CN107106674A - 口蹄疫疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供用于预防口蹄疫(FMD)的组合物，其包含量等效于0.5μg到20μg FMD病毒的抗原组分和包含油、免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子载体的佐剂组分。还提供使用所述组合物的方法以及降低FMD续留(FMD persistence)的方法。

Description

口蹄疫疫苗
背景技术
口蹄疫(FMD)为一种对包括家畜(牛、猪、绵羊、山羊等)和多种野生动物的偶蹄类动物传染性极强的病毒疾病。在感染FMDV牛中最显著的疾病症状包括口腔、舌头、乳头和脚上皮细胞的囊泡病变。尽管一些国家(其中美国、加拿大、墨西哥、澳大利亚和欧洲的大部分)被认为是无FMD，但疾病已经遍布全球并且对出口行业具有极大的经济影响。实际上，在过去十年间几乎在每一个大陆上都发生过若干次对经济具有破坏性的爆发。
必需在昂贵的生物控制设施中通过使大量(数千升)的经调适以在细胞中生长的毒性FMDV生长来生产目前杀死的抗原FMDV疫苗，这有时是困难的。此方法已造成毒性病毒从制造设施中漏出，从而在牲畜中引发高代价的爆发(参见Cottam等人2008.《公共科学图书馆病原体(PLoS Pathogen)》4:1-8)。在生长之后，然后使用化学品灭活病毒并且制备抗原浓缩物，之后进行除去污染蛋白所需的纯化步骤。难以通过血清学诊断测试区分受感染的动物与已接种疫苗的动物(DIVA)。在血清型和亚型上几乎没有交叉保护，而是需要疫苗和传播野外病毒株之间适当的适当匹配来实现保护。尽管疫苗的这些缺点，但是每年在全世界范围内仍制造数十亿剂量。疫苗的使用已经成为从欧洲根除FMDV和在世界的许多地方通过大规模接种疫苗行动来控制疾病的基础。产生含有骨架和合适限制位点的经基因工程改造的病毒部分地解决灭活疫苗的缺点，因为限制位点为引入不同FMD病毒株的衣壳蛋白提供基因位点。尽管如此，抗原的成本是FMD和大部分其它疫苗的成本的最大贡献因素。
FMD控制问题通过病毒续留(virus persistence)现象而进一步加剧。简单来说，历史上，灭活FMD疫苗已不能够预防续留或携带状态(被定义为感染和/或暴露后在28天后病毒排出)。排毒的动物，尽管未呈现任何FMD症状，但可仍然为其它动物的FMD感染源。因而，通常认可的疾病控制操作需要屠宰已接种疫苗的畜群中的所有动物，即使它们没有疾病的临床征象。
因而，仍期望产生具有较低抗原负载量而不损害效率和/或降低或消除FMD续留的疫苗的方法和组合物。
发明内容
在一个方面中，本发明提供一种包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、免疫刺激寡核苷酸以及聚阳离子聚合物；铝源；并且抗原组分包含量等效于每剂量0.5μg到8μg的FMD病毒的FMD抗原组合物。
在某些实施例中，免疫刺激寡核苷酸为含有CpG的寡核苷酸。在某些实施例中，聚阳离子聚合物为DEAE葡聚糖。
在不同实施例中，抗原为FMD病毒组合物，并且以每剂量0.5μg到4μg，或每剂量0.5μg到2μg，或每剂量0.5μg到1μg的量，或以每剂量约0.5μg的量存在。
FMD病毒可被灭活或减毒。在某些实施例中，FMD病毒为灭活FMD A24Cruzeiro病毒株。在所选择的实施例中，灭活病毒株为经基因工程改造的病毒株，其缺失前导编码区(LL)并且任选地含有阴性抗原标记。
在某些实施例中，经基因工程改造的病毒含有来自异源病毒株的衣壳蛋白。
在另一方面中，本发明提供一种在有需要的动物中预防FMD的方法，所述方法包含向所述动物投与根据先前方面的实施例的免疫原性组合物。在不同实施例中，动物选自牛类、绵羊类、猪类和山羊类。
在另一方面中，本发明提供一种在感染FMD的反刍动物中降低FMD续留频率的方法，所述方法包含在感染之前向所述反刍动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的FMD病毒的FMD抗原。
在又一方面中，本发明提供一种畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的FMD病毒的FMD抗原，其中，在疑似与FMD感染接触后，不屠宰畜群的已接种疫苗成员。
本发明还提供一种畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的FMD病毒的FMD抗原，其中，在疑似与FMD感染接触后，将畜群的已接种疫苗成员隔离0到62天。
本发明还提供一种畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的FMD病毒的FMD抗原，其中，在疑似与FMD感染接触后，将畜群的已接种疫苗成员移出感染区。
附图说明
图1示出PEG沉淀的抗原与中空纤维浓缩的抗原之间的品质差异。
具体实施方式
定义
“约”或“大致”当与可测量数值变量结合使用时是指所述变量的指示值并且是指在指示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内的变量的所有值，无论哪个更大，除非约参考以周为单位的时间间隔使用，否则其中“3周”为17到25天，并且约2到约4周为10到40天。
“佐剂”意指提高对抗原的体液或细胞免疫应答的任何物质。佐剂一般用于实现两个目标：抗原从注射部位的控制释放和免疫系统的刺激。
“抗体”是指由于对特异性抗原的免疫应答可结合到所述特异性抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”区和“可变”区的“轻”和“重”多肽链构成的血清蛋白，并且基于恒定区的组成而分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
“抗原”或“免疫原”是指被动物的免疫系统识别并产生免疫应答的任何物质。所述术语包括经杀死、灭活、减毒或修饰的活细菌、病毒或寄生虫。术语“抗原”还单独地或以其任何组合包括多核苷酸、多肽、重组蛋白、合成肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖或脂质或其片段。术语抗原还包括如抗个体基因型抗体或其片段的抗体，和可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟表位。
“缓冲液”意指防止另一种化学物质的浓度变化的化学体系，例如，质子供体和受体体系充当防止氢离子浓度(pH)显著变化的缓冲液。缓冲液的另一个实例为含有弱酸和其盐(共轭碱)或弱碱和其盐(共轭酸)的混合物的溶液。
如应用于佐剂制剂的“主要组成”是指不含有以所述药剂发挥可测量辅助或免疫调节作用量的未列出的附加辅助剂或免疫调节剂的制剂。
“剂量”是指给予受试者的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“引发疫苗”是指在第0天给予的此类组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”或“年剂量”是指在第一剂量之后给予的此类组合物的量，其可为或可不为与第一剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。
术语“乳化剂”在本发明中广泛地使用。其包括公认为乳化剂的物质，例如，或产品线的不同产品(分别为聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯和经脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂)和不同溶解度增强剂如PEG-40蓖麻油或另一种聚乙二醇化氢化油。
“体液免疫应答”是指通过抗体介导的一种免疫应答。
受试者的“免疫应答”是指对抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答的研究。免疫应答通常可使用本领域中已知的标准免疫分析和中和分析来测定。
抗原的“免疫有效量”或“产生免疫应答的有效量”为在受体中有效诱导免疫原性应答的量。免疫原性应答可足以用于诊断目的或其它测试，或可足以预防疾病的征象或症状，包括由疾病药剂感染引起的不良健康影响或其并发症。可诱导体液免疫或细胞介导免疫中的一者或两者。动物对免疫原性组合物的免疫原性应答可例如，间接通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖分析，或直接通过监测在用野生型病毒株攻击之后的征象和症状来评估，而由疫苗赋予的保护性免疫可通过测量例如如死亡率、发病率、温度数值的临床征象的降低、受试者的总体生理状态和总体健康和表现来评估。免疫应答可包含但不限于诱导细胞和/或体液免疫。
“免疫原性”意指诱发免疫或抗原应答。因此，免疫原性组合物将为诱导免疫应答的任何组合物。
“受感染场所”是指其中基于实验室结果、相容性临床征象、FMD病例定义和国际标准存在假定的阳性病例或确认的阳性病例的场所。
“受感染区”是指超出假定或确认的受感染场所周边3km内的区域。
“脂质”是指一组包括脂肪、油、蜡、固醇和甘油三酯的有机化合物中的任一种，其不溶于水但可溶于非极性有机溶剂、触摸为油性的并且与碳水化合物和蛋白质一起构成活细胞的主要结构材料。
“医药学上可接受的”是指物质在合理医学判断的范围内适用于与受试者的组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等，与合理的效益-风险比相称，并且对其预定用途有效。
“TCID50”是指“组织培养物感染性剂量”并且被定义为感染50％给定批次的接种细胞培养物所需的病毒稀释度。多种方法可用于计算TCID50，包括在整个本说明书中利用的斯皮尔曼-卡勃方法(Spearman-Karber method)。对斯皮尔曼-卡勃方法的描述参见B.W.Mahy和H.O.Kangro,《病毒学方法指南(Virology Methods Manual)》,第25-46页(1996)。
持续感染或携带者动物为在感染临床疾病或临床疾病发病后在28天后排出FMD病毒的动物。
佐剂制剂和制备方法
本申请案公开适合于本发明的若干种佐剂制剂。这些佐剂的常见特征为存在油和一种或多种乳化剂，其中油相占包围其中公开的佐剂调配物的疫苗组合物的至少50％。
多种油和其组合适用于本发明。这些油包括但不限于动物油、植物油以及不可代谢的油。适于本发明的植物油的非限制性实例为玉米油、花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。动物油的非限制性实例为角鲨烷。不可代谢的油的合适的非限制性实例包括轻矿物油、直链或支链饱和油等。
在一组实施例中，用于本发明的佐剂制剂中的油为轻矿物油。如本文所用，术语“矿物油”是指经由蒸馏技术从矿脂获得的液体烃的混合物。所述术语与“液化石蜡”、“液体矿脂”和“白色矿物油”同义。所述术语还旨在包括“轻矿物油”，“即，类似地通过矿脂的蒸馏获得的油，但其具有比白色矿物油略微低的比重”。参见，例如，《雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第18版(宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)：马克出版公司(Mack Publishing Company),1990,第788页和1323页)。矿物油可从各种商业来源获得，例如J.T.Baker(宾夕法尼亚州菲利普斯堡(Phillipsburg,PA))、USB公司(俄亥俄州克利夫兰(Cleveland,Ohio))。优选的矿物油为可以名称商购的轻矿物油。
在特别适合于预防或消除FMD续留的某些实施例中，油相以按体积计50％到95％的量；优选地，以大于50％到85％的量；更优选地，以大于50％到60％的量，并且更优选地以大于疫苗组合物的50％v/v到52％v/v的量存在。油相包括油和乳化剂(例如，80、80等)，如果存在任何此类乳化剂的话。油相的体积被计算为油和一种或多种乳化剂的体积的总和。因此，举例来说，如果油的体积为组合物的40％并且一种或多种乳化剂的体积为组合物的12％，那么油相将以组合物的52％v/v存在。类似地，如果油以约45％的量存在并且一种或多种乳化剂以组合物的约6％的量存在，那么油相以组合物的约51％v/v存在。
还应理解，由于本发明的佐剂仅形成本发明疫苗的一部分，所以油相以按体积计50％到95％的量；优选地，以大于50％到85％的量；更优选地，以50％到60％的量，并且更优选地以本发明佐剂中的每一种的50％v/v到52％v/v的量存在。
在实施例的变换实施例中，油和油溶性乳化剂在一起的体积百分比为按体积计至少50％，例如，50％到95％；优选地，以大于50％到85％的量；更优选地，以50％到60％的量，并且更优选地以疫苗组合物的50％v/v到52％v/v的量。因此，举例来说但不限于，油可以45％的量存在并且脂溶性乳化剂将以大于5％v/v的量存在。因此，油和油溶性乳化剂在一起的体积百分比将为至少50％。
在适用于本发明的所有疫苗的又一变换实施例中，油的体积百分比为按体积计超过疫苗组合物的40％，例如，40％到90％；40％到85％；43％到60％，44％v/v到50％v/v。
适用于本发明乳液的乳化剂包括天然生物相容性乳化剂和非天然合成表面活性剂。生物相容性乳化剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)，如大豆卵磷脂或蛋卵磷脂。可通过水洗涤粗植物油并且分离并干燥所得水合胶状物获得作为磷脂和甘油三酯的混合物的卵磷脂。可通过分馏在经由丙酮洗涤去除甘油三酯和植物油之后残留的丙酮不可溶磷脂和糖脂的混合物来获得精炼产物。可替代地，卵磷脂可从各种商业来源获得。其它合适的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰乙醇胺。磷脂可从天然来源中分离或常规地合成。
在附加实施例中，本文所用的乳化剂不包括卵磷脂，或以免疫无效的量使用卵磷脂。
适用于本发明的佐剂制剂的非天然、合成乳化剂包括基于脱水山梨糖醇的非离子表面活性剂，例如经脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂(可以名称或商购)、聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯来自如蓖麻油来源的脂肪酸的聚乙二醇酯聚乙氧基化脂肪酸(例如，可以名称M-53获得的硬脂酸)、聚乙氧基化异辛基苯酚/甲醛聚合物聚氧乙烯脂肪醇醚聚氧乙烯非苯基醚(N)、聚氧乙烯异辛基苯基醚(X)。优选的合成表面活性剂为可以名称和获得的表面活性剂，如-80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和-80(脱水山梨糖醇单油酸酯)。
一般来说，一种或多种乳化剂可以按体积计0.01％到40％，优选地，0.1％到15％，更优选地2％到10％的量存在于疫苗组合物中。
存在于本发明佐剂制剂中的附加成分包括阳离子载体、免疫刺激寡核苷酸、单磷脂A和其类似物(MPL-A)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、皂苷、季铵、固醇、糖脂、铝源(例如，或VAC湿凝胶)和其组合。
合适的阳离子载体包括但不限于葡聚糖、葡聚糖DEAE(和其衍生物)、PEG、瓜尔豆胶、壳聚糖衍生物、聚纤维素衍生物比如羟基乙基纤维素(HEC)聚乙烯亚胺、聚氨基酸(比如聚赖氨酸)等。
合适的免疫刺激寡核苷酸包括ODN(基于DNA)、ORN(基于RNA)寡核苷酸或嵌合ODN-ORN结构，其可具有经修饰的骨架，包括但不限于硫代磷酸酯修饰、卤化、烷基化(例如，乙基或甲基修饰)和磷酸二酯修饰。在一些实施例中，可使用聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物(聚I:C)。
CpG寡核苷酸为近来描述的一类药物治疗剂，其特征在于在特异性碱基-序列背景(CpG基序)中存在未甲基化的CG二核苷酸。(HanselTT,Barnes PJ(编):《用于哮喘、过敏和COPD的新药(New Drugs forAsthma,Allergy and COPD)》.《呼吸研究进展(Prog RespirRes.)》Basel,Karger,2001,第31卷,第229-232页，其以引入的方式并入本文中)。这些CpG基序未见于真核DNA中，其中CG二核苷酸被抑制并且当存在时通常甲基化，但存在于它们赋予免疫刺激特性的细菌DNA中。
在所选择的实施例中，本发明的佐剂利用所谓的P类免疫刺激寡核苷酸，更优选地经修饰的P类免疫刺激寡核苷酸，甚至更优选地经E-修饰的P类寡核苷酸。P类免疫刺激寡核苷酸为CpG寡核苷酸，其特征在于存在回文序列，一般6到20个核苷酸长。P类寡核苷酸具有在活体外和/或活体内自发地自组装成多联体的能力。这些寡核苷酸严格说来是单股的，但回文序列的存在允许形成多联体或可能地茎-环结构。P类免疫刺激寡核苷酸的总长度为19和100个核苷酸之间，例如，19到30个核苷酸、30到40个核苷酸、40到50个核苷酸、50到60个核苷酸、60到70个核苷酸、70到80个核苷酸、80到90个核苷酸、90到100个核苷酸。
在本发明的一个方面中，免疫刺激寡核苷酸含有5'TLR活化域和至少两个回文区，一个回文区为至少6个核苷酸长的5'回文区并且直接或通过间隔子连接到至少8个核苷酸长的3'回文区。
P类免疫刺激寡核苷酸可根据本领域中已知的技术来修饰。举例来说，J-修饰是指经碘修饰的核苷酸。E-修饰是指一种或多种经乙基修饰的核苷酸。因此，经E-修饰的P类免疫刺激寡核苷酸为其中至少一个核苷酸(优选地5'核苷酸)被乙基化的P类免疫刺激寡核苷酸。附加修饰包括6-硝基-苯并咪唑的附接、O-甲基化、用proynyl-dU修饰、肌苷修饰、2-溴乙烯基附接(优选地附接到尿苷)。
P类免疫刺激寡核苷酸还可含有经修饰的核苷酸间键，包括但不限于磷酸二酯和硫代磷酸酯键。本发明的寡核苷酸可被合成或从商业来源获得。
P类寡核苷酸和经修饰的P类寡核苷酸进一步公开于公布的PCT申请案第WO2008/068638号中，其在2008年6月12日公布。经修饰的P类免疫刺激寡核苷酸的合适的非限制性实例在下文提供(“*”是指硫代磷酸酯键并且“-”是指磷酸二酯键)。
SEQ ID NO:1 5'T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:2 5'T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:3 5'T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:4 5'JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:5 5'JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:6 5'JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:7 5'EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:8 5'JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:9 5'JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:10 5'T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'
SEQ ID NO:11 5'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3'
SEQ ID NO:12 5'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3'
SEQ ID NO:13 5'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'
SEQ ID NO:14dTdCdGdTdCdGdTdTdTdTrGrUrUrGrUrGrUdTdTdTdT-3'
用于佐剂组合物的P类免疫刺激寡核苷酸的量取决于所用的P类免疫刺激寡核苷酸和预期物质的性质。
除了油和一种或多种乳化剂以外，佐剂制剂还包含(或主要由以下组成，或由以下组成)免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子载体的组合。这些佐剂被称作“TXO”。
在一组实施例中，TXO佐剂还可包括铝源，如Al(OH)3凝胶。具有铝的TXO佐剂被称作“TXO-A”。
在一组实施例中，佐剂TXO和TXO-A可任选地含有固醇，如例如，胆固醇、羊毛固醇、豆甾醇等。含有固醇的TXO和TXO-A佐剂分别被称作TCXO和TCXO-A。任选存在的固醇可以每剂量高达约1000μg(例如，100μg到1000μg、200μg到1000μg、250μg到700μg或约400μg到500μg)的量存在。
在一组实施例中，在TXO佐剂中，免疫刺激寡核苷酸，优选地ODN，其优选地含有回文序列并且任选地具有经修饰的骨架，可以每剂量5μg到400μg的量存在，并且聚阳离子载体可以每剂量5mg到400mg的量存在。
举例来说，在某些实施例中，一剂量的TXO将包含每剂量约5μg和400μg之间(例如，每剂量6.25μg到200μg或6.25μg到100μg或6.25μg到50μg或6.25μg到25μg或6.25μg到10μg或10μg到200μg或25μg到200μg或25μg到100μg或25μg到50μg或25μg到100μg或50μg到100μg)的免疫刺激寡核苷酸，并且聚阳离子载体可以每剂量约5mg和约500mg之间(例如，每剂量6.25mg到200mg或6.25mg到100mg或6.25mg到50mg或6.25mg到25mg或6.25mg到10mg或10mg到200mg或25mg到200mg或25mg到100mg或25mg到50mg或25mg到100mg或50mg到100mg)的量存在。
在某些实施例中，TXO佐剂制备如下：
a)将脱水山梨糖醇单油酸酯溶解于轻矿物油中。所得油溶液经无菌过滤；
b)将免疫刺激寡核苷酸、葡聚糖DEAE和聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯溶解于水相中，因此形成水溶液；和
c)在连续均匀化下将水溶液添加到油溶液中，因此形成佐剂制剂TXO。
在一组实施例中，在TXO-A佐剂中，免疫刺激寡核苷酸作为存在于TXO佐剂中，铝源以高达40％v/v(例如，35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％)的量存在。在一组实施例中，铝源以疫苗组合物的2％v/v到20％v/v，更优选地以约5％v/v和约17％v/v之间存在。
在某些实施例中，TXO-A佐剂以类似于TXO佐剂制备，并且将铝源添加到水溶液中。
在制备TCXO和TCXO-A佐剂中，将胆固醇溶解于油溶液中，并且制备TCXO和TCXO-A的其它步骤分别类似于制备TXO和TXO-A中使用的步骤。
抗原
本发明人已出人意料地发现，本发明的佐剂甚至当抗原的剂量从10μg的FMD病毒降低到0.5μg时还能够足够的预防口蹄疫疾病。因此，在本发明的不同实施例中，FMD病毒的量可为0.5μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg或约10μg。抗原的量可为在0.5μg和1μg之间、在1μg和2μg之间、在2μg和3μg之间、在3μg和4μg之间、在4μg和5μg之间、在5μg和6μg之间、在6μg和8μg之间、在8μg和10μg之间的FMD病毒(140S颗粒)。
当前，已分离出七种血清型的FMD。在此病毒的七种血清型中，A、C、O、Asia 1和SAT3似乎为不同的谱系；SAT 1和SAT 2为未解析的进化枝。在每种血清变型内，存在多种病毒株。举例来说，A24Cruzeiro属于血清型A，并且O1Campos属于血清型O。
任何血清型的FMD病毒可用作本发明中的抗原，其条件是此类病毒不是致病性的。致病性可通过灭活病毒例如，用甲醛或BEI处理来降低。
在某些实施例中，病毒可通过培养物传代或经由重组方式来减毒。先前已证实，举例来说，在牛和猪中前导蛋白Lpro编码区的缺失产生减毒的FMD病毒。参见，例如，US 5,824,316、US 8,765,141，《病毒学(Virology)》1997 227(1):96-102,J.Virol 2012 86:11675-11685。在L蛋白的SAP域内的位置55和58处的点突变还产生活的病毒，所述病毒在细胞培养物中呈现轻度减毒的表现型并且在猪FMD模型中为保护性的。参见美国专利第8,846,057号。
在某些实施例中，病毒还含有允许DIVA(区分受感染的动物与已接种疫苗的动物)分析的阴性抗原标记。在某些实施例中，将阴性抗原标记引入到3D和/或3B蛋白。参见，例如，SEQ ID NO 19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22。
如同其它病毒，FMD病毒不断地进化和突变，因此接种抵抗其的困难之一为血清型之间和甚至血清型内的巨大变化。在血清型之间不存在交叉保护(用于一种血清型的疫苗将不必针对任何其它疫苗进行保护)并且此外，在给定血清型内的两种病毒株对于给定基因可具有不同多达30％的核苷酸序列。这意味着FMD疫苗必须对所涉及的病毒株具有高度特异性。
因此，在某些实施例中，将核酸内切酶限制位点引入到病毒的基因组中，从而允许引入来自异源FMD病毒株的蛋白(例如，形成外衣壳的蛋白)。
在某些实施例中，抗原组分包含FMD病毒株A24Cruzeiro，其可任选地通过在3B和/或3D蛋白中缺失前导蛋白、阴性标记突变体和通过引入限制性核酸内切酶位点以便更容易引入来自异源病毒株的抗原(例如，衣壳蛋白)的序列来修饰。抗原的合适的非限制性实例描述于US 8,765,141中。对应于遗传修饰FMDV的RNA基因组的DNA序列还提供于SEQ ID NO:15(A24LL3DYR)和SEQ ID NO:17(A24LL3BPVKV3DYR)中。因此，与阐述于例如SEQ ID NO:15中的DNA序列互补的DNA序列为FMDV病毒的RNA基因组(即，编码FMDV的RNA)的模板，即与FMDV病毒的RNA基因组互补或“编码”FMDV病毒的RNA基因组。在某些实施例中，病毒包含异源FMD病毒株(即，除A24Cruzeiro以外的FMD的病毒株，包括但不限于谱系C、O、Asia1、SAT3、SAT 1和SAT 2、Turkey 06的病毒株和谱系A的其它病毒株)的一种或多种衣壳蛋白。此类异源抗原的非限制性实例示出在SEQID NO:23(Asia1-A24LL3BPVKV3DYR)和SEQ ID NO:24(A/Turkey/06-A24LL3BPVKV3DYR)中。另外，O1campos-A24LL3BPVKV3DYR(全基因组，也被称作O1campos)、C3Indaial-A24LL3BPVKV3DYR(全基因组)和衣壳Argentina 2001iso93(衣壳和2A部分序列)分别提供于SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26和SEQ IDNO 27中。
还设想了此类抗原的变体。运用使用标准参数描述的比对程序中的一种，变体与参考序列至少80％相同(例如，85％相同、90％相同、95％相同、96％相同、97％相同、98％相同或99％相同)。多个比对工具可用于确定序列一致性，包括但不限于BLAST、CLUSTAL或PHILIP。
本领域的技术人员将认识到，这些值可适当地调整，以便通过考虑密码简并、氨基酸类似性、阅读框定位等，确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。
在某些实施例中，变体涵盖不止特异性示例性核苷酸或氨基酸序列并且包括其功能等效物。引起在给定位点处产生化学等效氨基酸但不影响编码的多肽的功能特性的核酸片段的改变在本领域中是众所周知的。因此，用于氨基酸丙氨酸、疏水性氨基酸的密码子可由编码另一种疏水性较差的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，引起一种带负电残基取代另一种残基(如天冬氨酸取代谷氨酸)或一种带正电荷残基取代另一种残基(如赖氨酸取代精氨酸)的变化还可预期产生功能上等效的产物。引起多肽分子的N端和C端部分改变的核苷酸变化还将预期不改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种修饰在本领域的常规技能内都是良好的，正如确定所编码产物生物活性的保持力。
本发明的多肽可以不同方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截断和插入。可通过合并本发明的蛋白质的单元和片段以及其它蛋白质来形成具有所关注特性的新颖蛋白质。用于此类操控的方法一般在本领域中是已知的。因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体形式两者。同样地，本发明的蛋白质涵盖天然存在的蛋白质以及其变异体和经修饰形式。此类变体将继续具有父代FMD病毒的所需经修饰的活性。将在编码变体的DNA中作出的突变不得将序列放置在阅读框之外并且优选地将不形成可产生二级mRNA结构的互补区。
生长和纯化适合于本发明的抗原的方法在本领域中是众所周知的并且包括但不限于中空纤维过滤和PEG沉淀。这些方法在某种程度上产生不同的抗原组合物。举例来说，在PEG沉淀中，抗原组合物耗尽非结构蛋白。在其它方法如例如中空纤维过滤中，抗原组合物含有结构FMD蛋白和非结构FMD蛋白两者。因此，在一些实施例中，FMD抗原包含结构蛋白。在如例如其中FMD抗原通过中空纤维过滤制备的其它实施例中，FMD抗原包含结构蛋白和非结构蛋白两者，特别是3D蛋白。
使用不含区分已接种疫苗动物与受感染动物的内部抗原标记，去除非结构蛋白的目前疫苗平台为期望的，因为由于非结构蛋白抗体的存在可识别受感染动物的事实，所以这仍是期望的。然而，在FMDLL3B3D平台的情况下，在抗原制备中非结构蛋白的存在不妨碍区分已接种疫苗动物与受感染动物。在这种背景下，包括非结构蛋白和佐剂的本发明抗原制剂以比经纯化抗原制剂低的剂量提供两种针对临床疾病的保护并且在反刍动物中还更有效地防止持续感染的建立。
组合物
本发明的组合物可遵循公认惯例来调配以包括用于动物(包括人类)的可接受载体，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且也可经调配以促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等渗性的添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它合适的媒剂和添加剂，包括尤其适用于调配经修饰的活疫苗的那些，对本领域那些技术人员是已知的或将是清楚的。参见，例如，《雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Science)》,第18版,1990,马克出版(Mack Publishing)，其以引用的方式并入本文中。
本发明的组合物可进一步尤其包含一种或多种附加免疫调节组分如(例如)附加佐剂或细胞因子。可用于本发明疫苗的此类附加佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂体系(蒙大拿州汉密尔顿的瑞比公司(RibiInc.,Hamilton,Mont.))、弗氏(Freund's)完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(佐治亚州亚特兰大的CytRx(CytRx,Atlanta Ga.))、QS-21(马萨诸塞州剑桥的剑桥生物技术公司(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.))、SAF-M(加利福尼亚州爱莫利维尔的凯龙(Chiron,Emeryville Calif.))、佐剂、皂苷、Quil A或其它皂苷级分、单磷酰脂质A和阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂。可包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种介白素、干扰素或其它已知的细胞因子。
佐剂组合物的投与途径包括不经肠、口服、口鼻、鼻内、气管内、体表、皮下、肌内、经皮、皮内、腹膜内、眼内、静脉内和舌投与。任何合适的装置可用于投与组合物，包括针筒、滴管、无针注射装置、贴片等。所选择供使用的途径和装置将取决于佐剂的组成、抗原和受试者，并且对本领域技术人员而言是众所周知的。
鉴于FMD的高传染性，需要采取遏制和/或消除FMD爆发的测量受监管机构如例如国家农业部(national Ministries of Agriculture)控制，并且由国际组织如OIE(国际兽疫局(International Office of Epizootics))批准。需要结合爆发进行的测量可包括但不限于动物运动的停止、对包括奶、肉、兽皮等动物产品的运动的有效控制、消灭(stamping-out)策略(屠宰受感染畜群中的动物，以及在适当情况下，已通过动物间直接接触或通过间接接触病原体而暴露于感染的其它畜群中的那些动物)。通常，邻近畜群中的动物接种疫苗，随后被屠宰。
本发明人已出人意料地发现，本文所述的某些免疫原性组合物预防续留，所述续留被定义为在感染之后存在或排出FMD持续长于28天。在某些实施例中，此类免疫原性组合物包含抗原组分和佐剂组分，其中佐剂组分包含(或主要由以下组成或由以下组成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量至少6μg的FMD病毒的FMD抗原。
在某些实施例中，抗原可以等效于每剂量6μg到20μg的FMD病毒，例如，每剂量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的FMD病毒的量存在。免疫刺激寡核苷酸的量可为例如每剂量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg。聚阳离子聚合物可以例如每剂量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。
因此，本发明还提供一种在感染FMD的反刍动物中降低FMD续留频率的方法，其包含在感染之前向所述反刍动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含(或主要由以下组成或由以下组成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量至少6μg的FMD病毒的口蹄疫(FMD)抗原。
在不同实施例中，抗原的量可等效于每剂量6μg到20μg的FMD病毒，例如，每剂量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的FMD病毒。免疫刺激寡核苷酸的量可为例如每剂量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg。聚阳离子聚合物可以例如每剂量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。
向反刍动物(例如，牛、绵羊、骆驼等)投与这些免疫原性组合物允许改变畜群管理操作。在某些实施例中，在疑似与FMD病毒接触之后，不屠宰畜群的已接种疫苗成员。
在替代(或附加)实施例中，将已接种疫苗动物隔离一段较短时间。因此，在某些实施例中，可将疑似与FMD接触的动物隔离少于30天，例如，28天或29天。
此外，指定一个区域为封锁区意指对来自封锁区的动物或动物产品禁止运动的严格限制，一般来说，30天或更长。因此，在某些实施例中，可将疑似与FMD接触的动物在距离疑似与FDM接触的少于30天内例如28天或29天从封锁区中移出。
在其中抗原组分需要经基因工程改造的FMD抗原的实施例中，例如如上所述，有可能区分已接种疫苗的动物与受感染的动物。因此，在附加实施例中，畜群管理方法(或在感染FMD的反刍动物中降低FMD续留频率的方法)。
换句话说，在某些实施例中，包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物可用于畜群管理，其中佐剂组分包含(或主要由以下组成或由以下组成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg的FMD病毒的FMD抗原，其中在疑似与FMD感染接触后，不屠宰所述畜群的已接种疫苗成员；和/或在疑似接触之后隔离0到30天和/或在疑似接触的30天内被移出感染场所。
在不同实施例中，抗原的量可等效于每剂量6μg到20μg的FMD病毒，例如，每剂量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的FMD病毒。免疫刺激寡核苷酸的量可为例如每剂量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg聚阳离子聚合物可以例如每剂量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。
现将在以下非限制性实例中进一步描述本发明。
实例
实例1.制备抗原
两种方法用于制备抗原：中空纤维过滤和PEG沉淀。
PEG(聚乙二醇)沉淀方法已在本领域中已知。简单来说，用FMD病毒感染BHK-21细胞。然后(24到36h后)，细胞通过冷冻-解冻裂解，并且通过低速离心(500x g)细胞碎片使细胞裂解物澄清。将PEG添加(8％w/v)到含有结构蛋白和非结构蛋白两者的上清液中。将混合物在4℃下培育12到18hr。在此培育期间，FMDV颗粒与PEG缔合。通过以16,000xg离心和收集含有PEG和病毒的沉淀离心块来回收抗原。丢弃含有细胞非结构蛋白和病毒非结构蛋白的上清液。然后用小体积的缓冲液洗涤结合病毒颗粒的离心块以从PEG洗脱FMDV颗粒。
本文所述的附加方法是基于FMDV培养物上清液的中空-纤维浓度。此方法的步骤由连续过滤布置以首先从培养物(用FMD病毒感染并且通过冷冻-解冻裂解的BHK-21细胞)中去除细胞碎片和大的材料组成。将培养物材料连续地泵送通过10μm胶囊过滤器、4.5μm胶囊过滤器，然后最后通过0.8μm/0.2μm过滤器。然后使用允许小于0.01μm的颗粒流过膜的中空纤维超过滤滤芯来浓缩此滤液。FMDV颗粒和许多非结构蛋白仍然在柱回路中而液体和较小的蛋白通过膜变成废物。运行柱回路，直到浓缩物达到所需体积，通常十倍浓度。
图1为示出PEG沉淀和中空纤维浓缩的抗原之间品质差异的蛋白质印迹(Westernblot)。中空纤维浓缩的抗原含有大量结构蛋白和非结构蛋白，如在此图中通过使用对蛋白3D(最大FMDV非结构蛋白)具有特异性的抗体和对衣壳蛋白(结构蛋白)具有特异性的抗体染色的蛋白质印迹所示。相比之下，PEG沉淀的抗原(泳道9)含有结构蛋白但不含有可检测水平的3D蛋白。
实例2.用TXO辅助的FMD疫苗的作用
动物和样品收集
重180kg到230kg的六到八个月大的霍斯坦阉牛(Holstein steers)用于本研究中。如稍后从第0天取的血清样品确定，在接种之前，所述动物无FMDV反应性抗体，如通过3DELISA测试确定。所有28只动物共混在BSL-3-Ag动物测试设施中的一个房间中。喂食动物完全日粮球粒或苜蓿立方块，水和盐块可随意获得。在第0天之前，使动物适应设施五天。动物事先用Bovi-Shield5、300、和处理。具有连续耳标签数字的动物组(每组n＝4)被指派到处理组。
在接种后未记录到不良事件。
在第0天(在接种之前)、第4天、第7天、第14天、第21天(在攻击之前)、第24天、第28天、第31天和第42天从所有动物收集血清分离器血液试管以获得血清样品。使血清样品保持冷冻直到在血清中和分析中测试抵抗FMDV的中和抗体的存在(报告为在50％的凹孔中中和100TCID50的同源FMDV的最终血清稀释度的倒数)或以研究抗3Dpol应答(借助于竞争酶联免疫吸附分析(competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay))。
如OIE(“陆地动物的诊断测试和疫苗手册(Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals)”)所推荐，出于疫苗功效，通过针接种经由皮内经舌(IDL)途径攻击已接种疫苗的牛。在接种后21天，所有已接种疫苗的动物和未经处理的动物经IDL接种10,000BTID50(50％牛类动物舌部感染剂量)的同源FMDV A24Cruzeiro，其被分为4次接种，每次0.1mL，2,500BTID50/0.1mL。在攻击后跟踪所有动物10天以分析如通过发热、鼻分泌物、分泌唾液、食欲不振和/或跛行表现的临床疾病的发展。在镇静(以0.22mg/kg IM给予甲苯噻嗪从而在程序期间维持胸骨侧卧)情况下在第21天(在接种之前)和第24天、第28天和第31天进行临床评估蹄囊泡的存在。用妥拉苏林(tolazoline)，IV，以2mg/kg的剂量复原镇静剂。
疫苗
如实例1中所述制备抗原。抗原储备溶液含有5.51μg/mL通过中空纤维过滤(PrepA)制备的抗原或10.26μg/mL通过PEG沉淀(Prep B)制备的抗原。
向动物投与免疫原性组合物的细节在表1中提供。每组含有四只动物。表1.研究设计
T02组到T06组的免疫原性组合物在接种的当天均匀化并且在第0天投与到动物。
续留被测量为使用病毒分离和定量rRT-PCR两者确定的病毒(FMDV病毒RNA和/或感染性FMDV)的存在或不存在。用于定量rRT-PCR的引物为如下：
Forward正向(SEQ ID NO:28)：
GACAAAGGTTTTGTTCTTGGTCA
Reverse反向(SEQ ID NO:29)：TGCGAGTCCTGCCACGGA
Taqman探针：(FAM报导子，TAMRA淬灭剂，SEQ ID NO:30)TCCTTTGCACGCCGTGGGAC
对FMDV的血清中和滴度汇总于表2中。
表2-血清中和滴度
a,b,c在α＝0.05时，在每天内具有相同字母的处理组并非显著不同
将FMDV的征象评分为蹄囊泡的存在(1)或不存在(0)，即，在单个蹄上囊泡的存在产生得分1，在仅2个蹄上囊泡的存在产生得分2并且在4个蹄上的囊泡产生得分4。一旦动物得到得分4，就认为在研究期间其具有4分。
针对每个蹄和每天检查的来自各个动物的得分在表3中示出。在表4中，呈现了根据任一个蹄是否为阳性的每个动物的得分的汇总。
表3-FMDV囊泡评分各个动物列表
*自动评分为‘1’，因为此动物的所有蹄先前在所有四个蹄上具有囊泡。
表4-FMDV囊泡评分-任一蹄位置阳性
*自动评分为‘是(Yes)’，因为此动物的所有蹄先前在所有四个蹄上具有囊泡。
在T01(阴性对照)中的所有动物都在第24天开始表现出蹄囊泡。在第28天和第31天，在所有T01动物中的所有蹄都发现具有囊泡。相比之下，除T03(用PEG沉淀的2μg剂量的FMDV)外，对于每一组都观察到全保护(即，无蹄囊泡)，其中一只动物(R14-77)在第24天、第28天和第31天得到得分1。所测试的免疫原性组合物对续留感染的作用在表5和表6中示出。续留被定义为在攻击后28天之后在食道-咽部流体(使用“食道探管(Probang)”杯获得)中存在感染病毒或病毒RNA(在接种之后第49天，如表5和表6中所示)。在表5中，示出了针对各个动物和处理组的反转化的来自食道探管样品的每ml FMDVRNA拷贝数的最小平方均值的定量rRT-PCR结果。在表6中，食道探管样品病毒分离测试的结果报告为阳性或阴性。由于分析的检测限，表5中低于1.87的值被评分为‘阴性’。
表5-食道探管rRT-PCR各个动物列表和反转化的最小平方均值/处理组
表6-食道探管样品病毒分离-各个动物列表
对于第1组(盐水对照)，通过rRT-PCR对于FMDV，三只动物至少一次为阳性的，并且对于病毒分离两只动物一直为阳性的。
在T02组中，通过rRT-PCR未曾发现动物携带FMDV，但通过病毒分离发现一只动物(R14-74)仅在单个时间点(第42天：攻击后第21天)为阳性，但其后为阴性(第49天：和第52天，指示不存在持续感染。在第38天和超出第38天，在T02中的其它动物并未携带可通过rRT-PCR或通过病毒分离分析检测的FMDV。
在T03组中，一只动物(R14-79)得到完全保护而免遭FMDV感染，两只动物证实在测试天数中的三天或四天存在FMDV(通过rRT-PCR或通过病毒分离分析)，并且一只动物(R14-77)通过在第38天和第42天的两个测试证实FMDV存在，但其后不存在FMDV。
在T04组中，通过第52天的一个或两个测试，所有四只动物都表现出FMDV续留。
在T05组中，一只动物(R14-62)通过rRT-PCR仅在第38天证实存在病毒，但通过病毒分离证实不存在病毒，并且其后通过任一测试都未检测到病毒。对于T05组中的其它三只动物在任何时间通过rRT-PCR或通过病毒分离分析都未检测到FMDV。
在T06组中，两只动物得到完全保护而免遭续留，而其它两在检测的每一时间点都为rRT-PCR或病毒分离阳性。
在T07组中，四只动物中的三只得到完全保护，而一只动物(R14-71)对于rRT-PCR和病毒分离两者在每一时间点都为阳性的。
表7概括续留实验的结果。如果在第49天(攻击后28天)和第52天(攻击后第31天)rRT-PCR或病毒分离分析都未检测到FMDV，那么认为动物是非续留的。
表7续留和非续留频率
处理 续留％ 非续留％
T01(盐水) 50 50
T02(FMDV PEG沉淀-8μg) 0 100
T03(FMDV PEG沉淀-2μg) 50 50
T04(FMDV PEG沉淀-0.5μg) 100 0
T05(FMD中空纤维-8μg) 0 100
T06(FMDV中空纤维-2μg) 50 50
T07(FMDV中空纤维-0.5μg) 25 75
投与8μg抗原的八只动物(T02组和T05组)中的仅两只表现出存在病毒，并且仅一天存在病毒(一天分别在第37天和第42天)。这些组中的其它动物完全得到保护考虑到在感染之后28天和31天均未检测到病毒存在，投与8μg抗原的动物中无一者被认为是持续感染。投与2μg抗原的八只动物(T03组和T06组)中的五只表现出病毒续留。投与0.5μg抗原的八只动物八只动物(T04组和T07组)中的四只表现出续留。
结合在一起，这些结果指示在投与8μg抗原的动物中保护免遭FMDV病毒续留，并且还可看出，相比于PEG沉淀，通过中空纤维过滤纯化抗原是有利的。两种抗原制剂之间的主要差异为在中空纤维过滤制剂中存在除了结构蛋白以外的非结构蛋白。因此，在不受理论束缚的情况下，可看出由其中抗原含有结构蛋白和非结构蛋白(并且具体来说蛋白3D)两者的疫苗引起的免疫应答的品质在预防性FMDV续留方面更有效，如表8中所示。
表8.抗原制备方法对免疫应答的影响.
处理 续留％ 非续留％
T01(盐水) 50％(4只中2只) 50％(4只中2只)
Prep A(中空纤维，合并的T05组到T07组) 25％(12只中3只) 75％(12只中9只)
Prep B(PEG沉淀，合并的T02组到T04组) 50％(12只中6只) 50％(12只中6只)
本说明书中引用的所有公开案(专利公开案和非专利公开案)表示本发明所属领域的技术人员的技能水平。所有这些公开案在本文中以全文引用的方式并入，其程度如同每一篇个别公开案具体并且单独地说明为以引用方式并入。
尽管本文中已参考特定实施例描述本发明，但应理解，这些实施例仅仅说明本发明的原理和应用。因此，应理解，在不脱离如由以下权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可对说明性实施例作出众多修改并且可设计出其它配置。
序列表
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牛类动物鼻病毒2型(BRV2)
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ttcgcccaaa tggtttcaac aacggggttc atcccgccca tggcatcgct tgaggataaa 3300
ggcaaaccct tcaacagtaa ggtcatcata gcaaccacca acctgtactc gggcttcacc 3360
ccgaggacta tggtgtgccc tgatgccctg aaccggaggt ttcactttga catcgacgtg 3420
agcgccaagg acgggtacaa aattaacaac aaattggaca tcatcaaagc acttgaagat 3480
actcacacca acccagtggc aatgtttcag tacgactgtg cccttctcaa cggcatggct 3540
gttgaaatga agagaatgca acaagatatg ttcaagcctc aaccacccct tcagaacgtg 3600
taccaactgg ttcaagaggt gattgagcgg gtggagctcc acgagaaggt gtcgagccac 3660
ccgattttca aacagatctc aattccttcc caaaaatccg tgttgtactt cctcattgag 3720
aaaggacagc acgaggcagc aattgaattc tttgagggca tggtgcacga ctccatcaag 3780
gaggagctcc ggccgctcat ccaacaaacc tcatttgtga aacgcgcttt taagcgcctg 3840
aaggaaaact ttgagattgt tgccctatgt ctgaccctcc tggccaacat agtgatcatg 3900
atccgcgaaa ctcgcaagag acagaagatg gtggacgatg cagtgagtga gtacattgag 3960
agagcaaaca tcaccaccga cgacaagact cttgatgagg cggaaaagaa ccctctggaa 4020
accagcggtg ccagcaccgt cggcttcaga gagagacctc tcccaggcca aaaggcgcgt 4080
aatgacgaga actccgagcc cgcccagcct gctgaagagc aaccacaagc tgaaggaccc 4140
tacgctggcc cgatggagag accagttaaa gttaaagtga aagcaaaagc cccggtcgtt 4200
aaggaaggac cttacgaggg accggtgaag aagcctgttg ctttgaaagt gaaagctaag 4260
aacttgatcg tcactgagag tggtgcccca ccgaccgact tgcaaaagtt ggtcatgggc 4320
aacaccaagc ccgttgagct catccttgac gggaagacgg tagccatttg ctgtgctact 4380
ggagttttcg gcactgctta cctcgtgcct cgtcatcttt tcgcagaaaa gtacgacaag 4440
atcatgttgg acggcagagc catgacagat agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt 4500
aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac gctgcgctca ggggccggcc aatccagtcc 4560
ggcgaccggc tcgcagaacc aatctggcaa cactggcagc ataattaaca actactacat 4620
gcagcaatac cagaactcca tggacacaca gttgggagac aatgccatca gtggaggctc 4680
caacgagggc tccacggaca caacttcaac acacacaacc aacactcaaa acaatgactg 4740
gttctcgaag ctcgccagtt cagcttttac cggtctgttc ggtgcactgc tcgccgacaa 4800
gaagacagag gaaacgacac ttcttgagga ccgcatcctc accacccgca acgggcacac 4860
cacctcgacg acccaatcga gtgtgggtgt cacacacggg tactccacag aggaggacca 4920
cgttgctggg cccaacacat cgggcctgga gacgcgagtg gtgcaggcag agagattcta 4980
caaaaagtac ttgtttgact ggacaacgga caaggcattt ggacacctgg aaaagctgga 5040
gctcccgtcc gaccaccacg gtgtctttgg acacttggtg gactcgtacg cctatatgag 5100
aaatggctgg gatgttgagg tgtccgctgt tggcaaccag ttcaacggcg ggtgcctcct 5160
ggtggccatg gtacctgaat ggaaggaatt tgacacacgg gagaaatacc aactcaccct 5220
tttcccgcac cagtttatta gccccagaac taacatgact gcccacatca cggtccccta 5280
ccttggtgtg aacaggtatg atcagtacaa gaagcataag ccctggacat tggttgtcat 5340
ggtcgtgtcg ccacttacgg tcaacaacac tagtgcggca caaatcaagg tctacgccaa 5400
catagctccg acctatgttc acgtggccgg tgaactcccc tcgaaagagg ggattttccc 5460
ggttgcatgt gcggacggtt acggaggatt ggtgacgaca gacccgaaga cagctgaccc 5520
tgcttatggc aaggtgtaca acccgcctag gactaactac cctgggcgct tcaccaacct 5580
gttggacgtg gccgaagcgt gtcccacttt cctctgcttt gacgacggga aaccgtacgt 5640
caccacgcgg acggatgaca cccgactttt ggccaagttt gacctttccc ttgccgcaaa 5700
acatatgtcc aacacatacc tgtcagggat tgctcagtac tacacacagt actctggcac 5760
catcaatttg catttcatgt tcacaggttc cactgattca aaggcccgat acatggtggc 5820
ctacatccca cctggggtgg agacaccacc ggacacacct gaaagggctg cccactgcat 5880
tcacgctgaa tgggacactg gactaaactc caaattcact ttctcaatcc cgtacgtatc 5940
cgccgcggat tacgcgtaca cagcgtctga cacggcagaa acaatcaacg tacagggatg 6000
ggtctgcatc taccaaatta cacacgggaa ggctgaaaat gacaccttgg tcgtgtcggt 6060
tagcgccggc aaagactttg agttgcgcct cccgattgac ccccgccagc agaccaccgc 6120
taccggggaa tcagcagacc cggtcaccac caccgtggag aactacggcg gtgagacaca 6180
aatccagaga cgtcaccaca cggacattgg tttcatcatg gacagatttg tgaagatcca 6240
aagcttgagc ccaacacatg tcattgacct catgcagact caccaacacg gtctggtggg 6300
tgccttgctg cgtgcagcca cgtactactt ttctgacctg gaaattgttg tacggcacga 6360
aggcaatctg acctgggtgc ccaacggcgc ccctgaatca gccctgttga acaccagcaa 6420
ccccactgcc tacaacaagg caccattcac gagactcgct ctcccctaca ctgcgccgca 6480
ccgtgtgctg gcaacagtgt acaacgggac gagtaagtat gctgtgggtg gttcaggcag 6540
aagaggcgac atggggtctc tcgcggcgcg agtcgtgaaa cagcttcctg cttcatttaa 6600
ctacggtgca atcaaggccg acgccatcca cgaacttctc gtgcgcatga aacgggccga 6660
gctctactgc cccagaccgc tgttggcaat agaggtgtct tcgcaagaca ggcacaagca 6720
aaagatcatt gcaccagcaa agcagcttct gaattttgac ctgcttaagc tagccggaga 6780
cgttgagtcc aaccctgggc ccttcttctt ctccgacgtt aggtcaaact tttccaagct 6840
ggtagacaca atcaaccaga tgcaggaaga catgtccaca aagcacggac ctgactttaa 6900
ccggttggtg tccgcttttg aggagttggc cactggagtg aaagccatca ggaccggtct 6960
tgacgaggcc aagccctggt acaagcttat caagctcctg agccgcctgt cgtgcatggc 7020
cgctgtggca gcacggtcaa aggacccagt ccttgtggcc atcatgctgg ctgacaccgg 7080
tctcgagatt ctggacagca ccttcgtcgt gaagaagatc tccgactcgc tctccagtct 7140
cttccacgtg ccggcccccg tcttcagttt cggagccccg attctgttag ccgggttggt 7200
caaggtcgcc tcgagtttct tccggtccac gcccgaagac cttgagagag cagagaaaca 7260
gctcaaagca cgtgacatca acgacatttt cgccattctc aagaacggcg agtggctggt 7320
caaattgatc cttgccatcc gcgactggat caaggcatgg atagcctcag aagaaaagtt 7380
tgtcaccacg acagacttgg tacctagcat ccttgaaaaa cagcaggacc tcaacgaccc 7440
aagcaagtac aaggaagcca aggagtggct cgacaacgcg cgccaagcgt gtttgaagag 7500
cgggaacgtc cacattgcca acctgtgcaa agtggtcgcc ccggcaccca gcaggtcgag 7560
acccgagccc gtggtcgttt gcctccgtgg caagtccggt cagggcaaga gtttccttgc 7620
aaacgtgctc gcacaagcaa tctctaccca tttcactggc aggaccgatt cagtttggta 7680
ctgcccgcct gaccctgacc acttcgacgg ttacaaccaa cagactgtcg ttgtgatgga 7740
cgatttgggc cagaaccccg acggcaaaga cttcaagtac ttcgcccaaa tggtttcaac 7800
aacggggttc atcccgccca tggcatcgct tgaggataaa ggcaaaccct tcaacagtaa 7860
ggtcatcata gcaaccacca acctgtactc gggcttcacc ccgaggacta tggtgtgccc 7920
tgatgccctg aaccggaggt ttcactttga catcgacgtg agcgccaagg acgggtacaa 7980
aattaacaac aaattggaca tcatcaaagc acttgaagat actcacacca acccagtggc 8040
aatgtttcag tacgactgtg cccttctcaa cggcatggct gttgaaatga agagaatgca 8100
acaagatatg ttcaagcctc aaccacccct tcagaacgtg taccaactgg ttcaagaggt 8160
gattgagcgg gtggagctcc acgagaaggt gtcgagccac ccgattttca aacagatctc 8220
aattccttcc caaaaatccg tgttgtactt cctcattgag aaaggacagc acgaggcagc 8280
aattgaattc tttgagggca tggtgcacga ctccatcaag gaggagctcc ggccgctcat 8340
ccaacaaacc tcatttgtga aacgcgcttt taagcgcctg aaggaaaact ttgagattgt 8400
tgccctatgt ctgaccctcc tggccaacat agtgatcatg atccgcgaaa ctcgcaagag 8460
acagaagatg gtggacgatg cagtgagtga gtacattgag agagcaaaca tcaccaccga 8520
cgacaagact cttgatgagg cggaaaagaa ccctctggaa accagcggtg ccagcaccgt 8580
cggcttcaga gagagacctc tcccaggcca aaaggcgcgt aatgacgaga actccgagcc 8640
cgcccagcct gctgaagagc aaccacaagc tgaaggaccc tacgctggcc cgatggagag 8700
accagttaaa gttaaagtga aagcaaaagc cccggtcgtt aaggaaggac cttacgaggg 8760
accggtgaag aagcctgttg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgatcg tcactgagag 8820
tggtgcccca ccgaccgact tgcaaaagtt ggtcatgggc aacaccaagc ccgttgagct 8880
catccttgac gggaagacgg tagccatttg ctgtgctact ggagttttcg gcactgctta 8940
cctcgtgcct cgtcatcttt tcgcagaaaa gtacgacaag atcatgttgg acggcagagc 9000
catgacagat agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt aaagtaaaag gacaggacat 9060
gctctcagac gctgcgctca tggtgctcca ccgtgggaat cgcgtgagag acatcacgaa 9120
acactttcgt gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc gtcgttggtg tgatcaacaa 9180
cgccgatgtc gggagactga ttttctctgg tgaagccctt acctacaagg acattgtagt 9240
gtgcatggat ggagacacca tgcctgggct ctttgcctac aaagccgcaa ccaaggctgg 9300
ttattgcgga ggagccgtcc tcgctaagga cggggctgac acgttcatcg ttggcaccca 9360
ctccgctgga ggcaatggcg ttggatactg ctcttgcgtt tccaggtcca tgcttctcaa 9420
gatgaaggca cacgttgacc ccgaaccaca ccacgagggg ttgattgttg acaccagaga 9480
tgtggaagag cgcgttcacg tgatgcgcaa aaccaagctt gcacccaccg ttgcgtacgg 9540
tgtgttccgt cctgagttcg ggcctgccgc cttgtccaac aaggacccgc gcctgaacga 9600
cggtgttgtc ctcgacgaag tcatcttctc caaacacaag ggagacacaa agatgtctga 9660
ggaagacaaa gcgctgttcc gccgctgtgc tgctgactac gcgtcacgcc tgcacagcgt 9720
gttgggtacg gcaaatgccc cactgagcat ctacgaggca attaaaggcg ttgatggact 9780
cgacgcaatg gaaccagaca ccgcacccgg cctcccctgg gcactccagg ggaagcgccg 9840
tggcgcgctc atcgacttcg agaacggcac tgttggaccc gaagttgagg ctgccttgaa 9900
gctcatggag aaaagagaat acaagtttgc ttgccaaacc ttcctgaagg acgagattcg 9960
cccgatggag aaagtacgtg ccggtaagac tcgcattgtc gacgtcctac ctgttgaaca 10020
catcctctac accaggatga tgattggcag attttgtgca caaatgcact caaacaacgg 10080
accccaaatt ggctcggcgg tcggttgtaa ccctgatgtt gattggcaaa gatttggcac 10140
acacttcgcc caatacagaa acgtgtggga tgtggactat tcggccttcg atgctaacca 10200
ctgcagtgac gccatgaaca tcatgtttga ggaagtgttt cgcacagaat tcgggttcca 10260
cccaaacgct gagtggatcc tgaagactct cgtgaacacg gaacacgcct atgagaacaa 10320
acgcatcact gttgaaggcg ggatgccatc tggttgttcc gcaacaagca tcatcaacac 10380
aattttgaac aacatctacg tgctctacgc tttgcgtaga cactatgagg gagttgagct 10440
ggacacttac accatgatct cttacggaga cgatatcgtg gtggcaagtg attacgattt 10500
ggactttgag gctctcaagc cccacttcaa atcccttggt caaaccatca ctccagctga 10560
caaaagcgac aaaggttttg ttcttggtca ctccattact gatgtcactt tcctcaaaag 10620
acacttccac atggattatg gaactgggtt ttacaaacct gtgatggcct caaagaccct 10680
tgaggctatc ctctcctttg cacgccgtgg gaccatacag gagaagttga tctccgtggc 10740
aggactcgct gttcactctg gaccagacga gtaccggcgt ctcttcgagc cctttcaagg 10800
cctcttcgag attccaagct acagatcact ttacctgcgt tgggtgaacg ccgtgtgcgg 10860
cgacgca 10867
<210> 16
<211> 2109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白: 口蹄疫病毒(FMDV)和牛类动物
鼻病毒2型(BRV2)
<400> 16
Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn
20 25 30
Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn
50 55 60
Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu
85 90 95
Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln
100 105 110
Ser Ser Val Gly Val Thr His Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His Val
115 120 125
Ala Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Phe Tyr Lys Lys Tyr Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala Phe
145 150 155 160
Gly His Leu Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Asp His His Gly Val Phe
165 170 175
Gly His Leu Val Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val
180 185 190
Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val
195 200 205
Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr Gln
210 215 220
Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met Thr
225 230 235 240
Ala His Ile Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr
245 250 255
Lys Lys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro Leu
260 265 270
Thr Val Asn Asn Thr Ser Ala Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile
275 280 285
Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly
290 295 300
Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr
305 310 315 320
Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro Pro
325 330 335
Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu
340 345 350
Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val Thr
355 360 365
Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu Ser Leu
370 375 380
Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln Tyr
385 390 395 400
Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly
405 410 415
Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly
420 425 430
Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile His
435 440 445
Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro
450 455 460
Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu
465 470 475 480
Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly
485 490 495
Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp
500 505 510
Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala Thr
515 520 525
Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly
530 535 540
Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Ile Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile Asp
565 570 575
Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala
580 585 590
Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu Gly
595 600 605
Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ser Ala Leu Leu Asn
610 615 620
Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala
625 630 635 640
Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly
645 650 655
Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met Gly
660 665 670
Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr
675 680 685
Gly Ala Ile Lys Ala Asp Ala Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys
690 695 700
Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Glu Val Ser
705 710 715 720
Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu
725 730 735
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
740 745 750
Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val
755 760 765
Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro
770 775 780
Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val
785 790 795 800
Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu
805 810 815
Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala Arg
820 825 830
Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu
835 840 845
Glu Ile Leu Asp Ser Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser Asp Ser Leu
850 855 860
Ser Ser Leu Phe His Val Pro Ala Pro Val Phe Ser Phe Gly Ala Pro
865 870 875 880
Ile Leu Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg Ser
885 890 895
Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln Leu Lys Ala Arg Asp
900 905 910
Ile Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn Gly Glu Trp Leu Val Lys
915 920 925
Leu Ile Leu Ala Ile Arg Asp Trp Ile Lys Ala Trp Ile Ala Ser Glu
930 935 940
Glu Lys Phe Val Thr Thr Thr Asp Leu Val Pro Ser Ile Leu Glu Lys
945 950 955 960
Gln Gln Asp Leu Asn Asp Pro Ser Lys Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Trp
965 970 975
Leu Asp Asn Ala Arg Gln Ala Cys Leu Lys Ser Gly Asn Val His Ile
980 985 990
Ala Asn Leu Cys Lys Val Val Ala Pro Ala Pro Ser Arg Ser Arg Pro
995 1000 1005
Glu Pro Val Val Val Cys Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Lys
1010 1015 1020
Ser Phe Leu Ala Asn Val Leu Ala Gln Ala Ile Ser Thr His Phe
1025 1030 1035
Thr Gly Arg Thr Asp Ser Val Trp Tyr Cys Pro Pro Asp Pro Asp
1040 1045 1050
His Phe Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Thr Val Val Val Met Asp Asp
1055 1060 1065
Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Phe Lys Tyr Phe Ala Gln
1070 1075 1080
Met Val Ser Thr Thr Gly Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu
1085 1090 1095
Asp Lys Gly Lys Pro Phe Asn Ser Lys Val Ile Ile Ala Thr Thr
1100 1105 1110
Asn Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Pro Arg Thr Met Val Cys Pro Asp
1115 1120 1125
Ala Leu Asn Arg Arg Phe His Phe Asp Ile Asp Val Ser Ala Lys
1130 1135 1140
Asp Gly Tyr Lys Ile Asn Asn Lys Leu Asp Ile Ile Lys Ala Leu
1145 1150 1155
Glu Asp Thr His Thr Asn Pro Val Ala Met Phe Gln Tyr Asp Cys
1160 1165 1170
Ala Leu Leu Asn Gly Met Ala Val Glu Met Lys Arg Met Gln Gln
1175 1180 1185
Asp Met Phe Lys Pro Gln Pro Pro Leu Gln Asn Val Tyr Gln Leu
1190 1195 1200
Val Gln Glu Val Ile Glu Arg Val Glu Leu His Glu Lys Val Ser
1205 1210 1215
Ser His Pro Ile Phe Lys Gln Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ser
1220 1225 1230
Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile
1235 1240 1245
Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu
1250 1255 1260
Arg Pro Leu Ile Gln Gln Thr Ser Phe Val Lys Arg Ala Phe Lys
1265 1270 1275
Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu Thr Leu
1280 1285 1290
Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Ile Arg Glu Thr Arg Lys Arg Gln
1295 1300 1305
Lys Met Val Asp Asp Ala Val Ser Glu Tyr Ile Glu Arg Ala Asn
1310 1315 1320
Ile Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys Asn Pro
1325 1330 1335
Leu Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Val Gly Phe Arg Glu Arg Pro
1340 1345 1350
Leu Pro Gly Gln Lys Ala Arg Asn Asp Glu Asn Ser Glu Pro Ala
1355 1360 1365
Gln Pro Ala Glu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly
1370 1375 1380
Pro Met Glu Arg Pro Val Lys Val Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro
1385 1390 1395
Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val
1400 1405 1410
Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly
1415 1420 1425
Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Leu Val Met Gly Asn Thr Lys
1430 1435 1440
Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys
1445 1450 1455
Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu
1460 1465 1470
Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met
1475 1480 1485
Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys
1490 1495 1500
Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg
1505 1510 1515
Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala
1520 1525 1530
Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala
1535 1540 1545
Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys
1550 1555 1560
Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe
1565 1570 1575
Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val
1580 1585 1590
Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser
1595 1600 1605
Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser
1610 1615 1620
Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Val Asp Pro Glu Pro His His
1625 1630 1635
Glu Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His
1640 1645 1650
Val Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala Tyr Gly Val
1655 1660 1665
Phe Arg Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro
1670 1675 1680
Arg Leu Asn Asp Gly Val Val Leu Asp Glu Val Ile Phe Ser Lys
1685 1690 1695
His Lys Gly Asp Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe
1700 1705 1710
Arg Arg Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu
1715 1720 1725
Gly Thr Ala Asn Ala Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly
1730 1735 1740
Val Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu
1745 1750 1755
Pro Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg Gly Ala Leu Ile Asp Phe
1760 1765 1770
Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu
1775 1780 1785
Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys
1790 1795 1800
Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg
1805 1810 1815
Ile Val Asp Val Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr Arg Met
1820 1825 1830
Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly Pro
1835 1840 1845
Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln
1850 1855 1860
Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val
1865 1870 1875
Asp Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn
1880 1885 1890
Ile Met Phe Glu Glu Val Phe Arg Thr Glu Phe Gly Phe His Pro
1895 1900 1905
Asn Ala Glu Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala
1910 1915 1920
Tyr Glu Asn Lys Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly
1925 1930 1935
Cys Ser Ala Thr Ser Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr
1940 1945 1950
Val Leu Tyr Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp
1955 1960 1965
Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser
1970 1975 1980
Asp Tyr Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser
1985 1990 1995
Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe
2000 2005 2010
Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg His
2015 2020 2025
Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys Pro Val Met Ala
2030 2035 2040
Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg Arg Gly Thr
2045 2050 2055
Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val His Ser
2060 2065 2070
Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly Leu
2075 2080 2085
Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn
2090 2095 2100
Ala Val Cys Gly Asp Ala
2105
<210> 17
<211> 6327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合核苷酸: 口蹄疫病毒(FMDV)和
牛类动物鼻病毒2型(BRV2)
<400> 17
ggggccggcc aatccagtcc ggcgaccggc tcgcagaacc aatctggcaa cactggcagc 60
ataattaaca actactacat gcagcaatac cagaactcca tggacacaca gttgggagac 120
aatgccatca gtggaggctc caacgagggc tccacggaca caacttcaac acacacaacc 180
aacactcaaa acaatgactg gttctcgaag ctcgccagtt cagcttttac cggtctgttc 240
ggtgcactgc tcgccgacaa gaagacagag gaaacgacac ttcttgagga ccgcatcctc 300
accacccgca acgggcacac cacctcgacg acccaatcga gtgtgggtgt cacacacggg 360
tactccacag aggaggacca cgttgctggg cccaacacat cgggcctgga gacgcgagtg 420
gtgcaggcag agagattcta caaaaagtac ttgtttgact ggacaacgga caaggcattt 480
ggacacctgg aaaagctgga gctcccgtcc gaccaccacg gtgtctttgg acacttggtg 540
gactcgtacg cctatatgag aaatggctgg gatgttgagg tgtccgctgt tggcaaccag 600
ttcaacggcg ggtgcctcct ggtggccatg gtacctgaat ggaaggaatt tgacacacgg 660
gagaaatacc aactcaccct tttcccgcac cagtttatta gccccagaac taacatgact 720
gcccacatca cggtccccta ccttggtgtg aacaggtatg atcagtacaa gaagcataag 780
ccctggacat tggttgtcat ggtcgtgtcg ccacttacgg tcaacaacac tagtgcggca 840
caaatcaagg tctacgccaa catagctccg acctatgttc acgtggccgg tgaactcccc 900
tcgaaagagg ggattttccc ggttgcatgt gcggacggtt acggaggatt ggtgacgaca 960
gacccgaaga cagctgaccc tgcttatggc aaggtgtaca acccgcctag gactaactac 1020
cctgggcgct tcaccaacct gttggacgtg gccgaagcgt gtcccacttt cctctgcttt 1080
gacgacggga aaccgtacgt caccacgcgg acggatgaca cccgactttt ggccaagttt 1140
gacctttccc ttgccgcaaa acatatgtcc aacacatacc tgtcagggat tgctcagtac 1200
tacacacagt actctggcac catcaatttg catttcatgt tcacaggttc cactgattca 1260
aaggcccgat acatggtggc ctacatccca cctggggtgg agacaccacc ggacacacct 1320
gaaagggctg cccactgcat tcacgctgaa tgggacactg gactaaactc caaattcact 1380
ttctcaatcc cgtacgtatc cgccgcggat tacgcgtaca cagcgtctga cacggcagaa 1440
acaatcaacg tacagggatg ggtctgcatc taccaaatta cacacgggaa ggctgaaaat 1500
gacaccttgg tcgtgtcggt tagcgccggc aaagactttg agttgcgcct cccgattgac 1560
ccccgccagc agaccaccgc taccggggaa tcagcagacc cggtcaccac caccgtggag 1620
aactacggcg gtgagacaca aatccagaga cgtcaccaca cggacattgg tttcatcatg 1680
gacagatttg tgaagatcca aagcttgagc ccaacacatg tcattgacct catgcagact 1740
caccaacacg gtctggtggg tgccttgctg cgtgcagcca cgtactactt ttctgacctg 1800
gaaattgttg tacggcacga aggcaatctg acctgggtgc ccaacggcgc ccctgaatca 1860
gccctgttga acaccagcaa ccccactgcc tacaacaagg caccattcac gagactcgct 1920
ctcccctaca ctgcgccgca ccgtgtgctg gcaacagtgt acaacgggac gagtaagtat 1980
gctgtgggtg gttcaggcag aagaggcgac atggggtctc tcgcggcgcg agtcgtgaaa 2040
cagcttcctg cttcatttaa ctacggtgca atcaaggccg acgccatcca cgaacttctc 2100
gtgcgcatga aacgggccga gctctactgc cccagaccgc tgttggcaat agaggtgtct 2160
tcgcaagaca ggcacaagca aaagatcatt gcaccagcaa agcagcttct gaattttgac 2220
ctgcttaagc tagccggaga cgttgagtcc aaccctgggc ccttcttctt ctccgacgtt 2280
aggtcaaact tttccaagct ggtagacaca atcaaccaga tgcaggaaga catgtccaca 2340
aagcacggac ctgactttaa ccggttggtg tccgcttttg aggagttggc cactggagtg 2400
aaagccatca ggaccggtct tgacgaggcc aagccctggt acaagcttat caagctcctg 2460
agccgcctgt cgtgcatggc cgctgtggca gcacggtcaa aggacccagt ccttgtggcc 2520
atcatgctgg ctgacaccgg tctcgagatt ctggacagca ccttcgtcgt gaagaagatc 2580
tccgactcgc tctccagtct cttccacgtg ccggcccccg tcttcagttt cggagccccg 2640
attctgttag ccgggttggt caaggtcgcc tcgagtttct tccggtccac gcccgaagac 2700
cttgagagag cagagaaaca gctcaaagca cgtgacatca acgacatttt cgccattctc 2760
aagaacggcg agtggctggt caaattgatc cttgccatcc gcgactggat caaggcatgg 2820
atagcctcag aagaaaagtt tgtcaccacg acagacttgg tacctagcat ccttgaaaaa 2880
cagcaggacc tcaacgaccc aagcaagtac aaggaagcca aggagtggct cgacaacgcg 2940
cgccaagcgt gtttgaagag cgggaacgtc cacattgcca acctgtgcaa agtggtcgcc 3000
ccggcaccca gcaggtcgag acccgagccc gtggtcgttt gcctccgtgg caagtccggt 3060
cagggcaaga gtttccttgc aaacgtgctc gcacaagcaa tctctaccca tttcactggc 3120
aggaccgatt cagtttggta ctgcccgcct gaccctgacc acttcgacgg ttacaaccaa 3180
cagactgtcg ttgtgatgga cgatttgggc cagaaccccg acggcaaaga cttcaagtac 3240
ttcgcccaaa tggtttcaac aacggggttc atcccgccca tggcatcgct tgaggataaa 3300
ggcaaaccct tcaacagtaa ggtcatcata gcaaccacca acctgtactc gggcttcacc 3360
ccgaggacta tggtgtgccc tgatgccctg aaccggaggt ttcactttga catcgacgtg 3420
agcgccaagg acgggtacaa aattaacaac aaattggaca tcatcaaagc acttgaagat 3480
actcacacca acccagtggc aatgtttcag tacgactgtg cccttctcaa cggcatggct 3540
gttgaaatga agagaatgca acaagatatg ttcaagcctc aaccacccct tcagaacgtg 3600
taccaactgg ttcaagaggt gattgagcgg gtggagctcc acgagaaggt gtcgagccac 3660
ccgattttca aacagatctc aattccttcc caaaaatccg tgttgtactt cctcattgag 3720
aaaggacagc acgaggcagc aattgaattc tttgagggca tggtgcacga ctccatcaag 3780
gaggagctcc ggccgctcat ccaacaaacc tcatttgtga aacgcgcttt taagcgcctg 3840
aaggaaaact ttgagattgt tgccctatgt ctgaccctcc tggccaacat agtgatcatg 3900
atccgcgaaa ctcgcaagag acagaagatg gtggacgatg cagtgagtga gtacattgag 3960
agagcaaaca tcaccaccga cgacaagact cttgatgagg cggaaaagaa ccctctggaa 4020
accagcggtg ccagcaccgt cggcttcaga gagagacctc tcccaggcca aaaggcgcgt 4080
aatgacgaga actccgagcc cgcccagcct gctgaagagc aaccacaagc tgaaggaccc 4140
tacgctggcc cgatggagag acagaaacca ctgaaagtga aagcaaaagc cccggtcgtt 4200
aaggaaggac cttacgaggg accggtgaag aagcctgttg ctttgaaagt gaaagctaag 4260
aacttgatcg tcactgagag tggtgcccca ccgaccgact tgcaaaagtt ggtcatgggc 4320
aacaccaagc ccgttgagct catccttgac gggaagacgg tagccatttg ctgtgctact 4380
ggagttttcg gcactgctta cctcgtgcct cgtcatcttt tcgcagaaaa gtacgacaag 4440
atcatgttgg acggcagagc catgacagat agtgactaca gagtgtttga gtttgagatt 4500
aaagtaaaag gacaggacat gctctcagac gctgcgctca tggtgctcca ccgtgggaat 4560
cgcgtgagag acatcacgaa acactttcgt gacacagcaa gaatgaagaa aggcaccccc 4620
gtcgttggtg tgatcaacaa cgccgatgtc gggagactga ttttctctgg tgaagccctt 4680
acctacaagg acattgtagt gtgcatggat ggagacacca tgcctgggct ctttgcctac 4740
aaagccgcaa ccaaggctgg ttattgcgga ggagccgtcc tcgctaagga cggggctgac 4800
acgttcatcg ttggcaccca ctccgctgga ggcaatggcg ttggatactg ctcttgcgtt 4860
tccaggtcca tgcttctcaa gatgaaggca cacgttgacc ccgaaccaca ccacgagggg 4920
ttgattgttg acaccagaga tgtggaagag cgcgttcacg tgatgcgcaa aaccaagctt 4980
gcacccaccg ttgcgtacgg tgtgttccgt cctgagttcg ggcctgccgc cttgtccaac 5040
aaggacccgc gcctgaacga cggtgttgtc ctcgacgaag tcatcttctc caaacacaag 5100
ggagacacaa agatgtctga ggaagacaaa gcgctgttcc gccgctgtgc tgctgactac 5160
gcgtcacgcc tgcacagcgt gttgggtacg gcaaatgccc cactgagcat ctacgaggca 5220
attaaaggcg ttgatggact cgacgcaatg gaaccagaca ccgcacccgg cctcccctgg 5280
gcactccagg ggaagcgccg tggcgcgctc atcgacttcg agaacggcac tgttggaccc 5340
gaagttgagg ctgccttgaa gctcatggag aaaagagaat acaagtttgc ttgccaaacc 5400
ttcctgaagg acgagattcg cccgatggag aaagtacgtg ccggtaagac tcgcattgtc 5460
gacgtcctac ctgttgaaca catcctctac accaggatga tgattggcag attttgtgca 5520
caaatgcact caaacaacgg accccaaatt ggctcggcgg tcggttgtaa ccctgatgtt 5580
gattggcaaa gatttggcac acacttcgcc caatacagaa acgtgtggga tgtggactat 5640
tcggccttcg atgctaacca ctgcagtgac gccatgaaca tcatgtttga ggaagtgttt 5700
cgcacagaat tcgggttcca cccaaacgct gagtggatcc tgaagactct cgtgaacacg 5760
gaacacgcct atgagaacaa acgcatcact gttgaaggcg ggatgccatc tggttgttcc 5820
gcaacaagca tcatcaacac aattttgaac aacatctacg tgctctacgc tttgcgtaga 5880
cactatgagg gagttgagct ggacacttac accatgatct cttacggaga cgatatcgtg 5940
gtggcaagtg attacgattt ggactttgag gctctcaagc cccacttcaa atcccttggt 6000
caaaccatca ctccagctga caaaagcgac aaaggttttg ttcttggtca ctccattact 6060
gatgtcactt tcctcaaaag acacttccac atggattatg gaactgggtt ttacaaacct 6120
gtgatggcct caaagaccct tgaggctatc ctctcctttg cacgccgtgg gaccatacag 6180
gagaagttga tctccgtggc aggactcgct gttcactctg gaccagacga gtaccggcgt 6240
ctcttcgagc cctttcaagg cctcttcgag attccaagct acagatcact ttacctgcgt 6300
tgggtgaacg ccgtgtgcgg cgacgca 6327
<210> 18
<211> 2109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白: 口蹄疫病毒(FMDV)和牛类动物
鼻病毒2型(BRV2)
<400> 18
Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn
20 25 30
Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn
50 55 60
Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu
85 90 95
Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln
100 105 110
Ser Ser Val Gly Val Thr His Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His Val
115 120 125
Ala Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Phe Tyr Lys Lys Tyr Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala Phe
145 150 155 160
Gly His Leu Glu Lys Leu Glu Leu Pro Ser Asp His His Gly Val Phe
165 170 175
Gly His Leu Val Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val
180 185 190
Glu Val Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val
195 200 205
Ala Met Val Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr Gln
210 215 220
Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met Thr
225 230 235 240
Ala His Ile Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr
245 250 255
Lys Lys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro Leu
260 265 270
Thr Val Asn Asn Thr Ser Ala Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile
275 280 285
Ala Pro Thr Tyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly
290 295 300
Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr
305 310 315 320
Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro Pro
325 330 335
Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu
340 345 350
Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val Thr
355 360 365
Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu Ser Leu
370 375 380
Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala Gln Tyr
385 390 395 400
Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly
405 410 415
Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro Pro Gly
420 425 430
Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys Ile His
435 440 445
Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro
450 455 460
Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu
465 470 475 480
Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr His Gly
485 490 495
Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp
500 505 510
Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala Thr
515 520 525
Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly
530 535 540
Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Ile Gly Phe Ile Met
545 550 555 560
Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Leu Ser Pro Thr His Val Ile Asp
565 570 575
Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala
580 585 590
Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val Arg His Glu Gly
595 600 605
Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ser Ala Leu Leu Asn
610 615 620
Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr Asn Lys Ala Pro Phe Thr Arg Leu Ala
625 630 635 640
Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly
645 650 655
Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met Gly
660 665 670
Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr
675 680 685
Gly Ala Ile Lys Ala Asp Ala Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys
690 695 700
Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Glu Val Ser
705 710 715 720
Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu
725 730 735
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
740 745 750
Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Ser Lys Leu Val
755 760 765
Asp Thr Ile Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro
770 775 780
Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val
785 790 795 800
Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu
805 810 815
Ile Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Ala Ala Arg
820 825 830
Ser Lys Asp Pro Val Leu Val Ala Ile Met Leu Ala Asp Thr Gly Leu
835 840 845
Glu Ile Leu Asp Ser Thr Phe Val Val Lys Lys Ile Ser Asp Ser Leu
850 855 860
Ser Ser Leu Phe His Val Pro Ala Pro Val Phe Ser Phe Gly Ala Pro
865 870 875 880
Ile Leu Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Ala Ser Ser Phe Phe Arg Ser
885 890 895
Thr Pro Glu Asp Leu Glu Arg Ala Glu Lys Gln Leu Lys Ala Arg Asp
900 905 910
Ile Asn Asp Ile Phe Ala Ile Leu Lys Asn Gly Glu Trp Leu Val Lys
915 920 925
Leu Ile Leu Ala Ile Arg Asp Trp Ile Lys Ala Trp Ile Ala Ser Glu
930 935 940
Glu Lys Phe Val Thr Thr Thr Asp Leu Val Pro Ser Ile Leu Glu Lys
945 950 955 960
Gln Gln Asp Leu Asn Asp Pro Ser Lys Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Trp
965 970 975
Leu Asp Asn Ala Arg Gln Ala Cys Leu Lys Ser Gly Asn Val His Ile
980 985 990
Ala Asn Leu Cys Lys Val Val Ala Pro Ala Pro Ser Arg Ser Arg Pro
995 1000 1005
Glu Pro Val Val Val Cys Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Lys
1010 1015 1020
Ser Phe Leu Ala Asn Val Leu Ala Gln Ala Ile Ser Thr His Phe
1025 1030 1035
Thr Gly Arg Thr Asp Ser Val Trp Tyr Cys Pro Pro Asp Pro Asp
1040 1045 1050
His Phe Asp Gly Tyr Asn Gln Gln Thr Val Val Val Met Asp Asp
1055 1060 1065
Leu Gly Gln Asn Pro Asp Gly Lys Asp Phe Lys Tyr Phe Ala Gln
1070 1075 1080
Met Val Ser Thr Thr Gly Phe Ile Pro Pro Met Ala Ser Leu Glu
1085 1090 1095
Asp Lys Gly Lys Pro Phe Asn Ser Lys Val Ile Ile Ala Thr Thr
1100 1105 1110
Asn Leu Tyr Ser Gly Phe Thr Pro Arg Thr Met Val Cys Pro Asp
1115 1120 1125
Ala Leu Asn Arg Arg Phe His Phe Asp Ile Asp Val Ser Ala Lys
1130 1135 1140
Asp Gly Tyr Lys Ile Asn Asn Lys Leu Asp Ile Ile Lys Ala Leu
1145 1150 1155
Glu Asp Thr His Thr Asn Pro Val Ala Met Phe Gln Tyr Asp Cys
1160 1165 1170
Ala Leu Leu Asn Gly Met Ala Val Glu Met Lys Arg Met Gln Gln
1175 1180 1185
Asp Met Phe Lys Pro Gln Pro Pro Leu Gln Asn Val Tyr Gln Leu
1190 1195 1200
Val Gln Glu Val Ile Glu Arg Val Glu Leu His Glu Lys Val Ser
1205 1210 1215
Ser His Pro Ile Phe Lys Gln Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ser
1220 1225 1230
Val Leu Tyr Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile
1235 1240 1245
Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu
1250 1255 1260
Arg Pro Leu Ile Gln Gln Thr Ser Phe Val Lys Arg Ala Phe Lys
1265 1270 1275
Arg Leu Lys Glu Asn Phe Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu Thr Leu
1280 1285 1290
Leu Ala Asn Ile Val Ile Met Ile Arg Glu Thr Arg Lys Arg Gln
1295 1300 1305
Lys Met Val Asp Asp Ala Val Ser Glu Tyr Ile Glu Arg Ala Asn
1310 1315 1320
Ile Thr Thr Asp Asp Lys Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys Asn Pro
1325 1330 1335
Leu Glu Thr Ser Gly Ala Ser Thr Val Gly Phe Arg Glu Arg Pro
1340 1345 1350
Leu Pro Gly Gln Lys Ala Arg Asn Asp Glu Asn Ser Glu Pro Ala
1355 1360 1365
Gln Pro Ala Glu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly
1370 1375 1380
Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro
1385 1390 1395
Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val
1400 1405 1410
Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly
1415 1420 1425
Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Leu Val Met Gly Asn Thr Lys
1430 1435 1440
Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys
1445 1450 1455
Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu
1460 1465 1470
Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met
1475 1480 1485
Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys
1490 1495 1500
Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg
1505 1510 1515
Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Thr Ala
1520 1525 1530
Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala
1535 1540 1545
Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys
1550 1555 1560
Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe
1565 1570 1575
Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val
1580 1585 1590
Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr His Ser
1595 1600 1605
Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser
1610 1615 1620
Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Val Asp Pro Glu Pro His His
1625 1630 1635
Glu Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His
1640 1645 1650
Val Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala Tyr Gly Val
1655 1660 1665
Phe Arg Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro
1670 1675 1680
Arg Leu Asn Asp Gly Val Val Leu Asp Glu Val Ile Phe Ser Lys
1685 1690 1695
His Lys Gly Asp Thr Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe
1700 1705 1710
Arg Arg Cys Ala Ala Asp Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu
1715 1720 1725
Gly Thr Ala Asn Ala Pro Leu Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly
1730 1735 1740
Val Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu
1745 1750 1755
Pro Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg Gly Ala Leu Ile Asp Phe
1760 1765 1770
Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu
1775 1780 1785
Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys
1790 1795 1800
Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly Lys Thr Arg
1805 1810 1815
Ile Val Asp Val Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr Arg Met
1820 1825 1830
Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly Pro
1835 1840 1845
Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln
1850 1855 1860
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1865 1870 1875
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1880 1885 1890
Ile Met Phe Glu Glu Val Phe Arg Thr Glu Phe Gly Phe His Pro
1895 1900 1905
Asn Ala Glu Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala
1910 1915 1920
Tyr Glu Asn Lys Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly
1925 1930 1935
Cys Ser Ala Thr Ser Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr
1940 1945 1950
Val Leu Tyr Ala Leu Arg Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp
1955 1960 1965
Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser
1970 1975 1980
Asp Tyr Asp Leu Asp Phe Glu Ala Leu Lys Pro His Phe Lys Ser
1985 1990 1995
Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp Lys Ser Asp Lys Gly Phe
2000 2005 2010
Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr Phe Leu Lys Arg His
2015 2020 2025
Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys Pro Val Met Ala
2030 2035 2040
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2060 2065 2070
Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly Leu
2075 2080 2085
Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn
2090 2095 2100
Ala Val Cys Gly Asp Ala
2105
<210> 19
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒
<400> 19
Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met
1 5 10 15
Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Asn Pro
20 25 30
Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser
35 40
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒
<400> 20
Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met
1 5 10 15
Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala Tyr Gly Val Phe Arg Pro
20 25 30
Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser
35 40
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒
<400> 21
Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Arg
1 5 10 15
Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu
20
<210> 22
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 口蹄疫病毒
<400> 22
Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Pro Val Lys Val Leu Lys Val Arg
1 5 10 15
Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu
20
<210> 23
<211> 7589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合核苷酸: 口蹄疫病毒(FMDV)和
牛类动物鼻病毒2型(BRV2)
<400> 23
ttgaaagggg gcgctagggt ctcaccccta gcatgccaac gacagtcccc gcgttgcact 60
ccacactcac gttgtgcgtg cgcggagctc gatggactat cgttcaccca cctacagctg 120
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tcgcgtgacc ggttagtact ctcaccacct tccgcccact tggttgttag cgctgtcttg 240
ggcactcctg ttgggggccg ttcgacgctc cgcgagtttc cccgcacggc aactacggtg 300
atggggccgt accgcgcggg ctgatcgcct ggtgtgcttc ggctgtcacc cgaagcctac 360
ctttcacccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccccccctaa gttctaccgt 420
cgttcccgac gtaaagggat gtaaccacaa gcttactacc gcctttcccg gcgttaaagg 480
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accccccccc ttggtaacaa ggacccacgg ggccaaaagc cacgtccgaa tggacccgtc 840
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ttctatgtct gaataggtga ccggaggccg gcacctttct tttaattaca ctggacttat 1080
gaacacaact gattgtttta tcgctttggt acacgctatc agagagatca gagcattttt 1140
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ccaatctggc aacactggaa gcatcattaa caactactac atgcaacagt accagaattc 1260
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aaggttgagc gctcggctgc ccacctcctt caactacggc gccgtgaagg ccgacaccat 3240
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cgccattctc aagaacggcg agtggctggt caaattgatc cttgccatcc gcgactggat 3960
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cgacaacgcg cgccaagcgt gtttgaagag cgggaacgtc cacattgcca acctgtgcaa 4140
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<210> 24
<211> 7600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合核苷酸: 口蹄疫病毒(FMDV)和
牛类动物鼻病毒2型(BRV2)
<400> 24
ttgaaagggg gcgctagggt ctcaccccta gcatgccaac gacagtcccc gcgttgcact 60
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cctcctggag gaccgcatcc ttaccacccg caacggacac accacctcga caacccagtc 1500
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caacccgccc agaaccaact accctgggcg ctttacaaac ttgttggacg tggccgaggc 2220
ttgcccgacc ttcctctgtt ttgacgacgg gaaaccgtac gttgtgacaa ggacggacga 2280
ccaacgcctc ctggccaagt ttgacgtttc ccttgctgca aagcacatgt caaacaccta 2340
cctctcaggg atagcacagt actacacgca gtactctggc actatcaatc tgcatttcat 2400
gttcactggc tctactgaat caaaggcccg gtacatggtg gcgtacattc cacctggcat 2460
ggacaaccca ccggacacac ctgagaaggc tgcacattgc atccacgccg agtgggacac 2520
cgggctgaac tccaaattta ctttttctat cccgtacgtg tctgctgcag actacgcata 2580
cactgcgtct gacgtggcag aaacaacaaa cgtacagggg tgggtctgca tataccaaat 2640
cactcacggg aaggctgaac aggacactct ggtcgtgtcg gtcagcgccg gcaaggactt 2700
tgaactgcgc ctcccaattg acccccgcac gcaaaccacc actgccgggg agtcagcaga 2760
ccctgtcacc accaccgttg agaactacgg tggtgagaca caggctcagc gacgtcagca 2820
cactgacgtc ggcttcatca tggacaggtt tgcgaaaatc agccccgtga gccccacgca 2880
cgtcattgac ctcatgcaaa cacaccaaca cgcgttggtg ggtgcccttt tgcgtgcagc 2940
cacgtactac ttctccgatc tggagattgt ggtgcgtcat gatggcaact tgacgtgggt 3000
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<211> 7597
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 含有FMD的01 Campos病毒株的融合核苷酸序列(全基因组)
<400> 25
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ttcttcttct ccgacgttag gtcaaacttt tccaagctgg tagacacaat caaccagatg 3480
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<210> 26
<211> 7586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有FMD的C3 Indaial菌株的融合核苷酸序列(全基因组)
<400> 26
ttgaaagggg gcgctagggt ctcaccccta gcatgccaac gacagtcccc gcgttgcact 60
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ctggtactca agcactggtg acaggctaag gatgcccttc aggtaccccg aggtaacacg 960
tgacactcgg gatctgagaa ggggaccggg gcttctataa aagcgcccgg tttaaaaagc 1020
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ggtgactgct gttggaaacc agttcaacgg cggttgtctc ctggtggcgc tcgttcctga 1800
aatgggtgac atcagtgaca gagagaagta ccaactgact ctctaccccc accaattcat 1860
caacccacgc actaacatga cggcacacat caccgtgcct tacgtgggtg tcaacagata 1920
cgaccaatac aaccaacaca agccctggac tcttgtcgtc atggtcgttg ctccacttac 1980
tgtgaacaca tcaggtgccc agcagatcaa ggtgtatgcc aacatagccc caaccaacgt 2040
tcacgttgct ggtgaacttc cctccaagga ggggatcttc cccgttgcgt gtgccgacgg 2100
ctatggcaac atggtgacaa ctgacccgaa gacagctgac cctgcctacg ggaaagtcta 2160
caatccaccc aggaccgccc tgccgggccg gttcacaaac tacctggatg ttgctgaggc 2220
ttgccccact ctcctgacgt tcgagaacgt gccttacgtt tcaacacgga ctgatggaca 2280
aaggctgttg gccaagttcg acgtgtcatt ggcagcgaaa cacatgtcaa acacttactt 2340
ggctggcttg gcccagtact acacacagta cgctgggaca atcaacctgc acttcatgtt 2400
cactgggcca accgacgcga aagctcggta catggtggca tacgtgcccc ctggcatgga 2460
agcaccagac aacccagagg aggctgccca ctgcatacac gcagagtggg acactggttt 2520
gaactctaag ttcacatttt caatcccgta catctcggcc gctgactacg catacaccgc 2580
gtccagcgag gctgaaacaa caagcgtaca gggatgggtt tgtgtgtacc agatcactca 2640
cggcaaggca gacgctgacg cgctcgtcgt ctccgcttcg gcggggaaag actttgagct 2700
ccggctacct gtggacgcta gacagcaaac tacgaccact ggcgaatctg ccgaccccgt 2760
caccactacc gttgagaact acggaggaga aacacaaact caacgtcgcc accacactga 2820
cgttgccttc gttcttgacc ggtttgtgaa ggtccaggtg tcgggcaacc aacacacact 2880
ggacgttatg caggtacaca aggacagtat tgtgggtgca ctcctacgcg cagccacata 2940
ctacttctct gacttggaaa tagcagtgac tcacactggg aagctcacat gggtgcccaa 3000
cggcgcccca gtttctgcac ttgacaacac aaccaacccc actgcctacc acaaggggcc 3060
gctgactcgg ctggctctcc catacaccgc accacaccgc gtgctggcca cggcgtacac 3120
cggtacaacg gcctacacta ccggtgtacg caggggagac ctagcccact tggcggcggc 3180
gcacgctcgg cacctgccga cgtcgttcaa ctttggtgca gttaaagcag agacaatcac 3240
agagctgctt gtgcgcatga agcgtgctga actctactgc cccagaccgg tccttccggt 3300
ccaaccagcg ggcgataggc acaaacaacc gctcattgcg ccagcgaaac agcttctgaa 3360
ttttgacctg cttaagctag ccggagacgt tgagtccaac cctgggccct tcttcttctc 3420
cgacgttagg tcaaactttt ccaagctggt agacacaatc aaccagatgc aggaagacat 3480
gtccacaaag cacggacctg actttaaccg gttggtgtcc gcttttgagg agttggccac 3540
tggagtgaaa gccatcagga ccggtcttga cgaggccaag ccctggtaca agcttatcaa 3600
gctcctgagc cgcctgtcgt gcatggccgc tgtggcagca cggtcaaagg acccagtcct 3660
tgtggccatc atgctggctg acaccggtct cgagattctg gacagcacct tcgtcgtgaa 3720
gaagatctcc gactcgctct ccagtctctt ccacgtgccg gcccccgtct tcagtttcgg 3780
agccccgatt ctgttagccg ggttggtcaa ggtcgcctcg agtttcttcc ggtccacgcc 3840
cgaagacctt gagagagcag agaaacagct caaagcacgt gacatcaacg acattttcgc 3900
cattctcaag aacggcgagt ggctggtcaa attgatcctt gccatccgcg actggatcaa 3960
ggcatggata gcctcagaag aaaagtttgt caccacgaca gacttggtac ctagcatcct 4020
tgaaaaacag caggacctca acgacccaag caagtacaag gaagccaagg agtggctcga 4080
caacgcgcgc caagcgtgtt tgaagagcgg gaacgtccac attgccaacc tgtgcaaagt 4140
ggtcgccccg gcacccagca ggtcgagacc cgagcccgtg gtcgtttgcc tccgtggcaa 4200
gtccggtcag ggcaagagtt tccttgcaaa cgtgctcgca caagcaatct ctacccattt 4260
cactggcagg accgattcag tttggtactg cccgcctgac cctgaccact tcgacggtta 4320
caaccaacag actgtcgttg tgatggacga tttgggccag aaccccgacg gcaaagactt 4380
caagtacttc gcccaaatgg tttcaacaac ggggttcatc ccgcccatgg catcgcttga 4440
ggataaaggc aaacccttca acagtaaggt catcatagca accaccaacc tgtactcggg 4500
cttcaccccg aggactatgg tgtgccctga tgccctgaac cggaggtttc actttgacat 4560
cgacgtgagc gccaaggacg ggtacaaaat taacaacaaa ttggacatca tcaaagcact 4620
tgaagatact cacaccaacc cagtggcaat gtttcagtac gactgtgccc ttctcaacgg 4680
catggctgtt gaaatgaaga gaatgcaaca agatatgttc aagcctcaac caccccttca 4740
gaacgtgtac caactggttc aagaggtgat tgagcgggtg gagctccacg agaaggtgtc 4800
gagccacccg attttcaaac agatctcaat tccttcccaa aaatccgtgt tgtacttcct 4860
cattgagaaa ggacagcacg aggcagcaat tgaattcttt gagggcatgg tgcacgactc 4920
catcaaggag gagctccggc cgctcatcca acaaacctca tttgtgaaac gcgcttttaa 4980
gcgcctgaag gaaaactttg agattgttgc cctatgtctg accctcctgg ccaacatagt 5040
gatcatgatc cgcgaaactc gcaagagaca gaagatggtg gacgatgcag tgagtgagta 5100
cattgagaga gcaaacatca ccaccgacga caagactctt gatgaggcgg aaaagaaccc 5160
tctggaaacc agcggtgcca gcaccgtcgg cttcagagag agacctctcc caggccaaaa 5220
ggcgcgtaat gacgagaact ccgagcccgc ccagcctgct gaagagcaac cacaagctga 5280
aggaccctac gctggcccga tggagagacc agttaaagtt aaagtgaaag caaaagcccc 5340
ggtcgttaag gaaggacctt acgagggacc ggtgaagaag cctgttgctt tgaaagtgaa 5400
agctaagaac ttgatcgtca ctgagagtgg tgccccaccg accgacttgc aaaagttggt 5460
catgggcaac accaagcccg ttgagctcat ccttgacggg aagacggtag ccatttgctg 5520
tgctactgga gttttcggca ctgcttacct cgtgcctcgt catcttttcg cagaaaagta 5580
cgacaagatc atgttggacg gcagagccat gacagatagt gactacagag tgtttgagtt 5640
tgagattaaa gtaaaaggac aggacatgct ctcagacgct gcgctcatgg tgctccaccg 5700
tgggaatcgc gtgagagaca tcacgaaaca ctttcgtgac acagcaagaa tgaagaaagg 5760
cacccccgtc gttggtgtga tcaacaacgc cgatgtcggg agactgattt tctctggtga 5820
agcccttacc tacaaggaca ttgtagtgtg catggatgga gacaccatgc ctgggctctt 5880
tgcctacaaa gccgcaacca aggctggtta ttgcggagga gccgtcctcg ctaaggacgg 5940
ggctgacacg ttcatcgttg gcacccactc cgctggaggc aatggcgttg gatactgctc 6000
ttgcgtttcc aggtccatgc ttctcaagat gaaggcacac gttgaccccg aaccacacca 6060
cgaggggttg attgttgaca ccagagatgt ggaagagcgc gttcacgtga tgcgcaaaac 6120
caagcttgca cccaccgttg cgtacggtgt gttccgtcct gagttcgggc ctgccgcctt 6180
gtccaacaag gacccgcgcc tgaacgacgg tgttgtcctc gacgaagtca tcttctccaa 6240
acacaaggga gacacaaaga tgtctgagga agacaaagcg ctgttccgcc gctgtgctgc 6300
tgactacgcg tcacgcctgc acagcgtgtt gggtacggca aatgccccac tgagcatcta 6360
cgaggcaatt aaaggcgttg atggactcga cgcaatggaa ccagacaccg cacccggcct 6420
cccctgggca ctccagggga agcgccgtgg cgcgctcatc gacttcgaga acggcactgt 6480
tggacccgaa gttgaggctg ccttgaagct catggagaaa agagaataca agtttgcttg 6540
ccaaaccttc ctgaaggacg agattcgccc gatggagaaa gtacgtgccg gtaagactcg 6600
cattgtcgac gtcctacctg ttgaacacat cctctacacc aggatgatga ttggcagatt 6660
ttgtgcacaa atgcactcaa acaacggacc ccaaattggc tcggcggtcg gttgtaaccc 6720
tgatgttgat tggcaaagat ttggcacaca cttcgcccaa tacagaaacg tgtgggatgt 6780
ggactattcg gccttcgatg ctaaccactg cagtgacgcc atgaacatca tgtttgagga 6840
agtgtttcgc acagaattcg ggttccaccc aaacgctgag tggatcctga agactctcgt 6900
gaacacggaa cacgcctatg agaacaaacg catcactgtt gaaggcggga tgccatctgg 6960
ttgttccgca acaagcatca tcaacacaat tttgaacaac atctacgtgc tctacgcttt 7020
gcgtagacac tatgagggag ttgagctgga cacttacacc atgatctctt acggagacga 7080
tatcgtggtg gcaagtgatt acgatttgga ctttgaggct ctcaagcccc acttcaaatc 7140
ccttggtcaa accatcactc cagctgacaa aagcgacaaa ggttttgttc ttggtcactc 7200
cattactgat gtcactttcc tcaaaagaca cttccacatg gattatggaa ctgggtttta 7260
caaacctgtg atggcctcaa agacccttga ggctatcctc tcctttgcac gccgtgggac 7320
catacaggag aagttgatct ccgtggcagg actcgctgtt cactctggac cagacgagta 7380
ccggcgtctc ttcgagccct ttcaaggcct cttcgagatt ccaagctaca gatcacttta 7440
cctgcgttgg gtgaacgccg tgtgcggcga cgcataatcc ctcagagact acattggcat 7500
actgtttctg aggcgcgcga cgccgtagga gtgaaaagcc tgaaagggct tttcccgctt 7560
cctattccaa aaaaaaaaaa aaaaaa 7586
<210> 27
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有FMD的C3 Indaial病毒株的衣壳和2A部分序列的融合核苷酸序列
<400> 27
ggggccggcc aatccagccc agctactggc tcgcagaacc aatctggtaa cacaggtagc 60
ataatcaaca actactacat gcaacagtac caaaactcca tggacacaca gcttggtgac 120
aatgccatca gtggaggctc taacgagggc tccacggaca caacttcaac tcacacaacc 180
aacacccaaa acaatgactg gttttcaaga ctcgccggtt cggccttctc cggtttgttt 240
ggggccttgc ttgccgacaa gaagacggag gagacgacac tccttgagga ccgcattctc 300
accactcgca atgggcacac cacctccacg acccagtcca gcgtaggcgt tacatacggg 360
tactccacaa cagaggacca cgttgctgga cccaacacat caggtttgga gacacgagtg 420
gtacaggcag agagattcta caaaaagttt ttgtttgatt ggacaacgga caagcctttt 480
ggacacctgc acaaactgga gttgcccacc gaccaccacg gtgttttcgg acacttggtg 540
gactcatacg cctacatgag gaacggttgg gacgttgagg tgtctgctgt tggcaaccag 600
ttcaacggcg gatgcctcct agtggccatg gtacccgaat ggaaagagtt tgaaacgcgg 660
gagaagtacc agctcacgct tttcccgcac cagttcatta gccccagaac caacatgacc 720
gcccacatca cggttcctta ccttggtgtg aatagatatg atcagtacaa aaaacacaaa 780
ccctggacac tggttgtcat ggtcgtgtcc ccgctcacgg tcaacgccac gagcgcggca 840
cagatcaagg tctatgccaa catcgctccg acctacgttc atgtggccgg cgagctcccc 900
tcgaaagagg ggatcttccc tgtcgcgtgc gcggacggtt acggaggact ggtgacaacg 960
gacccgaaaa cagctgaccc cgcctacggc aaggtgtaca atccgccccg gactaactac 1020
cccgggcgtt tcactaactt gttggacgtg gctgaggcat gtcccacctt tctgtgtttt 1080
gacgacggga aaccgtacgt taccacacag acaggtgagt ctcgtcttct ggccaagttc 1140
gacctttccc ttgccgcgaa gcacatgtct aacacatact tggcaggaat tgcccagtac 1200
tacacacagt actcaggcac catcaatttg catttcatgt tcacaggttc aactgattca 1260
aaagcccgct acatggtggc ttacatcccg cctggggtgg aaacaccacc ggacacacct 1320
gagagggcag cccactgcat ccatgctgag tgggacacag ggctgaattc caaattcaca 1380
ttctcaatcc cgtacgtgtc tgccgcggat tacgcctaca cggcgtctga tgaggcagag 1440
acaacaaacg tacagggatg ggtctgcgtt taccagatca cacacgggaa ggctgacaac 1500
gacactctgg tcgtgtcggt tagcgccggc aaggacttcg agttgcgcct ccccattgac 1560
ccccgaccgc agaccaccgc tactggggaa tcagcagacc ctgtcaccac cactgtagag 1620
aactacggcg gtgagacaca agttcagaga cgccaccaca ccgacgttgg cttcatcatg 1680
gacagatttg tgaaaataaa cagcccaaaa tccacccatg ttattgacct catgcaaacc 1740
caccaacacg gtctagtggg tgcgctgctg cgtgcggcga cctactactt ctcagatctg 1800
gaaattgttg tgcggcatga cggcaaccta acttgggtgc ccaatggtgc tcccgtgtca 1860
gccttgtcca acaccagcaa ccccaccgcc tacaacaagg caccgttcac gagacttgcc 1920
ctcccctaca ccgcgccaca ccgcgtgttg gcgactgtgt acaacgggac gagcaagtac 1980
actgtgagtg ggtcaagcag acgaggcgac ttgggttccc tcgcggcacg agtcgtgaag 2040
gcacttcctg cttctttcaa ctacggtgca atcaag 2076
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
gacaaaggtt ttgttcttgg tca 23
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
tgcgagtcct gccacgga 18
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 30
tcctttgcac gccgtgggac 20

Claims (29)

1.一种免疫原性组合物，其包含抗原组分和佐剂组分，其中
a)所述佐剂组分包含含有油的乳液、免疫刺激寡核苷酸和以下中的至少一种：
i)聚阳离子聚合物；或
ii)铝源；和
b)所述抗原组分包含每剂量0.5μg到10μg的口蹄疫(FMD)病毒组合物。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中：
a)所述佐剂组分包含所述聚阳离子聚合物，
b)所述聚阳离子聚合物为二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖(Dextran)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含CpG。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含至少15个连续的SEQ ID NO:8的核苷酸。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述油相以所述组合物的高达80％v/v的量存在。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述油相占所述组合物的50.01％v/v到55％v/v。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其进一步包含一种或多种乳化剂。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂组分包含SEQ ID NO:8和二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述DEAE葡聚糖以每剂量6mg到200mg的量存在。
10.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸以每剂量6μg到200μg的量存在。.
11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述FMD病毒组合物为FMD病毒Cruzeiro病毒株的制备物。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述FMD病毒Cruzeiro病毒株经基因工程改造。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述FMD病毒Cruzeiro病毒株缺失前导编码区(LL)。
14.根据权利要求12或13所述的免疫原性组合物，其中所述FMD病毒Cruzeiro病毒株含有在病毒非结构3Dpol和3B蛋白中的一个或两个中引入的阴性抗原标记。
15.根据权利要求12到14中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述FMD病毒Cruzeiro病毒株含有异源衣壳蛋白。
16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中除Cruzeiro以外的病毒株选自Asia1、Turkey06、O1Campos、C3Indaial和A2001-Argentina。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述抗原组分包含每剂量0.5μg到6μg的FMD病毒。
18.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述抗原组分包含每剂量0.5μg到4μg的FMD病毒。
19.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述抗原组分包含每剂量0.5μg到2μg的FMD病毒。
20.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述抗原组分包含每剂量0.5μg到1.5μg的FMD病毒。
21.根据权利要求1到20中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中所述FMD病毒组合物包含结构FMD蛋白和非结构FMD蛋白两者。
22.一种在有需要的动物中治疗或预防FMD的方法，所述方法包含向所述动物投与根据权利要求1到21中任一权利要求所述的免疫原性组合物。
23.一种畜群管理方法，其包含向所述畜群中的每个成员投与根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(FMD)病毒组合物；
b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg。
并且其中进一步地，在疑似与FMD感染接触后，不屠宰所述畜群的已接种疫苗成员。
24.一种畜群管理方法，其包含向所述畜群中的每个成员投与根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(FMD)病毒组合物；
b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg。
并且其中进一步地，在疑似与FMD感染接触后，将所述畜群的已接种疫苗成员隔离0到30天。
25.一种畜群管理方法，其包含向所述畜群中的每个成员投与根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(FMD)病毒组合物；
b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg。
并且其中进一步地，在疑似与FMD感染接触后，将所述畜群的已接种疫苗成员移出感染场所。
26.一种在感染FMD的反刍动物中降低FMD续留(FMD persistence)频率的方法，所述方法包含在感染之前向所述反刍动物投与根据权利要求1到16中任一权利要求所述的免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(FMD)病毒组合物；
b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg。
27.根据权利要求23到26中任一权利要求所述的方法，其中不屠宰所述畜群的已接种疫苗成员并且将其隔离0到30天。
28.根据权利要求23到27中任一权利要求所述的方法，其中所述畜群为牛类畜群。
29.根据权利要求22到28中任一权利要求所述的方法，其中所述FMD病毒组合物通过中空纤维过滤制备。
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