JP2006516099A - 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法 - Google Patents

分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、免疫調節化合物、並びに該免疫調節化合物を使用して細胞及び個体を免疫調節する方法を提供する。

Description

技術分野
[0002] 本発明は、細胞及び個体による免疫応答調節のための化合物及び方法に関する。本発明は、生体臨床医学及び免疫学の分野における使用を見出す。
関連特許出願に対するクロス-リファレンス
[0001] 本出願は、2002年12月23日に出願された米国仮特許出願第60/436,406号の利益を主張し、その開示全てが援用される。
背景
[0003] この節における刊行物への参照は、該刊行物が本発明に対する先行技術であるという示唆として解釈すべきでない。
[0004] 感染又は他の抗原チャレンジにより作り出される免疫応答のタイプは、応答に関わるＴヘルパー(Ｔｈ)細胞のサブセットにより一般的に区別される。Ｔｈ１サブセットは、古典的な細胞媒介性機能、例えば、遅延型過敏性及び細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬｓ)の活性化の原因である。一方Ｔｈ２サブセットは、Ｂ細胞活性化に対するヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫応答のタイプは、一般的に抗原に応答する細胞により作り出されるサイトカインにより一般的に影響される。Ｔｈ１とＴｈ２細胞により分泌されるサイトカインの違いは、これらの２個のサブセットの異なった生物学的機能を反映すると信じられている。例えば、Romagnani (2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85: 9-18を参照のこと。
[0005] Ｔｈ１サブセットは、ウイルス感染、細胞内病原体、及び腫瘍細胞に応答するためにとくに適しているかもしれない。なぜなら、Ｔｈ１サブセットは、ＣＴＬｓを活性化するＩＬ-２及びＩＦＮ-γを分泌するからである。Ｔｈ２サブセットは、遊離の生細菌及び蠕虫の寄生に応答するためにより適しうるし、そしてアレルギー反応を調節しうる。なぜならＩＬ-４及びＩＬ-５は、それぞれＩｇＥ産生及び好酸級活性化を誘導すると知られているからである。一般的に、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞は、異なったパターンのサイトカインを分泌し、そして応答のタイプの一方は、応答のタイプの他方の活性を抑えうる。Ｔｈ１/Ｔｈ２バランスの偏移は、アレルギー性反応、例えば又は或いは増大されたＣＴＬ応答をもたらす。
[0006] Ｔｈ１型の免疫応答は、特定の免疫調節ポリヌクレオチドの投与により、哺乳動物において誘導されうるということが、ここしばらくの間認識されてきた。免疫調節ポリヌクレオチドは、免疫刺激配列(「ＩＳＳ」)と呼ばれ、ＣＧジヌクレオチドを含むことが多い。例えば、ＰＣＴ公開WO 98/55495号、WO 97/28259号、米国特許第6,194,388号及び第6,207,646号；及びKrieg et al. (1995) Nature 374: 546-49を参照のこと。多くの感染性疾患、例えば結核およびマラリアでは、Ｔｈ２型応答は、感染に対してほとんど防御価値がない。タンパク質に基くワクチンは、典型的にＴｈ２型免疫応答を誘導し、中和抗体の高いタイターであるが、有意な細胞媒介性免疫を伴わないことにより特徴付けられる。それ以上に、抗体応答のいくつかのタイプは、特定の適応において、特にＩｇＥ抗体応答がアナフィラキシー・ショックをもたらしうるアレルギーにおいて不適切である。
[0007] 免疫療法の改良された方法に対する必要性を考慮すると、免疫応答を調節する化合物の同定のための必要性が存在する。
[0008] 一の態様では、本発明は、分枝状の免疫調節化合物(ＢＩＣ)であって、３個の中心核酸成分が共有結合される分枝点(branch-point)ヌクレオシドを含み、ここで該３個の中心核酸成分が分枝点ヌクレオシドの異なる位置に結合される、上記免疫調節化合物を提供する。該ＢＩＣは、場合により１以上のさらなる核酸成分を含み；そしてＢＩＣの核酸成分の少なくとも１は、５'-ＣＧ-３'配列を含む。ある実施態様では、ＢＩＣは、スペーサー成分を含む。ある実施態様では、ＢＩＣにおける中心核酸成分の１以上は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート・エステル、ホスホロジチオエート・エステル、ホスホラミダイト(phosphoramidite)、又はアルキルホスホネート(alkylphosphonate)である結合により、分枝点ヌクレオシドに共有結合される。ある実施態様では、ＢＩＣにおける３個の中心核酸成分の１以上は、スペーサー分子を介して分枝点ヌクレオシドに共有結合される。
[0009] 一の態様では、本発明は、互いにスペーサー成分により共有結合される２個の分枝点ヌクレオシドを含み、ここで該２個の分枝点ヌクレオシド間の該結合は、核酸成分を含まず、ここで該分枝点ヌクレオシドの各々は、少なくとも２個の別の成分に共有結合され、ここで各成分は、分枝点ヌクレオシド及び核酸成分からなる群から独立して選ばれる；該ＢＩＣは、少なくとも４個の核酸成分を含み；そしてＢＩＣの核酸成分の少なくとも１は、５'-ＣＧ-３'配列を含む。
[0010] ある実施態様では、ＢＩＣの核酸成分の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４は、スペーサー成分を介して、分枝点ヌクレオシドに共有結合される。幾つかの実施態様では、スペーサー成分は、ＨＥＧ、ＴＥＧ、又はＣ２-Ｃ１０アルキル、及び/又はホスホジエステル-又はホスホロチオエート結合オリゴエチレン・グリコール成分からなる群から選ばれる要素を含む。
[0011] 核酸成分は、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート・エステル結合、又はホスホロジチオエート・エステル結合により少なくとも１のスペーサー成分に結合されることもある。分枝点ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート・エステル結合、又はホスホロジチオエート・エステル結合により、少なくとも１のスペーサー成分に結合されることもある。
[0012] 本発明のＢＩＣは、１以上の核酸成分(例えば、中心(core)核酸成分(neucleic acid moieties)[ＮＡＭｓ]、プライム(prime)ＮＡＭｓ、及び/又は周辺(peripheral)ＮＡＭｓ)を含み、該成分は、５'-ＣＧ-３'配列、代わりに５'-ＴＣＧ-３'配列、代わりに５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)-３'配列、代わりに５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)ＣＧ-３'配列、代わりに、５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)ＣＧ(Ａ／Ｔ)-３'配列、代わりに５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'又は５'-ＴＣＧＴＣＧＡ-３'配列を含む。
[0013] 本発明のＢＩＣは、１以上の核酸成分(例えば、中心核酸成分[ＮＡＭｓ]、プライムＮＡＭｓ、及び/又は周辺ＮＡＭｓ)であって、１２ヌクレオチド長未満、又は１５ヌクレオチド長未満のものを含む。ある実施態様では、５'-ＣＧ-３'配列を含むＢＩＣにおけるＮＡＭｓの各々は、８ヌクレオチド長未満である。
[0014] ある態様では、ＢＩＣは、リボヌクレオシドである分枝点ヌクレオシド(ｂＮ)を含む。ある実施態様では、ＢＩＣは、分枝点ヌクレオシドの塩基に結合される１の核酸成分、分枝点ヌクレオシドの５'位に結合される１の核酸成分、及び分枝点ヌクレオシドの３'又は２'位のいずれかに結合される１の核酸成分を含む。
[0015] ある態様では、ＢＩＣは、２'-デオキシリボヌクレオシドである分枝点ヌクレオシドを含むこともある。ある実施態様では、１の核酸成分は分枝点ヌクレオシドの塩基に結合され、１の核酸成分は分枝点ヌクレオシドの５'位に結合され、そして１の核酸成分は分枝点ヌクレオシドの３'位に結合される。
[0016] ある実施態様では、ＢＩＣはピリミジン塩基を含む。
[0017] ある実施態様では、分枝点ヌクレオシドは、ピリミジン塩基、分枝点ヌクレオシドの５'位に結合される１の核酸成分、分枝点ヌクレオシドの３'位に結合される１の核酸成分、そして分枝点ヌクレオシドの糖の５'-Ｃ、４'-Ｃ、又は３'-Ｃ位に結合される１の核酸成分を含む２'-デオキシリボヌクレオシドである。
[0018] ある実施態様では、分枝点ヌクレオシドは、ピリミジン塩基、分枝点ヌクレオシドの５'位に結合される１の核酸成分、分枝点ヌクレオシドの２'-又は３'位いずれかに結合される１の核酸成分、並びに分枝点ヌクレオシドの糖の５'-Ｃ、４'-Ｃ、又は３'-Ｃ位に結合される１の核酸成分を含むリボヌクレオシドである。
[0019] 種々の実施態様では、本明細書中で記載されるＢＩＣは、以下の特徴：
(ｖｉｉ)ＢＩＣは、「単離された(isolated)免疫調節活性」を持たないＢＩＣの核酸成分の少なくとも１含み、
(ｖｉｉｉ)ＢＩＣは、「単離された免疫調節活性」を持つ核酸成分を全く含まない、
(ｉｘ)ＢＩＣは、「劣った単離された免疫調節活性」を持つＢＩＣの核酸成分の少なくとも１を含む
の１以上を有する。ＢＩＣｓは、自己相補的核酸成分を有し、その結果二本鎖が形成されうる。
[0020] ＢＩＣは、免疫調節活性、例えば
(ａ)ヒト末梢血液単核細胞によりＩＦＮ-γ産生を刺激する能力；
(ｂ)ヒト末梢血液単核細胞によりＩＦＮ-α産生を刺激する能力；及び/又は
(ｃ)ヒトＢ細胞増殖を刺激する能力
のうちの少なくとも１を有しうる。
[0021] 本発明はまた、医薬として許容される賦形剤及び/又は抗原及び/又はカチオン性マイクロキャリア(例えば、乳酸及びグリコール酸)と一緒にＢＩＣを含む組成物を提供する。組成物は、実質的にエンドトキシン-フリーでありうる。
[0022] ある態様では、本発明は、本明細書中に記載されるＢＩＣと、医薬として許容される賦形剤、抗原(例えば、免疫応答が所望される抗原)、又はその両方を含む組成物を提供する。ある実施態様では、組成物はＧＭＰ基準の下で剤形される。ある実施態様では、組成物はエンドトキシンの存在について組成物をアッセイすることを含む方法により製造される。ある実施態様では、組成物は実質的にエンドトキシン-フリーである。ある実施態様では、組成物はリポソームを含まない。
[0023] ある態様では、本発明は、医薬の製造のための、本明細書中に記載されるＢＩＣの使用を提供する。
[0024] ある態様では、本発明は、細胞とＢＩＣを含む組成物とを接触することにより、細胞の免疫応答を調節する方法を提供する。ある実施態様では、ＢＩＣを含む組成物は、多量体のＢＩＣを含む。
[0025] ある態様では、本発明は、分枝状免疫調節化合物又は本明細書中に記載されるＢＩＣを含む組成物を、個体において免疫応答を調節するために十分な量で投与することにより、個体において免疫応答を調節する方法を提供する。一の実施態様では、該個体は、Ｔｈ２型免疫応答に関連する疾患、例えばアレルギー又はアレルギー誘導性喘息を患う。一の実施態様では、該個体は感染性疾患を有する。
[0026] ある態様では、本発明は、個体においてインターフェロン・ガンマ(ＩＦＮ-γ)を増大するために十分な量で、本明細書中に記載されるＢＩＣ又は組成物を投与することにより、個体においてＩＦＮ-γを増大する方法を提供する。ある実施態様では、該個体は、炎症性疾患を患う。ある実施態様では、該個体は特発性繊維症を患う。
[0027] ある態様では、本発明は、個体においてインターフェロン・アルファ(ＩＦＮ-α)を増大するために十分な量で、本明細書中に記載されるＢＩＣ又は組成物を投与することにより、個体においてＩＦＮ-αを増大する方法を提供する。ある実施態様では、個体は、ウイルス感染を患う。
[0028] ある態様では、本発明は、個体に、本明細書中に記載されるＢＩＣ又は組成物の有効量を投与することにより、個体における感染性疾患の病徴を改善する方法を提供する。ここで、該有効量は、該感染性疾患の病徴を改善するために十分な量である。
[0029] ある態様では、本発明は、ＩｇＥ関連疾患を患う個体に、本発明に記載されるＢＩＣ又は組成物の有効量を投与することにより、個体においてＩｇＥ関連疾患を改善する方法を提供する。ここで、有効量は、ＩｇＥ関連疾患の病徴を改善するために十分な量である。ある実施態様では、ＩｇＥ関連疾患は、アレルギー性又はアレルギー関連疾患である。
[0030] 本発明は、さらに、個体において免疫応答を調節するために十分な量で、個体にＢＩＣを投与することにより、個体において免疫応答を調節する方法を提供する。ある実施態様では、該個体は癌を患い、及び/又はＴｈ２型免疫応答に関連する疾患(例えば、アレルギー又はアレルギー誘導性喘息)を患い、及び/又は感染性疾患を患う。
発明の詳細な記載
Ｉ. 一般的方法
[0040] 本発明の実行は、他に指示がない限り、分子生物学 (組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生物化学、核酸化学、及び免疫学の慣用技術を使用し、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。そうした技術は、文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook et al., 1989) 、及びMolecular Cloning : A Laboratory Manual, 第三版(Sambrook and Russel, 2001)、(本明細書中で、併せて及び個々に、「Sambrook」と呼ぶ)。 Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 2001年の捕捉を含む); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991) ; The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, and Harlow and Lane (1999) Using Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (併せて及び個々に"Harlow and Lane"と呼ぶ), Beaucage et al.著 Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); 並びにAgrawal, ed., Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press Inc., New Jersey, 1993)に十分に説明される。
ＩＩ. 定義
[0041] 本明細書中に使用されるとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、他に記載されるか又は文脈から明確でない限り、複数形を含む。
[0042] 本明細書中に交換可能なように使用されるとき、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)、二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)、及び二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、改変オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド、又はそれらの組合せを含む。核酸は、直鎖又は環状の形状であるか、又はオリゴヌクレオチドは、直鎖及び環状断片の両方を含みうる。核酸は、例えばホスホジエステル結合又は代わりの結合、例えばホスホロチオエート・エステルを介して繋がれたヌクレオシドのポリマーである。ヌクレオシドは、プリン(アデニン(Ａ)若しくはグアニン(Ｇ)又はそれらの誘導体)又はピリミジン(チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)、又はウラシル(Ｕ)、又はそれらの誘導体)塩基であって、糖に結合される塩基からなる。ＤＮＡにおける４個のヌクレオシド・ユニット(又は塩基)は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
[0043] 「３'」という用語は、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける別の領域又は位置から３'(下流)のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける領域又は位置を一般的に指す。
[0044] 「５'」という用語は、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける別の領域又は位置から５'(上流)のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける領域又は位置を一般的に指す。
[0045] 領域、部分、スペーサー、又は配列に直接接しているとき、ある要素、例えば領域、部分、非核酸スペーサー成分、核酸成分、又は配列は、別の要素、例えば領域、部分、非核酸スペーサー成分、核酸成分、又は配列に「隣接」する。
[0046] 「ＢＩＣ-抗原複合体」という用語は、ＢＩＣ及び抗原が結合された複合体を指す。そうした複合体結合は、共有及び/又は非共有結合を含む。
[0047] 「抗原」という用語は、抗体により又はＴ細胞抗原受容体により特異的に認識され、そして結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、炭化水素複合体、糖、ガングリオシド、脂質、及びリン脂質；それらの部分、並びにそれらの組合せを含みうる。抗原は、天然に見つかることもあるし、又は合成されることもある。ＢＩＣと併せた投与に適した抗原は、Ｂ細胞又はＴ細胞抗原特異的応答を誘発できる分子のいずれかを含む。好ましくは、抗原は、抗原に特異的な抗体応答を誘発する。好ましくは、本発明の抗原は、ペプチド、脂質(例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質)、多糖、例えばヘモフィルス・インフルエンザ・ワクチンにおいて使用される多糖、ガングリオシド、及び糖タンパク質を含む。
[0048] 「アジュバント」は、免疫原、例えば抗原に加えられるとき、非特異的に該混合液に晒された際にレシピエントの宿主において、非特異的に免疫原に対する免疫応答を高め又は増強する物質を指す。
[0049] 「ペプチド」という用語は、十分な長さを有し、そしてペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生物学的応答、例えば抗体産生又はサイトカイン活性に影響する組成のポリペプチドである。典型的に、ペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸残基長である。「ペプチド」という用語は、さらに(天然であろうと又は非天然であろうと)改変アミノ酸を含み、そうした改変は、非限定的にリン酸化、グリコシル化、ペグ化(pegylation)、脂質化(lipidization)、及びメチル化を含む。
[0050] 「抗原性ペプチド」は、精製された未変性のペプチド、合成ペプチド、組み換えペプチド、粗製ペプチド抽出物、又は部分的に精製された状態若しくは未精製の活性状態におけるペプチド(例えば、弱毒化又は不活性化ウイルス、細胞、微生物の一部であるペプチド)、又はそうしたペプチドの断片を含みうる。「抗原性ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は従って、１以上の抗原性質を示すポリペプチドの全て又は一部を意味する。こうして、例えば「Ａｍｂ ａ １抗原性ポリペプチド」又は「Ａｍｂ ａ １ ポリペプチド抗原」は、配列全体、配列の一部、及び/又は配列の改変であろうと、Ａｍｂ ａ１由来のアミノ酸配列であり、これは抗原性性質を示す(つまり、抗体又はＴ細胞受容体に特異的に結合する)。
[0051] 「デリバリー分子」又は「デリバリー担体」は、ＢＩＣ、ＢＩＣ-抗原混合体、又はＢＩＣ-抗原複合体の、特定の部位への及び/又は特定のタイミングでのデリバリーを亢進し、許容し、及び/又は高める化学成分である。デリバリー担体は、さらに免疫応答を刺激することもあるし又は刺激しないこともある。
[0052] 「抗原に対するアレルギー応答」は、(通常肺において)好酸球及び/又は抗原特異的ＩｇＥの生成、及びその結果としての効果により一般的に特徴付けられる免疫応答を意味する。当該技術分野に周知であるように、ＩｇＥは、マスト細胞及び好塩基球上のＩｇＥ受容体に結合する。ＩｇＥにより認識される抗原に晒された後、抗原は、マスト細胞及び好塩基球上のＩｇＥに結合(cross-links）し、これらの細胞の脱顆粒を引き起こし、非限定的にヒスタミン放出を含む。「抗原に対するアレルギー反応」、「アレルギー」、及び「アレルギー状態」という用語は、本発明の方法の幾つかを適用することに同等に適しているということが理解され、そして意図される。さらに、本発明の方法がアレルギー反応を予防するために、並びにすでに存在しているアレルギー状態を治療するために同等に適している方法を含むことは、理解され、そして意図される。
[0053] 本明細書中に使用されるとき、「アレルゲン」という用語は、抗原、或いは対象にさらされた際にアレルギー反応を誘発する分子、通常はタンパク質の抗原性部分を意味する。典型的に、対象は、例えば、膨疹試験及び発赤試験、又は当該技術分野に周知である方法のいずれかにより徴候を示したとき、アレルゲンに対してアレルギー性である。ある分子に晒された際に対象の一部のみがアレルギー性(例えば、ＩｇＥ)の免疫応答を示すならば、該分子はアレルゲンであるといわれる。多くの単離されたアレルゲンは、当該技術分野に周知である。これらは、非限定的に、本明細書中の表１において提供されるアレルゲンを含む。
[0054] 「脱感作」という用語は、対象が感受性を示したアレルゲンの投与量を増大して投与する処置のことを指す。脱感作に使用されるアレルゲンの投与量の例は、当該技術分野に周知であり、例えばFornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31: 111-127.を参照のこと。
[0055] 「抗原特異的免疫治療」は、抗原に関わり、そして免疫応答の抗原特異的調節を作り出す免疫治療形態のいずれかを指す。アレルギーの文脈では、抗原特異的免疫治療は、非限定的に脱感作治療を含む。
[0056] 「マイクロキャリア」という用語は、水に不溶であり、約１５０、１２０、又は１００μｍ未満、通常約５０〜６０μｍ未満未満の大きさを有し、そして約１０μｍ未満又はさらに約５μｍ未満であってもよい微粒子組成物を指す。マイクロキャリアは、「ナノキャリア」を含み、ナノキャリアは、約１μｍ未満、好ましくは約５００ｎｍ未満のサイズを有するマイクロキャリアである。マイクロキャリアは固相粒子を含み、そうした粒子は、生物適合性のある天然ポリマー、合成ポリマー、又は合成コポリマーから形成される。しかしながら、アガロース又は架橋アガロースから形成されるマイクロキャリアが含まれうるし、又は本明細書中のマイクロキャリア並びに当該技術分野に周知である生分解性の物質の定義から除外されることもある。固相マイクロキャリアは、ポリマー又は哺乳動物生理条件下で非侵食性及び/又は非分解性である別の物質、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ヒドロキシアパタイト、及び強磁性及び常磁性物質から形成される。生分解性の固相マイクロキャリアは、哺乳動物生理条件下で、分解性であるポリマー(例えば、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、及びそれらのコポリマー、例えばポリ(Ｄ,Ｌ-ラクチド-コ-グリコリド)、又は侵食性であるポリマー(例えば、ポリ(オルト・エステル)、例えば３,９-ジエチリデン-２,４,８,１０-テトラオキサスピロ[５.５]ウンデカン(ＤＥＴＯＳＵ)、又はポリ(無水物)、例えばセバシン酸のポリ(無水物)）から形成されうる。マイクロキャリアはまた、(例えば、油又は脂質に基く)液相、例えば、リポソーム、抗原を伴わないiscoms(免疫刺激複合体(immune-stimulating complexes)、該複合体は、コレステロール、リン脂質、及びアジュバント活性サポニンの安定な複合体である)、又は油入りの水(oil-in-water）又は水入りの油(water-in-oil）の乳濁液において見られる滴又はミセルでありうる。生分解性液相マイクロキャリアは、典型的に生分解性の油を含み、それらの多くは、当該技術分野に周知であり、スクアレン及び野菜油を含む。マイクロキャリアは、典型的に球形であるが、球形から逸脱したマイクロキャリアもまた許容される(例えば、長円体、棒状など)。不溶性の性質のため、固相マイクロキャリアは、 (例えば、０.２ミクロンフィルターを使用して)水及び水溶液からろ過される。
[0057] 本明細書中で使用される「非生分解性」という用語は、通常の哺乳動物生理条件下で分解又は侵食されないマイクロキャリアを指す。一般的に、マイクロキャリアは、通常ヒト血清中で７２時間３７℃でインキュベーションした後に、分解されない (つまり、重量又は平均ポリマー長の５％未満しか失わない)ならば、非生分解性であると考えられている。
[0058] マイクロキャリアは、通常の哺乳動物生理条件下で分解性又は侵食性であるならば、「生分解性」であると考えられる。一般的に、マイクロキャリアは、通常ヒト血清中で７２時間３７℃でインキュベーションした後に分解性である(つまり、その重量又は平均ポリマー長の少なくとも５％を失う)ならば、生分解性であると考えられる。
[0059] 「ＢＩＣ/マイクロキャリア複合体」又は「ＢＩＣ/ＭＣ複合体」という用語は、ＢＩＣとマイクロキャリアとの複合体を指す。該複合体の要素は、共有又は非共有結合されうる。非共有結合は、非共有結合力のいずれか、例えば疎水性相互作用、イオン性(静電的)結合、水素結合、及び/又はファン・デル・ワールス力により媒介されうる。疎水性結合の場合、結合は、一般的に疎水性成分を介して(例えば、コレステロール)ＢＩＣに共有結合される。
[0060] 「個体」又は「対象」は、脊椎動物、例えばトリ、好ましくはヒトなどの哺乳動物である。哺乳動物は、非限定的にヒト、非ヒト霊長類、家畜、スポーツ動物、実験動物、げっ歯類(例えば、マウス及びラット)、及びペットを含む。
[0061] 物質の「有効量」又は「十分な量」は、所望の生理効果、例えば利得のある結果、例えば臨床結果をもたらすために十分な量であり、そのような物として、「有効量」は、適用される文脈に左右される。共投与された抗原に対する免疫応答を調節する組成物を投与する文脈では、有効量のＢＩＣ及び抗原は、抗原のみが投与されるときに得られる免疫応答に比較されるそうした調節を達成するために十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与されうる。
[0062] 本明細書中に使用される「共投与」という用語は、免疫応答を調節するために、少なくとも２個の異なる物質を、十分近い時間で投与することを指す。好ましくは、共投与は、少なくとも２個の異なる物質の同時の投与のことを指す。
[0063] 免疫応答、例えばＴｈ１応答の「刺激」は、応答の増大を意味し、応答の誘発及び/又は強化から生じうる。同様にサイトカイン又は細胞型(例えばＣＴＬｓ)の「刺激」は、サイトカイン又は細胞型の量又はレベルの増加を意味する。
[0064] 「ＩｇＥ関連疾患」は、増大されたＩｇＥレベルにより、部分的に特徴付けられる生理的条件であり、持続性であってもよいしそうでなくてもよい。ＩｇＥ関連疾患は、非限定的にアレルギー、及びアレルギー反応、アレルギー関連疾患(以下に記載)、喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎、結膜炎、蕁麻疹、ショック、膜翅目毒針アレルギー、食物アレルギー、及び薬剤アレルギー、及び寄生虫感染を含む。
[0065] 「アレルギー関連疾患」は、抗原特異的ＩｇＥ免疫応答の効果からもたらされる疾患を意味する。そうした効果は、非限定的に低血圧及びショックを含みうる。過敏症は、アレルギー関連疾患の例であり、過敏症の間、循環血液に放出されるヒスタミンは、血管拡張並びに毛細血管の透過性の増大を引き起こし、循環血液からの血漿の著しい減少を招く。過敏症は、体全体で生じる関連効果を伴って、全身で起こりることもあり、そして特定の標的組織又は器官に限定される反応を伴って、局所的に起こることもある。
[0066] 本明細書中に使用される「ウイルス疾患」という用語は、病原因子としてウイルスを有する疾患を指す。ウイルス疾患の例は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、及び帯状ヘルペスを含む。
[0067] 本明細書中に使用されるとき、及び当該技術分野に知られるとき、「治療」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を獲得するためのアプローチである。本発明の目的のため、有益又は所望の臨床結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと、非限定的に１以上の病徴の緩和又は改善、疾患範囲の縮小、疾患状態の安定化(つまり、悪化しないこと)、疾患の広がりの妨害、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は軽減、及び鎮静(部分的又は全体的)を含む。「治療」はまた、治療を受けない場合に予期される生存期間に比べて生存期間を延長することも意味する。
[0068] 疾患又は疾病の「軽減」は、疾患を治療しない場合に比較して、疾患又は疾病状態の程度及び/又は不所望の臨床徴候が少なくなり、及び/又は進行の経時変化が減速され、又は延長されることを意味する。特に、アレルギーの文脈で、当業者によりよく理解されることであるが、「軽減」は、アレルゲン(単数又は複数)に対する免疫応答の調節の際に生じうる。さらに、軽減は、１回の投与量を投与することにより必ずしも起こるわけではないが、数回の投与量を投与した際に起こることが多い。こうして、応答又は疾患を軽減するための十分な量は、１回以上の投与量において投与されうる。
[0069] ＢＩＣ及び抗原により「誘発」される「抗体タイター」又は「抗体量」は、ＢＩＣ及び抗原の投与後のある時間点で計測される生成抗体量を指す。
[0070] 「ＴＨ１関連抗体」は、その産生及び/又は増加が、Ｔｈ１免疫応答と関連する抗体である。例えば、ＩｇＧ２ａは、マウスにおけるＴｈ１関連抗体である。本発明の目的のため、Ｔｈ１-関連抗体の計測は１以上のそうした抗体を計測することでありうる。例えば、ヒトにおいて、Ｔｈ１関連抗体の計測は、ＩｇＧ１及び/又はＩｇＧ３の計測を伴う。
[0071] 「Ｔｈ２関連抗体」は、その産生及び/又は増加が、Ｔｈ２免疫応答と関連する抗体である。例えば、ＩｇＧ１は、マウスにおけるＴｈ２関連抗体である。本発明の目的のため、Ｔｈ２関連抗体の計測は１以上のそうした抗体の計測することでありうる。例えば、ヒトにおいて、Ｔｈ２関連抗体の計測は、ＩｇＧ２及び/又はＩｇＧ４の計測を伴う。
[0072] 機能又は活性を「抑制」又は「阻害」するために、例えばサイトカイン産生、抗体産生、又はヒスタミン放出は、関心の条件又はパラメーターを別にすれば同じであるほかの条件と比較したとき、又は代わりに別の条件と比較されるとき、機能又は活性を低減する。例えば、ヒスタミン放出を抑制するＢＩＣ及び抗原を含む組成物は、例えば抗原単独により誘導されるヒスタミン放出と比べてヒスタミン放出を低減する。別の例では、抗体産生を抑制するＢＩＣ及び抗原を含む組成物は、抗原のみにより産生される抗体の程度及び/又はレベルと比べて抗体の程度及び/又はレベルを低減する。
[0073] 本明細書中に使用され、医薬組成物についていうとき、「ＧＭＰ基準の下」で製造された又は剤形されたという用語は、組成物が滅菌、実質的に等張で、かつ米国食品医薬品局の医薬品製造管理基準(ＧＭＰ)の全てを順守して剤形される組成物を意味する。
[0074] 本明細書中に使用されるとき「免疫原性」という用語は、当該技術分野に周知である技術分野において通常の意味を有し、そしてヒト又は動物中に注射される際に適応的免疫反応を誘発する薬剤(例えば、ポリペプチド)のことを指す。該免疫応答は、Ｂ細胞(液性)及び/又はＴ細胞(細胞性)でありうる。
[0075] 本明細書中で使用されるとき、分子(例えば、分枝点ヌクレオシド)への共有結合の文脈における「位」というフレーズは、化学分野における通常の意味を有する。位は置換基の結合場所を指し、例えばここで、置換基は未改変分子の水素原子を置換する。例えば、分枝点ヌクレオシドがキラルであるので、未改変分枝点ヌクレオシドの水素原子は、置換基(例えばＮＡＭｓ、ＳＭｓなど)を潜在的に結合されるための分枝点ヌクレオシドの異なる位を表す。こうして、３'ヒドロキシ部位に結合されたＮＡＭ及び同じ分枝点ヌクレオシドの３'-Ｃ-(ヒドロキシメチル)部位に結合されたＮＡＭは、分枝点ヌクレオシドの異なる位に結合される。
[0076] 全ての範囲は、末端の数字を含めるように意図される。こうして、「２から７個までのヌクレオチド」又は「２〜７個のヌクレオチド」のポリマーは、２個のヌクレオチドのポリマーと７個のヌクレオチドのポリマーを含む。下限と独立して選ばれる上限が記載される場合、上限は下限より大きいことが理解される。
ＩＩＩ. 分枝状免疫調節化合物(ＢＩＣｓ)
[0077] 本発明は、とりわけ免疫応答を調節するために使用されうる分枝状免疫調節化合物(ＢＩＣｓ)を提供する。 こうして、本発明は免疫応答の調節のための新規の薬剤と方法を提供し、ヒト及び動物における疾患の治療及び予防を含む。以下の節は、ＢＩＣｓの構造及び性質を記載する。
１. ＢＩＣｓの構造：導入
[0078] 本発明の分枝状の化合物(「ＢＩＣｓ」)は、１以上の分枝点ヌクレオシド(「ｂＮｓ」)及び１以上の核酸成分(「ＮＡＭｓ」)を含む。分枝点ヌクレオシドの構造及び性質は、後の節ＩＩＩ.３において、及び本発明の他の場所に詳細に記載される。簡潔に記載すると、分枝点ヌクレオシドは、少なくとも３個の他の成分(「Ｍ」)に共有結合されるヌクレオシドであり、ここで各成分は、(１)第二分枝点ヌクレオシド又は(２)核酸成分のいずれかである。ＮＡＭｓの構造及び性質は、後の節ＩＩＩ.２において、及び本明細書中の他の場所で詳細に記載される。しかしながら、この導入を目的とし非限定的に、ＮＡＭｓは、ヌクレオチド・モノマー(１個のヌクレオチド)又はポリマー(２〜１００個のヌクレオチド)であると考えられうる。「共有結合される」という用語の意味は、後にも記載される。簡潔に記載すると、「共有結合される」は、一組の電子対化学結合を介して結合される２つの成分(例えば２個のｂＮｓ又はｂＮ、及びＮＡＭ)を指し、但し、介在ＮＡＭ又はｂＮは、２個の共有結合される成分間に存在しない。読み手に明らかであるように、特定の一般的実施態様では、２個の成分間の結合は、非核酸「スペーサー成分(ＳＭ)」を含む。スペーサー成分の構造及び性質は、後の節ＩＩＩ.４において、及び本明細書の他の場所で詳細に記載される。
[0079] 前部における記載から、本発明のＢＩＣｓが以下の構造：
Figure 2006516099
 [式中、
Ｍ1、Ｍ2、及びＭ3は、ＮＡＭ及びｂＮｓからなる群から各々独立して選ばれる成分であり、そして「-」は、該成分が分枝点ヌクレオシド、ｂＮ1に共有結合されることを示す]
を含むことが明らかであろう 。本発明に従って、Ｍ1、Ｍ2、及びＭ3の各々は、分枝点ヌクレオシドの異なる位置に結合される。本発明のＢＩＣの種々の特定の実施態様は、構造Ｉに関して記載されうる。例えば、一の実施態様では、Ｍ1、Ｍ2、及びＭ3は全て核酸成分であり、ＢＩＣは以下の構造：
Figure 2006516099
 [式中、
ＮＡＭ1、ＮＡＭ2、及びＮＡＭ3は、各々独立して選ばれる核酸成分である]
を含む。
別の実施態様では、構造Ｉを含むＢＩＣの少なくとも１の成分は、別の分枝点ヌクレオシドであり、そして該ＢＩＣは、以下の構造：
Figure 2006516099
 [式中、
ｂＮ2は、第二分枝点ヌクレオシドであり(該第二分枝点ヌクレオシドは第一分枝点ヌクレオシドと同じであることもあり、又は異なることもある)、そしてＭ4及びＭ5は、ＮＡＭｓ及びｂＮｓからなる群から独立して選ばれる成分である]
を有する。Ｍ4又はＭ5のいずれかが存在しない場合、「ｂＮ2」と名付けられる構造は、分枝点ヌクレオシドではないということが認識されるだろう。
[0081] 構造Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、「中心」構造であるということが読者により認められるだろう。示された構造の１以上を含む限り、本発明のＢＩＣｓは、さらに共有結合されたＮＡＭｓ及びｂＮｓ、並びに別の共有結合基及び原子を含んでもよいし、しばしば必ず含む。例えば、以下の構造Ａ及びＢは、各々構造ＩＩの中心構造を含むＢＩＣを記載する。
Figure 2006516099
[0082] 上で記載されるように、ＢＩＣの分枝点ヌクレオシドは、少なくとも３個の別の成分に共有結合され、このうち１以上はＮＡＭでありうる。(１)２個の成分は、互いに一組の電子対結合により互いに結合され (例えば、リガンド-抗リガンド相互作用、塩基対、「疎水性相互作用」などを介して物理的に会合される成分からは区別される)、そして(２)核酸成分又は分枝点ヌクレオシドが２個の成分の間に存在しない(つまり、介在性ＮＡＭｓ又はｂＮｓが、共有結合成分の間に存在しない)とき、上で記載されるように、第一成分(例えば、ｂＮ)は、第二成分(例えば、Ｍ)に共有結合される。
[0083] 本発明に従って、二個の成分は、種々の方法で共有結合されうる。例えば(そして非限定的に)、二個の成分は、エステル結合(例えば、ｂＮの水酸基とＮＡＭの末端リン酸基との間のホスホジエステル結合)、ホスホラミダイト結合(例えば、ｂＮのアミノ基とＮＡＭの末端リン酸基との間)、アルキルホスホネート結合(例えば、ｂＮの水酸基とＮＡＭの末端ホスホネート基との間)により結合されうる。さらに、ＮＡＭは、「スペーサー成分(ＳＭ)」を介して、ｂＮの塩基又は糖に共有結合されうる(例えば、後述の節ＩＩＩ.４を参照のこと)。
[0084] 記載を簡単にするために、ｂＮに共有結合されるＢＩＣ中のＮＡＭｓは、「中心核酸成分(中心ＮＡＭｓ)」と呼ばれ、そしてｂＮに共有結合されないＢＩＣ中のＮＡＭｓは、時折「周辺核酸成分(周辺ＮＡＭｓ)」と呼ばれる。上記構造Ｂでは、ＮＡＭ1、ＮＡＭ2、及びＮＡＭ3は、中心ＮＡＭｓであり、そしてＮＡＭ4及びＮＡＭ5は、周辺ＮＡＭｓである。
[0085] 典型的なＢＩＣ構造は、以下の実施例１〜８に記載される。
２. 核酸成分
[0086] 本発明のＢＩＣｓは、３以上の核酸成分iを含む。本明細書中に使用される「核酸成分」という用語は、ヌクレオチドポリマーを指し(つまり、少なくとも２個の連続ヌクレオチドを含む)ii、又はモノマー(つまり、モノヌクレオチド)のことを指す。但し、ｂＮは、ＮＡＭではない。本明細書中に使用されるとき、ヌクレオチドは、(１)ホスフェート基へのエステル結合を含む糖に結合されたプリン又はピリミジン塩基であるか、又は(２)塩基及び/又は糖及び/又はリン酸エステルが、例えば以下に記載されるアナログにより置換されるアナログである。
[0087] 記載されるように、ＢＩＣは少なくとも３個のＮＡＭｓを含み、そしてかなり大きな数(例えば、３〜３０、時に３〜１５、時に３〜７)を含みうる。特定のＢＩＣにおいて、ＮＡＭｓの全ては、ＢＩＣにおける同じ位置、配列、長さ、ｂＮに対する極性(例えば、全ては、ｂＮに、５'→３'の方向で共有結合される)、ヌクレオチド間結合(例えば、全てのホスホロチオエート)などを有してもより。或いは、単一のＢＩＣにおけるいくつかのＮＡＭｓは、同じＢＩＣにおける他のＮＡＭｓとは異なってもよい。以下の節、ＩＩＩ.２.Ａ-Ｆは、ＢＩＣにおける１以上のＮＡＭｓが有しうる特定の構造及び生物学的性質を記載する。さらなる記載は、本明細書中の別の場所に見られる。
Ａ. ＢＩＣにおけるＮＡＭの位置
[0088] ＮＡＭは、ＢＩＣにおけるその位置について記載される。例えば、遊離末端(有利末端ヌクレオチド)を有するＮＡＭは、「プライムＮＡＭ」と時に呼ばれる。遊離５'末端を有するＮＡＭは、「５-プライムＮＡＭ」及び遊離３'末端を有するＮＡＭは、「３-プライムＮＡＭ」と呼ばれうる。遊離末端を有さないＮＡＭは、時々「内部ＮＡＭ」と呼ばれる。単一のＢＩＣは、０、１、又は複数の５-プライムＮＡＭｓ、０、１、又は複数の３-プライムＮＡＭｓ、及び０、１、又は複数の内部ＮＡＭｓを有してもよい。
[0089] 記載されるように(及び本明細書以下で記載されるように)、ＢＩＣにおけるＮＡＭの位置、特に特定の配列モチーフを含むＮＡＭｓの位置は、免疫調節活性に影響を与えうる。この点で、及び余剰を避けるために、本明細書の以下にＮＡＭに関して記載される各特徴は、ＮＡＭｓに対して一般的に適用するように理解されるべきではなく、各カテゴリーが個別に指し示された様に、本明細書中に記載されるＮＡＭの各カテゴリーに対して独立して適用するように理解されるべきである。例えば、一の態様では、本発明のＢＩＣが５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'配列を伴う少なくとも１のＮＡＭを含むという記載は、以下の実施態様：
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上のＮＡＭｓを含むＢＩＣ；
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上のプライムＮＡＭｓを含むＢＩＣ；
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上の５'-プライムＮＡＭｓを含むＢＩＣ；
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上の３-プライムＮＡＭｓを含むＢＩＣ；
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上の中心ＮＡＭｓを含むＢＩＣ；
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上の周辺ＮＡＭｓを含むＢＩＣ；及び
・配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を有する一以上の内部ＮＡＭｓ を含むＢＩＣ；
を、各亜属が明示的に挙げられたのと同様に、考慮されるということを指すように理解されるべきである：
[0090] 第二の例として、一の態様では、本発明のＢＩＣが、配列５'-ＣＧ-３'を含む７個のヌクレオチドより長いＮＡＭを含まないという記載は、以下の実施態様：
・７個のヌクレオチドより長いＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
・７個のヌクレオチドより長いプライムＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
・７個のヌクレオチドより長い５-プライムＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
・７個のヌクレオチドより長い３-プライムＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
・７個のヌクレオチドより長い中心ＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
・７個のヌクレオチドより長い周辺ＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
・７個のヌクレオチドより長い内部ＮＡＭが配列５'-ＣＧ-３'を含まないＢＩＣ；
を、各亜属が明示的に挙げられたのと同じように、考慮されるということを指すように理解されるべきである：
Ｂ. 核酸成分の長さ
[0091] ＮＡＭｓは、通常１〜１００個のヌクレオチド長であるが、ＮＡＭｓ＞１００ヌクレオチドは、除外されていない。種々の実施態様では、核酸成分は５０、３０、１５、１０、又は７ヌクレオチド長以下である。種々の実施態様では、ＮＡＭは、少なくとも２ヌクレオチド長であり、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０ヌクレオチド長である。種々の実施態様では、ＮＡＭは、１〜２０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、３〜２０ヌクレオチド、４〜２０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、６〜２０ヌクレオチド、２〜７ヌクレオチド、３〜７ヌクレオチド、４〜７ヌクレオチド、５〜７ヌクレオチド、又は６〜７ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
[0092] 幾つかの実施態様では、ＢＩＣが８ヌクレオチド長より短い(例えば６又は７ヌクレオチド長)ＮＡＭの少なくとも１を含むことが考慮される。いくつかの実施態様では、ＢＩＣにおけるＮＡＭｓの全ては、８個のヌクレオチドより短い(例えば、２、３、４、５、又は６の下限と、独立して選ばれる上限５、６、又は７ヌクレオチドにより定義される範囲の長さを有し、ここで該上限は下限より大きい。)
Ｃ. 配列及び配列モチーフ
[0093] ＢＩＣの少なくとも１のＮＡＭは、少なくとも１の５'-シトシン,グアニン-３'(５'-ＣＧ-３')配列を含み、ここで該シトシンは、Ｃ-５位でメチル化されておらず、かつ好ましくはどの位置でもメチル化されていない(ここより後で「ＣＧ」2と記載する)。多くの別の配列は、本節において提供され、そして便宜上ＣＧを含む配列及び本節に記載されるモチーフのいずれか１つ又はセット全体は、「調節配列(単数又は複数)」34と呼ばれうる。
[0094] ＢＩＣにおける１以上のＮＡＭは、調節配列、例えばＣＧを含む事が多い。時に、全てのＮＡＭｓは調節配列を含む。より頻繁に、ＮＡＭｓの以下のサブセット；プライムＮＡＭｓの全て、５-プライムＮＡＭｓの全て、３-プライムＮＡＭｓの全て、中心ＮＡＭｓの全て、内部ＮＡＭｓの全て、及び周辺ＮＡＭｓの全てのうちの一以上は、調節配列を含む。或いは、ＢＩＣにおける少なくとも半分(５０％)又は少なくとも４分の３(７５％)のＮＡＭｓ(又は、代わりに、前述のＮＡＭｓのサブセット)は、調節配列を含む。ある実施態様では、調節配列を含む全ての、少なくとも半分の、又は少なくとも４分の３のＮＡＭｓは、同じ配列を含む。
[0095] 一の実施態様では、ＢＩＣにおける少なくとも１の核酸成分は、調節配列、例えばＣＧを含み、そして８ヌクレオチド長未満である。関連の実施態様では、ＢＩＣは、８ヌクレオチド長より長く、かつ「ＣＧ」配列、又は代わりに「ＴＣＧ」又は「ＡＣＧ」配列を含むＮＡＭを含まない。ある実施態様では、ＢＩＣにおける少なくとも１の核酸成分は、ＣＧ配列を含まない。
[0096] 以下の式では、全ての配列は５'→３'の方向であり、そして以下の略語が使用される：Ｂ＝５-ブロモシトシン；ｂＵ＝５-ブロモウラシル；ａ-Ａ＝２-アミノ-アデニン；ｇ＝６-チオ-グアニン；ｔ＝４-チオ-チミン；Ｈ＝電子吸引基、例えばハロゲンを５位に含む改変シトシン；他に指示がなければ、Ｘ＝いずれの塩基。他に指示がなければ、ＮＡＭモチーフは、多数のＸヌクレオチドを示し、各Ｘは、独立して選ばれる。幾つかの実施態様では、以下に記載される配列中のシトシン(Ｃ)は、Ｎ４-エチルシトシン又はＮ４-メチルシトシン、又は５-ヒドロキシシトシンで置換される。種々の実施態様では、式中のグアノシン(Ｇ)は、７-デアザグアノシンで置き換えられる。
[0097] 一の実施態様では、ＮＡＭｓは、３〜７個のヌクレオチド長である。ある実施態様では、核酸成分は、５'-チミジン、シトシン、グアニン-３'(５'-ＴＣＧ-３')を含む。実施例は、非限定的に３ｍｅｒのＴＣＧ、４ｍｅｒのＴＣＧＸ(例えば、ＴＣＧＡ)、５-ｍｅｒのＴＣＧＸＸ(例えば、ＴＣＧＴＣ及びＴＣＧＡＴ)、６-ｍｅｒのＴＣＧＸＸＸ、ＸＴＣＧＸＸ、及びＴＣＧＴＣＧ、並びに７-ｍｅｒのＴＣＧＸＸＸＸ、ＸＴＣＧＸＸＸ、ＸＸＴＣＧＸＸ、及びＴＣＧＴＣＧＸを含む。
[0098] 一の実施態様では、核酸成分は、７塩基長以下であり、そして配列５'-［(Ｘ)0-2］ＴＣＧ［(Ｘ)2-4］-３'、又は５'-ＴＣＧ［(Ｘ)2-4］-３'、又は５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)［(Ｘ)1-3］-３'、又は５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)ＣＧ(Ａ／Ｔ)-３'、又は５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'、又は５'-ＴＣＧＴＣＧＡ-３'を有する。しばしば、少なくとも１の核酸成分は、配列５'-ＴＣＧＡ-３'又は５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を含む。
[0099] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列を含む：
Figure 2006516099
[00100] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、
５'-プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン-３'；
５'-プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ-３'；又は
５'-プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｃ-３'；例えば、
Figure 2006516099
Figure 2006516099
 である配列を含む。
[0100] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列を含む：
Figure 2006516099
[0101] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列を含む：
Figure 2006516099
[0102] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列を含む：
Figure 2006516099
Figure 2006516099
[0103] 種々の実施態様では、核酸成分は、
５'-Ｘ1Ｘ2ＡＸ3ＣＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号４)
[式中、Ｘ1は、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＢであり、Ｘ2は、Ｔ、Ｇ、Ａ、又はＵであり、Ｘ3は、Ｔ、Ａ、又はＣであり、Ｘ4は、Ｔ、Ｇ、又はＵであり、ここで該配列は、
５'-ＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧ-３'(配列番号５)；又は
５'-ＧＧＡＡＣＧＴＴＣＧ-３'(配列番号６)ではない]
を含む。例は以下：
Figure 2006516099
 を含む。
[0104] 種々の実施態様では、核酸成分は以下の配列を含む：
Figure 2006516099
[0105] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列：
５'-Ｘ1Ｘ2ＡＸ3ＢＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号５３)
[式中、
Ｘ1は、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＢであり、
Ｘ2は、Ｔ、Ｇ、Ａ、又はＵであり、
Ｘ3は、Ｔ、Ａ、又はＣであり、
Ｘ4は、Ｔ、Ｇ、又はＵである]
を含む。幾つかの実施態様では、核酸成分は、５'-ＴＧＡＡＢＧＴＴＣＧ-３'(配列番号５４)ではない。例は以下：
Figure 2006516099
 を含む。
[0106] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列：
Figure 2006516099
 を含む。
[0107] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列：
５'-Ｘ1Ｘ2ＡＸ3ＣＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号７５)
[式中、
Ｘ1は、Ｔ、Ｃ、又はＢであり
Ｘ2は、Ｔ、Ｇ、Ａ、又はＵであり、
Ｘ3は、Ｔ、Ａ、又はＣであり、
Ｘ4は、Ｔ、Ｇ、又はＵである]
を含む。幾つかの実施態様では、式は、５'-ＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧ-３'(配列番号５)ではない。
[0108] 別の実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
Figure 2006516099
 を含む。
[0109] 幾つかの実施態様では、上に開示された配列の幾つかに関して、上記核酸成分は、さらに１、２、３、又はそれを超えるのＴＣＧ及び/又はＴＢＧ及び/又はＴＨＧ配列を、好ましくは上に提供された配列の５'側に含む。ＴＣＧ(単数又は複数)及び/又はＴＢＧ(単数又は複数)は、以下に示された配列に直接隣接していることもあるし、隣接していないこともある。例えば、幾つかの実施態様では、核酸成分は以下：
Figure 2006516099
 のいずれかを含む。
[0110] 幾つかの実施態様では、更なるＴＣＧ及び/又はＴＢＧ配列(単数又は複数)は、５'の直近に存在し、そして参照配列に隣接する。別の実施態様では、１又は２個の塩基を離して存在する。
[0111] 幾つかの実施態様では、ＮＡＭは、以下の配列：
５'-(ＴＣＧ)wＮyＡＸ3ＣＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号１０２及び１４５)
[式中、
ｗは１〜２であり、ｙは０-２であり、Ｎは塩基のいずれかであり、Ｘ3はＴ、Ａ、又はＣであり、Ｘ4はＴ、Ｇ、又はＵである]
を有する。
[0112] 幾つかの実施態様では、ＮＡＭは、以下の配列：
Figure 2006516099
 のうちの幾つかを含む。
[0113] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
５'-(ＴＢＧ)zＮyＡＸ3ＣＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号１１５及び１４６)
[式中、ｚは１〜２であり、ｙは０〜２であり、Ｂは５-ブロモシトシンであり、Ｎは塩基のいずれかであり、Ｘ3はＴ、Ａ、又はＣであり、Ｘ4はＴ、Ｇ、又はＵである]
で表される配列のいずれかを含む。
[0114] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下：
Figure 2006516099
 を含む。
[0115] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
５'-ＴＣＧＴＢＧＮyＡＸ3ＣＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号１２１)
[式中、ｙは０〜２であり、Ｂは５ブロモシトシンであり、Ｎは塩基のいずれかであり、Ｘ3はＴ、Ａ、又はＣであり、Ｘ4はＴ、Ｇ、又はＵである。幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列のいずれか：
Figure 2006516099
 を含む。
[0116] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
５'-(ＴＣＧ)wＮyＡＸ3ＢＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号１２５及び１４７)
[式中、ｗは１〜２であり、ｙは０〜２であり、Ｎは塩基のいずれかであり、Ｘ3はＴ、Ａ、又はＣであり、Ｘ4はＴ、Ｇ、又はＵである]のいずれかを含む。
幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
ＴＣＧＧＡＡＡＢＧＴＴＣＧ (配列番号１２６)又は
ＴＣＧＡＡＢＧＴＴＣＧ (配列番号１２７)
のいずれかを含む。
[0117] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
５'-(ＴＢＧ)zＮyＡＸ3ＢＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号：１２８及び１４８)
[式中、ｚは１〜２であり、yは０〜２であり、Ｂは５-ブロモシトシンであり、Ｎは塩基のいずれかであり、Ｘ3はＴ、Ａ、又はＣであり、Ｘ4はＴ、Ｇ、又はＵである。幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
ＴＢＧＡＡＢＧＵＴＣＧ(配列番号１２９)又は
ＴＢＧＡＡＢＧＴＴＣＧ(配列番号１３０)
のいずれかを含む。
[0118] 幾つかの実施態様では、核酸成分は以下の配列：
５'-ＴＣＧＴＢＧＮyＡＸ3ＢＧＸ4ＴＣＧ-３'(配列番号１３１)
[式中、ｙは０〜２であり、Ｂは５ブロモシトシンであり、Ｎは塩基のいずれかであり、Ｘ3はＴ、Ａ、又はＣであり、Ｘ４はＴ、Ｇ、又はＵである]
のいずれかを含む。
幾つかの実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
ＴＣＧＴＢＧＡＡＢＧＵＴＣＧ (配列番号１３２)又は
ＴＣＧＴＢＧＡＡＢＧＴＴＣＧ (配列番号１３３)
のいずれかを含む。
[0119] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、ＡＡＣＧＵＵＣＣ、ＡＡＣＧＵＵＣＧ、ＧＡＣＧＵＵＣＣ、及びＧＡＣＧＵＵＣＧ配列のＲＮＡを含む。
[0120] ある実施態様では、核酸成分は以下の式：
５'-ＴＣＧ［(Ｘ)2-4］-３'、又は
５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)［(Ｘ)1-3］、又は
５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)ＣＧ(Ａ／Ｔ)-３'、又は
５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'
[式中、各Ｘは、独立して選ばれるヌクレオチドである]
を有する。
[0121] 一の実施態様では、核酸成分は、配列：５'-ＴＣＧＴＣＧＡ-３'を含む。一の実施態様では、核酸成分は以下の配列：
Figure 2006516099
Figure 2006516099
 [式中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり；Ｕは、２'-デオキシウリジン及びＢは５-ブロモ-２'-デオキシシチジンである]
から選ばれる配列を含む。
[0122] 一の実施態様では、核酸成分は、以下の配列：
Figure 2006516099
 を有する７-ｍｅｒであり、或いは以下の配列：
Figure 2006516099
 を有する６-ｍｅｒであり、或いは以下の配列：
Figure 2006516099
 を有する５-ｍｅｒであり、或いは以下の配列：
ＴＣＧＡ,
ＴＣＧＴ,又は
ＴＣＧＸ,
[式中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣである]
を有する４ｍｅｒであり
[0123] 或いはＴＣＧ配列を有する３-ｍｅｒである。
[0124] 幾つかの実施態様では、核酸成分は、同時係属同時割り当て米国特許出願第09/802,685iii号(２００２年３月７日に米国出願公開第20020028784A1号として、そして２００１年９月２０日にWO 01/68077として公開された);第09/802,359号(２００１年９月２０日にWO 01/68144として公開され)、及び同時係属米国特許出願第10/033,243号、又はＰＣＴ公開WO 97/28259、WO 98/16247; WO 98/55495; WO 99/11275; WO 99/62923;及びWO 01/35991.iv,vにおいて記載される配列又は配列モチーフを有する。一の実施態様では、ＢＩＣの少なく１の核酸成分は、ＰＣＴ公開ＷＯ01/22972に記載されるように、ＴＧ配列又はピリミジン-リッチ(例えばＴ-リッチ又はＣリッチ)配列を含む。
[0125] 単一ＮＡＭが調節配列の１以上の反復を含み及び/又は２以上の異なる調節配列を含みうることが認められだろう。単一ＮＡＭ中の調節配列は、ＮＡＭ中のさらなるヌクレオチド塩基により隣接され、オーバーラップされ、又は分離されうる。
[0126] ある実施態様では、ＮＡＭは、１以上のパリンドローム領域を含む。一本鎖配列の文脈では、「パリンドローム」という用語は、その配列が二本鎖である場合に(つまり、二本鎖分子を形成するために相補的な配列で複合体形成されると)パリンドロームになる配列を指す。一の実施態様では、１のＮＡＭは、ＢＩＣにおける第二のＮＡＭに関してパリンドローム又は部分的にパリンドロームである配列を有する。本発明のある実施態様では、ＢＩＣの核酸成分の１以上の配列は、パリンドロームではない。本発明の実施態様では、ＢＩＣの１以上のＮＡＭｓ(例えば全て、又はＮＡＭサブグループの全て)の配列は、４塩基、場合により６塩基より多いパリンドローム配列を含まない。
Ｄ. 調節配列の位置
[0127] ＢＩＣのＮＡＭにおける配列モチーフの位置に関して、以下の専門用語が使用されうる：特定配列の５'側に存在するＮＡＭにヌクレオチドがない場合、ＮＡＭ内において、配列又はモチーフは、ＮＡＭの「５-プライム位」に存在する。配列５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を持つＮＡＭにおいて、配列Ｔ、ＴＣ、ＴＣＧ、及びＴＣＧＡは「５-プライム位」に存在し、一方配列「ＧＡＣ」は「５-プライム位」に存在しないvi。遊離の５'末端を有するＮＡＭ(つまり、５-プライムＮＡＭ；上記§III(2)(A)を参照のこと)は、ＮＡＭの塩基配列の式の左側に記号「５'F」を使用して表される。本明細書中で使用されるとき、核酸成分の文脈における「遊離５'末端」という用語は、通常の意味を有し、そして核酸成分の５'末端が別のヌクレオチド、スペーサー分子、又は他の保護基、又は官能基に結合されないということを意味する。遊離５'ヌクレオシドは、未改変５'水酸基又は５'ホスフェート、５'二ホスフェート、又は５'三ホスフェート基、或いは別の共通の改変ホスフェート基(例えば、チオホスフェート、ジチオホスフェートなど)であって、保護又は官能基にさらに結合されないものを含む。
[0128] 一の実施態様では、本発明のＢＩＣは、配列５'-Ｘ-ＣＧ-Ｙ-３'を有する少なくとも１のＮＡＭを含む。ここでＸは、０、１、又は２個のヌクレオチドであり、そしてＹは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１５を超える長さのヌクレオチドである。ある実施態様では、５'-Ｘ-ＣＧ-Ｙ-３'配列は、ＢＩＣの１以上の５プライムＮＡＭｓ内、例えば１以上の５-プライムＮＡＭｓの５プライム位に存在する。ある実施態様では、ＢＩＣは、２、３、又はそれを超える核酸成分であって、式５’-Ｘ-ＣＧ-Ｙ-３’配列を有する配列を有する成分を含む。例えば、ある実施態様では、ＢＩＣの核酸成分の全ては、式５'-Ｘ-ＣＧ-Ｙ-３'配列を有する。
[0129] 種々の実施態様では、本発明のＢＩＣは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５個の遊離５'末端を含む。いくつかの実施態様では、遊離５'末端の数は、１〜２５個、１〜１０個、１０〜２５個、２〜６個、３〜５個、又は４〜５個である。
Ｅ. 核酸成分の構造
[0130] ＢＩＣの核酸成分は、天然核酸に対する構造改変を伴うヌクレオチドを含みうる。改変は、ポリヌクレオチドの技術分野において周知の物全てを含むが、非限定的に３'ＯＨ又は５'ＯＨ基の改変、ヌクレオチド塩基の改変、糖要素の改変、及びホスフェート基の改変を含む。種々のそうした改変は、以下に記載される。
[0131] 核酸成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ/ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖であってもよく、そして別の改変ポリヌクレオチドを含んでもよい。核酸成分は、天然又は改変、非天然塩基を含んでもよく、そして改変された糖、ホスフェート、及び/又は末端を含んでもよい。例えば、ホスフェート改変は、非限定的に、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホールアミデート(phosphoramidate)(架橋又は非架橋)、ホスホトリエステル、及びホスホロジチオエートを含み、そしていずれかの組合せにおいて使用されうる。別の非ホスフェート結合も使用されうる。好ましくは、本発明の核酸成分は、ホスホロチオエート骨格を含む。当該技術分野に周知である糖改変、例えば２'-アルコキシ-ＲＮＡアナログ、２'-アミノ-ＲＮＡアナログ、及び２'-アルコキシ又はアミノ-ＲＮＡ/ＤＮＡキメラ及び本明細書中に記載される別の物が作られてもよく、そしてホスフェート改変のいずれかと混合されてもよい。
[0132] 核酸成分は、ホスフェート改変ヌクレオチドも含みうる。改変ホスフェート結合又は非ホスフェート結合を含む核酸の合成は、当該技術分野に周知である。概説としてMatteucci (1997)"Oligonucleotide Analogs: an Overview"in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D. J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NYを参照のこと。本発明の核酸における糖又は糖アナログ成分に結合されうるリン誘導体(又は改変ホスフェート基)は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホールアミデートなどでありうる。上記ホスフェート・アナログの調製、及びそれらのヌクレオチド、改変ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへの取り込みは、それ自身周知であり、そしてここで詳細に記載される必要がない(Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2318-2323 ; and Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973)。 例えば、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの合成は、天然のオリゴヌクレオチドについて上で記載される合成と類似であるが、但し酸化ステップは、硫化ステップ(Zon(1993)"Oligonucleoside phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190)により置き換えられる。同様に、他のホスフェートアナログ、例えばホスホトリエステル(Miller et al. (1971) JACS 93: 6657-6665)、非結合性ホスホールアミデート(Jager et al. (1988), Biochem. 27: 7247-7246),Ｎ３'からＰ５' ホスホールアミデート(Nelson et al. (1997) JOC 62: 7278-7287)、及びホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)はまた記載された。他のリンに基かない改変核酸はまた使用されうる(Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6129-6141)。ホスホロチオエート骨格を有する核酸は、宿主に注射された後により分解抵抗性である(Braun et al. (1988) J. Immunol. 141: 2084-2089 ; and Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32: 1057-1064)。
[0133] 本発明において使用される核酸成分は、(リボースを唯一又は基本糖要素として含む)リボヌクレオチド、及び/又は(デオキシリボースを基本糖要素として含む)デオキシリボヌクレオチドを含みうる。改変された糖又は糖アナログは、核酸成分において取り込まれうる。こうして、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖成分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「アナログ」シクロペンチル基でありうる。糖は、ピラノシル又はフラノシル形態でありうる。糖成分は、好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース、又は２'-Ｏ-アルキルリボースのフラノシドであり、そして該糖は、α又はβアノマー立体配置で、それぞれの複素環塩基に結合されうる。糖改変は、非限定的に２'-アルコキシ-ＲＮＡアナログ、２'-アミノ-ＲＮＡアナログ、及び２'-アルコキシ-若しくはアミノ-ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。例えば、ＢＩＣにおける糖改変は、非限定的に２'-アミノ-２'-デオキシアデノシンを含む。これらの糖又は糖アナログ、並びにそうした糖又はアナログがそれ自体、複素環塩基(核酸塩基)に結合される個々の「ヌクレオシド」の製造は周知であり、そうした製造が特定の実施例に関連しない限りでは、ここで記載される必要がない。糖改変が成され、そしてＢＩＣの製造におけるホスフェートの改変のいずれかと組み合わせられることもある。
[0134] 核酸成分に取り込まれる複素環塩基、又は核酸塩基は、天然基本プリン及びピリミジン塩基(つまり、上で記載されるウラシル、チミン、シトシン、アデニン、及びグアニン)、並びに該基本塩基の天然及び合成改変でありうる。
[0135] 種々の複素環塩基及び種々の糖成分(及び糖アナログ)を含む多くの「合成」非天然ヌクレオシドが、当該技術分野で利用可能であり、そして本発明の他の基準が満たされる限り、天然核酸の５個の基本塩基要素以外の、１又は幾つかの複素環塩基を含みうるということが、当業者により認識される。しかしながら、好ましくは、複素環塩基は、非限定的にウラシル-５-イル、シトシン-５-イル、アデニン-７-イル、アデニン-８-イル、グアニン-７-イル、グアニン-８-イル、４-アミノピロロ［２.３-ｄ］ピリミジン-５-イル、又は２-アミノ-４-オキソピロロ［２,３-ｄ］ピリミジン-５-イル、又は２-アミノ-４-オキソピロロ［２.３-ｄ］ピリミジン-３-イル基であり、ここで、該プリンは９位を介して、該ピリミジンは１位を介して、該ピロロピリミジンは７位を介して、該ピラゾロピリミジンは１位を介して核酸成分の糖成分に結合される。
[0136] 核酸成分は、少なくとも１の改変塩基を含みうる。本明細書中に使用されるとき、「改変塩基」という用語は、「塩基アナログ」と同義であり、例えば「改変シトシン」は、「シトシンアナログ」と同義である。同様に、「改変」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、ヌクレオシド又はヌクレオチド「アナログ」と同義であると本明細書中で定義される。
[0137] 塩基改変の例は、非限定的に、電子吸引性成分を、核酸成分のシトシンのＣ‐５及び／又はＣ‐６に加えることを含む。好ましくは、電気吸引性成分は、ハロゲンである。そうした改変シトシンは、非限定的に、アザシトシン、５-ブロモシトシン、５-クロロシトシン、クロル化シトシン、シクロシトシン、シトシン・アラビノシド、５-フルオロシトシン、フルオロピリミジン、５,６-ジヒドロシトシン、５-ヨードシトシン、５-ニトロシトシン、及び他のピリミジン・アナログ、又は改変ピリミジンを含みうる。塩基改変の別の例は、非限定的に電気吸引性成分を、核酸成分のウラシルのＣ‐５及び／又はＣ‐６に加えることを含む。好ましくは、電気吸引性成分はハロゲンである。そうした改変ウラシルは、非限定的に５‐ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-フルオロウラシル、５-ヨードウラシルを含みうる。例えば、ＰＣＴ出願WO 99/62923を参照のこと。Kandimalla et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13も参照のこと。
[0138] 塩基改変の別の例は、塩基に１以上のチオール基を加えることを含む。非限定的に、６‐チオ-グアニン、４-チオ-チミン、及び４-チオ-ウラシルを含む。
Ｆ. 「単離された免疫調節活性」及び「劣った免疫調節活性」
[0139] 核酸成分の１の性質は、ＮＡＭのヌクレオチド配列に関連する「単離された免疫調節活性」である。
[0140] 幾つかの実施態様では、ＢＩＣの核酸成分は、以下に記載されるように「単離された免疫調節活性」を有さないか、又は(ＢＩＣと比較したとき)「劣った単離された免疫調節活性」しか有さない。
[0141] 核酸成分の「単離された免疫調節活性」は、核酸成分の一次配列を有し、かつ同じ核酸骨格(例えば、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、キメラ)を有する単離されたポリヌクレオチドの免疫調節活性を計測することにより測定される。例えば、以下の構造：
Figure 2006516099
 を有するＢＩＣは、３個の核酸成分を含む。例えば、配列５'-ＴＣＧＴＣＧ-３を有するＢＩＣの核酸成分の独立した免疫調節活性を測定するために、同じ配列(つまり、５'-ＴＣＧＴＣＧ-３')及び同じ骨格構造(例えば、ホスホロチオエート)を有する試験ポリヌクレオチドは合成され、そして(あるとしたら)その免疫調節活性が計測される。免疫調節活性は、以下の§９において記載されるアッセイなどの、免疫応答の種々の態様を示す標準アッセイを使用して測定されうる。好ましくは、以下の§9に記載されるヒトＰＢＭＣアッセイが使用される。以下に記載されるように、ドナーによる変動を説明するために、典型的に該アッセイは、複数のドナーから得られた細胞を使用して行われる。該ポリヌクレオチドと接触されたＰＢＭＣｓによって分泌されるＩＦＮ‐γの量が、試験化合物が存在しない際又は(幾つかの実施態様において)不活性コントロール化合物 (例えば、５'‐ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号３))が存在する際より、ドナーの大部分において有意に大きくない(約２倍より少ない）場合、ポリヌクレオチドは、免疫調節活性を有さない(そして、対応する核酸成分は、「単離された免疫調節活性」を有さない)。
[0142] ＢＩＣ及び単離されたポリヌクレオチドの免疫調節活性を比較するために、免疫調節活性は、以下の§９において記載されるヒトＰＢＭＣアッセイを使用して計測される。通常、２個の化合物の活性は、通常約２０μｇ／ｍｌの濃度で、同じ条件下で(例えば、同じ細胞を使用して)平行してそれらをアッセイすることにより比較される。上に記載されるように、典型的に、濃度は、２６０ｎｍでの吸光度を計測し、そして変換式０.５ＯＤ260／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌを使用することにより測定される。該変換は、この試験サンプルにおける総核酸の量を基準化する。或いは、濃度又は重量は、当該技術分野に周知である別の方法により計測されうる。所望されるなら、核酸成分の量は、２６０での吸光度、並びにＢＩＣの分子式を使用して計算されるＢＩＣの重量を計測することにより測定されうる。該方法は、ＢＩＣのＮＡＭｓに起因する重量に対するスペーサー成分(単数又は複数)の比率が高いとき(つまり１を超えるとき)時々使用される。
[0143] 比較された２個のサンプルの計算された分子量が２０％を超えて異なるとき、代わりに３μＭの濃度が使用されうる。
[0144] 試験ポリヌクレオチドが、活性が比較されたＢＩＣより少ない活性を有する場合、ＢＩＣの核酸成分は「劣った免疫調節活性」を有すると特徴付けられる。好ましくは、試験ポリヌクレオチドの単離された免疫調節活性は、ＢＩＣの活性の５０％未満、より好ましくは約２０％未満、最も好ましくは約１０％未満であるか、又は幾つかの実施態様においてそれ未満である。
[0145] 複数の(例えば複数の異なる)核酸成分を伴うＢＩＣｓについて、複数の核酸成分に対応する試験ポリヌクレオチドの混合体の免疫調節活性を(あるとしたら)測定することは、可能である。該アッセイは、使用されるＢＩＣの量と等しい量の試験ポリヌクレオチド(つまり、混合体)の総量を使用して行われうる。或いは、混合体における各試験ポリヌクレオチドの量、又は各異なる試験ポリヌクレオチドの量は、アッセイにおけるＢＩＣの量と等しい。§8において記載されるとき、ドナーの変動を説明するために、好ましくはアッセイ及び分析は、複数のドナー由来のＰＭＢＣｓを使用する。
[0146] 一の実施態様では、ＢＩＣにおける１以上(例えば、個々に計測されるか、又は代わりに組み合わせて計測される少なくとも約２、少なくとも約４、又は少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、または全て)の核酸成分は、単離された免疫調節活性を有さない。一の実施態様では、１以上(例えば、個々に計測されるか、又は代わりに組み合わせて計算される、少なくとも約２、少なくとも約４、又は少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、又は全て)は、ＢＩＣに比べて、劣った単離された免疫調節活性を有した。
[0147] 関連する実施態様において、ＢＩＣは、単離された免疫調節活性を有する１以上の核酸成分を含む。例えば、幾つかの実施態様では、全て又はほとんど全て(例えば少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％)の核酸成分は、単離された免疫調節活性を有する。こうして、特定のＢＩＣにおいて、単離された免疫調節活性を有する核酸成分の数は、０、１、２以上、３以上、３未満,４以上、５未満、４未満、５以上、５未満、少なくとも１０、又は少なくとも２０、全て、又は全て未満のＮＡＭｓ、プライムＮＡＭｓ、５プライムＮＡＭｓ、又は３‐プライムＮＡＭｓでありうる。
３. 分枝点ヌクレオシド
[0148] ＢＩＣｓの分枝点ヌクレオシドは、ＮＡＭｓ及び／又は別のｂＮｓが共有結合される３以上の分枝点を含むヌクレオシド・モノマーである。ヌクレオシド上の「分枝点」は、中心核酸成分又は別の分枝点ヌクレオシドのいずれかが、ヌクレオシドに結合される部位である。こうして各分枝点ヌクレオシドは、核酸成分及び分枝点ヌクレオシドから選ばれる少なくとも３個の成分に結合される。３個の成分の各々は、分枝点ヌクレオシド上の異なる位置に結合される。
[0149] 各分枝点ヌクレオシドは、窒素含有塩基に結合される糖分子を含む。糖は典型的には５炭糖であるが、糖は場合により６炭糖でありうる。一の実施態様では、糖は、リボース又は２'‐デオキシリボースである。改変糖又は糖アナログは、核酸成分内に取り込まれうる。こうして、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖成分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、又は糖「アナログ」シクロペンチル基でありうる。糖は、ピラノシル又はフラノシルの形態でありうる。糖成分は、場合によりリボース、デオキシリボース、アラビノース、又は２'‐Ｏ‐アルコキシリボースのフラノシドであり、そして糖は、それぞれα又はβアノマー立体配置のいずれかで、それぞれの複素環塩基に結合されうる。糖改変は、非限定的に２'‐アルコキシリボース及び２'アミノリボース・アナログを含む。
[0150] 核酸成分に取り込まれる塩基は、天然プリン又はピリミジン塩基(つまり、上で記載されるように、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、及びグアニン)、並びに、それら基本塩基の天然及び合成改変でありうる。
[0151] 種々の複素環塩基及び種々の糖成分(及び糖アナログ)を含む多くの合成非天然ヌクレオシドは、当該技術分野に周知であり、そして本発明の他の判定基準が満たされる限り、ｂＮは、天然核酸の５個の基本塩基要素以外の複素環塩基を含みうるということは、当業者により理解されるだろう。一の実施態様では、複素環塩基は、ウラシル-５-イル、シトシン-５-イル、アデニン-７-イル、アデニン-８-イル、グアニン-７-イル、グアニン-８-イル、４-アミノピロロ［２.３-ｄ］ピリミジン-５-イル、２-アミノ-４-オキソピロロ［２,３-ｄ］ピリミジン-５-イル、又は２-アミノ-４-オキソピロロ［２.３-ｄ］ピリミジン-３-イル基であり、ここで、該プリンは９位を介して、該ピリミジンは１位を介して、該ピロロピリミジンは７位を介して、そして該ピラゾロピリミジンは１位を介して、核酸成分の糖成分に結合される。
[0152] ｂＮは改変塩基を含みうる。本明細書中に使用されるとき、「改変塩基」という用語は、「塩基アナログ」と同義であり、例えば、「改変シトシン」は「シトシンアナログ」と同義である。同様に「改変」ヌクレオシドは、本明細書中でヌクレオシド「アナログ」と同義であると定義される。塩基改変の例は、１以上のチオール基を塩基に付与することを含み、非限定的に６-チオ-グアニン、４-チオ-チミン、及び４-チオ-ウラシルを含む。
[0153] 付け加えて、分枝点ヌクレオシドの合成に適したヌクレオシドは、購入されることもあるし(Biosearch Technologies, Inc.; Glen Research, Inc. )、又は合成されることもある(以下を参照のこと)。典型的に、これらのｂＮ前駆体は、ＢＩＣ合成の間、反応性部位の脱保護を許容する保護基(例えば、レブリニル(levulinyl)、４,４'-ジメトキシトリチル［ＤＭＴ］、フルオレニルメチルオキシカルボニル［Ｆｍｏｃ］、 シアノエチル ［ＣＥ］)を有する。頻繁に、ｂＮ前駆体は、ＮＡＭ又はさらなるスペーサー成分要素が(例えば、エステル結合又は他の結合を介して)結合されるＳＭ要素(例えば、２'‐デオキシウリジンのＣ‐５位で結合される６-ヒドロキシ-１-アミノヘキシル-３(Ｅ)-アクリルアミド；図１Ａを参照のこと)を有する(以下の§ＩＩＩ(４)を参照のこと)。
[0154] 本発明のＢＩＣでは、ｂＮに共有結合される成分は、分枝点ヌクレオシド上の種々の位置に結合されうる。例えば、核酸成分及び更なる分枝点ヌクレオシドは、分枝点ヌクレオシドの糖又は塩基のいずれか上に位置に結合されうる。場合により、ＢＩＣの分枝点ヌクレオシド上の分枝点位の全ては、分枝点ヌクレオシドの糖成分上でありうる。或いは、１以上の分枝点位は、分枝点ヌクレオシドの塩基上でありうる。
[0155] 一の実施態様では、分枝点ヌクレオシドは、リボヌクレオシド又は２'‐デオキシリボヌクレオシドである。代わりの実施態様では、分枝点ヌクレオシドの糖は、上に記載される改変糖又は糖アナログであってもよい。例えば、リボースの代わりに、糖成分は、２‐メチル-β-Ｄ‐アラビノフラノシルであってもよい。分枝状のオリゴヌクレオチドを製造するための保護１‐(２‐メチル-β-Ｄ‐アラビノフラノシル)ウラシル・ホスホラミダイトの合成及び使用は、Von Buren, et al., 1995, Tetrahedron, 51: 8491-8506.において記載される。
[0156] 一の実施態様では、ＢＩＣの分枝点ヌクレオシドは、リボヌクレオシド及びＮＡＭｓであり、或いはｂＮｓは、リボヌクレオシドの２'-、３'-、及び／又は５'‐ヒドロキシル位で、リボヌクレオシドに結合される。
[0157] リボヌクレオシドの２'‐、３'‐、又は５'-ヒドロキシル位で分枝点を有する分枝点ヌクレオシドとして、リボヌクレオシドを含むＢＩＣを作るために適した試薬の合成及び使用は、当業者に周知である。例えば、アデノシン・ビスホスホラミダイトの合成は、Damha and Oglivie, J. Org. Chem, 1988,53 : 3710において記載される。分枝状核酸分子の合成におけるアデノシン・ビスホスホラミダイトの使用は、Hudson and Damha, J. Am. Chem. Soc., 1993,115 : 2119-2124, Damha and Zabarylo, Tetrahedron Letters, 1989,30 : 6295-6298, and Damha et al., Tetrahedron Letters, 1992,20 : 6565-6573に記載される。分枝状核酸分子を合成するための２'‐シリル-保護アデノシン・ホスホラミダイトの使用は記載される(例えば、Braich and Damha, Bioconjugate Chem., 1997,8 : 370-377, 及びKierzek, et al., Nucleic Acids Research, 1986,14 : 4751-4764を参照のこと)。 Sproat et al., Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1994,4 : 419-431は、分枝状オリゴリボヌクレオチドを作るために、５'‐ホスホラミダイト(アデノシン、グアノシン、ウラシル、及びシチジン) の合成及び使用を記載する。別の例では、２'‐、３'‐、及び５'‐結合の組合せは、例えばVon Buren, et al., 1995, Tetrahedron, 51: 8491-8506で開示される１‐(２‐メチル-(β‐Ｄ‐アラビノフラノシル)ウラシル・ホスホラミダイトの使用からもたらされる分枝点ヌクレオシドで達成されうる。２'位を通して結合されるメトキシオキサルアミド基を含む改変ウリジン・ホスホラミダイトの合成及び使用は、Polushin, Collection Symposium Series, 1999,2 : 145-150.に記載される。
[0158] 従って、一の実施態様では、本発明のＢＩＣは、リボヌクレオシド(ｂＮ)、リボヌクレオシドの２'ヒドロキシルに結合される第一ＮＡＭ、リボヌクレオシドの３'‐ヒドロキシルに結合される第二ＮＡＭ、及びリボヌクレオシドの５'‐ヒドロキシルに結合される第三ＮＡＭを含む。
[0159] 別の実施態様では、ＢＩＣは、第一成分(ｂＮ又はＮＡＭ)がｂＮの３'‐ヒドロキシル位に結合され、第二成分が５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして第三成分がｂＮの５'‐Ｃ、４'‐Ｃ、又は３'-Ｃ位に結合される、２'‐デオキシリボヌクレオシド(ｂＮ)を含む。従って、一の実施態様では、本発明のＢＩＣは、２'‐デオキシリボヌクレオシドと３個の中心核酸成分を含み、ここで、核酸成分の内の１が、２'‐デオキシリボヌクレオシドの３'‐ヒドロキシル位に結合され、中心核酸成分の１が２'‐デオキシリボヌクレオシドの５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして中心核酸成分の１が２'‐デオキシリボヌクレオシドの５'‐Ｃ、４'‐Ｃ、又は３'‐Ｃに結合される。
[0160] 別の実施態様では、ＢＩＣの分枝点ヌクレオシドは、リボヌクレオシドであり、そして中心核酸成分又は該リボヌクレオシドに結合されるＢＩＣの別の分枝点ヌクレオシドのうちの１は、２'‐又は３'‐ヒドロキシル位に結合され、１は５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして１はリボヌクレオシドの５'‐Ｃ、４'‐Ｃ、又は３'‐Ｃ位に結合される。
[0161] 従って、本発明のＢＩＣは、場合によりリボヌクレオシド及び３個の中心核酸成分を含み、ここで、該中心核酸成分の１つは、該リボヌクレオシドの２'‐又は３'-ヒドロキシル位に結合され、該中心核酸成分のうちの１つは、該リボヌクレオシドの５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして該中心核酸成分のうちの１つは、該リボヌクレオシドの５'‐Ｃ、４'‐Ｃ、又は３'‐Ｃ位に結合される。
[0162] ５'‐Ｃ及び３'‐Ｃ、又は５'‐Ｃ及び２'‐Ｃでの分枝点に加えて、５'‐Ｃ、４'‐Ｃ、又は３'‐Ｃ位のうちの１における分枝点を伴う分枝点ヌクレオシド前駆体を合成する方法が当該技術分野に周知である。例えば、Pfundheller et al., Helvetica Chimica Acta, 2000,83 : 128-151において、ＢＩＣｓにおける分枝点ヌクレオシドとしての使用に適した４'‐Ｃ及び３'‐Ｃ‐(アミノアルキル)チミジンを調製する方法が記載される。４'‐Ｃ‐(ヒドロキシメチル)チミジン(Thrane et al., Tetrahedron, 1995,51 : 10389-P-72)、３'-Ｃ-(ヒドロキシメチル) チミジン(Jorgensen et al., 1994, J. Am. Chem. Soc., 116: 2231-32 and Jorgensen et al., Tetrahedron, 51: 2155-2164)、及び５'-Ｃ-(ヒドロキシメチル)チミジン(Fensholdt et al., 1996, Acta Chem Scand. 50: 1157-63)の合成及び使用はまた記載された。
[0163] 上で記載されるように、分枝点ヌクレオシドの塩基は、プリン又はピリミジンでありうる。場合により、分枝点ヌクレオシドの塩基は、アデニン(Ａ)、グアニン(Ｇ)、ウラシル(Ｕ)、シトシン(Ｃ)、チミン(Ｔ)、又はヒポキサンチン(Ｉ)である。代わりに、塩基は改変Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ若しくはＩであり、又はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ若しくはＩアナログであることもある。分枝点ヌクレオシドの塩基は、場合により別の改変プリン若しくはピリミジンでありうる。例えば、２,６‐ジアミノプリンは、分枝点ヌクレオシド上の塩基として使用してもよい。
[0164] 一の実施態様では、ＢＩＣの分枝点ヌクレオシドが、２'‐デオキシリボヌクレオシドであり、そして２'‐デオキシリボヌクレオシドに結合される中心核酸成分又はＢＩＣの分枝点ヌクレオシドに関して、１つは３'ヒドロキシル位に結合され、１つは５'ヒドロキシル位に結合され、そして１つは２'デオキシリボヌクレオシドの塩基上の位置に結合される。
[0165] 従って、本発明のＢＩＣは、２'‐デオキシリボヌクレオシド及び３個の中心核酸成分を含み、ここで核酸成分のうちの１つは、２'‐デオキシリボヌクレオシドの３'‐ヒドロキシル位に結合され、核酸成分のうちの１つは、２'‐デオキシリボヌクレオシドの５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして核酸成分のうちの１つは、２'‐デオキシリボヌクレオシドの塩基の位置に結合される。
[0166] さらに別の実施態様では、ＢＩＣの分枝点ヌクレオシドは、リボヌクレオシドであり、そして中心核酸成分又は該リボヌクレオシドに結合されるＢＩＣの別の分枝点ヌクレオシドのうちの１つは、２'‐又は３'‐ヒドロキシル位に結合され、１つは５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして１つはリボヌクレオシドの塩基上の位置に結合される。
[0167] 従って、本発明のＢＩＣは、場合によりリボヌクレオシド及び３個の中心核酸成分を含むことがあり、ここで核酸成分のうちの１つは、リボヌクレオシドの２'‐又は３'‐ヒドロキシル位に結合され、核酸成分のうちの１つは、リボヌクレオシドの５'‐ヒドロキシル位に結合され、そして核酸成分のうちの１つは、リボヌクレオシドの塩基上の位置に結合される。
[0168] 中心核酸成分又は別の分枝点ヌクレオシドが、結合されうる分枝点ヌクレオシドの塩基上の位置は、使用される特定のヌクレオシドに左右されて変わるだろう。成分を分枝点ヌクレオシドに結合するために、特定の分枝点ヌクレオシド上のどの位置が適しているかを、当業者は容易に見分けることができるであろう。この決定は、分枝点ヌクレオシドの塩基上に利用できる官能基のタイプに基いて行われる。例えば、シチジンのＣ-4位上のアミノ官能基(Ｎ-４)は、非核酸スペーサー成分の結合を含むさらなる改変に適した反応性の基であるということを、当業者は容易に見分けるだろう。
[0169] 分枝点ヌクレオシドの塩基がプリンであるなら、塩基上の適切な分枝点は典型的にＮ‐２、Ｎ‐６、Ｃ‐８、Ｎ‐１、及びＯ‐６を含む。一の実施態様では、分枝点ヌクレオシドの塩基はグアニンであり、又はその誘導体であり、そして中心核酸成分又は第二分枝点ヌクレオシドが結合される塩基上の位置は、Ｎ-２、Ｎ‐１、Ｏ‐６、及びＣ‐８からなる群から選ばれる。別の実施態様では、分枝点ヌクレオシドの塩基は、アデニンであり、或いはその誘導体であり、そして中心核酸成分又は第二分枝点ヌクレオシドが結合される塩基上の位置は、Ｎ‐６及びＣ‐８からなる群から選ばれる。分枝点ヌクレオシドがイノシンであるなら、一方で、中心核酸成分又は第二分枝点ヌクレオシドが結合される塩基上の位置が、場合によりＯ‐６及びＣ-８からなる群から選ばれる。分枝点ヌクレオシドが、２,６‐ジアミノプリンであるなら、中心核酸成分又は第二分枝点ヌクレオシドが共有結合される塩基上の位置は、Ｎ‐２、Ｎ‐６、又はＣ‐８であってもよい。
[0170] 分枝点ヌクレオシドの塩基がピリミジンであるなら、次に、塩基上の適切な分枝点は、典型的にＮ-３、Ｎ-４、Ｏ-４、Ｃ-５、Ｃ-６、及びＯ-２を含む。例えば、分枝点ヌクレオシドの塩基が、ウラシル、チミン、又はウラシル若しくはチミンのいずれかの誘導体であるなら、中心核酸成分又は第二分枝点ヌクレオシドが結合される塩基上の位置は、典型的にＮ‐３、Ｏ‐４、Ｏ‐２、Ｃ‐５、及びＣ‐６からなる群から選ばれる。分枝点ヌクレオシドの塩基がシトシン、又はその誘導体であるならば、中心核酸成分又は第二分枝点ヌクレオシドが結合される塩基上の位置は、典型的にＮ‐４、Ｃ‐５、及びＣ‐６からなる群から選ばれる。特定の実施態様では、分枝点ヌクレオシドが、Ｎ-４‐(６‐ヒドロキシへキシル)‐５‐メチル-２'‐デオキシシチジン以外である。
[0171] 塩基の少なくとも１の位置上に分枝点を有するヌクレオシド・モノマーを合成及び取り込む方法は、当業者に周知である。例えば、Lyttle et al., Bioconjugate Chem., 2002,13, 1146-1154は、Ｎ4-(２-(エチレン・グリコール-２-レブリネート）エチル)-５-メチル-５'-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(２-シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイト)-２'-デオキシシチジン、及び５-(Ｎ-(６-Ｏ-レブリノイル-１-アミノヘキシル)-３(Ｅ)-アクリルアミド)-５'-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-(２-シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイト)-２'-デオキシウリジンなどのホスホラミダイトの合成及び該ホスホラミダイトをオリゴヌクレオチド中に取り込むことを記載する。Urdea et al, 米国特許第5,093,232号、Urdea et al,米国特許第5,124,246号、米国特許第5,703,218号、米国特許第5,591,584号、Urdea et al.,米国特許第5,594,118、Urdea and Horn,米国特許第5,594,118号;Horn and Urdea, Nucleic Acids Res., 1989, 17: 6959-6967, Horn et al, NucleicAcids Res., 1997,25 : 4835-4841, Horn et al., Nucleic Acids Res., 1997,25 : 4842-4849 and Chang et al., 米国特許第5,580,731号は、Ｎ-４改変ピリミジンヌクレオチドの合成を記載し、そしてモノマー、例えばＮ-４-(６-ヒドロキシヘキシル)-５-メチル-２'-デオキシシチジンを、オリゴヌクレオチド中に取り込み、時折分枝オリゴヌクレオチドを含む。Ｃ８-ヒドロキシメチル-ｄＡ及びＣ６ヒドロキシメチル-ｄＵモノマーを、分枝モノマーとしての合成及び使用は、Czechtisky and Vasella, Helvetica Chimica Acta, 2001, 84: 1000-1016に記載される。
４. スペーサー成分 (ＳＭｓ)
[0172] 上に記載されるように、ＢＩＣにおけるＮＡＭ及びｂＮ成分は、種々の方法で別のＮＡＭ及びｂＮ成分に共有結合されうる。例えば、幾つかの実施態様では、ｂＮとＮＡＭの間の結合は、ホスホジエステル、ホスホチオエート・エステル、ホスホロジチオエート・エステル、ホスホラミダイト、又はアルキルホスホネート結合であるか、又はこれらを含む。ｂＮ及びＮＡＭは、ＮＡＭとｂＮ成分(例えば、ｂＮとＮＡＭ、及びＮＡＭと別のＮＡＭ、又はｂＮと別のｂＮ)を結合する「スペーサー成分(ＳＭｓ)」と呼ばれる種々の結合分子のいずれかを介して互いに共有結合されうる。ＳＭｓの例は、非限定的に、Ｃ2-Ｃ10アルキル基、オリゴ-エチレン・グリコール基、そうした基の組合せ、そしてそうした基のポリマー(例えば、エステル結合ポリマー)を含む。１超のＳＭｓを含むＢＩＣにおいて、ＳＭｓは、同じであってもよいし、異なってもよい。ＳＭｓは、本明細書の以下にさらに詳細に記載される。
[0173] ＳＭｓは、一般的に約５０〜約５０００、時には約７５〜約５００の分子量である。
[0174] 典型的なＳＭｓ及びＳＭ要素は、Ｃ2-Ｃ10アルキル・スペーサー、典型的には、Ｃ2-Ｃ6アルキル基(例えば、プロピル、ブチル、及びヘキシル基)を含む。別の典型的なＳＭｓは、オリゴ-エチレン・グリコール要素、例えばトリエチレン・グリコール、テトラエチレン・グリコール(ＴＥＧ)、及びヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)、又は約１０、約２０、約４０、又は約５０までのエチレン・グリコール・ユニットを有するポリエチレン・グリコールであるか、又はそれらを含む。ＳＭは、１以上の糖、例えば、１'２'-ジデオキシリボース、１'-デオキシリボース、１'-デオキシアラビノース、及びそれらのポリマーであって、エステル(例えば、ホスホジエステル)又は他の結合を介して結合されるものを含んでもよい。
[0175] 別の適切なＳＭｓは、置換アルキル、置換ポリグリコール、場合により置換ポリアミン、場合により置換ポリアルコール、場合により置換ポリアミド、場合により置換ポリエーテル、場合により置換ポリアミン、場合により置換ポリホスホジエステル(例えば、ポリ(１-ホスホ-３-プロパノール)などを含む。任意の置換基は、アルコール、アルコキシ(例えば、メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ)、直鎖又は分枝鎖アルキル(例えば、Ｃ1-Ｃ10アルキル)、アミン、アミノアルキル(例えば、アミノＣ1-Ｃ10アルキル)、ホスホラミダイト、ホスフェート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン(例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ)、アミド、アルキルアミド(例えば、アミドＣ1-Ｃ10アルキル)、カルボン酸、カルボン酸エステル、無水カルボン酸、ハロゲン化カルボン酸、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミデート・エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、カルボジイミド付加体、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、ＮＲ1Ｒ2、[式中、Ｒ1Ｒ2は-Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ＝ＣＨＣ(＝Ｏ)(マレイミド)、チオエーテル、シアノ、糖(例えば、マンノース、ガラクトース、及びグルコース)、α,β-未飽和カルボニル、水銀化アルキル(alkyl mercurial)、α,β-未飽和スルホンを含む。
[0176] 他の適切なＳＭｓは、多環分子、例えば、フェニル又はシクロへキシル環を含む分子を含んでもよい。ＳＭは、ポリエーテル、例えばポリホスホプロパンジオール、ポリエチレン・グリコール、ポリプロピレン・グリコール、二官能基多環分子、例えば、二官能基ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、アシミダセン(asymindacene)、シム-インダセン(sym-indacene)、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン(phenalene)、フェナンスレン(phenanthrene)、アントラセン、フルオランセン(fluoranthene)、アセフェナスリレン(acephenathrylene)、アセアンスリレン(aceanthrylene)、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、チアンスレン(thianthrene)、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチン(phenoxathiin)を含んでもよく、これらは、置換されてもよいし又は改変されてもよく、又はポリエーテル及び多環分子の組合せであってもよい。多環分子は、Ｃ1-Ｃ5アルキル、Ｃ6アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、又はハロアルキル基で置換又は多置換されてもよい。窒素含有多複素環分子(例えば、インドリジン)は、典型的に適切なスペーサーではない。スペーサーは、ポリアルコール、例えばペンタエリスリトールであってもよい。ＳＭｓは、(１-ホスホプロパン)3-ホスフェート、又は(１-ホスホプロパン)4-ホスフェート(テトラホスホプロパンジオール及びペンタホスホプロパンジオール)又は誘導体化２、２'-エチレンジオキシジエチルアミン(ＥＤＤＡ)を含んでもよい。
[0177] 別の適切なＳＭｓは、Cload及びSchepartz, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113: 6324; Richardson and Schepartz, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113 : 5109; Ma et al., 1993, Nucleic Acids Research 21: 2585; Ma et al., 1993, Biochemistry 32: 1751 ; McCurdy et al., 1991, nucleosides & Nucleotides 10: 287; Jaschke et al., 1993, Tetrahedron Lett. 34: 301; Ono et al., 1991, Biochemistry 30: 9914; Arnold et al., 国際公開WO 89/02439及びEP0313219B1題名"Non-nucleic acid Linking Reagents for Nucleotide Probes, " Salunkhe et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. l 14 : 8768; Nelson et al., 1996, Biochemistry 35: 5339-44; Bartley et al., 1997, Biochemistry 36: 14502-511; Dagneaux et al. 1996, Nucleic Acids Research 24: 4506-12; Durand et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 6353-59; Reynolds et al., 1996, Nucleic Acids Research, 24: 760-65; Hendry et al. 1994, Biochemica et Biophysica Acta, 1219: 405-12; ; Altmann et al., 1995, Nucleic Acids Research 23: 4827-35,及び米国特許第6,117,657号(Usman et al.)により記載される「リンカー」を含む。
[0178] 種々のＳＭｓｓは、例示の目的で、非限定的に本明細書中に記載される。ＳＭ又はＳＭ要素は、しばしばスペーサー成分又は要素の由来元の化合物(例えば、ヘキサエチレングリコール)の化学名により呼ばれることが多いということが読者により便宜上認められ、ＢＩＣが実質的に分枝点ヌクレオシドと核酸成分 (又は２個の分枝点ヌクレオシド間、又は２個の核酸成分間)についての化合物(単数又は複数)の複合体を含むということが理解される。通常、ＨＥＧについて、実施例１〜４、及び６〜８において以下に記載されるように、ＳＭは、スペーサー成分前駆体(単数又は複数）であって、スペーサー成分前駆体、分枝点ヌクレオシド、核酸成分、又は別のスペーサー成分要素をカップリングすることを許容する反応基を含み、かつ保護基も含められうる前駆体から形成されうる。スペーサー前駆体上の反応基は、同じであってもよいし、又は異なってもよい。
[0179] モノヌクレオチド及びポリヌクレオチドが、ＳＭｓではありえないことが読者にとって明らかであろう。(これらの除外をなくしてしまうと、ＮＡＭと隣接ＳＭとの間の違いがなくなってしまう)。
[0180] 適切なＳＭｓは、それらが要素となるＢＩＣを、水溶液(例えばＰＢＳ,ｐＨ７.０)中に不溶なものとしない。こうして、ＳＭｓはマイクロキャリア又はナノキャリアを含まない。加えて、低い溶解度を有するスペーサー分子、例えばドデシル・スペーサー(ジアルコール前駆体、１,１２-ジヒドロキシドデカンとして計測した場合、溶解度＜５ｍｇ/ｍｌ)は、好ましくない。なぜなら、それは、ＢＩＣの親水性及び活性を低減しうるからである。好ましくは、スペーサー成分は、例えばジアルコール前駆体として計測したとき、５ｍｇ/ｍｌよりずっと大きい溶解度(例えば少なくとも約２０ｍｇ/ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ/ｍｌ、又は少なくとも約１００ｍｇ/ｍｌ)を有する。水溶性について試験するために使用されるスペーサー成分の形態は、一般的に最も密接に関連した不活性かつ未保護のスペーサー前駆体分子である。
[0181] スペーサー成分は、小さいユニット(ＳＭ要素)を含み、そしてＳＭ要素のホモポリマー又はヘテロポリマーでありうる。例えば、ＢＩＣ Ｂ０７［(５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'-ＨＥＧ)2-(Ｕ)-ＡＨＡ-ＨＥＧ-５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'］のＳＭは、２個のＨＥＧ・ＳＭｓと、６-ヒドロキシ-１-アミノへキシル-３(Ｅ)-アクリルアミド要素へのホスホロチオエート結合中にＨＥＧ要素を含むＳＭを有すると記載されうる。
[0182] 一の実施態様では、ＳＭは、複数の共有結合された要素(又はサブユニット)を含み、そしてホモポリマー又はヘテロポリマーの構造を有しうる。幾つかのＳＭｓにおいて、要素は、リンカー、ホスホジエステル結合、及び/又はホスホロチオエート・エステル結合により結合される。１の実施態様では、例示の目的で非限定的に、ＢＩＣは、２以上(例えば、３以上、４以上、又は５以上)のサブユニットであって、ホスホジエステル結合及び/又はホスホロチオエート・エステル結合の以下のタイプ：オリゴエチレン・グリコールＳＭ要素(例えば、トリエチレン・グリコール要素；ヘキサエチレン・グリコール要素)；アルキルＳＭ要素(例えば、プロピル要素；ブチル要素；ヘキシル要素)；分枝状ＳＭ要素(例えば、２-(ヒドロキシメチル)エチル・スペーサー；グリセロール・スペーサー；トレブラー(trebler)スペーサー；対称ダブラー(doubler)スペーサー)から選ばれるサブユニットのいずれかを含むＳＭを含む。例として、スペーサー成分は、ホスホジエステル結合を介して、オリゴエチレン・グリコール、例えばＨＥＧ(例えば、Ｘ＝［5'Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ａ3'・ＨＥＧ］2・グリセロール・ＨＥＧ・［ｂＮ］・(核酸成分)2、ここで「・」は、ホスホジエステル結合を意味する)に結合するグリセロールを含んでもよい。ＳＭ要素間の別の通常結合は、ホスホロチオエート、アミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホールアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、及びメチル・ホスホネートを含む。
[0183] スペーサー成分はまた、多価(例えば、分枝状)でありうる。適切な多価ＳＭｓは、グリセロール又は置換グリセロール(例えば、２-ヒドロキシメチル・グリセロール、レブリニル-グリセロール)；テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、１,３,５-トリヒドロキシシクロヘキサン、ペンタエリスリトール、及びペンタエリスリトール誘導体、テトラアミノペンタエリスリトール、１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラデカン(シクラム(Cyclam))、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン(シクレン(Ｃｙｃｌｅｎ))、ポリエチレンイミン、１,３-ジアミノ-２-プロパノール、及び置換誘導体(例えば、「対称ダブラー」)、［プロピルオキシメチル］エチル化合物(例えば、トレブラー(trebler))、ポリエチレン・グリコール誘導体、例えばいわゆる「スター(Star)ＰＥＧｓ」及び「ｂＰＥＧ」(例えば、Gnanou et al., 1988, Makromol. Chem. 189: 2885; Rein et al., 1993, Acta Polymer 44: 225, Merrill et al., 米国特許第5,171,264号; Shearwater Polymers Inc., Huntsville ALを参照のこと)。多価ＳＭは、複数のＮＡｓ又は別の成分に結合されうる。図７を参照のこと。
５. ＢＩＣｓの合成
Ａ. ＮＡＭＳ、ＳＭｓ、及びｂＮｓ
[0184] ＢＩＣｓをルーチンな方法を使用して製造することは、本明細書及び当該技術分野の知識により導かれて、当業者の能力の範囲内であるだろう。ＢＩＣｓ(例えば、ＮＡＭｓ、ｂＮｓ、及びＳＭｓ)の要素は、種々の方法を使用して製造及び混合されうる。本明細書中に記載される方法は、例示的であり、そして制限することを意図しない。
[0185] 核酸成分(例えば、オリゴヌクレオチド及び改変オリゴヌクレオチド)の製造技術は知られている。核酸成分は、非限定的に酵素的方法及び化学的方法、並びに酵素的及び化学的アプローチの組合せを含む技術を使用して合成されうる。例えば、ホスホジエステル結合を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、３'末端で個体支持体に結合された成長オリゴヌクレオチドの５'ヒドロキシ基に適切なヌクレオシド・ホスホラミダイトを連続的に結合し、続いて中間体のホスファイト・トリエステルを、ホスフェート・トリエステルへと酸化することにより化学的に合成されうる。ＤＮＡ合成に有用な個体支持体は、コントロールド・ポア・ガラス(Controlled Pore Glass)(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ポリスチレン・ビーズ・マトリックス(プライマー・サポート、Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)、及びテントゲル(TentGel）(Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany)を含む。一度、所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されたなら、オリゴヌクレオチドは、支持体から取り除かれ、ホスフェートトリエステル基は、ホスフェートジエステルへと脱保護され、そしてヌクレオシド塩基は水性アンモニア又は別の塩基を使用して脱保護される。
[0186] 例えば、ホスホジエステル結合を含むＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド(核酸成分)は、一般的に以下のステップ：ａ) ３'-個体支持体-結合ヌクレオシド若しくは核酸の５'-ヒドロキシル基から保護基を取り除き、ｂ) 活性化ヌクレオシド・ホスホラミダイトを、５'-ヒドロキシル基にカップリングし、ｃ) ホスファイト・トリエステルをホスフェート・トリエステルに酸化し、そしてｄ) 未反応の５'-ヒドロキシル基をキャッピングするステップの繰り返し反応により一般的に合成される。ホスホールチオエート結合を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、上に記載されるように製造される。但し酸化ステップは、硫化ステップに置き換えられる。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されたら、オリゴヌクレオチドは支持体から取り外され、該ホスフェート・トリエステル基は、ホスフェートジエステルへと脱保護され、そしてヌクレオシド塩基は、アンモニア水溶液又は別の塩基を使用して脱保護される。例えば、Beaucage(1993)PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS, SYNTHESIS AND PROPERTIES (Agrawal, ed. ) Humana Press, Totowa, NJの「Oligodeoxyribonucleotide Synthesis」; Warner et al. (1984) DNA 3: 401 ; Tang et al. (2000) Org. Process Res. Dev. 4: 194-198; Wyrzykiewica et al. (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4: 1519-1522; Radhakrishna et al. (1989) J. Org. Chem. 55: 4693- 4699、及び米国特許第4,458,066号を参照のこと。特定の配列の核酸成分を自動的に合成するプログラム可能な機械が広く利用できる。この例は、Expedite8909自動ＤＮＡ合成機(Perseptive Biosystem, Framington MA);the ABI 394(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA);及びOligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を含む。
[0187] ポリヌクレオチドは、例えば、酸変化性５'-保護基及び３'-ホスホラミダイトを含む塩基保護ヌクレオシド(モノマー)を使用して、３'から５'方向に組み立てられうる。そうしたモノマーの例は、５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシドー３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルアミノ)２-シアノエチルホスホラミダイトを含み、ここで保護ヌクレオシドの例は、非限定的にＮ６-ベンゾイルアデノシン、Ｎ４-ベンゾイルシチジン、Ｎ２-イソブチリルグアノシン、チミジン、及びウリジンを含む。この場合、使用される個体支持体は、３'-結合保護ヌクレオシドを含む。或いは、ポリヌクレオチドは、酸変化性３'保護基と５'ホスホラミダイトを含む塩基保護ヌクレオシドを使用して、５'から３'方向に組み立てられる。そうしたモノマーの例は、３'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-５'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルアミノ)２-シアノエチル・ホスホラミダイトを含み、ここで保護ヌクレオシドの例は、非限定的に、Ｎ６-ベンゾイルアデノシン、Ｎ４-ベンゾイルシチジン、Ｎ２-イソブチリルグアノシン、チミジン、及びウリジン(Glen Research, Sterling, VA)を含む。この場合、使用される個体支持体は、５'結合保護ヌクレオシドを含む。環状核酸要素は、単離され、組み換え方法を介して合成され、又は化学的に合成されうる。化学合成は、文献において記載される方法のいずれかを使用して行われうる。例えば、Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 2025-2029 and Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2326-2333を参照のこと。
[0188] ホスホラミダイト化学は、特定のＢＩＣｓの製造に適しているが、本発明のＢＩＣｓが、合成又は製造の特定の方法のいずれかにより製造される化合物に限定されていないということが認められるだろう。例えば、ＤＮＡ合成及び脱保護条件と適合性のない基を含む核酸成分、例えば(比限定的に)ヒドラジン、又はマレイミドは、アミノリンカーを含む核酸成分を、異種二官能性の架橋剤、例えばＳＨＮＨ(スクシンイミジル・ヒドラジニウムニコチネート)又はスルホ-ＳＭＣＣ(スルホスクシンイミジル４-[Ｎ-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-１-カルボキシレート)と反応することにより製造されうる。
[0189] 分枝点ヌクレオシドは、当該技術分野に周知である。例えば、ホスホラミダイトに基くＤＮＡ合成と併せた使用に適した官能基を有するｂＮｓの合成は、例えばChang et al. 米国特許5580731号、Lyttle et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 1146-1154、von Biiren et al. (1995) Tetrahedron 51: 8491-8506, D； amha et al (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6565-6573、 Kierzek et al (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4751-4763、及びPfundheller et al (2000) Helvetica Chimica Acta 83: 128-151において記載される。分枝点ヌクレオシドは、分枝点ヌクレオシドとＮＡＭ又はＳＭとの間の共有結合の種々のタイプ、例えば非限定的にホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホールアミデート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、及びジスルフィドを許容する反応基を伴って製造されうる。
[0190] 有用な保護及び反応基を伴う種々の分枝点ヌクレオシドは市販される。例えば：
Ｕ-ＡＨＡ分枝点ヌクレオシド：(５-(Ｎ-(６-Ｏ-レブリノイル-１-アミノヘキシル)-３(Ｅ)-アクリルアミド-５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-デオキシウリジン(図１Ａ、Biosearch Technologies, Novato, CA)
ｍｄＣ-ＤＥＧ分枝点ヌクレオシド：(Ｎ４-(６-Ｏ-レブリノイル-１-ジエチレン・グリコール)-５-メチル-５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-デオキシシチジン(図１Ｅ, Biosearch Technologies, Novato, CA)
Ｕ-ＭＤＰ分枝点ヌクレオシド：(５-(Ｎ-(１-Ｏ-フルオレニルメトキシカーボンアミジル-メチル)-１,２-ジスクシンアミジル)-３-プロピニル-５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-デオキシウリジン (図1C、 Eurogentec, eurogentec. com)
ｒＡ分枝点ヌクレオシド：(５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-ｔ-ブチルジメチルシリル-アデノシン (Glen Research, Sterling, VA).
[0191] スペーサー成分の合成はまた、当該技術分野に周知である。例えば、ホスホラミダイトに基くＤＮＡ合成との組合せ使用に適した官能性を有するスペーサーは、ジオール(例えば、ヘキサエチレン・グリコール、１,３-プロパンジオールなど)から、４,４'-ジメトキシトリチル・クロリドを使用して１個のアルコールを一箇所保護し(monoprotecting)、そしてもう一方のアルコールを２-シアノエチル・ジイソプロピルクロロホスホラミダイトで一箇所活性化する(monoactivating)ことによりにより合成される。スペーサー成分は、分枝点ヌクレオシドとＮＡＭとの間の共有結合の種々のタイプ、非限定的にホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホールアミデート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、及びジスルフィドを可能にする反応基で製造されてもよい。
[0192] 有用な保護及び反応基を有する多くのスペーサー成分は、市販されており、非限定的に以下：
トリエチレン・グリコール・スペーサー、つまり「ＴＥＧスペーサー」： ９-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)トリエチレングリコール-１-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Glen Research, Sterling, VA);
ヘキサエチレン・グリコール・スペーサー 、つまり「ＨＥＧ スペーサー」： １８-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)ヘキサエチレングリコール-１-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Glen Research, Sterling, VA);
プロピル・スペーサー： ３-(４,４'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシ-１-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］ (Glen Research, Sterling, VA);
ブチル・スペーサー：４-(４,４'-ジメトキシトリチルオキシ)ブチルオキシ-１-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Chem Genes Corporation, Ashland Technology Center, Ashland, MA) ;
ヘキシル・スペーサー : ６-(４,４'-ジメトキシトリチルオキシ)ヘキシルオキシ-１-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Biosearch Technologies, Novoto, CA)
２-(ヒドロキシメチル)エチル・スペーサー、つまり「ＨＭＥスペーサー」：１-(４,４'-ジメトキシトリチルオキシ)-３-(レブリニルオキシ)-プロピルオキシ-２-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト(Chem Genes Corp., Ashland Technoklgy Center, Ashland MA.)
「脱塩基ヌクレオチド・スペーサー」、つまり「脱塩基スペーサー」５-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-１,２-ジデオキシリボース-３-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Glen Research, Sterling, VA);
「対称性分枝スペーサー」、つまり「グリセロールスペーサー」： １,３-Ｏ,Ｏ-ビス(４,４'-ジメトキシトリチル)グリセロール-２-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Chem Genes, Ashland, MA) (図２を参照のこと) ;
「トレブラー・スペーサー」(図２を参照のこと)：２,２,２-Ｏ,Ｏ,Ｏ-トリス［３-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル］エチル-１-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Glen Research, Sterling, VA);
「対称ダブラー・スペーサー」(図２を参照のこと)： １,３-Ｏ,Ｏ-ビス［５-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド］プロピル-２-Ｏ-［(２-シアノエチル)Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルホスホラミダイト］(Glen Research, Sterling, VA)。
Ｂ. ＢＩＣｓの合成
[0193] 分枝状オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野に周知であり、そして類似の方法は、ＢＩＣｓの合成において使用されうる。例えば、リボヌクレオチドを分枝点ヌクレオシドとして含む分枝状オリゴヌクレオチドの合成は、Braich and Damha (1997) Bioconjugate Chem. 8: 370-377, Hudson, H. E. and Damha, M. J. (1993) J : Am. Chem. Soc. 115: 2119-2124, Damha, M. J. and Zabarylo, S. V. (1989) Tetrahedron Lett. 30: 6295-6298 Damha, M. J.; Ganeshan, K..; Hudson, R. H. E.; Zabarylo, S. V. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6565- 6573, Kierzek, R.; Kopp, D. W.; Edmonds, M.; Caruthers, M. H. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4751-4764, Sproat, B. S.; Beijer, B.; Grotli, M.; Ryder, U.; Morand, K. L.; Lamond, A. I. (1994) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 14 : 419-431, Polushin, N. N. (1999) Collection Symposium Series 2: 145-150, Von Buren, M.; Petersen G. V.; Rasmussen, K.; Brandenburg, G.; Wengel, J. (1995) Tetrahedron 51: 8491-8506に記載される。分枝点ヌクレオシドの塩基に結合される分枝点を含む分枝状ヌクレオチドの合成の更なる例は、Chang, C.; Urdea, M. S.; Horn, T. 1996 米国特許第5580731号、Horn, T. 及びUrdea M. S. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6959-6967, Horn T.; Chang, C-A.; Urdea M. S. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4835-4841, Horn T.; Chang, C-A.; Urdea M. S. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4842-4849、並びにCzechtizky, W.; Vasella, A. (2001) Helv. Chim. Acta 84: 1000- 1016を含む。５'-Ｃ、４'-Ｃ、又は３'-Ｃ分枝部位を含む分枝状オリゴヌクレオチドは、Thrane, H.; Fensholdt, J.; Regner, M.; Wengel, J. (1995) Tetrahedron 51: 10389-P-72, Jorgensen, P. N.; Stein, P. C.; Wengel, J. (1994) J. Am Chem. Soc. 116: 2231 並びにJorgensen, P. N.; Svendsen, M. L.; Scheuer-Larsen, C.; Wengel, J. (1995) Tetrahedron 51: 2155において記載されるように合成されうる。
[0194] １のアプローチでは、ＢＩＣｓは、分枝状ヌクレオシド並びにＤＮＡ合成において使用されるものと同じ反応基及び保護基を含むスペーサー成分、例えば２-シアノエチル(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル) ホスホラミダイト反応基及び４,４'-ジメトキシトリチル保護基を使用して製造されうる。分枝点ヌクレオシド及びスペーサー成分のこれらのタイプは、ＮＡＭ合成について前に記載されたのと同じ合成サイクルを使用して、ホスホジエステル又はホスホロチオエート結合を介して、互いに及びＮＡＭｓに共有結合される。分枝状ヌクレオシドは、４,４'-ジメトキシトリチル基、たとえばレブリニルに比較して、直交保護(orthogonal protection)を有する別の保護基を有することが多い。この基は、合成サイクルにおける脱トリチル(detritylation)ステップの前又は後のいずれかで、選択的に取り外される。しばしば立体障害のため、反応基の濃度の増大及び反応時間の増大は、分枝状ヌクレオシドへの高カップリング収率を維持するために必要である。この方式で製造されるＢＩＣｓは、オリゴヌクレオチドについて記載されるように脱保護されそして精製される。
６. 精製
[0195] 本発明のＢＩＣｓは、慣用的な手段のいずれか、例えば、高速液体クロマトグラフィー(実施例を参照のこと)、電気泳動方法、核酸親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。幾つかの実施態様では、ＢＩＣｓは、実質的に純粋であり、例えば、重量で少なくとも純度約８０％であり、しばしば重量で少なくとも純度約９０％であり、たいてい少なくとも純度約９５％、最も多くは少なくとも純度約９８％である。
７. 典型的なＢＩＣ構造及び３次構造
Ａ. 典型的なＢＩＣ構造
[0196] 上で記載されるように、本発明のＢＩＣは、多数の分枝点ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、ＢＩＣは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも１０の分枝点ヌクレオシドを、その構造内に有してもよい。
[0197] 一の実施態様では、ＢＩＣは１のｂＮ及び３個のプライムＮＡＭｓを含む。そうしたＢＩＣは、「Ｙ」構造を有すると呼ばれる。
[0198] 一の実施態様では、ＢＩＣは、(ｂＮ)n+2(ＮＡ)n+4構造を含み、ここでｎは０〜約２５の整数であり、しばしば０〜１０、０〜５、０〜３であるか、又は０、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８の下限と、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、若しくは２５の独立して選ばれる上限により定義される範囲内(ここで上限は下限より大きい)である。例えば(及び例示の目的のみで)ＢＩＣは、以下の構造：
Figure 2006516099
 [式中、ｎ＝０〜２５、しばしば０〜１０、又は３〜１０であり；そしてＮＡＭとＮＡＭ'は、独立して選ばれる核酸成分である]
を含みうる。種々の実施態様では、全てのＮＡＭ'は、一般の性質を有し、例えば全てが同じ配列を有するか、及び/又は全てがプライムＮＡＭｓであり、全てが５-プライムＮＡＭｓであり、又は全てが３-プライムＮＡＭｓである。
[0199] 関連する態様では、ＢＩＣは、少なくとも２個の分枝点ヌクレオシドと少なくとも４個の中心ＮＡＭｓを含む。実施態様では、ＢＩＣは、１、２、又は３個の別の分枝点ヌクレオシドに共有結合される分枝点ヌクレオシドを含む。
[0200] ＢＩＣは上記構造Ｉ及びＩＩなどの構造により特徴付けられてもよいが、個々のＢＩＣが１超のそうした「中心構造」を含んでもよいことは明らかであろう。上に記載されるように、本発明のＢＩＣｓは、本明細書中に記載される１以上の中心構造を含む限り、さらなる共有結合されたＮＡＭｓ及びｂＮｓ、並びに別の共有結合された基及び原子を含みうるし、そしてしばしば実際に含む。例えば、一の実施態様では、ＢＩＣは４個の(又はそれを超える)ＮＡＭｓに共有結合される少なくとも１のｂＮを含み、ここで各ＮＡＭは、ｂＮの異なる位に結合される。さらに、例えばもしＳＭ(例えば、グリセロールに基くＳＭ)が分枝点を誘導するなら、ｂＮは一の場所で１超のＮＡＭに共有結合されることもある。例えば、図７のＢＩＣを参照のこと。ここでは、２個のＮＡＭｓは、ウリジン塩基のＣ５位に共有結合され、そして２個のさらなるＮＡＭｓは、ヌクレオシドのペントース糖の５'と３'位6に共有結合される。分枝状ＳＭｓを使用することにより、１〜１０、又は１〜２５個の(又はさらに２５超の)中心ＮＡＭｓを有するＢＩＣを設計することは可能である。
[0201] 別の実施態様では、ＢＩＣは場合により、少なくとも１の周辺ＮＡＭ、例えば０〜約２５、０〜３、又は０〜１０個の周辺ＮＡＭｓを含んでもよい。
[0202] ある実施態様では、ＢＩＣは３超の中心ＮＡＭｓ、例えば４〜６、４〜１０、４〜２５、１０〜２５、又は２５超のＮＡＭｓを含んでもよい。
[0203] ある実施態様では、中心ＮＡＭｓの全ては、プライムＮＡＭ(例えば、５プライムＮＡＭ)である。ある実施態様では、プライムＮＡＭｓの全て(例えば、５プライムＮＡＭｓ)は周辺ＮＡＭである。
Ｂ. 規定の三次構造を有するＢＩＣｓ
[0204] ＢＩＣｓが構造上の特徴に基いて特徴付けられるということが、本明細書の上の記載から明らかであるだろう。この節及び以下の節(§８)は、さらにＢＩＣの二次及び四次構造、並びにＢＩＣ多量体を記載する。この節で記載されるＢＩＣｓ及びＢＩＣ多量体は、食細胞又は抗原提示細胞に標的されるか、又はこれらの細胞に効果的に取り込まれれ、核酸成分の５'末端の高い密度を提示してもよいし、(例えば、ヌクレアーゼ又は他の分解性活性、エンドソーム内での酸性化、及び/又はＢＩＣの希釈又はin vivoにおける多量体形成(それにより、対象へ投与後又は特定の生物学的区画中において、性質を変化させる)のため)in vivoで構造を変化してもよい。
[0205] 本明細書中に他の場所に記載されるように、ＢＩＣｓは、互いに全体的に又は部分的に相補的な配列を有する２個の核酸成分を含みうる。相補配列ＮＡＭｓは、互いにハイブリッド形成して、ＢＩＣ間二本鎖(intra-BIC duplex)を形成する。例えば実施例５(C-６２１)を参照のこと。以下の§８において論じられるように、異なるＢＩＣｓからの相補的ＮＡＭｓは、ＢＩＣ多量体の形成において二本鎖を形成しうる。
[0206] 二本鎖において、相補配列を有するＮＡＭｓのペアは、自己相補的(例えばパリンドローム的)であり、又は該ペアは異なる配列を有しうる。生理的ｐＨ(つまり７.０〜７.４、例えば７.２)及びイオン強度(例えば１５０ｍＭ・ＮａＣｌ)の水溶液３７℃中で、核酸成分が二本鎖を形成するために十分な相補性及び長さである限り、正確な相補性が必要とされないということが認められるだろう。ＢＩＣ間二本鎖の形成は、二本鎖を形成する二個の核酸が、塩基対形成が生じる立体配置に置かれることを必要とする。通常、介在性ＮＡＭｓ、ＳＭｓ及び/又はｂＮの存在により、十分な配向由度が提供されて、そうしたＢＩＣがそうした立体配置を達成することを可能にする。
[0207] 二本鎖構造の存在は、周知の方法を使用して検出されうる。これらの方法は、サイズ排除クロマトグラフィーに基くＢＩＣ構造の変化を検出し、そしてＢＩＣを含む組成物の温度を上げ下げする際にＡ260又はＡ280の変化(融解又は二本鎖の形成を示す)を検出することを含む。二本鎖ＤＮＡが一本鎖形態に分離すると、吸光度が増加する。
[0208] 分子間二本鎖形成に加えて、別の立体配置のＢＩＣｓが設計されうる。典型的な立体配置は、「Ｈ」及び「くし」構造を含む。
[0209] 「Ｈ」構造は、以下の：
・丁度２個のｂＮｓ；
・中心ＮＡＭｓ又は周辺ＮＡＭｓであってもよい、４個のプライムＮＡＭｓ；
・０又は少なくとも１の内部ＮＡＭｓ(通常２０未満、ときどき１０以下、ときどき５)
を有することにより定義される。
図３及び図４を参照のこと。ある実施態様では、少なくとも３、又は少なくとも４個のプライムＮＡＭｓは、５'ＮＡＭｓである。一の実施態様では、５-プライムＮＡＭｓは同じものである。ある実施態様では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は４個全ての５-プライムＮＡＭｓ核酸成分は、配列ＣＧ、場合によりＴＣＧ、場合により５'F-ＴＣＧを含む。
[0210] ＢＩＣは、「くし」構造の立体配置を有する構造を含みうる。「くし」構造は、以下の構造５：
Figure 2006516099
 [式中、ｎは１〜１０であり、好ましくは３〜６であり、最も好ましくは３又は４であり、ｘは０〜３であり、通常０又は１であり、「-」は、(場合によりＳＭを介して)ＮＡＭとｂＮａが共有結合されていること、そして各ＮＡＭとＳＭが独立して選ばれかつ同じか又は異なりうるということを示す]を含む。種々の実施態様では、少なくとも１の核酸成分は、プライム成分、５-プライム成分であり、そして/又は配列ＣＧ、場合によりＴＣＧ、場合により５'F-ＴＣＧを含む。一の実施態様では、プライム成分の全て(例えば、５-プライム成分)は同じ配列を有し、及び/又は５'成分ではない核酸成分の全ては、同じ配列を有し、及び/又は内部成分の全ては同じ配列を有する。図５及び６を参照のこと。
[0211] 一の態様では、ＢＩＣは、デンドリマーの構造を有しうる(ＢＩＣデンドリマー)。ＢＩＣデンドリマーは、複数(例えば、３-１５)のコピーの分枝状ＢＩＣの共有結合により作られる個別の、高分枝状ポリマーである。例えば、図８は、中心構造ＩＩを有するＢＩＣｓを結合することにより作り出される第三世代(third generation)ＢＩＣデンドリマーを示す。
８. ＢＩＣ多量体
[0212] 本発明の特定のＢＩＣｓは、少なくとも部分的に相補性のある核酸成分のペアの間におけるワトソン-クリック-ハイブリダイゼーションのため、互いに安定して会合する２以上のＢＩＣｓの「多量体」を形成しうる。ＢＩＣｓは、所望の多量体へと集合するように設計されうる。多くの多量体立体構造が可能であり、その中の２個の例が、以下：「中心軸ＢＩＣ多量体」及び「かご構造」ＢＩＣ多量体で記載される。
[0213] 記載されるように、ＢＩＣ多量体の個々のＢＩＣｓは、互いに安定して会合する。本文脈において使用されるように、「安定して会合」という用語は、生理イオン強度及びｐＨに近い緩衝塩水溶液、例えば１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.２で、３７℃で会合されたままであることを意味する。「安定して会合」された多量体の巨大分子が、例えば個々のＢＩＣｓが、比較的短い期間未会合でありうるような平行状態で存在してもよく、或いは多量体構造におけるＢＩＣｓと、溶液中の未会合のモノマーとの間で交換されうる。ＢＩＣ多量体は、自己集合性である(つまり、ＢＩＣｓの要素は、生理条件下で、自発的に会合されうる)。通常、ＢＩＣ要素が約１.０ｍｇ/ｍｌの濃度で、５０ｍＭ・リン酸ナトリウム/１５０ｍＭ塩化ナトリウム/ｐＨ７.２中に溶解し、９５℃で３分間熱し、そしてゆっくり(約２時間超)３７℃又は室温へと冷やしたときに、ＢＩＣ多量体が形成するだろう。以下の実施例７を参照のこと。
[0214] ＢＩＣ多量体中のＢＩＣｓ間の会合が、少なくとも１部は、少なくとも部分的に相補的であり、そして時に完全に相補的である核酸成分との間で形成されるハイブリッドに依存するので、核酸ハイブリッドの形成のための通常のパラメーターが適用される。つまり、核酸成分のハイブリッド形成試薬は、安定なＢＩＣ多量体を形成するために十分な長さ及び/又は配列組成(ＧＣ含量)である。一般的に、１のＢＩＣの核酸成分は、少なくとも８、たいてい少なくとも１０、そして通常少なくとも１２個の連続塩基であって、多量体における第二ＢＩＣの核酸成分と正確に相補的であるものを含むだろう。しかしながら、多くのハイブリッド形成核酸成分が存在する場合、相補的又は近接の領域は短いことがある。２個のポリヌクレオチド又は自己相補的ポリヌクレオチドの領域が、二本鎖を形成する条件は、実験的に測定されるか又は周知の方法を使用して(塩基配列、ポリヌクレオチド長、エステル結合[例えば、ホスホロチオエート又はホスホジエステル結合]、温度、イオン強度、改変塩基又は糖の存在などを考慮に入れて)予測されうる。ＢＩＣｓを会合する際において核酸成分をアニーリングすることは、各々自己相補的であるか(例えば、図２及び９を参照のこと)、又は代わりにＢＩＣ上の核酸成分(単数又は複数)は、第二ＢＩＣ上の核酸成分(単数又は複数)に相補的でありうるが、それ自身に相補的ではない。
[0215] ＢＩＣ多量体(二量体)の例は、図２において示され、そして以下の実施例７において記載される。図２において示される構造は、「中心軸」構造の例である。中心軸多量体は、構造ＩＩ(上記参照)の２以上のＢＩＣｓであって、各ＢＩＣにおいて１以上のＮＡＭｓのハイブリッド形成により安定して会合されるものを含む。一の実施態様では、中心軸構造は、各ＢＩＣの１のＮＡＭが二本鎖になり、そして両方の二本鎖ＮＡＭｓが中心ＮＡＭｓであるダイマーである。或いは、中心軸は、各ＢＩＣからの複数の二本鎖ＮＡＭｓを含み、そして該ＮＡＭｓは、中心ＮＡＭｓ、周囲ＮＡＭｓであるか、又はその両者を含みうる。関連の実施態様では、中心軸多量体は、２超のＢＩＣｓを含みうる。多量体のＢＩＣのいずれかについて、他の２個のＢＩＣｓは、第一ＢＩＣのｂＮの同じ位置に共有結合される第一ＢＩＣのＮＡＭｓと二本鎖を形成し；各別のＢＩＣは、ｂＮの異なる位置に共有結合される第一ＢＩＣのＮＡＭｓと二本鎖を形成するだろう。
[0216] ＢＩＣ多量体の構造の別の例は、「かご」構造である。例えば、図９に示されるＢＩＣを参照のこと。かご構造では、各ＢＩＣは少なくとも２、そして通常少なくとも３個の、プライムＮＡＭｓ(例えば５-プライムＮＡＭｓ)であって、少なくとも２、及び通常少なくとも３個の、第二ＢＩＣのプライムＮＡＭｓにハイブリッド形成するＮＡＭｓを含む。典型的に、図９において示される例のように、２個のＢＩＣｓは同じである。しばしば、図９において示される例において、アニーリングＮＡＭｓの全ては、中心ＮＡＭｓである。「かご構造」は、アニーリングＮＡＭｓの各々が、同じ方向性でＮＡＭにアニールされるという点で特徴付けられる(例えば、両方とも遊離５'末端又は遊離３'末端を有する)。
[0217] 「ヒトデ」構造は、多量体ＢＩＣの別のタイプである。ヒトデ構造は、アニーリングＮＡＭｓが、反対の方向性を有するＮＡＭにアニールする(例えば、一方は遊離５'末端を有し、そしてもう一方は遊離３'末端を有する)ということを除いて、上記かご構造と同じ性質を有する。
[0218] ＢＩＣ多量体の各タイプにおいて、特徴が多量体構造と一致する限り、多量体における核酸成分が、核酸成分について、本明細書中に記載される配列、構造特徴、又は性質のいずれかを有しうるということが理解されるだろう。こうして、１以上の核酸成分が、５-プライム成分であり、ＣＧ、ＴＣＧ、または５'F-ＴＣＧ配列を含んでもよく、又は本明細書中に記載される別の配列、モチーフ、又は性質を有してもよい。さらに、図及び実施例において記載される多量体は、例示の目的に提供され、そして非限定的でありうることが理解されるだろう。
９. ＢＩＣｓの免疫調節活性
[0219] 本発明のＢＩＣは、免疫調節活性を有する。本明細書中に使用される「免疫調節」、「免疫調節活性」、又は「免疫応答の調節」という用語は、免疫調節性並びに免疫抑制性の効果を含む。本発明に従った免疫調節性である免疫応答は、「Ｔｈ２型」免疫応答に対抗し、Ｔｈ１型免疫応答へとシフトをする免疫応答である。Ｔｈ１型応答は、典型的には細胞性免疫系(例えば、細胞障害性リンパ球)応答と考えられ、一方Ｔｈ２型応答は一般的に「液性」、又は抗体に基く免疫応答である。Ｔｈ１型免疫応答は、一般的に抗原に対する「遅延型過敏性」により通常特徴付けられる。Ｔｈ１型応答は、Ｔｈ１関連サイトカイン、例えばＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、及びＴＮＦ-α、並びにＩＬ-６などのレベルの増加により生物化学的レベルで検出されうるが、但しＩＬ-６はまた、Ｔｈ２型応答にも関連しうる。Ｔｈ２型免疫応答は、抗体産生の高いレベルに一般的に関連され、ＩｇＥ産生、最小ＣＴＬ産生の欠如、並びにＴｈ２関連サイトカイン、例えば、ＩＬ-４及びＩＬ-５の発現を含む。
[0220] 本発明に従った免疫調節は、in vivo、in vitro、及び/又はex vivoでの計測(アッセイ)により認識されうる。免疫調節活性を指し示す計測できる免疫応答の例は、非限定的に、抗原特異的抗体産生、サイトカインの分泌、リンパ球数、例えばＮＫ細胞、ＣＤ４+Ｔリンパ球、ＣＤ８+Ｔリンパ球、Ｂリンパ球などの活性化及び増大を含む。例えば、WO 97/28259; WO 98/16247; WO 99/11275; Krieg et al. (1995) Nature 374: 546-549; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076; Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157: 1840-1845; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158: 3635-3639; Sato et al. (1996) Science 273: 352-354; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156: 421-423; Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77: 808-816; Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156: 4570-4575; Roman et al. (1997) Nat Med. 3: 849-54; Lipford et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 2340- 2344; WO 98/55495、 WO 00/61151, Pichyangkul et al. (2001) J. Imm. Methods 247: 83-94を参照のこと。以下の実施例を参照のこと。特に有用なアッセイは、例示の目的で、非制限的に、本明細書の以下に記載される。
[0221] アッセイは、一般的に、注射すること、又は細胞、組織、動物などを(例えばＢＩＣ、ポリヌクレオチド、及び/又は別の薬剤を含む)試験サンプルと接触又は投与すること、そして応答を計測することにより行われる。ＢＩＣｓ又はポリヌクレオチドを含む試験サンプルは種々の形態又は濃度であり、これは、アッセイタイプに適していると当業者により理解されるだろう。例えば、細胞に基くアッセイの目的では、ＢＩＣｓ又はアポリヌクレオチドは、２０μｇ/ｍｌ、又は１０μｇ/ｍｌ、又は２μｇ/ｍｌの濃度で使用されることが多い。典型的に、アッセイの目的のため、濃度は、２６０ｎｍでの吸光度を計測し、そして変換：０.５ＯＤ260/ｍｌ＝２０μｇ/ｍｌを使用することによって測定される。
[0222] 免疫調節活性のアッセイにおいて、ポジティブ及びネガティブコントロールが有用であることは理解されるだろう。免疫調節活性の適切なポジティブコントロールは、配列５'-ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号１３４)を有する免疫調節性ホスホロチオエートＤＮＡであり、しかしながら、免疫調節活性を有する別の適切なポジティブコントロールは、当業者に明らかであるだろう。１の適切なネガティブコンゴロールは、試験薬剤がないものであり(つまり、賦形剤又は培地のみであり、また特定のin vitroアッセイでの「細胞のみ」を指す)。或いは、配列５'-ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号３)を有するホスホロチオエートＤＮＡは、幾つかの実施態様においてネガティブ・コントロールとして使用される。別のネガティブ・コントロールは、本明細書中の開示及び通常のアッセイ設計により指示されて当業者により設計されうる。
[0223] １の有用なクラスのアッセイは、「サイトカイン応答アッセイ」である。免疫調節活性の典型的なアッセイは、ヒト末梢血液単核細胞(「ＰＢＭＣｓ」)のサイトカイン応答を計測する(例えば、Bohle et al. [1999], Eur. J. Immunol. 29: 2344-53; Verthelyi et al. [2001] J. Immunol. 166: 2372- 77に記載される)。本アッセイの１の実施態様では、末梢血液は、１人以上の健常ヒトボランティアから収集され、そしてＰＢＭＣｓが単離される。典型的に血液は、ヘパリン処理されたシリンジを使用して静脈穿刺し、ＦＩＣＯＬＬ(商標)(Amersham Pharnmacia Biotech)クッションに重層し、そして遠心することにより収集される。ＰＢＭＣは、次にＦＩＣＯＬＬ(商標)インターフェースから収集し、そして冷リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄した。細胞を再懸濁し、そして１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、５０ユニット/ｍｌペニシリン、５０μｇ/ｍｌストレプトマイシン、３００μｇ/ｍｌグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１×ＭＥＭ必須アミノ酸欠如(ＮＥＡＡ)を伴うＲＰＭＩ１６４０中で、試験サンプル又はコントロールの有無のもとで、２×１０6細胞/ｍｌの濃度で２４時間培養した。
[0224] 無細胞培地は、各ウェルから回収され、そしてＩＦＮ-γ及び/又はＩＦＮ-α濃度についてアッセイされる。試験化合物と接触されたＰＢＭＣｓにより分泌されるＩＦＮ-γの量が、試験化合物が存在しない際、又は幾つかの実施態様では不活性コントロール化合物(例えば、５'-ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号３))が存在する際にＰＢＭＣｓにより分泌される量より、有意に大きい(例えば、少なくとも約３倍大きい、通常少なくとも約５倍大きい)とき、免疫調節活性は検出される。逆に、試験化合物は、免疫調節活性を有さず、試験化合物と接触されたＰＢＭＣｓにより分泌されるＩＦＮ-γの量が、試験化合物がない際、又は代わりに不活性コントロール化合物(例えば、５'-ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号３))が存在する際より有意に大きくない(例えば、２倍未満)ならば、免疫調節活性を有さない。
[0225] ＩＦＮ-α濃度がアッセイされるとき、試験化合物と接触されたＰＢＭＣｓにより分泌されるＩＦＮ-αの量は、試験化合物が存在しない際、又は幾つかの実施態様では不活性コントロール化合物(例えば、５'-ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号３))が存在する際にＰＢＭＣｓにより分泌される量より、しばしば有意に多い(例えば、ＩＦＮ-αの場合、しばしば少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍超)。幾つかの実施態様では、ＩＦＮ-α分泌レベルの有意な増大は、コントロールに対し、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又はさらに少なくとも約２０倍のレベルである。逆に、試験化合物と接触されたＰＢＭＣｓにより分泌されるＩＦＮ-αの量が、試験化合物が存在しない際、又は代わりに不活性コントロール化合物(例えば、５'-ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ-３'(配列番号３))の存在する際よりも有意に大きくない (例えば、２倍未満)なら、試験化合物は免疫調節活性を有さない。
[0226] アッセイの別の有用なクラスは、細胞増殖アッセイであり、例えばＢ細胞増殖アッセイである。薬剤(例えば、ＢＩＣ)のＢ細胞増殖に関する効果は、当該技術分野に周知である種々のアッセイのいずれかを使用して決定されうる。典型的なＢ細胞増殖アッセイは、実施例１３において提供される。
[0227] ドナー変動を考慮に入れるため、例えば、細胞に基くアッセイ、例えばサイトカイン及び増殖アッセイでは、好ましくは、複数の異なるドナー由来の細胞(例えば、ＰＢＭＣｓ)を使用してアッセイが行われる。ドナーの数は、通常少なくとも２(例えば２)、好ましくは少なくとも４(例えば４)、しばしば少なくとも１０(例えば１０)である。試験化合物の存在下で分泌されるＩＦＮ-γの量が、試験化合物が存在する際に、又は幾つかの実施態様では、上記のような不活性コントロール化合物が存在する際に分泌される量より、(例えば、試験された健常ドナーの少なくとも半分、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％で)少なくとも約３倍大きいか、又は少なくとも約５倍大きいとき、免疫調節活性が検出される。
[0228] 免疫調節活性はまた、哺乳動物細胞(例えば、ＰＢＭＣｓ、鰓肺胞洗浄液細胞(bronchial alveolar lavage (BAL) cells)、及びインターフェロンに反応性の別の細胞)における、サイトカイン、ケモカイン、及び別の遺伝子の、インターフェロン誘導性発現変化を計測することにより検出されうる。例えばケモカイン、例えばインターフェロン誘導性タンパク質１０ｋＤａ(ＩＰ-１０)、ＩＦＮ-γにより誘導されるモノカイン(ＭＩＧ)、及び単球走化性タンパク質１(ＭＣＰ-１)は、ＩＦＮ-α及びＩＦＮ-γの存在下で増加される。これらのタンパク質又はこれらの対応するｍＲＮＡの発現は、ＢＩＣが投与された培養細胞或いは動物組織若しくは血液において、免疫刺激性活性のマーカーとして使用されうる。そうしたマーカーの発現は、遺伝子発現をアッセイする種々の方法、例えばｍＲＮＡｓの計測(例えば定量的ＰＣＲ)、免疫アッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)などの計測のいずれかによりモニターされうる。
[0229] ＢＩＣｓの生物学的活性は、抗ウイルス活性を有すると知られている遺伝子産物、例えば２'-５'オリゴアデニレート合成(２'-５'ＯＡＳ)、インターフェロン-刺激性遺伝子-５４ｋＤａ(ＩＳＧ-５４ｋＤ)、グアニレート結合タンパク質-Ｉ(ＧＢＰ-１)、ＭｘＡ及びＭｘＢなどの誘導を計測することにより測定されうる。これらのタンパク質、又はそれらの対応するｍＲＮＡの発現は、培養細胞又はＢＩＣが投与された動物の組織若しくは血液において免疫刺激活性のマーカーとして使用されうる。そうしたマーカーの発現は、ｍＲＮＡｓの計測(例えば、定量的ＰＣＲによる)、免疫アッセイ(例えばＥＬＩＳＡ)などを含む遺伝子発現の種々のアッセイ方法のいずれかによりモニターされうる。
[0230] in vitroアッセイは、例えば以下の実施例１２において記載されるように、マウス細胞を使用して、並びに別の哺乳類細胞において行われる。in vivoアッセイにおける例は、実施例１４(マウス)及び１５(非ヒト霊長類)において記載される。
１０. 組成物
[0231] 種々の実施態様では、本発明の組成物は、１以上のＢＩＣｓ(つまり、単一のＢＩＣ又は２以上のＢＩＣｓの組合せ)を、場合により別の免疫調節薬剤、例えばペプチド、(以下に記載される)抗原、及び/又はさらなるアジュバントと併せて含む。本発明の組成物は、ＢＩＣ及び医薬として許容される賦形剤を含んでもよい。「医薬として許容される」という用語は、製剤の他の成分と適合性があり、かつその受容者に有害ではない担体、希釈剤、又は賦形剤を意味する。医薬として許容される賦形剤は、当該技術分野に周知であり、そして滅菌水、等張溶液、例えば生理食塩水、及びリン酸緩衝生理食塩水、並びに当該技術分野に周知である他の賦形剤を含む。例えば、Remington : Ihe Science and Practice of Pharmacy (第19版, 1995, Gennavo編)を参照のこと。アジュバント(アジュバントの例はミョウバンである)は、当該技術分野に周知である。ＢＩＣ製剤は、別の免疫治療薬剤、例えばサイトカイン及び抗体と共に製造されうる。幾つかの実施態様では、組成物は等張及び/又は滅菌であり、例えばヒト患者への投与に適しており、例えばＧＭＰ基準の下で製造又は剤形される。ある実施態様では、ＢＩＣは、本明細書中に記載されるようにマイクロキャリア及び/又は抗原と混合される。幾つかの実施態様では、本発明のＢＩＣ組成物又は製剤は、(ｉ)コロイド性懸濁システム、(ｉｉ)リポソーム、(ｉｉｉ)マイクロキャリア、(ｉｖ)ポリペプチド、(ｖ)抗原、及び(ｖｉ)エンドトキシンの１以上を含まないだろう。
Ａ. ＢＩＣ/ＭＣ複合体
[0232] ＢＩＣｓは、ＢＩＣ/マイクロキャリア(ＢＩＣ/ＭＣ)複合体の形態で投与されてもよい。従って、本発明は、ＢＩＣ/ＭＣ複合体を含む組成物を提供する。
[0233] ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、マイクロキャリアの表面に結合されたＢＩＣ (つまり、ＢＩＣはＭＣ内に封入されていない)を含み、そして好ましくは各マイクロキャリアに結合されたＢＩＣの複数の分子を含む。特定の実施態様では、異なるＢＩＣｓは、マイクロキャリアは、１以上のＢＩＣ種に結合されるように、マイクロキャリアと複合体化される。ＢＩＣとＭＣとの間の結合は、共有結合であってもよいし又は非共有結合であってもよい(例えばイオン性及び/又は疎水性相互作用により媒介される)。当業者により理解されるように、ＢＩＣは、改変されてもよいし、又は誘導体化されてもよく、そしてマイクロキャリアの組成物は、ＢＩＣ/ＭＣ複合体形成に所望される結合の所望のタイプを収容するように選択され及び/又は改変されてもよい。
[0234] 共有結合されたＢＩＣ/ＭＣ複合体は、当該技術分野に周知である共有結合技術のいずれかを使用して結合されてもよい。典型的に、ＢＩＣ成分は、さらなる成分(例えば、遊離アミン、カルボキシル基、又はスルフヒドリル基)を取り込むか、又は改変(例えば、ホスホールチオエート)ヌクレオチド塩基を取り込むように改変されて、ＢＩＣ成分がマイクロキャリアに結合されうる部位を提供する。複合体のＢＩＣとＭＣ成分との間の結合は、ＢＩＣの３'又は５'末端で作られうるか、又はＢＩＣにおける内側の成分の適切に改変された塩基で作られうる。マイクロキャリアは、一般的に共有結合が形成されうる成分を取り込むように一般的に改変されるが、しかしながらマイクロキャリア上に通常存在する官能基はまた利用されうる。ＢＩＣ/ＭＣは、共有結合複合体の形成を許容する条件下で(例えば、架橋剤の存在下において、又はＢＩＣとの共有結合を形成する活性化成分を含む活性化マイクロキャリアの使用により)、ＢＩＣをマイクロキャリアとインキュベーションすることにより形成される。
[0235] 種々の架橋技術は当該技術分野に周知であり、そしてアミノ、カルボキシル、及びスルフヒドリル基と反応性のある架橋剤を含む。当業者に明らかであるように、架橋剤及び架橋プロトコルの選択は、ＢＩＣとマイクロキャリアの立体配置、並びにＢＩＣ/ＭＣ複合体の所望の最終立体配置に左右されるだろう。架橋剤は同種二官能基を有するか、又は異種二官能基を有する。同種二官能基の架橋剤が使用されるとき、架橋剤はＢＩＣ及びＭＣ上の同じ成分を使う(例えば、アルデヒド架橋剤は、ＢＩＣとＭＣとを共有結合するために使用されうるし、ここでＢＩＣ及びＭＣの両者は１以上の遊離アミンを含む)。異種二官能基の架橋剤は、ＢＩＣ及びＭＣ上の異なる成分を使用し(例えば、マレイミド-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステルは、ＢＩＣ上の遊離スルフヒドリル並びにＭＣ上の遊離アミンに共有結合するように使用されうる)、そしてマイクロキャリア間結合の形成を最小限にすることが好ましい。多くの場合、マイクロキャリア上の第一架橋成分とＢＩＣ上の第二架橋成分を介して架橋することが好ましく、ここで第二架橋成分は、マイクロキャリア上に存在しない。ＢＩＣ/ＭＣ複合体を作り出す１の好ましい方法は、異種二官能基架橋材とインキュベーションすることによりマイクロキャリアを「活性化」し、次に反応に適切な条件下でＢＩＣと活性化ＭＣをインキュベーションすることによりＢＩＣ/ＭＣ複合体を形成することによる。架橋剤は、反応性成分の間で「スペーサー」腕を取り込んでもよく、又は架橋剤における２個の反応性成分が直接結合されてもよい。
[0236] 一の好ましい実施態様では、ＢＩＣ成分は、マイクロキャリアに架橋されるための少なくとも１の遊離スルフヒドリル(例えば、５'チオール改変塩基又はリンカーにより提供される)を含み、一方該マイクロキャリアは遊離アミン基を含む。これらの二個の基と反応性のある異種二官能基の架橋剤(例えば、マレイミド基とＮＨＳエステルとを含む架橋剤)、例えばスクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレートは、ＭＣを活性化し、次にＢＩＣに共有結合するために使用されて、ＢＩＣ/ＭＣ複合体を形成する。
[0237] 非共有ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、非共有結合又は相互作用のいずれか、例えばイオン性(静電気的)結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又は２以上の異なる相互作用の組合せにより結合されてもよく、結合ペアがＢＩＣとＭＣに結合することになっている場合には通常のことである。
[0238] 好ましい非共有ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、典型的に疎水性又は静電的(イオン性)相互作用又はそれらの組合せにより(例えばＢＩＣと、ＭＣに結合されるポリヌクレオチド結合との間の塩基対を介して)複合体化される。ポリヌクレオチド骨格の親水性の性質のため、複合体を形成するために疎水性相互作用に頼るＢＩＣ/ＭＣ複合体は、疎水性の高い成分を取り込むために複合体のＢＩＣ成分を改変することを一般的に必要とする。好ましくは、疎水性成分は、生物適合性であり、非免疫原性であり、そして組成物を投与することを意図される個体(例えば、哺乳動物、特にヒト）において自然に生じるものである。好ましい疎水性成分の例は、非限定的に、脂質、ステロイド、ステロール、例えばコレステロール、及びテルペンを含む。疎水性成分をＢＩＣに結合する方法は、もちろん、ＢＩＣの立体配置と疎水性成分の独自性に左右されるだろう。疎水性成分は、ＢＩＣにおけるいずれかの都合のよい部位、好ましくは５'又は３'末端のいずれかで加えられ；コレステロール成分をＢＩＣに加える場合、コレステロール成分は、慣用の化学反応を使用して好ましくはＢＩＣの５'末端に加えられる(例えば、Godard et al. (1995) Eur. J Biochem. 232: 404- 410を参照のこと)。好ましくは、疎水性結合により結合されるＢＩＣ/ＭＣ複合体において使用するためのマイクロキャリアは、疎水性物質、例えば油滴又は疎水性ポリマーから作られるが、しかしながら疎水性成分を取り込むように改変された親水性成分は同様に使用されてもよい。マイクロキャリアがリポソームであり、又はルーメンを含む他の液相マイクロキャリアであるとき、ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、ＭＣ製造過程の間にＢＩＣを封入することを避けるため、ＭＣの調製後にＢＩＣとＭＣを混合することによって形成される。
[0239] 静電気的結合により結合される非共有ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、典型的に、ポリヌクレオチド主鎖の高い負電荷を使用する。従って、非共有的に結合されたＢＩＣ/ＭＣ複合体において使用するためのマイクロキャリアは、一般的に生理条件ｐＨ(例えば約ｐＨ６.８〜７.４)で正に荷電される。マイクロキャリアは、内在的に正荷電を有しうるが、通常正の荷電を有さない化合物から作られるマイクロキャリアは、誘導体化され又はそうでなければ改変されて、正に荷電されてもよい。例えば、マイクロキャリアを作るために使用されるポリマーは、正に荷電された基、例えば一級アミンを加えるように、誘導体化されてもよい。或いは、正に荷電された化合物は、製造の間にマイクロキャリアの剤形中に取り込まれてもよい(例えば、正に荷電された界面活性剤は、ポリ(乳酸)/ポリ(グリコール酸)コポリマーの製造の間に使用されて、得られたマイクロキャリア粒子上に正荷電を与えてもよい)。
[0240] ヌクレオチド塩基対により結合される非共有ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、慣用の方法論を使用して生成されてもよい。一般的に、塩基対ＢＩＣ/ＭＣ複合体は、結合、好ましくは共有結合、少なくとも部分的にＢＩＣに相補的であるポリヌクレオチド(「捕捉ポリヌクレオチド」)を含むマイクロキャリアを使用して製造される。ＢＩＣと捕捉ヌクレオチドとの間の相補的断片は、好ましくは少なくとも６、８、１０、又は１５の連続塩基対であり、より好ましくは少なくとも２０の連続塩基対である。捕捉ヌクレオチドは、当該技術分野に周知である方法のいずれかによりＭＣに結合され、そして好ましくは５'又は３'末端でＢＩＣに共有結合される。
[0241] 別の実施態様では、ＢＩＣ/ＭＣ複合体において、結合ペアは、ＢＩＣとＭＣとを結合するために使用されうる。結合ペアは、レセプターとリガンド、抗体と抗原(又はエピトープ)、或いは高い親和性(例えば約１０-8未満のＫｄ)で結合するほかの結合ペアのいずれかであってもよい。好ましい結合ペアの１のタイプは、ビオチンとストレプトアビジン又はビオチンとアビジンであり、これらはかなり強い複合体を形成する。ＢＩＣ/ＭＣ複合体結合を媒介するために結合ペアを使用するとき、ＢＩＣは、典型的には共有結合により、結合ペアの１のメンバーで誘導体化され、そしてＭＣは結合ペアのもう一方のメンバーで誘導体化される。２個の誘導体化された化合物を混合することにより、ＢＩＣ/ＭＣ複合体形成がもたらされる。
[0242] 多くのＢＩＣ/ＭＣ複合体実施態様は、抗原を含まず、そして特定の実施態様は、ＢＩＣ/ＭＣ複合体治療の対象である疾患又は疾病に関連する抗原(単数又は複数)を除外する。更なる実施態様では、ＢＩＣはまた、１以上の抗原分子に結合される。抗原は、ＢＩＣ/ＭＣ複合体のＢＩＣ部分に、種々の方法、例えば共有及び/又は非共有相互作用で結合されうる。或いは、抗原はマイクロキャリアに結合されうる。ＢＩＣに結合される抗原を含むＢＩＣ/ＭＣ複合体におけるＢＩＣと抗原との間の結合は、本明細書中に記載されかつ当該技術分野に周知である技術により作られうる。
Ｂ. 抗原の共投与
[0243] 幾つかの実施態様では、ＢＩＣは抗原と共投与される。抗原のいずれかは、ＢＩＣと共投与されるか、及び/又はＢＩＣと抗原を含む組成物の製造のために使用されてもよい。
[0244] 幾つかの実施態様では、抗原はアレルゲンである。組み換えアレルゲンの例は、表１において提供される。多くのアレルゲンの調製は、当該技術分野に周知であり、非限定的にブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ(Ａｍｂ ａＩ)(Rafnar et al. (1991) J : Biol. Chem. 266: 1229-1236)、牧草 (grass)アレルゲンLol p1(Tamborini et al. (1997) Eur. J Biochem. 249: 886-894)、主要チリダニ・アレルゲンＤｅｒ ｐＩ及びＤｅｒ ＰＩＩ (Chua et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 124-129)、イエネコ・アレルゲンＦｅｌ ｄＩ (Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 559-568)、白樺花粉Ｂｅｔ ｖｌ(Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8: 1935-1938)、日本杉アレルゲンＣｒｙ ｊ １及びＣｒｙ ｊ ２(Kingetsu et al. (2000) Immunology 99: 625-629)、及び別の木の花粉からのタンパク質抗原(Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204: 17-31)を含む。牧草花粉から、in vivo投与用のタンパク質抗原を調製することが報告された。
[0245] 幾つかの実施態様では、アレルゲンは、食品アレルゲンであり、非限定的にピーナッツ・アレルゲン、例えばAra h I(Stanley et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409: 213-216);クルミ・アレルゲン、例えばJug r I(Tueber et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101: 807-814);ブラジル・ナッツ・アレルゲン、例えばアルブミン (Pastorello et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102: 1021-1027; エビ・アレルゲン、例えばPen a I(Reese et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 240-242); 卵アレルゲン、例えば、オボムコイド(Crooke et al. (1997) J. Immunol. 159: 2026- 2032); 乳アレルゲン、例えば、ウシβ-ラクトグロビン(Selot al. (1999) Clin. Exp. Allergy 29: 1055-1063);魚アレルゲン、例えば、 パルブアルブミン(Van Do et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50: 619-625; Galland et al. (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706: 63-71)を含む。幾つかの実施態様では、アレルゲンはラテックス・アレルゲンであり非限定的にHev b 7(Sowka et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255: 213- 219)を含む。表１は使用されうるアレルゲンのリストを示す。
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[0246] 幾つかの実施態様では、抗原は病原体、例えば、原生動物、細菌、真菌(単細胞及び多細胞を含む)、及びウイルス病原体由来である。適切なウイルス抗原の例は、本明細書中に記載され、そして当該技術分野に周知である。細菌は、ヘモフィラス・インフルエンザ(Hemophilus influenza)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、及びボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)を含む。原生動物病原体は、マラリア・プラスモジア(malarial plasmodia)、リーシュマニア・スピーシーズ(Leishmania species)、トリパノソーマ・スピーシーズ(Trypanosoma species)、及び住血吸虫(Schistosoma species)を含む。真菌はカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を含む。
[0247] 幾つかの実施態様では、抗原はウイルス抗原である。ウイルス・ポリペプチド抗原は、非限定的にＨＩＶタンパク質、例えばＨＩＶｇａｇタンパク質(非限定的に、膜アンカー(ＭＡ)タンパク質、コア・キャプシド(ＣＡ)タンパク質、及びヌクレオキャプシド(ＮＣ)タンパク質)、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザ・ウイルス・マトリックス(Ｍ)タンパク質、及びインフルエンザ・ウイルス・ヌクレオキャプシド(ＮＰ)タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)、Ｂ型肝炎コアタンパク質(ＨＢｃＡｇ)、Ｅ型肝炎タンパク質(ＨＢｅＡｇ)、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原などを含む。インフルエンザワクチン接種を論じる参考文献は、Scherle and Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4446- 4450; Scherle and Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164: 1114-1128; Granoffetal. (1993) Vaccine ll : S46-51 ; Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71: 3391-3396; Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11: 1302-1309; Chen et al. (1999) Vaccine 17: 653-659; Govorkova and Smirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41: 251-257; Koide et al. (1995) Vaccine 13: 3- 5; Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12: 1340-1348; Tamura et al. (1994) Vaccine 12: 310-316; Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 477-481 ; Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8: 595-599を含む。抗原ポリペプチドの別の例は、グループ又はサブ・グループ特異的抗原であり、多くの病原体、例えば非限定的に、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、パピローマ・ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びポックスウイルスについて知られている。
[0248] 多くの抗原ペプチド及びタンパク質は知られ、そして当該技術分野で利用でき；他の物は、慣用の技術を使用して同定されうる。腫瘍形成に対する免疫化又は存在する腫瘍の治療のため、免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞(生又は放射後)、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原のタンパク質サブユニット、例えばHer-2/neu、Mart１、癌胎児性抗原(CEA)、ガングリオシド、ヒト・乳脂肪球(ＨＭＦＧ)、ムチン(ＭＵＣ１)、ＭＡＧＥ抗原、ＢＡＧＥ抗原、ＧＡＧＥ抗原、ｇｐ１００、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、及びチロシナーゼを含む。免疫に基いた避妊法のためのワクチンは、ＢＩＣｓと共に投与される精子タンパク質を含むことにより形成されうる。Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307: 263を参照のこと。
[0249] 弱毒化及び不活性化ウイルスは、本明細書中における抗原としての使用に適している。これらのウイルスの調製は、当該技術分野に周知であり、そして多くは市販されている(例えば、Physicians'Desk Reference (1998) 第52版, Medical Economics Company, Inc. を参照のこと)。例えば、ポリオウイルスはＩＰＯＬ(商標)(Pasteur Merieux Connaught)、及びＯＲＩＭＵＮＥ(商標)(Lederle Laboratories)として、Ａ型肝炎ウイルスはＶＡＱＴＡ(商標)(Merck)として、はしかウイルスはＡＴＴＥＮＵＶＡＸ(商標)(Merck)として、おたふく風邪ウイルスはＭＵＭＰＳＶＡＸ(商標)(Merck)として、及び風疹ウイルスはＭＥＲＵＶＡＸ(商標)ＩＩ(Merck)として利用できる。さらに弱毒化及び不活性化ウイルス、例えばＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２、単純疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非ヒト・パピローマウイルス、及びスローブレイン・ウイルスは、ペプチド抗原を提供しうる。
[0250] 幾つかの実施態様では、抗原はウイルスベクター、例えばワクシニア、アデノウイルス、及びカナリア・ポックスなどを含む。
[0251] 抗原は、当該技術分野に周知である精製技術を使用して、それらの源から単離されてもよいし、又はより都合よく組み換え方法を使用して作り出されてもよい。
[0252] 抗原性ペプチドは、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化又は不活性化ウイルス、細胞、微生物、又はアそうしたペプチドの断片を含みうる。免疫調節ペプチドは、天然でありうるし又は化学的に若しくは酵素的に合成されうる。当該技術分野に周知である化学合成の方法のいずれかは適切である。液相ペプチド合成は、中くらいの大きさのペプチドを構築するために使用され、また、ペプチドの化学構築には、固相合成が使用されうる。Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z Physiol. Chem. 362: 833-839を参照のこと。タンパク質分解性の酵素はまた、アミノ酸を結合するために使用されて、ペプチドを生成する。Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. を参照のこと。或いはペプチドは、細胞の生物化学的機構を使用することにより、或いは生物学的ソースから単離することにより獲得されうる。組換えＤＮＡ技術は、ペプチドの生成のために使用されうる(Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press)。ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーなどの標準技術を使用して単離されうる。
[0253] 好ましくは、抗原は、ペプチド、リピド(例えばコレステロール、脂肪酸、及びリン脂質を除くステロール)、例えばＨ.インフルエンザ・ワクチンにおいて使用される多糖、ガングリオシド、及び糖タンパク質である。これらは、当該技術分野に周知である幾つかの方法を介して得られ、化学又は酵素的方法を使用する単離及び合成を含む。幾つかの場合では、多くのステロール、脂肪酸、及びリン脂質に対しては、該分子の抗原性部分が市販される。
[0254] 対象組成物、及び該組成物を使用する方法に使用されうるウイルス抗原の例は、非限定的にＨＩＶ抗原を含む。そうした抗原は、非限定的にｇｐ１６０、ｇｐ１２０、及びｇｐ４１を含むＨＩＶエンベロープ由来の抗原を含む。ＨＩＶ遺伝子及び抗原に対する多数の配列が知られている。例えば、ロスアラモス国立研究所HIV配列データーベースは、ＨＩＶヌクレオチド及びアミノ酸配列を収集し、キュレーションを行ない、そしてアノテーションを行う。このデーターベースは、インターネットhttp://hiv-web.lanl.gov/、及び年一回の刊行物を介して利用できる。ヒト・レトロウイルス及びＡＩＤＳ大要(例えば、2000年版)を参考のこと。
[0255] 病原体由来の抗原は、当該技術分野に周知である方法を使用して、例えば天然のウイルス又は細菌抽出物から、病原体で感染された細胞から、精製ポリペプチドから、組換え生成されたポリペプチドから、及び/又は合成ペプチドとして獲得されてもよい。
[0256] ＢＩＣｓは、種々の方法において、抗原と組み合わせて投与されうる。幾つかの実施態様では、ＢＩＣと抗原は、互いに空間的に近接されて投与される。以下に記載されるように、空間的な近接は、多くの方法において達成され、例えば複合体形成、キャプシド形成、プラットホームへの固定又は表面上への吸着を介して達成されうる。一の実施態様では、ＢＩＣ及び抗原は、混合体として(例えば溶液中で)投与される。特定の実施態様において、ＢＩＣは免疫原又は抗原に結合されないことが特異的に考慮される。
[0257] 幾つかの実施態様では、ＢＩＣはポリペプチド、例えば抗原に結合される。ＢＩＣ部分は、種々の方法、例えば共有及び/又は非共有相互作用で、核酸成分又は非核酸スペーサー成分を介して、複合体の抗原部分と結合されうる。 幾つかの実施態様では、結合は、反応基、例えば非限定的にチオ、アミン、カルボキシレート、アルデヒド、ヒドラジン、ヒドリゾン、ジスルフィドなどを介する。
[0258] 部分間の結合は、核酸成分の３'又は５'末端で作られうるか、又は核酸成分中の内部の位置で適切に改変された塩基で作られうる。例えば、抗原がペプチドであり、そして適切な反応基(例えばＮ-ヒドロキシルスクシンイミド・エステル)を含むなら、抗原はシトシン残基のＮ4-アミノ基で直接反応されうる。ＢＩＣにおけるシトシン残基の数及び位置に左右されて、１以上の残基での特異的カップリングが達成されうる。
[0259] 或いは、当該技術分野に周知であるように改変オリゴヌクレオシドは、どちらかの末端又はＢＩＣの内部の位置に取り込まれうる。改変オリゴヌクレオシドは保護官能基を含み、脱保護された際に、関心の抗原上に存在しうるか又は関心の抗原に結合される種々の官能基と反応する。
[0260] 抗原がペプチドである場合、複合体のペプチド部分は、核酸成分に結合されるか、又は固体支持化学を通して、スペーサー成分に結合されうる。例えば、ＢＩＣの核酸部分は、支持体上に前以って合成されたポリペプチド部分に付け加えられうる。Haralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 493-499; and Haralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 501-505を参照のこと。
[0261] 代わりに、ＢＩＣは、核酸成分の３'末端から伸張される切断可能なリンカーを介して固体支持体に結合されるように合成されうる。支持体からＢＩＣを化学的に切断する際に、末端チオール基または末端アミノ基は、核酸成分の３'末端に残される(Zuckermann et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 5305-5321; Corey et al., 1987, Science 238 : 1401-1403; Nelson et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 1781-1794)。アミノ改変ＢＩＣをペプチドのアミノ基に結合することは、Benoit et al. (1987) Neuromethods 6: 43-72に記載されるように行われうる。チオール改変ＢＩＣを、ペプチドのカルボキシル基に結合することは、Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues : A Practical Approach, IRL Pressにおいて記載される。核酸成分又は添付のマレイミドを有するスペーサーを、ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖に結合することが記載された(Tung et al. (1991) Bioconjug Chem. 2: 464-465)。
[0262] 複合体のペプチド部分は、アミン、チオール、又はカルボキシル基であって、核酸成分又はスペーサーに(例えば、遊離５'末端、３'末端を介して、改変塩基を介して)取り込まれた基を通して核酸成分の遊離５'末端に結合されうる。
[0263] 都合の良いことに、保護されたアミン、チオール、又はカルボキシルを１の末端に含む結合基と、ホスホラミダイトは、ＢＩＣのヒドロキシ基に共有結合されうる。Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13: 4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2891-2909 ; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164: 336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10283-10299; 並びに米国特許第4,849,513号、第5,015,733号、第5,118,800号、及び第5,118,802号を参照のこと。脱保護に続いて、アミン、チオール、及びカルボキシル官能基は、ＢＩＣをペプチドに共有結合するために使用されうる(Benoit et al. (1987); 及び Sinah et al. (1991))。
[0264] ＢＩＣ抗原複合体は、非共有相互作用、例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、及び/又はファンデルワールス力などを介して形成されうる。
[0265] 非共有結合された複合体は、非共有相互作用、例えばビオチン-ストレプトアビジン複合体を含みうる。ビオチン基は、例えばＢＩＣの改変塩基に結合されうる(Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7643-7651)。ストレプトアビジン成分をペプチド部分中に取り込むことにより、ストレプトアビジン結合ペプチドとビオチン化オリゴヌクレオチドの非共有結合複合体の形成が可能になる。
[0266] 非共有結合は、ＢＩＣと抗原内の残基、例えば荷電アミノ酸とを関連づけるイオン性相互作用を介して、或いはオリゴヌクレオチドと抗原との両者と相互作用できる荷電残基を含むリンカー部分の使用を介しても生じうる。例えば、非共有結合は、一般的に負に荷電されたＢＩＣとペプチドの正に荷電されたアミノ酸残基、例えばポリリジン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジン残基との間で生じうる。
[0267] ＢＩＣと抗原との間の非共有結合は、その天然リガンドとして、ＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して起こってもよい。例えば、そうしたＤＮＡ結合モチーフは、転写因子及び抗ＤＮＡ抗体において見られる。
[0268] ＢＩＣの脂質への結合は、標準方法を使用して形成されうる。これらの方法は、非限定的にオリゴヌクレオチド-リン脂質複合体(Yanagawa et al. (1988) NucleicAcids Symp. Ser. 19: 189- 192)、オリゴヌクレオチド-脂肪酸複合体(Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185: 131-135; and Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156: 220-222)、及びオリゴヌクレオチド-ステロール複合体の合成を含む(Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5728-5731)。
[0269] オリゴヌクレオチドの多糖への結合は、標準周知方法を使用して形成されうる。これらの方法は、非限定的にオリゴヌクレオチド-多糖複合体の合成を含み、ここで該多糖は、免疫グロブリンの成分である(O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7: 347-355. )。
[0270] ペプチド及び別の分子をオリゴヌクレオチドに結合するための更なる方法は、米国特許第5,391,723号において見られる; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids"in Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; and GeogＨＥＧan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3: 138-146。
[0271] ＢＩＣは、別の方法で抗原(単数又は複数)と近位で会合されてもよい。幾つかの実施態様では、ＢＩＣ及び抗原は、近位でカプセル化により会合される。別の実施態様では、ＢＩＣと抗原は、プラットホーム分子に結合することにより近位で会合される。「プラットホーム分子」(「プラットホーム」とも呼ばれる)は、ＢＩＣと抗原(単数又は複数)との結合を可能にする部位を含む分子である。別の実施態様では、ＢＩＣと抗原は、表面、好ましくは担体粒子上への吸着により近位で会合される。
[0272] 幾つかの実施態様では、本発明の方法は、複合体が標的に利用されるまで、ＢＩＣと第一抗原との近位の会合を維持することができるカプセル化剤 (又はそうしたカプセル化剤を含む組成物)を使用する。好ましくは、ＢＩＣ、抗原、及びカプセル化剤を含む組成物は、アジュバント・油入りの水の乳濁液、微小粒子、及び/又はリポソームの形態である。より好ましくは、ＢＩＣをカプセル化するアジュバント・油入りの水乳濁液、微小粒子、及び/又はリポソームは、約０.０４μｍ〜約１００μｍのサイズの粒子の形態であり、好ましくは以下の範囲：約０.１μｍ〜約２０μｍ：約０.１５μｍ〜約１０μｍ；約０.０５μｍ〜約１.００μｍ；約０.０５μｍ〜約０.５μｍの範囲のいずれかである。
[0273] コロイド分散システム、例えばミクロスフィア、ビーズ、マクロ分子複合体、ナノカプセル、及び脂質に基くシステム、例えば油入りの水乳濁液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームは、ＢＩＣを含む組成物を効果的にカプセル化することを提供しうる。
[0274] 組成物のカプセル化は、多種の要素のいずれかをさらに含む。これらは、非限定的に、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造(ＬＭＳ)、ポリエチレン・グリコール(ＰＥＧ)、及び別のポリマー、例えばポリペプチド、グリコペプチド、及び多糖を含む。
[0275] カプセル化要素に適したポリペプチドは、当該技術分野に周知であるもの全てを含み、そして非限定的に脂肪酸結合タンパク質を含む。改変ポリペプチドは、種々の改変のいずれか、例えば非限定的にグリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化、及び水酸化を含む。本明細書中に使用されるように、適切なポリペプチドは、ＢＩＣを含む組成物を保護するポリペプチドであり、その免疫調節活性を保持する。結合タンパク質の例は、非限定的にウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)及びエンドウマメアルブミンなどのアルブミンを含む。
[0276] 別の適切なポリマーは、医薬の分野に周知であるポリマーのいずれかであり、そして非限定的に天然ポリマー、例えばデキストラン、ヒドロキシエチル・スターチ、及び多糖、及び合成ポリマーを含む。天然ポリマーの例は、タンパク質、糖タンパク質、多糖、デキストラン、及び脂質を含む。さらなるポリマーは、合成ポリマーでありうる。本発明での使用に適した合成ポリマーの例は、非限定的に、ポリアルキル・グリコール(ＰＡＧ)、例えばＰＥＧ、ポリオキシエチル化ポリオール(ＰＯＰ)、例えばポリオキシエチル化グリセロール(ＰＯＧ)、ポリトリメチレン・グリコール(ＰＴＧ)ポリプロピレン・グリコール(ＰＰＧ)、ポリヒドロキシエチル・メタクリレート、ポリビニル・アルコール(ＰＶＡ)、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、ポリアミノ酸、ポリウレタン、及びポリホスファゼンを含む。合成ポリマーは、直鎖であるか又は分枝鎖であり、置換又は非置換の同種ポリマー、コポリマー、又は２以上の異なる合成モノマーの保護コポリマーを含みうる。
[0277] 本発明の組成物をカプセル化するために使用するＰＥＧは、化学販売元から購入されるか、又は当業者に周知の技術を使用して合成される。
[0278] 本明細書中で使用される「ＬＭＳ」という用語は、薄膜脂質粒子を意味し、ここで極性脂質の極性頭部は、界面の水層に向うように配列されて、膜構造を形成する。ＬＭＳｓの例は、リポソーム、ミセル、コックリート(cochleates)(つまり円筒状リポソーム)、マイクロエマルジョン、単層小胞、多層小胞などを含む。
[0279] ＢＩＣｓの投与において使用されうるコロイド性の分散システムは、リポソームである。リポソーム中にカプセル化された抗原で免疫化されたマウスにおいて、リポソームは、抗原に対するＴｈ１型免疫応答を高めた(Aramaki et al. (1995) Vaccine 13: 1809-1814)。本明細書中に使用されるとき「リポソーム」又は「脂質小胞」は、少なくとも１及びおそらく１以上の脂質二重膜に囲まれる小さい小胞である。リポソームは、当該技術分野に周知であるのいずれかにより、リン脂質、糖脂質、脂質、ステロイド、例えばコレステロール、関連分子、又はそれらの組合せから人工的に作られ、非限定的に超音波処理、突出処理、又は脂質-界面活性剤複合体から界面活性剤を取り除くことを含む。ＢＩＣｓを細胞にデリバリーする際に使用するためのリポソームの１のタイプは、カチオン性のリポソームである。リポソームは、場合によりさらなる要素、例えば組織標的要素を含む。「脂質膜」又は「脂質二重層」が、脂質のみからなる必要はなく、いずれの適切な他の要素、例えば非限定的にコレステロール及び他のステロイド、脂質可溶化学物質、いずれかの長さのタンパク質、及び他の両親媒性分子をさらに含みうることが理解される。ただし、膜の一般的な構造は疎水性中心を挟み込む２個の親水性表面のシートである。膜構造の一般的な記載については、例えばLasic (1993) "Liposomes : from Physics to Applications"Elsevier, Amsterdamを参照のこと。
[0280] ＢＩＣ含有組成物を含むリポソームの製造方法は、当該技術分野に周知である。脂質小胞は、当該技術分野に周知である他の適切な技術により製造されうる。方法は、非限定的に、マイクロカプセル化、マイクロ流動化、ＬＬＣ法、エタノール注入、フレオン(freon)注入、「泡立て」法、界面活性剤透析、水和、超音波処理、そして逆相蒸発を含む。Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68: 715-724に概説される。最も望ましい特性を有する小胞を提供するために、技術が組み合わされる。
[0281] 本発明は、組織又は細胞標的要素を含むＬＭＳｓの使用を含む。そうした標的要素は、未処理の動物、器官、又は細胞培養に投与されたとき、他の組織又は細胞部位に優先して特定の組織又は細胞でその集積を高めるＬＭＳの要素である。標的要素は、一般的にリポソームの外側から利用可能であり、そしてそれゆえ好ましくは外側表面に結合されるか又は外側脂質二重層中に挿入される。標的要素は、とりわけ、ペプチド、巨大ペプチドの部位、細胞表面分子又はマーカーに特異的な抗体、又はその抗原結合性断片、核酸、炭化水素、炭化水素複合体の一部、特別な脂質、又は低分子、例えば薬、ホルモン、又はハプテンなどあり、前記分子のいずれかに結合される。細胞型特異的細胞表面マーカーに対して特異性を有する抗体は、当該技術分野に周知であり、そして当該技術分野に周知である方法により容易に製造される。
[0282] ＬＭＳｓは、治療処置が方向付けられる細胞型のいずれか、例えば免疫応答を調節し及び/又は免疫応答に関わることができる細胞型に標的されうる。そうした標的細胞及び器官は、非限定的にＡＰＣｓ、例えばマクロファージ、樹上細胞、リンパ球、リンパ組織、例えばリンパ節及び脾臓、並びに非リンパ組織、特に樹上細胞が見られる非リンパ組織を含む。
[0283] 本発明のＬＭＳ組成物は、さらに界面活性剤を含みうる。界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、両親媒性、又は非イオン性でありうる。界面活性剤の好ましいクラスは、非イオン性であり；特に水溶性である界面活性剤が好ましい。
[0284] 幾つかの実施態様では、ＢＩＣと抗原は、タンパク性又は非タンパク性の(例えば、合成)結合価プラットホーム(valency platform)などのプラットホーム分子へ結合することにより近位で会合される。適切なプラットホームの例は、ＢＩＣのスペーサー成分として使用される結合価プラットホームの記載において上記される。抗原を結合価プラットホームに結合することは、ルーチンな方法を使用して行われうる。例として、ポリペプチドは、アミノ、カルボキシル、又はスルフヒドリル基などの官能基であって、ポリペプチドをプラットホームへと結合するための部位として役に立つ官能基を有するアミノ酸側鎖を含む。ポリペプチドがこうした基を含まないならば、そうした官能基を有する残基は該ポリペプチドに加えられることもある。そうした残基は、固相合成技術又は組換え技術により取り込まれてもよく、その両方はペプチド合成分野に於いてよく知られている。ペプチドが炭化水素側鎖(単数又は複数)を含むとき(又は、抗原が炭化水素であるなら)、アミノ、スルフヒドリル、及び/又はアルデヒド官能基は、慣用の化学方法によりその中へ取り込まれうる。例えば、一級アミノ基は、シアノボロ水素化ナトリウムの存在下で、酸化された糖をエチレンジアミンと反応することにより取り込まれ、スルフヒドリルは、システアミン・ジヒドロクロリドを反応させ、続いて標準ジスルフィド還元剤で還元することにより導入されうるか、一方アルデヒド基は、過ヨウ素酸酸化に続いて作られうる。類似の様式で、プラットホーム分子が適切な官能基を有していないならば、プラットホーム分子は、官能基を含むように誘導体化されてもよい。
[0285] 別の実施態様では、ＢＩＣと抗原は、ナノ粒子又はマイクロキャリアなどの表面に吸着することによって、共投与される。ＢＩＣ及び/又は抗原の表面への吸着は、非共有結合を介して生じ、イオン性及び/又は疎水性相互作用を含む。吸着された分子を細胞ヘデリバリーする目的で、ポリヌクレオチド及びポリペプチドを表面に吸着することは、当該技術分野に周知である。例えば、Douglas et al. (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. CarrierSyst. 3: 233-261 ; Hagiwaraetal. (1987) In Vivo 1: 241-252 ; Bousquet et al. (1999) Pharm. Res. 16: 141-147 ;及びKossovsky et al., 米国特許第5,460,831号を参照のこと。好ましくは、吸着表面を含む物質は、生分解性である。
[0286] 一般的に、ナノ粒子の特徴、例えば表面荷電、粒子サイズ、及び分子量は、ポリマー化条件、モノマー濃度、及びポリマー化過程の間の安定化剤の存在に左右される(Douglas et al., 1987、上記)。キャリア粒子の表面は、例えば、表面被膜で改変されて、ＢＩＣ及び/又は抗原の吸着を可能にするか又は高める。吸着されたＢＩＣ及び/又は抗原を伴うキャリア粒子は、さらに別の物質で被膜されうる。そうした別の物質の添加は、対象に投与された粒子の半減期を延長することもあり、及び/又は本明細書中に記載されるように、特異的な細胞型又は組織へ粒子を標的することもある。
[0287] ＢＩＣと抗原が吸着されうるナノ結晶表面が記載された(例えば、米国特許第5,460,831号を参照のこと)。ナノ結晶中心粒子(１μｍ以下の直径を有する)は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び/又は別の医薬薬剤の吸着を促進する表面エネルギー改変層で被膜される。米国特許第5,460,831号において記載されるように、例えば中心粒子は、オリゴヌクレオチドの吸着を促進する表面で被膜され、そして続いて例えば脂質-抗原混合体の形態の抗原調製品で被膜される。そうしたナノ粒子は、ナノメーターサイズ、典型的に０.１μｍのオーダーの粒子の自己集合複合体であり、そしてＢＩＣの内部層と抗原の外部層を有する。
[0288] 別の吸着表面は、アルキルシアノアクリレートのポリマー化により作られるナノ粒子である。アルキルシアノアクリレートは、アニオン性ポリマー化過程により酸性の水媒体中でポリマー化されうる。ポリマー化条件に左右されて、小粒子は、２０〜３０００ｎｍの範囲のサイズを有し、そして特異的表面特性を有し、かつ特異的表面電荷を有するナノ粒子を作ることが可能である(Douglas et al., 1987,上記)。例えば、オリゴヌクレオチドは、疎水性カチオン、例えばテトラフェニルホスホニウム・クロリド又は４級アンモニウム塩、例えばセチルトリメチル・アンモニウム・ブロミドの存在下で、ポリイソブチル-及びポリイソヘキシルシアノアクリレート・ナノ粒子へと吸着されうる。これらのナノ粒子上へのオリゴヌクレオチドの吸着は、核酸鎖の負に荷電されたホスフェート基と疎水性カチオンとの間でイオン対を形成することにより媒介されるようである。例えば、Lambert et al. (1998) Biochimie 80: 969-976, Chavany et al. (1994) Pharm. Res. 11: 1370-1378 ; Chavany et al. (1992) Pharm. Res. 9: 441-449を参照のこと。ポリペプチドは、ポリアルキルシアノアクリレート粒子に吸着されうる。例えばDouglas et al., 1987 ; Schroeder et al. (1998) Peptides 19: 777-780を参照のこと。
[0289] 別の吸着表面は、メチリデン・マロネートのポリマー化により作られるナノ粒子である。例えば、Bousquet et al., 1999,に記載されるように、ポリ(メチリデン・マロネート２.１.２)ナノ粒子に吸着されるポリペプチドは、先ず静電的引力を介し吸着され、そして疎水的引力を介して安定化されるようである。
Ｃ. 更なるアジュバント
[0290] ＢＩＣはまた、アジュバントと組み合わせて投与されてもよい。抗原をＢＩＣ及びアジュバントと投与することは、抗原に対する免疫応答の増強作用を導き、そうしてＢＩＣと抗原のみを含む組成物からもたらされる免疫応答と比べて高められた免疫応答をもたらしうる。当該技術分野に周知であるアジュバントは、非限定的に油入りの水乳濁液、水入りの油乳濁液、ミョウバン(アルミニウム塩)、リポソーム、及びマイクロ粒子を含み、非限定的にポリスチレン、スターチ、ポリホスファゼン、及びポリラクチド/ポリグリコシドを含む。別の適切なアジュバントはまた、非限定的にＭＦ５９、ＤＥＴＯＸ(商標)(Ｒｉｂｉ)、スクアレン混合体(ＳＡＦ-１)、ムラミル・ペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製品、モノホスホリル・リピドＡ、ミコール酸誘導体、非イオン性保護コポリマー界面活性剤、キルＡ(Ｑｕｉｌ Ａ)、コレラ・トキシンＢサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、並びに例えばTakahashi et al. (1990) Nature 344: 873-875により記載された免疫刺激性複合体(ＩＳＣＯＭｓ)、並びに脂質に基くアジュバント及び本明細書に記載される別の物を含む。獣医分野における使用及び動物における抗体の産生のため、フロイントアジュバント(完全及び不完全の両方)のマイトジェン要素が使用されうる。
ＩＶ. 本発明の方法
[0291] 本発明は、動物又は細胞の集合、例えば哺乳動物、場合によりヒトの血液細胞(例えば、ＰＢＭＣｓ、リンパ球、樹上細胞)、気管支肺胞洗浄細胞、又は免疫刺激剤に応答する細胞を含む別の細胞若しくは細胞集合の免疫応答の調節方法であって、該細胞を、ＢＩＣ又は本明細書中で記載されるＢＩＣを含む組成物(例えば、ＢＩＣ、ＢＩＣ及び抗原、ＢＩＣ-抗原複合体、ＢＩＣ/マイクロキャリア複合体など)と接触することによる上記調節方法を提供する。該調節は、接触のいずれの形態により達成され、非限定的にin vitroでの細胞とBICとのコインキュベーション、哺乳動物(例えば実験動物)の肌へのＢＩＣの適用、並びに非経口投与により達成されうる。
[0292] 動物又は細胞集合における免疫応答は、数種の方法で検出され、１以上のＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＰ-１０、ＩＳＧ-５４Ｋ、ＭＣＰ-１、の発現の増加、或いは免疫刺激の特徴である遺伝子発現プロフィールの変化(例えば実施例４３を参照のこと)、並びにＢ細胞増殖及び樹上細胞成熟などの応答を含む。細胞集合での免疫応答を刺激する能力は、例えば免疫抑制剤についてのアッセイシステムにおいて、多くの用途を有する。
[0293] こうして、個体において、好ましくは哺乳動物、より好ましくは人において、免疫応答を調節する方法であって、本明細書中に記載されるＢＩＣを個体に投与することを含む方法を提供する。免疫調節は、Ｔｈ１型免疫応答を刺激し及び/又はＴｈ２型免疫応答を抑制又は低減することを含む。ＢＩＣは、免疫応答を調節するために十分な量で投与される。本明細書中に記載されるように、免疫応答の調節は、液性及び/又は細胞性であり、そして当該技術分野に周知でかつ本明細書中に記載される標準技術を使用して計測される。
[0294] 特定の実施態様では、個体は、Ｔｈ２型免疫応答に関連する疾患、例えば(比限定的に)アレルギー、アレルギー誘導性喘息、アトピー性皮膚炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性食道炎、及びアレルギー性気管支肺アスペルギルス症を患う。ＢＩＣの投与は、免疫調節、１以上のＴｈ１型応答関連サイトカインのレベルの増加をもたらし、ここでこれはアレルゲンに対する個体の応答に関連するＴｈ２型応答特性の低減をもたらしうる。Ｔｈ２型応答関連疾患を患う個体の免疫調節は、疾患の１以上の徴候の低減又は改善をもたらす。疾患がアレルギー又はアレルギー誘導性喘息である場合、１以上の徴候の改善は、以下の：鼻炎、アレルギー性結膜炎、ＩｇＥの循環レベル、ヒスタミンの循環レベル、及び/又は「救助」吸入治療('rescue' inhaler therapy)(例えば、計量された投与量の吸入器又は噴霧器により投与される吸入されたアルブテロール)の必要性うちの１以上を低減することを含む。
[0295] さらなる実施態様では、本発明の免疫調節治療をうける個体は、ワクチンを受けている個体である。ワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンであってもよい。予防ワクチンは、個体が感染の危険性を有しうる疾患に関連する１以上のエピトープを含む(例えば、結核の予防用のワクチンとしてＭ.ツベルクロシス抗原)。治療ワクチンは、個体において発症された特定の疾患に関連する１以上のエピトープ、例えば結核患者におけるＭ.ツベクルロシス(M. tuberculosis)又はＭ.ボビス(M. bobis)の表面抗原、アレルギーにかかる個体においてアレルギー性である抗原(つまり、アレルギー脱感作)、癌を患う個体由来の腫瘍細胞(例えば、米国特許第5,484,596号において記載される)、癌患者における癌関連抗原を含む。ＢＩＣは、ワクチンと組み合わせて(例えば同じ注射又は同時に別々の場所での注射で)与えられるか、又はＢＩＣは、離されて(例えば、ワクチン投与前又は後、少なくとも１２時間で)投与されうる。特定の実施態様では、ワクチンの抗原(単数又は複数)は、ＢＩＣの一部であり、ＢＩＣへの共有結合又は非共有結合により結合される。ワクチンを受けている個体へＢＩＣ療法の施行により、ワクチンに対する免疫応答であって、ＢＩＣを含まないワクチンを受けている個体に比べてＴｈ１型応答へシフトされる応答がもたらされる。Ｔｈ１型応答へのシフトは、
ワクチン中の抗原(単数又は複数)への遅延型過敏性応答、
ＩＦＮ-γ及び他のＴｈ１型応答関連サイトカインの増加、
ワクチンの抗原(単数又は複数)特異的なＩｇＥレベルが低いこと又は該レベルの低下、
ワクチンの抗原(単数又は複数)特異的なＴｈ２関連抗体の低下、及び/又は
ワクチンの抗原(単数又は複数)特異的なＴｈ１関連抗体の増加
により認識されうる。治療ワクチンの場合、ＢＩＣ及びワクチンの投与は、ワクチンが治療することを意図される疾患の１以上の徴候を改善することをもたらす。当業者に明らかであるように、正確な徴候及び改善の程度は、治療されようとする疾患に左右される。例えば、治療用ワクチンが結核用である場合、ワクチンを伴って行うＢＩＣ処置は、咳、胸膜又は胸壁痛、熱、及び/又は当該技術分野に周知である別の症状の低減をもたらす。ワクチンがアレルギー脱感作治療において使用されるアレルゲンである場合、該治療は、アレルギーの症状の低下(例えば鼻炎、アレルギー性結膜炎、ＩｇＥの循環レベル、及び/又はヒスタミンの循環レベルの低下)をもたらす。
[0296] 本発明の組成物は、遺伝的に改変された生物であって、生物戦争又はテロに使用される生物を含む広範な細菌又はウイルス病原体による感染への抵抗性を増大するために予防的に使用されうる。
[0297] 本発明の別の実施態様は、既に存在する疾患又は疾病、例えば癌又は感染性疾患を患う個体を免疫調節治療することに関する。癌は、免疫調節において関心の高い標的である。なぜなら、多くの癌は、体内における他の細胞上で見られない腫瘍関連及び/又は腫瘍特異的抗原を発現するからである。腫瘍細胞に対するＴｈ１型応答の刺激によって、免疫系による直接的及び/又は傍系的腫瘍細胞殺傷がもたらされて、癌細胞の低減及び病徴の低減を導く。癌を有する個体にＢＩＣを投与することにより、腫瘍細胞に対するＴｈ１型免疫応答の刺激がもたらされる。そうした免疫応答は、細胞性免疫系細胞(例えばＣＴＬｓ)又は液性免疫系の要素の直接的作用によって、或いはマクロファージ及びナチュラル・キラー(ＮＫ)細胞を含む免疫系により標的される細胞の近位の細胞上での傍系効果によって、腫瘍細胞を殺傷することができる。例えば、Cho et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18: 509-514を参照のこと。既に存在している疾患又は疾病を治療する際に、ＢＩＣは、別の免疫薬剤、例えばサイトカイン、アジュバント、及び抗体と組み合わせて投与されうる。例えば、ＢＩＣは、腫瘍細胞により提示される抗原に結合する結合剤の投与を含む治療投薬計画の一部として投与されうる。典型的な結合剤は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。標的抗原の例は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＥＲ２、及び当該技術分野に知られるか又は将来発見される別の抗原を含む。理論に束縛されることを意図せず、ＢＩＣは、結合剤が会合される腫瘍細胞の殺傷を高める(例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性及び/又はエフェクター機能により)。結合剤は、例えば放射性同位体、又は結合剤が結合された細胞にダメージを与えるトキシンで場合により標識されうる。ＢＩＣは、該薬剤と組み合わされて(例えば同時に)与えられるか、或いは前若しくは後で(例えば、該薬剤の投与前又は投与後２４時間で)与えられうる。例えば、癌の場合、ＢＩＣは、癌の治療に有効であると知られるか又は思われている化学療法薬剤と組み併せて投与されうる。別の例として、ＢＩＣは、放射線療法、遺伝子治療などと組み合わせて投与されうる。該ＢＩＣは、本明細書中に記載されるもののいずれかでありうる。
[0298] 本発明にしたがった免疫調節治療は、感染性疾患、特に液性免疫応答に抵抗性のある感染性疾患(例えば、マイコバクテリア感染及び細胞内病原体により引き起こされる疾患)を患う個体において使用されうる。免疫調節治療は、細胞性病原体(例えば細菌又は原生動物)により、或いは細胞内病原体(例えばウイルス)により引き起こされる感染性疾患の治療のために使用されうる。ＢＩＣ治療は、マイコバクテリア疾患、例えば結核(例えばＭ.ツベルクロシス及び/又はＭ.ボビス感染)、ハンセン病(つまり、Ｍ.レプラエ(M. leprae)感染)、又はＭ.マリヌーム(M. marinum)若しくＭ.ウルセランス(M. ulcerans)感染などを患う個体に投与されうる。ＢＩＣ治療は、ウイルス感染、例えばインフルエンザ・ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス(ＲＳＶ)、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペス・ウイルス、特に単純疱疹ウイルス、及びパピローマ・ウイルスによる感染などの治療のために使用される。細胞内寄生生物、例えばマラリア(例えばプラスモジウム・ビバックス(Plasmodium vivax)、Ｐ.オベール(P. ovale)、Ｐ.ファルシパルム(P. falciparum)、及び/又はP.マラリア(P.malariae)、レーシュマニア(例えば、 レーシュマニア・ドノバーニ(Leishmania donovani)、L.トロピカ(L. tropica)、L.メキシカーナ(L. mexicana)、Ｌ.ブラジリエンシス(L. braziliensis)、Ｌ.ペルビアナ(L. peruviana)、Ｌ.インファンタム(L. infantum)、Ｌ.チャガシ(L. chagasi)、及び/又はL.アエチオピカ(L. aethiopica)、及びトキソプラスモシス(つまり、トキソプラスモシス・ゴンジー(Toxoplasmosis gondii）による感染)により感染される疾患はまた、ＢＩＣ治療からの利益を受ける。ＢＩＣ治療は、寄生生物疾患、例えば住血吸虫症(つまり、シストソーマ属、例えばS.ヘマトビウム(S. haematobium)、S.マンソーニ(S. mansoni)、S.ジャポニカム(S. japonicum)、及びS.メコンギ(S. mekongi)、及び肝吸虫症(つまり、クロノルキス・シネンシス(Clonorchis sinensis))の治療のために使用されうる。感染性疾患を患う個体に対するＢＩＣの投与は、感染性疾患の病徴の改善をもたらす。幾つかの実施態様では、感染性疾患は、ウイルス疾患ではない。
[0299] 本発明はさらに、個体においてＴｈ１関連サイトカイン、例えばＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ、及びＩＦＮ-αのうちの少なくとも１を増大し、又は刺激する方法を提供する。特定の実施態様では、感染は個体において、特にＩＦＮ-γレベルの増大を必要とする個体において、有効量のＢＩＣを該個体に投与することによって、ＩＦＮ-γを増大し又は刺激する方法を提供する。増大されたＩＦＮ-γを必要とする個体は、ＩＦＮ-γの投与に応答する疾患を有する者である。そうした疾患は、多くの炎症性疾患、例えば非限定的に、潰瘍性大腸炎を含む。そうした疾患はまた、多くの線維症疾患、例えば非限定的に、特発性肺線維症(ＩＰＦ)、強皮症、皮膚への放射線照射誘導性線維症、肝臓線維症、例えば住血吸虫症誘導性肝臓線維症、腎臓線維症、並びにＩＦＮ-γの投与により改善されうる他の病気も含む。ＩＦＮ-γレベルの増加は、１以上の病徴の改善をもたらし、１以上の病徴の安定化をもたらし、又はＩＦＮ-γに応答する疾患の進行の抑制(例えば、さらなる病巣又は病徴の低減又は排除)をもたらしうる。本発明の方法は、疾患に対する標準的なケアを作り出す他の治療、例えば抗炎症剤の投与、例えばＩＰＦにおける副腎皮質ステロイド(例えばコルチゾン)の全身治療と組み合わせて行われうる。
[0300] 特定の実施態様では、本発明は、個体、特にＩＦＮ-αのレベルの増大を必要とする個体においてＩＦＮ-αレベルを増大する方法であって、ＩＦＮαレベルが増大されるようにＢＩＣの有効量を該個体に投与することによる方法を提供する。増大されたＩＦＮ-αを必要とする個体は、組換えＩＦＮ-αを含むＩＦＮ-αの投与に応答する疾患、例えば非限定的にウイルス感染及び癌を有する者である。
[0301] 本発明の特定の実施態様に関して、ＢＩＣを投与することは、ＩＦＮ-αのレベルの増加をもたらし、そして１以上の病徴の改善、１以上の病徴の安定化、ＩＦＮ-αに応答する疾患の進行の抑制(例えば、さらなる病巣又は病徴の低減若しくは排除)をもたらす。本発明の方法は、疾患に対する標準的なケアを作り出す他の治療、例えばウイルス感染に対する抗ウイルス剤の投与などと組み合わせて行われうる。
[0302] ＩｇＥ関連疾患を患う個体において、ＢＩＣの有効量を該個体に投与することにより、ＩｇＥのレベル、特に血清レベルを低減する方法が提供される。そうした方法では、ＢＩＣは単独で(例えば抗原を伴わずに)投与されてもよいし、又はアレルゲンなどの抗原と投与されてもよい。ＩｇＥ関連疾患は、ＩｇＥレベルの低下により改善される病気、疾病、又は一連の病徴である。ＩｇＥの低減は、ＩｇＥ関連疾患の病徴の改善をもたらす。そうした病徴は、アレルギー性の病徴、例えば、鼻炎、結膜炎を含み、アレルゲンへの低減された感受性においては、アレルギーを患う個体においてアレルギーの病徴の低減、又はアレルギー応答の重篤度の低減を含む。
[0303] 本発明の方法は、ＢＩＣ/マイクロキャリア(単数又は複数)の形態で投与される実施態様を含む。
[0304] 幾つかの実施態様では、本発明は、個体におけるＣＴＬ産生を刺激する方法であって、ＣＴＬ産生が増加するように、ＢＩＣの有効量を個体に投与することを含む。
[0305] 当業者に明らかであるように、本発明の方法は、ＢＩＣが投与される特定の適応症についての他の治療と組み合わせて行われてもよいということは当業者に明らかであろう。例えば、ＢＩＣ治療は、クロロキンなどの抗マラリア薬剤と併せてマラリア患者に投与され、ペンタミジン及び/又はアロプリノールなどのレーシュマニア薬と併せてレーシュマニア患者に投与され、イソニアジド、リファンピン、及び/又はエタンブトール等の抗マイコバクテリウム薬と併せて結核患者に投与され、或いはアレルゲン脱感作療法と組み合わせてアトピー(アレルギー)患者に投与されてもよい。
１. 投与及び免疫応答の評価
[0306] ＢＩＣは、本明細書中に記載されるように、医薬及び/又は免疫原及び/又は他の免疫調節剤と組み合わせて投与されうるし、そして物理的に許容されるその担体と組み合わせられうる。
[0307] 例えば、ＢＩＣ又は本発明組成物は、他の免疫治療剤、例えばサイトカイン、アジュバント、及び抗体と併せて投与されうる。ＢＩＣは、該薬剤と併せて(例えば同時に)、或いは前若しくは後で(例えば、該薬剤の投与の２４時間前若しくは後で)与えられうる。ＢＩＣは、本明細書中に記載されるもののいずれかでありうる。
[0308] 全ての免疫調節組成物と同様に、免疫学的に有効な量及び特定のＢＩＣ製剤の投与方法は、個体、治療される病気、及び当業者に明らかな別の因子に基いて変わりうる。考慮される因子は、共投与された抗原の存在、ＢＩＣがアジュバント若しくはデリバリー分子と共に投与されるか又は共有結合されるか否か、投与経路、並びに投与される免疫化投与回数を含む。そうした因子は、当該技術分野に周知であり、そして必要以上の実験をすることなくそうした決定を下すことは、当業者の技術の範囲内である。適切な投与量範囲は、抗原に免疫応答する所望の調節を提供する範囲である。一般的に、投与量は、ＢＩＣの全体量よりはむしろ患者に投与されたＢＩＣの量により決定される。ＢＩＣの典型的な投与量範囲は、デリバリーされるＢＩＣの量で与えられ、例えば以下：１〜５００μｇ/ｋｇ、１００〜４００μｇ/ｋｇ、２００〜３００μｇ/ｋｇ、１〜１００μｇ/ｋｇ、１００〜２００μｇ/ｋｇ、３００〜４００μｇ/ｋｇ、４００〜５００μｇ/ｋｇのいずれかでありうる。各患者に与えられる絶対量は、薬理学性質、例えば生体利用効率、排除率、及び投与経路に左右される。
[0309] 特定のＢＩＣ製剤の有効量及び投与方法は、個々の患者、及び疾患ステージ、及び当業者に明らかな別の因子に基いて変わりうる。特定の用途に適した投与経路(単数又は複数)は、当業者に周知であろう。投与経路は、非限定的に局所的、皮膚、経皮、経粘膜、上皮、非経口、胃腸、及び鼻-咽頭及び肺、例えば経気管支及び経肺胞を含む。適切な投与量範囲は、血液レベルにより計測される約１〜１０μＭの組織濃度を与えるように十分なＢＩＣを含む組成物を提供する範囲である。各患者に与えられる絶対量は、生体利用度、排除率、及び投与経路などの医薬性質に左右される。
[0310] 本明細書中に記載されるとき、高濃度のＡＰＣｓを伴う組織及びＡＰＣｓは、ＢＩＣの好ましい標的である。こうして、ＡＰＣｓが比較的高濃度で存在する場合、ＢＩＣを哺乳動物皮膚及び/又は粘膜へ投与することが好ましい。
[0311] 本発明は、局所投与に適したＢＩＣ製剤、例えば非限定的に生体に受け入れられる移植物、軟膏、クリーム、リンス、及びゲルを提供する。局所投与は、例えば中にデリバリー・システムを分散された包帯剤又は包帯によって、切開又は開放創中へデリバリーシステムを直接投与することによって、又は関心の部位に対する経皮投与手段によって、行われる。中にＢＩＣを分散されたクリーム、リンス、ゲル、又は軟膏は局所的軟膏又は創傷充填剤としての使用に適している。
[0312] 皮膚投与の好ましい経路は、最も浸潤性が少ない経路である。これらの手段の間では、経皮透過、上皮投与、及び皮下注射が好ましい。皮内組織において期待されるＡＰＣｓの高い濃度を達成するためには、これらの手段のなかでは上皮投与が好ましい。
[0313] 経皮投与は、クリーム、リンス、ゲルなどの適用により達成されて、ＢＩＣが皮膚を浸透し、そして血流に入ることを可能にする。経皮投与に適した組成物は、非限定的に医薬として許容される懸濁液、オイル、クリーム、及び軟膏であって、肌に直接適用されるか又は保護担体、例えば経皮装置(いわゆる「パッチ」)中に取り込まれるものを含む。適切なクリーム、軟膏などの例は、例えば医薬品便覧において見つけられる。
[0314] 経皮透過のため、イオントフォレーゼは、適切な方法である。イオントフォレーゼ透過は、市販のパッチであって、数日またはそれ以上の期間、無傷の皮膚を通して連続的に生成物をデリバリーするパッチを使用して達成されうる。この方法の使用は、比較的高い濃度で医薬組成物の制御された透過を可能にし、組合せ薬の注入を許容し、そして吸収プロモーターの同時使用を許容する。
[0315] この方法に使用するための典型的なパッチ製品は、General Medical Company of Los Angeles, CA.のＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ(商標)である。この製品は、電気的に中性ｐＨにリザーバー電極を電子的に維持し、そして異なる濃度の投与量を提供し、連続的及び/又は定期的に投薬するために適用されうる。パッチの調製及び使用は、ＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ製品についてくる製品取扱説明書に従って行われるべきであり；これらの取扱説明書は、本明細書中に援用される。別の密封パッチシステムもまた適切である。
[0316] 経皮透過のために、低周波超音波デリバリーも適切な方法である。Mitragotri et al. (1995) Science 269: 850-853。低周波超音波の振動数(約１ＭＨｚ)は、高分子量のものを含む治療組成物の一般的な制御されたデリバリーを許容する。
[0317] 上皮投与は、刺激に対する免疫応答を引き起こすために、機械的又は化学的に上皮の最も外側の層を刺激することを本質的に含む。特に、刺激は、刺激部位にＡＰＣｓを誘引するために十分であるべきである。
[0318] 典型的な機械的刺激方法は、複数のかなり細い直径の短い針(tine)であって、皮膚を刺激しかつＡＰＣｓを刺激部位に誘引するために使用される針を使用して、ＢＩＣを針の末端から移させる。例えば、Pasteur Merieux of Lyon, Franceにより製造されるＭＯＮＯ-ＶＡＣＣの旧ツベルクリン試験は、ＢＩＣを含む組成物の導入に適した装置を含む。
[0319] (Connaught Laboratories, Inc. of Swiftwater, PAにより米国で流通される)装置は、シリンジ・プランジャーを一の末端に有し、そして針ディスク(tine disk)をもう一方の末端に有するプラスチック・コンテナからなる。針ディクスは、上皮細胞の最も外側の層を傷つけるだけの長さである複数の細い直径の針を支える。ＭＯＮＯ-ＶＡＣＣキットにおける針の各々は、旧ツベルクリンで被膜されており；本発明では、各針は、ＢＩＣ製剤の医薬組生物で被膜される。該装置の使用は、好ましくは、該装置製品に含められた製品取扱説明書に従う。この実施態様で使用されうる類似の装置は、アレルギー試験を行うために現在使用されている装置である。
[0320] ＢＩＣの上皮投与に対する別の適したアプローブは、上皮の最も外側の細胞を刺激する化学物質の使用により行われ、こうしてＡＰＣｓをこの部位に誘引するために十分な免疫応答を引き起こす。一の例は、ケラチン溶解剤(keratinolytic agent)、例えばNoxema CorporationによりNAIR(商標)で売られている市販の局所的脱毛クリームにおいて使用されるサリチル酸などである。このアプローチは、粘膜における上皮投与を達成するためにも使用されうる。化学刺激は、機械的刺激と組み合わせて適用されうる(例えば、MONO-VACC型の針はまた、化学刺激物で被膜される)。ＢＩＣは、化学刺激物を含む担体内で懸濁されるか、又はそれらと共投与されうる。
[0321] 投与の非経口経路は、非限定的に電気(イオントフォレーゼ)、または直接注射、例えば中心静脈ラインへの直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下注射を含む。非経口投与に適したＢＩＣの製剤は、一般的にＵＳＰ水又は注射用の水で一般的に剤形され、そしてさらにｐＨ緩衝液、塩バルク剤、保存剤、及び他の医薬として許容される賦形剤をさらに含みうる。非経口注射のためのＢＩＣｓは、医薬として許容される滅菌等張溶液、例えば生理食塩水、及び注射のためのリン酸緩衝生理食塩水で剤形されうる。
[0322] 投与の胃腸経路は、非限定的に摂食及び直腸投与経路を含む。本発明は、直腸投与に適したＢＩＣ製剤を含み、非限定的に医薬として許容される摂食のための粉末、ピル、又は液体、及び直腸投与のための座剤を含む。当業者に明らかであるように、ピル又は座剤は、さらに医薬として許容される固体、例えばスターチを含み、組成物に大きさを与える。
[0323] 鼻-咽頭及び肺投与は、吸入により達成され、そして経鼻、経気管支、及び経肺胞の経路を含む。本発明は、吸入による投与に適したＢＩＣの製剤、例えば非限定的にエアロゾルを形成するための液体懸濁液、並びに乾燥粉末吸入デリバリーシステムのための粉末形態を含む。ＢＩＣ製剤の吸入による投与のために適した装置は、非限定的にアトマイザー、バポライザー、ネブライザー、及び乾燥粉末吸入デリバリー装置を含む。
[0324] デリバリー経路の選択は、誘発された免疫応答を調節するために使用されうる。例えば、インフルエンザ・ウイルス・ベクターが筋肉内又は上皮(遺伝子銃)経路を介して投与された場合、ＩｇＧタイター及びＣＴＬ活性は等しいが；しかしながら、筋肉接種は主にＩｇＧ２ａを産生し、一方上皮経路は主にＩｇＧ１を産生した(Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70: 6119-6125)。こうして、当業者は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与の異なる経路により誘発される免疫原性における少しの違いを巧みに利用しうる。
[0325] 上記組成物及び投与方法は、非限定的に本発明のＢＩＣの製剤の投与方法を記載することを意味する。種々の組成物及び装置を生成する方法は、当業者の能力の範囲内であり、そして本明細書中に詳細には記載されない。
[0326] ＢＩＣに対する免疫応答の分析(定性及び定量の両者)は、当該技術分野に周知である方法のいずれか、例えば非限定的に抗原特異的抗体産生の計測(特異的抗体＋サブクラスの計測を含む)、リンパ球、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＣＴＬｓの特定集団の活性化、サイトカイン、例えばＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-α、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-１０、又はＩＬ-１２などの産生、及び／又はヒスタミンの放出を計測することにより行われうる。特異的抗体応答を計測する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を含み、そして当該技術分野に周知である。リンパ球の特定の型、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞の数の計測は、例えば蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)で達成されうる。細胞毒性及びＣＴＬアッセイは、例えばRaz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 9519-9523 and Cho et al. (2000)に記載されるように行われうる。サイトカイン濃度は、例えばＥＬＩＳＡにより計測されうる。免疫原に対する免疫応答を評価するためのこれらの及び別のアッセイは、当該技術分野に周知である。例えば、SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (1980) Mishell and Shiigi, eds., W. H. Freeman and Co. を参照のこと。
[0327] 好ましくは、Ｔｈ１型応答は、刺激、つまり誘発及び／又は亢進される。本発明に関して、Ｔｈ１型免疫応答の刺激は、ＢＩＣで治療されていないコントロール細胞に対して、ＢＩＣで治療された細胞からのサイトカイン産生を計測することにより、in vitro又はex vivoで決定されうる。細胞のサイトカイン産生を測定するための方法は、本明細書中に記載される方法及び当該技術分野に周知である方法を含む。ＢＩＣ治療に応答して産生されるサイトカインのタイプは、Ｔｈ１型又はＴｈ２型に偏った細胞による免疫応答を示す。本明細書中に使用されるとき、「Ｔｈ１型に偏った」サイトカイン産生という用語は、刺激の非存在下でＴｈ１型免疫応答と関連するサイトカインの産生に対して、刺激剤の存在下でそうしたサイトカインの産生が計測できるほど増大することを指す。そうしたＴｈ１型に偏ったサイトカインの例は、非限定的にＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ、ＩＦＮ-αを含む。対照的に、「Ｔｈ２型に偏ったサイトカイン」は、Ｔｈ２型免疫応答に関連するサイトカインを指し、非限定的にＩＬ-４、ＩＬ-５、及びＩＬ-１３を含む。ＢＩＣ活性の決定に有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主から単離された初代細胞、及び／又は細胞系列、好ましくはＡＰＣｓ及びリンパ球、さらに好ましくはマクロファージ及びＴ細胞を含む。
[0328] ＢＩＣで治療された宿主において計測されるＴｈ１型免疫応答の刺激は、当該技術分野に周知である方法のいずれかにより、例えば非限定的に：
(１)抗原チャレンジ前と後に計測されるＩＬ-４又はＩＬ‐５のレベルの低下；
つまり、ＢＩＣで処理されないコントロールであって、抗原刺激されるか又は抗原刺激及びチャレンジされたコントロールに比較して、ＢＩＣで処理された宿主においてＩＬ-４又はＩＬ-５のレベルの低下(又は該レベルがほぼないこと)を検出すること；
(２)抗原チャレンジの前と後で、ＩＬ-１２、ＩＬ-１８、及び／又はＩＦＮ(α、β、又はγ)のレベルの増加；
つまり、ＢＩＣで処理されないコントロールであって、抗原刺激されるか又は抗原刺激及びチャレンジされたコントロールに比較して、ＢＩＣで処理された宿主においてＩＬ‐１２、ＩＬ-１８、及び／又はＩＦＮ(α、β、又はγ)の高いレベルを検出すること；
(３) ＢＩＣでなしで処理されたコントロールに比較して、ＢＩＣで処理された宿主において「Ｔｈ１型に偏った」抗体産生；及び／又は
(４)抗原チャレンジの前と後で計測される抗原特異的ＩｇＥのレベルの低下；
つまり、ＢＩＣで処理されないコントロールであって、抗原刺激されるか又は抗原刺激及びチャレンジされたコントロールに比較して、ＢＩＣで処理された宿主において抗原特異的ＩｇＥのレベルの低下を検出すること；
により測定されうる。種々のこれらの測定は、in vitro又はex vivoにおいて、本明細書中に記載される方法又は当該技術分野に周知である方法のいずれかを使用して、ＡＰＣｓ及び／又はリンパ球、好ましくはマクロファージ及び／又はＴ細胞により作られるサイトカインを計測することにより成されうる。これらの測定の幾つかは、本明細書中に記載される方法又は当該技術分野に周知である方法のいずれかを使用して、抗原特異的抗体のクラス及び／又はサブクラスを計測することにより成されうる。
[0329] ＢＩＣ処理に応答して産生される抗原特異的抗体のクラス及び／又はサブクラスは、Ｔｈ１型又はＴｈ２型に偏った細胞による免疫応答を示す。本明細書中に使用されるとき、「Ｔｈ１型に偏った」抗体産生という用語は、Ｔｈ１型免疫応答に関連する抗体(つまり、Ｔｈ１関連抗体)の産生の計測できるほどの増加を指す。１以上のＴｈ１関連抗体は、計測されうる。そうしたＴｈ１型に偏った抗体の例は、非限定的にヒトＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ３(例えば、 Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47: 575-581 and de Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83: 160-164)並びにマウスＩｇＧ２ａを含む。対照的に「Ｔｈ２-型に偏った抗体」は、Ｔｈ２型免疫応答に関連する抗体を指し、そして非限定的にヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４、及び／又はＩｇＥ(例えばWidhe et al. (1998) and de Martino et al. (1999)を参照のこと)、並びにマウスＩｇＧ１及び／又はＩｇＥを含む。
[0330] ＢＩＣの投与の結果として生じるＴｈ１型に偏ったサイトカイン誘導は、高められた細胞免疫応答、例えばＮＫ細胞、細胞傷害性キラー細胞、Ｔｈ１ヘルパー、及び記憶細胞により行われうる応答を作り出す。これらの応答は、ウイルス、真菌、原生動物寄生生物、細菌、アレルギー性疾患、及び喘息、並びに腫瘍に対する防御又は治療のワクチン化における使用のために、特に有益である。
[0331] 幾つかの実施態様では、Ｔｈ２応答は抑制される。Ｔｈ２応答の抑制は、例えばＴｈ２関連サイトカイン、例えばＩＬ-４及びＩＬ-５のレベルの低減、並びにＩｇＥ低減及びアレルゲンに応答したヒスタミン放出の低減により測定されてもよい。
Ｖ. 本発明のキット
[0332] 本発明は、キットを提供する。特定の実施態様では、本発明のキットは、ＢＩＣを含む１以上のコンテナを含む。キットはさらに、適切な一組の説明書、一般的に書面の説明書であって、意図された治療(例えば、免疫調節、感染疾患の病徴の改善、ＩＦＮ‐γレベルの増加、ＩＦＮ‐αレベルの増加、又はＩｇＥ関連疾患の改善)のためのＢＩＣの使用に関する説明書をさらに含みうる。
[0333] キットは、いずれかの都合の良い適切なパッケージング内にパッケージされるＢＩＣを含みうる。例えば、ＢＩＣが、乾燥製剤(例えばフリーズドライ又は乾燥粉末)であるなら、弾力のあるストッパーを備えるバイアルが通常使用され、その結果ＢＩＣは、容易に弾力性のあるストッパーを通して液体を注入することにより容易に再懸濁されうる。弾力性がなく取り外し可能なクローザー(例えば、密閉ガラス)又は弾力性のあるストッパーを備えるアンプルは、ＢＩＣの液体製剤用に最も便利に使用される。特定の装置、例えば吸入器、鼻投与装置(例えば、アトマイザー)、またはミニポンプなどの輸液用器具と組み合わせて使用するためのパッケージも考慮される。
[0334] ＢＩＣの使用に関する説明書は、投与量、投与スケジュール、及び意図された治療のための投与経路を一般的に含む。ＢＩＣの容器は、単位投与量、バルクパッケージ(例えば、多投与パッケージ)、又はサブ-ユニット投与量であってもよい。本発明のキットに提供された説明書は、ラベル上の文書の説明書又はパッケージ内の説明書(例えば、キット内に入れられた紙)であるが、機械が読み取り可能な説明書(例えば、磁気又は光学記憶ディスク)もまた許容される。
[0335] 幾つかの実施態様では、該キットは、さらに抗原(又は１以上の抗原)を含み、該抗原は、ＢＩＣ(単数又は複数)と同じ容器(製剤)内にパッケージされてもよいしされなくてもよい。抗原は、本明細書中に記載された。
[0336] 特定の実施態様では、本発明のキットは、ＢＩＣ／マイクロキャリア複合体(ＢＩＣ／ＭＣ)の形態でＢＩＣを含み、そしてさらに一組の説明書、一般的に書面の説明書であって、意図された治療(例えば、免疫調節、感染疾患の病徴の改善、ＩＦＮ‐γレベルの増加、ＩＦＮ‐αレベルの増加、又はＩｇＥ関連疾患の改善)のためのＢＩＣ／ＭＣ複合体の使用に関する説明書をさらに含みうる。
[0337] 幾つかの実施態様では、ＢＩＣ／ＭＣ複合体を製造するための材料を含む本発明のキットは、ＢＩＣ及びＭＣの分けられた容器を一般的に含み、しかしながら、特定の実施態様では、前以って形成されたＭＣであるよりはむしろ、ＭＣを製造するための材料は提供される。ＢＩＣとＭＣは、好ましくは提供されたＢＩＣとＭＣとを混合すると、ＢＩＣ／ＭＣ複合体の形成を許容する形態で提供される。この立体配置は、ＢＩＣ/ＭＣ複合体が非共有結合により結合される場合に好ましい。この立体配置はまた、ＢＩＣとＭＣが異種二官能基架橋剤を介して架橋される場合に好ましく、ＢＩＣ又はＭＣのいずれかは、「活性化形態」（例えば、異種二官能基架橋剤に結合され、その結果ＢＩＣと反応性のある成分が利用できる形態)で提供される。
[0338] 液相ＭＣを含むＢＩＣ／ＭＣ複合体についてのキットは、液相ＭＣを製造するための材料を含む１以上の容器を好ましくは含む。例えば、油入りの水乳濁液ＭＣのＢＩＣ／ＭＣキットは、油層及び水層を含む１以上の容器を含みうる。容器の中身は、ＭＣを作り出すために乳濁化されて、ＭＣを作り出し、該ＭＣは、次にＢＩＣ、好ましくは疎水性成分を取り込むように改変されたＢＩＣと混合されてもよい。そうした材料は、油入りの水乳濁液の製造のため、油と水を含むか、或いは凍結乾燥されたリポソーム要素(例えば、リン脂質、コレステロール、及び界面活性剤)と水相(例えば医薬として許容される水緩衝液)の１以上の容器を含む。
ＶＩ. 実施例
[0339] 以下の実施例は、非限定的に本発明を例示するために提供される。
実施例１：２'デオキシウリジンに基く分枝点ヌクレオシドとヘキサエチレン・グリコール・スペーサー成分を含むＢＩＣの合成
[0340] 以下の：
Figure 2006516099
 で表される構造を有する分枝点免疫調節化合物、Ｂ０７を合成した。Ｂ０７の核酸成分は、ＤＮＡであり、そしてｂＮは２'デオキシウリジンの５位に結合される６‐ヒドロキシ-１-アミノへキシル-３(Ｅ)‐アクリルアミド(ＡＨＡ)‐ＳＭ要素を含む２'デオキシウリジン(Ｕ‐ＡＨＡ；Biosearch Technologies)である。図１Ａを参照のこと。ＮＡＭｓ及びｂＮは、上記の構造において表されるように、ヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)とＡＨＡ‐ＳＭ要素を介して結合される。ＨＥＧ要素とＮＡＭとの間の結合、ＨＥＧ要素とｂＮとの間の結合、及びＡＨＡとＨＥＧ要素との間の結合は、ホスホロチオエート・ジエステルであった。核酸成分の合成は、５'‐Ｏ‐(４,４'‐ジメチオキシトリチル)‐３'‐(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト(5'-O-(4,4'-dimethyoxytrityl)-3'-(N,N'-diisopropyl)2-cyanoethylphosphoramidite）保護されたヌクレオシド・モノマーを使用して３’から５’の方向であった。
[0341] 分枝点ヌクレオシドへの結合点は以下の通りである：
５'＝５'-ＯＨを介した結合
３'＝３'-ＯＨを介した結合
ｂ＝塩基を介した結合、この場合、結合は、２'-ｄＵ分枝点ヌクレオシドの５位に共有結合されるＡＨＡ基を介する。
[0342] Perseptive Biosystems Expedite 8909自動化ＤＮＡ合成機を使用して、１５μｍｏｌのホスホロチオエートＤＮＡについての製品プロトコルについて特定の改変を行ったものを使用して、Ｂ０７を合成した。ヌクレオシドモノマーのホスホラミダイト形態、ヘキサエチレン・グリコール・スペーサー(４,４'-Ｏ-ジメトキシトリチル-ヘキサエチレン・グリコール-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト、ＤＭＴ-ＨＥＧ-ＣＥＰと略す、ChemGenes, Ashland, MA)、及びＴ-Ｃ６分枝点ヌクレオシド・モノマー(５-(Ｎ-(６-Ｏ-レブリノイル-１-アミノヘキシル)-３(Ｅ)-アクリルアミド-５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-デオキシウリジン、５'-ＤＭＴ-ＴＣ６-Ｏ-Ｌｅｖ３'-ＣＥＰと略す、Biosearch Technologies, Novato, CA)を、アセトニトリル中に０.１Ｍの濃度で溶解した。９：１アセトニトリル：ピリジン中の水素化キサンタン(xanthane）の０.０２Ｍ溶液を、ホスファイト・トリエステル基をホスホロチオエート結合へと硫化するために使用した。
[0343] 核酸成分、スペーサー成分、及び分枝点ヌクレオシドを加えるために、以下の順番でＤＮＡ合成機をプログラムした。
１. ３'-で支持体に結合された「Ｔ」固体支持体を使用し、
２. ５'-ＴＣＧＡＣＧ-３'を合成し
３. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え
４. Ｕ‐ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドを加え、
５. 以下に記載されるように、水素化ヒドラジンでレブリニル基を取り除き、
６. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
７. ５'‐ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を合成する。
[0344] 標準合成サイクルは、脱トリチル化ステップ、カップリング・ステップ(ホスホラミダイト・モノマー＋１Ｈ‐テトラゾール)、キャッピング・ステップ、硫化ステップ、及び最終キャッピング・ステップからなった。Ｕ‐ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドを加える合成サイクルを完了した後に、カラムを合成機から取り出し、そして３：２ピリジン：酢酸／ｐＨ５.１(１０ｍｌ)中の０.５Ｍ水素化ヒドラジンで５分処理して、レブリニル基を取り除いた。固体支持体をアセトニトリルでよく洗浄し(２×２０ｍｌ)、そして合成が完了するまで、ＤＮＡ合成機に戻した。ステップ６及び７について、合成サイクルにおける各試薬のデリバリーは、２倍にされた。なぜなら、２個の鎖が同時に作られるからである。組み立てが終了した際、「トリチル-オン」化合物を制御されたガラス固体支持体から切断し、そして塩基を、５８℃で１６時間濃アンモニア水で脱保護した。
[0345] ０.１M酢酸トリエチルアンモニウム／pH７.０中のアセトニトリルの増加勾配を使用して、ＢＩＣを、ＰＬＲＰ‐Ｓカラム(１００Ａ、８ｕ、７５×３００ｍｍ、Polymer,Labs, Amherst, MA)上でＲＰ‐ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含む分画を、吸引下で乾燥して、８０％酢酸水溶液で１５分間脱トリチル化し、そして０.６M酢酸ナトリウム／ｐＨ５.１から、２.５量の冷９５％エタノールで沈殿させた。沈殿形成を１回繰り返し、そしてＢＩＣを滅菌水中で溶解し、続いて希釈サンプルの２６０ｎｍで吸光度を読み取った。化合物を粉末になるまで凍結乾燥した。
[0346] BICをキャピラリーゲル電気泳動、電子スプレー・マス・スペクトロメトリー、及びＲＰ‐ＨＰＬＣにより性質決定を行なって、組成と純度を確かめた。エンドトキシン含有量アッセイ(LALアッセイ、 Bio Whittaker)も行ない、エンドトキシンレベルが、５ＥＵ／ｍｇ化合物未満であることを示した(つまり、実質的に、エンドトキシン・フリー)。
実施例２：２'デオキシシチジン-に基づく分枝点ヌクレオシドとヘキサエチレン・グリコール・スペーサーの合成
[0347] 分枝状免疫調節化合物Ｂ０８は、以下：
Figure 2006516099
 に示される構造を有する。Ｂ０８の核酸成分はＤＮＡであり、そしてｂＮは、５‐メチル-２'‐デオキシシチジンのＮ４位に結合されるジエチレン・グリコール(ＤＥＧ)‐ＳＭ要素を含む５‐メチル-２'‐デオキシシチジンである(ｍｄＣ‐ＤＥＧ；Biosearch Technologies)。図１Ｅを参照のこと。以下の構造に示されるように、ＮＡＭｓとｂＮは、ヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)とＤＥＧ-ＳＭ要素を介して結合される。ＨＥＧ要素とＮＡＭとの間の結合、ＨＥＧ要素とｂＮとの間の結合、並びにＤＥＧとＨＥＧ要素との間の結合は、ホスホロチオエート・ジエステルである。核酸成分の合成は、５'‐Ｏ‐(４,４'‐ジメチオキシトリチル)‐３'‐(Ｎ,Ｎ'‐ジイソプロピル)２‐シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して、３'から５'方向に行うことを含む。
[0348] 分枝点ヌクレオシドへの結合点は以下の通りである：
５'＝５'-ＯＨを介した結合
ｂ＝塩基を介した結合、この場合、結合は、Ｃ分枝点ヌクレオシドのＮ４位に結合されるジエチレン・グリコール(ＤＥＧ)を介して結合される
３'＝３'-ＯＨを介した結合
[0349] Ｂ０８は、実施例１に記載されるとおりに合成される。Ｕ‐ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドは、ｍｄＣ‐ＤＥＧ分枝点ヌクレオシド(Ｎ４-(６-Ｏ-レブリノイル-１-ジエチレン・グリコール)-５-メチル-５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-デオキシシチジン、５'-ＤＭＴ-ｍｄＣ(ＴＥＧ-Ｏ-Ｌｅｖ)３'-ＣＥＰと略する、Biosearch Technologies)で置換される。
[0350] 精製及び分析は、実施例１で記載されるとおりに行われる。
実施例３:３'-末端を介して結合される全ての核酸成分を伴い、かつ２'-デオキシウリジン-に基く分枝点ヌクレオシド及びヘキサエチレン・グリコール・スペーサーを含むＢＩＣの合成
[0351] 分枝点免疫調節化合物Ｂ０１は、以下：
Figure 2006516099
 に示される構造を有する。Ｂ０１の核酸成分はＤＮＡであり、かつｂＮが２'‐デオキシウリジンの５位に結合される６‐ヒドロキシ-１‐アミノへキシル-３(Ｅ)‐アクリルアミド(ＡＨＡ)‐ＳＭ要素を含む２'‐デオキシウリジン(Ｕ-ＡＨＡ；Biosearch Technologies)である。図１Ａを参照のこと。上記の構造に示されるように、ヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)及びＡＨＡ‐ＳＭ要素を介してＮＡＭｓとｂＮは結合される。ＨＥＧ要素とＮＡＭとの間の結合、ＨＥＧ要素とｂＮとの間の結合、並びにＡＨＡとＨＥＧ要素との間の結合は、ホスホロチオエート・ジエステルである。
[0352] 分枝点ヌクレオシドへの結合点は以下の通りである：
５'＝５'-ＯＨを介した結合
ｂ＝塩基を介した結合、この場合、結合は、ＡＨＡ基を介して、２'ｄＵ分枝点ヌクレオシドの５位に共有結合される。
３'＝３'-ＯＨを介した結合
[0353] Ｂ０１は、以下の改良点を伴い実施例１に記載されるように合成される。核酸成分、スペーサー成分、及び分枝点ヌクレオシドを加えるために、以下の順番で装置をプログラムした。
１. ５'-で支持体に結合された「Ｔ」固体支持体を使用し、
２. ３'‐Ｏ‐(４,４'‐ジメチオキシトリチル)‐５'‐(Ｎ,Ｎ'‐ジイソプロピル)２‐シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して３'-ＴＧＣＡＧＣ‐５'を合成し(５'から３'方向への合成)、
３. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
４. Ｕ‐ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドを加え、
５. 以下に記載されるように、水素化ヒドラジンでレブリニル基を取り除き、
６. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
７. ５'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-３'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して、５'‐ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を合成する(３’から５’方向への合成）。
[0354] ステップ２について、３'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-５'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマー((Glen Research, Sterling, VA)を使用して、合成は５'から３'方向へと進む。ステップ７について、５'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-３'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して、合成は３'から５'方向へと進む。ステップ６及び７について、合成サイクルにおける各試薬デリバリーは、２倍にされた。なぜなら、２個の鎖が同時に作られるからである。
[0355] 精製及び分析は実施例１に記載される通りに行う。
実施例４：アデノシン分枝点ヌクレオシド及びヘキサエチレン・グリコール・スペーサーを含むＢＩＣの合成
[0356] 以下：
Figure 2006516099
 に示される構造を有する分枝状核酸分子、Ｂ０９を、Braich and Damha, Bioconjugate Chem., 1997,8 : 370-377において記載される方法を実質的に使用して合成した。核酸成分はＤＮＡであり、スペーサー成分はヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)であり、そして分枝点ヌクレオシドはアデノシンである(ｒＡ)。ヌクレオシド、スペーサー、及び分枝点ヌクレオシド間の結合は、全てホスホロチオエート・エステルである。核酸成分の合成は、５'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-３'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して、３'から５'方向であった。
[0357] 分枝点ヌクレオシドへの結合点は、以下の通りである：
５'＝５'ＯＨを介した結合
３'＝３'ＯＨを介した結合
２'＝２'ＯＨを介した結合
[0358] Perseptive Biosystems Expedite 8909 自動化ＤＮＡ合成機を使用し、１５μｍｏｌホスロチオエートＤＮＡに対する製品プロトコルであって、特定の改変を行ったものを使用して、Ｂ０９を合成した。ヌクレオシド・モノマーのホスホラミダイト形態、ヘキサエチレン・グリコール・スペーサー(ＤＭＴ-ＨＥＧ-ＣＥＰ、ChemGenes, Ashland, MA)、及びｒＡ分枝点ヌクレオシド・モノマー(５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル)(２-シアノエチルホスホラミダイト)-２'-ｔ-ブチルジメチルシリル-アデノシン、５'-ＤＭＴ-Ａ-２'-ＴＢＤＭＳ-３'-ＣＥＰと略する、Glen Research, Sterling, VA)を、アセトニトリル中に０.１Ｍの濃度で溶解した。ＤＭＴ-ＨＥＧ-ＣＥＰの０.３Ｍ溶液を、２'-ＯＨ基へとカップリングするために調製した。９：１のアセトニトリル：ピリジン中の水素化キサンタンの０.０２Ｍ溶液を、ホスファイト・トリエステル基をホスホロチオエート結合へと硫化するために使用した。
[0359] 核酸成分、スペーサー成分、及び分枝点ヌクレオシドを加えるために、以下の順番でＤＮＡ合成機をプログラムした。
１. ３'-で支持体に結合された「Ａ」固体支持体を使用し、
２. ５'-ＴＣＧＴＣＧ-３'を合成し、
３. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
４. ｒＡ分枝点ヌクレオシドを加え(３'結合)、
５. 以下に記載されるように、４：６トリエチルアミン：アセトニトリルで、シアノエチル保護基を取り除き、
６. 以下に記載されるように、１Ｍ・ＴＢＡＦを含むＴＨＦで２'-シリル保護基を取り除き、
７. アセトニトリル中の０.３Ｍ溶液、及び３０分のカップリング時間を使用して、ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを２'ＯＨに加え、
８. ５'‐ＴＣＧＴＣＧＡ-３'を合成する。
[0360] ｒＡ分枝点ヌクレオシドを加えた合成サイクルが完了した後で、カラムを合成機から取り出し、そして４：６トリエチルアミン：アセトニトリル(ｖ/ｖ)で９０分間処理して、シアノエチルホスフェート保護基を取り除いた。固体支持体を、アセトニトリル(２×２０ｍｌ)で洗浄し、そして次に２'-シリル保護基を、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)(１０ｍｌ)中の１Ｍテトラブチルアンモニウム・フルオリド(ＴＢＡＦ)で１０分間処理することにより取り除いた。固体支持体をＴＨＦで洗浄し(２×２０ｍｌ)そしてアセトニトリルで洗浄した(２×２０ｍｌ)。ステップ６及び７で、カラムを合成機に再設置し、ここで合成サイクルにおける各試薬デリバリーは２倍にされた。なぜなら２個の鎖が同時に作られるからである。また、ステップ６で、ＨＥＧホスホラミダイトの濃度は、０.３Ｍまで増加され、そして２'部位での立体障害のためカップリング時間は３０分であった。ステップ７でのカップリングは、通常０.１Ｍホスホラミダイト・モノマーとカップリング時間(２分)を使用した。
[0361] 脱保護、精製、及び分析を実施例１に記載されるように行った。
実施例５：アデノシン分枝点ヌクレオシドを含み、分枝点ヌクレオシドに直接結合される３種の異なる核酸成分を伴うＢＩＣの合成
[0362] 以下で示される構造を有する分枝状免疫調節化合物Ｂ１０を、アデノシン分枝点ヌクレオシドの３'ＯＨに結合される核酸成分が、アデノシン分枝点ヌクレオシドの２'ＯＨに結合される核酸成分と相補的であり、最初の数塩基がループ構造の一部となるように、設計した。それゆえ、塩緩衝液の存在下で、アデノシンの２'-及び３'-位に結合される２個の核酸成分は、ワトソン-クリック塩基対を介してハイブリッド形成することが予期される。
[0363] Bioconjugate Chem., 1997,8 : 370-377において実質的に記載され、そして実施例４において記載される方法であって、以下に記載する例外を伴う方法を使用して、Ｂ１０(配列番号１３５、１３６、及び１３７)を合成した。核酸成分はＤＮＡであり、そして分枝点ヌクレオシドはアデノシン(ｒＡ)である。ヌクレオシドと分枝点ヌクレオシドとの間の結合は、全てホスホロチオエート・エステルである。核酸成分の合成は、５'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-３'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシドモノマーを使用して、３'から５'の方向であった。
Figure 2006516099
[0364] 核酸成分と分枝点ヌクレオシドを加えるために、ＤＮＡ合成機を幾何の順番でプロブラムした。
１. ３'で支持体に結合される「Ａ」固体支持体を使用し、
２. ５'-ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡ-ｒＡ-ＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧ-３'(配列番号１３８)を合成し、
３. 脱トリチル化し、そして５'末端をキャッピングし、
４. 以下に記載されるように、４：６のトリエチルアミン：アセトニトリルでシアノエチル保護基を取り除き、
５. 以下に記載されるように、ＴＨＦ中の１Ｍ・ＴＢＡＦで２'シリル保護基を取り除き、
６. 以下に記載されるように、アセトニトリル中の０.３Ｍ溶液及び３０分のカップリング時間を使用して、Ｔホスホラミダイトを２'ＯＨに加え、
７. ５'-ＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡ-３'(配列番号１３９)を合成する。
[0365] ステップ２を完了後、４,４'-ジメトキシトリチル基を核酸成分の５'末端から取り除き、そして遊離の５'ＯＨをピリジン/ＴＨＦ中の無水酢酸とＮ-メチルイミダゾールの混合液でキャップした。次にカラムを合成機から取り外し、そして４：６のトリエチルアミン：アセトニトリル(ｖ/ｖ)で、９０分間処理して、シアノエチル・ホスフェート保護基を取り除いた。固体支持体をアセトニトリルで洗浄し(２×２０ｍｌ)、そして次に２'シリル保護基を、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)(１０ｍｌ)中の１Ｍテトラブチルアンモニウム・フルオリド(ＴＢＡＦ)で１０分間処理することにより取り除いた。固体支持体をＴＨＦで洗浄し(２×２０ｍｌ)、そしてアセトニトリルで洗浄した(２×２０ｍｌ)。ステップ６及び７で、カラムを合成機に再設置した。ステップ６では、Ｔホスホラミダイトの濃度を０.３Ｍに増大し、そしてカップリング時間は３０分であった。ｒＡの２'部位は、立体的に障害されるからである。ステップ７におけるカップリングは、通常濃度のホスホラミダイト・モノマー(０.１Ｍ)及びカップリング時間(２分)を使用した。
[0366] 脱保護、精製、及び分析を、実施例１に記載されるように行った。
実施例６：くし構造を有する分枝状ＢＩＣの製造
[0367] 分枝状免疫調節化合物Ｂ０２とＢ０３の構造は、以下及び図５と６に示される。Ｂ０２及びＢ０３の核酸成分はＤＮＡであり、そしてｂＮは、２'デオキシウリジンの５位に結合された６-ヒドロキシ-１-アミノヘキシル-３(Ｅ)-アクリルアミド(ＡＨＡ)-ＳＭ要素を含む２'-デオキシウリジン(Ｕ-ＡＧＡ；Biosearch Technologies)である。図１Ａを参照のこと。以下の構造に示されるように、ヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)及びＡＨＡ-ＳＭ要素を介して、ＮＡＭｓとｂＮは結合される。ＨＥＧ要素とＮＡＭとの間の結合、ＨＥＧ要素とｂＮとの間の結合、及びＡＨＡとＨＥＧ要素との間の結合は、ホスホロチオエート・ジエステルである。核酸成分の合成は、５'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-３'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して、３'から５'の方向である。Ｂ０２は、以下の変化を伴って、実施例１に記載されるように合成される。
Figure 2006516099
[0368] 核酸成分及びスペーサー成分を加えるために、ＤＮＡ合成機は、以下の順番でプログラムされる。
１. ３'で支持体に結合される「Ｔ」固体支持体を使用し
２. ５'-ＴＣＧＡＣＧ-3'を合成し、
３. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
４. Ｕ-ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドを加え、
５. ステップ３とステップ４を２回以上繰り返し、
６. ０.５Ｍ・水素化ヒドラジンを含むピリジン：酢酸(１：１、ｖ/ｖ)での９０分間処理を使用して、レブリニル保護基を取り除き、
７. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
８. ５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を合成する。
[0369] ステップ６に記載されるように３レブリニル保護基を取り除いた後に、試薬を、通常量の３〜４倍量で加えた。なぜなら４個の核酸成分が、１回で合成されるからである。ＢＩＣを、Organic Process Research & Development 2000,4 : 205-213に記載されるように、ＳｏｕｒｃｅＱ３０(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) を使用して、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
[0370] 図６に示されるＢ０３は、Ｂ０２と同一の方式であるが、但しステップ３'がステップ３と４との間に挿入され、ここでステップ３'が５'-ＴＴＴＴＴ-３'の合成であり、かつステップ５がステップ３'と４の２回以上の繰り返しである方式で製造される。
実施例７: 二本鎖構造を形成できる自己相補核酸配列を含む自己集合ＢＩＣの製造
[0371] 分枝状免疫調節化合物Ｂ０４の構造は、図２及び以下において記載される。Ｂ０４の核酸成分はＤＮＡであり、そしてｂＮは２'-デオキシウリジンの５位に結合される６-ヒドロキシ-１-アミノヘキシル-３(Ｅ)-アクリルアミド(ＡＨＡ)-ＳＭ要素を含む２'-デオキシウリジン(Ｕ-ＡＨＡ；Biosearch Technologies)である。図１Ａを参照のこと。ＮＡＭｓ及びｂＮは、以下の構造に示されるように、ヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)とＡＨＡ-ＳＭ要素を介して結合される。ＨＥＧ要素とＮＡＭとの間の結合、ＨＥＧ要素とｂＮとの間の結合、及びＡＨＡとＨＥＧ要素との間の結合は、ホスホロチオエート・ジエステルである。核酸成分の合成は、５'-Ｏ-(４,４'-ジメチオキシトリチル)-３'-(Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピル)２-シアノエチルホスホラミダイト保護ヌクレオシド・モノマーを使用して、３'から５'の方向である。Ｂ０４は実施例１に記載されるように合成される。
Figure 2006516099
[0372] ＢＩＣにおける自己相補的１８ｍｅｒの核酸成分は、図２に示されるように、約１.０ｍｇ/ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム/１５０ｍＭ塩化ナトリウム/ｐＨ７.２中で約１.０ｍｇ/ｍｌの濃度のＢ０４溶液を調製し、溶液を９５℃で３分熱し、次に溶液を約２時間かけてヒートブロック中でゆっくり冷却させることにより、ＢＩＣの第二分子へとハイブリッド形成される。二本鎖ＢＩＣの形成は、サイズ排除クロマトグラフィーにより確かめられる。
実施例８：ホスホラミダイト化学を使用したＨ構造を有するＢＩＣの製造
[0373] Ｂ０５及びＢ０６の構造は、図３及び４に示される。Ｂ０５及びＢ０６の核酸成分はＤＮＡであり、そしてｂＮは２'デオキシウリジンの５位に結合される６-ヒドロキシ-１-アミノへキシル-３(Ｅ)-アクリルアミド(ＡＨＡ)-ＳＭ要素を含む２'-デオキシウリジン(Ｕ-ＡＨＡ；Biosearch Technologies)である。例えば、図１Ａを参照のこと。ＮＡＭｓとｂＮは、以下の構造に示されるように、ヘキサエチレン・グリコール(ＨＥＧ)とＡＨＡ-ＳＭ要素を介して結合される。ＨＥＧ要素とＮＡＭとの間の結合、ＨＥＧ要素とｂＮとの間の結合、ＡＨＡとＨＥＧ要素との間の結合は、ホスホロチオエート・ジエステルである。
[0374] ＤＮＡ合成機は、核酸成分とスペーサー成分を加えるために、以下の順番でプログラムされる。
１. ５'で支持体に結合された「Ｔ」固体支持体を使用し、
２. ３'-ＴＧＣＡＧＣ-５'を５'から３'の方向で合成し(実施例３を参照のこと)
３. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
４. Ｕ-ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドを加え、
５. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
６. ５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を、３'から５'方向に合成し、
７. 脱トリチル化し、そして５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'成分をキャッピングし、
８. レブリニル保護基を、０.５Ｍ水素化ヒドラジンを含むピリジン：酢酸(３：２、ｖ/ｖ)で５分間で取り除き、
９. ＨＥＧスペーサーホスホラミダイトを加え、
１０. Ｕ-ＡＨＡ分枝点ヌクレオシドを加え、
１１. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
１２. ５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を、３'から５'の方向で合成し、
１３. 脱トリチル化し、そして５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'成分をキャッピングし、
１４. レブリニル保護基を、０.５Ｍ水素化ヒドラジンを含むピリジン：酢酸(３：２、ｖ/ｖ)で５分間で取り除き、
１５. ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトを加え、
１６. ５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'を３'から５'方向に合成する。
[0375] この方法は、Ｈ-構造を有するＢＩＣをもたらす。この方法を使用して、ＤＮＡ配列は、独立して選ばれうる。
[0376] 精製を実施例６に記載されるように行ない、そして実施例１に記載されるように分析を行う。
[0377] 図６に示される分枝状の免疫調節化合物Ｂ０６は、Ｂ０５と同一の方式であるが、但しステップ９が、ＨＥＧスペーサー・ホスホラミダイトの添加の変わりに５'-ＴＴＴＴＴ-３'の合成である方式で製造される。Ｂ０５における全てのヌクレオチド結合及び核酸成分、核酸スペーサー成分、及び分枝点ヌクレオシド間の結合は、ホスホールチオエート・エステルである。
実施例９：ＢＩＣｓによるヒト細胞の免疫調節
[0378] ＢＩＣの免疫調節活性を評価するために、並びにポリヌクレオチドと、スペーサー成分を含むキメラ分子であって分枝点ヌクレオシドを含まないものとを比較するために、試験を行った。
[0379] ＢＩＣ０７は上に記載されるように合成された。
[0380] ヘパリン化シリンジを使用して静脈穿刺により、末梢血液をボランティアから収集した。血液をＦＩＣＯＬＬ(商標)(Amersham Pharmacia Biotech)クッション上に重層し、そして遠心した。ＦＩＣＯＬＬ(商標)インターフェースに局在されたＰＢＭＣｓを回収し、次に冷リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄した。細胞を懸濁し、そして４８ウェルプレート又は９６ウェルプレート内で、２×１０6細胞/ｍｌ、３７℃で、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清＋５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、３００μｇ／ｍｌグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１×非必須アミノ酸(ＮＥＡＡ)ＭＥＭを含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
[0381] 試験サンプルがない状態、２０μｇ／ｍｌの試験サンプル(０.５ＯＤ／ｍｌ)の存在する状態、又は１００μｇ／ｍｌカチオン性ポリ(乳酸、グリコール酸)マイクロキャリア(ｃＰＬＧＡ；以下を参照)(使用時)と混合された２０μｇ／ｍｌの試験サンプルが存在する状態で、細胞を２４時間培養した。細胞を含まない培地を次に各ウェルから回収し、そしてＩＦＮ-γ及びＩＦＮ-αの濃度についてアッセイした。ＳＡＣ(Pansorbin CalBiochem, 1/5000希釈)をポジティブコントロールとして使用した。ＳＡＣは、スタフ. アウレウス(Staph. aureus)(cowan)細胞物質である。
[0382] カチオン性ポリ(乳酸、グリコール酸)マイクロキャリア(ｃＰＬＧＡ)を以下の様に調製した。固有の粘度０.４１ｄｌ／ｇ(０.１％、クロロホルム、２５℃)を有する０.８７５gのポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド(glycolide))の５０：５０ポリマー(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を、０.３ｇのＤＯＴＡＰと共に７.８７５ｇの塩化メチレン中に１０％ｗ／ｗ濃度で溶解した。透明有機層を次に、研究室ミキサー(Silverson L4R、Silverson Instrument)を使用して４０００ｒｐｍで３０分間室温でホモジェナイズすることにより、５００ｍｌのＰＶＡ水溶液(０.３５％ｗ／ｖ)中に乳濁した。システムの温度を混合容器の外側に温水を循環させることによって４０℃まで上げた。同時に、攪拌速度を１５００ｒｐｍへと減らし、そしてこれらの条件を２時間維持して、抽出し、そして塩化メチレンを蒸発した。循環冷水の助けのもと、ミクロスフィア懸濁液を室温に冷却した。
[0383] ＩＦＮ-γ及びＩＦＮ-αを、BioSource International, Inc.,から市販されるCYTOSCREEN(商標)ELISAキットを使用し、製品説明書に従ってアッセイした。
[0384] ヒトＰＢＭＣアッセイにおいて、ＩＦＮ-γのバックグラウンド・レベルは、ドナーについて有意に変化しうる。ＩＦＮ-αのレベルは、一般的に、刺激がない条件下で低バックグラウンド・レベルを示す。
[0385] アッセイの結果からの例は、以下の実施例１０において示される。
実施例１０：ＢＩＣ・Ｂ０７の免疫調節活性
[0386] 化合物Ｂ０７(上の実施例１を参照のこと)を、上の実施例９において概説されるように、ヒトＰＢＭＣ細胞における免疫調節活性について試験した。比較の目的のため、種々のポリヌクレオチド及びスペーサー成分を含むキメラ分子の免疫調節活性もまたアッセイした。免疫調節活性についてアッセイされた化合物及びその構造を、以下の表２に示す。免疫調節キメラ分子、例えば化合物Ｃ-１０１、Ｃ-１２４、及びＣ１２５の合成及び特徴は、「Chimeric Immunomodulatory Compounds and Methods of Using the Same」という題名で、２００２年６月２１日に出願された米国特許出願10/176,883号において記載され、該文献は本明細書中に援用される。表に載せられた化合物の全てのヌクレオチド結合、並びにＮＡＭｓ、スペーサー成分、及び分枝点ヌクレオシド間の結合は、ホスホロチオエート・エステルである。ＨＥＧ＝ヘキサエチレン・グリコール;対称ダブラー＝1,３-ジアミノ-２-プロパノール；トレブラー＝改変ペンタエリスリトール；Ｔ-Ｃ６＝２'-デオキシウリジン；ＡＨＡ＝２'-デオキシウリジンのＣ５位で結合されるアミノヘキシル-３(Ｅ)-アクリルアミドである(図１Ａを参照)。化合物は、各々単独で試験され、並びにｃＰＬＧＡと剤形された(上記実施例９を参照のこと)。
Figure 2006516099
[0387] ＰＢＭＣｓにおける免疫調節アッセイの結果は、以下の表３に示される。「１７---」という数は、個々のドナーを表す。種々の化合物に対する免疫調節アッセイの平均結果は、以下の表４に要約される。
Figure 2006516099
Figure 2006516099
[0388] これらのＰＢＭＣアッセイでは、ＢＩＣ・Ｂ０７が、ＩＦＮ-γ及びＩＦＮ-αの誘導の点で、免疫調節キメラ化合物Ｃ-１０１、Ｃ-１２４、及びＣ１２５に同等の活性を有することが示された。ＢＩＣ・Ｂ０７は、５'-ＴＣＧ-３'配列を含む直鎖状ポリヌクレオチドＰ-６に比べ、優れた免疫調節活性を有することも示された。
実施例１１：カチオン性生分解性マイクロキャリアの製造
[0389] カチオン性ポリ(乳酸、グリコール酸)マイクロキャリア(ｃＰＬＧＡ)を以下の様に製造した。固有粘度０.４１ｄｌ／ｇ(０.１％、クロロホルム、２５℃)を有する０.８７５ｇのポリ(Ｄ,Ｌ-ラクチド-コ-グリコリド)５０：５０ポリマー(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を、０.３ｇのＤＯＴＡＰを伴って、１０％ｗ／ｗ濃度で７.８７５ｇの塩化メチレン中に溶解した。研究室ミキサー(Silverson L４R, Silverson Instruments)を使用して室温で３０分間４０００ｒｐｍでホモジェナイズすることによって、透明有機層を、５００ｍｌのＰＶＡ水溶液(０.３５％ｗ／ｖ)中に乳濁化した。混合容器の外側を通して熱水を循環することにより、システム温度を次に４０℃に上げた。同時に、攪拌速度を１５００ｒｐｍに減らし、そしてこれらの条件を２時間維持して、抽出し、そして塩化メチレンを蒸発した。冷却水の循環の手助けにより、ミクロスフィアの懸濁液を室温へと冷却した。
[0390] マイクロキャリアを、室温で１０分間８０００ｒｐｍで遠心することにより分離し(Beckman Instruments)、そして穏やかな浴槽超音波処理をすることにより脱イオン水中に懸濁した。遠心洗浄をさらに２回繰り返して、過剰量のＰＶＡを粒子表面から取り除いた。粒子の最終遠心分離ペレットは、おおよそ１０ｍｌの水中に懸濁し、そして一晩凍結乾燥した。乾燥カチオン性マイクロキャリア粉末を、大きさ及び表面荷電について特徴決定した。平均の大きさ(重量数(number weighted)、μ)＝１.４；ゼーター電位(ｍＶ)＝３２.４。
実施例１２：ＢＩＣによるマウス細胞の免疫調節
[0391] ＢＩＣｓを実施例１〜８において記載されるように合成し、そしてマウス脾細胞において免疫活性を試験した。免疫刺激は、培養培地へのサイトカイン分泌を計測することによって評価される。培養上清中のサイトカインレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)試験により測定される。
[0392] 標準技術を使用して細胞を単離し、そして準備した。８〜２０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓を収集し、そして標準試験及びBio Whittaker, Inc.から市販されるＡＣＫ溶解緩衝液での処理を使用して脾細胞を単離した。４個の脾臓を、この実験で取っておく。単離された細胞を、２％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、５０μＭ・２-メルカプトエタノール、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、及び２ｍＭ・Ｌ-グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で洗浄し、そして１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ(１０％熱不活性化ＦＣＳ、５０μＭの２-メルカプトエタノール、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、及び２ｍＭ・Ｌ-グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地)中に約７×１０5細胞／ｍｌで懸濁する。
[0393] 細胞を蒔いた後に少なくとも１時間静止させて、細胞培養を、９６ウェル・フラットマイクロタイタープレート内で、約７×１０5細胞／ウェルで三重に開始した。指示された試験化合物は、０.１、１.０、及び５.０μｇ／ｍｌで２４時間、３７℃でインキュベーションされる。細胞によるサイトカイン産生は、ＥＬＩＳＡにより測定される。
実施例１３：Ｂ細胞増殖アッセイにけるＢＩＣｓの効果
[0394] ヒトＰＢＭＣｓは、２人の健常対象からのヘパリン化血液から単離される。幾つかのＰＢＭＣｓは、残りがＣＤ１９＋ＭＡＣＳビーズ(Miltenyi Biotec)とインキュベーションされる間、とっておかれる。これらの細胞を次に磁石に通し、陽性反応を介してＣＤ１９＋Ｂ細胞を分離する。この集合は、ＦＡＣＳ分析により測定されるとき、９８％ＣＤ１９＋を超える。Ｂ細胞を次に１×１０5／２００μｌ／ウェルで、９６ウェル丸底プレート内で培養する。細胞を２μｇ／ｍｌのＢＩＣ又はコントロール化合物で刺激する。これらの培養期間は、３７℃で４８時間である。培養期間の終わりに、プレートを３Ｈ-チミジン、１μＣｉ／ウェル、でパルス標識し、そしてさらに８時間インキュベーションした。次にプレートは、標準液体シンチレーション技術を使用して収集され、そしてデーターをカウント毎分(ｃｐｍ)で得た。
実施例１４：ＢＩＣｓのｉｎ ｖｉｖｏ活性
[0395] ｉｎ ｖｉｖｏ試験は、マウス(１０マウス／群)に２０μｇ(２００μｌの体積)のＰ-６(ポジティブ・コントロール)、Ｐ-７(ネガティブ・コントロール)、Ｃ-９、Ｃ-２３、Ｐ１、又はＰ１１を首筋に皮下注射することにより行われる。２時間後に血液を収集する。ＬＰＳポジティブ・コントロール群については、マウスは２００μｌの体積で腹腔内注射され、そして血液は１.５時間後 (つまり、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ-α活性のピークで)に収集される。血液を凝固させ、そして血清を調製し、そして-８０℃でアッセイするまで貯蔵した。ＴＮＦ-αに対するバイオソース・サイトスクリーン・キット並びにｍIL-６及びｍIL-１２に対するPharmingen抗体ペアを使用して血清サイトカインをアッセイする。全てのサンプルは、二回アッセイされる。
実施例１５：抗原及びＢＩＣｓに対する霊長類の免疫応答
[0396] ＢＩＣｓの存在下におけるＢ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)の投与に応答する免疫を、ヒヒにおいて試験する。
[0397] ＨＢｓＡｇは、酵母で生成された組換えＨＢｓＡｇである。ヒヒの群(一群あたり８匹)は、実験の開始時で８〜３１ｋｇの体重範囲(群の平均体重は１３〜１６)の雄及び雌のヒヒを含んだ。
[0398] ヒヒは、１ｍｌ体積中の２０μｇのＨＢｓＡｇで筋肉内(ＩＭ)注射により、２ヶ月の間隔で２回免疫化される(０ヶ月と２ヶ月目)。以下に概説されるように、幾つかの群はまた、ＨＢｓＡｇと共に、ＢＩＣｓ(Ｃ-８又はＣ-９)又はポジティブコントロール(Ｐ-６)を受けた。
[0399] 免疫化前に、そして免疫化後２週間で、全ての動物において血液を収集する。抗-ＨＢｓＡｇ・ＩｇＧタイターを、以下の様に計測する。ヒト血漿由来ＨＢｓＡｇ被膜ビーズを使用してＡＵＳＡＢ・ＥＩＡ市販キット(Abbott Labs カタログ番号9006-24及び1459-05)により、ヒヒ血漿サンプルを分析する。０〜１５０ｍＩＵ／ｍｌの範囲のヒト血漿由来ＨＢｓＡｇ陽性及び陰性基準のパネルに沿って、サンプルを試験する。ビオチン結合ＨＢｓＡｇ及びウサギ抗-ビオチン-ＨＲＰ結合抗体は、検出のために使用される二次抗体複合体として使用される。アッセイは、オルソ-フェニレンジアミン(ＯＰＤ)で発光され、そして吸光度を、６００ｎｍでのバックグラウンドをサブトラクションして４９２ｎｍで計測した(QuantumII分光光度計,Abbott Labs)。標本吸光度を使用し、対応する抗ＨＢｓＡｇの濃度は、製造元により決められたパラメーターに従った検量線から決定されるミリ-インターナショナル・ユニット／ｍｌ(ｍＩＵ／ｍｌ)で表される。希釈標本では、定量は、０〜１５０ｍＩＵ／ｍｌの間の値をもたらす標本吸光度に基き、最終濃度で達成される希釈度をかける。
[0400] ログ変換データーについて、一元配置ＡＮＯＶＡ計画比較(α＝０.０５)を使用して分散分析(NCSS97 Statistical Software program, Kaysville, UT) により統計分析が行われる。ｐ≦０.０５を有意とする。
試験される動物群は、以下の様に免疫化される：
群１ ２０μｇ・ＨＢｓＡｇ
群２ ２０μｇ・ＨＢｓＡｇ＋ＢＩＣ
実施例１６：ＢＩＣ抗原複合体により作られるin vivo応答
[0401] この例は、ＢＩＣ抗原複合体の投与による、マウスにおける抗体媒介性免疫応答の導入を示す。
[0402] 以下に記載されるように、１０匹のマウス／群を、２週間の間隔で、以下に記載されるように合成されたＣ-１１／Ａｍｂ・ａ１複合体(１μｇ又は１０μｇ)、Ｐ-６／Ａｍｂ・ａ１(１μｇ)、又はＡｍｂ・ａ１(１μｇ)で、２回皮内免疫化する。抗-Ａｍｂ・ａ１特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａタイターは、各注射の後２週間で取った血清から測定される。in vitro再刺激を、２回目の免疫化の６週間後で脾臓細胞で行なって、Ａｍｂ・ａ１特異的ＩＦＮ-γ及びＩＬ-５応答を測定する。
一般的方法
[0403] Charles River Laboratories(hollister, CA)から購入された８〜１２週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、動物試験を行う。１０匹のマウス／群を以下の物質：Ｃ-１１／Ａｍｂ・ａ１複合体(１μｇ)、Ｃ-１１／Ａｍｂ・ａ１複合体(１０μｇ)、Ｐ-６／Ａｍｂ・ａ複合体(１μｇ)、又はＡｍｂ・ａ１抗原(１μｇ)のうちの１つで、２週間の間隔で２回皮内注射する。各注射の２週間後に眼窩後経路を介して血液を収集し、そして抗体測定のために血清が調製される。２回目の注射の６週間後に、in vitro再刺激アッセイのため脾臓細胞を収集して、ＩＦＮ-γ及びＩＬ-５のサイトカイン応答を測定する。脾臓は個々にアッセイされる。Ａｍｂ・ａ１は、５×１０5細胞／ウェルで、再刺激のため２５及び５μｇ／ｍｌで使用され、そして上清を４日目で収集し、そしてアッセイするまで-８０℃で貯蔵する。in vitroアッセイのコントロールは、０.０１％でのＳＡＣ並びに１０ｎｇ／ｍｌ及び１μＭそれぞれでのＰＭＡ／ＩＯを含んだ。
マウス抗Ａｍｂ・ａ１・ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアッセイ。
[0404] マウス血清サンプルは、５０μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ・Ａｍｂ・ａ１抗原で被膜される９６ウェル丸底プレート内で、ＥＬＩＳＡにより分析される。ヤギ抗-マウスＩｇＧ１(又はＩｇＧ２ａ)ビオチン結合抗体は、２次抗体として使用される。ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ複合体は、検出のために使用される。アッセイは、ＴＭＢで発光され、そして吸光度を６５０ｎｍでのバックグラウンドをサブトラクションして４５０ｎｍで測定する(Ｅｍａｘ精密マイクロプレートリーダー、Molexular Devices, Sunnyvale, CA)。タイターは、４-パラメーター分析を使用して、０.５ＯＤのＥＬＩＳＡ吸光度を与えた血清希釈度の逆数として定義される(Softmax Pro97, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)。全てのサンプルを別のプレート上で二組のウェルで試験され、そしてタイターを２個の平均値として報告する。
[0405] 上清は、抗サイトカイン・モノクローナル抗体でコートされたプレート上で、捕捉ＥＬＩＳＡによりＩＬ-５及びＩＦＮ-γレベルについて試験される。ビオチン化抗-サイトカインＭＡｂｓは、２次抗体として使用される。ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ複合体は、検出用に使用され、そしてアッセイは、ＴＭＢにより発光される。濃度は、各プレート上でアッセイされる検量線から計算される。吸光度は、６５０ｎｍでのバックグラウンドをサブトラクションして４５０ｎｍで検出される(Ｅｍａｘ精密マイクロプレートリーダー、Molecular Devices, Sunnyvale, CA)。全てのサンプルは、別々のプレート上の二組のウェルで試験され、そして濃度は２個の値の平均値として報告される。
[0406] 統計処理は、一元配置ＡＮＯＶＡ計画比較、α＝０.０５を使用して、配列NCSS９７プログラム(ＮＣＳＳ統計ソフトウェア、Kaysville, Utah)で、ログ変換データーについて行われる。この実験では、ｐ＜０.０５が統計的に有意であるとする。
[0407] しかしながら、前述の発明は、明確かつ理解可能にするために、説明及び例示により、幾らか詳細に記載されたが、特定の変化及び改変が慣用的であるということは、当業者にとって明らかであろう。それゆえ、記載及び実施例は、本発明の範囲を制限するものと解釈するべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により表される。
[0408] 本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、及び公開は、それぞれの公開、特許、又は特許出願が特別にかつ個々に本明細書中に援用されたと記載された場合と同じ程度に、全ての目的のためにそれら全てを本明細書中に援用される。
図１は、保護スペーサー成分及び反応基を含む市販の分枝点ヌクレオチドの例(図１Ａ、１Ｃ、及び１Ｅ)、及びこれらの化合物を包含するＢＩＣｓの部分(図１Ｂ、１Ｄ、及び１Ｆ)である。図１Ａ-１Ｄは、２'デオキシウリジンから派生された分枝点ヌクレオチドを示し、そして図１Ｅ-１Ｆは、２'-デオキシシチジンから派生された分枝点を示す。 図１は、保護スペーサー成分及び反応基を含む市販の分枝点ヌクレオチドの例(図１Ａ、１Ｃ、及び１Ｅ)、及びこれらの化合物を包含するＢＩＣｓの部分(図１Ｂ、１Ｄ、及び１Ｆ)である。図１Ａ-１Ｄは、２'デオキシウリジンから派生された分枝点ヌクレオチドを示し、そして図１Ｅ-１Ｆは、２'-デオキシシチジンから派生された分枝点を示す。 図１は、保護スペーサー成分及び反応基を含む市販の分枝点ヌクレオチドの例(図１Ａ、１Ｃ、及び１Ｅ)、及びこれらの化合物を包含するＢＩＣｓの部分(図１Ｂ、１Ｄ、及び１Ｆ)である。図１Ａ-１Ｄは、２'デオキシウリジンから派生された分枝点ヌクレオチドを示し、そして図１Ｅ-１Ｆは、２'-デオキシシチジンから派生された分枝点を示す。 図２は、「中心軸」構造を有するＢＩＣを示す。図２-６において図示されるＢＩＣｓでは、ＮＡＭｓにおけるヌクレオチド間、ＮＡＭのヌクレオチドとＨＥＧとの間、ＨＥＧと分枝点ヌクレオシドとの間、ＨＥＧとＡＨＡ要素との間、並びにＮＡＭｓと分枝点ヌクレオシドとの間の結合は、ホスホロチオエートでありうる(配列番号１)。 図３は、「Ｈ」構造を有するＢＩＣを示す。 図４は、「Ｈ」構造を有するＢＩＣを示す。 図５は、「くし」構造を有するＢＩＣを示す。 図６は、「くし」構造を有するＢＩＣを示す。 図７は、多量体(分枝状)ＳＭを含み、そして式：(５-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'-ＨＥＧ)-(５'-Ｕ-３')-ＨＥＧ-(３'-ＴＧＣＡＧＣＴ-５')ｂ-ＡＨＡ(ＨＥＧ-３'-ＴＧＣＡＧＣＴ-５')-グリセロール-(３'-ＴＧＣＡＧＣＴ-５')2、[式中、ｂは、ＡＨＡスペーサー成分を介した分枝点ヌクレオシドの２'デオキシウリジン塩基のＣ５位に結合される成分を示す]を有するＢＩＣを示す。 図８は、ＢＩＣデンドリマーを示す。図８-９において図示されるＢＩＣｓでは、ＮＡＭｓにおけるヌクレオチド間及びＮＡＭｓと分枝点ヌクレオシドとの間の結合は、ホスホロチオエートでありうる。線は、(ホスホロチオエート結合及び/又はスペーサー成分(単数又は複数)を介した)分枝点ヌクレオシドとＮＡＭｓとの共有結合を示す。 図９は、「かご」構造を有するＢＩＣ多量体を示す(配列番号２)。ＮＡＭｓにおけるヌクレオチド間、及びＮＡＭｓと分枝点ヌクレオシドとの間の結合は、ホスホロチオエートでありうる。線は、 (例えば、ホスホロチオエート結合及び/又はスペーサー成分(単数又は複数)を介した)分枝点ヌクレオシドとＮＡＭｓの共有結合を示す。

Claims (20)

  1. 少なくとも３個の核酸成分を含む分枝状免疫調節化合物(ＢＩＣ)であって、該核酸成分の少なくとも１が、配列５'-ＣＧ-３'、及び少なくとも１の分枝点ヌクレオシドを含み、ここで該ＢＩＣが免疫調節活性を有する、前記化合物。
  2. 前記ＢＩＣが、(ｉ)ヒト末梢血液単核細胞からのＩＦＮ-γ産生を刺激する能力、(ｉｉ)ヒト末梢血液単核細胞からのＩＦＮ-α産生を刺激する能力、及び(ｉｉｉ)Ｂ細胞増殖を刺激する能力からなる群から選ばれる免疫調節活性を有する、請求項１に記載のＢＩＣ。
  3. 直接又は非核酸スペーサー成分を介して分枝点ヌクレオシドに共有結合される３個の核酸成分を含む、請求項１に記載のＢＩＣ。
  4. 少なくとも２個の分枝点ヌクレオシド及び少なくとも４個の核酸成分を含み、ここで該分枝点ヌクレオシド及び該核酸成分からなる群から各々独立して選ばれる３個の成分が、直接又は非核酸スペーサー成分を介して該分枝点ヌクレオシドの各々に共有結合される、請求項１に記載のＢＩＣ。
  5. Ｃ4-Ｃ20ポリエチレン・グリコール、Ｃ2-Ｃ8アルキル、ペンタエリスリトール、２-(ヒドロキシメチル)エチル、グリセロール、多糖、２-アミノブチル-１,３-プロパンジオール、又は１,３-ジアミノ-２-プロパノールを含む非核酸スペーサー成分を含む、請求項３に記載のＢＩＣ。
  6. Ｃ4-Ｃ20ポリエチレン・グリコール、Ｃ2-Ｃ8アルキル、ペンタエリスリトール、２-(ヒドロキシメチル)エチル、グリセロール、多糖、２-アミノブチル-１,３-プロパンジオール、又は１,３-ジアミノ-２-プロパノールを含む非核酸スペーサー成分を含む、請求項４に記載のＢＩＣ。
  7. 前記３個の核酸成分のうちの少なくとも１が以下：
    ａ)５'-ＴＣＧ-３'；
    ｂ)５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)-３'；
    ｃ)５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)ＣＧ-３'；
    ｄ)５'-ＴＣＧ(Ａ／Ｔ)ＣＧ(Ａ／Ｔ)-３'；
    ｅ)５'-ＴＣＧＡＣＧＴ-３'；及び
    ｆ)５'-ＴＣＧＴＣＧＡ-３'
    からなる群から選ばれる配列を含む、請求項１に記載のＢＩＣ。
  8. 前記３個の核酸成分の全てが、５'-ＣＧ-３'を含む配列を有する、請求項２に記載のＢＩＣ。
  9. 前記配列５'-ＣＧ-３'を含む前記核酸成分の各々が、８ヌクレオチド長未満である、請求項２に記載のＢＩＣ。
  10. 前記分枝点ヌクレオシドが、リボヌクレオシド又は２'-デオキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載のＢＩＣ。
  11. 前記ＢＩＣの５'-ＣＧ-３'を含む核酸成分の少なくとも１が、
    (ｉ)単離された免疫学的活性を有さないか、又は
    (ｉｉ)劣った単離された免疫学的活性を有する、請求項１に記載のＢＩＣ。
  12. 単一の分枝点ヌクレオシドを含むＹ型構造；フォーク型構造、Ｈ型構造、及びくし型構造からなる群から選ばれる構造を有する、請求項１に記載のＢＩＣ。
  13. 請求項１に記載の第一ＢＩＣと、請求項１に記載の第二ＢＩＣを含む自己集合性水素結合複合体であって、該第一ＢＩＣの核酸成分が、ワトソン-クリック塩基対形成を介して該第二ＢＩＣの核酸成分に水素結合され、かつ該第一ＢＩＣと第二ＢＩＣが同じであるか又は異なる、前記複合体。
  14. 請求項１に記載のＢＩＣ及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  15. 抗原又はカチオン性ミクロスフィアをさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 個体において免疫応答を調節する方法であって、該個体において免疫応答を調節するために十分な量で、請求項１に記載のＢＩＣを該個体に投与することを含む、前記方法。
  17. 前記個体が、Ｔｈ２型免疫応答に関連する疾患を患う、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記疾患が、アレルギー、アレルギー誘導性喘息、又は感染性疾患である、請求項１７に記載の方法。
  19. 個体において血液細胞によるインターフェロン-ガンマ(ＩＦＮ-γ)の分泌を増大する方法であって、該個体において血液細胞によるＩＦＮ-γの分泌を増大するために十分な量で、請求項１に記載のＢＩＣを該個体に投与することを含む、前記方法。
  20. 個体において血液細胞によるインターフェロン-アルファ(ＩＦＮ-α)の分泌を増大する方法であって、該個体において血液細胞によるＩＦＮ-αの分泌を増大するために十分な量で、請求項１に記載のＢＩＣを該個体に投与することを含む、前記方法。
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