CN101517082A - 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物 - Google Patents

具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物 Download PDF

Info

Publication number
CN101517082A
CN101517082A CNA2007800359671A CN200780035967A CN101517082A CN 101517082 A CN101517082 A CN 101517082A CN A2007800359671 A CNA2007800359671 A CN A2007800359671A CN 200780035967 A CN200780035967 A CN 200780035967A CN 101517082 A CN101517082 A CN 101517082A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleotide
cancer
odn
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2007800359671A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101517082B (zh
Inventor
哈拉尔德·德贝拉克
尤金·乌尔曼
玛丽昂·朱尔克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Inc
Original Assignee
Coley Pharmaceutical GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coley Pharmaceutical GmbH filed Critical Coley Pharmaceutical GmbH
Publication of CN101517082A publication Critical patent/CN101517082A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101517082B publication Critical patent/CN101517082B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及包含至少一个亲脂性取代核苷酸类似物和嘧啶－嘌呤二核苷酸的寡聚核苷酸。本发明还涉及药物组合物及其使用方法。

Description

具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
技术领域
本发明大体上涉及免疫学领域。更具体而言，本发明涉及具有增强的免疫刺激能力的治疗性寡聚核苷酸。
背景技术
细菌DNA具有激活B细胞和自然杀伤细胞的免疫刺激作用，但脊椎动物DNA则否(Tokunaga，T.等，1988，Jpn.J.Cancer Res.79：682-686；Tokunaga，T.等，1984，JNCI 72：955-962；Messina，J.P.等，1991，J.Immunol.147：1759-1764；并且在下述文件中进行了综述：Krieg，1998，In：AppliedOligonucleotide Technology，C.A.Stein和A.M.Krieg，(编)，John Wileyand Sons，Inc.，New York，NY，pp.431-448)。现已得知细菌DNA的这些免疫刺激作用是在特殊碱基内容(CpG模体)中存在未甲基化的CpG的结果，这种未甲基化的CpG在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物DNA中被甲基化并表达不足(underrepresented)(Krieg等，1995Nature374：546-549；Krieg，1999Biochim.Biophys.Acta 93321：1-10)。细菌DNA的免疫刺激作用可由含有这些CpG模体的合成寡聚脱氧核苷酸(ODN)模拟。这些CpG ODN对人和鼠白细胞(包括B细胞)增殖、细胞因子和免疫球蛋白分泌、自然杀伤(NK)细胞溶解活性和IFN-γ分泌、以及树突状细胞(DC)和其它表达共刺激分子并分泌细胞因子(尤其是在促进类Th1的T细胞应答的发展中起重要作用的类Th1细胞因子)的抗原呈递细胞的激活具有高刺激作用。天然磷酸二酯骨架CpG ODN的这些免疫刺激作用具有很高的CpG特异性，因为如果CpG模体被甲基化、变为GpC、或者被去掉或改变，则这些作用显著降低(Krieg等，1995Nature374：546-549；Hartmann等，1999Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10)。
在早期研究中，认为免疫刺激CpG模体遵循式嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶(Krieg等，1995Nature 374：546-549；Pisetsky，1996J.Immunol.156：421-423；Hacker等，1998EMBO J.17：6230-6240；Lipford等，1998Trends in Microbiol.6：496-500)。然而，现在已经清楚鼠淋巴细胞对不遵循该“式”的磷酸二酯CpG模体有很强的应答(Yi等，1998J.Immunol.160：5898-5906)，人类B细胞和树突状细胞也是如此(Hartmann等，1999Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：9305-10；Liang，1996J.Clin.Invest.98：1119-1129)。
最近已描述了数种不同类的CpG核酸。一类有可能激活B细胞，但在诱导IFN-α和NK细胞活化方面相对弱；该类被命名为B类。B类CpG核酸通常是非常稳定的，并在某些优选碱基内容(base context)中包含未甲基化的CpG二核苷酸。参见，例如，美国专利6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。另一类CpG核酸激活B细胞和NK细胞，并且诱导IFN-α；这类已被命名为C类。C类CpG核酸，如首先所表征的，通常是完全稳定的，其包含B类类型的序列和富含GC的回文或近似回文。这一类已经在2001年8月17日提交的共同未决的美国临时专利申请60/313,273、2002年8月19日提交的US 10/224,523和以国际公开号WO 03/015711公开的相关PCT专利申请PCT/US02/26468中进行了描述。
发明内容
本发明涉及一种寡聚核苷酸，其包含一种和多种能引起增强的免疫刺激能力的修饰。具体而言，本发明基于以下发现：具有至少一个亲脂性取代核苷酸类似物的特定的寡聚核苷酸亚类能非常有效地调节免疫应答。这些寡聚核苷酸能治疗性地和预防性地用于诱导免疫应答和用于治疗诸如癌症和病毒感染之类的疾病和功能紊乱。
在一个方面，本发明是一种包含序列R1YZR2的组合物，其中R1和R2表示亲脂性取代核苷酸类似物(L)、核苷酸和键(linkage)，其中R1和R2中的至少一个是亲脂性取代核苷酸类似物(L)，其中Y是嘧啶核苷酸，且其中Z是嘌呤、嘧啶或脱碱基残基(abasic residue)。
在一些实施方式中，L包含5或6元环的核碱基类似物(nucleobaseanalog)。
在本发明这一方面的其它实施方式中，L是下式I的基团：
Figure A20078003596700141
式I
该式中具有以下元素：A、B、X、D、E和F，它们是选择性地具有氢或取代基的C(碳)或N(氮)；n是0或1；虚线表示选择性的双键；其中至少一个取代基不是从下组中选择：氧代、硫代、羟基、巯基、亚氨基、氨基、甲基和氢，并且A、B、X、D、E和F原子中总共不超过3个氮(N)。在一些情况中，n是1，而在另一些情况中n是0。在一些实施方式中，A、B、X、D、E和F原子都是碳(C)。在一些实施方式中，A、B、X、D、E和F原子中的一个、两个或三个是氮(N)。根据一些实施方式，A、B、X、D、E和F原子中的至少一个被以下基团之一所取代：F、Cl、Br、I、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烯基、环烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2；-S-烷基、-SO-烷基、-SO2-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、苄基、氧代、硫代、羟基、巯基和亚氨基，其中至少一个取代基不是氧代、硫代、羟基、巯基、亚氨基、氨基或甲基。根据其它实施方式，A或E这两个原子中一个被F、Cl、Br、I、C2-C6-烷基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烯基、环烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2；-S-烷基、-SO-烷基、-SO2-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、苄基或甲基所取代，条件是如果被甲基取代，则A、B、X、D、E和F全是C。
在一些实施方式中，式I包括取代嘧啶、尿嘧啶、甲苯、咪唑或吡唑或三唑。根据其它实施方式，式I选自：5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基-尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶和2，4-二氟-甲苯。根据本发明的一个实施方式，与3至6元芳环或脂环体系相稠合。根据其它实施方式，式I与5至6元的糖部分(sugar moiety)相连接，所述5至6元糖部分包括戊糖或己糖。在一些情况下，戊糖是呋喃糖，己糖是吡喃糖，它们可选择性地被F、氨基、烷氧基、烷氧基-乙氧基、氨基丙基、烯基、炔基或O2，C4-亚烷基桥(O2，C4-alkylene bridge)所取代。在其它情况下，戊糖是核糖或脱氧核糖。
根据本发明的一些实施方式，R1和R2都是L。在一些实施方式中，R1是L，且R2是核苷酸。另一种方式，在一些情况下，R1是L，且R2是键，因此寡聚核苷酸包含结构5′R1CG 3′。其它实施方式包括这样的寡聚核苷酸：其中R1是L，R2是键，且其中R3位于R1YZ的5′，因此寡聚核苷酸包含结构5′R3R1YZ 3′。在一些实施方式中，R1是L，且R2是键，且其中第二个R1位于R1YZ的5′并与R1YZ通过一个核苷酸N隔开，因此寡聚核苷酸包含结构5′R1NR1YZ 3′。在一些情况下，寡聚核苷酸包含两个5′R1NR1YZ 3′模体。
根据一些实施方式，寡聚核苷酸包括Y，所述Y是以下嘧啶之一：胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-卤素-胞嘧啶、2-硫代-胞嘧啶、4-硫代-胞嘧啶、N3-甲基-胞嘧啶、N4-烷基-胞嘧啶或6-取代胞嘧啶。
根据一些实施方式，寡聚核苷酸包括Z，所述Z是包括下述的嘌呤核苷酸：鸟嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮-次黄嘌呤、2-氨基-嘌呤、4-硫代-嘌呤、2.6-二氨基-嘌呤、8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤、7-硫代-8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤、7-烯丙基-8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮-鸟嘌呤、8-氮-鸟嘌呤、N1-甲基-鸟嘌呤或嘌呤。在其它实施方式中，Z是包括T的嘌呤核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，R2是L，且R1是核苷酸。
根据一些实施方式，寡聚核苷酸的长度为3个核苷酸；例如，寡聚核苷酸的长度为3-6个核苷酸、长度为3-100个核苷酸或长度为7-100个核苷酸。在一些情形下，寡聚核苷酸富含T，由此使得至少80％的核苷酸是T。
本发明包括含有至少一个回文序列的实施方式。例如，在一些情况下，寡聚核苷酸包含两个回文结构。
根据本发明，一些实施方式包括一至四个未甲基化的CG二核苷酸。在一些实施方式中，包含至少一个(G)m序列，其中m为4至10。在一些情况下，至少一个但至多所有的CG二核苷酸均未被甲基化。根据一些实施方式，寡聚核苷酸另外还包含非核苷酸修饰(non-nucleotidic modification)。所述非核苷酸修饰包括但不限于：C6-C48-聚乙二醇、C3-C20-烷-二醇、C3-C18-烷基氨基连接子和C3-C18-烷基硫醇连接子、胆固醇、胆汁酸、饱和或不饱和脂肪酸、叶酸、十六烷基-甘油或二(十六烷基)甘油基团、十八烷基-甘油或二(十八烷基)-甘油基团、维生素E基团。在另一些实施方式中，本发明的寡聚核苷酸进一步包括非核苷酸分枝部分或核苷酸分枝部分。在一些实施方式中，寡聚核苷酸包括分枝部分(brancher moiety)，其中所述寡聚核苷酸具有至少两个5′-末端。
根据本发明，一些实施方式包括所述寡聚核苷酸的至少两个核苷酸具有稳定键，所述稳定键包括：硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、硼代磷酸酯键、氨基磷酸酯键或脱磷键(dephospho linkage)，它们是对映体混合物或者是对映体纯的S或R构型。
在另一些实施方式中，R1YZR2中的YZ具有磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。在一些情况下，R1YZR2中的R1Y和/或ZR2具有硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，所有其它寡聚核苷酸具有硫代磷酸酯键。
根据本发明的一些实施方式，寡聚核苷酸不含包括脂质载体在内的微载体。
根据本发明，寡聚核苷酸可以是A类寡聚核苷酸、B类寡聚核苷酸、C类寡聚核苷酸、P类寡聚核苷酸或T类寡聚核苷酸。对于本发明的B类寡聚核苷酸，一些实施方式包括序列5′TCN1TX1X2CGX3X43′，其中X1是G或A；X2是T、G或A；X3是T或C；X4是T或C；且N是任何核苷酸，N1和N2是各自由约0-25个N构成的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方式，寡聚核苷酸包括至少一个3′-3′键和/或至少一个5′-5′键。
在另一方面，本发明是本文所描述的寡聚核苷酸与抗原或诸如抗微生物剂之类的其它治疗化合物的组合物。抗微生物剂可以是，例如，抗病毒剂、抗寄生虫剂、抗细菌剂或抗真菌剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包括本文所述的寡聚核苷酸的持续释放装置(sustained release device)的组合物。
该组合物可选择性地包括药物载体和/或在输送装置中配制。在一些实施方式中，输送装置选自阳离子脂质、细胞渗入蛋白和持续释放装置。在一些实施方式中，持续释放装置是可生物降解的聚合物或微粒。
根据本发明的另一方面，提供了一种刺激免疫应答的方法。该方法包括对受试对象施用能够有效地在该受试对象体内诱导免疫应答的量的寡聚核苷酸。优选寡聚核苷酸通过下述方式施用：经口、局部、在持续释放装置中、经粘膜、全身性地、肠胃外或肌内施用。当寡聚核苷酸施用至粘膜表面时，其可以以有效地诱导粘膜免疫应答或全身性免疫应答的量来输送。在优选实施方式中，粘膜表面选自口、鼻、直肠、阴道和眼睛表面。
在一些实施方式中，本发明包括将受试对象与抗原接触，其中免疫应答是抗原特异性免疫应答。在一些实施方式中，抗原选自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原和肽抗原。
寡聚核苷酸可用于在患有癌症的受试对象中或在具有患癌症风险的受试对象中治疗癌症(例如，降低癌症发生风险)。这些癌症可选自胆道癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、上皮内肿瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、黑色素瘤、神经母细胞瘤、口癌(oral cancer)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、甲状腺癌和肾癌，以及其它癌及肉瘤。在一些重要的实施方式中，癌症选自骨癌、大脑和中枢神经系统癌、结缔组织组织癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、喉癌、口腔癌(oral cavity cancer)、皮肤癌和睾丸癌。
选择性地，当CpG免疫刺激性寡聚核苷酸与抗癌疗法联合施用时，寡聚核苷酸也可用于提高癌细胞对癌症疗法(例如抗癌疗法)的应答性。这些抗癌疗法可以是化疗、疫苗(例如，体外已接触抗原的树突状细胞疫苗或癌症抗原疫苗)或抗体类疗法。后一种疗法也可包括施用对例如癌细胞的细胞表面抗原具有特异性的抗体，其中免疫应答导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一个实施方式中，抗体选自瑞布他辛(Ributaxin)、赫塞汀(Herceptin)、奎左门特(Quadramet)、盘诺瑞克斯(Panorex)、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、昂可林(Oncolym)、SMART M195、ATRAGEN、欧瓦瑞克斯(Ovarex)、百克沙(Bexxar)、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、塞尼哌(Zenapax)、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、预靶定(Pretarget)、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗-FLK-2、MDX-260、ANAAb、SMART 1D10Ab、SMART ABL 364Ab和ImmuRAIT-CEA。
因此，根据本发明的一些方面，向患有癌症或者具有患癌症风险的受试对象施用寡聚核苷酸和抗癌疗法。在一些实施方式中，抗癌疗法选自化疗剂、免疫治疗剂和癌症疫苗。
本发明在其它方面涉及防治受试对象的疾病的方法。该方法包括定期向受试对象施用寡聚核苷酸以提高免疫系统应答，从而防治受试对象的疾病。采用本发明的预防方法进行防治的疾病和病症的例子包括细菌感染(例如性传播疾病)和因食物过敏而导致的过敏性休克。
在另一方面，本发明是一种通过向受试对象施用能有效激活先天免疫应答(innate immune response)的量的寡聚核苷酸以诱导先天免疫应答的方法。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗病毒或逆转录病毒感染的方法。该方法涉及向患有病毒或逆转录病毒感染或者具有患病毒或逆转录病毒感染的风险的受试对象施用能有效治疗病毒或逆转录病毒感染的量的任何本发明的组合物。在一些实施方式中，病毒感染由例如乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、疱疹病毒或乳头状瘤病毒之类的病毒引起。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗细菌感染的方法。该方法包括向患有细菌感染或具有患细菌感染的风险的受试对象施用能有效治疗细菌感染的量的任何本发明的组合物。在一个实施方式中，细菌感染由细胞内细菌引起。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗寄生虫感染的方法。该方法包括向患有细菌感染或具有患寄生虫感染的风险的受试对象施用能有效治疗寄生虫感染的量的任何本发明的组合物。在一个实施方式中，寄生虫感染由细胞内寄生虫引起。在另一个实施方式中，寄生虫感染由非肠道寄生虫引起。
在一些实施方式中，受试对象是人；在其它实施方式中，受试对象是选自下组的非人脊椎动物：狗、猫、马、牛、猪、火鸡、山羊、鱼、猴子、鸡、大鼠、小鼠和绵羊。
在其它方面，本发明涉及一种通过向患有自免疫疾病或具有患自免疫疾病的风险的受试对象施用能有效治疗或防治自免疫疾病的量的任何本发明的组合物从而治疗自免疫疾病的方法。
本发明在一些方面是一种治疗气道重塑(airway remodeling)、哮喘或过敏的方法，所述方法包括对受试对象施用能有效治疗受试对象的气道重塑、哮喘或过敏的量的任何本发明的组合物。在一个实施方式中，受试对象患有哮喘、慢性阻塞性肺疾病，或者受试对象是吸烟者。在其它实施方式中，受试对象没有哮喘症状。
作为本发明的一个方面，还提供了本发明的寡聚核苷酸用于刺激免疫应答的应用。
还提供了一种用于刺激免疫应答的本发明的寡聚核苷酸药物的制造方法。
本发明的每一条限制可包含本发明的各种实施方式。因此，可预期的是，涉及任一要素或要素组合的每一条本发明的限制均能包含在本发明的每个方面之中。本发明并非将其应用局限于在以下描述中阐述的或者在附图中描述的各个部分的构造和布局的细节之中。本发明可具有其它实施方式并且以各种方式得以实践或进行实施。同样，在本文中使用的短语和术语是出于描述的目的而不应当被当作进行限制。本文中“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”，以及其各种变化方式的使用意指涵盖其后所罗列的条目及其等效方式以及额外的条目。
附图说明
图1是举例说明本发明的经修饰的碱基结构的两幅图。图1a显示了CpG六聚体模体(GTCGTT)部分。图1b显示了掺入的疏水性2′-脱氧胸腺嘧啶的形状类似物：2，4-二氟甲苯(FF)、5-溴尿嘧啶(BU)和5-碘尿嘧啶(JU)。
图2是显示了用胸腺嘧啶形状类似物2，4-二氟甲苯(FF)修饰的B类寡聚核苷酸进行荧光素酶检测结果的图形。FF修饰的ODN(SEQ IDNO：3-9)的活性与未经修饰的B类母本序列(SEQ ID NO：1)、完全PS母本序列(SEQ ID NO：2)和第三未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：37)的活性进行比较。用指定量的ODN刺激hTLR9-LUC-293细胞，并通过测量16小时后的荧光素酶活性来测定NF-κB刺激。x轴是单位为μM的log ODN浓度，y轴是相对刺激指数。
图3是描述用经修饰的B类ODN进行荧光素酶检测结果的图形。胸腺嘧啶(T)被5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BU)(SEQ ID NO：10-12)和5-碘-2′-脱氧尿嘧啶(JU)(SEQ ID NO：13-15)替代。它们的活性与未经修饰的B类母本序列(SEQ ID NO：1)、完全PS母本序列(SEQ ID NO：2)和第三未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：37)的活性进行比较。用指定量的ODN刺激hTLR9-LUC-293细胞，并通过测量16小时后的荧光素酶活性测定NF-κB刺激。x轴是log ODN浓度(单位为μM)，y轴是相对刺激指数。
图4是描述用经修饰的B类ODN进行荧光素酶检测结果的图形。2′-脱氧胸腺嘧啶(T)被2′-脱氧尿嘧啶(U)(SEQ ID NO：16-18)替代。U-经修饰的ODN的活性与未经修饰的B类母本序列(SEQ ID NO：1)、完全PS母本序列(SEQ ID NO：2)和第三未经修饰的B类ODN(SEQ IDNO：37)的活性进行比较。用指定量的ODN刺激hTLR9-LUC-293细胞，并通过测量16小时后的荧光素酶活性测定NF-κB刺激。x轴是log ODN浓度(单位为μM)，y轴是相对刺激指数。
图5是描述用经修饰的B类ODN进行荧光素酶检测和PBMC检测结果的两幅图形。具有5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶(EU)(SEQ ID NO：42)、2′-脱氧尿嘧啶(U)(SEQ ID NO：16)、5-碘-2′-脱氧尿嘧啶(JU)(SEQ IDNO：13)、5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BU)(SEQ ID NO：10)和5-氯-2′-脱氧尿嘧啶(CU)(SEQ ID NO：41)的ODN的相对活性与母本序列(SEQ ID NO：1)的活性进行比较。图5a显示了TLR9活性，图5b显示了IFN-α的产生。显示的是三个供体的平均+/-SEM。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是相对刺激指数(图5a)或单位为pg/ml的IFN-α浓度(图5b)。
图6是描述用EU修饰的ODN进行荧光素酶检测结果的图形。EU修饰的ODN SEQ ID NO：29、30和42的活性与母本序列和其它未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：37)的活性进行比较。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是相对刺激指数。
图7是描述用经修饰的B类ODN进行荧光素酶检测结果的图形。JU修饰的SEQ ID NO：19-24的活性与母本序列SEQ ID NO：37的活性相比。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是相对刺激指数。
图8是描述用经修饰的A类ODN进行荧光素酶检测和PBMC检测结果的两幅图形。JU修饰的SEQ ID NO：35-37的活性与未经修饰的母本序列(SEQ ID NO：43)和未经修饰的B类ODN SEQ ID NO：1的活性进行比较。图8a显示了TLR9活性，图8b显示了IFN-α的产生。显示的是三个供体的平均+/-SEM。x轴是log ODN浓度(图8a)或ODN浓度(图8b)(单位为μM)，y轴是相对刺激指数(图8a)或IFN-α浓度(单位为pg/ml(图8b)。
图9是描述用经修饰的A类ODN进行荧光素酶检测结果的图形。JU修饰的C类ODN SEQ ID NO：27-28和44-45的活性与未经修饰的母本序列SEQ ID NO：45和未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：37)的活性进行比较。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是相对刺激指数。
图10是描述用经修饰的P类ODN进行荧光素酶检测结果的图形。JU修饰的SEQ ID NO：31-33的活性与(SEQ ID NO：52)的活性进行比较。x轴是log ODN浓度(单位为μM)，y轴是相对刺激指数。
图11是描述用经修饰的T类ODN进行荧光素酶检测结果的图形。JU修饰的SEQ ID NO：47-50和U修饰的SEQ ID NO：51的活性与未经修饰的母本序列SEQ ID NO：25的活性进行比较。x轴是log ODN浓度(单位为μM)，y轴是相对刺激指数。
图12是描述用短ODN进行荧光素酶检测结果的图形。JU修饰的短ODN SEQ ID NO：39-40的活性与未经修饰的母本序列SEQ IDNO：38和B类ODN SEQ ID NO：37的活性进行比较。用或者不用DOTAP配制ODN。x轴是log ODN浓度(单位为μM)，y轴是相对刺激指数。
图13是测量脾细胞培养上清液中细胞因子浓度的ELISA检测结果的四幅图形，其中用不同的ODN培养BALB/c小鼠脾细胞。培养上清液在6小时(对于TNF-α)或24小时(对于IL-6、IL-10和IL-12)收获。对JU修饰的B类ODN(SEQ ID NO：13)、未经修饰的B类ODN(SEQ IDNO：37)和非pG负对照ODN(SEQ ID NO：26)的活性进行比较。图13a-d分别显示了TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12浓度。x轴是单位为μg/ml的ODN浓度，y轴是单位为pg/ml的细胞因子浓度。
图14是显示B细胞增殖的FACS分析结果的图形。CFSE染色BALB/c小鼠脾细胞(4×105/孔)用0.001、0.01、0.1、0.3、1、3或10μg/ml的ODN进行温育。在温育后72小时，细胞针对CD19进行染色，用FACS测量B-细胞增殖，随后用ModFit软件分析。JU修饰的B类ODN(SEQ ID NO：13)、未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：37)和非CpG负对照(SEQ ID NO：26)的活性进行比较。x轴是单位为μg/ml的ODN浓度，y轴是相对B细胞增殖。
图15是显示经ELISA测量的体内细胞因子产生的两幅图形。BALB/c小鼠(每组5只)用10、50或100μg的ODN进行皮下注射。对照组则只接受100μl的PBS。在注射后1小时(对于TNF-α)或3小时(对于IP-10)，利用心脏穿刺使动物出血，利用ELISA检测血浆中的TNF-α和IP-10。JU修饰的B类ODN(SEQ ID NO：13)和未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：37)的活性进行比较。图15a显示了TNF-α浓度，图15b显示了IP-10浓度。x轴是单位为μg的ODN剂量，y轴是单位为pg/ml的细胞因子浓度。
图16是显示了用通用碱基(6-硝基苯并吡唑)替代母本序列(SEQ IDNO：1)中胸腺嘧啶的B类ODN(SEQ ID NO：178)对TLR9介导的NF-κB的活化的图形。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图17是显示了用5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶替代母本序列(SEQ IDNO：1)中胸腺嘧啶的B类ODN(SEQ ID NO：153和154)对TLR9介导的NF-κB的活化的图形。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图18是显示了具有糖修饰(2′-O-甲基鸟嘌呤核苷)和亲脂性取代核苷酸类似物的B类ODN(SEQ ID NO：111-113)对TLR9介导的NF-κB的活化的图形。这些ODN的活性与母本序列(SEQ ID NO：1)和仅具有亲脂性取代核苷酸类似物的相同序列(SEQ ID NO：13)的活性进行比较。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图19是显示了具有多个可接近的5′端的分枝B类ODN对TLR9介导的NF-κB的活化的图形。分枝ODN(SEQ ID NO：96、97、101和102)的活性与SEQ ID NO：1的活性进行比较。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图20是显示了较短的未经修饰B类ODN(SEQ ID NO：38)和具有亲脂性取代核苷酸类似物和亲脂性3′标签的相同序列的ODN(SEQ IDNO：126)对TLR9介导的NF-κB的活化的图形。用或者不用DOTAP对二者进行配制。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图21是显示了用5-丙烯基-dU替代母本序列(SEQ ID NO：1)中胸腺嘧啶的两条B类ODN(SEQ ID NO：116和117)对TLR9介导的NF-κB的活化的图形。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图22是显示了具有第二核苷酸类似物和亲脂性取代核苷酸类似物的B类ODN(SEQ ID NO：138，7-脱氮-dG；SEQ ID NO：139，肌苷；SEQ ID NO：140，5-甲基-dC)对hTLR9介导的NF-κB的活化的图形。这些ODN的活性与母本序列(SEQ ID NO：1)和仅具有亲脂性取代核苷类似物的相同序列(SEQ ID NO：13)的活性进行比较。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图23是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的T-类ODN(SEQ IDNO：132-134)对hTLR9介导的NF-κB的活化的图形。它们的活性与免疫刺激性C类ODN(SEQ ID NO：198)的活性进行比较。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图24是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：58-63)对hTLR9介导的NF-κB的活化的两幅图形。图24a显示了SEQ ID NO：58-61的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)和未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：56)的活性进行比较。图24b显示了SEQ IDNO：62-63的活性与相同的正对照和负对照的活性进行比较。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是相对刺激指数。
图25是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：64、66-67)对hTLR9介导的NF-κB的活化的图形。它们的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)、C类ODN(SEQ ID NO：68)和未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：57)的活性进行比较。hTLR9-LUC-293细胞用指定量的核酸进行温育，在16小时后通过测量荧光素酶活性测定NF-κB活化。x轴是单位为μM的ODN浓度的log值，y轴是相对刺激指数。
图26是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：58-63)对IFN-α的诱导的两幅图形。图26a显示了SEQ ID NO：58-61的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)和未经修饰的P类ODN(SEQ IDNO：56)的活性进行比较。图26b显示了SEQ ID NO：62-63的活性与相同正对照和负对照的活性进行比较。人类PBMC与指定的ODN进行温育48小时。然后通过ELISA测定细胞培养上清液中的IFN-α。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图27是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：64、66-67)对IFN-α的诱导的图形。它们的活性与B类正对照(SEQID NO：55)、C类ODN(SEQ ID NO：68)和未经修饰的P类ODN(SEQ IDNO：57)的活性进行比较。人类PBMC与指定的ODN进行温育48小时。然后通过ELISA测定细胞培养上清液中的IFN-α。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图28是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：58、60-62，图28a)(SEQ ID NO：64和67，图28b)对IL-6诱导的图形。活性与未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：55)和未经修饰的C类ODN(SEQ ID NO：54)、负对照ODN(SEQ ID NO：53)、以及未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：56)的活性进行比较。来自提供者的PBMC与所述ODN温育24小时，并通过luminex对上清液进行分析。显示的是平均+/-SEM。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是单位为pg/ml的IL-6浓度。
图29是显示了用具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQID NO：58、60-62，图29a)(SEQ ID NO：64和67，图29b)进行处理后的B-细胞增殖的图形。活性与未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：55)、未经修饰的C类ODN(SEQ ID NO：54)、负对照ODN(SEQ ID NO：53)、未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：56)、LPS、R-848、SEB和聚[I]:[C]ODN的活性进行比较。来自提供者的CFSE-标记PBMC与所述ODN温育5天，然后用CD19抗体进行染色。测定具有减弱的CFSE染色的B细胞的百分比。x轴是单位为μM的ODN浓度，y轴是是分化后具有减弱的染色的B细胞的百分比％。
图30是显示了具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：58、60-62、64和67)对鼠类IFN-α的诱导的图形。它们的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)和负对照(SEQ ID NO：26)的活性进行比较。BALB/c小鼠(每组5只)用不同剂量的ODN进行皮下注射。在注射后3小时使动物出血，通过ELISA检测血浆中的TNF-α。x轴是单位为μg的ODN剂量，y轴是单位为pg/ml的IFN-α浓度。
图31是显示了在小鼠SA1N肿瘤模型中ODN对肿瘤体积的作用的两幅图形。雌性A/J小鼠(每组10只)在第0日用5×105SaI/N肿瘤细胞进行皮下注射。在肿瘤诱导后的第8日开始每周一次皮下注射提供35μg(图31a)或100μg(图31b)具有亲脂性取代寡聚核苷酸类似物的P类ODN(SEQ ID NO：60、64和67)、未经修饰的C类ODN、未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：55)或仅提供PBS进行治疗。监测动物的存活和肿瘤体积。使用数字游标卡尺测量肿瘤尺寸(长度和宽度)。利用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(0.4)(ab2)，其中a＝较大直径，且b＝较小直径。x轴显示肿瘤诱导后的天数，y轴显示了单位为mm3的肿瘤体积。
具体实施方式
本发明部分基于显示出增强的免疫刺激能力的CpG寡聚核苷酸。已知CpG寡聚核苷酸例如通过与toll样受体9(TLR9)相互作用从而刺激免疫系统。TLR9的刺激具有许多作用，包括刺激Th1偏移免疫应答、NK细胞活化和B细胞活化。本发明在一些方面涉及具有被改变的结构的免疫刺激性寡聚核苷酸的鉴别，所述被改变的结构影响了它们与TLR9的相互作用。本发明人发现在CpG模体之外的具有亲脂性取代核苷酸类似物的寡聚核苷酸具有增强的刺激干扰素-α(IFN-α)产生和诱导TLR9活化的能力。已在经测试的所有类型的免疫刺激性寡聚核苷酸中观察到这种作用。这些具有增强的刺激能力的修饰寡聚核苷酸已被命名为E类寡聚核苷酸。
本发明的E类修饰寡聚核苷酸在一些情况下具有增强的诱导免疫应答的能力。诱导免疫应答是指免疫细胞数量或活性的任何增加，或者诸如细胞因子之类的免疫因子的表达或绝对水平的提高。免疫细胞包括但不限于NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和其它抗原呈递细胞。细胞因子包括但不限于白细胞介素，TNF-α，IFN-α、β和γ，Flt-配体和共刺激分子。
已知含有未甲基化的CpG模体的寡聚核苷酸能通过Toll样受体9(TLR9)途径刺激免疫应答。许多细胞因子的诱导与TLR9活化相关。因此诱导随着TLR9活化的提高而提高。然而，对于CpG ODN来说，在TLR9和IFN-α诱导之间通常存在负相关。已发现本发明的一些修饰物能产生改变的信号模式，由此观察到TLR9和IFN-α之间更直接的相关，而不是负相关。
本发明人开始研究CpG模体周围区域中亲脂性残基的影响。正如在以下例子中所描述的，将诸如2，4-二氟甲苯、5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶之类的不同类型的亲脂性取代核苷酸类似物在CpG模体的5′或3′端接入到CpG寡聚核苷酸中。出乎意料地是，这些亲脂性取代核苷酸类似物的接入导致hTLR9活性以及人类PBMC中IFN-α诱导非同寻常地明显提高。用诸如尿嘧啶(其与胸腺嘧啶结构相似但缺少甲基)之类的非亲脂性核苷酸残基取代会造成hTLR9刺激的显著降低。在所测试的寡聚核苷酸中，如果亲脂性取代核苷酸类似物位于CpG模体的5′时，TLR9刺激的提高似乎强于当亲脂性取代核苷酸类似物位于所述模体的3′时。双替代(即，5′和3′亲脂性取代核苷酸类似物替代)导致经测试的那些寡聚核苷酸的最有力的刺激。相反，CpG模体上用2，4-二氟甲苯替代鸟嘌呤或胞嘧啶则在两种情况下均导致TLR9刺激指数的显著降低。
亲脂性取代核苷酸类似物修饰导致IFN-α诱导的明显增强。尤其是，对于5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶修饰的ODN，似乎在TLR9刺激和IFN-α诱导之间有良好的相关。如上所提及的，该观察结果是出乎意料的，这是由于(i)母本分子21317事实上对诱导IFN-α是没有活性的，以及(ii)对于不含有这些修饰的CpG ODN而言，TLR9和IFN-α诱导之间通常是负相关的。
在本发明的一些方面，寡聚核苷酸具有序列R1YZR2。该寡聚核苷酸可包括一个或多个这样的模体。R1和R2独立地是亲脂性取代核苷酸类似物(L)、核苷酸和键中的任一种。然而，优选R1和R2中的至少一个是亲脂性取代核苷酸类似物(L)。在一些情况下，R1和R2都是L。正如以下实施例章节中所示的，在CpG模体的5′和3′均具有L的寡聚核苷酸具有非常强的刺激性。然而有时仅一个R是L。例如，R1可以是L且R2是核苷酸，反之亦然。另一种方式，R1可以是L且R2可以是键，因此寡聚核苷酸包含结构5′R1CG 3′。
在一些情况下，寡聚核苷酸具有序列R1N1YZN2R2，其中N1和N2是长度为0-3个核苷酸的核苷酸。其它可能的变化形式包括诸如5′R1N1R1YZ N23′、5′R3R1YZ 3和R1ZN2R2之类的结构。
Y是嘧啶核苷酸。Z是嘌呤、嘧啶或脱碱基残基。在一些实施方式中，Z优选为嘌呤。
L是亲脂性取代核苷酸类似物，例如是5或6元环的核碱基类似物。5或6元环的核碱基类似物的例子如下式I的基团所示。
Figure A20078003596700281
式I
A、B、X、D、E和F独立地是C(碳)或N(氮)之一，其选择性地具有氢或取代基，这些取代基诸如但不限于F、Cl、Br、I、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烯基、环烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2；-S-烷基、-SO-烷基、-SO2-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、苄基、氧代、硫代、羟基、巯基和亚氨基。在一些情况下，至少一个取代基不是氧代、硫代、羟基、巯基、亚氨基、氨基或甲基。n是0或1。虚线表示选择性的双键。然而，至少一个取代基不是从下组中选择：氧代、硫代、羟基、巯基、亚氨基、氨基、甲基和氢。此外，A、B、X、D、E和F原子中总共不超过3个氮(N)。在一些实施方式中，A、B、X、D、E和F原子都是碳(C)。另外可选地，A、B、X、D、E和F原子中的至少一个、两个或三个是氮(N)。
上式的化合物可以是，例如，以下任一种亲脂性取代核苷酸类似物：取代嘧啶、取代尿嘧啶、取代甲苯、取代咪唑或吡唑、取代三唑、5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基-尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶或2，4-二氟-甲苯。
亲脂性取代核苷酸类似物可以是独立的，或者与其它化合物相稠合。例如，可以与3至6元芳环或脂环体系相稠合。也可以与诸如戊糖或己糖之类的相连。戊糖的例子是诸如核糖或脱氧核糖之类的呋喃糖，己糖的例子是吡喃糖。戊糖或己糖可选择性地被F、氨基、烷氧基、烷氧基-乙氧基、氨基丙基、烯基、炔基或O2，C4-亚烷基桥取代。
寡聚核苷酸也可以包括非核苷酸修饰，所述非核苷酸修饰的例子是C6-C48-聚乙二醇、C3-C20-烷-二醇、C3-C18-烷基氨基连接子和C3-C18-烷基硫醇连接子、胆固醇、胆汁酸、饱和或不饱和脂肪酸、叶酸、十六烷基-甘油或二(十六烷基)甘油基团、十八烷基-甘油或二(十八烷基)-甘油基团或维生素E基团。
亲脂性取代核苷酸类似物可以接入到任何免疫刺激性寡聚核苷酸中。在本发明的一些实施方式中，所述免疫刺激性寡聚核苷酸包括作为“CpG二核苷酸”的免疫刺激性模体。CpG二核苷酸可以是甲基化的或未甲基化的。一种含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性核酸是下述核酸分子：所述核酸分子含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即，通过磷酸酯化学键相连的未甲基化的5′胞嘧啶和3′鸟嘌呤)，并且激活免疫系统；这样的免疫刺激性核酸是CpG核酸。CpG核酸已在大量已授权专利、专利申请公开和其它公开出版物中有所描述，包括美国专利6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。一种含有至少一个甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激性核酸是下述核酸分子：所述核酸分子含有甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即，通过磷酸酯化学键相连的甲基化5′胞嘧啶和3′鸟嘌呤)，并且激活免疫系统。在其它实施方式中，免疫刺激性寡聚核苷酸不含有CpG二核苷酸。这些不含有CpG二核苷酸的寡聚核苷酸称为非CpG寡聚核苷酸，并且它们具有非CpG免疫刺激性模体。优选这些寡聚核苷酸是富含T的ODN，诸如含有至少80％的T的ODN。
本发明的E类ODN可包括诸如A类、B类、C类、T类和P类之类的其它CpG ODN类别的模体和性质，只要它们包括YGZ模体的亲脂性取代核苷酸类似物5′和/或3′(lipophilic substituted nucleotideanalogs 5’and/or 3’of a YGZ motif)。
“A类”CpG免疫刺激性核酸已在美国非临时专利申请09/672,126和已公开的PCT申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)中进行了描述，上述两项申请均在2000年9月27日提交。这些核酸的特征在于能诱导高水平的干扰素-α而同时保持最小的B细胞活化作用的能力。A类CpG免疫刺激性核酸并非必须含有Yamamoto及其同伴所描述的六聚体回文GACGTC、AGCGCT或AACGTT。见Yamamoto S等J.Immunol.148：4072-6(1992)。
A类免疫刺激性核酸的示例性序列在美国非临时专利申请09/672,126和已公开的PCT申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)中描述，上述两项申请均在2000年9月27日提交。
“B类”ODN能有效地激活B细胞，但在诱导IFN-α和NK细胞活化方面相对弱。B类CpG核酸通常是完全稳定的，并在某些优选碱基内容中包含未甲基化的CpG二核苷酸。参见，例如美国专利6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。另一类CpG核酸能有效地诱导IFN-α和NK细胞活化，但在刺激B细胞方面相对弱；这一类被称为“A类”。A类CpG核酸通常具有在5′和3′端稳定的多G序列和至少六个核苷酸的含磷酸二酯CpG二核苷酸的回文序列。参见，例如已公开的专利申请PCT/US00/26527。
再另一类CpG核酸激活B细胞和NK细胞并诱导IFN-α；这类已被命名为C类。“C类”免疫刺激性核酸含有对免疫系统细胞有独特和所希望的刺激效果的至少两个不同的模体。这些ODN中的一些同时具有传统的“刺激性”CpG序列以及“富含GC”或“B细胞中和”的模体。这些组合模体核酸具有处在与传统的“B类”CpG ODN相关的那些作用之间某处的免疫刺激作用，所述传统的“B类”CpG ODN是B细胞活化和树突状细胞(DC)活化的强诱导子，并且这些作用与最近描述的一类免疫刺激性核酸(“A类”CpG ODN)相关，所述“A类”CpGODN是IFN-α和自然杀伤(NK)细胞活化的强诱导子，然而是B细胞和DC活化的相对较弱的诱导子。见Krieg AM等(1995)Nature 374：546-9；Ballas ZK等(1996)J Immunol 157：1840-5；Yamamoto S等(1992)JImmunol 148：4072-6。虽然优选的B类CpG ODN经常具有硫代磷酸酯键骨架且优选的A类具有混合或嵌合的骨架，但C类组合模体免疫刺激性核酸可具有稳定的(例如硫代磷酸酯)、嵌合的或磷酸二酯骨架，在一些优选实施方式中，它们具有半软性骨架。该类在2002年8月19日提交的美国专利申请US 10/224,523中描述，该专利申请的全部内容在此以引用的方式引入。
“P类”免疫刺激性寡聚核苷酸具有若干域，这些域包括5′TLR活化域、2双链形成区域和选择性的间隔子及3′尾部。与C类相比，这类寡聚核苷酸在一些情况下具有诱导更高水平的IFN-α分泌的能力。P类寡聚核苷酸具有在体外和/或体内自发地自组装为串联体的能力。不希望受任何关于这些分子的作用方法的具体理论的约束，一种可能的假设是该性质使P类寡聚核苷酸与先前描述的CpG寡聚核苷酸类别相比具有在某些免疫细胞中更大程度地交联TLR9、诱导独特的免疫活化模式的能力。TLR9受体的交联可通过浆细胞样树突状细胞中的I型IFNR反馈回路来诱导更强的IFN-α活化。P类寡聚核苷酸至少在美国专利11/706,561中描述。
当没有如同本发明的ODN一样进行修饰时，与B类和C类寡聚核苷酸相比，“T类”寡聚核苷酸诱导较低水平的IFN-α分泌和IFN-相关的细胞因子和趋化因子，但同时保留了与B类寡聚核苷酸相似的IL-10诱导水平。T类寡聚核苷酸至少在美国专利申请11/099,683中有所描述，上述专利申请的全部内容在此以引用的方式引入。
在一个实施方式中，本发明的免疫刺激性ODN有利地与阳离子脂质相结合。在一个实施方式中，阳离子脂质是DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基(甲基硫酸)铵)。替代DOTAP或者除DOTAP之外可以使用其它具有相似的性质(包括运输至内体囊)的其它试剂。其它脂质制剂包括例如EFFECTENETM(一种具有特异性DNA压缩增强子的非脂质体脂质)和SUPERFECTTM(一种新型作用树突状技术)。脂质体可从Gibco BRL通过商业途径获得，例如，如LIPOFECTINTM和LIPOFECTACETM，它们由诸如N-[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)之类的阳离子脂质形成。制造脂质体的方法在本领域中是公知的，并且在许多文献中描述。Gregoriadis G(1985)Trends Biotechnol3：235-241也对脂质体进行了综述。
在其它实施方式中，免疫刺激性ODN并未配制在阳离子脂质体中。由于ODN中修饰类似物的亲脂性性质，即使诸如长度为3个核苷酸的较短的ODN也可无需加以配制以在体内有效地发挥作用。
在一个实施方式中，本发明的免疫刺激性ODN为具有一级和二级结构的共价封闭哑铃状分子的形式。在一个实施方式中，这种环状的寡聚核糖核苷酸包括两个通过居间的双链片段相连的单链环。在一个实施方式中，至少一个单链环包括本发明的免疫刺激性DNA模体。本发明的另一种共价封闭哑铃状分子包括嵌合的DNA:RNA分子，其中，例如，所述双链片段至少部分是DNA(例如，同二聚体dsDNA或异二聚体DNA:RNA)，且至少一个单链环包括本发明的免疫刺激性DNA模体。另外一种方式，嵌合分子的双链片段是DNA。
在某些实施方式中，免疫刺激性ODN是孤立的。孤立分子是基本上纯的并且不伴有通常在自然界或体内系统中发现与其相伴的其它物质，其程度使之能实际地合适地用于其用途的分子。具体而言，所述免疫刺激性ODN充分纯净并且充分地不伴有其它生物细胞组成部分，因此可用在例如制造药物制剂之中。因为孤立的本发明的免疫刺激性ODN可与可药用载体在药物制剂中相混合，所述免疫刺激性ODN可仅占制剂重量的很小的百分比。然而，免疫刺激性ODN是基本上纯的，因此其基本上与其在活体系统中相连物质进行了分离。
免疫刺激性核酸分子可具有嵌合骨架。出于本发明的目的，嵌合骨架指部分稳定的骨架，其中至少一个核苷酸间键是磷酸二酯或类磷酸二酯，并且其中至少一个其它核苷酸间键是稳定的核苷酸间键，其中至少一个磷酸二酯或类磷酸二酯键与至少一个稳定的核苷酸间键是不同的。由于已报道相对于磷酸二酯键，硼代磷酸酯键是稳定的，出于骨架嵌合特性的目的，硼代磷酸酯键可根据上下文而被划分为为类磷酸二酯键或划分为稳定的键。例如，本发明的嵌合骨架可在一个实施方式中包括至少一个磷酸二酯(磷酸二酯或类磷酸二酯)键和至少一个硼代磷酸酯(稳定的)键。在另一个实施方式中，本发明的嵌合骨架可以包括硼代磷酸酯(磷酸二酯或类磷酸二酯)和硫代磷酸酯(稳定的)键。“稳定的核苷酸间键”应指与磷酸二酯核苷酸间键相比能相对耐受体内降解(例如，通过外切或内切核酸酶)的核苷酸间键。优选的稳定核苷酸间键包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键和甲基硫代磷酸酯键。其它稳定的核苷酸间键包括但不限于：肽、烷基、脱磷及上述其它稳定的核苷酸间键。
可使用采用氨基磷酸酯或H-磷酸酯化学的自动技术来合成诸如硫代磷酸酯之类的经修饰的骨架。芳基磷酸酯和烷基磷酸酯可如美国专利4,469,863所述般制备；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分如美国专利5,023,243和欧洲专利092,574所述般进行烷基化)可使用市售试剂通过自动固相合成来制备。制造其它DNA骨架修饰和替代的方法也已有描述。Uhlmann E等(1990)Chem.Rev.90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate.Chem.1：165。制备嵌合寡聚核苷酸的方法也是已知的。例如授权给Uhlmann等的专利已描述了这样的技术。
混合的骨架修饰ODN可以利用商业提供的DNA合成仪和标准氨基磷酸酯化学进行合成。(见F.E.Eckstein，″Oligonucleotides andAnalogs-A Practical Approach″IRL Press，Oxford，UK，1991，及M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，Tetrahedron Lett.21，719(1980))。在偶联后，通过使用Beaucage试剂(R.P.Iyer，W.Egan，J.B.Regan and S.L.Beaucage，J.Am.Chem.Soc.112，1253(1990))(0.075M in acetonitrile)或者苯乙酰基二硫化物(PADS)进行硫化从而引入PS键，随后用乙酸酐、2，6-二甲基吡啶和四氢呋喃(1∶1∶8；v∶v∶v)和N-甲基咪唑(16％四氢呋喃溶液)来封端(capping)。封端步骤在硫化反应后进行，从而在硫代磷酸酯键应当处于的位置上尽可能少地形成不需要的磷酸二酯(PO)键。例如在CpG二核苷酸中引入磷酸二酯键的情况下，中间体磷-III通过用碘的水/吡啶溶液处理而被氧化。在从固体载体上切下并用浓氨水处理(50℃，15小时)进行最后的脱保护之后，通过在Gen-Pak Fax柱(Millipore-Waters)上使用NaCl-梯度(例如，缓冲液A：10mM NaH2PO4在乙腈/水＝1∶4/v∶v中，pH 6.8；缓冲液B：10mM NaH2PO4，1.5M NaCl在乙腈/水＝1∶4/v∶v中；30分钟由5至60％B，1ml/min)的HPLC或者通过毛细管凝胶电泳对ODN进行分析。ODN可经HPLC或者经源高效柱(Amersham Pharmacia)上的FPLC进行纯化。合并HPLC-均相馏分，通过C18柱或者通过超滤脱盐。用质谱分析ODN以确认计算质量。
本发明的核酸也可包括其它修饰。这些包括非离子DNA类似物，诸如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电荷的磷酸酯的氧被烷基或芳基替换)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧部分被烷基化。在一个或两个终端处含有诸如四乙二醇或六乙二醇之类的二醇的核酸也已显示出能实际耐受核酸酶降解。
在一些实施方式中，寡聚核苷酸可以是软或半软的寡聚核苷酸。软寡聚核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激性寡聚核苷酸，其中仅在至少一个内部嘧啶-嘌呤二核苷酸(YZ)内或与其紧邻的位置上出现磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键。优选YZ是YG，嘧啶-鸟嘌呤(YG)二核苷酸。至少一个内部YZ二核苷酸自身具有磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键。与至少一个内部YZ二核苷酸紧邻出现的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键可以位于所述至少一个内部YZ二核苷酸的5′、3′，或者同时位于5′和3′。
具体而言，磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键涉及到“内部二核苷酸”。内部核苷酸一般应指通过核苷酸间键相连的任何相邻核苷酸对，其中核苷酸对中的任一个都不是末端核苷酸，即，核苷酸对中的任一个都不是界定寡聚核苷酸的5′或3′末端的核苷酸。因此，n个核苷酸长的直链寡聚核苷酸具有总共n-1个二核苷酸并且仅有n-3个内部二核苷酸。每个在内部二核苷酸中的核苷酸间键是内部核苷酸间键。因此，n个核苷酸长的直链寡聚核苷酸具有总共n-1个核苷酸间键并且仅有n-3个内部核苷酸间键。按策略放置的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键因此指位于核酸序列中任何核苷酸对之间的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键。在一些实施方式中，磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键并不位于最接近5′或3′端的任一核苷酸对之间。
优选紧邻至少一个内部YZ二核苷酸出现的磷酸二酯或磷酸二酯核苷酸间键自身是内部核苷酸间键。因此，对于序列N1 YZ N2，其中N1和N2各自相互独立地是任何单个核苷酸，YZ二核苷酸具有磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键，并且此外(a)当N1是内部核苷酸时，N1和Y通过磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键相连，(b)当N2是内部核苷酸时，Z和N2通过磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键相连，或者(c)当N1是内部核苷酸时，N1和Y通过磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键相连，当N2是内部核苷酸时，Z和N2通过磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键相连。
在本发明的寡聚核苷酸中，至少一个R1YZR2的YZ具有磷酸二酯键。另外一种方式，R1YZR2的YZ可具有硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，R1YZR2的R1Y和/或ZR2具有硫代磷酸酯键。
与完全稳定的寡聚核苷酸相比，本发明的软寡聚核苷酸被认为相对更易被核酸酶切割。不希望受具体理论或机制的约束，相对于全长软寡聚核苷酸而言，认为本发明的软寡聚核苷酸可被切割为具有相对降低的免疫刺激活性或不具有免疫刺激活性的片段。加入至少一个对核酸酶敏感的内部核苷酸间键，尤其靠近寡聚核苷酸中部，则被认为提供了“关闭开关”，其将改变寡聚核苷酸的药代动力学，从而缩短寡聚核苷酸的最大免疫刺激活性的持续时间。这在诸如肾之类的其中需要避免与慢性局部发炎或免疫刺激相关的损伤的组织和临床应用中特别有价值。
半软寡聚核苷酸是具有部分稳定骨架的免疫刺激性寡聚核苷酸，其中磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键仅出现在至少一个内部嘧啶-嘌呤(YZ)二核苷酸内。与相应的完全稳定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比，半软寡聚核苷酸通常具有提高的免疫刺激潜力。由于半软寡聚核苷酸的更大的潜力，在一些情况下，半软寡聚核苷酸可以以较低的有效浓度使用，并且与传统的完全稳定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比以更小的有效剂量获得所希望的生物效果。
人们认为上述半软寡聚核苷酸的性质通常随着牵涉到内部YZ二核苷酸的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键的“剂量”的增加而提高。因此，可认为，例如通常对于具有五个内部YZ二核苷酸的给定寡聚核苷酸序列而言，具有五个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性比具有四个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YG核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强，后者的免疫刺激性又比具有三个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强，后者的免疫刺激性又比具有两个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强，后者的免疫刺激性又比具有一个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键的寡聚核苷酸的免疫刺激性更强。重要的是，即使包括一个内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键也被认为比没有内部磷酸二酯或类磷酸二酯YZ核苷酸间键更加有力。除磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键的数目之外，沿核酸长度方向的位置也可影响潜力。
除位于优选内部位置的磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键之外，所述软或半软寡聚核苷酸通常包括耐降解的5′和3′端。这些耐降解末端可包括使其与相应的未经修饰的末端相比具有提高的外切核酸酶消化耐受性的任何合适的修饰。例如，5′和3′端可通过加入骨架的至少一个磷酸酯修饰而稳定。在优选实施方式中，在骨架的每个末端处的至少一个磷酸酯修饰独立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或甲基硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方式中，耐降解末端包括在3′端通过肽键或酰胺键相连的一个或多个核苷酸单元。
磷酸二酯核苷酸间键是在自然界中发现的核酸的特征键类型。磷酸二酯核苷酸间键包括与两个桥接氧原子侧面相连并与另外两个氧原子(一个带有电荷而另一个不带有电荷)相连的磷原子。当缩短寡聚核苷酸的组织半衰期非常重要时，特别优选磷酸二酯核苷酸间键。
类磷酸二酯核苷酸间键是含有磷的桥接基团，其与磷酸二酯化学地和/或非对映地相似。与磷酸二酯的相似性的量度包括对核酸酶消化的易受性和活化RNAse H的能力。因此，例如磷酸二酯(而不是硫代磷酸酯)寡聚核苷酸易被核酸酶消化，尽管磷酸二酯和硫代磷酸酯寡聚核苷酸均活化RNAse H。在优选实施方式中，类磷酸二酯核苷酸间键是硼代磷酸酯(或者相当于硼代磷酸酯)键。见美国专利5,177,198；美国专利5,859,231；美国专利6,160,109；美国专利6,207,819；Sergueev等，(1998)J.Am.Chem.Soc.120：9417-27。在另一个优选实施方式中，类磷酸二酯核苷酸间键是非对映的纯Rp硫代磷酸酯。据认为非对映的纯Rp硫代磷酸酯与混合的或非对映的纯Sp硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化并能更好地活化RNAse H。CpG寡聚核苷酸的立体异构体是1999年6月27日提交的共同未决的美国专利申请09/361,575和已公开的PCT申请PCT/US99/17100(WO 00/06588)的主题。应当注意到出于本发明的目的，术语“类磷酸二酯核苷酸间键”特意排除了二硫代磷酸酯和甲基磷酸酯核苷酸间键。
如上所述，本发明的软和半软寡聚核苷酸可以在C和G之间具有类磷酸二酯键。类磷酸二酯键的一个例子是Rp构象的硫代磷酸酯键。根据活性测量的时间点，寡聚核苷酸p-手性对CpG寡聚核苷酸的免疫活性有明显的相反作用。在早期40分钟时间点，硫代磷酸酯CpG寡聚核苷酸的Rp而不是SP立体异构体诱导了小鼠脾细胞中的JNK磷酰化。相反，当在较晚的44小时时间点，SP而并非Rp立体异构体在刺激脾细胞增殖中起作用。Rp和Sp立体异构体的动力学和生物活性的差异并非源自于任何细胞摄取的差异，而最可能是由于p-手性的两种相反的生物角色。首先，在早期时间点Rp立体异构体相比Sp而言增强的刺激免疫细胞的活性表明Rp可更有效地与CpG受体TLR9相互作用，或者诱导下游信号途径。另一方面，与Sp相比，Rp PS-寡聚核苷酸的更快速降解导致了短得多的信号持续时间，因此当在较后期时间点，Sp PS-寡聚核苷酸似乎更具生物活性。
由CpG二核苷酸自身的p-手性实现了令人惊奇的强烈作用。与立体随机的CpG寡聚核苷酸相比，其中单一CpG二核苷酸以Rp连接的同类物的活性稍微高一些，而含有Sp键的同类物对于诱导脾细胞增殖几乎没有活性。
术语“核酸”和“寡聚核苷酸”也涵盖诸如在碱基和/或糖上具有取代或修饰的核酸或寡聚核苷酸。例如，它们包括具有与除2′位置上的羟基和除5′位置上的磷酸酯基团或羟基之外的低分子量有机基团共价相连的骨架糖的核酸。因此，经修饰的核酸可包括′-O-烷基化核糖基团。此外，经修饰的核酸可包括诸如阿拉伯糖或2′-氟阿拉伯糖之类的糖以替代核糖。因此，核酸在骨架组成上可以是异质的，从而含有连接在一起的聚合物单元的任意组合，例如肽-核酸(具有带核酸碱基的氨基酸骨架)。
核酸也包括诸如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代嘌呤修饰碱基之类的取代嘌呤和嘧啶。见Wagner RW等(1996)Nat.Biotechnol.14：840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤及其它天然或非天然的核碱基、取代的和未取代的芳香部分。其它这样的修饰对本领域技术人员是公知的。
与天然RNA和DNA相比，本发明的免疫刺激性寡聚核苷酸可涵盖各种化学修饰和取代，包括磷酸二酯核苷酸间桥、β-D-核糖单元和/或天然核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰的例子对本领域技术人员是公知的，并且在例如Uhlmann E等(1990)Chem.Rev.90：543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST等(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；和Hunziker J等(1995)Mod.Synth.Methods.7：331-417中描述。本发明的寡聚核苷酸可具有一种或多种修饰，其中与由天然DNA或RNA构成的相同序列的寡聚核苷酸相比，每种修饰位于特定的磷酸二酯核苷酸间桥上和/或在特定β-D-核糖单元上和/或在特定天然核苷酸碱基位置上。
例如，本发明涉及一种可包括一种或多种修饰的寡聚核苷酸，其中每种修饰独立地选自：
a)在核苷酸的3′和/或5′端由经修饰的核苷酸间桥替代磷酸二酯核苷酸间桥，
b)在核苷酸的3′和/或5′端由脱磷桥替代磷酸二酯核苷酸间桥，
c)由另一个单元替代来自糖磷酸酯骨架的糖磷酸酯单元，
d)由经修饰的糖单元替代β-D-核糖单元，和
e)由经修饰的核苷酸碱基替代天然核苷酸碱基。
寡聚核苷酸的化学修饰的更详细例子如下。
位于核苷酸的3′和/或5′端的磷酸二酯核苷酸间桥可由经修饰的核苷酸间桥替代，其中所述经修饰的核苷酸间桥例如选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NRlR2-氨基磷酸酯、硼代磷酸酯、α-羟基苄基磷酸酯、磷酸酯-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸酯-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基磷酸酯和/或(C6-C12)芳基磷酸酯桥、(C7-C12)-α-羟甲基-芳基(例如，在WO 95/01363中所公开)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基和(C6-C14)芳基选择性地被卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1和R2相互独立地是氢、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基，优选为氢、(C1-C8)-烷基，优选为(C1-C4)-烷基和/或甲氧基乙基，或者R1和R2与承载它们的氮原子一起形成5-6元杂环，该杂环还可以含有更多选自O、S和N的杂原子。
位于核苷酸的3′和/或5′端的磷酸二酯核苷酸间桥可由脱磷桥(脱磷桥的例子是Uhlmann E和Peyman A在“Methods in Molecular Biology”，Vol.20，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，Chapter 16，pp.355ff中所述者)替代，其中脱磷桥例如选自脱磷桥甲缩醛、3′-硫代甲缩醛、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基-肼撑、二亚甲基砜和/或甲硅烷基。
来自糖磷酸酯骨架(即，糖磷酸酯骨架由糖磷酸酯单元构成)的糖磷酸酯单元(即，β-D-核糖和磷酸二酯核苷酸间桥共同形成糖磷酸酯单元)可由其它单元替代，其中所述其它单元例如适合于构建“吗啉-衍生”寡聚物(例如在Stirchak EP等(1989)Nucleic.Acids.Res.17：6129-41中所述者)，即，例如，由吗啉衍生单元替代；或者构建聚酰胺核酸(“PNA”；例如在Nielsen PE等(1994)Bioconjug.Chem.5：3-7中所述)，即，例如由PNA骨架单元替代，例如2-氨基乙基甘氨酸。
β-核糖单元或β-D-2′-脱氧核糖单元可被经修饰的糖单元替代，其中所述经修饰的糖单元例如选自β-D-核糖、α-D-2′-脱氧核糖、L-2′-脱氧核糖、2′-F-2′-脱氧核糖、2′-F-阿拉伯糖、′-O-(C1-C6)烷基-核糖，优选为′-O-(C1-C6)烷基-核糖是2′-O-甲基核糖、′-O-(C2-C6)烯基-核糖、2′-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2′-NH2-2′-脱氧核糖、β-D-木糖-呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脱氧-β-D-赤式-己糖-吡喃糖和碳环(例如在Froehler J(1992)Am.Chem.Soc.114：8320中所述)和/或开链糖类似物(例如在Vandendriessche等(1993)Tetrahedron 49：7223中所述)和/或双环糖类似物(例如在Tarkov M等(1993)Helv.Chim.Acta.76：481中所说)。
在一些优选的实施方式中，糖是2′-O-甲基核糖，尤其是对于一个或两个由磷酸二酯或类磷酸二酯核苷酸间键相连的核苷酸而言。
核酸也包括取代嘌呤和嘧啶，诸如C-5丙炔嘧啶和7-脱氮-7-取代嘌呤修饰碱基。Wagner RW等(1996)Nat.Biotechnol.14：840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶和其它天然和非天然核碱基、取代或非取代的方向部分。
经修饰的碱基是与通常在DNA和RNA中发现的诸如T、C、G、A和U之类的天然碱基化学上不同但与这些天然碱基共用基本化学结构的任何碱基。经修饰的核苷酸碱基可以例如选自次黄嘌呤、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、2，4-二氨基-嘌呤、8-氮嘌呤、取代7-脱氮嘌呤，优选7-脱氮-7-取代和/或7-脱氮-8-取代嘌呤、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羟基脱氧胞苷脱氧胞苷、5-羟甲基脱氧胞苷、N4-烷基脱氧胞苷(例如N4-乙基脱氧胞苷)、6-硫代鸟苷和硝基吡咯的脱氧核糖核苷酸、C5-丙炔基嘧啶以及二氨基嘌呤(例如2，6-二氨基嘌呤)、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤或其它天然核苷酸碱基的修饰。该名单仅是示例性的，而不应被理解为限制性的。
在本文中所描述的具体结构式中定义了一套经修饰的碱基。例如，字母Y用于指代嘧啶，且在一些实施方式中指代含有胞嘧啶或修饰胞嘧啶的核苷酸。本文中所使用的修饰胞嘧啶是胞嘧啶的天然或非天然的嘧啶碱基类似物，其可以替代该碱基而不破坏寡聚核苷酸的免疫刺激活性。修饰胞嘧啶包括但不限于5-取代胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶、以及未取代或取代的5-炔基-胞嘧啶)、6-取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假-异胞嘧啶、具有稠环体系的胞嘧啶类似物(例如N，N′-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙烯基-尿嘧啶)。一些优选的胞嘧啶包括5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在其它本发明的实施方式中，胞嘧啶碱基被通用碱基(例如3-硝基吡咯、P-碱基)、芳香环体系(例如氟苯或二氟苯)或卤素原子(d间隔子)替代。
字母Z用于指代嘌呤、嘧啶或脱碱基残基，且在一些实施方式中指代鸟嘌呤或修饰鸟嘌呤碱基。本文中使用的修饰鸟嘌呤是鸟嘌呤的天然或非天然嘌呤碱基类似物，其可以替代该碱基而不破坏寡聚核苷酸的免疫刺激活性。修饰鸟嘌呤包括但不限于7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代鸟嘌呤(诸如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7-脱氮-8取代鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)8-取代鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤。在其它本发明的实施方式中，鸟嘌呤碱基被通用碱基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚和K-碱基)、芳环体系(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-甲酰胺)或氢原子(d间隔子)替代。
寡聚核苷酸可具有一个或多个可接近的5′端。可以形成具有两个这样的5′端的修饰寡聚核苷酸。这可以例如通过将两个寡聚核苷酸经3′-3键形成具有一个或两个可接近的5′端从而实现。所述3′-3′-键可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯任何其它修饰核苷酸间桥。实现这些键的方法在本领域中是已知的。例如，这些键已在Seliger，H.等，Oligonucleotideanalogs with terminal 3′-3′-and 5′-5′-internucleotidic linkages as antisenseinhibitors of viral gene expression，Nucleotides & Nucleotides(1991)，10(1-3)，469-77；以及Jiang等，Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro andin vivo properties，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1999)，7(12)，2727-2735中描述。
此外，其中位于3′-端核苷酸之间的键不是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它修饰桥的3′3′-连接核酸可利用诸如三或四-乙二醇磷酸酯部分之类的其它间隔子来制备(Durand，M.等，Triple-helix formation by anoligonucleotide containing one(dA)12and two(dT)12sequences bridged bytwo hexaethylene glycol chains，Biochemistry(1992)，31(38)，9197-204；美国专利5658738；和美国专利5668265)。另外一种方式，所述非核苷酸连接子可以采用标准氨基磷酸酯化学而衍生自乙二醇、丙二醇，或者衍生自脱碱基脱氧核糖(d间隔子)单元(Fontanel，Marie Laurence等，Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidicmoieties 5′-attached to oligonucleotides；Nucleic Acids Research(1994)，22(11)，2022-7)。所述非核苷酸连接子可以接入一次或多次，或者相互组合从而获得被连接的两个ODN的3′-端之间的任意距离。
寡聚核苷酸部分地耐受降解(例如，被稳定)。“稳定的寡聚核苷酸分子”应当指能相对耐受体内降解(例如通过外切或内切核酸酶)的寡聚核苷酸。核酸稳定可通过骨架修饰而实现。具有硫代磷酸酯键的寡聚核苷酸提供了最大活性并保护寡聚核苷酸免受细胞内外切和内切核酸酶降解。其它修饰寡聚核苷酸包括磷酸二酯修饰核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸组合、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基及其组合。
可使用采用氨基磷酸酯或者H-磷酸酯化学的自动技术合成经修饰的骨架诸如硫代磷酸酯。芳基-和烷基-磷酸酯可如美国专利4,469,863所述般进行制备；烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分如美国专利5,023,243和欧洲专利092,574所述般进行烷基化)可使用市售试剂通过自动固相合成而进行制备。制造其它DNA骨架修饰和替代的方法也已被描述(例如Uhlmann E和Peyman，A.，Chem.Rev.90：544，1990；Goodchild，J.，Bioconjugate Chem.1：165，1990)。
其它稳定的寡聚核苷酸包括：非离子DNA类似物，诸如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电荷的磷酸酯氧被烷基或芳基替换)；磷酸二酯；和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧部分被烷基化。在一个或两个终端处含有诸如四乙二醇或六乙二醇之类的二醇的核酸也已显示出能实际耐受核酸酶降解。
在一些实施方式中，寡聚核苷酸包括一个或多个回文序列。如本文中所使用，“回文”以及等同的“回文序列”应指倒置的重复，即，诸如ABCDEE′D′C′B′A′的序列，其中A和A′、B和B′等是能形成常规Watson-Crick碱基对的碱基。在一些情况下，回文是富含GC的。富含GC的回文是碱基组成为G和C占至少三分之二的回文。在一些实施方式中，富含GC的区域优选为“B细胞刺激域”的3′一侧。在10-碱基长的富含GC的回文的情况中，所述回文因此含有至少8个G和C。在12-碱基长的富含GC的回文的情况中，所述回文也含有至少8个G和C。在14聚体富含GC的回文的情况中，所述回文的至少十个碱基是G和C。在一些实施方式中，所述富含GC的回文完全由G和C组成。在一些实施方式中，所述寡聚核苷酸含有一个以上的回文序列。
DNA是经3′-5′磷酸二酯键相连的脱氧核糖核苷酸的聚合物。本发明的聚合物的单元也可经3′-5′磷酸二酯键相连。然而，本发明也涵盖具有异常核苷酸间键(具体包括5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′和2′-5′核苷酸间键)的聚合物。在一个实施方式中，尽管一个或多个这样的键可以出现在聚合物中其它地方，但这些异常键不包含在免疫刺激性DNA模体之外。对于具有游离末端的聚合物，包括一个3′-3′核苷酸间键可形成具有两个游离5′端的聚合物。反之，对于具有游离末端的聚合物，包括一个5′-5′核苷酸间键可形成具有两个游离3′端的聚合物。
本发明的免疫刺激性组合物可含有通过分枝单元相连的两个或多个免疫刺激性DNA模体。这些核苷酸间键可以是3′-5′、5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′或2′-5′键。因此，命名2′-5′是根据脱氧核糖的碳原子而选定的。然而，如果采用非天然糖部分，诸如环扩张糖类似物(例如，己糖、环己烯或吡喃糖)或者二环或三环糖类似物，则该命名根据单体的命名而改变。异常核苷酸间键可以是磷酸二酯键，但另外一种方式，也可以修饰为硫代磷酸酯或任何其它在本文中描述的修饰键。式IV显示了通过核苷酸分枝单元而成的分枝DNA寡聚物和本发明的修饰寡聚核糖核苷酸类似物的通用结构。因此，Nu1、Nu2和Nu3可通过3′-5′、5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′或2′-5′-键相连。DNA寡聚物的分枝也可涉及采用非核苷酸连接子和脱碱基间隔子。在一个实施方式中，Nu1、Nu2和Nu3表示相同的或不同的免疫刺激性DNA模体。
Figure A20078003596700431
式IV
修饰寡聚核糖核苷酸类似物可含有二倍子或三倍子单元(GlenResearch，Sterling，VA)，尤其是那些具有3′-3′键的修饰寡聚核糖核苷酸类似物。在一个实施方式中的二倍子单元可以基于1，3-二-[5-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊基氨基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-氨基磷酸酯。在一个实施方式中的三倍子可基于接入三-2，2，2-[3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-氨基磷酸酯。通过多个二倍子、三倍子或其它加倍单元造成的修饰寡聚核糖核苷酸的分枝形成树突，这是本发明的又一个实施方式。与所述类似物的非分枝形式相比，分枝的修饰寡聚核糖核苷酸类似物导致特别针对免疫刺激性RNA和DNA组合的具有独特免疫作用的受体诸如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的交联。此外，分枝或多体类似物可稳定DNA而耐降解，并且能使低效或部分有效的DNA序列发挥治疗水平的免疫活性。修饰寡聚脱氧核糖核苷酸也可含有源自于肽修饰剂或寡聚核苷酸修饰剂(Glen Research)的连接子单元。此外，修饰寡聚脱氧核糖核苷酸类似物可含有通过肽(酰胺)键与聚合物相连的一个或多个天然或非天然氨基酸残基。
3′-5′、5′-5′、3′-3′、2′-2′、2′-3′和2′-5核苷酸间键可以是直接或间接键。在该行文中直接键指如本文所公开的磷酸酯或修饰磷酸酯键，其不具有居间的连接子部分。居间的连接子部分是与本文中所公开的磷酸酯或修饰磷酸酯键不同的有机部分，其可包括例如聚乙二醇、三乙二醇、六乙二醇、d间隔子(即，脱碱脱氧核苷酸)、二倍子单元或三倍子单元。
所述键优选由C、H、N、O、S、B、P和卤素构成，含有3至300个原子。3个原子的例子是缩醛键(ODN1-3′-O-CH2-O-3′-ODN2)，其将例如一个核苷酸的3′-羟基连接到第二个寡聚核苷酸的3′-羟基。含有约300个原子的例子是PEG-40(四十聚乙二醇)。优选的键是磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯、酰胺、醚、硫醚、缩醛、硫代缩醛、脲、硫脲、磺胺、希夫碱和二硫键。也可以使用Solulink BioConjugation System，即(www.trilinkbiotech.com)。
如果寡聚核苷酸由两个或多个序列部分组成，这些部分可以是相同或不同的。因此，在具有3′3′-键的寡聚核苷酸中，所述序列可以是相同的5′-ODN1-3′3′-ODN1-5′或不同的5′-ODN1-3′3′-ODN2-5′。此外，各寡聚核苷酸部分以及将其连接的连接子的化学修饰可以是不同的。由于短寡聚核苷酸的摄取似乎不如长寡聚核苷酸的摄取有效，两个或多个短寡聚核苷酸的连接能导致提高的免疫刺激。短寡聚核苷酸的长度优选为2-20个核苷酸，更优选为3-16个核苷酸，最优选为5-10个核苷酸。优选具有两个或两个以上未连接的5′-端的连接寡聚核苷酸。
寡聚核苷酸部分序列也可以通过非核苷酸连接子相连。本文中所使用的“非核苷酸连接子”指任何非核苷酸或其聚合物(即聚核苷酸)的连接子部件，其中核苷酸包括嘌呤或嘧啶核碱基和糖磷酸酯，具体为脱碱基连接子(d间隔子)、三乙二醇单元或六乙二醇单元。其它优选的连接子是诸如C3、C6、C12氨基连接子之类的烷基氨基连接子和诸如C3或C6硫醇连接子之类的烷基硫醇连接子。这些寡聚核苷酸也可以通过芳香性残基相连，所述芳香性残基可进一步被烷基或取代烷基所取代。
为有助于摄取进入细胞，在一些实施方式中的免疫刺激性寡聚核苷酸长度为3至100个碱基。在一些实施方式中，寡聚核苷酸长度为7-100个碱基。通常，如果存在足够的免疫刺激模体，长度超过6个核苷酸(甚至数个kb长)的核酸能诱导根据本发明的免疫应答。然而，本发明的修饰寡聚核苷酸的提高的免疫刺激能力为免疫刺激分子提供了短得多的长度。在一些实施方式中，免疫刺激性寡聚核苷酸的长度为3-6个碱基。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可在本发明的一些方面用作治疗具有患过敏或哮喘、被传染性生物体感染或其中特定癌症抗原已被鉴定的癌症的风险的受试对象的疫苗。也可以在没有抗原或过敏原的情况下给予CpG免疫刺激性寡聚核苷酸以保护受试者免于患感染、过敏或癌症，在此情况下，重复剂量可进行更长期的保护。本文中所使用的具有风险的受试对象是具有暴露于导致感染的病原体或癌症或过敏原中的任何风险或具有患癌症的风险的受试对象。例如，具有风险的受试对象可以是计划到发现了特殊类型传染剂的地区旅游的受试对象，可以是由于生活方式或医疗过程而暴露于含有传染性生物体的体液或直接暴露于所述生物体、或者甚至与在已鉴别出传染性生物体或过敏原的区域中生活的受试对象进行接触的受试对象。具有患感染的风险的受试对象也包括医疗组织向其推荐具有特定传染性生物体抗原的疫苗的普通人群。如果抗原是过敏原，受试对象对该特定抗原出现过敏反应，且受试对象可能暴露于该抗原(例如，在花粉季节)，则受试对象具有暴露于该抗原的风险。具有患过敏或哮喘风险的受试对象包括那些已被鉴定为患有过敏或哮喘但在CpG免疫刺激性寡聚核苷酸治疗期间未出现活性疾病的受试对象，以及那些由于基因或环境因素而被认为具有患这些疾病的风险的受试对象。
具有患癌症的风险的受试对象是很有可能患癌症的受试对象。这些受试对象包括，例如，具有其存在已被证实与更高的患癌症的可能性有关的基因异常的受试对象，以及暴露于诸如烟草、石棉或其它化学毒素之类的致癌剂的受试对象，或者之前已因为癌症进行治疗并且表现出复发的受试对象。当具有患癌症风险的受试对象用对该受试对象具有风险患上的那种癌症类型具有特异性的抗原和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸进行治疗时，受试对象可以在癌症细胞发展时杀灭癌症细胞。如果在受试对象中开始形成肿瘤时，所述受试对象将出现特异性免疫应答以抵抗该肿瘤抗原。
除使用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸用于预防性治疗之外，本发明还包括使用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸治疗患有感染、过敏、哮喘或癌症的受试对象。
患感染的受试对象是已暴露于传染性病原体并在体内出现急性或慢性可检测水平的病原体的受试对象。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可伴有或者不伴有抗原而用于引起能够降低传染性病原体水平或者清除传染性病原体的抗原特异性全身性或粘膜性免疫应答。如本文中所使用，传染性疾病是由于在身体中存在外来微生物而导致的疾病。尤其重要的是开发出有效免疫策略和治疗以保护身体粘膜表面，身体粘膜表面是病原进入的首要位置。
患有过敏的受试对象是患有或者具有患响应过敏原的过敏反应的受试对象。过敏指对物质(过敏原)的后天超敏性。过敏性病症包括但不限于湿疹、过敏性鼻炎或鼻炎、花粉热、结膜炎、支气管哮喘、荨麻疹(麻疹)和食物过敏以及其它遗传过敏性病症。
过敏通常由抗无害过敏原而产生的IgE抗体导致。由CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的全身性或粘膜性施用诱导的细胞因子主要是被称之为Th1的一类(例子有IL-12、IP-10、IFN-α和IFN-γ)，并且它们同时诱导体液和细胞免疫应答。另一种主要类型的免疫应答与IL-4和IL-5细胞因子的产生相关，其被称为Th2免疫应答。通常，似乎免疫疾病是由Th2型免疫应答介导的。基于CpG免疫刺激性寡聚核苷酸改变受试对象体内的免疫应答由占主要的Th2(与IgE抗体和过敏相关)变为平衡的Th2/Th1应答(保护免受过敏反应)，诱导CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的过敏应答的有效剂量可施用给受试对象以治疗或防治哮喘和过敏。
因此，CpG免疫刺激性寡聚核苷酸在诸如哮喘之类的过敏和非过敏病症的治疗中具有显著的治疗效用。Th2细胞因子，尤其是IL-4和IL-5，在哮喘受试对象的气道中升高。这些细胞因子促进哮喘炎性应答的重要方面，包括IgE同位素切换、嗜酸性粒细胞趋化性和活化和肥大细胞生长。Th1细胞因子，尤其是IFN-γ和IL-12，能抑制Th2克隆的形成和Th2细胞因子的产生。哮喘指呼吸系统疾病，其特征在于发炎、气道狭窄和气道对被吸入的试剂的提高的反应性。哮喘通常但非绝对性地与遗传过敏性或过敏症状相关。
患癌症的受试对象是具有可检测到的癌细胞的受试对象。癌症可以是恶性或非恶性癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳腺癌；子宫颈癌；绒癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌和肾癌；以及其它癌及肉瘤。在一个实施方式中，癌症是毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤T细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱癌或结肠癌。
受试对象应指人类或脊椎动物，包括但不限于狗、猫、猫、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡、例如猴之类的灵长类和例如鲑鱼之类的鱼(水产物种)。因此，本发明也可用于治疗非人受试对象的癌症和肿瘤、感染和过敏/哮喘。癌症是伴侣动物(即，猫和狗)死亡的主要原因之一。
如本文中所使用的，当针对诸如传染性疾病、癌症、过敏或哮喘之类的病症来使用时，术语治疗、已治疗或治疗中指预防性治疗及在受试对象已患疾病之后的治疗，所述预防性治疗提高受试对象对患所述疾病(例如感染病原体)的抵抗力，或者换言之，降低受试对象患所述疾病(例如被病原体感染)的可能性；且所述在受试对象已患疾病之后的治疗对抗所述疾病(例如减少或消除感染)或防止疾病恶化。
在将CpG寡聚核苷酸与抗原一起施用的情况下，受试对象暴露于抗原。如本文中所使用的，术语“暴露于”是指受试对象与抗原的主动接触或受试对象对抗原的体内被动暴露。受试对象对抗原的主动暴露方法在本领域中是公知的。通常，通过诸如静脉注射、肌肉注射、经口、透皮、经粘膜、鼻内、气管内或皮下注射施用等任何方式直接向受试对象施用抗原。抗原可全身施用或局部施用。抗原和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的施用方法在以下更详细地进行描述。当抗原变得可暴露于体内的免疫细胞时，受试对象被动暴露于抗原。受试对象可例如通过外来病原体进入体内或通过在其表面表达外来抗原的肿瘤细胞的发展从而被动地暴露于抗原。
其中受试对象被动暴露于抗原的方法可特别依赖于CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的施用时机。例如，在具有患癌症或传染性疾病或过敏或哮喘性应答的风险的受试对象中，当风险最大时，即在过敏季节或在暴露于致癌剂之后，可以定期向受试对象施用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸。此外，在旅行者前往他们具有暴露于传染性媒介风险的国外地区旅行之前可向其施用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸。同样，可向具有暴露于生化战争风险的士兵或平民施用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸从而在受试对象暴露于抗原时诱导对所述抗原的全身性或粘膜免疫应答。
本文中所使用的抗原是能激起免疫应答的分子。抗原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖轭合物、多糖的肽或非肽模拟物以及其它分子、小分子、脂质、糖脂、碳水化合物、病毒和病毒提取物和多细胞生物体诸如寄生虫和过敏原。术语抗原广泛地包括被宿主免疫系统识别为外来的任何类型的分子。抗原包括但不限于癌抗原、微生物抗原和过敏原。
本文中所使用的癌抗原是与肿瘤或癌细胞表面相连的化合物诸如肽或蛋白质，当其依据MHC分子而在抗原呈递细胞表面表达时能够激起免疫应答。可通过例如在Cohen等，1994，Cancer Research，54：1055中所述制备癌细胞粗提取物，通过部分纯化抗原，通过重组技术，或者通过已知抗原的重新合成而从癌细胞制备癌抗原。癌抗原包括但不限于是能重组表达的抗原，肿瘤或癌症的免疫原部分或整个肿瘤或癌症。这些抗原可根据本领域中已知的任何其它方法进行分离或重组制备。
本文中所使用的微生物抗原是微生物的抗原，包括但不限于病毒、细菌、寄生虫和真菌。这些抗原包括完整的微生物及其天然分离物和片段或衍生物，以及与天然微生物抗原相同或者相似并能诱导对该微生物具有特异性的免疫应答的合成化合物。如果化合物诱导对天然微生物抗原的免疫应答(体液的和/或细胞的)，则其与天然微生物抗原相似。这些抗原在本领域中经常使用并且对于本领域技术人员是广为所知的。
病毒是小的传染性媒介，其通常含有核酸核心和蛋白质外壳，但不是独立存活的生物体。病毒也可以采取缺失蛋白的传染性核酸的形式。病毒在没有活体细胞时不能存活，其能在活体细胞中进行复制。病毒通过细胞内吞作用或直接注入DNA(噬菌体)而进入特定活体细胞并繁殖，导致疾病。繁殖的病毒随后能被释放并感染其它细胞。一些病毒是含有DNA的病毒，其它是含有RNA的病毒。DNA病毒包括痘病毒(Pox)、疱疹病毒(Herpes)、腺病毒(Adeno)、乳多空病毒(Papova)、细小病毒(Parvo)和嗜肝DNA病毒(Hepadna)。RNA病毒包括微小核糖核酸病毒(Picorna)、杯状病毒(Calici)、Astro、披膜样病毒(Toga)、黄病毒(Flavi)、冠状病毒(Corona)、副粘液病毒(Paramyxo)、正粘病毒(Orthomyxo)、布尼亚病毒(Bunya)、沙粒病毒(Arena)、弹状病毒(Rhabdo)、丝状病毒(Filo)、波尔纳病毒(Borna)、呼肠孤病毒(Reo)和逆转录病毒(Retro)。在一些方面，本发明也意图治疗其中在病程中牵涉到朊病毒的疾病诸如例如动物中的牛海绵状脑病(即疯牛病，BSE)或羊瘙痒症，或人类中的克罗伊茨费尔特-雅各布病。
病毒包括但不限于肠道病毒(包括但不限于小RNA病毒科(picornaviridae)病毒家族，诸如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒)、轮状病毒(rotaviruses)、腺病毒和肝炎病毒比如肝炎甲、乙、丙、丁、戊型病毒。已在人类中发现的病毒的具体例子包括但不局限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人类免疫缺陷性病毒，诸如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；以及其它分离株，诸如HIV-LP))；小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，骨髓灰白质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒，人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；Calciviridae(例如，导致胃肠炎的病毒株)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；管状病毒科(Coronaviridae)(例如，日冕形病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、phlebo病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、orbiviurses和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；微细小病毒科(Parvoviridae)(微细小病毒)；乳多泡病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(最主要是腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV))；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)；及其它病毒急性哮吼伴随病毒、A病毒、考波希肉瘤相关的疱疹疱疹病毒、新城疫病毒、尼帕病毒(Nipahvirus)、诺沃克病毒(Norwalkvirus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、副流感病毒、禽流感、SARs病毒和西尼罗河病毒。
本发明的方法在一些实施方式中特别有用于治疗人类免疫缺陷性病毒(HIV)和肝炎病毒。HIV，一种逆转录病毒，也称为人类T-细胞淋巴细胞病毒III(HTLV III)，其造成导致称之为AIDS的疾病的恶化。HIV感染并摧毁T细胞，扰乱免疫系统的整体平衡，导致患者与其它感染斗争的能力，使患者有更大的机会患通常为致命的感染。
病毒性肝炎是肝脏的炎症，其可造成肿胀、触痛并且有时候造成肝脏的永久损伤。如果肝脏的炎症持续至少六个月或者更长，则称之为慢性肝炎。已知存在至少五种不同的病毒导致肝炎，包括甲、乙、丙、丁、戊型肝炎。甲型肝炎通常通过被人类粪便污染的食物或饮用水传染。乙型肝炎通常通过体液诸如血液传播。例如，可在分娩时由母亲传染给婴儿、通过性接触、污染的血液输血和针头传播。丙型肝炎很常见并且类似于乙型肝炎，其通常通过输血和污染的针头传播。丁型肝炎大多在为与之共同相关的乙肝病毒携带者的IV药物使用者中发现。戊型肝炎与病毒性甲型肝炎相似，通常与较差的卫生状况有关。
革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均为脊椎动物体的抗原。这些革兰氏阳性菌包括但不限于巴氏杆菌属(Pasteurella)、葡萄球菌属(Staphylococci)和链球菌属(Streptococcus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)和沙门氏菌属(Salmonella)。传染性细菌的具体例子包括但不限于幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、侵肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sps)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、贪食分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A类链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B类链球菌)、链球菌(Streptococcus)(草绿色类(viridians))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(Streptococcus)(厌氧属(anaerobic sps.))、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、病原性弯曲杆菌属(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、类杆菌属(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponemapallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)、和衣氏放线菌(Actinomycesisraelli)。
真菌的例子包括新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。
其它传染性生物体(即原生生物)包括疟原虫属(Plasmodium spp.)，诸如镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)和间日疟原虫(Plasmodiumvivax)和龚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。血液传播和/或组织寄生虫包括疟原虫属(Plasmodium spp.)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、分离巴贝虫(Babesia divergens)、热带利什曼虫(Leishmania tropica)、利什曼原虫(Leishmania spp.)、巴西利什曼虫(Leishmania braziliensis)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)和罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)、南美洲锥虫(Trypanosoma cruzi)(沙加斯疾病)和龚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。
其它医学相关的微生物已在文献中广泛地进行了描述，例如参见C.G.A Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain1983，其全部内容在此以引用的方式引入。
过敏原指能在易感受试对象中诱导过敏性或哮喘应答的物质(抗原)。过敏原的列表将非常庞大并且可包括花粉、昆虫毒素、动物毛屑、真菌孢子和药物(例如盘尼西林)。天然、动物和织物过敏原的例子包括但不限于以下具体属的蛋白质：犬属(家犬)；尘螨属(例如粉尘螨(Dermatophagoides farinae))；猫属(家猫)；Ambrosia(Ambrosiaartemiisfolia)；黑麦草属(Lolium)(例如黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multiflorum))；柳杉(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeriajaponica))；交链孢属(链格孢)；赤杨(Alder)；赤杨属(Alnus)(Alnusgultinoasa)；桦属(Betula)(疣皮桦(Betula verrucosa))；栎属(Quercus)(白栎(Quercus alba))；木樨榄属Olea(油橄榄(Olea europa))；蒿(Artemisia)(艾蒿(Artemisia vulgaris))；车前属(Plantago)(例如长叶车前(Plantagolanceolata))；墙草属(Parietaria)(例如药用墙草(Parietaria officinalis)或者犹大墙草(Parietaria judaica))；小蠊属(Blattella)(例如德国小蠊(Blattella germanica)；蜂(Apis)(例如黑麦草蜂(Apis multiflorum))；柏木属(Cupressus)(例如地中海柏(Cupressus sempervirens)、绿杆柏(Cupressus arizonica)、金叶大果柏(Cupressus macrocarpa))；桧属(Juniperus)(例如Juniperus sabinoides、铅笔柏(Juniperus virginiana)、欧洲刺柏(Juniperus communis)和德州雪松(Juniperus ashei))；侧柏属(Thuya)(例如侧柏(Thuya orientalis))；扁柏属(Chamaecyparis)(例如日本扁柏(Chamaecyparis obtuse))；大蠊属(Periplaneta)(例如美洲大蠊(Periplaneta americana))；冰草属(Agropyron)(例如匍匐冰草(Agropyronrepens))；黑麦属(Secale)(例如黑麦(Secale cereale))；小麦(Triticum)(例如小麦(Triticum aestivum))；鸭茅属(Dactylis)(例如鸭茅(Dactylisglomerata))；羊茂属(Festuca)(例如高羊茅(Festuca elatior))；早熟禾属(Poa)(例如草地早熟禾(Poa pratensis)或扁早熟禾(Poa compressa))；燕麦属(Avena)(例如燕麦(Avena sativa))；绒毛草属(Holcus)(例如绒毛草(Holcus lanatus))；黄花茅属(Anthoxanthum)(例如黄花茅(Anthoxanthumodoratum))、燕麦草属(Arrhenatherum)(例如燕麦草(Arrhenatherumelatius))；翦股颖属(Agrostis)(例如小糠草(Agrostis alba))；梯牧草属(Phleum)(例如梯牧草(Phleum pratense))；虉草属(Phalaris)(例如虉草(Phalaris arundinacea))；毛花雀稗(Paspalum)(例如百喜草(Paspalumnotatum))；高粱(Sorghum)(例如约翰逊草(Sorghum halepensis))和雀麦属(Bromus)(例如无芒雀麦(Bromus inermis)。
本文中使用的术语“基本纯净”指基本上不含有与之天然相关的其它蛋白质、脂质、碳水化合物或其它材料的多肽。本领域技术人员能采用用于蛋白质纯化的标准技术纯化病毒或细菌多肽。这些基本纯净的多肽通常在非还原聚丙烯酰胺凝胶上形成单一主要条带。在部分糖基化多肽或者具有数个开始密码子的情况下，在非还原聚丙烯酰胺凝胶上可以有多条带，但这些带将形成该多肽的特征图形。病毒或细菌多肽的纯度可由氨基端氨基酸序列分析进行测定。非核酸载体编码的其它类型的抗原诸如多糖、小分子、模拟物等也包括在本发明中
本发明的寡聚核苷酸可以与抗微生物剂一起施用给受试对象。本文中所使用的抗微生物剂指能杀灭或抑制传染性微生物的天然或合成化合物。根据本发明可用的抗微生物剂类型将取决于受试对象所感染的或者具有被其感染的风险的微生物类型。抗微生物剂包括但不限于抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂。诸如“抗感染剂”、“抗细菌剂”、“抗病毒剂”、“抗真菌剂”、“抗寄生虫剂”和“杀寄生虫剂”之类的短语对于本领域技术人员来说已有明确含义，并且已在标准医学教科书中定义。简言之，抗细菌剂杀灭或抑制细菌，并包括抗生素以及具有相似功能的其它合成或天然化合物。抗生素是能通过细胞诸如微生物产生次级代谢物的低分子量分子。通常而言，抗生素干扰微生物特有的在宿主细胞中并不存在的一个或多个细菌功能和结构。抗病毒剂可从天然来源中分离或者合成，并可用于杀灭或抑制病毒。抗真菌剂用于治疗表面真菌感染以及机会感染和原发性全身真菌感染。抗寄生虫剂杀灭或抑制寄生虫。
可用于人类施用的抗寄生虫剂(也称为杀寄生虫剂)的例子包括但不限于阿苯达唑、两性霉素B、苄硝唑、硫氯酚、氯喹盐酸盐、氯喹磷酸盐、氯脱氧林肯霉素、去氢吐根碱、二乙基氨基甲吖嗪、二氯尼特糠酸盐或酯、依氟鸟氨酸、furazolidaone、糖皮质激素、卤泛群、碘化奎宁、异阿凡曼菌素、磺唑氨酯、甲氟喹、葡甲胺锑酸盐、美拉胂醇、美曲膦酯、依氟鸟氨酸、灭绦灵、硝呋噻氧、羟胺硝喹、巴龙霉素、异硫化羟酸羟乙基磺酸盐、哌嗪、吡喹酮、伯氨喹啉磷酸盐、白乐君、双羟萘酸喹嘧啶、乙胺嘧啶-氨磺酰、乙胺嘧啶-磺胺多辛、奎吖因盐酸盐、硫酸奎宁、葡糖酸奎尼定、螺旋霉素、葡萄糖酸锑钠(stibogluconate sodium(sodium antimony gluconate))、拜尔205、四环素、强力霉素、噻菌灵、磺甲硝咪唑、三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异恶唑和对氨甲酰甲胺苯胂酸钠，其中一些可单独使用或与其它组合使用。
抗细菌剂杀灭或抑制细菌的生长或功能。一大类抗细菌剂是抗生素。能有效杀灭或抑制大范围细菌的抗生素称之为光谱抗生素。其它类型的抗生素主要有效地抗革兰氏阳性或革兰氏阴性类的细菌。这些类型的抗生素称之为狭谱抗生素。能抗单一生物体或疾病而不抗其它类型的细菌的抗生素称之为受限谱抗生素。抗细菌剂有时候根据其主要作用模式进行分类。通常，抗细菌剂是细胞壁合成抑制剂、细胞膜抑制剂、蛋白合成抑制剂、核酸合成或功能抑制剂和竞争抑制剂。
抗病毒剂是能防止细胞被病毒感染或细胞内病毒复制的化合物。相比抗细菌剂药物，抗病毒药物少很多，这是因为病毒复制的过程与宿主细胞中的DNA复制紧密相关，而非特异性抗病毒剂通常对宿主也是有毒的。病毒感染过程中存在多个阶段可被抗病毒剂阻断或抑制。这些阶段包括病毒附着于宿主细胞(免疫球蛋白或结合肽)、病毒脱壳(例如金刚烷胺)、病毒mRNA的合成或翻译(例如干扰素)、病毒RNA或DNA的复制(例如核苷酸类似物)、新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制剂)和病毒出芽和释放。
核苷酸类似物是与核苷酸相似但具有不完整的或异常的脱氧核糖或核糖基团的合成化合物。一旦核苷酸类似物在细胞中，它们被磷酰化，形成与正常核苷酸竞争进入病毒DNA或RNA的三磷酸酯形式。一旦核苷酸类似物的三磷酸酯形式进入生长中的核酸链，它导致与病毒聚合酶的不可逆结合从而造成链终止。核苷酸类似物包括但不限于阿昔洛韦(acyclovir)(用于单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒的治疗)、更昔洛韦(gancyclovir)(用于巨细胞病毒的治疗)、碘苷(idoxuridine)、利巴韦林(ribavirin)(用于呼吸道合胞病毒的治疗)、二脱氧肌苷、二脱氧胞苷、叠氮胸苷(azidothymidine)、咪喹莫特(imiquimod)和瑞咪喹莫特(resimiquimod)。
干扰素是由病毒感染细胞以及免疫细胞分泌的细胞因子。干扰素通过与感染细胞相邻的细胞上的特异性受体相结合而发挥作用，从而导致细胞发生变化以保护其免受病毒感染。α和β-干扰素也诱导感染细胞表面上I类和II类MHC分子的表达，导致更多的抗原呈现以供宿主免疫细胞识别。α和β-干扰素以重组形式提供并用于慢性乙肝和丙肝感染的治疗。以有效进行抗病毒治疗的剂量，干扰素有严重的副作用，诸如发热、不适和体重降低。
可用于本发明的抗病毒剂包括但不限于免疫球蛋白、金刚烷胺、干扰素、核苷酸类似物和蛋白酶抑制剂。抗病毒剂的具体例子包括但不限于醋孟南(Acemannan)；阿昔洛韦(Acyclovir)；阿昔洛韦钠；阿德福韦酯(Adefovir)；阿罗夫定(Alovudine)；阿韦舒托(Alvircept Sudotox)；盐酸金刚烷胺；阿拉诺丁(Aranotin)；阿立酮(Arildone)；阿替韦啶(Atevirdine)甲磺酸盐；阿夫立定(Avridine)；西多弗韦(Cidofovir)；西潘茶碱(Cipamfylline)；盐酸阿糖胞苷；地拉韦啶(Delavirdine)甲磺酸盐；地昔洛韦(Desciclovir)；去羟肌苷(Didanosine)；二恶沙利(Disoxaril)；依度尿苷(Edoxudine)；恩韦拉登(Enviradene)；恩韦肟(EnViroxime)；泛昔洛韦(Famciclovir)；抑感灵盐酸盐(Famotine Hydrochloride)；非西他滨(Fiacitabine)；非阿尿苷(Fialuridine)；磷利酯(Fosarilate)；膦甲酸钠(Foscarnet sodium)；膦乙醇钠(Fosfonet sodium)；更昔洛韦(Ganciclovir)；更昔洛韦钠；碘苷；乙氧二羟丁酮(Kethoxal)；拉米夫定(Lamivudine)；洛布卡韦(Lobucavir)；美莫汀(Memotine)盐酸盐；美替沙腙(Methisazone)；萘维拉平(Nevirapine)；喷昔洛韦(Penciclovir)；吡罗达韦(Pirodavir)；利巴韦林(Ribavirin)；盐酸金刚乙胺(RimantadineHydrochloride)；沙奎那维(Saquinavir)甲磺酸盐；索金刚胺(Somantadine)盐酸盐；索立夫定(Sorivudine)；匐支青霉菌素(Statolon)；司他夫定(Stavudine)；双二乙氨乙基芴酮(Tilorone)盐酸盐；曲氟尿苷(Trifluridine)；盐酸伐昔洛韦(Valacyclovir Hydrochloride)；阿糖腺苷(Vidarabine)；阿糖腺苷磷酸盐；阿糖腺苷磷酸钠；韦罗肟(Viroxime)；扎西他滨(Zalcitabine)；齐多夫定(Zidovudine)和净韦肟(Zinviroxime)。
抗真菌剂可用于传染性真菌的治疗和防治。抗真菌剂有时候根据其作用机理进行分类。一些抗真菌剂通过抑制葡萄糖合成酶作为细胞壁抑制剂。这些包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌剂通过使细胞膜整体性失稳而起作用。这些包括但不限于咪唑诸如克霉唑、sertaconzole、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和voriconacole，以及FK 463、两性霉素B、BAY 38-9502、MK 991、pradimicin、UK 292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌剂通过破坏甲壳素(例如几丁质酶)或免疫抑制(501霜)起作用。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸能与其它治疗剂诸如佐剂联合以增强免疫应答。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和其它治疗剂可同时施用或依序施用。当其它治疗剂同时施用时，可以在同一制剂或独立的制剂中施用，但同时施用。当其它治疗剂和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸时间上分离时，另一治疗剂与在另一治疗剂以及与CpG免疫刺激性寡聚核苷酸依序施用。这些化合物的施用之间的时间间隔可以为数分钟或者更长。其它治疗剂包括但不限于佐剂、细胞因子、抗体、抗原等。
本发明的组合物可以与非核酸佐剂一起施用。非核酸佐剂是除本文所描述的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸之外的能刺激体液和/或细胞免疫应答的任何分子或化合物。非核酸佐剂包括例如能形成depo作用的佐剂、免疫刺激佐剂和能形成depo作用并刺激免疫系统的佐剂。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也可用做粘膜佐剂。先前已发现全身和粘膜免疫性可被CpG核酸的粘膜输送诱导。因此，所述寡聚核苷酸能与其它粘膜佐剂联合施用。
通过细胞因子(Bueler & Mulligan，1996；Chow等，1997；Geissler等，1997；Iwasaki等，1997；Kim等，1997)或B-7共刺激性分子(Iwasaki等，1997；Tsuji等，1997)与CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的共同施用或者共线表达也可诱导或增加免疫应答。术语细胞因子用作各类在纳摩尔至皮摩尔浓度下作为体液调节剂并且在正常或者病理条件下介导独立细胞和组织的功能活性的可溶性蛋白质和肽的通用名称。这些蛋白也直接介导细胞间相互作用并且调节在细胞外环境中发生的过程。细胞因子的例子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(γ-IFN)、IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3配体和CD40配体。
寡聚核苷酸也可用于将来自Th2的免疫应答重新指向Th1免疫应答。这导致形成相对平衡的Th1/Th2环境。来自于Th2的免疫应答重新指向Th1免疫应答可通过测量响应于所述核酸而产生的细胞因子水平而进行评估(例如，通过诱导单核细胞和其它细胞从而产生Th1细胞因子，包括IL-12、IFN-γ和GM-CSF)。来自于Th2的免疫应答重新指向或者重新平衡至Th1应答对于哮喘的治疗或防治特别有用。例如，治疗哮喘的有效量可以是能用于将与哮喘相关的Th2型免疫应答重新指向Th1型应答或者平衡的Th1/Th2环境的量。在哮喘受试对象气道中的Th2细胞因子，尤其是IL-4和IL-5增加。本发明的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸导致Th1细胞因子的增加，有助于重新平衡免疫系统、防止或减少与占主要的Th2免疫应答相关的副作用
本发明的寡聚核苷酸可用于治疗气道重塑(airway remodeling)。气道重塑源自于气道中平滑肌细胞增殖和/或粘膜增厚，并最终导致气道狭窄而限制气流。本发明的寡聚核苷酸可防止进一步重塑并甚至可能减少源自于重塑过程的组织堆积。
寡聚核苷酸也可用于改善树突状细胞的存活、分化、活化和成熟。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸具有能促进树突状细胞的细胞存活、分化、活化和成熟的独特能力。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也提高自然杀伤细胞的胞解活性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。可使用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸以及细胞目标诸如癌细胞的特异性抗体进行ADCC。当CpG免疫刺激性寡聚核苷酸与所述抗体一起施用于受试对象时，受试对象的免疫系统被诱导以杀灭肿瘤细胞。在ADCC中可用的抗体包括能与体内细胞相互作用的抗体。许多这样的细胞目标特异性抗体已在本领域中得以描述并且许多可从商业途径获得。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也可与抗癌疗法联合施用。抗癌疗法包括癌症药物、放射和手术过程。如本文中所使用的，“癌症药物”指出于治疗癌症的目的向受试对象施用的试剂。本文所使用的“治疗癌症”包括防止癌症发展、减少癌症症状和/或抑制已形成的癌症的生长。在其它方面，出于减小患癌症的风险的目的向具有患癌症风险的受试对象施用癌症药物。在本文中描述了各种类型的用于癌症治疗的药物。为本说明书的目的，癌症药物分类为化疗试剂、免疫疗法试剂、癌症疫苗、荷尔蒙疗法和生物应答修改剂。
此外，本发明的方法意图包括一种以上的癌症药物和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的联合使用。举例，当适合时，CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可以与化疗剂和免疫疗法试剂共同施用。另外一种方式，癌症药物可包括免疫疗法试剂和癌症疫苗或者化疗剂和癌症疫苗或者化疗剂、免疫疗法试剂和癌症疫苗，出于治疗患有癌症或者具有患癌症风险的受试对象的目的将所有均施用给一个受试对象。
所述化疗剂可选自甲氨蝶呤(methotrexate)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、含有氯乙基硝基的非糖来源、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素(mitomycin C)、博莱霉素(bleomycin)、阿霉素(doxorubicin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、紫杉醇(taxol)、泛戈林(fragyline)、葡甲胺GLA、戊柔比星(valrubicin)、卡姆司坦恩(carmustaine)和泼立氟泼散(poliferposan)、MMI270、BAY12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/罗莫特松(Lometexol)、格兰莫雷克(Glamolec)、CI-994、TNP-470、和美新(Hycamtin)/托泊替康(Topotecan)、PKC412、伐司朴达(Valspodar)/PSC833、诺消灵(Novantrone)/米托蒽醌(Mitroxantrone)、美他特(Metaret)/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、英赛尔(Incel)/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马迷司他(Marmistat)、BB2516/马迷司他(Marmistat)、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP 2202、FK 317、毕西巴尼(Picibanil)/OK-432、AD 32/戊柔比星(Valrubicin)、美他特龙(Metastron)/锶衍生物、泰道(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、伊瓦瑟(Evacet)/脂质体阿霉素、紫杉醇(Yewtaxan)/紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇(Taxol)/紫杉醇(Paclitaxel)、Xeload/卡培他滨、氟铁龙(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、环派克斯(Cyclopax)/口服紫杉醇、口服Taxoid、SPU-077/顺铂(Cisplatin)、HMR 1275/弗拉平度(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟(Tegafur)/尿嘧啶)、尔吉咪唑(Ergamisol)/左旋咪唑、氟尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强子、开普拓(Campto)/左旋咪唑、坎普特莎(Camptosar)/伊立替康(Irinotecan)、Tumodex/Ralitrexed、乐司他丁(Leustatin)/克拉利宾(Cladribine)、紫杉醇(Paxex)/紫杉醇(Paclitaxel)、多丝尔(Doxil)/脂质体阿霉素、楷莱(Caelyx)/脂质体阿霉素、福达华(Fludara)/氟达拉滨(Fludarabine)、表柔比星(Pharmarubicin)/表阿霉素、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis-Naphtalimide、LU 103793/多拉司坦(Dolastain)、Caetyx/脂质体阿霉素、健择(Gemzar)/吉西他滨(Gemcitabine)、ZD 0473/Anormed、YM 116、碘种子、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/美司那(Mesnex)/异环磷酰胺(Ifosamide)、卫萌(Vumon)/替尼泊甙(Teniposide)、伯尔定(Paraplatin)/卡铂(Carboplatin)、Plantinol/顺铂(cisplatin)、足叶乙甙(Vepeside)/依托泊苷()、ZD 9331、泰索帝(Taxotere)/多西紫杉醇(Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖胞苷药物前体、紫杉类似物、nitrosoureas、烷基化试剂诸如美芬兰(melphelan)和环磷酰胺(cyclophosphamide)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、马利兰(Busulfan)、卡铂(Carboplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorombucil)、阿糖胞苷盐酸盐(Cytarabine HCI)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin HCl)、雌莫司汀(Estramustine)磷酸钠、足叶乙甙(VP16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU的)、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(羟基碳酰二胺脲)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、干扰素Alfa-2a、Alfa-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH释放因子类似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、盐酸氮芥(Mechlorethamine HCl)(氮芥子气)、巯基嘌呤、美司那(Mesna)、米托坦(Mitotane)(op′-DDD)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥曲肽(Octreotide)、光辉霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine)、链佐星(Streptozocin)、枸橼酸他莫昔芬(Tamoxifen citrate)、硫代鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、硫酸长春碱(Vinblastine)、胺苯丫啶(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、促红细胞生成素(Erthropoietin)、六甲三聚氰胺(HMM)、白细胞介素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG；甲基乙二醛双咪腙；MGBG)、喷司他丁(Pentostatin)(2′-脱氧肋间型霉素(2′-deoxycoformycin))、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)和硫酸长春地辛(Vindesine)，但并非仅限于此。
免疫治疗剂可选自瑞布他辛(Ributaxin)、赫塞汀(Herceptin)、奎左门特(Quadramet)、盘诺瑞克斯(Panorex)、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、昂可林(Oncolym)、SMART M195、ATRAGEN、欧瓦瑞克斯(Ovarex)、百克沙(Bexxar)、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、塞尼哌(Zenapax)、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、预靶定(Pretarget)、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、anti-FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART 1D10Ab、SMART ABL 364Ab andImmuRAIT-CEA，但并非局限于此。
癌症疫苗可选自EGF、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神经节苷脂结合疫苗、Her2/neu、欧瓦瑞克斯(Ovarex)、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL色拉特普(theratope)、BLP25(MUC-1)、脂质体独特型疫苗、美拉辛(Melacine)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、MVA-类疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，但并非局限于此。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸与免疫治疗剂诸如单克隆抗体的联合使用能够通过大量机制包括ADCC的显著增强(如上所述)、自然杀伤(NK)细胞的活化和IFNα水平的提高从而提高长期存活。当与单克隆抗体联合使用时，这些核酸用以减少实现生物结果所需要的抗体的剂量。
如本文中所使用的，术语“癌症抗原”和“肿瘤抗原”可相互替换，用以指被癌细胞所差别表达的抗原并因此可被开发用来靶定癌细胞。癌抗原是能潜在地刺激显著肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些是被正常细胞编码的，尽管并非必须表达。这些抗原可被表征为在正常细胞中通常是静默(即，未被表达)的那些，仅在分化的某些阶段被表达的那些以及临时被表达的那些例如胚胎和胎儿抗原。其它癌抗原由突变细胞基因编码，诸如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变体p53)、由于内部缺失或染色体移位导致的融合蛋白。更多其它癌基因可由病毒基因编码，诸如由RNA和DNA肿瘤病毒携带的那些。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也可用于治疗和防治自免疫疾病。自免疫疾病是其中受试对象自身的抗体与宿主组织反应，或者其中免疫效应子T细胞对内源自身肽是自反应的从而导致组织破坏的一类疾病。因此，免疫应答产生以对抗受试对象自身的抗原(称为自体抗原)。自免疫疾病包括但不限于类风湿关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本甲状腺炎、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、天疱疮(例如寻常性天疱疮)、格雷夫斯病(Grave′s disease)、自身免疫性溶血贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、硬皮病抗胶原抗体、混合性结缔组织病、多发性肌炎、恶性贫血、特发性阿狄森氏病、自身免疫相关的不孕症、肾小球肾炎(例如新月体肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、
Figure A20078003596700611
氏综合征、胰岛素抵抗和自身免疫性糖尿病。
本文中所使用的“自身抗原”指正常宿主组织的抗原。正常宿主组织不包括癌细胞。因此在自免疫疾病中，出现的抗自身抗原的免疫应答是不合需要的免疫应答，并且导致正常组织的破坏和损伤，而出现的抗癌抗原的免疫应答是合乎需要的免疫应答并且导致肿瘤或癌的破坏。因此，在针对治疗自免疫疾病的本发明的一些方面中，并不推荐将CpG免疫刺激性核酸与自身抗原一起施用，尤其是作为自免疫疾病标靶的那些。
在其它例子中，CpG免疫刺激性核酸可与低剂量的自身抗原一起输送。大量的动物研究已经证实低剂量抗原的粘膜施用可导致免疫低应答性或“耐受”状态。活性机制似乎是偏离Th1而朝向占主导的Th2和Th3(即，TGF-β主导)应答的细胞因子介导的免疫偏离。伴有低剂量抗原输送的活性抑制也能抑制非相关的免疫应答(旁侧抑制)，其在自免疫疾病例如类风湿关节炎和SLE的治疗中引起相当的注意。旁侧抑制牵涉到在局部环境中Th1-反调节、抑制子细胞因子的分泌，其中促炎和Th1细胞因子以抗原特异性或抗原非特异性方式得以释放。本文中所使用的“耐受”用以指这种现象。实际上，口腔耐受在大量动物的自免疫疾病治疗中是有效的，所述自免疫疾病包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性重症肌无力、胶原性关节炎(CIA)和胰岛素依赖型糖尿病。在这些模型中，自免疫疾病的防治和抑制是与抗原特异性体液和细胞应答由Th1变换至Th2/Th3应答相关联的。
本发明还包括利用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸诱导抗原非特异性先天免疫活化和对传染性挑战的广谱抵抗力。本文中所使用的术语抗原非特异性先天免疫活化指除B细胞之外的免疫细胞的活化，例如可包括NK细胞、T细胞或其它能以抗原非依赖性方式进行应答的免疫细胞，或者这些细胞的一些组合。对传染性挑战的广谱抵抗力被诱导是因为免疫细胞处于活化状态并准备好对任何侵入的化合物或微生物作出应答。细胞并未针对特定的抗原进行特异性的准备。这在生物战争中，以及上述的其它环境例如旅行者中尤其有用。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可直接施用给受试对象或者与核酸输送复合物一起施用。核酸输送复合物应指与靶定方法(例如能导致与靶定细胞以更高亲合力结合的分子)相结合(例如离子地或共价地相连；或包封其中)的核酸分子。核酸输送复合物的例子包括与固醇(例如胆固醇)、脂质(例如阳离子脂质、病毒颗粒或脂质体)、或靶细胞特异性结合剂(例如被靶细胞特异性受体识别的配体)相连的核酸。优选的复合物在体内足够稳定以防止在被靶细胞内吞之前出现明显的分离。然而，所述复合物在细胞内的合适条件下能可被切割，从而将核苷酸以功能性形式释放。用于输送抗原或寡聚核苷酸至表面的输送载体或输送装置已被描述。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和/或抗原和/或其它治疗剂可单独施用(例如，在盐水或缓冲液中)或采用本领域中已知的任何输送载体进行施用。例如，以下输送载体已被描述：脂质双层体(Cochleates)；Emulsomes、ISCOM；脂质体；活细菌载体(例如，沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Bacillus calmatte-guerin、志贺氏菌(Shigella)、乳酸菌(Lactobacillus))；活病毒载体(例如，痘苗病毒、腺病毒、单纯疱疹)；微球体；核酸疫苗；聚合物；聚合物环；蛋白体；氟化钠；转基因植入物；病毒颗粒；类病毒微粒。其它输送载体在本领域中已知并在以下载体的讨论中提供更多的例子。
术语CpG免疫刺激性寡聚核苷酸有效量指实现所需生物效果所必需的或者足够的量。例如，用于诱导粘膜免疫的与抗原一起施用的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸有效量是能在暴露于抗原时导致产生IgA以应答抗原所必需的量，而诱导全身免疫所需要的量是能在暴露于抗原时导致产生IgG以应答抗原所必需的量。与本文所提供的教导相结合，通过在各种活性化合物中进行选择并权衡诸如潜力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的严重性和施用的优选模式等因素，则能计划出有效的预防性或治疗性医治方案，而不导致实质性的毒性并且对治疗特定的受试对象完全有效。任何特定应用的有效量可根据诸如被治疗的疾病或病症、施用的具体CpG免疫刺激性寡聚核苷酸、受试对象的大小或所述疾病或病症的严重性等因素而变化。本领域技术人员能经验性地确定特定CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和/或抗原和/或治疗剂的有效量而无须进行不必要的试验。
经粘膜或局部输送的本文所描述的化合物的受试对象的剂量通常为每次施用约0.1μg至10mg，根据用途其可以以每日、每周或每月及其间的任何其它时间量来给予。更常见为经粘膜或局部剂量为每次施用约10μg至5mg，最常见为约100μg至1mg，每天或每周施用2-4次。更常见为，免疫刺激剂量为每次施用1μg至10mg，并最常见为10μg至1mg，每日或每周施用。出于诱导抗原特异性免疫应答而肠胃外输送的本文所描述的化合物(其中药物与抗原一起输送但没有其它治疗剂)的受试对象剂量通常比疫苗佐剂或免疫刺激应用的有效粘膜量高5至10,000倍，更常见为高10至1,000倍，最常见为高20至100倍。当CpG免疫刺激性寡聚核苷酸与其它治疗剂联合施用或者在特制输送载体中进行施用时，出于诱导先天免疫应答或提高ADCC或诱导抗原特异性免疫应答的目的，用于肠胃外输送的本文所描述的化合物的剂量通常为每次施用约0.1μg至10mg，根据用途其可以以每日、每周或每月及其间的任何其它时间量来给予。更常见为肠胃外剂量为每次施用约10μg至5mg，最常见为约100μg至1mg，每天或每周施用2-4次。然而，在一些实施方式中，出于这些目的的肠道外剂量可以以比上述典型剂量高5至10,000倍使用。
对于本文所描述的任何化合物，治疗有效量最初可由动物模型确定。也可以由已经在人体中进行测试的CpG寡聚核苷酸(已开始人类临床试验)和已知表现出相似药理活性的化合物诸如其它佐剂，例如LT和用于接种疫苗目的的其它抗原的人类数据确定治疗有效剂量。对于肠道外施用可需要更高剂量。可根据所施用的化合物的相对生物利用度和潜力调整所用剂量。根据以上所描述的方法以及本领域中已知的其它方法调整剂量以实现最大功效是在本领域技术人员能力范围之内的。
本发明的制剂以可药用溶液进行施用，其中可例行地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体、佐剂和选择性的其它治疗成分。
为在治疗中使用，可以通过将寡聚核苷酸输送至例如粘膜、全身等所需表面的任何模式来将有效量的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸施用给受试对象。可通过本领域技术人员已知的任何方法实现本发明的药物组合物的施用。优选的施用途径包括但不限于经口、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、经眼、阴道和直肠。
对于口服施用，可通过将活性化合物与本领域中已知的可药用载体相混合从而容易地配制化合物(即CpG免疫刺激性寡聚核苷酸、抗原和其它治疗剂)。这些载体使本发明的化合物能被配制为片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮剂等以便被治疗的受试对象口服消化。可以以固体赋形剂，选择性地研磨所得混合物并加工所述颗粒混合物，需要时加入合适的辅剂之后得到片剂或糖衣丸剂芯从而获得口服用药物制剂。合适的赋形剂具体为，诸如糖之类的填料，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐(诸如海藻酸钠)。选择性地，口服制剂也可配制在盐中水或用于中和内部酸环境的缓冲液(如EDTA)中或者无需任何载体而施用。
还具体设想的是上述一种或多种成分的口服剂型。所述一种或多种成分可经化学修饰从而使得衍生物的口服输送有效。通常，所设想的化学修饰是将至少一部分连接在所述成分分子本体上，其中所述部分能够(a)抑制蛋白质水解；和(b)从胃或肠摄入到血液中。还希望的是一种或多种成分的整体稳定性的增加和体内循环时间的增加。这些部分的例子包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。见Abuchowski和Davis，1981，″Soluble Polymer-Enzyme Adducts″In：Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.367-383；Newmark，等，1982，J.Appl.Biochem.4：185-189。其它可使用的聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane。如上所述，优选为药物使用的是聚乙二醇部分。
对于所述成分(或衍生物)，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)，或大肠。本领域技术人员有可供使用的不在胃中溶解，却在十二指肠或肠道其它位置释放材料的制剂。优选为，所述释放或者通过寡聚核苷酸(或衍生物)的保护或通过在胃环境之外例如在肠中释放生物活性材料从而避免胃环境的不利影响。
为确保完全的胃耐受性，至少在pH 5.0时不能穿透的糖衣是必须的。用作肠糖衣的更常见的惰性成分的例子是纤维素乙酸酯偏苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP55、聚乙烯乙酸酯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和虫胶清漆(Shellac)。这些糖衣可用作混合膜。
糖衣或糖衣混合物可也用在片剂上，而这并非旨在保护免受胃的影响。这可包括糖制糖衣或使片剂易于吞咽的糖衣。胶囊可由硬壳(诸如明胶)构成以输送干燥治疗剂即粉末；对于液体形式，可使用软明胶。胶囊剂的壳材料可以是厚淀粉或其它可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或片剂粉末，可以使用湿式结块技术。
治疗剂可以以粒径约1mm的颗粒或微球形式包含在制剂中作为微细的复合颗粒。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉末、略微压缩的栓剂或者甚至片剂。所述治疗剂可通过压缩制备。
着色剂和调味剂也均可加入。例如，寡聚核苷酸(或衍生物)可经配制(诸如通过脂质体或微球体包封)，然后进一步包装在可食用产品诸如含有着色剂和调味剂的冰冻饮料之中。
可用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，具体为甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可用作填料，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
可包括崩解剂使治疗剂制剂为固体剂型。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂，羧甲基淀粉钠(Explotab)。乙醇酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超直链淀粉(ultramylopectin)、褐藻酸钠、明胶、橘皮、酸式羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土均可使用。崩解剂的另一形式是不溶性阳离子交换树脂。粉末树胶也可用作崩解剂和粘合剂并且这些可包括粉末树胶诸如琼脂、刺梧桐树胶或黄芪胶。褐藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可用以将治疗剂保持在一起乙撑硬质片剂并包括来自天然产品的材料诸如阿拉伯树胶、黄芪胶、淀粉和明胶。其它包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可用在醇溶液使治疗剂成粒。
抗摩擦剂可包括在治疗剂制剂中以防止在配制过程中起粘。可在治疗剂和模具壁之间使用润滑剂层，所述润滑剂可包括但不限于：硬脂酸包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、蔬菜油和蜡。可溶性润滑油也可使用诸如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、具有各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。
也可加入滑动剂以在配制过程中改善药物的流动性质并有助于在压缩时的重新分配。所述滑动剂可包括淀粉、滑石、热解硅石和含水硅铝酸盐。
为有助于治疗剂溶解在水性环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去垢剂诸如十二烷基硫酸钠、二辛基硫代琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去垢剂也可以使用，包括氯化苯扎溴铵或苄索氯铵。可包含在制剂之中作为表面活性剂的潜在非离子去垢剂的列表有lauromacrogol 400、硬脂酸聚烃氧(40)酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酸酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂或者单独地或者作为具有不同比例的混合物存在于所述寡聚核苷酸或衍生物的制剂中。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制得的压入式(push-fit)胶囊，以及由明胶和塑化剂诸如甘油或山梨糖醇制得的软密封胶囊。所述压入式(push-fit)胶囊可含有与填料诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁和可选地稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮在合适的液体诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。也可以使用用于口服施用的微球体。这些微球体已经在本领域中很好地得以定义。用于口服施用的所有制剂应当为适于如此施用的剂量。
对于口腔施用，所述组合物可以采用以传统方式配制的片剂或锭剂形式。
为了通过吸入进行施用，根据本发明使用的化合物可以利用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式便捷地输送。在加压气溶胶的情况下，通过提供输送特定量的阀门确定单位剂量。在吸入器或吹药器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为含有化合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文还设想的是寡聚核苷酸(或其衍生物)的肺部输送。所述寡聚核苷酸(或衍生物)在吸气时输送至哺乳动物肺部并横跨肺上皮层进入血液。吸入分子的其它报道包括Adjei等，1990，Pharmaceutical Research，7：565-569；Adjei等，1990，International Journal of Pharmaceutics，63：135-144(leuprolide acetate)；Braquet等，1989，Journal of CardiovascularPharmacology，13(suppl.5)：143-146(endothelin-1)；Hubbard等，1989，Annals of Internal Medicine，Vol.III，pp.206-212(al-antitrypsin)；Smith等，1989，J.Clin.Invest.84：1145-1146(a-1-proteinase)；Oswein等，1990，″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium on RespiratoryDrug Delivery II，Keystone，Colorado，March，(重组人类生长荷尔蒙)；Debs等，1988，J.Immunol.140：3482-3488(干扰素-g和肿瘤坏死因子α)和Platz等，美国专利5,284,656(粒细胞群落刺激因子)。全身作用肺部药物输送的方法和组合物在于1995年9月19日授权给Wong等的美国专利5,451,569中进行描述。
在本发明的实践中设想使用的是大量设计用于治疗剂产品肺部输送的机械装置，包括但不限于吹药器、配量吸入器和粉末吸入器，所有这些对本领域技术人员都是熟悉的。适用于本发明的实践的商业装置的一些具体例子是Ultravent吹药器，由Mallinckrodt，Inc.，圣路易斯，密苏里州制造；Acorn II吹药器，由Marquest Medical Products，Englewood，科罗拉多州制造；Ventolin配量吸入器，由Glaxo Inc.，Research TrianglePark，北卡罗来纳州制造；和Spinhaler粉末吸入器，由Fisons Corp.，Bedford，马萨诸塞州制造。
所有这些装置要求使用适用于分配寡聚核苷酸(或衍生物)的制剂。通常，每种制剂专用于所使用的装置类型并可涉及到合适的推进剂材料，以及在治疗中有用的常见稀释剂、佐剂和/或载体的使用。同样，也设想了脂质体、微胶囊或微球体，内含复合物或其它类型载体。根据化学修饰的类型或所采用的装置的类型可将化学修饰寡聚核苷酸制备为不同制剂。
适合与喷气或超声吹药器一起使用的制剂通常包括以约每mL溶液中0.1至25mg生物活性寡聚核苷酸的浓度溶解在水中的寡聚核苷酸(或衍生物)。所述制剂也可包括缓冲剂和简单糖(例如，为了寡聚核苷酸稳定和渗透压的调整)。吹药器制剂也可含有表面活性剂以减小或防止由于在形成气溶胶时溶液气雾化导致的寡聚核苷酸的表面诱导聚结。
与配量吸入器一起使用的制剂通常包括精细分散的粉末，其含有在表面活性剂的协助下悬浮在推进剂中的寡聚核苷酸(或衍生物)。所述推进剂可以是任何能为此目的采用的传统材料，诸如含氯氟烃、含氯氟碳氢化合物、含氟碳氢化合物或碳氢化合物，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。
从粉末吸入器装置中分发而出的制剂将包括含有寡聚核苷酸(或衍生物)的精细分离的粉末并还可以含有能有助于粉末从装置中分散而出的量例如占制剂50重量％至90重量％的疏松剂诸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇。所述寡聚核苷酸(或衍生物)应当最有利地制备为颗粒形式，平均粒径小于10mm(或微米)，最优选为0.5至5mm，以便于最有效地输送至肺末梢。也设想了本发明的药物组合物的鼻腔输送。鼻腔输送使得在施用治疗剂产品至鼻部之后本发明的药物组合物直接进入血液，而无需将产品堆积到肺部。鼻腔输送的制剂包括含有葡聚糖或环葡聚糖的那些制剂。
针对鼻腔施用，有用的装置是其上连接有配量喷雾器的小硬质瓶。在一个实施方式中，通过将本发明的药物组合物吸入到具有确定体积的小室中从而输送配定剂量，所述小室具有小孔，小孔的大小使得通过小室中的液体被压缩时形成喷雾从而使气溶胶制剂气雾化。小室被压缩从而施用本发明的药物组合物。在具体实施方式中，小室为活塞式设置。这些装置可通过商业途径获得。
另外一种方式，可使用塑料挤压瓶，其具有小孔或开口，小孔或开口的大小使得通过挤压形成喷雾从而使气溶胶制剂气雾化。开口通常位于瓶子的顶部，顶部通常逐渐变细以适合放入鼻腔从而有效地施用气溶胶制剂。优选为，为了施用测定剂量的药物，鼻腔吸入器将提供配量的气溶胶制剂。
当希望全身输送时，所述化合物可配制用于经注射的肠道外施用，例如通过弹丸式注射(bolus injection)或连续输液。用于注射的制剂可以以加入防腐剂的单位剂型存在，例如在安瓿瓶或多剂量容器中。所述组合物可以采用诸如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液形式，并且可含有配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠道外施用的药物制剂包括为水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，可以将活性化合物的悬浮液制备为适宜的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪酸诸如芝麻油或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酸酯或脂质体。水性注射悬浮液可含有能提高悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。选择性地，所述悬浮液也可含有合适的稳定剂或能提高所述化合物的溶解度的试剂从而能获得高浓缩溶液制剂。
另外一种方式，活性化合物可以为粉末形式，以供在使用前用合适的载体例如无菌无热原水重新配制。
所述化合物可配制为直肠或阴道组合物诸如栓剂或滞留灌肠剂，例如含有传统栓剂基质诸如可可油或其它甘油酯。
除之前描述的制剂之外，所述化合物还可以调制为长效制剂。这样的长期作用制剂可用稳定的聚合性或疏水性材料(在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或微溶衍生物例如微溶盐进行配制。
所述药物组合物也可含有合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物诸如聚乙二醇。合适的液体或固体药物制剂形式是例如用于吸入的水性或盐水溶液，微包封的，encochleated、涂覆在在微观金颗粒上的，包含在脂质体中的，雾化的，气溶胶，用于植入皮肤的小丸或在尖锐物体上干燥以便扎入皮肤的等形式。所述药物组合物还包括粒剂、粉末剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、霜剂、滴剂或活性化合物缓释制剂，在这些制剂中，通常如上所述使用赋形剂和添加剂和/或助剂诸如崩解剂、粘合剂、涂覆剂、膨胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或溶解剂。这些药物组合物适用于各种药物输送系统。药物输送方法的简短综述参见Langer，Science 249：1527-1533，1990，在此以引用的方式引入。
CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和可选的其它治疗剂和/或抗原可以以其自体(纯)进行施用，或者以可药用盐的形式施用。当在药物中使用时，所述盐应当是可药用的，但非药用盐也可以便利地用于制备其可药用盐。这些盐包括但不限于由以下酸制得的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲基磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。同样，这些盐可制备为羧酸基团的碱金属或碱土金属盐，诸如钠、钾或钙盐。
合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；磷酸和盐(0.8-2％w/v)。适合的防腐剂包括(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；尼泊金(0.01-0.25％w/v)和噻汞撒(0.004-0.02％w/v)。
本发明的组合物含有选择性地包含在可药用载体中的有效量的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和选择性的抗原和/或其它治疗剂。术语可药用载体指一种或多种适用于向人类或其它脊椎动物施用的相容固体或液体填料、稀释剂或包封物质。术语载体指有机或无机成分、天然的或合成的，活性成分与其相结合以助于应用。所述药物组合物的成分也能与本发明的化合物以不会出现实质性破坏所希望的药效的方式相互混合。
通过以下实施例进一步描述本发明，其决不可解释为进行限制。在本申请中引用的参考文献(包括文献、授权专利、公开专利申请和共同未决专利申请)的全部内容以引用的方式引入。
实施例
材料和方法
寡聚脱氧核苷酸(ODN)和试剂
所有ODN按照标准氨基磷酸酯化学方案进行合成，并通过ColeyPharmaceutical GmbH进行成分(identity)和纯度的控制，并具有经鲎检验(BioWhittaker，Verviers，比利时)测量的不可检测的内毒素水平(＜0.1EU/ml)。ODN悬浮在无菌无内毒素的Tris-EDTA(Sigma，Deisenhofen，德国)中，并在无菌环境下保存和操作以防止微生物和内毒素污染。使用无内毒素Tris-EDTA进行所有稀释。
TLR检验
用表达相应人类TLR的载体和6×NF-κB-荧光素酶报道子质粒通过电穿孔对HEK293细胞进行转染。稳定的转染子(3×104细胞/孔)用指定量的ODN在加湿温育器中在37℃温育16小时。每个数据点重复进行三次。细胞被裂解并检测荧光素酶基因活性(采用来自Perkin-Elmer，Zaventem，比利时的BriteLite试剂盒)。参照没有加入ODN的培养基中的报道基因活性计算刺激指数。
细胞纯化
来自健康人类捐献者的外周血血沉棕黄层制剂从杜塞尔多夫大学(德国)血库获得，并通过Ficoll-Hypaque(Sigma)离心对PBMC进行纯化。37℃，在加湿温育器中，细胞在补充有5％(v/v)热灭活人类AB血清(BioWhittaker)或10％(v/v)热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素(均来自Sigma)的RPMI 1640培养基中培养。
细胞因子检测和流式细胞分析
以5×106细胞/ml的浓度重新悬浮PBMC，并加入到96孔圆底板(250μl/孔)中。PBMC与ODN进行温育，在指定时间点收集培养上清液(SN)。如果并非立即使用，SN在-20℃进行保存直至需要。
使用市售抗体(PBL，New Brunswick，NJ，美国)利用针对IFN-α产生的内部ELISA或者在Luminex multiplex system(Luminex Corporation，12212Technology Boulevard，Austin，Texas 78727-6115)上对在SN中细胞因子的数量进行评估。
动物
雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)购自Charles River Canada(魁北克，加拿大)，并关养在Coley Pharmaceutical Group Canada的动物护理所的微隔离间中。在加拿大动物保护协会的指导下依照Coely Canada动物保护委员会进行所有研究。所有动物均未接触过CpG ODN。
SA1N肿瘤模型：雌性A/J小鼠(每组10只)在第0日用5×105SaI/N肿瘤细胞进行皮下注射。在肿瘤诱导后的第8日开始每周一次皮下注射用100μg ODN或仅用PBS进行治疗。检测动物的存活和肿瘤体积。使用数字游标卡尺测量肿瘤尺寸(长度和宽度)。利用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(0.4)(ab2)，其中a＝较大直径和b＝较小直径。
体外检验
新鲜BALB/c小鼠脾细胞(来自3-5只动物的合并液)用于体外检验。用异氟醚对动物进行麻醉并通过颈椎脱位进行安乐死。在无菌条件下摘除脾脏并放置在PBS+0.2％牛血清白蛋白(Sigma Chemical Company)中。然后将脾脏匀浆粉碎并将脾细胞重新悬浮在补充有2％正常小鼠血清(Cedarlane Laboratories，安大略，加拿大)、盘尼西林-链霉素溶液(分别最终浓度为1000U/ml和1mg/ml；Sigma Chemical Company)和5×10-5M b-巯基乙醇(Sigma Chemical Company)的RPMI  1640(LifeTechnologies，Grand Island，NY)组织培养介质中。
B细胞增殖检验
羧基-荧光素-二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen，Eugene，俄勒冈，美国)染色的BALB/c小鼠脾细胞(4×105/孔)与不同浓度的ODN在5％CO2温育箱中在37℃温育5天。然后用PE轭合抗-CD19抗体(BDPharmingen，圣地亚哥，加州，美国)针对CD19对细胞进行染色，经FACS测量B-细胞增殖，随后用ModFit软件V3.0(Verity Software House Inc.，Topsham，ME，美国)进行分析。
实施例1：CpG模体处结构活性关系的研究
已知含有未甲基化的CpG模体的寡聚核苷酸能通过类Toll受体9(TLR9)途径刺激免疫应答。为了鉴别具有最强刺激TLR9途径活性的寡聚核苷酸，进行了CpG模体处全面的结构活性关系(SAR)研究。结果显示鸟嘌呤被次黄嘌呤和6-硫代鸟嘌呤替代将导致hTLR9检验中的相似活性，而嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤和7-脱氮鸟嘌呤替代将导致40-80％的hTLR9刺激减小。此外，在C5和N4的修饰导致没有hTLR9途径的修饰。这些观测结果为在SAR模型中，鸟嘌呤是通过Hoogsteen位点被识别的，而胞嘧啶在C，H-边与TLR9受体结合(参见图1a)。因此，对鸟嘌呤的Hoogsteen识别位点以及胞嘧啶的C，H-边进行修饰而不导致hTLR9活性的显著丧失是不可能的。在被研究的在二核苷酸模体上的碱基修饰中无一比未修饰的CpG模体的活性更高。
实施例2：接近CpG模体的疏水性胸腺嘧啶碱基形状类似物的作用
为研究CpG模体附近dT残基的影响，多个疏水胸腺嘧啶碱基形状类似物，诸如2，4-二氟甲苯(FF)(SEQ ID NO：3-9)、5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BU)和5-碘-2′-脱氧尿嘧啶(JU)接入到CpG模体之外(参见表1和图2-3)。出乎意料地，所有经测试的疏水性胸腺嘧啶类似物的接入均导致异乎寻常的hTLR9活性的明显增加，而用尿嘧啶残基(缺失甲基的胸腺嘧啶，图4)进行替代则导致hTLR9刺激的明显下降。当所述修饰位于CpG模体的5′时，TLR9刺激增加明显。用5-碘尿嘧啶(JU)在CpG的5′和3′进行双替代导致所有测试中最强的刺激。相反，在CpG模体用2，4-二氟甲苯替代鸟嘌呤和胞嘧啶导致在两种情况下TLR9刺激指数的明显降低。
疏水T类似物的接入也导致人类PBMC中IFN-α诱导的明显增强。未曾预料的是，用5-溴鸟苷和5-碘鸟苷对实际上没有IFN-α诱导活性的ODN(SEQ ID NO：1)进行修饰特别地导致了提高的TLR9刺激和IFN-α诱导。通常针对不含有这些修饰的CpG ODN为TLR9和IFN-α诱导之间的负相关。
表1：CpG模体附近具有疏水性胸腺嘧啶碱基形状类似物的修饰寡聚核苷酸的例子
Seq ID No#   寡聚核苷酸序列   描述/类别衍生自
  1   T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T  SEQ ID NO：2的1×PO
  2   T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  3   T*G*FF*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′FF衍生物
  4   T*G*T*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′FF衍生物
  5   T*G*FF*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′和5′FF衍生物
  6   T*G*T*FF-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T C-＞FF
  7   T*G*T*C-FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T G-＞FF
  8   T*FF*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T GT-＞FF
  9   T*G*T*C-G*T*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′FF衍生物
  10   T*G*BU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′BU衍生物
  11   T*G*T*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′BU衍生物
  12   T*G*BU*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′和5′BU衍生物
  13   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′JU衍生物
  14   T*G*T*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′JU衍生物
  15   T*G*JU*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′和5′JU衍生物
  16   T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′U衍生物
  17   T*G*T*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′U衍生物
Seq ID No#   寡聚核苷酸序列   描述/类别衍生自
  18   T*G*U*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′和5′U衍生物
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
实施例3：亲脂性碱基形状替代的TLR9活化
由于位于CpG模体的5′侧的碱基的不同类型的亲脂性替代导致hTLR9刺激的显著提高，研究了其它碱基类似物诸如5-氯-尿嘧啶、5-三氟甲基-尿嘧啶、苯基、芳基和取代芳基残基刺激hTLR9的能力(表3)。为研究用不同亲脂性碱基类似物修饰的B类寡聚核苷酸的人类TLR9活化，B类ODN SEQ ID NO：1用5-氯-2′-脱氧尿嘧啶(CU)、5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BU)、5-碘-2′-脱氧尿嘧啶(JU)和5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶(EU)进行修饰。hTLR9-NFkB-293细胞与指定的ODN(图5a)温育16小时。然后将细胞溶解并测定荧光素酶活性。CU修饰的(SEQ ID NO：41)、BU修饰的(SEQ ID NO：10)、JU修饰的(SEQ ID NO：13)和EU修饰的(SEQ ID NO：42)寡聚核苷酸全部显示出相比对照(SEQ ID NO：1)更强的TLR9活性刺激。具有尿苷修饰的SEQ ID NO：16显示出明显降低的活性。在第二试验中测量了IFN-α生成(图5b)。人类PBMC与指明的经修饰的ODN共同温育24小时，随后利用ELISA测试上清液。JU修饰的、BU修饰的和EU修饰的ODN相比对照导致最高的IFN-α增加。这些数据证实了B类ODN上dU的5′-替代提高TLR9活性和IFN-α产生。
为进一步研究EU修饰对TLR9活化的作用，用具有CpG的5′(SEQID NO：42)、CpG的3′(SEQ ID NO：29)和CpG的5′和3′(SEQ ID NO：30)的EU修饰的修饰寡聚核苷酸重复所述试验。SEQ ID NO 42和30显示了相比未修饰的SEQ ID NO：1和未修饰的B类ODN SEQ ID NO：37(图6)的TLR9活化的明显提高。。
表2：具有亲脂性碱基类似物替代的修饰寡聚核苷酸的例子
Seq ID编号   寡聚核苷酸序列 描述/类别衍生自
  1   T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 未经修饰
  41   T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的Cl衍生物
  10   T*G*BU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′BU衍生物
  13   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′JU衍生物
  16   T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的U衍生物
  41   T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的CU衍生物
Seq ID编号   寡聚核苷酸序列   描述/类别衍生自
  42   T*G*EU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的EU衍生物
  29   T*G*T*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的3′EU衍生物
  30   T*G*EU*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T SEQ ID NO：1的5′3′EU衍生物
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
实施例4：A、B、C、P和T类寡聚核苷酸上的亲脂性替代
为研究亲脂性碱基类似物替代对不同类型的ODN的影响，在A类、B类、C类、P类和T类寡聚核苷酸上进行了修饰。这些寡聚核苷酸的一些例子在表3中给出。
表3：JU修饰的A、B、C、P和T类寡聚核苷酸
Seq ID编号   修饰寡聚核苷酸   寡聚体类别
  16   T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   B
  17   T*G*T*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   B
  18   T*G*U*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   B
  19   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T   B
  20   T*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T   B
  21   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T   B
  22   JU*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T   B
  23   T*C*G*JU*C*G*JU*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T   B
  24   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*JU*T*T*T   B
  25   T*C*T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T
  26   T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T   非CpG ODN
  27   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G   C
  28   T*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G   C
  31   JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P
  32   T*C*G*JU*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P
  33   JU*C-G*JU*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P
  34   JU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G   A
  35   T*C-G-A-C-G-JU-C-G-T-G-G*G*G*G   A
  36   T*C-G-A-C-G-JU-C-G-JU-G-G*G*G*G   A
  37   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T   B
  43   T*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G   A
  44   JU*C-G*JU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G   P
  45   T*C*G*JU*C-G*JU*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G   P
  46   T*C*G*T*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G   P
  47   T*C*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T
  48   T*C*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T
  49   JU*C*T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T
  50   JU*C-T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T
  51   T*C*T*T*T*T*T*T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T
  52   T*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
为研究修饰B类寡聚核苷酸对人类TLR9的活化，在荧光素酶检验中评估了SEQ ID NO：37的5-碘-2′-脱氧尿苷修饰的B类衍生物活化TLR9的能力(参见材料和方法)。所有修饰的B类寡聚核苷酸相比未经修饰的SEQ ID NO：37显示出TLR9活化的显著提高(图7)。
为研究修饰A类寡聚核苷酸对人类TLR9的活化，如图5，在荧光素酶检验中(图8a)和PBMC检验(图8b)评估了SEQ ID NO：43的5-碘-2′-脱氧尿苷修饰的A-类衍生物活化TLR9的能力。尽管CpG模体的5′和3′侧的双5-碘尿嘧啶(JU)替代导致最有效的刺激，但当修饰位于CpG模体的5′侧时，TLR9刺激的增加明显。
为研究修饰C类寡聚核苷酸对人类TLR9的活化，测试了SEQID NO：46、SEQ ID NO：44和45的5-碘-2′-脱氧尿苷修饰的C类衍生物活化TLR9的作用。同时测试了A类序列SEQ ID NO：43(未经修饰)和SEQ ID NO：35和36。如图9所示，在荧光素酶检验中，经修饰的ODNSEQ ID NO：35、36、44和45全部显示出在未经修饰的A和C类以上的提高的TLR9刺激。为研究修饰P类寡聚核苷酸对人类TLR9的活化，测试了SEQ ID NO：46的5-碘-2′-脱氧尿苷修饰的P类衍生物在荧光素酶检验中活化TLR9的作用。如图10所示，修饰的ODN SEQ ID NO：31-33显示出相比未经修饰的ODN提高的TLR9刺激。
为研究修饰T类寡聚核苷酸对人类TLR9的活化，测试了SEQ IDNO：52的5-碘-2′-脱氧尿苷修饰的T类衍生物活化TLR9的作用。如图11所示，修饰的ODN SEQ ID NO：47-50显示出在荧光素酶检验中相比未经修饰的ODN提高的TLR9刺激。尿苷衍生物SEQ ID NO：51显示出降低的TLR9刺激。
如以上实施例所证实，在所有测试的类别中，CpG模体5′侧的亲脂性T-类似物替代导致TLR9活化的明显提高，并导致了提高的诱导IFN-α产生的能力。
实施例5：短修饰寡聚核苷酸对TLR9的刺激
由于长度为20个核苷酸的修饰CpG ODN显示出对TLR9活化非同寻常的亲合力，研究了非常的CpG ODN活化TLR9的能力。非常短的寡聚核苷酸在治疗中使用相比更长的寡聚核苷酸具有优势，这是因为更容易被细胞摄取，以及更简单地配制，而无需使用DOTAP。研究了三条短CpG ODN(短聚体)(表3)：6-聚体CpG模体六聚体(SEQ IDNO：38)，所述六聚体的5′JU修饰(SEQ ID NO：39)和所述六聚体的5′3′JU修饰(SEQ ID NO：40)(表4)。在荧光素酶检验中比较了短聚体与未经修饰的B类寡聚核苷酸SEQ ID NO：37的活性。如图12所示，尤其是SEQID NO：40，使用修饰短聚体显示出作为改进的免疫治疗药物的巨大潜力。
表4：修饰短寡聚核苷酸
Seq ID编号   短聚体序列   修饰
  38   G*T*C-G*T*T  未经修饰
  39   G*JU*C-G*T*T  5′JU
  40   G*JU*C-G*JU*T  5′和3′JU
  37   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T  未经修饰的B类
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
实施例6：修饰寡聚核苷酸对体内TLR9途径的活化
为了测定本发明的经修饰的ODN的体内效率，在独立的小鼠脾细胞中测试了具有亲脂性T类似物的ODN。分离BALB/c小鼠脾细胞并与修饰B类(SEQ ID NO：13)、未经修饰的B类(SEQ ID NO：37)和非CpGODN(SEQ ID NO：26)(表5)共同温育。在6小时(TNF-α)或24小时(IL-6、IL-10、IL-12)收集培养上清液并用ELISA测量细胞因子浓度。如图13所示，与经修饰的SEQ ID NO：13共同温育导致所测试的所有细胞因子水平显著增加。
随后测试ODN诱导脾细胞中B细胞增殖的能力。CFSE-染色BALB/c小鼠脾细胞(4×105/孔)与0.001、0.01、0.1、0.3、1、3或10μg/ml的指定ODN(图14)共同温育。在温育后72小时，针对细胞表面标记CD19对细胞染色，并通过FACS测量B-细胞增殖，随后用ModFit软件进行分析。如图14所示，与经修饰的SEQ ID NO：13共同温育导致B-细胞增殖的明显增加。即使在更低ODN浓度下该增加也是明显的。
为测量经修饰的ODN的体内作用，BALB/c小鼠(每组5只)用10、50或100μg的SEQ ID NO：13或100μg of SEQ ID NO：37以100μl的总体积进行皮下注射(SC)。对照组则只接受100μl的PBS。在注射后1小时(TNF-α)或3小时(IP-10)利用心脏穿刺使动物出血，利用ELISA针对TNF-α(图15a)和IP-10(图15b)对血浆进行检验。用经修饰的SEQ IDNO：13对BALB/c小鼠的注射相比未经修饰的SEQ ID NO：37而言导致更高的TNF-α和IP-10产生，证实了本发明的亲脂性碱基形状替代的ODN相比未经修饰的免疫刺激性ODN能引起更高的体内免疫刺激。
表5：体内测试的寡聚核苷酸
Seq ID编号   序列   修饰
  13   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   SEQIDNO：1的5′JU衍生物
  37   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T   未经修饰的B类
  26   T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T   非CpG对照
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
实施例7：具有其它修饰的寡聚核苷酸
测试了具有亲脂性碱基类似物的ODN在荧光素酶检验中诱导TLR9介导的NF-κB活性的能力(参见材料和方法)。图16-23显示了具有其它修饰的ODN的活性(参见表6)。为了测试其它碱基类似物的活性，比较了6-硝基-苯并咪唑(6NB)修饰的ODN SEQ ID NO：178和未经修饰的母本序列SEQ ID NO：1的活性。如图12所示，SEQ ID NO：178能够活化TLR9介导的NF-κB至可与未经修饰的母本序列相比的水平。随后将5-(2-溴乙烯基)-鸟苷修饰的ODN(SEQ ID NO：153-154)的活性与未经修饰的母本序列SEQ ID NO：1的活性进行比较。如图17所示，在检验中两条经修饰的ODN均比母本序列活性更强。随后，用5-丙炔基-dU替换母本序列(SEQ ID NO：1)的胸腺嘧啶的两条B类ODN(SEQ IDNO：116和117)的活性。如图21所示，两条经修饰的ODN均具有与母本序列的活性可比的活性。其中修饰位于CG二核苷酸5′侧的SEQ IDNO：116的活性略微强于母本序列。
为了测试JU修饰的ODN上的第二类型的修饰的作用，将2′O-甲基鸟苷接入到JU修饰的ODN中。2′-O-甲基鸟苷/JU ODN SEQ IDNO：111-113的活性与母本SEQ ID NO：1和仅有JU修饰的SEQ ID NO：13的活性进行比较。如图18所示，所有的JU修饰的ODN均比母本ODN的活性更强。在CG二核苷酸的3′侧具有2′O-甲基鸟苷的ODN(SEQ IDNO：112-113)比在CG二核苷酸的5′侧具有2′O-甲基鸟苷的ODN(SEQ IDNO：111)或仅有JU修饰的ODN(SEQ ID NO：13)的活性略强。
然后，JU修饰的分枝ODN(SEQ ID NO：96、97、101和102)的活性与SEQ ID NO：1的活性进行比较。如图19所示，在检验中，具有两个可接近的5′端的分枝ODN与未经修饰的SEQ ID NO：1的活性相当或者更强。具有三乙二醇磷酸酯间隔子的SEQ ID NO：101和102比具有3′-O-甲基-G间隔子的SEQ ID NO：96和97的活性更强。
然后，将短未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：38)的活性与具有亲脂性取代核苷酸类似物和亲脂性3′标签的相同序列的ODN(SEQ IDNO：126)的活性进行比较。二者伴有或者不伴有DOTAP进行配制。如图20所示，与加入DOTAP相同，加入JU修饰和亲脂性标签显著地增强了ODN的活性。
然后，具有除亲脂性取代核苷酸类似物之外的第二核苷酸类似物的B类ODN(SEQ ID NO：138，7-脱氮-dG；SEQ ID NO：139，肌苷；SEQ ID NO：140，5-甲基-dC)的活性与母本序列(SEQ ID NO：1)和仅具有亲脂性取代核苷酸类似物的相同序列(SEQ ID NO：13)的活性进行比较。如图22所示，在检验中，所有经修饰的ODN均比母本ODN的活性更强。
然后，将具有亲脂性取代核苷酸类似物的T-类ODN(SEQ IDNO：132-134)的活性与已知为免疫刺激性的C类ODN(SEQ ID NO：198)的活性进行比较。如图23所示，在检验中，所有经修饰的ODN均比未经修饰的C类ODN的活性更强。
表6：具有其它修饰的亲脂性替换寡聚核苷酸
  Seq ID编号   序列   类型和修饰
  1   T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T 未经修饰的B类
  13   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T B类：SEQ ID NO：1的5′JU衍生物
  38   G*T*C-G*T*T 未经修饰的B类
  96   (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-3mG 3′3′-分枝
  97   (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-3mG 3′3′-分枝
  Seq ID编号   序列   类型和修饰
  101   (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-teg   3′3′-分枝
  102   (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-teg   3′3′-分枝
  111   T*mG*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   2′-O-甲基修饰的B类
  112   T*G*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   2′-O-甲基修饰的B类
  113   T*mG*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   2′-O-甲基修饰的B类
  116   T*G*PU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有5-丙炔基-dU(PU)的B类
  117   T*G*T*C-G*PU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有5-丙炔基-dU(PU)的B类
  126 G*JU*C-G*JU*T-hex   具有JU和十六烷基甘油基3′标签的38的B类衍生物
  132   JU*C*T*T*T*T*T*T*T*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T-类
  133   T*C*T*T*T*T*T*T*T*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T-类
  134   JU*C*T*T*T*T*T*T*T*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   T-类
  138   T*G*JU*C-E*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有7-脱氮-dG(E)的B类
  139   T*G*JU*C-I*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有肌苷(I)的B类
  140   T*G*JU*Z-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有5-甲基-dC(z)的B类
  153 T*G*BVU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有5-(2-溴-乙烯基)-尿苷(BVU)的B类
  154 T*G*T*C-G*BVU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有5-(2-溴-乙烯基)-尿苷(BVU)的B类
  178   T*G*6NB*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T   具有6-硝基-苯并咪唑(6NB)的B类
  198   C*G*G*C*G*C*C*T*C*G   C类
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
实施例8：经修饰的P类寡聚核苷酸的活性
经荧光素酶检验测定，测试了具有亲脂性碱基类似物的P类ODN活化经由TLR9的NF-kB途径的能力。具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ ID NO：58-61)的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)和未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：56)的活性进行比较。如图24所示，所有显示的经修饰的P类ODN相比于对照显示出提高的TLR9刺激。图24a显示了JU修饰的P类ODN和24b显示了EU修饰的P类ODN。
然后，将经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：64(EU修饰)、66-67(JU修饰)的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)、C类ODN(SEQ ID NO：68)和未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：57)的活性进行比较。如图25所示，所有经修饰的ODN相比未经修饰的P类ODN显示出更高程度的TLR9刺激。在CG二核苷酸之间具有磷酸二酯键的SEQ ID NO：66相比于全部为硫代硫酸酯的SEQ ID NO：67显示出降低的活性。
然后，测试经修饰的P类ODN诱导IFN-α表达的能力。经ELISA检验测量，将具有亲脂性取代核苷酸类似物的P类ODN(SEQ IDNO：58-61)的活性与B类正对照(SEQ ID NO：55)和未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：56)的活性进行比较。如图26所示，所有经修饰的P类ODN显示出IFN-α诱导的增加。图26a显示了JU修饰的P类ODN和26b显示了EU修饰的P类ODN。
然后，经ELISA检验的测量，比较了经修饰的P类ODN(EU修饰)、66-67(JU修饰)与B类正对照(SEQ ID NO：55)、C类ODN(SEQ IDNO：68)和未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：57)的诱导IFN-α的能力。如图27所示，经修饰的P类ODN显示了诱导IFN-α的增强能力。如在图24中，SEQ ID NO：66相比SEQ ID NO：67显示出降低的活性。
然后，测试了经修饰的P类ODN在人类PBMC中诱导IL-6的能力。来自三名捐献者的PBMC与指明浓度的ODN共同温育24小时，随后针对IL-6对上清液进行luminex 25-plex分析。经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：58、60-62，图28a)(SEQ ID NO：64和67，图28b)的活性与未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：55)和未经修饰的C类ODN(SEQID NO：54)、负对照ODN(SEQ ID NO：53)和未经修饰的P类ODN(SEQID NO：56)的活性进行比较。JU修饰的ODN(SEQ ID NO：58，60-61和67)相比EU修饰的ODN(SEQ ID NO：62和64)显示出略微较高的IL-6的活化。所有经修饰的ODN相比未经修饰的ODN显示出提高的活性。
然后，将经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：58、60-62，图29a)(SEQID NO：64和67，图29b)的活性与未经修饰的B类ODN(SEQ IDNO：55)、未经修饰的C类ODN(SEQ ID NO：54)、负对照ODN(SEQ IDNO：53)、未经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：56)、LPS、R-848、SEB和聚[I]:[C]ODN的活性进行比较。来自三名捐献者的CFSE-标记的PBMC与ODN温育5天，然后用CD19抗体染色。测量具有减少的CFSE染色的B细胞的百分比。用B类ODN进行的处理导致分化后最高百分比的B细胞。用JU修饰的ODN进行的处理导致相比EU修饰的ODN更高的B细胞的百分比。
为了测量经修饰的P类ODN的体内作用，BALB/c小鼠(每组5只)用不同剂量的ODN进行皮下注射。在注射后3小时使动物出血，通过ELISA检测血浆中的TNF-α。经修饰的P类ODN(SEQ ID NO：58、60-62、64和67)的活性与B类负对照(SEQ ID NO：55)和负对照(SEQ IDNO：26)的活性进行比较。如图30所示，用JU修饰的ODN SEQ NO：58、60和61相比EU修饰的ODN SEQ ID NO：64导致略微更高的IFN-α诱导。B类ODN SEQ ID NO：55如预期未能诱导许多鼠类IFN-α。
然后，评估经修饰的P类ODN减小小鼠SA1N肿瘤模型中肿瘤体积的能力。雌性A/J小鼠(每组10只)在第0日用5×105SaI/N肿瘤细胞进行皮下注射。小鼠用35μg(图31a)或100μg(图31b)具有亲脂性取代寡聚核苷酸类似物的P类ODN(SEQ ID NO：60、64和67)、未经修饰的C类ODN、未经修饰的B类ODN(SEQ ID NO：55)或仅提供PBS进行治疗。在肿瘤诱导后的第8日开始每周一次皮下注射提供ODN。监测动物的存活和肿瘤体积。如图31a所示，用较低剂量的经修饰的P类ODN治疗显示出肿瘤体积的最大程度的缩小。在31b中的更高剂量，所有经修饰的P类ODN和C类ODN均能有效减小肿瘤体积。
表7：经修饰的P类寡聚核苷酸
  Seq ID编号   序列   类型和修饰
  53   T*C*C*A*G*G*A*C*T*T*C*T*C*T*C*A*G*G*T*T   负对照
  54   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   C类
  55   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T   B类
  56   T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类T-＞A，5′CpG PO
  57   T*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G   P类3′回文，5′CpG PO
  58   JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类
  59   JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类
  60   JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T   P类
  61   JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T   P类
  62   EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类
  63   EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类
  64   EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类
  65   EU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G   P类
  66   JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T   P类
  67   JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T   P类
  68   T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G   C类
*硫代磷酸酯核苷酸间键
-磷酸二酯核苷酸间键
示例性经修饰的ODN一览列在表8中：
表8
  Seq ID编号   寡聚核苷酸序列
  3   T*G*FF*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  4   T*G*T*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  5   T*G*FF*C-G*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  6   T*G*T*FF-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  7   T*G*T*C-FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  8   T*FF*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  9   T*G*T*C-G*T*FF*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  10   T*G*BU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  11   T*G*T*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  12   T*G*BU*C-G*BU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  13   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  14   T*G*T*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  15   T*G*JU*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  16   T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  17   T*G*T*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  18   T*G*U*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  19   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  20   T*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  21   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T
  22   JU*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  23   T*C*G*JU*C*G*JU*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  24   T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*JU*T*T*T
  27   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G
  28   T*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G
  29   T*G*T*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  30   T*G*EU*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  31   JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  32   T*C*G*JU*C-G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  33   JU*C-G*JU*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  34   JU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G
  35   T*C-G-A-C-G-JU-C-G-T-G-G*G*G*G
  36   T*C-G-A-C-G-JU-C-G-JU-G-G*G*G*G
  39   G*JU*C-G*T*T
  40   G*JU*C-G*JU*T
  41   T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  42   T*G*EU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  44   JU*C-G*JU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G
  45   T*C-G*JU*C*G*JU*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G
  47   T*C*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  48   T*C*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  49   JU*C*T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  50   JU*C-T*T*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  51   T*C*T*T*T*T*T*T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  58   JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  59   JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  60   JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  61   JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  Seq ID编号   寡聚核苷酸序列
  62   EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  63   EU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  64   JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T
  65   JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T
  66   EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G
  67   JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G
  78   T*G*T*C-G*FU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  79   T*G*FU*C-G*FU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  80   T*G*U*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  81   T*G*T*C-6NB*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  82   T*G*T*6NB-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  83   T*G*T*6NB-G-T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  84   JU*G*T*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  85   JU*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  86   T*G*T*C-G*T*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  87   T*G*FT*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  88   T*G*T*C-G*FT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  89   T*G*FT*C-G*FT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  90   T*G*CU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  91   T*G*T*C-G*CU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  92   T*G*CU*C-G*CU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  93   T*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  94   T*G*JU*C-G*T*T*T*T
  95   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*G*T*C-G*T*T
  96   (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-3mG
  97   (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-3mG
  98   T*T*JU*C-G*T*C-G*T*T*T*C-G*T*C-G*T*T
  99   BU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G-G*G*G
  100   T*G*JU*G-C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  101   (T*G*JU*C-G*T*T*L*)2doub-teg
  102   (JU*C*G*T*T*C*G*L*)2doub-teg
  103   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  104   T*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  105   T*C*G*T*C*G*T*T*T*JU*C-G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  106   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T
  107   T*C*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*JU*C*G*T*T*T*T
  108   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T
  109   T*G*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  110   JU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*E*G*G
  111   T*mG*JU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  112   T*G*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  113   T*mG*JU*C-mG*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  114   JU*C-G*JU*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  115   JU*C*G*JU*C-G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  116   T*G*PU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  117   T*G*T*C-G*PU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  118   BU*C-G-A-C-G-T-C-G-T-G-G*G*G*G
  119   T*G*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  120   T*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  121   T*EU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  122   T*G*EU*G-C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
Seq ID编号   寡聚核苷酸序列
  123   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  124   EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  125   G*JU*C-G*T*T-hex
  126   G*JU*C-G*JU*T-hex
  127   G*EU*C-G*EU*T-hex
  128   EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G
  129   T*C*G*EU*C-G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G
  130   EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  131   JU*C*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  132   JU*C*T*T*T*T*T*T*T*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  133   T*C*T*T*T*T*T*T*T*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  134   JU*C*T*T*T*T*T*T*T*JU*C*G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  135   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
  136   T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T
  137   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*JU*C-G*T*T
  138   T*G*JU*C-E*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  139   T*G*JU*C-I*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  140   T*G*JU*Z-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  141   T*G*T*C-G*T*T*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  142   T*G*T*C-G*T*T*T*JU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  143   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  144   EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  145   T*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  146   T*C-G*T*C*G*T*T*T*JU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  147   T*C-G*T*C*G*T*T*T*EU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  148   EU*C-G*T*C*G*T*T*T*EU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  149   EU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  150   JU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  151   JU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
  152   EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
  153   T*G*BVU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  154   T*G*T*C-G*BVU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  155   JU*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G
  156   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG
  157   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG
  158   EU*C*G*EU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG
  159   EU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG
  160   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*iT
  161   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  162   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  163   EU*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  164   EU*C*G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  165   EU*C-G*EU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  166   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*EU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  167   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*JU*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  168   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT
  169   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT
  170   EU*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG
  171   JU*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*3mG
  172   JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  173   EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*3mG
  Seq ID编号   寡聚核苷酸序列
  174   EU*C*G*T*C*G*A*C*G*T*T*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*iT
  175   EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*iT
  176   T*G*NI*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  177   T*G*NP*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  178   T*G*6NB*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  179   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T
  180   JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*G*G*C*G*G*C*G*C*C*G*C*C
  181   EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*G*G*C*G*G*C*G*C*C*G*C*C
  182   T*T*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  183   T*EU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  184   JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  185   JU*JU*C-G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  186   T*JU*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T
  187   EU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*T
  188   T*EU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*T
  189   T*JU*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G*T
  190   JU*C*G*T*C*G*T*T*T*T*rG*rU*rU*rG*rU*rG*rU
  191   EU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T
  192   EU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T
  193   EU-C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  194   EU-C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G
  195   T*G*U*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
  196   T*G*T*C-G*U*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T
缩写
  *   硫代磷酸酯核苷酸间键
  -   磷酸二酯核苷酸间键
  teg   间隔子9(三乙二醇磷酸酯)
  hex   十六烷基甘油基
  3mG   3′-O-甲基-rG
  iT   逆向核苷酸(3′和5′交换)
  2doub   二倍子2(Chemgenes)
  FF   2，4-二氟甲苯
  BU   5-溴-2′-脱氧尿苷
  JU   5-碘-2′-脱氧尿苷
  U   尿苷
  CU   5-氯-2′-脱氧尿苷
  FU   5-氟-dU
  EU   5-乙基-2′-脱氧尿苷
  6NB   6-硝基-苯并咪唑
  PU   5-丙炔基-dU
  I   肌苷
  Z   5-甲基-dC
  E   7-脱氮-dG
  FT   a，a，a-三氟-dT
  BVU   5-(d-溴-乙烯基)-尿苷
  NI   硝基吲哚
  NP   硝基吡咯
  F   5-氟-dU
  L   间隔子18(六乙二醇磷酸酯)
等效性
以上撰写的说明书可认为足以使本领域技术人员实践本发明。本发明并非限制在实施例确定范围之内，这是由于实施例旨在作为本发明的一个方面的单一描述，而其它功能性的等价实施例也在本发明的范围之内。由以上的描述，除本文所显示和描述之外的本发明的各种改型对本领域技术人员而言也是显而易见的，并且落在所附权利要求的范围之中。本发明的优势和目的并非必须地被本发明的每个实施例所涵盖。
序列表
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
序列表
<110>科勒制药有限责任公司(Coley Pharmaceutical GMBH)
<120>具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
<130>PSH53774AJ-SEQ ID NOS
<140>未转让
<141>2007-09-27
<150>US 60/847,811
<151>2006-0927
<160>198
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>1
tgtcgttttt tttttttttt    20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>2
tgtcgttttt tttttttttt    20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<400>3
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<400>4
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<400>5
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<400>6
tgtngttttt tttttttttt    20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<400>7
tgtcnttttt tttttttttt    20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<400>8
tncgtttttt tttttttttt    20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是2，4-二氯甲苯
<400>9
tgtcgtnttt tttttttttt    20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-溴-2’-脱氧尿苷
<400>10
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-溴-2’-脱氧尿苷
<400>11
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-溴-2’-脱氧尿苷
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-溴-2’-脱氧尿苷
<400>12
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>13
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>14
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>15
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是尿苷
<400>16
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是尿苷
<400>17
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是尿苷
<400>18
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>19
ncgtcgtttt tcggtcgttt t    21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>20
tcgncgtttt tcggtcgttt t    21
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>21
tcgtcgtttt tcggncgttt t    21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>22
ncgncgtttt tcggtcgttt t    21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是5-碘2’-脱氧尿苷
<400>23
tcgncgnttt tcggtcgttt t    21
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>24
tcgtcgtttt tcggncgntt t    21
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>25
tcttttttgt cgtttttttt tt    22
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>26
tgctgctttt gtgcttttgt gctt    24
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>27
ncgtcgtttt acggcgccgt gccg    24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>28
tcgncgtttt acggcgccgt gccg    24
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>29
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>30
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>31
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>31
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg    23
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>32
tcgncgacga tcggcgcgcg ccg    23
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n是a，c，g或t
<400>33
ncgncgacga tcggcgcgcg ccg    23
<210>34
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>34
ncgacgtcgt ggggg    15
<210>35
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>35
tcgacgncgt ggggg    15
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<210>36
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>36
tcgacgncgn ggggg    15
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>37
tcgtcgtttt tcggtcgttt t    21
<210>38
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>38
gtcgtt    6
<210>39
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>39
gncgtt    6
<210>40
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>40
gncgnt    6
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-氯-2’-脱氧尿苷
<400>41
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>42
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>43
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>43
tcgacgtcgt ggggg    15
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>n是a，c，g或t
<400>44
ncgncgtttt acggcgccgt gccg    24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是5-碘-2’脱氧尿苷
<400>45
tcgncgnttt acggcgccgt gccg    24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>46
tcgtcgtttt acggcgccgt gccg    24
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>47
tcttttttgn cgtttttttt tt    22
<210>48
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>48
tcttttttgn cgnttttttt tt    22
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>49
ncttttttgt cgtttttttt tt    22
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>50
ncttttttgt cgtttttttt tt    22
<210>51
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是尿苷
<400>51
tcttttttgn cgtttttttt tt    22
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<400>52
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg    23
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>53
tccaggactt ctctcaggtt    20
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>54
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg    22
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>55
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt    24
<210>56
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>56
tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>57
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>57
tcgtcgacga tcggcggccg ccg    23
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>58
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>59
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>其中所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键
<400>59
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>60
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt    24
<210>61
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>其中所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键
<400>61
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt    24
<210>62
<211>23
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>62
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>63
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1).，(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>63
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>64
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>64
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>其中所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>65
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>66
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt    24
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>67
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt    24
<210>68
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>68
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg    22
<210>69
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>69
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg    23
<210>70
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>70
tcggacgttc ggcgcgcgcc g    21
<210>71
<211>19
<212>DNA
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>71
tcggacgttc ggcgcgccg    19
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>72
tcgcgtcgtt cggcgcgccg    20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>73
tcgacgttcg gcgcgcgccg    20
<210>74
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>74
tcgacgttcg gcgcgccg    18
<210>75
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>75
tcgcgtcgtt cggcgccg    18
<210>76
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>76
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg    22
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-氟-dU
<400>77
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-氟-dU
<400>78
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-氟-dU
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-氟-dU
<400>79
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是尿苷
<400>80
tgncgntttt tttttttttt    20
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是6-硝基-苯并咪唑
<400>81
tgtcnttttt tttttttttt    20
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是6-硝基-苯并咪唑
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>其中核苷酸间键是磷酸二酯键
<400>82
tgtngttttt tttttttttt    20
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是6-硝基-苯并咪唑
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>其中核苷酸间键是磷酸二酯键
<400>83
tgtngttttt tttttttttt    20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>84
ngtcgttttt tttttttttt    20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>85
ngncgttttt tttttttttt    20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>86
tgtcgtnttt tttttttttt    20
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是a，a，a-三氟-dT
<400>87
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是a，a，a-三氟-dT
<400>88
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是a，a，a-三氟-dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是a，a，a-三氟-dT
<400>89
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-氯-2’-脱氧尿苷
<400>90
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-氯-2’-脱氧尿苷
<400>91
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-氯-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-氯-2’-脱氧尿苷
<400>92
tgncgntttt tttttttttt    20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>93
tncgtttttt tttttttttt    20
<210>94
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>94
tgncgtttt    9
<210>95
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>95
tgncgttttg tcgtt    15
<210>96
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>其中n是六乙二醇磷酸酯
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中n是Doubler2
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>96
tgncgttnnn    10
<210>97
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>其中n是六乙二醇磷酸酯
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中n是Doubler2
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>97
ncgttcgnnn    10
<210>98
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>98
ttncgtcgtt tcgtcgtt    18
<210>99
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-溴-2’-脱氧尿苷
<400>99
ncgacgtcgt ggggg    15
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>100
tgngcttttt tttttttttt    20
<210>101
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>其中n是六乙二醇磷酸酯
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中n是Doubler2
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是三乙二醇磷酸酯
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<400>101
tgncgttnnn    10
<210>102
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>其中n是六乙二醇磷酸酯
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中n是Doubler2
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是三乙二醇磷酸酯
<400>102
ncgttcgnnn    10
<210>103
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>103
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cg    22
<210>104
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>104
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
tcgncgtttt cggcgcgcgc cg    22
<210>105
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>105
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cg    22
<210>106
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>106
ncgtcgtttt tcggncgttt t    21
<210>107
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>107
tcgncgtttt tcggncgttt t    21
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>108
tgncgttttt ttttgncgtt    20
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>109
tgncgttttt ttt ttttttt    20
<210>110
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>其中n是7-脱氮-dG
<400>110
ncgacgtcgt ggngg    15
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<400>111
tnncgttttt tttttttttt    20
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>112
tgncnttttt tttttttttt    20
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>113
tnncnttttt tttttttttt    20
<210>114
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>114
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
ncgncgtttt tcggtcgttt t    21
<210>115
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>其中所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>115
ncgncgtttt tcggtcgttt t    21
<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-丙炔基-dU
<400>116
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-丙炔基-dU
<400>117
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>118
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-溴-2’-脱氧尿苷
<400>118
ncgacgtcgt ggggg    15
<210>119
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>119
tgncgttttc ggcgcgcgcc g    21
<210>120
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>120
tncgttttcg gcgcgcgccg t    21
<210>121
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>121
tncgtttttt tttttttttt    20
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>122
tgngcttttt tttttttttt    20
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>123
ncgtcgtttt tcggtcgttt t    21
<210>124
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>124
ncgtcgtttt tcggtcgttt t    21
<210>125
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是十六烷基甘油基
<400>125
gncgttn    7
<210>126
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是十六烷基甘油基
<400>126
gncgntn    7
<210>127
<211>7
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>其中n是十六烷基甘油基
<400>127
gncgntn    7
<210>128
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>128
ncgtcgtttt acggcgccgt gccg    24
<210>129
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>129
tcgncgtttt acggcgccgt gccg    24
<210>130
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>130
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccg    23
<210>131
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>131
nctttttttt ttttttt    17
<210>132
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>132
nctttttttt cgtttttttt tt    22
<210>133
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<400>133
tctttttttn cgtttttttt tt    22
<210>134
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>134
nctttttttn cgtttttttt tt    22
<210>135
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>135
ncgtcgtttc gtcgttttgt cgtt    24
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>136
tcgtcgtttc gtcgttttgn cgtt    24
<210>137
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>137
ncgtcgtttc gtcgttttgn cgtt    24
<210>138
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是7-脱氮-dG
<400>138
tgncnttttt tttttttttt    20
<210>139
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>其中n是肌苷
<400>139
tgncnttttt tttttttttt    20
<210>140
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>其中n是5-甲基-dC
<400>140
tgnngttttt tttttttttt    20
<210>141
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>141
tgtcgttntt tttttttttt    20
<210>142
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>142
tgtcgtttnt tttttttttt    20
<210>143
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>143
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt    23
<210>144
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>144
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgt    23
<210>145
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>145
tcgncgtttt cggcgcgcgc cgt    23
<210>146
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>146
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt    23
<210>147
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>147
tcgtcgtttn cggcgcgcgc cgt    23
<210>148
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<400>148
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cgt    23
<210>149
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>149
ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt    23
<210>150
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>150
ncgncgtttt cggcgcgcgc cgt    23
<210>151
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>151
ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt    24
<210>152
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>152
ncgtcgtttt gtcgttttgt cgtt    24
<210>153
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是5-d-溴-乙烯基-尿苷
<400>153
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>154
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是5-d-溴-乙烯基-尿苷
<400>154
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>155
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>155
ncggcggccg ccg    13
<210>156
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>156
ncgtcgtttt acggcgccgt gccn    24
<210>157
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是3’O-甲基-rG
<400>157
ncgtcgtttt acggcgccgt gccn    24
<210>158
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>其中所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>158
ncgncgtttt acggcgccgt gccn    24
<210>159
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>159
ncgncgtttt acggcgccgt gccn    24
<210>160
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>其中n是5’到5’连接的胸苷
<400>160
ncgtcgtttt acggcgccgt gccgn    25
<210>161
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>161
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn    22
<210>162
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>162
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn    22
<210>163
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>163
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cn    22
<210>164
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>其中所有核苷酸间键都是硫代磷酸酯核苷酸间键
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>164
ncgncgtttt cggcgcgcgc cn    22
<210>165
<211>22
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>165
ncgncgtttt cggcgcgcgc cn    22
<210>166
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>166
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn    22
<210>167
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<222>(22)..(22)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>167
ncgtcgtttn cggcgcgcgc cn    22
<210>168
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>其中n是5’到5’连接的胸苷
<400>168
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgn    23
<210>169
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>其中n是5’到5’连接的胸苷
<400>169
ncgtcgtttt cggcgcgcgc cgn    23
<210>170
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>170
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn    24
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<210>171
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>171
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccn    24
<210>172
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>n是a，c，g或t
<400>172
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn    23
<210>173
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>其中n是3’-O-甲基-rG
<400>173
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccn    23
<210>174
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>其中n是5’到5’连接的胸苷
<400>174
ncgtcgacgt tcggcgccgt gccgn    25
<210>175
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>其中n是5’到5’连接的胸苷
<400>175
ncgtcgacga tcggcgcgcg ccgn    24
<210>176
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是硝基吲哚
<400>176
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>177
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是硝基吡咯
<400>177
tgncgttttt tttttttttt    20
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<210>178
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是6-硝基-苯并咪唑
<400>178
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>179
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>179
ncgtcgtttt tcggtcgttt t    21
<210>180
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>180
ncgtcgacga tggcggcgcc gcc    23
<210>181
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>181
ncgtcgacga tggcggcgcc gcc    23
<210>182
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>182
ttcgttttcg gcgcgcgccg t    21
<210>183
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>183
tncgttttcg gcgcgcgccg t    21
<210>184
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>184
ncgttttcgg cgcgcgccgt    20
<210>185
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>185
nncgttttcg gcgcgcgccg t    21
<210>186
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>186
tncgttttcg gcgcgcgccg t    21
<210>187
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>187
ncgtcgtttt acggcgccgt gccgt    25
<210>188
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>188
tncgttttac ggcgccgtgc cgt    23
<210>189
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<400>189
tncgttttac ggcgccgtgc cgt    23
<210>190
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>其中残基是脱氧核糖核苷酸
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-碘-2’-脱氧尿苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(17)
<223>其中残基是核糖核苷酸
<400>190
ncgtcgtttt guugugu    17
<210>191
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>191
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt    24
<210>192
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>192
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt    24
<210>193
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>193
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>194
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
PSH53774AJ-SEQ ID NOS.txt
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>其中n是5-乙基-2’-脱氧尿苷
<400>194
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg    23
<210>195
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>其中n是尿苷
<400>195
tgncgttttt tttttttttt    20
<210>196
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>其中n是尿苷
<400>196
tgtcgntttt tttttttttt    20
<210>197
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>197
tctttttttt cgtttttttt tt    22
<210>198
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡聚核苷酸
<400>198
cggcgccgtg ccg    13

Claims (94)

1.一种寡聚核苷酸，其包括：
序列R1YZR2，其中R1和R2选自亲脂性取代核苷酸类似物L、核苷酸和键，其中R1和R2中的至少一个是亲脂性取代核苷酸类似物L，其中Y是嘧啶核苷酸，且其中Z是嘌呤、嘧啶或脱碱基残基。
2.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中L包含5或6元环的核碱基类似物。
3.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中L包括下式I的基团，
Figure A2007800359670002C1
式I
其中A、B、X、D、E和F选自选择性地带有氢或取代基的碳或氮；
n是0或1；
虚线表示选择性的双键；
其中至少一个取代基不是从下组中选择：氧代、硫代、羟基、巯基、亚氨基、氨基、甲基和氢，且A、B、X、D、E和F原子中总共不超过3个氮(N)。
4.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中n是1。
5.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中n是0。
6.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子都是碳。
7.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的一个是氮。
8.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的两个是氮。
9.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的三个是氮。
10.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的至少一个被下组中的成员所取代：
F、Cl、Br、I、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烯基、环烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2、-S-烷基、-SO-烷基、-SO2-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、苄基、氧代、硫代、羟基、巯基和亚氨基，其中至少一个取代基不是氧代、硫代、羟基、巯基、亚氨基、氨基或甲基。
11.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A或E这两个原子中的一个被F、Cl、Br、I、C2-C6-烷基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烯基、环烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2、-S-烷基、-SO-烷基、-SO2-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、苄基或甲基所取代，条件是如果被甲基取代，则A、B、X、D、E和F都是C。
12.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代嘧啶。
13.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代尿嘧啶。
14.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代甲苯。
15.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代咪唑或吡唑。
16.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代三唑。
17.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶。
18.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是5-乙基-尿嘧啶或5-丙基-尿嘧啶。
19.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是5-丙炔基-尿嘧啶或(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶。
20.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是2，4-二氟-甲苯。
21.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I与3至6元芳环或脂环体系相稠合。
22.如权利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I与5至6元糖部分相连。
23.如权利要求22所述的寡聚核苷酸，其中所述5至6元糖部分是戊糖或己糖。
24.如权利要求23所述的寡聚核苷酸，其中所述戊糖是呋喃糖且所述己糖是吡喃糖，它们能够选择性地被F、氨基、烷氧基、烷氧基-乙氧基、氨基丙基、烯基、炔基或O2，C4-亚烷基桥取代。
25.如权利要求23所述的寡聚核苷酸，其中所述呋喃糖是核糖或脱氧核糖。
26.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1和R2都是L。
27.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1是L且R2是核苷酸。
28.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1是L且R2是键，因此所述寡聚核苷酸包含结构5′R1CG3′。
29.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1是L且R2是键，其中R3位于R1YZ的5′，因此所述寡聚核苷酸包含结构5′R3R1YZ3′。
30.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1是L且R2是键，其中第二个R1位于R1YZ的5′并与R1YZ通过一个核苷酸N隔开，因此所述寡聚核苷酸包含结构5′R1NR1YZ3′。
31.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含两个5′R1NR1YZ3′模体。
32.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Y包括选自下组的嘧啶：胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-卤代-胞嘧啶、2-硫代-胞嘧啶、4-硫代-胞嘧啶、N3-甲基-胞嘧啶、N4-烷基-胞嘧啶或6-取代胞嘧啶。
33.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Z是嘌呤核苷酸。
34.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Z包括选自下组的嘌呤：鸟嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮-次黄嘌呤、2-氨基-嘌呤、4-硫代-嘌呤、2，6-二氨基-嘌呤、8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤、7-硫代-8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤、7-烯丙基-8-氧代-7，8-二氢鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮-鸟嘌呤、8-氮-鸟嘌呤、N1-甲基-鸟嘌呤或嘌呤。
35.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Z是嘧啶核苷酸。
36.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Z是T。
37.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R2是L且R1是核苷酸。
38.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的长度为3个核苷酸。
39.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的长度为3-6个核苷酸。
40.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的长度为3-100个核苷酸。
41.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的长度为7-100个核苷酸。
42.如权利要求41所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸富含T。
43.如权利要求42所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包括至少80％的T。
44.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含至少一个回文序列。
45.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含两个回文序列。
46.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含一至四个未甲基化的CG二核苷酸。
47.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含至少一个(G)m序列，其中m为4至10。
48.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含至少一个甲基化CG二核苷酸。
49.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所有CG二核苷酸均未甲基化。
50.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其还包含非核苷酸修饰。
51.如权利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修饰选自C6-C48-聚乙二醇、C3-C20-烷-二醇、C3-C18-烷基氨基连接子和C3-C18-烷基硫醇连接子。
52.如权利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修饰选自胆固醇、胆汁酸、饱和或不饱和脂肪酸、以及叶酸。
53.如权利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修饰是十六烷基-甘油或二(十六烷基)甘油基团。
54.如权利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修饰是十八烷基-甘油或二(十八烷基)-甘油基团。
55.如权利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修饰是维生素E基团。
56.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其进一步包含非核苷酸分枝部分。
57.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其进一步包括核苷酸分枝部分。
58.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其进一步包括分枝部分，其中所述寡聚核苷酸具有至少两个5′-末端。
59.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的至少两个核苷酸具有稳定的键。
60.如权利要求59所述的寡聚核苷酸，其中所述稳定的键是硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、硼代磷酸酯键、氨基磷酸酯键或脱磷键，它们是对映体混合物或者是对映体纯的S或R构型。
61.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1YZR2中的YZ具有磷酸二酯键。
62.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1YZR2中的YZ具有硫代磷酸酯键。
63.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1YZR2中的R1Y具有硫代磷酸酯键。
64.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R1YZR2中的ZR2具有硫代磷酸酯键。
65.如权利要求61所述的寡聚核苷酸，其中所有其它核苷酸具有硫代磷酸酯键。
66.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸不含微载体。
67.如权利要求66所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸不含脂质载体。
68.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是A类寡聚核苷酸。
69.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是B类寡聚核苷酸。
70.如权利要求69所述的寡聚核苷酸，其中所述B类寡聚核苷酸具有序列5′TCN1TX1X2CGX3X43′，其中X1是G或A，X2是T、G或A，X3是T或C，X4是T或C，且N是任何核苷酸，N1和N2是各自由约0-25个N构成的核苷酸序列。
71.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是C类寡聚核苷酸。
72.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是P类寡聚核苷酸。
73.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是T类寡聚核苷酸。
74.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包括至少一个3′-3′键。
75.如权利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包括至少一个5′-5′键。
76.一种诱导免疫应答的方法，所述方法包括将免疫细胞与权利要求1-75中任一项所述的寡聚核苷酸相接触。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述免疫应答是IFN-α诱导。
78.如权利要求76所述的方法，其进一步包括抗原。
79.如权利要求76所述的方法，其中所述寡聚核苷酸通过选自下组的途径输送：经口、鼻内、舌下、静脉内、皮下、经粘膜、经眼、气管内、直接注射和皮内。
80.如权利要求76所述的方法，其中所述寡聚核苷酸或组合物以有效诱导细胞因子和/或趋化因子表达的量输送给受试对象。
81.如权利要求76所述的方法，其进一步包括向受试对象施用另外的免疫调节剂。
82.如权利要求76所述的方法，其中所述寡聚核苷酸输送给受试对象以治疗受试对象的自免疫疾病。
83.如权利要求76所述的方法，其中所述寡聚核苷酸输送给受试对象以治疗受试对象的气道重塑。
84.如权利要求76所述的方法，其中向受试对象施用所述寡聚核苷酸但不施用抗原。
85.一种治疗患有癌症的受试对象的方法，所述方法包括：
向受试对象施用有效治疗所述癌症的量的如权利要求1-75中任一项所述的寡聚核苷酸。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述癌症选自基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、大脑和中枢神经系统癌；乳腺癌、宫颈癌；绒癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头颈部癌；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌；包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤在内的淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌；泌尿系统癌症；以及其它癌和肉瘤。
87.如权利要求85所述的方法，其进一步包括向受试对象施用抗癌药物或治疗，例如化疗剂、放射。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述寡聚核苷酸通过选自下组的途径输送：经口、鼻内、舌下、静脉内、皮下、经粘膜、经眼、气管内、直接注射和皮内。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述受试对象经过外科手术治疗。
90.一种治疗受病毒感染或存在受病毒感染风险的受试对象的方法，所述方法包括：
向受病毒感染或存在受病毒感染风险的受试对象施用有效治疗所述病毒感染的量的如权利要求1-75中任一项所述的寡聚核苷酸。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述病毒感染由下述病毒引起：乙肝病毒HBV、丙肝病毒HCV、人类免疫缺陷病毒HIV、流感病毒、呼吸道合胞病毒RSV或乳头状瘤病毒HPV。
92.如权利要求90所述的方法，其中所述寡聚核苷酸通过选自下组的途径输送：经口、鼻内、舌下、静脉内、皮下、经粘膜、经眼、气管内、直接注射和皮内。
93.如权利要求90所述的方法，其进一步包括抗病毒剂。
94.如权利要求90所述的方法，其中所述受试对象对非CpG抗病毒疗法无应答。
CN200780035967.1A 2006-09-27 2007-09-25 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物 Active CN101517082B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84781106P 2006-09-27 2006-09-27
US60/847,811 2006-09-27
PCT/IB2007/004389 WO2008068638A2 (en) 2006-09-27 2007-09-27 Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101517082A true CN101517082A (zh) 2009-08-26
CN101517082B CN101517082B (zh) 2014-01-22

Family

ID=39492695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780035967.1A Active CN101517082B (zh) 2006-09-27 2007-09-25 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物

Country Status (22)

Country Link
US (3) US8580268B2 (zh)
EP (2) EP2078080B1 (zh)
JP (2) JP5455629B2 (zh)
KR (2) KR101251707B1 (zh)
CN (1) CN101517082B (zh)
AU (1) AU2007330410B2 (zh)
BR (1) BRPI0717510B8 (zh)
CA (1) CA2664219C (zh)
DK (1) DK2078080T3 (zh)
ES (1) ES2544958T3 (zh)
HK (1) HK1133440A1 (zh)
HU (1) HUE027064T2 (zh)
IL (1) IL197549A (zh)
MX (1) MX2009003398A (zh)
NO (1) NO342465B1 (zh)
NZ (1) NZ575437A (zh)
PL (1) PL2078080T3 (zh)
PT (1) PT2078080E (zh)
RU (1) RU2477315C2 (zh)
SI (1) SI2078080T1 (zh)
WO (1) WO2008068638A2 (zh)
ZA (1) ZA200901735B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105936906A (zh) * 2013-11-08 2016-09-14 上海交通大学 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
CN107090009A (zh) * 2017-04-14 2017-08-25 佛山科学技术学院 一种二糖核苷化合物及其制备方法
CN107106674A (zh) * 2015-01-16 2017-08-29 硕腾服务有限责任公司 口蹄疫疫苗
CN109675025A (zh) * 2013-09-19 2019-04-26 硕腾服务有限责任公司 油基佐剂

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
ES2272069T3 (es) 1998-05-22 2007-04-16 Ottawa Health Research Institute Metodos y productos para inducir inmunidad en mucosas.
AU4343700A (en) * 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
ES2487645T3 (es) * 2001-06-21 2014-08-22 Dynavax Technologies Corporation Compuestos inmunomoduladores quiméricos y métodos de uso de los mismos
CN1604795B (zh) 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
EP2368431A1 (en) 2002-04-04 2011-09-28 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
MXPA05004588A (es) 2002-10-29 2005-12-14 Coley Pharmaceutical Group Ltd Metodos y productos relacionados con el tratamiento y prevencion de infeccion de virus de hepatitis c.
KR20050088079A (ko) 2002-11-15 2005-09-01 이데닉스 (케이만) 리미티드 2'-분지형 뉴클레오시드 및 플라비비리다에 돌연변이
AU2003300919A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 Coley Pharmaceutical Gmbh 5' cpg nucleic acids and methods of use
US8158768B2 (en) * 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
EP1663316A2 (en) * 2003-09-25 2006-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid lipophilic conjugates
UA88457C2 (ru) 2003-10-30 2009-10-26 Коли Фармасьютикал Гмбх Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
EP2591787A1 (en) 2007-08-13 2013-05-15 Pfizer Inc Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
CN101820908A (zh) 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
US8541569B2 (en) * 2008-09-06 2013-09-24 Chemgenes Corporation Phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, efficient RNA synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA
SG171914A1 (en) 2008-12-02 2011-07-28 Chiralgen Ltd Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
KR100998365B1 (ko) * 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
DK2575878T3 (en) 2010-05-28 2018-08-13 Zoetis Belgium S A VACCINES INCLUDING CHOLESTEROL AND CPG AS THE ONLY ADJUVENT CARRIER MOLECULES
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
JP2014514295A (ja) 2011-03-31 2014-06-19 アイディニックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ウイルス感染の治療のための化合物および薬学的組成物
DK2734208T3 (en) 2011-07-19 2017-06-19 Wave Life Sciences Ltd PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS
EP2755983B1 (en) * 2011-09-12 2017-03-15 Idenix Pharmaceuticals LLC. Substituted carbonyloxymethylphosphoramidate compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of viral infections
EP2852605B1 (en) 2012-05-22 2018-01-31 Idenix Pharmaceuticals LLC 3',5'-cyclic phosphate prodrugs for hcv infection
SG11201407674TA (en) 2012-05-22 2014-12-30 Idenix Pharmaceuticals Inc D-amino acid compounds for liver disease
WO2013177188A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 3',5'-cyclic phosphoramidate prodrugs for hcv infection
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
US9598458B2 (en) 2012-07-13 2017-03-21 Wave Life Sciences Japan, Inc. Asymmetric auxiliary group
JP6246121B2 (ja) 2012-07-13 2017-12-13 株式会社新日本科学 キラル核酸アジュバント
WO2014052638A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Esters and malonates of sate prodrugs
TR201809048T4 (tr) 2012-10-08 2018-07-23 Centre Nat Rech Scient Hcv enfeksiyonu için 2'-kloro nükleosit analogları.
CN104884618A (zh) 2012-11-15 2015-09-02 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 寡核苷酸缀合物
EP2970358B1 (en) 2013-03-04 2021-06-30 Idenix Pharmaceuticals LLC 3'-deoxy nucleosides for the treatment of hcv
EP2970357A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 IDENIX Pharmaceuticals, Inc. Amino acid phosphoramidate pronucleotides of 2'-cyano, azido and amino nucleosides for the treatment of hcv
EP2996719B1 (en) * 2013-05-14 2019-06-26 Zoetis Services LLC Novel vaccine compositions comprising immunostimulatory oligonucleotides
WO2014197578A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Idenix Pharmaceuticals, Inc. 1',4'-thio nucleosides for the treatment of hcv
US20150037282A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 Idenix Pharmaceuticals, Inc. D-amino acid phosphoramidate pronucleotides of halogeno pyrimidine compounds for liver disease
CA2932878C (en) 2013-11-26 2020-11-03 Zoetis Services Llc Compositions for induction of immune response
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP3095460A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
US10160969B2 (en) 2014-01-16 2018-12-25 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
EP3131914B1 (en) 2014-04-16 2023-05-10 Idenix Pharmaceuticals LLC 3'-substituted methyl or alkynyl nucleosides for the treatment of hcv
ES2856844T3 (es) 2014-12-31 2021-09-28 Checkmate Pharmaceuticals Inc Inmunoterapia antitumoral combinada
US10456459B2 (en) 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions
EP3431591B1 (en) * 2016-03-09 2020-09-16 Tokyo University of Science Foundation Nucleic acid oligomer for rna hybrid formation
KR20210068601A (ko) 2016-06-02 2021-06-09 조에티스 서비시즈 엘엘씨 감염성 기관지염에 대한 백신
JP2019520339A (ja) * 2016-06-03 2019-07-18 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． オリゴヌクレオチド、その組成物および方法
GB201703529D0 (en) 2017-03-06 2017-04-19 Cambridge Entpr Ltd Vaccine composition
AU2018252193A1 (en) 2017-04-14 2019-10-17 Tallac Therapeutics, Inc. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
BR112020011845A2 (pt) 2017-12-15 2020-11-24 Bayer Animal Health Gmbh composições imunoestimulatórias
JP7370983B2 (ja) 2017-12-20 2023-10-30 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー ヘンドラウイルス感染症及びニパウイルス感染症に対するワクチン
EP3746457A1 (en) 2018-01-29 2020-12-09 Stichting Katholieke Universiteit New potent sialyltransferase inhibitors
TW202206098A (zh) 2020-08-11 2022-02-16 美商碩騰服務公司 抗冠狀病毒疫苗
WO2024077025A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Zoetis Services Llc Poultry vaccines and methods of protecting poultry

Family Cites Families (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
DE3280400D1 (de) 1981-10-23 1992-06-04 Molecular Biosystems Inc Oligonukleotides heilmittel und dessen herstellungsverfahren.
CA1339596C (en) 1987-08-07 1997-12-23 New England Medical Center Hospitals, Inc. Viral expression inhibitors
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
CA2082951C (en) 1991-03-15 1999-12-21 Robert M. Platz Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
AU678769B2 (en) 1992-07-27 1997-06-12 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5658738A (en) 1994-05-31 1997-08-19 Becton Dickinson And Company Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030050263A1 (en) 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
WO1996002555A1 (en) * 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US6030955A (en) 1996-03-21 2000-02-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York And Imclone Systems, Inc. Methods of affecting intracellular phosphorylation of tyrosine using phosphorothioate oligonucleotides, and antiangiogenic and antiproliferative uses thereof
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
JP2001513776A (ja) 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
JP2001526688A (ja) 1997-05-19 2001-12-18 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドアジュバント
ATE370740T1 (de) 1997-05-20 2007-09-15 Ottawa Health Research Inst Verfahren zur herstellung von nukleinsäurekonstrukten
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US20040006034A1 (en) 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
ATE408422T1 (de) 1997-07-03 2008-10-15 Donald E Macfarlane Methode zur hemmung immunstimulatorischer mit dna assoziierter antworten
ES2284247T3 (es) 1998-04-03 2007-11-01 University Of Iowa Research Foundation Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos.
AU3884199A (en) 1998-05-06 1999-11-23 Ottawa Health Research Institute Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
JP2002514397A (ja) 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
ES2272069T3 (es) 1998-05-22 2007-04-16 Ottawa Health Research Institute Metodos y productos para inducir inmunidad en mucosas.
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US20040247662A1 (en) 1998-06-25 2004-12-09 Dow Steven W. Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
AU764532B2 (en) 1998-07-27 2003-08-21 University Of Iowa Research Foundation, The Stereoisomers of CpG oligonucleotides and related methods
AU777225B2 (en) 1998-09-03 2004-10-07 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
FR2783170B1 (fr) 1998-09-11 2004-07-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Emulsion immunostimulante
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
AU3760100A (en) 1999-03-16 2000-10-04 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
AU4343700A (en) 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
WO2000067023A1 (en) 1999-04-29 2000-11-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening for immunostimulatory dna functional modifyers
BR0010323A (pt) 1999-05-06 2002-01-08 Immune Response Corp Inc Composições imunogênicas, kit e método de confecção da mesma para uso na imunização de um mamìfero
CA2412345A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
CA2381993A1 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide cpg-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
MXPA02003108A (es) 1999-09-25 2003-10-14 Univ Iowa Res Found Acidos nucleicos inmunoestimuladores.
AU783118B2 (en) 1999-09-27 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
WO2001045750A1 (en) 1999-12-21 2001-06-28 The Regents Of The University Of California Method for preventing an anaphylactic reaction
CA2396871A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
JP4443810B2 (ja) 2000-01-26 2010-03-31 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ誘導性免疫刺激の調節
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
EP1278761B1 (en) * 2000-05-01 2005-04-06 Hybridon, Inc. MODULATION OF OLIGONUCLEOTIDE CpG-MEDIATED IMMUNE STIMULATION BY POSITIONAL MODIFICATION OF NUCLEOSIDES
US20020013287A1 (en) 2000-05-09 2002-01-31 Reliable Biopharmaceuticals, Inc. St Louis Missouri Polymeric compounds useful as prodrugs
CA2412026A1 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
PT1296714E (pt) 2000-06-22 2009-10-15 Coley Pharm Gmbh Combinação de cpg e anticorpos dirigidos contra cd19, cd20, cd22 ou cd40 para o tratamento ou prevenção do cancro
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
EP1366077B1 (en) 2000-09-15 2011-05-25 Coley Pharmaceutical GmbH PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
JP2004509970A (ja) 2000-09-26 2004-04-02 ハイブリドン・インコーポレイテッド 位置的化学変化による免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログの免疫刺激活性の調節
FR2814958B1 (fr) 2000-10-06 2003-03-07 Aventis Pasteur Composition vaccinale
GB0025577D0 (en) 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ES2307568T3 (es) 2000-12-08 2008-12-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Acidos nucleicos de tipo cpg y metodos de uso de los mismos.
AU2002248185A1 (en) 2000-12-14 2002-07-16 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
ES2487645T3 (es) 2001-06-21 2014-08-22 Dynavax Technologies Corporation Compuestos inmunomoduladores quiméricos y métodos de uso de los mismos
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
AU2002318944A1 (en) 2001-08-01 2003-02-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
US20030133988A1 (en) 2001-08-07 2003-07-17 Fearon Karen L. Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
CN1604795B (zh) 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
CA2461315A1 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
WO2003094836A2 (en) 2001-10-12 2003-11-20 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US7276489B2 (en) 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
WO2003066649A1 (en) 2002-02-04 2003-08-14 Biomira Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
EP2368431A1 (en) * 2002-04-04 2011-09-28 Coley Pharmaceutical GmbH Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
CA2483012C (en) 2002-04-22 2011-05-24 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotide compositions and their use for the modulation of immune responses
CN1665531A (zh) 2002-05-10 2005-09-07 伊内克斯药物公司 甲基化的免疫刺激性寡核苷酸和利用这些寡核苷酸的方法
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
AU2003243409A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
SG167667A1 (en) * 2002-07-03 2011-01-28 Coley Pharm Group Inc Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AU2003255969A1 (en) 2002-07-17 2004-02-02 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
GT200300176A (es) * 2002-08-19 2004-03-29 Acidos nucleicos inmunoestimuladores
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
MXPA05004588A (es) 2002-10-29 2005-12-14 Coley Pharmaceutical Group Ltd Metodos y productos relacionados con el tratamiento y prevencion de infeccion de virus de hepatitis c.
AU2003300919A1 (en) 2002-12-11 2004-06-30 Coley Pharmaceutical Gmbh 5' cpg nucleic acids and methods of use
JP2006516099A (ja) 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
CA2512484A1 (en) 2003-01-16 2004-05-08 Hybridon, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by utilizing modified immunostimulatory dinucleotides
CA2521050A1 (en) 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use
US20050004144A1 (en) 2003-04-14 2005-01-06 Regents Of The University Of California Combined use of IMPDH inhibitors with toll-like receptor agonists
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
KR20060012622A (ko) 2003-05-16 2006-02-08 하이브리돈, 인코포레이티드 화학요법제와 함께 이뮤노머를 사용하는 상승적 암 치료방법
MXPA05013658A (es) 2003-06-11 2006-03-02 Hybridon Inc Oligonucleotidos inmunomoduladores estabilizados.
JP2007524615A (ja) 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
CN1822856B (zh) 2003-07-11 2010-04-28 英特塞尔股份公司 Hcv疫苗
US20050013812A1 (en) 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
MXPA06000619A (es) 2003-07-15 2006-04-11 Hybridon Inc Estimulacion sinergistica del sistema inmune usando oligonucleotidos inmunoestimuladores y/o compuestos inmunomeros en conjunto con citocinas y/o agentes quimioterapeuticos o terapia de radiacion.
WO2005023289A1 (ja) 2003-09-08 2005-03-17 Intellectual Property Consulting Incorporated 慢性ｃ型肝炎を治療するための医薬組成物
EP1663316A2 (en) 2003-09-25 2006-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
UA88457C2 (ru) 2003-10-30 2009-10-26 Коли Фармасьютикал Гмбх Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
US7713535B2 (en) 2003-12-08 2010-05-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties by small oligonucleotide-based compounds
AU2005230938A1 (en) 2004-02-19 2005-10-20 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
CN101217973A (zh) 2004-03-12 2008-07-09 海布里顿公司 使用第二代免疫调节寡核苷酸增强的hiv疫苗活性
JP2007531746A (ja) 2004-04-02 2007-11-08 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド Ｉｌ−１０応答を誘導するための免疫活性化核酸
JP2008501807A (ja) 2004-06-08 2008-01-24 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 抗原ならびに免疫活性化アゴニストおよび免疫活性化アンタゴニストのための担体基本骨格としての無塩基オリゴヌクレオチド
EE200700003A (et) 2004-06-15 2007-06-15 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimuleeriv oligonukleotiid ning selle kasutamine
EP2484374A1 (en) 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses
WO2006134423A2 (en) 2004-07-18 2006-12-21 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Methods and compositions for inducing innate immune responses
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
JP2008531018A (ja) 2005-02-24 2008-08-14 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 免疫刺激性オリゴヌクレオチド
BRPI0610449A2 (pt) 2005-04-08 2012-01-10 Coley Pharm Group Inc métodos para tratar asma exarcebada por doença infecciosa
US20060241076A1 (en) 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
EA200800268A1 (ru) 2005-07-07 2008-06-30 Коли Фармасьютикал Груп, Инк. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ АНТИТЕЛОМ ПРОТИВ CTLA-4 И СОДЕРЖАЩИМ CpG-МОТИВ СИНТЕТИЧЕСКИМ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
KR20080048067A (ko) 2005-09-16 2008-05-30 콜리 파마슈티칼 게엠베하 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 면역자극성 단일가닥리보핵산
CN101321868A (zh) 2005-09-16 2008-12-10 科利制药公司 通过核苷酸修饰调节短干扰核糖核酸(siRNA)的免疫刺激特性
WO2007050405A2 (en) 2005-10-21 2007-05-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. The induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in dendritic cells by tlr ligands and uses thereof
US20070093439A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US7470674B2 (en) 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
CA2630738C (en) 2005-11-25 2013-09-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
WO2007075626A2 (en) 2005-12-20 2007-07-05 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory activity of palindromic immune modulatory oligonucleotides (imo tm) contiaining different lengths of palindromic segments
EP1991678B2 (en) 2006-02-15 2020-07-15 Rechtsanwalt Thomas Beck Compositions and methods for oligonucleotide formulations
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
US20100189772A1 (en) 2006-09-27 2010-07-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc Compositions of TLR ligands and antivirals
KR101251707B1 (ko) * 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
KR20090058584A (ko) 2006-10-26 2009-06-09 콜리 파마슈티칼 게엠베하 올리고리보뉴클레오티드 및 그의 용도
US20090142362A1 (en) 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
AU2008252577A1 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Class A oligonucleotides with immunostimulatory potency
CN101820908A (zh) 2007-10-09 2010-09-01 科利制药公司 包含改性糖部分的免疫刺激寡核苷酸类似物
US9968305B1 (en) 2014-10-02 2018-05-15 James S Brown System and method of generating music from electrical activity data

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109675025A (zh) * 2013-09-19 2019-04-26 硕腾服务有限责任公司 油基佐剂
CN105936906A (zh) * 2013-11-08 2016-09-14 上海交通大学 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
CN105936906B (zh) * 2013-11-08 2019-06-21 上海交通大学 被修饰的含CpG序列单元的寡聚脱氧核苷酸分子及其用途
CN107106674A (zh) * 2015-01-16 2017-08-29 硕腾服务有限责任公司 口蹄疫疫苗
CN114699518A (zh) * 2015-01-16 2022-07-05 硕腾服务有限责任公司 口蹄疫疫苗
CN114699518B (zh) * 2015-01-16 2024-07-02 硕腾服务有限责任公司 口蹄疫疫苗
CN107090009A (zh) * 2017-04-14 2017-08-25 佛山科学技术学院 一种二糖核苷化合物及其制备方法
CN107090009B (zh) * 2017-04-14 2019-10-25 佛山科学技术学院 一种二糖核苷化合物及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8580268B2 (en) 2013-11-12
US9382545B2 (en) 2016-07-05
CN101517082B (zh) 2014-01-22
WO2008068638A8 (en) 2011-12-22
DK2078080T3 (en) 2015-08-24
EP2078080B1 (en) 2015-06-17
JP6006183B2 (ja) 2016-10-12
IL197549A (en) 2016-04-21
AU2007330410A8 (en) 2012-05-03
JP2010504750A (ja) 2010-02-18
AU2007330410B2 (en) 2012-07-26
US20160348115A1 (en) 2016-12-01
KR101251707B1 (ko) 2013-04-11
CA2664219C (en) 2013-12-17
NO342465B1 (no) 2018-05-28
WO2008068638A3 (en) 2008-11-13
NO20091218L (no) 2009-04-21
BRPI0717510B1 (pt) 2021-01-12
KR20130014620A (ko) 2013-02-07
EP2078080A2 (en) 2009-07-15
US20100166780A1 (en) 2010-07-01
AU2007330410A1 (en) 2008-06-12
EP2960332A1 (en) 2015-12-30
PT2078080E (pt) 2015-09-18
JP5455629B2 (ja) 2014-03-26
HK1133440A1 (zh) 2010-03-26
MX2009003398A (es) 2009-08-12
ES2544958T3 (es) 2015-09-07
US20140163213A1 (en) 2014-06-12
KR20090058581A (ko) 2009-06-09
BRPI0717510A2 (pt) 2013-11-19
ZA200901735B (en) 2010-05-26
RU2009109098A (ru) 2010-11-10
PL2078080T3 (pl) 2015-12-31
US10260071B2 (en) 2019-04-16
CA2664219A1 (en) 2008-06-12
JP2014036652A (ja) 2014-02-27
WO2008068638A2 (en) 2008-06-12
HUE027064T2 (hu) 2016-09-28
IL197549A0 (en) 2011-08-01
NZ575437A (en) 2012-02-24
BRPI0717510B8 (pt) 2021-09-14
RU2477315C2 (ru) 2013-03-10
SI2078080T1 (sl) 2015-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101517082B (zh) 具有增强的免疫刺激活性的含疏水性T类似物的CpG寡聚核苷酸类似物
ES2634328T3 (es) Ácidos nucleicos inmunoestimuladores
ES2486298T3 (es) Análogos de oligonucleótidos inmunoestimuladores que contienen azúcares modificados
US20080009455A9 (en) Immunostimulatory oligonucleotides
ES2544484T3 (es) Análogos de oligonucleótidos modificados con fosfato con actividad inmunoestimulante

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1133440

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CI01 Publication of corrected invention patent application

Correction item: Application date international application date

Correct: 20070927

False: 20070925

Number: 04

Volume: 30

CI03 Correction of invention patent

Correction item: Application date international application date

Correct: 20070927

False: 20070925

Number: 04

Page: The title page

Volume: 30

ERR Gazette correction

Free format text: CORRECT: APPLICATION DATE INTERNATIONAL APPLICATION DATE; FROM: 2007.09.25 TO: 2007.09.27

RECT Rectification
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1133440

Country of ref document: HK

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210324

Address after: American New York

Patentee after: Pfizer Inc.

Address before: Dusseldorf, Germany

Patentee before: COLEY PHARMACEUTICAL GmbH

TR01 Transfer of patent right