', 또는 5'-TCGACGT-3' 또는 5'-TCGTCGA-3'를 가지고, 여기서 각 X는 독립적으로 선택된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, CIC는 상술된 서열을 갖는 적어도 3, 적어도 10, 적어도 30 또는 적어도 100개 핵산 부분을 함유한다.
한 구체예에서, 핵산 부분은 서열 5'-티미딘,시토신,구아닌-3'(5'-TCG-3')을 포함하며, 예를 들어(제한은 없다) 3-량체 TCG, 4-량체 TCGX(예를 들어, TCGA), 5-량체 TCGXX(예를 들어, TCGTC 및 TCGAT), 6-량체 TCGXXX, XTCGXX 및 TCGTCG, 및 7-량체 TCGXXXX, XTCGXXX, XXTCGXX 및 TCGTCGX이고, 여기서 X는 어떤 염기이다. 주로 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-티미딘,시토신,구아닌,아데노신-3'(5'-TCGA-3')을 포함하며, 예를 들어 서열 5'-TCGACGT-3'을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열 5'-ACGTTCG-3'; 5'-TCGTCG-3';
5'-AACGTTC-3'; 5'-AACGTT-3'; 5'-TCGTT-3'; 5'-CGTTCG-3'; 5'-TCGTCGA-3';
5'-TCGXXX-3'; 5'-XTCGXX-3'; 5'-XXTCGX-3'; 5'-TCGAGA-3'; 5'-TCGTTT-3';
5'-TTCGAG-3'; 5'-TTCGT-3'; 5'-TTCGC-3'; 5'-GTCGT-3'; 5'-ATCGT-3';
5'-ATCGAT-3'; 5'-GTCGTT-3'; 5'-GTCGAC-3'; 5'-ACCGGT-3'; 5'-AABGTT-3';
5'-AABGUT-3'; 5'-TCGTBG-3'를 포함하며, 여기서 X는 어떤 뉴클레오티드이다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열 5'-X1X2CGX3X4-3'를 포함하며, 여기서 X1은 0 내지 10 뉴클레오티드이고; X2는 부재하거나 또는 A, T, 또는 U이고; X3은 부재하거나 또는 A이고; X4는 0 내지 10 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 3' 단부에서 스페이서 부분에 콘쥬게이트된다. 어떤 구체예에서, X1은 0 내지 5 뉴클레오티드, 또는 달리 0 내지 2 뉴클레오티드이고, X4는 0 내지 5 뉴클레오티드, 또는 달리 0 내지 2 뉴클레오티드이다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 5'-푸린,푸린,C,G,피리미딘,피리미딘-3'; 5'-푸린,푸린,C,G,피리미딘,피리미딘,C,C-3'인 서열; 예를 들어 (모두 5'→3')
를 포함한다. 어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열: 5'-푸린,푸린,시토신,구아닌,피리미딘,피리미딘,시토신,시토신-3' 또는 5'-푸린,푸린,시토신,구아닌,피리미딘,피리미딘,시토신,구아닌-3'을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열(모두 5'→3') AACGTTCG; AACGTTCC; AACGUTCG; AABGTTCG; AABGUTCG 및/또는 AABGTTBG을 포함한다.
다양한 구체예에서, 핵산 부분은 모티프 5'-X1X2AX3CGX4TCG-3'(SEQ ID NO:4)를 포함하고, 여기서 X1은 T, G, C 또는 B이고, X2는 T, G, A 또는 U이고, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이며, 서열은 5'-TGAACGTTCG-3'(SEQ ID NO:5) 또는 5'-GGAACGTTCG-3'(SEQ ID NO:6)이 아니다. 예들은 (모두 5'→3'):
을 포함한다.
다양한 구체예에서, 핵산 부분은 서열:
을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열: 5'-X1X2AX3BGX4TCG-3'(SEQ ID NO:53)를 포함하며, 여기서 X1은 T, G, C 또는 B이고, X2는 T, G, A 또는 U이고, X3는 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다. 어떤 구체예에서, 핵산 부분은 5'-TGAABGTTCG-3'(SEQ ID NO:54)가 아니다. 예들은 (모두 5'→3'):
을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열:
를 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열: 5'-X1X2AX3CGX4TCG-3'(SEQ ID NO:75)이며, 여기서 X1은 T, C 또는 B이고, X2는 T, G, A 또는 U이고, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다. 어떤 구체예에서, 식은 5'-TGAACGTTCG-3'(SEQ ID NO:5)가 아니다.
다른 구체예에서, 핵산 부분은 서열:
을 포함한다.
어떤 구체예에서, 상기 개시된 서열들 중 어느 것에 관하여, 핵산 부분은 1개, 2개, 3개 이상의 TCG 및/또는 TBG 및/또는 THG 서열들을, 바람직하게는 상기 제공된 서열에 대해 5' 쪽에 포함한다. TCG(들) 및/또는 TBG(들)은 나타낸 서열에 직접 인접해 있을 수도 있고 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서,핵산 부분은 다음 중 어느 것을 포함한다.
어떤 구체예에서, 추가 TCG 및/또는 TBG 서열(들)은 인접한 5' 쪽에 그리고 기준 서열에 인접해 있다. 다른 구체예에서는, 하나 또는 둘의 염기 분리가 있다.
어떤 구체예에서 핵산 부분은 서열 5'-(TCG)wNyAX3CGX4TCG-3'(SEQ ID NO:102)을 가지며, 여기서 w는 1 내지 2이고, y는 0 내지 2이고, N은 어떤 염기이며, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
5'-(TBG)zNyAX3CGX4TCG-3'(SEQ ID NO:115), 여기서 z는 1 내지 2이고, y는 0 내지 2이고, B는 5-브로모시토신이고, N은 어떤 염기이고, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은:
을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
5'-TCGTBGNyAX3CGX4TCG-3'(SEQ ID NO:121), 여기서 y는 0 내지 2이고, B는 5-브로모시토신이고, N은 어떤 염기이고, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다. 어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들을 포함한다:
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
5'-(TCG)wNyAX3BGX4TCG-3'(SEQ ID NO:125), 여기서 w는 1 내지 2이고, y는 0 내지 2이고, N은 어떤 염기이고, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다. 어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다: TCGGAAABGTTCG (SEQ ID NO:126) 또는 TCGAABGTTCG(SEQ ID NO:127).
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
5'-(TBG)zNyAX3BGX4TCG-3'(SEQ ID NO:128), 여기서 z는 1 내지 2이고, y는 0 내지 2이고, B는 5-브로모시토신이고, N은 어떤 염기이고, X3은 T, A 또는 C이고,X4는 T, G 또는 U이다. 어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다: TBGAABGUTCG(SEQ ID NO:129) 또는 TBGAABGTTCG(SEQ ID NO:130).
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
5'-TCGTBGNyAX3BGX4TCG-3'(SEQ ID NO:131), 여기서 y는 0 내지 2이고, B는 5-브로모시토신이고, N은 어떤 염기이고, X3은 T, A 또는 C이고, X4는 T, G 또는 U이다. 어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 서열들 중 어느 것을 포함한다:
TCGTBGAABGUTCG (SEQ ID NO:132) 또는 TCGTBGAABGTTCG (SEQ ID NO:133).
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열: AACGTTCC, AACGTTCG, GACGTTCC, GACGTTCG을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열:
을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열:
을 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 서열 AACGUUCC, AACGUUCG, GACGUUCC, 및 GACGWCG의 RNA를 포함한다.
어떤 구체예에서, 핵산 부분은 다음 문헌들에 설명된 서열 또는 서열 모티프를 포함하는 서열을 가진다: 계류중인 공동소유의 미국특허출원 09/802,685(2002년 3월 7일 미국출원 공개번호 20020028784A1로서, 2001년 9월 20일 WO 01/68077로서 공개됨); 09/802,359(2001년 9월 WO 01/68144로서 공개됨), 및 계류중인 미국출원 일련번호 10/033,243, 또는 PCT 공보 WO 97/28259, WO 98/16247; WO 98/55495; WO 99/11275; WO 99/62923; 및 WO01/35991. 또한, 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 길이보다 더 큰(주로 실질적으로 더 큰) 폴리뉴클레오티드로서 투여되었을 때 면역자극 활성과 상호관련될 수 있다고 이전에 보고된 서열들 중 어느 것 또는 그 중 몇몇을포함하는 서열을 가질 수 있다: 예를 들어,
한 구체예에서, CIC의 적어도 1개의 핵산 부분은 PCT 공보 WO 01/22972에 설명된 바와 같은 TG 서열 또는 피리미딘-부화(예를 들어, T-부화 또는 C-부화) 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 핵산 부분은 6량체들 5'-GACGTT-3', 5'-GAGCTT-3', 5'-TCCGGA-3', 5'-AACGTT-3', 5'-GACGTT-3', 5'-TACGTT-3', 5'-CACGTT-3', 5'-AGCGTT-3', 5'-ATCGTT-3', 5'-ACCGTT-3', 5'-AACGGT-3', 5'-AACGAT-3', 5'-AACGCT-3', 5'-AACGTG-3', 5'-AACGTA-3' 및 5'-AACGTC-3' 중 1개 이상의 것 이외의 다른 것이다.
어떤 구체예에서, CIC는 상기 설명된 서열을 갖는 적어도 3, 적어도 10, 적어도 30 또는 적어도 100 핵산 부분을 함유한다.
C.핵산 부분 서열: 이종성 및 위치 효과
다수 핵산 부분을 포함하는 CIC에서 핵산 부분들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다는 것이 고찰된다.
한 구체예에서, CIc의 모든 핵산 부분은 동일한 서열을 가진다. 한 구체예에서, CIC는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6개 이상의 상이한 서열을 갖는 핵산 부분을 포함한다. 한 구체예에서, CIC는 10개 미만의 상이한 핵산 부분을 가진다. 한 구체예에서, CIC의 각 핵산 부분은 상이한 서열을 가진다.
어떤 구체예에서, 단일 핵산 부분은 상기 §3(B)에 열거된 서열 모티프의 1회 이상의 반복을 함유하거나, 또는 2개 이상의 상이한 서열 모티프를 함유한다. 단일 핵산 부분 내의 모티프들은 인접하거나, 오버랩되거나, 또는 핵산 부분 내의 추가의 뉴클레오티드 염기에 의해 분리될 수 있다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 1개 이상의 팔린드롬 영역을 포함한다. 단일가닥 올리고뉴클레오티드에 관해서, 용어 "팔린드롬"은 만일 올리고뉴클레오티드가 상보성 서열과 합체되어 이중가닥 분자를 형성했더라면 팔린드롬일 수 있는 서열로 간주한다. 다른 구체예에서, 1개의 핵산 부분은 CIC 내의 제 2 핵산 부분에 관하여 팔린드롬 또는 부분적으로 팔린드롬인 서열을 가진다. 본 발명의 구체예에서, CIC의 핵산 부분들 중 1개 이상의 서열은 팔린드롬이 아니다. 본 발명의 구체예에서, CIC의 핵산 부분들 중 1개 이상의 서열은 4 염기 이상, 선택적으로는 6 염기 이상의 팔린드롬 서열을 포함하지 않는다.
상기 설명된 대로, 다양한 구체예에서, CIC 내의 핵산 부분들 중 1개 이상(예를 들어, 전부)는 5'-CG-3' 서열, 또는 달리 5'-TCG-3' 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 5, 6, 또는 7 염기 길이이다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 식 5'-TCG[(X)2-4]-3' 또는 5'-TCG(A/T)[(X)1-3] 또는 5'-TCG(A/T)CG(A/T)-3' 또는5'-TCGACGT-3'(여기서, 각 X는 독립적으로 선택된 뉴클레오티드이다)을 가진다. 한 구체예에서, 상술된 핵산 부분은 5-프라임 부분이다.
한 구체예에서, 핵산 부분은 5'-TCGTCGA-3'을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 부분은 하기 서열들로부터 선택된 서열을 포함한다: (모두 5'→3')
(여기서, X는 A, T, G 또는 C이고; U는 2'-디옥시우리딘이고, B는 5-브로모-2'-디옥시시티딘이다)
한 구체예에서, 핵산 부분은 서열 TCGXXXX, TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT, TCGACTC, TCGAGCG, TCGATTT, TCGCTTT, TCGGTTT, TCGTTTT, TCGTCGT, ATCGATT, TTCGTTT, TTCGATT, ACGTTCG, AACGTTC, TGACGTT, 또는 TGTCGTT을 갖는 7-량체이거나; 또는 서열 TCGXXX, TCGAXX, TCGTCG, AACGTT, ATCGAT, GTCGTT, 또는 GACGTT을 갖는 6-량체이거나; 또는 서열 TCGXX, TCGAX, TCGAT, TCGTT, 또는 TCGTC을 갖는 5-량체이거나; 또는 서열 TCGA, TCGT, 또는 TCGX을 갖는 4-량체이거나; 또는 서열 TCG를 갖는 3-량체이며, 여기서 X는 A, T, G 또는 C이다.
한 구체예에서, CIC의 핵산 부분들 중 적어도 약 25%, 바람직하게 적어도 약50%, 또는 적어도 약 75%, 그리고 때로 전부는 상술된 서열들 중 적어도 1개를 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 1개 핵산 부분은 CG 모티프를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, CIC의 핵산 부분들 중 적어도 약 25%, 때로 적어도 약 50%, 그리고 때로 적어도 약 75%는 CG 모티프, 또는 달리 TCG 모티프를 갖지 않는 핵산 부분들이다.
하기 실시예들에 예시된 대로, CIC에서 서열 또는 서열 모티프의 위치는 CIC의 면역조절 활성에 영향을 미칠 수 있다. CIC의 핵산 부분에서 서열 모티프의 위치와 관련하여 다음의 용어가 유용하다: (1) 다수 핵산 부분을 함유하는 CIC에서 자유-5' 단부를 갖는 부분은 "5-프라임 부분"이라고 한다. 단일 CIC가 다수의 5-프라임 부분을 가질 수 있다는 것이 인정될 것이다. (2) 어떤 특정한 핵산 부분 내에서, 서열 또는 모티프는, 그 서열 내에 기준 서열에 대한 5' 쪽에 뉴클레오티드 염기들이 없을 때는 "5-프라임 위치" 안에 있다. 따라서, 서열 5'-TCGACGT-3'을 갖는 부분에서 서열 T, TC, TCG 및 TCGA는 "5-프라임 위치" 안에 있는 반면 서열 GAC는 그렇지 않다. 예시를 위하여, 핵산 부분의 5-프라임 위치 안에 서열 TCG를 함유하는 CIC는, 상이하게 위치된 TCG 모티프를 갖는 다른 유사한 CIC보다 CIC를 더욱 활성으로 만들 수 있다. 5-프라임 부분 안에, 예를 들어 5-프라임 부분의 5-프라임 위치에 TCG 서열을 갖는 CIC는 CIC를 특히 활성으로 만들 수 있다. 예를 들어, 실시예 38을 참조한다. 자유 5' 단부를 갖는 핵산 부분은 그 핵산 부분의 염기 서열에 대한 식의 좌측에 기호 "5'F"를 사용하여 지정될 수 있다(예를 들어,5'F-TACG-3'). 본원에 사용된 핵산 부분에 관련된 용어 "자유 5' 단부"는 그것의 통상적인 의미를 가지며, 핵산 부분의 5' 말단이 차단기 또는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분에 콘쥬케이트되지 않았다는 의미이다.
또한, 면역조절 활성은 핵산 부분에서(예를 들어, 5'-부분에서) CG 모티프의 위치에 의해 영향 받을 수 있다. 예를 들어, 한 유용한 구체예에서, CIC는 서열 5'-X-CG-Y-3'을 갖는 적어도 1개의 핵산 부분을 함유하며, 여기서 X는 0, 1, 또는 2 뉴클레오티드이고, Y는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 15 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 한 구체예에서, 5'-X-CG-Y-3' 서열은 CIC의 5'-부분 내에, 예를 들어 CIC의 5-프라임 위치에 있다. 한 구체예에서, CIC는 식 5'-X-CG-Y-3'의 서열을 갖는 2, 3 또는 그 이상의 핵산 부분을 함유한다. 예를 들어, 한 구체예에서, CIC의 모든 핵산 부분은 식 5'-X-CG-Y-3'의 서열을 가진다.
유사하게, 핵산 부분에 서열 TCGA(예를 들어, TCGACGT를 포함하는 서열)을 포함하는 CIC는 면역조절 활성을 가지며, IFN-α 유도에 효과적이다. 5-프라임 부분의, 예를 들어 5-프라임 부분의 5-프라임 위치에 있는 TCGA(예를 들어, TCGACGT를 포함하는 서열)은 CIC를 특히 활성으로 만든다. 실시예 38 및 49를 참조한다. 따라서, 한 구체예에서, CIC는 식 (5'-N1-3')-S1-N2(Ia)를 갖는 코어 구조를 포함하며, 여기서 N1은 서열 5'-TCGAX-3'을 가지고, X는 0 내지 20 뉴클레오티드 염기, 주로 0 내지 3 염기이다. 한 구체예에서, X는 CGT이다. 또한, 서열 TCGTCGA은 IFN-α 유도에서 특히 효과적이다.
여기에 더하여, 자유(콘쥬게이트되지 않은) 핵산 5'-단부의 존재가 면역자극 활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 실시예 39를 참조한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 CIC는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 자유 5' 단부를 포함한다. 어떤 구체예에서, 자유 5' 단부의 수는 1 내지 10, 2 내지 6, 3 내지 5, 또는 4 내지 5이다. 한 구체예에서, 자유 5' 단부의 수는 적어도 약 50 또는 적어도 약 100이다.
D."분리된 면역조절 활성"
핵산 부분의 한 가지 특성은 핵산 부분의 뉴클레오티드 서열에 관련된 "분리된 면역조절 활성"이다. 상기 주지된 대로, 본 발명자들은, 놀랍게도, CIC의 핵산 부분들 중 어느 것도, 폴리뉴클레오티드만으로 존재할 때 비슷한 면역조절 활성을 나타내는 서열을 갖지 않을 때도, CIC가 면역조절 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.
어떤 구체예에서, CIC의 핵산 부분은 하기 설명된 대로, "분리된 면역조절 활성"을 갖지 않거나, 또는 "열등한 분리된 면역조절 활성"을 가진다(즉, CIC와 비교했을 때).
핵산 부분의 "분리된 면역조절 활성"은 핵산 부분의 주 서열 및 동일한 핵산 백본(예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르, 키메라)를 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드의 면역조절 활성을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 구조 "5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'"을 갖는 CIC는 3개의 핵산 부분을 함유한다. 예를 들어, CIC에 있는 제 1 핵산 부분의 독립적인 면역조절 활성을 결정하기 위해, 동일한 서열(즉, 5'-TCGTCG-3') 및 동일한 백본 구조(예를 들어, 포스포로티오에이트)를 갖는 시험 폴리뉴클레오티드가 루틴한 방법을 사용하여 합성되고, 그것의 면역조절 활성(만약 있다면)이 측정된다. 면역조절 활성은 상기 §2에 설명된 것들과 같은, 다양한 양태의 면역반응을 나타내는 표준 분석들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는 상기 §2에 설명된 사람 PBMC 분석이 사용된다. 상기 논의된 대로, 제공자의 편차를 고려하기 위해 전형적으로 분석은 다수의 제공자로부터 얻어진 세포를 사용하여 수행된다. 폴리뉴클레오티드와 접촉된 PBMC에 의해 분비된 IFN-γ의 양이, 시험 화합물의 부재하에 또는 (어떤 구체예에서) 비활성 대조군 화합물(예를 들어, 5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3'(SEQ ID NO:3))의 존재하에서보다, 대다수 제공자에서 유의하게 더 크지 않을 때(예를 들어, 약 2-배 이상 미만), 폴리뉴클레오티드는 면역조절 활성을 갖지 않는다(그리고, 상응하는 핵산 부분도 "분리된 면역조절 활성"을 갖지 않는다).
CIC와 분리된 폴리뉴클레오티드의 면역조절 활성을 비교하기 위해서, 바람직하게는 상기 §2에 설명된 사람 PBMC 분석을 사용하여 면역조절 활성이 측정된다. 통상 2개 화합물의 활성은 그들을 동일한 조건하에서 나란히 분석함으로써 비교되는데, 통상 약 20㎍/ml의 농도에서 분석된다. 상기 주지된 대로, 전형적으로 농도는 260nm에서 흡광도를 측정하고, 전환 0.5 OD260/ml=20㎍/ml을 사용함으로써 결정된다. 이것은 시험 샘플에 있는 총핵산량을 정규화한다. 또는 달리, 농도나 중량은 본 분야에 공지된 다른 방법에 의해 측정될 수 있다. 원한다면, 핵산 부분의 양은260nm에서 흡광도를 측정하고, CIC의 분자식을 사용하여 CIC의 중량을 계산함으로써 결정될 수 있다. 이 방법은 때로 CIC에서 스페이서 부분(들)에 의해 기여된 중량 대 핵산 부분에 의해 기여된 중량의 비가 높을 때(즉, 1 이상) 사용된다.
또는 달리, 특히 비교되는 2개 샘플의 계산된 분자량이 20% 이상까지 차이 날 때는 3μM의 농도가 사용될 수 있다.
CIC의 핵산 부분은 "열등한 면역조절 활성"을 갖는 것을 특징으로 하는데, 이 때 시험 폴리뉴클레오티드는 그것이 비교되는 CIC보다 더 적은 활성을 가진다. 바람직하게, 시험 폴리뉴클레오티드의 분리된 면역조절 활성은 CIC 활성의 약 50% 이하이며, 더 바람직하게는 CIC 활성의 약 20% 이하, 가장 바람직하게는 약 10% 이하이거나, 또는 어떤 구체예에서는 훨씬 더 적다.
다수의(예를 들어, 다수의 상이한) 핵산 부분을 갖는 CIC에 대해서, 다수 핵산 부분에 상응하는 시험 폴리뉴클레오티드들의 혼합물의 면역조절 활성(만약 있다면)을 결정하는 것이 또한 가능하다. 사용된 CIC의 양과 동등한 시험 폴리뉴클레오티드의 총량(즉, 혼합물에서)을 사용하여 분석이 수행될 수 있다. 또는 달리, 혼합물 중의 각 시험 폴리뉴클레오티드, 또는 각 상이한 시험 폴리뉴클레오티드의 양이 분석에서 CIC의 양과 동등할 수 있다. §2에서 주지된 대로, 제공자의 편차를 고려하기 위해 바람직하게 분석은 다수 제공자로부터의 PMBC를 사용한다.
한 구체예에서, CIC에 있는 핵산 부분들 중 1개 이상(예를 들어, 개별적으로 측정하거나 또는 달리 합쳐서, 적어도 약 2, 적어도 약 4, 또는 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 또는 전부)은 분리된 면역조절 활성을 갖지 않는다. 한 구체예에서,1개 이상은(예를 들어, 개별적으로 측정하거나 또는 달리 합쳐서, 적어도 약 2, 적어도 약 4, 또는 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 또는 전부)은 CIC에 비하여 열등한 분리된 면역조절 활성을 가진다.
관련 구체예에서, CIC는 분리된 면역조절 활성을 갖는 1개 이상의 핵산 부분을 포함한다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 핵산 부분 전부 또는 거의 전부(예를 들어, 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%)는 분리된 면역조절 활성을 가진다. 예를 들어, 다가 스페이서(들)을 포함하는 CIC는 분리된 면역조절 활성(예를 들어, 서열 5'-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A-3'(SEQ ID NO:2)을 갖는)을 갖는 4 이상, 주로 10 이상, 빈번하게는 적어도 약 20, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 적어도 약 400 또는 적어도 약 1000의 핵산 부분(예를 들어, 적어도 약 2500)들을 포함할 수 있다.
따라서, 특정한 CIC에서 분리된 면역조절 활성을 갖는 핵산 부분의 수는 CIC의 핵산 부분들 중 0, 1, 2 이상, 3 이상, 3 미만, 4 이상, 4 미만, 5 이상, 5 미만, 적어도 10, 적어도 약 20, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 적어도 약 400 또는 적어도 약 1000, 전부 또는 전부 미만일 수 있다.
E.핵산 부분의 구조
CIC의 핵산 부분은 자연발생 핵산에 비해 구조적인 변형을 함유할 수 있다. 변형은 본 분야에서 폴리뉴클레오티드에 대해 공지된 어떤 것도 포함하며, 제한은 없으나 3'OH 또는 5'OH 기의 변형, 뉴클레오티드 염기의 변형, 당 성분의 변형, 및 인산염 기의 변형이 있다. 다양한 그러한 변형이 하기 설명된다.
핵산 부분은 DNA, RNA 또는 혼성 DNA/RNA, 단일가닥, 이중가닥 또는 부분 이중가닥일 수 있으며, 다른 변형된 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 이중가닥 핵산 부분 및 CIC가 고찰되며, 용어 "염기" 또는 "뉴클레오티드"는 다른 나타낸 바가 없다면 염기쌍 또는 염기쌍을 이룬 뉴클레오티드를 포함하도록 한다. 핵산 부분은 자연발생 또는 변형된 비-자연발생 염기를 함유할 수 있으며, 변형된 당, 인산염, 및/또는 말단들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 인산염 변형은 제한은 없으나 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트(브릿징 또는 비-브릿징), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트를 포함하며 어떤 조합으로 사용될 수도 있다. 또한, 다른 비-인산염 결합이 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 CIC 및 핵산 부분은 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. 또한, 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라 및 본원에 설명된 여타의 것들과 같은, 본 분야에 공지된 당 변형이 만들어져 어떤 인산염 변형과 조합될 수 있다. 염기 변형(하기 더 논의됨)의 예들은 제한은 없으나 시토신의 C-5 및/또는 C-6(예를 들어, 5-브로모시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-요도시토신), 및 우라실의 C-5 및/또는 C-6(예를 들어, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-요도우라실)에 전자끄는 부분을 부가하는 것을 포함한다. 예를 들어, PCT 출원번호 WO 99/62923 참조.
또한, 핵산 부분은 인산염-변형 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 변형된 인산염 결합 또는 비-인산염 결합을 함유하는 핵산의 합성이 본 분야에 공지되어 있다. Matteucci(1997) "Oligonucleotide Analogs: an Overview": Oligonucleotidesas Therapeutic Agents (D. J. Chadwick 및 G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY을 리뷰로서 참조한다. 본 발명의 핵산의 당 또는 당 유사체 부분에 부착될 수 있는 인 유도체(또는 변형 인산염 기)는 일인산염, 이인산염, 삼인산염, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트 등일 수 있다. 상기 주지된 인산염 유사체의 제조, 및 그들과 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 결합이 또 이미 공지되어 있으므로 본원에 상세히 설명하지 않는다. Peyrottes 등 (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi 등 (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; 및 Schultz 등 (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성은, 산화 단계가 황화 단계로 대체되는 것을 제외하고는 자연발생 올리고뉴클레오티드에 대해 상기 설명된 것과 유사하다(Zon(1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates": Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190). 유사하게, 다른 인산염 유사체의 합성, 예컨대 포스포트리에스테르(Miller 등 (1971) JACS 93:6657-6665), 비-브릿징 포스포라미데이트(Jager 등(1988) Biochem. 27:7247-7246), N3'→P5' 포스포라미데이트(Nelson 등 (1997) JOC 62:7278-7287) 및 포스포로디티오에이트(미국특허 번호 5,453,496)가 또한 설명되었다. 또한, 다른 비-인 기제 변형 핵산이 사용될 수 있다(Stirchak 등 (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141). 포스포로티오에이트 백본을 갖는 핵산은 숙주에게 주사된 후 분해에 대해 더 저항성인 것으로 여겨진다. Braun 등 (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; 및 Latimer 등 (1995)Mol. Immunol. 32:1057-1064.
본 발명에 사용된 핵산 부분은 리보뉴클레오티드(유일한 또는 주요 당 성분으로서 리보스를 함유함) 및/또는 디옥시리보뉴클레오티드(주요 당 성분으로서 디옥시리보스를 함유함)를 포함할 수 있다. 변형된 당 또는 당 유사체들이 핵산 부분에 결합될 수 있다. 따라서, 리보스 및 디옥시리보스에 더하여, 당 부분은 펜토스, 디옥시펜토스, 헥소스, 디옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 크실로스, 리소스 및 당 "유사체" 시클로펜틸기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태일 수 있다. 당 부분은 바람직하게 리보스, 디옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보스의 푸라노시드이며, 당은 각 헤테로고리 염기에 α 또는 β 아노머의 입체형태로 부착될 수 있다. 당 변형은 제한은 없으나 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함한다. 예를 들어, CIC에서의 당 변형은 제한은 없으나 2'-아미노-2'디옥시아데노신을 포함한다. 이들 당 또는 당 유사체의 제조 및 그러한 당 또는 유사체가 헤테로고리 염기(핵산 염기)에 부착되는 각 "뉴클레오시드"는 이미 공지되어 있으므로 본원에서 설명될 필요는 없으며, 단 그러한 제조의 범위는 어떤 특정한 실시예에 속할 수 있다. 또, 당 변형이 만들어져 CIC의 제조에서 어떤 인산염 변형과 조합될 수 있다.
핵산 부분에 결합되는 헤테로고리 염기 또는 핵산 염기는 자연발생한 주요 푸린 및 피리미딘 염기(즉, 상기 언급된 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌) 뿐만 아니라 상기 주 염기들의 자연발생 및 합성 변형체일 수 있다.
당업자는, 다양한 헤테로고리 염기 및 다양한 당 부분(및 당 유사체)를 포함하는 다수의 "합성" 비-자연적 뉴클레오시드가 본 분야에 이용될 수 있으며, 본 발명의 다른 기준이 만족되는 한, 핵산 부분이 자연발생 핵산의 주요 5개 염기 성분 이외의 다른 1개 또는 몇몇 헤테로고리 염기를 포함할 수 있다는 것을 인정할 것이다. 그러나, 바람직하게 헤테로고리 염기는 제한은 없으나 우라실-5-일, 시토신-5일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로[2.3-d]피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2.3-d]피리미딘-5-일 또는 2-아미노-4-옥소피롤로[2.3-d]피리미딘-3-일 기이며, 여기서 푸린은 9-위치를 통해 핵산 부분의 당 부분에 부착되고, 피리미딘은 1-위치를 통해, 피롤로피리미딘은 7-위치를 통해, 그리고 피라졸로피리미딘은 1-위치를 통해 부착된다.
핵산 부분은 적어도 1개의 변형 염기를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "변형 염기"는 "염기 유사체"와 동의어로서, 예를 들어 "변형 시토신"은 "시토신 유사체"와 동의어이다. 유사하게, "변형" 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 본원에서 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 "유사체"와 동의어인 것으로 정의된다. 염기 변형의 예들은 제한은 없으나 핵산 부분의 시토신의 C-5 및/또는 C-6에 전자끄는 부분을 부가하는 것을 포함한다. 바람직하게 전자끄는 부분은 할로겐이다. 그러한 변형 시토신은 제한은 없으나 아자시토신, 5-브로모시토신, 5-클로로시토신, 염화 시토신, 시클로시토신, 시토신 아라비노시드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 5,6-디히드로시토신, 5-요도시토신, 5-니트로시토신, 및 어떤 다른 피리미딘 유사체 또는 변형 피리미딘을 포함할 수 있다. 염기 변형의 다른 예들은 제한은 없으나 핵산 부분의 우라실의 C-5 및/또는 C-6에 전자끄는 부분을 부가하는것을 포함한다. 바람직하게 전자끄는 부분은 할로겐이다. 그러한 변형 우라실은 제한은 없으나 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-요도우라실을 포함할 수 있다. 또한, Kandimalla 등 2001, Bioorg Med. Chem. 9:807-13을 참조한다.
염기 변형의 다른 예들은 염기에 1개 이상의 티올기를 부가하는 것을 포함하며, 제한은 없으나 6-티오-구아닌, 4-티오-티민 및 4-티오-우라실을 포함한다.
염기-변형 뉴클레오시드의 제조 및 상기 염기-변형 뉴클레오시드를 전구체로 사용한 변형 올리고뉴클레오티드의 합성은, 예를 들어 미국특허 번호 4,910,300, 4,948,882 및 5,093,232에 설명되었다. 이들 염기-변형 뉴클레오시드는 화학적 합성에 의해 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 안쪽 위치들에서 결합될 수 있도록 디자인된다. 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 안쪽 위치에 존재하는 그러한 염기-변형 뉴클레오시드는 펩티드나 다른 항원의 부착 자리로서 사용될 수 있다. 당 부분에서 변형된 뉴클레오시드가 또한 설명되었으며(제한은 없으나, 예를 들어 미국특허 번호 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 5,118,802를 포함함), 유사하게 사용될 수 있다.
4.비-핵산 스페이서 부분
본 발명의 CIC 화합물은 핵산 부분에 공유결합된 1개 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 포함한다. 본원에서는 편의를 위해 비-핵산 스페이서 부분을 때로 간단히 "스페이서" 또는 "스페이서 부분"으로 언급한다.
스페이서는 일반적으로 분자량이 약 50 내지 약 500,000(예를 들어, 약 50내지 약 50,000), 때로 약 75 내지 약 5000, 때로 약 75 내지 500이며, 다양한 구체예에서, 이들은 1, 2, 3, 또는 3개 이상의 핵산 부분에 공유결합된다. 다양한 제제가 핵산 부분을 연결하는데 적합하다. 예를 들어, 과학 문헌에 "비-핵산 링커", "비-뉴클레오티드 링커" 또는 "원자가 플랫폼 분자"로 언급된 여러 가지 화합물이 CIC에서 스페이서로 사용될 수 있다. 스페이서가 이 스페이서의 서브유닛이나 일부로서 특성 성분(또는 치환 유도체)을 포함할 때, 스페이서 부분은 특정 스페이서 성분(예를 들어, 헥사에틸렌 글리콜)을 포함한다고 한다. 예를 들어, 실시예 49에 나타낸 스페이서는 다당류 성분, 헥사에틸렌 글리콜 성분, 및 유도된 티오에테르 링커 성분을 포함하는 것으로 설명될 수 있다. 하기 설명된 대로, 어떤 구체예에서, 스페이서는 다수의 공유연결된 서브유닛들을 포함하며, 이들은 동종중합체나 이종중합체의 구조를 가질 수 있다. 주로 서브유닛은 링커, 포스포디에스테르 결합, 및/또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합에 의해 연결된다. 예를 들어 하기한 바를 참조한다. 그러한 다수 유닛을 포함하거나 그들로부터 유도된 CIC의 비-뉴클레오티드 스페이서 부분은 "화합물 스페이서"로 간주될 수 있다. 예시를 위한 것이며 제한은 아닌 한 구체예에서, CIC는 포스포디에스테르 결합 및/또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합으로 하기 화합물들 중 어떤 2개 이상(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상)을 포함하는 화합물 스페이서를 포함한다: 올리고에틸렌 글리콜 유닛(예를 들어, 트리에틸렌 글리콜 스페이서; 헥사에틸렌 글리콜 스페이서); 알킬 유닛(예를 들어, 프로필 스페이서; 부틸 스페이서; 헥실 스페이서); 분기 스페이서(예를 들어, 2-(히드록시메틸)에틸 스페이서; 글리세롤 스페이서; 트레블러 스페이서; 대칭 더블러 스페이서).
모노뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 비-핵산 스페이서의 정의 내에 포함되지 않는다는 것이 인정되지만, 핵산 부분과 인접한 비-핵산 스페이서 부분 사이에 차이점이 없을 수도 있다는 것을 배제하지는 않는다.
다양한 스페이서가 본원에 설명되는데, 이들은 예시를 위한 것으로서 제한은 아니다. 편의를 위하여 스페이서 부분(또는 스페이서 부분의 성분)은 때로 스페이서 부분 또는 성분이 유도된 화합물의 화학적 명칭(예를 들어, 헥사에틸렌 글리콜)으로 언급된다는 것이 독자에 의해 인정될 것이며, 이와 함께 CIC가 실지로는 이 화합물(들)과 핵산 부분의 콘쥬게이트를 포함한다는 것이 이해된다. 당업자에 의해 이해된 대로(그리고, 하기 더 상세히 설명된 대로), 비-핵산 스페이서는 1개 이상의 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 스페이서 부분 전구체의 커플링을 허가하여 CIC를 형성하도록 하는 반응기들을 포함하는 스페이서 부분 전구체(들)로부터 형성될 수 있으며(통상 형성됨), 보호기가 포함될 수도 있다. 스페이서 전구체 상의 반응기들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
전형적인 비-핵산 스페이서는 올리고-에틸렌 글리콜(예를 들어, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, 및 약 10, 약 20, 약 40, 약 50, 약 100 또는 약 200까지의 에틸렌 글리콜 유닛을 포함하는 다른 중합체), 알킬 스페이서(예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실 및 다른 C2-C12 알킬 스페이서, 예를 들어 통상 C2-C10 알킬, 가장 흔히 C2-C6 알킬), 글리세롤, 펜타에리트리톨, 1,3,5-트리히드록시시클로헥산 또는 1,3-디아미노-2-프로판올로부터 유도된 대칭 또는 비대칭 스페이서(예를 들어, 본원에 설명된 대칭 더블러 및 트레블러 스페이서 부분). 선택적으로 이들 스페이서 성분은 치환된다. 예를 들어, 당업자에게 잘 이해된 대로, 글리세롤 및 1,3-디아미노-2-프로판올은 1, 2 및/또는 3 위치에서 치환될 수 있다(예를 들어, 탄소에 부착된 1개 이상의 수소를 하기 기재된 기들 중 1개로 대체). 유사하게, 펜타에리트리톨은 메틸렌 위치들 중 어느 위치나 전 위치에서 하기 설명된 기들 중 어느 것으로 치환될 수 있다. 치환기는 알콜, 알콕시(메톡시, 에톡시, 및 프로폭시 같은), 직쇄 또는 분기쇄 알킬(C1-C12 알킬 같은), 아민, 아미노알킬(아미노 C1-C12 알킬 같은), 포스포라미다이트, 인산염, 포스포라미데이트, 포스포로디티오에이트, 티오인산염, 히드라지드, 히드라진, 할로겐(F, Cl, Br 또는 I 같은), 아미드, 알킬아미드(아미드 C1-C12 알킬 같은), 카르복실산, 카르복실산 에스테르, 카르복실산 무수물, 카르복실산 할로겐화물, 에테르, 술포닐 할로겐화물, 이미데이트 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아테이트, 할로포르메이트, 카르보디이미드 애덕트, 알데히드, 케톤, 술프히드릴, 할로아세틸, 알킬 할로겐화물, 알킬 술폰산염, NR1R2(여기서, R1R2는 -C(=O)CH=CHO(=O)(말레이미드)이다), 티오에테르, 시아노, 당(만노스, 갈락토스 및 글루코스 같은), α,β-불포화 술폰을 포함한다.
한 구체예에서, 스페이서는 1개 이상의 무염기 뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 염기를 결여하지만, 당과 인산염 부분은 갖고 있는)를 포함할 수 있다. 전형적인 무염기 뉴클레오티드는 1'2'-디옥시리보스, 1'-디옥시리보스, 1'-디옥사라비노스 및 그들의 중합체를 포함한다.
스페이서는 본원에 설명된 비-핵산 성분의 이종체 또는 동종체 올리고머 및 중합체를 포함할 수 있다(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합, 또는 달리 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디술피드, 포스포라미데이트, 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트 또는 다른 결합에 의해 연결된). 예를 들어, 한 구체예에서, 스페이서 부분은 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합을 통해 HEG(예를 들어, C-94 참조)와 같은 올리고에틸렌 글리콜에 콘쥬게이트된 분기 스페이서 성분(예를 들어, 글리세롤)을 포함한다. 다른 예는 HEG와 같은 올리고에틸렌 글리콜에 콘쥬게이트된 다가 스페이서 성분을 포함하는 스페이서이다.
다른 적합한 스페이서는 치환 알킬, 치환 폴리글리콜, 선택적으로 치환된 폴리아민, 선택적으로 치환된 폴리알콜, 선택적으로 치환된 폴리아미드, 선택적으로 치환된 폴리에테르, 선택적으로 치환된 폴리이민, 선택적으로 치환된 폴리포스포디에스테르(폴리(1-포스포-3-프로판올) 같은) 등을 포함한다. 선택적 치환기는 알콜, 알콕시(메톡시, 에톡시, 및 프로폭시 같은), 직쇄 또는 분기쇄 알킬(C1-C12 알킬 같은), 아민, 아미노알킬(아미노 C1-C12 알킬 같은), 포스포라미다이트, 인산염, 티오포스페이트, 히드라지드, 히드라진, 할로겐(F, Cl, Br 또는 I 같은), 아미드, 알킬아미드(아미드 C1-C12 알킬 같은), 카르복실산, 카르복실산 에스테르, 카르복실산 무수물, 카르복실산 할로겐화물, 에테르, 술포닐 할로겐화물, 이미데이트 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아테이트, 할로포르메이트, 카르보디이미드 애덕트, 알데히드, 케톤, 술프히드릴, 할로아세틸, 알킬 할로겐화물, 알킬 술폰산염, NR1R2(여기서, R1R2는 -C(=O)CH=CHO(=O)(말레이미드)이다), 티오에테르, 시아노, 당(만노스, 갈락토스 및 글루코스 같은), α,β-불포화 카르보닐, 알킬 머큐리알, α,β-불포화 술폰을 포함한다.
다른 적합한 스페이서는 페닐 또는 시클로헥실 고리를 함유하는 것들과 같은, 다고리 분자를 포함할 수 있다. 스페이서는 폴리에테르, 예를 들어 폴리포스포프로판디올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 2작용기 다고리 분자, 예들 들어 2작용기 펜탈렌, 인덴, 나프탈렌, 아줄렌, 헵탈렌, 비페닐렌, 비대칭-인다센, 대칭-인다센, 아세나프탈렌, 플루오렌, 페날렌, 페나트렌, 안트라센, 플루오란텐, 아세페나트릴렌, 아세안트릴렌, 트리페닐렌, 피렌, 크리센, 나프타센, 티안트렌, 이소벤조푸란, 크로멘, 크산텐, 페노크사티인일 수 있으며, 이들은 치환 또는 변형될 수 있고, 또는 폴리에테르와 다고리 분자의 조합일 수도 있다. 다고리 분자는 C1-C5 알킬, C6 알킬, 알케닐, 히드록시알킬, 할로겐 또는 할로알킬기로 치환 또는 다-치환될 수 있다. 질소-함유 폴리헤테로고리 분자(예를 들어, 인돌리진)는 전형적으로 적합한 스페이서가 아니다. 또한, 스페이서는 글리세롤 또는 펜타에리트리톨 같은 폴리알콜일 수 있다. 한 구체예에서, 스페이서는 (1-포스포프로판)3-포스페이트 또는 (1-포스포프로판)4-포스페이트(테트라포스포프로판디올 및 펜타포스포프로판디올이라고도 함)을 포함한다. 한 구체예에서, 스페이서는 유도 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민(EDDA)를 포함한다.
CIC에 유용한 비-핵산 스페이서의 다른 예들은 다음 문헌들에 설명된 "링커"를 포함한다:
적합한 스페이서 부분은 CIC에 전하 및/또는 소수성을 부여하고, CIC에 유리한 약물동력학 특성(예를 들어, 개선된 안정성, 혈액에서의 더 긴 체류시간)을 부여하며, 및/또는 특정 세포 또는 기관에 대한 CIC의 표적화를 가져올 수 있다. 스페이서 부분을 선택 또는 변형하여 원하는 약물동력학 특성, 특정한 면역반응의 유도, 또는 원하는 투여 방식(예를 들어, 경구 투여)에 대한 적합성에 대해 CIC를 맞춤 제작할 수 있다.
1개 이상의 스페이서 부분을 포함하는 CIC에서 스페이서들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, CIC에 있는 비-핵산 스페이서 부분 전부는 동일한 구조를 가진다. 한 구체예에서, CIC는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6개 이상의 상이한 구조를 갖는 비-핵산 스페이서 부분을 포함한다.
본 발명의 어떤 고찰된 구체예에서, CIC의 스페이서 부분은 어떤 구조를 배제하도록 한정된다. 따라서, 본 발명의 어떤 구체예에서, 스페이서는 무염기 뉴클레오티드 또는 무염기 뉴클레오티드들의 중합체 이외의 다른 것이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 스페이서는 올리고(에틸렌글리콜)(예를 들어, HEG, TEG 등) 또는 폴리(에틸렌글리콜) 이외의 다른 것이다. 어떤 구체예에서, 스페이서는 C3 알킬 스페이서 이외의 다른 것이다. 어떤 구체예에서, 스페이서는 알킬 또는 치환 스페이서 이외의 다른 것이다. 어떤 구체예에서, 스페이서는 폴리펩티드 이외의 다른 것이다. 따라서, 어떤 구체예에서, 면역원성 분자, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩티드는 스페이서 부분의 성분으로 적합하지 않다. 그러나, 하기 논의된 대로, 어떤 구체예에서는 CIC가 "단백질성 CIC"인 것, 즉 폴리펩티드(즉, 아미노산의 올리고머 또는 중합체)를 포함하는 스페이서 부분을 포함하는 것이 고찰된다. 예를 들어, 하기 논의된 대로, 어떤 구체예에서, 폴리펩티드 항원이 다수 핵산 부분이 콘쥬게이트되는 플랫폼(다가 스페이서)으로 사용될 수 있다. 그러나, 어떤 구체예에서, 스페이서 부분은 단백질성이 아니며, 및/또는 항원이 아니다(즉, CIC로부터 분리된 경우 스페이서 부분이 항원이 아니다).
적합한 스페이서 부분은 그들의 한 성분인 CIC를 수용액(예를 들어, PBS, pH 7.0)에서 불용성으로 만들지 않는다. 따라서, 스페이서의 정의에는 마이크로캐리어 또는 나노캐리어가 배제된다. 더하여, 도데실 스페이서(용해도<5mg/ml, 디알콜 전구체 1,12-디히드록시도데칸으로서 측정되었을 때) 같은 낮은 용해도를 갖는 스페이서 부분은 그것이 CIC의 친수성 및 활성을 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 바람직하게, 스페이서 부분은, 예를 들어 디알콜 전구체로서 측정되었을 때, 5mg/ml를 훨씬 넘는(예를 들어, 적어도 약 20mg/ml, 적어도 약 50mg/ml 또는 적어도 약 100mg/ml) 용해도를 가진다. 수용해도를 시험하는데 사용된 스페이서 부분의 형태는 일반적으로 그것과 가장 밀접하게 관련된 비활성화되고 비보호된 스페이서 전구체 분자이다. 예를 들어, C-19는 C-1 및 C-12 위치에 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 갖는 도데실기를 포함한 스페이서 부분을 함유함으로써 이 스페이서 부분과 핵산 부분을 연결한다. 이 경우에 도데실 스페이서인 1,12-디히드록시도데칸의 디알콜 버전의 수용해도가 시험되었으며 5mg/ml 미만으로 밝혀졌다. 그들의 디알콜 전구체로서 시험되었을 때 더 높은 수용해도를 갖는 스페이서는 더욱 면역자극성인 CIC를 가져온다. 이들 더 높은 수용해도 스페이서는 제한은 없으나 프로판-1,3-디올; 글리세롤; 부탄-1,4-디올; 펜탄-1,5-디올; 헥산-1,6-디올; 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜 및 HEG를 포함한다.
A.하전된 멀티유닛 스페이서 부분
CIC의 전하는 인산염, 삼인산염, 또는 핵산 부분에 있는 다른 기들 뿐만 아니라 비-핵산 부분에 있는 기들에 의해 부여될 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 비-핵산 스페이서 부분은 순 전하를 지닌다(예를 들어, pH 7에서 측정했을 때 순 양전하 또는 순 음전하). 한 유용한 구체예에서, CIC는 순 음전하를 가진다. 어떤 구체예에서, CIC에 있는 스페이서 부분의 음전하는 본원에서 설명된 스페이서 서브유닛을 유도하여 그것의 전하를 증가시킴으로써 증가된다. 예를 들어, 글리세롤은 2개 핵산 부분에 공유결합될 수 있으며, 남은 알콜이 활성 포르포라미다이트와 반응된 후, 산화 또는 황화되어 인산염 또는 삼인산염을 각각 혈성할 수 있다. 어떤 구체예에서, CIC에 있는 비-핵산 스페이서 부분에 의해 부여된 음전하(즉, 1개 이상의 스페이서가 있을 때의 전하들의 합)은 CIC의 핵산 부분에 의해 부여된 음전하보다 더 크다. 전하는 분자식을 기초로 계산될 수 있거나, 또는 실험적으로, 예를 들어 모세관 전기영동에 의해 결정될 수 있다(Li 편저 1992, Capillary Electrophoresis, Principles, Practice and Application, Elsevier Science Publ-ishers, 네덜란드 암스테르담, pp 202-206).
상기 주지된 대로, 적합한 스페이서는 본원에 설명된 것들과 같은, 통상 비-뉴클레오티드 "링커"로 언급되는 화합물을 포함해서, 그들 자체로서 스페이서로 유용한 더 작은 비-핵산(예를 들어, 비-뉴클레오티드) 화합물들의 중합체일 수 있다. 그러한 중합체(즉, "멀티유닛 스페이서")는 이종체 또는 동종체일 수 있으며, 주로 에스테르 결합(예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 연결된 단량체 유닛들(예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디디옥시리보스 등)을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 스페이서는 비-뉴클레오티드 유닛들(예를 들어, 2 내지 약 100 유닛, 또는 달리 2 내지 약 50, 예를 들어 2 내지 약 5, 또는 달리 예를 들어 약 5 내지 약 50, 예를 들어 약 5 내지 약 20)의 중합체 구조를 포함한다.
예를 들어, 멀티유닛 스페이서를 함유하는 CIC는
5'-TCGTCG-(C3)15-T
5'-TCGTCG-(글리세롤)15-T
5'-TCGTCG-(TEG)8-T
5'-TCGTCG-(HEG)4-T
을 포함하며, 여기서 (C3)15는 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 연결된 15개 프로필 링커를 의미하고; (글리세롤)15는 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 연결된 15개 글리세롤 링커를 의미하고; (TEG)8은 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 연결된 8개 트리에틸렌글리콜 링커를 의미하고, (HEG)4는 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 연결된 4개 헥사에틸렌글리콜 링커를 의미한다. 어떤 멀티유닛 스페이서는 순 음전하를 가지며, 이 음전하는, 예를 들어 에스테르-연결 단량체 유닛의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
B.다가 스페이서 부분
어떤 구체예에서, 스페이서 부분은 다가 비-핵산 스페이서 부분(즉, "다가 스페이서")이다. 이와 관련하여 사용된 다가 스페이서를 함유하는 CIC는 3개 이상의 핵산 부분에 공유결합된 스페이서를 함유한다. 다가 스페이서는 본 분야에서 때로 "플랫폼 분자"로 언급된다. 다가 스페이서는 중합체이거나 또는 비-중합체일 수 있다. 적합한 분자의 예들은 글리세롤 또는 치환 글리세롤(예를 들어, 2-히드록시메틸 글리세롤, 레불리닐-글리세롤); 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타시클로덱스트린, 1,3,5-트리히드록시시클로헥산, 펜타에리트리톨 및 펜타에리트리톨 유도체, 테트라아미노펜타에리트리톨, 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(Cyclam), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Cyclen), 폴리에틸렌이민, 1,3-디아미노-2-프로판올 및 치환 유도체(예를 들어, "대칭 더블러"), [프로필옥시메틸]에틸 화합물(예를 들어, 트레블러), 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 예를 들어 소위 말하는 "스타PEG" 및 "bPEG"(예를 들어, Gnanou 등 1988, Makromol. Chem. 189:2885; Rein 등, 1993, Acta Polymer 44:225, Merrill 등, 미국특허 번호 5,171,264; Shearwater Polymers Inc., 알라바마 헌트스빌, 참조), 덴드리머 및 다당류를 포함한다.
덴드리머는 본 분야에 알려져 있으며, 일반적으로 다작용기 단량체들의 단계적 또는 반복 반응에 의해 분기 구조를 얻음으로써 제조된 구형 분자로 화학적으로 정의된다(예를 들어, Tomalia 등, 1990, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-75 참조). 다양한 덴드리머가 알려져 있으며, 예를 들어 아민-말단 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민 및 폴리프로필렌이민 덴드리머가 있다. 본 발명에 유용한 전형적인 덴드리머는 미국특허 번호 4,587,329; 5,338,532; 및 6,177,414에 설명된 것들과 같은 "덴스 스타" 중합체 또는 "스타버스트" 중합체를 포함하며, 소위 말하는 "폴리(아미도아민)("PAMAM") 덴드리머도 포함된다. 본 발명 내에서 사용하기 적합한 또 다른 다량체 스페이서 분자는 화학적으로 정의된 비-중합체 원자가 플랫폼 분자들이며, 예를 들어 미국특허 번호 5,552,391; 및 PCT 출원 PCT/US00/15968(WO 00/75105); PCT/US96/09976(WO 96/40197), PCT/US97/10075(WO 97/46251); PCT/US94 /10031(WO 95/07073); 및 PCT/US99/29339(WO 00/34231)에 개시된 것들이다. 많은다른 적합한 다가 스페이서가 사용될 수 있으며, 당업자에게 공지될 것이다.
핵산 부분과 플랫폼 분자의 콘쥬게이션은 다수 방식으로 달성될 수 있으며, 전형적으로 하나 이상의 교차연결제와, 핵산 부분 및 플랫폼 분자 상의 작용기들을 수반한다. 연결기가 표준 합성화학 기술을 사용하여 플랫폼에 부가될 수 있다. 연결기는 표준 합성기술을 사용하여 핵산 부분에 부가될 수 있다.
다양한 원자가를 갖는 다가 스페이서가 본 발명의 실시에서 유용하며, 다양한 구체예에서 CIC의 다가 스페이서는 약 3 내지 약 400 핵산 부분, 때로 약 100 내지 약 500, 때로 약 150 내지 약 250, 때로 약 3 내지 200, 때로 3 내지 100, 때로 3 내지 50, 주로 3 내지 10, 및 때로 400개 이상의 핵산 부분에 결합된다. 다양한 구체예에서, 다가 스페이서는 10 이상, 25 이상, 50 이상, 100 이상 또는 500 개 이상의 핵산 부분(이들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다)에 콘쥬게이트된다. CIC가 다가 스페이서를 포함하는 어떤 구체예에서, 본 발명이 약간 상이한 분자 구조들을 갖는 CIC들의 집단을 제공한다는 것이 인정될 것이다. 예를 들어, CIC가 덴드리머, 다당류 또는 높은 원자가를 갖는 다른 다가 스페이서를 사용하여 제조될 때, 다소 이종성인 분자 혼합물, 즉 다가 스페이서 부분에 결합된 상이한 수(결정가능한 범위 내이거나 또는 주로 그 범위 내)의 핵산 부분을 포함하는 분자들의 혼합물이 생성된다. 덴드리머, 다당류 등이 다가 스페이서 요소로 사용될 때, 핵산 부분은 이 요소(예를 들어, 덴드리머)에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, CIC는 올리고에틸렌글리콜 요소를 통해 덴드리머에 결합된 핵산 부분을 포함할 수 있다(이 경우, 덴드리머 + 올리고에틸렌글리콜이 스페이서 부분을 구성한다). 핵산 부분은 상기 §III(1)B에 설명된 대로, 1개 이상의 스페이서 부분에 콘쥬게이트될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
핵산 부분에의 연결을 허용하도록 유도된 다당류가 CIC에서 다가 스페이서로 사용될 수 있다. 적합한 다당류는 자연발생 다당류 또는 합성 다당류이다. 전형적인 다당류는, 예를 들어 덱스트란, 만닌, 키토산, 아가로스, 및 녹말을 포함한다. 만닌이 사용될 수 있는 것은, 예를 들어 단핵세포 및 폐포대식세포와 같은 면역 관련 세포 타입 상에 만닌(만노스) 수용체가 있고, 그래서 다당류 스페이서 부분이 특정 세포 타입을 표적화하는데 사용될 수 있기 때문이다. 한 구체예에서 다당류는 교차연결된다. 한 적합한 화합물은 에피클로로히드린-교차연결 수크로스(예를 들어, FICOLL)이다. FICOLL은 수크로스와 에피클로로히드린을 교차연결하여 고도로 분기된 구조를 가져옴으로써 합성된다. 예를 들어, 실시예 49에 나타낸 대로, 아미노에틸카르복시메틸-피콜(AECM-피콜)이 Inman, 1975, J. Imm. 114-704-709의 방법으로 제조될 수 있다. 다당류를 포함하는 CIC에서 핵산 부분의 수는 CIC(예를 들어, 다가 CIC)에 대해 본원에 설명된 어떤 범위일 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서, 다당류는 약 150 내지 약 250 핵산 부분을 포함한다. 다음에, AECM-피콜은 6-말레이미도 카프로산 아실 N-히드록시숙신이미드 에스테르 같은 이종 2작용기 교차연결제와 반응된 후 티올-유도 핵산 부분과 콘쥬게이트될 수 있다(예를 들어, Lee 등, 1980, Mol. Imm. 17:749-56 참조). 다른 다당류들도 유사하게 변형될 수 있다.
5.CIC의 합성
루틴한 방법을 사용하여 CIC를 제조하는 것은 당업자의 능력 범위일 것이며, 본 명세서 및 본 분야의 지식에 의해 안내될 것이다. 핵산 부분(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 및 변형 올리고뉴클레오티드)를 제조하는 기술은 공지의 기술이다. 핵산 부분은 제한은 없으나 효소적 방법 및 화학적 방법, 그리고 효소와 화학적 접근법의 조합을 포함하는 기술들을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 함유하는 DNA 또는 RNA는 3'-단부에서 고체 지지체에 부착된 성장중인 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록시기에 적합한 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 연속 커플링킨 후, 중간체인 아인산염 트리에스테르를 인산염 트리에스테르로 산화시킴으로써 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 합성을 위한 유용한 고체 지지체는 Controlled Pore Glass(Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터시티), 폴리스티렌 비드 매트릭스(Primer Support, Amersham Pharmacia, 뉴저지 피스카타웨이), 및 TentGel(Rapp Polymere GmbH, 독일 튜빙겐)을 포함한다. 일단 원하는 올리고뉴클레오티드 서열이 합성되면, 올리고뉴클레오티드는 지지체로부터 제거되고, 인산염 트리에스테르기가 인산염 디에스테르로 탈보호되며, 뉴클레오시드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기들을 사용하여 탈보호된다.
예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 함유하는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드(핵산 부분)은 일반적으로 다음 단계들의 반복에 의해 합성된다: a) 3'-고체 지지체-결합 뉴클레오시드 또는 핵산의 5'-히드록실기로부터 보호기의 제거, b) 활성 뉴클레오시드 포스포라미다이트와 5'-히드록시기의 커플링, c) 아인산염 트리에스테르를 인산염 트리에스테르로 산화, 및 d) 미반응된 5'-히드록실기의 캡핑. 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 DNA 또는 RNA는 산화 단계가 황화 단계로 대체되는 것을 제외하고는 상기 설명된 대로 제조된다. 일단 원하는 올리고뉴클레오티드 서열이 합성되면, 올리고뉴클레오티드는 지지체로부터 제거되고, 인산염 트리에스테르기가 인산염 디에스테르로 탈보호되며, 뉴클레오시드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기들을 사용하여 탈보호된다. 예를 들어, Beaucage(1993) "Oligodeoxy-ribonucleotide Synthesis": PROTOCOLS FOROLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS, SYNTHE-SIS AND PROPERTIES(Agrawal 편저) Humana Press, 뉴저지 토토와; Warner 등(1984) DNA 3:401; Tang 등 (2000) Org. Process Res. Dev. 4:194-198; Wyrzykiewica 등 (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4:1519-1522; Radhakrishna 등 (1989) J. Org. Chem. 55:4693-4699, 및 미국특허 번호 4,458,066 참조. 특이적 서열의 핵산 부분을 자동합성하도록 프로그램가능한 기계가 널리 이용될 수 있다. 예들은 Expedite 8909 자동 DNA 합성기(Perseptive Biosystem, 매사츄세츠 프라밍톤); ABI 394(캘리포니아 포스터시티, Applied Biosystems, Inc.); OligoPilot II(뉴저지 피스카타웨이, Amersham Pharmacia Biotech)를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 산-불안정 5'보호기 및 3'포스포라미다이트를 함유하는 염기-보호된 뉴클레오시드(단량체)를 사용하여 3'에서 5' 방향으로 어셈블될 수 있다. 그러한 단량체의 예들은 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호 뉴클레오시드-3'-O-(N,N-디이소프로필아미노) 2-시아노에틸 포스포라미다이트를 포함하며, 여기서 보호된 뉴클레오시드의 예들은 제한은 없으나 N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시티딘, N2-이소부트리릴구아노신, 티미딘, 및 유리딘을 포함한다. 이 경우, 사용된 고체 지지체는 3'-연결 보호된 뉴클레오시드를 함유한다. 또는, 폴리뉴클레오티드는 산-불안정 3'-보호기 및 5'-포스포라미다이트를 함유하는 염기-보호된 뉴클레오시드를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 어셈블될 수 있다. 그러한 단량체의 예들은 3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호 뉴클레오시드-5'-O-(N,N-디이소프로필아미노) 2-시아노에틸 포스포라미다이트를 포함하며, 여기서 보호된 뉴클레오시드의 예들은 제한은 없으나 N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시토신, N2-이소부트리릴구아노신, 티미딘, 및 유리딘(Glen Research, 버지니아 스터링)을 포함한다. 이 경우, 사용된 고체 지지체는 5'-연결 보호된 뉴클레오시드를 함유한다. 원형 핵산 성분은 분리되거나, 재조합 방법을 통해 합성되거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 화학적 합성은 문헌에 설명된 어떤 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Gao 등 (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029, Wang 등(1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333 참조.
핵산 부분과 스페이서 부분의 콘쥬게이션은 제조될 특정한 CIC에 따라 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 특정한 스페이서 부분을 부가하는 방법은 본 분야의 공지이며, 예를 들어 상기 인용된 참고문헌들에 설명된다. 예를 들어, Durand 등, Nucleic Acids Research 18:6353-59 (1990) 참조. 스페이서 부분과 핵산 부분 간의 공유결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디술피드, 포스포라미데이트, 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트 및 다른 결합들을 포함한 많은 종류들 중 어느 것일 수 있다. 상기 주지된 대로, 스페이서 부분 전구체는 선택적으로 핵산과의 커플링을위해 말단 활성화기로 변형될 수 있다. 활성 스페이서 부분의 예들은 도 1에서 볼 수 있으며, 이 경우 자동합성에 적합한 보호기가 부가될 수 있다. 다른 스페이서 부분 전구체들은 제한은 없으나, 예를 들어 (1) HOCH2CH20(CH2CH2O)nCH2CH2OH(여기서 n = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 또는 45 이상); (2) HOCH2CHOHCH20H; (3) HO(CH2)nOH(여기서 n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11)을 포함한다.
한 구체예에서, 단계적 방식으로 핵산 부분과의 콘쥬게이트를 허가하는 제 1 및 제 2 반응기를 포함하는 스페이서 부분 전구체가 사용되며, 여기서 제 1 반응기는 핵산의 성장중인 사슬의 말단에 효과적으로 커플링하는 특성을 가지며, 제 2 반응기는 CIC에 있는 혼합된 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드 부분의 성장중인 사슬을 단계적 방식으로 더 연장할 수 있다. 핵산 부분의 합성에 사용되는 것과 동일한 포스포라미다이트-형 화학을 사용하여 스페이서 부분(들)과 핵산 부분(들)을 조합하는 것이 주로 편리할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 CIC는 포스포라미다이트 화학을 사용하는 자동 DNA 합성기(예: Expedite 8909; Perseptive Biosystems, 매사츄세츠 프라밍톤)을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다(예를 들어, Beaucage, 1993, 상동; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 상동 참조). 그러나, 당업자는 자동 DNA 합성기에 의해 수행되는 동일한(또는 동등한) 합성 단계가 원한다면 수동으로 수행될 수도 있음을 이해할 것이다. 핵산과 스페이서 전구체 간의결과의 결합은 포스포로티오에이트 또는 포스포디에스테르 결합일 수 있다. 그러한 합성에서, 전형적으로 스페이서(또는, 다량체 스페이서를 위한 스페이서 서브유닛)의 한 단부는 4,4'-디메티옥시트리틸기로 보호되며, 나머지 단부는 포스포라미다이트기를 함유한다.
유용한 보호기 및 반응기를 갖는 다양한 스페이서가 화학적으로 이용될 수 있으며, 예를 들어 다음과 같다:
트리에틸렌 글리콜 스페이서 또는 "TEG 스페이서"9-O-(4,4'-디메톡시트리틸)트리에틸렌글리콜-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]
(Glen Research, 22825 데이비스 드라이브, 버지니아 스터링);
헥사에틸렌 글리콜 스페이서 또는 "HEG 스페이서"18-0-(4,4'-디메톡시트리틸)헥사에틸렌글리콜-1-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]
(Glen Research, 버지니아 스터링);
프로필 스페이서3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트] (Glen Research, 버지니아 스터링);
부틸 스페이서4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)부틸옥시-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]
(Chem Genes Corporation, Ashland Technology Center, 200 호머 애비뉴, 매사츄세츠 애쉬랜드);
헥실 스페이서6-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)헥실옥시-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트](Biosearch Technologies, 캘리포니아 노보토);
2-(히드록시메틸)에틸 스페이서 또는 "HME 스페이서"1-(4,4-디메톡시트리틸옥시)-3-(레불리닐옥시)-프로필옥시-2-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]; 또한, "비대칭 분기" 스페이서라고도 함 (도 2 참조)
(Chem Genes Corp., Ashland Technoklgy Center, 매사츄세츠 애쉬랜드);
"무염기 뉴클레오티드 스페이서" 또는 "무염기 스페이서"5-0-(4,4'-디메톡시트리틸 1,2-디디옥시리보스-3-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트] (Glen Research, 버지니아 스터링);
"대칭 분기 스페이서" 또는 "글리세롤 스페이서"1,3-O,O-비스(4,4'-디메톡시트리틸)글리세롤-2-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]
(Chem Genes, 매사츄세츠 애쉬랜드) (도 2 참조);
"트레블러 스페이서"(도 2 참조)2,2,2-O,O,O-트리스[3-0-(4,4-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-1-O-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트] (Glen Research, 버지니아 스터링);
"대칭 더블러 스페이서"(도 2 참조)1,3-O,O-비스[5-O-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]
(Glen Research, 버지니아 스터링);
"도데실 스페이서"12-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)도데실옥시-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트] (Glen Research, 버지니아 스터링).
이들 및 많은 다양한 다른 보호된 스페이서 부분 전구체(예를 들어, DMT 및 포스포라미다이트기 보호기들을 포함하는)들이 구입될 수 있거나, 또는 본원에 개시된 CIC들의 제조에 사용되는 루틴한 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 제조자의 지시에 따라 기기를 프로그래밍하여 원하는 순서로 핵산 단량체와 스페이서를 부가한다.
DNA 합성기에서 "인시튜" 제조된 CIC는 보호된 뉴클레오시드 및 보호된 스페이서 단량체를 필요로 하며, 이들 모두는 반응성 또는 활성화가능한 작용기를 함유한다. 스페이서 부분의 반응성 및/또는 보호된 형태는 "스페이서 전구체 성분"으로 설명될 수 있다. 스페이서 전구체에 있는 반응성기들은 커플링 후 안정한 결합을 형성하며, 스페이서 전구체 상의 보호기들은 CIC 중의 결과의 스페이서 부분에서 제거된다는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다. 보호기는 일반적으로 CIC의 단계적 합성 동안 제거되어, 그 자리에서의 반응을 허락한다. 추가 반응기 상에 보호기가 있는 경우, 보호기는 CIC의 단계적 합성 후에 제거된다(C-25를 제조하는데 사용된, 도 2의 구조 3에 나타낸, 스페이서 전구체 상의 레불리닐기와 같은).
추가 반응성 작용기가 없는 스페이서 전구체의 예는 18-0-(4,4'-디메톡시트리틸)헥사에틸렌글리콜-1-0-[(2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트]이며, 이것은 보호기 4,4'-디메톡시트리틸기, 및 반응기 (2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트기를 함유한다. DNA 합성기에서 포스포라미다이트 화학을 사용하여 CIC를 제조하는 동안, 스페이서 전구체의 (2-시아노에틸) N,N-디이소프로필포스포라미다이트기는 1H-테트라졸과 같은 약산에 의해 활성화되고, 뉴클레오염기-보호 핵산 부분의 자유 5'-히드록실과 반응되어 아인산염 트리에스테르를 형성한다. 다음에, 아인산염 트리에스테르기는 안정한 포스포트리에스테르 또는 포스포로티오에이트 트리에스테르기로 각각 산화되거나 황화된다. 결과의 트리에스테르기는 나머지 CIC 합성에 안정하며, 최종 탈보호 때까지 그 형태로 유지된다. 다음 핵산 부분의 일부가 될 또 다른 스페이서 전구체 또는 활성화된 뉴클레오시드 단량체를 커플링하기 위해서, 스페이서 전구체 상의 4,4'-디메톡시트리틸기가 제거된다. 커플링 및 산화나 황화 후, 이 기는 또 각각 안정한 포스포트리에스테르 또는 포스포티오에이트 트리에스테르기로 된다. 일단 보호된 CIC가 완전히 어셈블되면, CIC는 고체 지지체로부터 절단되고, 포스포트리에스테르 또는 포스포로티오에이트 트리에스테르기 상의 시아노에틸기가 제거되며, 뉴클레오염기 보호가 제거된다. 이 예에서, CIC는 핵산 부분과의 안정한 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합을 포함하는 스페이서 부분을 함유한다. 스페이서 전구체의 반응성 포스포라미다이트기와 보호된 히드록실기는 모두 스페이서 부분에서 안정한 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 결합으로 전환된다. 스페이서의 각 단부의 반응이 독립적일 수 있기 때문에, 한 결합은 포스포디에스테르이고 나머지 결합은 포스포로티오에이트 디에스테르일 수 있거나, 또는 이들의 어떤 조합일 수도 있다. 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트, 및 포스포라미데이트와 같은 다른 인산염 변형을 갖는 CIC들이 또한 적합한 반응기, 정확한 보호 시약, 및 결합 종류에 맞게 디자인된 프로토콜을 사용하여 이 방식으로 제조될 수 있다. 이들 프로토콜은 변형 인산염 결합을 갖는 핵산 부분을 제조하는데 대해 설명된 것들과 유사하다.
포스포라미다이트 화학의 사용이 어떤 CIC의 제조에 편리하지만, 본 발명의CIC는 어떤 특정한 합성 또는 제조 방법에 의해 제조된 화합물에 제한되지 않는다. 예를 들어, (제한은 없으나) 히드라진 또는 말레이미드와 같은, DNA 합성 및 탈보호 조건과 양립할 수 없는 기들을 함유하는 핵산 부분은, 아미노 링커를 함유하는 핵산 부분과, 적합한 이종 2작용기 교차연결 시약, 예를 들어 SHNH(숙신이미딜 히드라지늄니코티네이트) 또는 술포-SMCC(술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]-시클로헥세임-1-카르복실레이트)와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
단백질, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 소분자를 다양한 조합으로 콘쥬게이트하는 방법은 문헌에 설명되며, 반응성 연결기를 함유하는 핵산 부분과 스페이서 부분 전구체의 콘쥬게이션을 달성하도록 적합하게 될 수 있다. 예를 들어 Bio-conjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, Inc. 캘리포니아 샌디에고, 1996 참조. 어떤 구체예에서, 핵산 부분(들)이 합성되고, 반응성 연결기(예를 들어, 아미노, 카르복실레이트, 티오, 디술피드 등)이 표준 합성화학 기술을 사용하여 부가된다. 반응성 연결기(이것은 결과의 스페이서 부분의 일부를 형성하는 것으로 여겨진다)는 추가 비-핵산 화합물(예를 들어, 제한은 없으나 상기 §4에 열거된 화합물)과 콘쥬게이트되어 스페이서 부분의 일부를 형성한다. 반응성 연결기는 본 분야에 공지된 여러 가지 시약을 사용하는 핵산 합성에 대한 표준 방법을 사용하여 핵산에 부가된다. 예들은 보호된 아미노기, 카르복실레이트기, 티올기, 디술피드기, 알데히드기, 디올기, 디엔기 및 포스포라미다이트기를 함유하는 시약들을 포함한다. 일단 이들 화합물이 활성화 포스포라미다이트기를 통해 핵산에 결합되고 탈보호되면, 그들은 아미노, 카르복실레이트, 알데히드, 디올, 디엔 또는 티올 반응성을 갖는 핵산을 제공한다. 반응성 링커기를 함유하는 핵산 부분과 반응기를 함유하는 스페이서 부분 전구체를 콘쥬게이트하기 위한 반응기의 예들을 하기 나타낸다.
핵산 반응기 스페이서 전구체 반응기 형성된 안정한 결합
티올 말레이미드, 할로아세틸 티오에테르
말레이미드 티올 티오에테르
티올 디술피드 피리딘 디술피드
디술피드 피리딘 티올 디술피드
아민 NHS 또는 다른 활성 에스테르 아미드
아민 카르복실레이트 아미드
카르복실레이트 아민 아미드
알데히드, 케톤 히드라진, 히드라지드 히드라진, 히드라지드
히드라진, 히드라지드 알데히드, 케톤 히드라진, 히드라지드
디엔 디에노필 지방족고리 또는
헤테로고의
반응성 연결기와 스페이서 전구체가 반응하여 안정한 결합을 형성하고, 2개(또는 이상의) 핵산 부분들 사이의 전체 원자군이 스페이서 부분으로 정의된다. 예를 들어, 포스포로티오에이트기를 통해 핵산 부분에 연결된 메르캅토헥실기를 갖는 합성된 핵산 부분은 1개(또는 이상의) 말레이미드기(들)을 함유하는 스페이서 전구체와 반응될 수 있으며, 이로써 티오에티르 결합(들)을 형성한다. 이 CIC의 스페이서 부분은 핵산 부분 상의 링커로부터의 포스포로티오에이트기와 헥실기, 새로운 티오에테르 결합, 및 스페이서 전구체의 일부였던 스페이서의 나머지를 포함한다.
선형 CIC가 이들 콘쥬게이션 전략을 사용하여 만들어질 수 있지만, 이들 방법은 분기 CIC의 제조에 가장 흔히 적용된다. 추가로, 스페이서 전구체 분자는 1종 이상의 핵산 부분(예를 들어, 상이한 서열 모티프)을 부가하기 위해서 몇몇 직교 반응기들을 사용하여 제조될 수 있다.
한 구체예에서, 1종 이상의 핵산 부분에 콘쥬게이트된 다가 스페이서를 갖는 CIC가 제조된다. 예를 들어, 2개의 말레이미드기(이것은 티올-함유 폴리뉴클레오티드와 반응할 수 있다)를 함유하는 플랫폼, 및 2개의 활성화 에스테르기(이것은 아미노-함유 핵산과 반응할 수 있다)가 설명되었다(예를 들어, PCT/US94/10031, WO 95/07073으로 공개, 참조). 이들 2개의 활성화기는 서로 독립적으로 반응될 수 있다. 이것은 각 서열은 2개의 각 서열, 총 4개의 핵산 부분을 함유하는 CIC를 가져올 것이다.
또한, 2개의 상이한 핵산 서열을 함유하는 다가 스페이서를 갖는 CIC가 상기 설명된 대칭 분기 스페이서, 및 종래의 포스포라미다이트 화학(예를 들어, 수동 또는 자동 방법을 사용하는)을 사용하여 제조될 수 있다. 대칭 분기 스페이서는 포스포라미다이트기 및 동시에 제거되는 동일한 2개의 보호기를 함유한다. 한 접근법에서, 예를 들어 제 1 핵산이 합성되어 대칭 분기 스페이서에 커플링되는 동시에 보호기가 스페이서로부터 제거된다. 다음에, 2개의 추가 핵산(동일한 서열의)이 스페이서 상에 합성된다(각 단계에서 1개 핵산 부분의 합성에 사용된 시약량의 2배를 사용하여). 이 과정은 하기 실시예 15에 상세히 설명된다.
유사한 방법을 사용하여 상이한 핵산 부분들(하기에서 핵산 I, II 및 III로 언급됨)을 다가 플랫폼(예를 들어, 비대칭 분기 스페이서)에 연결할 수 있다. 이것은 자동 DNA 합성기를 사용하여 가장 편리하게 수행된다. 한 구체예에서, 비대칭 분기 스페이서는 포스포라미다이트기 및 독립적으로 제거될 수 있는 2개의 직교 보호기를 함유한다. 먼저, 핵산 I가 합성된 후, 비대칭 분기 스페이서가 핵산 I에 커플링되고, 보호기들 중 1개의 선택적 제거 후에 핵산 II가 부가된다. 핵산 II가 탈보호되고 캡핑된 후, 스페이서 상의 나머지 보호기가 제거된다. 마지막으로, 핵산 III가 합성된다. 이 과정은 하기 실시예 17에 상세히 설명된다.
예를 들어, 핵산 부분과 플랫폼 분자를 연결하는데 길이가 변할 수 있는 친수성 링커가 유용하다. 여러 가지 적합한 링커가 알려져 있다. 적합한 링커는 제한은 없으나 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 그러한 링커는 식 R1S(CH2CH20)nCH2CH20(CH2)mCO2R2(여기서, n = 0 내지 200, m = 1 또는 2, R1= H 또는 트리틸과 같은 보호기, R2= H 또는 알킬 또는 아릴, 예를 들어 4-니트로페닐 에스테르)을 포함한다. 이들 링커는 할로아세틸, 말레이미드 등과 같은 티올 반응기를 함유하는 분자를, 아미드 결합에 의한 아미드기를 함유하는 제 2 분자에, 티오에테르를 통해 연결하는데 유용하다. 부착 순서는 변할 수 있으며, 즉 티오에테르 결합이 아미드 결합이 형성되기 전에 또는 그 후에 형성될 수 있다. 다른 유용한 링커는 Sulfo-SMCC(술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]-시클로헥산-1-카르복실레이트 Pierce Chemical Co. 제품 22322; Sulfo-EMCS(N-[ε-말레이미도카프로일옥실 술포숙신이미드 에스테르 Pierce Chemical Co. 제품 22307; Sulfo-GMBS(N-[γ-말레이미도부티릴옥시]술포숙신이미드 에스테르 Pierce Chemical Co.제품 22324 (Pierce Chemical Company, 일리노이 락포드), 및 일반식 말레이미도-R-C(O)NHS 에스테르(여기서, R = 알킬, 고리 알킬, 에틸렌 글리콜의 중합체 등)의 유사한 화합물을 포함한다.
핵산 부분을 다가 스페이서에 공유결합시키는 특히 유용한 방법은 상기 인용된 참고문헌 및 실시예들에 설명된다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드(들)와 화합물을 공유결합시킴으로써, 핵산 부분과 스페이서 부분 영역을 포함하고, 면역조절 활성을 갖는 키메라 화합물을 가져옴에 의한, 포유류에서 면역반응을 조절하는데 유용한 CIC를 제조하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 핵산 영역은 본원에 설명된 어떤 핵산 부분의 구조 및 서열을 가질 수 있으며, 스페이서 영역은 본원에 설명된 어떤 스페이서 부분의 구조를 가질 수 있다. 주로, 1단계 이상의 결합 단계가 있으며, 예를 들어, 결합 단계는 적어도 1회 반복되어 1 또는 2개의 스페이서에 공유결합된 2개의 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 주로 적어도 2회 또는 3회 반복된다. 이 방법은 CIC와 제약학적으로 허용되는 부형제를 조합하여 조성물을 형성하는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, 조성물은 멸균되며, 예를 들어 사람 환자에의 투여에 적합하고, 예를 들어 GMP 표준에 따라 제조 또는 조제된다. 한 구체예에서, 본원에 설명된 대로, CIC는 마이크로캐리어 및/또는 항원과 조합된다. 또한 어떤 구체예에서, 본 발명의 CIC 제제는 (i) 콜로이드상 분산 시스템, (ii) 리포솜, (iii) 마이크로캐리어, (iv) 폴리펩티드, (v) 항원, 및 (vi) 내독소 중 1가지 이상으로부터 자유롭다는 것이 고찰된다.
6.단백질성 CIC
어떤 구체예에서, 단백질 항원 또는 항원 단편과 같은 폴리펩티드가, 복수의 핵산 부분들이 직접 또는 링커를 통해 공유적으로 콘쥬게이트되어 '단백질성 CIC'를 형성하는 다가 스페이서 부분으로 사용된다. 폴리펩티드는 그에 대한 적응가능한 면역반응이 바람직한 항원 또는 면역원, 또는 캐리어(예를 들어, 알부민)일 수 있다. 전형적으로, 단백질성 CIC는 적어도 1개의, 통상 몇몇의 또는 많은 핵산 부분을 포함하며, 이것은 (a) 2 내지 7, 더욱 흔히 4 내지 7 뉴클레오티드 길이, 또는 달리 2 내지 6, 2 내지 5, 4 내지 6, 또는 4 내지 5 뉴클레오티드 길이이며, 및/또는 (b) 열등한 분리된 면역조절 활성을 가지거나, 또는 분리된 면역조절 활성을 갖지 않는다. 단백질성 CIC를 제조하는 방법은 본 명세서를 살펴본다면 당업자에게 분명할 것이다. 핵산은, 예를 들어 핵산 부분의 3' 또는 5' 단부(또는, 핵산 부분의 안쪽에 위치한 적합하게 변형된 염기에서)와 적합한 반응기(예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이것은 시토신 잔기의 N4 아미노기와 직접 반응될 수 있다)를 갖는 폴리펩티드 간의 결합을 포함하는 본 분야에 공지된 방법에 의해 폴리펩티드 스페이서 부분에 공유적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 더 이상의 예로서, 폴리펩티드는 핵산 부분에 결합된 아민, 티올, 또는 카르복실기를 통해 핵산 부분의 자유 5'-단부에 부착될 수 있다. 또는 달리, 폴리펩티드는 본원에 설명된대로 스페이서 부분에 콘쥬게이트될 수 있다. 더 이상으로, 한 단부에 보호된 아민, 티올, 또는 카르복실을 포함하는 연결기, 및 포스포라미다이트가 폴리뉴클레오티드의 히드록실기에 공유적으로 부착되고 이어서 탈보호될 수 있으며, 작용기는 펩티드에 CIC를 공유적으로 부착하는데 사용될 수 있다.
7.정제
본 발명의 CIC는 고성능 액체 크로마토그래피, 전기영동법, 핵산 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 이온교환 크로마토그래피와 같은, 어떤 종래의 수단을 사용하여 정제된다. 어떤 구체예에서, CIC는 실질적으로 순수하며, 예를 들어 적어도 약 80중량%, 흔히 적어도 약 90중량%, 더욱 흔히 적어도 약 95%, 가장 흔히 적어도 약 85% 순수하다.
8.조성물
다양한 구체예에서, 본 발명의 조성물은, 선택적으로 단백질, 항원(하기 설명된) 및/또는 추가 애쥬번트와 같은 다른 면역조절제와 함께, 1개 이상의 CIC(예를 들어, 1개의 CIC 또는 2개 이상의 CIC들의 조합)을 포함한다. 본 발명의 조성물은 CIC 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. "제약학적으로 허용되는"은 캐리어, 희석제 또는 부형제가 나머지 제제 성분과 양립가능해야 하며, 수용자에게 해롭지 않아야 한다는 의미이다. 제약학적으로 허용되는 부형제는 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 멸균수, 식염수 및 인산염 완충 식염수와 같은 등장액, 및 본 분야에 공지된 다른 부형제들을 포함한다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice ofPlaarniacy(19판, 1995, Genfaavo, 편저). 애쥬번트(이것의 예는 백반이다)은 본 분야에 공지되어 있다. CIC 제제는 사이토카인 및 항체와 같은 다른 면역치료제와 함께 제조될 수 있다. 어떤 구체예에서, 조성물은, 예를 들어 사람 환자에게 투여하기에 적합하게 등장성이거나 및/또는 멸균되며, 예를 들어 GMP 표준에 따라 제조 또는 조제된다.
A.CIC/MC 복합체
CIC는 CIC/마이크로캐리어(CIC/MC) 복합체의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CIC/MC 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
CIC/MC 복합체는 마이크로캐리어의 표면에 결합된 CIC(즉, CIC는 MC 내에 캡슐화되지 않는다)를 포함하며, 바람직하게는 각 마이크로캐리어에 결합된 CIC의 다수 분자를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상이한 CIC들의 혼합물이 마이크로캐리어와 복합체화될 수 있으며, 이로써 마이크로캐리어는 1개 이상의 CIC 종들에 결합된다. CIC와 MC 간의 결합은 공유 또는 비-공유(예를 들어, 이온 및/또는 소수성 상호작용에 의해 매개된)일 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, CIC는 변형 또는 유도될 수 있으며, 마이크로캐리어의 조성물은 CIC/MC 복합체 형성에 바람직한 결합 종류를 도모하도록 선택 및/또는 변형될 수 있다.
공유결합된 CIC/MC 복합체는 본 분야에 공지된 어떤 공유 교차연결 기술을 사용하여 연결될 수 있다. 전형적으로, CIC 부분이 변형되어 추가 부분(예를 들어, 자유 아민, 카르복실 또는 술프히드릴 기) 또는 변형된(예를 들어, 포스포로티오에이트) 뉴클레오티드 염기와 결합되어, CIC 부분이 마이크로캐리어에 연결될 수 있는 자리를 제공할 것이다. 복합체의 CIC와 MC 부분들 간의 연결은 CIC의 3' 또는 5' 단부에서, 또는 CIC의 안쪽에 위치한 적합하게 변형된 염기에서 만들어질 수 있다. 또한, 마이크로캐리어는 일반적으로 그것을 통해 공유연결이 형성될 수 있는 부분들을 결합시킴으로써 변형될 수 있지만, 통상은 마이크로캐리어 상에 존재하는 작용기들이 또한 사용될 수도 있다. CIC/MC는 공유 복합체의 형성을 허가하는 조건하에서(예를 들어, 교차연결제의 존재하에 또는 CIC와의 공유결합을 형성할 활성화 부분을 포함하는 활성화된 마이크로캐리어의 사용에 의해) CIC를 마이크로캐리어와 함께 인큐베이션함으로써 형성된다.
광범한 교차연결 기술이 본 분야에 공지되어 있으며, 아미노, 카르복실 및 술프히드릴 기와 반응하는 교차링커들을 포함한다. 당업자에게 분명한 대로, 교차연결제 및 교차연결 프로토콜의 선택은 CIC 및 마이크로캐리어의 입체형태 뿐만 아니라 CIC/MC 복합체의 바람직한 최종 입체형태에 의존한다. 교차링커는 동종 2작용기 또는 이종 2작용기일 수 있다. 동종 2작용기 교차링커가 사용될 때, 교차링커는 CIC와 MC 상의 동일한 부분을 이용한다(예를 들어, 알데히드 교차링커는, CIC와 MC가 모두 1개 이상의 자유 아민을 포함하는 CIC와 MC를 공유연결하는데 사용될 수 있다). 이종 2작용기 교차링커는 CIC와 MC 상의 상이한 부분을 이용하며(예를 들어, 말레이미도-N-히드록시숙신이미드 에스테르는 CIC의 자유 술프히드릴과 MC의 자유 아민을 공유연결하는데 사용될 수 있다), 마이크로캐리어간 결합의 형성을 최소화하는 것이 바람직하다. 대부분의 경우, 마이크로캐리어의 제 1 교차연결 부분과 CIC의 제 2 교차연결 부분을 통해 교차연결하는것이 바람직하며, 이 경우 제 2 교차연결 부분은 마이크로캐리어에는 존재하지 않는다. CIC/MC 복합체를 생성하는한 바람직한 방법은, 이종 2작용기 교차연결제와 함께 인큐베이션하여 마이크로캐리어를 '활성화'시킨 후, 반응에 적합한 조건하에서 CIC와 활성화된 MC를 인큐베이션함에 의해 CIC/MC 복합체를 형성하는 것이다. 교차링커는 반응성 부분들 사이를 "스페이서" 팔로 결합시킬 수 있거나, 또는 교차링커에 있는 2개 반응성 부분이 직접 연결될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, CIC 부분은 마이크로캐리어와의 교차연결을 위한 적어도 1개의 자유 술프히드릴(예를 들어, 5'-티올 변형된 염기 또는 링커에 의해 제공된)을 포함하며, 마이크로캐리어는 자유 아민기를 포함한다. 이들 2개 기(예를 들어, 말레이미드기와 NHS-에스테르를 포함하는 교차링커)와 반응하는 이종 2작용기 교차링커, 예를 들어 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트를 사용하여 MC를 활성화시킨 후, CIC를 공유적으로 교차연결하여 CIC/MC 복합체를 형성한다.
비-공유 CIC/MC 복합체는, 통상 결합쌍이 CIC와 MC를 연결하는 것인 경우와 마찬가지로, 이온(정전기)결합, 소수성 상호작용, 수소결합, 반데르발스 인력, 또는 2가지 이상의 상이한 상호작용들의 조합을 포함한 어떤 비-공유 결합 또는 상호작용에 의해 연결될 수 있다.
바람직한 비-공유 CIC/MC 복합체는 전형적으로 소수성 또는 정전기(이온) 상호작용, 또는 그들의 조합에 의해 복합체로 된다(예를 들어, MC에 결합된 폴리뉴클레오티드와 CIC 사이의 염기쌍을 통해). 폴리뉴클레오티드 백본의 친수성으로 인해, 소수성 상호작용에 의존하여 복합체를 형성한 CIC/MC 복합체는, 일반적으로 고도로 소수성인 부분을 결합시키기 위해 복합체 중 CIC 부분의 변형을 필요로 한다. 바람직하게, 소수성 부분은 생체적합성, 면역원성이며, 조성물이 목적으로 하는 개체에서 자연발생한다(예를 들어, 포유류, 특히 사람에서 발견됨). 바람직한 소수성 부분의 예들은 지질, 스테로이드, 콜레스테롤과 같은 스테롤, 및 테르펜을 포함한다. 소수성 부분을 CIC에 연결하는 방법은, 물론 CIC의 입체형태 및 소수성 부분의 동일성에 의존할 것이다. 소수성 부분은 CIC에서 어떤 편리한 자리에 부가될 수 있는데, 바람직하게는 5' 또는 3' 단부에 부가될 수 있고; 콜레스테롤 부분이 CIC에 부가되는 경우, 콜레스테롤 부분은 종래의 화학반응을 사용하여 바람직하게 CIC의 5' 단부에 부가된다(예를 들어, Godard 등 (1995) Eur. J Biochem. 232:404-410 참조). 바람직하게, 소수성 결합에 의해 연결된 CIC/MC 복합체에 사용되는 마이크로캐리어는 오일 방울 또는 소수성 중합체와 같은 소수성 물질로부터 만들어지지만, 소수성 부분과 결합하도록 변형된 친수성 물질도 또한 이용될 수 있다. 마이크로캐리어가 리포솜이거나, 또는 루멘을 포함하는 다른 액상 마이크로캐리어일 때, CIC/MC 복합체는 MC 제조 후 CIC와 MC를 혼합함으로써 형성되며, 이로써 MC 제조 과정 동안 CIC의 캡슐화를 피할 수 있다.
정전기 결합에 의해 결합된 비-공유 CIC/MC 복합체는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 백본의 높은 음전하를 이용한다. 따라서, 비-공유결합된 CIC/MC 복합체에 사용되는 마이크로캐리어는 일반적으로 생리학적 pH(예를 들어, 약 pH 6.8-7.4)에서 양으로 하전된다. 마이크로캐리어는 본질적으로 양전하를 지닐 수 있지만, 보통 양전하를 지니지 않는 화합물로부터 만들어진 마이크로캐리어는 양전하로 되도록 유도되거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 마이크로캐리어를 제조하는데 사용된 중합체를 유도하여 1차 아민과 같은 양으로 하전된 기를 부가할 수 있다. 또는 달리, 양으로 하전된 화합물이 제조 동안에 마이크로캐리어 제제에 결합될 수 있다(예를 들어, 양으로 하전된 계면활성제가 폴리(락트산)/폴리(글리콜산) 공중합체를 제조하는 동안 사용되어, 결과의 마이크로캐리어 입자에 양전하를 부여할 수 있다). 예를 들어, 하기 실시예 28 및 34를 참조한다.
뉴클레오티드 염기쌍에 의해 연결된 비-공유 CIC/MC 복합체는 종래의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 염기쌍 CIC/MC 복합체는, 적어도 부분적으로 CIC에 상보하는 결합된, 바람직하게는 공유결합된 폴리뉴클레오티드("캡쳐 폴리뉴클레오티드")를 포함하는 마이크로캐리어를 사용하여 생성된다. CIC와 캡쳐 뉴클레오티드 사이의 상보성 세그먼트는, 바람직하게 적어도 6, 8, 10 또는 15 연속 염기쌍, 더 바람직하게 적어도 20 연속 염기쌍이다. 캡쳐 뉴클레오티드는 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해 MC에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 5' 또는 3' 단부에서 CIC에 공유결합된다.
다른 구체예에서, 결합쌍은 CIC/MC 복합체에서 CIC와 MC를 연결하는데 사용될 수 있다. 염기쌍은 수용체와 리간드, 항체와 항원(또는, 에피토프), 또는 높은 친화성(예를 들어, 약 10-8미만의 Kd)으로 결합하는 어떤 다른 결합쌍일 수 있다. 바람직한 결합쌍의 한 종류는 비오틴과 스트렙토아비딘 또는 비오틴과 아비딘이며, 이것은 매우 타이트한 복합체를 형성한다. 염기쌍을 사용하여 CIC/MC 복합체 결합을 매개할 때는, 전형적으로 공유결합에 의해, CIC는 결합쌍의 한 구성원을 갖도록 유도되고, MC는 결합쌍의 나머지 구성원을 갖도록 유도된다. 2개의 유도된 화합물의 혼합물이 CIC/MC 복합체 형성을 가져온다.
많은 CIC/MC 복합체 구체예가 항원을 포함하지 않고, 어떤 구체예는 CIC/MC 복합체 치료법이 대상으로 하는 질환이나 장애에 관련된 항원(들)을 배제한다. 더 이상의 구체예에서, CIC는 또 1개 이상의 항원 분자에 결합될 수 있다. 항원은 공유 및/또는 비-공유 상호작용을 포함한 여러 가지 방식으로 CIC/MC 복합체의 CIC 부분과 커플링될 수 있다. 또는 달리, 항원은 마이크로캐리어에 연결될 수 있다. CIC에 결합된 항원을 포함하는 CIC/MC 복합체에서 항원과 CIC 간의 연결은 본원에 개시되고 본 분야에 공지된 기술에 의해 만들어질 수 있다.
B.공동-투여된 항원
한 구체예에서, CIC는 항원과 함께 공동-투여된다. 어떤 항원도 CIC와 함께 공동-투여될 수 있으며, 및/또는 CIC 및 항원을 포함하는 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서, 항원은 알레르겐이다. 재조합 알레르겐의 예들이 표 1에 제공된다. 많은 알레르겐의 제제가 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 제한은 없으나 두드러기쑥 꽃가루 알레르겐 항원 E(Amb aI)(Rafnar 등(1991) J. Biol. Chem. 266: 1229-1236), 풀 알레르겐 Lol p 1(Tamborini 등 (1997) Eur. J Biochem. 249:886-894), 주요 먼지 진드기 알레르겐 Der pI 및 Der PII(Chua 등 (1988) J. Exp. Med. 167:175-182; Chua 등 (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129),집고양이 알레르겐 Fel d I(Rogers 등 (1993) Mol. Immunol. 30:559-568), 흰자작나무 꽃가루 Bet v1(Breiteneder 등 (1989) EMBO J. 8:1935-1938), 일본 삼나무 알레르겐 Cry j1 및 Cry j2(Kingetsu 등 (2000) Immunology 99:625-629), 및 다른 나무 꽃가루로부터의 단백질 항원(Elsayed 등(1991) Scarad. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31)의 제제를 포함한다. 생체내 투여를 위한 풀 꽃가루로부터의 단백질 항원의 제제가 보고되었다.
어떤 구체예에서, 알레르겐은 식품 알레르렌이며, 제한은 없으나 땅콩 알레르겐, 예를 들어 Ara h I(Stanley 등 (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409:213-216); 호두 알레르겐, 예를 들어 Jug r I(Tueber 등 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101:807-814); 브라질 호두 알레르겐, 예를 들어 알부민(Pastorello 등 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:1021-1027); 새우 알레르겐, 예를 들어 Pen a I(Reese 등 (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:240-242); 계란 알레르겐, 예를 들어 오보뮤코이드(Crooke 등 (1997) J. Immunol. 159:2026-2032); 우유 알레르겐, 예를 들어 소 β-락토글로빈(Selo 등(1999) Clin. Exp. Allergy 29:1055-1063); 생선 알레르겐, 예를 들어 파르발부민(Van Do 등 (1999) Scand. J. Immunol. 50:619-625; Galland 등 (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706:63-71)을 포함한다. 어떤 구체예에서, 알레르겐은 라텍스 알레르겐이며, 제한은 없으나 Hev b 7(Sowka 등 (1998) Eur. J. Biochem. 255:213-219)을 포함한다. 표 1은 사용될 수 있는 알레르겐 리스트를 나타낸다.
어떤 구체예에서, 항원은 원생동물, 박테리아, 진균(단세포 및 다세포를 포함함), 및 바이러스 감염성 병인을 포함한 감염성 병인에 유래한다. 적합한 바이러스 항원의 예들이 본원에 설명되며 본 분야에 공지이다. 박테리아는Hemophilus influeszza, Mycobacterium tuberculosis및Bordetella pertussis을 포함한다. 원생동물 감염성 병인은 말라리아 원충,Leishmania종들,Trypanosoma종들, 및Schistosoma종들을 포함한다. 진균은Candida albicans을 포함한다.
어떤 구체예에서, 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 폴리펩티드 항원은 제한은 없으나 HIV 단백질, 예를 들어 HIV gag 단백질(제한은 없으나, 멤브레인 고정(membrane anchoring:MA) 단백질, 코어캡시드(CA) 단백질 및 뉴클레오캡시드(NC)단백질을 포함함), HIV 중합효소, 인플루엔자 바이러스 매트릭스(M) 단백질 및 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질, B형 간염 표면 항원(HBsAg), B형 간염 코어 단백질(HBcAg), 간염 e 단백질(HBeAg), B형 간염 DNA 중합효소, C형 감염 항원 등을 포함한다. 인플루엔자 백신접종을 논의하는 참고문헌들로는 Scherle 및 Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450; Scherle 및 Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128; Granoff 등 (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodi-halli 등(1997) J. viral. 71:3391-3396; Ahmeida 등(1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen 등 (1999) Vaccine 17:653-659; Govorkova 및 Smirnov Acta Virol. (1997) 41:251-257; Koide 등(1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuike 등(1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura 등 (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura 등 (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi 등 (1990) Vaccine 8:595-599이 있다. 항원 폴리펩티드의 다른 예들은 그룹- 및 서브-그룹-특이적 항원이며, 이것은 많은 감염성 병인에 대해 공지되어 있고, 제한은 없으나 아데노바이러스, 단순포진 바이러스, 유두종 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 및 천연두 바이러스를 포함한다.
많은 항원 펩티드 및 단백질이 본 분야에 알려져 있으며 이용가능하고; 여타의 것들은 종래의 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 종양 형성에 대한 면역화 또는 존재하는 종양의 치료를 위해, 면역조절 펩티드는 종양세포(살아 있거나 조사된), 종양세포 추출물, 또는 종양 항원의 단백질 서브유닛, 예를 들어 Her-2/neu, Mart1, 암종배아성 항원(CEA), 강글리오시드, 인유의 지방구(HMFG), 무친(MUC1), MAGE 항원, BAGE 항원, GAGE 항원, gp 100, 전립선 특이적 항원(PSA), 및 티로시나제를 포함할 수 있다. 면역-기초 피임법을 위한 백신은 CIC와 함께 투여되는 정액 단백질을 포함시킴으로써 형성될 수 있다. Lea 등 (1996) Biochim Biophys. Acta 1307:263.
감독 및 비활성화된 바이러스가 본원에서 항원으로 사용하기 적합하다. 이들 바이러스의 제제는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 많은 것이 상업적으로 이용될 수 있다(예를 들어, Physicians' Desk Reference (1998) 52판, Medical Economics Company, Inc.. 예로서, 소아마비 바이러스는 IPOL(Pasteur Merieux Connaught) 및 ORIMUNE(Lederle Laboratories), A형 간염 바이러스는 VAQTA(Merck), 홍역 바이러스는 ATTENUVAX(Merck), 이하선염 바이러스는 MUMPSVAX(Merok) 및 풍진 바이러스는 MERLJVAXII(Merck)로서 이용할 수 있다. 추가로, 감독 및 비활성화된 바이러스, 예를 들어 HIV-1, HIV-2, 단순포진 바이러스, B형 간염 바이러스, 로타바이러스, 사람 및 비-사람 유두종 바이러스 및 슬로우 브레인 바이러스가 펩티드 항원을 제공할 수 있다.
어떤 구체예에서, 항원은 우두, 아데노바이러스 및 카나리아 천연두와 같은, 바이러스 벡터를 포함한다.
항원은 본 분야에 공지된 정제 기술을 사용하여 그들의 공급원으로부터 분리될 수 있거나, 또는 더 편리하게는 재조합 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
항원 펩티드는 정제된 자생 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 펩티드, 가공하지 않은 단백질 추출물, 감독 또는 비활성화된 바이러스, 세포, 미생물, 또는 이러한펩티드들의 단편을 포함할 수 있다. 면역조절 펩티드는 자생이거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 본 분야에 공지된 어떤 화학적 합성법이 적합하다. 중간 정도 크기의 펩티드를 구성하기 위해 용액상 펩티드 합성을 사용하거나, 또는 펩티드의 화학적 구성을 위해서는 고체상 합성이 사용될 수도 있다. Atherton 등 (1981) Hoppe Seylers Z Physiol. Chem. 362:833-839. 또, 단백질 가수분해 효소를 이용하여 아미노산을 커플링하여 펩티드를 생성할 수도 있다. Kul-lmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. 또는 달리, 펩티드는 세포에 대한 생화학적 기계류를 사용하거나, 또는 생물학적 공급원으로부터 분리함에 의해 얻어질 수 있다. 재조합 DNA 기술이 펩티드 생성에 사용될 수 있다. Hames 등(1987) Transcription and Translation:A Practical Approach, IRL Press. 또한, 펩티드는 친화성 크로마토그래피 같은 표준 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
바람직하게 항원은 펩티드, 지질(예를 들어, 콜레스테롤을 제외한 스테롤, 지방산, 및 인지질), H 인플루엔자 백신에 사용되는 것들과 같은 다당류, 강글리오시드 및 당단백질이다. 이들은 화학적 및 효소적 방법을 사용하는 분리 및 합성을 포함한 본 분야에 공지된 몇 가지 방법을 통해 얻어질 수 있다. 어떤 경우, 많은 스테롤, 지방산 및 인지질에 대해서와 같이, 분자의 항원 부분들이 상업적으로 이용될 수 있다.
당해 조성물 및 그 조성물을 사용하는 방법에 유용한 바이러스 항원의 예는 제한은 없으나 HIV 항원을 포함한다. 이러한 항원은 제한은 없으나, gp160, gp120및 gp41(제한은 없다)을 포함하는 HIV 외피 당단백질로부터 유래된 항원들을 포함한다. HIV 유전자 및 항원에 대한 수많은 서열들이 공지되어 있다. 예로서, Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Database는 HIV 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 수집하고 관리하며 주석을 단다. 인터넷(http://hiv-web.lanl.gov/)과 연간 간행물을 통해서 이 데이타베이스에 접근할 수 있으며, Human Retroviruses and AIDS Compendium(예를 들어, 2000판)을 참조한다.
감염성 병인으로부터, 예를 들어 자생 바이러스 또는 박테리아 추출물, 감염성 병인으로 감염된 세포, 정제된 폴리펩티드, 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및/또는 합성 펩티드로부터 유래된 항원이 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 얻어질 수 있다.
CIC는 여러 가지 방식으로 항원과 조합하여 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, CIC와 항원은 서로에 관해 공간적으로 가깝게 투여된다. 하기 설명된 대로, 공간적 근접은, 콘쥬게이션, 인캡시데이션, 플랫폼에의 고정에 의한 방식 또는 표면 위에 흡착하는 방식을 포함한, 많은 방식으로 달성될 수 있다. 한 구체예에서, CIC 및 항원은 혼합물(예를 들어, 용액 상태로)로서 투여된다. 어떤 구체예에서는 CIC가 면역원 또는 항원에 콘쥬게이트되지 않는 것이 구체적으로 고찰된다.
어떤 구체예에서, CIC는 폴리펩티드, 예를 들어 항원에 연결된다. CIC 부분은, 공유 및/또는 비-공유 상호작용, 핵산 부분을 통한 방식 또는 비-핵산 스페이서 부분을 통한 방식을 포함하는 다양한 방식으로 콘쥬게이트의 항원 부분과 연결될 수 있다. 어떤 구체예에서, 결합은 제한은 없으나 티오, 아민, 카르복실레이트, 알데히드, 히드리진, 히드리존, 디술피드 등과 같은 반응기에 의한 것이다.
이 부분들 사이의 연결은 핵산 부분의 3' 또는 5' 단부에서, 또는 핵산 부분의 안쪽에 위치한 적합하게 변형된 염기에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 만일 항원이 펩티드이고 적합한 반응기(예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 함유한다면, 그것은 시토신 잔기의 N4 아미노기와 직접 반응될 수 있다. CIC에 있는 시토신 잔기의 수 및 위치에 따라 1개 이상의 잔기에서 특이적 커플링이 달성될 수 있다.
또는 달리, 본 분야에 공지된 것과 같은 변형된 올리고뉴클레오시드가 CIC의 어느 한쪽 말단, 또는 안쪽 위치에서 결합될 수 있다. 이들은 차단된 작용기를 함유할 수 있으며, 이것은 탈차단되었을 때 관심의 항원에 존재하거나 부착된 여러 가지 작용기와 반응한다.
항원이 펩티드인 경우, 콘쥬게이트의 이 부분은 고체 지지체 화학을 통해 핵산 부분 또는 스페이서 부분에 부착될 수 있다. 예를 들어, CIC의 핵산 부분은 지지체 상에서 미리 합성된 폴리펩티드 부분에 부가될 수 있다. Haralambidis 등 (1990) Nucleic Acids Res. 18:493-499; 및 Haralambidis 등 (1990) Nucleic Acids Res. 18:501-505.
또는 달리, CIC는 핵산 부분의 3'-단부에서 연장된 절단가능한 링커를 통해 고체 지지체에 연결되도록 합성될 수 있다. 지지체로부터 CIC의 화학적 절단 시, 말단 티올기 또는 말단 아미노기가 핵산 부분의 3'-단부에 남게 된다(Zuckermann 등, 1987, Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; Corey 등, 1987, Science 238:1401-1403; Nelson 등, 1989, Nucleic Acids Res. 17:1781-1794). 아미노-변형 CIC와 펩티드의 아미노기들의 콘쥬게이션은 Benoit 등 (1987) Neuromethods 6:43-72에 설명된 대로 수행될 수 있다. 티올-변형 CIC와 펩티드의 카르복실기들의 콘쥬게이션은 Sinah 등 (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press에 설명된 대로 수행될 수 있다. 또한, 덧붙여진 말레이미드를 지닌 핵산 부분 또는 스페이서와 펩티드의 시스테인 잔기의 티올 측쇄의 커플링이 설명되었다. Tung 등 (1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465.
콘쥬게이트의 펩티드 부분은, 핵산 부분 또는 스페이서에 결합되어 있는 아민, 티올, 또는 카르복실 기를 통해 핵산 부분의 자유 5'-단부에 부착될 수 있다(예를 들어, 자유 5'-단부, 3'-단부, 변형된 염기 등을 통해).
편리하게, 한 단부에 보호된 아민, 티올, 또는 카르복실을 포함하는 연결기, 및 포스포라미다이트가 CIC의 히드록실기에 공유적으로 부착될 수 있다. Agrawal 등 (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff 등 (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks 등 (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; 및 미국특허 번호 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 및 5,118,802. 이어서 탈보호되고, 아민, 티올, 및 카르복실 작용기는 펩티드에 CIC를 공유적으로 부착하는데 사용될 수 있다. Benoit 등 (1987); 및 Sinah 등 (1991).
또한, CIC-항원 콘쥬게이트는 이온결합, 소수성 상호작용, 수소결합 및/또는반데르발스 인력과 같은 비-공유 상호작용을 통해 형성될 수 있다.
비-공유연결된 콘쥬게이트는 비오틴-스트렙토아비딘 복합체와 같은 비-공유 상호작용을 포함할 수 있다. 비오티닐기는, 예를 들어 CIC의 변형된 염기에 부착될 수 있다. Roget 등 (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. 펩티드 부분에 스트펩토아비딘 부분의 결합은, 스트렙토아비딘 콘쥬게이트된 펩티드와 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드의 비-공유결합된 복합체의 형성을 허용한다.
또한, 비-공유결합은 하전된 아미노산 같은 항원 내의 잔기와 CIC를 수반하는 이온 상호작용을 통해, 또는 올리고뉴클레오티드 및 항원과 모두 상호작용할 수 있는 하전된 잔기를 포함하는 링커 부분의 사용을 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, 비-공유 콘쥬게이션은, 일반적으로 음으로 하전된 CIC와 펩티드의 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예를 들어 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리히스티딘 잔기 사이에서 일어날 수 있다.
CIC와 항원의 비-공유 콘쥬게이션은 분자의 DNA 결합 모티프를 통해 일어날 수 있으며, 이것은 그들의 자연적 리간드로서 DNA와 상호작용한다. 예를 들어, 그러한 DNA 결합 모티프는 전사 인자 및 항-DNA 항체에서 발견될 수 있다.
CIC와 지질의 결합은 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 이들 방법은 제한은 없으나, 올리고뉴클레오티드-인지질 콘쥬게이트(Yanagawa 등(1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), 올리고뉴클레오티드-지방산 콘쥬게이트(Grabarek 등(1990) Anal.Biochem. 185:131-135; 및 Staros 등(1986) Anal.Biochem. 156:220-222), 및 올리고뉴클레오티드-스테롤 콘쥬게이트의 합성을 포함한다. Boujrad 등(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.
올리고뉴클레오티드와 올리고당의 결합은 공지된 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 이들 방법은 제한은 없으나 올리고뉴클레오티드-올리고당 콘쥬게이트의 합성을 포함하며, 여기서 올리고당은 면역글로불린의 일부분이다. O'Shannessy 등 (1985) J. Applied Biochem. 7:347-355.
올리고뉴클레오티드에 펩티드 및 다른 분자들을 부착는 추가의 방법은 미국특허 번호 5,391,723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nuc-leic acids": Kricka (편저) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; 및 Geoghegan 등 (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146에서 찾을 수 있다.
CIC는 다른 방식으로 항원(들)과 가깝게 회합될 수 있다. 어떤 구체예에서, CIC와 항원은 캡슐화에 의해 가깝게 회합된다. 다른 구체예에서, CIC와 항원은 플랫폼 분자와의 결합에 의해 가깝게 회합된다. "플랫폼 분자"(또한, "플랫폼"이라고도 함)는 CIC 및 항원(들)의 부착을 허용하는 자리를 함유하는 분자이다. 다른 구체예에서, CIC 및 항원은 표면, 바람직하게는 캐리어 입자 위의 흡착에 의해 가깝게 회합된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 CIC와 제 1 항원의 근접 회합을 그 복합체가 표적에 이용될 수 있을 때까지 유지할 수 있는 캡슐화제를 사용한다(또는, 그러한 캡슐화제를 포함하는 조성물). 바람직하게, CIC, 항원 및 캡슐화제를 포함하는 조성물은 애쥬번트 수중유 에멀젼, 마이크로입자 및/또는 리포솜의 형태이다. 더 바람직하게, CIC를 캡슐화하는 애쥬번트 수중유 에멀젼, 마이크로입자 및/또는리포좀은 약 0.04㎛에서 약 100㎛까지의 크기의 입자 형태이며, 바람직하게는 다음 범위들 중 어느 것이다: 약 0.1㎛ 내지 약 20㎛; 약 0.15㎛ 내지 약 10㎛; 약 0.05㎛ 내지 약 1.00㎛; 약 0.05㎛ 내지 약 0.5㎛.
콜로이드상 분산 시스템, 예를 들어 마이크로스피어, 비드, 거대분자 복합체, 나노캡슐 및 지질-기제 시스템, 예를 들어 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀이 CIC-함유 조성물의 효과적인 캡슐화를 제공할 수 있다.
캡슐화 조성물은 광범한 성분들 중 어느 것을 더 포함한다. 이들은 제한은 없으나 백반, 지질, 인지질, 지질 멤브레인 구조(LMS), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 다른 중합체들, 예를 들어 폴리펩티드, 당단백질, 및 다당류를 포함한다.
캡슐화 성분에 적합한 폴리펩티드는 본 분야에 공지된 어떤 것을 포함하며, 제한은 없으나 지방산 결합 단백질을 포함한다. 변형 폴리펩티드는 여러 가지 변형 중 어떤 것을 함유하며, 제한은 없으나 당화, 인산화, 미리스틸화, 황산화 및 히드록실화를 포함한다. 본원에 사용된 적합한 폴리펩티드는 CIC-함유 조성물을 그들의 면역조절 활성을 보존하도록 보호하는 것이다. 결합 단백질의 예들은 제한은 없으나 소혈청 알부민(BSA) 및 완두콩 알부민과 같은 알부민을 포함한다.
다른 적합한 중합체는 제약학의 분야에 공지된 어떤 것일 수 있으며, 제한은 없으나 덱스트란, 히드록시에틸 녹말 및 다당류와 같은 자연발생 중합체, 및 합성 중합체를 포함한다. 자연발생 중합체의 예들은 단백질, 당단백질, 다당류, 덱스트란 및 지질을 포함한다. 추가의 중합체는 합성 중합체일 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 합성 중합체의 예들은 제한은 없으나 폴리알킬 글리콜(PAG), 예컨대PEG, 폴리옥시에틸화 폴리올(POP), 예컨대 폴리옥시에틸화 글리세롤(POG), 폴리트리메틸렌 글리콜(PTG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리아크릴산, 폴리에틸옥사졸린, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리아미노산, 폴리우레탄 및 폴리포스파젠을 포함한다. 또한, 합성 중합체는 선형 또는 분기, 치환 또는 비치환, 동종중합체, 공중합체, 또는 2개 이상의 상이한 합성 단량체의 블럭 공중합체일 수 있다.
본 발명의 캡슐화 조성물에 사용되는 PEG는 화학제품 공급업자로부터 구입하거나, 또는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 합성된다.
본원에 사용된 용어 "LMS"는 극성 지질의 극성 머리기가 계면의 수성상을 향하도록 정렬되어 멤브레인 구조를 형성하는 층판 지질 입자를 의미한다. LMS의 예들은 리포솜, 미셀, 코크리트(cochleates)(즉, 일반적으로 원통형 리포솜), 마이크로에멀젼, 단층판 소포, 다층판 소포 등을 포함한다.
CIC의 투여에 유용한 한 콜로이드상 분산 시스템은 리포솜이다. 리포솜-캡슐화 항원으로 면역화된 마우스에서, 리포솜은 항원에 대한 Th1-형 면역반응을 증진시키는 것으로 드러났다. Aramaki 등 (1995) Vaccine 13:1809-1814. 본원에 사용된 "리포솜" 또는 "지질 소포"는 적어도 1개이며, 가능한 1개 이상의 이중층 지질 멤브레인에 의해 결합된 작은 소포이다. 리포솜은, 제한은 없으나 지질-세제 복합체로부터 세제의 초음파 분해, 추출, 또는 제거를 포함하는, 본 분야에 공지된 어떤 기술에 의해, 인지질, 당지질, 지질, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 관련 분자들, 또는 그들의 조합으로부터 인위적으로 만들어진다. 또한, 리포솜은 선택적으로 조직 표적화 성분과 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. "지질 멤브레인" 또는 "지질 이중층"이 오로지 지질만으로 구성될 필요는 없으며, 제한은 없으나 콜레스테롤 및 다른 스테로이드, 지질-가용성 화학물질, 어떤 길이의 단백질, 및 다른 양쪽성 분자를 포함하는 어떤 적합한 다른 성분을 추가로 함유할 수 있고, 이로써 소수성 코어가 샌드위치된 두 친수성 표면을 가진 시트인, 멤브레인의 일반적 구조를 제공한다. 멤브레인 구조에 대한 일반적 논의에 대해서는 J. Kendrew(1994)의 The Encyclopedia of Molecular Biology를 참조한다. 적합한 지질에 대해서는, 예를 들어 Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications"(암스테르담 엘세비에르)를 참조한다.
CIC-함유 조성물을 함유하는 리포솜을 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 지질 소포는 본 분야에 공지된 어떤 적합한 기술에 의해 제조될 수 있다. 방법들은 제한은 없으나 마이크로캡슐화, 미세유동화, LLC법, 에탄올 주사, 프레온 주사, "버블"법, 세제 투석, 수화, 초음파 분해, 및 역상 증발을 포함한다. Watwe 등 (1995) Curr. Sci. 68:715724에서 리뷰한다. 가장 바람직한 속성을 갖는 소포를 제공하기 위해서 기술들을 조합할 수 있다.
본 발명은 조직 또는 세포 표적화 성분을 함유하는 LMS의 사용을 포함한다. 그러한 표적화 성분은, 완전한 동물, 기관, 또는 세포 배양물에 투여되었을 때, 다른 조직 또는 세포 부위에 우선하여 어떤 조직 또는 세포 부위에서 LMS의 축적을 증진시키는 LMS의 성분이다. 표적화 성분은 일반적으로 리포솜의 외부에서 얻어지며, 따라서 바람직하게는 외부 표면에 결합되거나 또는 외부 지질 이중층에 삽입된다. 표적화 성분은 특히 펩티드, 더 큰 펩티드에 속한 영역, 세포 표면 분자 또는 마커에 특이적인 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편, 핵산, 탄수화물, 복합 탄수화물에 속한 영역, 특수한 지질, 또는 상술된 분자들 중 어느 것에 부착되는 약물, 호르몬, 또는 합텐과 같은 소분자일 수 있다. 세포 타입-특이적 세포 표면 마커에 대한 특이성을 갖는 항체가 본 분야에 공지되어 있으며, 본 분야에 공지된 방법에 의해 쉽게 제조된다.
LMS는 치료적 처치가 지시되는 어떤 세포 타입에, 예를 들어 면역반응을 조절하거나 및/또는 그에 참여할 수 있는 세포 타입에 대해 표적화될 수 있다. 그러한 표적 세포 및 기관은 제한은 없으나 APC, 예컨대 대식세포, 수지상세포 및 림프구, 림프구조, 예컨대 림프절 및 비장, 및 비림프구조, 특히 수지상세포에서 발견되는 것들을 포함한다.
본 발명의 LMS 조성물은 추가로 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 양이온계, 음이온계, 양쪽성계, 또는 비이온계일 수 있다. 바람직한 부류의 계면활성제는 비이온계 계면활성제이며, 수용성인 것들이 특히 바람직하다.
어떤 구체예에서, CIC 및 항원은 단백질성 또는 비-단백질성(예를 들어, 합성) 원자가 플랫폼과 같은 플랫폼 분자와의 결합에 의해 가깝게 회합된다. 적합한 플랫폼의 예들은 CIC에서 스페이서 부분으로 사용된 원자가 플랫폼의 논의에서 설명된다. 원자가 플랫폼에 항원의 부착은 루틴한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예로서, 폴리펩티드는 폴리펩티드와 플랫폼을 커플링하는 자리로 사용되는 아미노, 카르복실 또는 술프히드릴기 같은 작용기를 갖는 아미노산 측쇄 부분을 함유한다.만일 폴리펩티드가 이들 기를 이미 함유하지 않는다면, 그러한 작용기를 갖는 잔기가 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 그러한 잔기는 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술에 의해 결합될 수 있으며, 이들 모두는 펩티드 합성 분야에 잘 알려져 있다. 폴리펩티드가 탄수화물 측쇄(들)을 가질 때(또는, 만일 항원이 탄수화물이라면), 작용기 아미노, 술프히드릴 및/또는 알데히드기는 종래의 화학법에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 1차 아미노기는 나트륨 시아노보호히드리드의 존재하에 산화된 당과 에틸렌디아민의 반응에 의해 결합될 수 있고, 술프히드릴은 시스테아민 중염산염의 반응 후 표준 디술피드 환원제를 사용한 환원에 의해 도입될 수 있으며, 알데히드기는 과요오드산 산화 후에 발생될 수 있다. 유사한 방식으로, 만일 이미 적합한 작용기를 지니지 않는다면, 플랫폼 분자는 또한 작용기를 함유하도록 유도될 수 있다.
다른 구체예에서, CIC와 항원은 나노입자 또는 마이크로캐리어와 같은 표면에 이 둘을 흡착시킴으로써 공동-투여된다. 표면에 CIC 및/또는 항원의 흡착은 이온 및/또는 소수성 상호작용을 포함하는 비-공유 상호작용을 통해 일어날 수 있다. 흡착된 분자를 세포로 송달하려는 목적을 위해 표면에 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 흡착하는 것이 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Douglas 등 (1987) Crit.Rev.Tuer.Drug. Carrier Syst. 3:233-261; Hagiwara 등(1987) In Vivo 1:241-252; Bousquet 등 (1999) Phare. Res. 16:141-147; 및 Kossovsky 등, 미국특허 번호 5,460,831 참조. 바람직하게, 흡착 표면을 포함하는 물질은 생분해성이다.
일반적으로, 표면 전하, 입자 크기 및 분자량과 같은 나노입자의 특성은 중합 조건, 단량체 농도 및 중합 과정 동안에 안정제의 존재에 의존한다(Douglas 등, 1987, 상동). 캐리어 입자의 표면은 CIC 및/또는 항원의 흡착을 허용 또는 증진하기 위해, 예를 들어 표면 코팅으로 변형될 수 있다. 흡착된 CIC 및/또는 항원을 갖는 캐리어 입자는 다른 물질로 더 코팅될 수 있다. 그러한 다른 물질의 첨가는, 예를 들어 일단 피험자에게 투여되었다면 입자의 반감기를 연장할 수 있으며 및/또는 본원에 설명된 대로 이 입자들을 특이적 세포 타입 또는 조직에 대해 표적화할 수 있다.
CIC 및 항원이 흡착될 수 있는 나노결정질 표면이 설명되었다(예를 들어, 미국특허 번호 5,460,831 참조). 나노결정질 코어 입자(직경 1㎛ 미만을 갖는)는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 제약학적 제제의 흡착을 촉진하는 표면 에너지 변형 층으로 코팅된다. 미국특허 번호 5,460,831에 설명된 대로, 예를 들어 코어 입자는 올리고뉴클레오티드의 흡착을 촉진하는 표면으로 코팅되고, 이어서 예를 들어 지질-항원 혼합물 형태의 항원 제제로 코팅된다. 그러한 나노입자는, 전형적으로 0.1㎛ 정도의 나노미터 크기 입자들의 자기-어셈블링 복합체이며, CIC의 내층과 항원의 외층을 지닌다.
또 다른 흡착 표면은 알킬시아노아크릴레이트의 중합에 의해 만들어진 나노입자이다. 알킬시아노아크릴레이트는 산성화된 수성 매질에서 음이온계 중합 과정에 의해 중합될 수 있다. 중합 조건에 따라서, 작은 입자들은 20 내지 300nm 범위의 크기를 가지려는 경향이 있으며, 특이적 표면 특징들 및 특이적 표면 전하를 갖는 나노입자를 만드는 것을 가능하게 한다(Douglas 등, 1987, 상동). 예를 들어,올리고뉴클레오티드는 테트라페닐포스포늄 클로라이드 또는 4차 암모늄염, 예를 들어 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드와 같은 소수성 양이온의 존재하에 폴리이소부틸- 및 폴리이소헥실시아노아크릴레이트 나노입자에 흡착될 수 있다. 이들 나노입자 상의 올리고뉴클레오티드 흡착은 핵산 사슬의 음으로 하전된 인산염기와 소수성 양이온 간의 이온쌍의 형성에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. Lambert 등(1998) Biochimie 80:969-976, Chavany 등 (1994) Pharm. Res. 11:1370-1378; Chavany 등 (1992) Pharm. Res. 9:441-449 참조. 폴리펩티드가 또한 폴리알킬시아노아크릴레이트 나노입자에 흡착될 수 있다. 예로서, Douglas 등(1987); Schroeder 등(1998) Peptides 19:777-780 참조.
또 다른 흡착 표면은 메틸리덴 말로네이트의 중합체 의해 제조된 나노입자이다. 예를 들어, Bousquet 등 (1999)에 설명된 바와 같이, 폴리(메틸리덴 말로네이트 2.1.2) 나노입자에 흡착된 폴리펩티드는 정전기력을 통해 초기에 흡착을 행하고, 이어서 소수성 힘을 통해 안정화되는 것으로 여겨진다.
C.추가 애쥬번트
또한, CIC는 애쥬번트와 함께 투여될 수 있다. CIC 및 애쥬번트와 함께 항원의 투여는 항원에 대한 면역반응의 강화를 이끌며, 따라서 그 결과 CIC 및 항원 만을 포함하는 조성물로부터의 결과와 비교하여 증진된 면역반응을 가져올 수 있다. 애쥬번트는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 제한은 없으나 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 백반(알루미늄염), 리포솜 및 마이크로입자를 포함하고, 제한은 없으나 폴리스티렌, 녹말, 폴리포스파젠 및 폴리락티드/폴리글리코시드를 포함한다. 다른적합한 애쥬번트는 또한 제한은 없으나 MF59, DETOXTM(Ribi), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 뮤라밀 펩티드, 사포닌 유도체, 미코박테리아 세포벽 제제, 모노포스포릴 리피드 A, 미콜릭산 유도체, 비이온계 블럭 공중합체 계면활성제, Quil A, B형 콜레라 독소 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 Takahashi 등 (1990) Nature 344:873-875에 설명된 것들과 같은 면역자극 복합체(ISCOM), 뿐만 아니라 지질-기제 애쥬번트 및 본원에 설명된 여타의 것들을 포함한다. 수의과적 용도 및 동물에서의 항체 생성을 위해서는 프로인드 애쥬번트(Freund's adjuvant: 완전 및 불완전 모두)의 미토겐 성분이 사용될 수 있다.
IV.본 발명의 방법
본 발명은, 본원에 설명된 CIC를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 사람에서 면역반응을 조절하는 방법을 제공한다. 면역조절은 Th1-형 면역반응의 자극 및/또는 Th2-형 면역반응의 저해 또는 감소를 포함할 수 있다. CIC는 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 투여된다. 본원에 설명된 면역반응의 조절은 체액 및/또는 세포성일 수 있으며, 본 분야에 공지되며 본원에 설명된 표준 기술을 사용하여 측정된다.
많은 개체가 본원에 설명된 CIC(들)을 받는데 적합하다. 필수적인 것은 아니나 바람직하게 개체는 사람이다.
어떤 구체예에서, 개체는 (제한은 없으나) 알레르기, 알레르기-유발 천식, 아토피피부염, 호산구 위장관 염증, 호산구 식도염, 및 알레르기기관지폐아스페르길루스증과 같은 Th2-형 면역반응에 관련된 장애로 고통받는다. CIC의 투여는 면역조절을 가져오고, 사이토카인에 관련된 1종 이상의 Th1-형 반응의 수준을 증가시키며, 이것은 알레르겐에 대한 개체의 반응에 관련된 Th2-형 반응 특징들의 감소를 가져올 수 있다. 장애에 관련된 Th2-형 반응을 가진 개체의 면역조절은 장애의 증상들 중 한 가지 이상의 감소 또는 개선을 가져올 수 있다. 장애가 알레르기 또는 알레르기-유발 천식인 경우, 한 가지 이상의 증상의 개선은 다음 중 하나 이상의 감소를 포함한다: 비염, 알레르기결막염, IgE의 혈중 수준, 히스타민의 혈중 수준 및/또는 "구급" 흡입기 치료법(예를 들어, 계량 분량 흡입기 또는 분무기에 의해 투여된 알부테롤 흡입)의 필요.
더 이상의 구체예에서, 본 발명의 면역조절 치료법을 받는 개체는 백신을 받는 개체이다. 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다. 예방 백신은 개체가 위험에 처할 수도 있는 장애에 관련된 에피토프를 1개 이상 포함한다(예를 들어, 결핵 예방 백신으로서M. tuberculosis항원). 치료 백신은 개체가 걸린 특정한 장애에 관련된 에피토프를 1개 이상 포함하는데, 결핵 환자에서M. tuberculosis또는M. bovis표면 항원, 알레르기를 겪는 개체에서 이 개체가 그에 대해 알레르기성인 항원(즉, 알레르기 탈민감 치료법), 암을 가진 개체의 종양세포(예를 들어, 미국특허 번호 5,484,596에 설명된), 또는 암환자의 종양 관련 항원을 예로 들 수 있다. CIC는 백신과 함께 제공될 수 있거나(예를 들어, 동일 주사로 또는 동시이지만 개별적 주사로), 또는 CIC는 따로 투여될 수 있다(예를 들어, 백신을 투여하기 적어도 12시간 전 또는 후에). 어떤 구체예에서, 백신의 항원(들)은 CIC와의공유 또는 비-공유 결합에 의해 CIC의 일부로 된다. 백신을 받는 개체에 CIC 치료제의 투여는, CIC를 함유하지 않은 백신을 받은 개체와 비교하여, 백신에 대한 면역반응이 Th1-형 반응을 향해 이동되는 결과를 가져온다. Th1-형 반응을 향한 이동은 백신에 있는 항원(들)에 대한 지연-형 과민(DTH) 반응, 증가된 IFN-γ 및 사이토카인에 관련된 다른 Th1-형 반응, 백신의 항원(들)에 특이적인 IgE 수준의 저하 또는 감소, 백신의 항원(들)에 특이적인 Th2-관련 항체의 감소, 및/또는 백신의 항원(들)에 특이적인 Th1-관련 항체의 증가에 의해 인식될 수 있다. 치료 백신의 경우, CIC 및 백신의 투여는 또한 백신이 치료하고자 하는 장애의 증상들 중 하나 이상의 개선을 가져온다. 당업자에게 분명한 대로, 정확한 증상 및 그들의 개선 방식은 치료되길 원하는 장애에 의존할 것이다. 예를 들어, 치료 백신이 결핵용인 경우, 백신과 함께 한 CIC 치료는 기침, 흉막 또는 흉벽 통증, 열, 및/또는 이 분야에 알려전 다른 증상들을 감소시킨다. 백신이 알레르기 탈민감 치료법에 사용된 알레르겐인 경우, 치료는 알레르기 증상들의 감소를 가져온다(예를 들어, 비염, 알레르기결막염, IgE의 혈중 수준, 및/또는 히스타민의 혈중 수준의 감소).
본 발명의 다른 구체예는 암 또는 감염성 질환과 같은, 이미 존재하는 질환 또는 장애를 가진 개체의 면역조절 치료법에 관한 것이다. 대부분의 암들은 신체의 다른 세포에서는 발견되지 않는 종양-관련 및/또는 종양 특이적 항원을 발현하기 때문에, 암은 면역조절에 대한 매력적인 표적이다. 종양 세포에 대항한 Th1-형 반응의 자극은 면역 시스템에 의한 직접적 및/또는 방관자적 종양세포 살생을 가져오며, 이로써 암세포의 감소 및 증상의 감소를 가져온다. 암을 가진 개체에 CIC의투여는 종양세포에 대항한 Th1-형 면역반응의 자극을 가져온다. 그러한 면역반응은 세포성 면역 시스템 세포(예를 들어, CTL) 또는 체액성 면역 시스템 성분의 직접적 작용에 의해, 또는 대식세포 및 자연살(NK)세포를 포함한 면역 시스템에 의해 표적화된 세포에 가까이 있는 세포에 대한 방관자적 효과에 의해 종양세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, Cho 등 (2000) Nat. Biotechnol. 18:509-514 참조. 이미 존재하는 질환 또는 장애의 치료에서, CIC는 사이토카인, 애쥬번트 및 항체와 같은 다른 면역치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, CIC는 종양세포에 의해 나타난 항원과 결합하는 결합제의 투여를 포함하는 치료 섭생의 일부로서 투여될 수 있다. 전형적인 결합제는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한다. 표적 항원의 예들은 CD20, CD22, HER2 및 본 분야에 공지되거나 또는 앞으로 발견될 여타의 것들을 포함한다. 이론에 결부시키려는 의도는 없으나, CIC는 결합제가 결합된 종양세포의 살생을 증진시키는 것으로 여겨진다(예를 들어, 항체 의존성 세포성 세포독성 및/또는 이펙터 기능을 증진시킴에 의해). 결합제는 선택적으로, 예를 들어 결합제가 결합된 세포를 손상시키는 방사성동위원소나 독소로 표지될 수 있다. CIC는 결합제와 함께(예를 들어, 동시에), 또는 전이나 후에(예를 들어, 결합제를 투여하기 24시간 미만 전 또는 후에) 제공될 수 있다. 예를 들어, 암의 경우 CIC는 암치료에 유용하다고 알려지거나 또는 그렇게 생각되는 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, CIC는 방사선 치료제, 유전자 치료제 등과 함께 투여될 수 있다. CIC는 본원에 설명된 것들 중 어떤 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따르는 면역조절 치료법은 감염성 질환, 특히 체액성 면역반응에 저항성인 감염성 질환(예를 들어, 미코박테리아 감염 및 세포내 병원체로 인한 질환)을 가진 개체에 유용하다. 면역조절 치료법은 세포성 병원균(예를 들어, 박테리아 또는 원생동물) 또는 아-세포성 병원균(예를 들어, 바이러스)로 인한 감염성 질환의 치료에 사용될 수 있다. CIC 치료제는 결핵과 같은 미코박테리아 질환(예를 들어,M. tuberculosis및/또는M. bovis감염), 나병(즉,M. leprae감염), 또는M. marinum또는M. ulcerans감염으로 고통받는 개체에 투여될 수 있다. 또한, CIC 치료제는, 인플루엔자 바이러스, 호흡기세포융합바이러스(RSV), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 포진 바이러스, 특히 단순포진 바이러스, 및 유두종 바이러스에 의한 감염들을 포함하는, 바이러스 감염의 치료에 유용하다. 말라리아(예:Plasmodium vivax, P. ovale, P. falciparum및/또는P. malariae에 의한 감염), 리슈만편모충증(예:Leishmania donovani, L. tropic, L. mexican, L. braziliensis, L. peruviana, L. infantum, L. chagasi,및/또는L. aethiopica에 의한 감염), 및 톡소포자충증(즉,Toxoplasmosis gondii에 의한 감염)과 같은 세포내 기생출으로 인한 질환들이 또한 CIC 치료법으로부터 이익을 얻는다. 또한, CIC 치료제는 주혈흡충증(즉,Schistosoma속, 예를 들어S. haematobium, S. mansoni, S. japonicum및S. mekongi의 주혈흡충에 의한 감염) 및 간흡충증(즉,Clonorchis sinensis에 의한 감염)과 같은 기생출 질환들의 치료에 유용하다. 감염성 질환으로 고통받는 개체에 CIC의 투여는 감염성 질환의 증상들의 개선을 가져온다. 어떤 구체예에서는 감염성 질환이 바이러스 질환이 아니다.
본 발명은 개체에서 적어도 1개의 Th1-관련 사이토카인(IL-2, IL-12, TNF-β, IFN-γ 및 IFN-α를 포함함)을 증가 또는 자극하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 유효량의 CIC를 개체에 투여함에 의한, 개체, 특히 증가된 IFN-γ 수준을 필요로 하는 개체에서 IFN-γ를 증가 또는 자극하는 방법을 제공한다. 증가된 IFN-γ를 필요로 하는 개체는 IFN-γ의 투여에 반응하는 장애를 가진 개체들이다. 그러한 장애는 위궤양을 포함하는(제한은 없다) 다수의 염증성 장애이다. 또한, 그러한 장애는 다수의 섬유화 장애를 포함하며, 이들은 제한은 없으나 특발성 폐섬유증(IPF), 피부경화증, 피부 방사선-유발 섬유증, 주혈흡충증-유발 간섬유증을 포함하는 간섬유증, 신장섬유증 뿐만 아니라, IFN-γ의 투여에 의해 개선될 수 있는 다른 상태를 포함한다. 본 발명에 따르는 CIC의 투여는 IFN-γ 수준의 증가를 가져오며, 한 가지 이상의 증상의 개선, 한 가지 이상의 증상의 안정화, 또는 IFN-γ에 반응하는 장애의 진행의 예방(예를 들어, 추가 병소 또는 증상의 감소 또는 제거)를 가져온다. 본 발명의 방법은, IPF에서 전신 코르티코스테로이드 치료제(예를 들어, 코르티손)과 같은 항-염증제의 투여와 같이, 그 장애에 대한 관리의 표준을 구성하는 다른 치료법들과 조합하여 실시될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 IFN-α 수준이 증가하도록 유효량의 CIC를 개체에 투여함에 의한, 개체, 특히 증가된 IFN-α 수준을 필요로 하는 개체에서 IFN-α를 증가시키는 방법을 제공한다. 증가된 IFN-α를 필요로 하는 개체는, 제한은 없으나 바이러스 감염 및 암을 포함하는, 재조합 IFN-α를 포함한 IFN-α의 투여에 반응하는 장애를 가진 개체들이다. 본 발명에 따르는 CIC의 투여는 IFN-α 수준의 증가를 가져오며, 한 가지 이상의 증상의 개선, 한 가지 이상의 증상의 안정화, 또는 IFN-α에 반응하는 장애의 진행의 예방(예를 들어, 추가 병소 또는 증상의 감소 또는 제거)를 가져온다. 본 발명의 방법은, 바이러스 감염에 대한 항-바이러스제의 투여와 같이, 그 장애에 대한 관리의 표준을 구성하는 다른 치료법들과 조합하여 실시될 수 있다.
본 명세서의 검토 시 분명한 대로, CIC의 스페이서 조성물은 CIC의 투여에 의해 도출된 면역반응에 영향을 미칠 수 있다. 사실상 시험된 모든 스페이서는 사람 PBMC에서 IFN-γ를 효과적으로 유도하기 위해 CIC에 사용될 수 있다. 그러나, 선형 CIC의 스페이서 조성물은 IFN-α의 유도에 대해 차별적인 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 예를 들어, 예컨대 HEG, TEG 또는 C6 스페이서를 함유하는 CIC는 C3, C4 또는 무염기 스페이서를 함유하는 CIC보다, PBMC에서 더 높은 IFN-α 유도(및 감소된 B 세포 증식)를 일으키는 경향이 있다(예를 들어, 하기 실시예 34 참조).
또한, 개체에게 유효량의 CIC를 투여함에 의한, IgE-관련 장애를 가진 개체에서 IgE의 수준, 특히 혈청 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 그러한 방법에서, CIC는 단독 투여되거나(예를 들어, 항원 없이), 또는 알레르겐 같은 항원과 함께 투여될 수 있다. IgE-관련 장애는 IgE 수준의 감소에 의해 개선되는 상태, 장애, 또는 증상들이다. IgE의 감소는 IgE-관련 장애의 증상들의 개선을 가져온다. 그러한 증상은 비염, 결막염과 같은 알레르기 증상, 알레르겐에 대한 민감성의 감소, 알레르기를 갖는 개체에서 알레르기 증상의 감소, 또는 알레르기 반응의 심한 정도의 감소를 포함한다.
본 발명의 방법은 CIC가 CIC/마이크로캐리어 복합체(들)의 형태로 투여되는구체예를 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 CTL 생성이 증가되도록 유효량의 CIC를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 CTL 생성을 자극하는 방법을 제공한다.
당업자에게 분명한 대로, 본 발명의 방법은, CIC를 투여하는 특정 처방에 대한 다른 치료제와 조합하여 실시될 수 있다. 예를 들어, CIC 치료제는 말라리아 환자용 클로로퀸 같은 항-말라리아약과 함께, 리슈만편모충증 환자용 펜타미딘 및/또는 알로푸리놀 같은 리슈만편모충증약과 함께, 결핵 환자용 이소니아지드, 리팜핀 및/또는 에탐부톨 같은 항-미코박테리아약과 함께, 또는 아토피(알레르기) 환자용 알레르겐 탈민감 치료제와 함께 투여될 수 있다.
A.투여 및 면역반응 평가
CIC는 본원에 설명된 대로 제약학적 및/또는 면역학적 및/또는 다른 면역자극제와 조합하여 투여될 수 있으며, 그들의 생리학적으로 허용되는 캐리어와 조합될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 CIC 또는 조성물은 사이토카인, 애쥬번트 및 항체와 같은 다른 면역치료제와 함께 투여될 수 있다. CIC는 이 제제와 함께 제공될 수 있다(예를 들어, 동시에, 또는 전 또는 후에(예를 들어, 제제를 투여하기 24시간 미만 전 또는 후에). CIC는 본원에 설명된 것들 중 어떤 것일 물 있다.
모든 면역자극성 조성물과 마찬가지로, 특정 CIC 제제에 대한 면역학적 유효량 및 투여 방법은 개체, 치료될 상태, 및 당업자에게 분명한 다른 요인들에 기준하여 변할 수 있다. 고려되는 요인은 함께 투여된 항원의 존재, CIC가 애쥬번트또는 송달 분자와 함께 투여되거나 또는 그것에 공유적으로 부착되어 투여되는지의 여부, 투여 경로, 및 투여될 면역화 분량의 수량을 포함한다. 그러한 요인들은 본 분야에 공지되어 있으며, 과도한 실험 없이 당업자가 그러한 결정을 할 수 있는 범위 내이다. 적합한 투약량 범위는 항원에 대한 면역반응의 바람직한 조절을 제공하는 것이다. 일반적으로, 투약량은 총체적인 CIC의 양보다는 오히려 환자에게 투여된 CIC의 양에 의해 결정된다. CIC의 유용한 투약량 범위는, 송달된 CIC의 양으로 제공되며, 예를 들어 대략 다음 중 어떤 범위일 수 있다: 1 내지 500㎍/kg, 100 내지 400㎍/kg, 200 내지 300㎍/kg, 1 내지 100㎍/kg, 100 내지 200㎍/kg, 300 내지 400㎍/kg, 400 내지 500㎍/kg. 각 환자에게 제공되는 절대량은 생체이용률, 청소 속도 및 투여 경로와 같은 제약학적 특성들에 의존한다.
특정 CIC 제제에 대한 유효량 및 투여 방법은 환자 개체 및 질환 단계, 그리고 당업자에게 분명한 다른 요인들에 기준하여 변할 수 있다. 특정 용도에 유용한 투여 경로(들)은 당업자에게 명백하다. 투여 경로는 제한은 없으나 국소, 비부, 경피, 경점막, 상피, 비경구, 위장관, 및 경기관지 및 경치조를 포함한 코인두 및 폐의 경로를 포함한다. 적합한 투약량 범위는 혈액 수준으로 측정하여 약 1-10μM의 조직 농도를 얻을 만큼 충분한 CIC-함유 조성물을 제공하는 것이다. 각 환자에게 제공되는 절대량은 생체이용률, 청소 속도 및 투여 경로와 같은 제약학적 특성들에 의존한다.
본원에 설명된 대로, APC 및 고농도의 APC를 가진 조직이 CIC의 바람직한 표적이다. 따라서, APC가 비교적 고농도로 존재하는 포유류 피부 및/또는 점막에CIC를 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명은, 제한은 없으나 생리학적으로 허용되는 임플란트, 연고, 크림, 린스 및 젤을 포함하여, 국소용으로 적합한 CIC 제제를 제공한다. 국소 투여는 예를 들어, 송달 시스템이 분산되어 있는 드레싱 또는 붕대, 절개부위 또는 개방창에 송달 시스템의 직접 투여, 또는 관심의 부위에서 감독되는 경피 투여 장치에 의한다. CIC가 분산된 크림, 린스, 젤 또는 연고가 국소용 연고 또는 상처 충진제로 사용하기 적합하다.
피부 투여의 바람직한 경로는 최소한 침습성인 것들이다. 이들 중 경피 전달, 상피 투여 및 피하 주사가 바람직하다. 이들 수단 중 경피 투여는 피내 조직에 있을 것으로 예상되는 더 높은 농도의 APC에 대해 바람직하다.
경피 투여는, CIC가 피부에 스며들어 혈류로 진입하는 것을 허용하는 크림, 린스, 젤 등의 도포에 의해 달성된다. 경피 투여에 적합한 조성물은 제한은 없으나, 피부에 직접 도포되거나 또는 경피용 장치와 같은 보호용 캐리어(소위 말하는 "패치")에 결합된 제약학적으로 허용되는 현탁액, 오일, 크림 및 연고를 포함한다. 적합한 크림, 연고 등의 예들은, 예를 들어 Physician's Desk Reference에서 찾을 수 있다.
경피 전달을 위해서는 이온삼투요법이 적합한 방법이다. 이온삼투 전달은 상업적으로 이용가능한 패치를 사용하여 달성될 수 있으며, 이 패치는 온전한 피부를 통해 그들의 산출물을 수일 이상의 기간 동안 연속적으로 송달한다. 이 방법의 사용은 비교적 큰 농도의 제약 조성물의 조절 전달을 허용하고, 조합 약물의 주입을 허가하며, 흡수촉진제의 동시 사용을 허용한다.
이 방법에 사용되는 전형적인 패치 제품은 General Medical Company(캘리포니아 로스앤젤레스)의 상품명 LECTRO PATCH인 제품이다. 이 제품은 중성 pH에서 저장소 전극들을 전자적으로 유지하며, 상이한 농도들의 투약량을 제공하여 연속적으로 및/또는 주기적으로 투약하도록 적합하게 될 수 있다. 패치의 제조 및 사용은 LECTRO PATCH 제품에 수반된 제조자의 인쇄된 지시서에 따라 수행되어야 하며, 이들 지시서는 참조를 위하여 본원에 포함된다.
또한, 저-주파 초음파 송달이 경피 전달에 적합한 방법이다. Mitragotri 등 (1995) Science 269:850-853. 저-주파 초음파 주파수(약 1MHz)의 적용은 치료 조성물(고분자량인 것들을 포함함)의 일반적인 제어 송달을 허용한다.
상피 투여에는, 자극제에 대한 면역반응을 충분히 유발하기 위해 상피의 최외곽층을 기계적 또는 화학적으로 자극하는 것이 본질적으로 수반된다. 구체적으로, 자극은 자극 부위로 APC를 유인할 만큼 충분해야 한다.
전형적인 기계적 자극 수단은, 피부를 자극하여 APC를 자극 부위로 유인하는데 사용될 수 있는, 직경이 매우 좁고 짧은 다수 개의 빗살(tine: 타인)들을 사용하여, 이 빗살들의 단부로부터 전달된 CIC를 흡수하는 것이다. 예를 들어, 프랑스 리용의 Pasteur Merieux에 의해 제조된 MONO-VACC 올드 투베르쿨린 시험이 CIC-함유 조성물의 도입에 적합한 장치를 함유한다.
이 장치(이것은 팬실베이나 스위프트워터의 Connaught Laboratories, Inc.에 의해 미국에서 유통된다)는 한 단부에 시린지 플런저를 갖고 나머지 단부에 빗살원반을 갖는 플라스틱 용기로 구성된다. 빗살 원반은 다수 개의 좁은 직경 빗살들을 지지하며, 이 빗살들은 단지 상피세포의 최외곽층을 긁을 만큼의 길이를 갖는 다. MONO-VACC 키트에 있는 각 빗살은 올드 투베르쿨린으로 코팅되는데; 본 발명에서는 각 바늘을 CIC 제제의 제약 조성물로 코팅한다. 이 장치의 사용은 장치 제품과 함께 포함된 제조자의 서면 지시서에 따르는 것이 바람직하다. 이 구체예에서, 또 사용될 수 있는 유사한 장치는 현재 알레르기 시험을 수행하는데 사용되는 것들이다.
CIC의 상피 투여에 대한 또 다른 적합한 접근법은 상피의 최외곽 세포를 자극함으로써, 그 부위로 APC를 유인할 만큼 충분한 면역반응을 유발하는 화학물질을 사용하는 것이다. 예는 상품명 NAIR로 Noxema Corporation에 의해 판매된 상업적으로 이용가능한 국소 탈모제 크림에 사용된 살리실산과 같은 케라틴 가수분해제이다. 또한, 이 접근법은 점막에서의 상피 투여를 달성하는데 사용될 수 있다. 또한, 화학적 자극은 기계적 자극과 함께 적용될 수 있다(예를 들어, 만일 MONO-VACC 형 빗살이 화학자극제로 또 코팅되었을 경우 일어날 수 있는 것처럼). CIC는 화학자극제를 또 함유하거나 또는 그와 함께 공동-투여되는 캐리어 중에 현탁될 수 있다.
비경구 투여 경로는 제한은 없으나 전기적(이온삼투요법) 주사 또는 중심정맥회로에 직접 주사하는 것과 같은 직접 주사, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 또는 피하 주사를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 CIC 제제는 일반적으로 USP 수(물) 또는 주사용수 중에 조제되며, pH 완충액, 염 벌크화제, 보존제, 및 다른 제약학적으로 허용되는 부형제를 더 포함할 수 있다. 비경구 주사용 CIC는 주사용 식염수 및 인산염 완충 식염수와 같은 제약학적으로 허용되는 멸균 등장액 중에 조제될 수 있다.
위장관 투여 경로는 제한은 없으나 섭취 및 직장 경로를 포함한다. 본 발명은 위장관 투여에 적합한 CIC 제제를 포함하며, 이들 제제는 제한은 없으나, 제약학적으로 허용되는 섭취용 가루, 알약 또는 액체 및 직장 투여용 좌약을 포함한다. 당업자에게 분명한 대로, 알약 및 좌약은 조성물을 벌크로 만들기 위해 녹말과 같은 제약학적으로 허용되는 고체를 더 포함할 수 있다.
코인두 및 폐 투여는 흡입에 의해 달성되며, 비강내, 경기관지 및 경치조 경로와 같은 송달 경로를 포함한다. 본 발명은 흡입에 의한 투여에 적합한 CIC 제제를 포함하며, 이들 제제는 제한은 없으나, 에어로졸을 만들기 위한 액체 현탁액 뿐만 아니라 건조 가루 흡입 송달 시스템을 위한 가루 형태를 포함한다.
송달 경로의 선택은 도출된 면역반응을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, IgG 역가 및 CTL 활성은 인플루엔자 바이러스 벡터가 근육내 또는 상피(유전자총) 경로를 통해 투여되었을 때 동일했지만; 근육 접종은 주로 IgG2a를 산출한 반면 상피 경로는 대부분 IgG1을 산출했다. Pertmer 등(1996) J. Virol. 70:6119-6125. 따라서, 당업자는 본 발명의 면역조절 올리고뉴클레오티드를 투여하는 상이한 경로들에 의해 도출되는 면역원성의 약간의 차이들로 인한 이점을 취할 수 있다.
상기 언급된 조성물 및 투여 방법은 본 발명의 CIC 제제를 투여하는 방법을설명하고자 하는 것이며 제한하려는 것은 아니다. 다양한 조성물 및 장치를 제조하는 방법은 당업자의 능력 범위이므로 본원에서 상세히 설명하지 않는다.
CIC에 대한 면역반응의 분석(정성 및 정량 모두)은 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의할 수 있으며, 제한은 없으나 항원-특이적 항체 생성의 측정(특이적 항체 +서브클래스의 측정을 포함함), CD4+ T 세포, NK 세포 또는 CTL과 같은 특이적 림프구 집단의 활성화, IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 또는 IL-12와 같은 사이토카인 생성, 및/또는 히스타민 방출을 포함한다. 특이적 항체 반응을 측정하는 방법은 효소면역측정법(ELISA)을 포함하며, 본 분야에 잘 공지되어 있다. CD4+ T 세포와 같은 다수의 특이적 림프구 종류의 측정은, 예를 들어 형광-활성화 세포분리(FACS)를 사용하여 달성될 수 있다. 세포독성 및 CTL 분석은, 예를 들어 Raz 등(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523 및 Cho 등(2000)에 설명된 대로 수행될 수 있다. 사이토카인 농도는, 예를 들어 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 면역원에 대한 면역반응을 평가하는 이들 및 다른 분석들이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (1980) Mishell 및 Shiigi, 편저, W. H. Freeman and Co 참조.
바람직하게, Th1-형 반응이 자극, 즉 도출 및/또는 증진된다. 본 발명과 관련하여, Th1-형 면역반응의 자극은, CIC로 치료되지 않은 대조군 세포와 비교하여, CIC로 치료된 세포로부터의 사이토카인 생성을 측정함에 의해 시험관내 또는 생체외적으로 결정될 수 있다. 세포의 사이토카인 생성을 결정하는 방법은 본원에 설명된 방법들 및 본 분야에 공지된 어떤 것들을 포함한다. CIC 치료에 반응하여 생성된 사이토카인의 타입은 세포에 의한 Th1-형 또는 Th2-형 편향된 면역반응을 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "Th1-형 편향" 사이토카인 생성은, 자극의 부재하에 그러한 사이토카인이 생성되는 것과 비교하여, 자극제의 존재하에서 Th1-형 면역반응에 관련된 사이토카인 생성의 측정가능한 증가로 간주한다. 그러한 Th1-형 편향 사이토카인의 예들은 제한은 없으나 IL-2, IL-12, IFN-γ 및 IFN-α를 포함한다. 반대로, "Th2-형 편향 사이토카인"은 Th2-형 면역반응에 관련된 것들로 간주하며, 제한은 없으나 IL-4, IL-5, 및 IL-13을 포함한다. CIC 활성의 결정에 유용한 세포는 면역 시스템에 속한 세포, 숙주 및/또는 셀라인으로부터 분리된 1차 세포, 바람직하게는 APC 및 림프구, 더욱 더 바람직하게는 대식세포 및 T 세포를 포함한다.
또한, Th1-형 면역반응의 자극은 CIC로 치료된 숙주에서 측정될 수 있으며, 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해 결정될 수 있고, 제한은 없으나 (1) 항원-유발반응검사(challenge) 전 및 후에 측정된 IL-4 또는 IL-5 수준의 감소; 또는 항원-감작(antigen-primed)된, 또는 감작 및 유발반응된 CIC 없이 치료된 대조군과 비교하여, CIC 치료된 숙주에서 IL-4 또는 IL-5의 저하된(또는, 심지어 부재하는) 수준의 검출; (2) 항원-유발반응검사 전 및 후에 IL-12, IL-18 및/또는 IFN(α, β 또는 γ) 수준의 증가; 또는 항원-감작된, 또는 감작 및 유발반응된 CIC 없이 치료된 대조군과 비교하여, CIC 치료된 숙주에서 IL-12, IL-18 및/또는 IFN(α, β 또는 γ)의 더 높은 수준의 검출; (3) CIC 없이 치료된 대조군과 비교하여, CIC 치료된 숙주에서 "Th1-형 편향" 항체 생성; 및/또는 (4) 항원-유발반응검사 전 및 후에 측정된 항원-특이적 IgE 수준의 감소; 또는 항원-감작된, 또는 감작 및 유발반응된CIC 없이 치료된 대조군과 비교하여, CIC 치료된 숙주에서 항원-특이적 IgE의 저하된(또는, 심지어 부재하는) 수준의 검출을 포함한다. 여러 가지 이들 결정은 본원에 설명된 방법 또는 본 분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여 시험관내 또는 생체외적으로 APC 및/또는 림프구, 바람직하게는 대식세포 및/또는 T 세포에 의해 만들어진 사이토카인을 측정함으로써 만들어질 수 있다. 이들 결정들 중 일부는 본원에 설명된 방법 또는 본 분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여, 항원-특이적 항체의 부류 및/또는 서브클래스를 측정함으로써 만들어질 수 있다.
CIC 투여의 결과로써 일어난 Th1-형 편향 사이토카인 유발은, NK 세포, 세포독성 세포, Th1 헬퍼 및 면역기억세포에 의해 수행된 것들과 같이, 증진된 세포성 면역반응을 생성한다. 이들 반응은 바이러스, 진균, 원생동물문 기생충, 박테리아, 알레르기 질환 및 천식, 뿐만 아니라 종양에 대한 예방 또는 치료적 백신접종에 사용하는데 특히 이롭다.
어떤 구체예에서, Th2 반응이 억제된다. Th2 반응의 억제는, 예를 들어 IL-4 및 IL-5와 같은 Th2-관련 사이토카인 수준의 감소, 뿐만 아니라 Ige 감소 및 알레르겐에 대한 반응에서의 히스타민 방출 감소에 의해 결정될 수 있다.
V.본 발명의 키트
본 발명은 키트를 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 키트는 CIC를 포함하는 1개 이상의 용기를 포함한다. 키트는 일반적으로 서면 지시서로서 의도된 치료(예를 들어, 면역조절, 감염성 질환의 증상 개선, IFN-γ 수준 증가, IFN-α 수준 증가, 또는 IgE-관련 장애의 개선)를 위한 CIC의 사용에 관한 적합한 지시서세트들을 더 포함한다.
키트는 어떤 편리하고 적합한 패키징에 패키지된 CIC를 포함한다. 예를 들어, 만일 CIC가 건조 제제(예를 들어, 동결건조된 가루나 건조 가루)라면, 탄력성 마개를 갖는 바이알이 통상 사용되어 탄력성 마개를 통해 유체를 주사함으로써 CIC가 쉽게 복원될 수 있도록 한다. 탄력성이 없는 제거가능한 것으로 폐쇄되거나(예를 들어, 밀봉 글라스) 또는 탄력성 마개를 갖는 앰풀은 액체 CIC 제제에 가장 편리하게 사용된다. 또한, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 같은, 특수 장치와 조합하여 사용되는 패키지도 고려된다.
CIC의 사용에 관한 지시서는 일반적으로 투약량, 분량 스케쥴, 및 의도된 치료에 대한 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. CIC 용기는 단위 분량, 벌크 패키지(예를 들어, 다수-분량 패키지) 또는 아-단위 분량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지시서는 전형적으로, 라벨 또는 패키지 인서트 상의 서면 지시서(예를 들어, 키트에 포함된 종이)이지만, 기계로 읽을 수 있는 지시서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스켓에 담은 지시서)도 허용된다.
어떤 구체예에서, 키트는 항원(또는, 1개 이상의 항원들)을 더 포함하며, 이것은 CIC(들)과 동일한 용기(제제)에 패키지될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 키트는 CIC/마이크로캐리어 복합체(CIC/MC) 형태로 CIC를 포함하며, 일반적으로 서면 지시서로서 의도된 치료(예를 들어, 면역조절, 감염성 질환의 증상 개선, IFN-γ 수준 증가, IFN-α 수준 증가, 또는 IgE-관련 장애의 개선)를 위한 CIC/MC의 사용에 관한 지시서 세트를 더 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 키트는 CIC/MC 복합체의 생성을 위한 물질을 포함하고, 일반적으로 CIC 및 MC의 개별 용기를 포함하지만, 어떤 구체예에서는 미리 형성된 MC보다는 오히려 MC를 형성하는 물질이 공급되기도 한다. CIC 및 MC는 바람직하게는 공급된 CIC 및 MC를 혼합했을 때 CIC/MC 복합체가 형성될 수 있는 형태로 공급된다. 이런 형태는 CIC/MC 복합체가 비-공유 결합에 의해 연결된 때 바람직하다. 또한, 이 형태는 CIC와 MC가 이종 2작용기 교차연결제를 통해 교차연결되고; CIC 또는 MC 중 어느 1개는 "활성화된" 형태(예를 들어, 이종 2작용기 교차연결제에 연결되어 CIC와 반응하는 부분을 이용할 수 있게 된)로 공급된 때 바람직하다.
액상 MC를 포함하는 CIC/MC 복합체용 키트는 바람직하게 액상 MC를 생성하는 물질을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함한다. 예를 들어, 수중유 에멀젼 MC용의 CIC/MC 키트는 오일상 및 수성상을 함유하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. 용기 내용물이 에멀젼화되어 MC를 생성한 후, CIC와, 바람직하게는 소수성 부분에 결합하도록 변형된 CIC와 혼합될 수 있다. 그러한 물질은 수중유 에멀젼을 생성하기 위한 오일과 물을 포함하거나, 또는 동결건조된 리포솜 성분(예를 들어, 인지질, 콜레스테롤 및 계면활성제)의 용기와 1개 이상의 수성상(예를 들어, 제약학적으로 허용되는 수성 완충액) 용기를 포함한다.
다음 실시예들은 본 발명을 예시하려는 것이며 제한하지는 않는다.
실시예 1
폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물의 구조
표 2는 실시예들에 언급된 폴리뉴클레오티드 및 키메라 분자의 구조를 나타낸다. "HEG"는 헥사(에틸렌 글리콜) 스페이서 부분이고; "TEG"는 트리에틸렌 글리콜이고; "C3"은 프로필 스페이서 부분이고; "C4"는 부틸 스페이서이고; "C6"은 헥실 스페이서이고; "C12"는 도데실 스페이서이고; "HME"는 2-히드록시메틸에틸이고; "무염기" 또는 "ab"는 1'2'-디디옥시리보스이다. 다른 스페이서들도 본 명세서 및 도면에 설명된다.
표 2나 특정한 실시예에서 주지된 경우를 제외하고, 모든 뉴클레오티드 결합 및 핵산 부분과 스페이서 부분 사이의 결합은 포스포로티오에이트 에스테르이다. 예를 들어, 다수의 HEG 또는 C3 유닛(예를 들어, C-13, C-14, C-15, C-15, C-91, C-92, C-36, C-37, 및 C-38)을 갖는 화합물(다수 서브유닛) 스페이서 부분을 포함하는 CIC에서, C3 또는 HEG 유닛은 포스포로티오에이트 링커로 연결된다. 유사하게, 나타낸 분기 CIC(예를 들어, C-93, C-94, C-95, C-96, C-97, C-98, C-100, C-101, C-103, C-104, C-121, C-122, C-123, C124, C-125, C-126, C-127, C-129, C-130)는 스페이서의 분기 서브유닛과 선형 서브유닛 사이에 포스포로티오에이트 링커를 포함한다. 나타낸 다른 분기 CIC(예를 들어, C-26, C-99, C-102, C-105, 및 C-137)는 콘쥬게이션 전략에 의해 제조되며, 실시예들에 설명된 연결기를 가진다.
또한, 표 2는 이들 분자를 분기 스페이서 부분에 연결하여 분기 CIC를 만드는데 유용한 단부 연결기(예를 들어, HS(CH2)6- 및 HO(CH2)6SS(CH2)6)를 갖는 CIC(예를 들어, C-128, C106, C-133)을 포함한다. 이들 연결기는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 CIC에 연결된다.
실시예 2
선형 구조 및 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-10을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)이다.
C-10: 5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGA-3'
C-10 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다(당업계의 독자에게 분명한 대로, 예를 들어, CIC 합성에 관련하여 용어 "뉴클레오시드 단량체" 또는 "스페이서부분"이 때로 본원에서 사용되는데, 이것은 본원에 설명된 것들과 같은 합성 방법을 사용하여 탈보호되고 다른 성분에 연결되었을 때 CIC의 핵산 및 비-핵산 부분을 발생시키는 전구체 시약으로 간주한다). HEG 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 HEG 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3' 지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. HEG 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. HEG 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성 사이클은 탈트리틸화 단계, 커플링 단계(포스포라미다이트 단량체+1H-테트라졸), 캡핑 단계, 0.05M 3H-1,2-벤조티티올-3-온 1,1-디옥시드(Beaucage 시약)을 사용한 황화 단계, 및 최종 캡핑 단계로 구성된다. 어셈블리의 완료 시에, "트리틸-오프" 화합물을 조절된-기공성 유리(controlled-pore glass)로부터 절단했고, 염기들을 농축 수성 암모니아로 58℃에서 16시간 동안 탈보호했다. 화합물을 예비 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 정제하고, Sep-pak Plus 카트리지(Waters, 매사츄세츠 밀포드) 상에서 탈염하고, 2.5 부피의 95% 에탄올을 갖는 1M 수성 염화나트륨으로부터 침전시켰다. 분자를 Milli Q 수에 용해하고, 수율을 260nm에서의 흡광도로부터 결정했다. 마지막으로, 화합물을 가루로 동결견조했다. 화합물을모세관 겔 전기영동, 전자분무 질량분광법, 및 RP-HPLC로 특성화하여 조성 및 순도를 확인했다. 또한, 내독소 함량 분석(LAL 분석, Bio Whittaker)을 수행했으며, 내독소 수준은 < 5 EU/mg 화합물로 나타났다(즉, 본질적으로 내독소를 함유하지 않음).
C-8, C-21, C-22, C-23, C-24, C-32 및 M-1 및 다른 선형 HEG를 유사하게 합성했다.
실시예 3
선형 구조 및 프로필 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-11을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 프로필(C3)이다.
C-11: 5'-TCGTCG-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-11 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 4,4'-O-디메톡시트리틸-프로필-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. C3 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 C3 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. C3 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. C3 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
C-9 및 다른 C3-함유 CIC를 유사하게 합성했다.
실시예 4
선형 구조 및 부틸 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-17을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 부틸(C4)이다.
C-17: 5'-TCGTCG-3'-C4-5'-ACGTTCG-3'-C4-5'-AGATGAT-3'
C-11 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 4,4'-O-디메톡시트리틸-부틸-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(ChemGenes(매사츄세츠 애쉬랜드)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. C4 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 C3 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. C4 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. C4 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
실시예 5
선형 구조 및 트리에틸렌 글리콜 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-18을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 트리에틸렌 글리콜(TEG)이다.
C-18: 5'-TCGTCG-3'-TEG-5'-ACGTTCG-3'-TEG-5'-AGATGAT-3'
C-18 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 4,4'-O-디메톡시트리틸-트리에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. TEG 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 TEG 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. TEG 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. TEG 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
실시예 6
선형 구조 및 도데실 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-19를 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 도데실(C12)이다.
C-19: 5'-TCGTCG-3'-C12-5'-ACGTTCG-3'-C12-5'-AGATGAT-3'
C-19 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 4,4'-O-디메톡시트리틸-도데실-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. C12 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 C12 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. C12 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. C12 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
실시예 7
선형 구조 및 무염기 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-20을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 1',2'-디디옥시리보스(무염기)이다.
C-20: 5'-TCGTCG-3'-무염기-5'-ACGTTCG-3'-무염기-5'-AGATGAT-3'
C-20 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-1',2'-디디옥시리보스-3'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. 무염기 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 무염기 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. 무염기 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. 무염기 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
실시예 8
선형 구조 및 헥사에틸렌 글리콜과 트리에틸렌 글리콜 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-29을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산부분에 연결되는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)이고, 3'-단부 기는 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 트리에틸렌 글리콜(TEG)이다.
C-29: 5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
C-29 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 합성에서 고체 지지체로 사용된 트리에틸렌 글리콜-조절된-기공성 유리를 Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. HEG 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 HEG 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 트리에틸렌 글리콜 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. HEG 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. HEG 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
실시예 9
선형 구조 및 헥사에틸렌 글리콜과 트리에틸렌 글리콜 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-30을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분 및 5'-단부 기는 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)이고, 3'-단부 기는 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 트리에틸렌 글리콜(TEG)이다.
C-30: HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
C-30 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 합성에서 고체 지지체로 사용된 트리에틸렌 글리콜-조절된-기공성 유리를 Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. HEG 스페이서 전구체를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 HEG 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 트리에틸렌 글리콜 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. HEG 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. HEG 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
7. HEG 스페이서의 부가
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
실시예 10
선형 구조 및 헥사에틸렌 글리콜과 트리에틸렌 글리콜 스페이서를 갖고, 포스포디에스테르 결합을 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-31을 합성했다. 핵산 부분은 포스포디에스테르 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분 및 5'-단부 기는 포스포디에스테르 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)이고, 3'-단부 기는 포스포디에스테르 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 트리에틸렌 글리콜(TEG)이다.
C-31: HEG-5'-TCGTCG-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5'-AGATGAT-3'-TEG
C-31 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 합성에서 고체 지지체로 사용된 트리에틸렌 글리콜-조절된-기공성 유리를 Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분, 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(GlenResearch(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. HEG 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 HEG 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 트리에틸렌 글리콜 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. HEG 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. HEG 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
7. HEG 스페이서의 부가
합성 사이클은 탈트리틸화 단계, 커플링 단계(포스포라미다이트 단량체+1H-테트라졸), 캡핑 단계, 산화 단계, 및 최종 캡핑 단계로 구성된다. 어셈블리의 완료 시에, "트리틸-오프" 화합물을 조절된-기공성 유리로부터 절단했고, 염기들을 농축 수성 암모니아로 58℃에서 16시간 동안 탈보호했다. 화합물을 예비 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 정제하고, Sep-pak Plus 카트리지(Waters, 매사츄세츠 밀포드) 상에서 탈염하고, 2.5 부피의 95% 에탄올을 갖는 1M 수성 염화나트륨으로부터 침전시켰다. 분자를 Milli Q 수에 용해하고, 수율을 260nm에서의 흡광도로부터 결정했다. 마지막으로, 화합물을 가루로 동결견조했다. 화합물을 모세관 겔 전기영동, 전자분무 질량분광법, 및 RP-HPLC로 특성화하여 조성 및 순도를 확인했다. 또한, 내독소 함량 분석(LAL 분석, Bio Whittaker)을 수행했으며, 내독소 수준은 < 5 EU/mg 화합물로 나타났다.
실시예 11
선형 구조 및 2-(히드록시메틸)에틸 스페이서를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-25를 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 2-(히드록시메틸)에틸(HME)이다.
C-25: 5'-TCGTCG-3'-HME-5'-ACGTTCG-3'-HME-5'-AGATGAT-3'
C-25 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 1-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-3-O-레불리닐-글리세롤-2-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(GhemGenes(매사츄세츠 애쉬랜드)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. HME 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 HME 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. HME 스페이서의 부가
4. 5'-ACGTTCG-3' 부분의 합성
5. HME 스페이서의 부가
6. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다. 레불리닐기는 암모니아로 처리하는 동안 제거된다.
실시예 12
선형 구조 및 음으로 하전된 스페이서 부분을 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-13을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 연결되는 프로필(C3) 중합체이다.
C-13: 5'-TCGTCG-3'-(C3)15-5'-T-3'
C-13 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 4,4'-O-디메톡시트리틸-프로필-O-(N,N-디이소프로필)2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 무수 아세토니트릴에 0.1M의 최종 농도로 용해했다. C3 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 C3 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "T" 고체 지지체 사용
2. 15개 C3 스페이서의 부가
3. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
합성 사이클은 탈트리틸화 단계, 커플링 단계(포스포라미다이트 단량체+1H-테트라졸), 캡핑 단계, 9:1 아세토니트릴:피리딘 중의 0.02M 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온(ADTT)를 사용한 황화 단계, 및 최종 캡핑 단계로 구성된다. 어셈블리의 완료 시에, "트리틸-온" 화합물을 조절된-기공성 유리로부터 절단했고, 염기들을 농축 수성 암모니아로 58℃에서 16시간 동안 탈보호했다. 화합물을 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 중의 아세토니트릴의 구배를 증가시키면서 Hamilton PRP-1 칼럼 HPLC에 의해 정제했다. 정제된 화합물을 건조상태로 농축하고, 4,4'-디메톡시트리틸기를 80% 수성 아세트산으로 제거한 후, 화합물을 2.5 부피의 95% 에탄올을 갖는 1M 수성 염화나트륨으로부터 2회 침전시켰다. 화합물을 Milli Q 수에 용해하고, 수율을 260nm에서의 흡광도로부터 결정했다. 마지막으로, 화합물을 가루로 동결견조했다.
화합물을 모세관 겔 전기영동, 전자분무 질량분광법, 및 RP-HPLC로 특성화하여 조성 및 순도를 확인했다. 또한, 내독소 함량 분석(LAL 분석, Bio Whittaker)을 수행했으며, 내독소 수준은 < 5 EU/mg 화합물로 나타났다.
C-14, C-15 및 C-16을 유사하게 합성했다.
실시예 13
선형 구조 및 음으로 하전된 스페이서 부분을 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-38을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 연결되는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)이다.
C-38: 5'-TCGTCGA-3'-(HEG)4-5'-TCGTCGA-3'
C-38 분자를 실시예 2에 설명된 대로 합성했다. 스페이서 부분 전구체는 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)이다. 합성을 다음 단계들을 수행하여 달성했다:
1. 3'-지지체 결합된 "A" 고체 지지체 사용
2. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
3. 4개 HEG 스페이서의 부가
4. 5'-TCGTCGA-3' 부분의 합성
화합물을 실시예 12에 설명된 대로 HPLC를 사용하여 정제했다. 실시예 2에 설명된 대로 화합물을 특성화하고 내독소 함량을 결정했다.
실시예 14
선형 구조 및 3'-단부를 통해 부착된 핵산 부분을 양쪽에 갖는 음으로 하전된 스페이서 부분을 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-37을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이고, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 연결되는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)이다.
C-37: 5'-TCGTCGA-3'-(HEG)-3'-AGCTGCT-5'
C-37 분자를 실시예 2에 설명된 대로 합성했는데, 단, 5'-지지체 결합 뉴클레오시드 및 3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-5'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)를 제 1 핵산 부분을 합성하는데 사용했다. 스페이서 부분 전구체는 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌글리콜-O-(N,N-디이소프로필)2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)이다. 합성을 다음 단계들을 수행하여 달성했다:
1. 5'-지지체 결합 "T" 고체 지지체 사용
2. 3'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-5'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트를 갖는 3'-AGCTGC-5'의 합성(5'에서 3' 방향 합성)
3. 4개 HEG 스페이서의 부가
4. 5'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-3'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트를 갖는 5'-TCGTCGA-3'의 합성(3'에서 5' 방향 합성)
화합물을 실시예 12에 설명된 대로 HPLC를 사용하여 정제했다. 실시예 2에 설명된 대로 화합물을 특성화하고 내독소 함량을 결정했다.
실시예 15
분기 구조를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-27을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 글리세롤이다.
C-27: (5'-TCGTCGA-3')2-글리세롤-5'-AACGTTC-3'
C-27 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 1,3-디-(4,4'-O-디메톡시트리틸)-글리세롤-2-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(ChemGenes(매사츄세츠 애쉬랜드)로부터 입수한 대칭 분기 포스포라미다이트, 도 2)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. 글리세롤 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 글리세롤 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "C" 고체 지지체 사용
2. 5'-AACGTT-3' 부분의 합성
3. 글리세롤에 기초한 대칭 분기 포스포라미다이트의 부가
4. 2개 5'-TCGTCGA-3' 부분의 동시 합성
이 분기 화합물의 제조는 실시예 2에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 따랐는데, 단, 단계 4에서 2개의 핵산 사슬이 동시에 조립되기 때문에 합성 사이클로 송달되는 각 시약을 2배로 했다. 도 2에 나타낸 대칭 분기 포스포라미다이트는 대칭 분기 포스포라미다이트의 부가 후에 합성된 핵산 서열들이 동일해야 하지만, 그것의 부가 전에 합성된 핵산 서열은 후속 서열들과 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
실시예 2에 설명된 대로 분기 화합물을 정제하고 특성화했다.
C-28을 유사하게 합성했다.
실시예 16
분기 구조를 갖고, 3'-단부를 통해 부착된 모든 핵산 부분을 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-95를 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 글리세롤 및 HEG이다.
C-95: (5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-글리세롤-HEG-3'-AGCTGCT-5'
C-95 분자를 실시예 2에 설명된 대로 합성했는데, 단, 5'-지지체 결합 뉴클레오시드 및 3'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-5'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research, 버지니아 스터링)를 제 1 핵산 부분을 합성하는데 사용했다. 분기 스페이서 부분 전구체는 1,3-디-(4,4'-O-디메톡시트리틸)-글리세롤-2-O-(N,N-디이소프로필)2-시아노에틸포스포라미다이트(ChemGenes(매사츄세츠 애쉬랜드)로부터 입수한 대칭 분기 포스포라미다이트)이다. 합성을 다음 단계들을 수행하여 달성했다:
1. 5'-지지체 결합 "T" 고체 지지체 사용
2. 3'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-5'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트를 갖는 3'-AGCTGC-5'의 합성(5'에서 3' 방향 합성)
3. 4개 HEG 스페이서의 부가
4. 글리세롤에 기초한 대칭 분기 포스포라미다이트의 부가
5. 2개 HEG 스페이서의 동시 부가
6. 5'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-보호된 뉴클레오시드-3'-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트를 갖는 2개 5'-TCGTCGA-3'의 동시 합성(3'에서 5' 방향 합성)
이 분기 화합물의 제조는 실시예 2에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 따랐는데, 단, 단계 5 및 6에서 2개의 핵산 사슬이 동시에 조립되기 때문에 합성 사이클로 송달되는 각 시약을 2배로 했다. 도 2에 나타낸 대칭 분기 포스포라미다이트는 대칭 분기 포스포라미다이트의 부가 후에 합성된 핵산 서열들이 동일해야 하지만, 그것의 부가 전에 합성된 핵산 서열은 후속 서열들과 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
화합물을 실시예 12에 설명된 대로 HPLC를 사용하여 정제했다. 실시예 2에 설명된 대로 화합물을 특성화하고 내독소 함량을 결정했다.
실시예 17
분기 구조를 갖고, 3개의 상이한 핵산 부분을 함유하는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 식을 갖는 C-35를 합성했다. 핵산은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이고, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 글리세롤이다.
C-35 분자를 실시예 2에 설명된 대로 합성한다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체, 1-(4,4'-0-디메톡시트리틸)-3-0-레불리닐-글리세롤-2-0-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(ChemGenes(매사츄세츠 애쉬랜드)로부터 입수한 비대칭 분기 포스포라미다이트, 도 2)를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해한다. 글리세롤 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓는다. 뉴클레오티드 단량체와 글리세롤 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍한다.
1. 3'-지지체 결합 "T" 고체 지지체 사용
2. 5'-AGATGA-3' 부분의 합성
3. 글리세롤에 기초한 비대칭 분기 포스포라미다이트의 부가
5. AACGTTC 부분의 탈트리틸화 및 캡핑
6. 레불리닐 보호기의 제거
7. 5'-TCGTCGA-3' 부분의 합성
합성은 본질적으로 실시예 2에 설명된 대로 일어나며, 단, 단계 4 후에 5'-AACGTTC-3' 부분을 탈트리틸화하고 무수 아세트산/N-메틸이미다졸로 캡핑하여 핵산 부분을 종결한다. 다음에, 레불리닐 보호기를 3:2 피리딘:아세트산/pH 5.1 중의 0.5M 히드라진 수화물로 5분간 제거한다. 화합물-함유 고체 지지체를 무수 아세토니트릴로 잘 세척하고, 실시예 2에 설명된 프로토콜을 사용하여 5'-TCGTCGA-3' 부분을 부가한다.
실시예 2에 설명된 대로 분기 화합물을 정제하고 특성화한다.
실시예 18
콘쥬게이션 전략에 의한 분기 구조를 갖는 키메라 화합물의 합성
C-36을 도 3에 나타낸 대로 합성한다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이고, 스페이서 부분은 STARBURSTW 덴드리머에 기초한다. 핵산 부분은 5'-C6-디술피드 스페이서(티올-변형제 C6 S-S, Glen Research(버지니아 스터링) 제품 번호 10-1926-xx)로 합성하며, 이것은 환원 시 덴드리머 상의 말레이미드기와 반응할 수 있는 티올기를 제공한다.
5'-C6-디술피드-TCGTCGA(4)의 합성:
5'-C6-디술피드-TCGTCGA를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 합성한다. 뉴클레오시드 단량체 및 티올-변형제 C6 S-S(Glen Research, 버지니아 스터링)를 무수 아세토니트릴에 0.1M의 최종 농도로 용해한다. 티올-변형제를기기의 보조 단량체 자리에 놓는다. 뉴클레오티드 단량체와 티올 변형제를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍한다.
1. 3'-지지체 결합 "A" 고체 지지체 사용
2. 5'-TCGTCG-3' 부분의 합성
3. 티올 변형제 전구체(S-트리틸-6-메르캅토헥실)-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필) 포스포라미다이트)의 부가
합성 사이클은 탈트리틸화 단계, 커플링 단계(포스포라미다이트 단량체+1H-테트라졸), 캡핑 단계, 9:1 아세토니트릴:피리딘 중의 0.02M 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온을 사용한 황화 단계, 및 최종 캡핑 단계로 구성된다. 어셈블리의 완료 시에, "트리틸-온" 화합물을 조절된-기공성 유리로부터 절단하고, 염기들을 농축 수성 암모니아로 58℃에서 16시간 동안 탈보호한다. 화합물을 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 중의 아세토니트릴의 구배를 증가시키면서 Hamilton PRP-1 칼럼 HPLC에 의해 정제한다. 정제된 화합물을 건조상태로 농축하고, 4,4'-디메톡시트리틸기를 80% 수성 아세트산으로 제거한 후, 화합물을 2.5 부피의 95% 에탄올을 갖는 1M 수성 염화나트륨으로부터 2회 침전시킨다. 화합물을 Milli Q 수에 용해하고, 수율을 260nm에서의 흡광도로부터 결정한다. 마지막으로, 화합물을 가루로 동결견조한다.
화합물을 모세관 겔 전기영동, 전자분무 질량분광법, 및 RP-HPLC로 특성화하여 조성 및 순도를 확인한다. 또한, 내독소 함량 분석(LAL 분석, Bio Whittaker)이 수행되며, 내독소 수준은 < 5 EU/mg 화합물로 나타난다.
5'-티올-C6-TCGTCGA(5)의 합성:
디술피드 변형 핵산(4)을 트리스(2-카르복시에틸포스핀) 염산염(TCEP; Pierce, 일리노이 락포드)를 사용하여 티올로 환원시킨다. 핵산을 0.1M 인산나트륨/0.15M 염화나트륨/pH 7.5를 함유하는 완충액에 20mg/ml의 농도로 용해한다. 개별 바이알에 TCEP를 0.1M 인산나트륨/0.15M 염화나트륨/pH 7.5에 0.17M의 최종 농도로 용해한다. 핵산에 TCEP 5당량을 가하고 부드럽게 혼합한다. 용액을 40℃에서 120분간 인큐베이션한 후, 크기 배제 크로마토그래피(Pharmacia P2 칼럼)으로 정제하여 5'-티올-C6-TCGTCGA(5)를 수득한다.
말레이미드-변형 STARBURST 덴드리머(7)의 합성:
Aldrich(위스콘신 밀워키)로부터 여러 수의 팔(4, 8, 16, 32, 64 등)을 갖는 STARBURST덴드리머를 입수한다. 4개 아미노기를 갖는 Starburst 덴드리머(6)를 디메틸포름아미드(DMF)에 0.2M 농도로 용해한다. 다음에, 트리에틸아민(10당량)과 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfo-SMCC; 8당량, Pierce, 일리노이 락포드)을 가하고, 용액을 2시간 또는 박층 크로마토그래피(TLC; 10% 메탄올/디클로로메탄)로 측정하여 반응 완료 시까지 교반한다. 반응을 물로 30분간 급냉시킨 후 DMF를 진공에서 제거한다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해하고, 포화 중탄산나트륨 수용액으로 2회 세척한 후 물로 세척한다. 유기상을 MgSO4 위에서 건조시키고 여과하고 진공에서 건조상태로 농축한다. 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여7을 수득한다.
STARBURST덴드리머-(5'-TCGTCGA-3')4(8)의 합성:
말레이미드-변형 STARBURST덴드리머(6)를 DMSO에 용해하고(5mg/ml), 0.1M 인산나트륨/0.15M 염화나트륨/pH 7.5에 10mg/ml의 농도로 용해된 정제된 5'-C6-티올-TCGTCGA(5)(10당량)를 적가한다. 결과의 혼합물을 40℃에서 하룻밤 교반한다. 콘쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피(Sephadex G-25)로 정제하여 화합물8을 수득한다.
실시예 19
분기 구조를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-94를 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 글리세롤이다.
C-94: (5'-TCGTCGA-3'-HEG)2-글리세롤-HEG-5'-TCGTCGA-3'
C-94 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체 [1,3-디-(4,4'-O-디메톡시트리틸)-글리세롤-2-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(ChemGenes(매사츄세츠 애쉬랜드)로부터 입수한 대칭 분기 포스포라미다이트, 도 2) 및 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아스터링)로부터 입수)]를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. 글리세 및 HEG 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체, HEG 스페이서 및 글리세롤 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "A" 고체 지지체 사용
2. 5'-TCGTCGA-3' 부분의 합성
3. HEG 스페이서의 부가
4. 글리세롤에 기초한 대칭 분기 포스포라미다이트의 부가
5. 2개 HEG 스페이서의 동시 부가
4. 2개 5'-TCGTCGA-3' 부분의 동시 합성
이 분기 화합물의 제조는 실시예 2에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 따랐는데, 단, 단계 5 및 6에서 2개의 핵산 사슬이 동시에 조립되기 때문에 합성 사이클로 송달되는 각 시약을 2배로 했다. 도 2에 나타낸 대칭 분기 포스포라미다이트는 대칭 분기 포스포라미다이트의 부가 후에 합성된 핵산 서열들이 동일해야 하지만, 그것의 부가 전에 합성된 핵산 서열은 후속 서열들과 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
분기 화합물을 실시예 12에 설명된 대로 HPLC로 정제했고, 실시예 2에 설명된 대로 특성화했다.
C-96 및 C-101을 유사하게 합성했다.
또한, C-103 및 C-104를 동일한 방법으로 합성했는데, 단, 헥사에틸렌 글리콜 스페이서 대신에 각각 트리에틸렌 글리콜 또는 프로필 스페이서를 사용했다.
실시예 20
분기 구조를 갖는 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-98을 합성했다. 핵산 부분은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포로티오에이트 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 글리세롤이다.
C-98: (5'-TCGTCGA-3'-HEG)3-트레블러-HEG-5'-AACGTTC-3'-HEG-5'-TCGA-3'
C-98 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체 [트레블러 포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수 및 4,4'-O-디메톡시트리틸-헥사에틸렌 글리콜-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)]를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. 트레블러 및 HEG 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체, HEG 스페이서 및 트레블러 스페이서를 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "A" 고체 지지체 사용
2. 5'-TCGA-3' 부분의 합성
3. HEG 스페이서의 부가
4. 5'-AACGTTC-3' 부분의 합성
5. HEG 스페이서의 부가
6. 트레블러 포스포라미다이트(도 2 참조)의 부가
7. 3개 HEG 스페이서의 동시 부가
8. 3개 5'-TCGTCGA-3' 부분의 동시 합성
이 분기 화합물의 제조는 실시예 2에 설명된 것과 동일한 프로토콜을 따랐는데, 단, 단계 7 및 8에서 3개의 핵산 사슬이 동시에 조립되기 때문에 합성 사이클로 송달되는 각 시약을 3배로 했다. 도 2에 나타낸 대칭 트레블러 포스포라미다이트는 대칭 트레블러 포스포라미다이트의 부가 후에 합성된 핵산 서열들이 동일해야 하지만, 그것의 부가 전에 합성된 핵산 서열은 후속 서열들과 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
분기 화합물을 실시예 12에 설명된 대로 HPLC로 정제했고, 실시예 2에 설명된 대로 특성화했다.
실시예 21
헥사에틸렌 글리콜 스페이서 및 3'-티올 링커를 갖는 선형 키메라 화합물의 합성
먼저 3'-티올 링커를 함유하는 CIC를 합성하고 그들의 디술피드 유도체로 정제한다. 다음에, 디술피드기를 환원시켜 반응성 티올기를 얻는다. 예를 들어, C-116을 합성하기 위해, C-8을 실시예 2에서처럼 합성했는데, 단, "T" 고체 지지체대신에 3'-티올 변형제 C3 S-S CPG(Glen Research, 버지니아 스터링)를 고체 지지체로 사용했다.
C-116: 5'-TCGTCGA-3'-HEG-5'-ACGTTCG-3'-HEG-5AGATGAT-3'-(CH2)3SS(CH2)30H
C-116은 [C-8]-3'-디술피드로 설명될 수 있다는 것이 인정될 것이다. CIC를 실시예 12에 설명된 대로 HPLC로 정제했다. 화합물을 실시예 2에 설명된 대로 특성화했다.
C-116을 트리스(2-카르복시에틸포스핀) 염산염(TCEP; Pierce, 일리노이 락포드)를 사용하여 티올로 환원시켰다. C-116을 100mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/ 1mM EDTA/pH 7.4 완충액에 30.5mg/ml(0.8ml, 24.4mg; 3.14umol)의 농도로 용해했다. 개별 바이알에 TCEP를 100mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/1mM EDTA/pH 7.4 완충액에 0.167M의 농도로 용해했다. CIC 용액에 TCEP 스톡 용액 5당량(100ul, 4.8mg, 17umol)을 가했다. 용액을 부드럽게 혼합하고, 40℃에서 120분간 인큐베이션하고, Sephadex G-25 칼럼(5ml, Amersham Pharmacia, 뉴저지 피스카타웨이) 상에서 정제하여 C-117(13.2mg)를 수득했다. C-117은 [C-8]-3'-티오로 설명될 수 있다는 것이 인정될 것이다. CIC를 실시예 12에 설명된 대로 HPLC로 정제했다.
C-115를 C-114로부터 유사하게 합성했다.
실시예 22
프로필 스페이서 및 5'-티올 링커를 갖는 선형 키메라 화합물의 합성
먼저 5'-티올 링커를 함유하는 CIC를 합성하고 그들의 이황화 유도체로 정제한다. 다음에, 이황화기를 환원시켜 반응성 티올기를 얻는다. 화합물 C-110(하기)은 5'-디술피드-C-11로 설명될 수 있다. 화합물 C-11은 5'-티올-C-11로 설명될 수 있다.
C-110: HO(CH2)6SS(CH2)6-5'-TCGTCG-3'-C3-5'-ACGTTCG-3'-C3-5'-AGATGAT-3'
C-110을 실시예 3에서처럼 합성했는데, 단, 최종 커플링 단계에서 티올 변형제 C6 S-S(Glen Research, 버지니아 스터링)을 사용했다. CIC를 실시예 12에 설명된 대로 HPLC로 정제했다. 화합물을 실시예 2에 설명된 대로 특성화했다. 실시예 2에 설명된 대로, C-110을 트리스(2-카르복시에틸포스핀) 염산염(TCEP; Pierce, 일리노이 락포드)를 사용하여 티올로 환원시켰다.
C-107, C-113 및 P-16을 유사하게 합성했다.
실시예 23
콘쥬게이션 전략에 의한 분기 구조를 갖는 키메라 화합물의 합성
C-105를 도 4에 나타낸 대로 합성했다. 디메틸포름아미드(DMF)에 4.3mg/ml의 농도로 트리스(2-말레이미도에틸)아민(TMEA, Pierce, 일리노이 락포드)를 용해했다. TMEA 용액(12ul, 52ug, 1.0당량)을 100mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/1mM EDTA/pH 7.4 완충액에 용해된 C-117(237ul, 4.0mg, 4.0당량) 용액에 가하고 잘 혼합했다. 용액을 실온에서 하룻밤 방치하고, 10mM 인산나트륨/141mM 염화나트륨/pH 7.0 완충액으로 Superdex 200 칼럼(24ml, Amersham Pharmacia, 뉴저지 피스카타웨이) 상에서 정제했다. 생성물을 진공에서 건조시키고, 0.4ml Milli Q 수에 용해하고, 95% 에탄올 0.1ml로 침전시켰다. -20℃에서 1시간 동안 냉동한 후, 혼합물을 원심분리하고(14K RPM에서 2분), 상청액을 주의깊게 제거했다. 펠릿을 0.35ml Milli Q 수에 용해하여 C-115의 농도를 측정했다(0.4mg 분리됨). 화합물을 실시예 2에 설명된 대로 분석했다.
C-99를 유사하게 합성했다.
실시예 24
콘쥬게이션 전략에 의한 분기 구조를 갖는 키메라 화합물의 합성
A. 말레이미도-STARBURST DENDRIMERGeneration 2의 합성
16개의 히드록실기를 함유하는 STARBURST DENDRIMER, Generation 2를 메탄올에 용해된 20% 용액으로 Aldrich(위스콘신 밀워키)로부터 구입했다. 진공에서 덴드리머(191ul, 38.2mg, 11.7umol)를 건조시키고, 200ul의 DMF에 다시 용해하고, 진공에서 다시 건조시켜 마지막 미량의 메탄올까지 제거했다. 말레이미도-덴드리머를 제조하기 위해서, 개별 유리 바이알에서 200ul DMF에 N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(PMPI, 50mg, 233.5umol)를 용해한 후 덴드리머에 재빨리 가했다. 혼합물을 덴드리머가 용해될 때까지 휘저었다. 용액을 실온에서 하룻밤 동안 회전 혼합기에 두었다. 용액을 진공에서 농축하고, 20% 메탄올/디클로로메탄(1ml)에 용해하고, 20% 메탄올/디클로로메탄으로 7.5g 실리카겔 칼럼(70-230메시, 60A) 상에서 정제했다. 말레이미도-덴드리머 생성물은 칼럼으로부터 첫번째 분획 중에 용출되었고(잔류 DMF의 존재로 인해), PMPI 부산물은 함유하지 않았다. 생성물을 황갈색 고체로 농축했다(10mg, 수율 13%).
B. STARBURST DENDRIMER-(5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA)X=3-16(SEQ ID N0:2) (C-102)의 합성
말레이미도-덴드리머(5.7mg)를 디메틸술폭시드(DMSO)에 용해하여 2.5mg/ml 농도의 스톡 용액을 만들었다. 말레이미도-덴드리머 스톡 용액(100ul, 0.25mg, 0.0375umol)을 100mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/1mM EDTA/pH 7.4 완충액(0.7ml)에 용해된 C-107(9.1mg, 1.2umol) 용액에 가했다. 용액을 실온에서 하룻밤 동안 회전 혼합기에 두었고, 생성물을 10mM 인산나트륨/141mM 염화나트륨/pH 7.0 완충액으로 Superdex 200 칼럼(24ml, Amersham Pharmacia, 뉴저지 피스카타웨이) 상에서 정제했다. 생성물은 10.4분에 보이드 부피 중에 용출되었다(1.3mg). 1.2% 아가로스 E-겔(Invitrogen, 캘리포니아 칼스배드) 상에서의 분석에 의하면, 생성물은 고분자량 종들의 혼합물인 것으로 밝혀졌으며, 이는 덴드리머 상에 폴리뉴클레오티드가 상이하게 로딩된 것을 나타낸다.
C-102는 1kb에서 15kb 이상의 생성물들의 혼합물로 되었다(이중가닥 DNA 마커와 비교한 유효 크기)
실시예 25
프로필 스페이서 및 혼성 포스포디에스테르/포스포로티오에이트 결합을 갖는 선형 키메라 화합물의 합성
하기 나타낸 구조를 갖는 C-84를 합성했다. 핵산 부분은, 소문자 "s"로 나타낸 포스포로티오에이트 결합, 또는 포스포디에스테르 결합(모든 다른 결합들)을갖는 DNA이며, 스페이서 부분은 포스포디에스테르 결합을 통해 핵산 부분에 연결되는 프로필(C3)이다.
C-84: 5'-GsGs-3'-C3-5'-TGC-3'-C3-5'-ATCGAT-3'-C3-5'-GCA-3'-C3-5'-GGsGsGsGsG-3' (여기서, 소문자 "s"가 포스포로티오에이트 결합을 나타내며, 나머지 결합들은 포스포디에스테르이다)
C-84 분자를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 1umol 포스포로티오에이트 DNA에 대한 제조자의 프로토콜을 사용하여 TriLink Bio Technologies(캘리포니아 샌디에고)에 의해 합성했다. 포스포로티오에이트 결합은 염기에 대해 대문자를 사용하여 프로그래밍했고, 포스포디에스테르 결합은 염기에 대해 소문자를 사용하여 프로그래밍했으며, 보조 위치들은 프로필 스페이서 포스포라미다이트를 함유한다. 뉴클레오시드 단량체 및 스페이서 부분 전구체 4,4'-O-디메톡시트리틸-프로필-O-(N,N-디이소프로필) 2-시아노에틸포스포라미다이트(Glen Research(버지니아 스터링)로부터 입수)]를 무수 아세토니트릴에 0.05M의 최종 농도로 용해했다. C3 스페이서를 기기의 보조 단량체 자리에 놓았다. 뉴클레오티드 단량체와 C3 스페이서 원하는 순서로 부가하면서, 핵산 부분의 합성은 3'에서 5' 방향으로 일어나도록 기기를 프로그래밍했다.
1. 3'-지지체 결합된 "G" 고체 지지체 사용
2. 5'-GGsGsGsGsG-3'의 합성
3. C3 스페이서의 부가
4. 5'-GCA-3'의 합성
5. C3 스페이서의 부가
6. 5'-ATCGAT-3'의 합성
7. C3 스페이서의 부가
8. 5'-TGC-3'의 합성
9. C3 스페이서의 부가
10. 5'-GsGs-3'의 합성
합성, 탈보호, 워크업, 및 분석은 실시예 2에 설명된 대로 수행했다.
C-85 및 C-87을 유사하게 합성했다.
실시예 26
8개 미만의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성
8개 미만의 염기를 함유하고 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 Perseptive Biosystems Expedite 8909 자동 DNA 합성기 상에서 합성했다. 폴리뉴클레오티드를 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 중의 아세토니트릴의 구배를 증가시키면서 Polymer Labs PLRP-S 칼럼 RP-HPLC로 정제했다. 정제된 폴리뉴클레오티드를 건조상태로 농축했고, 4,4'-디메톡시트리틸기를 80% 수성 아세트산으로 제거한 후, 화합물을 3 부피의 이소프로판올을 갖는 0.6M 수성 나트륨 아세테이트/pH 5.0으로부터 2회 침전시켰다. 폴리뉴클레오티드를 Milli Q 수에 용해하고, 수율을 260nm에서의 흡광도로부터 결정했다. 마지막으로, 폴리뉴클레오티드를 가루로 동결건조시켰다. 실시예 2에 설명된 대로 폴리뉴클레오티드를 특성화하고 내독소 함량을 결정했다.
실시예 27
양이온계 폴리(락트산, 글리콜산) 마이크로캐리어(cPLGA)를 다음과 같이 제조했다. 0.41dl/g의 고유점도를 갖는 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) 50:50 중합체(Boehringer Mannheim, 인디애나 인디애나폴리스) 0.875g을 염화메틸렌 7.875g에 10% w/w 농도로 DOTAP 0.3g과 함께 용해했다. 다음에, 투명한 유기상을 PVA 수용액(0.35% w/v) 500ml에서 실험실용 혼합기(Silverson L4R, Silverson Instruments)를 사용하여 실온에서 30분간 4000rpm에서 균질화하여 에멀젼으로 만들었다. 다음에, 시스템 온도를 혼합 용기의 재킷을 통해 뜨거운 물을 순환시켜 40℃까지 올렸다. 동시에, 교반 속도는 1500rpm으로 줄였으며, 이들 조건을 2시간 동안 유지하여 염화메틸렌을 추출증발시켰다. 마이크로스피어 현탁액을 차가운 물을 순환시켜 실온까지 냉각시켰다.
마이크로캐리어를 실온에서 10분간 8000rpm으로 원심분리하여 분리(Beckman Instruments)했고, 욕조를 부드럽게 초음파분해하여 탈이온수에 재현탁했다. 원심분리 세척을 2번 더 반복하여 과량의 PVA를 입자 표면으로부터 제거했다. 입자들의 최종 원심분리 펠릿을 대략 10ml의 물에 현탁하고, 하룻밤 동안 동결건조했다. 건조된 양이온계 마이크로캐리어 가루를 크기 및 표면 전하에 대해 특성화했다: 평균 크기(갯수 가중, μ) = 1.4; 제타 전위(mV) = 32.4.
실시예 28
CIC에 의한 사람 세포의 면역조절
(1) 스페이서 부분을 함유하는 키메라 분자 및 (2) 폴리뉴클레오티드의 면역조절 활성을 평가하는 시험을 수행했다.
키메라 화합물 및 폴리뉴클레오티드를 상기 설명된 대로, 또는 종래의 포스포로라미데이트 화학에 의해 합성했다. 폴리뉴클레오티드 P-6 및 P-7을 Hybridon Specialty Products(매사츄세츠 밀포드)에 의해 합성했다. 본원에 개시된 루틴한 분석에 의해 면역조절 활성을 결정했다.
헤파린 첨가 주사기로 정맥천자하여 지원자로부터 말초혈을 수집했다. 혈액을 FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech) 쿠션 위에 층으로 만들어 원심분리했다. FICOLL계면에 위치된 PBMC를 수집한 후, 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 2번 세척했다. 세포를 재현탁하고, 37℃에서 48-웰 플레이트(실시예 29-32) 또는 96-웰 플레이트(실시예 33-40)에서 10% 열-비활성화 사람 AB 혈청 + 50유닛/ml 페니실린, 50㎍/ml 글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 및 1xMEM 비-필수 아미노산(NEAA)를 갖는 RPMI 1640에서 2x106세포/ml로 배양했다.
세포를 시험 샘플의 부재하에, 20㎍/ml(0.5 OD/ml)의 시험 샘플의 존재하에, 또는 100㎍/ml cPLGA(사용되었을 때)와 함께 미리 혼합된 20㎍/ml의 시험 샘플의 존재하에 24시간 동안 배양했다. 다음에, 세포-프리 배지를 각 웰로부터 수집하여, IFN-γ 및 IFN-α 농도에 대해 분석했다. SAC(Pansorbin CalBiochem, 1/5000 희석)을 양성 대조군으로 사용했다. SAC는Staph. aureus(cowan) 세포 물질을 함유한다.
BioSource International,Inc.로부터의 CYTOSCREENTMELISA 키트를 제조자의지시에 따라 사용하여 IFN-γ 및 IFN-α를 분석했다.
사람 PBMC 분석에서, IFN-γ의 바탕 수준은 제공자에 따라 변할 수 있다(심지어 유의하게도 변할 수 있다). IFN-α 수준은 일반적으로 자극되지 않은 상태에서 더 낮은 바탕 수준을 나타낸다.
이러한 분석으로부터의 결과의 예들을 하기 실시예 29-40에 나타낸다.
나타낸 실험들 각각에서, "배지 단독" 및 "p-7"은 음성 대조군이다. "P-7"은 면역자극 활성을 갖지 않는 것으로 이미 나타났다. SAC 및 "P-6"은 양성 대조군이다. P-6은 상당한 면역자극 활성을 갖는 것으로 이미 나타났다.
실시예 29
CIC의 면역자극 활성
이 실시예는 4개의 상이한 CIC가 IFN-γ 및 IFN-α 분비의 자극에 의해 증명된 대로 상당한 면역조절 활성을 가졌다는 것을 나타낸다(표 3). 예상된 대로 P-7은 활성을 갖지 않았다. 게다가, P-1, TCG-함유 7량체도 활성을 갖지 않았다. 흥미롭게도, HEG 및 프로필 스페이서 부분을 갖는 CIC는 INF-α 분비의 자극 정도가 상이했다. 두 종류의 CIC가 모두 INF-α 분비를 자극했지만, 그 효과는 HEG-함유 CIC에서 더욱 현저했다.
실시예 30
폴리뉴클레오티드의 합성
이 실시예는 폴리뉴클레오티드 P-1, P-2, P-3, P-4 및 P-5가 면역조절 활성을 갖지 않았다는 것을 나타낸다(표 4). 이들 폴리뉴클레오티드는 면역조절 활성을 가진다고 실시예 29에 나타낸, C-10 및 C-11의 핵산 부분들의 서열을 가진다.
실시예 31
폴리뉴클레오티드 혼합물의 활성
이 실시예는 폴리뉴클레오티드 P-1과 P-3의 혼합물, 또는 P-1, P-3, P-4 및 P-5의 혼합물이 면역조절 활성을 갖지 않았다는 것을 나타낸다(표 5). 이들 폴리뉴클레오티드는 면역조절 활성을 가졌던 C-10 및 C-11의 핵산 부분들의 서열을 가진다. 혼합물들은 20㎍/ml 총 폴리뉴클레오티드의 총 농도로 각 폴리뉴클레오티드를 동일한 양으로 함유했다.
실시예 32
CIC의 면역조절 활성
이 실시예는, 실시예 29 및 31과 다른 제공자를 사용한 분석에서, C-10 및 C-11의 면역조절 활성을 나타낸다(표 6).
실시예 33
CIC의 면역조절 활성
이 실시예는, 실시예 29와 다른 제공자를 사용한 분석에서, C-8 및 C-9의 면역조절 활성을 나타낸다(표 7). P-2인 TCG-함유 6량체는 활성을 갖지 않았다.
실시예 34
CIC의 면역조절 활성
표 8에 나타낸 분석은 본 발명의 몇몇 CIC, 즉 다양한 상이한 짧은 핵산 부분 및 다양한 상이한 스페이서 부분을 특징으로 하는 CIC의 면역자극 활성을 증명한다. 또한, 표 8은 혼성 HEG/핵산 구조는 갖지만 어떤 5'-C,G-3' 서열은 갖지 않으며(표 2 참조), 뿐만 아니라 다른 화합물(C-19)들을 함유하는 화합물 M-1이 활성을 나타내지 않았음을 나타낸다. cPLGA를 갖는 CIC의 제제는 IFN-α의 유도를 상당히 증진시켰다. 또한, IFN-γ 수준도 어떤 경우에는 증가했다. 번호 "28---"은 제공자 개체를 나타내는 번호이다.
표 8을 살펴보면 Donor 28065가 IFN-γ 분석에서 높은 바탕값을 나타냈음이 분명할 것이다. "1000"으로 나타낸 수치들은 분석의 감응한계를 벗어난 측정값들을 나타낸다.
실시예 42
CIC에 의한 마우스 세포의 면역조절
폴리뉴클레오티드 및 키메라 화합물을 마우스 비장세포에 대한 면역자극 활성에 대해 시험했다. 면역자극을 배양 배지로의 사이토카인 분비를 측정하여 평가했다. 배양 상청액에서 사이토카인 수준을 효소면역측정법(ELISA) 시험에 의해 결정했다.
세포를 분리하고 표준 기술을 사용하여 제조했다. 8 내지 20주 된 BALA/c 마우스의 비장을 채취했고, 표준 티징법(teasing)을 사용하고 BioWhittaker, Inc.의 ACK 용해 완충액으로 처리하여 비장세포를 분리했다. 이 실험에서는 4개의 비장을 모았다. 분리된 세포를 2% 열-비활성화 태아소혈청(FCS), 50μM 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지로 세척했고, 10% FCS/RPMI(10% 열-비활성화 FCS, 50μM 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 2mM L-글루타민을 갖는 RPMI 1640 배지) 중에 대략 7x105세포/ml로 재현탁했다.
세포 배양을 96-웰 플렛 마이크로타이터 플레이트에서 100㎕ 10% FCS/RPMI에서 대략 7x105세포/웰을 사용하여 3회 셋업했으며, 플레이팅 후 적어도 1시간 동안은 세포를 휴지시켰다. 나타낸 시험 화합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다(나타낸 농도에서). 세포 상청액을 채취하여 -80℃에서 냉동했다. 세포에 의한 사이토카인 생성을 ELISA에 의해 결정했으며, 표 9에 나타낸다.
실시예 35
3-뉴클레오티드 핵산 부분을 함유하는 CIC의 활성 및 cPLGA에 의한 활성 증진
이 실시예는 cPLGA의 존재 및 부재하에서의 몇몇 CIC의 면역자극 활성을 나타내며, 사람 PBMC를 사용하여 분석되었다. 흥미롭게도, C-30의 포스포디에스테르 버전(C-31)은 CIC 단독으로서는 비활성이었지만, cPLGA와 함께 조제되었을 때는 양호한 활성을 가졌다. 사실상, 일반적인 경향은 모든 포스포디에스테르 결합(C-31, C-36 및 C-93)을 함유하는 CIC들은 CIC 단독으로는 비활성이었지만, 그들이 cPLGA와 함께 조제되었을 때는 상당히 더 활성으로 되었다.
3량체 핵산 부분만을 함유하는 CIC인 C-32는 단독 사용되었을 때 활성을 가졌고, cPLGA와 함께 조제되었을 때는 더 많은 활성을 나타냈다. 표 10 참조.
실시예 36
5' TCG를 함유하는 CIC의 면역자극 활성
이 실시예는 다양한 핵산 부분들을 함유하는 CIC에 의한 면역조절을 나타낸다(표 11 참조). 일반적으로 5'-TCG3'(C-8, C-21, C-50, C-51 등)나 5'-NTCG(C-46)(여기서, N은 어떤 뉴클레오시드이다)을 함유하는 서열은 다른 CG-함유 CIC(C-24, C-52)보다 더욱 활성이었다. 추가로, 대부분의 CIC들은 상당한 양의 IFN-γ를 유도했으며, 그 결과는 IFN-α의 유도보다 더욱 가변적이었는데, 이것은 IFN-α 유도에 대한 모티프 필요조건이 IFN-γ 유도에 대한 것들보다 더욱 엄격할 수 있음을암시한다. 구체적으로, 5'-TCGA-3'를 함유하는 CIC(C-50, C-51, C-45)는 5'-TCGT-3'를 함유하는 CIC들(C-41, C-42, C-52)보다 더 많은 IFN-α를 발생시켰다.
C-8 및 C-21(모티프 5' TCGTCGA-3'를 포함)의 예상에 있어서, 최상의 IFN-α 유도는 5' 위치에 TCGA를 갖는 CIC에 의해 발생되었다.
6량체(C-22), 5량체(C-43), 및 4량체(C-44) 핵산 부분만을 함유하는 CIC는 단독 사용되었을 때 IFN-γ를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 이들 각 CIC 뿐만 아니라, 3량체 핵산 부분만을 함유하는 C-32는 cPLGA와 함께 조제되었을 때 상당한 IFN-γ 및 IFN-α를 유도했다. 2개의 7량체 핵산 부분을 갖는 CIC인 C-39는 단독 사용되었을 때 활성이었고, 1개의 6량체와 1개의 4량체 핵산 부분을 갖는 CIC인 C-40은 이 실험에서 비활성이었다. 이들 CIC는 모두 cPLGA와 함께 조제되었을 때 유의한 활성을 나타냈다.
실시예 37
CIC의 면역자극 활성
이 실험은 추가의 선형 CIC(포스포로티오에이트(PS)와 포스포디에스테르(PO)를 모두 함유하는 어떤 것) 및 분기 CIC에 대한 면역조절 분석을 나타낸다(표 12 및 13 참조). 동일한 핵산 부분을 함유하는 분기 CIC인 C-94와 선형 CIC인 C-21의 비교는 분기 CIC가 선형 CIC보다 IFN-α를 4-배 이상 유도한 것으로 나타났다. 유도된 IFN-γ 및 IFN-α의 양은 cPLGA와 함께 조제함에 의해 각 CIC에서 유의하게증가되었다. C-94 및 C-93의 포스포디에스테르 버전은 조제되었을 때만 활성이었다. C-87은 IFN-α의 현저한 유도를 나타냈다.
실시예 38
CIC에서 서열 모티프의 위치 효과
이 실시예는 다수 CIC에 대한 면역조절 분석을 설명하며(이들 중 일부는 이전의 실시예와 상이한 제공자에서 분석되었다), CIC에서 핵산 서열 위치 효과를 예시한다.
시험된 CIC는, CG 서열을 함유하지 않는 1개의 핵산 부분(AGATGAT)과 함께핵산 부분에 2개의 상이한 CG-함유 핵산 서열(TCGTCGA 및 ACGTTCG)을 함유하는 CIC를 포함했다. CG-함유 핵산 서열들 중, TCGTCGA 서열을 함유하는 CIC들은 ACGTTCG만을 함유하는 CIC들보다 더 큰 활성을 가진다. 이들 2개 중, TCGTCGA를 가진 CIC가 더욱 활성이었다. 이 실시예에서 사용된 CIC의 일반적 구조인 N1-S1-N2-S2-N3가 CIC 내의 모티프들의 위치를 설명하는데 사용될 수 있다. N1위치에 가장 활성 모티프인 TCGTCGA를 두는 것이 가장 활성인 CIC(C-8, C-56)를 가져왔다. 또한, N2위치의 배치가 활성을 부여했다. 예를 들어, N2위치에 TCGTCGA를 갖는 C-57은 N3위치에 TCGTCGA를 갖는 C-58보다 다소 더 활성이었다. N1 위치에 ACGTTCG 서열을 갖는 CIC는, TCGTCGA 서열을 갖는 유사한 CIC보다 덜 활성이었던 반면, N1위치에 AGATGAT 서열을 갖는 CIC보다는 더 활성이었다(C-57 및 C-58과 C-59 및 C60 비교). 이 실험에서, CG 모티프는 포함하지만 TCG 모티프는 포함하지 않는 핵산 부분을 함유했던 C-61은 cPLGA와 함께 조제되었을 때 IFN-γ를 유도했다.
또한, 이 실험에서는 2가지 종류의 분기 CIC, 즉 분기한 글리세폴 성분과 핵산 부분 사이에 HEG 부분을 갖는 C-94와 글리세롤 스페이서에 직접 부착된 핵산 부분을 갖는 C-28의 면역조절 활성을 비교했다. 표 15 참조. 흥미롭게도, IFN-γ의 유도는 두 분기 CIC에서 유사했던 반면, IFN-α의 유도는 HEG 스페이서를 함유하는 CIC에서 극적으로 더 높았다. 5-단부를 통해 말레이미도-활성 트리에틸아민 스페이서(C-99)에 부착된 3개의 P-6 서열을 함유하는 분기 CIC는 cPLGA와 함께 조제되었을 때만 IFN-γ를 유도했고, IFN-α는 유도하지 않았다. 일반적으로, 최대 IFN-α 생성은, 분기 구조를 통해 부착되며, 핵산 부분에 다수의 미부착된 또는 "자유로운" 5'-단부를 가진 핵산 부분들을 가지며, 입체구조적 유연성 및 핵산 부분들간의 거리를 제공하는 스페이서를 포함하는 CIC를 사용하여 생성되었다.
실시예 39
분기 CIC의 활성
이 실시예는, 다수의 자유 5'-단부 및 HEG 스페이서에 의해 제공된 입체구조적 유연성을 갖는 분기 CIC가, HEG 스페이서를 갖는 선형 CIC(C-94와 C-21 및 C-96과 C-23 비교) 또는 추가(HEG) 스페이서 없는 분기 CIC(C-94와 C-28 및 C-96과 C-27 비교)에 비하여 더 많은 INF-α를 유도했음을 나타낸다. C-96에 또 다른 HEG 스페이서 및 4-염기 핵산 부분을 부가하는 것은 INF-α 유도의 감소를 일으켰다(C-96과 C-97 비교). 표 16 참조.
3량체 5'-TCG-3' 모티프를 함유하는 두 CIC의 면역자극 활성을 시험했다(C-91 및 C-68). 두 CIC 모두 스스로는 활성이 아니었으며, C-91은 cPLGA와 함께 조제되었을 때 유의한 활성을 가졌다.
다수의 P-6 서열이 콘쥬게이트된 친수성 폴리아미드-함유 STARBURST DENDRI-MER(C-102)는, 동일한 양의 P-6과 비교했을 때(가닥 당 6가닥을 기준으로 하여) P-6 서열 만에 비해서 상당히 더 많은 IFN-α 활성을 가졌다. 이 결과는, 상기 나타낸 것과 상이한 조성 및 합성 프로토콜을 사용하여, IFN-α의 유도를 유의하게 증가시키기 위한 유연하고 친수성인 코어 상에 5'-CG-3'-함유 핵산 부분을 다량체 송달하는 것의 유용성을 확인시킨다.
실시예 40
이 실험에서는 6량체 핵산 모티프 5'-TCGTCG-3', 및 핵산 부분의 3'-단부에 부착된 다수 스페이서를 함유하는 일련의 CIC의 활성을 시험했다(C-13, C-14, C-15 및 C-16). 표 17 참조. CIC들 중 어느 것도 단독 사용되었을 때 활성이 아니었지만, cPLGA와 함께 조제되었을 때는 모두 유의한 활성을 가졌다.
실시예 41
B 세포 증식 분석에서 CIC의 효과
사람 PBMC를 2명의 정상 피험자의 헤파린화 혈액으로부터 분리했다. 일부의 PBMC를 예비로 남겨두고, 나머지를 CD19+ MACS 비드(Miltenyi Biotec)와 함께 인큐베이션했다. 다음에, 이들 세포를 자석을 통과시켜 양극쪽을 선택하여 CD19+ B 세포를 분리했다. 이 집단은 FACS 분석으로 결정된 바 > 98% CD19+이었다. 다음에, B 세포를 96-웰 둥근바닥 플레이트에서 1x105/200㎕/웰로 배양했다. 어떤 경우에는 또 PBMC를 2x105/200배양했지만 ㎕/웰로 배양했다. 세포를 2㎍/ml 폴리뉴클레오티드 또는 CIC를 사용하여 3회 자극했다. 배양 기간은 37℃에서 48시간이었다. 배양 기간의 마직막에, 플레이트를 3H-티미딘으로 1μCi/웰로 펄싱하여 8시간 더 인큐베이션했다. 다음에, 표준 액체 섬광방출 기술을 사용하여 플레이트를 채취했고, 분당 계수(cpm)하여 데이타를 수집했다.
실험 A
실험 A의 결과(표 18)는 5'-C,G-3' 모티프를 함유한 폴리뉴클레오티드(P-6) 및 CIC(C-8, C-9, C-21, C-28)가 B 세포를 증식시킨 것을 나타낸다. 대조군 화합물 P-7과 M-1, 7량체 폴리뉴클레오티드 P-1은 B 세포 증식을 거의 일으키지 않았다. 분기 CIC인 C-28, 및 프로필 스페이서를 함유한 CIC인 C-9는 헥사에틸렌 글리콜 스페이서를 함유한 CIC인 C-8과 C-21보다 B 세포 증식을 더 많이 유도했다. PBMC의 증식은 B 세포의 것을 그대로 반영했다.
실험 B
실험 B(표 19)에서는 B 세포 증식에 대한 스페이서 조성, 및 CIC 구조(선형 대 분기)의 효과를 평가했다. 프로필, 부틸, 무염기, 및 히드록시메틸에틸 스페이서를 함유하는 CIC는 헥사에틸렌 글리콜 또는 트리에틸렌 글리콜 스페이서를 함유한 상응하는 CIC보다 B 세포 증식을 더 많이 유도하는 경향이 있었다(C-10, C-11,C-17, C-18, C-20, C-25 비교). 도데실 스페이서는 CIC를 비활성으로 만들었다(C-19). 두드러진 것은, B 세포 증식 데이타가 상기 나타낸 사이토카인 데이타를 반드시 반영하지는 않으며, B 세포 증식과 IFN-α 유도 사이에 특정한 차이점들이 보인다는 것이다.
실시예 43
CIC로 비강내 치료한 후 마우스 폐에서 면역-관련 유전자의 유도
마우스 폐에서 75개의 상이한 유전자들의 mRNA 발현을 유도하는 C-9, C-23, 및 P-6(양성 대조군)의 능력을 조사했다. 평가된 유전자는 사이토카인, 케모카인, 세포표면분자, 전사 인자, 메탈로프로테아제, 및 다른 분자들을 암호화하는 유전자들을 포함했다. Jackson Labs(메인주 바하버)으로부터의 6-8주령 암컷 BALB/c 마우스를 사용하여 Northview Pacific Laboratories(캘리포니아 허큘레스)에서 연구를 수행했다. 그룹당 5마리 마우스를 가벼운 이소플로린 마취하에 식염수 50uL 중의 C-9, C-23, P-6(양성 대조군) 또는 P-7(음성 대조군) 20ug로 비강내 치료했다. 이전의 실험은, 대부분의 유전자의 최적 유도가 치료 후 6시간째에 있었다고 나타냈다. 따라서, 6시간째에 폐를 채취하여 액체 질소에서 재빨리 냉동시키고 나중에 사용하기 위해 -80℃에 저장했다. 총 RNA를 RNeasy 미니키트(Qiagen Inc., 캘리포니아 발렌시아)를 사용해 분리했다. Scheerens 등, 2001, Eur. J. of linmunology 31:1465-74에 설명된 대로, RNA 샘플을 DNAse-처리했고(Roche Diagnostics, 독일 만하임), Superscript II Rnase H-Reverse Transcriptase(Invitrogen, 미들랜드 록빌)을 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 그룹 당 cDNA 샘플을 모아서, 각각의 모아진 샘플에서 75개 유전자의 mRNA의 발현을 실시간 정량 PCR(ABI Prism 5700, Perlcin Elmer Applied Biosystems) 및 사이버 그린(Qiagen Inc.)을 사용하여 측정했다. 관심의 유전자들에 더하여, 각 샘플에서 하우스키핑 유전자의 mRNA 발현을 특정했다(HPRT 또는 유비퀴틴). 각 샘플에서 RNA의 양을 보정하기 위해, 모든 데이타를 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 계산했다. 가장 조절되지 않은 유전자의 선택을 도 5에 나타내며, 데이타는 대조군-치료된(P-7) 마우스에서의 반응에 비해 몇배인지로 표현되었다(배수-유도). 데이타는 C-9, C-23, 및 P-6이 IL-6, IL-12p40, IFN-α, IP-10 및 IL-10을 포함한 다양한 유전자의 발현을 효능 있게 유도했음을 나타낸다. 그러나, C-9로 치료된 마우스는 C-23 또는 P-6 치료된 그룹과 비교했을 때 IFN-α의 mRNA 발현을 상당히 더 많이 유도했다.
실시예 44
CIC의 생체내 활성
P-6(양성 대조군), P-7(음성 대조군), C-9, C-23, P-1 또는 P-11 20ug(200ul 부피)를 마우스(10마리/그룹)의 목덜미에 피하 주사하여 생체내 연구를 수행했다. 2시간 후에 혈액을 수집했다. LPS 양성 대조군 그룹에 대해서, 마우스에 200ul 부피를 복강내 주사했고, 혈액을 1.5 시간 후에 수집했다(즉, LPS 유도된 TNF-α 활성의 최고점에서). 혈액을 응고시켜 혈청을 제조했고 분석할 때까지 -80℃에서 저장했다. TNF-α에 대해 Biosource 시토스크린 키트를 사용하고, mIL-6 및 mIL-12에 대해 Pharmingen 항체쌍을 사용하여 혈청 사이토카인을 분석했다. 모든 샘플을 2번 분석했다.
P-6 및 2개의 CIC C-9와 C-23은, 각각 IL-12p40, IL-6, 및 TNF-α를 유도한 반면, 대조군 올리고뉴클레오티드 P-7은 비활성이었다(도 6A-C 참조). 이 분석에서 CIC C-23은 C-9와 P-6보다 더 효능있었다. 예상 대로, 6량체(P-11: 5'-AACGTT) 및 7량체(P-1: 5'-TCGTCGA)는 비활성이었다.
실시예 45
항원 및 CIC에 대한 영장류의 면역반응
개코원숭이에서 CIC의 존재하에 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 투여에 대한 면역반응을 시험했다.
HBsAg는 효모에서 생성된 재조합 HBsAg였다. 개코원숭이 그룹(그룹 당 8마리)은 연구 시작 시 8-31kg 범위의 중량(그룹평균중량 13-16kg)을 갖는 수컷 및 암컷 개코원숭이들을 포함했다.
개코원숭이를 1ml 부피 중의 20㎍ HBsAb로 근육내 주사하여 2달 간격(0 및 2개월)으로 2회 면역화했다. 하기 개략된 대로, 일부 그룹은 또 CIC(C-8 또는 C-9) 또는 양성 대조군(P-6)을 HBsAg와 함께 받았다.
모든 동물에서 혈액을 면역화 전 및 면역화 후 2주 후에 수집했다. 항-HBsAg IgG 역가를 다음과 같이 측정했다. 개코원숭이 혈청 샘플을 사람 혈장 유래 HBsAg 코팅 비드를 사용하여 AUSAB EIA 시판용 키트(Abbott Labs Cat. #9006-24 및 1459-05)에 의해 분석했다. 샘플을 0-150mIU/ml 범위의 사람 혈장 유래 HBsAg 양성 및 음성 표준 패널과 함께 시험했다. 비오틴 콘쥬게이트된 HBsAg 및 토끼 항-비오틴-HRP 콘쥬게이트 항체를 검출에 사용된 2차 항원 복합체로 사용했다. 분석을 오르토-페닐렌디아민(OPD)을 사용하여 전개했고, 흡광도 값을 492nm에서 측정하여 600nm에서의 바탕값을 뺐다(Quantum II 분광광도계, Abbott Labs). 표본 흡광도 값을 사용하여, 상응하는 항-HBsAg 농도를 제조자에 의해 확립된 파라미터에 따른 표준 커브로부터 측정된 ml 당 밀리-인터내셔날 단위((mIU/ml)로 표현한다. 희석 표본에 대해서, 정량은 0-150mIU/ml 사이의 값을 가져오는 견본 흡광도를 기초로 했으며, 희석 인자를 곱하여 최종 농도에 도달한다.
원-웨이 ANOVA 플랜드 컴패리즌(α=0.05)을 사용한 평방편차의 분석(NCSS97 통계 소프트웨어 프로그램, 유타주 케이스빌)에 의해 로그-변형 데이타에 대한 통계분석을 행했다. p≤0.05를 유의하게 고려했다.
시험된 동물 그룹은 다음과 같이 면역화되었다:
그룹 1 - 20㎍ HBsAg;
그룹 2-20㎍ HBsAg + 1000㎍ P-6;
그룹 3-20㎍ HBsAg + 1000㎍ C-8;
그룹 4-20㎍ HBsAg + 1000㎍ C-9.
연구 결과를 하기 표 20에 나타낸다. HBsAg와 함께 CIC 또는 양성 대조군 P-6의 투여는 HBsAg의 단독 투여와 비교하여 항-HBsAg 항체의 역가를 증가시켰다. 쌍을 이룬 비교에서, 그룹 2, 3, 및 4에서 검출된 면역반응은 그룹 1에서 검출된 것과는 상당히 상이했다(2차 면역화 후, 그룹 2에 대해 p<0.05 및 그룹 3 및 4에 대해 p<0.005).
실시예 46
CIC-항원 콘쥬게이트에 의해 발생된 생체내 반응
이 실시예는 CIC-항원 콘쥬게이트의 투여에 의한 마우스에서의 항체-매개 면역반응의 유도를 나타낸다.
하기 설명된 대로, 10마리/그룹을 하기 설명된 대로 합성된 C-11/Amb a 1 콘쥬게이트(10ug 또는 10ug), P-6/Amb a 1(1ug) 또는 Amb a 1(1ug)로 2주 간격으로 2회 피내(꼬리에) 면역화했다. 항-Amb a 1-특이적 IgG1 및 IgG2a 역가를 각 주사 후 2주 후에 취한 혈청으로부터 결정했다. 시험관내 재-자극을 2차 면역화 후 6주 후에 비장 세포에 대해 행하여 Amb a 1-특이적 IFN-γ 및 IL-5 반응을 측정했다.
C-11-Amb a 1 콘쥬게이트로 면역화된 마우스는 P-6-Amb a 1 기준 물질에서 보여진 특징적인 면역반응 패턴, 구체적으로 Th2로부터 Th1-형 Amb a 1-특이적 면역반응을 향한 전환을 나타냈다. C-11 또는 P-6 콘쥬게이트로 면역화된 마우스는 강한 IgG2 반응을 발생시켰고, IgG1 반응을 감소시켰다. 또한, 이 콘쥬게이트로 치료된 그룹은 IL-5 반응의 정지 및 IFN-γ 반응의 상승을 나타냈다. 추가로, C-11-Amb a 1 콘쥬게이트에 대한 면역반응은 용량 의존적 방식으로 증가하는 것으로 드러났으며, 이것은 1ug과 10ug 분량 그룹을 비교함으로써 증명되었다. C-11-Amb a 1 콘쥬게이트는 P-6-Amb a 1에서 보여진 것과 유사한 질의 면역반응을 도출한다.
결과는 표 21 내지 23에 나타낸다.
일반적 과정:
Charles River 연구소(캘리포니아 홀리스터)로부터의 8-12주령 암컷 BALB/c 마우스를 사용하여 Northview Pacific Laboratories(캘리포니아 허큘레스)에서 동물 연구를 수행했다. 10마리/그룹을 다음 물질 중 하나로 2주 간격으로 2회 꼬리에 피내주사했다: C-11/Amb a 1 콘쥬게이트(1ug), C-11/Amb a 1 콘쥬게이트(10ug), P-6/Amb a 1 콘쥬게이트(1ug) 또는 Amb a 1 항원(1ug). 각 주사 후 2주 후에 눈뒤를 통해 혈액을 수집했고, 항체 측정용 혈청을 제조했다. 2차 주사 후 6주 후에 IFN-γ 및 IL-5의 사이토카인 반응을 결정하기 위한 시험관내 재-자극 분석용의 비장을 채취했다. 비장들은 개별적으로 분석했다. 5x105세포/웰을 사용한 재-자극을 위해서 Amb a 1을 25 및 5ug/ml로 사용했고, 상청액을 4일째에 채취하여 분석할 때까지 -80℃에서 저장했다. 시험관내 분석의 대조군은 SAC(0.01%) 및 PMA/IO(각각 10ng/ml 및 1uM)을 포함했다.
마우스 항-Amb a 1 IgG1 및 IgG2a 분석:
마우스 혈청 샘플을 1㎍/ml의 Amb a 1 항원을 50㎍/웰로 코팅한 96-웰 둥근바닥 플레이트에서 ELISA에 의해 분석했다. 염소 항-마우스 IgG1(또는, IgG2a) 비오틴 콘쥬게이트된 항체를 2차 항체로 사용했다. 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트를 검출을 위해 사용했다. 분석을 TMB를 사용하여 전개했고, 흡광도 값을 450nm에서 측정하여 650nm에서의 바탕값을 뺐다(Emax 정밀 마이크로플레이트 리더, Molecular Devices, 캘리포니아 서니베일). 4-파라미터 분석을 사용하여 0.5 OD의 ELISA 흡광도를 제공했던 혈청 희석의 역수로서 역가를 정의했다. 모든 샘플은 별도 플레이트의 웰에서 2회 시험했고, 역가는 두 값의 평균으로 기록했다.
마우스 IL-5 및 IFN-γ 분석:
항-사이토카인 모노클로날 항체 코팅 플레이트에서 캡쳐 ELISA에 의해 상청액을 IL-5 및 IFN-γ 수준에 대해 시험했다. 비오티닐화된 항-사이토카인 MAb를 2차 항체로 사용했다. 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트를 검출을 위해 사용했고, 분석은 TMB를 사용하여 전개했다. 각 플레이트에 대해 분석된 표준 곡선으로부터 농도를 계산했다. 흡광도 값은 450nm에서 측정하여 650nm에서의 바탕값을 뺐다(Emax 정밀 마이크로플레이트 리더, Molecular Devices, 캘리포니아 서니베일). 모든 샘플은 별도 플레이트의 웰에서 2회 시험했고, 역가는 두 값의 평균으로 기록했다.
원-웨이 ANOVA 플랜드 컴패리즌(α=0.05)을 사용하는 NCSS97 프로그램(NCSS 통계 소프트웨어, 유타주 케이스빌)로 로그-변형 데이타에 대한 통계를 행했다. 다음 연구에 대해서, p≤0.05를 통계적으로 유의하게 고려했다.
C-11/Amb a 1 콘쥬게이트의 합성:
활성화 C-11의 합성 (C-111):
5'-디술피드-C-11(C-110)을 활성화 완충액(100mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨/pH 7.5)에 용해하고 TCEP로 환원하여 활성화시켰다. 활성화된 CIC(C-111)를 이동상으로 동일한 활성화 완충액을 사용한 5ml Sephadex G25 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 정제했다. 베이스라인이 상승할 때 시작하여 0.5분 간격으로 수동으로 분획들을 수집했다. 정제 후 여러 분획들의 농도를 A260 및 25.6 OD/mg의 흡광 계수를 사용하여 결정했다.
활성화 Amb a 1의 합성:
Amb a 1을 그것의 자유-술프히드릴을 먼저 차단하여 활성화시킨 후 이종-작용기 교차연결제를 부가했다. 과량의 시약을 HiTrap G-25 탈염 칼럼(Pharmacia Catalog #17-1408-01)을 사용하여 탈염시켜 제거했다. 결과의 활성화된 Amb a 1은 활성화된 단백질 당 평균 9.3개의 자리를 가졌다.
C-11/Amb a 1 콘쥬게이트의 합성:
활성화 C-11(C-111) 및 활성화 Amb a 1를 조합하고, 결과의 C-11/Amb a 1 콘쥬게이트를 Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피 칼럼(Pharmacia, Cat. #17-1088-01; 1cmx30cm)을 사용하여 분별했다. 공식 완충액(10mM 인산염, 150mM NaCl, pH 7.2)을 이동상으로 사용했다. 베이스라인이 상승하기 시작할 때 시작하여 1분 간격으로 분획들을 수집했다.
콘쥬게이트 샘플을 MOPS 완충액(Invitrogen, Cat.#NP0001)을 사용하는 4-12% NuPAGE 겔(Invitrogen, Catalog #NP0322)을 사용한 SDS-PAGE, 및 BioSep SEC-S3000 칼럼(Phenomenex, Catalog #OOH-2146-EO)를 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석했다. SDS-PAGE 후, 단백질을 Coomassie Blue 염색(GelCode, Pierce Catalog #24596)를 사용하여 시각화했다. DNA-Silver 염색(Pharmacia, Catalog #17-6000-30)에 의해 CIC의 존재를 확인했다. SDS-PAGE 및 SEC-HPLC는 모두 모집 기준을 한정하고, 얻어진 풀의 특성화를 위해 사용했다.
단백질 농도를 비신코닌산법(BCA, Sigma Catalog #CA-1)에 의해 측정했다.
실시예 47
CIC 활성에 대한 스페이서 부분의 효과
이 실시예는 IFN-α 유도에 대한 상이한 스페이서 부분의 효과를 나타낸다.C-90(C3 CIC) 및 C-51(HEG CIC)의 비교는 C-51이 C-90보다 8-배 더 많은 IFN-α를 유도했음을 나타냈지만, 각 CIC에 의해 유도된 IFN-γ의 양은 유사했다. 유사하게, 상이한 링커를 함유하는 분기 CIC들의 비교는, IFN-α 유도에 대해, HEG(C-94) > TEG(C-103) > C3(C-104) = 링커 없음(C-28)으로 나타났다.
실시예 48
CIC 핵산 부분과 서열에서 상응하는 폴리뉴클레오티드의 분리된 면역조절 활성의 평가
이 실시예는 분리된 면역조절 활성을 갖지 않는 핵산 부분을 함유하는 CIC의면역자극 활성을 더 예시한다. CIC 핵산 부분과 서열에서 상응하는 폴리뉴클레오티드의 활성을 단독으로 또는 자유 스페이서와 조합하여 분석했고, 동일한 양의 핵산 및 스페이서를 함유하는 CIC의 활성과 비교했다. 예를 들어, 3uM의 CIC C-101를 9uM P-14 또는 9uM P-14와 9uM 헥사에틸렌 글리콜과 3uM 글리세롤의 혼합물(왜냐하면, C-101이 3당량의 P-14, 3당량의 헥사에틸렌 글리콜, 및 1당량의 글리콜을 함유하기 때문이다)과 비교했다. 모든 경우에 CIC는 활성이었던 반면, 짧은 폴리뉴클레오티드는 단독으로든 스페이서와의 혼합물로든 모두 비활성이었다. 표 25 참조. 스페이서만의 활성을 9uM의 농도에서 시험했으며, 모두 완전히 비활성이었다.
실시예 49
(5'-TCGACGT-3'-HEG) ave=185 -Ficoll 400 (C-137)의 제조
A. 말레이미도-Ficoll400의 제조
아미노에틸카르복시메틸(AECM)180-Ficoll400을 Inman(J. Immunology 1975 114: 704-709)의 방법에 의해 제조했다. Ficoll(MW=400,000Da) 몰 당 평균 180개의 아미노에틸기가 있었다. DMSO 300ul에 용해된 술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도-메틸]-시클로헥산-1-카르복실레이트 27.6mg(62.6umol)을 1.0ml의 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 6.66)에 용해된 23.2mg(0.058umol)의 AECM180-Ficoll400에 계속 휘저으면서 적가했다. 반응 혼합물을 2시간 동안 쉐이커에 둔 후, Sephadex G-25 칼럼 상에서 탈염하여 말레이미도-Ficoll40020mg을 수득했다. Ficoll 몰 당 대략 165개의 말레이미드기가 있었다.
B. 5'-TCGACGT-3'-HEG-(CH2)3-SH(C-136)의 제조
5'-TCGACGT-3'-HEG-(CH2)3-SS-(CH2)3-OH(C-135)를 C-116과 유사하게 합성했다. 0.1M 인산나트륨/150mM 염화나트륨/pH 7.5 완충액 0.4ml에 용해된 C-135 10mg (3.57umol)에 동일한 완충액 0.7ml에 용해된 TCEP 5.7mg(20umol)을 가했다. 혼합물을 잘 휘젓고 2시간 동안 40℃ 수조에 두었다. 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAA)/pH 7.0 중의 아세토니트릴의 구배를 증가시키면서 RP-HPLC(Polymer Labs PLRP-S 칼럼)에 의해 티올(C-136)을 정제하여 다음 반응에 바로 사용했다.
C. (5'-TCGACGT-3'-HEG)x-Ficoll400(C-137)의 제조
0.1M 인산나트륨/pH 6.66 0.7ml에 용해된 말레이미도-Ficoll4005.5mg(0.014 umol)에 3.45ml의 대략 30%의 아세토니트릴/TEAA/pH 7.0 완충액 3.45ml에 용해된 C-136 6.8mg(2.5umol)을 가했다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 쉐이커에 두었고, 생성물을 Superdex 200 칼럼(Pharmacia) 상에서 정제했다. 분리된 생성물의 총중량 및 260nm에서의 흡광도 값을 사용한 계산은 생성물이 Ficoll 몰 당 평균 대략 185개 올리고뉴클레오티드를 함유했음을 나타냈다. 또한, Ficoll 당 올리고뉴클레오티드를 더 적게 함유하는 두번째 분획을 얻었다.
D. C-137의 활성
표 26에 나타낸 대로, 다당류 기제 CIC는 사이토카인 분석 반응에서 현저한 활성을 가졌으며, 특히 IFN-α의 유의한 자극을 나타낸다.
앞서 말한 발명은 명쾌함과 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세히 설명되었으며, 어떤 변화 및 변형이 실행될 수 있음이 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 설명 및 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 묘사된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보들은, 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고자료로 수록되도록 나타냈던 것처럼, 동일한 범위까지 모든 목적을 위해 그들의 전체가 참고자료로서 본원에 수록된다.

Claims (49)

  1. 2개 이상의 핵산 부분 및 1개 이상의 비-핵산 스페이서 부분을 포함하는 키메라 면역조절 화합물(CIC)로서, 여기서
    적어도 1개의 비-핵산 스페이서 부분은 2개의 핵산 부분에 공유결합되고,
    상기 스페이서는 폴리펩티드가 아니며,
    적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-CG-3'을 포함하고,
    상기 CIC는 면역조절 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 키메라 면역조절 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-TCG-3'을 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  3. 제 1 항에 있어서, CIC는
    (a) 사람 말초혈 단핵세포에 의한 IFN-감마 생성을 자극하는 능력;
    (b) 사람 말초혈 단핵세포에 의한 IFN-알파 생성을 자극하는 능력;
    (c) B 세포 증식을 자극하는 능력
    으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역조절 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 CIC.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식을 갖는 코어 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
    N1-S1-N2또는 N1-S1-N2-S2-N3
    (여기서, N1, N2및 N3는 핵산 부분이고, S1및 S2는 비-핵산 스페이서 부분이며, S1및 S2는 정확히 2개의 핵산 부분에 공유결합된다)
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기 식을 갖는 코어 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
    [Nv]x-Sp
    (여기서, Sp는 X개의 독립적으로 선택된 핵산 부분 Nv에 공유결합된 다가 스페이서이며, X는 적어도 3이다)
  6. 제 5 항에 있어서, X는 3 내지 약 50인 것을 특징으로 하는 CIC.
  7. 제 6 항에 있어서, X는 약 50 내지 약 500인 것을 특징으로 하는 CIC.
  8. 제 5 항에 있어서, Sp는 덴드리머 또는 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  9. 제 8 항에 있어서, Sp는 교차연결 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항 또는 제 2 항에 있어서, 적어도 3개의 핵산 부분을 포함하며, 각 핵산 부분은 적어도 1개의 비-핵산 스페이서 부분에 공유결합된 것을 특징으로 하는 CIC.
  11. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고에틸렌 글리콜, 글리세롤, C2-C10알킬, 무염기 뉴클레오티드, 펜타에리트리톨, 1,3-디아미노-2-프로판올, 2-(히드록시메틸)에틸, 다당류, 또는 덴드리머를 포함하는 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  12. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 비-뉴클레오티드 스페이서 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  13. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 HEG 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  14. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-뉴클레오티드 스페이서는 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 연결된 올리고에틸렌 글리콜 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  15. 제 5 항에 있어서, 덴드리머, 다당류, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 또는 2-(히드록시메틸)에틸을 포함하는 제 1 스페이서 서브유닛을 포함하며, 적어도 1개의 HEG 서브유닛을 더 포함하고, 상기 HEG 서브유닛은 제 1 스페이서 서브유닛 및 핵산 부분에 공유결합된 것을 특징으로 하는 CIC.
  16. 제 15 항에 있어서, HEG 서브유닛과 제 1 스페이서 요소 사이의 결합은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합이고, HEG 서브유닛과 핵산 부분 사이의 결합은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 CIC.
  17. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-TCGA-3'를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-[(X)0-2]TCG[(X)2-4]-3'을 포함하며, 여기서 각 X는 독립적으로 선택된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 CIC.
  19. 제 15 항에 있어서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-TCG[(X)2-4]3'; 5'-TCG(A/T)[(X)1-3]-3'; 또는 5'-TCG(A/T)[(X)1-3]-3'을 가지며, 여기서 각 X는 독립적으로 선택된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 CIC.
  20. 제 19 항에 있어서, 적어도 1개의 핵산 부분은 서열 5'-TCGACGT-3' 또는 5'-TCGTCGA-3'을 갖는 것을 특징으로 하는 CIC.
  21. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, CIC에 있는 모든 핵산 부분은 식 5'-TCG[(X)2-4]3'; 5'-TCG(A/T)[(X)1-3]-3'; 또는 5'-TCG(A/T)[(X)1-3]-3'의 서열을 가지며, 여기서 각 X는 독립적으로 선택된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 CIC.
  22. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 5'-CG-3'을 포함하는 적어도 1개의 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 길이 미만인 것을 특징으로 하는 CIC.
  23. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 5'-CG-3'을 포함하는 모든 핵산 부분은 8 뉴클레오티드 길이 미만인 것을 특징으로 하는 CIC.
  24. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 핵산 부분은 동일한 것을 특징으로 하는 CIC.
  25. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, CIC의 적어도 1개 핵산 부분은 (i) 분리된 면역학적 활성을 갖지 않거나, 또는 (ii) 열등한 분리된 면역학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 CIC.
  26. 제 25 항에 있어서, CIC의 핵산 부분은 분리된 면역조절 활성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 CIC.
  27. 제 14 항에 있어서, 하기 식들로 구성되는 군으로부터 선택된 식을 갖는 것을 특징으로 하는 CIC.
  28. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 부분의 뉴클레오티드들 사이의 결합은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 에스테르 결합으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 CIC.
  29. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 부분의 뉴클레오티드들, 핵산 부분과 스페이서 부분, 및 스페이서 부분의 서브유닛들 사이의 결합은 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 에스테르인 것을 특징으로 하는 CIC.
  30. 제 1 항에 있어서, 스페이서 부분은 덴드리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  31. 제 1 항에 있어서, 스페이서 부분은 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 CIC.
  32. 전술한 항 중 어느 한 항에 설명된 CIC 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  33. 제 29 항에 있어서, 본질적으로 내독소를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 양이온계 마이크로스피어를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 32 항에 있어서, 마이크로스피어는 락트산과 글리콜산의 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 개체에게 상기 개체에서 면역반응을 조절하기에 충분한 양으로 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 CIC 또는 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 면역반응을 조절하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 개체는 Th2-형 면역반응에 관련된 장애로 고통받는것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, Th2-형 면역반응에 관련된 상기 장애는 알레르기 또는 알레르기-유발 천식인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 개체는 감염성 질환을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 개체에게 상기 개체에서 IFN-γ를 증가시키기에 충분한 양으로 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 CIC 또는 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 인터페론-감마(IFN-γ)를 증가시키는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 개체는 특발성 폐섬유증을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 개체에게 상기 개체에서 IFN-α를 증가시키기에 충분한 양으로 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 CIC 또는 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 인터페론-알파(IFN-α)를 증가시키는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 개체는 바이러스 감염을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 개체에게 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 CIC 또는 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 감염성 질환의 증상을 개선하는 방법으로서, 여기서 유효량은 상기 감염성 질환의 증상을 개선하기에 충분한 양인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. IgE-관련 장애를 가진 개체에게 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 CIC 또는 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 IgE-관련 장애를 개선하는 방법으로서, 여기서 유효량은 상기 IgE-관련 장애의 증상을 개선하기에 충분한 양인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 IgE-관련 장애는 알레르기인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, 상기 IgE-관련 장애는 알레르기-관련 장애인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 치료를 필요로 하는 개체에게 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 CIC 또는 제 32 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여함에 의해 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 유효량은 암의 증상을 개선하기에 충분한 양인 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100784164B1 (ko) 2006-05-08 2007-12-10 고려대학교 산학협력단 이중 마커를 이용한 ｓｉＲＮＡ의 정량용 조성물

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030109469A1 (en) * 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
EP1176966B1 (en) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
CA2430691A1 (en) 2000-12-27 2002-07-04 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory polynucleotides and methods of using the same
US20040132677A1 (en) * 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
EP1404873B1 (en) * 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
US20030148316A1 (en) * 2001-08-01 2003-08-07 Lipford Grayson B. Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
AU2002326561B2 (en) 2001-08-07 2008-04-03 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
US7354909B2 (en) * 2001-08-14 2008-04-08 The United States Of America As Represented By Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
PT1446162E (pt) 2001-08-17 2009-01-27 Coley Pharm Gmbh Agrupamentos imunoestimuladores oligonucléotidos com actividade melhorada
WO2003035836A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
US7615227B2 (en) 2001-12-20 2009-11-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce angiogenesis
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
EP1393745A1 (en) * 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5'ends
KR20050052467A (ko) 2002-08-12 2005-06-02 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역조절 조성물, 이의 제조방법 및 이의 이용방법
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US8263091B2 (en) 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
EP1556077A2 (en) 2002-10-29 2005-07-27 Coley Pharmaceutical Group, Ltd Use of cpg oligonucleotides in the treatment of hepatitis c virus infection
AU2003300919A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 Coley Pharmaceutical Gmbh 5' cpg nucleic acids and methods of use
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7625872B2 (en) * 2002-12-23 2009-12-01 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
PT1992635E (pt) * 2002-12-23 2012-03-20 Dynavax Tech Corp Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos
CA2512484A1 (en) * 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
KR20060012622A (ko) * 2003-05-16 2006-02-08 하이브리돈, 인코포레이티드 화학요법제와 함께 이뮤노머를 사용하는 상승적 암 치료방법
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
SG122973A1 (en) 2003-10-30 2006-06-29 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
AU2004304770B2 (en) * 2003-12-08 2010-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
US20050175630A1 (en) * 2003-12-23 2005-08-11 Eyal Raz Immunogenic compositions and methods of use thereof
CA2567789A1 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US7498425B2 (en) * 2004-06-15 2009-03-03 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
WO2006002038A2 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Hybridon, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
NZ561144A (en) * 2005-03-04 2009-09-25 Dynavax Tech Corp Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (ISS) wherein the ISS are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
WO2006102716A1 (en) * 2005-04-01 2006-10-05 Medvet Science Pty. Ltd. A method of diagnosis and treatment and agents useful for same
WO2007075626A2 (en) * 2005-12-20 2007-07-05 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory activity of palindromic immune modulatory oligonucleotides (imo tm) contiaining different lengths of palindromic segments
JP5473336B2 (ja) * 2006-02-15 2014-04-16 アディウタイド・ファーマスーティカルズ・ゲーエムベーハー オリゴヌクレオチドの処方に関する組成物および方法
CN101460178B (zh) 2006-04-07 2016-12-07 艾德拉药物股份有限公司 用于tlr7和tlr8的稳定化的免疫调节性rna(simra)化合物
DE102006035618A1 (de) * 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz
NZ575437A (en) 2006-09-27 2012-02-24 Coley Pharm Gmbh Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity
WO2008050833A1 (fr) * 2006-10-25 2008-05-02 Panasonic Corporation Procédé d'émission et dispositif d'émission
EP2821488B1 (en) 2007-08-01 2016-07-27 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of TLR9
US20090196915A1 (en) * 2007-08-21 2009-08-06 Gary Van Nest Composition and methods of making and using influenza proteins
GB0807306D0 (en) 2008-04-22 2008-05-28 Univ Ghent Adjuvants for use in vaccination
WO2010002940A2 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Dynavax Technologies Corporation Heterogeneous synthesis of multivalent chimeric immunomodulatory compounds using platform based molecules
JP5769624B2 (ja) * 2008-08-28 2015-08-26 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
MY160201A (en) 2008-12-09 2017-02-28 Coley Pharm Group Inc Immunostimulatory oligonucleotides
JP5775004B2 (ja) * 2009-03-03 2015-09-09 アクセス メディカル システムズ，リミティド 高感度蛍光分析のための検出システム及び方法
BRPI1009842B8 (pt) 2009-03-25 2021-05-25 Univ Texas uso de agonista de tlr9 e agonista de tlr2/6 na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento, inibição ou atenuação de uma infecção microbiana, bem como composição farmaceuticamente aceitável compreendendo os referidos agonistas
FR2975600B1 (fr) 2011-05-24 2013-07-05 Assist Publ Hopitaux De Paris Agents pour le traitement de tumeurs
CN105579582A (zh) 2013-07-25 2016-05-11 埃克西奎雷股份有限公司 用于预防和治疗用途的作为免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体
AU2014313699B2 (en) 2013-08-24 2019-12-19 Bharat Biotech International Limited A bacterial vaccine and methods for manufacture thereof
EP3066105A4 (en) * 2013-11-06 2017-10-11 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having disulfide groups
EP3164113B1 (en) 2014-06-04 2019-03-27 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
US9336861B1 (en) * 2014-08-12 2016-05-10 Skan Technologies Corporation Static random access memory (SRAM) bitcell and memory architecture without a write bitline
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
JP2017537619A (ja) 2014-11-21 2017-12-21 ノースウェスタン ユニバーシティ 球状核酸ナノ粒子複合体の配列特異的細胞内取込
CN107567335B (zh) 2015-01-23 2021-10-29 戴纳瓦克斯技术公司 支化的和线性的嵌合化合物、多核苷酸、它们的用途和制备方法
IL260983B (en) * 2016-02-19 2022-07-01 Genisphere Llc Nucleic acid carriers and methods of medical use
EP3500581A4 (en) 2016-08-17 2021-10-06 Solstice Biologics, Ltd. POLYNUCLEOTIDE CONSTRUCTS
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
US20190321481A1 (en) * 2016-11-11 2019-10-24 Nantbio, Inc. Immunomodulatory compositions, processes for making the same, and methods for inhibiting cytokine storms
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
US20210122778A1 (en) * 2019-10-21 2021-04-29 Northwestern University Spherical nucleic acids with dendritic ligands
US20230053708A1 (en) * 2019-12-25 2023-02-23 Napajen Pharma, Inc. Short-chain cpg-containing oligodeoxynucleotide with linked polydeoxyadenylic acid, complex containing said oligodeoxynucleotide, and use thereof
WO2021249116A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof

Family Cites Families (189)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3324301A (en) 1963-02-28 1967-06-06 Lan Jen Chu Photoelectric vehicle identification system
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458065A (en) * 1983-02-17 1984-07-03 Eli Lilly And Company 7-N-(Substituted-apramycin antibiotic derivatives and intermediates therefor
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4650675A (en) * 1983-08-18 1987-03-17 The Children's Medical Center Corporation Oligonucleotide conjugates
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5015733A (en) 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4828991A (en) 1984-01-31 1989-05-09 Akzo N.V. Tumor specific monoclonal antibodies
US4587329A (en) 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
US4650575A (en) * 1985-07-03 1987-03-17 Pall Corporation Sorbing apparatus
US5093232A (en) * 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4910300A (en) 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US5338532A (en) 1986-08-18 1994-08-16 The Dow Chemical Company Starburst conjugates
US6312679B1 (en) * 1986-08-18 2001-11-06 The Dow Chemical Company Dense star polymer conjugates as dyes
US6031091A (en) * 1987-09-21 2000-02-29 Gen-Probe Incorporated Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
CA1339303C (en) 1987-09-21 1997-08-19 Lyle John Arnold Jr. Non-nucleotide linking reagents for nucleotide probes
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
ATE96274T1 (de) * 1988-07-12 1993-11-15 Humber Growers Ltd Bekaempfung unerwuenschter schaedlinge.
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5162515A (en) 1990-01-16 1992-11-10 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates of biologically stable polymers and polynucleotides for treating systemic lupus erythematosus
US5552391A (en) 1990-01-16 1996-09-03 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
US5171264A (en) * 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5244807A (en) * 1990-05-23 1993-09-14 Automedix Sciences, Inc. Production of pseudomonas xa cells containing indolyl-3-alkane alpha-hydroxylase
US5460831A (en) * 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Targeted transfection nanoparticles
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
HU217036B (hu) * 1990-08-03 1999-11-29 Sanofi Eljárás génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására
WO1993002093A1 (en) 1991-07-15 1993-02-04 La Jolla Pharmaceutical Company Modified phosphorous intermediates for providing functional groups on the 5' end of oligonucleotides
US5495006A (en) * 1991-09-27 1996-02-27 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Antiviral polynucleotide conjugates
US6113946A (en) * 1992-04-03 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
EP0570973B1 (en) * 1992-05-22 1998-11-18 Eastman Kodak Company Color photographic materials and methods containing DIR or DIAR couplers and phenolic coupler solvents
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US6346614B1 (en) * 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0606811A3 (en) * 1992-12-28 1995-06-21 Ibm Use a preferred object handler.
US5849719A (en) * 1993-08-26 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Method for treating allergic lung disease
PT748382E (pt) 1993-09-02 2003-03-31 Ribozyme Pharm Inc Acidos nucleicos enzimaticos contendo nao-nucleotidos
US6156501A (en) * 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5658738A (en) * 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
JP3045928B2 (ja) * 1994-06-28 2000-05-29 松下電子工業株式会社 半導体装置およびその製造方法
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ATE420171T1 (de) * 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US5627025A (en) * 1994-08-12 1997-05-06 The Rockefeller University Method for the identification of compounds capable of abrogating human immunodeficiency virus (HIV) infection of dendritic cells and T-lymphocytes
US5650502A (en) 1994-11-09 1997-07-22 Hybridon, Inc. Ribozyme analogs having rigid non-nucleotidic linkers
US5674683A (en) 1995-03-21 1997-10-07 Research Corporation Technologies, Inc. Stem-loop and circular oligonucleotides and method of using
US5874409A (en) 1995-06-07 1999-02-23 La Jolla Pharmaceutical Company APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies
WO1996040273A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Schering Aktiengesellschaft Conjugates of ferrites and oligonucleotides, which bond specifically to certain target structures
US7074768B2 (en) * 1995-08-17 2006-07-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modified protein kinase A-specific oligonucleotides and methods of their use
EP0879284B1 (en) 1996-01-30 2009-07-29 The Regents of The University of California Gene expression vectors which generate an antigen specific immune response and methods of using the same
US5795582A (en) * 1996-02-07 1998-08-18 Novavax, Inc. Adjuvant properties of poly (amidoamine) dendrimers
US5998602A (en) 1996-02-15 1999-12-07 The Cleveland Clinic Fouindation And Government RNase L activators and antisense oligonucleotides effective to treat RSV infections
CA2256449A1 (en) 1996-06-06 1997-12-11 Lajolla Pharmaceutical Company Apl immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for apl antibody-mediated pathologies
FR2750136B1 (fr) * 1996-06-25 1998-08-14 Cis Bio Int Conjugues d'un oligonucleotide/polymere conducteur electronique avec une molecule d'interet, et leurs utilisations
US5912332A (en) * 1996-07-26 1999-06-15 Hybridon, Inc. Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides
US5856462A (en) * 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
DK1005368T3 (da) 1997-03-10 2010-01-04 Ottawa Hospital Res Inst Anvendelse af nukleinsyrer, der indeholder ikke-metyleret CpG dinukleotid i kombination med alun som hjælpestoffer
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6524613B1 (en) * 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
US6426334B1 (en) * 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
CA2289741A1 (en) 1997-05-19 1998-11-26 Merck & Co., Inc. Oligonucleotide adjuvant
EP1003531B1 (en) 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
US6589940B1 (en) * 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
JP4101888B2 (ja) 1997-06-06 2008-06-18 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法
US20040006034A1 (en) 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6183959B1 (en) * 1997-07-03 2001-02-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method for target site selection and discovery
AU757175B2 (en) 1997-09-05 2003-02-06 Regents Of The University Of California, The Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or reducing antigen-stimulated, granulocyte-mediated inflammation
JP2001518292A (ja) 1997-09-22 2001-10-16 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸触媒
US7393630B2 (en) * 1997-12-16 2008-07-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JPH11209289A (ja) * 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
PT1061954E (pt) 1998-03-12 2004-10-29 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados de poli(etileno glicol) com grupos reactivos proximos
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
CA2328602A1 (en) 1998-05-06 1999-11-11 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
CA2328406A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
DE69932717T2 (de) 1998-05-22 2007-08-09 Ottawa Health Research Institute, Ottawa Methoden und produkte zur induzierung mukosaler immunität
US5948648A (en) * 1998-05-29 1999-09-07 Khan; Shaheer H. Nucleotide compounds including a rigid linker
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
EP1113818B1 (en) 1998-09-18 2006-05-17 Dynavax Technologies Corporation METHODS OF TREATING IgE-ASSOCIATED DISORDERS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREIN
EP1117433A1 (en) * 1998-10-09 2001-07-25 Dynavax Technologies Corporation Anti hiv compositions comprising immunostimulatory polynucleotides and hiv antigens
US6458953B1 (en) 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
US6399578B1 (en) 1998-12-09 2002-06-04 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates comprising galactose α1,3 galactosyl epitopes and methods of using same
WO2000054803A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
EP1176966B1 (en) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
AU4978100A (en) 1999-04-29 2000-11-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening for immunostimulatory dna functional modifyers
FR2793249B1 (fr) 1999-05-03 2001-07-27 Roquette Freres Procede de transformation de matieres amylacees en phase seche
OA11937A (en) 1999-05-06 2006-04-12 Immune Response Corp Inc HIV immunogenic compositions and methods.
CN1762990A (zh) 1999-06-08 2006-04-26 拉卓拉药物公司 包含氨基氧基的化合价平台分子
US6531591B1 (en) * 1999-07-07 2003-03-11 Exiqon A/S Synthesis of stable quinone and photoreactive ketone phosphoramidite reagents for solid phase synthesis of photoreactive-oligomer conjugates
CA2377589A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-18 Jef Fensholdt Synthesis of stable quinone and photoreactive ketone phosphoramidite reagents for solid phase synthesis of photoreactive-oligomer conjugates
EP2314693A3 (en) * 1999-08-13 2012-11-28 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
AU774380B2 (en) 1999-08-19 2004-06-24 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
MXPA02002107A (es) 1999-08-27 2003-08-20 Inex Pharmaceuticals Corp Composiciones para estimular la secrecion de citoquina e inducir una respuesta inmune.
DE60022665T2 (de) 1999-09-25 2006-06-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunstimulierende nukeinsäuren
AU783118B2 (en) 1999-09-27 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
AU2593701A (en) 1999-12-21 2001-07-03 Regents Of The University Of California, The Method for preventing an anaphylactic reaction
AU2001227889A1 (en) 2000-01-14 2001-07-24 The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
JP4443810B2 (ja) 2000-01-26 2010-03-31 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ誘導性免疫刺激の調節
AT409085B (de) 2000-01-28 2002-05-27 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen
AU2001231245A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
CA2399550A1 (en) 2000-02-23 2001-08-30 The Regents Of The University Of California Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
US20010046967A1 (en) 2000-03-10 2001-11-29 Gary Van Nest Methods of preventing and treating respiratory viral infection using immunomodulatory polynucleotide
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7157437B2 (en) * 2000-03-10 2007-01-02 Dynavax Technologies Corporation Methods of ameliorating symptoms of herpes infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20020098199A1 (en) 2000-03-10 2002-07-25 Gary Van Nest Methods of suppressing hepatitis virus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20020028784A1 (en) 2000-03-10 2002-03-07 Nest Gary Van Methods of preventing and treating viral infections using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20020107212A1 (en) 2000-03-10 2002-08-08 Nest Gary Van Methods of reducing papillomavirus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
WO2001072123A1 (en) 2000-03-28 2001-10-04 The Regents Of The University Of California Methods for increasing a cytotoxic t lymphocyte response in vivo
AU2001251407A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 The Regents Of The University Of California Synergistic improvements to polynucleotide vaccines
US7115579B2 (en) * 2000-05-01 2006-10-03 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
JP2004530629A (ja) 2000-06-07 2004-10-07 バイオシネクサス インコーポレーテッド 免疫刺激ｒｎａ／ｄｎａハイブリッド分子
KR100396983B1 (ko) 2000-07-29 2003-09-02 이강춘 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
ES2298269T3 (es) * 2000-09-26 2008-05-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulacion de la actividad inmunoestimulante de analogos oligonucleotidicos inmunoestimulantes mediante cambios quimicos posicionales.
DE10048417A1 (de) 2000-09-29 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verbindungen mit verzweigtem Linker
EP1985702A3 (en) 2000-12-08 2010-08-18 Coley Pharmaceutical GmbH CPG-like nucleic acids and methods of use thereof
CA2430691A1 (en) * 2000-12-27 2002-07-04 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory polynucleotides and methods of using the same
AU2002248646A1 (en) 2001-03-16 2002-10-03 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating an immune response
US20040132677A1 (en) * 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
EP1404873B1 (en) * 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US20030006034A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-09 Heartland Rig International, Llc Coiled tubing level wind system
AU2002326561B2 (en) * 2001-08-07 2008-04-03 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
US7354909B2 (en) * 2001-08-14 2008-04-08 The United States Of America As Represented By Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
PT1446162E (pt) * 2001-08-17 2009-01-27 Coley Pharm Gmbh Agrupamentos imunoestimuladores oligonucléotidos com actividade melhorada
US7255866B2 (en) * 2001-09-17 2007-08-14 Allergan, Inc. Botulinum toxin therapy for fibromyalgia
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
EP1393745A1 (en) 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5'ends
EP1575504A4 (en) * 2002-08-01 2009-11-04 Us Gov Health & Human Serv METHOD FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY ARTHROPATHIES WITH SUPPRESSORS OF THE CPG OLIGONUCLEOTIDES
KR20050052467A (ko) * 2002-08-12 2005-06-02 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역조절 조성물, 이의 제조방법 및 이의 이용방법
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US8043622B2 (en) * 2002-10-08 2011-10-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating inflammatory lung disease with suppressors of CpG oligonucleotides
JP4084801B2 (ja) * 2002-10-11 2008-04-30 富士通株式会社 Ｐｎ符号発生器、ｇｏｌｄ符号発生器、ｐｎ符号逆拡散器、ｐｎ符号発生方法、ｇｏｌｄ符号発生方法、ｐｎ符号逆拡散方法、及びコンピュータプログラム
US7325872B2 (en) * 2002-10-15 2008-02-05 Mattel, Inc. Rocker and method of using the same
EP1556077A2 (en) * 2002-10-29 2005-07-27 Coley Pharmaceutical Group, Ltd Use of cpg oligonucleotides in the treatment of hepatitis c virus infection
EP1581548A4 (en) 2002-11-21 2008-04-23 Archemix Corp MULTIVALENT APTAMER THERAPEUTIC WITH IMPROVED PHARMACODYNAMIC PROPERTIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
AU2003300919A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-30 Coley Pharmaceutical Gmbh 5' cpg nucleic acids and methods of use
PT1992635E (pt) * 2002-12-23 2012-03-20 Dynavax Tech Corp Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7625872B2 (en) * 2002-12-23 2009-12-01 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
CA2512484A1 (en) * 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US7176208B2 (en) * 2003-04-18 2007-02-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Quinoxalinyl macrocyclic hepatitis C serine protease inhibitors
KR20060012622A (ko) * 2003-05-16 2006-02-08 하이브리돈, 인코포레이티드 화학요법제와 함께 이뮤노머를 사용하는 상승적 암 치료방법
JP4874801B2 (ja) * 2003-06-11 2012-02-15 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
JP2007531699A (ja) * 2003-07-15 2007-11-08 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー化合物をサイトカインおよび／または化学療法剤または放射線療法と組み合わせて用いる、免疫系の相乗的刺激
BRPI0414045A (pt) * 2003-09-05 2006-10-24 Anadys Pharmaceuticals Inc administração de ligantes de tlr7 e pró-medicamentos dos mesmos para tratamento de infecção por vìrus de hepatite c
US7250398B2 (en) * 2003-09-12 2007-07-31 Novozymes A/S Synthetic antimicrobial polypeptides
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
SG122973A1 (en) * 2003-10-30 2006-06-29 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
AU2004304770B2 (en) * 2003-12-08 2010-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
EP2415481A3 (en) * 2004-02-19 2012-04-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
WO2005081847A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Hybridon, Inc. Potent mucosal immune response induced by modified immunomodulatory oligonucleotides
WO2006002038A2 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Hybridon, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
US7498425B2 (en) * 2004-06-15 2009-03-03 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
US8289972B2 (en) * 2004-11-10 2012-10-16 Alcatel Lucent Gigabit passive optical network strict priority weighted round robin scheduling mechanism
AU2006216822A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Daniel Rachmilewitz Methods of treating gastrointestinal inflammation
NZ561144A (en) * 2005-03-04 2009-09-25 Dynavax Tech Corp Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (ISS) wherein the ISS are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
WO2006116458A2 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhances immunostimulatory activity
US7357184B2 (en) * 2005-10-21 2008-04-15 Schlumberger Technology Corporation Jacking frame having a wellhead centralizer and method of use
AU2006336242A1 (en) 2005-12-20 2007-07-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of toll-like receptors containing CG dinucleotide modifications
WO2007075626A2 (en) * 2005-12-20 2007-07-05 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory activity of palindromic immune modulatory oligonucleotides (imo tm) contiaining different lengths of palindromic segments
JP4864766B2 (ja) * 2006-03-31 2012-02-01 富士フイルム株式会社 半導体層の成膜方法
EP1887446A1 (de) * 2006-08-02 2008-02-13 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur seriellen asynchronen Übertragung von Daten in einer Anordnung zur Überwachung, Steuerung und Regelung einer betriebstechnischen Anlage eines Gebäudes
NZ575437A (en) * 2006-09-27 2012-02-24 Coley Pharm Gmbh Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity
ES2454175T3 (es) * 2006-11-09 2014-04-09 Dynavax Technologies Corporation Modificación de una enfermedad a largo plazo mediante el uso de oligonucleótidos inmunoestimuladores
CN101600728A (zh) * 2006-12-04 2009-12-09 伊利诺斯大学理事会 使用铜氧还蛋白和富含CpG的DNA治疗癌症的组合物和方法
EP2190440A1 (en) * 2007-08-13 2010-06-02 Pfizer Inc. Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
US20090196915A1 (en) * 2007-08-21 2009-08-06 Gary Van Nest Composition and methods of making and using influenza proteins
JP5727367B2 (ja) * 2008-05-15 2015-06-03 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫賦活オリゴヌクレオチドを使用する長期疾患改良
US8222225B2 (en) * 2008-05-21 2012-07-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating pneumoconiosis with oligodeoxynucleotides
WO2010002940A2 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Dynavax Technologies Corporation Heterogeneous synthesis of multivalent chimeric immunomodulatory compounds using platform based molecules
US8053422B2 (en) * 2008-12-04 2011-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-cancer oligodeoxynucleotides

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100784164B1 (ko) 2006-05-08 2007-12-10 고려대학교 산학협력단 이중 마커를 이용한 ｓｉＲＮＡ의 정량용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US20030199466A1 (en) 2003-10-23
US20140127255A1 (en) 2014-05-08
EP2423335A2 (en) 2012-02-29
US20030175731A1 (en) 2003-09-18
HK1068924A1 (en) 2005-05-06
US8003115B2 (en) 2011-08-23
DK1404873T3 (da) 2013-08-05
WO2003000922A3 (en) 2003-10-23
CA2451974C (en) 2014-10-14
US8222398B2 (en) 2012-07-17
ES2487645T3 (es) 2014-08-22
US20080181909A1 (en) 2008-07-31
JP2004537535A (ja) 2004-12-16
EP1404873A4 (en) 2009-03-25
AU2002345847B2 (en) 2008-05-29
DK2423335T3 (da) 2014-08-18
US7255868B2 (en) 2007-08-14
WO2003000922A2 (en) 2003-01-03
EP1404873A2 (en) 2004-04-07
NZ530460A (en) 2008-06-30
US20120231039A1 (en) 2012-09-13
US8114418B2 (en) 2012-02-14
EP2423335B1 (en) 2014-05-14
JP4598389B2 (ja) 2010-12-15
US20090317480A1 (en) 2009-12-24
US9028845B2 (en) 2015-05-12
PT1404873E (pt) 2013-07-30
US8597665B2 (en) 2013-12-03
KR100985457B1 (ko) 2010-10-06
ES2421532T3 (es) 2013-09-03
CA2451974A1 (en) 2003-01-03
EP2423335A3 (en) 2012-08-08
CN1533442A (zh) 2004-09-29
CN100334228C (zh) 2007-08-29
US20150297737A1 (en) 2015-10-22
JP2010189400A (ja) 2010-09-02
HK1167690A1 (en) 2012-12-07
EP1404873B1 (en) 2013-05-22
US20070049550A1 (en) 2007-03-01

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