CN1665531A - 甲基化的免疫刺激性寡核苷酸和利用这些寡核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明发现,通过将核苷酸包裹在脂质颗粒中,可使甲基化核酸,尤其是甲基化寡核苷酸,更尤其是含有甲基化胞嘧啶CPG二核苷酸基元的甲基化寡核苷酸在体内具有免疫刺激活性。本发明还发现,通常在体内不具备免疫刺激性的包裹甲基化核酸,能与其包裹的未甲基化对应物同样有效或者比其包裹的未甲基化对应物更有效。本发明还发现了利用本文所公开的组合物和方法,来使应答抗原刺激的树突细胞活化 和/或扩增的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享受2002年5月10日提交的美国临时专利申请系列号60/379,343;2002年11月7日提交的美国专利申请系列号10/290,545;以及2003年4月4日提交的美国专利申请系列号60/460,646的优选权。
技术领域
本申请涉及脂质-核酸配制剂和其用于体内刺激免疫应答的方法,尤其涉及核酸序列的脂质体配制剂,所述核酸序列含有至少一个甲基化胞嘧啶从而协同地增强它们的免疫刺激活性,其中甲基化胞嘧啶优选形成CpG基元的一部分。
背景技术
胞嘧啶的甲基化是真核生物中唯一已知的DNA内源修饰,其通过将甲基或羟甲基基团酶促加成到胞嘧啶的C-4或C-5位来实现。Costello和Plass,2001,J.Med.Genet.38:285。许多研究者认为:细菌DNA可在体外和体内激发免疫应答的原因是由于低频率的甲基化胞嘧啶残基在细菌DNA中存在的结果,相反具有高频率甲基化胞嘧啶残基的脊椎动物DNA就不能刺激任何免疫应答。Messina等,1991,J.Immunol 147:1759。利用外周血单核细胞实验(PBMC)测定体外寡核苷酸促有丝分裂活性的随后研究表明:未甲基化DNA可促有丝分裂,而甲基化DNA则不能促有丝分裂。在检验的大量寡核苷酸序列中,那些含有CpG二核苷酸基元的寡核苷酸序列表现了显著地促有丝分裂性。Krieg等,1995,Nature 374:546-9。同样地,只要CpG二核苷酸基元的胞嘧啶未甲基化,则包含该基元的寡核苷酸在体内也显示免疫刺激性。Parronchi P.等1999,J.Immunol 163:5946-53;Kreig A.M,1999,Biochim Biophys Acta 1489:107-16。
相似地,美国专利6,194,388公开了,当将CpG基元的胞嘧啶甲基化而其它胞嘧啶未甲基化时,通过体外将胸苷掺入PBMC来测定,在T细胞耗竭的脾细胞中B细胞的促有丝分裂活性被破坏。接着,根据在超过300个寡核苷酸序列中由体外尿苷摄取测定筛选它们在T细胞耗竭的脾细胞中诱导B细胞活化的能力的结果,相关美国专利6,207,646公开了,与缺少CpG基元的寡核苷酸相比,具有未甲基化CpG二核苷酸基元的寡核苷酸能更有效的刺激促有丝分裂活性,而相同CpG寡核苷酸的甲基化对应物并不同样有效。这再次表明,最不会影响B细胞促有丝分裂活性的甲基化位点是CpG二核苷酸的胞嘧啶,其被甲基化时与其它胞嘧啶的甲基化相比,体外刺激降低。
同一组申请:美国专利6,239,116(甲基化序列降低了NK细胞裂解活性),美国专利6,406,705(当与HBsAg联合时非CpG寡核苷酸缺乏佐剂效应)和美国专利6,429,199(CpG基元的甲基化导致与GM-CSF联合时丧失刺激效应)得到了相似的结论。因此,总体上,甲基化CpG寡核苷酸一般不能有效地刺激体外促有丝分裂效应或激发体内免疫刺激性效应,或者所述效应低于甲基化寡核苷酸。
最近,Schetter等在国际申请号WO02/069369中提示:根据测定一些白细胞表面标记(包括CD86,CD80,CD25和CD69)的产生的体外PBMC试验,一些甲基化CpG寡核苷酸类型可具有免疫刺激活性。然而,测定的核酸序列在寡核苷酸(含有1-4个CpG二核苷酸)4-9个位点被重度甲基化,在所有例子中,甲基化寡核苷酸比其未甲基化对应物保留的有效性更低。还研究了多种其它寡核苷酸结构,包括肌苷取代鸟苷,胞嘧啶与肌苷相邻,“d间隔臂”含糖以避免对邻近肌苷的碱基的取代,ZpG二核苷酸(其中Z由2-脱氧尿苷、5-氟2-脱氧尿苷取代),和CpY二核苷酸(其中Y由2-氨基嘌呤、黄苷、N7-甲基-黄苷、水粉蕈素或d间隔臂取代)。不幸地是,未提供有效对照序列,如随机序列或相同长度序列的混合物,来证实该体外试验的预测值和/或申请人对体内可能出现的免疫刺激活性的结论的准确性。而且,未观察到对树突细胞(抗原呈递细胞的重要亚型)的免疫刺激活性。
本领域仍需要提高免疫刺激活性的改进佐剂组合物。该组合物必须能刺激较宽范围的抗原呈递细胞,尤其包括树突细胞。且该组合物必须能独立地、以及与肿瘤、病原体或其它抗原组合地刺激有效的体内免疫应答。
本领域还对扩大用作免疫刺激性佐剂的核酸序列基元的范围感兴趣。尤其需要能由含有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸序列,以及其它已在体外免疫刺激活性中证实有显著可变性的寡核苷酸结构激发持续免疫刺激活性的组合物和方法。
发明概述
本发明人已发现:将甲基化核酸序列掺入本发明脂质-核酸(LNA)配制剂能解决上述现有技术问题,并提供协同效益。尤其是当根据本发明所述使用时,能显著提高甲基化核酸序列的免疫刺激活性,并持续地获得提高的体内免疫刺激,与现有技术中广泛大量报导的结果形成鲜明的对比。令人惊讶地是,本发明的脂质-甲基化核酸配制剂还显示了与其具有相应未甲基化序列的相同脂质-核酸配制剂一样好的,在多数情况下更好的治疗效力。此外,在更宽范围的抗原呈递细胞,尤其在树突细胞中获得了免疫刺激活性。而且,如本文中所述,与现有技术不同,利用只有单个甲基化CpG二核苷酸的包裹的(encapsulated)核酸能获得有效的免疫刺激。
一方面,本发明提供了在动物中刺激免疫应答的脂质-甲基化核酸配制剂,其含有脂质成分和核酸成分,其中核酸成分含有至少一个甲基化核酸序列。在一些优选实施方式中,甲基化核酸序列含有连接到至少一个胞嘧啶的C-4(4-mC)或C-5(5-mC)位的甲基或羟甲基基团,其中所述甲基化胞嘧啶残基通常是所述序列中CpG二核苷酸基元的一部分。在另一些优选实施方式中,脂质成分完全包裹甲基化核酸而形成脂质颗粒,见本文进一步描述。
在一些实施方式中,当以游离核酸形式对动物给药时,甲基化核酸序列在体内无免疫刺激活性。在另一些实施方式中,脂质-甲基化核酸配制剂与具有相同序列但缺乏一个或多个胞嘧啶残基的甲基化的相应脂质-核酸配制剂相比,在体内具有相等或更好的免疫刺激性。
在一个实施方式中,核酸序列含有至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。在一个优选实施方式中,核酸序列含有单一的CpG二核苷酸,其中所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的。在一个特殊的实施方式中,所述核酸序列含有序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′(ODN1m)。在另一个实施方式中,所述核酸序列含有至少两个CpG二核苷酸,其中CpG二核苷酸中至少有一个胞嘧啶是甲基化的。在进一步的实施方式中,序列中CpG二核苷酸的每个胞嘧啶都是甲基化的。在另一个特殊的实施方式中,核酸序列含有序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGTT 3′(ODN2m)。在另一个实施方式中,核酸序列含有多个CpG二核苷酸,其中至少有一个所述CpG二核苷酸含有甲基化胞嘧啶。然而很明显,而且并不像现有技术所教导的,如本文所述利用具有单个CpG二核苷酸或多个CpG二核苷酸的核酸序列可获得有效的免疫刺激,其中所述单个CpG二核苷酸只具有一个甲基化胞嘧啶,所述多个CpG二核苷酸的一对胞嘧啶是甲基化的。
在优选实施方式中,当动物体内给药时,脂质-甲基化核酸配制剂能活化和/或扩增(expand)树突细胞。一方面,携有CD11c和DEC205中至少一种标记的树突细胞在体内通过给药受试配制剂(优选联合给与抗原刺激)而扩增。另一方面,携有CD11c或DEC205标记的树突细胞通过给药受试配制剂(优选联合给与抗原刺激)被体内活化而表达CD86标记。
在各种实施方式中,脂质-核酸配制剂进一步含有可药用载体、缓冲剂或稀释剂。
在一些实施方式中,核酸含有磷酸二酯骨架。在其它的实施方式中,核酸含有非磷酸二酯骨架。在更具体实施方式中,非磷酸二酯骨架是硫代磷酸酯骨架。
在组合物的各种实施方式中,脂质体颗粒包含阳离子脂质。阳离子脂质的例子选自DDAB、DODAC、DOTAP、DMRIE、DOSPA、DMDMA、DC-Chol、DODMA、DODAP和其混合物。在进一步的实施方式中,脂质体颗粒进一步含有中性脂质,其选自DOPE、DSPC、POPC、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂和其混合物。在其它的实施方式中,脂质体颗粒仅含有中性脂质,其选自DOPE、DSPC、POPC、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂和其混合物。在其它实施方式中,脂质颗粒含有但不限于下述脂质:DODAP、DODMA、DSPC、POPC和其混合物。在另一些实施方式中,脂质颗粒含有鞘磷脂和脂质的混合物,所述脂质选自DODAP、DODMA、DSPC、POPC和其混合物。在另一些实施方式中,脂质成分含有DSPC、DODMA、Chol和PEG-DMG,且DSPC∶DODMA∶Chol∶PEG-DMG的比约为20∶25∶45∶10mol/mol。在另一更具体实施方式中,所述脂质成分与所述核酸成分的比约为0.01-0.25wt/wt。
在其它实施方式中,脂质颗粒进一步在脂质颗粒表面包括空间屏障脂质成分。在一些实施方式中,空间屏障脂质选自PEG-DMG、PEG-PE和PEG神经酰胺。在一个实施方式中,PEG神经酰胺是PEG神经酰胺C-14。另一个实施方式中,PEG神经酰胺是PEG神经酰胺C-20。
在另一实施方式中,提供了含有目的抗原与前述脂质-甲基化核酸配制剂的组合物。抗原可与脂质-甲基化核酸配制剂混合(mix)或结合(associate)。优选抗原与配制剂结合,如本文所述。在一个实施方式中,抗原是肿瘤抗原。在优选实施方式中,甲基化核酸序列在至少一个CpG二核苷酸基元中含有4-mC或5-mC。在特别优选实施方式中,甲基化核酸序列包裹在脂质体颗粒中。在另一实施方式中,抗原也包裹在脂质体颗粒中。
另一方面,本发明提供了在动物中刺激增强的免疫活性的方法,包括对动物施用前述任何组合物从而诱导增强的免疫应答。LNA配制剂可直接用作佐剂,或优选在疫苗制剂中与一或多种靶抗原联合。优选地,施用所述组合物能刺激动物免疫系统中的一或多种树突细胞。在一个实施方式中,靶抗原与本文所述的脂质-核酸配制剂结合给药,更优选与脂质颗粒结合给药。在进一步优选实施方式中,抗原包裹在脂质体颗粒中。在一些实施方式中,抗原含有来自一或多种肿瘤抗原或微生物抗原的一个或多个表位。
在进一步的方面,提供了刺激抗原呈递细胞的方法,包括在体外(invitro)、回体(ex vivo)或体内(in vivo)将至少一种抗原呈递细胞与本文所述免疫刺激组合物接触。在优选实施方式中,抗原呈递细胞包括树突细胞。
在一个实施方式中,提供了体内扩增树突细胞的方法,包括将受试脂质-核酸配制剂对宿主给药,所述配制剂含有于CpG二核苷酸中具有至少一个4mC或5mC的核酸序列,其中所述给药对在所述宿主中扩增树突细胞是有效的。优选地,所述树突细胞的扩增以表达至少CD11c和DEC205标记中的一种的宿主抗原呈递细胞数量的增加为特征。
在另一实施方式中,提供了体内活化树突细胞的方法,包括将所述脂质-核酸配制剂对宿主给药,所述配制剂含有于CpG二核苷酸中具有至少一个4mC或5mC的核酸序列,其中所述给药对在所述宿主中应答抗原刺激而扩增树突细胞是有效的。优选所述树突细胞的活化以宿主抗原呈递细胞数量的增加为特征,宿主抗原呈递细胞共表达CD11c或DEC205标记中至少一种以及CD86标记。在特别优选实施方式中,通过将所述配制剂与一或多种目的靶抗原联合给药、与脂质-甲基化核酸配制剂混合或结合,可刺激抗原。
附图说明
图1说明含有活化标记CD69的白血球的体外刺激,用游离寡核苷酸处理全血后获得的结果。用本文命名为ODN1的游离寡核苷酸或命名为ODN2的寡核苷酸在体外处理小鼠全血。
图2说明通过注射包裹的或游离ODN1和ODN2寡核苷酸产物在体内治疗小鼠,获得与体外相反的结果。
图3显示当被包裹在脂质小泡中时,甲基化ODN1m比未甲基化相应ODN1能更有效的刺激体内树突细胞活化。
图4A显示甲基化ODN1m和未甲基化ODN1都能在脾和全血中刺激CD11c阳性细胞扩增。
图4B显示ODN1和ODN1m都能在脾、全血和淋巴结中刺激DEC205阳性细胞扩增。
图5显示甲基化ODN1m比未甲基化相应ODN1能更有效地刺激CD86表达,各ODN均被脂质包囊。
图6显示体内施用游离寡核苷酸对刺激IL-6、IL-12、IFN-γ或MCP-1无作用。相反,体内施用脂质包裹的寡核苷酸能刺激这些每种细胞因子的产生。
图7A说明与游离寡核苷酸ODN1相比,通过用包裹的PO或PS寡核苷酸ODN1治疗小鼠增强了IL-12的诱导,测定了一段寡核苷酸剂量范围。图7B显示用包裹的PO寡核苷酸治疗能刺激强的IFN-γ早期诱导,而用包裹的PS寡核苷酸治疗刺激减小,但仍能有效的诱导IFN-γ。
图8显示IgM滴度比较,指示施用游离PO或PS寡核苷酸后的Th-1应答。
图9显示IgG的产生的比较,指示施用游离PO或PS寡核苷酸,包括甲基化寡核苷酸后的Th-2应答。
图10显示在一系列筛选施用甲基化或未甲基化脂质包裹的寡核苷酸处理的动物时,甲基化寡核苷酸比未甲基化寡核苷酸能大约一样地或更好的刺激树突细胞、NK细胞和CD8+T细胞的增殖。
图11A和B显示在一系列筛选施用甲基化或未甲基化脂质包裹的寡核苷酸处理的动物时,甲基化寡核苷酸能比未甲基化寡核苷酸更好的刺激细胞毒性T淋巴细胞和抗原-特异性淋巴细胞的增殖。
图11C说明从包括在图11A和图11B所描述的全部筛选中的典型四聚物研究获得的数据。
图12说明当以游离寡核苷酸对动物给药时,甲基化型比未甲基化核苷酸减小肿瘤生长的治疗效力低。
图13说明寡核苷酸的包裹为甲基化和未甲基化寡核苷酸提供了超过游离ODN的改进效力,尤其当寡核苷酸含有天然硫代磷酸酯(PS)骨架时。
图14显示当寡核苷酸含有磷酸二酯(PO)骨架时,寡核苷酸的包裹提供了甲基化和未甲基化寡核苷酸超过游离ODN的改进效力。
图15显示脂质包裹的PS寡核苷酸ODN2和ODN2m均表现出治疗效力。
图16说明对接种B16黑素瘤肿瘤的动物施用甲基化ODN1m的辅助效力和治疗效力。将ODN1m寡核苷酸包裹在脂质颗粒中增强了其减小肿瘤体积的效力。
图17显示对于一系列接种B16黑素瘤并接着施用20mg/kg剂量的寡核苷酸治疗的小鼠,用包裹的游离寡核苷酸ODN1和ODN1m治疗的小鼠中肿瘤的平均肿瘤大小。
图18显示当小鼠用包裹的甲基化ODN1m和未甲基化相应ODN1治疗时的肿瘤体积的减小。
图19显示在两种不同研究中,与用未甲基化ODN1治疗相比,用包裹的甲基化ODN1m治疗的小鼠的存活率。
图20说明当甲基化ODN1m和未甲基化相应ODN1被包裹在脂质颗粒中时对肿瘤体积的效力。
图21显示相对于用未甲基化的包裹的ODN1治疗,用包裹的甲基化ODN1m治疗的小鼠的存活率。
图22说明在治疗6天后,包裹的PS寡核苷酸ODN1和ODN2产生IFN-γ峰,其不是由包裹的PO寡核苷酸产生。
图23显示在有不同PEG-神经酰胺空间包被(PEG-ceramide steric coating)脂质颗粒中包裹的甲基化或未甲基化寡核苷酸对小鼠血液清除率的影响。
图24说明包裹甲基化或未甲基化CpG寡核苷酸的脂质体颗粒在通过对含有肿瘤的动物施用该组合物来治疗肿瘤时的治疗效力。
图25说明在一段时间内,甲基化PS-ODN5m的脂质包裹提供了比相同未甲基化PS-ODN5的包裹更有效的减小肿瘤生长的治疗效益。
图26显示相对于用未甲基化包裹的和游离的ODN5治疗,用游离的和包裹的甲基化ODN5m治疗小鼠的存活率。
图27说明当用游离的未甲基化和甲基化PS和POODN7以及游离和包裹的PO-ODN7m治疗时对肿瘤体积的效力。
图28显示与用包裹的PO ODN7m治疗相比,用游离的未甲基化和甲基化PS和PO ODN7治疗小鼠时的存活率。
图29显示在用多表位癌疫苗和包裹的ODN 1m免疫后,CTL对B16细胞靶的应答。
图30显示在用多表位癌疫苗和肽脉冲的(peptide-pulsed)树突细胞免疫后,CTL对B16细胞靶的应答。
图31显示在用肿瘤细胞溶菌产物和包裹的ODN 1m或树突细胞联合免疫后,CTL对B16细胞靶的应答。
发明详述
本发明是在发现,将甲基化核酸,尤其甲基化寡核苷酸,更尤其含有CpG二核苷酸基元的甲基化胞嘧啶的甲基化寡核苷酸包裹在脂质颗粒中,能在体外、回体和体内增强对免疫应答的刺激后,基于该发现提供了配制剂和及其使用方法。本发明还发现,脂质包裹的甲基化核酸,其通常以游离形式在体内不具免疫刺激性,事实上当包裹在所述制剂内时与其未甲基化对应物相比同样有效,在一些情况下能更有效的刺激免疫应答。
本发明通过检验由不同骨架形成、并包裹在不同脂质颗粒配制剂中的不同寡核苷酸的甲基化和未甲基化对应物进行举例说明。脂质包裹的甲基化寡核苷酸具有普通磷酸二酯骨架(PO)和硫代磷酸酯骨架(PS)时具有免疫刺激性。本发明还发现,在一些情况下,PO骨架能增强Th-1介导的细胞免疫应答,而PS骨架能刺激Th-1介导的体液免疫应答。在本发明的一些方面,脂质包裹的甲基化寡核苷酸进一步与靶抗原尤其是微生物抗原和/或肿瘤相关抗原联合。
尤其当根据本发明所述使用时,与现有技术报导的大量不同结果形成明显的对比,甲基化核酸序列的免疫刺激活性显著增强,在体内获得了增强的免疫刺激。进一步,在更宽范围的抗原呈递细胞,尤其是树突细胞中获得了免疫刺激活性。本发明第一次证明,用脂质包裹的甲基化寡核苷酸处理使得树突细胞活化和扩增。因此,本发明的另一方面是促进树突细胞的活化和/或扩增的方法。产生、利用和检测本发明不同配制剂的详细方法在下文和本文引证的文献(全部引入以供参考)中进行更详细说明。
缩写词和定义
本文中使用下述缩写:RBC,红细胞;DDAB,N,N-二硬酯基-N,N-二甲基溴化铵;DODAC,N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵;DOPE,1,2-sn-二油酰基磷脂酰乙醇胺;DOSPA,2,3-二油基氧-N-(2(精胺酰胺)乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸;DOTAP,1,2-二油基氧-3-(N,N,N-三甲基氨)氯丙烷;DOTMA,1,2-二油基氧-3-(N,N,N-三甲基氨)氯丙烷;OSDAC,N-油基-N-硬脂基-N,N-二甲基氯化铵;RT,室温;HEPES,4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸;FBS,胎牛血清;DMEM,Dulbecco改进的Eagle培养基;PEG-Cer-C.sub.14,1-O-(2′-(.ω.-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰(succinoyl))-2-N-肉豆蔻酰-鞘氨醇;PEG-Cer-C.sub.20,1-O-(2′-(.ω.-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰)-2-N-花生四烯酰(arachnidoyl)-鞘氨醇;PBS,磷酸盐缓冲液;THF,四氢呋喃;EGTA,亚乙基次氮基四乙酸;SF-DMEM,无血清DMEM;NP40,壬基苯氧基聚乙氧基乙醇,1,2-二油酰-3-二甲基氨丙烷(DODAP),棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
除非另外定义,属于本发明的本文中所用的技术和科学术语与本领域普通技术人员已知的技术和科学术语具有相同的意义。本文中的参考文献是本领域熟练技术人员已知的各种方法。用作参考的阐述已知方法的出版物和其它材料中的全部内容都在此通过引证引入本文。阐述常用重组DNA技术的标准文献著作包括:Sambrook,J.等分子克隆:实验室指南第二版,冷泉港实验室出版社,Planview,N.Y.(1989);McPherson,M.J.,Ed.,DirectedMutagenesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(1991);Jones,J.,AminoAcid and Peptide Synthesis,Oxford Science Publications,Oxford(1992);Austen,B.M.和Westwood,O.M.R.,Protein Targeting and Secretion,IRL Press,Oxford(1991)。在进行本发明时可使用任何本领域熟知的适合材料和/或方法;但是优选的材料和/方法如上所述。除非另外注明,下面描述和实施例中提及的材料和试剂等可从商业来源获得。我们相信本领域的技术人员在本文描述的基础上可最大限度的利用本发明。本申请中引用的所有文献(包括著作文献、授权专利、公开的专利申请和正审查的专利申请)的全部内容在此引入做参考。
本发明方法中使用的免疫刺激组合物通常指脂质-治疗剂(“LTA”)配制剂,其含有至少一种脂质成分和至少一种治疗剂,且其在体内比单个治疗剂具有更强的免疫刺激活性。本文中使用的“治疗剂”或“治疗化合物”或“药”可交换使用,是指在对受试者进行药物治疗时具有有益效果的任何合成分子、重组分子或天然分子。治疗剂的例子包括但不限于:核酸、肽和化学制剂。
在本文所述的优选实施方式中,治疗剂包含至少一种甲基化核酸序列,更优选至少一种甲基化寡核苷酸,最优选至少一种甲基化寡脱氧核苷酸(“ODN”)。在优选实施方式中,甲基化胞嘧啶残基是所述序列中CpG二核苷酸基元的一部分。CpG包含结合到至少一个胞嘧啶的C-4位(4-mC)或C-5位(5-mC)的甲基或羟甲基基团。在更优选实施方式中,甲基化核酸序列可选择地或额外地包含脱氧核糖或核糖糖部分的甲基修饰,如Henry等,2000,J.Pharmacol.Exp.Ther.292:468,Zhao等,1999 Bioorg.Med.Chem Lett,9:3453,Zhao等,2000 Biorg Med.Chem Lett.10:1051所述。在一个特别优选实施方式中,ODN包含具有免疫刺激活性的甲基化核酸序列,也称为未甲基化形式的免疫刺激序列(″ISS″)。
本文所用“受试者”或“宿主”指的是具有免疫系统的雄性或雌性生物,优选动物,更优选脊椎动物,甚至更优选哺乳动物,而且甚至更优选啮齿动物,最优选人。受试者的进一步例子包括但不限于狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔和大鼠。本文中所用“患者”是指需要对医学状况(如疾病或不适)进行治疗的受试者。
本文所用“在体内(in vivo)”是指在生物,优选哺乳动物,更优选啮齿动物,最优选人的体内。
本文所用“免疫刺激性”,“免疫刺激活性”或“刺激免疫应答”和其语法上的等同语是指诱导、增加、提高或调节免疫应答,或在免疫应答方面提供有益效果。如本文所用,“免疫应答”是指全身和/或粘膜的免疫应答。优选地,且考虑到现有技术报导的体外实验结果的较大差异,给定配制剂和核酸序列的免疫刺激活性由如本文所述的适合的体内试验测定。
本文所用“靶抗原”是指能指导或刺激免疫应答的目的抗原。本发明组合物中使用的刺激直接针对靶抗原的免疫应答的靶抗原可以是合成、天然或分离的分子或其片段,且可包含单一表位或多个表位。因此,本发明的组合物可刺激直接针对抗原的单一或多个表位的免疫应答。在优选实施方式中,靶抗原与本发明的脂质颗粒结合。本文就抗原(或靶抗原)而言的“结合”或其语法上的等同语是指抗原与其它成分结合或由其它成分包裹。对于本发明的脂质颗粒或脂质体而言,抗原可,例如包裹在脂质颗粒的腔或片层内部空间内;沉积在或附着在脂质膜内,或者部分沉积在或附着在脂质膜内,或者与脂质颗粒结合(如共价式结合或离子式结合)。抗原可与脂质颗粒内部结合,或更优选地抗原与脂质颗粒的外部结合。在优选实施方式中,抗原包裹在脂质颗粒内。
本发明的组合物和方法中有效的抗原的例子包括但不限于:肽或蛋白、细胞、细胞提取物、多糖、多糖偶联物、脂质、糖脂、糖肽和碳水化合物。在一个实施方式中,抗原是肽或蛋白抗原形式。在另一个实施方式中,抗原是编码肽或蛋白的核酸,其形式适合在受试者中表达并递呈给受试者的免疫系统。在优选实施方式中,本发明方法中使用的组合物包括肽或蛋白靶抗原,该靶抗原能在哺乳动物中刺激针对该靶抗原的免疫应答。优选地,靶抗原是能感染哺乳动物的病原体(“靶病原体”),包括:例如细菌、病毒、真菌、酵母、寄生虫和其它能感染哺乳动物物种的微生物。另外,靶抗原可以是肿瘤相关抗原。
本文所用“肿瘤相关抗原”是与肿瘤或癌细胞相关的分子或化合物(如蛋白、肽、多肽、脂质、糖脂、碳水化合物和/或DNA),在MHC分子环境中,当在抗原呈递细胞表面表达时其能引起免疫应答。肿瘤相关抗原包括自身抗原,以及其它当施用于动物时并不特别地与肿瘤相关但能提高免疫应答和/或减小肿瘤生长的抗原。考虑到自身免疫反应的潜在危险,在受试疫苗中的自身抗原的使用可限制到非重要组织,如乳房、前列腺、睾丸、黑素细胞等。本文提供了更具体的实施方式。
本文所用“微生物抗原”是微生物的抗原,包括但不限于感染性病毒、感染性细菌、感染性寄生虫和感染性真菌。微生物抗原可以是完整的微生物和其自然分离物、片段或衍生物;以及与天然微生物抗原相同或相似并且优选能够诱导特异于相应微生物(产生所述天然微生物抗原的微生物)的免疫应答的合成化合物。在优选实施方式中,当化合物诱导对天然微生物抗原的免疫应答(体液的或细胞的)时,该化合物与天然微生物抗原相似。与天然微生物抗原相似的化合物或抗原是本领域普通技术人员所熟知的。与天然微生物抗原相似的化合物的非限制性例子是多糖抗原的肽模拟物。本文提供了更具体的实施方式。
术语“抗原”还包括已知抗原或野生型抗原(如上述那些)的肽或蛋白类似物。类似物可比野生型抗原更易溶解或更稳定,还可包含突变或修饰而使抗原更具免疫活性。具有与所需抗原同源的氨基酸序列的肽或蛋白在本发明组合物和方法中也是有用的,其中同源性抗原诱导对相应病原体的免疫应答。
本文所用“同源的”是指两种聚合物分子,例如两种核酸分子(如两种DNA分子或两种RNA分子)或两种多肽分子的亚序列相似性。当一个亚序列位点在两种分子中为相同单体亚基所占据,例如,当一个位点在两种DNA分子中都被腺嘌呤占据,那么它们在该位点同源。两序列间的同源性是匹配或同源位点数量的直接函数,例如,当两种化合物序列中的一半位点(例如长为十个亚基的聚合物的五个位点)同源,那么这两个序列50%同源,如果90%的位点,例如10个中有9个匹配或同源,那么这两种序列具有90%同源性。例如,DNA序列5′-CCGTTA-3′和5′-GCGTAT-3′享有50%的同源性。本文中所用术语“实质上同源”是指与所需核酸有约50%同源性,更优选约70%同源性,甚至更优选约80%同源性,最优选约90%同源性的DNA或RNA。与所需抗原编码序列同源的基因应当包括在本发明内,只要其编码与所需抗原具有基本相似的生物活性的肽或多肽。在本文中,肽和/或DNA序列由他们与鉴定序列的百分比同源性或同一性定义,用来计算百分比同源性或百分比同一性的算法包括:Smith-Waterman算法(J.F.Collins等,Comput.Appl.Biosci.,(1988)4:67-72;J.F.Collins等,分子序列比较和比对(Molecular Sequence Comparison and Alignment),(M.J.Bishop等,eds.)实践方法系列:核酸和蛋白序列分析XVIII(In Practical Approach Series:NucleicAcid and Protein Sequence AnalysisXVIII),IRL Press:Oxford,England,UK(1987)417),以及BLAST和FASTA程序(E.G.Shpaer等,1996,Genomics,38:179-191)。这些文献在此引入以供参考。
本文所述抗原类似物可以与天然蛋白或肽不同在于保守氨基酸序列差异和/或不影响序列的修饰。例如可进行保守氨基酸改变,其虽然改变了蛋白或肽的主要序列,但是通常不改变其功能。修饰(通常不改变主要序列)包括多肽的体内或体外化学衍生作用,例如乙酰化作用或羧化作用。同样视为抗原的是糖基化修饰的蛋白,例如,通过在多肽合成和加工过程中或在进一步处理的步骤中修饰多肽的糖基化模式而获得的蛋白;例如将多肽与影响糖基化的酶,如哺乳动物糖基化或去糖基化酶接触而获得的蛋白。同样视为抗原的包括具有磷酸化氨基酸残基,例如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,或磷酸苏氨酸的氨基酸序列。同样视为抗原的还有通过常规分子生物技术修饰而提高对蛋白酶降解的抗性或使裂解特性最佳的多肽。所述多肽类似物包括下述多肽,它们含有除天然L-氨基酸之外的残基,例如D-氨基酸或非天然合成氨基酸。
本发明的抗原并不被限制到任何本文所列具体示例方法的产物。除了实质上全部长度的多肽外,本发明中使用的抗原包括多肽的免疫活性片段。例如,抗原可以是包括完整抗原中至少一个表位的片段。本文中所用“表位”是指抗原上可以与抗体的相对表位(paratope)结合的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团,例如氨基酸或糖侧链组成,并且通常具有特异的三维结构特性。本发明的组合物和方法的特别优选实施方式包括组合抗原,其含有多个来自相同靶抗原的表位,或来自两种或多种不同靶抗原的表位(即多表位(polytope)疫苗)。例如,组合抗原可以是相同或不同类型,如肽-肽抗原,糖脂-肽抗原或糖脂-糖脂抗原。
多肽或抗原当能诱导对靶抗原或病原体的免疫应答时具有“免疫活性”。本文所用“疫苗”是指含有靶抗原的组合物,其能刺激针对该靶抗原的特异性免疫应答。
本文所用“佐剂”是指能刺激或增强免疫应答此即的任何物质。有些佐剂可使免疫系统的细胞活化,例如,佐剂可使免疫细胞产生并分泌细胞因子。能使免疫系统的细胞活化的佐剂的例子包括但不限于:从Q.Saponaria树皮提纯的皂苷类,如QS21(经HPLC分级分离在第21个峰洗脱出的糖脂;Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Worcester,Mass.);聚(二(羧基化苯氧基)膦腈(PCPP聚合物,Virus Research Institute,USA);脂多糖衍生物,如单磷酰脂质A(MPL;Ribi ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Mont.),胞壁酰二肽(MDP;Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP;Ribi);OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖;OM Pharma SA,Meyrin,Switzerland);和利什曼虫(Leishmania)延伸因子(纯化的利什曼虫蛋白;Corixa Corporation,Settle,Wash.)。传统佐剂是本领域已知的,包括例如磷酸铝或氢氧化物(“明矾”)。
与已知佐剂相比,本发明提供了改良的佐剂,其包括能协同刺激偏向Th-1的增强型免疫应答的脂质和核酸组合。在优选实施方式中,本发明该组合物包括核酸成分和脂质成分,优选核酸成分包括至少一种寡核苷酸,更优选至少一种ODN,最优选至少一种含有至少一个CpG基元的ODN。
在优选实施方式中,本发明方法中所用的免疫刺激组合物包含脂质成分,该脂质成分包含包裹治疗剂的脂质膜。本文所用“脂质体颗粒”,“脂质体”,“脂质小泡(lipid vesicle)”和“脂质体小泡”或其语法上的等同语可交换使用,是指包含含脂质膜的结构、颗粒、复合物或配制剂,其中所述膜内部包装或包裹水相。在优选实施方式中,脂质体包装或包裹治疗剂,例如核酸。脂质体可有一个或多个脂质膜。具有一层脂质膜的脂质体在本文中指“单层”。具有多层脂质膜的脂质体在本文中指“多层”。“脂质双层”是指两层脂质膜。在优选实施方式中,脂质体是多层。
本发明方法中使用的免疫刺激组合物通常包含包裹至少一种甲基化核酸的脂质颗粒。
核酸
适合在本发明的组合物中使用的核酸包括,例如,DNA或RNA。优选地,核酸是寡核苷酸,更优选ODN,最优选包含ISS(“ISS ODN”)和至少一个甲基化胞嘧啶的ODN。
本文中“核酸”是指多核苷酸(即含有糖(如核糖或脱氧核糖)且所述糖与磷酸基团连接并与可替换的有机碱连接的分子,所述可替换的有机碱是取代的嘧啶(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)),或取代的嘌呤(如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。核酸可以是,例如DNA或RNA。优选地,核酸是寡核糖核苷酸,更优选ODN。核酸还可以是多核苷,即多核苷酸减去磷酸,以及任何其它含有有机碱的聚合物。本发明的免疫刺激组合物包含核酸成分。就本发明组合物而言的“核酸成分”是指含有核酸的成分。
在优选实施方式中,寡核苷酸是单链的,且长度为5-50个核苷酸(“nt”)。但可使用任何寡核苷酸,包括例如,长度为500-50,000个碱基(“bp”)的大型双链质粒DNA。
在本发明的组合物和方法中有用的核酸可获自已知来源或使用本领域熟知的方法分离。核酸也可以通过本领域熟知的重组或合成方法制备。然后,将所述核酸包裹在脂质颗粒中,并使用本发明所述方法检测所得组合物的免疫刺激活性。
为了在体内使用,核酸可以对降解(如通过外切核酸酶或内切核酸酶的降解)有抵抗性。二级结构,如茎环结构能使核酸稳定抵抗降解。另外,可通过磷酸骨架修饰实现核酸稳定。优选的稳定的核酸至少有部分硫代磷酸酯修饰的骨架。硫代磷酸酯可利用自动技术应用亚磷酰胺(phosphoramidate)或H-磷酸酯化学来合成。芳基磷酸酯和烷基磷酸酯可如美国专利US4,469.863所述来制备;烷基磷酸三酯(其中带电的氧组分被烷基化,如美国专利US5,023,243和欧洲专利EP092,574所述)可利用商购试剂通过自动固相合成来制备。进行其它DNA骨架修饰和取代的方法已有描述(Uhlmann和Peyman,Chem.Rev.90:544,1990;Goodchild,Bioconjugate Chem.1:165,1990)。但如本文所述,本发明的方法和组合物减少了对受试核酸进行上述修饰的需要。
因此,在本发明组合物和方法中有用的寡核苷酸具有修饰的磷酸盐骨架,如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及其相互组合和/或其与磷酸二酯寡核苷酸的组合。此外,其它修饰的寡核苷酸包括:非离子性DNA类似物,如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电的磷酸氧被烷基或芳基取代)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯,其中带电的氧组分被烷基化。如本文所示,在需要细胞免疫应答处,优选PO ODN,而在需要体液免疫应答处优选修饰的ODN,如PS ODN。
对碱基、糖或键组分的多种其它化学修饰也是有效的。碱基可以是甲基化的或未甲基化的。在优选实施方式中,甲基或羟甲基基团结合到至少一个胞嘧啶的C-4位(4-mC)或C-5位(5-mC)。甲基化胞嘧啶优选位于核酸序列中的CpG基元中。另外,如本领域所述可用甲基修饰糖组分。
在本发明组合物和方法中有用的核酸序列可与病人/个体mRNA互补,如反义寡核苷酸,或可以是外源或非互补的(如核酸序列不能与病人/个体基因组专一性杂交)。核酸序列可以是表达的,且获得的表达产物可以是RNA和/或蛋白。另外,所述核酸序列可与合适的启动子和表达元件连接,并且可包含在表达载体内。在本发明组合物和方法中有用的核酸序列可以是ISS,如一些回文序列,它们形成发夹二级结构(见Yamamoto S.等(1992)J.Immunol.148:4072-4076),或CpG基元或其它已知的ISS特征(例如多G结构域,参见WO 96/11266)。在特别优选实施方式中,核酸序列包含至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG基元。
本发明的核酸可利用本领域熟知的任何方法从头(de novo)合成。例如,β-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage,S.L.和Caruthers,M.H.,Tet.Let.22:1859,1981);核苷H-磷酸酯法(Garegg等,Tet.Let.27:4051-4054,1986;Froehler等,Nucl.Acid.Res,14:5399-5407,1986;Garegg等,Tet.Let.27:4055-4058,1986,Gaffney等,Tet.Let.29:2619-2622,1988)。这些化学反应可在市场上可购得的不同自动寡核苷酸合成仪上进行。而且,CpG二核苷酸可在质粒中大规模生产,(参见Sambrook,T.等,分子克隆:实验室指南,冷泉港实验室出版社,纽约,1989)。所述质粒编码表达的其它基因,如在DNA疫苗情况下的抗原编码基因。利用已知技术,如应用限制性酶、外切酶或内切酶从存在的核酸序列(如基因组的或cDNA)制备寡核苷酸。
为了体内给药,可将本发明组合物,包括该组合物的成分(例如脂质成分或核酸成分),与导致高亲和力结合靶细胞(如B细胞、单核细胞和自然杀伤(NK)细胞)表面和/或促进被靶细胞吸收的分子结合。本发明组合物,包括该组合物的成分,可利用本领域熟知的技术与期望的分子离子地或共价地结合。各种偶联剂或交联剂是可使用的,例如蛋白A、碳二亚胺和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。
核酸序列在生物中的免疫刺激活性可通过简单的实验,例如通过将待测序列与其它免疫刺激剂,如其它佐剂或ISS进行比较;或通过检测或测量待测序列的免疫刺激活性,如通过检测或测量宿主防御机制的活化或免疫系统成分的活化来确定。所述实验是本领域所熟知的。本领域熟练技术人员应该知道如何利用本文所述和/或本领域已知的常规试验识别对感兴趣的具体哺乳动物有用的最佳寡核苷酸。
适用于本发明组合物和方法中的具体ODN核酸序列在美国专利申请US60/379,343,US09/649,527,国际专利申请WO02/069369,WO01/15726,美国专利US6,406,705和Raney等,Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics,298:1185-1192(2001)(在此全部引入以供参考)中进行了描述。ODN序列的例子包括但不限于表1中所示的核酸序列。在优选实施方式中,本发明的组合物和方法中使用的ODN具有磷酸二酯(″PO″)骨架或硫代磷酸酯(″PS″)骨架和至少一个在CpG基元中的甲基化胞嘧啶残基。
表1
ODN名称 | ODN序列号 | ODN序列(5’-3’) |
ODN 1(INX-6295) | SEQ ID NO:2 | 5′-TAACGTTGAGGGGCAT-3 |
人c-myc | ||
*ODN im(INX-6303) | SEQ ID NO:4 | 5′-TAAZGTTGAGGGGCAT-3 |
ODN 2(INX-1826) | SEQ ID NO:1 | 5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3 |
*ODN 2m(INX-1826m) | SEQ ID NO:31 | 5′-TCCATGAZGTTCCTGAZGTT-3 |
ODN 3(INX-6300) | SEQ ID NO:3 | 5′-TAAGCATACGGGGTGT-3 |
ODN 5(INX-5001) | SEQ ID NO:5 | 5′-AACGTT-3 |
ODN 6(INX-3002) | SEQ ID NO:6 | 5′-GATGCTGTGTCGGGGTCTCCGGGC-3′ |
ODN 7(INX-2006) | SEQ ID NO:7 | 5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′ |
ODN 7m(INX-2006m) | SEQ ID NO:32 | 5′-TZGTZGTTTTGTZGTTTTGTZGTT-3′ |
ODN 8(INX-1982) | SEQ ID NO:8 | 5′-TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3′ |
ODN 9(INX-G3139) | SEQ ID NO:9 | 5′-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3′ |
ODN 10(PS-3082)鼠细胞内粘附分子-1 | SEQ ID NO:10 | 5′-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3 |
ODN 11(PS-2302)人细胞内粘附分子-1 | SEQ ID NO:11 | 5′-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3′ |
ODN 12(PS-8997)人细胞内粘附分子-1 | SEQ ID NO:12 | 5′-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3′ |
ODN 13(U53)人erb-B-2 | SEQ ID NO:13 | 5′-GGT GCTCACTGC GGC-3′ |
ODN 14(LR-3280)人c-myc | SEQ ID NO:14 | 5′-AACC GTT GAG GGG CAT-3′ |
ODN 15(LR-3001)人c-myc | SEQ ID NO:15 | 5′-TAT GCT GTG CCG GGG TCT TCGGGC-3′ |
ODN 16(Inx-6298) | SEQ ID NO:16 | 5′-GTGCCG GGGTCTTCGGGC-3′ |
ODN 17(hIGF-1R)人胰岛素生长因子1受体 | SEQ ID NO:17 | 5′-GGACCCTCCTCCGGAGCC-3′ |
ODN 18(LR-52)人胰岛素生长因子1受体 | SEQ ID NO:18 | 5′-TCC TCC GGA GCC AGA CTT-3′ |
ODN 19(hEGFR)人表皮生长因子受体 | SEQ ID NO:19 | 5′-AAC GTT GAG GGG CAT-3′ |
ODN 20(EGFR)表皮生长因子受体 | SEQ ID NO:20 | 5′-CCGTGGTCA TGCTCC-3′ |
ODN 21(hVEGF)人血管内皮生长因子 | SEQ ID NO:21 | 5′-CAG CCTGGCTCACCGCCTTGG-3′ |
ODN 22(PS-4189)鼠磷酸激酶C-α | SEQ ID NO:22 | 5′-CAG CCA TGG TTC CCC CCAAC-3′ |
ODN 23(PS-3521) | SEQ ID NO:23 | 5′-GTT CTC GCT GGT GAG TTTCA-3′ |
ODN 24(hBcl-2)人Bcl-2 | SEQ ID NO:24 | 5′-TCT CCCAGCGTGCGCCAT-3′ |
ODN 25(hC-Raf-1)人C-Raf-s | SEQ ID NO:25 | 5′-GTG CTC CAT TGA TGC-3′ |
ODN#26(hVEGF-R1)人血管内皮生长因子受体-1 | SEQ ID NO:26 | 5′-GAGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUCUG-3′ |
ODN#27 | SEQ ID NO:27 | 5′-RRCGYY-3′ |
ODN#28(INX-3280) | SEQ ID NO:28 | 5′-AACGTTGAGGGGCAT-3′ |
ODN#29(INX-6302) | SEQ ID NO:29 | 5′-CAACGTTATGGGGAGA-3′ |
ODN#30(INX-6298)人c-myc | SEQ ID NO:30 | 5′-TAACGTTGAGGGGCAT-3′ |
“Z”代表甲基化胞嘧啶残基
注:ODN14是15-mer寡核苷酸,ODN1是相同的寡核苷酸在5’端添加一个胸腺嘧啶核苷而使得ODN1成为16-mer。在ODN14和ODN1之间未检测到生物活性差异,而且二者都显示了相似的免疫刺激活性(Mui等,2001)。
脂质和其它成分
脂质配制剂和制备作为传送工具(delivery vehicle)的脂质体的方法是本领域已知的,任何所述配制剂都可在本文中发现其优势用途,包括在美国专利US6,465,439,US6,379,698,US6,365,611和US6,093,816中所描述的配制剂,其所公开的内容在此引入以供参考。优选的脂质配制剂是本文所述的脂质颗粒配制剂,并且在例如美国专利US5,785,992,US6,287,591,US6,287,591B1,正审查的美国专利申请序列号US60/379,343和正审查的美国专利申请序列号US09/649,527(在此引入以供参考)中有更详细的描述。
在一个优选实施方式中,优选的脂质配制剂是比例为20∶25∶45∶10mol/mol的DSPC,DODMA,Chol和PEG-DMG。本文所用脂质配制剂中每种脂质的摩尔量按照脂质被列出的顺序给出(例如DSPC∶DODMA∶Chol∶PEG-DMG的比为20DSPC∶25DODMA∶45Chol∶10PEG-DMG或“20∶25∶45∶10”)。在另外的实施方式中,可用POPC代替DSPC,DODAP代替DODMA,用PEGCer14或PEGCer20代替PEG-DMG。
术语“脂质”是指一组有机化合物,是脂肪酸酯,其特征是不溶于水但溶于许多有机溶剂。它们通常分为至少三类:(1)“单脂”,包括脂肪和油,以及蜡;(2)“化合物脂质”,包括磷脂和糖脂;和(3)“衍生脂质”,例如类固醇和衍生自脂质操作的化合物。本发明可使用各种各样的脂质,一些如下所述。
术语“带电荷的脂质”指带有正电荷或负电荷的脂质,或是并非净中性电荷的两性离子,通常需要考虑该脂质所处的溶液的pH。
在生理pH中带正电荷的脂质包括但不限于:N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(″DODAC″);N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(″DOTMA″);N,N-二硬酯基-N,N-二甲基溴化铵(″DDAB″);N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(″DOTAP″);3b-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(″DMRIE″)。另外,可购得许多能用于本发明的阳离子脂质的商品。这些包括例如LipofectinTM(商业购得的阳离子脂质体,含有DOTMA和1,2-二油基-sn-3-磷脂酰乙醇胺(″DOPE″),来自GIBCO/BRL,Grand Island,New York,USA);LipofectamineTM(商业购得的阳离子脂质体,含有N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(″DOSPA″)。
一些带正电荷的(cationic charged)脂质是可滴定的,即它们的pKa是生理pH值或者接近该值,这对于本发明的重要意义在于,在温和的酸性条件下它们是强阳离子,而在生理pH值它们则表现为弱(或者没有)阳离子性。这些带正电荷的脂质包括但不限于N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N-二甲基氯化铵(“DODMA”)和1,2-二油基-3-二甲基丙铵(“DODAP”)。DMDMA也是有用的可滴定阳离子脂。
在生理pH中带负电荷的(anionic charged)脂质包括但不限于:磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二磷脂酰甘油、聚(乙二醇)-磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸等。
一些带负电荷的脂质是可滴定的,即它们具有处在生理pH或接近生理pH值的pKa,这对于本发明的重要意义在于,在温和的碱性条件下它们是强阴离子,而在生理pH值它们则表现为弱(或者没有)阴离子性。本领域技术人员可根据本文所公开的原理鉴定这些带负电荷的脂质。
术语“中性脂质”指在生理pH值以不带电荷或中性的两性离子形式存在的许多脂质中的任何一种,这些脂质包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
本发明使用的一些优选脂质配制剂包括阻止聚集的化合物,如PEG-脂质或聚酰胺寡聚物-脂质(如ATTA-脂质),和其它的空间屏障脂质或“隐秘(stealth)”脂质、去污剂(detergent)等。在美国专利US4,320,121,US5,820,873,US5,885,613,国际申请WO98/51278和涉及聚酰胺寡聚物的美国专利申请序列号US09/218,988中描述了这些脂质,在此引入以供参考。这些脂质和去污剂化合物防止含有相反电荷脂质和治疗剂的配制剂沉淀和聚集。这些脂质还可用于改善体内循环寿命(见Klibanov等(1990),FEBS Letters,268(1):235-237),或者在体内被选择快速从配制剂中替换出来(见美国专利5,885,613,引入以供参考)。
本发明的优选实施方式使用可替换的空间屏障脂质(如美国专利US5,820,873,美国专利US5,885,613和美国专利申请序列号09/094540和美国专利US6,320,017所述,在此引入以供参考)。可替换的空间屏障脂质,如PEG2000-CerC14和ATTA8-CerC14,是在施给受试者/病人后被迅速替换出脂质颗粒外侧单层的空间屏障脂质。每种这样的脂质都具有从颗粒替换出来的特征性速率,这由各种因素,包括酰基链长度、饱和度、空间屏障组分的大小、膜的组成和血清的组成等决定。这类脂质可用于在颗粒形成过程中防止聚集,它们在给药后从颗粒加速分离,这提供了益处,例如可控的致融合性和颗粒去稳定活性,如上述专利中所述。
一些脂质颗粒配制剂可使用为了促进脂质体在一些靶细胞或靶组织定位而设计的靶向组分。靶向组分可在配制过程中或配制后与脂质颗粒的外层双层结合(即通过直接偶联、疏水相互作用等结合)。这些方法是本领域所熟知的。另外,一些脂质颗粒配制剂可使用致融合聚合物,如PEAA、血凝素、其它脂肽(参见美国专利6,417,326和美国专利09/674,191,所有文献在此引入以供参考)和其它可用于体内和/或细胞内传送的物质。
在另一个优选实施方式中,本发明的脂质成分脂质颗粒含有鞘磷脂和胆固醇(″sphingosomes″)。在优选实施方式中,本发明组合物和方法中使用的脂质颗粒含有鞘磷脂和胆固醇并且具有酸性的脂质体内部pH值。与其它配制剂相比,含有鞘磷脂和胆固醇的脂质颗粒具有许多优点。与所检测的其它脂质体配制剂相比,鞘磷脂/胆固醇组合产生具有延长的循环寿命的脂质体,它们在酸性水解作用中更加稳定,有更好的药物滞留特性,有更好的加载入肿瘤等特性,且显示了明显更好的抗肿瘤效力。
在优选实施方式中,本发明的脂质颗粒包含化学式I所示的阳离子化合物和至少一种下述中性脂质(其如美国专利5,785,992中全面所述,在此引入以供参考)。在优选实施方式中,本发明的LNA配制剂包含化学式I所示的阳离子化合物和至少一种下述中性脂质(其如美国专利5,785,992中全面所述,在此引入以供参考)。
在化学式I中,R1和R2分别是C1到C3烷基。Y和Z是烷基或烯基链,且分别为:--CH2CH2CH2CH2CH2--、--CH=CHCH2CH2CH2--、--CH2CH=CHCH2CH2--、--CH2CH2CH=CHCH2--、--CH2CH2CH2CH=CH--、--CH=CHCH=CHCH2--、--CH=CHCH2CH=CH--或--CH2CH=CHCH=CH--,但Y和Z不同时为--CH2CH2CH2CH2CH2--。字母n和q为整数3-7。字母m和p为整数4-9,且n+m和q+p的和均为整数10-14。符号X-代表可药用阴离子。在上述化学式中,双键的取向可以是顺式或反式,但是通常优选顺式异构体。
在另一个优选实施方式中,阳离子化合物具有化学式I,其中R1和R2是甲基,Y和Z分别为:--CH=CHCH2CH2CH2--、--CH2CH=CHCH2CH2--、--CH2CH2CH=CHCH2--或--CH2CH2CH2CH=CH--。在优选实施方式中,R1和R2是甲基;Y和Z均为--CH=CHCH2CH2CH2--;n和q都为7;m和p都为5。在另一个优选实施方式中,阳离子化合物是DODAC(N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵)。DODAC是本领域的已知物,并且是广泛用作去污剂和洗发剂中的添加剂的化合物。DODA也在具有其它去污剂的脂质体组合物中作为协同脂质(co-lipid)(参见Takahashi等,GB2147243)。
本发明LNA配制剂中的中性脂质可以是通常用在去污剂中,或用于形成胶粒(micelle)或脂质体的多种中性脂质中的任何一种。在本发明组合物中有用的中性脂质的例子包括但不限于二酰基磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂和脑苷脂。在优选实施方式中,本组合物包括一或多种中性脂质,它们是二酰基磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺或鞘磷脂。这些中性脂质中的酰基优选为衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基。更优选地,酰基是月桂酰、肉豆寇酰、棕榈酰、硬脂酰或油酰基。在特别优选实施方式中,中性脂质是1,2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺。
阴离子,X-同样可以是多种可药用阴离子中的任何一种。这些阴离子可以是有机的或无机的,包括例如Br-、Cl-、F-、I-、硫酸根、磷酸根、醋酸根、硝酸根、苯甲酸根、柠檬酸根、谷氨酸根和乳酸根。在优选实施方式中,X-是Cl-或AcO-。
除了本文中描述的其它成分之外,本发明组合物可包括可药用载体。可药用载体为本领域所熟知。对载体的选择一部分由施用的特定组合物以及施用组合物的特定方法所决定。优选地,药学载体在溶液中,在水或盐水中。
在本发明的组合物中,阳离子化合物与中性脂质的比率优选从约25∶75(阳离子化合物∶中性脂质),到优选75∶25(阳离子化合物∶中性脂质)或优选约50∶50范围内。
在本发明组合物中使用的阳离子化合物可利用标准合成反应(参见March,Advanced Organic Chemistry,4th Ed.,Wiley-Interscience,NY,N.Y.1992,在此引入以供参考)通过本领域技术人员熟知的方法制备。例如,OSDAC的合成可通过在导致胺的还原性烷基化的条件下,首先用甲醛和氰基氢硼化钠处理油胺而进行。该方法提供了二甲基油胺,然后可用硬脂基溴化物将其烷基化从而形成相应铵盐。阴离子的替换导致形成OSDAC。二甲基油胺还可通过用过量的二甲基胺处理油基溴化物来合成,并如上所述进一步衍生。
对于两个脂肪酸链均未饱和的阳离子化合物(如DODAC),可使用下述常规方法。用试剂如草酰氯、亚硫酰氯、PCl3和PCl5,可使未饱和酸(如油酸)转化为相应酰基氯。可将酰基氯与未饱和胺(例如油胺)反应从而生成相应酰基胺。用例如氢化铝锂还原酰基胺产生仲胺,其中两个烷基基团都是未饱和长链烷基基团。然后用卤代烷,如甲基碘处理仲胺,产生季铵化合物。然后进行阴离子交换,产生含有所需药学上可接受阴离子的阳离子化合物。烷基胺前体可用相同的方式合成。例如,用过量的氨的甲醇溶液与卤代烷反应,纯化后产生需要的胺。另外,用草酰氯处理合适的羧酸产生的酰基氯可与氨反应而产生酰胺。用LiAlH4还原酰胺将产生需要烷基胺。
在优选实施方式中,本发明的药物组合物配制为胶粒或脂质体。本发明的含有阳离子化合物和中性脂质的胶粒可通过本领域熟知的方法制备。除了本组合物的胶粒配制剂,本发明还提供了包括其它物质的胶囊配制剂,所述其它物质如溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯偶联物、神经酰胺-聚氧乙烯偶联物或磷脂酸-聚氧乙烯偶联物。
本发明组合物中使用的聚氧乙烯偶联物可通过偶联基团(如磷脂酸或磷脂酰乙醇胺)与适合的功能性聚氧乙烯衍生物组合来制备。例如,磷脂酰乙醇胺可与ω-甲氧聚乙烯乙二醇琥珀酸酯化合生成磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯偶联物(参见,例如Parr等,Biochim.Biophys.Acta 1195:21-30(1994),在此引入以供参考)。
用在本发明组合物和方法中的中性脂质的选择通常考虑例如,脂质体大小和在血清中脂质体的稳定性。如上所述,脂质体中的中性脂质组分是具有两个酰基基团(即二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰-乙醇胺)的脂质。可商购或分离或通过已知的技术合成具有不同链长度和饱和度的不同酰基链基团。通常,较低饱和度的脂质更容易成形,尤其当出于过滤杀菌的目的,脂质体必须是低于约0.3微米的大小时。在一组实施方式中,优选碳链长度为C14到C22个范围的含有饱和脂肪酸的脂质。在另一组实施方式中,使用碳链长度为C14到C22个范围的具有单一或二个未饱和脂肪酸的脂质。另外,可使用具有饱和和未饱和脂肪酸链的混合脂质。
在本发明组合物和方法中有用的脂质体还可含有具有其它头部基团(如丝氨酸和肌醇)的鞘磷脂或磷脂。在本发明组合物和方法中有用的其它脂质体包括胆固醇、甘油二酯、神经酰胺、磷脂酰乙醇胺-聚氧乙烯偶联物、磷脂酸-聚氧乙烯偶联物或聚氧乙烯乙二醇-神经酰胺偶联物(如PEG-Cer-C14或PEG-Cer-C20)。用于按大小分配(sizing)和过滤除菌的脂质体的方法见下文。
各种制备脂质体的方法是本领域已知的(见如,Szoka等,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980),美国专利4,235,871,4,501,728,4,837,028,the text Liposomes,Marc J.Ostro,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1983,第1章和Hope等,Chem.Phys.Lip.40:89(1986),其全部引入以供参考)。一种已知方法产生不均一尺寸的多层小泡。在该方法中,形成小泡的脂质溶于合适的有机溶剂或溶解体系中,真空条件下干燥或充入气体以形成薄脂质膜。如果需要的话,膜可再溶于合适的溶剂如叔丁醇,然后冻干形成更均一更易水合的粉状脂质混合物。该膜用含水缓冲液覆盖并使之水合,一般是搅拌15-60分钟。通过在更激烈的搅拌条件下或通过添加可溶去污剂,如脱氧胆酸盐可使获得的多层小泡的尺寸分布向更小的尺寸转换。
随后的脂质体制备,脂质体可获得需要的尺寸范围和相对狭小的脂质体大小分布。经传统过滤器,通常经0.22微米过滤器过滤,可使约0.2-0.4微米大小的脂质体悬液灭菌。如果已将脂质体筛分到约0.2-0.4微米,就可在高通量的基础上进行过滤除菌法。
许多技术可用于筛分脂质体到所需大小。美国专利4,737,323中描述了一种筛分方法,在此引入以供参考。通过浴超声或探针超声处理脂质悬浮液,产生尺寸逐渐减小到大小小于约0.05微米的小的单层小泡。均质化是另一种方法,该方法依赖于剪切能量将大脂质体剪切成较小的脂质体。在一般的均质化过程中,将多层小泡循环通过标准的乳化液均化器,直到观察到所选择尺寸的脂质体,一般约为0.1-0.5微米。在这两种方法中,可使用传统激光束粒子大小鉴定器测定颗粒大小的分布。
通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜将脂质体挤出也是一种有效的将脂质体大小减小到相对充分限定的大小分布的方法。通常,将悬浮液循环通过膜一次或多次,直到获得所需尺寸的脂质体。可将脂质体挤过孔越来越小的膜,以逐渐减小脂质体尺寸。为了在本发明中使用,优选脂质体大小为约0.05微米-约0.15微米。
如下更进一步的描述,本发明的组合物可以任何已知的给药途径施于受试者。一旦被细胞吸收,脂质体(包括先前所述的复合物)可被细胞部分内吞,使脂质与细胞膜交换,或与细胞融合。通过这些途径中的任何一种,都可发生复合物的聚阴离子部分的转移或结合。特别是当发生融合时,脂质体膜可整合进细胞膜且脂质体组分可与细胞内液混合。
如下更详细的描述,可将也是治疗性化合物的其它组分添加到本发明的脂质颗粒中,以使治疗性化合物靶向特异性细胞类型。例如,脂质体可与单克隆抗体或其结合片段结合,其中其结合片段结合到存在于特异性细胞类型的表位,如肿瘤相关抗原,提供在全身给药后脂质体的靶向方法。另外,结合靶细胞的表面受体的配体也可与脂质体结合。本发明还可使用其它靶向脂质体的方法。
在分离步骤后,由于可能需要从含有脂质体的介质中除去游离药物,使脂质体悬浮液达到可药用载体中的所需浓度以便对患者或宿主细胞给药。多种可药用载体可用于本发明的组合物和方法。可使用各种含水载体,例如水、缓冲的水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸以及类似的载体,包括用于提高稳定性的糖蛋白,如清蛋白、脂蛋白和球蛋白。通常,可用生理盐水(135-150mM NaCI)作为可药用载体,但其它合适的载体也可使用。这些组合物可通过常规脂质体灭菌技术,如过滤除菌。组合物可包含对接近生理条件所需的可药用辅助物质,如PH调节剂和缓冲剂、张力调节剂以及类似物质,例如乙酸钠,乳酸钠,氯化钠,氯化钾,氯化钙。这些组合物可通过上面提及的技术灭菌或在无菌条件下产生。所得水溶液可被包裹以供使用,或在无菌条件下过滤并冻干,在给药之前将冻干的制品与无菌的水溶液混合。
载体中的脂质体浓度可改变。在优选实施方式中,脂质体浓度是约0.1-200mg/ml。精通技术的技术人员应该知道如何改变它们的浓度,使得用不同脂质体组分进行的处理最佳化或使得对具体患者而言最佳化。例如,可增加浓度以减小与治疗相关的流体负荷。
受试者的细胞通常通过体内或体外给药与本发明组合物接触。在本文描述的优选实施方式中,将本发明的组合物全身性给药,例如静脉给药,并且尝试肌内、皮下和局部给药。换句话说,可使用鼻内或气管内给药。可以液体,优选气雾剂进行气管内给药。例如,可用喷雾器产生70-100pm直径的气雾滴。应该理解,滴大小应该通常大于脂质体大小。
尝试了多种对患者的给药方式。施用的用药方案由疾病和患者状况决定。本领域所熟知的施用治疗性化合物,包括免疫刺激性组合物(如疫苗)的标准可作为施用包含治疗性化合物的脂质体的指导。施用的持续时间和方案可通过本领域熟知的方法改变,但是循环时间的增加和脂质体消耗的减少通常允许将用药剂量调节到低于先前的施用量。本发明的脂质体剂量可根据接受治疗的动物或患者的临床状况和大小改变。当不被包裹时,治疗性化合物的标准剂量可作为脂质体包裹的化合物的剂量指导。通常,剂量应该在治疗过程中是恒定的,虽然,在一些情况下可能会改变。可在治疗期间确定标准生理学参数,以用来改变本发明脂质体的剂量。
抗原
如本文所述,脂质体包裹的甲基化核酸可与至少一种靶抗原结合。在本发明的组合物和方法中有用的抗原可以是本身具有免疫原性的抗原,或无免疫原性的抗原,或免疫原性微弱的抗原。抗原的例子包括,但不限于:合成的、重组的、外源的或内源的抗原。抗原的进一步的例子包括,但不限于:HBA-乙肝抗原(重组或其它的);其它肝炎肽;HIV蛋白GP120和GP160;支原体细胞壁脂质;任何肿瘤相关抗原;癌胚抗原(CEA);其它作为肿瘤特异性抗原表达的胚性肽;细菌细胞壁糖脂;神经节苷脂(GM2、GM3);分枝杆菌糖脂;PGL-1;Ag85B;TBGL;淋病奈瑟氏球菌的淋球菌脂-寡糖表位2C7;Lewis(y);Globo-H;Tn;TF;STn;PorA;TspA或病毒糖脂/糖蛋白和表面蛋白。
抗原可以是肽抗原形式,或可以是编码抗原性肽的核酸,其形式适合在受试者内表达,并递呈给致敏受试者的免疫系统。抗原还可以是糖脂或糖蛋白。更进一步,抗原可以是完整抗原,或可以是含有完整抗原的至少一个治疗相关表位的片段。本文中所用“组合抗原”是指含有多个来自相同靶抗原的表位或来自两种或多种不同靶抗原的多个表位(多价疫苗)的抗原,所述靶抗原可以是相同类型的靶抗原(如两个抗原都是肽,或两个抗原都是糖脂),或不同类型的靶抗原(如糖脂抗原和肽抗原)。
在本发明的组合物和方法中,抗原可以是粗提取物、纯化、合成、分离或重组形式。由核酸编码的多肽或肽抗原(包括,例如作为多糖的肽模拟物的抗原)也可用于本发明的组合物和方法中。术语“抗原”广义上包括对被宿主免疫系统识别为外源物质的任何类型的分子。抗原包括,但不限于肿瘤抗原、微生物抗原和过敏原。
广泛多种抗原适合用于本发明的配制剂中。通常,抗原是施给脊椎动物宿主,使宿主对相同物质免疫的物质。抗原一般包含与疾病状态,如病毒感染、细菌感染和各种恶性肿瘤相关的物质。这些物质包括但不限于:蛋白、肽、多肽、脂质、糖脂、碳水化合物和DNA。
脂质配制剂抗原可用脂质体或脂质颗粒包裹、与脂质体或脂质颗粒结合或混合。在本发明的一些实施方式中,抗原包裹在脂质体或脂质颗粒中。在其它的实施方式中,抗原与脂质体或脂质颗粒混合。在其它的实施方式中,抗原与脂质体或脂质颗粒结合。一方面,抗原被吸附至脂质体或脂质颗粒。另一方面,抗原与脂质体或脂质颗粒共价结合。用于将抗原与脂质体或脂质颗粒共价结合的方法是本领域技术人员熟知的常规方法。
适合在本发明中使用的抗原的例子包括但不限于:多肽抗原和DNA抗原。抗原的具体例子是:甲型肝炎、乙型肝炎、天花、脊髓灰质炎、炭疽、流感、斑疹伤寒、破伤风、麻疹、轮状病毒、白喉,百日咳,结核和风疹的抗原。在优选实施方式中,抗原是乙型肝炎重组抗原。在其它方面,抗原是甲型肝炎重组抗原。在另一方面中,抗原是肿瘤抗原。所述肿瘤相关抗原的例子是MUC-1、EBV抗原和与Burkitt′s淋巴瘤相关的抗原。在进一步的方面中,抗原是酪氨酸酶相关蛋白肿瘤抗原重组抗原。本领域的技术人员知道适合用于本发明的其它抗原。
适合在本发明中使用的肿瘤相关抗原包括突变和未突变分子,其可表示单一肿瘤类型,在许多类型的肿瘤中共有,和/或与正常细胞相比,在肿瘤细胞中唯一表达或过表达。除了蛋白和糖蛋白之外,碳水化合物、神经节苷脂、糖脂和粘蛋白的肿瘤特异性表达形式也已有文献记载。Moingeon,见上。在本发明癌疫苗中使用的肿瘤相关抗原实例包括癌基因、肿瘤抑制基因和有肿瘤细胞特有突变或基因重排的其它基因的蛋白产物,再活化的(reactivated)胚胎基因产物,胚性癌抗原(oncofetal antigen),组织特异性(但不是肿瘤特异性)分化抗原,生长因子受体,细胞表面的碳水化合物残基、外源病毒蛋白和多种其它自身蛋白。
肿瘤相关抗原的具体实施方式包括,例如突变的抗原,如Ras p21原癌基因的蛋白产物、肿瘤抑制基因p53和HER-2/neu和BCR-abl癌基因,以及CDK4、MUM1、Caspase 8和β连环蛋白;过表达的抗原,如galectin 4、galectin 9、碳酸酐酶、Aldolase A、PRAME、Her2/neu、ErbB-2和KSA;胚性癌抗原,如甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG);自身抗原,如癌胚抗原(CEA)和黑素细胞分化抗原,如Mart 1/Melan A、gp100、gp75、酪氨酸酶、TRP1和TRP2;前列腺相关抗原,如PSA、PAP、PSMA、PSM-P1和PSM-P2;再活化的胚胎基因产物,如MAGE 1、MAGE 3、MAGE 4、GAGE 1、GAGE 2、BAGE、RAGE和其它癌睾丸抗原,如NY-ESO1、SSX2和SCP1;粘蛋白,如Muc-1和Muc-2;神经节苷脂,如GM2、GD2和GD3;中性糖脂和糖蛋白,如Lewis(y)和globo-H;以及糖蛋白,如Tn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)和sTn。本文中包括的肿瘤相关抗原还有完整细胞和肿瘤细胞裂解物以及其致免疫部分,以及用于抵抗B细胞淋巴瘤的、在B淋巴细胞单克隆增殖中表达的免疫球蛋白独特型。
肿瘤相关抗原可通过本领域已知的方法制备。例如,这些抗原可从癌细胞制备,例如通过制备癌细胞的粗提取物(如Cohen等,Cancer Res.,54:1055(1994)中所述),通过对抗原进行部分纯化,通过重组技术或通过已知抗原的从头合成。抗原还可以是编码抗原肽的核酸形式,其形式适合在受试者中表达并递呈给致敏受试者的免疫系统。此外,抗原可以是完整抗原,或可以是含有完整抗原中至少一个表位的片段。
病原体包括但不限于:感染哺乳动物,尤其是人的感染性病毒。感染性病毒的例子包括但不限于:逆转录病毒科(如人免疫缺陷病毒,如HIV-1(也称为HTLV-III,LAV或HTLV-III/LAV,或HIV-III;以及其它的分离物,如HIV-LP);小RNA病毒科(如脊髓灰质炎病毒,甲型肝炎病毒;肠道病毒,人柯萨奇病毒,鼻病毒,ECHO病毒);杯状病毒科(Calciviridae)(如引起胃肠炎的毒株);披膜病毒科(Togaviridae)(如马脑炎病毒,风疹病毒);黄病毒科(如登革热病毒,脑炎病毒,黄热病毒);冠状病毒科(如冠状病毒);弹状病毒科(如水泡性口炎病毒,狂犬病毒);线状病毒科(Filoviridae)(如ebola病毒);副粘病毒科(如副流感病毒,腮腺炎病毒,麻疹病毒,呼吸道合胞病毒;正粘病毒科(如流感病毒);布尼亚病毒(Bungaviridae)(如Hantaan病毒,布尼亚病毒(Bunga viruses),白蛉热病毒和Nairo病毒);沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒);呼肠病毒科(Reoviridae)(如呼肠病毒,环状病毒(orbiviurse)和轮状病毒);双RNA病毒科(Birnaviridae);嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒);细小病毒(Parvovirida)(细小病毒);乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒,多瘤病毒);腺病毒(大部分腺病毒);疱疹病毒单纯疱疹病毒(HSV)1和2,水痘带状疱疹病毒,巨细胞病毒(CMV),疱疹病毒;痘病毒(天花病毒,痘苗病毒,痘病毒);和虹彩病毒(Iridoviridae)(如非洲猪热病毒),以及未分类病毒(如海绵状脑病致病因子,δ肝炎(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷型卫星病毒)致病因子,非甲非乙型肝炎致病因子(1类=I内部传染,2类=肠胃外传染(如丙型肝炎);Norwalk病毒和相关病毒,和星状病毒(astroviruse))。
而且,革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌也可作为在哺乳动物中的抗原。所述革兰氏阳性细菌包括但不限于:巴斯德氏菌(Pasteurella),葡萄球菌(Staphylococci)和链球菌(Streptococcus)。革兰氏阴性菌包括但不限于:大肠杆菌(Escherichia coli),假单胞菌(Pseudomonas)和沙门氏菌(Salmonella)。感染性细菌的具体例子包括但不限于:幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris),布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi),侵肺军团菌(Legionella pneumophilia),分枝杆菌(Mycobacteria)(如结核分枝杆菌(M.tuberculosis),鸟型结核分枝杆菌(M.avium),胞内分枝杆菌(M.Intracellulare),堪萨斯分枝杆菌(M.Kansaii),戈登分枝杆菌(M.Gordonae)),金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus),淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae),脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis),单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes),化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A族链球菌),无乳链球菌(Streptococcus agalactie)(B族链球菌),链球菌属(viridans族),粪链球菌(Streptococcus faecalis),牛链球菌(Streptococcus bovis),链球菌属(厌氧菌,anaerobic sps),肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),病原性弯曲杆菌(pathogenic Campylobacter sp.),肠球菌(Enterococcus sp.),流感嗜血菌(Haemophilus infuenzae),炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis),白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae),棒状杆菌属(Corynebacterium sp.),红斑丹毒丝菌属(Erysipelothrix rhusiopathiae),产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers),破伤风杆菌(Clostridium tetani),Enterobacter aerogenes,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida),拟杆菌(Bacteroides sp.),核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum),念球状链杆菌(Streptobacillus moniliformis),梅毒螺旋菌(Treponema pallidum),细弱密螺旋体(Treponema pertenue),钩端螺旋体(Leptospira),立克次氏体(Rickettsia)和伊氏放线菌(Actinomyces israelli)。
病原体的例子包括但不限于:感染哺乳动物,更优选人的感染性真菌。感染性真菌的例子包括但不限于:新型隐球菌,荚膜组织胞浆菌,粗球孢子菌,皮炎芽酵母,沙眼衣原体,白色念球菌。感染性寄生虫的例子包括疟原虫,如恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫。其它感染性有机体(如原生动物)包括鼠弓形虫。
在文献,如参见C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983(全部内容引入以供参考)中大量描述了在哺乳动物和更优选人中作为抗原的其它医学上相关微生物。除了治疗感染性的人类疾病之外,本发明组合物和方法对治疗不包括人在内的哺乳动物的感染是有用的。病原体和抗原的具体例子
在优选实施方式中,本文中所用的涉及感染性病原体的“治疗”是指增加受试者对感染病原体抵抗力,或减少病原体感染受试者的可能性的预防性冶疗;和/或在受试者感染后,用来对抗感染,如减小或消除感染或防止其恶化的的治疗。在Bennett,K.Compendium of Veterinary Products,3rd ed.North American Compendiums,Inc.,1995中公开了许多治疗不包括人在内的哺乳动物的疫苗。如上所述,抗原包括感染性微生物,如衍生自自然物种或合成的病毒,细菌,寄生虫和真菌,以及其片段。人和不包括人在内的哺乳动物的感染性病毒包括逆转录酶病毒,RNA病毒和DNA病毒。逆转录酶病毒组包括简单逆转录酶病毒和复杂逆转录酶病毒。简单逆转录酶病毒包括B型逆转录酶病毒,C型逆转录酶病毒和D型逆转录酶病毒亚型。B型逆转录酶病毒的例子是鼠乳腺肿瘤病毒(″MMTV″)。C型逆转录酶病毒包括C型A组的亚组[包括劳氏肉瘤病毒(″RSV″),禽白血病毒(″ALV″)和禽成髓细胞瘤病毒(″AMV″)]和B组C型[包括鼠白血病毒(″MLV″),猫白血病毒(″FeLV″),鼠肉瘤病毒(″MSV″),长臂猿白血病毒(″GALV″),脾坏死病毒(″SNV″),网状内皮组织增生病毒(″RV″)和猿猴肉瘤病毒(″SSV″)。D型逆转录酶病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(″MPMV″)和1型猿猴逆转录酶病毒(″SRV-1″)。复杂逆转录酶病毒包括慢病,T细胞白血病毒和泡沫病毒亚型。慢病毒包括HIV-1,还包括HIV-2,SIV,绵羊髓鞘脱落病毒,猫免疫缺乏性病毒(″FIV″)和马传染性贫血病毒(″EIAV″)。T细胞白血病毒包括HTLV-1,HTLV-II,猿猴T细胞白血病毒(″STLV″)和牛白血病毒(″BLV″)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(″HFV″),猿猴泡沫病毒(″SFV″)和牛泡沫病毒(″BFV″)。
细菌病原体多肽包括但不限于:引起疖病的Aeromonis salmonicida的铁调节外膜蛋白(″IROMP″)、外膜蛋白(″OMP″)和A蛋白,引起细菌性肾病(″BKD″)的抗沙氏肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)的p57蛋白,耶尔森氏鼠疫杆菌的主要表面相关抗原(″msa″)、表面表达的细胞毒素(″mpr″)、表面表达的溶血素(″ish″)和鞭毛抗原;巴斯德氏菌病的细胞外蛋白(″ECP″)、铁调节外膜蛋白和结构蛋白;Vibrosisan guillarum和V.Ordalii的OMP和鞭毛蛋白;鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiellosis ictaluri)和鳗鱼溃疡病致病菌爱德华氏菌(E.Tarda)的鞭毛蛋白、OMP蛋白、aroA和purA;和小瓜虫(Ichthyophthirius)的表面抗原;和Cytophaga columnari的结构和调节蛋白;和立克次氏体的结构和调节蛋白。
寄生病原体多肽包括但不限于小瓜虫表面抗原。
“过敏原”是指可在易感染的受试者中诱导过敏或气喘反应的物质(抗原)。过敏原的名单是非常巨大的,可包括花粉、昆虫毒物、动物皮屑、真菌孢子和毒物(青霉素)。天然,动物和植物过敏原的例子包括但不限于对下述各属特异性的蛋白:犬(Canis familiaris);螨(例如Dermatophagoidesfarinae);Felis(Felis domesticus);豚草(Ambrosia artemiisfolia);黑麦草(例如Lolium perenne或Lolium multiflorum);柳杉(Cryptomeria japonica);链格孢(Alternaria alternata);桤木;赤杨(Alnus gultinoasa);桦木(Betula verrucosa);栎(Quercus alba);木犀榄(Oles europa);艾(Artemisia vulgaris);车前(例如Plantago lanceolata);墙草(例如Parietaria officinalis或Parietaria judaica);小蠊(例如Blattella germanica);蜂(例如Apis multiflorum);柏木(例如Cupressus sempervirens,Cupressus arizonica和Cupressus macrocarpa);刺柏(例如Juniperus sabinoides,Juniperus virginiana,Juniperus communis和Juniperus ashei);Thuya(例如Thuya orientalis);扁柏(例如Chamaecyparisobtusa);大蠊(例如Periplaneta americana);冰草(例如Agropyron repens);黑麦(例如Secale cereal);小麦(例如Triticum aestivum);鸭茅(例如Dactylisglomerata);羊茅(例如Festuca elatior);早熟禾(例如Poa pratensis或Poa compressa);燕麦(例如Avena sativa);绒毛草(例如Holcuslanatus);黄花茅(例如Anthoxanthum odoratum);燕麦草(例如PArrhenatherum elatius);剪股颖(例如Agrostis alba);梯牧草(例如Phleum pratense);Phalaris(例如Phalaris arundinacea);雀稗(例如Paspalum notatum);高粱(例如Sorghumhalepensis);和雀麦(例如Bromus inermis)。
其它药物组分
本发明的一些优选实施方式进一步含有其它治疗剂,例如药物或生物活性剂。这些额外的组分可提供直接的额外疗效或额外的免疫刺激作用。大量治疗性化合物可通过本发明的组合物和方法传送。治疗性化合物的例子包括但不限于:核酸、蛋白、肽、肿瘤消解药、抗感染药、抗焦虑药、治疗精神病的药、免疫调节剂、强心剂、毒素如乙酰胆碱受体(gelonin)和真核蛋白合成抑制剂等。掺入本发明脂质体中的优选的治疗性化合物是亲脂性阳离子。它们是亲脂性分子类的治疗剂,其能分配进脂质体的脂双层相,从而可以膜形式与脂质体结合。治疗性化合物的进一步例子包括但不限于:前列腺素、两性霉素B、氨甲喋呤、顺氯氨铂和衍生物、黄体激素、睾丸素、雌甾二醇、阿霉素、表阿霉素(epirubicin)、倍氯米松和酯、维生素E、可的松、地塞米松和酯、倍他米松valerete和其它类固醇、氟化喹诺酮抗菌卷须霉素和其衍生物,以及生物碱化合物和其衍生物。生物碱衍生物是苦马豆素(swainsonine)和长春花属生物碱成员和其半合成衍生物,如长春碱、长春新碱、长春地辛、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷(teniposide)。该组中,尤其优选长春碱、长春新碱和苦马豆素。苦马豆素(Creaven和Mihich,Semin.Oncol.4:147(1977)具有刺激骨髓增殖的能力(White和Olden,Cancer Commun.3:83(1991))。苦马豆素还刺激多种细胞因子的产生,包括IL-1、IL-2、TNF、GM-CSF和干扰素(Newton,CancerCommun.1:373(1989);Olden,K.,J.Natl.Cancer Inst.,83:1149(1991))。据报道,苦马豆素诱导B细胞和T细胞免疫,天然杀伤性T细胞和巨噬细胞诱导的体外肿瘤细胞的破坏,同时当其与干扰素联合时,具有指导在体内抵抗结肠癌和黑素瘤癌的抗肿瘤活性(Dennis,J.,Cancer Res.,50:1867(1990);Olden,K.,Pharm.Ther.44:85(1989);White和Olden,AnticancerRes.,10:1515(1990))。在本发明的组合物和方法中有用的其它生物碱包括但不限于:紫杉醇(taxol)和其合成衍生物。额外的药物组分包括但不限于:可掺入脂质颗粒的本领域已知的任何生物活性剂。
这些额外的药物组分可包裹在本文中所述脂质颗粒中,或与本文中所述脂质颗粒结合。另外,本发明组合物可包括与脂质核酸颗粒结合的药物或生物活性剂。所述药物或生物活性剂可在独立的脂质载体中或被联合给药。
组合物的制备
本发明组合物的制备可通过任何技术完成,但最优选乙醇透析或去污剂透析法,在下面的出版物、专利和申请中详述,全部在此引入以供参考:美国专利5,705,385;美国专利5,976,567;美国专利申请09/140,476;美国专利5,981,501;美国专利6,287,591;国际公开号WO96/40964和国际公开号WO98/51278。这些制造方法提供了小规模和大规模制造包裹在脂质颗粒,优选脂质-核酸颗粒中的含有治疗剂的免疫刺激组合物。这些方法还产生具有卓越药物特性的颗粒。
本发明的疫苗组合物可通过将靶抗原加到需要应答的地方来制备。掺入抗原的方法为本领域所熟知,包括如:1)配制过程中抗原的被动包裹(如抗原加到含ODN的溶液中);2)将糖脂和其它抗原性脂质掺入乙醇脂质混合物中,并用本文所述的以乙醇为基础的方案配制;3)插入脂质小泡内(如抗原-脂质可通过与将囊泡与抗原脂质微团一起培养,加到形成的脂质小泡内);和4)在配制后加入抗原(如与包括在已制成颗粒中的具有连接基团的脂质进行偶联,连接在配制后被活化从而与所需抗原偶联)。标准偶联和交联方法是本领域已知的。另一种制备物将抗原掺入不含核酸的脂质颗粒,这些颗粒与脂质核酸颗粒在施给病人前混合。
本发明方法中使用的组合物的特征
在本发明方法中使用的组合物具有下述优选特征。
本发明优选的脂质-核酸颗粒含有脂质膜(通常是磷脂双层)外部,其完全包裹内部空间。这些颗粒,有时在本文中称为脂质膜小泡,是平均直径50-200nm,优选60-130nm的小颗粒。静脉内给药最优选为粒径相对单一的颗粒,其中95%颗粒平均直径在30nm内。核酸和其它生物活性剂包含在内部空间内,或与包裹膜的内表面结合。
本文中所用“完全包裹”是指颗粒中的核酸在与血清接触后或与显著降解游离DNA的核酸酶试验接触后不显著降解。在一个完全包裹的系统中,优选少于25%的颗粒核酸在通常被降解100%游离核酸的处理中降解,更优选少于10%,最优选少于5%颗粒核酸被降解。另外,可通过OligreenTM试验确定完全包裹。完全包裹还提示颗粒是对于血清稳定的,即它们在体内施用后不会快速分解成其组分部分。
本发明组合物的这些特征从脂质-核酸聚集物(也称为阳离子复合物或脂复合物),例如DOTMA/DOPE(LIPOFECTINTM)制剂中鉴别出本发明的优选颗粒。这些聚集物通常直径大得多(>250nm),不能经受核酸酶消化。它们通常在体内给药后分解。如上所述的含有阳离子脂质-核酸聚集物和弱抗原的脂质-核酸配制剂可提供局部和区域性应用,如肌肉内、腹膜内和鞘内给药的合适疫苗。
本发明的脂质颗粒可各式各样的药物:脂质比配制。本文中所用的“药物:脂质比”是指治疗性核酸量(即包裹的和在接触血液后不迅速降解的核酸量)在一定体积的制备物中除以相同体积中脂质的量。这可摩尔比摩尔或重量比重量确定。药物:脂质比确定与给定剂量的核酸结合的脂质剂量。在优选实施方式中,本发明组合物药物:脂质比在0.01-0.25(wt/wt)范围内。
本发明组合物和方法的用途
B淋巴细胞和T淋巴细胞的联合分别使得可潜在的操作体液和细胞免疫应答。体液免疫应答和细胞免疫应答分别通过它们各自的细胞类型在应答抗原刺激时活化并随后分泌各种细胞因子来进行。抗原性肽对未受免疫的CD4+T辅助细胞的递呈导致细胞分化为两种不同的辅助细胞亚型(Th-1和Th-2),其可通过它们的功能和细胞因子表达增殖来区分。Mosman等,Annu.Rev.Immunol.,7:145-173(1989);Paul等,Cell,76:241-251(1994);O′Garra,Immunity,8:275-283(1998)。
CD4+Th细胞的细胞因子分泌的具体模式可控制免疫应答,使之主要为细胞性1型应答(包括IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-12和TNF-α)或主要为体液性2型应答(包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13)。Glimcher和Murphy,Genes Dev.,14:1693-1711(2000);Abbas等,Nature,383:787-793(1996)。Th-1亚型促进由CTL和NK细胞活化的细胞调节免疫,以及具有将人体内的免疫球蛋白从IgM转换为IgG和IgA,和小鼠内的转换为IgG2a特性的体液免疫。Th-1应答还可与延迟型超敏反应和自身免疫性疾病结合。Th-2亚型主要诱导体液免疫,并使人体内的免疫球蛋白转换为IgG1和IgE。与Th-1应答结合的抗体同种型通常具有较好的中和和调理能力,反之,那些与Th-2应答结合的抗体同种型通常更易与变应性反应结合。
如本文所示,所述免疫刺激组合物能引起对抗原性刺激,如微生物抗原和肿瘤相关抗原的强Th-1偏向免疫应答,并且能提高宿主免疫应答的细胞和体液成分。这样,本文所述的免疫刺激性组合物发现了通常在诱导Th-1免疫应答的方法中和在靶向所需特异性抗原的疫苗中作为佐剂的用途。本文还提供了提高体液应答成熟的方法,以及增加抗体同种型适应抗原刺激转换的方法。
这些免疫应答可用许多方式测量,包括但不限于免疫系统细胞(如B细胞、T细胞、APCs、如树突细胞或巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等)的活化、增殖或分化;标记表达的上调或下调;细胞因子的分泌;刺激或增加IgA、IgM或IgG滴度;同种型转换和脾肿大(包括增加的脾细胞构成)。特别地,免疫应答的存在可直接通过Th-1偏向的细胞因子(如IFN-γ,IL-12)和抗原特异性CD8+CTL的诱导来确定。这样,如果Th-1细胞因子或CTL被诱导,根据本发明,就会诱导Th-1偏向的免疫应答。相似地,提高的体液免疫应答和体液应答成熟的改善可通过检测诱导的1型抗原特异性抗体的同种型(例如小鼠中为IgG2a,IgG1,人中为IgG和IgA)来确定,并确定是否发生了同种型的转换,例如,IgM转换为IgG或IgA,如本文所示例的。如果与另一种佐剂相比,发生了增加的同种型转换,根据本发明就诱导了提高的体液免疫应答。
在优选实施方式中,本发明的方法包括通过施给受试者有效量的免疫刺激组合物,促进对抗原刺激的Th-1偏向免疫应答,其中免疫刺激组合物含有包括甲基化核酸的LNA配制剂。本发明还提供了含有与一或多种所需抗原的一或多种表位联合的所述LNA配制剂的疫苗。优选抗原与LNA颗粒结合,最优选使用多种抗原。在一个实施方式中,ODN含有PS或其它修饰的非磷酸二酯骨架。诱导Th1应答的其它佐剂包括但不限于:MPL、MDP、ISCOMS、IL-12、IFN-γ和SB-AS2。
在进一步的实施方式中,本发明的组合物和方法可用于调节细胞因子水平。本文中所用涉及细胞因子的“调节”是指当期望较低水平的表达时,抑制特定细胞因子的表达,或当期望较高水平的表达时,增加特定细胞因子的表达。可局部地或全身性进行特定细胞因子的调节。在优选实施方式中,本发明的组合物和方法可用于活化巨噬细胞或树突细胞分泌细胞因子。通常,Th1-型细胞因子可被诱导,这样本发明的免疫刺激组合物就能提高包括细胞毒素T细胞在内的Th1型抗原特异性免疫应答。
适应症、给药和剂量
本发明的组合物和方法适用于任何需要免疫系统刺激的病人或生物。这可包括但不限于许多医学领域,如癌症学、炎症、关节炎和风湿病学、免疫缺陷性疾病。本领域熟练技术人员能根据本文的公开内容选择合适的指标来测试效力。在优选实施方式中,本发明的组合物和方法被用于治疗肿瘤(任何病理性或可能是病理性的肿瘤细胞生长),如下文实施例中所述的肿瘤。
对受试者施用本发明的组合物可采用任何方法,包括体内或体外方法。体内方法可包括局部、区域性或全身性给药。在优选实施方式中,静脉内施用组合物,使颗粒能到达病人内的B细胞、巨噬细胞或脾细胞,和/或颗粒能刺激淋巴细胞增殖,导致所述病人中IL-6、IL-12、IFNg和/或IgM的分泌。
本发明的疫苗组合物可通过已知的给药途径给药。在一个实施方式中,本发明的组合物通过静脉内注射给药。在另一个实施方式中,通过肌肉内或皮下注射给药,这样就可用较大尺寸(150-300nm)的脂质颗粒。它可消除或减少昂贵的排除步骤的需要,由于颗粒不需要循环,脂质成分的选择可偏向较便宜的材料。例如,可减少Chol量,用刚性较小的物质,例如POPC或DMPC代替DSPC,可用较便宜的PEG-乙酰链代替PEG-脂。在进一步的实施方式中,本发明的组合物通过呼吸道,例如气管内滴注或鼻内吸入给药。
本领域熟练技术人员知道如何鉴定制剂的潜在毒性,例如补体活化、聚集、肾毒性、肝酶试验等。这些毒性在机体之间可以是不同的。
组合物的药物制备物通常使用其它载体来促进或辅助运送模式。通常,本发明的组合物将在生理学上可接受的载体,例如根据标准药物学实践选出的生理盐水或磷酸缓冲盐中施用。其它合适的载体包括水、0.9%盐水、0.3%甘氨酸等,包括用于增强稳定性的糖蛋白,如清蛋白、脂蛋白、球蛋白等。
脂质-核酸配制剂的剂量由所需的脂质剂量、所需的核酸剂量和组合物的药物:脂质比决定。本领域熟练技术人员能根据本文所提供的信息选出正确的剂量。
引发、增强和维持免疫力的免疫治疗或接种方案是本领域已知的,如下进一步描述。特别是本领域熟练技术人员知道如何根据本文所述服用量来计算受试者,优选是哺乳动物,更优选是人的服用量。换算从一种动物到另一种动物(如从小鼠大人)服用量的具体换算因素是本领域已知的,并全部描述在例如Food and Drug Administration网站,网址为:www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm(肿瘤学工具部分),引入以供参考。与含有游离核酸的已知免疫刺激组合物相比,本发明的免疫刺激组合物和方法可在体内利用少量的核酸刺激增强的免疫应答。
本发明制剂中的核酸量通常在约0.001-60mg/kg(毫克核酸/每千克重量小鼠/每剂)之间变化。在优选的静脉内(i.v.)给药的实施方式中,本发明的组合物和方法用约为1-50mg/kg,更优选约5-20mg/kg。在优选的皮下(s.c.)给药的实施方式中,本发明的组合物和方法用约为1-10mg/kg,更优选约1-5mg/kg,通常约3-5mg/kg。与本发明的脂质颗粒结合的抗原量优选为约0.04-40mg/kg,更优选约0.04-4mg/kg。如上所述,在上述确定的已知换算因素和进一步的经验性试验的基础上,本领域熟练技术人员可很容易地从本文给定的服用量中确定适合其它哺乳动物的服用量。
本发明制剂可以以可药用溶液的形式给药,其通常可包括药学上可接受浓度的盐、缓冲液、防腐剂、适合的载体、佐剂和其它可选择的治疗成分。
在治疗应用中,有效量的本发明的免疫刺激组合物可通过任何能够让其被合适的靶细胞吸收的方式向受试者给药。“施用”本发明的免疫刺激组合物可通过任何熟练技术人员已知的方式来完成。优选的给药途径包括但不限于:肠道外注射(皮下、皮内、静脉内、肠道外、腹膜内、鞘内等),以及粘膜、鼻内、气管内、吸入和直肠内、阴道内;或口服、经皮肤吸收(如经由片)。注射可以是推注或连续注入。
例如,本发明的免疫刺激组合物可通过肌肉内或皮内,或其它肠道外方式注射给药,或通过生物列表的“基因枪”施用于表皮。本发明的免疫刺激组合物还可通过例如,吸入、局部地、静脉内、口服、移植、直肠或阴道给药。适合的脂质或固体药物制备物形式是,例如注射或吸入的水或盐溶液,螺旋、涂覆到微观金颗粒上并成雾状。现有的药物送递方法的简要描述参见Langer,Science 249:1527-1533,1990,在此引入以供参考。
药物组合物优选以剂量单位制备和给药。脂质剂量单位是用于注射或其它肠胃外给药的小瓶或安瓿。固体剂量单位是片、胶囊和栓剂。为了治疗病人,根据化合物活性、给药方式、免疫目的(即预防性的或治疗性的)、病症的特性和严重性、患者的年龄、体重的不同可能需要不同的剂量。给定剂量的给药可个体剂量单位形式唯一给药或多次小剂量单位进行。在特定周或月间隔内的剂量多次给药通常用于增强抗原特异性应答。
合适的缓冲剂包括:乙酸和盐(1-2%w/v);柠檬酸和盐(1-3%w/v);硼酸和盐(0.5-2.5%w/v)和磷酸和盐(0.8-2%w/v)。合适的防腐剂包括:杀藻胺(0.003-0.03%w/v);氯丁醇(0.3-0.9%w/v);对羟基苯甲酸脂(0.01-0.25%w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。
在优选实施方式中,本发明的免疫刺激组合物包含有效量的佐剂和抗原,可选地包含在可药用载体内。本文中所用“可药用载体”是指那些适合向人或其它哺乳动物给药的一或多种适合的固体或液体填充物、稀释剂或包裹的物质。本文中所用“载体”是指有机或无机物质,天然的或合成的,活性成分与其结合可便于施用。本发明的免疫刺激组合物的成分还能与本发明化合物,和与各自,以不损害所需药效的方式。
适合肠胃外给药的组合物适宜含有灭过菌的含水制备物,其与受试者血液等渗。可接受的载体和溶剂是水、林格氏(Ringer′s)溶液、磷酸盐缓冲液和等渗氯化钠溶液。另外,灭过菌的不挥发性油通常作为溶剂或悬浮剂。为了这个目的,可使用任何温和的不挥发性矿物或非矿物油,包括合成的单序数甘油酯。另外,发现了脂肪酸如油酸在注射剂制备中的用途。适合皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内等给药的载体制剂可在Remington′sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa中找到。
在本发明中有用的佐剂或抗原可在多于两种的佐剂或抗原的混合物中传递。混合物可由除本文所述LNA配制剂之外的许多佐剂组成。
多种给药途径是可用的。所选的具体方式依赖于所选的具体佐剂或抗原、患者的年龄和一般健康状况、治疗的具体条件和疗效所需的剂量。总的来说,本发明的方法可使用任何医学上可接受的给药方式进行,意思是能产生有效水平的免疫应答,而不引起临床上不可接受的副作用任何方式。优选的给药方式如上所述。
组合物适宜以单位剂量形式存在,并且可通过任何药剂学领域熟知的方法制备。所有的方法都包括将化合物与构成一或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常,组合物通过均匀并熟练地将化合物与液体载体、精确分开的固体载体,或其两种结合,然后如果必要的话,使产物成形来制备。
其它给药系统包括时间-释放、延迟释放或持续释放给药系统。该系统可避免化合物的重复给药,增加受试者和医生的便利。许多类型的释放给药系统是可用的,并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括聚合物类系统,如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸内酯、聚酰胺脂、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。含有药物的前述聚合物微胶囊在,例如美国专利5,075,109中有描述。给药系统还包括:非聚合物系统,含有固醇,如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪,如单-二和三-甘油脂的脂质;水凝胶释放系统;sylastic系统;肽类系统;蜡涂层;使用传统粘合剂和赋形剂的压缩片;部分融合的埋植剂(implant)等。特殊的例子包括但不限于:(a)侵蚀系统,其中本发明试剂以一种形式包含在基质中,如美国专利4,452,775,4,675,189和5,736,152中所述,和(b)扩散系统,其中活性组分以受控速率从聚合物透过,如美国专利3,854,480,5,133,974和5,407,686所述。另外,也可使用泵类硬件给药系统,其中有些适合埋植。
现在说说本发明一些详细方面,一方面出自下述认识:显示寡核苷酸对不同白细胞标记物的刺激作用(包括活化标记物)的体外数据并不决定游离寡核苷酸是否事实上在体内有免疫刺激性或具有治疗效力。
实施例
实施例详述
小鼠。购自Harlan-Sprague Dawley(Indianapolis,IN),雌性,Balb/c或C57/BL6(″B6″)小鼠(6-8周龄)。在使用前对所有动物检疫一周。所有研究都是根据Canadian Council on Animal Care(CCAC)和Institutional Animal Care和User Committee(IACUC)确定的方针进行的。
肽。肽获自Common wealth Biotechnologies,纯度>95%(由HPLC确定),对每种肽都进行了QC分析。
寡核苷酸制剂。寡核苷酸获自Avecia或Proligo或Trilink。所有ODN以无菌水水合,并在无菌DPBS,pH7.2中稀释到合适的浓度。
LNA配制剂。LNA配制剂如下制备。起始ODN∶脂质比为0.25(w/w)。对于磷酸二酯制剂,用20mM柠檬酸盐缓冲液代替300mM柠檬酸盐缓冲液溶解ODN。不使用该方法将导致显著降低的包裹效率(如-3%最终)。
接种。对B6小鼠以每剂100ml进行皮下(SC)接种。定量给药方案是q7dx2或q4dx4,并在个体图标中标出。CFA混合物非常粘稠,必须使用大量度的注射器。为了进行体液研究,使用引发(第0天)和加强(第14天)策略,在不同时间从尾部切口采集血样。
疗效研究。研究过程中使用E.G7-OVA或EL-4胸腺瘤细胞系。这些细胞根据已确定的方法在体外进行培养。为了进行肿瘤研究,将含在1%FCS的50ml PBS中的2.5×106个E.G7-OVA细胞经皮下注射。通过重复垂直测量肿瘤大小进行肿瘤测量,并用以下公式计算:
体积(mm3)=(L×W×H)p/6
用B16/BL6鼠黑素瘤模型进行TRP-2和gp100研究。静脉内注射200mlB16细胞(1.0×105)。通常,动物每周接种2-3剂,在最后接种的1-2天后,注射B16细胞。在注射B16后的14-18天内将动物杀死,摘除肺,用立体显微镜计算转移病变。
流式细胞仪分析。在不同时间,用MHC四聚物(Beckman Coulter)或二聚物X试剂(Pharmingen)测定免疫小鼠中的抗原特异性T细胞。用针对CD8a、B220和CD4的抗体鉴定感兴趣的细胞群,并排除不需要的细胞群。脾和淋巴腺的单细胞悬浮物根据Current Protocols in Immunology概述的方案制备。将1×106细胞在96孔板中进行抗体染色,4℃。通常,每1×106细胞使用0.2mg抗体。
实施例1
在全血细胞中通过与游离或包裹的寡核苷酸接触,比较体外和体内的白细胞活化
为了指明预测的体内免疫刺激的体外分析效力,CD69表达比较在图1和图2中显示。CD69是细胞活化标记物,定量的表示NK细胞、B细胞和单核细胞的活性。在NK细胞中CD69的表达说明细胞活化和IFN-g的产生,其对诱导Th-1免疫应答很重要。在体外和体内检测游离和包裹的ODN1和2诱导CD69表达的能力。在体外,剂量为0.1mg/ml ODN2和10mg/mlODN1,在体内,剂量为10mg/kg ODN2和20mg/kg ODN1。每种寡核苷酸都包裹在由POPC∶CHOL∶DODMA∶PEGDMG比为20∶45∶25∶10组成的脂质颗粒中。
图1显示白细胞的体外刺激,白细胞含有用游离寡核苷酸和包裹的寡核苷酸,特别是ODN1和2处理的小鼠全血获得的活化标记物CD69。当在体外用游离寡核苷酸处理小鼠全血时,根据治疗15小时后使用的游离寡核苷酸量,在CD69阳性B-细胞、单核细胞和一些程度上的NK细胞量有剂量应答增加。在该体外试验中,游离ODN2比游离ODN1能引起更强的CD69刺激。然而,当这些相同的寡核苷酸包裹在脂质小泡中时,CD69产生的对这些相同细胞型的体外刺激就降低了或完全消除。
然而,当在体内测定相同的寡核苷酸时,获得了令人惊讶的结果。图2显示通过在体内注射包裹的或游离寡核苷酸来治疗ICR小鼠,产生了与体外试验所得结果相反的结果。该图清楚地显示在注射后16和24小时,在体内包裹的寡核苷酸比游离寡核苷酸能更有效的刺激相同细胞型的CD69标记物。该结果表明体外数据不足以决定寡核苷酸是否在体内有效。另外,图1和2表明脂质包囊是决定寡核苷酸是否在体内有效的重要因素。体内结果表明包裹的ODN1和ODN2都能刺激NK细胞产生CD69,然而,体外结果指出ODN1和ODN2的脂质包囊实际上将CD69对NK细胞的刺激降低到了低于控制水平。
前述体内结果表明游离寡核苷酸对免疫刺激不是必需的,除非它们包裹在脂质包囊中,如在体内测定的含CD69的细胞刺激一样。即使在体外观察到由游离ODN引起的CD69刺激,上述结论也是正确的。此外,该结果表明即使在体外未显示效力,包裹的寡核苷酸也可能在体内有效。
实施例2
在体内,用甲基化寡核苷酸使树突细胞活化
如前面背景技术部分所述,现有技术教导了与未甲基化CpG寡核苷酸相比,无论是体内或体外测定,甲基化CpG寡核苷酸通常不能有效的刺激免疫应答,或比未甲基化CpG寡核苷酸的效力低。美国专利6,429,199公开了甲基化寡核苷酸不能增强NK细胞或人B细胞中的CD40表达,而且也不表现任何改善的树突细胞成活率,其为Th-1应答中包含在体液和细胞免疫中的主要抗原呈递细胞。此外,公开的甲基化CpG寡核苷酸不能在体外提高树突细胞的成活率、分化、活化或成熟。相似地,WO02/069369公开的体外PBMC结果也未显示甲基化寡核苷酸对树突细胞有任何活性。
相反,本发明显示甲基化寡核苷酸比未甲基化寡核苷酸至少相同或更有效的诱导树突细胞的繁殖。未甲基化ODN1的对应物是将单CpG二核苷酸序列的胞嘧啶残基甲基化,并命名为ODN1m。
为了说明甲基化寡核苷酸能够刺激树突细胞,将ODN1和ODN1m均包裹在含有POPC∶CHOL∶DODMA∶PEGDMG比为20∶45∶25∶10的脂质包囊中。用PBS作为对照。该实验结果示于图3。
图3清楚的显示了包裹的ODN1m活化树突细胞的能力。另外,当包裹在脂质包囊时,甲基化ODN1m比其未甲基化对应物在体内刺激树突细胞活化方面更有活性。树突细胞的活化通过IFN-g分泌细胞的百分数来测定。这些细胞用抗体标记,从而表明细胞类型,而且只有那些具有树突细胞标记的细胞包括在该测定内。
为了说明由于施用脂质-包裹的未甲基化和甲基化CpG寡核苷酸引起了树突细胞的扩增,对来自血、脾和淋巴腺的细胞进行树突细胞群活化和扩增的分析。以20mg/kg的剂量对ICR小鼠单独静脉注射包裹的寡核苷酸进行免疫,对照ICR小鼠注射PBS。在不同时间点,将代表脾、血和淋巴腺的细胞分离,如图4和5所示,通过利用树突细胞标记物CD11c和DEC205来测定树突细胞的扩增和活化量。每种标记物对树突细胞都是特异的,虽然它们代表不同细胞亚群。在图4和5中,对照等于100%,每种骨架构型的ODN1m示意为对照百分比。图4A在各图板中说明:如通过与对照对比所测定的,甲基化ODN1m能刺激脾细胞和全血细胞,而非淋巴组织中的CD11c阳性树突细胞扩增。ODN1m PO和PS骨架都显示了树突细胞的扩增。图4B在各图板中显示:如通过与对照对比所测定的,甲基化ODN1m还能刺激脾细胞和全血细胞,而非淋巴组织中的DEC205阳性树突细胞的扩增。
图5还显示了树突细胞的活化。在采集样品时,细胞首先通过流式细胞仪分析CD86的共表达,其表明细胞活化,和树突细胞显型标记物CD11c和DEC205。活化的树突细胞的百分比示意与等于100%的PBS对照相对比。图5,各图板显示:当寡核苷酸被脂质包裹时,甲基化ODN1m诱导在CD11c阳性树突细胞中的CD86表达。当测定DEC205阳性树突细胞时,相似的结果示于图5的图板中。
这样,图4和5的数据反驳了美国专利6,429,199中的结论,其教导了甲基化CpG寡核苷酸对改善树突细胞存活、分化、活化和成熟是无作用的。
实施例3
PS和PO骨架构型对血浆细胞因子水平的作用
如上所述,通常将无脂质包裹的寡核苷酸骨架进行修饰,从而降低核酸酶对分子的降解。但是,包裹后就不再需要用这种修饰来防止降解。为了确定不同磷酸骨架对由脂质包包裹诱导的细胞因子刺激的效应,用含有PO和PS骨架的寡核苷酸注射小鼠,在一系列时间点(如图6和7B所示)和一段变化的剂量范围内(如图7A所示)测定细胞因子刺激。在该实验中,对ICR小鼠静脉注射剂量为20mg ODN/kg的游离PO ODN1、包裹的PO-ODN1和包裹的PS-ODN1。在超过给药24小时的时间段后测定Th-1和Th-2共有的细胞因子(IL-12,IL-6和IFN-g)和MCP-1(巨噬细胞趋化因子)。细胞因子刺激通常指示细胞免疫应答,如现在的MCP-1中的趋化应答。寡核苷酸包裹在DSPC∶Chol∶DODAP∶PEG-CER14比为20∶45∶25∶10的脂质颗粒中。
图6显示游离PO-ODN1的体内给药对刺激IL-6、IL-12、IFN-g或MCP-1无效力,这表明寡核苷酸可能已被核酸酶降解。本领域已知:为了避免核酸酶降解,在施用游离寡核苷酸时,PS骨架是必需的。相反,脂质包裹的PO和PS ODN1的体内给药能刺激每一种细胞因子和趋化因子的产生。图6表明PO-ODN能更有效的诱导细胞因子和趋化因子的产生。
图7A说明在一段变化剂量范围的测定中,与游离ODN14相比,对ICR小鼠施用包裹PO或PS ODN14能增强IL-12诱导。该图支持了从图6中得到的结论,脂质包裹增强了细胞因子刺激的效力,如IL-12诱导增强所证实的,PO-ODN比PS-ODN能更有效的诱导细胞因子应答。事实上,当以相同剂量给药但采用包裹形式时,在峰血浆IL-2中观察到2.5倍增加,甚至在其它细胞因子,如IL-6(1000倍)和IFN-γ(20倍)中观察到更惊人的增加。图7A还表明与缺乏以脂质颗粒施用的游离寡核苷酸相比,当寡核苷酸被包裹时,较小剂量的寡核苷酸是促进细胞因子应答所必需的。
为了进一步阐明PO-ODN与PS-ODN的区别,图7B说明了IFN-g细胞因子随时间对特异性PS和PO骨架构型刺激的不同。施用包裹的PO ODN14能刺激更强的IFN-γ早期应答,而施用包裹的PS ODN14刺激就较小,但仍然能有效的诱导IFN-γ。另外,图7B显示当用PS-ODN刺激时,在一段时间后,第二个大的IFN-g峰值就会出现,这说明通过施用包裹的PS-ODN使免疫系统引发,从而很可能在治疗后通过NK细胞的扩增而应答更有效的IL-12的产生。
图22同样显示了图7B中观察到的与相同寡核苷酸的PO型相比,PS-ODN的晚期IFN-g峰值,如在实施例4中进一步的讨论。
根据本发明,脂质包囊的一个重要特征是发现了可用具有天然PO骨架的寡核苷酸刺激免疫应答,然而在现有技术中,PS骨架是体内有效活性所必需的。如下面实施例7所示,包裹的PO寡核苷酸比PS寡核苷酸能更有效,当评价抗肿瘤效力,尤其当其中的寡核苷酸是甲基化的时。
实施例4
评价具有PS和PO骨架的CpG ODN的免疫刺激特性
当鉴别应答水平,尤其是与具有PS和PO骨架的ODN’s相关的应答水平时,进一方面就是分析所评价的应答的类型,更具体地是分析应答是否是体液应答或细胞应答。为了评定骨架的作用,需要进行实验观察PS-ODN和PO-ODN引发和诱导体液免疫应答成熟(如促进同型转换)的能力。对施用包裹的PO-ODN和PS-ODN引起的体液免疫应答的量值和动力学进行比较。以q14x2引发-加强方案在第0天和第14天,将PO-ODN和PS-ODN均以100mg/剂皮下给药,在6周后的第35天进行评估。对照小鼠用OVA-PBS和OVA-矾以相同剂量免疫。寡核苷酸包裹在DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DMG比为20∶45∶25∶10的脂质颗粒中。
可得到这样的结论:虽然PO和PS ODN都能诱导体液免疫应答,但应答的性质是不同的。图8和9以吸光度说明:6周后不同寡核苷酸和对照的IgM和IgG反应量值。如图中清楚的所示,PS-ODN1和PS-ODN2均产生了较弱的IgM应答,而PO-ODN2产生了强IgM应答。相反,与具有PO骨架的相同寡核苷酸相比,检测的各PS-ODN一贯能更好地产生IgG应答。这表明PS-ODN能产生更强的IgG应答。这些数据说明虽然PO和PS ODN都能引起体液免疫应答,但是如缺少同种型转换和IgM同种型占优势所表明的,PO应答并不成熟。另一方面,如同种型转换为IgG同种型抗体优势所表明的,PS-ODN能引起体液免疫应答和诱导应答成熟。
这些现象可能与PO和PS ODN诱导的细胞因子增殖有关。图7(b)和图22说明了包裹的PS寡核苷酸ODN1和ODN2在治疗后6天产生强IFN-g峰,其不是由包裹的PO寡核苷酸产生。已有报道称:细胞因子如IFN-g导致优选的同种型转换为不同IgG同种型。这样,大量PS-ODN-诱导的IFN-g峰可引起从IgM到IgG的同种型转换,而在PO-ODN-治疗的小鼠中缺少该峰就可能导致没有同种型转换。PO-ODN诱导的后期IFN-g峰的原理还并不清楚,但是此结果可能暗示用包裹的PO寡核苷酸而非PS寡核苷酸治疗能导致抑制IL-12表达的1型干扰素的先期诱导,其对提高IFN-g在NK或T细胞中的表达是必需的。
同样地,图6不仅显示了寡核苷酸的包裹对刺激如前所述的导致Th-1应答的细胞因子的产生是非常重要的,而且还显示了利用包裹的PO寡核苷酸比PS寡核苷酸能产生更多的细胞因子。该结果与现有技术中教导的施用游离寡核苷酸形成对比,其通常指出优选用PS骨架胜过PO寡核苷酸来防止体内寡核苷酸的降解。
实施例5
经细胞因子诱导、四聚体分析和细胞毒性分析(CTL)测定的对施用寡核苷酸的体内免疫应答
经细胞因子诱导、四聚体分析和细胞毒性分析(CTL)测定的对施用寡核苷酸的体内免疫应答。为了监测对皮下免疫的免疫应答,采用MHC 1-四聚体分析、细胞毒性分析和细胞因子释放分析监测抗原特异性细胞免疫应答,通过测定血浆抗体水平监测体液免疫应答。细胞和体液应答分别在C57BI/6和Balb/C小鼠中评定(每组5只动物)。为了进行细胞应答分析,用q7dx3给药方案,在第0、7和14天以100mg寡核苷酸并结合20mg抗原的剂量对小鼠皮下免疫3针。在第21天采集脾、肝、淋巴结和血组织。将固体组织机械分离,并将细胞处理,采集单核细胞。为了进行体液应答分析,用q14dx2方案,在第0和14天对动物免疫两次,在第35天采血以进行血浆免疫球蛋白水平分析。在这些一系列的实验中,每个寡核苷酸都包裹在DSPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DMG或POPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DMG比为20∶45∶25∶10的脂质颗粒中。所有比较均使用相同脂质颗粒。
MHC-四聚体分析被用来识别CD8+ve,细胞毒性T-淋巴细胞,其拥有适合的T细胞受体,允许在MHC I类复合体中识别和溶解含靶抗原的靶细胞。从免疫动物分离的脾细胞用PE-标记的与免疫显性OVA SIINFEKL肽以及FITC-标记的抗-CD8和Cy-铬-标记的抗-TCR抗体络合的MHC I类四聚体(H2Kb)染色,并进行流式细胞仪分析。评定CD8+ve,TCR+ve T-淋巴细胞在MHC I类分子中拥有能特异性识别和结合OVA的T-细胞受体的细胞量。
为了进行细胞毒性分析,采用4小时51铬-释放试验,以抗原特异方式对来自受免疫动物的脾细胞的特异性识别和溶解靶细胞的能力进行测定。用51铬标记靶细胞,细胞毒性量由从免疫效应细胞溶解的靶中释放到上清液中的放射性核素量决定。立即或在体外用OVA-脉冲合成的抗原呈递细胞重新刺激5天后检测获自受免疫动物的分离脾细胞的特异性溶解EG.7(OVA表达靶细胞)的能力,与EL4(非OVA-表达细胞)相比。
细胞因子释放试验的目的是检测抗原特异性免疫效应细胞,其应答特异性抗原的刺激,活化产生和分泌细胞因子,特别是IFN-g。从免疫动物的脾、肝、血和淋巴结分离细胞,并利用细胞因子分泌试验(Miltenyi Biotec)进行分析。将细胞用OVA-脉冲自体抗原呈递细胞刺激过夜,并用捕捉剂(一种在免疫细胞和IFN-g表面识别CD45表位的双特异性抗体)标记。识别和应答抗原刺激的任何细胞都合成和分泌细胞因子,其然后被细胞结合的捕捉剂捕获,导致在它们表面上IFN-g与标记结合。然后,用对IFN-g和各种表型标记物的荧光标记抗体标记细胞,并用流式细胞仪进行分析检测出能分泌IFN-g的特异性细胞型。
体液应答分析是用来确定在免疫动物血浆中的抗原特异性IgG水平。通过心脏穿刺采血,并离心采集血浆。采用终点稀释ELISA法来测定总IgM、IgG和IgG1、IgG2a、亚类滴度,以测定抗原特异性免疫球蛋白的产生。将上样的血浆样品连续稀释,并放在涂有OVA的平板中以在稀释的样品中捕获OVA特异性抗体。然后,用辣根过氧化酶偶联的兔抗小鼠IgM、IgG、IgG1或IgG2a抗体和TMB底物检测OVA特异性抗体。在450nm在ELISA平板读出器上测定比色反应的吸光度。终点稀释滴度定义为血浆最高稀释度,其导致吸光度值比未受免疫动物的吸光度大两倍,定点值为0.05。以此来评价血清转化和应答的大小,并且评价应答的Th类型。
图10和11各自说明了将ODN1m归一化为其未甲基化ODN1对应物。图中的每个柱状条代表施用甲基化ODN的一组动物(每组5只动物)和施用未甲基化对应物的第二组动物的直接对比,其中将每个寡核苷酸都脂质包裹在相同的脂质颗粒中。每组的未甲基化群体结果定为100%,甲基化组对比该100%标准进行测定。在柱状条上显示等于200%是截断值,实际上200%的线所代表的值为200%或更大。
图10显示如上所述的细胞因子释放试验的结果。该图说明在一系列筛选后,虽然甲基化和未甲基化脂质包裹的寡核苷酸均显示免疫应答,但甲基化ODN与未甲基化ODN相比,甲基化寡核苷酸与未甲基化ODN在刺激树突细胞、NK细胞和CD8+ T-细胞增殖方面同样有效,且通常好于未甲基化ODN,分别如图10A、B和C细胞因子分泌所示。
四聚体和CTL试验的结果示于图11A-C。这些图再一次说明了甲基化和未甲基化ODN刺激免疫应答的能力。但是,图11A和B还证明了在一系列用甲基化或未甲基化包裹的ODN处理动物的筛选后,分别在四聚体和CTL试验中,甲基化寡核苷酸一直在刺激细胞毒性T淋巴细胞和四聚淋巴细胞的增殖方面好于未甲基化ODN。另外,图11C阐明了代表性的四聚体研究数据,其中全部平均示于图11B。ODN5、ODN5m、ODN7和ODN7m均按照如上所述方案进行了检测。图11C清楚地显示了与脂质包裹的未甲基化对应物相比,脂质包裹的ODN5m和ODN7m能诱导更大量的抗原特异性CD8 T-细胞。
图10和11显示用甲基化ODN1m免疫获得的免疫应答,至少一直等效且通常好于用其未甲基化寡核苷酸对应物的相同治疗。该结果进一步在下面的实施例中证明。
实施例6
比较甲基化和未甲基化寡核苷酸在EG7-OVA肿瘤模型中预防的抗肿瘤效力
本文所准备的癌疫苗包括:与肿瘤相关抗原联合的脂质-核酸配制剂,其在体内刺激对抗原和肿瘤的免疫应答。雌鸡卵清蛋白(清蛋白;OVA)是广泛研究的模型抗原系统。抗原决定簇已被作图,并用反应物和模型来监测体液和细胞调节的免疫应答。另外,已建立且鉴定了含有OVA基因的细胞系,并在接种后用于常规评价抗肿瘤免疫应答。特别地,E.G7-OVA是设计用来表达作为异种肿瘤相关抗原OVA蛋白的鼠胸腺瘤细胞系,并且是研究诱导宿主免疫系统所需因素的公认模型特别是攻击体内恶性细胞。强有力的Th1细胞因子应答和抗原特异性CD8+ T淋巴细胞的诱导认为是确定有效抗肿瘤免疫反应所必需的。
在C57BI/6(每组5只动物)中以预防免疫模型评定皮下免疫诱导的抗肿瘤效力。按照q7dx3给药方案,在第0、7和14天,对小鼠进行3针皮下免疫,剂量为100μg寡核苷酸和20μg OVA抗原。然后在第21天,皮下注射2.5×106个EG.7 Ova肿瘤表达细胞,对动物进行攻击。每周监测小鼠3次,以评定肿瘤生长和重量的增加。以上述相同的方案,对对照小鼠注射PBS或HBS中的一种和20μg OVA抗原。寡核苷酸包裹在脂质颗粒中,含有POPC∶CHOL∶DODAP∶PEGCer14或DSPC∶CHOL∶DODAP∶PEGCer14各比为25∶45∶20∶10的脂质组合物中的一种。甲基化和未甲基化寡核苷酸的所有比较均使用相同脂质颗粒。这些效力实验获得的结果在图12-15、18-21和25-28中详述。各图中的第0天是每只动物用肿瘤攻击的日子。
图12说明用游离ODN免疫动物时的效力走势。所示结果与现有技术一致,也就是,当动物施用游离寡核苷酸时,甲基化寡核苷酸比未甲基化寡核苷酸治疗效力低。在降低肿瘤生长方面。特别地,游离未甲基化ODN1和ODN2,具有PS骨架能避免核酸酶降解,比其甲基化对应物,ODN1m和ODN2m更明显的降低肿瘤生长。在接种肿瘤后约25天,当甲基化寡核苷酸的肿瘤生长率接近只用PBS缓冲液处理的对照动物的肿瘤生长率时,该结论尤其正确。
图13-15说明寡核苷酸包裹使得甲基化寡核苷酸的疗效等于或好于未甲基化寡核苷酸的疗效,尤其当寡核苷酸含有天然磷酸二酯(PO)骨架时。图13显示在植入肿瘤后,用具有PS骨架的甲基化包裹的ODN1m治疗的疗效等于未甲基化ODN1。相反,图14显示具有PO骨架的相应包裹的甲基化ODN1m和未甲基化ODN1寡核苷酸的作用,其中在移植后第32天,甲基化型疗效最好,而未甲基化型失去其效力。图15显示未甲基化ODN2和其甲基化对应物ODN2m在减小肿瘤生长方面实际上效力相同。因此,在一些实施方式中,当具有PS骨架时,甲基化寡核苷酸至少与未甲基化对应物等效。
图18,19,20和21进一步详细说明上述效力数据。图18显示在一段长时间内,甲基化PS-ODN1m的脂质包裹提供了比PS-ODN1包裹更有效的降低肿瘤生长的治疗效益。在图19描述的两项不同的研究中:用包裹的PS-ODN1m治疗的小鼠与用PS-ODN1治疗相比有更高生存率进一步证实了此效力。图19A说明在一系列时间点无肿瘤动物的百分比,同时图19B说明在相同的时间点,研究中剩余的动物数量。如图19B中清楚地所示,在研究过程中,用ODN1和ODN1m治疗的研究中剩余的动物数量实质上相同。然而,图19A清楚地说明与那些施用未甲基化ODN1的动物相比,施用甲基化ODN1m治疗无肿瘤动物百分比更高。
相似地,图20说明随时间在用两种寡核苷酸治疗的小鼠中的肿瘤体积,图21说明随时间存活的动物百分比。图20显示与包裹的未甲基化相应物ODN1相比,当动物施用包裹的甲基化ODN1m时效力提高。相对地,图21显示相对于施用未甲基化ODN1,施用甲基化ODN1m小鼠的存活率上升。
在相同肿瘤模型中,采用不同的免疫方案进行进一步的效力研究。在该研究中,通过皮下免疫诱导的抗肿瘤效力在C57BI/6(每组5只动物)中以预防性免疫模型评定。以q7dx2给药方案,在第0和7天,以100μg寡核苷酸和20μg抗原的剂量对小鼠皮下免疫2针。然后在第21天,皮下注射5×105个EG.7 Ova肿瘤表达细胞,对动物进行攻击。每周监测小鼠3次,以评定肿瘤生长和重量的增加。以上述相同的方案,对对照小鼠注射PBS。图24(b)中的寡核苷酸包裹在脂质颗粒中,含有DSPC∶CHOL∶DODAP∶PEGCer14各比为25∶45∶20∶10的脂质组合物。甲基化和未甲基化寡核苷酸的所有比较均使用相同脂质颗粒。这些效力实验获得的结果在图24中详述。各图中的第0天是每只动物用肿瘤攻击的日子。
图24说明利用脂质包裹的PS-ODN1、PS-ODN2(均未甲基化)、PS-ODN1m(甲基化)与E-G7 OVA肿瘤抗原联合治疗实验性肿瘤E-G7的实例,在这种情况下,其通过结合到脂质颗粒表面与脂质颗粒结合。图24A显示当寡核苷酸不以免疫刺激脂质颗粒给药时,甲基化PS-ODN1m对肿瘤生长几乎无作用。相应未甲基化寡核苷酸PS-ODN1对减小肿瘤体积有效,而未甲基化寡核苷酸PS-ODN2为部分有效。图24B显示不仅寡核苷酸包裹在脂质颗粒中使未甲基化PS-ODN2的效力增加到与ODN1相同的水平,而且包裹的甲基化寡核苷酸PS-ODN1m比任一个包裹的未甲基化寡核苷酸更有效。
图25-28进一步说明寡核苷酸包裹使得包裹的甲基化寡核苷酸与未甲基化寡核苷酸相同的疗效,或使甲基化寡核苷酸的疗效好于未甲基化寡核苷酸。图25说明甲基化PS-ODN5m的脂质包裹提供了比相同未甲基化PS-ODN5的包裹在over time减小肿瘤生长方面更有效的疗效。通过施用包裹的甲基化PS-ODN5m的小鼠存活率比施用未甲基化PS-ODN5的小鼠存活率更高,进一步证实了其效力,如图26所示。图27说明虽然游离的未甲基化PS-ODN7提供了一些抗肿瘤效益,但是游离的未甲基化PS-ODN7和PO-ODN7,以及游离甲基化PS-ODN7和PO-ODN7对减小肿瘤生长相对无效。然而,甲基化PO-ODN7m的脂质包裹提供了有效的减小肿瘤生长的治疗效力。相似地,图28中以施用这些相同ODN的小鼠存活率也说明了该趋势。
实施例7
在B-16黑素瘤肿瘤模型中比较甲基化和未甲基化寡核苷酸的治疗性抗肿瘤效力
在治疗免疫模型,C57BI/6(每组8只动物)中评定通过静脉内尾部免疫诱导的抗肿瘤效力。在第0天,对动物皮下注射3.0×105个EG.7 B16/BL6鼠黑素瘤表达肿瘤细胞进行攻击。然后,从第4天开始每隔一天,一共14天,以20mg/kg ODN的剂量对小鼠静脉给药。每隔一天对小鼠进行监测,评定肿瘤生长和重量的增加。以上述相同的方案对对照小鼠注射HBS。寡核苷酸包裹在脂质组分DSPC∶CHOL∶DODAP∶PEGCer14各比为25∶45∶20∶10的脂质颗粒中。这些效力实验获得的结果在图16和17中详述。各图中的第0天是每只动物用肿瘤攻击的日子。
图16说明对接种B16黑素瘤肿瘤的动物施用甲基化PS-ODN1m的疗效,与其未甲基化对应物PS-ODN1相比。在脂质颗粒中的PS-ODN1m包裹使得其减小肿瘤体积的效力增加到至少为包裹的未甲基化PS-ODN1的效力。
图17说明在第22天,每只小鼠中肿瘤的平均重量。施用游离甲基化PS-ODN1m的小鼠中的平均肿瘤大小几乎与施用缓冲液对照的小鼠中相同,而施用游离未甲基化PS-ODN1的小鼠显示减小的肿瘤生长。相反,当小鼠施用包裹在脂质颗粒中的甲基化PS-ODN1时,肿瘤减小的量几乎与施用脂质包裹的未甲基化PS-ODN1相同。因此,甲基化寡核苷酸的脂质包裹能产生体内治疗肿瘤的效力,虽然游离的甲基化寡核苷酸效力很低或无效。
实施例8
当施用包裹的寡核苷酸时的血Clearance水平
有效免疫刺激中的一个重要方面就是免疫系统提高针对特异性抗原的抗体应答的能力。图23中所示数据说明结合脂质包裹的寡核苷酸的抗原引发所述应答的能力的第一个实证中的一个。
ODN1和ODN1m分别包裹在两个不同的脂质颗粒中:脂质1(L1)为DSPC∶CHOL∶DODAP∶PEGCer20,脂质2(L2)除了用PEGCer14代替PEGCer20外,其它与脂质1相同。PEGCer 20在脂质体中的半衰期已知比PEGCer14长很多,这样,PEGCer20就会较长时间保存在脂质颗粒中。从第0天开始,对小鼠进行4次静脉内尾部注射,每周给药一次共3周。每周在注射1小时后采血,并分析血液中存在的包裹ODN。
图23说明不同脂质组合物对小鼠血液清除的影响,分别用不同PEG-神经酰胺空间包被的(分别用PEG-神经酰胺-C-20和PEG-神经酰胺-C-14)L1和L2分别与甲基化或未甲基化寡核苷酸ODN1m和ODN1联合。在注射1次后,结果显示不考虑组合物血液样品时,获得的所有包裹ODN都有延长的循环/慢清除。然而,在注射2、3和4次后,结果显示含有长寿命PEG Cer20的L1脂质体(L1-ODN1和L1-ODN1m)具有短循环/快清除,而含有短寿命PEG神经酰胺C-14的L2-ODN和L2-ODN2m比那些含PEG Cer20脂质的用脂质颗粒包裹具有长循环/慢清除。
此处所描述的数据说明两点:(1)抗原特异性抗体的诱导;(2)未甲基化和甲基化寡核苷酸的相关免疫刺激能力。就抗原特异性抗体的诱导来说,起初注射导致直接针对PEG-神经酰胺空间屏障脂质的PEG部分的抗体诱导,在注射动物的血浆中这些抗体的存在导致调理作用和接下来在注射2,3和4次后,从如从含PEG脂质体循环中快速的清除,如含PEGCer20的L1脂质体中所看见的。然而,那些注射不含PEG的脂质体的动物,如含PEGCer14的L2脂质体,从中PEG在循环中快速分离,就不受调理并且具有相对长度循环时间。从未甲基化寡核苷酸对甲基化寡核苷酸的相对免疫刺激效力来看,含未甲基化寡核苷酸或相应的甲基化型的脂质体的清除以相似的速率被清除,这就说明这两种物质都能诱导抗原特异性抗体。
实施例9
用多肿瘤相关抗原利用多表位型方法诱导CTL应答
单一表位型方法具有只能引起一种抗原的MHC-限制性CTL应答的缺点。另外,许多癌抗原是未突变的分化抗原,如上所举例的TRP-2,这样,在胸腺培养过程中,显著去除了宿主中的自反应T细胞。多表位型方法允许同时靶向多抗原,并增加针对所述自身抗原的抗肿瘤CTL应答的光谱。很明显对多抗原特异并由多MHC等位基因限制的CTL应答是广大免疫反应所希望的,使得在不同恶性肿瘤中肿瘤抗体和MHC等位基因可变表达。靶向与特定恶性肿瘤结合的多抗原将减小凭借抗原下调和表位突变的肿瘤逃逸机会。
可利用合成性肽表位的多重组抗原混合物获得靶向多抗原和MHC等位基因。为了提高针对这些多表位抗原的免疫应答,在对许多佐剂进行实验。该实验使用包裹的PS-ODN1m,利用联合两种鼠黑素瘤抗原TRP2(H2Kb,VYDFFVWL)和Gp100(H2Db,EGSRNQDWL)的POPC∶Chol∶DODMA∶PEG-DMG。以包裹的PS-ODN1m形式,对C57BU6小鼠注射每种抗原或两种抗原3次。作为阳性对照,我们使用已知能有效诱导CTL应答的树突细胞。用ODN1m或DC分析含有多表位的B16溶菌产物诱导多表位免疫的能力。以抗原特异性方式,通过CD8+T细胞针对肿瘤细胞,调节细胞毒性的能力评定免疫应答。
结果:当连同包裹的ODN1m一起注射时,可引起针对两种抗原的CTL应答(图29)。PS-ODN1m与DC在产生针对两种一同传递抗原的CTL应答方面同样有效(图30)。注射B16溶菌产物和PS-ODN1m比注射与B16溶菌产物培养的DC更能有效诱导CTL(图31)。
所提供的实施例说明了本发明的一些实施方式。然而从广义上说,本发明包含组合物和利用这些组合物提供对哺乳动物受试者(包括人)治疗上的益处的方法。本发明的组合物的形式是脂质膜小泡;和完全包裹在所述小泡中的核酸。在需要刺激产生对特定抗原的应答时,该组合物还可将抗原与小泡结合,例如通过化学偶合、疏水键或离子键结合到小泡外部表面,或将抗原包裹在小泡内。
优选的组合物是核酸占组合物重量4%以上的组合物。
本发明组合物中的核酸可以是合适的核酸,它不和受治疗的哺乳动物的基因组互补,并通过不依赖于与哺乳动物的核酸互补的碱基配对作用的机制提供免疫刺激。这些核酸常常含有免疫刺激性序列,如CpG基元或免疫刺激性回文序列。
本发明的组合物中使用的核酸可以是当以游离形式施给未受免疫攻击的哺乳动物时不诱导免疫应答的核酸,或当以游离形式施给未受免疫攻击的哺乳动物时,抑制对核苷酸的免疫刺激性序列免疫应答的核酸。
核酸可完全是磷酸二酯核苷酸间键或可以是经修饰的,其方式是多个磷酸二酯核苷酸间键与修饰的核苷酸间键联合。核酸还可完全是经修饰的键,或多个经修饰的键。例如,核酸还可完全是硫代磷酸酯核苷酸间键或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
用于合适的配制组合物的阳离子脂质选自DODAP、DODMA、DMDMA、DOTAP、DC-Chol、DDAB、DODAC、DMRIE、和DOSPA。另外,脂质配制剂优选含有防聚集化合物,如PEG-脂质、PAO-脂质或神经节苷脂。
除了或代替抗原,本发明的组合物可含有共同包裹的细胞毒性剂,如阿霉素。脂质膜载体完全包裹核酸和细胞毒性剂。该类组合物可用作为本发明的另一方面的方法制备。在该方法中,将脂质制备在乙醇中;将脂质与寡核苷酸在水相缓冲液中混合,形成负荷寡核苷酸的脂质小泡;并使寡核苷酸负荷的脂质小泡与细胞毒性剂接触,使细胞毒性剂活性聚集在所述小泡的内部空间中,制备治疗组合物。
本发明的组合物可不同方法使用,通过使用脂质-核酸颗粒,其含有完全包裹在脂质配制剂中的核酸,该脂质配制剂含有制造药物中的阳离子脂质,对哺乳动物(包括人)提供治疗上的益处。因此,可用组合物在哺乳动物中诱导免疫应答,活化哺乳动物中的CTL或B细胞或治疗具有肿瘤形成的哺乳动物中的肿瘤形成,使用方法:制备含有完全包裹在脂质配制剂中的核酸的脂质-核酸颗粒,该脂质配制剂含有阳离子脂质;对哺乳动物施用脂质-核酸颗粒。
当在组合物中包括抗原时,本发明提供了一种诱导对抗原的免疫应答的方法,包括:制备含有脂质膜小泡和一种抗原的颗粒,该脂质膜小泡含有完全包裹在所述小泡中的核酸,所需抗原是免疫应答所针对的,它与所述小泡外表面结合,并将颗粒施给要治疗的哺乳动物。
如上文实施例中所显示的,根据本发明,在组合物中利用脂质载体,使需要实现免疫系统的所需刺激的寡核苷酸量充分减少。在一些情况下,这由当以脂质包裹的形式提供时,游离形式下没有明显活性的寡核苷酸能用于刺激免疫应答反映。在其它情况下,这由需要用较低的ODN剂量水平,实现相同应答水平的ODN量反映。因此,在实施使用有效量的寡核苷酸刺激哺乳动物的免疫应答的方法中,本发明提供了改进,包括在脂质小泡中完全包裹寡核苷酸,对哺乳动物受试者施用小于所述有效量20%的寡核苷酸,从而在所述哺乳动物受试者中获得所需的免疫应答。
虽然本文中描述的数据显示了体内免疫刺激活性和治疗效力,利用本发明的一些示范性的实施方式,其为了提供完整性和一致性,很明显本发明并不限制到这些示范性的实施方式。本领域的普通技术人员很容易地制造和利用与本文所提供教导一致的本发明的其它特殊实施方式。
Claims (44)
1.一种在动物中刺激免疫应答的脂质-甲基化核酸配制剂,所述配制剂包括脂质成分和核酸成分,其中核酸成分含有甲基化核酸序列。
2.根据权利要求1所述的脂质-核酸配制剂,其中所述甲基化核酸序列含有至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。
3.根据权利要求2所述的配制剂,其中所述甲基化胞嘧啶包含连接到碳-4位(4-mc)或碳-5位(5-mc)的甲基或羟甲基基团。
4.一种含有脂质-核酸(LNA)配制剂的佐剂,其中所述LNA配制剂包含:
a)脂质成分,其包括至少一种阳离子脂质;和
b)核酸成分,其含有至少一种甲基化寡核苷酸;
其中所述佐剂能在体内刺激树突细胞应答抗原刺激。
5.根据权利要求4所述的佐剂,其中所述佐剂能在体内刺激树突细胞的扩增,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
6.根据权利要求4所述的佐剂,其中所述佐剂能在体内刺激树突细胞的活化,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记并表达CD86标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
7.根据权利要求4所述的佐剂,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含具有甲基化胞嘧啶的单个CpG二核苷酸。
8.根据权利要求7所述的佐剂,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′(ODN1m)。
9.根据权利要求4所述的佐剂,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含两个CpG二核苷酸,且所述CpG二核苷酸中至少一个的胞嘧啶是甲基化的。
10.根据权利要求9所述的佐剂,其中所述的甲基化核酸序列是具有序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGTT 3′(ODN2m)的寡核苷酸。
11.根据权利要求4所述的佐剂,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸含有至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的佐剂,其中所述寡核苷酸含有修饰的磷酸骨架。
13.根据权利要求12所述的佐剂,其中所述修饰的磷酸骨架是硫代磷酸酯。
14.包含脂质-核酸(LNA)配制剂以及至少一种靶抗原的疫苗,其中所述至少一种靶抗原与所述LNA配制剂混合或结合,所述配制剂包含:
a)脂质成分,其包括至少一种阳离子脂质;和
b)核酸成分,其含有至少一种甲基化寡核苷酸;
其中所述疫苗能在体内刺激树突细胞应答由所述配制剂向抗原-呈递细胞呈递的所述至少一种靶抗原。
15.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述疫苗能在体内刺激树突细胞的扩增,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
16.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述疫苗能在体内刺激树突细胞的活化,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记并表达CD86标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
17.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含具有甲基化胞嘧啶的单个CpG二核苷酸。
18.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含多个CpG二核苷酸,且所述CpG二核苷酸中至少一个的胞嘧啶是甲基化的。
19.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的疫苗,其中所述至少一种靶抗原包含微生物抗原。
21.根据权利要求14-19中任一项所述的疫苗,其中所述至少一种靶抗原包含肿瘤相关抗原。
22.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述至少一种靶抗原包含多个来自相同抗原的表位。
23.根据权利要求14所述的疫苗,其中所述至少一种靶抗原包含多个来自不同抗原的表位。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的疫苗,其中所述寡核苷酸含有修饰的磷酸骨架。
25.根据权利要求24所述的疫苗,其中所述修饰的磷酸骨架是硫代磷酸酯。
26.一种刺激宿主对抗原刺激的免疫应答提高的方法,包括对所述宿主施用脂质-核酸(LNA)配制剂,所述LNA配制剂包含:
a)脂质成分,其包括至少一种阳离子脂质;和
b)核酸成分,其含有至少一种甲基化寡核苷酸;
其中所述LNA配制剂能在体内刺激树突细胞应答抗原刺激。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述LNA配制剂能在体内刺激树突细胞的扩增,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
28.根据权利要求26所述的方法,其中所述LNA配制剂能在体内刺激树突细胞的活化,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记并表达CD86标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
29.根据权利要求26所述的方法,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含具有甲基化胞嘧啶的单个CpG二核苷酸。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸含有序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′(ODN1m)。
31.根据权利要求26所述的方法,其中所述至少一种甲基化寡核苷酸包含至少两个CpG二核苷酸,且所述CpG二核苷酸中至少一个的胞嘧啶是甲基化的。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述甲基化核酸序列是具有序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGTT 3′(ODN2m)的寡核苷酸。
33.根据权利要求26-32中任一项所述的方法,其中所述LNA配制剂与至少一种靶抗原联合给药,其中所述至少一种靶抗原与所述LNA配制剂混合或结合。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述至少一种靶抗原与所述LNA配制剂混合。
35.根据权利要求33所述的方法,其中所述至少一种靶抗原与所述LNA配制剂结合。
36.根据权利要求26-35中任一项所述的方法,其中所述甲基化寡核苷酸含有修饰的磷酸骨架。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述修饰的磷酸骨架是硫代磷酸酯。
38.一种刺激树突细胞的方法,包括将至少一种树突细胞与脂质-甲基化核酸配制剂接触,所述配制剂包含脂质成分和核酸成分,所述核酸成分含有甲基化核酸序列。
39.一种在体内刺激宿主的树突细胞的方法,包括对所述宿主施用脂质-甲基化核酸配制剂,所述配制剂含有脂质成分和核酸成分,该核酸成分含有甲基化核酸序列,其中所述制剂能在体内刺激树突细胞应答抗原刺激。
40.根据权利要求38或39所述的方法,其中刺激树突细胞包括树突细胞的扩增,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
41.根据权利要求38或39所述的方法,其中刺激树突细胞包括树突细胞的活化,其特征为,表达CD11c和DEC205标记中至少一种标记并表达CD86标记的抗原-呈递细胞的数量增加。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法,其中所述甲基化核酸序列包含至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述甲基化胞嘧啶含有连接到碳-4位(4-mc)或碳-5位(5-mc)的甲基或羟甲基基团。
44.一种同时将抗原和佐剂免疫刺激传递给抗原呈递细胞的方法,包括将脂质-核酸(LNA)配制剂与靶抗原结合施用,所述LNA配制剂包含:
a)脂质成分,其包括至少一种阳离子脂质;和
b)核酸成分,其含有至少一种具有至少一个CpG二核苷酸的寡核苷酸;
其中所述LNA配制剂能在体内刺激树突细胞。
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