KR20060007444A - 안정화된 면역조절 올리고누클레오티드 - Google Patents

안정화된 면역조절 올리고누클레오티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20060007444A
KR20060007444A KR1020057023889A KR20057023889A KR20060007444A KR 20060007444 A KR20060007444 A KR 20060007444A KR 1020057023889 A KR1020057023889 A KR 1020057023889A KR 20057023889 A KR20057023889 A KR 20057023889A KR 20060007444 A KR20060007444 A KR 20060007444A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
deoxy
nucleic acid
dna
cpg
substituted
Prior art date
Application number
KR1020057023889A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101137572B1 (ko
Inventor
에캄바 알. 칸디말라
라크스미 바갯
라젠드라 케이. 판데이
동 유
서드허 아그라월
Original Assignee
하이브리돈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 하이브리돈, 인코포레이티드 filed Critical 하이브리돈, 인코포레이티드
Publication of KR20060007444A publication Critical patent/KR20060007444A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101137572B1 publication Critical patent/KR101137572B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Abstract

본 발명은 하나 이상의 CpG 디누클레오티드 및 5'- 또는 3'-말단에 2차 구조를 갖는 면역자극 올리고누클레오티드를 제공한다. 이들 올리고누클레오티드는 감소되거나 증진된 면역자극 특성을 지닌다. 본 발명은, 5'-말단 구조가 3'-말단에서의 2차 구조보다 더욱 현저하게 면역자극 활성에 영향을 미친다는 것을 확립한다. 본 발명은 또한 CpG-함유 핵산의 면역자극 활성을 증가시키거나 감소시키기 위한 방법을 제공한다.
면역자극 올리고누클레오티드, CpG 디누클레오티드, 면역자극 활성

Description

안정화된 면역조절 올리고누클레오티드 {STABILIZED IMMUNOMODULATORY OLIGONUCLEOTIDES}
발명의 배경
관련 출원
본 출원은, 전문이 본원에 참조로 인용된, 2003년 6월 11일자로 출원된 미국 가특허원 제60/477,608호, 2003년 8월 29일자로 출원된 미국 가특허원 제60/499,038호, 및 2003년 9월 18일자로 출원된 미국 가특허원 제60/504,279호의 이익을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학, 면역학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 면역조절 올리고누클레오티드 및 이의 치료학적 용도에 관한 것이다.
관련 기술의 요약
면역계는 세균 및 바이러스와 같은 병원체의 DNA에서 일반적으로 발생하는 메틸화되지 않은 CpG 디누클레오티드 모티프를 함유하는 DNA를 특이적으로 인지하도록 진화되어 있다. 그 결과, 메틸화되지 않은 CpG-함유 DNA는 척추동물 면역계의 강력한 자극인자이다. DNA에 의한 면역 자극의 최초 보고는 세균 DNA 및 회문식 서열(palindromic sequence)을 함유하는 DNA의 짧은 단편을 사용한 연구에서 이루어졌으며, 이들 두 서열은 포스포디에스테르 골격을 갖는 이본쇄 구조이다. 도쿠나가, 티.(Tokunaga, T.) 등은 문헌[참조: J. Natl. Cancer Inst. 72: 955-962(1984)]에서 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG로부터 분리된 DNA에 대한 강력한 항-종양 활성을 증명하였다. 가타오카, 티.(Kataoka, T) 등의 문헌[참조: Jpn. J. Cancer Res. 83: 244-247 (1992)], 하르트만(Hartmann) 등의 문헌[참조: European Journal of lmmunology 33: 1673-1641 (2003)] 및 마샬(Marshall) 등의 문헌[참조: Journal of Leukocyte Biology 73: 781-792(2003)]은 마이코박테리움 보비스 BCG cDNA 서열을 기초로 설계된 합성 올리고데옥시누클레오티드에 있어서 유사한 형태의 항-종양 활성을 입증하였다.
사토, 와이.(Sato, Y.) 등은 문헌[참조; Science 273: 352-354 (1996)]에서 DNA 백신의 적용시 CpG-함유 DNA의 중요성을 나타내었다[추가 참조: Gurunathan S., et al., Annu. Rev. Immunol. 18 : 927-974 (2000)]. 피세츠키, 디. 에스.(Pisetsky, D. S.) 등의 문헌[참조: Mol. Biol. Rep. 18: 217-221 (1993)] 및 크리에그, 에이. 엠.(Krieg, A. M.) 등의 문헌[참조: Nature 374: 546-549 (1995)]은 특정의 서열 전후에 메틸화되지 않은 CpG-디누클레오티드를 함유하는 DNA(CpG DNA)가 척추동물 면역계를 활성화시키고 B 세포의 증식 및 대식구, 단핵구, NK 세포 및 수지상 세포의 활성화를 가져온다는 것을 나타내었다. CpG DNA 활성화에 반응하여, 면역 세포는 IL-12, IFN-γ, INF-α, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 다수의 사이토킨을 분비하며 몇가지 공-자극 분자(co-stimulatory molecule)를 포함하는 다수의 사이토킨을 분비한다[참조: Pisetsky, D. S., et al. and Krieg, A. M., et al., 상기 참조).
칸디말라, 이. 알.(Kandimalla, E.R.) 등은 문헌[참조: Curr. Opin. Mol. Ther. 4 122-129 (2002)]에서 CpG-디누클레오티드 및 이를 플랭킹하는 서열의 존재 및 위치가 면역자극 활성에 중요함을 나타내고 있다. 아그라왈, 에스(Agrawal, S.) 등의 문헌[참조: Current Cancer Drug Targets 1: 197-209 (2001)]은 CpG 올리고누클레오티드의 플랭킹 서열내 리보스 변형에 기인한 현저한 효과를 기술하고 있다. 이러한 효과는 2'-O-메톡시에톡시 및 2'- 또는 3'-O-메틸 그룹을 포함하는 치환체의 위치 및 특성에 의존한다. 유, 디.(Yu, D.) 등의 문헌[참조:Bioorg. Med. Chem. 9: 2803-2808 (2001)]은 포스페이트 변형이 또한 이들의 위치에 따라 면역조절 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있음을 입증하고 있다. 유, 디.(Yu D.) 등의 문헌[참조: Bioorg. Med. Chem. Lett. 11: 2263-2267 (2001)] 및 유, 디.(Yu, D.) 등의 문헌[참조; Bioorg. Med Chem. 11: 459-464 (2003)]은 특정의 핵염기의 결실에 의해 활성이 증가될 수 있음을 기술하고 있다. 또한, 유 디.(Yu D.) 등의 문헌[참조: Bioorg. Med Chem. 11: 459-464 (2003)]은 면역자극 활성이 특정의 플랭킹 누클레오티드를 비-누클레오티드성 링커로 치환시킴에 의해 증가시킬 수 있음을 기술하고 있다.
유, 디.(Yu D.) 등의 문헌[참조: Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 2585-2588 (2000)], 유, 디.(Yu, D.) 등의 문헌[참조: Nucleic Acids Res. 30: 4460-4469 (2002)], 유, 디.(Yu, D.) 등의 문헌[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002)], 바가트, 엘.(Bhagat L.) 등의 문헌[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003)] 및 칸디말라, 이. 알.(Kandimalla E. R.) 등의 문헌[참조: Nucleic Acids Res. 31: 2393-2400 (2003)]은, 5'-말단이 수용체 인지에 관여하며 이의 말단의 접근성이 활성에 중요함을 이미 밝혔다. 칸디말라, 이. 알.( Kandimalla E. R.) 등의 문헌[참조: Bioconj. Chem. 13: 966-974 (2002)]은 플루오레세인보다 큰 리간드 또는 5'-5' 연결된 디누클레오티드의 5'-말단 콘쥬게이션(conjugation) 이후에 면역조절 활성이 상실됨을 기술하고 있다. 3'-콘쥬게이션은 영향이 없으므로, 흡수의 변화가 그 결과에 대한 원인이 될 수 없다(Id.). 그러나, 면역 반응을 초래하는데 있어 DNA의 2차 구조의 역활을 설명하기 위한 어떠한 체계적 연구도 수행되지 않았다. 본원의 발명은 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있는 점성 말단(sticky end) 또는 5'- 및 3'-헤어핀 루프를 지닌 면역자극 DNA에 의한 면역자극에 관한 정보를 제공한다.
Th1 사이토킨 생산을 유도하고 면역글로불린 생산이 증진된 CTL 반응을 촉진하는 면역조절 DNA의 능력은, 암, 바이러스 및 세균 감염, 및 염증 장애를 포함하는 광범위한 스펙트럼의 질병 적응증을 치료하기 위해, 그리고 면역치료요법의 보조제로서 사용되어 왔다. 즉, 면역조절 DNA 활성을 증진시키거나 조절하는 잇점은 명백하며, 증진된 면역자극 핵산을 개발하는 것이 당해 분야에서 요구되고 있다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 증가되거나 감소된 면역자극 특성을 갖는 면역조절 올리고누클레오티드를 포함하는 물질의 신규 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 면역조절 특성이 증가되거나 감소되거나, 또는 대사 안정성이 증가된 면역조절 올리고누클레오티드의 설계가 가능한 방법을 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도, 면역조절 올리고누클레오티드의 3'- 말단 또는 5'-말단내로 2차 구조를 도입시킴에 의해 이러한 올리고누클레오티드의 면역조절 활성 및 안정성이 크게 영향을 받는다는 것을 발견하였다.
본 발명의 제1 측면은 면역조절 핵산을 제공하는 것이다. 면역조절 핵산은 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 사이티딘, 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고, G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하는 올리고누클레오티드 서열을 포함한다. 특정의 바람직한 양태에서, 올리고누클레오티드 서열은 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단에서 2차 구조를 지닌다. 특정의 바람직한 양태에서, 면역조절 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
일부 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 2 내지 약 50개 누클레오티드이다. 특정 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드이다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드 각각은 약 3 내지 약 35개 누클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30개 누클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 20개 누클레오시드 잔기를 갖는다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드는 약 5 내지 약 18개 또는 약 5 내지 약 14개의 누클레오시드 잔기를 갖는다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "약"은 정확한 수가 중요하지 않음을 의미한다. 따라서, 올리고누클레오티드내 누클레오시드의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 수의 누클레오시드 잔기를 갖거나, 하나 내지 수개의 첨가적인 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드가 상술한 양태 각각의 균등물로서 고려된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 11개의 누클레오티드를 갖는다.
특정의 양태에서, 면역자극 핵산은 3'-말단 스템 루프 2차 구조를 갖는다. 일부 양태에서, 면역자극 핵산은 상보성 서열과의 수소 결합에 의해 3'- 말단에 2차 구조를 갖는다. 특정의 양태에서, 면역자극 핵산은 SEQ ID NO.: 2, 3, 4, 9, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
제2 측면에서, 본 발명은 면역자극 활성이 감소된 핵산을 제공한다. 당해 측면에서, 핵산은 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고; G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며; C*는 2'-데옥시티미딘, 1- (2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고; G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이며; p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하는 올리고누클레오티드 서열을 포함한다. 특정의 바람직한 양태에서, 올리고누클레오티드 서열은 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단에 2차 구조를 갖는다. 특정의 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
일부 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 2 내지 약 50개 누클레오티드인 올리고누클레오티드 서열이다. 특정의 양태에서, 면역조절 핵산은, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드인 올리고누클레오티드 서열이다.
특정의 양태에서, 감소된 면역자극 활성을 갖는 핵산은 5'-말단 루프 2차 구조를 형성한다. 일부 양태에서, 면역자극 활성이 감소된 핵산은 상보성 서열과의 수소 결합에 의해 5'-말단에 2차 구조를 갖는다. 특정의 양태에서, 면역자극 활성이 감소된 핵산은 SEQ ID NO.: 5, 6, 7, 10, 15, 16 및 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
제3 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하는 면역자극 핵산을 제공하며, 여기서, 면역자극 핵산은 2차 구조를 갖는다. 당해 측면에서, 면역조절 핵산은 하기식 I의 구조를 포함한다.
도메인 A-도메인 B-도메인 C (I)
도메인은, 길이가 약 2 내지 약 12개인 누클레오티드일 수 있다. 도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이며, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신, 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하거나 함유하지 않는 회문식 또는 자가-상보성 도메인을 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5' 또는 2'-5'DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA일 수 있다. 특정의 양태에서, 도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드일 것이다.
하기 "X로 나타낸 바와 같은, 도메인 B는 3'-5'결합, 2'-5'결합, 3'-3'결합, 포스페이트 그룹, 누클레오시드 또는 지방족, 방향족, 아릴, 사이클릭, 키랄, 아키랄, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 지방산, 모노- 트리- 또는 헥사폴리에틸렌 글리콜, 또는 헤테로사이클릭 잔기일 수 있는 비-누클레오시드 링커일 수 있는, 도메인 A 및 C를 결합시키는 링커이다. 일부 양태에서, 도메인 B는 바람직하게는 "이뮤노머(immunomer)"로 언급되는 도메인 A 및 도메인 C의 올리고누클레오티드를 연결하는 비-누클레오티드 링커이다.
도메인 C는 회문식 또는 자가-상보성 서열을 가지거나 가지지 않는 5'-3' 또는 3'-5', 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA 폴리 I-폴리 C일 수 있으며, 이는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다. 특정의 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG이 아니다. 특정의 바람직한 양태에서, 도메인 C는 디누클레오티드 CpG, C*pG, C*pG*, 또는 CpG*를 갖지 않는다.
일부 양태에서, 상기식 I에 함유된 올리고누클레오티드는, 길이가 약 2 내지 약 50개 누클레오티드이다. 특정의 양태에서, 상기식 I에 함유된 올리고누클레오티드는, 길이가 약 12 내지 약 26개인 누클레오티드이다.
비-제한적인 예로서, 본 측면의 특정 양태에서 면역자극 핵산은 하기식 II로 상세히 나타내어지는 구조를 가질 것이다.
Figure 112005072530017-PCT00001
당해 분야의 숙련가가 인지하는 바와 같이, 분자의 3' 말단에 2차 구조 성분이 분자내 스템-루프 형태로 존재한다.
비-제한적인 예로서, 본 측면의 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 하기식 III으로 상세히 나타내어지는 구조를 가질 것이다.
Figure 112005072530017-PCT00002
상기식 III으로 나타낸 구조는, 2개의 3' 말단의 서열이 분자간 수소 결합을 허용하는 상보성이므로 2개 분자의 3' 말단이 차단되기 때문에 "말단 다이머(terminal dimmer)"로 언급된다. 또한, 도메인 A 및 A'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고, 도메인 B 및 B'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있으며, 도메인 C 및 C'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
비-제한적인 예로서, 본 측면의 특정 양태에서, 면역자극 핵산은 하기식 IV에 상세히 나타낸 구조를 가질 것이다.
Figure 112005072530017-PCT00003
당해 분야의 숙련가에게 인지되는 바와 같이, 묘사된 분자의 3' 말단은, 3' 말단의 상보성 서열이 당해 영역에 수소 결합되므로 2차 구조를 가진다.
특정의 양태에서, 본 발명의 면역자극 핵산은 SEQ ID NO.: 1 내지 38로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 면역자극 핵산은 SEQ ID NO.: 39 내지 68로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는다.
제4 측면에서, 본 발명은 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 올리고누클레오티드의 5'-말단에 도입시킴을 포함한다. 이러한 측면의 일부 양태에서, 2차 구조는 스템-루프 구조이다. 본 측면의 특정 양태에서, 2차 구조는 상보성 서열을 올리고누클레오티드 서열의 5'-말단에 수소 결합시킴으로써 수득된다.
제5 측면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 면역자극 올리고누클레오티드의 3'-말단에 도입시킴을 포함한다. 당해 측면의 일부 양태에서, 2차 구조는 스템-루프 구조이다. 당해 측면의 특정 양태에서, 2차 구조는 상보성 서열을 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단에 수소결합시킴에 의해 수득된다.
제6 측면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 면역자극 올리고누클레오티드의 3'-말단 또는 5'-말단에 도입시킴을 포함한다. 당해 측면의 일부 양태에서, 2차 구조는 스템-루프 구조(stem-loop structre)이다. 당해 측면의 특정 양태에서, 2차 구조는 상보성 서열을 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 수소결합시킴에 의해 수득한다.
제7 측면에서, 본 발명은 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 조성물은 단독 또는 배합된 본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 측면에 기술된 조성물중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 1.0㎍/mL의 농도의 올리고 1, 2 및 5에 의해 유도된 세포 증식을 나타내는 개략도이다.
도 1B는 BALB/c 마우스에 5mg/kg의 투여량으로 복강 투여된 올리고 1,2 및 5로 유도된 비장비대를 나타내는 개략도이다.
도 2는 3㎍/mL의 농도에서 올리고누클레오티드 1 내지 7과 24시간 항온처리한 후 BALB/c 마우스 비장 세포에서 사이토킨 IL-12 및 IL-6의 유도를 나타내는 개략도이다.
도 3은 3㎍/mL 농도의 올리고누클레오티드 8 내지 10과 함께 24시간 배양한 후 BALB/c 마우스 비장 세포에서 사이토킨 IL-12 및 IL-6의 유도를 나타내는 개략도이다.
도 4는 10㎍/mL의 올리고 1 내지 8로 1시간 자극 후 J774 대식구에서 NF-κB 경로의 활성화를 나타내는 개략도이다. M은 배지로 처리한 대조군을 나타내고 C는 비-CpG 올리고로 처리한 세포이다.
도 5는 올리고 1 내지 7 10㎍/mL의 농도에서 J774 대식구 세포 배양물에서 사이토킨 IL-12 및 IL-6의 유도를 나타내는 개략도이다. M은 PBS로 처리한 대조 그룹을 나타낸다. ND는 검출되지 않음을 나타낸다.
도 6은 10㎍/ml의 올리고 11, 12, 14, 15 및 17에 노출시킨 후 형질세포모양(plasmacytoid) 수지상 세포에서 인터페론 α(IFN-α)의 유도를 나타내는 개략도이다.
도 7은 10㎍/ml의 올리고 18, 19, 20 및 21에 노출시킨 후 형질세포모양 수지상 세포에서 인터페론 α(IFN-α)의 유도를 나타내는 개략도이다.
도 8은 10㎍/ml의 올리고 41, 44 및 45에 노출시킨 후 세포형질세포모양 수지상 세포에서 인터페론 α(IFN-α)의 유도를 나타내는 개략도이다.
도 9는 본 발명의 이뮤노머의 병행 합성을 위한 개략도이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 10은 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성에 적합한 대표적인 소분자 링커의 그룹을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성을 위한 개략도이다. MTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 12는 본 발명의 이뮤노머의 병행 합성에 적합한 대표적인 소분자 링커의 그룹을 나타낸다.
도 13은 자가-안정화된 CpG DNA가 배양액에서 (A) 사람 pDC에 의한 IFN-α 분비 및 (B) 사람 B-세포 증식을 유도함을 도시한 것이다. (A) pDC를 5 내지 8명의 건강한 공여자로부터 입수한 사람 PBMC로부터 분리하고 24시간 동안 10㎍/mL의 CpG DNA로 자극시키고 상층액을 ELISA에 의해 IFN-α 분비에 대해 검정하였다. (B) 1㎍/mL의 CpG DNA로 72시간 동안 자극시킨 4 내지 7명의 건강한 공여자로부터 입수한 사람 PBMC로부터 B 세포를 분리하고, [3H]-티미딘 흡수를 측정하였다. 기호는 각각의 공여자를 이용하여 수득한 데이터를 나타내고 + 표시는 패널 둘다에서 모든 공여자의 평균치를 나타낸다.
도 14는 사람 B 세포 증식의 CpG DNA 농도 의존성을 나타낸다. 상이한 농도의 CpG DNA로 72시간 동안 자극시킨 4 내지 6명의 건강한 공여자로부터 B 세포를 분리하였다. 나타낸 데이터는 평균 ± SD이다.
도 15에서 (A)는 CpG 모티프의 존재 및 2차 구조가 사람 pDC에 의한 IFN-α 분비의 유도에 필요함을 나타낸다. 나타낸 데이터는 10㎍/mL 농도의 CpG DNA에서 6 내지 8명의 사람 공여자의 평균 ± SD이다. (B)는 사람 B-세포 증식은 CpG 자극 모티프의 존재를 필요로 하나 DNA에서 2차 구조를 필요로 하지 않음을 나타낸다. 나타낸 데이터는 1㎍/mL 농도의 CpG DNA에서 5 내지 8명의 평균 ± SD이다.
도 16은 (A) 사람 pDC에 의한 INF-α분비 및 (B) 사람 B-세포 증식에 있어 헤어핀 2차 구조내 2'-O-메틸리보누클레오티드 분절의 효과를 도시한다. 나타낸 데이터는 pDC 배양물중 10㎍/mL 농도의 CpG DNA에서 6 내지 8명의 사람 공여자 및 B 세포 배양물중 1 ㎍/mL 농도의 CpG DNA에서 5 내지 8명의 공여자의 평균 ± SD이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 면역자극 특성이 증가되거나 감소된 면역자극 올리고누클레오티드를 포함하는 물질의 신규 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 면역자극 특성이 증가되거나 감소되거나, 또는 대사 안정성이 증가된 면역자극 올리고누클레오티드를 설계할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명자들은, 놀랍게도 면역자극 올리고누클레오티드의 3'-말단 또는 5'-말단내로 2차 구조를 도입시키는 것이 이들 올리고누클레오티드의 면역자극 활성 및 안정성에 현저히 영향을 미침을 발견하였다.
본원된 인용된 허여된 특허, 특허출원 및 문헌은, 각각이 참조로써 인용되도록 특정하게 및 개별적으로 지시된 경우에서와 동일한 정도로 참조로서 본원에 인용된다. 본원에 인용된 어떠한 문헌의 교시와 본 특허 명세서 간에 불일치가 있는 경우, 본 특허 명세서가 본 발명의 목적을 위해 우선한다.
제1 측면에서, 본 발명은 면역자극 핵산을 제공한다. 면역자극 핵산은 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, l-(2'-데옥시-6-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로부터 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유한 올리고누클레오티드 서열을 포함하고, 올리고누클레오시드 서열은 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단에 2차 구조를 갖는다. 특정의 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
일부 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 2 내지 약 50개 누클레오티드이다. 특정 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드이다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드 각각은 약 3 내지 약 35개 누클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30개 누클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 20개 누클레오시드 잔기를 갖는다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드는 약 5 내지 약 18개, 또는 약 5 내지 약 14개의 누클레오시드 잔기를 갖는다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "약"은, 정확한 수가 중요하지 않음을 의미한다. 즉, 올리고누클레오티드내 누클레오시드의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 수의 누클레오시드 잔기를 갖거나, 하나 내지 수개의 첨가적인 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드가 상술한 양태 각각의 균등물로서 고려된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 11개의 누클레오티드를 갖는다.
특정의 양태에서, 면역자극 핵산은 3'-말단 스템 루프 2차 구조를 갖는다. 일부 양태에서, 면역자극 핵산은 상보성 서열과의 수소 결합에 의해 3'-말단에 2차 구조를 갖는다. 특정의 양태에서, 면역자극 핵산은 SEQ ID NO.: 2, 3, 4, 9, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "올리고누클레오티드"는 다수의 연결된 누클레오시드 단위로부터 형성된 폴리누클레오시드를 말한다. 이러한 올리고누클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는 존재하는 핵산 공급원으로부터 수득될 수 있으나, 바람직하게는 합성 방법에 의해 생산된다. 바람직한 양태에서, 각각의 누클레오시드 단위는 헤테로사이클릭 염기 및 펜토푸라노실, 2'-데옥시펜트푸라노실, 트레할로즈, 아라비노즈, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노즈, 2'-O-치환된 아라비노즈 또는 헥소즈 당 그룹을 포함한다. 누클레오시드 잔기는 다수의 공지된 누클레오시드간 결합중 어느 것에 의해 각각 서로 커플링될 수 있다. 이러한 누클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬 포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리논, 보라노, 티오에테르, 브릿지된 포스포르아미데이트, 브릿지된 메틸렌 포스포네이트, 브릿지된 포스포로티오에이트, 및 설폰 누클레오시드간 결합을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 용어 "올리고누클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체특이적 누클레오시드간 결합[예: (RP)- 또는 (SP)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 결합]을 갖는 폴리누클레오시드를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "올리고누클레오티드" 및 "디누클레오티드"는, 결합이 포스페이트 그룹을 포함하든 않든 간에, 이러한 누클레오시드간 결합을 갖는 디누클레오시드 및 폴리누클레오시드를 포함하는 것을 명백히 의미한다. 특정의 바람직한 양태에서, 이들 누클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합, 또는 이의 조합일 수 있다.
용어 "올리고누클레오티드"는 또한 단백질 그룹, 친지성 그룹, 삽입제(intercalating agent), 디아민, 엽산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가의 치환체를 갖는 폴리누클레오시드를 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드"는 또한 펩타이드 핵산(PNA), 포스페이트 그룹을 갖는 펩타이드 핵산(PHONA), 잠금(locked) 핵산(LNA), 모르폴리노-골격 올리고누클레오티드, 및 골격 부분에 알킬 링커 또는 아미노 링커를 갖는 올리고누클레오티드를 포함하나 이에 한정되지 않는, 어떠한 다른 핵염기 함유 중합체를 포함한다.
본 발명의 올리고누클레오티드는 천연적으로 존재하는 누클레오시드, 변형된 누클레오시드, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "변형된 누클레오시드"는 변형된 헤테로사이클릭 염기, 변형된 당 잔기, 또는 이의 조합물을 포함하는 누클레오시드이다. 일부 양태에서, 변형된 누클레오시드는 본원에 기술된 것으로서 비-천연 피리미딘 또는 푸린 누클레오시드이다. 일부 양태에서, 변형된 누클레오시드는 2'-치환된 리보누클레오시드, 아라비노누클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노사이드이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "2'-치환된 리보누클레오시드" 또는 "2'-치환된 아라비노사이드"는, 펜토즈 잔기의 2' 위치에서 하이드록실 그룹이 치환되어 2'-치환되거나 2'-O-치환된 리보누클레오시드를 생산하는 아라비노누클레오시드 ㄸ는 리보누클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 치환은 1 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬 그룹, 또는 탄소수가 6 내지 10인 아릴 그룹으로 이루어지며, 여기서, 이러한 알킬 또는 아릴 그룹은 치환되지 않거나, 또는 예를 들면, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카복실, 카보알콕시 또는 아미노 그룹으로 치환될 수 있다. 2'-O-치환된 리보누클레오시드 또는 2'-O-치환된 아라비노사이드는 2'-O-메틸리보누클레오시드 또는 2'-O-메틸아라비노사이드 및 2'-O-메톡시에톡시리보누클레오시드 또는 2'-O-메톡시에톡시아라비노사이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "2'-치환된 리보누클레오시드" 또는 "2'-치환된 아라비노사이드"는 또한, 2'-하이드록실 그룹이 1 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬 그룹, 또는 아미노 또는 할로 그룹으로 치환된 리보누클레오시드 또는 아라비노누클레오시드를 포함한다. 이러한 2'-치환된 리보누클레오시드 또는 2'-치환된 아라비노사이드의 예는 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 및 2'-프로파르길 리보누클레오시드 또는 아라비노사이드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "올리고누클레오티드"는 하이브리드 및 키메라 올리고누클레오티드를 포함한다. "키메라 올리고누클레오티드"는 하나 이상의 유형의 누클레오시드간 결합을 갖는 올리고누클레오티드이다. 이러한 키메라 올리고누클레오티드의 하나의 바람직한 예는 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 또는 포스포로디티오에이트 영역 및 알킬포스포네이트 또는 알킬포스포노티오에이트 결합과 같은 비-이온성 결합을 포함하는 키메라 올리고누클레오티드이다(참조: Pederson et al. 미국 특허 제5,635,377호 및 제5,366,878호).
"하이브리드 올리고누클레오티드"는 하나 이상의 유형의 누클레오시드를 갖는 올리고누클레오티드이다. 이러한 하이브리드 올리고누클레오티드의 한가지 바람직한 예는 리보누클레오티드 또는 2' 치환된 리보누클레오티드 영역, 및 데옥시리보누클레오티드 영역을 포함한다(참조: Metelev 및 Agrawal, 미국 특허 제5,652,355호, 제6,346,614호 및 제6,143,881호).
본원에 사용된 것으로서, 용어 "2차 구조"는 분자간 및 분자내 수소 결합을 말한다. 분자내 수소 결합은 스템-루프 구조를 형성한다. 분자간 수소 결합은 듀플렉스 핵산 분자의 형성을 가져온다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "약"은, 정확한 수가 중요하지 않음을 의미한다. 즉, 올리고누클레오티드내 누클레오시드의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 수의 누클레옷드 잔기를 갖거나, 하나 내지 수개의 첨가적인 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드가 본 발명의 목적을 위하여 상술한 양태 각각의 균등물로서 고려된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "상보성"은 핵산에 하이브리드화하는 능력을 가지는 것을 의미한다. 이러한 하이브리드화는, 통상 상보성 가닥 사이에 수소 결합을 형성한 결과, 바람직하게는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 후스틴 염기 쌍(Hoogsteen base pair)을 형성하지만, 다른 양식의 수소 결합 및 염기 적층(base stacking) 또한 하이브리드화를 초래할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은, 면역자극 활성이 감소된 핵산을 제공한다. 이와 관련하여, 핵산은 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, 1- (2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O- 치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이며, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하는 올리고누클레오티드 서열을 포함하며, 올리고누클레오티드 서열은 올리고누클레오티드 서열의 5'-말단에 2차 구조를 갖는다. 통상 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다.
일부 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 2 내지 약 50개 누클레오티드인 올리고누클레오티드이다. 특정 양태에서, 면역자극 핵산은, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드인 올리고누클레오티드 서열이다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드 각각은 잔기가 약 3 내지 약 35개 누클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30개 누클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 20개 누클레오시드 잔기를 갖는다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드는 약 5 내지 약 18개 또는 약 5 내지 약 14개의 누클레오시드 잔기를 갖는다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "약"은 정확한 수가 중요하지 않음을 의미한다. 즉, 올리고누클레오티드내 누클레오시드의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 수의 누클레오시드 잔기를 갖거나, 하나 내지 수개의 첨가적인 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드가 상술한 양태 각각의 균등물로서 고려된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 11개의 누클레오티드를 갖는다.
특정의 양태에서, 면역자극 활성이 감소된 핵산은 5'-말단 스템 루프 2차 구조를 형성한다. 일부 양태에서, 면역자극 활성이 감소된 핵산은 상보성 서열과 수소 결합에 의해 5'-말단에 2차 구조를 갖는다. 특정의 양태에서, 면역자극 활성이 감소된 핵산은 SEQ ID NO.: 5, 6, 7, 10, 15, 16 및 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 제3 측면은 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하는 면역자극 핵산을 제공하며, 여기서, 면역자극 핵산은 2차 구조를 갖는다. 당해 측면에서, 면역자극 핵산은 하기식 I에서 상세히 나타낸 구조를 포함한다:
도메인 A-도메인 B-도메인 C (I)
도메인은, 길이가 약 2 내지 약 12개 누클레오티드일 수 있다. 도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이며, G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하거나 함유하지 않는 회문식 또는 자가-상보성 도메인을 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5' 또는 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA일 수 있다. 특정의 바람직한 양태에서, 면역조절 디누클레오티드느 CpG가 아니다.
특정 양태에서, 도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 지닐 것이다.
하기 "X"로 나타낸 바와 같은 도메인 B는 3'-5' 결합, 2'-5' 결합, 3'-3' 결합, 포스페이트 그룹, 누클레오시드, 또는 지방족, 방향족, 아릴, 사이클릭, 키랄, 아키랄, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 지방산, 모노-, 트리- 또는 헥사폴리에틸렌 글리콜, 또는 헤테로사이클릭 잔기일 수 있는 비-누클레오시드 결합일 수 있는, 도메인 A 및 C를 연결하는 링커이다.
도메인 C는 CpG, C*pG, C*pG*, CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, l- (2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 기타 피리미딘 누클레오시드 유사체이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 푸린 누클레오시드 유사체이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 디누클레오시드를 갖거나 갖지 않을 수 있는 회문식 또는 자가-상보성 서열을 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5', 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA 폴리 I-폴리 C일 수 있다. 특정의 바람직한 양태에서, 면역자극 디누클레오티드는 CpG가 아니다. 일부 양태에서, 도메인 B는 "이뮤노머"라고 언급되는 도메인 A 및 도메인 C의 올리고누클레오티드를 연결하는 비-누클레오티드 링커이다. 특정의 바람직한 양태에서, 도메인 C는 디누클레오티드 CpG, C*pG, C*pG* 또는 CpG*를 갖지 않는다.
일부 양태에서, 상기식 I에 함유된 올리고클레오타이드는, 길이가 약 2 내지 약 50개 누클레오티드이다. 특정 양태에서, 상기식 I에 함유된 올리고누클레오티드는, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드이다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드 각각은 약 3 내지 약 35개 누클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30개 누클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 20개 누클레오시드 잔기를 갖는다. 일부 양태에서, 올리고누클레오티드는 약 5 내지 약 18개, 또는 약 5 내지 약 14개의 누클레오시드 잔기를 갖는다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "약"은 정확한 수가 중요하지 않음을 의미한다. 즉, 올리고누클레오티드내 누클레오시드의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 수의 누클레오시드 잔기를 갖거나, 하나 내지 수개의 첨가적인 누클레오시드 잔기를 갖는 올리고누클레오티드가 상술한 양태 각각의 균등물로서 고려된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 올리고누클레오티드는 11개의 누클레오티드를 갖는다.
비-제한적인 예로서, 당해 측면의 특정 양태에서 면역자극 핵산은 하기식 II로 상세히 나타낸 구조를 가질 것이다.
Figure 112005072530017-PCT00004
당해 분야의 숙련가가 잘 인지하는 바와 같이, 분자의 3' 말단에는 2차 구조 성분이 분자내 스템-루프의 형태로 존재한다.
비-제한적인 예로서, 당해 측면의 특정 양태에서 면역자극 핵산은 하기식 III에 상세히 나타낸 구조를 가질 것이다.
Figure 112005072530017-PCT00005
상기식 III으로 나타낸 구조는 본원에서 "말단 다이머(terminal dimmer)"로 언급되는데, 이는, 2개의 3' 말단의 서열이 분자간 수소 결합을 허용하는 상보성이므로 2개 분자의 3' 말단이 차단되기 때문이다. 또한, 도메인 A 및 A'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고, 도메인 B 및 B'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있으며, 도메인 C 및 C'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
비-제한적인 예로서, 당해 측면의 특정의 양태에서, 면역자극 핵산은 하기식 IV에 상세히 나타낸 구조를 가질 것이다.
Figure 112005072530017-PCT00006
당해 분야의 숙련가가 인지할 수 있는 바와 같이, 나타낸 분자의 3' 말단은, 3' 말단의 상보성 서열이 당해 영역에 수소 결합되므로 2차 구조를 갖는다. 특정의 양태에서, 리간드와 같은 분자는 세포 흡수를 용이하게 하거나 분자의 안정성을 개선시키기 위하여 3'-말단에 부착될 수 있다.
본 발명의 일부 핵산 분자의 비-제한적인 예를 표 1에 나타낸다.
표 1
Figure 112005072530017-PCT00007
Figure 112005072530017-PCT00008
Figure 112005072530017-PCT00009
Figure 112005072530017-PCT00010
*: 상부 경우-PS; 하부 경우-PO; 굵은 글씨-2'-O-메틸-리보누클레오티드(서열 26 및 27); G-2'-데옥시-7-데아자-G(서열 28); G -araG (서열 29); X-C3-링커(서열 37 및 38).
대안적으로, 본 발명의 핵산 분자는 비-누클레오티드 링커에 의해 연결된 2개의 이뮤노머일 수 있다. 당해 분자의 비-제한적인 대표적 예를 표 2에 나타낸다.
표 2
Figure 112005072530017-PCT00011
Figure 112005072530017-PCT00012
*상부 경우-PS; 하부 경우-PO, X-C3-링커; Y-테트라에틸렌글리콜 링커; Z-헥사에틸렌글리콜 링커, 굵은 글씨-2'-O-메틸리보누클레오티드(서열 44 및 57); G-2'-데옥시-7-데아자-G (서열 45).
특정의 양태에서, 본 발명의 면역자극 핵산은 SEQ ID NO.: 1 내지 38로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 면역자극 핵산은 SEQ ID NO.: 39 내지 68로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 면역자극 올리고누클레오티드는 식 5'-Pyr-Pur-3'(여기서, Pyr은 천연 피리미딘 누클레오시드 또는 이의 유사체이고 Pur은 천연의 푸린 누클레오시드 또는 이의 유사체이다)의 면역자극 디누클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "피리미딘 누클레오시드"는, 누클레오시드의 염기 성분이 피리미딘 염기인 누클레오시드를 말한다. 유사하게, 용어 "푸린 누클레오시드"는, 누클레오시드의 염기 성분이 푸린 염기인 누클레오시드를 말한다. 본 발명의 목적을 위해, "합성" 피리미딘 또는 푸린 누클레오시드는 비-천연적으로 존재하는 피리미딘 또는 푸린 염기, 비-천연적으로 존재하는 당 잔기 또는 이의 조합을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서 바람직한 피리미딘 누클레오시드는 하기식 V의 구조를 갖는다:
Figure 112005072530017-PCT00013
상기식에서,
D는 수소 결합 공여체이고;
D'는 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체(acceptor), 친수성 그룹, 소수성 그룹, 전자 흡인 그룹 및 전자 공여 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 그룹이고;
A'는 수소 결합 수용체, 친수성 그룹, 소수성 그룹, 전자 흡인 그룹 및 전자 공여 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
X는 탄소 또는 질소이고;
S'는 펜토즈 또는 헥소즈 당 고리이거나, 또는 비-천연적으로 존재하는 당이다.
바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 잔기, 변형된 포스페이트 잔기, 또는 다른 누클레오시드 또는 누클레오시드 유사체에 피리미딘 누클레오시드를 연결시키기에 적합한 다른 링커 잔기로 유도체화된다.
바람직한 수소 결합 공여체는 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 수소 결합 수용체는 C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예를 들면, 사이토신의 N3를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 식 V에서 염기 잔기는 비-천연적으로 존재하는 피리미딘 염기이다. 비-천연적으로 존재하는 피리미딘 염기의 바람직한 예는 5-하이드록시사이토신, 5-하이드록시메틸사이토신, N4-알킬사이토신, 바람직하게는 N4-에틸사이토신, 및 4-티오우라실을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 식 V에서 당 잔기 S'는 비-천연적으로 존재하는 당 잔기이다. 본 발명의 목적을 위해, "천연적으로 존재하는 당 잔기"는 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하는 당 잔기, 예를 들면, 리보스 및 2'-데옥시리보스이며 "비-천연적으로 존재하는 당 잔기"는 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하지는 않지만, 올리고누클레오티드에 대한 골격에서 사용될 수 있는 당, 예를 들면, 헥소즈이다. 아라비노즈 및 아라비노즈 유도체는 바람직한 당 잔기의 예이다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에서 바람직한 푸린 누클레오시드 유사체는 하기식 VI의 구조를 갖는다:
Figure 112005072530017-PCT00014
상기식 VI에서,
D는 수소 결합 공여체이고;
D'는 수소, 수소 결합 공여체 및 친수성 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며;
A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 그룹이고;
X는 탄소 또는 질소이며;
각각의 L은 C, O, N 및 S로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
S'는 펜토즈 또는 헥소즈 당 고리, 또는 비-천연적으로 존재하는 당이다.
바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 잔기, 변형된 포스페이트 잔기 또는 피리미딘 누클레오시드를 다른 누클레오시드 또는 누클레오시드 유사체에 연결시키기에 적합한 기타 링커 잔기로 유도체화된다.
바람직한 수소 결합 공여체는 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 수소 결합 수용체는 C=O, C=S, -N02 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예를 들면 구아닌의 N1을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 식 VI중 염기 잔기는 비-천연적으로 존재하는 푸린 염기이다. 바람직한 비-천연적으로 존재하는 푸린 염기의 예는 6-티오구아닌 및 7-데아자구아닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 식 VI에서 당 잔기 S'는 상기식 V에서 기술한 바와 같이, 천연적으로 존재하는 당 잔기이다.
제4 측면에서, 본 발명은 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 CpG-함유 올리고누클레오티드의 5'-말단에 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 도입시킴을 포함한다. 당해 측면의 일부 양태에서, 2차 구조는 스템-루프 구조이다. 당해 측면의 특정 양태에서, 2차 구조는 상보성 서열을 올리고누클레오티드 서열의 5'-말단에 수소결합시킴으로써 수득한다.
제5 측면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 당해 방법은 면역자극 올리고누클레오티드의 3'-말단에 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 도입시킴을 포함한다. 당해 측면의 일부 양태에서, 2차 구조는 스템-루프 구조이다. 당해 측면의 특정 양태에서, 2차 구조는 상보성 서열을 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단에 대한 수소결합시킴으로써 수득한다.
제6 측면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 면역자극 올리고누클레오티드의 3'-말단 또는 5'-말단에 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 도입시킴을 포함한다. 당해 측면의 일부 양태에서, 2차 구조는 스템-루프 구조이다. 당해 측면의 특정 양태에서, 2차 구조는 상보성 서열을 올리고누클레오티드 서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 수소결합시킴으로써 수득한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "조절하는" 또는 "조절하다"는 모 면역자극 핵산의 면역자극 활성과 비교하여 면역자극 핵산의 면역자극 활성을 증가시키거나 감소시키는 것을 의미한다.
제7 측면에서, 본 발명은 약제학적 조성물을 제공한다. 당해 조성물은 본 발명의 제1, 제2 및 제3 측면에 기술된 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "생리학적으로 허용되는"은 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면의 조성물의 효능을 방해하지 않으며 세포, 세포 배양물, 조직 또는 기관과 같은 생물학적 시스템과 양립가능한 물질을 언급한다. 바람직하게는, 생물학적 시스템은 척추동물과 같은 살아있는 유기체이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "담체"는 약제학적 제형에 사용하기 위해 당해 분야에 잘 공지된 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질 또는 기타 물질을 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특성은 특정 적용을 위한 투여 경로에 따를 것임은 이해될 것이다. 이들 물질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형의 제조는 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, ISBN: 0-912734- 04-3)에 기술되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암 백신을 포함할 수 있으며, 상기 암백신은EFG, 항-이디오타입 암 백신, Gp75 항원, GMK 흑색종 백신, MGV 강글리오사이드 콘쥬게이트 백신, Her2/new, 오바렉스(Ovarex), M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL 써라토프(theratope), BLP25 (MUC-1), 지질 이디오타입 백신, 멜라킨(Melacine), 펩타이드 항원 백신, 독소/항원 백신, MVA-계 백신, PACIS, BCG 백신, TA-HPV, TA-CIN, DISC-바이러스 및 ImmunCyst/TheraCys으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 암 백신을 포함한다.
본 발명의 각종 양태에서, 본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 측면은 항원과 공유 결합되거나, 항원과 작동적으로 결합될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "작동적으로 결합(operatively associated with)"은 본 발명의 제1, 제2, 제3 측면의 조성물 및 항원 둘다의 활성을 유지하는 결합을 언급한다. 이러한 작동적 결합의 비-제한적 예는 동일한 리포좀 또는 기타 이러한 전달 비히클 또는 시약의 일부임을 포함한다. 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면의 조성물이 항원에 공유 결합된 양태에서, 이러한 공유 결합은 바람직하게는 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 측면의 조성물에서 면역자극 올리고누클레오티드의 접근가능한 5' 말단을 제외한 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 항원은 누클레오시드간 결합에 부착될 수 있거나 비-누클레오티드 링커에 부착될 수 있다. 달리는, 항원은 자체로 비-누클레오티드 링커일 수 있다.
본 발명의 각종 양태에서, 본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 측면은 안티센스 활성을 지닌 올리고누클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "안티센스 활성"은, 세포 또는 동물내로 도입되는 경우, 올리고누클레오티드가 상보성인 유전자의 발현을 감소시키는 것을 의미한다.
본 발명의 각종 양태에서, 본 발명의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 측면의 조성물은 아프타머(aptamer)인 올리고누클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 아프타머는 다른 분자에 결합하는 이들의 능력을 기초로 무작위적인 풀로부터 선택된 핵산 분자이다. 핵산, 단백질, 소형 유기 화합물 및 심지어 전체 유기체와 결합하는 아프타머가 선택되어 왔다. 이들 신규 분자는 의약 및 기술에서 많은 잠재적인 용도를 지닌다[참조: Burgstaller P., et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 5: 690-700 (2002)].
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비강내, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 적합한 경로에 의해서, 유전자 총(gene gun), 경피 패취 또는 안구 점적 또는 구강세척 형태에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 목적하는 효과, 예를 들면, 암의 치료, 감염의 치료 및 자가면역 질병의 치료를 달성하는데 효과적인 기간 및 용량으로 공지된 과정을 사용하여 전달될 수 있다. 전신 투여되는 경우, 약제학적 조성물은 본 발명의 제1, 제2 및/또는 제3 측면의 조성물의 혈액 수준을 약 0.0001 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰로 하는데 충분한 용량으로 투여된다. 국소 투여의 경우, 이보다 훨씬 더 적은 농도가 효과적일 수 있고, 훨씬 더 높은 농도가 허용될 수 있다. 바람직하게는, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머의 총 용량은 약 0.0001mg/환자 체중 kg/일 내지 약 200mg/체중 kg/일의 범위이다. 단일 치료 에피소드로서 개개인에게 본 발명의 하나 이상의 치료학적 조성물의 치료학적 유효량을 동시에 또는 순서대로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 면역자극 올리고누클레오티드가 이뮤노머로서 고안된 경우, 하기 프로토콜을 합성에 사용하였다. 본 발명의 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 도 9 및 도11에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 자동화된 합성기 및 포스포르아미다이트 방법을 사용하여 편리하게 합성할 수 있다. 일부 양태에서, 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머를 선형 합성 방법(도 9)으로 합성한다. 이러한 합성을 위한 대표적인 링커는 도 10에 나타낸다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "선형 합성(linear synthesis)"은 이뮤노머의 한쪽 말단에서 개시하여 다른 말단으로 선형으로 진행하는 합성을 말한다. 선형 합성은, 동일하거나 동일하지 않은(길이, 염기 조성 및/또는 혼입된 화학적 변형의 측면에서) 단량체 단위가 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머에 혼입되도록 한다.
이뮤노머를 합성하는 대체 양식은 "병행 합성(parallel synthesis)"이며, 여기서, 합성은 중심 링커 잔기로부터 밖으로 진행된다(참조: 도 11). 이러한 합성 방법의 대표적인 링커는 도 12에 나타낸다. 고체 지지체에 부착된 링커가 미국 특허 제5,912,332호에 기술된 바와 같이 병행 합성에 사용될 수 있다. 달리는, 조절된 공극 유리 지지체에 부착된 포스페이트와 같은 일반적인 고체 지지체를 사용할 수 있다.
이뮤노머의 병행 합성은 선형 합성에 비해 몇가지 장점을 갖는다: (1) 병행 합성은 동일한 단량체 단위의 혼입을 허용한다; (2) 선형 합성과는 달리, 양쪽(또는 모든) 단량체 단위가 동시에 합성되므로, 합성 단계의 수 및 합성에 요구되는 시간이 단량체 단위의 것과 동일하다; 및 (3) 합성 단계의 감소는 최종 이뮤노머 생성물의 순도를 증가시키고 수율을 증가시킨다.
선형 합성 또는 병행 합성 프로토콜에 의한 합성 말기에, 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 또는 이뮤노머는 변형된 누클레오시드가 혼입되는 경우, 진한 암모니아 용액으로 또는 포스포르아미다이트 공급업자에 의해 추천되는 바와 같이 편리하게 탈보호시킬 수 있다. 생성물인 면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머는 바람직하게는 역상 HPLC에 의해 정제되고, 탈트리틸화되며, 탈염되고 투석된다.
CpG DNA 18 내지 21의 자극 도메인은 5'-말단에 사람 특이적인 'GTCGTT'모티프를 함유하였다. 구조 도메인 영역내에서 7, 11, 15, 또는 19개 염기쌍(bp) 헤어핀 스템-루프 구조물을 형성한 상보성 서열은 자극 도메인의 3'-말단에 근접하게 혼입되었다(표 3). 자가-안정화된 CpG DNA는 자극 도메인이 구조 모티프(염기-짝지음)를 함유하지 않고 CpG 자극 모티프가 구조 도메인에 존재하지 않도록 설계되었다. CpG DNA에 있어서 자극 모티프 및 2차 구조 둘다는 pDC 활성화에 요구된다. CpG DNA는 배양물중 사람 B 세포의 강력한 농도-의존적 증식을 유도하였다. 그러나, B-세포 증식은 헤어핀 듀플렉스 길이에 의존적이지는 않았다. pDC 및 B 세포 둘다를 활성화시키는 자가-안정화된 CpG DNA의 능력은 암, 천식, 알레르기 및 감염성 질병에 대해 사용하기 위한 치료제, 및 B 세포 또는 pDC의 어느 한쪽을 자극하는 것보다 더욱 강력한 보조제로서의 개발을 허용할 수 있다.
서열 22는 자극 도메인을 갖지만 이의 3'-말단에서 헤어핀 구조(구조 도메인)를 형성하는데 필요한 상보성을 함유하지 않았다. 대조적으로, CpG DNA 30은 헤어핀 구조(구조 도메인)를 형성하였으나 자극 모티프를 갖지 않았다(표 3). 서열 69, 서열 19의 유사체는 헤어핀 서열의 가닥 중 하나에 2'-O-메틸-리보누클레오티드를 함유하였다.
CpG DNA에 의한 안정한 헤어핀 구조의 형성은 열 용융(도 3) 및 EMSA 연구로 확인하였다. 예측한 바와 같이 CpG DNA 18 내지 21은 상이한 길이 및 구조의 올리고누클레오티드 마커와 비교하여 변성되지 않은 폴리아크릴아미드 겔상에서 요구된 이동성을 갖는 밴드를 나타내어 헤어핀 구조 형성이 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).
사람 pDCs는 TLR9을 발현하며 CpG DNA-유도된 IFN-α의 주요 공급원인 것으로 여겨진다. CpG DNA 18 내지 21은 도 13에 나타낸 바와 같이 사람 pDC 배양물에서 IFN-α의 생산을 유도하였다. IFN-α 분비 수준은 헤어핀 듀플렉스 구조의 길이에 의존한다. 19-bp 듀플렉스를 형성한 CpG DNA 21은 가장 높은 수준의 IFN-α를 유도하였다(도 13). 비록 반응은 공여체에 따라 달랐지만, 이러한 경향은CpG DNA 간에 일치하였다(도 13). CpG DNA 70, 즉 폴리(dG) 서열을 함유하고 사람 pDC를 자극하는 것으로 알려진 회문식 CpG 올리고는 포지티브 대조군으로서 사용되었다.
모든 4개의 CpG DNA는 배양물에서 사람 B 세포의 강력한 농도-의존적 증식을 유도하였다(도 14). 그러나, B-세포 증식은 헤어핀 듀플렉스의 길이에 의존하지 않았다(도 13).
CpG DNA 18, 19, 22 및 30에 의한 IFN-α 분비를 유도하기 위한 사람 pDC의 활성화를 연구하였다. 앞서의 시험에서 관측된 바와 같이, 18 및 19는 둘 모두 IFN-α의 생산을 유도하였다(도 15). 자극 모티프를 지니지만, 2차 구조를 지니지 않는 서열 22, 및 자극 모티프는 없지만 2차 구조를 지닌 서열 30은 pDC 배양물에서 IFN-α 생산을 유도하지 못하였다(도 15). 이러한 결과는, CpG DNA에서 자극 모티프 및 2차 구조 둘다가 pDC 활성화에 필요하였음을 제시한다.
도 4B에 나타낸 B-세포 증식에 대한 데이터는, 2차 구조를 형성한 CpG DNA 18 및 19와, 2차 구조를 형성하지 않은 22가 강력한 B-세포 증식을 유도하였음을 나타낸다. 자극 모티프를 가지지 않았던 서열 30은 최소의 증식을 유도하였으며, 이는, CpG 모티프가 활성에 필요하지만 2차 구조는 필요하지 않음을 나타낸다.
TLR9는 CpG DNA를 특이적으로 인지하지만 RNA는 인지하지 않는다. 그러나, 플랭킹 서열내 CpG 디누클레오티드의 말단에 2'-O-알킬리보누클레오티드의 혼입은 허용된다. 본 발명자들은, 루프 영역을 포함하는 3'-말단에 근접하는 스템 서열을 2'-O-메틸리보누클레오티드로 대체시킨 CpG DNA 19의 유사체를 합성하였다. CpG DNAs 69 및 19 둘다는, 사람 pDC 배양물에서 IFN-α 분비(도 16) 및 사람 B-세포 배양물에서 증식을 유사한 수준으로 유도하였다(도 16). 이러한 결과는, 2'-O-메틸리보누클레오티드 치환 또는 이러한 치환에 의해 부여된 구조적 변화가 pDC 또는 B-세포 활성화를 방해하지 않았음을 제시하였다.
톨-유사 수용체(toll-like receptor) 9(TLR9)는 메틸화되지 않은 CpG DNA를 인지하고 스트레스-키나제 및 NF-κB 경로를 포함하는 수개의 시그날링 경로를 활성화시켜 IFN-α/β, IFN-γ, IL-12, IL-6, 및 TNF-α를 포함하는 다수의 케모킨 및 사이토킨을 시험관내 및 생체내 분비시킨다. 그러나, CpG DNA 및 이의 수용체 TLR9간의 직접적인 상호작용은 아직 확립되지 않았다. CpG DNA 면역 자극에서 대체 수용체 또는 공-수용체의 가능학 역활은 제안되어 있다. 상이한 골격, 서열 및 구조를 갖는 CpG DNA는 세포-특이적이지만 TLR9-의존적인 양식으로 면역계를 활성화시킨다.
CpG DNA의 3'-말단에서 2차 구조의 최적 배치는 상이한 사이토킨 프로파일을 유도할 수 있다. 사람-특이적인 모티프를 갖는 CpG DNA 구조물은 사람 pDC 배양물에서 높은 수준의 IFN-α를 유도하였으며, 이러한 사실은, 2차 구조가 pDC 활성화에 필요할 수 있음을 제안한다(데이터는 나타내지 않음).
본 CpG DNA는 2개의 구별되는 도메인인, 5'-말단에 CpG-모티프를 갖는 자극 도메인 및 3'-말단에 헤어핀 듀플렉스 형성을 허용하는 서열을 함유하는 구조 도메인을 함유하도록 설계되었다. 분자내 2차 구조를 형성하는 이들 CpG DNA의 능력은 편재하는 3'-누클레아제에 대해 추가의 안정성을 제공하므로, 자가-안정화된 CpG DNA로 명명된다. 자가-안정화된 CpG DNA는, 분자간 2차 구조를 형성하고 구조 도메인 영역내에 CpG 모티프를 갖지 않는 앞서 보고된 회문식 CpG DNA와는 상이하다.
CpG 디펩타이드를 함유하는 회문식 서열은 면역 세포를 활성화시켜 IFN-α/β 및 -γ를 생산한다. 본원에 기술된 자가-안정화된 CpG DNA는 본 발명자들이 사람 B 세포 및 pDC 둘다에 의해 인지된 CpG DNA의 자극성 및 구조 특징을 분석하도록 하였다. CpG DNA 18 내지 21은 헤어핀 듀플렉스 길이-의존적 양식으로 pDC를 활성화시켰다. 구조 도메인을 갖지 않는 대조군 DNA 분자 22 및 자극 도메인을 갖지 않는 대조 DNA 30은 둘 모두 IFN-α 분비를 유도하지 않았으며, 이는, 자극 및 구조 도메인이 둘다 pDC 활성화에 요구되었음을 나타낸다. 대조적으로, B-세포 활성화는 자극 도메인만을 필요로 하였으며 구조 도메인은 필요로 하지 않았다. CpG DNA 20 및 21의 보다 낮은 활성은, CpG DNA내 2차 구조가 B-세포 활성화를 방해할 수 있음을 제시하였다. 실제로, 구조 도메인을 갖지 않고 CpG DNA 18와 누클레오티드 길이가 동일한 CpG DNA 30은 B 세포를 19의 것과 동일한 수준으로 활성화시켰고, 이는 단일 가닥 DNA가 B-세포 활성에 바람직함을 제시한다. 30을 사용하여 관측한 B 세포의 보다 낮은 활성화는 비-특이적인 활성과 관련될 수 있다.
CpG DNA 69를 사용한 본 결과는, DNA/RNA 하이브리드 이종듀플렉스(heteroduplex)가 pDC 또는 B 세포 활성화를 방해하지 않았음을 제시하였다. 이러한 결과는, 구조 도메인 영역내에서 2'-O-메틸리보누클레오티드 치환에 의해 부과된 B 대 A의 구조적 변화는 면역 자극에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았으므로, 이들 위치에서 치환이 허용됨을 제시하였다.
결론적으로, 본 연구에서, 본 발명자들은 사람 면역 세포의 TLR9-포지티브 서브세트인 pDC 및 B 세포의 최적 활성화를 위해 CpG DNA내 자극 및 구조 도메인의 비례적 조합을 제안하였다. 본원에 나타낸 당해 연구는 본 발명자들이 pDC 및 B 세포의 활성화에 필요한 CpG DNA의 특이적 특성을 결정하도록 하였다. CpG 자극 모티프는 사람 B 세포의 활성화에 필요한 반면, 자극 모티프 및 추가의 구조 도메인 둘다는 사람 pDC의 활성화에 요구되었다. 동일한 TLR9 수용체가 2개의 상이한 세포 집단에서 자극을 위해 이의 리간드의 상이한 구조적 특성을 필요로 하는 이유는 명확하지 않다. 이러한 사실은, pDC 및 B 세포에서 TLR9 시그날링에 있어 상이한 어댑터(adapter) 분자의 관여를 나타낼 수 있다. pDC 및 B 세포 둘다를 활성화시키는 자가-안정화된 CpG DNA의 능력은 암, 천식, 알레르기 및 감염성 질병에 대해 사용하기 위한 치료제 및 B 세포 또는 pDC중의 어느 하나를 자극하는 것보다 더욱 강력한 보조제로서의 개발을 허용할 것이다.
표 3
CpG DNA의 개략도a, 서열, 2차 구조 및 Tms
Figure 112005072530017-PCT00015
a: 필수적인 자극 도메인 및 구조 도메인을 나타내는 신규 CpG DNA 설계의 개략적인 그림(박스). 구조 도메인이 아닌, 자극 도메인은 적절한 CpG 모티프를 함유하였음;
b: 70을 제외한 모든 서열을 포스포로티오에이트 변형시켰고, 69에서 이탤릭체로 나타낸 누클레오티드는 2'-O-메틸리보누클레오티드를 나타내며, 70에서 밑줄친 누클레오티드는 포스포디에스테르 골격을 나타냄;
c: ND-측정되지 않았음.
하기 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 양태를 추가로 설명하기 위해 의도된 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 올리고누클레오티드 합성, 정제 및 열 용융 프로파일
CpG 올리고를 DNA 합성기(PerSeptive Biosystem's 8909 Expedite DNA synthesizer)(제조원: PerSeptive Biosystem, Boston, MA)를 사용하여 1 내지 2μmole 규모로 합성하였다. dA, dG, dC, 및 T의 포스포르아미다이트를 업자(PE Biosystems: Foster City, CA)로부터 입수하였다. 문헌[참조: Iyer R. P., et al. (J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990)]에 기술되어 있는 바와 같이, 요오드 산화제를 사용하여 포스포로티오에이트 골격 변형을 수득하였다. 모든 올리고를 표준 프로토콜을 사용하여 탈보호시키고, HPLC로 정제하고, USP 품질의 관주용 멸균수에 대해 투석하였다. 올리고를 동결건조시키고 다시 증류수에 용해하고 농도를 260nm에서 UV 흡광도로부터 측정하였다. 모든 올리고를 CGE 및 MALDI-TOF 질량 분광계(제조원: Applied Biosystem's Voyager-DETM STR BiospectrometryTM Workstation)로 순도 및 분자량 각각에 대해 특성화하였다. 완전한 길이의 올리고의 순도는 90 내지 96%의 범위이고 나머지는 CGE 및/또는 변성 PAGE로 측정한 것으로서 1개 내지 2개 누클레오티드 만큼 더 짧았다(n-1 및 n-2). 모든 올리고는 리물루스 검정(Limulus assay)[제조원: Bio-Whittaker, 현재 제조사명: Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. , Walkersville, MD]으로 측정한 것으로서 <0.1 EU/mL의 내독소를 함유하였다.
열 용융 연구를 150mM NaCl 및 2mM MgCl2를 함유하는 10mM 인산수소이나트륨, pH 7.2±0.2의 1mL 용액속에서 수행하였다. 당해 용액을 95℃에서 10분 동안 가열하고 실온으로 서서히 되도록 한 후 4℃에서 밤새 저장하였다. 올리고누클레오티드 가닥의 최종 농도는 2.0μM이었다. UV 열 용융 측정을 260nm에서 펠티어 열 조절기(peltier thermal controller) 및 개인용 컴퓨터에 부착되고 1cm 경로 길이의 석영 큐베트를 사용하는 퍼킨-엘머 람다(Perkin-Elmer Lambda) 20 분광광도계상에서 0.5℃/분의 가열 속도로 수행하였다. 용융 온도(Tm)를 1/2 해리 온도로서 간주하고 최초 유도체 플롯으로부터 수득하였다. 각각의 Tm 평균은 2개 또는 3개의 별개 시험의 평균이고 값은 ±1.0℃내였다.
(1)'GACGTT' 헥사머 모티프를 함유하는 17-량체 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드(1)를 포지티브 대조군으로서 사용하였다(표 1). 올리고누클레오티드 2 내지 7은 서열 1의 일부에 상보성인 5개, 11개 또는 17개의 누클레오티드의 추가 서열을 함유한다(표 1). 연장부는 3'-(2 내지 4) 또는 5'-말단(5 내지 7)에 연결되며 문헌[참조: Hirao, I., et al., Nucleic Acids Res. 22: 576-582 (1994)]에 기술된 바와 같이 안정한 스템-루프의 형성을 허용하는 GAA 삼량체를 함유한다. 서열 2 내지 7에 의한 헤어핀의 형성을 UV 영 용융 실험으로 측정하였다. 150mM NaCl 및 2mM MgCl2를 함유하는 10 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.2중에서 40 내지 66℃의 Tm 값은, 서열 2 내지 7이 실험 조건하에서 안정한 2차 구조를 형성하였음을 제시한다(표 1). 10㎍/ml의 올리고 18, 19, 20 및 21에 노출된 후 형질세포모양 수지상 세포에서 인터페론 α(INF-α).
실시예 2: 세포 배양 조건 및 시약
4 내지 8주된 BALB/c, C57BL/6 또는 C3H/HeJ 마우스의 비장 세포를 문헌[참조: Zhao, Q., et al., Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996) 및 Branda, R. F., et al., Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)]에 기술된 바와 같이 RPMI 완전 배지에서 배양하였다. 쥐 J774 대식구(버지니아주 마나사스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)를 10%(v/v) 우태아 혈청 및 항생제(100 IU/mL의 페니실린 G/스트렙토마이신)으로 보충된 둘베코 변형된 이글스 배지에서 배양하였다. 모든 다른 배양 시약은 업자[Mediatech (Gaithersburg, MD)]로 부터 입수하였다.
실시예 3: 비장 세포 증식 검정
통상적으로, 마우스(Balb-C) 비장 세포를 0.1, 1.0 및 10.0㎍/ml의 농도의 CpG 올리고와 함께 48시간 동안 배양하고 세포 증식을 문헌[참조: Zhao, Q., et al., Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996)]에 기술된 바와 같이 3H-우리딘 혼입으로 측정하였다.
초기에, 올리고 1, 2 및 5를 배양물속에서 BALB/c 마우스 비장 세포의 증식을 유도하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 올리고 1 및 2는 용량-의존적인 비장 세포 증식을 유도하였다. 스템-루프 구조를 갖지 않았던 모 올리고 1은 1.0㎍/mL의 농도에서 6.3±0.3의 증식 지수를 나타내었다(도 1A). 3'-말단에서 스템-루프 구조를 형성하는 올리고 2는 동일한 농도에서 9.0±2.5의 증식 지수를 제공하였다. 그러나, 5'-말단에서 스템-루프를 형성하는 올리고 5는 동일한 농도에서 1.5±0.3라는 더 낮은 증식 지수를 나타내었으며, 이는 PBS 대조군의 것과 유사하다(도 1A).
실시예 4: 사이토킨 유도 검정
마우스 비장 또는 J774 세포를 각각 5x105 또는 1x106 세포/mL을 사용하여 24-웰 디쉬에서 플레이팅하였다. TE 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA)중에 용해된 CpG를 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 또는 10.0㎍/mL의 최종 농도로 세포 배양물에 가하였다. 그 다음, 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하고 상층액을 ELISA 검정을 위해 수집하였다. 시험을 각각의 CpG 올리고에 대해 2 또는 3회 및 각각의 농도에서 3중으로(triplicate) 수행하였다. IL-12 및 IL-6의 분비는 문헌[참조: Bhagat L., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003)]에 기술된 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 사이토킨 항체 및 표준물을 포함하는 필요한 시약은 업자[BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA)]로부터 입수하였다.
CpG 올리고는 IL-12 및 IL-6을 포함하는 다수의 사이토킨을 유도한다. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 시험 화합물 1 및 2는 농도-의존적 메카니즘으로 IL-12 및 IL-6를 유도하였다. 모 올리고 1은 3.0㎍/mL의 농도에서 1514±113 pg/mL의 IL-12 및 7681±839pg/mL의 IL-6을 유도하였다(도 2). 3'-헤어핀을 함유하는 올리고 2는 약간 많은 양의 IL-12(1771±286 pg/mL)을 유도하였고 더 적은 양의 IL-6(2582±300pg/mL)을 유도하였다. 그러나, 5'-헤어핀을 갖는 올리고 5는 사이토킨 분비를 유도하지 않았다. 이들 결과는, 안정한 헤어핀 루프가 5'-말단에서는 면역자극 활성을 차단하나, 3'-말단에서는 그렇지 않음을 나타낸다.
CpG DNA 3 및 4는 GACGTT 모티브에 걸쳐 연장되어 있거나, 5'-말단까지 이르는 3'-헤어핀 스템을 갖는다. 그 결과, 이들은 상부 가닥에 GACGTT와 하부에 이의 상보성 서열 AACGTC이 있는 2개의 CpG 모티프를 함유한다(표 1). 올리고 6 및 7은 유사하게 긴 5'-헤어핀을 갖는다. 2개의 CpG 모티프를 가짐에도 불구하고, 올리고 3 및 4는 올리고 1과 비교하여 보다 낮은 IL-12 및 최소의 IL-6을 유도하거나 IL-6을 전혀 유도하지 않는다(도 2). 5'-헤어핀을 갖는 올리고 6 및 7 둘다도 동일한 시험 조건하에서 사이토킨 분비를 유도하지 않았다. 올리고 4에 의한 최소의 사이토킨 유도는, 5'-말단으로의 스템 구조의 연장이 해로우며 아마도 인지 및 후속적인 면역 자극을 방해함을 제시한다. 이러한 결과는, 5'-말단으로 연장된 듀플렉스(duplex) 스템 구조가 면역 자극을 방해함을 제시한다.
올리고 4의 5'-말단에서 염기 짝지음이 면역 자극을 억제하므로, 양쪽 말단에서 듀플렉스 형성을 CpG DNA 8 내지 10을 사용하여 시험하였다. 올리고 8은 18개의 누클레오티드와 올리고 1과 같은 동일한 GACGTT 모티프를 함유한다. 올리고 9 및 10에서 자가-상보성 3'- 또는 5'- 연장은 점성 말단으로서 작용하여 8개 염기쌍의 이량체를 형성한다(표 1). 이들 듀플렉스는 면역 자극에서 길이-의존적 포스포로티오에이트 효과를 감소시키기 위해 포스포디에스테르 결합을 함유한다. 올리고 9은 3'-말단에서 이량체화되며 이의 모 올리고 8과 같이 유사한 IL-12 및 IL-16 유도를 나타내었다(도 3). 그러나, 5'-듀플렉스를 형성하는 올리고 10은 최소의 IL-12 및 IL-6을 유도하였다(도 3). 즉, 5'-듀플렉스를 형성하는 특성은 면역 자극 상실과 강력하게 관련되어 있다. 이러한 결과는, 3'-말단이 아닌 5'-말단에서 듀플렉스가 면역자극을 방해함을 제안한다.
J774 세포 배양물에서 사이토킨 분비를 유도하는 올리고 1 내지 7의 능력을 또한 시험하였다. 10㎍/mL 올리고 농도에서 수득한 IL-12 및 IL-6 데이터(도 5)는 비장세포 배양 검정에서 수득한 결과를 보충한다. 이 결과는 또한, 수용체가 CpG DNA 서열을 이의 5'-말단으로부터 판독하고 접근가능한 5'-말단이 CpG DNA 활성에 필요함을 입증한다. CpG 올리고에서 5'-말단으로 연장하는 2차 구조의 존재는 수용체 판독을 방해함으로써 면역자극 활성을 방해할 수 있다.
형질세포모양 수지상 세포에서 인터페론 α(INF-α)의 생산을 유도하는 본 발명의 올리고누클레오티드의 능력을 또한 시험하였다. 이들 세포의 분리 및 배양은 문헌[참조: Krug, A., et al., Eur. J. Immunol, 31: 2154- 2163 (2001)]을 참조한다. 결과는 도 6, 7 및 8에 나타낸다. 이들 결과는, 3'-헤어핀 구조를 갖는 본 발명의 핵산 분자가 인터페론-α의 생산을 자극하는 반면, 5'-말단 헤어핀 구조가 면역자극 작용, 즉, 이들 분자의 인터페론-α의 생산을 억제함을 나타낸다.
실시예 5: 마우스 비장비대 검정
암컷 BALB/c 마우스(4 내지 4주, 19 내지 21gm)를 3마리 마우스의 그룹으로 나누었다. CpG 올리로를 멸균된 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 용해하고 마우스에 5mg/kg의 투여량으로 피하(SC) 투여하였다. 마우스를 48시간 후 희생시키고 비장을 수거하여 문헌[참조: Zhao, Q., et al., BiochemPharmacol. 51: 173-182 (1996)) 및 Branda, R. F., et al., Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)]에 기술된 바와 같이 칭량하였다.
올리고누클레오티드 1, 2 및 5를 BALB/c 마우스에 5mg/kg의 투여량으로 투여하여 이들이 생체내에서 비장 확대를 유발하는지를 측정하였다. PBS를 주사한 마우스의 대조 그룹과 비교하여 올리고 처리에 있어서 비장 중량의 증가는 CpG 올리고의 면역자극 활성의 결과인 것으로 생각된다[참조: Zhao, Q., et al. Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996); Branda, R. F., et al. Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)]. 생체내 연구의 결과를 도 1B에 나타낸다. 스템-루프 구조를 갖지 않았던 올리고 1, 및 5'-말단에서 스템-루프를 형성하는 서열을 가진 올리고 5는 PBS를 주사한 대조 그룹과 비교하여 비장 중량이 각각 약 29% 및 15% 증가하였다. 대조적으로, 3'-말단에 스템-루프 구조를 가진 올리고 2는 대조 그룹과 비교하여 약 48%의 비장 중량의 증가를 유발하였다.
실시예 6: NF -κB 경로의 활성화
톨-유사 수용체 9(TLR9)는 세균, 플라스미드 및 합성 DNA에서 메틸화되지 않은 CpG-디누클레오티드를 인지하고[참조: Hemmi H., et al. Nature 408 : 740-745 (2000)] 스트레스 키나제[참조: Yi A. K., et al. J. Immunol. 161: 4493- 4497 (1998)] 및 NF-1κB 경로[참조; Stacey K. J., et al. J. Immunol. 157: 2116-2122 (1996)]를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. CpG DNA로 처리한 J774 세포에서 NF-κB 활성화를 수행하고 문헌[참조: Yu D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002) 및 Bhagat L., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003)]에 기술된 바와 같이 EMSA로 분석하였다.
J774에서 NK-αB 경로의 올리고 1 내지 7에 의한 활성화를 EMSA를 사용하여 쥐 대식구 세포 핵 추출물속에서 시험하였다. 도 4는 수득된 결과를 나타낸다. 모 올리고 1 및 8 둘다는 복합체의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 NF-κB를 활성화시켰다. 3'-말단에 루프를 가진 올리고 2 내지 4는 또한 적합한 복합체의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 NF-κB를 활성화시켰다. 대조적으로, 5'-말단 루프 올리고 5 내지 7은 J774 세포에서 전사 인자 NF-κB를 활성화시키지 못하였다(도 4). 대조군 비-CpG 올리고는 동일한 시험 조건하에서 NF-κB를 활성화시키지 못하였다(레인 C). 당해 결과는 마우스 비장 세포 배양물 검정에서 수득한 데이터와 일치한다.
실시예 7: 전기영동 이동성 쉬프트 검정( Electrophoretic mobility shift assay)( EMSA )
약 0.2 OD의 CpG DNA 및 기타 마커를 25μL의 100 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨, pH 7.2 완충액에 용해시키고 90℃로 15분 동안 가열하고 실온으로 되도록 한 후 겔상에서 분석할 때까지 4℃에서 저장하였다. 제조한 DNA 샘플을 글리세롤 완충액과 혼합하고 15% 비-변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 용해시켰다. 겔을 260nm UV 광하에 가시화시켰다.
실시예 8: 사람 B 세포 및 형질세포모양 가지줄기 세포(pDC)의 분리
새로이 채혈한 건강한 자원자 혈액의 PBMC(공급처: CBR Laboratories, Boston, MA)를 피콜 밀도 구배 원심분리 방법(Histopaque-1077, Sigma)로 분리하고 B 세포를 제조업자 지시에 따라 CD19 세포 분리 키트(제조원: Miltenyi Biotec)를 사용하여 포지티브 선택에 의해 PBMC로부터 분리하였다.
실시예 9: B 세포 증식 검정
약 1X105 B 세포/200㎕를 0.3, 1.0, 3.0 또는 10.0 ㎍/mL 농도의 CpG DNA로 64시간 동안 자극시킨 후 0.75μCi의 [3H]-티미딘으로 펄싱하고 8시간 후 수거하였다. 방사활성의 혼입을 액체 신틸레이션 계수기로 측정하였다. 표 4는 10.0㎍/mL의 최종 농도에서 6개의 CpG DNA에 대한 B 세포 증식의 평균 ± SD를 나타낸다.
표 4: 이뮤노머 구조 및 사람 B-세포 증식 검정에서 면역자극 활성(72시간)
Figure 112005072530017-PCT00016
Figure 112005072530017-PCT00017
보통체는 포스포로티오에이트 결합을 나타내며; 밑줄친 부분은 2'-OMe 리보누클레오티드를 나타내고; X는 C3-링커를 나타낸다.
실시예 10: 사람 pDC 배양물 및 IFN -α ELISA
pDC를 사람 PBMC로부터 BDCA-4 세포 분리 키트(제조원: Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 분리하였다. pDC를 1x106 세포/mL, 200μL/웰을 사용하여 96-웰 플레이트상에 플레이팅하였다. 올리고누클레오티드를 0.3, 1.0, 3.0 또는 10.0 ㎍/mL의 최종 농도로 세포 배양물에 가하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후에 상층액을 수거하고 ELISA 키트(PBL)를 사용하여 IFN-α, IL-6 및 IL-10에 대해 검정하였다. 표 5A 및 5B는 10.0㎍/mL의 농도의 6개 올리고누클레오티드에 대한 IFN-α의 평균±SD를 나타낸다.
표 5A 이뮤노머 구조 및 사람의 수지상 세포 검정에서 면역자극 활성(24시간)
Figure 112005072530017-PCT00018
Figure 112005072530017-PCT00019
Figure 112005072530017-PCT00020
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 밑줄친 부분은 2'-OMe리보누클레오티드를 나타내며; X는 C3-링커를 나타낸다.
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신
표 5B 이뮤노머 구조 및 사람의 수지상 세포 검정에서 면역자극 활성(24시간)
Figure 112005072530017-PCT00021
Figure 112005072530017-PCT00022
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 이탤릭체 부분은 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
밑줄은 2'-OMe-누클레오시드를 나타낸다.
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신, G1=2'-데옥시-7-데아자구아노이즈
X=글리세롤 링커
실시예 11: 사이토신 분석
척추동물 세포, 바람직하게는 BALB/c 마우스 비장 세포 또는 사람 PBMC에서 IFN-2 및 IL-6의 분비를 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 사이토킨 항체 및 사이토킨 표준물을 포함하는 요구되는 시약은 업자(PharMingen, San Diego, CA)로부터 입수하였다. ELISA 플레이트(Costar)를 PBSN 완충액(PBS/0.05% 나트륨 아지드, pH 9.6)에서 5㎍/mL의 적절한 항체와 함께 4℃에서 배양한 다음, 37℃에서 PBS/1% BSA로 30분 동안 차단시켰다, 세포 배양 상층물 및 사이토킨 표준물을 PBS/10% FBS로 적절히 희석하고, 플레이트에 3회 가하고, 25℃에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 1㎍/mL의 적절한 바이오티닐화된 항체로 덮고 25℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 이후에 플레이트를 PBS-T 완충액(PBS/0.05% 트윈 20)으로 완전히 세척하고 스트렙토아비딘 콘쥬게이트 퍼옥시다제(제조원: Sigma, St. Louis, MO)를 가한 후 25℃에서 1.5시간 동안 더 배양하였다. 당해 플레이트를 Sure BlueTM(제조원: Kirkegaard and Perry) 발색성 시약으로 전개시키고 반응을 정지 용액(제조원: Kirkegaard and Perry)을 가하여 종결시켰다. 색상 변화를 Ceres 900 HDI 분광광도계(제조원: Bio-Tek Instruments)로 측정하였다.
사람 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 건강한 자원자의 말초 혈액으로부터 피콜-파크(Ficoll-Paque) 밀도 구배 원심분리(제조원: Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)에 의해 분리하였다. 요약하면, 헤파린 처리한 혈액을 코니칼 원심분리기에서 히스토파크(Histopaque)-1077(동 용적)상에 적층시키고 실온에서 400xg로 30분 동안 원심분리시켰다. 단층 세포를 함유하는 연막(buffy coat)을 조심스럽게 제거하고 등장성 포스페이트 완충 염수(PBS)를 사용하여 250xg에서 10분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하였다. 수득되는 세포 펠렛을 L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지(제조원: MediaTech, Inc., Herndon, VA)속에 재현탁시키고 10% 열 불활성화시킨 FCS 및 페니실린-스트렙토마이신(lOOU/ml)을 보충시켰다. 세포를 올리고누클레오티드의 존재 또는 부재하에 다양한 기간 동안 24 웰 플레이트에서 1X106 세포/ml/웰로 배양하였다. 배양 기간 말기에, 상층액을 수거하여, IL-6(제조원: BD Pharmingen, San Diego, CA) 및 IFN-α(제조원: BioSource International)을 포함한 다양한 사이토킨에 대해 샌드위치 ELISA에 의해 검정할 때까지, -70℃에서 동결시켰다. 당해 결과를 하기 표 6A 및 6B에 나타낸다.
모든 예에서, 세포 배양 상층액중 IFN-2 및 IL-6의 수준을 IFN-2 및 IL-6 각각에 대해 동일한 시험 조건하에 작성한 표준 곡선으로부터 계산하였다.
표 6 이뮤노머 구조 및 사람 PBMC 검정에서 면역자극 활성(24 시간)
Figure 112005072530017-PCT00023
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 밑줄친 부분은 2'-OMe-리보누클레오티드를 나타내며; X는 C3-링커를 나타낸다.
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신
표 6B 이뮤노머 구조 및 사람 PBMC 검정에서 면역자극 활성(24시간)
Figure 112005072530017-PCT00024
Figure 112005072530017-PCT00025
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 이탤릭체 부분은 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
밑줄친 부분 = 2'-OMe-누클레오시드
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신, G1=2'-데옥시-7-데아자구아노이즈
X=글리세롤 링커
실시예 12: B 세포 검정
B-세포를 1x106 세포/mL, 200 μL/웰을 사용하여 96-웰에서 플레이팅하였다. 올리고누클레오티드를 0.3, 1.0, 3.0, 또는 10.0㎍/mL의 최종 농도로 세포 배양물에 가하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후에 상층액을 수거하고 ELISA 키트(PBL에 의해 제공)를 사용하여 IL-6에 대해 검정하였다. 표 7은, 10.0㎍/mL의 최종 농도에서 올리고누클레오티드를 사용한 공여체 5 내지 10의 평균 ± SD를 나타낸다.
표 7 이뮤노머 구조 및 사람 B-세포에서 면역자극 활성
Figure 112005072530017-PCT00026
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 밑줄친 부분은 2'-OMe-리보누클레오티드를 나타내며; X는 C3-링커를 나타낸다.
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신
유동 세포계산 분석
CD69 및 CD86의 세포 표면 마커를 업자(BD Pharmingen; San Diego, USA)로부터 입수한 항-사람 CD69-Fitc 및 CD86-Fitc를 사용하는 Coulter Epics-XL 유동 세포계산기로 검출하였다. 염색 방법은 하기와 같이 간략히 기술하였다. 활성화된 배양 세포를 4℃에서 1시간 동안 염색 완충액(1% BSA 및 0.1% NaN3를 포함하는 PBS)중에서 10% 사람 AB 혈청(제조원: Sigma)으로 차단시키고 4℃에서 밤새 항체로 염색하였다. PBMC(4x105)을 CD69-Fitc 및 CD86-Fitc으로 염색하였다. PDC(2x105)를 CD86-Fitc으로 염색하였다. 세포 염색 데이터를 획득하고 Coulter System II 소프트웨어로 분석하였다.
표 8 이뮤노머 구조 및 사람 PBMC로부터 BC의 발현(24시간)
Figure 112005072530017-PCT00027
Figure 112005072530017-PCT00028
Figure 112005072530017-PCT00029
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 이탤릭체 부분은 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
밑줄친 부분 = 2'-OMe-누클레오시드.
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신, G1=2'-데옥시-7-데아자구아노이즈
X=글리세롤 링커
표 9 이뮤노머 구조 및 사람 PBMC로부터 DC의 발현(24시간)
Figure 112005072530017-PCT00030
Figure 112005072530017-PCT00031
보통체 부분은 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 이탤릭체 부분은 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
밑줄친 부분 = 2'-OMe-누클레오시드
R=2'-데옥시-7-데아자구아노신, G1=2'-데옥시-7-데아자구아노이즈
X=글리세롤 링커
균등물
상기 발명을 명확성 및 이해의 목적을 위해 일부 상세히 기술하였지만, 당해 분야의 숙련가라면 당해 기술의 판독으로부터 형태 및 세부사항에 있어서의 각종 변화가 본 발명의 영역 및 첨부한 청구의 범위 영역에 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> HYBRIDON, INC. <120> STABILIZED IMMUNOMODULATORY OLIGONUCLEOTIDES <130> HYB-021PC <140> PCT/US04/018745 <141> 2004-06-10 <150> 60/477,608 <151> 2003-06-11 <150> 60/499,038 <151> 2003-08-29 <150> 60/504,279 <151> 2003-09-18 <160> 76 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> phosphorothioate <400> 1 ctgtctgacg ttctctg 17 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 2 ctgtctgacg ttctctggaa cagag 25 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> phosphorothioate <400> 3 ctgtctgacg ttctctggaa cagagaacgt c 31 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> phosphorothioate <400> 4 ctgtctgacg ttctctggaa cagagaacgt cagacag 37 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 5 gacaggaact gtctgacgtt ctctg 25 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> phosphorothioate <400> 6 aacgtcagac aggaactgtc tgacgttctc tg 32 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> phosphorothioate <400> 7 cagagaacgt cagacaggaa ctgtctgacg ttctctg 37 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> phosphorothioate <400> 8 ctatctgacg ttctctgt 18 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(26) <223> phosphodiester <400> 9 ctatctgacg ttctctgtgt gatcac 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (9)..(26) <223> phosphorothioate <400> 10 gtgatcacct atctgacgtt ctctgt 26 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> phosphorothioate <400> 11 ctgtctgtcg ttctctg 17 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 12 ctgtctgtcg ttctctggaa cagag 25 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> phosphorothioate <400> 13 ctgtctgtcg ttctctggaa cagagaacga c 31 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> phosphorothioate <400> 14 ctgtctgtcg ttctctggaa cagagaacga cagacag 37 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 15 gacaggaact gtctgtcgtt ctctg 25 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> phosphorothioate <400> 16 aacgacagac aggaactgtc tgacgttctc tg 32 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(37) <223> phosphorothioate <400> 17 cagagaacga cagacaggaa ctgtctgtcg ttctctg 37 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 18 tcgtcgttga gctctgaaag agctc 25 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothioate <400> 19 tcgtcgttgt gagctctgtg aaacagagct cac 33 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> phosphorothioate <400> 20 tcgtcgttgc acagagctct gctgaaagca gagctctgtg c 41 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(49) <223> phosphorothioate <400> 21 tcgtcgttgc tgacagagct ctgctatgaa atagcagagc tctgtcagc 49 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 22 tcgtcgttgt gctctgaact tgctc 25 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothioate <400> 23 tcgtcgttgt gtgctctgtg aacatcagtc tac 33 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (19)..(25) <223> phosphodiester <400> 24 tcgtcgttga gctctgaaag agctc 25 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (9)..(19) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (20)..(22) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (23)..(33) <223> phosphodiester <400> 25 tcgtcgttgt gagctctgtg aaacagagct cac 33 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (16)..(25) <223> 2'-O-methyl-ribonucleotide <400> 26 tcgtcgttga gctctgaaag agctc 25 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (20)..(33) <223> 2'-O-methyl-ribonucleotide <400> 27 tcgtcgttgt gagctctgtg aaacagagct cac 33 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> 2'-deoxy-7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 2'-deoxy-7-deaza-G <400> 28 tcgtcgttga gctctgaaag agctc 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> araG <220> <221> modified_base <222> (6) <223> araG <400> 29 tcgtcgttga gctctgaaag agctc 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 30 tgctgcttga gctctgaaag agctc 25 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate <400> 31 tcttgacgtt ctctct 16 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothioate <400> 32 tcttgacgtt ctctctgaaa gagag 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (20)..(25) <223> phosphodiester <400> 33 tcttgacgtt ctctctgaaa gagag 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (17)..(25) <223> phosphorothioate <400> 34 tcttgacgtt ctctctgaaa gagag 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (20)..(25) <223> phosphodiester <400> 35 tcttgacgtt ctctctgaaa gagag 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphodiester <400> 36 tcttgacgtt ctctctgaaa gagag 25 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphorothioate <400> 37 tcttgacgtt ctctct 16 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> phosphodiester <400> 38 tcttgacgtt ctctct 16 <210> 39 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothioate <400> 39 tcgtcgtt 8 <210> 40 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> 2'-deoxy-7-deaza-G <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 2'-deoxy-7-deaza-G <400> 40 tcgtcgtt 8 <210> 41 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothioate <400> 41 ttgtgctt 8 <210> 42 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> phosphorothioate <400> 42 tcgtcgttg 9 <210> 43 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> phosphodiester <400> 43 tcgtcgttg 9 <210> 44 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphodiester <400> 44 tcgtcgtt 8 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (10)..(21) <223> phosphodiester <400> 45 tcgtcgttgt gcatcgatgc a 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (10)..(21) <223> phosphorothioate <400> 46 tcgtcgttgt gcatcgatgc a 21 <210> 47 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphorothioate <400> 47 cagagctctg 10 <210> 48 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphorothioate <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> 2'-O-methylribonucleotide <400> 48 cagagcucug 10 <210> 49 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphorothioate <400> 49 cacacctctg 10 <210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(12) <223> phosphodiester <400> 50 ggcatcgatg cc 12 <210> 51 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> phosphodiester <400> 51 gagctc 6 <210> 52 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> phosphodiester <400> 52 gacagagctc tgtc 14 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> phosphodiester <400> 53 gctgacagag ctctgtcagc 20 <210> 54 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphodiester <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> 2'-O-methylribonucleotide <400> 54 cagagcucug 10 <210> 55 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> phosphodiester <400> 55 tgcatcgatg ca 12 <210> 56 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> phosphodiester <400> 56 acgtagctac gt 12 <210> 57 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> phosphorothioate <400> 57 tgcatcgatg ca 12 <210> 58 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> phosphorothioate <400> 58 acgtagctac gt 12 <210> 59 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphodiester <400> 59 cagagctctg 10 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (9)..(25) <223> 2'-OMe-ribonucleotide <400> 60 tcgtcgttga gcucugaaag agcuc 25 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (9)..(29) <223> 2'-OMe-ribonucleotide <400> 61 tcgtcgttga gcucucugaa agagagcuc 29 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (9)..(33) <223> 2'-OMe-ribonucleotide <400> 62 tcgtcgttga gcucucugug aaacagagag cuc 33 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanosine <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanosine <400> 63 tcntcnttgt gagctctgtg aaacagagct cac 33 <210> 64 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanosine <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanosine <400> 64 tcntcntt 8 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanosine <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(33) <223> 2'-OMe-ribonucleotide <400> 65 tcntcnttgt gagctctgtg aaacagagcu cac 33 <210> 66 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (3) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanoise <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 2'-deoxy-7-deazaguanoise <400> 66 tcntcntt 8 <210> 67 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> phosphorothiate <400> 67 agagag 6 <210> 68 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> phosphodiester <400> 68 agagag 6 <210> 69 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (20)..(33) <223> 2'-O-methylribonucleotide <400> 69 tcgtcgttgt gagctctgtg aaacagagcu cac 33 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> phosphorothiate <220> <221> misc_feature <222> (3)..(15) <223> phosphodiester <220> <221> misc_feature <222> (16)..(20) <223> phosphorothiate <400> 70 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothiate <400> 71 gtgagctctg tgaaacagag ctcac 25 <210> 72 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> 2'-OMe-ribonucleotide <400> 72 cagagcucug 10 <210> 73 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (1)..(25) <223> 2'-OMe-nucleoside <400> 73 gugagcucug ugaaacagag cucac 25 <210> 74 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphodiester <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> 2'-OMe-nucleoside <400> 74 cagagcucug 10 <210> 75 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphorothiate <400> 75 ctcacctctg 10 <210> 76 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> phosphorothiate <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> 2'-OMe-nucleoside <400> 76 cucaccucug 10

Claims (20)

  1. CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드이고, G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하고 3'-말단에 2차 구조를 갖는 올리고누클레오티드 서열을 포함하는 면역자극 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이, 길이가 약 12 내지 약 50개 누클레오티드인 면역자극 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드인 면역자극 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이 3'-말단 스템 루프 2차 구조를 형성하는 면역조절 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이 회문식 또는 상보성 서열을 갖는 면역자극 핵산.
  6. 제1항에 있어서, SEQ ID NO.: 2, 3, 4, 9, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 38로 이루어진 그룹 중에서 선택된 면역자극 핵산.
  7. CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드이고, G*는 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 비-천연 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하고 5'-말단에 2차 구조를 갖는 올리고누클레오티드 서열을 포함하는, 면역자극 활성이 감소된 면역자극 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이, 길이가 약 12 내지 약 50개 누클레오티드인 면역자극 핵산.
  9. 제7항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이, 길이가 약 12 내지 약 26개 누클레오티드인 면역자극 핵산.
  10. 제7항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이 5'-말단 스템 루프 2차 구조를 형성하는 면역자극 핵산
  11. 제7항에 있어서, 올리고누클레오티드 서열이 5'-말단에서 회문식 또는 상보성 서열을 갖는 면역자극 핵산.
  12. 제7항에 있어서, SEQ ID NO.: 5, 6, 7, 10, 15, 16 및 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된 면역자극 핵산
  13. CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 갖는 올리고누클레오티드의 면역자극 활성을 감소시키거나 제거하는 방법으로서, 2차 구조를 포함하는 핵산 서열을 상기 올리고누클레오티드의 5'-말단에 도입시킴을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 2차 구조가 스템-루프 구조인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 2차 구조가 회문식 또는 상보성 서열에 대한 수소 결합인 방법.
  16. 제1항에 따른 면역자극 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제7항에 따른 면역자극 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 2개 이상의 올리고누클레오티드를 포함하고, 2차 구조를 지니며, 하기식 I을 포함하는 면역자극 핵산:
    도메인 A-도메인 B-도메인 C (I)
    상기식 I에서,
    도메인 A는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 비천연 피리미딘 누클레오시드이며, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하거나 함유하지 않는 회문식 또는 자가-상보성 도메인을 갖거나 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5' 또는 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA일 수 있고, 도메인 B는 3'-'5' 결합, 2'-5' 결합, 3'-3' 결합, 포스페이트 그룹, 누클레오시드 또는 지방족, 방향족, 아릴, 사이클릭, 키랄, 아키랄, 펩타이드, 탄수화물, 지질, 지방산, 모노- 트리- 또는 헥사폴리에틸렌 글리콜, 또는 헤테로사이클릭 잔기일 수 있는 비-누클레오시드 링커일 수 있는, 도메인 A 및 C를 결합시키는 링커이며, 도메인 C는 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*(여기서, C는 사이티딘 또는 2'-데옥시사이티딘이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-푸린, 2'-디데옥시-5-할로사이토신, 2'-디데옥시-5-니트로사이토신, 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노사이티딘, 2'-O-치환된 아라비노사이티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시사이티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-사이티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 또는 기타 비천연 피리 미딘 누클레오시드이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'-치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 기타 비천연 푸린 누클레오시드이며, p는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 누클레오시드간 결합이다)이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디누클레오티드를 함유하거나 함유하지 않는 회문식 또는 자가-상보성 서열을 가지거나 가지지 않는 5'-3' 또는 3'-5', 2'-5'DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA 폴리 I-폴리 C일 수 있다.
  19. 제18항에 있어서, SEQ ID NO.: 1 내지 38로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 면역자극 핵산.
  20. 제18항에 있어서, SEQ ID NO.: 39 내지 68로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 면역자극 핵산.
KR1020057023889A 2003-06-11 2004-06-10 안정화된 면역조절 올리고뉴클레오티드 KR101137572B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47760803P 2003-06-11 2003-06-11
US60/477,608 2003-06-11
US49903803P 2003-08-29 2003-08-29
US60/499,038 2003-08-29
US50427903P 2003-09-18 2003-09-18
US60/504,279 2003-09-18
PCT/US2004/018745 WO2005001055A2 (en) 2003-06-11 2004-06-10 Stabilized immunomodulatory oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060007444A true KR20060007444A (ko) 2006-01-24
KR101137572B1 KR101137572B1 (ko) 2012-05-30

Family

ID=33556397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057023889A KR101137572B1 (ko) 2003-06-11 2004-06-10 안정화된 면역조절 올리고뉴클레오티드

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8008267B2 (ko)
EP (2) EP2371834B1 (ko)
JP (2) JP4874801B2 (ko)
KR (1) KR101137572B1 (ko)
CN (1) CN102604957B (ko)
AU (2) AU2004252505B2 (ko)
CA (1) CA2528597C (ko)
ES (1) ES2569927T3 (ko)
MX (1) MXPA05013658A (ko)
WO (1) WO2005001055A2 (ko)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
CA2423487C (en) * 2000-09-26 2015-12-15 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
CN100334228C (zh) 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) * 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AU2003300919A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 Coley Pharmaceutical Gmbh 5' cpg nucleic acids and methods of use
US7851453B2 (en) * 2003-01-16 2010-12-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
EP2371834B1 (en) * 2003-06-11 2016-02-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
AU2004259204B2 (en) * 2003-07-15 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synergistic stimulation of the immune system using immunostimulatory oligonucleotides and/or immunomer compounds in conjunction with cytokines and/or chemotherapeutic agents or radiation therapy
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
CA2540949A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
WO2005060377A2 (en) * 2003-12-08 2005-07-07 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
US9090673B2 (en) 2003-12-12 2015-07-28 City Of Hope Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide
JP2007523173A (ja) * 2004-02-20 2007-08-16 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 修飾免疫調節オリゴヌクレオチドにより誘導された強力な粘膜免疫応答
US7427405B2 (en) * 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
EP2901856B1 (en) * 2004-06-15 2017-08-09 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US8076068B2 (en) * 2005-09-14 2011-12-13 Gunther Hartmann Method for determining immunostimulatory activity of RNA oligonucleotides
EA013375B1 (ru) * 2005-09-16 2010-04-30 Коли Фармасьютикал Гмбх МОДУЛЯЦИЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ КОРОТКОЙ ИНТЕРФЕРИРУЮЩЕЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (siРНК) С ПОМОЩЬЮ МОДИФИКАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
US7470674B2 (en) * 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
JP2009521218A (ja) * 2005-12-20 2009-06-04 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 異なる長さのパリンドロームセグメントを含むパリンドローム免疫調節オリゴヌクレオチド（ｉｍｏ（ｔｍ））の免疫賦活作用
AU2006336242A1 (en) * 2005-12-20 2007-07-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of toll-like receptors containing CG dinucleotide modifications
EP2405002B1 (en) * 2006-02-15 2014-09-24 AdiuTide Pharmaceuticals GmbH Compositions and methods for oligonucleotide formulations
AU2007235231B2 (en) * 2006-04-07 2012-04-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds for TLR7 and TLR8
CA2653939C (en) 2006-05-31 2013-01-22 Toray Industries, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides and use thereof in pharmaceuticals
AU2007283022B2 (en) 2006-08-08 2011-07-28 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universitat Bonn Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides
MX2009003398A (es) 2006-09-27 2009-08-12 Coley Pharm Gmbh Analogos de oligonucleotidos cpg que contienen analogos t hidrofobos con actividad inmunoestimuladora mejorada.
AU2007333146A1 (en) * 2006-12-12 2008-06-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synthetic agonists of TLR9
KR101343489B1 (ko) * 2007-07-09 2013-12-20 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）화합물
CA2693266C (en) * 2007-08-01 2015-06-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of tlr9
WO2009141146A1 (en) 2008-05-21 2009-11-26 Gunther Hartmann 5' triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
AU2010229835B2 (en) 2009-03-25 2015-01-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions for stimulation of mammalian innate immune resistance to pathogens
KR101670319B1 (ko) 2009-09-15 2016-10-28 타이젠 바이오테크놀러지 컴퍼니 리미티드 Ｈｃｖ 프로테아제 저해제
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
WO2013012875A2 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Mount Sinai School Of Medicine Bacterial rnas as vaccine adjuvants
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
KR101898177B1 (ko) * 2013-01-08 2018-09-12 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 톨－유사 수용체 기반 면역 반응을 조절하기 위한 면역 조절 올리고누클레오티드 （ｉｒｏ） 화합물
CN105579582A (zh) 2013-07-25 2016-05-11 埃克西奎雷股份有限公司 用于预防和治疗用途的作为免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体
US10568898B2 (en) 2013-08-13 2020-02-25 Northwestern University Lipophilic nanoparticles for drug delivery
CA2953216C (en) 2014-06-04 2020-12-22 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
US10286065B2 (en) 2014-09-19 2019-05-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
CA2968531A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
DE102015008536A1 (de) * 2015-07-02 2017-01-05 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Diskontinuierliche Oligonukleotid-Liganden
US10449212B2 (en) 2015-07-09 2019-10-22 National Institute For Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
TW202334427A (zh) 2016-01-26 2023-09-01 日商日產化學工業股份有限公司 單股寡核苷酸
CN109843302B (zh) 2016-07-06 2022-11-29 F-星治疗公司 用于治疗疾病的化合物、组合物和方法
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
KR20190096936A (ko) 2016-09-15 2019-08-20 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 암 치료를 위하여 tlr9 작용제를 사용한 면역 조정
CN110234548B (zh) * 2017-01-24 2022-08-23 Cts公司 用于车辆制动踏板的位置和力传感器组件
CN110337495B (zh) 2017-02-06 2024-03-29 日产化学株式会社 单链寡核苷酸
WO2018201090A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Exicure, Inc. Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US11433131B2 (en) 2017-05-11 2022-09-06 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (SNAs)
AU2018385256A1 (en) * 2017-12-15 2020-06-11 Bayer Animal Health Gmbh Immunostimulatory compositions
EP3966331A4 (en) * 2019-05-10 2023-07-05 Microbio (Shanghai) Co., Ltd. DIMER CPG OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN MODULATION OF IMMUNE RESPONSE

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149797A (en) * 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5495006A (en) * 1991-09-27 1996-02-27 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Antiviral polynucleotide conjugates
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6346614B1 (en) * 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
TW244371B (ko) 1992-07-23 1995-04-01 Tri Clover Inc
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5912332A (en) * 1996-07-26 1999-06-15 Hybridon, Inc. Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides
US5921332A (en) 1997-12-29 1999-07-13 Sandvik Ab Apparatus for facilitating removal of a casing of an overburden drilling equipment from a bore
EP1322655B1 (en) 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
CA2423487C (en) * 2000-09-26 2015-12-15 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
ATE447043T1 (de) * 2000-12-14 2009-11-15 Gen Probe Inc Verfahren und kits zur verbesserung der hybridisierungsraten von polynukleotiden
DE60142410D1 (de) * 2000-12-27 2010-07-29 Dynavax Tech Corp Immunomodulatorische polynukleotide und verfahren zur deren verwendung
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
US8153141B2 (en) * 2002-04-04 2012-04-10 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory G, U-containing oligoribonucleotides
EP1393745A1 (en) 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5'ends
US7851453B2 (en) * 2003-01-16 2010-12-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
EP2371834B1 (en) * 2003-06-11 2016-02-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immunomodulatory oligonucleotides
EP2901856B1 (en) * 2004-06-15 2017-08-09 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
CA2589406A1 (en) * 2004-12-09 2006-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inducing an immune response in a mammal and methods of avoiding an immune response to oligonucleotide agents such as short interfering rnas
WO2007047396A2 (en) * 2005-10-12 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US8383598B2 (en) * 2005-10-12 2013-02-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US8426375B2 (en) * 2005-10-12 2013-04-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
US8399423B2 (en) * 2005-10-12 2013-03-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
AU2007235231B2 (en) * 2006-04-07 2012-04-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds for TLR7 and TLR8
US8377898B2 (en) * 2006-10-12 2013-02-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
KR101343489B1 (ko) * 2007-07-09 2013-12-20 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）화합물
CA2693266C (en) * 2007-08-01 2015-06-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel synthetic agonists of tlr9
EP2207787B1 (en) * 2007-11-06 2014-11-12 AdiuTide Pharmaceuticals GmbH Immune stimulatory oligoribonucleotide analogs containing modified oligophosphate moieties
WO2010053978A2 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of toll-like receptor 5 expression by antisense oligonucleotides
WO2010093705A2 (en) * 2009-02-10 2010-08-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Synthetic rna-based agonists of tlr7
EP2588143B1 (en) * 2010-06-25 2017-02-22 Idera Pharmaceuticals, Inc. Novel agonists of toll-like receptor 3 and methods of their use
CA2817891C (en) * 2010-11-19 2021-10-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (iro) compounds to modulate toll-like receptor based immune response

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011200272B2 (en) 2011-12-22
AU2004252505B2 (en) 2010-10-28
EP1631576A2 (en) 2006-03-08
EP2371834B1 (en) 2016-02-17
JP2011200248A (ja) 2011-10-13
US20050026861A1 (en) 2005-02-03
AU2004252505A1 (en) 2005-01-06
CA2528597C (en) 2014-08-05
AU2011200272A1 (en) 2011-02-17
US8008267B2 (en) 2011-08-30
CN102604957A (zh) 2012-07-25
KR101137572B1 (ko) 2012-05-30
EP2371834A1 (en) 2011-10-05
MXPA05013658A (es) 2006-03-02
JP4874801B2 (ja) 2012-02-15
ES2569927T3 (es) 2016-05-13
JP2007500018A (ja) 2007-01-11
WO2005001055A2 (en) 2005-01-06
CN102604957B (zh) 2015-10-07
US8946175B1 (en) 2015-02-03
WO2005001055A3 (en) 2005-10-13
CA2528597A1 (en) 2005-01-06
EP1631576A4 (en) 2010-08-25
AU2004252505A2 (en) 2005-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101137572B1 (ko) 안정화된 면역조절 올리고뉴클레오티드
JP2007500018A6 (ja) 安定化免疫調節オリゴヌクレオチド
KR100945104B1 (ko) 5&#39; 말단의 최적 제공에 의한 올리고뉴클레오티드-기초 화합물의 면역자극 특성의 조절
EP1393745A1 (en) Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5&#39;ends
US20040198685A1 (en) Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
US20040097719A1 (en) Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5&#39; ends
KR20070028537A (ko) 면역자극 올리고누클레오티드 다량체
EP1942945B1 (en) Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
CA2630118A1 (en) Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee