SK287468B6 - Použitie analógu autológneho Aß alebo APP polypeptidu živočícha, analóg, fragment nukleovej kyseliny, vektor, transformovaná bunka, bunková línia a kompozície - Google Patents

Použitie analógu autológneho Aß alebo APP polypeptidu živočícha, analóg, fragment nukleovej kyseliny, vektor, transformovaná bunka, bunková línia a kompozície Download PDF

Info

Publication number
SK287468B6
SK287468B6 SK1178-2002A SK11782002A SK287468B6 SK 287468 B6 SK287468 B6 SK 287468B6 SK 11782002 A SK11782002 A SK 11782002A SK 287468 B6 SK287468 B6 SK 287468B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
cell
polypeptide
epitope
nucleic acid
analog
Prior art date
Application number
SK1178-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK11782002A3 (sk
Inventor
Martin Roland Jensen
Peter Birk
Klaus Gregorius Nielsen
Original Assignee
H. Lundbeck A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by H. Lundbeck A/S filed Critical H. Lundbeck A/S
Publication of SK11782002A3 publication Critical patent/SK11782002A3/sk
Publication of SK287468B6 publication Critical patent/SK287468B6/sk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Použitie činidla zvoleného z a) analógu autológneho beta amyloidného, Abeta, alebo amyloidného prekurzorového proteínového, APP, polypeptidu živočícha, do ktorého je zavedený aspoň jeden izolovaný cudzí epitop pomocných T buniek (TH epitop) prostredníctvom inzercie, adície, delécie alebo substitúcie aminokyseliny, pričom cudzí TH epitop neobsahuje D-aminokyseliny a zavádza sa do autológneho Abeta alebo APP polypeptidu tak, ako je to schematicky znázornené pre P2 a P30 epitopy na obr. 1, b) sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej aspoň jeden analóg definovaný v odseku a) alebo c) nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu nesúceho fragment nukleovej kyseliny definovaný v odseku b) na výrobu liečiva obsahujúceho činidlo na liečenie a/alebo prevenciu, a/alebo zlepšenie Alzheimerovej choroby alebo iných chorôb alebo stavov charakterizovaných Abeta depozitmi u týchto živočíchov.

Description

Vynález sa týka zlepšení v liečbe a prevencii Alzheimerovej choroby (AD) a iných chorôb charakterizovaných depozitmi (ložiskami) amyloidu, tzn. charakterizovaných depozíciami amyloidu v centrálnom nervovom systéme (CNS). Špecifickejšie vynález poskytuje metódu „regulácie s cieľom znížiť“ (nežiaduce) depozity amyloidu produkciou protilátok proti zodpovedajúcemu proteínu alebo týmto zložkám u pacientov trpiacich alebo ohrozených chorobami s patologickým ukladaním amyloidu. Vynález tiež poskytuje metódy produkcie polypeptidov užitočných pri tomto spôsobe a modifikované polypeptidy samotné. Vynález tiež zahŕňa produkciu fragmentov nukleových kyselín kódujúcich modifikované polypeptidy a vektory začleňujúce tieto fragmenty nukleových kyselín a transformované hostiteľské bunky a línie buniek. Vynález ďalej poskytuje metódu identifikácie analógov deponovaných polypeptidov, ktoré sú užitočné podľa vynálezu a súčasne pre kompozície obsahujúce modifikované polypeptidy alebo obsahujúce nukleové kyseliny kódujúce modifikované polypeptidy.
Doterajší stav techniky
Amyloidóza je extraceluláme ukladanie nerozpustných vlákien proteínov vedúce k poškodeniu tkanív a chorobe (Pepys, 1996; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). Vlákna ako normálne tvoria rozpustné proteíny a peptidy, ale združujú sa abnormálnym spôsobom (Kelly, 1997).
Amyloid je spojený s vážnymi chorobami zahŕňajúcimi systémovú amyloidózu, AD, diabetes s nástupom v dospelosti, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu chorobu, fronto-temporálnu demenciu a s priónmi súvisiacu transmisnú spongiformnú encefalopatiu (kuru a Creutzfeldt-Jacobova choroba ľudí a skrapia a BSE oviec a dobytka). Tvorba povlakov amyloidov napríklad pri Alzheimerovej chorobe sa zdá byť úzko spojená s vývojom ľudských chorôb. Na zvieracích modeloch nadexpresie alebo expresie modifikovaných foriem proteínov nájdených v ložiskách, ako je β-amyloidový proteín, bolo ukázané, že vyvolávajú rôzne symptómy choroby, napr. symptómy podobné ako pri Alzheimerovej chorobe. V súčasnosti neexistuje špecifické ošetrenie ukladania amyloidu a tieto choroby sú zvyčajne smrteľné.
Subjednotky amyloidových vlákien môžu byť divokého typu, rôznorodé alebo skrátené proteíny a podobné vlákna sa môžu tvoriť in vitro z ologopeptidov a denaturovaných proteínov (Bradbury et al., 1960; Filshie et al., 1964 ; Búrke & Rougvie, 1972). Druh polypeptidových zložiek vlákien určuje charakter amyloidózy. Napriek veľkým rozdielom vo veľkosti, prirodzenej štruktúre a funkcii amyloidových proteínov, všetky amyloidové vlákna majú kolísavú dĺžku, sú nerozvetvené, dlhé v priemere od 70 do 120 Ä a sú viditeľné pri farbení Kongo červení (Pepys, 1996). Sú charakteristické krížovou β štruktúrou (Pauling & Corey, 1951), v ktorej je polypeptidový reťazec organizovaný v β-plátoch. Hoci majú amyloidové proteíny veľmi rôznorodú štruktúru, sú tiež schopné prejsť štrukturálnou konverziou do formy, ktorá je stavebným prvkom β-plátov špirály protofilamentov, snáď podobným spôsobom.
Tento charakteristický vzor vlákien vedie k amyloidóze, ktorá sa volá β-fibrilóza (Glenner, 1980a, b) a proteín vlákna AD bol nazvaný ako β-proteín ešte predtým, ako bola známa jeho sekundárna štruktúra (Glenner & Wong, 1984). Charakteristický krížový-β difrakčný vzor, spolu s prítomnosťou vlákien a tinktoriálnymi vlastnosťami sú v súčasnosti akceptované diagnostické charakteristické známky amyloidu a naznačujú, že vlákna, aj keď sú vytvorené z celkom odlišných proteínových prekurzorov, majú podiel na stupni štrukturálnej podobnosti a tvoria štrukturálnu superrodinu, bez ohľadu na pôvod ich prekurzorových proteínov (Sunde M., Serpell L. C, Bartlam M., Fraser P. E., Pepys M. B., Blake C. C. F. J., Mol. Biol. 1997, 31. október; 273(3): 729-739).
Jednou z najrozšírenejších a dobre známych chorôb, kde sa predpokladá, že ložiská amyloidu v centrálnom nervovom systéme hrajú hlavnú úlohu vo vývoji choroby, je Alzheimerova choroba.
Alzheimerova choroba
Alzheimerova choroba (AD) je nevratné progresívne ochorenie mozgu, ktoré sa vyvíja postupne a výsledkom je strata pamäti, zmeny správania, zmeny osobnosti a zníženie duševných schopností. Tieto straty majú vzťah na smrť mozgových buniek a na prerušenie spojenia medzi nimi. Priebeh choroby kolíše od osoby k osobe podľa rýchlosti úpadku. Pacienti trpiaci AD žijú priemerne 8 až 10 rokov od času, keď sú diagnostikovaní, aj keď choroba môže trvať viac ako 20 rokov.
AD sa vyvíja postupne, od občasnej miernej zábudlivosti k silnej strate duševných funkcií. Táto strata je známa ako demencia. Pri väčšine ľudí trpiacich AD, sa symptómy po prvý raz objavujú vo veku 60 rokov, ale časnejší nástup je tiež častý. Prvé, časné symptómy často zahŕňajú stratu súčasnej pamäti, porušené úsudky a zmeny osobnosti. Ľudia postihnutí prvotnými štádiami AD neuvažujú jasne a zabúdajú mená príslušníkov rodiny a známych miest. Neskoršie s priebehom choroby, môžu zabudnúť, ako urobiť aj jednoduché úkony. Prípadne ľudia trpiaci AD strácajú všetku schopnosť úvahy a stávajú sa závislými od druhých ľudí pri ich každodennom živote. Nakoniec v konečnom štádiu sa choroba stáva taká vyčerpávajúca, že sú pacienti pripútaní na lôžko a náchylní na vývoj iných ochorení a infekcií. Vo väčšine prípadov pacienti trpiaci AD zomierajú na zápal pľúc.
Hoci sa riziko vývoja AD zvyšuje s vekom, AD a symptómy demencie nie sú súčasťou normálneho starnutia. AD a iné duševné ochorenia sú spôsobené poruchami, ktoré ovplyvňujú mozog. Pri normálnom starnutí sa nervové bunky v mozgu nestrácajú vo veľkom počte. Naopak AD prerušuje tri kľúčové procesy: komunikáciu medzi nervovými bunkami, metabolizmus a náhrady (opravy). Toto prerušenie nakoniec spôsobuje stratu funkcie veľkého počtu nervových buniek, stratu spojenia s ostatnými nervovými bunkami a odumieranie buniek.
Spočiatku AD ničí neuróny v časti mozgu, ktorá ovláda pamäť, predovšetkým v hipokampe a pridružených štruktúrach. Súčasne, ako nervové bunky v hipokampe silne strácajú svoju funkciu, dochádza ku krátkodobým výpadkom pamäti a často sa znižuje schopnosť pacientov robiť známe veci. AD tiež atakuje kôru mozgovú, najmä oblasť zodpovednú za reč a úvahu. Nakoniec sú zasiahnuté tiež iné oblasti mozgu, všetky tieto mozgové regióny atrofujú (zrúcajú sa) a pacienti trpiaci AD sú pripútaní na lôžko, sú inkontinentní, celkom bezmocní a nereagujúci na okolie (zdroj: National Inštitúte on Aging Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
Následok AD
AD je najbežnejšia príčina demencie u ľudí vo veku 65 rokov a starších. Predstavuje hlavné ohrozenie zdravia, pretože má vážny vplyv na jednotlivcov, rodiny, zdravotnícky systém a spoločnosť ako celok. Výskumní pracovníci odhadujú, že 4 milióny ľudí súčasne trpí touto chorobou a rozšírenie sa zdvojnásobuje každých 5 rokov po veku 65 rokov. Tiež sa odhaduje, že sa objaví každý rok približne 360 000 nových prípadov (výskytu) a predpokladá sa, že tento počet porastie s rastúcim vekom populácie (Brookmayer et al., 1998).
AD kladie veľké ekonomické náklady na spoločnosť. Posledná štúdia v Spojených štátoch odhaduje, že každoročné náklady na ošetrovanie jedného pacienta sú 18 408 USD pri pacientovi s miernou formou AD, 30 096 USD pri pacientovi so strednou AD a 36 132 USD pri pacientovi so silnou AD. Ročné náklady na ošetrovanie pacientov trpiacich AD sa v USA odhaduje na mierne nad 50 miliárd dolárov (Leon et al., 1998).
Približne 4 milióny amerických občanov má 85 rokov alebo viac a vo väčšine priemyselných krajín je táto veková skupina jednou z najrýchlejšie rastúcich skupín obyvateľstva. Odhaduje sa, že táto skupina bude mať počet takmer 8,5 miliónov v roku 2030 v USA; niektorí experti, ktorí sa zaoberajú pupulačnými trendmi, predpokladajú, že tento počet môže byť dokonca aj vyšší. S tým, ako čím ďalej tým viacej ľudí žije dlhšie, sa počet ľudí postihnutých chorobami spojenými so starnutím, zahŕňajúcimi AD, zvyšuje. Napríklad niektoré štúdie ukazujú, že takmer polovina všetkých 85 ročných ľudí alebo starších trpí nejakou formou demencie (National Inštitúte on Aging Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
Hlavné charakteristiky AD ’
Abnormálne štruktúry v mozgu sú hlavné znaky AD: povlaky amyloidov a neurofibriláme zámotky (NFT). Povlaky sú husté, do značnej miery nerozpustné ložiská proteínu a bunkového materiálu zvonka a okolo mozgových neurónov. Zámotky sú nerozpustné stočené vlákna, ktoré sa vytvoria vnútri neurónov.
Existujú dva typy AD: dedičná AD (FAD), ktorá pochádza z istého typu dedičnosti a náhodná (sporadická) AD, kde nie je pozorovateľný zrejmý typ dedičnosti. S ohľadom na rozdiely vo veku pri nástupe choroby, AD sa ďalej rozdeľuje na AD s časným nástupom (vyskytujúca sa u ľudí mladších ako 65 ročných) a AD s neskorým nástupom (vyskytujúca sa u ľudí 65 ročných a starších). Skorý nástup AD je riedky (asi 10 % prípadov) a spravidla postihuje ľudí vo veku od 30 do 60 rokov. Niektoré formy AD so skorým nástupom tiež často postupujú rýchlejšie ako oveľa obvyklejšia forma s neskorým nástupom.
Všetky posiaľ známe dedičné formy AD (FAD) majú skorý nástup a viac ako o 50 percentách prípadov FAD je známe, že sú spôsobené defektmi v troch génoch umiestnených na troch rozdielnych chromozómoch. Sú to mutácie v APP géne na chromozóme 21; mutácie v géne na chromozóme 14; nazývanom ako presenilín 1; a mutácie na chromozóme 1; nazývanom ako presenilín 2. Neexistujú však dosiaľ údaje o tom, že akákoľvek mutácia hrá podstatnú úlohu v oveľa bežnejšej sporadickej alebo nededičnej forme AD s neskorým nástupom (National Inštitúte on Aging Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
Amyloidové povlaky
Pri AD sa amyloidové povlaky najskôr vyvíjajú v oblastiach mozgu, ktorá sa používa pre pamäť a iné poznávacie funkcie. Skladajú sa z prevažne nerozpustných ložísk beta amyloidu (ďalej označovaného ako Αβ) - proteínový fragment veľkého proteínu nazývaného amyloidový prekurzorový proteín (APP, sekvencia aminokyselín, z ktorých je zostavená SEQ ID NO: 2) premiešaný s časťou neurónov a s nenervovými bunkami, ako sú mikroglia a astrocysty. Nie je známe, či amyloidové povlaky samotné sú hlavnou príčinou AD alebo či sú vedľajším produktom procesov AD. Je isté, že zmeny v APP proteíne môžu spôsobiť AD, ako je ukáza né pri dedičnej forme AD spôsobenej mutáciami v APP géne a tvorba Αβ povlakov sa zdá byť úzko spojená s vývojom choroby ľudí (Lippa CF et al., 1998).
APP
APP je jeden z mnohých proteínov, ktoré sú spojené s bunkovými membránami. Potom, ako sa vytvorí, usadzuje sa APP v membráne nervovej bunky, čiastočne vnútri a čiastočne zvonka bunky. Posledné štúdie používajúce transgénne myši demonštrujú, že APP hrá dôležitú úlohu v raste a prežívaní neurónov. Napríklad určité formy a množstvá APP môžu chrániť neuróny tak proti krátkodobému, ako aj dlhodobému poškodeniu a môžu pomôcť pri oprave poškodení neurónov medzi sebou a môžu časti neurónov pomôcť v raste po zranení mozgu.
Akonáhle sa APP usadia v bunkovej membráne, proteázy pôsobia na určité miesta v APP a rozštiepujú ich na proteínové fragmenty. Jedna proteáza napomáha štiepeniu APP za vytvorenia formy Αβ a iná proteáza štiepi APP uprostred amyloidového fragmentu tak, že Αβ nemôže byť vytvorený. Vytvorený Αβ má dve odlišné dĺžky, kratší 40 (alebo 41) aminokyselinový Αβ, ktorý je relatívne rozpustný a zhlukuje sa pomaly, a trocha dlhší 42 aminokyselinový „priľnavý“ Αβ, ktorý rýchlo vytvorí nerozpustné zhŕknutia. Nie je dosiaľ presne známe, ako sa Αβ pohybuje cez alebo vôkol nervových buniek, potom čo sa vytvorí. V záverečných fázach tohto procesu sa „priľnavý“ Αβ zhrkuje do dlhých vlákien zvonka bunky a pozdĺž fragmentov mŕtvych a odumierajúcich neurónov a mykroglií a astrocytov a tvorí povlaky, ktoré sú charakteristické pre AD v tkanive mozgu.
Existujú niektoré údaje, že sú pravdepodobné mutácie v APP predtým, ako je Αβ vystrihnutý z APP prekurzoru, čo spôsobuje že sa vytvorí buď viac celkového Αβ alebo relatívne viac „priľnavej“ formy APP. Zdá sa tiež, že mutácie v presenilínových génoch môžu prispievať k degenerácii neurónov prinajmenšom dvoma spôsobmi: Modifikáciou produkcie Αβ alebo priamo spustením smrti buniek. Iní pracovníci v odbore predpovedajú, že mutované presenilíny 1 a 2 môžu byť zapojené v zrýchlení procesu apoptózy.
Očakáva sa, že ako choroba pokračuje, vytvorí sa viac a viac povlakov, ktoré vypĺňajú stále sa zväčšujúcu plochu mozgu. Štúdie predpokladajú, že je možné, že sa Αβ zhrkuje a naopak oddeľuje v rovnakom čase, v dajakom dynamickom rovnovážnom stave. To vzbudzuje nádej, že by bolo možné rozbiť povlaky potom, čo sa vytvoria (National Inštitúte on Aging Progress Report on Alzheimer's Desease, 1999).
Predpokladá sa, že Αβ je toxický pre neuróny. V štúdiách s tkanivovými kultúrami pracovníci pozorovali zvýšenie odumierania neurónových buniek hipokampu riadených k nadexpresii mutovanými formami ľudského APP v porovnaní s neurónmi nadexpresovanými normálnym ľudským APP (Luo et al., 1999).
Navyše, nadexpresia alebo expresia modifikovaných foriem Αβ proteínu demonštrovaná v zvieracom modeli vyvolala symptómy podobné Alzheimerovým (Hsiao K., et al., 1998).
Keď je dané, že zvýšená tvorba Αβ, jeho zhrkovanie do povlakov a z toho vyplývajúca neurotoxickosť môžu viesť k AD, má terapeutický význam skúmať podmienky, pri ktorých môže byť zhrkovanie Αβ do formy povlakov spomalené alebo dokonca zablokované.
Presenilíny
Mutácie v presenilíne-1 (S-180) zodpovedajú za takmer 50 % všetkých prípadov dedičnej AD so skorým nástupom (FAD). Bolo identifikovaných približne 30 mutácií, ktoré dávajú vzniknúť AD. Nástup AD sa mení podľa mutácií. Mutácie v presenilíne-2 zodpovedajú za oveľa menšiu časť prípadov FAD, ale sú stále významným faktorom. Nie je známe, či sa presenilíny podieľajú na sporadickej nededičnej AD. Funkcia presenilínov nie je známa, ale zdá sa, že sa podieľajú na spracovaní APP za vytvorenia Ap-42 (dlhšia lepivá forma peptidu, SEQ ID NO: 2, zvyšky 673-714), pretože AD pacienti s presenilínovými mutáciami majú zvýšené hladiny tohto peptidu. Nie je jasné, či presenilíny majú tiež úlohu pri tvorbe NFT. Predpokladá sa, že preseniliny by mohli tiež mať viac priamu úlohu pri degenerácii neurónov a odumieraní neurónov. Presenilín-1 je umiestnený na chromozóme 14, zatiaľ čo presenilín-2 je spojený s chromozómom 1. Keď v sebe osoba prenáša mutovanú verziu práve jedného z týchto génov, celkom iste sa pri ňom alebo pri nej vyvinie AD s časným nástupom.
Existujú niektoré neistoty v tom, či je presenilín-1 identický s hypotetickou gama-sekretázou podieľajúcou sa na tvorbe APP (Naruse et al., 1998).
Apolipoproteín E
Apolipoproteín E je zvyčajne spojený s cholesterolom, ale bol nájdený tiež v povlakoch a zámotkoch mozgu s AD. I keď sa nezdá, že by sa alely 1-3 podielali na AD existujú signifikantné korelácie medzi prítomnosťou AP0E-e4 alelami a vývojom AD s neskorším nástupom (Strittmatter et al., 1993). Ale je to rizikový faktor a nie priama príčina tak pre presenilíny, ako APP mutácie a nie je obmedzený len na dedičnú
AD.
Spôsob, akým ApoE-e4 proteín zvyšuje pravdepodobnosť vývoja AD, nie je dosiaľ s určitosťou známy, ale jedna možná teória je taká, že uľahčuje tvorbu Αβ a tak prispieva na zníženie veku pri nástupe AD alebo prítomnosť alebo neprítomnosť určitých APOE alel môže ovplyvniť spôsob, akým neuróny reagujú na poškodenie (Buttini et al., 1999).
Tiež bolo ukázané, že Apo Al môže byť amyloigénny. Celý Apo Al môže samotný vytvoriť amyloidom podobné vlákna in vitro, ktoré sú pozitívne pri farbení Kongo červeňou (Am. J. Pathol. 147(2): 238-244 (september, 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B).
Niektoré výsledky sa zdajú byť protichodné, keď naznačujú, že existuje pozitívny vplyv AP0E-e4 alely pri zvyšovaní symtómov straty duševných schopností v porovnaní s inými alelami (Stem, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
Neurofibriláme zámotky
Druhý charakteristický znak AD spočíva v abnormálnych kolekciách stočených vlákien nachádzaných vnútri nervových buniek. Hlavnou zložkou zámotkov je jedna forma proteínu, ktorá sa nazýva tau (t). V centrálnom nervovom systému sú tau proteíny najlepšie známe, s ohľadom na ich schopnosť viazať a pomáhať stabilizovať mikrotubuly, ktoré sú jedným zo stavebných prvkov vnútornej podpornej štruktúry buniek alebo skeletónu. Ale pri AD sú tau proteíny chemicky pozmenené a táto zmena nedovoluje tau proteínom stabilizovať naďalej mikrotubuly, čo potom spôsobí, že mikrotubuly strácajú súdržnosť. Toto zlyhanie transportného systému má v prvom rade za následok chybné fungovanie pri komunikácii medzi nervovými bunkami a neskoršie môže viesť k neuronálnemu odumieraniu.
Pri AD sa chemicky pozmenené tau proteíny stáčajú do párovaných špirálovitých filamentov - dve vlákna tau proteínu, ktoré sú vzájomne stočené jedno okolo druhého. Tieto filamenty tvoria hlavnú zložku nájdenú pri neurofíbrilámych zámotkoch. V jednej súčasnej štúdii zistili výskumní pracovníci neurofibriláme zmeny pri menej ako 6 % neurónov v určitej oblasti hipokampu v zdravých mozgoch, pri viac ako 43 % týchto neurónov u ľudí, ktorí zomreli na miernu formu AD a pri 71 % týchto neurónov u ľudí, ktorí zomreli na silnú formu AD. Keď bola študovaná strata neurónov, bolo pozorované podobné percentuálne zvyšovanie. Údaje tohto typu podporujú názor, že tvorba zámotkov a strata neurónov dohromady urýchľujú priebeh AD. (National Inštitúte on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Tauopatia a zámotky
Niektoré neurodegeneratívne choroby, iné ako AD, sú charakteristické agregáciou tau proteínov do nerozpustných filamentov v neurónoch a glia, čo vedie k strate funkčnosti a odumieraniu. Najnovšie našlo niekoľko skupín vedcov, ktorí študovali rodiny trpiace rôznymi dedičnými demenciami inými ako AD, prvé mutácie v tau géne na chromozóme 17 (Clark et al., 1988; Hutton et al., 1988; Poorkaj et al., 1988; Spillantiani et al., 1998). V týchto rodinách mutácie v tau géne spôsobili odumieranie nervových buniek a demenciu. Tieto poruchy, ktoré vykazujú niektoré vlastnosti ako pri AD, sa ale líšia v niektorých dôležitých ohľadoch, sa súhrnne nazývajú „fronto-temporálna demencia a parkinsonizmus spojené s chromozómom 17“ (FTDP-17). Existujú choroby, ako je Parkinsonova choroba, niektoré formy amyotrofickej laterálnej sklerózy (ALS), kortikobazálna degenerácia, progresívna supranukleáma mŕtvica a Pickova choroba, a tieto všetky choroby sú charakterizované abnormálnou agregáciou tau proteínu.
Iné neurologické choroby podobné AD
Existujú dôležité podobnosti medzi AD a inými neurologickými chorobami, zahŕňajúcimi priónové choroby (ako je kuru, Creutzfeld-Jacobova choroba a hovädzia spongiformná encefalitída), Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba a fronto-temporálna demencia. Všetky tieto choroby sa vyznačujú ložiskami abnormálnych proteínov v mozgu. AD a priónové choroby spôsobujú demenciu a smrť a pri všetkých sa tvoria nerozpustné amyloidové vlákna, ktoré sú vytvorené proteínmi, ktoré sa líšia jeden od druhého.
Vedci zaoberajúci sa Parkinsonovou chorobou, ktorá je druhým najbežnejším neurodegeneratívnym ochorením po AD, objavili prvý gén spojený s touto chorobou. Tento gén kóduje proteín nazývaný synuklein, ktorý sa netušene tiež nachádza v amyloidových povlakoch pri pacientoch trpiacich AD (Lavedan C, 1988, Génom Res. 8(9): 871-880). Vedci tiež zistili, že genetické defekty pri Huntingtonovej chorobe, ďalšom progresívnom neurodegeneratívnom ochorení, ktoré spôsobuje demenciu, spôsobuje Huntingtonov proteín, ktorý tvorí nerozpustné vlákna veľmi podobné AD vláknom pri AD a proteínovým vláknam pri priónových chorobách (Scherzinger E. et al., 1999, PNAS U.S.A. 96(8): 4604-9).
Vedci tiež objavili nový gén, ktorý, keď je mutovaný, je zodpovedný za dedičnú britskú demenciu (FBD), čo je zriedkavo sa vyskytujúce dedičné ochorenie, ktoré spôsobuje silné pohybové ťažkosti a progresívnu demenciu podobnú AD. Pri biochemických analýzach amyloidových vlákien nájdených pri FBD povlakoch, bol objavený unikátny peptid, nazývaný ABri (Vídal et al., 1999). Mutácia v určitom mieste pozdĺž tohto génu mala za následok produkciu dlhšieho Bri proteínu, ako je normálne. ABri peptid, ktorý je odstrihnutý z mutovaného konca Bri proteínu sa ukladá ako amyliodové vlákna. O týchto povlakov sa predpokladá, že vedú k neuronálnej dysfunkcii a demencii, ktorá je charakteristická pre FBD.
Imunizácia AD
Imunitný systém je normálnou súčasťou pri čistení organizmu od cudzích proteínov a proteínových častíc, ale ložiská spojené s uvedenými chorobami sú vytvorené predovšetkým vlastnými proteínmi, a preto je úloha imunitného systému v riadení týchto chorôb menej zreteľná. Ložiská sú navyše umiestnené v kompartmentoch (CNS) zvyčajne oddelených od imunitného systému. Z týchto skutočností sa dá predpokladať, že vakcinácia alebo imunoterapia by mali byť neúspešné.
Ale vedci v súčasnosti uskutočnili imunizáciu myši vakcínou zloženou z heterologného ľudského Αβ a látkou, o ktorej je známe, že podnecuje imunitný systém (Chenk et al., 1999 a WO 99/27944). Vakcína bola testovaná na čiastočne transgénnom myšom modeli AD ľudským mutovaným génom APP vloženým do DNA myši. Myši produkovali modifikovaný APP proteín a tvorili amyloidové povlaky, tak ako starli. Tento myší model bol použitý na testáciu, či má vakcinácia proti modifikovanému transgénnemu ľudskému APP vplyv na tvorbu povlakov. V prvom pokuse bola jednej skupine transgénnych myší podaná raz za mesiac injekcia vakcíny, začínalo sa v 6 týždňoch veku a končilo pri 11 mesiacoch veku myší. Druhá skupina transgénnych myší nedostala žiadne injekcie a slúžila ako kontrola. V 13 mesiacoch veku vykazovala kontrolná skupina povlaky pokrývajúce 2 až 6 % ich mozgu. Naopak imunizované myši nemali zjavne žiadne povlaky.
V druhom experimente začali vedci s injekciami v 11 mesiaci, keď sa povlaky už vytvorili. Za 7 mesiacov mali kontrolné transgénne myši 17-krát zvýšené množstvo povlakov v mozgu, zatiaľ čo myši, ktoré dostávali vakcínu vykazovali 99 % zníženie v porovnaní s 18 mesiacov starými kontrolnými transgénnymi myšami. Pri niektorých myšiach sa niektoré predtým existujúce povlakové ložiská zásluhou ošetrenia odstránili. Bolo tiež pozorované, že iné poškodenia spojené s povlakmi, ako je zápal a abnormálne procesy v nervových bunkách sa znížili ako výsledok imunizácie.
Uvedené pokusy tvoria predbežnú štúdiu na myšiach, pretože vedci potrebujú zistiť, či vakcínované myši zostávajú zdravé aj v iných ohľadoch a či vedomie myší, ktoré boli vakcínované zostáva normálne. Navyše pretože myší model netvorí kompletnú reprezentáciu AD (zvieratá nevytvárajú neurofibriláme zámotky a veľa ich nervových buniek neodumiera) budú nezbytné následné štúdie na určenie; či ľudia budú mať podobné alebo odlišné reakcie ako myši. Ďalšou vecou, ktorú je potrebné vziať do úvahy je to, že táto metóda môže snáď „liečiť“ amyloidové ukladanie, ale môže zlyhať pri zastavení vývoja demencie.
Technické aspekty musia tiež urobiť dôležitý pokrok. Napríklad je nepredstaviteľné, ale možné, použitie tejto technológie na vytvorenie vakcíny, ktorá dovoľuje ľuďom vytvoriť si protilátky proti ich vlastným proteínom. Je preto potrebné vyriešiť veľa aspektov bezpečnosti a efektivity predtým, ako bude možné uvažovať o testoch na ľuďoch.
Práca Schenka et al. ukazuje, že keď by bolo možné vyvolať silnú imunitnú reakciu proti vlastným proteínom v ložiskách (depozitoch) proteínov v centrálnom nervovom systéme, ako sú povlaky tvorené pri AD, bolo by možné zabrániť tvorbe týchto ložísk a možná tiež odstraňovať už vytvorené povlaky.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je zaistiť novú liečbu proti ochoreniam charakterizovaným ukladaním amyloidov, ako pri AD.
Ďalším cieľom vynálezu je vyvinúť autovakcínu proti amyloidom, na účely získania nového spôsobu liečenia AD a iných patologických ochorení zahŕňajúcich ukladanie amyloidov.
Tu opísané riešenie je tvorené použitím technológie autovakcinácie na účely vytvorenia silnej imunitnej reakcie proti inak neimunogénnym vlastným proteínom obsiahnutým v ložiskách (depozitoch) amyloidov, ktoré majú patologický účinok. Týmto spôsobom sa vytvorí silná imunitná reakcia buď proti amyloidom alebo jednej alebo viacerým komponentom obsiahnutým v ložiskách alebo proti jednému alebo viacerým proteínom zodpovedným za tvorbu amyloidov. Je tu tiež opísaná príprava takých vakcín na prevenciu, možnú liečbu alebo zmiernenie symptómov chorôb spojených s ukladaním amyloidov.
V širšom a všeobecnejšom zmyslu sa predkladaný vynález, vzťahuje na metódu in vivo regulácie na účely zníženia amyloidov v živočíchoch vrátane ľudí; metóda zahŕňa vykonanie zásahu do imunitného systému živočíchov pomocou imunologický efektívneho množstva - prinajmenšom jedného amyloidogenného polypeptidu alebo subsekvencie, ktoré boli vytvorené tak, aby imunizácia živočícha amyloidogénnym polypeptidom alebo subsekvenciou vyvolala tvorbu protilátok proti amyloidogénnemu polypeptidu a/alebo prinajmenšom jedného amyloidového analógu, ktorý je zavedený ako modifikácia v amyloidogénnom polypeptide, čo má za následok, že imunizácia živočícha analógom vyvolá tvorbu protilátok proti amyloidogénnemu polypeptidu.
Predmetom vynálezu je i) použitie činidla zvoleného z
a) aspoň jedného analógu autológneho β amyloidného, Αβ, alebo amyloidného prekurzorového proteínového, APP, polypeptidu živočícha, do ktorého je zavedený aspoň jeden izolovaný cudzí epitop pomocných T buniek (TH epitop) prostredníctvom inzercie, adície, delécie alebo substitúcie aminokyseliny, pričom cudzí TH epitop neobsahuje D-aminokyseliny a zavádza sa do autológneho Αβ alebo APP polypeptidu tak, ako je to schematicky znázornené pre P2 a P30 epitopy na obr. 1,
b) sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej aspoň jeden analóg definovaný v odseku a) alebo d) nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusa nesúceho fragment nukleovej kyseliny definovaný v odseku b) na výrobu liečiva obsahujúceho činidlo na liečenie a/alebo prevenciu, a/alebo zlepšenie Alzheimerovej choroby alebo iných chorôb, alebo stavov charakterizovaných Αβ depozitmi u týchto živočíchov.
Prednotné uskutočnenia tohto použitia osobitne zahŕňajú tieto aspekty:
ii) použitie podľa aspektu i), kde zavedenie aspoň jednoho izolovaného cudzieho epitopu pomocných T buniek má za následok, že sa zachová podstatný podiel epitopov Αβ alebo APP polypeptidu B-bunky a že
- sa zavedie aspoň jeden prvý zvyšok, ktorý vyvolá zameranie analógu na bunku prezentujúcu antigén (APC) alebo B-lymfocyt a/alebo
- sa zavedie aspoň jeden druhý zvyšok, ktorý stimuluje imunitný systém a/alebo
- sa zavedie aspoň jeden tretí zvyšok, ktorý optimalizuje prezentáciu analógu imunitnému systému.
iii) Použitie podľa aspektu ii), kde analóg sa modifikuje zavedením prvého a/alebo druhého, a/alebo tretieho zvyšku pripojením k vhodnej chemickej skupine v Αβ, APP polypeptidu alebo jeho subsekvencii prostredníctvom kovalentnej alebo nekovalentnej väzby.
iv) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde analóg zahrnuje duplikáciu aspoň jedného epitopu B-bunky Αβ alebo APP polypeptidu a/alebo zavedenie hapténu.
v) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde cudzí T-bunkový epitop je v živočíchovi imunodominantný.
vi) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde cudzí T-bunkový epitop je promiskuitný, ako je to u cudzieho T-bunkového epitopu zvoleného z prírodného promiskuitného T-bunkového epitopu a umelej MHC-II väzbovej peptidovej sekvencie.
vii) Použitie podľa aspektu vi), kde prírodný T-bunkový epitop je zvolený z toxoidného epitopu tetanu, ako je P2 alebo P30, toxoidného epitopu záškrtu, hemagluttininového epitopu chrípkového vírusa a CS epitopu P. falciparum.
viii) Použitie podľa niektorého z aspektov ii) až vii), kde prvý zvyšok je špecifickým väzbovým partnerom pre B-lymfocyt špecifický povrchový antigén alebo pre APC špecifický povrchový antigén, ako je haptén alebo sacharid, pre ktorý existuje receptor v B-lymfocytu alebo APC.
ix) Použitie podľa niektorého z aspektov ii) až viii), kde druhý zvyšok je zvolený z citokínu, ako je interferón gamma (IFN-gamma) alebo ich účinná časť, Flt3L alebo jeho účinná časť, interleukín 1 (IL-1) alebo jeho účinná časť, interleukín 2 (IL-2) alebo jeho účinná časť, interleukín 4 (IL-4) alebo jeho účinná časť, interleukin 6 (IL-6) alebo jeho účinná časť, interleukín 12 (IL-12) alebo jeho účinná časť, interleukín 13 (IL-13) alebo jeho účinná časť, interleukín 15 (IL-15) alebo jeho účinná časť, faktor stimulujúci granulocytmakrofágové kolónie (GM-CSF) alebo jeho účinná časť, hormón, proteín tepelného šoku, ako je HSP70 alebo jeho účinná časť, HSP90 alebo jeho účinná časť, HSC70 alebo jeho účinná časť, GRP94 alebo jeho účinná časť a kalretikulín (CRT) alebo jeho účinná časť.
x) Použitie podľa niektorého z aspektov ii) až ix), kde tretí zvyšok má lipidickú povahu, ako je palmitoylskupina, myristylskupina, famesylskupina, geranyl-geranylskupina, GPI-kotevná skupina, N-acyldiglyceridová skupina alebo kde tretím zvyškom j e polyhydroxypolymér, ako polysacharid.
xi) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde autológny Αβ alebo APP polypeptid je modifikovaný tak, aby zachoval B-bunkové epitopy, ktoré nie sú exponované extracelulámej fáze, keď sú prítomné vo forme viazanej k bunke autológneho APP.
xii) Použitie podľa aspektu xi), kde Αβ alebo APP polypeptid je modifikovaný tak, aby stratil aspoň jeden B-bunkový epitop, ktorý je exponovaný extracelulámej fáze, keď je prítomný vo forme viazanej k bunke autológneho APP polypeptidu.
xiii) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde je substituovaná aspoň jedna aminokyselinová sekvencia v autológnom Αβ alebo APP polypeptide aminokyselinovou sekvenciou s rovnakou alebo odlišnou dĺžkou vyvolávajúcou vznik cudzieho TH epitopu v analógu.
xiv) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde analóg obsahuje aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu aminokyselinám 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2, pričom je vložená aminokyselinová sekvencia vyvolávajúca vznik cudzieho TH epitopu v analógu alebo kde analóg obsahuje aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu aminokyselinám 672 až 714 v SEQ ID NO: 2, kde aspoň jedna aminokyselinová sekvencia je nahradená aminokyselinovou sekvenciou s rovnakou alebo odlišnou dĺžkou, aby pritom vznikol cudzí TH epitop.
xv) Použitie podľa niektorého z aspektov i) až xiii), kde sa analóg od N-konca k C-konci skladáz aminokyselinových zvyškov 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 4, ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 6 a ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2.
xvi) Použitie podľa niektorého z aspektov i) až xiii), kde sa analóg od N-konca ku C-konci skladá z aminokyselinových zvyškov 630 až 634 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 6, ďalej nasleduje sekvencia SEQ ID NO: 4 a ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 671 až 714 zo SEQ ID NO: 2.
xvii) Použitie podľa niektorého z aspektov i) až xiii), kde sa analóg od N-konca ku C-konci skladá z aminokyselinových zvyškov 672 až 713 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 6, ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 729 až 734 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 4 a ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 750 až 770 zo SEQ ID NO: 2.
xviii) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde sú k nosičovej molekule schopnej zaistiť prezentáciu viacerých kópií antigénnych determinantov viazané aspoň dve kópie analógu prostredníctvom kovalentnej alebo nekovalentnej väzby.
xix) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde analóg je formulovaný s adjuvantom, ktorý umožňuje zrušiť autotoleranciu proti autoantigenom.
xx) Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich aspektov, kde účinné množstvo analógu je vo forme na parenteráln, ako intrakutáne, subkutánne a intramuskuláme podanie; peritoneálne podanie; perorálne podanie; bukálne podanie; sublinguálne podanie; epidurálne podanie; spinálne podanie; análne podanie a intrakraniálne podanie.
xxi) Použitie podľa aspektu xx), kde účinné množstvo analógu predstavuje 0,5 až 2000 pg.
xxii) Použitie podľa aspektu xx) alebo xxi), kde analóg je obsiahnutý v zariadení virtuálnej lymfatickej uzliny (VLN).
xxiii) Použitie podľa niektorého z aspektov i) až xvii), kde negatívna regulácia zahrnuje zavedenie nukleovej kyseliny alebo nukleových kyselín kódujúcich analóg do buniek živočícha a tým dosiahnutie in vivo expresie tejto nukleovej kyseliny alebo týchto nukleových kyselín bunkami.
xxiv) Použitie podľa aspektu xxiii), kde nukleová kyselina alebo nukleové kyseliny sa zvolia zo súboru pozostávajúceho z prostej DNA, DNA formulovanej s nabitými alebo nenabitými lipidmi, DNA formulovanej v lipozómoch, DNA obsiahnutej vo vírusovom vektore, DNA formulovanej s proteínom alebo polypeptidom umožňujúcim transfekciu, DNA formulovanej so smerovacím proteínom alebo polypeptidom, DNA formulovanej s činidlami zrážajúcimi vápnik, DNA kopulovanej s inertnou nosičovou molekulou, DNA zapuzdrenej v chitíne alebo chitosáne a DNA formulovanej s adjuvantom.
xxv) Použitie podľa aspektu xxiv), kde nukleová kyselina alebo nukleové kyseliny sú obsiahnuté v zariadení VLN.
xxvi) Použitie podľa niektorého z aspektov xxi) až xxv) , ktoré zahrnuje aspoň jedno podanie/zavedenie za rok, ako aspoň 2, aspoň 3, aspoň 4, aspoň 6 alebo aspoň 12 podanie/zavedenie za rok.
xxvii) Použitie podľa niektorého z aspektov i) až xvii), kde liečenie a/alebo prevencia a/alebo zlepšovanie stavu zahrnuje podávanie nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu nesúceho fragment nukleovej kyseliny kódujúcej a exprimujúcej analóg.
Predmetom vynálezu je tiež xxviii) Analóg amyloidogenného polypeptidu, ktorý je odvodený od autológneho β amyloidného, Αβ, alebo amyloidného prekurzorového proteínového, APP, polypeptidu živočícha, do ktorého je zavedený aspoň jeden cudzí TH epitop, ako je to schematicky znázornené pre epitopy P2 a P30 na obr. 1, tak, aby imunizácia živočícha analógom indukovala produkciu protilátok proti amyloidogénnemu polypeptidu.
Prednostným aspektom tohto analógu je xxix) Analóg podľa aspektu xxviii), kde modifikácia je definovaná v niektorom z aspektov ii až xvii).
Predmetom vynálezu je tiež xxx) Imunogénna kompozícia, ktorá obsahuje imunogenicky účinné množstvo analógu podľa aspektu xxviii) alebo xxix), pričom kompozícia ďalej obsahuje farmaceutický a imunologický vhodný nosič a/alebo vehikulum a prípadne adjuvans.
Predmetom vynálezu je tiež xxxi) Fragment nukleovej kyseliny kódujúci analóg podľa aspektu xxviii) alebo xxix).
Predmetom vynálezu je tiež xxxii) Vektor nesúci fragment nukleovej kyseliny podľa aspektu xxxi) ako vektor, ktorý je schopný autonómnej replikácie.
Prednostné vektory osobitne zahŕňajú:
xxxiii) Vektor podľa aspektu xxxii) zvolený zo súboru pozostávajúceho z plazmidu, fágu, kozmidu, minichromozómu a vírusu.
xxxiv) Vektor podľa aspektu xxxii) alebo xxxiii) obsahujúci v smere 5' —> 3' a v operabilnom spojení promótor poháňajúci expresiu fragmentu nukleovej kyseliny podľa aspektu 31, prípadne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej vedúci peptid umožňujúci sekréciu polypeptidového fragmentu alebo jeho integráciu do membrány, fragment nukleovej kyseliny podľa aspektu 31a prípadne terminátor.
xxxv) Vektor podľa niektorého z aspektov xxxii) až xxxiv), ktorý po zavedení do hostiteľskej bunky je alebo nie je schopný sa integrovať do genómu hostiteľskej bunky.
xxxvi) Vektor podľa aspektu xxxiv) alebo xxxv), kde promotor poháňa expresiu v eukaryotickej bunke a/alebo prokaryotickej bunke.
Predmetom vynálezu je tiež xxxvii) Transformovaná bunka nesúca vektor podľa niektorého z aspektov xxxii) až xxxvi), ako transformovaná bunka, ktorá je schopná replikovať fragment nukleovej kyseliny podľa aspektu xxxi).
Prednostné uskutočnenia tejto bunky zahŕňajú xxxviii) Transformovanú bunku podľa aspektu xxxvii), ktorou je mikroorganizmus zvolený z baktérie, kvasinky, prvoka alebo bunka pochádzajúca z viacbunkového organizmu zvolená z bunky huby, bunky hmyzu, ako bunky S2 alebo SF, rastlinnej bunky a cicavčej bunky.
iii. Transformovanú bunku podľa aspektu xxxvii) alebo xxxviii) exprimujúcu fragment nukleovej kyseliny podľa aspektu xxxi), ako je transformovaná bunka, ktorá vylučuje alebo na svojom povrchu nesie analóg podľa aspektu xxviii) alebo ixxx).
Predmetom vynálezu je tiež il) Kompozícia na indukciu produkcie protilátok proti Αβ alebo APP polypeptidu v živočíchovi, kde tieto proteíny sú autológne, ktorá obsahuje fragment nukleovej kyseliny podľa aspektu xxxi) alebo vektor podľa ktoréhokoľvek z aspektov xxxii) až xxxvi)
A farmaceutický a imunologický prijateľný nosič a/alebo vehikulum, a/alebo adjuvans.
Konečne je predmetom vynálezu tiež iii) Stabilná bunková línia nesúca vektor podľa niektorého z aspektov xxxii) až xxxvi)exprimujúca fragment nukleovej kyseliny podľa aspektu xxxi), ktorá prípadne vylučuje alebo nesie na svojom povrchu analóg podľa aspektu xxviii) alebo xxix.
Prehľad obrázkov na výkrese
Na obrázku je schematické znázornenie variantov autovakcíny pochádzajúcich z amyloidovéhoprekurzorového proteínu, s účelom vyvolať tvorbu protilátok proti Αβ proteínu Αβ-43 (alebo C-100).
APP je ukázaný schematicky v hornej časti obrázku a zostávajúce schematické vyobrazenia ukazujú, že modelové epitopy P2 a P30 sú nahradené alebo inzertované do rôznych skrátení APP. Na obrázku čierny vzor označuje APP signálnu sekvenciu, obojsmerné krížne šrafovanie je extracelulárna časť APP, tmavé vertikálne šrafovanie je transmembránová doména APP, svetlé vertikálne šrafovanie je intraceluláma doména APP, hrubé krížne šrafovanie označuje P30 epitop a jemné krížne šrafovanie označuje P2 epitop. Obdĺžnik nakreslený plnou čiarou predstavuje Αβ-42/43 a obdĺžnik nakreslený plnou čiarou spolu s obdĺžnikom, nakresleným bodkovanou čiarou, predstavuje C-100. „Abeta“ označuje Αβ.
Detailný opis vynálezu
Definície
V ďalšom texte budú detailne definované a vysvetlené termíny použité v opise vynálezu a nárokoch, aby sa ujasnili ciele a hranice vynálezu.
Termíny „amyloidy“ a „amyloidový proteín“, ktoré sú použité zameniteľné, označujú triedu proteínových nerozvetvených vlákien s kolísavou dĺžkou. Amyloidové vlákna vykazujú charakteristické farbenie pri použití Kongo červene a vyznačujú sa krížovou-β štruktúrou, v ktorej je polypeptidový reťazec organizovaný v β-plátoch. Amyloid je všeobecne tvorený amyliodogénnymi proteínmi, ktoré majú veľmi rozdielnu prekurzorovú štruktúru, ktoré však všetky môžu podstúpiť štrukturálnu konverziu na formu, ktorá je stavebným prv kom β-plátových špirálovitých profilamentov. Priemer amyloidových vlákien sa bežne pohybuje medzi 70 a asi 120 Ä.
Termín „amyloidogénny proteín“ označuje polypeptid, ktorý má vzťah k formovaniu amyloidových ložísk. Je buď priamou súčasťou ložísk samotných, alebo je súčasťou biosyntetickej dráhy vedúcej k tvorbe ložísk. Príkladmi amyloidogénnych proteínov je APP alebo Αβ, ale tiež proteíny, podieľajúce sa na ich metabolizme, môžu byť amyloidogénne proteíny. Veľa amyloidogénnych polypeptidov je tu podrobne diskutovaných.
Termín „amyloidový polypeptid“ označuje polypeptidy obsahujúcesekvencie aminokyselín opísaných amyloidogénnych proteínov pochádzajúcich od ľudí alebo iných cicavcov (alebo skrátenia tvoriace podstatné množstvo B-bunkových epitopov s neporušeným amyloidogénnym proteínom) -amyliodogénny polypeptid môže preto napr. obsahovať podstatné časti prekurzora pre amyloidogénny polypeptid (v prípade Αβ môže byť odvodený od APP jeden možný amyloidový polypeptid). Tiež neglykozylované formy amyloidogénnych polypeptidov, ktoré sa pripravia v prokaryotickom systéme patria do rozsahu tohto termínu ako formy, ktoré majú meniaci sa spôsob glykozylácie napr. vplyvom použitia kvasiniek alebo iných eukaryotických expresných systémov, líšiacich sa od cicavčích. Je však potrebné poznamenať, že keď sa používa termín „amyloidogénny polypeptid“ je potrebné vziať do úvahy, že polypeptid je bežne neimunogénny, keď je poskytovaný živočíchom, ktoré majú byť ošetrené. Inými slovami, amyloidogénny polypeptid je vlastný proteín, alebo je to analóg takého vlastného proteínu, ktorý bežne neumožňuje vyvolanie imunitnej reakcie proti amyloidogenickosti živočíchov.
„Analóg amyloidogénneho polypeptidu“ je amyloidogénny polypeptid, pri ktorom boli vyvolané zmeny v jeho základnej štruktúre. Také zmeny môžu byť napr. realizované vo forme fúzie amyloidového polypeptidu na účely získania vhodného fúzneho partnera (tzn., že zmeny v základnej štruktúre predovšetkým zahŕňajú Ca/alebo N-terminálne prídavky aminokyselinových zvyškov) a/alebo môžu byť vo forme inzercií a/alebo delécií a/alebo substitúcií aminokyselinových sekvencii amyloidogénnych polypeptidov. Tento termín tiež zahŕňa odvodené amyloidogénne molekuly, ktoré budú diskutované v nasledujúcom texte pri modifikáciách amyloidogénnych polypeptidov. V prípade, že amyloidogénny polypeptid je amyloid alebo prekurzor, analóg môže byť skonštruovaný tak, aby bol menej schopný alebo dokonca neschopný vyvolať tvorbu protilátok proti normálnemu prekurzorovému proteínu (proteínom) amyloidu, a tak sa vyvarovať nežiaducej interferencii s (fyziologicky normálnou) neagregovanou formou polypeptidu, ktorý je prekurzorom amyloidového proteínu.
Je potrebné poznamenať, že si je možné predstaviť použitie xeno-anológu (napr. psieho alebo porcine analógu) ľudského amyloidogénneho polypeptidu ako vakcíny pre ľudí, na účely vyvolania žiaducej imunity proti amyloidogénnemu polypeptidu. Takéto použitie xeno-analógu na účely imunizácie tvorí tiež súčasť vynálezu.
Termín „polypeptid“ v tomto kontexte znamená ako krátke peptidy s 2 až 10 aminokyselinovými zvyškami, tak oligopeptidy s 11 až 100 aminokyselinovými zvyškami, ako tiež polypeptidy s viac ako 100 aminokyselinovými zvyškami. Navyše termín tiež zahŕňa proteíny, tzn. funkčné biomolekuly obsahujúce prinajmenšom jeden polypeptid; keď tieto molekuly obsahujú prinajmenšom dva polypeptidy, môžu byť tieto vo forme komplexov a môžu byť pripojené kovalentne alebo nekovalentne. Polypeptid(y) môže byť v proteíne glykozylovaný a/alebo lipidovaný alebo môže obsahovať prostetické skupiny.
Termíny „T-lymfocyt“ a „T-bunka“ budú používané zameniteľné pre lymfocyty týmusového pôvodu, ktoré sú zodpovedné za rôzne bunkou mediované imunitné reakcie aj za pomocnú aktivitu v humorálnej imunitnej reakcii. Termíny „B-lymfocyt“ a „B-bunka“ budú používané tiež zameniteľné pre lymfocyty produkujúce protilátky.
Termín „subsekvencia“ znamená po sebe idúci úsek prinajmenšom 3 aminokyselín alebo relevantne prinajmenšom 3 nukleotidov, pochádzajúcich priamo z prirodzene sa vyskytujúcich amyloidových aminokyselinových sekvencii alebo sekvencii nukleových kyselín.
Termín „živočích“ v tomto kontexte všeobecne označuje živočíšne druhy (prednostne cicavcov), ako je Homo sapiens, Canis domesticus, a pod. a nie iba jedného živočícha. Termín tiež označuje populáciu takých živočíšnych druhov, pretože je dôležité, že jednotlivci imunizovaní metódou podľa vynálezu v sebe nesú podstatné množstvo rovnakého amyloidogénneho polypeptidu, čo umožňuje imunizáciu živočíchov rovnakým imunogénom (imunogénmi). Keď napríklad existujú v rôznych ľudských populáciách genetické varianty amyloidogénneho polypeptidu, môže byť nevyhnuté použiť odlišné imunogény v týchto rozdielnych populáciách tak, aby bolo možné prekonať autotoleranciu proti amyloidogénnemu polypeptidu optimálnym spôsobom pri každej populácii. Odborníkom v odbore bude jasné, že živočíchom sa v tejto súvislosti rozumie žijúci živočích s imunitným systémom. Preferuje sa, keď je živočích stavovec, ako je cicavec.
Termínom „in vivo regulácia amyloidu na účely zníženia jeho obsahu“ sa v tomto texte rozumie redukcia celkového množstva uloženého amyloidu zodpovedajúceho typu v živom organizme. Regulácia na účely zníženia obsahu môže byť získaná prostredníctvom niekoľkých mechanizmov: z nich je jednoduché zasiahnutie do amyliodu väzbou na protilátku na účely zabránenia agregácii najjednoduchšie. Ale v rozsahu vynálezu je tiež to, že väzba protilátky má za následok odstránenie amyloidov odstraňujúcimi (scavenger) bunkami (ako sú makrofágy a iné fágocytické bunky) a že protilátky interferujú s inými amyloidogénnymi polypeptidmi, čo vedie na tvorbu amyloidov.
Výraz „poskytnutie (zavedenie) ....do imunitného systému“ znamená, že imunitný systém živočícha je vystavený imunogénnemu povzbudeniu kontrolovaným spôsobom. Ako bude jasné z nasledujúceho vysvetlenia, také povzbudenie imunitného systému je možné uskutočniť veľa spôsobmi, z ktorých je najdôležitejšia vakcinácia polypeptidom obsahujúcim „pharmaccines“ (tzn. vakcínu, ktorá je vytvorená tak, aby liečila alebo zlepšovala stav trvajúcich chorôb) alebo vakcinácia nukleovými kyselinami „pharmaccines“. Významným výsledkom, ktorý má byť dosiahnutý, je to, že bunky zodpovedajúce za imunitu sú v živočíchoch konfrontované s antigénom imunologický efektívnym spôsobom, zatiaľ čo presný spôsob dosiahnutia tohto výsledku má z hľadiska vynálezcovskej myšlienky vynálezu menší význam.
Termín „imunologický efektívne množstvo“ sa bežne používa v odbore a znamená množstvo imunogénu, ktoré je schopné vyvolať imunitnú reakciu, ktorá významne obmedzí patogénnemu pôvodcovi, aby sa podieľal na imunologických rysoch s imunogénom.
Keď sa použije výraz, že amyloidogénny polypeptid bol „modifikovaný“, tak sa tým rozumie chemická modifikácia polypeptidu, ktorá tvorí základnú štruktúru amyloidogénneho polypeptidu. Takou modifikáciou môže byť napr. derivatizácia (napr. alkylácia) určitých aminokyselinových zvyškov v sekvencií amyloidogénneho polypeptidu, ale ako bude zrejmé z ďalej uvedeného opisu, preferované modifikácie zahŕňajú zmeny primárnej štruktúry aminokyselinovej sekvencie.
Keď sa diskutuje výraz „autotolerancia proti amyloidogénnemu polypeptidu“, rozumie sa tým to, že pretože je amyloidogénny polypetid vlastný proteín, v populácii, ktorá má byť očkovaná, normálni jednotlivci nevytvoria imunitnú reakciu proti amyloidogénnemu polypetidu; nie je možné však vylúčiť, že náhodní jedinci v populácii živočíchov môžu byť schopní produkovať protilátky proti prirodzeným amyloidogénnym polypeptidom, napr. ako súčasť porúch autoimunity. V každom prípade budú živočíchy normálne autotolerantné proti ich vlastnému amyloidogénnemu polypeptidu, ale nie je vylúčené, že analógy pochádzajúce od iných živočíšnych druhov alebo od populácií, ktoré majú odlišný fenotyp, budú tiež týmito živočíchmi tolerované.
„Cudzí T-bunkový epitop“ (alebo „cudzí T-lymfocytový epitop“) je peptid, ktorý je schopný viazať MHC molekuly a ktorý stimuluje T-bunky živočíšnych druhov. Preferovanými cudzími T-bunkovými epitopmi podľa predkladaného vynálezu sú „promiskuitné“ epitopy, tzn. epitopy, ktoré sa viažu k podstatným frakciám určitej triedy MHC molekúl živočíšnych druhov alebo populácií. Je známy iba veľmi obmedzený počet takých promiskuitných T-bunkových epitopov a tieto budú diskutované detailnejšie ďalej. Promiskuitné T-bunkové epitopy sú označované tiež ako „univerzálne“ T-bunkové epitopy. Je však nutné poznamenať, že aby imunogény, ktoré sú použité podľa vynálezu, boli efektívne vo veľkej časti živočíšnej populácie je nevyhnutné 1) vložiť niekoľko cudzích T-bunkových epitopov do rovnakého analógu alebo 2) pripraviť niekoľko analógov, z ktorých každý analóg bude mať vložený odlišný promiskuitný epitop. Je potrebné tiež poznamenať, že koncept cudzích T-bunkových epitopov tiež zahŕňa použitie kryptických T-bunkových epitopov, tzn. epitopov, ktoré sú odvodené od vlastného proteínu a ktoré, keď existujú v izolovanej forme bez toho, aby boli súčasťou vlastného proteínu, prejavujú imunogénnu funkciu.
„Cudzí T pomocný lymfocytový epitop“ (cudzí TH epitop) je cudzí T-bunkový epitop, ktorý viaže MHC triedu II molekúl a môže byť prítomný na povrchu antigén poskytujúcich buniek (APC) viazaných k MHC triede II molekúl.
„Funkčná časť“ (bio)molekuly znamená v predkladanom vynáleze časť molekuly, ktorá je zodpovedná za prinajmenšom jeden biochemický alebo fyziologický efekt prejavujúci sa v molekule. V odbore je dobre známe, že veľa enzýmov a iných efektorových molekúl má aktívne miesta, ktoré sú zodpovedné za účinky prejavujúce sa v takých molekulách. Iné časti molekuly môžu slúžiť na účely zvýšenia stabilizácie alebo rozpustnosti a môžu preto byť vynechané, keď tieto účely nemajú v kontexte určitých aspektov vynálezu dôležitosť. Napríklad je možné použitie určitých cytokínov ako modifikujúcej časti v amyloidogénnom polypeptide (pozri detailnejšu diskusiu opísanú ďalej) a v takom prípade, môže byť stupeň stability irevelantný, pretože väzba na amyloidogénny polypeptid môže nevyhnutnú stabilitu zaistiť.
Termín „adjuvans“ je bežný termín v odbore technológií očkovania a znamená látku alebo kompozíciu látok, ktoré 1) nie sú samotné schopné vyvolať špecifickú reakciu proti imunogénu vakcíny, ale ktoré sú však 2) schopné zvýšiť imunitnú reakciu proti imunogénu. Inými slovami, očkovanie samotným adjuvansom nezaistí imunitnú reakciu proti imunogénu, očkovanie imunogénom môže alebo nemusí vyvolať imunitnú reakciu proti imunogénu, ale kombinované očkovanie imunogénom a adjuvansom vyvolá imunitnú reakciu proti imunogénu, ktorá je silnejšia ako reakcia vyvolaná samotným imunugénom.
„Zacielenie“ molekuly v tomto texte znamená situáciu, keď sa zavádzaná molekula v živočíchovi objaví prednostne v určitom pletive(ách) alebo sa prednostne spojí s istými bunkami alebo druhmi buniek. Účinok môže byť dosiahnutý viacerými spôsobmi zahŕňajúcimi formuláciu molekuly v kompozícii uľahčujúcej ža li cielenie alebo zavedenie v skupine molekúl, ktoré uľahčujú zacielenie. Tieto aspekty budú detailnejšie diskutované ďalej.
„Stimulácia imunitného systému“ znamená, že látka alebo kompozícia látok vykazuje celkový, nešpecifický imuno-stimulačný efekt. Veľa adjuvansov a domnelých adjuvansov (ako sú určité cytokíny) sa zúčastnia schopnosti stimulovať imunitný systém. Výsledkom použitia takých imunostimulačných činidiel je zvýšenie „ostražitosti“ imunitného systému, čím sa rozumie, že súčasná alebo následná imunizácia imunogénmi vyvoláva významne efektívnejšiu imunitnú reakciu v porovnaní so samotným použitím imunogénu.
Preferovaná realizácia regulácie amyloidu na účely jeho obmedzenia
Amyloidogénny polypeptid použitý ako imunogén podľa metódy podľa vynálezu je prednostne modifikovaná molekula, kde je prítomná prinajmenšom jedna zmena v aminokyselinovej sekvencii amyloidogénneho polypeptidu, pretože príležitosť získať všeobecne dôležité rozrušenie auto tolerancie proti amyloidogénnemu polypeptidu je týmto spôsobom veľmi podporená - to je napríklad evidentné z výsledkov uvedených v príklade 2, kde imunizácia divokým typom Αβ je porovnávaná s imunizáciou Αβ variantnou molekulou. Je nutné poznamenať, že použitie modifikovanej molekuly nevylučuje možnosť použitia takého modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu vo formuláciách, ktoré ďalej napomáhajú rozrušiť autotoleranciu voči amyloidgénnomu polypeptidu, napr. formulácií obsahujúcich adjuvansy.
Bolo ukázané (Dalum I. et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), že potenciálne samo-reaktívne B-lymfocyty rozpoznávajúce vlastné proteíny sú fyziologicky prítomné v normálnych jedincoch. Ale aby tieto B-lymfocyty boli povzbudené k skutočnej tvorbe protilátok reagujúcich so zodpovedajúcimi vlastnými proteínmi, je potrebná podpora od cytokiny produkujúcich T-pomocných lymfocytov (Tn-bunky alebo TH-lymfocyty). Normálne nie je táto podpora zaisťovaná, pretože T-lymfocyty všeobecne nerozpoznávajú T-bunkové epitopy pochádzajúce od vlastných proteínov prezentovaných antigén poskytujúcimi bunkami (APC). Ale zaistením prvku „cudzosti“ vo vlastnom proteíne (tzn. zavedením imunologický významnej modifikácie), sa T-bunky rozpoznávacie cudzí prvok aktivujú tak, že rozpoznajú cudzí epitop na APC (najskôr ako mononukleámu bunku). Polyklonálne B-lymfocyty (ktoré sú tiež APC) schopné rozpoznať vlastné epitopy na modifikovaných vlastných proteínoch tiež intemalizujú antigén a následne poskytujú cudzí T-bunkový epitop(y) a aktivované T-lymfocyty následne zaistia pomoc cytokínov týchto samo-reagujúcich polyklonálnych B-lymfocytov. Pretože protilátky produkované týmito polyklonálnymi B-lymfocytmi reagujú s rôznymi epitopmi modifikovaných polypeptidov, zahŕňajúcich tie, ktoré sú prítomné v prirodzených polypeptidoch, indukuje sa protilátková krížová reakcia s nemodifikovanými polypetidmi. Súhrnne, lymfocyty môžu pôsobiť tak, ako keby populácia polyklonálnych lymfocytov bola rozpoznaná celkom cudzím antigénom, zatiaľ čo v skutočnosti iba vložený epitop(y) je/sú cudzie vo vzťahu k hostiteľovi. Týmto spôsobom sa vytvoria protilátky schopné krížovej reakcie s nemodifikovanými vlastnými antigénmi.
V odbore je známych niekoľko metód modifikujúcich peptidový vlastný proteín na účely rozrušenia autotolerancie. Podľa vynálezu, modifikácie môžu zahŕňať skutočnosť, že:
je zavedený prinajmenšom jeden cudzí T-bunkový epitop a/alebo je zavedená prinajmenšom jedna prvá časť (moiety), ktorá ovplyvňuje zacielenie modifikovanej molekuly do antigén poskytujúcej bunky (APC), a/alebo je zavedená prinajmenšom jedna druhá časť, ktorá stimuluje imunitný systém, a/alebo je zavedená prinajmenšom jedna tretia časť, ktorá optimalizuje poskytnutie modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu do imunitného systému.
Ale všetky tieto modifikácie by mali byť realizované pri zachovaní podstatnej frakcie pôvodných B-lymfocytových epitopov v amyloidogénnom polypeptide, pretože B-lymfocytové rozpoznávanie prirodzenej molekuly sa tak zvýši.
V jednom prednostnom rozpracovaní, sú postranné skupiny (vo forme cudzích t-bunkových epitopov alebo uvedených prvých, druhých alebo tretích častí) kovalentne alebo nekovalentne zavádzané. To znamená, že úseky amino- kyselinových zvyškov, pochádzajúcich z amyloidogénneho polypeptidu sú derivatizované bez zmeny primárnej aminokyselinovej sekvencie, alebo prinajmenšom bez zavedenia zmien v peptidových väzbách medzi jednotlivými aminokyselinami v reťazci.
Pri alternatívnom prednostnom rozpracovaní je využitá substitúcia a/alebo delécia, a/alebo vloženie a/alebo pridanie aminokyselín (čo môže byť vykonané rekombináciou alebo prostredníctvom peptidovej syntézy; modifikácie, ktoré zahŕňajú dlhšie úseky aminokyselín môžu vyvolať íuziu polypeptidov). Jednou osobitne preferovanou verziou tohto rozpracovania je spôsob opísaný vo WO 95/05849, ktorý zahŕňa metódu znižovania obsahu vlastných proteínov imunizáciou analógmi vlastných proteínov, kde určité množstvo aminokyselín bolo substituované zodpovedajúcim počtom aminokyselinových sekvencii, ktoré každá obsahuje cudzí imunodominantný T-bunkový epitop, zatiaľ čo súčasne zostáva zachovaná celková terciáma štruktúra vlastného proteínu v analógu. Na účely vynálezu je však dostačujúce, keď modifikácia (vloženie, adícia, delécia alebo substitúcia) umožňuje rast cudzieho T-bunkového epitopu a súčasne zachováva podstatný počet B-bunkových epitopov v amyloidogénnom polypeptide. Ale na účely získania maximálnej účinnosti vyvola nej imunitnej reakcie sa prednosť venuje tomu, keď je zachovaná celková terciáma štruktúra amyloidogénneho polypeptidu v modifikovanej molekule.
Nasledujúci vzorec opisuje molekulárne konštrukty všeobecne zahrnuté vynálezom:
(MOD1)sl(amyloidei)ni(MOD2)S2(amyloide2)n2-(MODx)sx(amyloidex)nx (I), kde amyloide|-amyloidex sú x B-bunkové epitopy obsahujúce subsekvencie amyloidogénneho polypeptidu, ktoré sú nezávisle identické alebo neidentické a ktoré môžu obsahovať alebo neobsahovať cudzie postranné skupiny, x je celé číslo > 3, nl-nx sú celé čísla > 0 (prinajmenšom jedno je > 1), M0DrM0Dx sú x modifikácie vložené medzi zachované B-bunkové epitopy, a S] -sx sú x celé čísla > 0 (prinajmenšom jedno je > 1, keď nie sú vložené žiadne postranné skupiny do amyloideX sekvencii). Tak, vzhľadom na všeobecnú funkčnú kontrolu imunogenickosti konštruktov, vynález poskytuje všetky druhy permutácií pôvodnej sekvencie amyloidogénneho polypeptidu a všetky druhy ich modifikácií. Vynález zahŕňa modifikované amyloidogénne polypeptidy získané vynechaním časti sekvencie amyloidogénneho polypeptidu, ktoré napr. vykazujú silné účinky in vivo alebo vynechaním častí, ktoré sú normálne intraceluláme, a tak zvyšujú nežiaduce imunologické reakcie.
Jednou prednostnou použiteľnou verziou konštruktov, sú také konštrukty, kde B-bunkový epitop obsahujúci sekvencie amyloidového proteínu, nie je intraceluláme umiestnený v prekurzorovom polypeptide, z ktorého amyloid pochádza. Urobením takého výberu amyloidových epitopov sa zaistí, že sa nevytvoria protilátky, ktoré by reagovali s bunkami produkujúcimi amyloidový prekurzor, a tak je imunitná reakcia, ktorá je vyvolaná, obmedzená na imunitnú reakciu proti nežiaducim amyloidovým ložiskám. Podobný výber môže, keď je použiteľný, byť urobený pre iné amyloidogénne polypeptidy, ako je amyloid. V týchto prípadoch bude napríklad primerané vyvolať imunitu proti epitopom amyloidogénneho polypeptidu ktoré sú iba nekryte umiestnené do extracelulámej fázy, ktorá je bez akýchkoľvek väzieb k bunkám, z ktorých sú vytvorené.
Udržiavanie podstatnej frakcie B-bunkových epitopov alebo dokonca celkovej terciámej štruktúry proteínu, ktorý podstupuje modifikáciu a je tu opísaný, môže byť dosiahnuté rôznymi spôsobmi. Jedným jednoduchým spôsobom je príprava polyklonálneho antiséra priamo proti amyloidogénnemu polypeptidu (napr. antisérum pripravené v králikoch) a potom použitie tohto antiséra ako testačného činidla (napr. kompetitívnou ELISA) proti modifikovaným proteínom, ktoré sú produkované. Modifikované verzie (analógy), ktoré reagujú v rovnakom rozsahu s antisérom ako amyloidogénny polypeptid, majú rovnakú terciámu štruktúru ako amyloidogénny polypeptid, zatiaľ čo analógy vykazujúce obmedzenú (ale stále významnú a špecifickú) reaktivitu s takým antisérom, majú zachovanú podstatnú frakciu pôvodných B-bunkových epitopov.
Alternatívne môže byť pripravený výber monoklonálnych protilátok reagujúcich s odlišnými epitopmi na amyloidogénnom polypeptide a použitý ako testovací panel. Tento prístup má nasledujúce výhody umožňujúce 1) mapovanie epitopov amyloidogénneho polypeptidu a 2) mapovanie epitopov, ktoré sú zachované v pripravených analógoch.
Tretím prístupom by bolo rozlíšenie 3-dimenziálnej štruktúry amyloidogénneho polypeptidu alebo jeho biologicky aktívneho skrátenia (pozri hore) a porovnanie s rozlíšenou troj-dimenziálnou štruktúrou pripraveného analógu. Troj-dimineziálna štruktúra môže byť rozlíšená prostredníctvom rôntgenových difrakčných štúdií a NMR-spektroskopiou. Ďalšie informácie vzťahujúce sa na terciámu štruktúru môžu byť, na účely zaistenia užitočnosti informácie o terciámej štruktúre molekuly v určitom rozsahu, získané zo štúdií kruhového dichroizmu, ktoré majú výhodu v tom, že požadujú polypeptid iba v čistej forme (zatiaľ čo rontgenová difrakcia vyžaduje zaistenie kryštalizovaného polypeptidu a NMR vyžaduje izotopové varianty polypeptidu). Ale nakoniec sú predsa nevyhnutné rontgenová difrakcia a/alebo NMR na získanie presvedčivých údajov, pretože kruhový dichroizmus môže zaistiť iba nepriame údaje o správnosti 3-dimenziálnej štruktúry prostredníctvom informácií o elementoch sekundárnej štruktúry.
Jeden preferovaný aspekt vynálezu využíva niekoľkonásobné poskytnutie B-lymfocytových epitopov amyloidogénneho polypeptidu (vzorec (I), kde prinajmenšom jeden B-bunkový epitop je prítomný v dvoch pozíciách). Tento efekt môže byť dosiahnutý rôznym spôsobom, napr. jednoduchou prípravou fúznych polypeptidov majúcich štruktúru (amyloidogénny polypeptid)m, kde mje celé číslo > 2 a potom vložením tu diskutovaných modifikácií do prinajmenšom jednej amyloidovej sekvencie. Prednosť sa venuje tomu, keď vložené modifikácie zahŕňajú prinajmenšom jednu duplikáciu B-lymfocytového epitopu a/alebo vloženie hapténu. Tieto aspekty, ktoré zahŕňajú násobné poskytnutie vybraných epitopov, sú osobitne preferované v situáciách, kde je len malá časť amyloidogénneho polypeptidu užitočná ako stavebný prvok vakcinového činidla.
Ako bolo uvedené, zavedenie cudzieho T-bunkového epitopu môže byť sprevádzané zavedením prinajmenšom jednej aminokyselinovej inzercie, adície, delécie alebo substitúcie. Samozrejme, že normálnou situáciou bude zavedenie viac ako jednej zmeny v aminokyselinovej sekvencii (napr. inzercia alebo substitúcia úplného T-bunkového epitopu), ale dôležitý cieľ, ktorý má byť dosiahnutý, je to, že analóg, keď je spracovaný antigén poskytujúcou bunkou (APC), zvýši prítomnosť cudzieho imunodominantného T-bunkového epitopu, ktorý je prítomný v súvislosti s MCH trieda II molekulou na povrchu APC. Keď aminokyselinová sek venčia amyloidogénneho polypeptidu vo vhodnej pozícii obsahuje množstvo amynokyselinových zvyškov, ktoré je možné tiež nájsť v cudzom TH epitope, potom môže byť zavedenie cudzieho TH epitopu sprevádzané zaistením zostávajúcich aminokyselín cudzieho epitopu prostredníctvom aminokyselinovej inzercie, adície, delécie alebo substitúcie. Inými slovami, na dosiahnutie cieľa predkladaného vynálezu je nevyhnutné zaviesť kompletný TH epitop pomocou inzercie alebo substitúcie.
Prednosť má to, keď počet aminokyselinových inzercií, delécií, substitúcií a adícií je prinajmenšom 2, ako je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 inzercií, substitúcií, adícií a delécií. Ďalej sa preferuje to, keď počet aminokyselinových inzercií, substitúcií, adícií a delécií neprevýši 150, ako je najviac 100, najviac 90, najviac 80 a najviac 70. Špeciálnu prednosť má to, keď počet aminokyselinových substitúcií, inzercií, delécií a adícií nepresiahne 60 a najmä 50 alebo dokonca 40. Najprednostnejším počtom je nie viac ako 30. S ohľadom na aminokyselinové adície, je potrebné poznamenať, že tie, kde výsledný konštrukt je vo forme fúzneho polypeptidu, majú počet často značne vyšší ako 150.
Prednostný aspekt vynálezu zahŕňa modifikáciu zavedením prinajmenšom jedného cudzieho imunodominantného T-bunkového epitopu. Rozumie sa, že otázka imunitnej dominancie T-bunkového epitopu závisí od živočíšneho druhu. Tu použitý termín „imunodominancia“ sa jednoducho vzťahuje na epitopy, ktoré pri očkovanom jednotlivci/populácii vyvolajú signifikantnú imunitnú reakciu, aleje dobre známa skutočnosť, že T-bunkový epitop, ktorý je imunodominantný v jednotlivcovi/ populácii nemusí byť nevyhnutne imunodominantný v inom jednotlivcovi rovnakého druhu, i keď môže pri tomto jednotlivcovi byť schopný viazať MHC-II molekuly. Ale na účely predkladaného vynálezu je imunodominantný T-bunkový epitop taký epitop, ktorý bude efektívny pri zaistení pomoci T-bunkám, keď je prítomný v antigéne. Typicky majú imunodominantné T-bunkové epitopy vrodené charakteristické rysy, ktoré budú vždy v podstate prítomné ako viazané k MHC trieda II molekule, bez ohľadu na polypeptid, kde sa objavia.
Ďalším dôležitým bodom je problém MHC reštrikcie T-bunkových epitopov. Prirodzene sa vyskytujúce T-bunkové epitopy sú všeobecne reštrikované MHC, tzn. že určité peptidy tvoriace T-bunkový epitop sa efektívne viažu iba na sub- jednotku MHC trieda II molekúl. To má naopak ten efekt, že vo väčšine prípadov využitie jedného špecifického T-bunkového epitopu má za následok získanie zložky vakcíny, ktorá je efektívna len v časti populácie a v závislosti od veľkosti tejto časti, môže byť nevyhnutné vložiť viac T-bunkových epitopov do rovnakej molekuly, alebo alternatívne pripraviť multi-zložkovú vakcínu, kde zložkami sú varianty amyloidogénneho polypeptidu, ktoré sa jeden od druhého líšia pôvodom zavedeného T-bunkového epitopu.
Keď MHC reštrikcia použitých T-buniek je celkom neznáma (napríklad v situácii, kde očkovaný živočích má zle definované MHC zloženie), môže byť časť populácie pokrytá vakcínou so špecifickou zložkou, určenou prostredníctvom nasledujúceho vzorca n
žpooulácia ~ 1 ” Γ] Íl-Pi) (II), kde p, je frekvencia jednotlivcov v populácii, ktorí odpovedajú na aj cudzí T-bunkový epitop prítomný v zložke vakcíny a n je celkový počet cudzích T-bunkových epitopov v zložke vakcíny. Zložka vakcíny obsahujúca tri cudzie T-bunkové epitopy majúca frekvencie reakcie v populácii 0,8, 0,7 a 0,6 dá
- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976, tzn., že 97,6 percent populácie bude štatisticky vykazovať MHC-II mediovanú reakciu na vakcínu.
Uvedený vzorec nie je použiteľný v situácii, kde je známy viac alebo menej presný MHC reštrikčný vzor peptidov. Keď sa napríklad určitý peptid viaže iba na ľudské MHC-II molekuly kódované HLA-DR alelami DRI, DR3, DR5 a DR7, potom použitím tohto peptidu dohromady s iným peptidom, ktorý sa viaže na zostávajúce MHC-II molekuly kódované HLA-DR alelami bude dosiahnuté 100 % pokrytie populácie. Podobne, keď sa druhý peptid viaže iba na DR3 a DR5, pridanie tohto peptidu nezvýši vôbec pokrytie. Keď je základom kalkulácie populácia reagujúca čisto na MHC reštrikciu T-bunkových epitopov vo vakcíne, časť populácie pokrytej špeciálnou zložkou vakcíny môže byť určená prostredníctvom nasledujúceho vzorca:
.5 ^/populácia — 1 ~ Π ( 1 ~ (pj) (III), kde je suma frekvencií v populácii alelických haplotypov kódujúcich MHC molekuly, ktoré viažu akékoľvek T-bunkové epitopy vo vakcíne a ktoré patria k j troch známych HLA loci (DP, DR, DQ); prakticky je to prvý doklad, že MHC molekuly rozpoznávajú každý T-bunkový epitop vo vakcíne a potom sú podľa toho ty lá povo označené (DP, DR alebo DQ) - jednotlivé frekvencie rozdielnych uvedených alelických halotypov sú sumarizované pre každý typ, za zisku ψ\, a φ$.
Môže sa stať, že hodnota p, vo vzorci (II) presiahne zodpovedajúcu teoretickú hodnotu p,:
πΛ = 1 - Π d-Vj)2 (IV), kde Vj je suma frekvencií v populácii alelických haplotypov kódujúcich MHC molekuly, ktoré viažu i T-bunkové epitopy vo vakcíne a ktoré patria k j troch známych HLA loci (DP, DR, DQ). To znamená, že 1-pi populácie je frekvencia reagujúcich jednotlivcov fzostávajúci_i = (Pi-Pi)/(1-Pi)· Potom môže byť vzorec (III) upravený tak, že vznikne vzorec (V):
n /papulácie = 1 _ Π (1-¾) + (1 ~ Π (1 -/jcscáv«júci_ i 1 ) (V), kde termín I-#?zostávajúcej je určený ako 0, keď je negatívny. Je potrebné poznamenať, že vzorec (V) vyžaduje, aby všetky epitopy boli haplotypy mapované proti identickej sade haplotypov.
Preto, keď sa majú selektujúce T-bunkové epitopy vložiť do analógu, je dôležité vziať do úvahy všetky vedomosti o epitopoch, ktoré sú dostupné: 1) frekvenciu reagujúcich jednotlivcov v populácii na každý epitop, 2) MHC reštrikčné údaje a 3) frekvenciu relevantných haplotypov v populácii.
Existuje množstvo prirodzene sa vyskytujúcich „promiskuitných“ T-bunkových epitopov, ktoré sú aktívne vo veľkej časti jednotlivcov živočíšnych druhov alebo živočíšnych populácií a tieto sú prednostne vkladané do vakcíny, čím sa redukuje potreba veľkého počtu rozdielnych analógov v rovnakej vakcíne.
Promiskuitný epitop môže byť, v súlade s vynálezom, prirodzene sa vyskytujúci ľudský T-bunkový epitop, ako sú epitopy z tetanus toxoid (napr. P2 a P30 epitopy), diptheria toxoid, Influenza vírus hemagluttinin (HA) a P. falciparum CS antigén.
Počas rokov bolo identifikovaných veľa iných promiskuitných T-bunkových epitopov. Predovšetkým boli identifikované peptidy schopné viazať veľké časti HLA-DR molekúl kódovaných rozdielnymi HLA-DR alelami a tieto sú všetky T-bunkové epitopy schopné vloženia do analógov použiteľných podľa vynálezu. Pozri tiež epitopy diskutované v nasledujúcich odkazoch, ktoré sú takto vložené do textu vo forme referencií: WO 98/23635 (Frazer I. H. et al., zastupujúci Univerzitu z Queenslandu); Southwood S. et al., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. et al., 1988, Náture 336: 778-780; Chicz R. M. et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27-48; Hammer J. et al., 1993, Celí 74: 197-203; a Falk K. et al, 1984, Immunogenetics 39: 230-242. Neskoršie uvedené referencie sa zaoberajú tiež HLA-DQ a -DP Ugandami. Všetky epitopy uvedené v piatich referenciách sú relevantné ako kandidáty prirodzených epitopov použiteľných podľa predkladaného vynálezu, ako sú epitopy, ktoré s nimi majú spoločný všeobecný motív.
Epitop môže byť alternatívne umelý T-bunkový epitop, ktorý je schopný viazať veľkú časť MHC trieda II molekúl. V tomto kontexte pan DR epitopové peptidy („PADRE“) opísané vo WO 95/07707 a v súvisiacej práci Alexandra J. et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (obidve citácie sú začlenené do textu formou odkazu) sú zaujímavé kandidáty na epitopy použiteľné podľa predkladaného vynálezu. Je potrebné poznamenať, že najefektívnejšie PADRE peptidy objavené v týchto publikáciách nesú aminokyseliny na C- a A-konci na účely vylepšenia stability, keď sa s nimi pracuje. Ale primárnym cieľom predkladaného vynálezu je inkorporácia relevantných epitopov ako súčasť modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov, ktoré by mali byť potom následne enzymaticky rozrušené vnútri lyzozymálnych kompartmentov APC, na účely následného poskytnutia v súvislosti s MHC-II molekulou a preto nie je účelné inkorporovať D-aminokyseliny do epitopov použitých podľa vynálezu.
Jedným prednostným PADRE peptidom je peptid majúci aminokyselinovú sekvenciu AKFVAAWTLKAAA alebo imunologický efektívnu subsekvenciu. Tento a iné epitopy postrádajúce rovnakú MHC reštrikciu sú preferované T-bunkové epitopy, ktoré by mali byť prítomné v analógoch, použitých v metóde podľa vynálezu. Také super-promiskuitné epitopy by mali byť vzaté do úvahy pri najjednoduchšom aspekte vynálezu, kde je živočíšnemu imunitnému systému poskytnutý iba jeden samotný modifikovaný amyloidogénny polypeptid.
Ako je uvedené, modifikácia amyloidogénneho polypeptidu môže tiež zahŕňať zavedenie prvej časti, ktorá smeruje modifikovaný amyloidogénny polypeptid do APC alebo B-lymfocytu. Napríklad prvá časť môže byť špecificky viažuci partner pre B-lymfocytový špecifický povrchový antigén alebo pre APC špecifický povrchový antigén. Veľa takých špecifických povrchových antigénov je známych v odbore. Napríklad časťou môže byť uhľohydrát, pre ktorý existuje receptor na B-lymfocyte alebo APC (napr. manan alebo manóza). Alternatívne môže byť druhou časťou haptén. Takisto fragment protilátky, ktorý špecificky rozpoznáva po vrch molekuly na APC alebo lymfocytoch, môže byť použitý ako prvá časť (povrch molekuly môže napríklad byť FCy receptor makrofágov a monocytov, ako je FCyRI alebo alternatívne akýkoľvek špecifický povrchový marker, ako je CD40 alebo CTLA-4). Je potrebné poznamenať, že všetky tieto príkladné cielené molekuly môžu byť tiež použité ako súčasť adjuvansov, pozri ďalší text.
Ako alternatíva alebo dodatok na zacielenie modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu do určitých typov buniek na účely dosiahnutia zvýšenej imunitnej reakcie, je možné zvýšiť hladinu citlivosti imunitného systému vložením uvedených druhých častí, ktoré stimulujú imunitný systém. Typickým príkladom takých druhých častí sú cytokiny a tepelne spracované (heat-shock) proteíny alebo molekulárne chaperóny, rovnako ako ich efektívne časti.
Vhodné cytokiny, ktoré je možné použiť podľa vynálezu, sú tie cytokiny, ktoré tiež vo vakcíne normálne fungujú ako adjuvansy, ako je napr. interferón γ (IFN-γ), interleukín 1 (IL-1), interleukín 2 (IL-2), interleukín 4 (IL-4), interleukín 6 (IL-6), interleukín 12 (IL-12), interleukín 13 (IL-13), interleukín 15 (IL-15) a granulocytový-makrofágový kolónie stimulujúci faktor (GM-CSF); alternatívne môže funkčná časť cytokínovej molekuly postačovať ako druhá časť. S ohľadom na použitie takých cytokínov ako adjuvansovej zložky pozri diskusiu uvedenú ďalej.
Podľa vynálezu môžu byť ako druhé časti použité vhodné tepelne spracované proteíny alebo molekulárne chaperóny, ako je HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (tiež známy ako gp96, pozri Wearsch P.A et al., 1998, Biochemistry 37: 5709-19) a CRT (calreticulin).
Alternatívne môže byť druhou časťou toxín, ako je listeriolycin (LLO), lipid A a teplotné labilný enterotoxín. Zaujímavými možnosťami je tiež veľa mykobakteriálnych derivátov, ako je MDP (muramyl dipeptid), CFÄ (kompletný Freundov adjuvans) a diestery trehalózy TDN a TDE.
Tiež možnosť zavedenie tretej časti, ktorá zvyšuje poskytnutie modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu imunitnému systému, je dôležitá súčasť vynálezu. V odbore je známych niekoľko príkladov tohto princípu. Napríklad je známe, že palmitoylová lipidačná kotva v proteíne OspA Borrelia burgdorferi môže byť použitá na účely zaistenia samo-adjuvácie polypeptidov (pozri napr. WO 96/40718) - zdá sa, že lipidované proteíny tvorené štruktúrami podobnými micelám s vrstvou skladajúcou sa z častí lipidačných kotiev polypeptidov a zvyšných častí molekuly z toho vyčnievajúcich majú za následok násobné poskytnutia antigénnych determinantov. Preto použitie takéhoto spôsobu a jemu podobných prístupov využívajúcich rôzne lipidačné kotvy (napr. myristylové skupiny, famezylové skupiny, geranyl-geranyl skupiny, GPI-kotva a N-acyl diglyceridové skupiny) tvoria prednostný aspekt vynálezu, predovšetkým pretože zaistenie takej lipidačnej kotvy v rekombinantné vytvorenom proteíne je dosť priamočiare a vyžaduje len použitie napr. prirodzene sa vyskytujúcich signálnych sekvencií ako fuznych partnerov pre modifikovaný amyloidogénny polypeptid. Ďalšou možnosťou je použitie C3d fragmentu doplnkového faktoru C3 alebo C3 samotného (pozri Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 a Lou & Kohler, 1998, Náture Biotechnology 16, 458-462).
Alternatívnym znakom vynálezu, ktorý má tiež podstatu v preferovanom poskytnutí násobných (napr. prinajmenšom dvoch) kópií dôležitých epitopových regiónov amyloidogénneho polypeptidu imunitnému systému, je kovalentná párovanie amyloidogénneho polypeptidu, subsekvencií variantov do určitých molekúl. Napríklad môžu byť použité polyméry, napr. uhľohydráty, ako je dextrán, pozri napr. Lees A. et al., 1994 , Vaccine 12: 1160-1166; Lees A. et al., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ale ako alternatíva sú užitočné tiež manóza a manan. Integrálne membránové proteíny z napr. E. coli a iných baktérií sú tiež užitočný partneri konjugácie. Tradičné nosičové molekuly, ako je prílipkový hemokyanín (KLH), tetanus toxoid, diptheria toxoid a hovädzí sérový albumín (BSA) majú tiež prednosť ako užitočný partneri konjugácie.
Prednostné znaky kovalentného párovania amyloidogénneho polypeptidu do polyhydroxypolymérov, ako sú uhľohydráty zahŕňajú použitie prinajmenšom jedného amyloidogénneho polypeptidu a prinajmenšom jedného cudzieho T-pomocného epitopu, ktoré sa párujú oddelene do polyhydroxypolyméru (tzn. cudzí T-pomocný epitop a amyloidogénny polypeptid nie sú fúzované jeden na druhý ale skôr viazané do polyhydroxypolyméru, ktorý potom slúži ako nosičová kostra). Prednosť má taký znak, kde sú vhodné B-bunkové epitopy nesúce regióny amyloidogénneho polypeptidu tvorené krátkymi peptidovými úsekmi - tento prístup je jedným veľmi vhodným spôsobom na dosiahnutie násobného poskytnutia vybraných epitopov vzniknutého imunogénneho činidla.
Osobitnú prednosť má párovanie cudzieho T-pomocného epitopu a amyloidogénneho (poly)peptidu prostredníctvom amidovej väzby, ktorá môže byť rozštiepená peptidázou. Táto stratégia má ten účinok, že APC budú schopné konjugácie a v rovnakom čase budú schopné procesu konjugácie a následne poskytnú cudzí T-bunkový epitop v súvislosti s MHC trieda II.
Jedným spôsobom dosiahnutia párovania peptidov (amyloidogénneho polypeptidu a cudzieho epitopu) je aktivovať vhodný polyhydroxypolymér trezyl skupinami; tak je napríklad možné pripraviť trezylované polysacharidy, ako je opísané vo WO 00/05316 a US 5 874 469 (obidve citácie sú vložené do textu formou odkazu) a párovať ich do amyloidogénnych peptidov a T-bunkových epitopov pripravených prostredníctvom obvyklých pevných alebo tekutých fáz podľa metód syntézy peptidov. Výsledný produkt sa skladá z polyhydroxypolymérovej kostry (napr. dextránovej kostry) ktorá má, pripojené ich N-koncami alebo inou dostupnou dusíkovou časťou, amyloidogénne polypeptidy a cudzie T-bunkové epitopy. Keď je to požadované, je možné syntetizovať amyloidogénne polypeptidy rovnako ako chrániť všetky dostupné aminoskupiny, ale iba jednu v N-konci, následne párovať získané chránené peptidy do trezylovanej dextránovej časti a konečne odstrániť chránenie výsledného konjugátu. Špecifický príklad tohto spôsobuje opísaný v ďalej uvedených príkladoch.
Namiesto použitia vo vode rozpustných polysacharidových molekúl, ako sa uvádza vo WO 00/05316 a US 5 874 469, je rovnako možné využiť zosietené polysacharidové molekuly, čím sa získa partikulámy konjugát medzi polypeptidmi a polysacharidom - predpokladá sa, že to vedie k vylepšeniu poskytnutia polypeptidov imunitnému systému, pretože sa dosiahnu dva ciele, predovšetkým získanie efektu miestneho uloženia, keď sa konjugát injektuje, a získanie častíc, ktoré sú príťažlivé ciele pre APC. Spôsob využitia takých partikulárnych systémov je tiež podrobne opísaný v príkladoch.
Podklady tvoriace základ vybraných oblastí zavedenia modifikácií do amyloidogénnych polypeptidov sú a) zachovanie známych a predpokladaných B-bunkových epitopov, b) zachovanie terciámej štruktúry, c) vyvarovanie sa B-bunkových epitopov prítomných na „produkčnej bunke“ a pod. V akomkoľvek rozsahu, ako je diskutované, je celkom ľahké testovať sadu modifikovaných amyloidogénnych molekúl, ktoré všetky boli podrobené vloženiu T-bunkového epitopu v rôznych miestach.
Pretože najviac preferovaný znak predkladaného vynálezu zahŕňa reguláciu s cieľom obmedzenia ľudského Αβ, má následne prednosť to, že diskutovaný amyloidový polypeptid je ľudský Abb polypeptid. V tomto aspekte sa osobitne preferuje fakt, že ľudský amyloidogénny polypeptid bol modifikovaný substitúciou prinajmenšom jednej aminokyselinovej sekvencie v SEQ ID NO: 2 spolu s prinajmenšom jednou aminokyselinovou sekvenciou s rovnakou alebo rozdielnou dĺžkou a obsahujúcou cudzí Th epitop. Preferované príklady modifikovaných amyloidogénnych APP a Αβ sú zobrazené schematicky na obr. 1, kde sú P2 a P30 epitopy použité ako príklady. Dôvody použitia takých konštruktov sú diskutované podrobne v príkladoch.
Špecifickejšie TH obsahujúca (alebo dokončujúca) aminokyselinová sekvencia, ktorá je vložená do SEQ ID NO: 2 môže byť vložená do akejkoľvek aminokyseliny v SEQ ID NO: 2. To znamená, že vloženie je možné za akoukoľvek aminokyselinou 1-770, ale najlepšie za akoukoľvek aminokyselinou 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 a 714 v SEQ ID NO: 2. To môže byť kombinované s odstránením akejkoľvek alebo všetkých aminokyselín 1-671, alebo akoukoľvek zo všetkých aminokyselín 715-770. Navyše, keď sa použije metóda substitúcie, akákoľvek z aminokyselín 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 a 714 v SEQ ID NO: 2 môže byť odstránená v kombinácii s vložením.
Formulácia amyloidogénneho polypeptidu a modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov
Na účely zavedenia amyloidogénneho polypeptidu alebo modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu do živočíšneho imunitného systému, prostredníctvom ich podania živočíchom, bude použitá príprava polypeptidov, ktorá sleduje princípy všeobecne známe v odbore.
Príprava vakcín, ktoré obsahujú peptidové sekvencie ako aktívnu zložku, je všeobecne dobre známa z literatúry, a je vysvetlená v US patentoch4 608 251; 4 601 903; 4 599 231; 4 599 230; 4 596 792; a 4 578 770, všetky tieto patenty sú začlenené do textu formou odkazu. Typicky sa také vakcíny pripravujú ako injektovateľné, buď ako tekuté roztoky, alebo suspenzie; pevné formy vhodné na rozpustenie alebo suspendovanie a môže byť tiež pripravená kvapalina pre injekcie. Preparáty môžu tiež byť emulgované. Aktívna imunogénna zložka je často miešaná s excipientmi, ktoré sú farmaceutický prijateľné a zlúčiteľné s aktívnou zložkou. Vhodnými excipientmi sú napríklad voda, roztok soli, dextróza, glycerol, etanol, a pod. a ich kombinácie. Navyše, keď je to požadované, môže vakcína obsahovať malé množstvo pomocných látok, ako sú zvhlčovacie alebo emulgujúce činidlá, pH upravujúce činidlá, alebo adjuvansy, ktoré zvyšujú efektívnosť vakcíny; pozri podrobnú diskusiu adjuvansov uvedenú ďalej.
Vakcíny sa bežne podávajú perenterálne, napríklad injekciou, buď subkutánne, intrakutánne, intradermálne, subdermálne, alebo intramuskuláme. Prídavné formulácie, ktoré sú vhodné pri iných spôsoboch podania zahŕňajú čapíky a v niektorých prípadoch, orálne, bukálne, sublinguálne, intraperitoneálne, intravaginálne, análne, epidurálne, spinálne a intrakraniálne formulácie. Pri čapíkoch, tradičné viažuce látky a nosiče môžu zahŕňať napríklad polyalkánové glykoly alebo triglyceridy; také čapíky môžu byť pripravené zo zmesi obsahujúcej aktívnu zložku v rozmedzí od 0,5 % do 10 %, predovšetkým 1 - 2 %. Orálne formulácie zahŕňajú bežne rozšírené excipienty, ako sú napríklad manitol, laktóza, škrob, magnéziumstearát, sódiumsacharín, celulóza, uhličitan horečnatý a pod. vo farmaceutickom stupni čistoty. Tieto kompozície majú formu roztokov, suspenzii, tabliet, piluliek, kapsúl, formulácii s trvalým uvoľňovaním alebo púdrov a obsahujú 10 - 95 % aktívnej zložky a prednostne 25 - 70 % aktívnej zložky. Pri orálnych formuláciách je zaujímavým partnerom vo formulácii cholerový toxín (a tiež prípadný konjugačný partner).
Polypeptidy môžu byť formulované do vakcín v neutrálnej alebo soľnej forme. Farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú adičné soli kyselín (tvorené voľnými aminoskupinami peptidov) a sú tvorené anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková alebo kyselina fosforečná alebo organickými kyselinami, ako je kyselina octová, kyselina oxalová, kyselina vínna, kyselina mandľová a pod. Soli vytvorené voľnými karboxylovými skupinami môžu byť tiež odvodené z anorganických báz, ako je napríklad sodík, draslík, amónium, vápnik, hydroxidy železa a takých organických báz, ako je izopropylamín, trimetylamín, 2-etylaminoetanol, histidín, prokaín a pod.
Vakcíny sa podávajú spôsobom kompatibilným s dávkovou formou a v množstve, ktoré bude terapeuticky účinné a imunogénne. Podávané množstvo závisí od jednotlivca, ktorý má byť ošetrený, od kapacity individuálneho imunitného systému na vyvolanie imunitnej reakcie a stupňa požadovanej ochrany. Vhodné rozmedzie dávkovania je od niekoľkých stoviek mikrogramov aktívnej zložky na vakcínu s preferovaným rozmedzím 0,1 pg do 2000 pg (i keď sa môžu očakávať tiež vyššie množstvá v rozmedzí 1-10 mg), ako je rozmedzie od 0,5 pg do 1000 pg, predovšetkým rozmedzie 1 pg až 500 pg a osobitne prednostne rozmedzie od asi 10 pg do 100 pg. Vhodné režimy úvodného podania a posilňovacích injekcií sú tiež variabilné, ale typizované úvodným podaním nasledovaným ďalším očkovaním alebo iným podaním.
Spôsob aplikácie sa môže značne líšiť. Akákoľvek konvenčná metóda podania vakcíny je možná. Metódy zahŕňajú orálnu aplikáciu na pevnej fyziologicky prijateľnej báze alebo vo fyziologicky prijateľnej disperzii, parenterálne, injekciou a pod. Dávkovanie vakcíny bude závisieť od spôsobu podania a bude sa meniť v závislosti od veku osoby, ktorá má byť očkovaná a formulácie antigénu.
Niektoré z polypeptidov vo vakcíne sú dostatočne imunogénne, ale pri niektorých iných bude imunitná reakcia zvýšená, keď bude vakcína navyše obsahovať prídavnú látku (adjuvans).
Sú známe rôzne metódy na dosiahnutie adjuvansového efektu pri vakcínach. Všeobecné princípy a metódy sú podrobne uvedené v „The Theory and Practical Application of Adjuvants“ 1995, Duncan E. S. StewartTull (ed.) John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, a tiež v „Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants“, 1995, Gregoriadis G. et al. (eds.) Plénum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obidve citácie sú do textu vložené formou odkazu.
Osobitne preferované je použitie adjuvansu, o ktorom je možné preukázať, že napomáha rozrušeniu autotolerancie k autoantigénom; to je v skutočnosti podstatné v prípadoch, kde je nemodifikovaný amyloidogénny polypeptid použitý ako aktívna zložka autovakcíny. Nelimitujúce príklady vhodných adjuvansov sú vybrané zo skupiny skladajúcej sa imunitného cieleného adjuvansu; imunitného modulujúceho adjuvansu ako je toxín, cytokín a mykobakteriálny derivát; olejová formulácia; polymér; micely tvoriace adjuvans; saponin; imunostimulujúca komplexná matrica (ISCOM matrix); častice; DDA; hliníkové adjuvansy; DNA adjuvansy; yyy-inulin; a zapuzdrovaci adjuvans. Všeobecne je potrebné poznamenať, že uvedené látky majú vzťah k zlúčeninám a činidlám užitočným ako prvá, druhá a tretia zložka v analógoch a tiež sa týkajú mutatis mutandis ich použitia v adjuvansoch vo vakcíne podľa vynálezu.
Aplikácia adjuvansov zahŕňa použitie činidiel, ako je hydroxid hlinitý alebo fosforečnan hlinitý (alum) bežne ako 0,05 až 0,1% roztok v pufrovanom soľnom roztoku, prímes so syntetickými polymérmi cukru (napr. Carbopol®) použitá ako 0,25 % roztok, tiež možná je agregácia proteínu vo vakcíne tepelným ošetrením pri teplote pohybujúcej sa v rozmedzí od 70 °C do 101 °C počas 30 sekúnd až 2 minút a tiež agregácia prostredníctvom zosietených činidiel. Agregácia reaktiváciou pepsínom ošetrených protilátok (Fab fragmenty) k albumínu, zmiešanie s bakteriálnymi bunkami, ako je C. parvum alebo endotoxínmi alebo lypopolysacharidovými komponentmi gram-negatívnych baktérií, emulgácia vo fyziologicky prijateľných olejových spojivách, ako je manid mono-oleát (Aracel A) alebo emulgácia s 20 % roztokom perfluórkarbónu (FluosolDA) , použité ako bloková náhrada, môžu byť tiež využiteľné. Prednosť má tiež prímes s olejom, ako je squalen a IFA.
DDA (dimetyldioktadecylamónium bromid) je tiež zaujímavý kandidát na adjuvans podľa vynálezu, DNA a yyy-inulin, ale tiež Freundov kompletný a nekompletný adjuvans rovnako ako quillaja saponiny ako je QuilA a QS21 a RIBI sú takisto zaujímavé. Ďalšou možnosťou sú monofosforyl lipid A (MPL), uvedené C3 a C3d a muramyl dipeptid (MDP).
O lipozómových formuláciách je tiež známe, že udeľujú adjuvansom účinnosť, a preto sú lipozómové adjuvansy tiež v spôsoboch podľa vynálezu preferované.
Tiež imunostimulujúce komplexné matricové typy (ISCOM® matrix) adjuvansov sú podľa vynálezu preferované, predovšetkým preto, že bolo ukázané, že tento typ adjuvansov je schopný regulácie MHC trieda II expresie pri APC. ISCOM® matrica sa skladá z (príležitostne frakcionovaných) saponínov (triterpenoidov) z Quillaja saponaria, cholesterolu a fosfolipidu. Keď je primiešaná k imunogénnemu proteínu, vzniká špecifická formulácia, ktorá je známa ako ISCOM častica, kde saponin zaujíma 60 - 70 % hmotn./hmotn., cholesterol a fosfolipid 10 - 15 % hmotn./hmotn. a proteín 10-15 % hmotn./hmotn. Podrobnosti vzťahujúce sa na kompozície a využitie imunostimulujúcich komplexov je možné napr. nájsť v citovanej knihe zaoberajúcej adjuvansami, ale tiež v Morein B. et al., 1995, Clin. Imunother. 3: 461-475 ako tiež v Barr I. G. a Mitchell G. F, 1996, Imunol. And Celí Biol. 74: 8-25 (obidve citácie sú do textu vložené formou odkazu). Táto literatúra poskytuje užitočné inštrukcie na prípravu úplných imunostimulujúcich komplexov.
Ďalšou vysoko zaujímavou (a preto preferovanou) možnosťou dosiahnutia adjuvansového účinkuje využitie techniky opísanej v Gosselin et al., 1992 (citácia je do textu vložená formou odkazu). V stručnosti, poskytnutie relevantného antigénu, ako je antigén podľa predkladaného vynálezu, môže byť dosiahnuté konjugáciou antigénu do protilátok (alebo antigén viažucich protilátkových fragmentov) proti Fcy receptorom na monocytoch/makrofágoch. Osobitne na účely očkovania bolo o konjugátoch medzi antigénom a anti-FCyRI preukázané, že zvyšujú imunogenickosť.
Ďalšie možnosti zahŕňajú využitie cielených a imuno-modulujúcich látok (tzn. cytokínov) uvedených hore ako kandidátov pre prvú a druhú časť v modifikovaných verziách amyloidogénnych polypeptidov. V tejto súvislosti je tiež možné použitie syntetických zavádzačov cytokínov ako je poly I:C.
Vhodné mykobakteriálne deriváty sú vybrané zo skupiny skladajúcej sa z muramyl dipeptidu, kompletného Freudovho adjuvansu, RIBI a diesterov trehalózy, ako je TDM a TDE.
Vhodné imunitné cielené adjuvansy sú vybrané zo skupiny skladajúcej sa z CD40 Ugandy a CD40 protilátok alebo špecificky viažucich fragmentov (pozri ďalej uvedenú diskusiu) manózy, Fab fragmentov a CTLA-4.
Vhodné polymérové adjuvansy sú vybrané zo skupiny skladajúcej sa z uhľohydrátov ako je dextrán, PEG, škrob, manan a manóza; plastických polymérov, ako je latex vo forme latexových gulôčok.
Ešte ďalším zaujímavým spôsobom modulácie imunitnej reakcie je zahrnutie imunogénu (pripadne spolu s adjuvansom a farmaceutický prijateľným nosičom a vehikulom) do „virtuálnej lymfatickej uzliny“ (VLN) (medicínske zariadenie vo vlastníctve firmy ImunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, N Y 10017-6501). VLN (tenké rúrkovité zariadenie) napodobňuje štruktúru a funkciu lymfatickej uzliny. Vloženie VLN pod kožu vytvára miesta sterilného zápalu so vzostupom cytokínov a chemokínov. T- a B-bunky ako tiež APC rýchlo reagujú na signály nebezpečenstva, usadzujú sa v mieste zápalu a akumulujú vnútri poréznej matrice VLN. Bolo ukázané, že nevyhnutná dávka antigénu požadovaná na vyvolanie imunitnej reakcie na antigén je znížená, keď sa použije VLN a že imunitná ochrana udelená očkovaním používajúcim VLN prekonáva bežnú imunizáciu používajúcu RiBi ako adjuvans. Technológia je opísaná v krátkosti v Gelbar C. et al., 1998 „Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node“ v: „From the Laboratory to the Clinc, kniha abstraktov, 12-15 október, 1998, Seascape Resort, Aptos, Califomia“.
O mikročasticovej formulácii vakcín bolo v mnohých prípadoch ukázané, že zvyšuje imunogenickosť proteínových antigénov a je preto ďalším preferovaným znakom vynálezu. Mikročastice sú vyrobené buď ako ko-formulácia antigénu s polymérom, lipidom, uhľohydrátom alebo inými molekulami vhodnými na výrobu častíc alebo môžu mikročastice byť homogénne častice skladajúce sa zo samotného antigénu.
Príkladmi na polyméri založených mikročastíc sú na PLGA a PVP založené častice (Gupta, R. K. et al. 1998), kde polymér a antigén sú kondenzované do pevných častíc. Častice založené na lipidoch môžu byť vyrobené ako micely lipidu (tzv. lipozómy) zachytávajúce antigén vnútri micely (Pietrobon, P. J. 1995). Častice založené na uhľohydrátoch sú typicky vyrobené z vhodného rozložiteľného uhľohydrátu, ako je škrob alebo chitosan. Uhľohydrát a antigén sú zmiešané a kondenzované do častíc v procese podobnom procesu použitému pre polymérové častice (Kas, H. S. et al., 1997).
Častice skladajúce sa iba z antigénu môžu byť vyrobené rôznymi postrekovacími a vymrazovacími technológiami. Osobitne vyhovujúcim spôsobom výroby na účely vynálezu je super kritická fluidná technológia, ktorá sa používa na výrobu vysoko jednotných častíc s kontrolovanou veľkosťou (York, P. 1999 & Shekunov, B. et al., 1999).
Očakáva sa, že vakcína bude podávaná 1- až 6-krát za rok, ako je 1-, 2-, 3-, 4-, 5- alebo 6-krát za rok jednotlivcom, ktorí to potrebujú. V predchádzajúcom texte bolo ukázané, že zapamätanie imunity vyvolanej použitím autovakcín, ktorým sa venuje prednosť, nie je trvalé a preto imunitný systém potrebuje to, aby bol periodicky povzbudzovaný amyloidogénnym polypeptidom alebo modifikovaným amyloidogénnym polypeptidom.
Vplyvom genetických variácii môžu jednotlivci pri podaní rovnakých polypeptidov vykazovať rozdielne silnú imunitnú reakciu. Preto môže vakcína podľa vynálezu na účely zvýšenia imunitnej reakcie obsahovať niekoľko odlišných polypeptidov, pozri tiež uvedenú diskusiu, ktorá sa týka výberu cudzích T-bunkových epitopov určených na aplikáciu. Vakcína môže obsahovať viac polypeptidov, pričom všetky polypeptidy boh definované.
Vakcína sa môže preto skladať z 3-20 modifikovaných alebo nemodifikovanmých polypeptidov, ako je 3-10 odlišných polypeptidov.
Očkovanie (vakcinácia) nukleovými kyselinami
Ako alternatíva ku klasickému podaniu vakcíny na báze peptidu, ponúka technológia vakcinácie nukleovými kyselinami (tiež známa ako „imunizácia nukleovými kyselinami“, „genetická imunizácia“ a „génová imunizácia“) rad atraktívnych rysov.
Po prvé, na rozdiel od spôsobu tradičnej vakcinácie, očkovanie nukleovými kyselinami nevyžaduje zdroje konzumujúcu veľkoobjemovú výrobu imunogénneho činidlá (napr. vo forme priemyselnej veľkoobjemovej fermentácie mikroorganizmov produkujúcich amyloidogénne polypeptidy). Navyše nie je potrebné zariadenie na čistenie a schémy imunogénu. Konečne pretože sa vakcinácia nukleovými kyselinami spolieha na biochemický aparát očkovaných jednotlivcov, aby bol vytvorený expresný produkt zavedených nukleových kyselín, očakáva sa že vznikne optimálny post-translačný proces expresného produktu; to je osobitne dôležité v prípade autovakcinácie, pretože, ako je uvedené, významná frakcia pôvodných B-bunkových epitopov by mala byť v modifikovanej molekule zachovaná, a pretože B-bunkové epitopy môžu byť v princípe tvorené časťou akejkoľvek (bio)molekuly (napr. uhľohydrátom, lipidom, proteínom a pod.). Preto spôsob natívnej glykozylácie a lipidácie imunogénu môžu mať veľkú dôležitosť pre celkovú imunogenickosť a to je najlepšie zaistené tým, keď je k dispozícii hostiteľ produkujúci imunogén.
Preto preferovaný znak vynálezu zahŕňa poskytnutie modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu do imunitného systému zavedením nukleovej kyseliny (kyselín) kódujúcich modifikované amyloidogénne polypeptidy do živočíšnych buniek a tým získanie in vivo expresie bunkami so zavedenou nukleovou kyselinou (kyselinami).
Pri tomto znaku vynálezu je zavádzanou nukleovou kyselinou prednostne DNA, ktorá môže byť vo forme prostej DNA, DNA formulovanej s nasýtenými alebo nenasýtenými lipidmi, DNA formulovanej v lipozómoch, DNA vloženej do vírusového vektoru, DNA formulovanej s transfekciu podporujúcim proteínom alebo polypeptidom, DNA formulovanej s činidlom zrážajúcim vápnik, DNA spojenej dohromady s inertnou nosičovou molekulou, DNA zapuzdrenej do polyméru, napr. do PLGA (pozri mikro-zapuzdrovaciu technológiu opísanú vo WO 98/31398) alebo do chitínu alebo chitosánu a DNA formulovanej s adjuvansom. V tomto kontexte je možné uviesť, že prakticky všetky prístupy týkajúce sa použitia adjuvansov v tradičných vakcinových formuláciách je možné aplikovať na formulácie DNA vakcín. Preto všetky poznatky, ktoré sa týkajú použitia adjuvansov v kontexte vakcín na báze polypeptidov sú aplikovateľné mutatis mutandis pri ich použití v technológii vakcinácie nukleovými kyselinami.
Spôsoby podávania a schémy podávania vakcín na báze polypeptidov, ktoré boli podrobne opísané, sú tiež použiteľné pre vakcíny na báze nukleových kyselín podľa vynálezu a celá uvedená diskusia týkajúca sa spôsobov podávania a schém podávania polypeptidov je aplikovateľná mutatis mutandis na nukleové kyseliny. K tomu je potrebné pridať to, že vakcíny obsahujúce nukleové kyseliny môžu byť vhodne podávané intravenózne a intrarteriálne. Navyše, v odbore je dobre známe, že vakcíny založené na báze nukleových kyselín môžu byť podávané pri použití tzv. génového dela (gene gun), a preto tiež tento a jemu ekvivalentný spôsob podania sa považujú za súčasť predkladaného vynálezu. Konečne tiež o použití VLN pri podávaní nukleových kyselín bolo uvedené, že prináša dobré výsledky a preto je tento osobitný spôsob podávania tiež preferovaný.
Nukleová kyselina(y) použitá ako imunizačné činidlo môže obsahovať regióny kódujúce prvú, druhú a/alebo tretiu časť, napr. vo forme imunomodulujúcich substancií opísaných, ako sú cytokíny diskutované ako užitočné adjuvansy. Prednostná verzia tohto aspektu vynálezu zahŕňa existenciu kódujúceho regiónu pre analóg a kódujúceho regiónu pre imunomodulátor v rozdielnych čítacích rámcoch alebo prinajmenšom pod kontrolou rôznych promotorov. Alternatívne môžu byť použité dva odlišné fragmenty nukleotidu, ale to má menší význam, pretože je výhodnejšie, keď sa zaistí ko-expresia existenciou obidvoch kódujúcich regiónov obsiahnutých v rovnakej molekule.
Súčasne sa vynález tiež týka kompozícií na vyvolanie tvorby protilátok proti amyloidogénnemu polypeptidu, ktoré obsahujú fragment aminokyseliny alebo vektor podľa vynálezu (pozri ďalej uvedenú diskusiu o vektoroch) a farmaceutický a imunologický prijateľné vehikulum a/alebo nosič, a/alebo adjuvans, ako je diskutované ďalej.
Za normálnych okolností je variantná kódujúca aminokyselina zavedená vo forme vektora, pričom expresia je pod kontrolou vírusového promotora. Detailnejšia diskusia vektorov podľa vynálezu je uvedená ďalej. Detailný opis vzťahujúci sa na formuláciu a použitie vakcín obsahujúcich nukleové kyseliny je uvedený v Donnelly J. J. et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 a Donnely J.J. et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Obidve tieto citácie sú do textu vložené formou odkazu.
Živé vakcíny
Treťou alternatívou efektívneho poskytnutia modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu imunitnému systému je použitie technológie živej vakcíny. Pri živej vakcinácii imunitného systému sa postupuje tak, že sa živočíchom podáva nepatogénny mikroorganizmus, ktorý bol transformovaný fragmentom nukleovej kyseliny kódujúcim modifikovaný amyloidogénny polypeptid alebo vektorom obsahujúcim taký fragment nukleovej kyseliny. Nepatogénny mikroorganizmus môže byť akýkoľvek vhodný zoslabený bakteriálny kmeň (zoslabený prostredníctvom pasážovania alebo odstránenia patogénnych expresných produktov DNA rekombinantnou technológiou), ako je napr. Mycobacterium bovis BCG., nepatogénny Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella a pod. Súhrn zaoberajúci sa prípravou živých vakcín, ktoré sú známe v doterajšom stave v odbore je možné nájsť v Saliou P., 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 a Walker P. D., 1992, Vaccine 10: 977-990, obidve tieto citácie sú do textu vložené formou odkazu. Detaily týkajúce sa fragmentov nukleových kyselín a vektorov v takých živých vakcínach sú uvedené ďalej nasledujúcej diskusii.
Ako alternatíva k živým bakteriálnym vakcínam môžu byť použité fragmenty nukleových kyselín podľa vynálezu (ďalej diskutované), ktoré sú začlenené do nevirulentných vírusových vakcinových vektorov, ako je kmeň vakcinie alebo iný vhodný vírus kiahní.
Bežne je nepatogénny mikroorganizmus alebo vírus živočíchom podávaný iba raz, ale v určitých prípadoch môže byť nevyhnutné podať mikroorganizmus viackrát ako raz za život, aby sa zachovala ochranná imunita. Uvažuje sa dokonca o tom, že imunizačné schémy, ako je tá, ktorá je opísaná pre polypeptidové očkovanie, bude užitočná pri použití živých alebo vírusových vakcín.
Alternatívne je živá alebo vírusová vakcinácia kombinovaná s predchádzajúcim alebo nasledujúcim očkovaním polypeptidom a/alebo nukleovou kyselinou. Napríklad je možné uskutočniť primárnu imunizáciu živou alebo vírusovou vakcínou nasledovanou zvýšenou imunizáciou pri použití polypeptidu alebo nukleových kyselín.
Mikroorganizmy alebo vírusy môžu byť transformované nukleovou kyselinou(nami) obsahujúcou región kódujúci prvú, druhú a/alebo tretiu časť, napr. vo forme imunomodulujúcich substancií opísaných, ako sú cytokíny považované za užitočné adjuvansy. Prednostná verzia tohto aspektu vynálezu zahŕňa existenciu kódujúceho regiónu pre analóg a kódujúceho regiónu pre imunomodulátor v rozdielnych čítacích rámcoch alebo prinajmenšom pod kontrolou rôznych promotorov. Takto je možné sa vyvarovať tomu, že analóg alebo epitopy sú produkované ako fúzni partneri k imunomodulátoru. Alternatívne môžu byť použité ako transformujúce činidlá dva odlišné fragmenty nukleotidu. Existencia prvej a/alebo druhej, a/alebo tretej časti v rovnakom čítacom rámci môže zaistiť expresný produkt, analóg podľa vynálezu, a taký znak má podľa predkladaného vynálezu mimoriadnu prednosť.
Použitie metód podľa vynálezu na ošetrovanie chorôb
Ako je postihnuté v uvedenej diskusii, poskytnutie metód podľa vynálezu dovoľuje kontrolovať choroby charakterizované ložiskami amyloidov. V tomto kontexte je pre nové metódy kľúčovým cieľom AD, ale tiež iné choroby charakterizované ložiskami amyloidov sú vhodným cieľom. Preto dôležitý znak metód podľa vynálezu na účely regulácie s cieľom obmedzenia aktivity amyloidu zahŕňa ošetrenie a/alebo prevenciu, a/alebo zlepšenie stavu AD alebo iných chorôb charakterizovaných ukladaním amyloidu; metóda zahŕňa reguláciu na účely zníženia amyloidu pri použití spôsobov podľa vynálezu v takom rozsahu, že sa množstvo amyloidu významne zníži.
Osobitne preferované je to, že redukcia amyloidu vyplýva zo zvratu v pomere medzi tvorbou amyloidu a degradáciou/odstránením amyloidu, tzn. že rýchlosť degradácie/ odstraňovania amyloidu prevýši rýchlosť tvorby amyloidu. Starostlivým riadením množstva a imunologického dopadu imunizácie na jednotlivcov, ktorí to potrebujú, bude možné získať za určitý čas taký pomer, ktorý vo výsledku bude redukciou ložísk amyloidu bez toho, aby to malo nadmerný nepriaznivý účinok.
Alternatívne, keď pri určitom jedincovi metóda podľa vynálezu nebude môcť odstrániť alebo redukovať existujúce ložiská amyloidu, bude metóda podľa vynálezu môcť byť použitá na získanie klinicky významných redukcií pri formovaní nového amyloidu, čím významne predĺži čas, v ktorom choroba nie je ešte toľko vysilujúca. Bude môcť byť možné monitorovať rýchlosť ukladania amyloidu buď meraním koncentrácie amyloidu v sére (o ktorom sa predpokladá, že je v rovnováhe s ukladaným materiálom) alebo použitím pozitrón-emisnej tomografie (PET), pozri Small G. W. et al., 1996, Ann. N. Y. Acad. Sci. 802: 70-78.
Iné choroby a stavy, kde môžu byť prezentované technológie a metódy podobným spôsobom použité na ošetrovanie alebo zlepšenie, boli uvedené v „Doterajšom stave techniky“ (systémové amyloidózy, diabetes s neskorým nástupom, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, fronto-temporálna demencia a s priónom spojená transmisná spongioformná encefalopatia) alebo sú uvedené ďalej v sekcii nazvanej „iné amyloidové choroby a proteíny s nimi spojené“.
Peptidy, polypeptidy a kompozície podľa vynálezu
Ako je zrejmé z uvedeného textu, je predložený vynález založený na koncepte imunizácie jednotlivcov proti amyloidogénnemu antigénu na účely dosiahnutia redukovaného množstva s patológiou spojených ložísk amyloidu. Prednostným spôsobom dosiahnutia takej imunizácie je použitie modifikovaných verzií amyloidogénneho polypeptidu, poskytnutím molekúl, ktoré neboli dosiaľ v tomto odbore opísané.
Predpokladá sa, že modifikované molekuly, tu diskutované, sú vynálezcovský nové a preto sa dôležitá časť vynálezu týka analógov, ktoré sú odvodené z živočíšneho amyloidogénneho polypeptidu, pri ktorých je zavedená modifikácia, ktorá má za následok imunizáciu živočícha analógmi, ktoré vyvolávajú tvorbu protilátok, reagujúcich špecificky s nemodifikovaným amyloidogénnym polypeptidom. Prednostne je, keď sú použité modifikované amyloidogénne polypeptidy, pôvod modifikácií prispôsobený typom modifikácií opísa ných v diskusii o rôznych protilátkach podľa metódy vynálezu. Preto akékoľvek nové poznatky tu prezentované týkajúce sa modifikovaných amyloidogénnych molekúl sú relevantné na účely opisujúce amyloidogénne analógy podľa vynálezu a akékoľvek také nové poznatky sú aplikované mutatis mutandis na opis týchto analógov.
Je potrebné poznamenať, že prednostné amyloidogénne molekuly obsahujú modifikácie, ktoré tvoria polypeptidy majúce prinajmenšom 70 % identitu sekvencii s amyloidogénnym proteínom alebo so subsekvenciou s dĺžkou prinajmenšom 10 aminokyselín. Prednosť majú vyššie identity sekvencii napr. prinajmenšom 75 % alebo dokonca 80, 85, 90 alebo 95 %. Sekvenčná identita proteínov alebo nukleových kyselín môže byť vypočítaná podľa vzorca (Nref - Ndlf). 100/Nref, kde Ndif je celkový počet neidentických zvyškov v dvoch porovnávaných sekvenciách a kde Nrefje počet zvyškov v jednej sekvencii. Preto DNA sekvencia AGTCAGTC bude mať sekvenčnú identitu 75 % so sekvenciou AATCAATC (Ndif = 2 a Nref = 8).
Vynález sa tiež týka kompozícií užitočných pri realizácii metód podľa vynálezu. Vynález sa ďalej týka imunogénnych kompozícií obsahujúcich imunogenicky účinné množstvo amyloidogénneho polypeptidu, ktorý je vlastným proteínom živočíchov, kde amyloidogénny polypeptid formulovaný dohromady s imunologický prijateľným adjuvansom, rozruší autotoleranciu živočíchov proti amyloidogénnemu polypeptidu; kompozície navyše obsahujú farmaceutický a imunologický prijateľné rozpúšťadlá a/alebo vehikulá a/alebo nosiče a/alebo excipienty.
Inými slovami, táto časť vynálezu sa týka formulácii prirodzene sa vyskytujúcich amyloidogénnych polypeptidov, ktoré boli opísané v spojení s metódami podľa vynálezu.
Vynález sa tiež vzťahuje na imunogénne kompozície, ktoré obsahujú imunologický účinné množstvo analógu opísaného, taká kompozícia navyše obsahuje farmaceutický prijateľné rozpúšťadlá a/alebo vehikulá a/alebo, nosiče a/alebo excipienty alebo prípadne adjuvans. Inými slovami táto časť vynálezu sa týka formulácií modifikovaného amyloidogénneho polypeptidu, predovšetkým, ako je opísaný. Výber adjuvans, nosičov a vehikúl je realizovaný v rozsahu, ktorý bol diskutovaný pri opise formulácií modifikovaných alebo nemodifikovaných amyloidogénnych polypeptidov na použitie na reguláciu amyloidu s cieľom jeho zníženia, podľa metód vynálezu.
Polypeptidy sa pripravujú podľa metód dobre známych v odbore. Dlhšie polypeptidy sa bežne pripravujú prostredníctvom technológie génovej rekombinácie, zahŕňajúcej vloženie sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej analóg do vhodného vektora, transformáciou vhodnej hostiteľskej bunky vektorom, expresiou hostiteľskej bunky sekvenciou nukleovej kyseliny, získaním expresného produktu z hostiteľských buniek alebo ich supematantu kultúry a následnou purifikáciou a prípadne ďalšou modifikáciou, napr. zložením alebo derivatizáciou.
Kratšie peptidy sú prednostne pripravované prostredníctvom dobre známych techník pevnej alebo tekutej peptidovej syntézy. Ale súčasné objavy v tejto technológii poskytnú týmto spôsobom možnú prípravu polypeptidov s plnou dĺžkou a proteínov, a preto je tiež v rozsahu vynálezu príprava dlhých konštruktov syntetickým spôsobom.
Fragmenty nukleových kyselín a vektory podľa vynálezu
Z uvedených nových poznatkov je možné pochopiť, že modifikované amyloidogénne polypeptidy môžu byť pripravené rekombinantnou génovou technológiou, ale tiež chemickou syntézou alebo semisyntézou; dve posledne uvedené možnosti sú osobitne príhodné, keď sa modifikácia skladá z pripojenia na proteínové nosiče (ako je KLH, diphtheria toxoid, tetanus toxoid a BSA) a nebielkovínových molekúl, ako sú polyméry uhľohydrátov a samozrejme tiež, keď modifikácia zahŕňa pridanie postranných reťazcov alebo postranných skupín k peptidovému reťazcu pochádzajúcemu z amyloidogénneho polypeptidu.
Fragmenty nukleových kyselín kódujúce modifikované amyloidogénne polypeptidy sú dôležité chemické produkty na účely rekombinantnej génovej technológie a tiež na účely imunizácie nukleovými kyselinami. Preto sa významná časť vynálezu týka fragmentov nukleových kyselín, ktoré kódujú analógy amyloidogénnych polypeptidov, tzn. polypeptidov odvodených z amyloidogénnych polypeptidov, ktoré buď obsahujú prirodzené sekvencie, ku ktorým bol pridaný alebo vložený fúzny partner alebo, prednostne, polypeptidov odvodených z amyloidogénnych polypeptidov, kde bol vložený cudzí T-bunkový epitop prostredníctvom inzercie a/alebo adície, prednostne prostredníctvom substitúcie a/alebo delécie. Fragmenty nukleových kyselín podľa vynálezu sú buď DNA alebo RNA fragmenty.
Fragmenty nukleových kyselín podľa vynálezu je bežne možné vkladať do vhodných vektorov za vytvorenia klonových alebo expresných vektorov nesúcich fragmenty nukleových kyselín podľa vynálezu; také nové vektory sú tiež súčasťou vynálezu.
Detaily týkajúce sa konštrukcie týchto vynálezov podľa vynálezu budú ďalej diskutované v kontexte transformovaných buniek a mikroorganizmov. Vektory môžu byť v závislosti od účelu a typu aplikácie vo forme plazmidov, fágov, kozmidov, mini-chromozómov alebo vírusov, ale tiež prostá DNA, ktorá je expresovaná iba prechodne v určitých bunkách, je dôležitý vektor. Prednostné klonové a expresné vektory podľa vynálezu sú schopné autonómnej replikácie, čím umožňujú získať vysoký počet kópií na účely vysokoúrovňovej expresie alebo vysokoúrovňovej replikácie na následné klonovanie.
Všeobecný hlavný rys vektora podľa vynálezu zahŕňa nasledujúce charakteristiky v 5'—>3' smere a operačnom spojení: promotor na riadenie expresie fragmentu nukleovej kyseliny podľa vynálezu, pripadne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu vedúci peptid uvoľňujúcu sekréciu (do extracelulámej fázy alebo, keď je to uskutočniteľné, do periplazmy) alebo integráciu do membrány polypeptidového fragmentu, fragment nukleovej kyseliny podľa vynálezu a prípadne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu terminátor. Keď sa pracuje s expresnými vektormi v producentských kmeňoch alebo bunkových líniách je na účely genetickej stability transformovanej bunky preferované to, že sa vektor, keď je zavedený do hostiteľskej bunky, integruje v genóme hostiteľskej bunky. Na rozdiel od toho, keď sa pracuje s vektormi, ktoré majú byť použité na vyvolanie in vivo expresie v živočíchoch (tzn. keď sa vektor použije pri DNA vakcinácii) je z bezpečnostných dôvodov preferované to, že je vektor neschopný integrácie do genómu hostiteľskej bunky; typicky sa použije prostá DNA alebo neintegrujúce vírusové vektory, výber ktorých je dobre známy odborníkom v odbore.
Vektory podľa vynálezu sú použité na transformáciu hostiteľských buniek, aby produkovali modifikovaný amyloidogénny polypeptid podľa vynálezu. Také transformované bunky, ktoré sú tiež súčasťou vynálezu, môžu byť vypestované bunky alebo bunkové línie použité na vytvorenie fragmentov nukleových kyselín a vektorov podľa vynálezu, alebo použité na rekombinantnú produkciu modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov podľa vynálezu. Alternatívne môžu byť transformované bunky vhodnými kmeňmi pre živú vakcínu, kde fragmenty nukleovej kyseliny (jeden samotný alebo násobné kópie) boli vložené tak, aby to vyvolalo sekréciu alebo integráciu modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov do bakteriálnej membrány alebo bunkovej steny.
Prednostné transformované bunky podľa vynálezu sú mikroorganizmy, ako sú baktérie (ako sú druhy Escherichia [napr. E. coli], Bacillus [napr. Bacillus subtilis), Salmonella alebo Mycobacterium [predovšetkým nepatogénne, napr. M. bovis BCG]), kvasinky (ako je Saccharomyces cerevisiae) a protozoa. Alternatívne sú transformované bunky odvodené od mikrocelulámych organizmov, ako sú huby, hmyzie bunky, rastlinné bunky alebo bunky cicavcov. Mimoriadne preferované sú bunky odvodené od ľudí, pozri ďalej uvedenú diskusiu bunkových línií a vektorov. Posledné výsledky ukazujú veľkú nádej v použití komerčne dostupných Drosophila melanogaster bunkových línií (Schneider 2 (S2) bunkové línie a vektorové systémy dostupné od Invitrogen) na rekombinantnú produkciu polypeptidov v aplikačných laboratóriách a preto sa tento expresný systém mimoriadne preferuje.
Na účely klonovania a/alebo optimalizovanej expresie sa preferuje to, že je transformovaná bunka schopná replikácie fragmentu nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Bunky expresujúce nukleový fragment sú preferovanými užitočnými súčasťami predkladaného vynálezu; môžu byť použité na maloobjemovú alebo veľkoobjemovú prípravu modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov alebo, v prípade nepatogénnych baktérií, ako základná zložka v živej vakcíne.
Keď sa pripravujú modifikované molekuly podľa vynálezu prostredníctvom transformovaných buniek, je vhodné, ale nie nevyhnutné, aby bol expresný produkt buď exportovaný do rastového média alebo nanesený na povrchu transformovanej bunky.
Keď boli identifikované produkčné bunky, preferuje sa na základe toho, založiť stabilnú bunkovú líniu, ktorá nesie vektor podľa vynálezu a ktorá expresuje fragmenty nukleových kyselín kódujúce modifikované amyloidogénne polypeptidy. Prednostne táto stabilná bunková línia vylučuje alebo nesie analógy podľa vynálezu, čím uľahčuje čistenie.
Všeobecne sú v spojení s hostiteľom použité plazmidové vektory obsahujúce replikačné a kontrolné sekvencie, ktoré sú odvodené od druhov kompatibilných s hostiteľskou bunkou. Vektor zvyčajne nesie replikačné miesto, rovnako ako označovacie sekvencie, ktoré sú schopné zaistiť fenotypovú selekciu v transformovaných bunkách. Napríklad E. coli je typicky transformovaná použitím pBR322, čo je plazmid odvodený od druhu E. coli (pozri napr. Bolivar et al., 1977). Plazmid pBR322 obsahuje gény rezistencie k ampicilínu a tetracyklínu a tak poskytuje ľahký spôsob identifikácie transformovaných buniek. pBR plazmid alebo iný mikrobiálny plazmid alebo fág musí takisto obsahovať, alebo musí byť modifikovaný tak, aby obsahoval, promotory, ktoré môžu byť použité prokarytickými mikroorganizmami na expresiu. Tieto promotory najčastejšie použité pri rekombinantných DNA konštrukciách obsahujú B-laktamázové (penicilinázové) a laktózové promotorové systémy (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goedddel et al., 1979) a tryptofánový (trp) promotorový systém (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Zatiaľ čo tieto systémy sú používané najčastejšie, boli objavené a použité iné mikrobiálne promotory, podrobnosti týkajúce sa ich nukleotidových sekvencií boli publikované, a to poskytlo odborníkom možnosť dodať im funkčnosť pomocou plazmidových vektorov (Siebwenlist et al., 1980). Určité gény z prokaryontov môžu byť účinne expresované v E. coli z ich vlastných promótorových sekvencií, čím sa predchádza potrebe dodania iných promótorov umelým spôsobom.
Eukaryotické mikróby, ako sú kvasinkové kultúry môžu byť tiež použité ako prídavok k prokaryontom a tu by promotor mal byť schopný riadenia expresie. Medzi eukaryotickými mikroorganizmami sú najbežnejšie používané Saccharomyces cerevisiae alebo bežné pekárske kvasinky, hoci je bežne dostupných veľa iných kmeňov. Na expresiu v Saccharomyces je napríklad bežne používaný plazmid Yrp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al. , 1979; Tschemper et al., 1980). Tento plazmid už obsahuje trpí gén, ktorý zaisťuje selektívny marker pre mutantný kmeň kvasiniek, ktorému chýba schopnosť rásť v tryptofáne, ako je napr. ATCC No. 44076 alebo PEP4-1 (Jones, 1977). Prítomnosť trpí lezie ako charakteristický rys genómu kvasinkovej hostiteľskej bunky potom zaistí efektívne prostredie na detekciu transformácie rastom v neprítomnosti tryptofánu.
Vhodné podporujúce sekvencie v kvasinkových vektoroch obsahujú promotory pre 3-fosfoglycerát kinázu (Hitzman et al., 1980) alebo iné glykolytické enzýmy (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), ako je enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát dekarboxyláza, fosfofrukto-kináza, glukózo-6-fosfát izomeráza, 3-fosfoglycerát mutáza, pyruvát kináza, triózofosfát izomeráza, fosfoglukózoizomeráza a glukokináza. Pri konštrukcii vhodných expresných plazmidov, terminačné sekvencie spojené s týmito génmi sú tiež ligátované do expresného vektora 3' sekvencie, od ktorej sa požaduje, aby bola expresovaná na účely zaistenia polyadenilácie mRNA a terminácie.
Iné promotory, ktoré majú dodatočnú výhodu transkripcie kontrolovanej rastovými podmienkami, sú promotorové regióny pre alkohol dehydrogenázu 2, izocytochróm C, kyslá fosfatáza, degradačné enzýmy spojené s metabolizmom dusíka a už uvedená gylceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy. Je vhodný akýkoľvek plazmidový vektor obsahujúci s kvasinkou kompatibilný promotor, vychádzajúci z replikačných a terminačných sekvencií.
Navyše k mikroorganizmom môžu byť ako hostitelia použité bunkové kultúry odvodené od multicelulárnych organizmov. V princípe akákoľvek taká bunková kultúra je spracovateľná, buď z kultúry stavovcov alebo iných organizmov. Ale najväčší záujem je o bunky stavovcov a pomnožovanie stavovcov v kultúre (tkanivovej kultúre) sa stalo v posledných rokoch rutinnou procedúrou (Tissue Culture, 1973) . Príkladmi takých užitočných hostiteľských bunkových línií sú VERO a HeLa bunky, bunkové línie vaječníkov čínskeho chrčka (CHO) a W138, BHK, COS-7 293, bunky Spodoptera frugiperda (SF) (komerčne dostupné ako úplné expresné systémy od Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA a od Invitrogen) a MDCK bunkové línie. Podľa predkladaného vynálezu majú osobitnú prednosť bunkové línie S2 dostupné od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandsko.
Expresné vektory pre také bunky bežne obsahujú (keď je to nezbytné) zdroj replikácie, promotor umiestnený pred génom, ktorý má byť expresovaný spoločne s akýmikoľvek nevyhnutnými ribozómovými viažucimi miestami, RNA spojovacie miesta, polyadenylačné miesta a transkripčné koncové sekvencie.
Pri použití v bunkách cicavcov sú kontrolné funkcie na expresných vektoroch často zaistené vírusovým materiálom. Napríklad bežne používané promotory pochádzajú z polyomného adenovírusu 2 a veľmi často Simian vírusu 40 (SV40). Skoré a neskoré promotory SV40 vírusu sú osobitne užitočné, pretože sú obidva ľahko získané z vírusu ako fragment, ktorý tiež obsahuje SV40 vírusový zdroj replikácie (Fiers et al., 1978). Menšie a väčšie SV40 fragmenty je tiež možné použiť, ich pripravením sa zahrnie približne 250 bp zväčšenie sekvencie z HindíII miesta smerom k BglI miestu uloženému vo vírusovom zdroji replikácie. Navyše je tiež možné a často požadované použitie promótorových alebo kontrolných sekvencií normálne spojených s požadovanou génovou sekvenciou na zaistenie toho, aby také kontrolné sekvencie boli kompatibilné so systémami hostiteľských buniek.
Zdroj replikácie môže byť pripravený buď konštrukciou vektora, ktorý obsahuje exogénny zdroj, tak že môže pochádzať z SV40 alebo iných vírusov (mapr. Polyoma, adeno, VSV, BPV) alebo môže byť pripravený replikačným mechanizmom chromozómu hostiteľskej bunky. Keď je vektor integrovaný do chromozómu hostiteľskej bunky, je druhý spôsob často dostatočný.
Identifikácia užitočných analógov
Odborníkom v odbore bude jasné, že nie všetky možné varianty alebo modifikácie prirodzene sa vyskytujúcich amyloidogénnych polypeptidov, ktoré sú krížne reaktívne s prirodzenou formou, budú mať schopnosť vyvolať tvorbu protilátok živočíchov. Nie je však ťažké stanoviť štandardné kritériá pre modifikované amyloidogénne molekuly, ktoré by mali splniť minimálne požiadavky imunologickej reaktivity, ako je tu diskutovaná. Ďalšia časť vynálezu sa týka metód identifikácie modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov, ktoré sú schopné vyvolania tvorby protilátok proti nemodifikovanému amyloidogénnemu polypeptidu v živočíšnych druhoch, kde nemodifikovaný amyloidogénny polypeptid je (neimunogénny) vlastný protein. Metódy zahŕňajú prípravu súboru vzájomne odlišných modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov použitím peptidovej syntézy alebo techník genetického inžinierstva, kde boli aminokyseliny pridané do, vložené do, odstránené z, alebo substituované v aminokyselinovej sekvencií amyloidogénneho polypeptidu živočíšnych druhov a takto vznikli v tomto súbore aminokyselínove sekvencie, ktoré obsahujú T-bunkové epitopy, ktoré sú cudzie pre živočíšny druh, alebo prípravu súboru fragmentov nukleových kyselín, kódujúcich súbor vzájomne odlišných modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov, testovanie členov súboru modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov alebo fragmentov nukleových aminokyselín na ich schopnosť vyvolať pri živočíšnych druhoch tvorbu protilátok proti nemodifikovaným amyloidogénnym polypeptidom, a identifikáciu a pripadne izoláciu člena(nov) súboru modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov, ktoré významne ovplyvňujú tvorbu protilátok proti nemodifikovaným amyloidogénnym polypeptidom pri druhoch, alebo identifikáciu alebo prípadne izoláciu polypeptidových expresných produktov kódovaných členmi súboru aminokyselinových fragmentov, ktoré významne ovplyvňujú tvorbu protilátok proti nemodifikovaným amyloidogénnym polypeptidom v živočíšnych druhoch.
V tomto kontexte znamená „súbor vzájomne odlišných modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov“ zbierku neidentických modifikovaných amyloidogénnych polypeptidov, ktoré boli napr. selektované na báze kritérií diskutovaných hore (napr. v kombinácii so štúdiami kruhového dichroizmu, NMR spektra, a/alebo rontgenovej difrakčnej metódy). Súbor môže obsahovať iba niekoľko členov, ale očakáva sa, že súbor môže mať niekoľko stoviek členov.
Test členov súboru môže byť vykonaný in vivo, ale môže byť použitý tiež rad in vitro testov, ktoré obmedzujú počet modifikovaných molekúl, ktoré budú slúžiť účelom vynálezu.
Pretože cieľom zavedenia cudzích T-bunkových epitopov je podpora B-bunkovej reakcie pomocou T-buniek, predpokladom je, že T-bunková proliferácia je vyvolaná modifikovaným amyloidogénnym polypeptidom. T-bunková proliferácia môže byť testovaná štandardizovaným proliferačným spôsobom in vitro. V krátkosti, vzorka obohatená o T-bunky sa získa zo subjektu a následne sa udržuje v kultúre. Napestované T-bunky sa knotaktujú s APC subjektu, ktorému boli pred tým odoberané modifikované molekuly a spracované tak, aby poskytli ich T-bunkové epitopy. Proliferácia T-buniek sa monitoruje a porovnáva s vhodnou kontrolou (napr. T-bunky v kultúre v kontakte s APC, ktoré majú spracované neporušené, natívne amyloidogénne polypeptidy). Alternatívne môže byť proliferácia meraná určením koncentrácie relevantných cytokínov uvolnených T-bunkami v reakcii na ich rozpoznanie cudzích T-buniek.
Keď sa ako veľmi pravdepodobné predpokladá, že prinajmenšom jeden modifikovaný amyloidogénny polypeptid akéhokoľvek typu v súbore je schopný vyvolať tvorbu protilátok proti amyloidogénnemu polypeptidu, potom je možné pripraviť imunogénnu kompozíciu obsahujúcu prinajmenšom jeden modifikovaný polypeptid amyloidu, ktorý je schopný vyvolať tvorbu protilátok proti nemodifikovanému amyloidogénnemu polypeptidu živočíšnych druhov, kde nemodifikovaný amyloidogénny polypeptid je vlastný proteín; metóda zahŕňa zmiešanie člena(ov) súboru, ktoré významne vyvolávajú tvorbu protilátok živočíšnych druhov, ktoré reagujú s amyloidogénnym polypeptidom s farmaceutický a imunologický prijateľným nosičom a/alebo vehikulom, a/alebo rozpúšťadlom, a/alebo excipientom, prípadne v kombinácii s prinajmenšom jedným farmaceutický a imunologický prijateľným adjuvansom.
Uvedené aspekty vynálezu, týkajúce sa testu súboru polypeptidov, sa bežne uskutočňujú spôsobom, ktorý najskôr zahŕňa prípravu radu vzájomne odlišných sekvencií nukleových kyselín alebo vektorov podľa vynálezu, transformáciu vhodných hostiteľských buniek (alebo hostiteľských živočíchov) s vektormi a efektívnu expresiu sekvencií nukleových kyselín podľa vynálezu. Tieto stupne môžu byť nasledované izoláciou expresných produktov. Prednosťou je, keď sú sekvencie nukleových kyselín a/alebo vektory pripravené metódami zahŕňajúcimi použitie molekulárnych amplifikačných technik, ako je PCR alebo prostredníctvom syntézy nukleových kyselín.
Špecifické amyloidogénne ciele
Okrem proteínov veľmi často spojovaných s Alzheimerovou chorobou, APP, ApoE4 a Tau, existuje veľa iných proteínov, ktoré sú nejakým spôsobom spojené s AD, buď ich priamou prítomnosťou v povlakoch alebo zámotkoch v mozgu postihnutom AD alebo ich zjavným genetickým spojením so zvyšujúcim sa rizikom vývoja AD. Väčšina, keď nie všetky tieto antigény, sú spoločne s uvedenými Αβ, APP, presenilínom a ApoE4, domnelými cieľovými proteínmi podľa predkladaného vynálezu.
Alfal-antichymotripsín (ACT) je hlavnou zložkou SP a predpokladá sa, že hrá dôležitú úlohu v patogenéze lézií pri AD a cerebrovaskulámej amyloidóze (CA) (Acta Neuropathol. 1998, 96: 628-36). Reaguje s Αβ in vitro a stimuluje formáciu a roztrhnutie Ap-42 vlákien (JBC, 1998, 273: 28360-4).
Alfa2-makroglobulín bol objavený imunofarbením vo vrstve povlaku v mozgu postihnutom AD. Vo vrstve povlaku bol objavený transmembránový fragment z beta-subjednotky, zatiaľ čo rozpustný alfa fragment bol zistený v povlakoch extra-celuláme (Acta Neuropathol. 1998, 96: 628-636 a Brain Res. 1997, 777: 223-227).
ABAD (Αβ-peptid viažuca alkohol dehydrogenáza) sa viaže s Αβ vnútri buniek. Je to neuronálny enzým prítomný v normálnych bunkách ale je nadexpresovaný v neurónoch ovplyvnených AD. Αβ je toxickejší pre bunky, ktoré nadexpresujú ABAD. ABAD je spojená s X-chromozómom (Yan, 1997, Náture 389).
APLP1 a -2 (amyloidovému prekurzoru podobný proteín 1 a -2)
Obidva proteíny patria k super-rodine proteínov APP homológov, ale postrádajú Αβ peptidový región. Ale existuje významné farbenie APLP v povlakoch (Acta Neuropathol. 1997, 94: 519-524).
AMY117 je novoobjavený proteín v léziách podobných povlakom v mozgu ľudí trpiacich AD, ktorý sa zdá byť hojný, široko rozšírený a „vysoko špecifický'“ pri chorobe. Očakáva sa, že proteín AMY117 môže hrať kľúčovú úlohu pri vývoji a progresii AD tvorbou týchto povlakov. Je zaujímavé, že AMY117 obsahuje povlaky, ktoré nie sú umiestnené popri povlakoch obsahujúcich AP a tak je možné definovať nové charakteristické rysy prejavu AD k dosiaľ dobre známym povlakom obsahujúcim Αβ a zámotkom obsahujúcim Tau. AMY117 pozitívne povlaky boli zistené v hojnom počte v mozgoch v sporadických prípadoch AD a v mozgoch ľudí trpiacich Downovým syndrómom, ale „veľmi zriedka alebo vôbec“ neboli zistené v mozgoch kontrolnej skupiny alebo pri iných neurodegeneratívnych chorobách (Am. J. Pathol. 1997, 151: 69, 80).
Bax: Monoklonálne protilátky detekovali Bax ako komponent senilných povlakov v AD mozgoch. Bax je tiež nadexpresovaný v dystrofických neuritoch (Acta Neuropathol. 1998, 95: 407-412).
Bcl-2 má nejasnú úlohu. Je nadexpresovaný v gliálnych bunkách obklopujúcich povlaky (Acta Neuropathol. 1998, 95:407-412).
Bleomycin hydroláza je asi beta-sekretáza. Bola zistená anti-bleomycin hydrolázová imunoreaktivita v SP pri AD (Brain Res. 1999, 830: 200-202). Určitý bleomycinový hydrolázový genotyp je v určitých prípadoch spojený so zvýšeným rizikom vývoja AD, zatiaľ čo pri iných chorobách neboli nájdené žiadne korelácie (Ann. Neurol. 1998,44: 808-811 a Ann. Neurol. 1999,46: 136-137).
BRI/ABRI: ABRI je 4 kD fragment putatívneho transmembránového proteínu, kódovaného BRI génom na chromozóme 13, ktorý bol nájdený v amyloidových povlakoch ľudí trpiacich britskou demenciou (FBD). Tieto pacienti majú mutáciu v stop kodóne BRI génu, ktorý tvorí dlhší otvorený čítací rámec. Uvoľnenie 34 karboxy terminálnych aminokyselín pozmeneného proteínu tvorí ABRI amyloidovú podjednotku. Protilátky proti ABRI rozpoznávajú parenchymálne aj vaskuláme lezie v mozgu FBD pacientov. ABRI peptid je uložený ako amyloidové vlákna a o výsledných povlakoch sa predpokladá, že spôsobujú neuronálnu dysfunkciu a demenciu, ktorá charakterizuje FBD (Vídal, R. et al., 1999, Náture 399).
Chromogranin A bol zistený v niektorých rozptýlených amyloidových ložiskách a dystrofických neuritoch, ktoré ich obklopujú (Brain Res. 1991, 539: 143-50).
Clusterin/apoJ je gén často v laboratóriách izolovaný pomocou rozdielnych testov v rôznych oblastiach molekulárnej biológie, pretože je nadexpresovaný v rade prípadov degeneratívnych chorôb, ako je AD a scarpie (Biochem. J. 1997., 15 nov.; 328 (1): 45-50, Michel D, Chatelain G, North S, Brun G).
CRF (konrtikotropin uvoľňujúci faktor) viažuci proteín viaže 41 aa CRF peptid, ktorý je dôležitý regulačný faktor pri stresových reakciách v mozgu. S ohľadom na to, že väčšina CRF je viazaná CRF viažucim proteínom, odstránenie CRF viažuceho proteínu (imunoterapiou) by mohlo viesť k zvýšeniu hladiny voľného CRF, čo, ako sa očakáva, by malo mať pozitívny efekt na AD (Behan, 1997, J. Neurochemistry, 68: 2053-2060).
EDTF (od endotélia odvodený toxický faktor): proteín produkovaný mikrocievami pri AD pacientoch. Je špecificky toxický pre neurónové bunky (WO 99/24468).
Proteoglykány heparansulfátu: bolo zistené, že sú umiestnené spolu s Αβ pri SP. Štúdie na potkanoch ukazujú, že heparansulfát glykózaminoglykán je potrebný pri tvorbe amyloidových vlákien (Neurón, 1994, 12:219234 a Acta Neuropathol. 1998, 96:628-36).
Ľudský collapsin reakčný mediátorový proteín-2 je 65kDa proteín nájdený v neurofibrilámych zámotkoch monoklonálnou protilátkou. Inkorporácia do zámotkov môže viesť k odčerpaniu rozpustných proteínov a k tvorbe abnormálnych neuritických výrastkov a tak k urýchleniu neuronálnej degradácie (JBC, 1998, 273:9761-8).
Huntingtin (proteín Huntigtonovej choroby) Pri HD je proteín Huntingtin N-terminálne rozšírený polyglutamínom. Táto forma Huntingtonu je tiež nájdená pri NFT v AD mozgoch a pri Pickovej chorobe (Exp. Neurol, 1988, 150:213-222).
ICAM-I je akumulovaný pri SP (Acta Neuropathol. 1998, 96:628-36 a Am. J. Pathol. 1994, 144:104-16).
IL 6 je spojený s neurofibrilárnymi zmenami a nachádza sa v centre povlakov. Predpokladá sa, že je to spúšťač AD. Je silne znásobený v astrocytoch aktívnym peptidom 25-35 v AP (Brain Res. 1997, 777:223-227 a Behav. Brain Res. 1996, 78:37-41).
S lysozýmom spojený antigén CD68 bol nájdený protilátkou KP-1 pri NFT a SP. Lysozýmy tak môžu hrať určitú úlohu pri tvorbe zámotkov a povlakov (Dement Geriatr Cogn. Disord, 1998, 9:13-19).
P21 ras je zapojený ako primárny stupeň pri rozvoji rastových faktorov a mitogénov pozorovateľných v časnom štádiu rozvoja AD (Neuroscience, 1999, 91:1-5).
PLC-delta 1 (fosfolipázový C izoenzým delta 1) sa abnormálne akumuluje pri NFT a vrstvách povlakov obklopujúcich neurity. Je intracelulámy (Alzheimer Dis. Assoc. Disord, 1995, 9:15-22).
Sérový amyloidový P komponent (SAP) je normálny plazmový konštituent, ktorý je prítomný vo všetkých typoch amyloidových ložísk, aj v ložiskách, ktoré sa objavujú pri AD (JBC, 1995, 270:26041-4). Je pozorovaný pri SP aj pri NFT. V niektorých štúdiách bolo ukázané, že podporuje agregáciu Αβ a bráni proteolýze fíbrilov (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 211:349v-53 a PNAS, 1995, 92:4299-4303), zatiaľ čo v inej štúdii je ukázané, že SAP inhibuje tvorbu Αβ vlákien (JBC, 1995, 270:26041-4).
Synaptopisín bol objavený v niektorých rozptýlených amyloidových ložiskách a v dystrofických neuritoch, ktoré ich obklopujú (Brain Res. 1991, 539:143-50).
Synukleín (alfa-synukleín alebo NACP): non-A beta komponent AD amyloidu (NAC) bol identifikovaný biochemický ako druhý hlavný komponent v amyloide purifikovanom z mozgových tkanív pacientov trpiacich AD. NAC pochádza z jeho 140 aminokyselín dlhého prekurzoru, NACP je dlhý prinajmenšom 35 aminokyselín (NAC35), hoci jeho amino koniec nie je definitívne určený. NAC monoklonálne protilátky imunofarbia SP v AD mozgoch, ale nereagujú s NACP (Biochemistry 34 (32):10139-10145 (15. august, 1995) Iwai A, Yoshimoto M, Masliah E, Saitoh T). V prítomnosti Αβ tvorí NAC vlastné oligoméry. Nové údaje ukazujú na potenciálnu úlohu týchto molekúl pri synaptickom poškodení a neurotoxickosti prostredníctvom tvorby amyloidom podobných vlákien a mitochondriálnych dysfunkcií (Brain Patho. 1999 Oct; 9(4):707-20. FEBS Lett. 1998, 421:73-76. Časť NACP má vysokú homológiu s C-terminálnym amyloidovým fragmentom APP a s oblasťou scarpie prion proteín (PrPSc). Synukleín je hlavný faktor spôsobujúci Parkinsonizmus (Chem. Biol. 1995,2:163-9).
TGF-bl (transformačný rastový faktor bl): Nadexpresia TGF-bl mutantným APP pri TG myši urýchľuje ukladanie Αβ. O TGF-bl sa tak predpokladá, že je zahrnutý do iniciácie alebo rozvoja tvorby amyloidových povlakov (Wyss-Coray, 1997, Náture 389).
Iné amyloidové choroby a proteíny s nimi spojené
Okrem uvedených proteínov, ktoré sú potenciálne prítomné pri AD a AD podobných chorobách (Huntigtonova choroba, Parkinsonova choroba, FBD a iné formy demencií), existuje relatívne široká škála chorôb, iných ako AD, kde tvorba amyloidov je zahrnutá pri spúšťaní chorôb alebo tvorí symptómy chorôb. Napriek tomu, že proteíny majúce vzťah k týmto chorobám sa líšia v pôvode, vyznačujú sa rovnakými charakteristickými rysmi, ktoré vymedzujú (definujú) amyloid; pozri skôr uvedený text. Nasledujúca tabuľka predkladá súhrn týchto amyloidových porúch a proteínov, ktoré ich spôsobujú.
Rôznorodosť amyloidových fibrilárnych proteínov
Klinický syndróm Fibrilárna subjednotka Štruktúra prekurzoru
Cerebrálna amyioidová angiopatia (CAA) Αβ Všetko β
Mokolonálna proteínová systemická (AL) amyloidóza V doména IG lahké reťazca s plnou dĺžkou alebo jej fragmenty Všetko β
Reaktívna systemická (AA) amyloidóza 76-zvyškový N-terminálny fragment amyloidového A proteínu α/β
Familiálna amyloidotická polyneuropatia Transtyretinové varianty s plnou dĺžkou alebo jeho fragmenty Všetko β
Dedičná ApoAl amyloidóza N-terminálne fragmenty («90 zvyškov) ApoAl variantov (α/β)
Dedičná lysozymová amyloidóza Lysozymové varianty s plnou dĺžkou α + β
Diabetes mellitus typ II 37-zvyškový fragment ostrovčekového amyloidového polypeptidu Neznáma
S inzulínom spojený amyloid Divoký typ inzulínu s plnou dĺžkou α + β
Transmisná spongioformná encefalopatia Priónový proteín s plnou dĺžkou alebo jeho fragmenty α + β
Modulárny karcinóm tyroidu Fragmenty kalcitonínu Neznáma
Senilná systemická amyloidóza Transtyretin s plnou dĺžkou alebo jeho fragmenty Všetko β
Amyloidóza spojená s hemodialýzou Divoký typ β-2 mikroglobulinu s plnou dĺžkou Všetko β
Izolované atriálne amyloidózy Atriálny natriuretický faktor Neznáma
Dedičná cerebrálna amyioidová angiopatia 110-zvyškový fragment variantu cistatínu α + β
Fínska dedičná amyloidóza 71-zvyškový fragment variantov gelsolínu α/β
Dedičná fibrinogénna a-reťazcová amyloidóza Fragmenty f ibrinogénnych a-reťazcových variantov α/β
Tieto proteiny sú, ako proteiny majúce vzťah k AD, všetky potenciálne ciele pre imunizačnú stratégiu tu navrhovanú.
Očakáva sa, že väčšina metód imunizácie proti amyloidogénnym polypeptidom by mala byť obmedzená na imunizáciu, ktorá vyvoláva tvorbu protilátok, ktoré krížovo reagujú s prirodzenými amyloidogénnymi polypeptidmi. Ale v niektorých prípadoch bude našim záujmom vyvolať bunkovú imunitu vo forme CTL reakcií proti bunkám, ktoré poskytujú MHC trieda I epitopy z amyloidgénnych polypeptidov - to bude prospešné v tých prípadoch, kde redukcia počtu buniek produkujúcich amyloidogénne polypeptidy nemá vážny nepriaznivý účinok. V takých prípadoch, kde sú CTL reakcie požadované, má prednosť použitie poznatkov z prihlášky PCT/DK99/00525 (zodpovedajúcej 09/413 186). Poznatky týchto dvoch dokumentov sú do textu vložené formou citácie.
V nasledujúcich príkladoch, ktoré nijak neobmedzujú rozsah vynálezu, je hlavný dôraz kladený na vývoj autovakcíny založenej na Αβ proti Alzheimerovej chorobe. Princípy tu predstavené sú však rovnako použiteľné na akýkoľvek amyloidový proteín.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Autovakcinácia na účely imunizácie proti AD
Skutočnosť, že AP proteín, ktorý poráža myši, nevykazuje akékoľvek abnormality alebo nepriaznivé vedľajšie účinky, potvrdzuje že odstránenie alebo zníženie obsahu Αβ bude bezpečné (Zheng H. 1996).
Publikované pokusy, v ktorých sú transgénne živočíchy imunizované proti transgénnemu ľudskému Αβ proteínu, podporujú domnienku, že ak by bolo možné zlomiť autotoleranciu znížením obsahu Αβ, bolo by možné získať autoreaktívne protilátky. Tieto experimenty navyše dovoľujú očakávať, že taká regulácia obsahu AP by mohla potenciálne zabrániť tvorbe povlakov a dokonca čistiť už vytvorené povlaky AP z mozgu, pozri Schemk et al (1999). Ale zvyčajne nie je možné vyvolať tvorbu protilátok proti vlastným proteínom. Publikované údaje tak neposkytujú informácie o rozrušení skutočnej vlastnej tolerancie proti skutočným vlastným proteínom. Žiadne údaje neposkytujú informácie o tom, ako zaistiť imunitnú reakciu namierenú iba proti alebo najmä proti AP ložiskám, a nie proti bunkovým membránam viažucim Αβ prekurzorový proteín (APP), keď sa to považuje za nevyhnutné. Imunitná reakcia vyvolaná použitím existujúcich technológií by mohla byť pravdepodobne vyvolaná proti vlastným proteínom neregulovaným spôsobom tak, že by sa vyvolala nechcená a nadmerná autoreaktivita proti časti AP proteínov. Ale použitie existujúcich imunizačných stratégií by väčšinou bolo nevhodné na vyvolanie silnej imunitnej reakcie proti vlastným proteínom a navyše by bolo nebezpečné vzhľadom na potenciálne silnú krížovú reaktivitu proti na membrány viazaným APP, ktoré sú prítomné vo veľkom počte buniek pri CNS.
Vo svetle uvedených faktov, je možné predpovedať, že AD, choroba, ktorá je predurčená k ochromeniu systému zdravotnej starostlivosti v nasledujúcom storočí, by mohla byť liečená, alebo také vakcíny, ako sú tu opísané, by mohli prinajmenšom vytvoriť efektívny terapeutický nástroj na ošetrovanie symptómov a vývoja tejto choroby.
Táto technika predstavuje celkom nový imunologický postup na blokáciu ukladania amyloidov pri AD a iných neurologických chorobách.
V nasledujúcej tabuľke je uvedených 35 zamýšľaných konštruktov. Všetky pozície dané v tabuľke sú vztiahnuté na štartovací metionin APP (prvá aminokyselina v SEQ ID NO:2) a zahŕňajú štartovaciu a koncovú aminokyselinu 672 a 714. Štartovacie a koncové pozície pre P2 a P30 označujú, že epitop nahradzuje časť fragmentu APP v označených pozíciách (obidve pozície zahrnuté v substitúcii) vo väčšine konštruktov zavedené epitopy nahradzujú fragment s dĺžkou epitopu. Hviezdička má v tabuľke nasledujúci význam:
*) Iba jedna pozícia pre P2 a P30 označuje, že epitop bol vložený do APP derivátu v označenej pozícii (epitop začína pri aminokyseline C-terminálne priliehajúcej k danej pozícii).
**) Konštrukcia 34 obsahuje tri identické APP fragmenty oddelené P30 rešp. P2.
***) Konštrukcia 35 obsahuje deväť identických APP fragmentov oddelených striedavo P30 a P2 epitopmi.
Var. č. Začiatok APP segmentu vztiahnutý na aa 1 APP Koniec APP segmentu vztiahnutý na aa 1 APP Pozícia P2 epitopu vztiahnutá na aa 1 APP Pozícia P30 epitopu vztiahnutá na aa 1 APP Dĺžka molekuly
1 630 770 656 - 670 635 - 655 141
2 630 714 656 - 670 635 - 655 85
3 672 770 735 - 749 714 - 728 99
4 672 770 314 - 728 99
5 672 770 714 - 728 99
6 672 770 723* 723* 135
7 672 770 723* 120
9 672 770 723* 114
9 672 714 672* 64
10 672 714 714* 64
11 672 714 672* 58
12 672 714 714* 58
13 672 714 714* 672* 79
14 672 714 630 - 694 43
15 672 714 685 - 799 43
16 672 714 690 - 704 43
17 672 714 695 - 709 43
18 672 714 675 - 695 43
19 672 714 680 - 700 43
20 672 714 685 - 705 43
21 672 714 690 - 71C 43
22 672 714 680* 680* 79
23 672 714 690* 690* 79
24 672 714 700* 700* 7 9
25 672 714 710* 710* 79
26 672 714 680* 64
27 672 714 69C* 64
28 672 714 700* 64
29 672 714 710* 64
30 672 714 680* 58
31 672 714 690* 59
32 672 714 700* 58
33 672 714 710* 58
34 672 714 Po rep. 1“ Po rep. 2** 165
35 672 714 34 x 3* 34 x 3·** 165
Časť APP, proti ktorej je najzaujímavejšie vyvolať reakciu, je 43 aminokyselinový AP jadrový peptid (Ap43, zodpovedajúci SEQ ID N0:2, zvyšky 672-714), ktorý je hlavný stavebný prvok amyloidových povlakov v AD mozgoch. Tento APP fragment tvorí súčasť všetkých konštruktov uvedených skôr.
Varianty 1 a 2 obsahujú časť APP proti Ap-43, kde boli umiestnené modelové epitopy P2 a P30. Varianty 1 a 3-8 všetky obsahujú C-100 fragment, o ktorom sa zistilo, že je neurotoxický - C-100 fragment zodpovedá aminokyselinovým zvyškom 714-770 SEQ ID NO:2. Vo variantoch 3-5 epitopy nahradzujú časť C-100 fragmentu, zatiaľ čo vo variantoch 6-8 boli epitopy vložené do C-100 fragmentu.
Varianty 9-35 obsahujú iba jadrový Αβ-43 proteín. Vo variantoch 9-13 sú P2 a P3 zlúčené do konca Ap-43; vo variantoch 14-21 nahradzujú P2 a P3 časť Ap-43; vo variantoch 22-33 sú P2 a P30 vložené do Ap-43; Variant 34 obsahuje tri identické Αβ-43 fragmenty preložené P30 resp. P2; Variant 35 obsahuje 9 Αβ-43 opakovane preložených striedavo P2 a P30 epitopmi.
Na účely získania väčších podrobností pozri obr. 1 a uvedenú tabuľku.
Osobitnú prednosť má ešte jeden ďalší typ konštruktu. Pretože jedným cieľom predkladaného vynálezu je sa vyhnúť deštrukcii buniek produkujúcich APP, zatiaľ čo sa požaduje odstránenie Αβ, zdá sa uskutočniteľné pripraviť autovakcínové konštrukty, skladajúce sa len z častí Αβ, ktoré nie sú vystavené extracelulámej fáze, keď sú prítomné v APP. Také konštrukty by potrebovali obsahovať prinajmenšom jeden Bbunkový epitop odvodený z aminokyselinového fragmentu definovaného aminokyselinami 700-714 v SEQ ID NO:2. Pretože sa o takom krátkom polypeptidovom fragmente predpokladá, že by bol len slabo imunogénny, preferuje sa aby sa taký autovakcínový konštrukt skladal z niekoľkých kópií B-bunkového epitopu, napr. vo forme konštruktu majúceho štruktúru ukázanú vo vzorci (I) detailne diskutovanom skôr. V onej verzii vzorca (I) sú termíny amyloidei-amyloidex x B-bunkový epitop obsahujúci aminokyselinové sekvencie odvodené z aminokyselín 700-714 SEQ ID NO:2. Prednostnou alternatívou je podrobne opísaná možnosť zviazania amyloidogénneho (polyjpeptidu a vybraného cudzieho T-pomocného epitopu prostredníctvom amidovej väzby k polysacharidovej nosičovej molekule - týmto spôsobom je možné znásobené poskytnúť „slabý“ epitop vytvorený aminokyselinami 700-714 SEQ ID NO: 2 a umožniť vybrať optimálny pomer medzi B-bunkovými a T-bunkovými epitopmi.
Príklad 2
Imunizácia transgénnej myši Αβ a modifikovanými proteínmi v súlade s vynálezom
Konštrukcia hAB43+-34 kódujúceho DNA hAB43+-34 gén bol konštruovaný v niekoľkých stupňoch. Prvý PCR fragment bol vytvorený s prajmermi ME#801 (SEQ ID NO: 10) a ME#802 (SEQ ID NO: 11) pri použití prajmeru ME#800 (SEQ ID:9) ako tem plátu. ME#8 00 kóduje ľudský Αβ-43 fragment s E. coli optimizovanými kodónmi. ME#801 a 802 pridávajú do fragmentu vhodné reštrikčné miesta.
PCR fragmenty boli vyčistené, natrávené Ncoľ a HindlII, opätovne prečistené a klonované do NcolHindlII, natrávený a bol prečistený pET28b+ E. coli expresný vektor. Výsledný plazmid kódujúci divoký typ ľudského Αβ-43 bol pomenovaný ako pAB 1.
V nasledujúcom stupni sa T-pomocný epitop P2 pridá k C-konci molekuly. Prajmer ME#806 (SEQ ID NO: 12) obsahuje sekvenciu kódujúcu P2 epitop a tak sa vytvorí fúzia P2 a Αβ-43 PCR reakciou.
Klonovanie bolo uskutočnené vytvorením PCR fragmentu prajmermi ME#178 (SEQ ID NO:8) a ME#806 pri použití pABl ako templátu. Fragment bol prečistený, natrávený Ncol a HindlII, opätovne prečistený a klonovaný do Ncol-HindlII, natrávený a vektor pET28b+ bol prečistený. Vzniknutý plazmid bol pomenovaný ako pAB2.
Analogickým spôsobom bol vytvorený ďalší plazmid za získania Αβ-43 kódujúcej sekvencie s ďalším T-pomocným epitopom P30 pridaným do N-konca. To bolo vykonané vytvorení PCR fragmentu s prajmermi ME#105 (SEQ ID NO:7) a ME#807 (SEQ ID NO:13) pri použití pABl ako templátu.
Fragment bol prečistený, natrávený Ncol a HindlII, opätovne prečistený a klonovaný do Ncol-HindlII, natrávený a vektor pET28b+ bol prečistený. Vzniknutý plazmid bol pomenovaný ako pAB3.
V treťom stupni bolo druhé Αβ-43 opakovanie pridané C-terminálne do P2 epitopu plazmidu pAB2 prajmerom ME#809 (SEQ ID NO: 14). ME#809 súčasne tvorí BamHI miesto bezprostredne za Ap-43 opakovaním. PCR fragment bol vytvorený s prajmermi ME#178 a ME#809 pri použití pAB2 ako templátu. Fragment bol natrávený Ncol a HindlII, prečistený a klonovaný do Ncol-HindlII, natrávený a vektor pET28b+ bol prečistený. Tento plazmid bol pomenovaný ako pAB4.
Záverom bol P30 epitop - Αβ-43 opakovaná sekvencia z pAB3 klonovaný do pAB4 plazmidu. To bolo vykonané vytvorením PCR fragmentu s prajmermi ME#811 (SEQ ID NO:16) a ME#105 pri použití pAB3 ako templátu. Fragment bol prečistený a použitý ako prajmer v nasledujúcej PCR reakcii s ME#810 (SEQ ID NO: 15) pri použití pAB3 ako templátu. Vzniknutý fragment bol prečistený, natrávený BamHI a HindlII a klonovaný do BamHI-HindlII, natrávený a plazmid pAB4 bol prečistený. Výsledný plazmid pAB5 kóduje hAB43+-34 molekulu.
Všetky PCR a klonovacie materiály boli vytvorené v podstate podľa spôsobov opísaných v Sambrook, J., Fritsch, E. P. & Maniatis, T. 1989 „Molecular cloning: a laboratory manual“. 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
Na všetko klonovanie boli použité producentské bunky E. coli K-12, kmeň Top-10 F' (Stratagene, USA). Vektor pET28b+ bol získaný od Novagen, USA. Všetky prajmery boli syntetizované v DNA Technology, Dánsko.
Expresia a purifikácia hAB43+-34 hAB43+-34 proteín kódovaný pAB5 bol expresovaný v BL21-Gold (Novagen) E. coli bunkách, ako je opísané dodávateľom pET28b+ systému (Novagen).
Expresovaný hAB43+-34 proteín bol prečistený na viac ako 85 % čistotu premytím inkluzných teliesok a nasledovala katión- výmenná chromatografia pri použití BioCad purifikačnej jednotky (PerSeptive Biosystems, USA) v prítomnosti 6 M močoviny. Močovina bola potom odstránená stupňovitou dialýzou proti roztoku obsahujúcemu znižujúce sa množstvo močoviny. Koncový tlmivý roztok bol 10 mM Tris, pH 8,5.
Imunizačná štúdia
Na štúdiu boli použité myši transgénne pre ľudský APP (Alzheimerov prekurzorový proteín). Tieto myši, nazvané TgRND8+, expresujú mutantnú formu APP, čo má za následok vysokú koncentráciu Αβ-40 a Αβ-42 v mozgoch myší (Janus, C. et al.).
Myši (8-10 myší v skupine) boli imunizované buď Abeta-42 (SEQ ID NO:2, zvyšky 673-714, syntetizované prostredníctvom štandardnej Fmoc stratégie), alebo hAB43+-34 variantom (konštrukt 34 z tabuľky v príklade 1, vytvorené rekombinantne) v čase dvoch týždenných intervalov. Dávky boli stanovené buď 100 mg pre Αβ alebo 50 mg pre hAB43+-34. V dni 43 (po troch injekciách) a po dni 52 (po štyroch injekciách) bola z myší odberaná krv a séra boli použité na stanovenie hladiny anti-Ap-42 špecifických titrov použitých na priamu Αβ-42 ELISA.
Nasledujúca tabuľka ukazuje priemerné relatívne anti-Abeta-42 titry.
Imunogén Deň 4 3 (po 3 imunizáciách) Deň 52 (po 4 imunizáciách)
Αβ-42 4000 3000
HAB43+-34 16000 23000
Ako je jasné z tabuľky, titre protilátok získané imunizáciou 11AB43+-34 Αβ variantom sú približne 4-krát a 7,5-krát vyššie po 3 a 4 imunizáciách ako titre získané nezmeneným divokým typom Αβ-42 ako imunogénom. Tento fakt je perspektívny, keď sa uváži, že množstvo variantu použité na imunizáciu tvorilo iba 50 % množstva sekvencie divokého typu použitej na imunizáciu.
Príklad 3
Syntéza Αβ peptidovej kompolymérovej vakcíny pri použití aktivovaného polyhydroxypolyméru ako zositeného činidla
Úvod
Tradičná konjugátová vakcína sa skladá z (poly)peptidu viazaného kovalentne na nosičový proteín. Peptidy obsahujú B-bunkový epitop(y) a nosičový proteín zaisťujúci T-pomocné epitopy. Ale väčšina nosičových proteínov je bežne nevhodná ako zdroj pre T-pomocné epitopy, pretože iba malá časť celkovej sekvencie obsahuje vhodné T-pomocné epitopy. Také epitopy môžu byť definované a syntetizované ako peptidy s napr. 12-15 aminokyselinami. Keď sú tieto epitopy pripojené kovalentne na peptidy obsahujúce B-bunkové epitopy, napr. prostredníctvom multivalentných aktivovaných polyhydroxy-polymérov, môže byť získaná molekula vakcíny, ktorá obsahuje iba zodpovedajúce časti. Je ďalej možné vytvoriť vakcínový konjugát, ktorý obsahuje optimalizovaný pomer medzi B-bunkovými a T-bunkovými epitopmi.
Syntéza aktivovaného polyhydroxypolyméru
Polyhydroxypolyméry, ako je dextrán, škrob, agaróza a pod. môžu byť aktivované 2,2,2-trifluóretánsulfonylchloridom (trezylchloridom) buď prostredníctvom homogénnej syntézy (dextrán rozpustený v N-metylpyrolidinóne (NMP) alebo heterogénnou syntézou (škrob, zositený dextrán) napríklad v acetóne.
225 ml suchého N-metylpyrolidinónu sa pridá v suchých podmienkach k vymrazenému, vo vode rozpustnému dextránu (4,5 g, 83 mmol, klinická čistota, Mw (priemerne) 78 000) v 500 ml nádobe s guľatým dnom vybavenej magnetickým miešačom. Nádoba sa uloží pri 60 °C do olejového kúpeľa vybaveného magnetickým miešačom. Teplota sa zvýši na 92 °C na 20 minút. Keď sa dextrán rozpusti, nádoba sa okamžite vyberie z olejového kúpeľa a teplota v kúpeli sa zníži na 40 °C. Nádoba sa potom vloží do miešaného olejového kúpeľa a po kvapkách sa pridá trezyl-chlorid (2,764 ml, 25 mmol). Po 15 minútach sa prikvapká pyridín (bezvodý, 2,020 ml, 25 mmol). Nádoba sa odoberie z olejového kúpeľa a mieša ešte 1 hodinu pri teplote miestnosti. Produkt (trezylový aktivovaný dextrán, TAD) sa vyzráža v 1200 ml chladného etanolu (99,9 %). Supematant sa dekantuje a zrazenina sa zoberie v 50 ml polypropylénových skúmavkách centrifugáciou pri 2000 otáčkach/min. Zrazenina sa rozpustí v 50 ml 0,5 % kyseline octovej, dialyzuje 2-krát proti 5000 ml 0,5 % kyseline octovej a vymrazí. TAD môže byť skladovaný ako vymrazený prášok pri -20 °C.
Nerozpustný polyhydroxypolymér, ako je agaróza alebo zositený dextrán môžu byť aktivované trezylom vytvorením suspenzie polyhydroxylpolyméru napríklad v acetóne a uskutočnením syntézy ako je syntéza na pevnej fáze. Aktivovaný polyhydroxypolymér môže byť zberaný filtráciou. Vhodné metódy sú opísané napr. v Nilsson K. a Mosbach K. (1987) Methods in Enzymology 135, str. 67 a v Hermansson G. T. et al. (1992) a v „Immobilized Affinity Ligand Techniques“, Academic Press, Inc., str. 87.
Syntéza A beta peptidových kopolymérových vakcín
TAD (10 mg) sa rozpustí v 100 pl H2O a 1000 pl uhličitanového tlmivého roztoku, pH 9,6, obsahujúceho 5 mg Αβ-42 (SEQ ID NO:2, zvyšky 673-714) a pridajú sa 2,5 mg P2 (SEQ ID NO: 4) a 2,5 mg P30 (SEQ ID NO: 6). Αβ-42 a P2 a P30 peptidy obsahujú chránené lyzínové skupiny: tie sú vo forme l-(4,4-dimetyl-2,6-dioxocyklohex-l-ylidén)etylu (Dde) chránených lyzinových skupín. Peptidy sa pripravia prostredníctvom štandardného Fmoc postupu, kde bežný Fmoc-Lys(Boc)-OH je substituovaný Fmoc-Lys(Dde)-OH (získaný od Novabiochem, kat. č. 04-12-1121), tzn. že E-aminoskupina v lyzíne je chránená Dde namiesto Boe.
Hodnota pH sa mieria a upravuje na 9,6 použitím 1 M HC1. Po 2,5 hodinách sa pri teplote miestnosti pridá hydrazín z 80 % roztoku do konečnej koncentrácie 8 % a roztok sa inkubuje ďalších 30 minút pri teplote miestnosti a potom ihneď vymrazuje. Vymrazený produkt sa rozpustí v H2O a dialyzuje proti H2O pred konečným vymrazovaním.
Pomer medzi B-bunkovými epitopmi (Αβ) a T-pomocnými epitopmi (P2 a P30) vo finálnom produkte sa môže meniť použitím rôznych koncentrácii týchto peptidov v tomto stupni syntézy. Navyše môže byť finálny produkt označený napr. manózou (ako cieľa konjugácie k APC) pridaním aminovanej manózy k uhličitanovému tlmivému roztoku v syntetickom stupni.
Keď je na zlučovanie peptidov obsahujúcich B-bunkový epitop a T-pomocný epitop použitý nerozpustný aktivovaný polyhydroxypolymér, pripojenie polyméru môže byť realizované syntézou na pevnej fáze a koncový produkt sa zberá a čistí premytím a filtráciou.
Zoznam literatúry
Brookmeyer, R.; Gray, S.; Kawas, C. (1998 ). Projections of Alzheimer's Disease in the United States and the Public Health Imapact of Delaying Disease Onset. Američan Joumal of Public Health, 88(9), 1337-1342.
Buttini, M.; Orth, M.; Bellosta, S.; Akeefe, H.; Pitas, R. E.; Wyss-Coray, T.; Mucke, L.; Mahley, R. W. (1999). Expression of Human Apolipoproteín E3 or E4 in the Brains of Apoe-/- Mice: Isoform-Specific Effects on Neurodegeneration. Joumal of Neuroscience, 19, 4867-4880.
Clark, L. N.; Poorkaj, P.; Wszolek, Z.; Geschwind, D. H.; Nasreddine, Z. S.; Miller, B.; Li, D./Payami, H.; Awert, F.; Markopoulou, K.; Andreadis, A.; D'Souza, I.; Lee, V. M.; Reed, L.; Trojanowski, J. Q.; Zhukareva, V.; Bird, T.; Schellenberg, G.; Wilhelmsen, K. C. (1998). Pathogenic Implications of Mutations in the Tau Gene in Pallido-Ponto-Nigral Degeneration and Related Neurodegenerative Disorders Linked to Chromosome 17. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(22), 13103-13107.
Gupta, R. K. et. al. (1998), Dev Biol Stand. 92: 63-78.
Hsiao K. et al. (1998) Transgenic mice expressing Alzheimer amyloid precursor proteíns“, Exp. Gerontol. 33 (7-8), 883-889.
Hutton, M.; Lendon, C. L.; Rizzu, P.; Baker, M.; Froelich, S.; Houlden, H.; Pickering-Brown, S.; Chakraverty, S.; Isaacs, A.; Grover, A.; Hackett, J.; Adamson, J.; Lincoln, S.; Dickson, D.; Davies, P.; Petersen, R. C; Stevens, M.; de Graaff, E.; Wauters, E.; van Baren, J.; Hillebrand, M.; Joosse, M.; Kwon, J. M.; Nowotny, P.; Che, L. K.; Norton, J.; Morris, J.C.; Reed, L. E.; Trojanowski, J.; Basun, H.; Lannfelt, L.; Neystat, M.; Fahn, S.; Dark, F.; Tannenberg, T.; Dodd, P.; Hayward, N.; Kwok, J. B. J.; Schofield, P. R.; Andreadis, A.; Snowden, J.; Craufurd, D.; Neary, D.; Owen, F.; Oostra, B. A.; Hardy, J.; Goate, A.; van Swieten, J.; Mann, D.; Lynch, T.; Heutink, P. (1998). Association of Missense and 5’-Splice-Site Mutations in Tau with the Inherited Dementia FTDP-17. Náture, 393, 702-705.
Janus, C. et. al. (2000), Náture 408: 979 - 982.
Kas, H. S. (1997) J Microencapsul 14: 689-711
Leon, J., Cheng, C. K.; Neumann, P. J. (1998). Alzheimer's Disease Čare: Costs and Potential Savings. Health Affairs, 17(6), 206-216.
Lippa C. F. et al. (1998 ) Ab-42 deposition precedes other changes in PS-1 Alzheimer's disease. Lancet 352, 1117-1118
Luo, J.-J.; Wallace, W.; Riccioni, T.; Ingram, D. K.; Roth, G. S.; Kusiak, J. W. (1999). Death of PC12 Cells and Hippocampal Neurons Induced by Adenovixal-Mediated FAD Human Amyloid Precursor Proteín Gene Expression. Joumal of Neuroscience Research, 55 (5), 629-642.
Naruse, S.; Thinakaran, G.; Luo, J.-J.; Kusiak, J. W.; Tomita, T.; Iwatsubo, T.; Qian, X.; Ginty, D. D.; Price, D. L.; Borchelt, D. R.; Wong, P.C; Sisodia, S. S. (1998). Effects of PSI Deficiency on Membráne Proteín Trafficking inNeurons. Neurón, 21(5), 1213-1231.
National Inštitúte on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999, NIH Publication No. 99-4 664. Pietrobon, P. J. (1995), Pharm Biotechnol. 6: 347-61Poorkaj, P.; Bird, T. D.; Wijsman, E.; Nemens, E.; Garruto, R. M.; Anderson, L.; Andreadis, A.; Wiederhold, W. C.; Raskind, M.; Schellenberg, G. D. (1998). Tau Is a Candidate Gene for Chromosorae 17 Frontotemporal Dementia. Annals ofNeurology, 43, 815-825.
Schenk, D.; Barbour, R.; Dunn, W.; Gordon, G.; Grajeda, H.; Guido, T.; Hu, K.; Huang, J.; Johnson-Wood, K.; Khan, K.; Kholodenko, D.; Lee, M.; Liao, Z.; Lieberburg, I.; Motter, R.; Mutter', L.; Soriano, F.; Shopp, G.; Vasquez, N.; Vandevert, C; Walker, S.; Wogulis, M.; Yednock, T.; Games, D.; Seubert, P. (1999). Immunization with A-beta Attenuates Alzheimer's Disease-Like Pathology in the PDAPP Mouse. Náture, 400(6740), 173-177.
Shekunov, B. et. al. (1999), J. Crystal Growth 198/199: 1345 - 1351.
Spillantini, M. G.; Murrell, J. R.; Goedert, M.; Farlow, M. R.; Klug, A.; Ghetti, B. (1998). Mutation in the Tau Gene in Familial Multiple Systém Tauopathy with Presenile Dementia. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 95(13), 7737-7741.
Strittmatter, W. J.; Saunders, A. M.; Schmechel, D.; Pericak-Vance, M.; Enghild, J.; Salvesen, G. S.; Roses, A. D. (1993). Apolipoproteín E: High-Avidity Binding to Αβ and Increased Frequency of Type 4 Allele in Late-Onset Familial Alzheimer Disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 90, 1977-1981.
Vídal, R.; Frangione, B.; Rostagno, A.; Mead, S.; Revesz, T.; Plánt, G.; Ghiso, J. (1999). A Stop-Codon Mutation in the BRI Gene Associated with Familial British Dementia. Náture, 399: 776-781.
Zheng H. (1996) „Mice defícient for the amyloid precursor proteín gene. Ann. N Y Acad. Sci., 777, 421-426. York, P. (1999), PSTT 11: 430-440.
Zoznam sekvencií <110> M&E Biotech A/S <120> Nová metóda regulácie obsahu amyloidu <130> P1009PC1 <140> <141>
<160> 16 <170> Patentln Ver. 3.0 <210> 1 <211> 2313 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221>CDS <222> (1)..(2313) <220>
<221> rôzna charakteristika <222> (2095).. (2169) <223> Nukleotidy kódujúce transmembránový región <220>
<221> rôzna charakteristika <222> (2014)..(2313) <223> Nukleotidy kódujúce C-100 <220>
<221> rôzna charakteristika <222> (2016).. (2144) <223> Abeta 42/43 <221> rôzna charakteristika <222> (2014) ..(2142) <223> Abeta 42/43 <400> 1
atg Met 1 ctg ccc Leu Pro ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg get cgg 48
Gly Leu 5 Ala Leu Leu Leu Leu Ala 10 Ala Trp Thr Ala 1S Arg
gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat get ggc ctg ctg get gaa ccc 96
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag 144
Gin íle Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
35 40 45
aat 999 aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att 192
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys íle Asp
50 55 60
acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg 240
Thr Lys Glu Gly íle Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu
6$ 70 75 60
cag atc acc aat gtg gta gaa gCC aac caa cca gtg acc atc cag aac 288
Gin íle Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr íle Gin Asn
85 90 95
tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg 336
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
IUD τστ ΤΠΓ
att CCC tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc 384
íle Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc 432
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp val Cys
130 135 140
gaa Glu 145 act Thr cat His ctt Leu cac His tgg cac acc gtc Thr Val gcc Ala aaa Lys 155 gag Glu aca Thr tgc Cys agt Ser gag Glu 160 480
Trp 150 His
aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg' ttg ctg ccc tgc gga att 528
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly íle
1-65 170 175
gac aag ttc ega ggg/. gta gag ttt gtg tgt tgc cca ctg get gaa gaa 576
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
agt gac aat gtg gat tet get gat gcg gag gag gat gac tcg gat gtc 624
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195 200 205
tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa 672
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 215 220
gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg get gag gtg gaa gaa gaa 720
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa 768
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255
gag get gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc age att 816
Glu Ala Glu ’Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser íle
-2-&Θ- - -2-65- 2+H
gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tet gtg gaa gag gtg •gtt ega 864
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
gag gtg tgc tet gaa caa gcc gag acg ggg ccg tgc ega gca atg atc 912
Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met íle
290 295 300
tcc Ser 305 cgc Arg tgg tac Trp Tyr ttt Phe gat Asp 310 gtg Val act Thr gaa Glu ggg Gly aag Lys 315 tgt Cys gcc Ala cca Pro ttc Phe ttt Phe 320 960
tac ggc gga tgt gg<= ggc aac cgg aac aac ttt gac aca gaa gag tac 1008
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu. Glu Tyr
325 330 335
tgc atg gcc gtg tgt ggc age gcc atg tcc caa agt tta ctc aag act 1056 ’
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
acc cag gaa cct ctt gcc ega gat cct gtt aaa ctt cct aca aca gca 1104
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 365
gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag aca cct ggg gat 1152
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc 1200
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala .
3Θ5 390 395 400
aag cac ega gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gaa gag gca 124 8
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410 415
gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa get gat aag aag gca gtt atc 1296
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val íle
- 42G -425 . . ... - - 430-
cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tet ttg gaa cag gaa gca gcc aac 1344
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn
435 440 445
gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg 1392
Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450 455 •460
ctc Leu 465 aat Asn gac Asp ege Arg ege Arg ege Arg 470 ctg Leu gcc Ala ctg Leu gag aac tac Tyr atc íle acc Thr get Ala ctg Leu 480 1440
Glu Asn 475
cag get gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg ttc aat atg cta aag aag 1488
Gin Äla Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
485 490 495
tat gtc ege gca gaa. cag aag gac aga cag cac acc Cta aag cat ttc 1536
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
gag cat gtg ege atg gtg gat ccc aag aaa gcc get cag atc cgg tcc 1584
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin íle Arg Ser
515 520 525
cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag ege atg aat cag tct 1632
Gin Val Met Thr His Leu Arg Val íle Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser
530 535 540
ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg .gcc gag gag att cag gat 1680
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu íle Gin Asp
545 550 555 560
gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tca gat gac gtc 1728
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat get 1776
Leu Ala Asn Met íle Ser Glu Pro Arg íle Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
5ÄQ -5B5- .59H
ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg gag ctc ctt ccc 1824
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
595 600 605
gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag ccg tgg cat tct ttt 1872
Val Asn Gly Glu. Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 620
ggg get gac tet gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag -cct gtt 1920
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
gat gcc ega cct get gcc gac ega gga ctg’ acc act ega cca ggt tet 1968
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tet gaa gtg aag atg gat 2016
Gly Leu Thr Asn íle Lys Thr Glu Glu íle Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 67 0
gca gaa ttc ega cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa ttg 2064
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu
67 5 680 685
gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gca atc att gga 2112
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala íle íle Gly
690 695 700
ctc atg gtg ggc g g t gtt gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg 2160
Leu Met Val Gly Gly val Val íle Ala Thr Val íle Val íle Thr Leu
705 710 715 720
gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg 2208
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser íle His His Gly Val Val
725 730 735
gag gtt gac gcc get gtc acc cca gag gag ege cac ctg tcc aag atg 2256
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
•7-4Ô- - +4-5- - +5-Θ
cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg 2304
Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met
755 760 765 cag aac tag
Gin Asn
770
2313 <210>2 <211>770 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2 Leu Leu 10 Ala Ala Trp Thr Ala 15 Arg
Met 1 Leu Pro Gly Leu Ala 5 Leu Leu
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
Gin íle Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin
35 40 45
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys íle Asp
50 55 60
Thr Lys Glu Gly íle Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65 70 75 80
Gin íle Thr Asn Val 85 Val Glu Ala Asn Gin 90 Pro Val Thr íle Gin 95 Asn
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
·. 100 105 110
íle Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys
130 135 140
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu
145 150 155 160
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly íle
165 17.0 175
Asp Lys •Phe Arg 180 Gly Val Glu Phe Val 185 Cys Cys Pro Leu Ala 190 Glu Glu
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195 200 205
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 215 220
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser íle
260 265 270
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met íle
290 295 300 -
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe •Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
325 330 335
Cys- -Met—Ala. -Val- -Cys- Gly- Ser .Ala. -Met. -Ser. Gin ..Ser Teň· Leu. Lys ..Thr
340 345 350
Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 365
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
Glu 385 Asn Glu His Ala His 390 Phe Gin Lys Ala Lys 395 Glu Arg Leu Glu Ala 400
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410> 415
Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val íle
420 425 430
Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn
435 440 445
Glu Arg 450 Gin Gin Leu Val Glu Thr 455 His Met Ala Arg 460 Val Glu Ala Met
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr íle Thr Ala Leu
4 65 470 475 480
Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
4 85 490 4 95
Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin íle Arg Ser
515 520 525
Gin Val Met Thr ' His Leu Arg Val íle Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser
530 535 540
—L«u-Sex .Leu—Leu Tyr Asn -Val. Prn ala Val aia Gin Gin
545 550 555 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
Leu Ala Asn Met íle Ser Glu Pro Arg íle Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
580 585 5 90
Leu Met Pro 595 Ser Leu Thr Glu Thr 600 Lys Thr Thr Val Glu 605 Leu Leu Pro
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe
610 615 620
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
•625 630 635 640
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
•Gly Leu Thr Asn íle Lys Thr Glu Glu íle Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 67 0
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu
675 680 685
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala íle íle Gly
690 695 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val íle Ala Thr Val íle Val íle Thr Leu
705 710 715 720
Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser íle His His Gly Val Val
725 730 735
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
Gin Gin Ae-a--Gly--T-y-s- Glu
-Bhé-G.Ui-Gln -Het..
755
760
765
Gin Asn
770 <210>3 <211> 45 <212> DNA <213> Clostridium tetani <220>
<221>CDS <222> (1)..(45) <223> DNA kódujúca P2 epitop <400> 3 cag tac atc aaa get aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg
Gin Tyr íle Lys Ala Asn S-er Lys Phe íle Gly íle Thr Glu Leu
5' 10 15 <210>4 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 4
Gin Tyr íle Lys Ala Asn Ser Lys Phe íle Gly íle Thr Glu Leu
I . 5 10 15 <210>5 <211> 63 <212>DNA <213> Clostridium tetani <220>
<221>CDS <222> (1).. (63) <223> DNA kódujúca P30 epitop <400> 5
ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc 40
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
get agc cac ctg gaa
Ala Ser His Leu Glu <210> 6.
<211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 6
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
Ala Ser His Leu Glu <210>7 <211>21 <212>DNA <213> Syntetická <400> 7 caactcagct tcctttcggg c <210>8 <211>21 <212>DNA <213> Syntetická
44W- -8— agatctcgat cccgcgaaat t <210>9 <211> 135 <212> DNA <213> Syntetická <400>9 atggatgcag aattccgtca cgactccggt tacg'aagttc accaccagaa actggttttc60 ttcgcagaag atgttggttc caacaaaggt gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt 120 gttatcgcga cctag135 <210> 10 <211>31 <212>DNA <213> Syntetická <400> 10 gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c 31 <210> 11 <211> 39 <212>DNA <213> Syntetická <400> 11 gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc <210> 12 <211> 84 <212>DNA <213> Syntetická <400>12 ccggcaagcť tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg60 gtcgcgataa caacaccgcc aacc84 <210> 13 <212> DNA <213> syntetická <400> 13 gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgaaagttag cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g
101 <210> 14 <211> 172 <212>DNA <213> syntetická <400> 14 gggccaagct tggatccggt cctttgttgg aaccaacatc ccggagtcgt. gacggaactc cgcgataaca ttctgcgaag tgcatccagc acaccgccaa aaaaccagtt tcggtgatac ccatcagacc tctggtggtg cgatgaattt gatgattgca aacttcgtaa gg
120
172 <210> 15 <211> 30 <212>DNA <213> syntetická <400> 15 ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc 30 <210> 16 <211>35.
<212>DNA <213> Syntetická <400> 16 gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc 35
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (41)

1. Použitie činidlá zvoleného z
a) aspoň jedného analógu autológneho β amyloidného, Αβ, alebo amyloidného prekurzorového proteínového, APP, polypeptidu živočícha, do ktorého je zavedený aspoň jeden izolovaný cudzí epitop pomocných T buniek (TH epitop) prostredníctvom inzercie, adície, delécie alebo substitúcie aminokyseliny, pričom cudzí TH epitop neobsahuje D-aminokyseliny a zavádza sa do autológneho AP alebo APP polypeptidu tak, ako je to schematicky znázornené pre P2 a P30 epitopy na obr.,
b) sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej aspoň jeden analóg definovaný v odseku a) alebo d) nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu nesúceho fragment nukleovej kyseliny definovaný v odseku b) na výrobu liečiva obsahujúceho činidlo na liečenie a/alebo prevenciu, a/alebo zlepšenie Alzheimerovej choroby, alebo iných chorôb alebo stavov charakterizovaných Αβ depozitmi u týchto živočíchov.
2. Použitie podľa nároku 1, kde zavedenie aspoň jedného izolovaného cudzieho epitopu pomocných T buniek má za následok, že sa zachová podstatný podiel epitopov Αβ alebo APP polypeptidu B-bunky a že
- sa zavedie aspoň jeden prvý zvyšok, ktorý vyvolá zameranie analógu na bunku prezentujúcu antigén (APC) alebo B-lymfocyt a/alebo
- sa zavedie aspoň jeden druhý zvyšok, ktorý stimuluje imunitný systém a/alebo
- sa zavedie aspoň jeden tretí zvyšok, ktorý optimalizuje prezentáciu analógu imunitnému systému.
3. Použitie podľa nároku 2, kde analóg sa modifikuje zavedením prvého a/alebo druhého, a/alebo tretieho zvyšku pripojením k vhodnej chemickej skupine v Αβ, APP polypeptidu alebo jeho subsekvencii prostredníctvom kovalentnej alebo nekovalentnej väzby.
4. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde analóg zahrnuje duplikáciu aspoň jedného epitopu B-bunky AP alebo APP polypeptidu a/alebo zavedenie hapténu.
5. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde cudzí T-bunkový epitop je v živočíchovi imunodominantný.
6. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde cudzí T-bunkový epitop je promiskuitný, ako je to u cudzieho T-bunkového epitopu zvoleného z prírodného promiskuitného T-bunkového epitopu a umelej MHC-II väzbovej peptidovej sekvencie.
7. Použitie podľa nároku 6, kde prírodný T-bunkový epitop je zvolený z toxoidného epitopu tetánu, ako je P2 alebo P30, toxoidného epitopu záškrtu, hemagluttinínového epitopu chrípkového vírusa a CS epitopu P.falciparum.
8. Použitie podľa niektorého z nárokov 2 až 7, kde prvý zvyšok je špecifickým väzbovým partnerom pre B-lymfocyt špecifický povrchový antigén alebo pre APC špecifický povrchový antigén, ako je haptén alebo sacharid, pre ktorý existuje receptor v B-lýmfocytu alebo APC.
9. Použitie podľa niektorého z nárokov 2 až 8, kde druhý zvyšok je zvolený z citokínu, ako je interferón gamma (IFN- gamma) alebo ich účinná časť, Flt3L alebo jeho účinná časť, interleukín 1 (IL-1) alebo jeho účinná časť, interleukín 2 (IL-2) alebo jeho účinná časť, interleukín A (IL-4) alebo jeho účinná časť, interleukín 6 (IL-6) alebo jeho účinná časť, interleukín 12 (IL-12) alebo jeho účinná časť, interleukín 13 (IL-13) alebo jeho účinná časť, interleukín 15 (IL-15) alebo jeho účinná časť, faktor stimulujúci granulocytmakrofágové kolónie (GM-CSF) alebo jeho účinná časť, hormón, proteín tepelného šoku, ako je HSP70 alebo jeho účinná časť, HSP90 alebo jeho účinná časť, HSC70 alebo jeho účinná časť, GRP94 alebo jeho účinná časť a kalretikulín (CRT) alebo jeho účinná časť.
10. Použitie podľa niektorého z nárokov 2 až 9, kde tretí zvyšok má lipidickú povahu, ako je palmitoylskupina, myristylskupina, famesylskupina, geranyl-geranylskupina, GPI-kotevná skupina, N-acyldiglyceridová skupina alebo kde tretím zvyškom je polyhydroxypolymér, ako polysacharid.
11. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde autológny AP alebo APP polypeptid je modifikovaný tak, aby zachoval B-bunkové epitopy, ktoré nie sú exponované extracelulámej fáze, keď sú prítomné vo forme viazanej k bunke autológneho APP.
12. Použitie podľa nároku 11, kde AP alebo APP polypeptid je modifikovaný tak, aby stratil aspoň jeden B-bunkový epitop, ktorý je exponovaný extracelulámej fáze, keď je prítomný vo forme viazanej k bunke autológneho APP polypeptidu.
13. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde je substituovaná aspoň jedna aminokyselinová sekvencia v autológnom Αβ alebo APP polypeptide aminokyselinovou sekvenciou s rovnakou alebo odlišnou dĺžkou vyvolávajúcou vznik cudzieho TH epitopu v analógu.
14. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde analóg obsahuje aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu aminokyselinám 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2, pričom je vložená aminokyselinová sekvencia vyvolávajúca vznik cudzieho TH epitopu v analógu alebo kde analóg obsahuje aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúcu aminokyselinám 672 až 714 v SEQ ID NO: 2, kde aspoň jedna aminokyselinová sekvencia je nahradená aminokyselinovou sekvenciou s rovnakou alebo odlišnou dĺžkou, aby pritom vznikol cudzí TH epitop.
15. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 13, kde sa analóg od N-konca k C-konci skladá z aminokyselinových zvyškov 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 4, ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 6 a ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 672 až 714 zo SEQ ID NO: 2.
16. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 13, kde sa analóg od N-konca ku C-konci skladá z aminokyselinových zvyškov 630 až 634 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 6, ďalej nasleduje sekvencia SEQ ID NO: 4 a ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 671 až 714 zo SEQ ID NO: 2.
17. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 13, kde sa analóg od N-konca ku C-konci skladá z aminokyselinových zvyškov 672 až 713 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 6, ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 729 až 734 zo SEQ ID NO: 2, po ktorých nasleduje sekvencia ID NO: 4 a ďalej nasledujú aminokyselinové zvyšky 750 až 770 zo SEQ ID NO: 2.
18. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde sú k nosičovej molekule schopnej zaistiť prezentáciu viacerých kópií antigénnych determinantov viazané aspoň dve kópie analógu prostredníctvom kovalentnej alebo nekovalentnej väzby.
19. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde analóg je formulovaný s adjuvantom, ktorý umožňuje zrušiť autotoleranciu proti autoantigenom.
20. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde účinné množstvo analógu je vo forme na parenterálne ako intrakutárme subkutánne a intramuskuláme podanie; peritoneálne podanie; perorálne podanie; bukálne podanie; sublinguálne podanie; epidurálne podanie; spinálne podanie; análne podanie a intrakraniálne podanie.
21. Použitie podľa nároku 20, kde účinné množstvo analógu predstavuje 0,5 až 2000 pg.
22. Použitie podľa nároku 20 alebo 21, kde analóg je obsiahnutý v zariadení virtuálnej lymfatickej uzliny (VLN).
23. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 17, kde negatívna regulácia zahrnuje zavedenie nukleovej kyseliny alebo nukleových kyselín kódujúcich analóg do buniek živočícha a tým dosiahnutie in vivo expresie tejto nukleovej kyseliny alebo týchto nukleových kyselín bunkami.
24. Použitie podľa nároku 23, kde nukleová kyselina alebo nukleové kyseliny sa zvolia zo súboru pozostávajúceho z prostej DNA, DNA formulovanej s nabitými alebo nenabitými lipidmi, DNA formulovanej v lipozómoch, DNA obsiahnutej vo vírusovom vektore, DNA formulovanej s proteínom alebo polypeptidom umožňujúcim transfekciu, DNA formulovanej so smerovacím proteínom alebo polypeptidom, DNA formulovanej s činidlami zrážajúcimi vápnik, DNA kopulovanej s inertnou nosičovou molekulou, DNA zapuzdrenej v chitinu alebo chitosánu a DNA formulovanej s adjuvantom.
25. Použitie podľa nároku 24, kde nukleová kyselina alebo nukleové kyseliny sú obsiahnuté v zariadení VLN.
26. Použitie podľa niektorého z nárokov 21 až 25, ktoré zahrnuje aspoň jedno podanie/zavedenie za rok, ako aspoň 2, aspoň 3, aspoň 4, aspoň 6 alebo aspoň 12 podanie/zavedenie za rok.
27. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 17, kde liečenie a/alebo prevencia, a/alebo zlepšovanie stavu zahrnuje podávanie nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu nesúceho fragment nukleovej kyseliny kódujúcej a exprimujúcej analóg.
28. Analóg amyloidogénneho polypeptidu, ktorý je odvodený od autológneho β amyloidného, Αβ, alebo amyloidného prekurzorového proteínového, APP, polypeptidu živočícha, do ktorého je zavedený aspoň jeden cudzí TH epitop, ako je to schematicky znázornené pre epitopy P2 a P30 na obr. 1 tak, aby imunizácia živočícha analógom indukovala produkciu protilátok proti amyloidogénnemu polypeptidu.
29. Analóg podľa nároku 28, kde modifikácia je definovaná v niektorom z nárokov 2 až 17.
30. Imunogénna kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje imunogenicky účinné množstvo analógu podľa nároku 28 alebo 29, pričom kompozícia ďalej obsahuje farmaceutický a imunologický vhodný nosič a/alebo vehikulum a prípadne adjuvans.
31. Fragment nukleovej kyseliny kódujúci analóg podľa nároku 28 alebo 29.
32. Vektor nesúci fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 31, ako vektor, ktorý je schopný autonómnej replikácie.
33. Vektor podľa nároku 32 zvolený zo súboru pozostávajúceho z plazmidu, fágu, kozmidu, minichromozómu a vírusa.
34. Vektor podľa nároku 32 alebo 33 obsahujúci v smere 5' —> 3' a v operabilnom spojení promotor poháňajúci expresiu fragmentu nukleovej kyseliny podľa nároku 31, prípadne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej vedúci peptid umožňujúci sekréciu polypeptidového fragmentu alebo jeho integráciu do membrány, fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 31a prípadne terminátor.
35. Vektor podľa niektorého z nárokov 32 až 34, ktorý po zavedení do hostiteľskej bunky je alebo nie je schopný sa integrovať do genómu hostiteľskej bunky.
36. Vektor podľa nároku 34 alebo 35, kde promotor poháňa expresiu v eukaryotickej bunke a/alebo prokaryotickej bunke.
37. Transformovaná bunka nesúca vektor podľa niektorého z nárokov 32 až 36, ako transformovaná bunka, ktorá je schopná replikovať fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 31.
38. Transformovaná bunka podľa nároku 37, ktorou je mikroorganizmus zvolený z baktérie, kvasinky, prvoka alebo bunka pochádzajúca z viacbunkového organizmu zvolená z bunky huby, bunky hmyzu, ako bunky S2 alebo SF, rastlinnej bunky a cicavčej bunky.
39. Transformovaná bunka podľa nároku 37 alebo 38 exprimujúci fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 31, ako je transformovaná bunka, ktorá vylučuje alebo na svojom povrchu nesie analóg podľa nároku 28 alebo 29.
40. Kompozícia na indukciu produkcie protilátok proti Αβ alebo APP polypeptidu v živočíchovi, kde tieto proteiny sú autológne, vyznačujúca sa tým, že obsahuje fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 31 alebo vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 36 a farmaceutický a imunologický prijateľný nosič a/alebo vehikulum, a/alebo adjuvans.
41. Stabilná bunková línia nesúca vektor podľa niektorého z nárokov 32 až 36 exprimujúca fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 31, ktorá pripadne vylučuje alebo nesie na svojom povrchu analóg podľa nároku 28 alebo 29.
SK1178-2002A 2000-02-21 2001-02-19 Použitie analógu autológneho Aß alebo APP polypeptidu živočícha, analóg, fragment nukleovej kyseliny, vektor, transformovaná bunka, bunková línia a kompozície SK287468B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000265 2000-02-21
US18629500P 2000-03-01 2000-03-01
PCT/DK2001/000113 WO2001062284A2 (en) 2000-02-21 2001-02-19 Novel method for down-regulation of amyloid

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK11782002A3 SK11782002A3 (sk) 2004-02-03
SK287468B6 true SK287468B6 (sk) 2010-10-07

Family

ID=8159174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1178-2002A SK287468B6 (sk) 2000-02-21 2001-02-19 Použitie analógu autológneho Aß alebo APP polypeptidu živočícha, analóg, fragment nukleovej kyseliny, vektor, transformovaná bunka, bunková línia a kompozície

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20030086938A1 (sk)
EP (2) EP1259251B1 (sk)
JP (1) JP5025871B2 (sk)
CN (1) CN1279971C (sk)
AR (1) AR027947A1 (sk)
AT (1) ATE306933T1 (sk)
BR (1) BR0108566A (sk)
CO (1) CO5280094A1 (sk)
DE (1) DE60114157T2 (sk)
DK (1) DK1259251T3 (sk)
EA (1) EA008762B1 (sk)
EE (1) EE200200444A (sk)
EG (1) EG25830A (sk)
ES (1) ES2248283T3 (sk)
GC (1) GC0000355A (sk)
HK (1) HK1054865B (sk)
HU (1) HUP0300067A3 (sk)
IL (3) IL150066A0 (sk)
IS (1) IS6446A (sk)
ME (2) MEP30408A (sk)
MY (1) MY131826A (sk)
NO (1) NO20023961D0 (sk)
NZ (1) NZ521442A (sk)
PL (1) PL204878B1 (sk)
RS (1) RS51164B (sk)
SI (1) SI1259251T1 (sk)
SK (1) SK287468B6 (sk)
WO (1) WO2001062284A2 (sk)
ZA (1) ZA200204830B (sk)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6905686B1 (en) 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
US6689753B1 (en) * 1999-11-05 2004-02-10 Axonyx, Inc. β sheet breaker peptide analogs that inhibit β pleated sheet formation in amyloid β-peptide
KR100879810B1 (ko) * 2000-02-21 2009-01-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
WO2001062284A2 (en) * 2000-02-21 2001-08-30 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
EP1251138B1 (en) * 2001-04-19 2006-07-26 Hermann Dr. Schätzl Prion protein dimers useful for vaccination
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
EP1820806A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-22 Crossbeta Biosciences B.V. Affinity regions
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
EP1380290A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-14 Universitair Medisch Centrum Utrecht Cross-beta structure pathway and its therapeutic relevance
US20070003552A1 (en) * 2002-07-09 2007-01-04 Gebbink Martijn F B Cross-beta structure comprising amyloid binding proteins and methods for detection of the cross-beta structure, for modulating cross-beta structures fibril formation and for modulating cross-beta structure-mediated toxicity and method for interfering with blood coagulation
EP1532167B1 (en) 2002-07-17 2012-01-25 Cytos Biotechnology AG Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the ap205 coat protein
NZ537003A (en) 2002-07-18 2008-03-28 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
SI1524994T1 (sl) 2002-07-19 2011-08-31 Cytos Biotechnology Ag Sestavki cepiv, ki vsebujejo amiloidne beta 1-6 antigenske mreĹľe
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US7358331B2 (en) * 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
TWI306458B (en) 2003-05-30 2009-02-21 Elan Pharma Int Ltd Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US7674599B2 (en) * 2003-11-08 2010-03-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of using antibodies to detect alpha-synuclein in fluid samples
JP4696079B2 (ja) 2003-12-17 2011-06-08 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー Ａβ免疫原性ペプチド担体結合物およびそれの製造方法
GB0424563D0 (en) 2004-11-05 2004-12-08 Novartis Ag Organic compounds
CA2590337C (en) 2004-12-15 2017-07-11 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
JP4903159B2 (ja) * 2005-04-20 2012-03-28 ディナベック株式会社 アルツハイマー病の治療のための安全性に優れた鼻腔内投与可能遺伝子ワクチン
EP1906995A2 (en) * 2005-07-13 2008-04-09 Crossbeta Biosciences B.V. Adjuvation through cross- structure
CA2615028A1 (en) 2005-07-13 2007-01-18 Crossbeta Biosciences B.V. Cross-.beta. structure binding compounds
US20070015133A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Umc Utrecht Holding B.V. Method for detecting and/or removing protein and/or peptide comprising a cross-beta structure from an aqueous solution comprising a protein
US8114832B2 (en) * 2005-07-13 2012-02-14 Crossbeta Biosciences B.V. Method for detecting and/or removing a protein comprising a cross-beta structure from a pharmaceutical composition
RU2442793C2 (ru) 2005-11-30 2012-02-20 Эбботт Лэборетриз АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ
SG2014013437A (en) 2005-11-30 2014-07-30 Abbott Lab Monoclonal antibodies and uses thereof
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
JP2007300856A (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Hiroshi Mori アミロイドタンパク質模倣物
WO2008040759A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Pharmexa A/S Method for down-regulation of cripto
US8188046B2 (en) 2006-10-16 2012-05-29 University Of South Florida Amyloid beta peptides and methods of use
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
PL2118300T3 (pl) * 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US7618944B2 (en) * 2007-03-01 2009-11-17 Intezyne Technologies, Inc. Encapsulated amyloid-beta peptides
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
ES2498040T3 (es) 2007-07-27 2014-09-24 Janssen Alzheimer Immunotherapy Tratamiento de enfermedades amiloidogénicas con anticuerpos anti-beta humanizados
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2058000A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Immunogenic compositions capable of activating T cells
EP2058001A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-13 Crossbeta Biosciences B.V. Enhancement of immunogenicity of antigens
AU2009263759B2 (en) 2008-06-27 2013-06-06 Zoetis Services Llc Novel adjuvant compositions
US8491890B2 (en) 2008-07-09 2013-07-23 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods and compositions for inhibiting diseases of the central nervous system
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
US9925282B2 (en) 2009-01-29 2018-03-27 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
EP2258398A1 (en) 2009-05-26 2010-12-08 Araclón Biotech, S. L. Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
CN101858910B (zh) * 2010-03-25 2013-03-27 辽宁大学 一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
EP3527220A1 (en) 2010-08-12 2019-08-21 AC Immune S.A. Vaccine engineering
JP6147665B2 (ja) 2010-08-14 2017-06-14 アッヴィ・インコーポレイテッド アミロイドベータ結合タンパク質
WO2012055933A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Ac Immune S.A. Liposome-based construct comprising a peptide modified through hydrophobic moieties
US20120321694A1 (en) * 2010-10-27 2012-12-20 Daniel Larocque Compositions and uses
CN104869993B (zh) 2012-10-25 2019-01-15 通用医疗公司 治疗阿尔茨海默病及相关疾病的组合疗法
US10058530B2 (en) 2012-10-25 2018-08-28 The General Hospital Corporation Combination therapies for the treatment of Alzheimer's disease and related disorders
US10525005B2 (en) 2013-05-23 2020-01-07 The General Hospital Corporation Cromolyn compositions and methods thereof
KR20200039025A (ko) 2013-09-19 2020-04-14 조에티스 서비시즈 엘엘씨 유성 아쥬반트
US10188757B2 (en) 2013-10-22 2019-01-29 The General Hospital Corporation Cromolyn derivatives and related methods of imaging and treatment
US10144778B2 (en) * 2014-03-12 2018-12-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
CN114699518A (zh) 2015-01-16 2022-07-05 硕腾服务有限责任公司 口蹄疫疫苗
CA3063061A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Ohio State Innovation Foundation Peptides and methods for treating neurodegenerative disorders
CA3033079A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 The General Hospital Corporation Macrophages/microglia in neuro-inflammation associated with neurodegenerative diseases
CN106854233B (zh) * 2017-03-03 2020-07-17 国家纳米科学中心 一种类肽及其制备方法和应用
CN107412782B (zh) * 2017-04-27 2020-09-08 国家纳米科学中心 一种多肽聚合物纳米材料及其制备方法和应用
CN111328287A (zh) 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子
MX2020000577A (es) 2017-07-20 2020-09-10 Aztherapies Inc Formulaciones en polvo de cromolina sodica e ibuprofeno.
AU2019299347A1 (en) 2018-07-02 2021-01-21 Aztherapies, Inc. Powdered formulations of cromolyn sodium and alpha-lactose
CN112210003A (zh) * 2019-07-09 2021-01-12 厦门德馨尚品医疗科技有限公司 一种重组载脂蛋白j及其类似物的晶体结构及应用

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4596792A (en) * 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) * 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4608251A (en) * 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US5278056A (en) * 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5192688A (en) * 1988-08-15 1993-03-09 Switzer Iii Robert C Histological analysis method
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US5851787A (en) * 1992-04-20 1998-12-22 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding amyloid precursor-like protein and uses thereof
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
US5747323A (en) * 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
DK96493D0 (da) * 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
CN1135181A (zh) * 1993-09-14 1996-11-06 Cytel有限公司 使用泛dr结合肽改变免疫应答
AUPM411994A0 (en) * 1994-02-25 1994-03-24 Deakin Research Limited Epitopes
US5709995A (en) * 1994-03-17 1998-01-20 The Scripps Research Institute Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5573916A (en) * 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
ATE218583T1 (de) * 1995-03-14 2002-06-15 Praecis Pharm Inc Verbindungen mit aggregations-modulierenden wirkung auf das amyloid protein
US5874469A (en) * 1996-01-05 1999-02-23 Alcon Laboratories, Inc. Fluoroalkyl hydrocarbons for administering water insoluble or unstable drugs
US5854469A (en) * 1996-06-28 1998-12-29 Gabay; David Heating unit for therapeutic instrument
US5985581A (en) * 1996-07-25 1999-11-16 The Mclean Hospital Corporation Use of presenilin-1 for diagnosis of alzheimers disease
IT1293511B1 (it) * 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US20040062802A1 (en) * 1998-04-02 2004-04-01 Hermelin Victor M. Maximizing effectiveness of substances used to improve health and well being
US20050059802A1 (en) * 1998-04-07 2005-03-17 Neuralab Ltd Prevention and treatment of amyloidogenic disease
CN1318105A (zh) * 1998-09-15 2001-10-17 M&E生物技术公司 负调节Osteoprotegerin配体活性的方法
NZ511055A (en) * 1998-10-05 2003-10-31 Pharmexa As Novel methods for therapeutic vaccination
EP2322210A1 (en) * 1999-04-19 2011-05-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide
US6787637B1 (en) * 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
EP1237930B1 (en) * 1999-12-08 2006-11-08 Intellect Neurosciences, Inc. Chimeric amyloid beta peptides
KR100879810B1 (ko) * 2000-02-21 2009-01-22 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법
WO2001062284A2 (en) * 2000-02-21 2001-08-30 Pharmexa A/S Novel method for down-regulation of amyloid
ATE286072T1 (de) * 2000-05-22 2005-01-15 Univ New York Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
US7097837B2 (en) * 2001-02-19 2006-08-29 Pharmexa A/S Synthetic vaccine agents
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
MY144532A (en) * 2001-08-20 2011-09-30 Lundbeck & Co As H Novel method for down-regulation of amyloid
US20030185845A1 (en) * 2001-11-16 2003-10-02 Steen Klysner Novel immunogenic mimetics of multimer proteins
EP1485122A2 (en) * 2002-03-11 2004-12-15 Pharmexa A/S Novel application of vaccination against tnf-alpha
US20040091945A1 (en) * 2002-07-17 2004-05-13 Cheryl Fitzer-Attas Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against Alzheimer's Disease

Also Published As

Publication number Publication date
IL189646A0 (en) 2011-07-31
EE200200444A (et) 2003-12-15
HUP0300067A2 (en) 2003-05-28
EP1632242A2 (en) 2006-03-08
SI1259251T1 (sl) 2006-04-30
DE60114157D1 (de) 2006-03-02
EP1259251A2 (en) 2002-11-27
HK1054865B (zh) 2007-06-01
SK11782002A3 (sk) 2004-02-03
AR027947A1 (es) 2003-04-16
PL362889A1 (en) 2004-11-02
ZA200204830B (en) 2003-11-26
DK1259251T3 (da) 2006-03-06
JP5025871B2 (ja) 2012-09-12
CO5280094A1 (es) 2003-05-30
CN1279971C (zh) 2006-10-18
IL150066A (en) 2009-02-11
ME00183B (me) 2011-02-10
WO2001062284A3 (en) 2001-11-29
CN1416350A (zh) 2003-05-07
EA008762B1 (ru) 2007-08-31
HK1054865A1 (en) 2003-12-19
WO2001062284A2 (en) 2001-08-30
MEP30408A (en) 2010-10-10
YU57702A (sh) 2005-09-19
IL150066A0 (en) 2002-12-01
NO20023961L (no) 2002-08-20
BR0108566A (pt) 2002-11-19
ATE306933T1 (de) 2005-11-15
EP1632242A3 (en) 2011-08-31
JP2003523402A (ja) 2003-08-05
EA200200889A1 (ru) 2003-02-27
GC0000355A (en) 2007-03-31
US20070041945A1 (en) 2007-02-22
HUP0300067A3 (en) 2010-03-29
MY131826A (en) 2007-09-28
US20090311281A1 (en) 2009-12-17
NZ521442A (en) 2003-09-26
PL204878B1 (pl) 2010-02-26
IS6446A (is) 2002-06-26
EP1259251B1 (en) 2005-10-19
RS51164B (sr) 2010-10-31
ES2248283T3 (es) 2006-03-16
US20030086938A1 (en) 2003-05-08
EG25830A (en) 2012-09-02
NO20023961D0 (no) 2002-08-20
DE60114157T2 (de) 2006-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7135181B2 (en) Method for down-regulation of amyloid
JP5025871B2 (ja) アミロイドの新規なダウン−レギュレート方法
EP1420815B1 (en) Beta-amyloid-analogue - t-cell epitop vaccine
AU2002325199A1 (en) Beta-amyloid-analogue-T-cell epitop vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20140219