KR20060012622A - 화학요법제와 함께 이뮤노머를 사용하는 상승적 암 치료방법 - Google Patents

화학요법제와 함께 이뮤노머를 사용하는 상승적 암 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상승적 치료 효과를 제공하기 위해 화학요법제와 함께 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 치료적으로 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

화학요법제와 함께 이뮤노머를 사용하는 상승적 암 치료 방법 {SYNERGISTIC TREATMENT OF CANCER USING IMMUNOMERS IN CONJUCTION WITH CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS}
본 발명은 치료제로서 이뮤노머(immunomer)를 사용하는 항암 분야에 관한 것이다.
최근, 몇몇 연구자들은 면역 치료 분야에서 면역자극제로서 올리고누클레오티드 사용의 유효성을 입증하였다. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 면역 자극을 유발할 수 있다는 관찰은 이들 화합물을 치료적 기구로서 개발하는 데 관심을 갖게 하였다. 이러한 노력은 천연 디누클레오티드 CpG를 함유하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 집중되었다. 구라모토(Kuramoto) 등의 문헌(Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992))은 CpG 디누클레오티드를 포함하는 팔린드롬을 함유하는 포스포디에스테르 올리고누클레오티드가 인터페론-알파 및 감마의 합성을 유도할 수 있으며, 자연 살해 활성(natural kill activity)을 증진시킴을 교시하고 있다. 크리그(Krieg) 등의 문헌(Nature 371:546-549 (1995))은 포스포로티오에이트 CpG 함유 올리고누클레오티드가 면역자극성임을 개시하고 있다. 리앙(Liang) 등의 문헌(J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996))은 이러한 올리고누클레오티드가 사람 B 세포를 활성화시킴을 개시하고 있다. 몰도베아누(Moldoveanu) 등의 문헌(et al., Vaccine 16:1216-124 (1998))은 CpG 함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 반응을 증진시킴을 교시하고 있다. 맥클러스키(McCluskie)와 데이비스(Davis)의 문헌(J. Immunol. 161:4463-4466 (1998))은 CpG 함유 올리고누클레오티드가 효능있는 애주번트로서 작용하여 B형 간염 표면 항원에 대해 면역 반응을 증진시킴을 교시하고 있다.
CpG 함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드의 다른 변형체는 면역 반응의 조절제로서 작용 능력에 영향을 미칠 수 있다[참조예: Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; 및 Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813]. 미국 특허 제 6,426,334호는 이들 화합물의 항암제로서의 가능성을 보여주고 있다.
다수의 소과동물 및 사람 종양이 숙주 면역계에 의해 인식될 수 있는 면역원성 에피토프를 지니는 것이 잘 입증되었지만, 대부분의 경우에 숙주 방어가 암 환자에게서 비조절 종양 성장을 유발하는 충분한 반응에 이르게 하는 데는 실패하였다. 숙주 면역계가 종양 세포에 대한 방어를 이끌어 내지 못한 것은 종양 항원의 낮은 면역원성 및 숙주 면역계 자체의 결함과 관련될 수 있다.
이러한 보고는, 여전히 면역자극성 올리고누클레오티드의 항암 활성을 증진시킬 필요가 있음을 보다 분명하게 한다.
발명의 요약
본 발명은 면역자극성 올리고누클레오티드 화합물의 항암 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역자극성 올리고누클레오티드의 면역자극와 화학요법제의 치료 효과 간에 상승작용을 일으킬 수 있다. 5' 말단을 최적으로 제공하는 면역자극성 올리고누클레오티드의 변형체는 항암 활성을 극적으로 증진시킨다. 이러한 올리고누클레오티드를 본원에서는 "이뮤노머"라 칭하고, 이는 하나 이상의 면역자극성 올리고누클레오티드를 함유할 수 있다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 치료제와 함께 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 암 환자에게서 암을 치료하는 방법으로서, 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 및 화학요법제가 상승적 치료 효과를 나타나게 하는 방법을 제공한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 CpG, C*pG, CpG*, 및 C*pG*로 이루어진 군으로부터 선택된 면역자극성 디누클레오티드를 포함하며, 여기에서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*는 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티닌, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 그 밖의 합성 피리미딘 누클레오티드 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이고; G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*는 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 또는 그 밖의 합성 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 누클레오시드간 결합이다. 특정 바라직한 구체예에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
몇몇 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 하기 화학식(III)의 면역자극성 도메인을 포함한다:
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' (III)
상기 식에서,
Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 그 밖의 합성 피리미딘 누클레오시드 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이고;
Z는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이거나, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 합성 푸린 누클레오시드이고;
N1은 각각의 경우에 바람직하게는 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, 및 3' 측 상에 인접한 누클레오시드로의 개질된 누클레오시드간 결합 또는 포스포디에스테르에 의해 결합된 누클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 또는 합성 누클레오시드 또는 면역자극성 부분(여기에서, 개질된 누클레오시드간 결합은 약 2 내지 약 200Å의 길이를 갖는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 및 2'-5' 누클레오시드간 결합, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합으로부터 선택되나, 이로 제한되는 것은 아니다)이고,
Nn은 각각의 경우에 천연 누클레오시드 또는 면역자극성 부분이고, 바람직하게는, 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-치환된 리보누클레오시드, 및 3' 측 상에 인접한 누클레오시드로의 개질된 누클레오시드간 결합에 의해 결합된 누클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기에서, 개질된 누클레오시드간 결합은 아미노 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드간 결합 및 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합으로부터 선택되며,
단, N1 및 Nn 중 하나 이상은 면역자극성 부분이고,
여기에서, n은 0 내지 30이고.
3'-누클레오시드는 임의로 면역자극성이거나 아닐 수 있는 다른 올리고누클 레오티드에 직접 연결되거나 비누클레오티드 링커를 통해 연결된다.
제 2의 양태에서, 본 발명은 화학요법제와 함께 상기 기술된 바와 같은 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머, 접근가능한 5' 말단 이외의 위치에서 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에 컨쥬게이트된 암 항원을 포함하는, 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하여 암 환자에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트, 화학요법제 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 제형을 제공한다.
도 1은 본 발명의 대표적인 이뮤노머를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 대표적인 몇몇 이뮤노머를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 이뮤노머의 선형(linear) 합성에 적합한 대표적인 일군의 소분자 링커를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 이뮤노머의 병렬적(parallel) 합성에 적합한 대표적인 일군의 소분자 링커를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성에 대한 합성도식이다. DMT = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 6은 본 발명의 이뮤노머의 병렬적 합성에 대한 합성도식이다. DMT = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 7는 BALB/c 마우스의 비장 세포 배양물 중에서의 올리고누클레오티드 1 및 이뮤노머 2-3에 의한 IL-2 유도에 대한 그래프도이다. 이들 데이타는 접근가능한 5'-말단을 갖는 이뮤노머 2가 모노머 올리고 1보다 IL-12의 보다 강한 인듀서(inducer)이고, 접근가능한 5'-말단을 갖지 않은 이뮤노머 3은 올리고 1와 비교하여 면역자극을 유발하는 능력이 동일하거나 보다 약하다는 것을 시사한다.
도 7b는 BALB/c 마우스의 비장 세포 배양물 중에서의 올리고누클레오티드 1 및 이뮤노머 2-3에 의한 IL-6 유도(각각 상부 대 저부)에 대한 그래프도이다. 이들 데이타는 접근가능한 5'-말단을 갖는 이뮤노머 2가 모노머 올리고 1보다 IL-6의 보다 강한 인듀서이고, 접근가능한 5'-말단을 갖지 않은 이뮤노머 3은 올리고 1와 비교하여 면역자극을 유발하는 능력이 동일하거나 보다 약하다는 것을 시사한다.
도 7c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고머누클레오티드 1 및 이뮤노머 2-3에 의한 IL-10 유도(각각 상부 대 저부)에 대한 그래프도이다.
도 8a는 각각 접근불능인 5' 말단 및 접근가능한 5' 말단을 갖는 상이한 농도의 이뮤노머 5 및 6에 의한 세포 배양물 중에서의 BALB/c 마우스 비장 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 8b는 CpG 모티브의 5' 플랭킹 서열에서 면역원성 화학 변형을 갖는 올리고누클레오티드 4 및 이뮤노머 5-6에 의한 BALB/c 마우스 비장 확대에 대한 대표도이다. 다시, 접근가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 (6)는 접근가능한 5' 말단을 갖지 않는 이뮤노머 5 및 모노머 올리고누클레오티드 4와 비교하여 비장 확대를 증가시키는 능력이 보다 컸다.
도 9a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고누클레오티드 4 및 이뮤노머 7 및 8의 상이한 농도에 의한 IL-12 유도에 대한 그래프도이다.
도 9b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고누클레오티드 4 및 이뮤노머 7 및 8의 상이한 농도에 의한 IL-6 유도에 대한 그래프도이다.
도 9c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고누클레오티드 4 및 이뮤노머 7 및 8의 상이한 농도에 의한 IL-10 유도에 대한 그래프도이다.
도 10a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 이뮤노머 14, 15 및 16에 의한 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 10b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 이뮤노머 14, 및 16의 상이한 농도에 의한, IL-12에 의한 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 10c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 이뮤노머 14, 및 16의 상이한 농도에 의한, IL-6에 의한 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 11a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고머 4 및 17, 및 이뮤노머 19 및 20에 의한 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 11b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고머 4 및 17, 및 이뮤노머 19 및 20의 상이한 농도에 의한, IL-12 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 11c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중에서의 올리고머 4 및 17, 및 이뮤노머 19 및 20의 상이한 농도에 의한, IL-6 세포 증식 유도에 대한 그래프도이다.
도 12는 올리고누클레오티드 4 및 이뮤노머 14, 23 및 24를 사용하는 BALB/c 마우스 비장 확대에 대한 그래프도이다.
도 13은 전립선 암의 누드 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 본 발명에 따른 방법의 효과를 나타낸다.
도 14는 연구에 사용되는 마우스의 체중에 대한 본 발명에 따른 방법의 효과를 나타낸다.
도 15는 IMO 화합물 구조 및 변형체의 예를 나타낸다.
도 16은 IMO 화합물의 시험관내 시토킨 유도 프로파일을 나타낸다.
도 17a는 BALB/c 마우스에서 CT25.CL25 결장 종양에 대한 IMO 화합물의 항종양 활성을 나타낸다. IMO 1 (원형), IMO 2(삼각형) 또는 대조군 비-CpG DNA(사각형). *p < 0.001, 비-CpG DNA 대조군과 비교. 플롯은 상이한 처리군에서 CT26.WT(도 17b) 또는 CT26.CL25(도 17c) 종양을 지닌 BALB/c 마우스의 생존율을 나타낸다. PBS(사각형) 또는 대조군 비-CpG DNA(원형) 또는 IMO 2(삼각형).
도 18은 24일째의 CT26.CL25 종양을 지닌 BALB/c 마우스에서의 혈청 β-gal-특이적 IgG1(빈 막대) 및 IgG2a(진한 막대)의 수준을 나타낸다.
도 19는 다양한 처리군에서 24일째의 CT26.CL25 결장 종양을 지닌 마우스의 비장으로부터 분리된 전체 T 세포(106) 중 T-림프구를 분비하는 IFN-γ(도 19a) 및 IL-4(도 19b)를 나타낸다. PBS(빈 막대), β-gal(어두운 막대), 또는 OVA 펩티드진한 막대).
도 20은 IMO 처리 후 지속되는 항종양 기억을 나타낸다. CT26.WT 결장(도 20a), CT26.CL25(도 20b), 또는 4T1 포유 동물 암종 세포(도 20c)로 재자극된 IMO 처리된 CT26.CL25 복막 종양의 장기간 생존자들에 대한 생존 플롯을 나타낸다. IMO 2(원형) 또는 IMO 모티브로 처리되지 않은 네이브(naive) 마우스(사각형).
도 21은 네이브 마우스가 IMO 화합물로 처리된 종양을 지닌 마우스로부터 면역 세포를 채택 전달한 후 특이적 항종양 보호능을 전개시킴을 보여준다. 도 21a는 IMO 2(삼각형)으로부터 처리된 마우스 또는 네이브 마우스(원형)로부터 얻은 면역 세포의 채택 전달 후 모 CT26.CL25 종양 세포 자극에 대한 마우스의 생존율을 도시한 것이다. 도 21b는 IMO 2(삼각형)으로부터 처리된 마우스 또는 네이브 마우스(원형)로부터 얻은 면역 세포의 채택 전달 후 4T1 유방암 세포 자극에 대한 마우스의 생존율을 도시한 것이다. 대조군으로서 PBS가 주입되고 C26.CL25 세포로 자극된 마우스가 두가지 패널에서 모두 사각형으로 도시된다.
도 22a는 C57BL/6 마우스의 B16.F0 흑색종에 대한 IMO 화합물의 항종양 활성을 나타낸 것이다. IMO 2 (진한 막대) 또는 대조군 비-CpG DNA(빈 막대), * p < 0.0183, 비-CpG DNA 대조군과 비교. IMO 2 또는 대조군 비-CpG DNA로 처리한 후 22일째 B16.F0 종양을 지닌 C57BL/6 마우스에서의 전체 혈청 IgG1(도 22b) 및 IgG2a(도 22c) 항체 서브클래스(subclass).
도 23은 B16.F0 흑색종을 갖는 wt, IL-6 ko 및 IL-12ko C57BL/6 마우스의 생존에 대한 IMO 2의 영향. 야생형 (wt)(사각형)에 있어서, 비-CpG DNA 및 wt(마름모형), IL-6 넉아웃(ko)(원형) 및 IL-12 ko(삼각형)에 있어서, IMO 2.
도 24는 조합된 통상적인 화학요법과 IMO 면역치료법의 상승된 항종양 활성. (A) 다양한 처리군의 BALB/c 마우스에서 4T1 유방 종양의 성장 억제. 각각의 원형은 단일 동물의 데이타를 나타내며, +는 평균을 나타낸다. *p = 0.0004는 PBS 대조군과 비교하였다. (B) 다양한 처리군에서 복막 전이된 B16.F0 흑색종 함유 C57BL/6 마우스의 생존 플롯. PBS(사각형), 2일째에 단일 용량의 도세탁셀 (20mg/kg, i.p.)(마름모형), IMO 2 (1.5mg/kg, i.p., 3, 6, 9, 12 및 15일)(원형) 또는 동일한 용량 및 단일요법으로의 도세탁셀 및 IMO2의 조합 (삼각형). (C) PBS, 도세탁셀 (Doce; 30mg/kg, i.p. 1일 및 3일째), IMO 2(5mg/kg, i.p., 1, 3, 5 및 7일째) 또는 도세탁셀 (Doce)과 IMO 2로 처리된 C57BL/6 마우스에서 CD69+ 및 CD86+ 세포의 활성화. CD69+(흰막대) 및 CD86+(검정 막대).
도 25. (A) BALB/c 마우스에서 CT26.CL25 결장 종양에 대한 마우스 및 사람 IMO 2 및 3 각각의 항종양 효과. IMO 2(원형), IMO 3(삼각형) 또는 비-CpG DNA(사각형). (B) IMO 모티프의 투여 4시간 후, 마우스에서 혈청 IL-12 수준.
도 26은 헤르셉틴의 존재하에 Her-2 파지티브 BT-474 세포의 사람 PBMC 유도 세포용해에 대한 IMO 3 활성을 나타낸다.
도 27은 IMO 화합물과 리투산(Rituxan) 또는 헤르셉틴(Herceptin) 조합 처리에 이용된 치료 스케쥴을 나타낸다.
도 28은 종양의 백분율 및 리투산 및/또는 IMO 처리로 종양 크기가 1.5그램에 도달하는데 요구되는 일수를 나타낸다.
도 29는 헤르셉틴 및/또는 IMO 처리 후 종양 성장의 억제율을 나타낸다.
도 30은 리투산 및/또는 IMO 처리 후 종양 성장의 억제율을 나타낸다.
본 발명은 화학요법제와 함께 항암제로서 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 치료학적 용도에 관한 것이다. 본원에 공개된 공고된 특허, 특허 출원 및 참조문헌은 각각이 특정하고 개별적으로 참조되는 것으로 지시된 바와 같이 동일 범위로 참조로서 본원에 인용되었다. 본원에 기재된 참조문헌의 교시와 본 명세서가 불일치하는 경우, 본 명세서 내용이 본 발명의 목적에 우세하다.
본 발명은 암 치료를 위한 면역치료법에 사용되는 면역자극 화합물에 의해 유도된 항암 효과를 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이뮤노머 및/또는 면역자극 올리고누클레오티드는 암 또는 종양 (예를 들어, 뇌, 폐 (예를 들어, 소세포 및 비소세포), 난소, 유방, 전립선, 결장, 신경교종의 종양, 기타 흑색종, 암종, 백혈병, 림프종 및 육종)의 발병 및/또는 진행을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 화학요법제와 함께 사용될 경우 상승된 치료 효과를 제공한다. 이러한 결과는 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머가 면역계 세포의 세포 분화를 유도하는 반면, 화학요법제는 일반적으로 활성적으로 분화하는 세포를 치사시킨다는 관점에서 놀라운 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 화학요법제와 함께 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 투여하는 것을 포함하여 암환자의 암을 치료하는 방법으로서, 이뮤노머는 하나 초과의 접근가능한 5' 말단을 갖도록 서로 결합된 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고누클레오티드중 하나 이상이 면역자극 올리고누클레오티드인 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접근가능한 5' 말단"은 올리고누클레오티드의 5' 말단이 이뮤노머를 인지하고 이에 결합하여, 면역 시스템을 자극하는 인자에 충분히 접근할 수 있는 것을 의미한다. 선택적으로, 5' OH는 포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 부분, 방향족 또는 지방족 링커, 콜레스테롤, 또는 접근에 방해되지 않는 기타 부분에 연결될 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 및 이뮤노머는 척추동물에 투여될 경우 면역반응을 유도한다. 화학요법제와 함께 사용될 경우, 상승 치료효과가 수득된다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 바람직한 화학요법제는 비제한적으로, 젬시타빈(Gemcitabine), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈크리스틴(vincristine), 아드리아마이신(adriamycin), 시스플라틴(cisplatin), 당비함유 클로로에틸니트로소우레아(non-sugar containing chloroethylnitrosoureas), 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxorubicin), 다카르바진(dacarbazine), 탁솔(taxol), 프라질린(fragyline), 메글라민 GLA(Meglamine GLA), 발루비신(valrubicin), 카르무스타인과 폴리퍼포산(carmustaine and poliferposan), MMI270, BAY 12-9566, RAS 파메실 트랜스퍼라아제 억제제 (RAS famesyl transferase inhibitor), 파메실 트랜스퍼라아제 억제제 (famesyl transferase inhibitor), MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔(Lometexol), 클라몰렉(Glamolec), CI-994, TNP-470, 히캄틴/토포테칸(Hycamtin/Topotecan), PKC412, 발스포다(Valspodar)/PSC833, 노반트론/미트록산트론(Novantrone/Mitroxantrone), 메타레트/수라민(Metaret/Suramin), 바티마스타트(Batimastat), E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트(Marmistat), BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, 이마티니브 메실레이트(imatinib mesylate)/글리베크(Gleevec), 피시바닐(Picibanil)/OK-432, AD 32/발루비신(Valrubicin), 메타스트론(Metastron)/스트론튬 유도체, 테모달/테모졸로미드(Temodal/Temozolomide), 에바세트/리포조말 독소루비신(Evacet/liposomal doxorubicin), 유탁산/플라클리탁셀(Yewtaxan/Placlitaxel), 탁솔/플라클리탁셀, 젤로드/카페시타빈(Xeload/Capecitabine), 푸르툴론/옥시플루리딘(Furtulon/Doxifluridine), 시클로팍스/오랄 파클리탁셀(Cyclopax/oral paclitaxel), 오랄 탁소이드(Oral Taxoid), SPU-077/시스플라틴(Cisplatin), HMR 1275/플라보피리돌(Flavopiridol), CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 온코젠 억제제, BMS-182751/오랄 플라티늄, UFT(테가푸르/우라실:Tegafur/Uracil), 에르가미솔/레바미솔(Ergamisol/Levamisole), 에닐우라실(Eniluracil)/776C85/5FU 증진제, 캄프토/레바미솔(Campto/Levamisole), 캄프토사르/이리노테칸(Camptosar/Irinotecan), 투모덱스/랄리트렉스트(Tumodex/Ralitrexed), 류스타틴/클라드리빈(Leustatin/Cladribine), 파섹스/플라시탁젤(Paxex/Paclitaxel), 독실/리포조말 독소루비신(Doxil/liposomal doxorubicin), 캐릭스(Caelyx)/리포조말 독소루비신, 플루다라/플루다라빈(Fludara/Fludarabine), 파마루비신/에피루비신(Pharmarubicin/Epirubicin), 데포시트(DepoCyt), ZD1839, LU 79553/비스-나프탈이미드(Bis-Naphtalimide), LU 103793/돌라스타인(Dolastain), 캐틱스(Caetyx)/리포조말 독소루비신, 겜자르/겜시타빈(Gemzar/Gemcitabine), ZD 0473/아노르메드(Anormed), YM 116, 로딘 시드(lodine seeds), CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드(Dexifosamide), 이페스/메스넥스/이포사미드(Ifes/Mesnex/Ifosamide), 부몬/테니포시드(Vumon/Teniposide), 파라플라틴/카르보플라틴(Paraplatin/Carboplatin), 플라티놀/시스플라틴(Plantinol/cisplatin), 베페사이드/에토포시드(Vepeside/Etoposide), ZD 9331, 탁소테레/도세탁셀(Taxotere/Docetaxel), 구아닌 아라비노사이드의 프로드러그(prodrug of guanine arabinoside), 탁산 아날로그(Taxane Analog), 니트로소우레아(nitrosoureas), 알킬화제 예컨대, 멜펠란 및 시클로포스프아미드, 아미노글루테티미드(Aminoglutethimide), 아스파라기나아제(Asparaginase), 부설판(Busulfan), 카르보 플라틴(Carboplatin), 클로롬부실(Chlorombucil), 시타르아빈(Cytarabine) HCl, 닥티노마이신(Dactinomycin), 다우노루비신(Daunorubicin) HCl, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨(Estramustine phosphate sodium), 에토포시드(Etoposide) (VP16-213), 플록스우리딘(Floxuridine), 플루오로우라실(Fluorouracil) (5-FU), 플루트아미드(Flutamide), 히드록시우레아(Hydroxyurea) (히드록시카르브아미드), 이포스아미드(Ifosfamide), 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트(Leuprolide acetate) (LHRH-방출 인사 유사체), 로무스틴(Lomustine) (CCNU), 메클로르에트아민(Mechlorethamine) HCl (질소 머스타드), 메르캅토퓨린, 메스나(Mesna), 미토탄(Mitotane) (o.p'-DDD), 미톡산트론(Mitoxantrone) HCl, 옥트레오타이드(Octreotide), 플리카마이신(Plicamycin), 프로카르바진(Procarbazine) HCl, 스트렙토조신(Streptozocin), 타목시펜 시트레이트(Tamoxifen citrate), 티오구아닌(Thioguanine), 티오테파(Thiotepa), 빈블라스틴 설페이트(Vinblastine sulfate), 암사크린(Amsacrine) (m-AMSA), 아자시티딘(Azacitidine), 에르트로포이에틴(Erthropoietin), 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터류킨 2, 미토구아존 (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴(Pentostatin) (2'데옥시코포르마이신), 세무스틴(Semustine) (메틸-CCNU), 테니포시드(Teniposide) (VM-26) 및 비데신 설페이트를 포함한다.
본 발명의 본 양태에 따른 방법에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 투여는 비제한적으로, 비경구, 경구, 설하, 피내, 국부, 비내, 에어로졸, 안구내, 직장재, 질내를 포함한 적합한 경로에 의해, 유전자 건, 피부 패치 또는 안약 또는 구강청결제 형태로 이루어질 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 치료학적 조성물의 투여는 질환의 증상 또는 대리표지자를 감소시키는데 효과적인 기간 및 투여량으로 공지된 공정으로 수행될 수 있다. 전신 투여될 경우, 치료 조성물은 바람직하게는 약 0.0001 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 혈액 수준을 달성하는데 충분한 투여량으로 투여된다. 국부 투여에 있어서, 이보다 더 적은 농도로도 효과적일 수 있으며, 더 높은 농도에도 내성이 있다. 바람직하게는, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 총 투여량은 약 0.0001mg/환자/1일 내지 약 200mg/체중 kg/1일이다. 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 단일 처리 에피소드로서 개체에 동시에 또는 연속적으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 이러한 양태에 있어서, "와 함께"는 동일한 환자에서 동일한 질환을 치료하는 경로이며, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 및/또는 화학요법제를, 동시 투여 또는 수일 이하의 간격을 두고 순차적으로 투여하는 것을 포함한 임의의 순서로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 조합 처리는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머, 및/또는 독립적으로 화학요법제의 단일 이상의 투여를 포함할 수 있다. 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 및/또는 화학요법제의 투여는 동일하거나 상이한 경로일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 이뮤노머는 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 면역자극 올리고누클레오티드 (이뮤노머에 있어서)를 포함한다. 바람직하게는, 이들 면역자극 올리고누클레오티드 각각은 하나 이상의 접근가능한 5' 말단을 갖는다.
본 발명에 따른 방법의 특정 구체예에서, 면역자극 올리고누클레오티드(들) 이외에, 이뮤노머는 유전자에 상보적인 하나 이상의 올리고누클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적"은 올리고누클레오티드가 유전자 영역에 생리학적 조건하에 하이브리다이징되는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 올리고누클레오티드는 유전자의 발현을 하향조절한다. 이러한 하향조절 올리고누클레오티드는 바람직하게는, 안티센스 올리고누클레오티드, 리보자임 올리고누클레오티드, 작은 억제 RNA 및 데코이 올리고누클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자의 하향조절"은 유전자의 전사 또는 유전자 생성물의 번역을 억제하는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 발명에 따른 방법에 사용된 이뮤노머는 면역계를 자극하면서 하나 이상의 특이적 질환 타겟을 타겟팅하는데 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 리보자임 또는 데코이 올리고누클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "리보자임"은 촉매 활성을 갖는 올리고누클레오티드를 의미한다. 바람직하게는, 리보자임은 특이적 핵산 표적에 결합하여, 표적을 절단한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "데코이 올리고누클레오티드"는 서열 특이적 방식으로 전사 인자에 결합하여, 전사 활성을 저지하는 올리고누클레오티드를 의미한다. 바람직하게는, 리보자임 또는 데코이 올리고누클레오티드는 비제한적으로 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 포함한 이차 구조를 나타낸다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 폴리(I)-폴리(dC)를 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 세트의 Nn은 3 내지 10dGs 및/또는 Gs의 스트링 또는 2'-치환된 리보-아라비노 Gs를 포함한다.
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "올리고누클레오티드"는 다수의 결합된 누클레오티드 유닛으로 형성된 폴리누클레오시드를 의미한다. 이러한 올리고누클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는 존재하는 핵산 공급원으로부터 수득될 수 있으나, 바람직하게는 합성 방법에 의해 생성된다. 바람직한 구체예에서, 각각의 누클레오시드 유닛은 헤테로시클릭 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로스, 아라비노스, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노스, 2'-O-치환된 아라비노스 또는 헥소스 당 기를 포함한다. 누클레오시드 잔기는 다양한 공지된 누클레오시드간 결합에 의해 서로 커플링될 수 있다. 이러한 누클레오시드간 결합은 비제한적으로, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미드, 카르바메이트, 모르폴리노, 보란, 티오에테르, 브릿징된 포스포르아미데이트, 브릿징된 메틸렌 포스포네이트, 브릿징된 포스포로티오에이트, 및 설폰 누클레오시드간 결합을 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드"는 하나 이상의 입체특이적 누클레오시드간 결합 (예를 들어, (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 결합)을 갖는 폴리누클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "올리고누클레오티드" 및 "디누클레오티드"는 결합이 포스페이트 기를 포함하는지의 여부에 상관없이 이러한 누클레오시드간 결합을 갖는 폴리누클레오시드 및 디누클레오시드를 포함하는 것으로 여겨진다. 특정 바람직한 구체예에서, 누클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트 결합 또는 이들의 조합물일 수 있다.
일부 구체예에서, 이뮤노머는 각각 약 3 내지 약 35개 누클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30개의 누클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 20개의 누클레오시드 잔기를 각각 갖는 폴리고누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고누클레오티드는 약 5 또는 6 내지 약 18개, 또는 약 5 또는 6 내지 약 14개의 누클레오티드 잔기를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 정확한 숫자가 중요하지는 않다는 것을 의미한다. 이와 같이, 올리고누클레오티드의 누클레오시드 잔기의 숫자는 중요하지 않으며, 1 또는 2개의 더 적은 누클레오시드 잔기를 갖거나, 1 또는 수개의 추가적인 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드는 본 발명의 목적에 있어서 상기 기술된 각각의 구체예의 등가물인 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 11개의 누클레오티드를 갖는다.
용어 "올리고누클레오티드"는 또한 비제한적으로 단백질 기, 친지성기, 삽입성물질, 디아민, 폴릭산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하는 추가적인 치환기를 갖는 폴리누클레오시드를 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드"는 또한 비제한적으로, 펩티드 핵산 (PNA), 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산 (PHONA), 록킹된 핵산 (LNA), 모르폴린-백본 올리고누클레오티드, 알킬 링커 또는 아미노 링커와 백본 섹션을 갖는 올리고누클레오티드를 포함하는, 기타 핵염기 함유 중합체를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 자연적으로 발생하는 누클레오시드, 변형된 누클레오시드 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "변형된 누클레오시드"는 변형된 헤테로시클릭 염기, 변형된 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함하는 누클레오시드이다. 일부 구체예에서, 변형된 누클레오시드는 본원에 기술된 바와 같은 비자연적 피리미딘 또는 퓨린 누클레오시드이다. 일부 구체예에서, 변형된 누클레오시드는 2'-치환된 리보누클레오시드, 아라비노누클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노시드이다.
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "2'-치환된 리보누클레오시드"는 펜토스 부분의 2' 위치에서의 히드록실기가 치환되어 2'-O-치환된 리보누클레오시드를 생성시키는 리보누클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 1-6개 포화 또는 불포화 탄소 원자를 갖는 저급 알킬기, 또는 6-10 탄소 원자를 갖는 아릴기로 치환되며, 여기서 이러한 알킬 또는 아릴기는 비치환되거나, 예를 들어, 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시 또는 아미노기로 치환될 수 있다. 이러한 2'-O-치환된 리보누클레오시드의 예로는 비제한적으로 2'-O-메틸리보누클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸리보누클레오시드를 포함한다.
용어 "2'-치환된 리보누클레오시드"는 또한 2'-히드록실기가 1-6개 치환된 또는 비치환된 탄소 원자, 또는 아미노 또는 할로 기를 갖는 저급 알킬 기로 치환된 리보누클레오시드를 포함한다. 이러한 2'-치환된 리보누클레오시드의 예로는 비제한적으로 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴 및 2'-프로파르길 리보누클레오시드를 포함한다.
용어 "올리고누클레오티드"는 하이브리드 및 키메릭 올리고누클레오티드를 포함한다. "키메릭 올리고누클레오티드"는 하나 초과 유형의 누클레오시드간 결합을 갖는 올리고누클레오티드이다. 이러한 키메릭 올리고누클레오티드의 한 바람직한 구체예는 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 또는 포스포로디티오에이트 영역 및 비이온성 결합 예컨대, 알킬포스포네이트 또는 알킬포스포노티오에이트 결합를 포함한 키메릭 올리고누클레오티드이다 (에를 들어, 페더슨(Pederson) 등의 미국특허 5,635,377 및 5,366,878 참조).
"하이브리드 올리고누클레오티드"는 하나 초과 유형의 누클레오시드를 갖는 올리고누클레오티드이다. 이러한 하이브리드 올리고누클레오티드의 한 바람직한 예는 리보누클레오티드 또는 2'-치환된 리보누클레오티드 영역, 및 데옥시리보누클레오티드 영역을 포함한다 (예를 들어, 메텔레브 및 아그라왈(Metelev and Agrawal)의 미국특허 5,652,355, 6,346,614 및 6,143,881 참조).
본 발명의 목적에 있어서, 용어 "면역자극 올리고누클레오티드"는 척추동물 예컨대, 어류, 조류 및 포유동물에 투여될 경우 면역반응을 유도하는 상기 기술된 바와 같은 올리고누클레오티드를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 비제한적으로, 래트, 마우스, 고양이, 개, 말, 소, 젖소, 돼지, 토끼, 사람 이외의 영장류 및 사람을 포함한다. 유용한 면역자극 올리고누클레오티드는 특허문헌[Agrawal et al., WO 98/49288, published November 5, 1998; WO 01/12804, published February 22, 2001; WO 01/55370, published August 2, 2001; PCT/US01/13682, filed April 30, 2001; and PCT/US01/30137, filed September 26, 2001]에 기술되어있다. 바람직하게는, 면역자극 올리고누클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 또는 포스포르디티오에이트 누클레오시드간 결합을 포함한다.
일부 구체예에서, 이뮤노머의 하나 이상의 면역자극 올리고누클레오티드는 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극 누클레오티드를 포함하며, 여기서 Pyr은 천연 또는 합성 피리미딘 누클레오시드이며, Pur은 천연 또는 합성 퓨린 누클레오시드이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "피리미딘 누클레오시드"는 누클레오시드의 염기 성분이 피리미딘 염기인 누클레오시드를 의미한다. 유사하게는, 용어 "퓨린 누클레오시드"는 누클레오시드의 염기 성분이 퓨린 염기인 누클레오시드를 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, "합성" 피리미딘 또는 퓨린 누클레오시드는 비자연적으로 발생하는 피리미딘 또는 퓨린 염기, 비자연적으로 발생하는 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서 바람직한 피리미딘 누클레오시드는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
Figure 112005066002272-PCT00001
(i) 상기 식에서,
D는 수소 결합 공여체이고;
D'는 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 흡인 기 및 전자 공여 기로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이며;
A'는 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전가 흡인 기 및 전자 공여 기로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
X는 탄소 또는 질소이며;
S'는 펜토오스 또는 헥소오스 당 고리, 또는 비천연 당이다.
바람직하게는, 당 고리는 인산염 부분, 개질된 인산염 부분, 또는 피리미딘 누클레오시드를 또 다른 누클레오시드나 누클레오시드 유사체에 결합시키기에 적합한 기타 링커 부분을 이용하여 유도된다.
바람직한 수소 결합 공여체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, -NH, -NH2, -SH 및 -OH가 포함된다. 바람직한 수소 결합 공여체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예를 들어 시스테인의 N3이 포함된다.
일부 구체예에서, ( I ) 내의 염기 부분은 비천연 피리미딘 염기이다. 바람직한 비천연 피리미딘 염기의 예로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 및 4-티오우라실이 포함된다. 일부 구체예에서, ( I ) 내의 당 부분 S'는 비천연 당 부분이다. 본 발명을 위한, "천연 당 부분"은, 핵산의 일부, 예를 들어 리보오스 및 2'-데옥시리보오스로서 천연적으로 존재하는 당 부분이며, "비천연 당 부분"은, 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하지는 않지만 올리고누클레오티드, 예를 들어 헥소오스에 대한 주쇄로 사용될 수 있는 임의의 당이다. 아라비노오스 및 아라비노오스 유도체가 바람직한 당 부분의 예이다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머(immunomer)에서의 바람직한 푸린 누클레오시드 유사체는 하기 구조식 ( II )을 갖는다:
Figure 112005066002272-PCT00002
(ii) 상기 식에서,
D는 수소 결합 공여체이고;
D'는 수소, 수소 결합 공여체, 및 친수성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고;
X는 탄소 또는 질소이고;
각각의 L은 C, O, N 및 S로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
S'는 펜토오스 또는 헥소오스 당 고리, 또는 비천연 당이다.
바람직하게는, 당 고리는 인산염 부분, 개질된 인산염 부분, 또는 피리미딘 누클레오시드를 또 다른 누클레오시드나 누클레오시드 유사체에 결합시키는데 적합한 기타 링커 부분을 이용하여 유도된다.
바람직한 수소 결합 공여체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, -NH, -NH2, -SH 및 -OH가 포함된다. 바람직한 수소 결합 공여체에는, 이들에 제한되는 것은 아니나, C=O, C=S, -NO2, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예를 들어 구아닌의 N1이 포함된다.
일부 구체예에서, ( II ) 내의 염기 부분은 비천연 푸린 염기이다. 바람직한 비천연 푸린 염기의 예로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 6-티오구아닌 및 7-데아자구아닌이 포함된다. 일부 구체예에서, ( II ) 내의 당 부분 S'는 구조식 ( I )에 대해 상기 기술된 바와 같은 천연 당 부분이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서의 면역자극성 디누클레오티드는 CpG, C*pG, CpG* 및 C*pG*로 이루어지는 군으로부터 선택되는데, 여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이며; C*는 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드, 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이며; G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며; G*는 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O 치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어지는 군으로부터 선택된 누클레오시드간 결합이다. 특정의 바람직한 구체예에서, 면역자극성 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
면역자극성 올리고누클레오티드는 면역자극성 디누클레오티드의 한면 또는 양면 상에 면역자극성 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 면역자극성 올리고누클레오티드는 하기 구조식( III )의 면역자극성 도메인을 포함한다:
Figure 112005066002272-PCT00003
상기 식에서,
Y는 시티딘, 2' 데옥시티미딘, 2' 데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드, 또는 2-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린이며;
Z는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2' 데옥시이노신, 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이며;
각각의 경우에 N1은, 바람직하게는 비염기성(abasic) 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 개질된 누클레오시드간 결합에 의해 3' 측 면 상의 인접 누클레오시드에 결합된 누클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 천연 또는 합성 누클레오시드 또는 면역자극성 부분으로서, 상기 개질된 누클레오티드간 결합은 이들에 제한되는 것은 아니나 약 2 옹스트롱 내지 약 200 옹스트롱의 길이를 갖는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드간 결합, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합으로부터 선택되며;
각각의 경우에 Nn은, 바람직하게는 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-치한된 리보누클레오시드, 및 개질된 누클레오시드간 결합에 의해 3' 측면 상의 인접 누클레오시드에 결합된 누클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 천연 누클레오시드 또는 면역자극성 부분으로서, 상기 개질된 누클레오시드간 결합은 바람직하게는 아미노 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드간 결합, 및 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
단, 상기 N1 또는 Nn중 하나 이상은 면역자극성 부분이며;
여기서 각각의 n은 독립적으로 0 내지 30의 수이며;
이뮤노머의 경우에, 3' 말단은 직접 또는 비누클레오티드성 링커를 경유하여 면역자극성이거나 아닐 수 있는 또 다른 올리고누클레오티드에 결합된다.
일부 바람직한 구체예에서, YZ는 아라비노시티딘 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘 및 아라비노구아노신 또는 2' 데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신이다. 바람직한 면역자극성 부분에는, 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테스, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르 전구약물, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, N-메틸히드록실아민, 카보네이트, 카르바메이트, 모르폴리노, 보라노포스포네이트, 포스포르아미데이트, 특히 1차 아미노-포스포르아미데이트, N3 포스포르아미데이트 및 N5 포스포르아미데이트를 포함하나 이들에 제한되지 않는 인산염 주쇄의 개질 부분; 및 입체특이적 결합 (예를 들어, (R p )- 또는 (S P )-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 결합)이 포함된다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분에는, 2'-O-메틸리보오스, 2'-O-메톡시에틸리보오스, 2'-O-프로파르길리보오스 및 2'-데옥시-2'-플루오로리보오스를 포함하나 이들에 제한되지 않는 2'-치환된 펜토오스 당; 3'-O-메틸리보오스를 포함하나 이들에 제한되지 않는 3'-치환된 펜토오스 당; 1',2'-디데옥시리보오스; 아라비노오스; 1'-메틸아라비노오스, 3'-히드록시메틸아라비노오스, 4'-히드록시메틸-아라비노오스, 및 2'-치환된 아라비노 당을 포함하나 이들에 제한되지 않는 치환된 아라비노오스 당; 1,5-언히드로헥시톨을 포함하나 이에 제한되지 않는 헥소오스 당; 및 알파-아노머를 포함하는 당 개질 부분을 갖는 누클레오시드가 추가로 포함된다. 개질된 당이 3'-데옥시리보누클레오시드 또는 3'-O-치환된 리보누클레오시드인 구체예에서, 면역자극성 부분은 2'-5' 누클레오시드간 결합에 의해 인접 누클레오시드에 결합된다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서의 바람직한 면역자극성 부분에는, 펩티드 핵산(PNA), 인산염 기를 갖는 펩티드 핵산(PHONA), 록티드(locked) 핵산(LNA), 모노폴리노 주쇄 올리고누클레오티드, 및 알킬 링커 또는 아미노 링커를 포함하나 이들에 제한되지 않는, 길이가 약 2 옹스트롱 내지 약 200 옹스트롱인 주쇄 링커 부분을 갖는 올리고누클레오티드를 포함하는 기타 탄수화물 주쇄 개질 부분 및 치환 부분을 갖는 올리고누클레오티드가 추가로 포함된다. 상기 알킬 링커는 분지되거나 분지되지 않을 수 있으며, 치환되거나 치환되지 않을 수 있으며, 키랄적으로 순수하거나 라세미 혼합물일 수 있다. 가장 바람직하게는, 그러한 알킬 링커는 약 2 내지 약 18개의 탄소수를 갖는다. 일부 바람직한 구체예에서, 그러한 알킬 링커는 약 3 내지 약 9개의 탄소수를 갖는다. 일부 알킬 링커는 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오에테르로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 포함한다. 일부의 그러한 작용화된 알킬 링커는, 식 -O-(CH2-CH2-O-) n (n = 1 내지 9)으로 표시되는 폴리(에틸렌 글리콜) 링커이다. 일부 기타 작용화된 알킬 링커는 펩티드 또는 아미노산이다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서의 바람직한 면역자극성 부분에는, β-L-데옥시리보누클레오시드 및 α-데옥시리보누클레오시드를 포함하나 이들에 제한되지 않는 DNA 이소폼(isoform)이 추가로 포함된다. 바람직한 면역자극성 부분에는 3' 개질 부분이 혼입되어 있으며, 2'-5', 2'-2', 3'-3' 및 5'-5' 결합을 포함하나 이들에 제한되지 않는 비천연 누클레오시드간 결합 위치를 갖는 누클레오시드가 추가로 포함된다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극성 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서의 바람직한 면역자극성 부분에는, 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 4-티오우라실, 6-티오구아닌, 7-데아자구아닌, 이노신, 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘, 및 2,6-디아미노푸린을 포함하나 이에 제한되지 않는 디아미노푸린을 포함하나 이들에 제한되지 않는 개질된 헤테로시클릭 염기를 갖는 누클레오시드가 추가로 포함된다.
구체적인 예로서 예시하나 이들에 제한되지 않는, 예를 들어 상기 구조식 ( III )의 면역자극성 도메인에서, 위치 N1 또는 Nn에서의 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합은 면역자극성 부분, 길이가 약 2 옹스트롱 내지 약 200 옹스트롱인 링커이며, 위치 X1에서의 C2-C18 알킬 링커는 면역자극성 부분이며, 위치 X1에서의 β-L-데옥시리보누클레오시드는 면역자극성 부분이다. 면역자극성 부분의 대표 위치 및 구조에 대해서는 하기 표 1을 참조하길 바란다. 상술된 위치에서 면역자극성 부분으로서의 링커에 대한 참조 설명은 그러한 위치에 있는 누클레오시드 잔기가 이의 3'-히드록실에서 지시된 링커로 치환되어, 이 누클레오시드 잔기와 3' 측면 상의 인접한 누클레오시드 사이에서 개질된 누클레오시드간 결합을 형성함을 의미하는 것으로 이해된다. 유사하게, 상술된 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 개질된 누클레오시드간 결합에 대한 참조 설명은, 그 위치에 있는 누클레오시드 잔기가 인용된 결합에 의해 3' 측면 상의 인접한 누클레오시드에 결합됨을 의미한다.
표 1
위치 전형적인 면역자극성 부분
N1 천연 누클레오시드, 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, β-L-데옥시리보누클레오시드 C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 결합, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 (아미노 링커), 2'-5' 누클레오시드간 결합, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합
Nn 천연 누클레오시드, 비염기성 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, 2'-O-치환된 리보누클레오시드, 2'-5' 누클레오시드간 결합, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합, 단 N1 및 Nn은 동시에 비염기성 결합일 수 없다.
하기 표 2에는 상류 상승작용(upstream potentiation)을 갖는 도메인을 지닌 면역자극성 올리고누클레오티드 내의 면역자극성 부분의 대표 위치 및 구조가 표시되어 있다. 본원에 사용된, 용어 "스페이서 9"는 식 -O-(CH2CH2-O) n - (여기서, n은 3이다)으로 표시되는 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 지칭한다. 상기 용어 "스페이서 18"은 식 -O-(CH2CH2-O) n - (여기서, n은 6이다)로 표시되는 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 지칭한다. 본원에 사용된, 용어 "C2-C18" 알킬 링커는 식 -O-(CH2) q -O- (여기서, q는 2 내지 18의 정수이다)로 표시되는 링커를 지칭한다. 따라서, "C3-링커" 및 "C3-알킬 링커"는 식 -O-(CH2)3-O-으로 표시되는 링커를 지칭한다. 스페이서 9, 스페이서 18 및 C2-C18 알킬 링커 각각에 대해서, 이들 각각의 링커는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 결합에 의해 인접한 누클레오시드에 연결된다.
표 2
위치 전형적인 면역자극성 부분
5' N2 천연 누클레오시드, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
5' N1 천연 누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜), 비염기성 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
3' N1 천연 누클레오시드, 1',2'-디데옥시리보오스, 2'-O-메틸-리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18
3' N2 천연 누클레오시드, 1',2'-디데옥시리보오스, 3'-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합
3' N3 천연 누클레오시드, 1',2'-디데옥시리보오스, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합, 2',5' 누클레오시드간 결합, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보오스, β-L-데옥시리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N3 + 3'N4 2'-O-메톡시에틸-리보누클레오시드, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N5 + 3'N6 1',2'-디데옥시리보오스, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC
5'N1 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보오스, d(G)n, 폴리I-폴리dC
하기 표 3에는 하류 상승 작용을 갖는 도메인을 지닌 면역자극성 올리고누클레오티드 내의 면역자극성 부분의 대표 위치 및 구조가 표시되어 있다.
표 3
위치 통상적인 면역자극 부분
5'N2 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합
5'N1 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합
3'N1 1',2'-디데옥시리보오스, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합, 2'-O-메틸
3'N2 1',2'-디데옥시리보오스, β-L-데옥시리보누클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합, 2'-O-메틸
3'N3 3'-데옥시리보누클레오시드, 3'-O-치환된 리보누클레오시드, 2'-O-프로파질-리보누클레오시드
3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보오스, β-L-데옥시리보누클레오시드
본 발명에 따른 방법에 사용된 이뮤노머는 직접적으로 또는 비-누클레오티드 링커를 통해 결합된 둘 이상의 올리고누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "비-누클레오티드 링커"는 공유 또는 비공유 결합에 의해 올리고누클레오티드에 결합될 수 있는 임의의 부분이다. 상기 링커는 약 2 옹스트롬 내지 약 200 옹스트롬의 길이인 것이 바람직하다. 바람직한 링커의 수 개의 예가 하기에 기술된다. 비공유 결합은 정전 상호작용, 소수성 상호작용, π-스태킹(stacking) 상호작용 및 수소 결합을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. "비-누클레오티드 링커"란 용어는 상기 기술된 대로, 예컨대 두 개의 누클레오시드의 3'-히드록실기를 직접 연결시키는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 작용기와 같은 누클레오시드간 결합을 언급하지 않도록 의도된다. 본 발명의 목적을 위해, 상기 직접 3'-3' 결합이 "누클레오시드 결합"으로 고려된다.
몇몇 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 금 입자를 비제한적으로 포함하는 금속이다. 몇몇 다른 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 가용성 또는 불용성의 생분해가능한 중합체 비드이다.
또한 다른 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 올리고누클레오티드에 대한 부착을 허용하는 작용기를 지니는 유기 부분이다. 상기 부착은 바람직하게 임의의 안정한 공유 결합에 의해 이루어진다.
몇몇 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 폴리펩티드, 항체, 지질, 항원, 알레르겐 및 올리고당류를 비제한적으로 포함하는 바이오분자이다. 몇몇 다른 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 소분자이다. 본 발명의 목적을 위해, 소분자는 분자량이 1,000 Da 미만인 유기 부분이다. 몇몇 구체예에서, 소분자의 분자량은 750 Da 미만이다.
몇몇 구체예에서, 소분자는 지방족 또는 방향족 탄화수소이고, 이들 각각은 올리고누클레오티드를 연결시키거나 이에 부가된 선형 사슬 중에 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오우레아로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 소분자는 시클릭 또는 아시클릭일 수 있다. 소분자 링커의 예로는 아미노산, 탄수화물, 시클로덱스트린, 아다만탄, 콜레스테롤, 합텐 및 항생물질이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 그러나, 비-누클레오티드 링커를 기술할 목적으로, "소분자"란 용어는 누클레오시드를 포함하지 않도록 의도된다.
몇몇 구체예에서, 소분자 링커는 화학식 HO-(CH2) o -CH(OH)-(CH2) p -OH (여기에서 o 및 p는 독립적으로 1 내지 약 6의 정수, 1 내지 약 4의 정수, 또는 1 내지 약 3의 정수이다)의 글리세롤 또는 글리세롤 호몰로그이다. 몇몇 다른 구체예에서, 소분자 링커는 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체이다. 상기 유도체의 몇몇은 화학식 HO-(CH2) m -C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2) m -OH (여기에서 m은 0 내지 약 10의 정수, 0 내지 약 6의 정수, 2 내지 약 6의 정수, 또는 2 내지 약 4의 정수이다)를 지닌다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 이뮤노머에서 몇몇 비-누클레오티드 링커는 도 1에 개략적으로 도시된 대로, 둘 이상의 올리고누클레오티드를 부착시킨다. 예를 들어, 소분자 링커 글리세롤은 올리고누클레티드가 공유적으로 부착될 수 있는 세 개의 히드록실기를 지닌다. 따라서, 본 발명에 따른 몇몇 이뮤노머는 이들의 3' 말단에서 비-누클레오티드 링커에 결합되는 둘 이상의 올리고누클레오티드를 포함한다. 상기 이뮤노머의 몇몇은 각각이 접근하기 쉬운 5' 말단을 지니는 둘 이상의 면역자극 올리고누클레오티드를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 자동 합성장치 및 도 5 및 6에 개략적으로 도시되고 추가로 실시예에 기술된 포스포르아미다이트 접근법을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 선형 합성 접근법 (참조 도 5)에 의해 합성된다. 본원에서 사용된 "선형 합성"이란 용어는 이뮤노머의 한 말단에서 시작하여 다른 쪽 말단으로 선형으로 진행되는 합성을 언급한다. 선형 합성은 동일하거나 동일하지 않은 (혼입되는 길이, 염기 조성 및/또는 화학적 개질에 대하여) 단량체 유닛이 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머로 혼입될 수 있게 한다.
이뮤노머의 대안적인 합성 양식은 "병렬적 합성"이고, 여기에서 합성은 중심 링커 부분으로부터 외부를 향해 진행된다 (참조 도 6). 링커에 부착된 고체 지지체가 미국특허 제 5,912,332호에 개시된 대로 병렬적 합성에 사용될 수 있다. 대안적으로, 조절된 포어 글래스 지지체에 부착된 포스페이트와 같은 광범한 고체 지지체가 사용될 수 있다.
이뮤노머의 병렬적 합성은 선형 합성에 비해 여러 가지 이점을 지닌다: (1) 병렬적 합성은 동일한 단량체 유닛을 혼입시킬 수 있다; (2) 선형 합성과 달리, 둘 모두의 (또는 모든) 단량체 유닛이 동시에 합성되므로 합성 단계의 수 및 합성에 요구되는 시간이 단량체 유닛과 동일하다; 및 (3) 합성 단계의 감소가 최종 이뮤노머 생성물의 순도 및 수율을 증가시킨다.
선형 합성 또는 병렬적 합성 프로토콜에 의한 합성의 종료시에, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머가 농축된 암모니아 용액 또는 개질된 누클레오시드가 혼입된 경우, 추천된 대로 포스포르아미다이트 서플라이어를 이용하여 편리하게 탈보호될 수 있다. 생성된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 바람직하게 역상 HPLC에 의해 정제하고, 탈트리틸화시키고, 탈염시키고, 투석시킨다.
표 4는 본 발명에 따른 방법에 사용된 대표적인 이뮤노머를 나타낸다. 추가의 이뮤노머가 실시예에 개시되어 있다.
표 4. 이뮤노머 서열의 예
Figure 112005066002272-PCT00004
Figure 112005066002272-PCT00005
Figure 112005066002272-PCT00006
L = C3-알킬 링커; X = 1',2'-디데옥시리보시드; Y = 5OHdC; R = 7-데아자-dG
두 번째 측면에서, 본 발명은 화학요법제를 상기 기술된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 컨쥬게이트 및 접근하기 쉬운 5' 말단 이외의 위치에서 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에 컨쥬게이션된 항원과 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 암 환자의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 비-누클레오티드 링커는 암과 관련된 항원을 포함하고, 이것은 올리고누클레오티드에 컨쥬게이션된다. 몇몇 다른 구체예에서, 항원은 이의 3' 말단 이외의 위치에서 올리고누클레오티드에 컨쥬게이션된다. 몇몇 구체예에서, 항원은 백신 효과를 제공한다. 본 발명의 목적을 위해 "관련된(associated with)"이란 용어는 암이 존재할 때 항원이 존재하나, 암이 부재할 때 항원이 부재하거나 감소된 양으로 존재하는 것을 의미한다.
면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 항원에 공유적으로 결합되거나, 다르게는 항원에 작동적으로 관련된다. 본원에서 사용된 "작동적으로 관련된"이란 용어는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 및 항원 둘 모두의 활성을 유지시키는 임의의 관련체를 의미한다. 상기 작동적인 관련체의 비제한적인 예로는 동일한 리포솜의 일부 또는 그러한 다른 전달 비히클 또는 시약이 있다. 추가로, 항원을 엔코딩하는 핵산 분자가 발현 벡터로 클로닝되어 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "벡터"란 용어는 이에 결합되어 있는 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 바람직한 벡터는 자율적 복제가 가능하여 이에 결합된 핵산을 발현시킬 수 있는 것들이다 (예컨대, 에피솜). 벡터에 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 본원에서 "발현 벡터"로서 언급한다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 발현 벡터는, 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않은 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 루프로 언급되는 "플라스미드"의 형태로 종종 이용된다. 본 명세서에서, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이므로 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 그러나 본 발명은 동등한 작용을 나타내고 당 분야에서 본원에 후속하여 공지된 발현 벡터의 다른 형태를 포함하도록 의도된다.
면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머가 항원에 공유적으로 결합되는 구체예에서, 상기 공유 결합은 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머상에서 면역자극 올리고누클레오티드의 접근하기 쉬운 5' 말단 이외의 임의의 위치에 존재하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항원은 누클레오시드간 결합에 부착될 수 있거나 비-누클레오티드 링커에 부착될 수 있다. 대안적으로, 항원 자체가 비-누클레오티드 링커일 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 면역자극 올리고누클레오티드 컨쥬게이트 및/또는 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트, 화학요법제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 "생리학적으로 허용되는"이란 용어는 이뮤노머의 유효성을 방해하지 않고 세포, 세포 배양액, 조직 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 적합한 물질을 언급한다. 바람직하게는, 생물학적 시스템이 척추동물과 같은 살아있는 유기체이다. 바람직한 화학요법제로는 겜시타빈 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 당류 비함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카르바진, 탁솔, 프라질린, 메글라민 GLA, 발루비신, 카르무스타인 및 폴리페르포산, MMI270, BAY 12-9566, RAS 파메실 트랜스퍼라아제 억제제, 파메실 트랜스퍼라아제 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔, 글라몰렉, CI-994, TNP-470, 히캄틴/토포테칸, PKC412, 발스포다르/PSC833, 노반트론/미트록산트론, 메타레트/수라민, 바티마스타트, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, 인셀/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트, BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날 DP 2202, FK 317, 이마티니브 메실레이트/글리벡, 이마티니브 메실레이트/글리벡, 피키바닐/OK-432, AD 32/발루비신, 메타스트론/스트론튬 유도체, 테모달/테모졸로미드, 에바세트/리포소말 독소루비신, 유탁산/파슬리탁셀, 탁솔/파슬리탁셀, 젤로드/카페시타빈, 프루툴론/독시플루리딘, 시클로팍스/경구 파슬리탁셀, 경구 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 종양유전자 억제제, BMS-182751/경구 백금, UFT(테가푸르/우라실), 에르가미솔/레바미솔, 에닐우라실/776C85/5FU 증강제, 캄프토/레바미솔, 캄프토사르/아이리노테칸, 투모덱스/랄리트렉세드, 루스타틴/클라드리빈, 팍세스/파슬리탁셀, 독실/리포소말 독소루비신, 캘릭스/리포소말 독소루비신, 플루다라/플루다라빈, 파마루비신/에피루비신, 데포시트, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈이미드, LU 103793/돌라스타틴, 캐틱스/리포소말 독소루비신, 겜자르/겜시타빈, ZD 0473/아노르메드, YM 116, 로딘 시드, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/데시포사미드, 이페스/메스넥스/이포사미드, 부몬/테니포시드, 파라플라틴/카르보플라틴, 플란티놀/시스플라틴, 베페시드/에토포시드, ZD 9331, 탁소테레/도세탁셀, 구아닌 아라비노사이드의 전구약물, 탁산 유사체, 니트로소우레아, 멜펠란 및 시클로포스파미드와 같은 알킬화제, 아미노글루테티미드, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 클로롬부실, 시타라빈 HCl, 닥티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에소포시드 (VP16-213), 플록우리딘, 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드, 히드록시우레아 (히드록시카르바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 루프롤리드 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체 ), 로무스틴 (CCNU), 메클로르에타민 HCl (질소 머스타드), 메르캅토푸린, 메스나, 미토탄 (o.p'-DDD), 미토크산트론 HCl, 옥트레오티드, 플라카마이신, 프로카르바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 술페이트, 암사크린 (m-AMSA), 아자시티딘, 에르트로포이에틴, 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터루킨 2, 미토구아존 (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴 (2'데옥시코포르마이신), 세무스틴 (메틸-CCNU), 테니포시드 (VM-26) 및 빈데신 술페이트가 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 제형은 EFG, 항-유전형 암 백신, Gp75 항원, GMK 흑색종 백신, MGV 강글리오시드 컨쥬게이트 백신, Her2/new, 오바렉스, M-박스, O-박스, L-박스, STn-KHL 테라토프, BLP25 (MUC-1), 리포소말 유전형 백신, 멜라카인, 펩티드 항원 백신, 톡신/항원 백신, MVA-베이스드 백신, PACIS, BCG 백신, TA-HPV, TA-CIN, DISC-바이러스 및 ImmunCyst/TheraCys로 구성된 군으로부터 선택된 암 백신을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 본원에 기술된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하여 암 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 항체, 특히 모노클로날 항체 형태의 수동적 면역치료는 항암제로서 상당한 연구 및 개발의 대상이 되어 왔다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는 단일 분자로 된 조성물의 항체 분자를 언급한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일한 결합 특이성 및 친화력을 나타낸다. 따라서, "사람 모노클로날 항체"란 용어는 사람 배선(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 지니며 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 언급한다. 항암제의 예로는 파노렉스 (글락소-웰컴), 리투산 (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), 밀로타르그 (Wyeth), 캄파트 (Millennium), 제발린 (IDEC and Schering AG), 벡사르 (Corixa/GSK), 에르비투스 (Imclone/BMS), 아바스틴 (Genentech) 및 헤르셉틴 (Genentech/Hoffman la Roche)이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 항체는 또한 암 항원을 모방하는 것처럼 보이는 (면역학적 의미에서) 항-유전형 항체를 이용하는 능동적 면역치료에 적용될 수 있다. 모노클로날 항체는 재조합 DNA 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 "담체"란 용어는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충액, 안정화제, 가용화제, 지질, 또는 약제 제형에 사용되는 당 분야에 널리 공지된 다른 재료를 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특성이 특정 응용에 대하여 투여 경로에 의존할 것을 이해할 것이다. 상기 재료를 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형의 제조가, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990]에 개시되어 있다.
본 발명은 화학요법제 및 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 포함하는 키트를 제공하며, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 함께 결합된 둘 이상의 올리고누클레오티드를 포함하여 이뮤노머가 하나 이상의 접근하기 쉬운 5' 말단을 지니도록 하며, 올리고누클레오티드 중의 하나 이상이 면역자극 올리고누클레오티드이다. 또 다른 측면에서, 키트는 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 면역자극 올리고누클레오티드 컨쥬게이트 및/또는 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트, 화학요법제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또한 키트는 일반적으로 사용을 위한 일련의 지침서를 포함할 것이다.
이뮤노머를 합성 자극 모티프, 예를 들어 CpR (R= 2'-데옥시-7-데아자구아노신)과 조합하면 합성 자극 모티프가 없는 것에 비해서 상이한 시토킨 발현 특성이 감소되었다. 그 결과, IMO 화합물은 전체 박테리아 생성물에 의해 종종 발견되는 역반응을 감소시킬 뿐만 아니라, 암의 유형에 따른 특이적 면역반응을 더 유발시킨다.
IMO 화합물의 반복된 종양주위 적용은 확립된 동계 종양 CT26.CL25 및 B16.F0의 강한 억제 또는 제거를 유도하였다. IMO 모티프의 복막투여는 또한 복막강에서의 미만성(disseminated) B16.F0, CT26.WT 또는 CT26.CL25 종양 성장을 억제시켰다. IMO 화합물의 몇몇의 면역학적 성질은 이러한 치료 효과가 있다. 특정의 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, IMO 모티프는 가능하게는 대식세포, 수지상 세포 및 NK 세포의 동원 및 활성화 및 시토킨 분비의 유도를 포함한 종양 모듈 주위에서의 신속한 급성 상 반응을 유도한다. 면역 세포의 활성화와 일관되게, 혈청 IL-12 및 순환 NK 및 대식 세포는 IMO 투여후 4 시간 이내에 현저하게 증가하며 24 시간 동안 지속된다(도면에는 도시되지 않음). 이러한 상승된 세포 면역 반응은 종양 세포에 대한 적대적 환경을 생성시킬 수 있다. 또한, 그러한 환경에서의 종양 세포의 파괴는 근처의 수지상 세포(DC) 및 대식세포에 종양 항원을 제공한다. IMO 화합물은 MHC 및 공동자극 분자의 표면 발현을 증가시키는 대식세포의 기능적 돌연변이 및 DC에 의한 항원 제시를 직접적으로 및 신속하게 촉진하는 것으로 보인다. 활성화된 항원 제시세포는 종양 마우스에서 강한 적응성 T 림프구-매개된 특이적 면역 반응을 유도한다.
고유의 면역성 외에, CT26 콜론 종양을 앓고 있는 마우스의 치료는 강한 적응성 면역 반응의 발생을 유도하였다. 첫째로, 모델 항원으로서 β-gal을 발현하는 종양 함유 마우스의 IMO 치료는 강한 MHC 클래스 I 제한된 특이적 T 세포 반응을 유발시켰다. 두 번째로, IMO 화합물로 처리된 종양 함유 마우스는 동일한 종양 세포에 의한 후속된 도전에 대해서 특이적으로 보호되어, 메모리 T 림프구의 관련성을 제시하였다. 세 번째로, IMO 화합물로 처리된 종양 함유 마우스로부터 얻은 비장 세포로 세포 이입된 네이티브 마우스는 특이적 항종양 면역성을 나타냈으며 동일한 종양 도전을 거부했다.
Th2-타입 시토킨은 항종양 면역성을 하향조절하며, Th1 세포 반응의 활성화는 항종양 면역성을 증진시킬 수 있다. 따라서, Th1-타입 시토킨 생성으로의 이동은 암의 면역치료 뿐만 아니라 바이러스 감염의 치료를 위한 가능한 방법일 수 있다. Th-2 시토킨, IL-4의 높은 수준이 PBS 또는 비-CpG DNA 대조 처리된 CT26.CL25 종양 함유 마우스로부터 얻은 비장 세포의 배양물에서 발견된다. 반면, 동일한 종양을 앓고 있는 IMO 처리된 마우스로부터의 비장세포가 보다 높은 IFN-γ를 생성시켜서, IMO 화합물은 종양 함유 마우스에서의 Th1 반응에 대한 Th2-타입 시토킨 생성을 역전시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, IMO 치료는 β-gal 특이적 IgG2a를 순환시키는 수준을 5 배(OD 단위) 증가시켜서, IgG2a/IgG1 비율을 현저하게 증가시킨다. 또한, IL-12 ko 마우스는 IMO 처리에 반응하지 않아서 IMO 항종양 활성에서의 이러한 Th-1 시토킨에 대한 역할을 제시하고 있다. 종합하면, 이러한 결과는 IMO 화합물이 종양 함유 마우스에서의 Th1 면역 반응을 강하게 활성화시킴을 명백하게 나타내고 있다.
화학치료 또는 수술 후의 후속된 치료에 대한 주된 한계는 독성 및 약물 내성이다. 수술 및 화학치료와 조합되는 경우의 면역치료는 잔류 종양 세포를 제거하고 약물 용량을 감소시키는데 유리할 수 있다. 이러한 경우는 선천성 면역체계 및 적응성 면역체계를 활성화시킴에 따른 IMO-기재 면역치료에 대해 특히 그러하다. IMO 치료는 화학요법제의 면역 억제 효과를 극복할 수 있으며, 이는 도세탁셀만으로 치료된 종양 함유 마우스에 비교한 IMO 2-도세탁셀 조합 치료된 종양 함유 마우스에서의 CD69+ 및 CD86+ 세포의 현저한 증가에 의해서 입증되고 있다. 각각 B16.F0 흑색종 또는 4T1 유방 암종 함유 마우스에서의 도세탁셀 또는 독소루비신을 사용한 통상의 화학치료 효과는 IMO 화합물과 조합되는 경우에 현저하게 증진되었다.
종합하면, 현재의 결과는 IMO 화합물이 생체내에서 강한 면역약리학적 및 항종양 효과를 유도함을 제시한다. 녹아웃 마우스에서의 종양 실험은 Th1 시토킨, IL-12가 IMO 유도된 항종양 효과에 대해서 요구됨을 제시하고 있다. 또한, IMO 화합물에 의한 치료는 종양 퇴행을 유도할 뿐만 아니라, 강한 종양 특이적 적응성 면역 반응의 발생을 유도한다. 또한, 사람 특이적 IMO 화합물은 동계(syngeneic) 종양 모델에서 효능적인 항종양 활성을 나타낸다. 상승 효과가 화학요법제와 IMO 치료의 조합에 의해서 나타났다. 또한, IMO 화합물은 화학치료 후의 면역 세포 활성화를 나타내어, 화학치료에 의해서 유도된 면역 억제를 극복하기 위한 수단으로 조합 치료를 제시하고 있다. IMO 치료-관련된 독성이 연구된 용량에서의 모든 종양 모델중의 마우스에서 관찰되지 않았다.
실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 양태를 추가로 예시하고자 하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 면역조절 잔기를 함유하는 올리고누클레오티드의 합성
올리고누클레오티드를 도 5 및 도 6에 개괄된 선형 또는 병렬적 합성 공정에 따라서 자동화된 DNA 합성기(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여 1μmol 규모로 합성하였다.
데옥시리보누클레오시드 포스포르아미다이트를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (Foster City, CA)로부터 얻었다. 1',2'-디데옥시리보오스 포스포르아미다이트, 프로필-1-포스포르아미다이트, 2-데옥시우리딘 포스포르아미다이트, 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸)펜틸아미딜]-2-프로판올 포스포르아미다이트 및 메틸 포스판아미다이트를 글렌 리서치(Glen Research) (Sterling, VA)로부터 얻었다. β-L-2'-데옥시리보누클레오시드 포스포르아미다이트, α-2'-데옥시리보누클레오시드 포스포르아미다이트, 모노-DMT-글리세롤 포스포르아미다이트 및 디-DMT-글리세롤 포스포르아미다이트를 켐진스(ChemGenes) (Ashland, MA)로부터 얻었다. (4-아미노부틸)-1,3-프로판디올 포스포르아미다이트 클론테크(Clontech) (Palo Alto, CA)로부터 얻었다. 아라비노시티딘 포스포르아미다이트, 아라비노구아노신, 아라비노티미딘 및 아라비노우리딘을 릴라이어블 파마슈티칼(Reliable Pharmaceutical) (St. Louis, MO)로부터 얻었다. 아라비노구아노신 포스포르아미다이트, 아라비노티미딘 포스포르아미다이트 및 아라비노우리딘 포스포르아미다이트를 하이브리돈, 인코포레이티드(Hybridon, Inc.) (Cambridge, MA) (Noronha et al. (2000) Biochem., 39:7050-7062)으로부터 얻었다.
모든 누클레오시드 포스포르아미다이트를 31P 및 1H NMR 스펙트럼으로 특성화시켰다. 변형된 누클레오시드를 정상의 커플링 사이클을 이용하여 특이적 부위에서 혼입시켰다. 합성 후에, 올리고누클레오티드를 진한 수산화암모늄을 사용하여 탈보호시키고, 역상 HPLC로 정제한 다음, 투석시켰다. 나트륨염 형태의 정제된 올리고누클레오티드를 사용전에 동결건조시켰다. 순도를 CGE 및 MALDI-TOF MS로 시험하였다.
실시예 2: 비장 세포 증식의 분석
비장세포 증식의 시험관내 분석을 상기된 바와 같은 표준 방법으로 수행하였다(see, e.g., Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182 (1996)). 결과를 도 8A에 도시한다. 이러한 결과는, 보다 높은 농도에서, 두개의 접근가능 5' 단부를 지니는 이뮤노머 6은 접근가능 5' 단부 또는 올리고누클레오티드 4를 지니지 않으며 단일의 접근가능 5' 단부를 지니는 이뮤노머 5에 비해서 더 많은 비장세포 증식을 유도한다. 이뮤노머 6은 또한 LPS 양성 대조군에 비해서 더 많은 비장세포 증식을 유발시킨다.
실시예 3: 생체내 비장비대 검정
생체내 모델에 대한 시험관내 결과의 적용성을 시험하기 위해서, 선택된 올리고누클레오티드를 마우스에 투여하고 비장비대의 정도를 면역자극 활성 수준의 지표로서 측정하였다. 5 mg/kg의 단일 용량을 BALB/c 마우스(자성, 주령 4-6, (Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT))에게 복막내 투여하였다. 마우스를 올리고누클레오티드 투여 72 시간 후에 치사시키고, 비장을 수거하고, 중량을 측정하였다. 결과를 도 8B에 나타낸다. 이러한 결과는 두 개의 접근가능 5' 단부를 지니는 이뮤노머 6이 올리고누클레오티드 4 또는 이뮤노머 5에 비해서 아주 더 큰 면역자극 효과를 지님을 입증하고 있다.
실시예 4: 시토킨 분석
척추동물 세포, 바람직하게는 BALB/c 마우스 비장 세포 또는 사람 PBMC에서의 IL-12 및 IL-6의 분비를 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 시토킨 항체와 시토킨 표준을 포함하는 요구된 시약을 파밍진(PharMingen)(San Diego, CA)으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트(Costar)를 PBSN 완충액 (PBS/0.05% 아지드화나트륨, pH 9.6)중의 5 μg/mL의 적절한 항체와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하고, 37℃에서 30분 동안 PBS/1% BSA로 블로킹시켰다. 세포 배양 상등물과 시토킨 표준은 PBS/10% FBS로 적절히 희석시키고, 플레이트에 삼중으로 가하고, 25℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1 μg/mL의 적절한 비오티닐화된 항체로 덮고 25℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 이어서 PBS-T 완충액 (PBS/0.05% 트윈(Tween) 20)으로 광범하게 세척하고, 스트렙타비딘 컨주게이트된 퍼옥시다제(Sigma, St. Louis, MO)를 가한 후에 25℃에서 1.5 시간 동안 더 인큐베이션하였다. 플레이트를 슈어 블루(Sure Blue)(Kirkegaard and Perry) 발색시약으로 전개시키고, 반응을 정지 용액(Kirkegaard and Perry)을 가함으로써 종결시켰다. 색 변화를 세레스 900 HDI 분광계(Ceres 900 HDI Spectrophotometer) (Bio-Tek Instruments)로 측정하였다. 결과를 하기 도 5A에 나타낸다.
사람 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 건강한 지원자의 말초혈액으로부터 피콜-파큐 밀도구배 원심분리(Ficoll-Paque density gradient centrifugation) (Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)에 의해서 분리하였다. 요약하면, 헤파린화된 혈액을 코니칼 센트리퓨즈(conical centrifuge)중의 히스토파큐-1077(Histopaque-1077) (동일한 용적)상에 적층하고, 400 x g로 30분 동안 실온에서 원심분리하였다. 단핵세포를 함유하는 담황갈색의 피복물을 조심스럽게 제거하고, 등장성 인산염 완충된 염수(PBS)로 250 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해서 2회 세척하였다. 생성된 세포 펠릿을 이어서 L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 매질(MediaTech, Inc., Herndon, VA)에 재현탁시키고, 10% 열 불활성화된 FCS 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/ml)을 보충시켰다. 세포를 올리고누클레오티드의 존재 또는 부재하에서 1 X 106 세포/ml/웰로 상이한 시간 동안 24웰 플레이트에서 배양하였다. 인큐베이션 기간의 종료시점에, 상등물을 수거하고 IL-6 (BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10 (BD Pharmingen), IL-12 (BioSource International, Camarillo, CA), IFN-α (BioSource International) and -γ (BD Pharmingen) 및 TNF-α (BD Pharmingen)를 포함한 다양한 시토킨에 대해서 샌드위치 ELISA로 검정할 때까지 -70℃에서 동결저장하였다. 결과를 이하 표 5에 나타낸다.
모든 예에서, 세포 배양 상등물 중의 IL-12 및 IL-6의 수준을 각각 IL-12 및 IL-6에 대한 동일한 실험 조건하에 구성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. 세포 배양 상등물 중의 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α의 수준을 각각 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α에 대한 동일한 실험 조건 하에 구성된 표준 곡선으로부터 계산하였다.
표 5. 사람 PBMC 배양물 중의 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00007
Figure 112005066002272-PCT00008
D1 및 D2는 공여자 1 및 2이다.
표 5A. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중의 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00009
정상의 글씨체는 포스포르티오에이트 연결을 나타내며; 이탤릭체는 포스포디에스테르 연결을 나타낸다.
Figure 112005066002272-PCT00010
또한, 도 7A-C에 나타낸 결과는 두 개의 접근가능 5' 단부를 지니는 이뮤노머 2는 IL-12 및 IL-6을 상승시키지만, 하나의 접근가능 5' 단부를 지니거나 이러한 단부가 없는 올리고누클레오티드 1 또는 3보다 IL-10의 농도가 더 낮다.
실시예 5: 비-천연 피리미딘 또는 비-천연 퓨린 누클레오시드를 함유하는 이뮤노머의 면역자극 활성
표 9 내지 표 11에 도시된 바와 같이, 면역자극 활성이 면역자극 디누믈레오티드 모티프중에 비-천연 피리미딘 누클레오시드 또는 비-천연 퓨린 누클레오시드를 지니는 다양한 길이의 이뮤노머의 경우에 유지되었다.
표 9. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00011
표 10. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00012
표 11. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00013
Figure 112005066002272-PCT00014
실시예 6: 면역자극 활성에 대한 링커의 효과
동일한 두개의 올리고누클레오티드를 연결하는 링커의 길이의 효과를 검사하기 위해 동일한 올리고누클레오티드를 함유하나 상이한 링커를 함유하는 이뮤노머를 함성하고, 면역자극 활성에 대해 테스트하였다. 표 12에 나타낸 결과는 링커 길이가 이뮤노머의 면역자극 활성의 역할을 하는 것을 암시한다. 최상의 면역자극 효과는 C3 내지 C6-알킬 링커 또는 인터스퍼링(interspering)된 포스페이트 전하를 지니는 어베이직(abasic) 링커를 사용하여 달성되었다.
표 12. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00015
Figure 112005066002272-PCT00016
실시예 7: 면역자극 활성에 대한 올리고누클레오티드 백본의 효과
일반적으로, 천연 포스포디에스테르 백본을 함유하는 면역자극 올리고누클레오티드는 포스포로티오에이트 백본을 지닌 동일한 길이의 올리고누클레오티드보다 면역자극성이 덜하다. 이러한 낮은 정도의 면역자극 활성은 실험 조건하에서의 포스포디에스테르 올리고누클레오티드의 신속한 분해에 부분적으로 기인될 수 있다. 올리고누클레오티드의 분해는 주로 3' 말단으로부터 올리고누클레오티드를 분해하는 3'-엑소누클레아제의 결과이다. 본 실시예의 이뮤노머는 자유 3' 말단을 함유하지 않는다. 따라서, 포스포디에스테르 백본을 지니는 이뮤노머는 상응하는 단량체의 올리고누클레오티드보다 실험 조건하에서의 반감기가 더 길어야 하고, 이에따라 개선된 면역자극 활성을 나타내야 한다. 표 13에 나타낸 결과는 이뮤노머 84 및 85가 BALB/c 마우스 비장 세포 배양에서의 사이토카인 유도에 의해 결정된 바와 같은 면역자극 활성을 나타냄으로써 이러한 효과를 입증한다.
표 13. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112005066002272-PCT00017
L = C3-링커
실시예 8: 이뮤노머와 화학요법제 병용에 있어서의 시험관내 항암 활성
PC3 세포를 인간 프로스테이트 암 모델(PC3)을 확립시키기 위해 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신의 존재하에서 햄스(Ham's) 배지, 10 % 우태아 혈청(FBS)을 지닌 F12K 배지에서 배양하였다. 4 내지 6주된 수컷의 흉선 없는 마우스(Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD)를 연구에 앞서 환경 적응을 위해 6일 동안 사육시켰다. 배양된 PC3 세포를 단층세포 배양으로부터 수거하고, 햄스 배지, F12K 배지(10% FBS)로 두번 세척하고, FBS가 제거된 햄스 배지:매트리겔 기저막 기질(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)(5:1 ; V/V)에 재현탁시키고, 각각의 마우스의 좌측 서혜부에 피하 주사하였다. 상기 동물들을 일반 임상 관찰, 체중, 및 종양 성장에 대해 모니터링했다. 종성 성장을 캘리퍼스를 사용하여 이식물의 두개의 수직판 직경의 측정에 의해 모니터링했다. 종양 크기(g의 중량)를 공식, 1/2a X b2를 사용하여 계산하였고, 여기서 'a'는 긴 직경(㎝)이고, 'b'는 짧은 직경(㎝)이다. 평균 종양 크기가 ~80 ㎎에 도달하는 경우, 인간 암종 이종이식물을 지니는 상기 동물을 무작위적으로 치료군 및 대조군(5마리의 동물/군)으로 나누었다. 대조군에게는 멸균된 생리식염수(0.9% NaCl)만을 투여했다. 생리식염수중에 무균으로 용해시킨 이뮤노머 255 또는 285를 주당 3회의 투여로 0.5 또는 1.0 ㎎/㎏/일의 용량으로 피하 주사하였다. 젬시타빈 HCl(Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN)을 0일 및 3일째에 160 ㎎/㎏에서의 복강내 주사로 2회 투여했다. 상세한 치료 스케줄은 하기에 나타냈다.
G1: 염수
G2: 젬시타빈 (160 mg/kg/일, IP, 0일 및 3일)
G3: 255 (1.0 mg/kg/일, SC, 3 회/주, 6주 동안)
G4: 255 (0.5 mg/kg/일, SC, 3 회/주, 6주 동안)
G5: 285 (1.0 mg/kg/일, SC, 3 회/주, 6주 동안)
G6: 285 (0.5 mg/kg/일, SC, 3 회/주, 6주 동안)
G7: 255 (0.5 mg/kg/일, SC, 3 회/주, 6주 동안) +
젬시타빈 (160 mg/kg/일, 0일 및 3일)
G8: 285 (0.5 mg/kg/일, SC, 3 회/주, 6주 동안) +
젬시타빈 (160 mg/kg/일, 0일 및 3일)
다양한 처리 후의 종양 측정을 표 14 및 도 13에 나타냈다. 모든 이뮤노머 255 및 285 처리된 동물에서의 종양 성장은 염수 대조군과 비교하여 현저하게 억제되었다(p<0.5). 이러한 처리군에 있어서 용량-반응 관계의 경향이 있었다(도 13). 이뮤노머 255 및 285 사이의 현저한 차이는 없었다(표 14).
Figure 112005066002272-PCT00018
Figure 112005066002272-PCT00019
다양한 시간에서의 체중 측정을 표 15 및 도 14에 나타내었다. 이뮤노머 255 또는 285 단독은 대조군과 비교하여 체중 증가에서의 현저한 차이가 없었다. 젬시타빈 처리된 동물들은 첫번째 주에 체중 손실이 있었고 그 후의 주에 회복했다. 이뮤노머 255 또는 285와의 병용은 젬시타빈의 부작용 프로파일을 변화시키지 않았다. 모든 군에서 기타 임상적 이상 또는 사망이 관찰되지 않았다.
표 15. 255 또는 염수의 처리 후 종양을 지닌 마우스의 체중
Figure 112005066002272-PCT00020
요약하면, 이뮤노머 255 및 285는 중대한 부작용 없이 인간 프로스테이트 암 PC3 이종이식물을 지니는 누드 마우스에서 종양 성장을 현저하게 억제하였다. 이뮤노머 255 또는 285를 젬시타빈과 병용하여 투여하는 경우, 각각의 화합물은 부작용 프로파일의 변화 없이 젬시타빈의 치료 효과를 증가시켰다. 게다가, 이뮤노머 255 또는 285 치료의 용량 의존 반응의 경향이 있었다.
실시예 9: 이뮤노머와 화학요법제 병용에 있어서의 시험관내 항암 활성
실시예 8의 실험을 젬시타빈 대신 탁소텔(taxotere)을 사용하여 반복하였다. 탁소텔을 0일 및 7일째에 투여하였다. 이뮤노머 165를 주당 5일로 투여하였다. 이뮤노머 255 및 285를 0, 2, 4, 7, 9 및 11일째에 투여하였다. 결과를 하기 표 16에 나타내었다. 이러한 결과는 이뮤노머 및 탁소텔 사이의 상승 작용을 명백하게 입증한다.
Figure 112005066002272-PCT00021
실시예 10
도 15에 나타낸 바와 같은 IMO 화합물 및 비-CpG DNA: (5'-CTATCTCACCTTCTCTGT-3')을 상기에 기재된 바와 같이 합성하고, 정제시키고, 분석하였다.
5 내지 8주된 암컷 BALB/c(H-2d), C57BL/6, 및 IL-6 및 IL-12 녹아웃(ko)(C57BL/6 백그라운드에 대해 둘 모두 ko) 마우스를 잭슨 래보레이토리(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. CT26.WT(ATCC, Rockville, MD)는 종양유발물질 유도된 BALB/c 미분화 결장 암종이다. CT26.CL25(ATCC, Rockville, MD)는 대장균 β-gal 유전자를 이용하여 유도된 CT26.WT의 서브클론이다. 4T1은 BALB/c 마우스의 유방암종 세포주이다. B16.F0은 C57BL/6 유도 흑색종(ATCC)이다. CT26.WT 및 4T1 세포를 RPMI 1640, 10% 가열 비활성화된 우태아 혈청(FBS, Atlas Biologicals, Fort Colins, CO), 2 mM L-글루타민, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린(Mediatech, VA)중에서 배양하였다. B16.F0 세포를 10% FBS 및 항생제를 함유하는 DMEM에서 성장시켰다.
혈청 사이토카인 수준을 평가하기 위해, BALB/c 마우스(n=5)를 10 ㎎/㎏(일회량)의 IMO 화합물을 복막내(i.p), 피하(s.c) 또는 근내(i.m) 주사하였다. 혈청을 IMO 투여의 4시간째에 눈뒤 출혈로 수거하고, 샌드위치 ELISA로 IL-12 및 IL-6을 결정하였다. 사이토카인 항체 및 표준을 파르밍겐사(PharMingen, San Diego, CA)로부터 구입하였다.
혈청 항체의 분석을 위하여, 96 웰 플레이트를 실온에서 3시간 동안 인산염 완충 염수(PBS) 중의 β-gal 단백질 (Calbiochem Novabiochem, Pasadena, CA) 2 ㎍/ml와 함께 인큐베이션하였다. 고체상을 밤새 4℃에서 정상 마우스 혈청(NMS) 또는 항혈청, 또는 β-gal 특이적 모노클로날 Ab (Calbiochem Novabiochem, Pasadena, CA)와 함께 인큐베이션한 후, 마우스 IgG (H+L)에 특이적인 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP)-콘쥬게이트 항체와 인큐베이션하였다. 이소타입 분석을 위해, HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG1 및 IgG2a (Southern Biotechnology, Birmingham, AL)를 사용하였다. 면역 복합체와 ABTS 기질 (Zymed, San Francisco, CA)의 반응 후에, 항체의 결합을 405nm에서 흡광도로서 측정하였다.
피하 고형 종양 모델을 위하여, 100 ㎕의 PBS중의 106 CT26.CL25 세포/마우스 또는 5 x 105 B16.F0 세포/마우스를 BALB/c 또는 C57BL/6 마우스의 우측 하부 옆구리에 이식하였다. 종양 크기는 CT26.CL25의 경우 종양 접종 후 6일째에, 그리고 B16.F0의 경우 종양 접종 후 8일째에 50 내지 200 mg이 되었다. 그 다음, 종양 보유 마우스를 IMO 화합물 또는 비-CpG DNA 대조물질을 격일로 10회 1mg/kg의 용량으로 종양 주변에 주입하여 처리하였다. 캘리퍼스를 사용하여 종양의 장경 및 단경을 측정하여 종양 성장을 기록하였다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 측정하고, 공식 (0.5 x 길이 x 폭2)을 적용하여 종양 성장 동력학을 결정하였다.
복강 파종 종양 모델을 위해서, 3 x 105 CT26.WT 또는 CT26.CL25 세포 및 5 x 104 B16.F0 세포를 BALB/c 또는 C57BL/6 마우스에 각각 복강내 주사하였다. IMO 화합물 또는 비-CpG DNA (2.5 mg/kg)를 1일째부터 시작하여 주당 2회 총 5회 복강내 투여하였다. 종양 성장 및 생존에 대하여 매일 마우스를 검사하였다. 각 용량군은 6 내지 10마리의 마우스로 구성되었다.
4T1 종양 모델을 위해서, 100㎕ PBS중의 5 x 105 세포/마우스를 BALB/c 마우스의 우측 하부 옆구리에 이식하였다. 5일째에, 평균 종양 크기가 50 mm2이 되었을 때, 마우스에 30 mg/kg 독소루비신 (Bedford lab, Bedford, OH)을 5, 6, 및 7일째에 3회 복강내 주사하였다. 100 ㎕ PBS에 용해시킨 IMO 2 (1 mg/kg)를 주당 2회 로 총 6회 종양 주변에 주입하여 투여하였다.
B16.F0 흑색종 종양을 위해서, 0일째에 C57BL/6 마우스에 100㎕ PBS중의 5 x 104 세포/마우스를 복강내 주사하였다. 2일째에 마우스를, 20 mg/kg 도세탁솔 (Aventis, Bridgewater, NJ)을 1회 복강내 주사한 다음, 3, 6, 9, 12 및 15일째에 2.5 mg/kg IMO 2를 복강내 주사하여 처리하였다.
CT26.WT 또는 CT26.CL25 복강 종양이 있고 IMO 화합물로 처리한 마우스 중에서 장기 생존동물(n=5)에 추가 처리 없이 5 x 105 의 모(parental) 종양 세포를 복강내 또는 정맥내로 재감염시켰다. 종양 보유 마우스에서 IMO 유도 항종양 반응의 특이성을 평가하기 위하여, 또한 이러한 장기 생존동물(n=5)에 기관 비관련성의 친연성 유방 종양 4T1 (5 x 105)을 재감염시켰다. 정맥내 재감염군의 경우, 마우스를 13일째에 희생시키고 폐를 수거하여 폐 전이를 계수하였다,
입양 면역 세포 전달을 연구하기 위하여, 나이브 BALB/c 마우스 또는 IMO로 처리한 CT26.WT 또는 CT26.CL25 보유 장기 생존동물로부터 얻은 5 x 106 개의 친연성 비장세포를 BALB/c 마우스에 복강내로 입양 전달하였다. 그 다음, 3일째에 마우스에 3 x 105 CT26.WT, CT26.CL25 또는 4T1 세포를 복강내 교차접종하였다.
T 세포 반응을 결정하기 위하여, 각 군으로부터 2 또는 3마리의 마우스를 피하 종양 이식후 26일째에 또는 복강내 종양 접종후 21일째에 희생시키고, 각 군에서 비장세포로부터 풀링된 T 세포를 T 세포 농축 칼럼 (R&D systems, Minneapolis, MN)으로 정제하였다. 정제된 T 세포 (2.5 x 105)를 2.5 x 105 미토마이신 C (50 ㎍/ml, Sigma, St. Louis, MO) 처리 β-gal 또는 OVA 펩티드 펄스 친연성 비장세포로 24시간 동안 자극하였다. 그 후, H-2d 제한, 항원 특이적 (β-gal876-884) 재자극에 특이적으로 반응하는 T 세포를 제조자(R&D Systems) 지시에 따라 인터페론-감마(IFN-γ) 및 IL-4 ELISPOT 분석에 의해 결정하였다. 반점을 전자적으로 계수하였다(Zellnet, New York, NY).
실시예 11: IMO 화합물의 혈청 시토카인 분비 프로파일.
IMO 1 및 2는 강한 IL-12 분비를 유도하였으나, IMO 2는 시험관 내에서 더 낮은 IL-6 생성을 유도하였다(도 16). 생체 내에서 면역약리학적 효과를 평가하기 위하여 IMO 화합물, CpG 이뮤노머(immunomer) 및, 비-CpG 올리고를 BALB/c 마우스에 10 mg/kg의 용량으로 i.p, s.c 또는 i.m 투여하고, 4시간 후에 IL-12 및 IL-6에 관하여 이들의 혈청을 평가하였다. IMO 화합물은 둘 모두 통상적인 CpG 올리고에 비해 강한 혈청 IL-12 분비를 유도하였다 (표 17). 그러나, 합성 CpR 모티프를 함유하는 IMO 2는 모든 3가지 투여 경로에서 유의하게 더 낮은 혈청 IL-6를 유도하였고(표 17), 이로써 본 발명자들의 이전의 시험관내 연구가 추가로 확인되었다. 대조물질인 비-CpG DNA는 유의성이 없는 IL-12 및 IL-6 유도를 나타내었다.
표 17. 상이한 경로로 투여된 IMO 화합물에 의한 생체내 시토카인 유도a
올리고 복강내 (i.p) 근육내 (i.m) 피하 (s.c)
IL-12 IL-6 IL-12 IL-6 IL-12 IL-6
CpG DNA 36.0 + 0.5 1.1 + 0.2 62.7 + 6.4 0.6 + 0.07 48.6 + 6.9 0.3 + 0.03
IMO 1 59.0 + 11 5.9 + 0.2 109.3 + 25 5.8 + 0.5 98.3 + 15 4.3 + 0.3
IMO 2 51.7 + 0.9 2.5 + 0.2 87.9 + 3.2 1.2 + 0.1 136.9 + 17 2.3 + 0.4
비-CpG 0.86 + 0.5 0.7 + 0.3 1.6 + 0.07 Nd 1.7 + 0.04 Nd
a: 표시된 값은 3개의 개별 마우스의 평균 ng/mL + SD; nd - 검출되지 않음.
실시예 12: IMO 화합물은 뮤린 결장 암종 모델에서 효과적인 항종양 활성을 나타낸다.
뮤린 결장 암종 CT26.CL25 모델에서 IMO 화합물의 항종양 활성을 평가하였다. CT26.CL25 피하 고형 종양을 보유한 BALB/c 마우스를, 종양 접종후 6일째부터 시작하여 격일로 10회 1 mg/kg IMO 화합물을 종양 주변에 투여하여 처리하였다. IMO 화합물로 처리한 결과 75% 이하의 동물에서 종양 성장이 완전한 거부되거나 강하게 억제되었다(도 17A). 비-CpG DNA로 처리한 마우스와 비교하여 24일째에 72% 및 85%의 평균 종양 성장 억제가 IMO 1 및 2로 처리한 마우스에서 각각 관찰되었다. 또한, 복강 파종 복수 CT26.WT (도 17B) 및 CT26.CL25 (도 17C)를 보유한 마우스에게 IMO 2를 1 mg/kg의 용량으로 복강내 투여한 결과 마우스 생존이 현저히 증가되었다.
실시예 13: 순환 β-gal-특이적 IgG1 및 IgG2a 서브클래스의 수준
IMO 화합물로 처리한 후 CT26.CL25 종양 보유 마우스의 혈청을 β-gal-특이적 IgG1 및 IgG2a 수준에 대하여 분석하였다. IMO 화합물로 처리한 마우스는 항-β-gal-특이적 IgG2a 수준이 5배 증가(OD 단위)한 것으로 나타났다(도 18). 통상적인 CpG DNA로 처리한 결과 β-gal-특이적 IgG2a 수준은 단지 약 2배 증가했을 뿐이었다. 대조적으로, β-gal-특이적 IgG1 수준은 단지 0.5 내지 2배 증가한 것으로 관찰되었다 (도 18).
실시예 14: IMO 화합물은 종양특이적 CTL 반응을 유도한다.
종양 보유 마우스의 IMO 처리가 종양특이적 CTL 반응을 유도하는지 조사하기 위하여, 다양한 처리군에서 CT26.CL25 종양을 보유한 마우스로부터 얻은 비장세포로부터 정제한 T 세포를 미토마이신 C 처리 β-gal 또는 OVA 펩티드 펄스 친연성 비장세포로 24시간 동안 자극하였다. H-2d 제한 (β-gal876-884) 항원에 대한 종양 특이적 CTL 반응이 대조물질 비-CpG DNA로 처리한 마우스 보다 IMO 화합물 및 CpG DNA로 처리한 마우스에서 유의하게 높은 것으로 관찰되는데, 이는 더 높은 인터페론-감마(IFN-γ) 유도(도 19A)에 의해 결정된 바와 같으나, IL-4의 경우는 그렇지 않았다(도 19B).
실시예 15: IMO 처리 후에 지속적인 항종양 기억
IMO 처리가 종양특이적인 적합 면역 반응을 또한 유도할 것인지를 연구하기 위하여, IMO 처리에 의해 CT26.CL25 복강 종양이 제거된 마우스를 재감염시켰다. 이전에 IMO 2로 처리된 마우스는 CT26.WT 및 CT26.CL25 종양의 i.p. 재감염을 거부하였다(도 20A 및 B). IMO 2 처리 후에 복강 주입된 종양으로부터 생존한 마우스는 또한 i.v. 접종후에 동일한 종양의 폐 전이를 거부할 수 있었다(데이터는 제시하지 않음). 유사한 결과는 CT26.WT 또는 CT26.CL25 세포로 재감염시킨 CT26.WT 종양 모델 실험에서 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음). 이러한 데이터는 IMO 2로 처리한 마우스는 모델 종양 항원 β-gal에 대해서 뿐만 아니라 모 종양(CT26) 항원에 대해서도 적합 면역 반응을 나타내었음을 보여준다. 그러나, 이러한 면역 기억은 종양 특이적이었고, 동일한 마우스는 기관 비관련성인 친연성 4T1 유방암종 감염은 방어하지 못하였다(도 20C).
실시예 16: 나이브 마우스는 IMO 처리 마우스로부터 면역 세포의 입양 전달 후에 항종양 방어를 나타낸다.
IMO 2처리가 특이적인 항종양 면역을 유도하였다는 개념과 일치하게, IMO 처리 후에 CT26.CL25 종양을 거부한 마우스로부터 비장세포를 나이브 마우스로 전달하였고, 이들 마우스를 CT26.CL25 또는 4T1 종양 세포로 감염시켰다. IMO 2 처리 마우스의 비장세포는 CT26.CL25 종양 세포에 의한 치명적인 종양 감염을 방어하였으나, 나이브 마우스의 종양세포는 그렇지 못하였다(도 21A). 종양 재감염 실험의 경우에서와 마찬가지로, 이러한 방어는 종양 특이적이었고, 4T1 종양 세포 감염에는 미치지 못하였다(도 21B).
실시예 17: IMO 2는 뮤린 흑색종 모델에서 효과적인 항종양 활성을 나타내며 IgG2a 항체 생성을 유도한다
B16.F0 뮤린 흑색종을 보유한 마우스에서 IMO 2의 항종양 활성에 대하여 추가로 시험하였다. B16.F0 흑색종을 보유하는 C57BL/6 마우스를, 종양 접종후 8일째부터 시작하여 격일로 10회 1mg/kg의 IMO 2를 종양 주변에 투여하여 처리하였다. 도 22A에 도시된 바와 같이, IMO 2는 피하 B16.F0 흑색종을 보유하는 C57BL/6 마우스에서 71%의 종양 성장 억제를 유도하였다. IMO 1 처리는 또한 IMO 2 의 처리와 유사한 수준으로 종양을 억제시켰다(데이터는 제시하지 않음).
CT26.CL25 결장 암종의 경우와 마찬가지로, B16.F0 종양 보유 마우스를 IMO 2로 처리한 결과 대조물질 비-CpG DNA로 처리한 마우스와 비교하여 전체 순환 혈청 IgG2a이 현저히 증가하면서 총 IgG1 수준이 감소하거나 변화하지 않았다 (도 22B 및 C). 이러한 결과는 IMO 처리후 B16.F0 종양 보유 마우스에서 효과적인 Th1 타입 면역 반응을 시사한다.
실시예 18: IMO는 B16.F0 종양 보유 마우스에서 항종양 방어에 필수적인 Th1 타입 반응을 유도하였다.
IgG2a 수준의 증가 및 종양 항원 특이적 CTL 반응을 포함하는 상기에서 제시된 데이터는 결장 암종 모델에서 IMO 처리후 Th1 우세 반응으로의 명백한 전환을 나타내었다. B16 흑색종을 보유하는 야생형(wt), IL-12 ko, 및 IL-6 ko C57BL/6 마우스에서 IMO 화합물의 항종양 효과를 조사하였다. B16 흑색종을 보유하는 야생형(wt), IL-12 ko C57BL/6 마우스를 IMO 2로 처리한 결과 종양 성장이 현저히 감소되었다(도 23). 그러나, IMO 처리는 동일한 종양을 보유하는 IL-12 ko 마우스에 대해서는 유의하지 않은 효과를 나타내었고, 이는 IL-12가 IMO 유도 항종양 활성에 필요하다는 것을 시사한다(도 23).
실시예 19: 통상적인 화학요법제 및 IMO 화합물의 병용 요법의 상승작용
B16.F0 복수 종양 또는 4T1 피하 고형 종양을 보유하는 마우스에서 화학요법제와 IMO 화합물 간의 상승 효과를 조사하였다. IMO 2의 종양 주변 주입과 독소루비신 단독의 전신 투여는 4T1 종양 성장의 강력한 억제를 초래하였다(도 24A). 병용시에, 두 치료는 훨씬 더 효과적이었다(도 24A). 도세탁셀과 IMO 2의 병용 치료는 또한 복강 파종 B16.F0 흑색종에 대하여 현저한 상승작용을 나타낸 결과, 각 약제 단독으로 치료한 것에 비해 마우스 생존이 증가하였다(도 24B).
면역 세포 활성화에 대한 도세탁셀과 IMO 2 치료의 효과를, 말초혈액중의 CD69+ 및 CD86+ 세포의 집단 변화를 결정하여 시험하였다. IMO 2로 처리한 마우스는 CD69+ 및 CD86+ 세포 비율의 현저한 증가를 나타낸 반면, 도세탁셀이 1일째 및 3일째에 30 mg/kg 투여된 경우 이러한 활성화를 억제하지 않았다(도 24C).
실시예 20: 사람 특이적인 모티프를 함유하는 IMO 3는 종양 보유 마우스에서 효과적인 항종양 활성을 나타내며 Th-1 시토카인, IL-12를 유도한다.
마우스 특이적인 면역자극 모티프를 함유하는 IMO 2의 결과에 기초하여, 사람 특이적인 모티프를 함유하는 IMO 3를 합성하여 마우스에서 CT26.CL25 종양에 대한 이의 활성을 연구하였다. IMO 3 또한 이러한 종양 모델에 대하여 효과적인 항종양 활성을 나타내었다(도 25A). 예측된 바와 같이, IMO 2 및 3은 마우스에서 IL-12 분비를 유도하였다(도 25B). 추가로, 도 26에 도시된 바와 같이, IMO 3에 의한 사람 PBMC의 활성화는 헤르셉틴(Herceptin)의 존재하에 Her-2 양성 BT-474 세포의 용해를 유도하였다.
실시예 21: IMO 화합물과 조합된 리툭산(Rituxan)의 증가된 항종양 효과
나말와(Namalwa) B-세포 림프종 세포를 복강내 주사에 의해 NOD/SCID 마우스에 이식하여 사람의 고급 B-세포 비-호지킨 림프종(high-grade B-cell Non-Hodgkins Lymphoma)과 유사한 질병을 유도하였다. 종양 보유 마우스를, 4, 6, 및 8일째에 50 mg/kg 리툭산 및/또는 4, 6, 8, 11, 14 및 21일째에 2.5 mg/kg IMO 2를 복강내 주사하여 처리하였다(도 27). 도 28에 도시된 바와 같이, 종양 성장은 리툭산과 IMO 2의 조합에 의해 억제되었다.
실시예 22: IMO 화합물은 헤르셉틴의 항종양 효과를 증강시킨다
피하 이식된 Her-2 과발현 사람 유방종양 (BT474)을 보유하는 누드 마우스를, 6주 동안 주당 2회 10 mg/kg 헤르셉틴의 복강 주사 및/또는 1 mg/kg IMO 화합물의 종양 주변 주입에 의해 처리하였다(도 27). 헤르셉틴 또는 IMO 2 단독으로 처리한 후에 종양 성장은 PBS 대조군에 비해 70% 및 65% 억제되었다(도 29). 헤르셉틴과 IMO 2의 조합 치료의 경우 종양 성장이 97% 억제된 것으로 나타났다(도 29).
실시예 23: IMO 화합물은 헤르셉틴의 항종양 효과를 증강시킨다
피하 이식된 Her-2 과발현 사람 유방종양 (BT474)을 보유하는 누드 마우스를, 5, 7, 9 및 11일째에 리툭산 및/또는 5, 7, 9, 11 및 13일째에 IMO 화합물의 복강 주사에 의해 처리하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, IMO 2 및 리툭산과 IMO 2의 조합에 의해 종양 성장이 현저히 억제되었다.
균등물
상기에서 발명이 명료성 및 이해의 목적으로 상세하게 기술되었지만, 본 개시내용의 숙지로부터 본 발명의 진정한 범위 및 첨부된 청구범위로부터 벗어나지 않고 형식 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다.

Claims (24)

  1. 환자에 화학요법제와 함께 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 투여하는 것을 포함하여 암 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 및 화학요법제가 상승 효과를 생성시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 비-누클레오티드 링커에 의해 결합되며 1개를 초과하는 5' 단부를 지닌 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고누클레오티드 중 하나 이상이 접근가능한 5' 단부를 지닌 면역자극 올리고누클레오티드이고 면역자극 디누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머가 하기 구조식(III)을 지님을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112005066002272-PCT00022
    상기 식에서,
    Y는 시티딘, 2' 데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 그 밖의 비천연 피리미딘 누클레오시드, 또는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸- 퓨린이고;
    Z는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'데옥시이노신 또는 그 밖의 비천연 퓨린 누클레오시드이고,
    N1은 각각의 경우에 천연 또는 합성 누클레오시드이거나 아베이직(abasic) 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, β-L-데옥시리보누클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 누클레오시드간 결합에 의해 3'측상의 인접 누클레오시드에 결합된 누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이며, 변형된 누클레오시드간 결합이 제한없이 약 2 옹스트롬 내지 약 200 옹스트롬의 길이를 지닌 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오시드간 결합 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합으로부터 선택되고,
    Nn은 각각의 경우에 바람직하게는 천연 누클레오시드이거나 아베이직 누클레오시드, 아라비노누클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보누클레오시드, 2'-O-치환된 리보누클레오시드, 및 변형된 누클레오시드간 결합에 의해 3'측상의 인접 누클레오시드에 결합된 누클레오시드로부터 선택된 면역자극 부분이며, 변형된 누클레오시드간 결합은 바람직하게는 아미노 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 누클레오 시드간 결합 및 메틸포스포네이트 누클레오시드간 결합으로 구성된 군으로부터 선택되고,
    단, 1개 이상의 N1 또는 Nn은 면역자극 부분이며;
    각각의 n은 독립적으로 0 내지 30의 수이고;
    이뮤노머의 경우, 3' 단부는 면역자극성일 수 있거나 비-면역자극성일 수 있는 또 다른 올리고누클레오티드에 직접 결합되거나 비-누클레오티드 링커를 통해 결합된다.
  4. 제 1항에 있어서, 화학요법제가 겜시타빈(Gemcitabine), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 비-당 함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카르바진, 택솔, 프라길린(fragyline), 메글라민(Meglamine) GLA, 발루비신(valrubicin), 카르무스타인(carmustaine) 및 폴리퍼포산(poliferposan), MMI270, BAY 12-9566, RAS 파메실(famesyl) 트랜스퍼라아제 억제제, 파메실 트랜스퍼라아제 억제제, MMP, MTA/LY231514, LY264618/로메텍솔(Lometexol), 글라몰렉(Glamolec), CI-994, TNP-470, 히캄틴/토포테칸(Hycamtin/Topotecan), PKC412, 발스포다르(Valspodar)/PSC833, 노반트론/미트록산트론(Novantrone/Mitroxantrone), 메타레트/수라민(Metaret/Suramin), 바티마스타트(Batimastat), E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, 인셀(Incel)/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트(Marmistat), BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날(Lemonal) DP 2202, FK 317, 이마티닙 메실레이트/글리벡(imatinib mesylate/Gleevec), 피시바닐(Picibanil)/OK-432, AD 32/발루비신(Valrubicin), 메타스트론(Metastron)/스트론튬 유도체, 테모달/테모졸로미드(Temodal/Temozolomide), 에바세트(Evacet)/리포솜 독소루비신, 유탁산/플라클리탁셀(Yewtaxan/Placlitaxel), 택솔/파클리탁셀, 제로우드/카펙시타빈(Xeload/Capecitabine), 푸르툴론/독시플루리딘(Furtulon/Doxifluridine), 시클로팍스(Cyclopax)/경구 파클리탁셀, 오랄 탁소이드(Oral Taxoid), SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌(Flavopiridol), CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 온코진 억제제, BMS-182751/경구 플라티넘(platinum), UFT(Tegafur/Uracil), 에르가미솔/레바미솔(Ergamisol/Levamisole), 에닐루아실(Eniluracil)/776C85/5FU 인핸서, 캄프토/레바미솔(Campto/Levamisole), 캄프토사르/이리노테칸(Camptosar/Irinotecan), 투모덱스/랠리트렉세드(Tumodex/Ralitrexed), 레우스타틴/클라드리빈(Leustatin/Cladribine), 팍섹스(Paxex)/파클리탁셀, 독실(Doxil)/리포솜 독소루비신, 캘릭스(Caelyx)/리포솜 독소루비신, 플루다라/플루다라빈(Fludara/Fludarabine), 파마루비신/에피루비신(Pharmarubicin/Epirubicin), 데포(Depo)Cyt, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈이미드, LU 103793/돌라스타인(Dolastain), 캐틱스(Caetyx)/리포솜 독소루비신, 겜자르/겜시타빈(Gemzar/Gemcitabine), ZD 0473/아노르메드(Anormed), YM 116, 요오딘 시드 (Idoine seed), CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드(Dexifosamide), 이페스/메스넥스/이포사미드(Ifes/Mesnex/Ifosamide), 부몬/테니 포시드(Vumon/Teniposide), 파라플라틴(Paraplatin)/카르보플라틴, 플랜티놀(Plantinol)/시스플라틴, 베페시드/에토포시드(Vepeside/Etoposide), ZD 9331, 택소테레/도세탁셀, 구아닌 아라비노시드의 프로드러그, 택산 유사체, 니트로소우레아, 알킬화 작용제, 예를 들어 멜펠란 및 시클로포스파미드, 아미노글루테트이미드(Aminoglutethimide), 아스파라기나아제, 부술판(Busulfan), 카르보플라틴, 클로롬부실(Chlorombucil), 시타라빈(Cytarabine) HCl, 닥티노마이신(Dactinomycin), 다우노루비신(Daunorubicin) HCl, 에스트라무수틴(Estramustine) 포스페이트 소듐, 에토포시드 (VP16-213), 플록스우리딘(Floxuridine), 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드(Flutamide), 히드록시우레아 (히드록시카르바미드), 이포스파미드(Ifosfamide), 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 레우프롤리드(Leuprolide) 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴(Lomustine) (CCNU), 메클로르에타민(Mechlorethamine) HCl (질소 머스타드), 메르캅토퓨린, 메스나(Mesna), 미토탄(Mitotane) (o.p'-DDD), 미톡산트론(Mitoxantrone) HCl, 옥트레오티드(Octreotide), 플리카마이신(Plicamycin), 프로카르바진(Procarbazine) HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파(Thiotepa), 빈블라스틴 설페이트, 암사크린(Amsacrine) (m-AMSA), 아자시티딘(Azacitidine), 에리트로포이에틴, 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터루킨 2, 미토구아존(Mitoguazone) (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴(pentostatin) (2'데옥시코포르마이신), 세무스틴(Semustine) (메틸-CCNU), 테니포시드(Teniposide) (VM-26) 및 빈데신(Vindesine) 설페이트로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 하기 구조식을 지님을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112005066002272-PCT00023
    상기 식에서, X는 C3 링커이고, Y는 글리세롤 링커이다.
  6. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 하기 구조식을 지님을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112005066002272-PCT00024
  7. 제 1항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머가 피리미딘-퓨린 디누클레오시드를 포함하며, 여기서 퓨린 누클레오티드는 하기 구조식(II)을 지님을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112005066002272-PCT00025
    상기 식에서,
    D는 수소 결합 도너이고;
    D'는 수소, 수소 결합 도너 및 친수성 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    A는 수소 결합 억셉터 또는 친수성 기이고;
    X는 탄소 또는 질소이고;
    각각의 L은 독립적으로 C, O, N 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고;
    S'는 펜토오스 또는 헥소오스 당 고리, 또는 비천연 당이다.
  8. 제 7항에 있어서, 수소 결합 도너가 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 수소 결합 억셉터가 C=O, C=S, -N= 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 비천연 퓨린이 6-티오구아닌 또는 7-데아자구아닌임을 특 징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머.
  11. 제 1항에 있어서, 비천연 피리미딘이 하기 구조식(I)을 지님을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112005066002272-PCT00026
    상기 식에서,
    D는 수소 결합 도너이고;
    D'는 수소, 수소 결합 도너, 수소 결합 억셉터, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끄는 기 및 전자 주는 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    A는 수소 결합 억셉터 또는 친수성 기이고;
    A'는 수소 결합 억셉터, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끄는 기 및 전자 주는 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
    X는 탄소 또는 질소이고;
    S'는 펜토오스 또는 헥소오스 당 고리, 또는 비천연 당이다.
  12. 제 11항에 있어서, 수소 결합 도너가 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH로 구성된 군으 로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 수소 결합 억셉터가 C=O, C=S, 및 시토신의 N3를 포함하는 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 구조식 (I)의 염기 부분이 비천연 피리미딘 염기임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 비천연 피리미딘 염기가 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신 및 4-티오우라실로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 구조식 (I)의 당 부분 S'가 비천연 당 부분임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 비천연 당 부분이 헥소오스, 아라비노오스 및 아라비노오스 유도체로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머가 약 2 옹 스트롬 내지 약 200 옹스트롬 길이의 링커, 금속, 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드, 올리고누클레오티드의 3'-말단 누클레오시드에 결합하게 하는 작용기를 지닌 유기 부분, 생체분자, 시클릭 또는 비시클릭(acyclic) 소분자, 지방족 또는 방향족 탄화수소 (이들 중 어느 하나는 올리고누클레오티드를 연결하거나 이에 부가된 선형 사슬에서 히드록시, 아미노, 티올, 티오에티르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오우레아로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 임의로 포함할 수 있다); 아미노산, 탄수화물, 시클로덱스트린, 아마단탄, 콜레스테롤, 합텐 항생제, 글리세롤 또는 HO-(CH2) o -CH(OH)-(CH2) p -OH (여기서 o 및 p는 독립적으로 1 내지 6의 정수임)의 글리세롤 동족체, 및 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 비-누클레오티드 링커를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머가 필수적으로 포스포디에스테르 결합으로 구성된 누클레오시드간 결합을 지님을 특징으로 하는 방법.
  20. 환자에게 화학요법제와 함께 면역자극 올리고누클레오티드 컨쥬게이트 및/또는 이뮤노머를 투여하는 것을 포함하여 암 환자에서 암을 치료하는 방법.
  21. 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머, 화학요법제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 제형.
  22. 제 1항에 있어서, 백신을 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 또는 백신, 또는 둘 모두가 면역원성 단백질에 결합되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 애쥬번트를 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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