ES2950822T3 - Vacuna contra la enfermedad de fiebre aftosa - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan composiciones para la prevención de la fiebre aftosa (FM D), que comprenden un componente antigénico en una cantidad equivalente a 0,5-20 μg de virus FM D y un componente adyuvante que comprende aceite, un oligonucleótido inmunoestimulante y un vehículo policatiónico. También se proporcionan métodos para usar la composición, así como métodos para reducir la persistencia de FM D. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra la enfermedad de fiebre aftosa
ANTECEDENTES
La enfermedad de la fiebre aftosa (FMD) es una enfermedad vírica extremadamente contagiosa de los ungulados de pezuña hendida, entre los que se incluyen los animales domésticos (vacas, cerdos, ovejas, cabras y otros) y una variedad de animales salvajes. Los síntomas más destacados de la enfermedad en el ganado infectado por el virus de la fiebre aftosa son las lesiones vesiculares del epitelio de la boca, la lengua, los pezones y las patas. Aunque algunos países, entre ellos Estados Unidos, Canadá, México, Australia y la mayor parte de Europa, se consideran libres de fiebre aftosa, la enfermedad está distribuida por todo el mundo y tiene un gran impacto económico en la industria exportadora. De hecho, en la última década se han producido varios brotes económicamente devastadores en casi todos los continentes.
En la actualidad, las vacunas contra el virus de la fiebre aftosa con antígeno muerto se producen necesariamente en costosas instalaciones de contención biológica, cultivando grandes volúmenes (miles de litros) de virus de la fiebre aftosa virulento que ha sido adaptado para crecer en células, lo que a veces puede resultar difícil. Este proceso ha dado lugar a la fuga de virus virulentos de las instalaciones de fabricación, causando costosos brotes en el ganado (véase Cottam et al. 2008. PLoS Pathogen 4:1-8). Tras el crecimiento, el virus se inactiva mediante productos químicos y se preparan concentrados de antígenos, seguidos de los pasos de purificación necesarios para eliminar las proteínas contaminantes. Es difícil diferenciar los animales infectados de los vacunados (DIVA) mediante pruebas serológicas de diagnóstico. La protección cruzada entre serotipos y subtipos es escasa o nula, por lo que se requiere una correspondencia adecuada entre la vacuna y las cepas de campo circulantes para lograr la protección. A pesar de estas deficiencias de las vacunas, cada año se fabrican miles de millones de dosis en todo el mundo. Su uso ha sido la base para erradicar el virus de la fiebre aftosa de Europa y para controlar la enfermedad en muchas partes del mundo mediante campañas de vacunación masiva. La creación de virus modificados genéticamente que contengan una columna vertebral y sitios de restricción adecuados resuelve parcialmente las deficiencias de las vacunas inactivadas, ya que los sitios de restricción proporcionan loci para la introducción de proteínas de la cápside de diferentes cepas de fiebre aftosa. No obstante, el coste del antígeno es el que más contribuye al coste de la fiebre aftosa y de la mayoría de las demás vacunas.
El problema del control de la fiebre aftosa se agrava aún más por el fenómeno de la persistencia del virus. En resumen, históricamente, las vacunas inactivadas contra la fiebre aftosa han sido incapaces de prevenir la persistencia o el estado de portador (definido como la excreción del virus pasados 28 días tras la infección y/o exposición). Los animales excretores, aunque no presenten ningún síntoma de fiebre aftosa, podrían seguir siendo una fuente de infección de fiebre aftosa para otros animales. Por ello, las prácticas de control de enfermedades comúnmente aceptadas exigen el sacrificio de todos los animales de un rebaño vacunado aunque no presenten signos clínicos de enfermedad.
Yimei C, Expert Rev. Vaccines 13 (2014) Vol. 11, 1377-1385 divulga una visión general de los adyuvantes para la vacuna contra el virus de la fiebre aftosa (FMDV) centrándose en su eficacia cuando se utilizan con la vacuna contra la fiebre aftosa, y en los mecanismos por los que los adyuvantes median sus efectos.
Bucafusco D et al., Virology 476 (2015) 11-18 divulgan un estudio de respuestas de recuerdo de Interferón-y contra el virus de la fiebre aftosa en bovinos vacunados para estudiar la inmunidad de los linfocitos T contra diferentes cepas de este virus.Ren J et al., Vaccine 29 (2011) 7960-7965 divulgan una vacuna recombinante contra el virus de la fiebre aftosa capaz de inducir una respuesta específica de anticuerpos en ratones y bovinos
Como tal, aún se desean procedimientos y composiciones que conduzcan a vacunas con una menor carga de antígeno sin comprometer la eficacia y/o reducir o eliminar la persistencia de la fiebre aftosa.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los productos (compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos) de la presente invención para uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo animal por terapia o diagnóstico.
En un aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un componente antígeno y un componente adyuvante, en el que el componente adyuvante comprende una emulsión que contiene aceite, un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende CpG, y dietilaminoetil (DEAE) Dextrano; y el componente antígeno comprende 0,5 - 10 |jg de una composición de virus inactivado de la fiebre aftosa (Fiebre Aftosa) cepa Cruzeiro por dosis.
En la presente invención, el oligonucleótido inmunoestimulador es un oligonucleótido que contiene CpG. En la presente invención, el antígeno es una composición vírica de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa, y puede estar presente en una cantidad de 0,5-4 jg por dosis, o de 0,5 - 2 jg por dosis, o de 0,5 - 1 jg por dosis, o en una cantidad de aproximadamente 0,5 jg por dosis.
El virus de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa está inactivado. En ciertas realizaciones, el virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa es una cepa inactivada Cruzeiro A24 de la fiebre aftosa. En determinadas realizaciones, la cepa inactivada es una cepa modificada genéticamente que contiene una deleción de la región codificante líder (LL) y, opcionalmente, contiene marcadores antigénicos negativos.
En ciertas realizaciones, el virus modificado genéticamente contiene proteínas de cápside de una cepa heteróloga.
En otro aspecto, la invención proporciona la composición inmunogénica según la presente invención para su uso en un procedimiento de prevención de la fiebre aftosa en un animal que la necesite, comprendiendo el procedimiento la administración de la composición inmunogénica según las realizaciones del aspecto anterior a dicho animal. En otras realizaciones, el animal se selecciona entre bovinos, ovinos, porcinos y caprinos.
En un aspecto de referencia, se divulga un procedimiento para reducir la frecuencia de persistencia de la fiebre aftosa en un rumiante infectado con fiebre aftosa que comprende administrar a dicho rumiante antes de la infección una composición inmunogénica que comprende un componente antígeno y un componente adyuvante, donde el componente adyuvante comprende una emulsión que contiene una fase oleosa, dicha fase oleosa comprende al menos 50 % v/v de dicha composición inmunogénica, un oligonucleótido inmunoestimulador en una cantidad de 75­ 200 |jg por dosis, y un polímero policatiónico en una cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de fiebre aftosa en una cantidad equivalente a 6 -10 jg de virus de fiebre aftosa por dosis.
En otro aspecto de referencia, se divulga un procedimiento de gestión de rebaño, que comprende administrar a los animales de dicho rebaño una composición inmunogénica que comprende un componente antígeno y un componente adyuvante, en el que el componente adyuvante comprende una emulsión que contiene una fase oleosa, dicha fase oleosa que comprende al menos 50 % v/v de dicha composición inmunogénica, un oligonucleótido inmunoestimulador en la cantidad de 75-200 jg por dosis, y un polímero policatiónico en la cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de fiebre aftosa en una cantidad equivalente a 6 - 10 jg de virus de fiebre aftosa por dosis, en el que, ante la sospecha de contacto con la infección de fiebre aftosa, los miembros vacunados del rebaño no son sacrificados.
Se divulga además un procedimiento de gestión de rebaños, que comprende administrar a los animales de dicho rebaño una composición inmunogénica que comprende un componente antígeno y un componente adyuvante, en el que el componente adyuvante comprende una emulsión que contiene una fase oleosa, dicha fase oleosa que comprende al menos 50 % v/v de dicha composición inmunogénica, un oligonucleótido inmunoestimulador en la cantidad de 75-200 jg por dosis, y un polímero policatiónico en la cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de la fiebre aftosa en una cantidad equivalente a 6 - 10 jg de virus de la fiebre aftosa por dosis, en el que, ante la sospecha de contacto con la infección de fiebre aftosa, los miembros vacunados del rebaño se ponen en cuarentena durante 0-62 días.
Se divulga además un procedimiento de gestión de rebaños, que comprende administrar a los animales de dicho rebaño una composición inmunogénica que comprende un componente antígeno y un componente adyuvante, en el que el componente adyuvante comprende una emulsión que contiene una fase oleosa, dicha fase oleosa que comprende al menos 50 % v/v de dicha composición inmunogénica, un oligonucleótido inmunoestimulador en la cantidad de 75-200 jg por dosis, y un polímero policatiónico en la cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de fiebre aftosa en una cantidad equivalente a 6 -10 jg de virus de fiebre aftosa por dosis, en el que, ante la sospecha de contacto con la infección de fiebre aftosa, los miembros vacunados del rebaño se desplazan más allá de la zona infectada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 ilustra la diferencia de calidad entre los antígenos precipitados con PEG y los concentrados con fibra hueca.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
"Alrededor de" o "Aproximadamente", cuando se utiliza en relación con una variable numérica mensurable, se refiere al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro del 10 % del valor indicado, lo que sea mayor, a menos que aproximadamente se use en referencia a intervalos de tiempo en semanas donde "aproximadamente de 3 semanas" es de 17 a 25 días, y aproximadamente de 2 a aproximadamente 4 semanas es de 10 a 40 días.
El término "adyuvante" se refiere generalmente a cualquier material que aumenta la respuesta inmunitaria humoral o celular a un antígeno. Los adyuvantes se utilizan generalmente para lograr dos objetivos: la liberación controlada de antígenos desde el lugar de la inyección y la estimulación del sistema inmunitario.
"Anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que puede unirse a un antígeno específico como resultado de una respuesta inmunitaria a ese antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas séricas compuestas por cadenas polipeptídicas "ligeras" y "pesadas", que tienen regiones "constantes" y "variables", y se dividen en clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) según la composición de las regiones constantes.
"Antígeno" o "inmunógeno" se refiere a cualquier sustancia que es reconocida por el sistema inmunitario del animal y genera una respuesta inmunitaria. El término incluye bacterias, virus o parásitos vivos muertos, inactivados, atenuados o modificados. El término antígeno también incluye polinucleótidos, polipéptidos, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, extracto de proteínas, células (incluidas células tumorales), tejidos, polisacáridos o lípidos, o fragmentos de los mismos, individualmente o en cualquier combinación de los mismos. El término "antígeno" también se refiere a los anticuerpos, como los anticuerpos antiidiotipo o sus fragmentos, y a los mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o un determinante antigénico (epítopo).
"Tampón" significa un sistema químico que impide el cambio en la concentración de otra sustancia química, por ejemplo, los sistemas donador y aceptor de protones sirven como tampones que impiden cambios marcados en la concentración de iones hidrógeno (pH). Otro ejemplo de tampón es una solución que contiene una mezcla de un ácido débil y su sal (base conjugada) o una base débil y su sal (ácido conjugado).
"Que consiste esencialmente" aplicado a formulaciones adyuvantes se refiere a una formulación que no contiene agentes adyuvantes o inmunomoduladores adicionales no mencionados en las cantidades en las que dichos agentes ejercen efectos adyuvantes o inmunomoduladores mensurables.
"Dosis" se refiere a una vacuna o composición inmunogénica administrada a un sujeto. Una "primera dosis" o "vacuna de cebado" se refiere a la dosis de dicha composición administrada el Día 0. Una "segunda dosis" o una "tercera dosis" o una "dosis anual" se refiere a una cantidad de dicha composición administrada con posterioridad a la primera dosis, que puede ser o no la misma vacuna o composición inmunogénica que la primera dosis.
El término "emulsionante" se utiliza ampliamente en la presente divulgación. Incluye sustancias generalmente aceptadas como emulsionantes, por ejemplo, diferentes productos de las líneas de productos TWEEN® o SPAN® (ésteres de ácidos grasos del sorbitol polietoxilado y tensioactivos de sorbitán sustituidos por ácidos grasos, respectivamente), y diferentes potenciadores de la solubilidad, como el aceite de ricino PEG-40 u otro aceite hidrogenado PEGilado.
La "respuesta inmune humoral" se refiere a la que está mediada por anticuerpos.
"Respuesta inmunitaria" en un individuo se refiere al desarrollo de una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria humoral y celular a un antígeno. Las respuestas inmunitarias pueden determinarse normalmente mediante inmunoensayos y ensayos de neutralización estándar, conocidos en la técnica.
"Cantidad inmunológicamente eficaz" o "cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria" de un antígeno es una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunógena en el receptor. La respuesta inmunogénica puede ser suficiente para fines de diagnóstico u otras pruebas, o puede ser adecuada para prevenir los signos o síntomas de la enfermedad, incluidos los efectos adversos para la salud o sus complicaciones, causados por la infección con un agente patógeno. Se puede inducir inmunidad humoral, inmunidad celular o ambas. La respuesta inmunogénica de un animal a una composición inmunogénica puede evaluarse, por ejemplo, indirectamente a través de la medición de los títulos de anticuerpos, ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente a través de la supervisión de los signos y síntomas después del desafío con la cepa de tipo salvaje, mientras que la inmunidad protectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por ejemplo, la reducción de los signos clínicos como la mortalidad, la morbilidad, el número de temperatura, la condición física general, y la salud y el rendimiento general del sujeto. La respuesta inmunitaria puede comprender, sin limitación, la inducción de la inmunidad celular y/o humoral.
"Inmunogénico" significa que evoca una respuesta inmunitaria o antigénica. Por lo tanto, una composición inmunogénica sería cualquier composición que induzca una respuesta inmunitaria.
"Locales infectados" se refiere a los locales en los que existe un caso presuntamente positivo o un caso positivo confirmado según los resultados de laboratorio, los signos clínicos compatibles, la definición de caso de fiebre aftosa y las normas internacionales.
"Zona infectada" se refiere a un área dentro de un radio de 3 km más allá de los perímetros de los Locales Infectados presuntos o confirmados.
"Lípidos" se refiere a cualquiera de un grupo de compuestos orgánicos, incluidas las grasas, aceites, ceras, esteroles y triglicéridos que son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos no polares, son aceitosos al tacto y, junto con los carbohidratos y las proteínas, constituyen el principal material estructural de las células vivas.
El término "farmacéuticamente aceptable", se refiere a las sustancias que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los sujetos, sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica, y similares, proporcionales a una relación razonable entre beneficio y riesgo, y eficaces para su uso previsto.
"TCID50" se refiere a la "dosis infectiva de cultivo de tejidos" y se define como la dilución de un virus necesaria para infectar el 50 % de un lote determinado de cultivos celulares inoculados. Se pueden utilizar varios procedimientos para calcular la TCID50, incluido el procedimiento de Spearman-Karber que se utiliza en esta memoria descriptiva. Para una descripción del procedimiento Spearman-Karber, véase B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25­ 46 (1996).
Los animales infectados persistentemente o portadores son animales que excretan el virus de la fiebre aftosa después de 28 días de la infección o de la aparición de la enfermedad clínica.
Formulaciones adyuvantes y procedimientos de elaboración
La presente solicitud divulga varias formulaciones adyuvantes adecuadas para la presente invención. La característica común de estos adyuvantes es la presencia de aceite y uno o más emulsionantes, en los que la fase oleosa comprende al menos el 50 % de la composición de la vacuna que engloba las formulaciones adyuvantes divulgadas en la misma.
Múltiples aceites y combinaciones de los mismos son adecuados para el uso de la presente invención. Estos aceites incluyen, sin limitaciones, aceites animales, aceites vegetales, así como aceites no metabolizables. Ejemplos no limitativos de aceites vegetales adecuados para la presente invención son el aceite de maíz, el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva. Un ejemplo no limitativo de aceite animal es el escualeno. Ejemplos adecuados no limitantes de aceites no metabolizables incluyen aceite mineral ligero, aceites saturados de cadena recta o ramificada, y similares.
En un conjunto de realizaciones, el aceite utilizado en las formulaciones adyuvantes de la presente invención es un aceite mineral liviano. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "aceite mineral" se refiere a una mezcla de hidrocarburos líquidos obtenida a partir de la vaselina mediante una técnica de destilación. El término es sinónimo de "parafina licuada", "vaselina líquida" y "aceite mineral blanco" El término también incluye el "aceite mineral liviano", es decir, el aceite que se obtiene de forma similar por destilación de la vaselina, pero que tiene una gravedad específica ligeramente inferiora la del aceite mineral blanco. Véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18° Ed. (Easton, Pa: Mack Publishing Company, 1990, at pages 788 and 1323). El aceite mineral puede obtenerse de varias fuentes comerciales, por ejemplo, J. T Baker (Phillipsburg, Pa.), USB Corporation (Cleveland, Ohio). El aceite mineral preferido es el aceite mineral ligero disponible comercialmente con el nombre de DRAKEOL®.
En ciertas realizaciones particularmente adecuadas para prevenir o eliminar la persistencia de la fiebre aftosa, la fase oleosa está presente en una cantidad de 50 % a 95 % en volumen; preferentemente, en una cantidad mayor que 50 % a 85 %; más preferentemente, en una cantidad mayor que 50 % a 60 %, y más preferentemente en la cantidad mayor que 50-52 % v/v de la composición de la vacuna. La fase oleosa incluye aceite y emulsionantes (por ejemplo, SPAn® 80, TWEEN® 80, etc.), si están presentes. El volumen de la fase oleosa se calcula sumando los volúmenes del aceite y del emulsionante o emulsionantes. Así, por ejemplo, si el volumen del aceite es del 40 % y el volumen del emulsionante o emulsionantes es del 12 % de una composición, entonces la fase oleosa estaría presente en un 52 % v/v de la composición. Del mismo modo, si el aceite está presente en una cantidad de aproximadamente el 45 % y el emulsionante o emulsionantes están presentes en una cantidad de aproximadamente el 6 % de una composición, entonces la fase oleosa está presente en aproximadamente el 51 % v/v de la composición.
También debe entenderse que, puesto que los adyuvantes de la presente invención forman sólo una parte de las vacunas de la presente invención, la fase oleosa está presente en una cantidad de 50 % a 95 % en volumen; preferentemente, en una cantidad de más de 50 % a 85 %; más preferentemente, en una cantidad de 50 % a 60 %, y más preferentemente en la cantidad de 50-52 % v/v de cada uno de los adyuvantes de la presente invención.
En un subconjunto de realizaciones, el porcentaje en volumen del aceite y el emulsionante soluble en aceite juntos es de al menos el 50 %, por ejemplo, 50 % a 95 % en volumen; preferentemente, en una cantidad mayor que 50 % a 85 %; más preferentemente, en una cantidad mayor que 50 % a 60 %, y más preferentemente en la cantidad mayor que 50-52 % v/v de la composición de la vacuna. Así, por ejemplo y sin limitaciones, el aceite puede estar presente en una cantidad del 45 % y el emulsionante liposoluble estaría presente en una cantidad superior al 5 % v/v. Así, el porcentaje en volumen del aceite y el emulsionante soluble en aceite juntos sería de al menos el 50 %.
En otro subconjunto, aplicable a todas las vacunas de la invención, el porcentaje en volumen del aceite es superior al 40 %, por ejemplo, 40 % a 90 % en volumen; 40 % a 85 %; 43 % a 60 %, 44-50 % v/v de la composición de la vacuna.
Los emulgentes adecuados para su uso en las presentes emulsiones incluyen emulgentes naturales biológicamente compatibles y tensioactivos sintéticos no naturales. Los emulsionantes biológicamente compatibles incluyen compuestos fosfolípidos o una mezcla de fosfolípidos. Los fosfolípidos preferidos son las fosfatidilcolinas (lecitina), como la lecitina de soja o de huevo. La lecitina puede obtenerse como una mezcla de fosfátidos y triglicéridos mediante el lavado con agua de aceites vegetales crudos, y la separación y secado de las gomas hidratadas resultantes. Puede obtenerse un producto refinado fraccionando la mezcla en busca de fosfolípidos y glicolípidos insolubles en acetona que queden tras eliminar los triglicéridos y el aceite vegetal mediante lavado con acetona. Alternativamente, la lecitina puede obtenerse de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípidos adecuados son el fosfatidilglicerol, el fosfatidilinositol, la fosfatidilserina, el ácido fosfatídico, la cardiolipina y la fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aislarse de fuentes naturales o sintetizarse convencionalmente.
En realizaciones adicionales, los emulsionantes aquí utilizados no incluyen lecitina, o utilizan lecitina en una cantidad que no es inmunológicamente eficaz.
Los emulsionantes sintéticos no naturales adecuados para uso en las formulaciones adyuvantes de la presente invención también incluyen tensioactivos no iónicos a base de sorbitán, por ejemplo tensioactivos de sorbitán sustituidos por ácidos grasos (disponibles comercialmente con el nombre de SPAN® o ARLACEL®), ésteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes como el aceite de ricino (EMULFOR®); ácido graso polietoxilado (por ejemplo, ácido esteárico disponible bajo el nombre de SIMULSOL® M-53), polímero de isooctilfenol/formaldehído polioxilado (TYLOXAPOL®), éteres de alcoholes grasos polioxilados (BRIJ®); éteres de nonfenilo polioxilados (TRITON® N), éteres de isooctilfenilo polioxilados (TRITON® X). Los tensioactivos sintéticos preferentes son los disponibles bajo el nombre de SPAN® y TWEEN®, tal como TWEEN®-80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitán) y SPAN®-80 (monooleato de sorbitán).
En general, los emulsionantes pueden estar presentes en la composición de la vacuna en una cantidad del 0,01 % al 40 % en volumen, preferentemente, del 0,1 % al 15 %, más preferentemente del 2 % al 10 %.
Los ingredientes adicionales presentes en las presentes formulaciones adyuvantes incluyen portadores catiónicos, oligonucleótidos inmunoestimulantes, monofosfolípido A y análogos del mismo (MPL-A), ácido polinosínico:policidílico (poli I:C), saponinas, amonios cuaternarios, esteroles, glicolípidos, una fuente de aluminio (por ejemplo, REHYDRAGEL® o VAC20® gel húmedo) y combinaciones de los mismos.
Los portadores catiónicos adecuados incluyen, sin limitaciones, dextrano, dextrano DEAE (y derivados de los mismos), PEGs, gomas guar, derivados del quitosano, derivados de la policelulosa como la hidroxietilcelulosa (HEC) polietilenimeno, poli aminos como la polilisina y similares.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados incluyen oligonucleótidos ODN (basados en ADN), oligonucleótidos ORN (basados en ARN), o estructuras quiméricas ODN-ORN, que pueden tener un esqueleto modificado incluyendo, sin limitaciones, modificaciones de fosforotioato, halogenaciones, alquilaciones (por ejemplo, modificaciones de etilo o metilo), y modificaciones de fosfodiéster. En algunas realizaciones, puede utilizarse ácido poli inosínico-citidílico o un derivado del mismo (poli I:C).
Los oligonucleótidos CpG se caracterizan por la presencia de un dinucleótido CG no metilado en contextos específicos de secuencias de bases (motivo CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basilea, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232 que se incorpora al presente documento como referencia). Estos motivos CpG no se observan en el ADN eucariota, en el que los dinucleótidos CG están suprimidos y, cuando están presentes, suelen estar metilados, pero sí en el ADN bacteriano, al que confieren propiedades inmunoestimuladoras.
En realizaciones seleccionadas, los adyuvantes de la presente invención utilizan un oligonucleótido inmunoestimulante de clase P, más preferentemente, oligonucleótidos inmunoestimulantes de clase P modificados, incluso más preferentemente, oligonucleótidos de clase P modificados con E. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P son oligonucleótidos CpG caracterizados por la presencia de palíndromos, generalmente de 6-20 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de la Clase P tienen la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en concámeros in vitro y/o in vivo. Estos oligonucleótidos son, en sentido estricto, monocatenarios, pero la presencia de palíndromos permite la formación de concámeros o, posiblemente, de estructuras de tallo y bucle. La longitud total de los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P suele estar comprendida entre 19 y 100 nucleótidos, por ejemplo, 19-30 nucleótidos, 30-40 nucleótidos, 40-50 nucleótidos, 50-60 nucleótidos, 60-70 nucleótidos, 70-80 nucleótidos, 80­ 90 nucleótidos, 90-100 nucleótidos.
En un aspecto, el oligonucleótido inmunoestimulador descrito en el presente documento puede contener un dominio de activación TLR 5' y al menos dos regiones palindrómicas, siendo una región palindrómica 5' de al menos 6 nucleótidos de longitud y conectada a una región palindrómica 3' de al menos 8 nucleótidos de longitud directamente o a través de un espaciador.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P pueden modificarse según técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la modificación J se refiere a nucleótidos modificados con yodo. La modificación E se refiere a nucleótidos modificados con etilo. Así, los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P modificados con E son oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P, en los que al menos un nucleótido (preferentemente el nucleótido 5') está etilado. Las modificaciones adicionales incluyen la unión de 6-nitro-benzimidazol, O-metilación, modificación con proinil-dU, modificación con inosina, unión de 2-bromovinilo (preferentemente a uridina).
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de clase P también pueden contener un enlace internucleotídico modificado que incluye enlaces fosfodiéster y enlaces fosforotioato. Los oligonucleótidos de la presente invención pueden sintetizarse u obtenerse de fuentes comerciales.
Ejemplos de oligonucleótidos de clase P y oligonucleótidos de clase P modificados se divulgan en la solicitud PCT publicada no. WO2008/068638publicada el 12 de junio de 2008. A continuación se ofrecen ejemplos adecuados no limitativos de oligonucleótidos inmunosupresores de clase P modificados ("*" se refiere a un enlace fosforotioato y "-" a un enlace fosfodiéster).
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La cantidad de oligonucleótido inmunoestimulador de clase P para su uso en las composiciones adyuvantes depende de la naturaleza del oligonucleótido inmunoestimulador de clase P utilizado y de la especie prevista.
Además del aceite y el emulsionante o emulsionantes, las formulaciones adyuvantes también comprenden (o consisten esencialmente en) una combinación de un oligonucleótido inmunoestimulador y un portador policatiónico. Estos adyuvantes se denominan "TXO".
En un conjunto de realizaciones, los adyuvantes TXO pueden incluir también una fuente de aluminio, como el gel Al(OH)3. Los adyuvantes TXO con aluminio se denominan "TXO-A".
En una serie de realizaciones, los adyuvantes TXO y TXO-A pueden contener opcionalmente un esterol, como, por ejemplo, colesterol, lanosterol, sigmasterol, etc. Los adyuvantes TXO y TXO-A que contienen el esterol se denominan TCXO y TCXO-A, respectivamente. El esterol opcionalmente presente puede estarlo en una cantidad de hasta unos 1000 |jg (por ejemplo, 100-1000 |jg, 200-1000 |jg, 250-700 |jg, o unos 400-500 |jg) por dosis.
En un conjunto de realizaciones, en los adyuvantes TXO, el oligonucleótido inmunoestimulador, preferentemente un ODN, que contiene preferentemente una secuencia palindrómica, y opcionalmente con una columna vertebral modificada, puede estar presente en la cantidad de 5-400 jig por dosis, y el portador policatiónico puede estar presente en la cantidad de 5-400 mg por dosis.
Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una dosis de TXO comprendería entre aproximadamente 5 y 400 jig por dosis (por ej, 6,25-200 jg o 6,25-100 jg o 6,25-50 jg o 6,25-25 jg o 6,25-10 jg o 10-200 jg o 25-200 jg o 25-100 jg o 25­ 50 jg o 25-100 jg o 50-100 jg por dosis) del oligonucleótido inmunoestimulador, y el portador policatiónico puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 mg por dosis (p. ej., 6,25-200 mg o 6,25-100 mg o 6,25-50 mg o 6,25-25 mg o 6,25-10 mg o 10-200 mg o 25-200 mg o 25-100 mg o 25-50 mg o 25­ 100 mg o 50-100 mg por dosis).
En ciertas realizaciones, los adyuvantes TXO se preparan como sigue:
a) El monooleato de sorbitán se disuelve en aceite mineral ligero. La solución oleosa resultante se filtra estérilmente;
b) El oligonucleótido inmunoestimulador, el Dextrano DEAE y el Monooleato de polioxietileno (20) sorbitán se disuelven en fase acuosa, formando así la solución acuosa; y
c) La solución acuosa se añade a la solución oleosa bajo homogeneización continua formando así la formulación adyuvante TXO.
En un conjunto de realizaciones, en los adyuvantes TXO-A, el oligonucleótido inmunoestimulador está presente como en el adyuvante TXO, la fuente de aluminio está presente en la cantidad de hasta 40 % v/v (por ejemplo, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 %). En una serie de realizaciones, la fuente de aluminio está presente entre el 2 % y el 20 % v/v de la composición de la vacuna, más preferentemente entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 17 % v/v.
En ciertas realizaciones, los adyuvantes TXO-A se preparan de forma similar a los adyuvantes TXO, y la fuente de aluminio se añade a la solución acuosa.
En la preparación de los adyuvantes TCXO y TCXO-A, el colesterol se disuelve en la solución oleosa, y los demás pasos de la fabricación de TCXO y TCXO-A son similares a los pasos utilizados en la preparación de TXO y TXO-A, respectivamente.
Antígenos
Los inventores han descubierto sorprendentemente que los adyuvantes de la presente invención son capaces de causar suficiente protección contra la fiebre aftosa incluso cuando la dosis del antígeno se disminuye de 1o |jg del virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa a 0,5 jg . Así, en diferentes realizaciones de la invención, la cantidad del virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa puede ser de 0,5 jg , aproximadamente 1 jg , aproximadamente 2 jg , aproximadamente 3 jg , aproximadamente 4 jg , aproximadamente 5 jg , aproximadamente 6 jg , aproximadamente 7 jg , aproximadamente 8 jg , aproximadamente 9 jg o aproximadamente 1o jg . La cantidad de antígeno puede estar comprendida entre 0,5 y 1 jg , entre 1 y 2 jg , entre 2 y 3 jg , entre 3 y 4 jg , entre 4 y 5 jg , entre 5 y 6 jg , entre 6 y 8 jg , entre 8 y 10 jg de virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa (partículas 140 S).
Actualmente, se han aislado siete serotipos de fiebre aftosa. De los siete serotipos de este virus, A, C, O, Asia 1 y SAT3 parecen ser linajes distintos; SAT 1 y SAT 2 son clados no resueltos. Dentro de cada serovar, existen múltiples cepas. Por ejemplo, a 24 Cruzeiro pertenece al serotipo A, y O1 Campos pertenece al serotipo O.
El virus de la fiebre aftosa cepa Cruzeiro, que es del serotipo A, se utiliza como antígeno en la presente invención, siempre que dicho virus no sea patógeno. La patogenicidad se reduce mediante la inactivación del virus, por ejemplo, tratamiento con formaldehído o BEI.
En ciertas realizaciones, el virus puede atenuarse por pasaje de cultivo o por medios recombinantes. Se ha demostrado anteriormente, por ejemplo, que la deleción de la región codificante de la proteína líder Lpr° da lugar a un virus de la fiebre aftosa atenuado en bovinos y cerdos. Véase, por ejemplo US 5.824.316, US 8.765.141, Virología 1997227(1): 96-102, J.Virol 201286:11675-11685. Las mutaciones puntuales en las posiciones 55 y 58 dentro del dominio SAP de la proteína L también dieron lugar a un virus viable que mostró un fenotipo atenuado leve en cultivo celular y fue protector en el modelo de fiebre aftosa porcina. Véase Patente estadounidense n° 8.846.057.
En ciertas realizaciones, el virus también contiene marcadores antigénicos negativos que permiten ensayos DIVA (diferenciación de animales infectados de vacunados). En ciertas realizaciones, los marcadores antigénicos negativos se introducen en proteínas 3D y/o 3B. Véase, por ejemplo, SEQ ID NOs 19, 20, 21, 22.
Al igual que otros virus, el virus de la fiebre aftosa evoluciona y muta continuamente, por lo que una de las dificultades a la hora de vacunar contra él es la enorme variación entre serotipos, e incluso dentro de un mismo serotipo. No existe protección cruzada entre serotipos (una vacuna para un serotipo no protegerá necesariamente contra los demás) y, además, dos cepas de un mismo serotipo pueden tener secuencias de nucleótidos que difieren hasta en un 30 % para un gen determinado. Esto significa que las vacunas contra la fiebre aftosa deben ser muy específicas para la cepa en cuestión.
Así, en ciertas realizaciones, se introducen sitios de restricción de endonucleasas en el genoma del virus, permitiendo así la introducción de proteínas (por ejemplo, proteínas que forman las cápsides externas) de cepas heterólogas de fiebre aftosa.
En ciertas realizaciones, el componente antígeno comprende la cepa de fiebre aftosa A24 Cruzeiro, que puede modificarse opcionalmente mediante la supresión de la proteína líder, mutaciones de marcadores negativos en las proteínas 3B y/o 3D, y mediante la introducción de sitios de endonucleasas de restricción para facilitar la introducción de secuencias para antígenos (por ejemplo, proteínas de la cápside) de cepas heterólogas. Ejemplos adecuados no limitantes de los antígenos se describen en US 8.765.141. Las secuencias de ADN correspondientes al genoma ARN de un virus de la fiebre aftosa modificado genéticamente también se proporcionan en SEQ ID NO: 15 (A24LL3Dyr) y SEQ ID NO: 17 (A24LL3Bpvkv3Dyr). Así, una secuencia de ADN complementaria a la secuencia de ADN establecida, por ejemplo, en SEQ ID NO: 15 es una plantilla para, es decir, es complementario o "codifica", el genoma de ARN del virus de la fiebre aftosa (es decir, ARN que codifica el virus de la fiebre aftosa). En ciertas realizaciones, el virus comprende proteína(s) de cápside de cepas heterólogas de fiebre aftosa (es decir, cepas de fiebre aftosa distintas de A24 Cruzeiro, incluyendo sin limitaciones, cepas de linajes C, O, Asia 1, SAT3, SAT 1 y SAT 2, Turquía 06 y otras cepas de linaje A). Ejemplos no limitantes de tales antígenos heterólogos se ilustran en SEQ ID NO: 23 (Asia1-A24LL3Bpvkv3Dyr) y SEQ ID NO: 24 (A/Turkey/06-A24LL3BpVKV3DYR). Además, O1 campos-A24LL3BpVKV3DYR (genoma completo, también denominado O1campos), C3 Indaial-A24LL3BpVKV3DYR (genoma completo), y capsid Argentina 2001 iso93 (capsid y 2A secuencia parcial) se proporcionan en SEQ ID NOs 25, 26, y 27, respectivamente.
También se prevén variantes de dichos antígenos. Las variantes son al menos un 80 % idénticas (por ejemplo, 85 % idénticas, 90 % idénticas, 95 % idénticas, 96 % idénticas, 97 % idénticas, 98 % idénticas o 99 % idénticas) a una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos utilizando parámetros estándar.
Existen múltiples herramientas de alineación para determinar la identidad de secuencias, incluyendo, sin limitaciones, BLAST, CLUSTAL o PHILIP
Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares.
En ciertas realizaciones, las variantes abarcan más que las secuencias ejemplares específicas de nucleótidos o aminoácidos e incluyen equivalentes funcionales de las mismas. Las alteraciones en un fragmento de ácido nucleico que dan lugar a la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio determinado, pero que no afectan a las propiedades funcionales del polipéptido codificado, son bien conocidas en la técnica. Así, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, puede sustituirse por un codón que codifique otro residuo menos hidrófobo, como la glicina, o un residuo más hidrófobo, como la valina, la leucina o la isoleucina. Del mismo modo, también cabe esperar que los cambios que dan lugar a la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, como el ácido aspártico por el ácido glutámico, o de un residuo cargado positivamente por otro, como la lisina por la arginina, produzcan un producto funcionalmente equivalente. Tampoco se espera que los cambios nucleotídicos que alteran las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula polipeptídica alteren la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas está bien dentro de la habilidad rutinaria en el arte, al igual que la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados.
Los polipéptidos divulgados en el presente documento también pueden alterarse de varias maneras, incluyendo sustituciones de aminoácidos, deleciones, truncamientos e inserciones. Pueden crearse nuevas proteínas con propiedades de interés combinando elementos y fragmentos de proteínas de la presente invención, así como con otras proteínas. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Así, los genes y las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen tanto las secuencias que se producen de forma natural como las formas mutantes. Asimismo, las proteínas de la invención abarcan proteínas de origen natural, así como variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes seguirán poseyendo las actividades modificadas deseadas del virus de la fiebre aftosa original. Las mutaciones que se realicen en el ADN que codifica la variante no deben situar la secuencia fuera del marco de lectura y, preferentemente, no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura secundaria del ARNm.
Los procedimientos de cultivo y purificación de los antígenos adecuados para la presente invención son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitaciones, la filtración por fibra hueca y la precipitación con PEG. Estos procedimientos producen composiciones antigénicas algo diferentes. Por ejemplo, en la precipitación con PEG, la composición antigénica queda desprovista de proteínas no estructurales. En otros procedimientos, como, por ejemplo, la filtración por fibra hueca, la composición antigénica contiene proteínas estructurales y no estructurales de la fiebre aftosa. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el antígeno de la fiebre aftosa comprende proteínas estructurales. En otras realizaciones, como, por ejemplo, cuando el antígeno de la fiebre aftosa se prepara por filtración de fibra hueca, el antígeno de la fiebre aftosa comprende proteínas estructurales y no estructurales, en particular la proteína 3D.
Utilizando las plataformas de vacunas actuales, desprovistas de marcadores antigénicos intrínsecos para diferenciar los animales vacunados de los infectados, es deseable la eliminación de las proteínas no estructurales, ya que sigue siendo deseable debido al hecho de que la presencia de anticuerpos contra la proteína no estructural identifica a los animales infectados. Sin embargo, en el contexto de la plataforma FMDLL3B3D, la presencia de proteína no estructural en la preparación del antígeno no excluye la diferenciación entre animales vacunados e infectados. Es en este contexto que la presente formulación de antígeno que incluye proteínas no estructurales y adyuvante proporciona tanto protección contra la enfermedad clínica a dosis más bajas que las formulaciones de antígeno purificado como también previene más eficazmente el establecimiento de infecciones persistentes en rumiantes.
Composiciones
Las composiciones de la presente invención pueden formularse siguiendo convenciones aceptadas para incluir portadores aceptables para animales, incluidos los seres humanos, como tampones estándar, estabilizadores, diluyentes, conservantes y/o solubilizantes, y también pueden formularse para facilitar la liberación sostenida. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los aditivos para la isotonicidad incluyen cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen, entre otros, la albúmina. Otros vehículos y aditivos adecuados, incluidos los que son particularmente útiles en la formulación de vacunas vivas modificadas, son conocidos o resultarán evidentes para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Science, 18a ed., 1990, Mack Publishing que se incorpora al presente documento por referencia.
Las composiciones de la presente invención pueden comprender además uno o más componentes inmunomoduladores adicionales como, por ejemplo, un adyuvante o citoquina adicional, entre otros. Ejemplos no limitantes de tales adyuvantes adicionales que pueden utilizarse en la vacuna de la presente invención incluyen el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), adyuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero de bloque (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adyuvante AMPHIGEN® , saponina, Quil A u otra fracción de saponina, lípido monofosforil A y adyuvante lípido-amina Avridine. Otros agentes inmunomoduladores que pueden incluirse en la vacuna incluyen, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones u otras citoquinas conocidas.
Las vías de administración para las composiciones adyuvantes incluyen administración parenteral, oral, oronasal, intranasal, intratraqueal, tópica, subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular, intravenosa y lingual. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para administrar las composiciones, incluyendo jeringas, goteros, dispositivos de inyección sin aguja, parches y similares. La vía y el dispositivo seleccionados para uso dependerán de la composición del adyuvante, el antígeno y el sujeto, y son bien conocidos por el experto en la técnica.
En vista de la alta infecciosidad de la fiebre aftosa, las medidas que deben tomarse para contener y/o eliminar el brote de fiebre aftosa son controladas por las autoridades reguladoras, como, por ejemplo, los Ministerios de Agricultura nacionales y sancionadas por organizaciones internacionales como la OlE (Oficina Internacional de Epizootias). Las medidas que deben adoptarse en relación con el foco pueden incluir, sin limitaciones, la paralización de los movimientos de animales, controles eficaces de los movimientos de productos animales, incluida la leche, la carne, la piel, etc., política de sacrificio sanitario (sacrificio de los animales del rebaño afectado y, en su caso, de los de otros rebaños que hayan estado expuestos a la infección por contacto directo entre animales o por contacto indirecto con el agente patógeno). A menudo se vacuna a los animales de los rebaños vecinos y luego se sacrifican.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que ciertas composiciones inmunogénicas aquí descritas previenen la persistencia, que se define como la presencia o excreción de fiebre aftosa durante más de 28 días después de la infección. En ciertas realizaciones, dichas composiciones inmunogénicas comprenden un componente antígeno y un componente adyuvante, en el que el componente adyuvante comprende (o consiste esencialmente o consiste en) una emulsión que contiene una fase oleosa, dicha fase oleosa que comprende al menos 50 % v/v de dicha composición inmunogénica, un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende CpG en una cantidad de 75­ 200 |jg por dosis, y dietilaminoetil (DEAE) Dextrano en una cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de fiebre aftosa en una cantidad equivalente a por lo menos 6 jg de un virus inactivado de la cepa Cruzeiro de fiebre aftosa por dosis.
En ciertas realizaciones, el antígeno puede estar presente en una cantidad equivalente a 6-10 jg de un virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa por dosis, por ejemplo, 8-10 jg de un virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa por dosis. La cantidad del oligonucleótido inmunoestimulador que comprende CpG puede ser, por ejemplo, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 o 125-150 jg por dosis. El dietilaminoetil (DEAE) Dextrano puede estar presente en una cantidad de, por ejemplo, 75-100, 75-125, 75-150, 75­ 150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 o 125-150 mg por dosis.
Por lo tanto, también se divulga aquí un procedimiento para reducir la frecuencia de persistencia de la fiebre aftosa en un rumiante infectado con fiebre aftosa que comprende administrar a dicho rumiante antes de la infección las composiciones inmunogénicas que comprenden un componente antígeno y un componente adyuvante, donde el componente adyuvante comprende (o consiste esencialmente o consiste en) una emulsión que contiene una fase oleosa, dicha fase oleosa comprende al menos 50 % v/v de dicha composición inmunogénica, un oligonucleótido inmunoestimulador en una cantidad de 75-200 jg por dosis, y un polímero policatiónico en una cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de fiebre aftosa en una cantidad equivalente a por lo menos 6 jg de virus de fiebre aftosa por dosis.
En aspectos de referencia, la cantidad del antígeno puede ser equivalente a 6-20 jg de virus de la fiebre aftosa por dosis, por ejemplo, 8-20, 10-20, 12-20, 14-20, 16-20, 18-20, 6-10, 6-12, 6-18, 8-12, u 8-10 jg de virus de la fiebre aftosa por dosis. La cantidad del oligonucleótido inmunoestimulador puede ser, por ejemplo, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 o 125-150 jg por dosis. El polímero policatiónico puede estar presente en una cantidad de, por ejemplo, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 o 125-150 mg por dosis.
La administración de estas composiciones inmunogénicas a rumiantes (por ejemplo, bovinos, ovinos, camellos, etc.) permite modificar las prácticas de gestión del rebaño. En tales aspectos de referencia, los miembros vacunados del rebaño no se sacrifican tras un presunto contacto con el virus de la fiebre aftosa.
En aspectos de referencia alternativos (o adicionales), los animales vacunados se mantienen en cuarentena durante menos tiempo. Así, en ciertos aspectos de referencia, los animales sospechosos de entrar en contacto con la fiebre aftosa pueden mantenerse en cuarentena durante menos de 30 días, por ejemplo, 28 días o 29 días.
Además, la designación de un área como zona de contención implica severas limitaciones de prohibición de movimiento de animales o productos animales desde la zona de contención, generalmente, 30 días o más. Así, en ciertos aspectos de referencia, los animales sospechosos de haber entrado en contacto con la fiebre aftosa pueden ser trasladados de la zona de contención en un plazo inferior a 30 días, por ejemplo, 28 días o 29 días desde el presunto contacto con la fiebre aftosa.
En las realizaciones en las que el componente antigénico implica un antígeno de la fiebre aftosa modificado genéticamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, es posible diferenciar los animales vacunados de los infectados. Por lo tanto, en aspectos de referencia adicionales, los procedimientos de gestión del rebaño (o procedimiento de reducción de la frecuencia de persistencia de la fiebre aftosa en un rumiante infectado con fiebre aftosa).
En otras palabras, las composiciones inmunogénicas, en ciertas realizaciones que comprenden un componente antígeno y un componente adyuvante, en las que el componente adyuvante comprende (o consiste esencialmente o consiste en) una emulsión que contiene aceite, un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende CpG en la cantidad de 75-200 |jg por dosis, y dietilaminoetil (DEAE) Dextrano en la cantidad de 75-200 mg por dosis; y el componente antigénico comprende un antígeno de fiebre aftosa en una cantidad equivalente a por lo menos 6 jg de un virus inactivado de la cepa Cruzeiro de fiebre aftosa por dosis puede utilizarse para la gestión de rebaños en los que, ante la sospecha de contacto con la infección de fiebre aftosa, los miembros vacunados de dicho rebaño no son sacrificados; y/o puestos en cuarentena durante 0-30 días después del contacto sospechoso y/o trasladados fuera de las instalaciones infectadas dentro de los 30 días siguientes al contacto sospechoso.
En diferentes realizaciones, la cantidad del antígeno puede ser equivalente a 6-10 jg de un virus inactivado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa por dosis, por ejemplo, 8-10 jg de un virus incativado de la cepa Cruzeiro de la fiebre aftosa por dosis. La cantidad del oligonucleótido inmunoestimulador que comprende CpG puede ser, por ejemplo, 75­ 100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 o 125-150 jg por dosis. El dietilaminoetil (DEAE) Dextrano puede estar presente en una cantidad de, por ejemplo, 75-100, 75-125, 75-150, 75-150, 100-200, 100-150, 125-200, 125-175 o 125-150 mg por dosis.
La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación de antígenos
Se utilizaron dos procedimientos para preparar los antígenos: Filtración por fibra hueca y precipitación de PEG.
Los procedimientos de precipitación con PEG (polietilenglicol) son conocidos en la técnica. En resumen, se infectaron células BHK-21 con el virus de la fiebre aftosa. A continuación (24-36 h después), las células se lisaron por congelación-descongelación, y el lisado celular se clarificó de restos celulares por centrifugación a baja velocidad (500 x g). Se añadió PEG (8 % p/v) al sobrenadante que contenía proteínas estructurales y no estructurales. La mezcla se incubó durante 12-18 horas a 4°C. Durante esta incubación, las partículas de FMDV se asocian con el PEG. El antígeno se recuperó por centrifugación a 16,000 xg y recogida del precipitado que contenía PEG y virus. Se desechó el sobrenadante, que contenía proteínas celulares y virales no estructurales. A continuación, el sedimento, al que están unidas las partículas de virus, se lavó con pequeños volúmenes de tampón para eluir las partículas de virus de la fiebre aftosa del PEG.
Un procedimiento adicional descrito en el presente documento se basa en la concentración en fibra hueca, de sobrenadantes de cultivo de FMDV. Las etapas de este procedimiento consisten en una filtración sucesiva para eliminar primero los restos celulares y el material de gran tamaño de los cultivos (células BHK-21 infectadas con el virus de la fiebre aftosa y lisadas por congelación-descongelación). El material de cultivo se bombeó sucesivamente a través de un filtro de cápsula de 10 jm , un filtro de cápsula de 4,5 jm y, por último, a través de un filtro de 0,8 jm/0,2 jm . A continuación, este filtrado se concentró utilizando un cartucho de ultrafiltración de fibra hueca que permite el paso de partículas de tamaño inferior a 0,01 jm a través de la membrana. Las partículas del virus de la fiebre aftosa y muchas proteínas no estructurales permanecen en el circuito de la columna, mientras que el líquido y las proteínas más pequeñas atraviesan la membrana y van a parar a los residuos. El circuito de la columna se hizo funcionar hasta que el concentrado alcanzó el volumen deseado, normalmente una concentración diez veces mayor.
La Figura 1 es una transferencia Western que ilustra la diferencia de calidad entre los antígenos precipitados con PEG y los concentrados con fibra hueca. El antígeno concentrado de fibra hueca contiene grandes cantidades de proteínas estructurales y no estructurales, como se ilustra en esta figura mediante tinción por transferencia western utilizando un anticuerpo específico para la proteína 3D, las proteínas no estructurales más grandes del virus de la fiebre aftosa y un anticuerpo específico para la proteína de la cápside (proteína estructural). Por el contrario, los antígenos precipitados con PEG (carril 9) contenían proteína estructural pero no niveles detectables de proteína 3D.
Ejemplo 2. Efectos de las vacunas contra la fiebre aftosa adyuvadas con TXO
Animales y recolección de muestras
En este estudio se utilizaron novillos Holstein de seis a ocho meses con un peso de 180-230 kg. Los animales estaban libres de anticuerpos reactivos contra el virus de la fiebre aftosa, según la prueba ELISA 3D, antes de la vacunación, como se determinó posteriormente a partir de muestras de suero tomadas el día 0. Los 28 animales estaban mezclados en una sala de una instalación de experimentación animal BSL-3-Ag. Los animales fueron alimentados con pellas de ración completa o cubos de alfalfa, con agua y bloques de sal disponibles ad libitum. Los animales se aclimataron cinco días a las instalaciones antes del Día 0. Los animales fueron tratados previamente con Bovi-Shield GOLD® 5, Micotil® 300, Liquamycin®LA-200® y Dectomax®. Se asignaron a un grupo de tratamiento grupos de animales (n=4 cada uno) con números de marca auricular consecutivos.
No se documentaron acontecimientos adversos tras la vacunación.
Se recogieron tubos de sangre con separador de suero para obtener muestras de suero en los días 0 (antes de la vacunación), 4, 7, 14, 21 (antes del desafío), 24, 28, 31 y 42 de todos los animales. Las muestras de suero se mantuvieron congeladas hasta que se comprobó la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la fiebre aftosa en un ensayo de neutralización del suero (indicado como el recíproco de la última dilución de suero para neutralizar 100 TCID50 de virus de la fiebre aftosa homólogo en el 50 % de los pocillos) o para estudiar la respuesta anti-3Dpol (mediante un ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima).
Según lo recomendado por el OlE ("Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals"), el desafío del ganado vacunado para la eficacia de la vacuna fue por inoculación con aguja por la vía intradérmica lingual (IDL). A los 21 días posvacunación, todos los animales vacunados y naíve fueron inoculados IDL con 10,000 BTID50 (dosis infecciosas del 50 % de la lengua bovina) del virus de la fiebre aftosa homólogo A24 Cruzeiro dividido en 4 inoculaciones de 0,1 ml/cada una con 2,500 BTID50/0,1 ml. Todos los animales fueron seguidos durante 10 días después de la provocación para evaluar el desarrollo de la enfermedad clínica expresada por fiebre, secreción nasal, salivación, pérdida de apetito y/o cojera. La evaluación clínica de la presencia de vesículas en las pezuñas se realizó con sedación (xilacina administrada por vía IM a 0,22 mg/kg para mantener el decúbito esternal durante todo el procedimiento) el día 21 (antes de la inoculación) y los días 24, 28 y 31. El sedante se revirtió con tolazolina, IV, a una dosis de 2 mg/kg.
Vacunas
Los antígenos se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Las soluciones madre de antígeno contenían 5,51 |jg/ml de antígeno preparado por filtración de fibra hueca (Prep A) o 10,26 μg/ml de antígeno preparado por precipitación con PEG (Prep B).
Los detalles de las composiciones inmunogénicas administradas a los animales se proporcionan en la Tabla 1. Cada grupo contenía cuatro animales.
Tabla 1. Diseño del estudio
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Las composiciones inmunógenas de los grupos T02 a T06 se homogeneizaron el día de la vacunación y se administraron a los animales el Día 0.
La persistencia se midió como la presencia o ausencia de virus (ya sea ARN viral del FMDV y/o FMDV infeccioso) determinada utilizando tanto el aislamiento viral como la rRT-PCR cuantitativa. Los cebadores utilizados para la rRT-PCR cuantitativa fueron los siguientes:
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Sonda Taqman: (FAM reportero, inactivador TAMRA, SEQ ID NO: 30) TCCTTTGCACGCCGTGGGAC
Los títulos neutrslizantes en suero frente al FMDV se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2 - Títulos neutralizantes en suero
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Los signos del virus de la fiebre aftosa se puntuaron como presencia (1) o ausencia (0) de vesículas en las pezuñas, es decir, la presencia de una vesícula en una sola pezuña produjo la puntuación de 1, la presencia de vesículas en sólo 2 pezuñas produjo la puntuación de 2 y la presencia de vesículas en las 4 pezuñas produjo la puntuación de 4. Una vez que un animal recibía una puntuación de 4, se consideraba que tenía una puntuación de 4 durante todo el estudio.
Las puntuaciones de animales individuales para cada pezuña y para cada día de examen se muestran en la Tabla 3. En la Tabla 4 se presenta un resumen de las puntuaciones de cada animal en función de si alguna pezuña dio positivo.
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Tabla 4 - Puntuación de la vesícula del FMDV - Cualquier localización del casco Positiva
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Todos los animales en T01 (control negativo) exhibieron vesículas en las pezuñas a partir del Día 24. Los días 28 y 31, todas las pezuñas de todos los animales T01 presentaban vesículas. Por el contrario, se observó una protección completa (es decir, sin vesículas en las pezuñas) en todos los grupos excepto en el T03 (dosis de 2 |jg de FMDV precipitada con PEG), en el que un animal (R14-77) recibió la puntuación de 1 en los días 24, 28 y 31. Los efectos de las composiciones inmunógenas probadas sobre la infección persistente se ilustran en las Tablas 5 y 6. La peristencia se definió como la presencia de virus infecciosos o de ARN viral en el líquido esofágico-faríngeo (obtenido utilizando un vaso "Probang") después de 28 días tras la provocación (día 49 tras la vacunación, como se muestra en las tablas 5 y 6). En la Tabla 5, se muestran los resultados cuantitativos de la rRT-PCR para los animales individuales y las medias de mínimos cuadrados retrotransformadas de los grupos de tratamiento de los números de copias deARN del FMDV por mL de las muestras de probang. En la Tabla 6, los resultados de las pruebas de aislamiento del virus de la muestra probang se presentan como positivos o negativos. Los valores inferiores a 1,87 en la tabla 5 se calificaron como "negativos" debido al límite de detección del ensayo.
Tabla 5 - Probang rRT-PCR Lista individual de animales y medias de mínimos cuadrados retrotransformadas por grupo de tratamiento
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(continuación)
Figure imgf000018_0001
Tabla 6 - Aislam iento viral de muestras probang - Listado individual de animales
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(continuación)
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Para el Grupo 1 (control salino), tres animales fueron positivos al menos una vez para FMDV por rRT-PCR y dos animales fueron siempre positivos para el aislamiento del virus.
En el Grupo T02, no se encontró ningún animal portador del FMDV por rRT-PCR, pero un animal (R14-74) resultó positivo por el ensayo de aislamiento del virus en un único punto temporal (Día 42: día 21 post-desafío) pero negativo a partir de entonces (Días 49:y 52, indicando la ausencia de infección persistente. Los demás animales del T02 no eran portadores del virus de la fiebre aftosa detectable ni por rRT-PCR ni por ensayo de aislamiento viral a partir del día 38.
En el grupo T03, un animal (R14-79) estaba totalmente protegido de la infección por el virus de la fiebre aftosa, dos animales demostraron la presencia del virus de la fiebre aftosa (ya sea por rRT-PCR o por ensayo de aislamiento viral) en tres o cuatro de los días de prueba y un animal (R14-77) demostró la presencia del virus de la fiebre aftosa por ambas pruebas en los días 38 y 42, pero no posteriormente.
En el grupo T04, los cuatro animales exhibieron persistencia del FMDV por una o ambas pruebas hasta el Día 52.
En el Grupo T05, un animal (R14-62) demostró la presencia del virus sólo en el Día 38 por rRT-PCR pero no por aislamiento del virus y el virus no fue detectado por ninguna de las dos pruebas a partir de entonces. No se detectó el fmdv ni por rRT-PCR ni por ensayo de aislamiento viral en ningún momento en los otros tres animales del grupo T05.
En el Grupo T06, dos animales estaban totalmente protegidos contra la persistencia, mientras que los otros dos eran positivos a la rRT-PCR o al aislamiento del virus en cada punto temporal examinado.
En el grupo T07, tres de cuatro animales estaban totalmente protegidos, mientras que un animal (R14-71) fue positivo tanto para la rRT-PCR como para el aislamiento del virus en cada punto temporal.
La Tabla 7 resume los resultados de los experimentos de persistencia. Se consideró que los animales no eran persistentes si ni la RCP-RT ni los ensayos de aislamiento viral detectaban el virus de la fiebre aftosa tanto el día 49 (28 días después de la provocación) como el día 52 (31 días después de la provocación).
Tabla 7 Frecuencia de persistencia y no persistencia
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Sólo dos de los ocho animales a los que se administró 8 |jg de antígeno (Grupos T02 y T05) mostraron alguna vez la presencia del virus y eso fue sólo durante un día (uno cada uno en los Días 37 y 42). Los demás animales de estos grupos estaban totalmente protegidos Teniendo en cuenta que no se detectó la presencia del virus ni a los 28 ni a los 31 días de la infección, ninguno de los animales a los que se administró 8 jg de antígeno se consideró infectado de forma persistente. Cinco de los ocho animales a los que se administró 2 jg de antígeno (Grupos T03 y T06) mostraron persistencia viral. Cuatro de los ocho animales a los que se administró 0,5 jg de antígeno (Grupos T04 y T07) mostraron persistencia.
En conjunto, estos resultados indican protección frente a la persistencia viral del FMDV en animales a los que se administró 8 jg de antígeno, y también parece que la purificación del antígeno mediante filtración por fibra hueca es ventajosa en comparación con la precipitación con PEG. La principal diferencia entre las dos formulaciones de antígenos es la presencia de proteínas no estructurales además de las estructurales en la formulación de filtración de fibra hueca. Así pues, sin atarse a la teoría, parece que la calidad de la respuesta inmunitaria suscitada por las vacunas cuyo antígeno contiene proteínas estructurales y no estructurales, y en particular la proteína 3D, es más eficaz para prevenir la persistencia del virus de la fiebre aftosa, como se ilustra en la Tabla 8.
Tabla 8. Efecto del procedimiento de preparación del antígeno en la respuesta inmunitaria.
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Todas las publicaciones citadas en la memoria descriptiva, tanto las publicaciones sobre patentes como las que no lo son, son indicativas del nivel de conocimientos de los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. En el presente documento se hace referencia a todas estas publicaciones.
Aunque la invención aquí descrita se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, debe entenderse que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención que se define por las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende un componente antígeno y un componente adyuvante, en la que a) el componente adyuvante comprende una emulsión que contiene aceite, un oligonucleótido inmunoestimulador que comprende CpG, y dietilaminoetil (DEAE) Dextrano; y
b) el componente antigénico comprende 0,5 - 10 |jg de una composición de virus el de la cepa Cruzeiro de FMD (enfermedad de la fiebre aftosa) inactivada por dosis.
2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido inmunoestimulador es un oligonucleótido inmunoestimulador de clase P
3. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el oligonucleótido inmunoestimulador comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 8.
4. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el porcentaje en volumen del aceite es del 40 % al 85 % v/v de la composición.
5. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el porcentaje en volumen del aceite es del 44-50 % v/v de la composición.
6. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que comprende además uno o más emulsionantes.
7. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el componente adyuvante comprende SEQ ID NO: 8.
8. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el dextrano DEAE está presente en una cantidad de 6-200 mg por dosis y/o en la que el oligonucleótido inmunoestimulador está presente en una cantidad de 6-200 jg por dosis.
9. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha cepa Cruzeiro del virus de FMD está modificada genéticamente y contiene una deleción de la región codificante líder (LL) y, opcionalmente, contiene además una proteína de la cápside de una cepa heteróloga.
10. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha cepa Cruzeiro del virus de FMD contiene marcadores antigénicos negativos introducidos en una o ambas proteínas virales no estructurales 3Dpt° y 3B.
11. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en la que dicha cepa Cruzeiro del virus de f Md contiene una proteína de cápside heteróloga.
12. La composición inmunogénica de la reivindicación 11, en la que la cepa distinta de Cruzeiro se selecciona entre Asial, Turkey06, O1Campos, C3lndaial y A2001-Argentina.
13. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el componente antígeno comprende un 0,5 - 6 jg de virus de FMD por dosis.
14. Una composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en un procedimiento de prevención de FMD en un animal que la necesite, que comprende administrar a dicho animal la composición inmunogénica.
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