KR20200039025A - 유성 아쥬반트 - Google Patents

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로렌 윌메스
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리차드 리 크렙스
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윌리엄 도나치
아니타 도로타 자그라츠
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Abstract

본 발명은 오일 에멀젼 내 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 다가양이온성 담체, 스테롤, 사포닌, 4차 아민, TLR-3 작용제, 당지질, 및 MPL-A 또는 이의 유사체의 조합을 포함하는 다양한 제형, 면역성 조성물 및 백신의 제조에 있어서 이의 용도, 및 동물의 치료에 있어서 이들의 용도를 제공한다.

Description

유성 아쥬반트{OIL-BASED ADJUVANTS}
본 발명은 일반적으로 면역성 및 백신 조성물에 사용하기 위해 항원에 대한 면역반응을 개선하기 위한 신규의 아쥬반트 제형에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 아쥬반트, 면역성 조성물 및 백신 조성물을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
세균성, 바이러스성 및 기생충 감염은 사람 및 동물에 널리 퍼져있다. 상기 감염원들에 의해 발생한 질환들은 종종 항균성 약물요법에 대하여 내성이 있어서, 효과적인 치료수단이 없는 실정이다. 결과적으로, 전염병을 제어하기 위해 백신학 접근법이 점점 더 많이 사용되고 있다. 모든 전염성 병원균은 화학적 불활성화 또는 적당한 유전자조작 후에 백신 제형에 사용하기에 적당하도록 제조될 수 있다. 선택적으로, 병원균의 단백질 서브유닛은 재조합 발현 시스템에서 발현될 수 있고, 백신 제형에 사용하기 위해 정제될 수 있다. 백신은 조성물에서 적당한 아쥬반트를 포함함으로써 보다 효과적이도록 제조될 수 있다.
용어 "아쥬반트"는 일반적으로 항원에 대한 체액성 또는 세포성 면역반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 아쥬반트들은 두가지 목적들을 수행하기 위해 사용된다: 이들은 주사 부위에서 항원들의 방출을 느리게 하며, 이들은 면역 시스템의 자극(stimulation)을 개선한다. 전형적인 백신들은 일반적으로 불활성화 또는 살해된 또는 변형된 생 병원균 미생물의 생약 제제로 조성되어 있다. 상기 병원균 미생물들의 배양액과 관련된 불순물들은 면역반응을 개선하기 위한 아쥬반트로서 작용할 수 있다. 그러나, 병원균 미생물 또는 정제 단백질 서브유닛의 균질한 제제를 항원으로서 사용하는 백신들에 의해 적용된 면역력은 종종 나빴다. 그러므로, 아쥬반트와 같은 특정 외인성 물질들을 첨가하는 것이 필요하게 된다. 그리고, 일부 경우, 합성 및 서브유닛 백신들은 제조하기에 비용이 많이 들 수 있다. 또한, 일부 경우, 병원균은 상업적인 규모로 성장할 수 없으며, 따라서 합성/서브유닛 백신들은 오로지 생균 옵션만 대표한다. 아쥬반트를 첨가하면, 유사한 면역반응을 활성화시키기 위해 더 적은 용량의 항원을 사용하도록 할 수 있도록 하며, 그럼으로써 백신의 제조비용이 감소하게 된다. 따라서, 일부 주사가능한 약물의 효과는 약물이 아쥬반트와 조합되었을 때 유의미하게 증가될 수 있다.
아쥬반트를 선택하는데 많은 요소들이 고려되어야 한다. 아쥬반트는 숙주에게 최소의 독성, 알레르기성, 자극성 및 다른 원하지 않는 효과들을 갖는 유효한 방법으로 항원을 비교적 느린 속도로 방출 및 흡수할 수 있게 하여야 한다. 적합하도록, 아쥬반트는 비-살바이러스성이어야 하며, 생분해성이어야 하고, 높은 수준의 면역력을 일관되게 생성할 수 있고, 교차 보호를 활성화할 수 있어야 하며, 여러 항원들과 맞아야 하며, 여러 종류들에서 효과적이어야 하며, 비-독성이어야 하며, 숙주에게 안전(예를 들면, 주사부위 반응없음)해야 한다. 아쥬반트의 다른 바람직한 특성들은 극미량 투여할 수 있고, 투여량 절감할 수 있고(dose sparing), 우수한 저장 안정성(shelf stability)을 가지며, 건조할 수 있고, 오일없이 제조될 수 있고, 고체 또는 액체로 존재할 수 있고, 등장성이며, 쉽게 제조되며, 제조하는데 저렴하다는 점이다. 마지막으로, 아쥬반트는 백신 시나리오의 요건들에 따라, 체액성 또는 세포성 면역반응 또는 둘 다를 유도하도록 설정가능한 것이 매우 바람직하다. 그러나, 상기 요건들을 만족시킬 수 있는 아쥬반트들의 수는 제한되어 있다.
아쥬반트의 선택은 백신에 대한 필요성, 항체반응의 규모 또는 기능을 증가시킬 수 있는지의 여부, 세포매개 면역반응 증가, 점막 면역력의 유도, 또는 항원 투여량의 감소에 따라 다르다. 여러 개의 아쥬반트들이 제안되어 있지만, 그 어떤 것도 모든 백신에 대하여 이상적으로 적합한 것으로 나타나지 않았다. 문헌에 보고된 첫번째 아쥬반트는 유중수형 에멀젼 및 마이코박테리아의 추출물을 함유하는 프로인드 완전 아쥬반트(Freund's Complete Adjuvant, FCA)이다. 불행히도, FCA는 저조하게 관용되며, 제어불가능한 염증을 유발시킬 수 있다. 80년전 FCA를 발견한 이래로, 아쥬반트의 원치 않는 부작용을 감소시키기 위해 많은 노력이 있어왔다.
아쥬반트로서 사용되었던 일부 다른 물질들은 금속 산화물(예를 들면, 수산화알루미늄), 명반, 염의 무기 킬레이트, 젤라틴, 여러 파라핀-타입 오일, 합성 수지, 알긴산염, 뮤코이드 및 다당류 화합물, 카제인염, 및 피브린괴(fibrin clot)와 같은 혈액-유도된 물질들을 포함한다. 상기 물질들이 일반적으로 면역시스템을 활성화하기에 효과적인 반면, 그 어떤 것도 숙주내에서 부작용(예를 들면, 무균성 농양의 생성, 기관 손상, 발암성, 또는 알레르기 반응) 또는 바람직하지 않은 약학적 특성들(예를 들면, 주사부위로부터 분산액의 신속한 분산 또는 좋지 않은 조절, 또는 물질의 팽윤)로 인해 완전히 만족스럽다고 밝혀지지 않았다.
본 발명은 신규한 백신 조성물 및 백신에 사용가능한 아쥬반트 제형을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 유상 및 수상을 포함하는 아쥬반트 제형을 제공하고, 상기 유상은 제형의 50% v/v 이상으로 포함되고, 상기 제형은 하나 이상의 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하되, a) 상기 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 부재할 경우, 제형이 폴리 I:C, 당지질, 및 선택적으로 4차 아민; 또는 다가양이온성 담체를 포함하고; b) 상기 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체가 부재할 경우, 제형이 알루미늄의 공급원, 및 선택적으로 다가양이온성 담체를 포함한다.
다른 구현예에서, 유상은 오일 및, 선택적으로 유용성 유화제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체가 모두 아쥬반트 제형내에 존재한다. 상기 구현예에서, 제형은 스테롤(예를 들면, 콜레스테롤), 폴리 I:C, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
특정 구현예 세트에서, 오일 및 임의의 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체, 스테롤 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드("TCMO")의 조합을 포함한다. 아쥬반트 제형은 또한, 선택적으로 폴리 I:C("TCMYO") 및/또는 사포닌(각각 "QTCMO" 또는 "QTCMYO")을 포함할 수 있다.
또다른 선택적인 구현예에서, 오일 및 임의의 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 4차 아민, 당지질, MPL-A 또는 이의 유사체, 및 폴리 I:C("ODYRM")의 조합을 포함한다.
또다른 구현예 세트에서, 오일 및 임의의 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 사포닌, 스테롤, 4차 아민, 다가양이온성 담체의 조합을 포함하되, 상기 다가양이온성 담체가 덱스트란 DEAE인 경우, 항원이 대장균 J-5 박테린("QCDXO")이 아니다.
추가의 구현예에서, 오일 및 임의의 유화제(들)에 더해, 아쥬반트는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 알루미늄의 공급원, 및 선택적으로 다가양이온성 담체(각각 "TOA" 및 "TXO-A")를 포함할 수 있다.
제2 양태에서, 상기 인용된 구현예들 중 어느 하나에 따른 아쥬반트 제형은 항원 성분을 포함할 수 있어서, 백신 조성물을 형성할 수 있되, 아쥬반트가 DEAE 덱스트란, Quil A, 콜레스테롤 및 DDA로 구성된다면(또는 이를 필수 구성성분으로 포함한다면), 또는 아쥬반트 제형이 DEAE 덱스트란 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드로 구성된다면(또는 이를 필수 구성성분으로 포함한다면), 대장균 J-5 단백질이 아니다. 특정 구현예에서, 본 양태의 백신은 소, 양, 말 또는 돼지에 영향을 미치는 병원균들로부터 유도된 항원(들)을 함유한다. 다른 구현예에서, 본 양태의 백신들은 가금류 또는 고양잇과 동물들에 영향을 미치는 병원균들로부터 유도된 항원(들)을 함유한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 항원 화합물 및 아쥬반트 제형들의 다른 조합들이 제공된다.
보다 구체적으로는, 제3 양태에서, 본 발명은 에이메리아 맥시마(Eimeria maxima) 및/또는 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 제3 양태의 다른 구현예에서, 아쥬반트 제형은 유상, 다가양이온성 담체, 및 선택적으로 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다. 본 발명의 본 양태의 다른 구현예에서, 본 발명은 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 스테롤 및 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체를 포함하는 아쥬반트 성분을 포함하는 백신 조성물을 제공하며; 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제4 양태에서, 본 발명은 네오스포라(Neospora) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 양태에 따른 본 발명의 다른 구현예에서, 아쥬반트 제형은 유상, 및 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다. 다른 구현예에서, 아쥬반트 제형은 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제5 양태에서, 본 발명은 클라미도필라 아보티스(Chlamydophila abortis) 항원, 및 유상; 스테롤; 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체; 및 폴리 I:C를 포함하는 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제6 양태에서, 본 발명은 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis) 항원, 및 유상; 및 다가양이온성 담체를 포함하는 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다. 본 발명의 제6 양태의 다른 구현예에서, 아쥬반트 제형은 또한, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 또는 추가로, 아쥬반트 제형은 사포닌, 스테롤 및 4차 아민을 포함할 수 있다.
제7 양태에서, 본 발명은 항원 성분으로서의 마이오스타틴, 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트 제형은 유상; 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 및 다가양이온성 담체; 또는 MPL-A 또는 이의 유사체를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다. 본 발명의 본 양태에 따른 구현예 세트에서, 아쥬반트 제형은 MPL-A 또는 이의 유사체를 포함한다. 본 세트의 일부 구현예에서, 아쥬반트 제형은 상기 백신 조성물의 50μL 당 0.5μg 미만의 스테롤을 함유하며, 바람직하게는 콜레스테롤을 함유하지 않는다. 마이오스타틴의 선택은 대상체 종류에 따라 다르다. 한 선택된 구현예에서, 선택 종류는 닭이며, 마이오스타틴의 공급원은 닭 마이오스타틴이다.
제8 양태에서, 본 발명은 A. 파이오게네스(pyogenes)(예전에는 아카노박테리움 파이오게네스(Arcanobacterium pyogenes), 악티노마이세스 파이오게네스(Actinomyces pyogenes) 또는 코리네박테리움 파이오게네스(Corynebacterium pyogenes)로 알려졌으며; 지금은 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes)로 알려져 있음) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며; 아쥬반트 제형은 유상; 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 및 다가양이온성 담체를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제9 양태에서, 본 발명은 대장균 항원, BRV 항원 또는 BCV 항원, 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트 제형은 상기 백신 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 및 다가양이온성 담체 및 알루미늄의 공급원 중 하나 이상을 포함한다.
제10 양태에서, 본 발명은 리피세팔루스 마이크로플러스(Rhipicephalus microplus) 항원 및 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트는 a) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 사포닌, 스테롤 및 4차 아민, 폴리아크릴계 폴리머 및 당지질을 포함하는 수성 아쥬반트; 및 b) 백신 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상을 포함하고, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함하는 유성 아쥬반트로 구성된 군으로부터 선택된다.
제11 양태에서, 본 발명은 구제역 바이러스(FMDV) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트 제형은 상기 백신 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함한다. 다른 구현예에서, 구제역 바이러스 항원은 야생형 FMDV, 유전자조작된 및/또는 약화된 FMDV 균주들, 또는 재조합 발현된 FMDV 구조 단백질, 예를 들면 혈청형 A, C, O, Asia1, SAT1, SAT2 또는 SAT3의 바이러스 유사 입자(VLP)일 수 있다.
제12 양태에서, 본 발명은 진단적 또는 치료 항체의 발생 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 제1 양태에 따른 구현예들 중 어느 하나에 따른 아쥬반트 제형 및 항원으로 공급원 동물을 면역화하는 단계, 및 공급원 동물로부터 항체들의 공급원을 추출하는 단계, 및 필요한 경우 항체들을 정제하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 공급원 동물은 래트, 마우스, 기니아 피그, 햄스터, 소, 염소, 토끼, 말, 돼지 또는 양이다. 일부 다른 구현예에서, 공급원 동물은 고양이 또는 개이다.
다중클론 항체들에 특히 적당한 일부 구현예에서, 항체들의 공급원은 혈청 또는 우유이다. 단일클론 항체들에 적당한 구현예에서, 항체들의 적당한 공급원은 비장 세포이다.
특정 구현예에서, 아쥬반트 제형은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함한다. 아쥬반트는 선택적으로, 수산화알루미늄 겔일 수 있는, 알루미늄의 공급원을 포함하는, 알루미늄 공급원을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 CpG이며, 다가양이온성 담체는 DEAE 덱스트란이다.
특정 구현예에서, 항원은 FeLV gp70, 소 파라인플루엔자-3 BPI-3(HN 단백질), 히스토필러스 솜니(Histophilus somni) p31, 보데텔라 FHA, 파라폭스(Parapox), BVDV1 gp53, BVDV2 gp53, 클로스트리듐 독소, 개의 써코바이러스(Canine Circovirus), 브라키스피라 히오다이센테리애(Brachyspira hyodysenteriae)(돼지 종) 항원; 불활성화된 전체 세포 및 불활성화된 펩신 다이제스트로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제3 내지 제12 양태들에 따른 백신들의 사용방법을 제공한다.
"약" 또는 "대략"은 측정가능한 수치 변수와 관련되어 사용될 때, 변수들의 표시값 및 표시값의 실험 오차내(예를 들면, 평균에 대하여 95% 신뢰구간내) 또는 표시값의 10%내에 있는 모든 변수 값들을 의미하며, "약 3주"가 17일 내지 25일이고, 약 2 내지 4주가 10 내지 40일인 경우, 약이 시간 간격(주)을 참고로 사용되지 않는 한, 어느 쪽이든 더 크다.
"아쥬반트"는 항원에 대한 체액성 또는 세포성 면역반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 아쥬반트는 일반적으로, 두가지 목적들(주사부위로부터 항원의 조절된 방출, 및 면역 시스템의 활성화)을 달성하기 위해 사용된다.
"아쥬반트 제형"은 아쥬반팅 특성들을 갖는 제형들을 의미한다.
"알킬"은 직선형 및 분지쇄형 포화 탄화수소 성분들을 모두 의미한다.
"아민"은 질소를 함유하는 화학 화합물을 의미한다. 아민은 수소 원자들에 대한 탄화수소기들을 치환함으로써 암모니아로부터 유도된 화합물들의 기이다. "4차 아민"은 4개의 탄화수소기들을 갖는 암모늄계 화합물을 의미한다.
"항체"는 항원에 대한 면역반응의 결과로서 특정 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 의미한다. 면역글로불린은 "불변" 및 "가변" 영역들을 갖는 "경(light)" 및 "중(heavy)" 폴리펩티드쇄들로 조성된 혈청 단백질들이며, 불변 영역의 조성에 기초하여, 등급(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)으로 세분화된다.
"항원" 또는 "면역원"은 동물의 면역 시스템에 의해 인지되어 면역반응을 발생시키는 임의의 물질을 의미한다. 이 용어는 살해된, 불활성화된, 약화된, 또는 변형된 생 박테리아, 바이러스, 또는 기생충들을 포함한다. 용어 "항원"은 또한, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 재조합 단백질, 합성 펩타이드, 단백질 추출물, 세포들(종양 세포 포함), 조직들, 다당류, 또는 지질, 또는 이의 단편을 개별적으로 또는 이들의 임의의 조합으로 포함한다. 용어 항원은 항체들, 예를 들면 항-이디오타입 항체들 또는 이의 단편들을 포함하며, 항원 또는 항원 결정기(에피토프)를 모방할 수 있는 합성 펩타이드 미모토프(mimotope)를 포함한다.
"박테린"은 백신 또는 면역성 조성물의 성분으로서 사용될 수 있는 1개 이상의 살해된 박테리아의 현탁액을 의미한다.
"완충액"은 수소 이온 농도(pH)의 뚜렷한 변화를 막는 완충액으로서 제공하는 양자 공여체 및 수용체 시스템과 같이, 다른 화학 물질의 농도 변화를 막는 화학 시스템을 의미한다. 완충액의 또다른 예는 약산 및 이의 염(콘쥬게이트 염기) 또는 약염기 및 이의 염(콘쥬게이트 산)의 혼합물을 함유하는 용액이다.
"세포성 면역반응" 또는 "세포매개 면역반응"은 T-림프구 또는 다른 백혈구들 또는 둘 다에 의해 매개되는 반응이며, 활성화된 T-세포, 백혈구, 또는 둘 다에 의해 생성된 사이토카인, 케모카인 및 유사한 분자들의 생성; 또는 감염된 세포를 살해하는 T 림프구 또는 다른 면역 세포 반응을 포함한다.
"반려 동물들"은 개, 고양이 및 말을 의미한다.
아쥬반트 제형에 적용되는, "필수적으로 구성된"은 상기 약물이 측정가능한 아쥬반팅 또는 면역조절 효과들을 발휘하는 양으로, 인용되지 않은 추가의 아쥬반팅 또는 면역조절 약물들을 함유하지 않는 제형을 의미한다.
"지연형 과민증(DTH)"은 면역 시스템이 외래 인자로 인식하는 항원에 노출후 24 내지 72시간후 발생하는 염증반응을 의미한다. 이 종류의 면역반응은 (B 세포들에 의해 제조된) 항체들보다는 주로 T 세포들을 포함한다.
"투여량"은 대상체에게 주어지는 백신 또는 면역성 조성물을 의미한다. "제1 투여량" 또는 "프라이밍 백신(priming vaccine)"은 0일째(Day 0)에 제공된 상기 조성물의 투여량을 의미한다. "제2 투여량" 또는 "제3 투여량" 또는 "연간 투여량"은 제1 투여량 이후에 제공된 상기 조성물의 양을 의미하며, 이는 제1 투여량과 같은 백신 또는 면역성 조성물이거나 아닐 수 있다.
용어 "유화제"는 본 문헌에 광범위하게 사용된다. 이것은 유화제로 일반적으로 인정되는 물질들, 예를 들면 TWEEN® 또는 SPAN® 생성물 라인의 다른 생성물(각각 폴리에톡시화 소르비톨의 지방산 에스테르, 및 지방산-치환된 소르비탄 계면활성제) 및 PEG-40 피마자유 또는 다른 페길화(PEGylated) 수소화 오일과 같은 다른 용해도 개선제들을 포함한다.
"체액성 면역반응"은 항체들에 의해 매개되는 반응을 의미한다.
대상체의 "면역반응"은 체액성 면역반응, 세포성 면역반응, 또는 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역반응의 발달을 의미한다. 면역반응은 보통 표준 면역분석법 및 중화 분석법을 사용하여 측정될 수 있고, 이는 당해 분야에 공지되어 있다.
항원의 "면역학적 보호량" 또는 "면역학적 유효량" 또는 "면역반응을 생성시키기에 유효한 양"은 수용체에서 면역반응을 유도하는데 유효한 양이다. 면역반응은 진단목적 또는 다른 테스트를 위해 충분할 수 있고, 또는 병원균(disease agent)에 의한 감염에 의해 야기되는, 건강상 부작용 또는 이의 합병증을 포함한, 질환의 징후 또는 증상을 예방하기에 적당할 수 있다. 체액성 면역력 또는 세포-매개 면역력, 또는 둘 다 유도될 수 있다. 면역성 조성물에 대한 동물의 면역반응은, 예를 들면 항체 역가의 측정을 통해 간접적으로, 림프구 증식 분석법을 통해, 또는 야생형 균주에 의한 시험감염후 징후 및 증상을 모니터링함으로써 직접 평가될 수 있는 반면, 백신에 의해 부여받은 보호성 면역력은, 예를 들면 사망률, 이환율, 온도 수, 전체 건강상태 및 대상체의 전반적인 건강 및 성능과 같은 임상 징후 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 면역반응은 제한 없이, 세포성 및/또는 체액성 면역의 유도를 포함할 수 있다.
"면역성"은 면역 또는 항원 반응을 일으키는 것을 의미한다. 따라서, 면역성 조성물은 면역반응을 유도하는 임의의 조성물이다.
"면역자극성 분자"는 비-항원-특이적 면역반응을 자극하는 분자를 의미한다.
"지질"은 지방, 오일, 왁스, 스테롤 및 물에는 불용성이지만 무극성 유기용매에는 용해성인 트리글리세리드를 포함하는 유기 화합물들의 임의의 군을 의미하며, 만지기에 기름기가 많으며, 탄수화물 및 단백질과 함께 생세포의 주요 구조물질을 구성한다.
"약학적으로 허용가능한"은 건강한 의학적 판단의 범주내에 있고, 과도한 독성, 염증, 알레르기 반응 등 없이 대상체의 조직과 접촉시에 사용하기에 적당하며, 타당한 이익 대 위험 비율에 비례하며, 이들의 의도된 용도에 효험이 있는 물질들을 의미한다.
용어 "폴리 I:C"는 폴리이노신산:폴리시티딜산의 자연발생 폴리머 뿐만 아니라, 이들의 합성 형태들을 의미하며, 예를 들면 안정화 백본 및 바람직하게는, TLR-3 작용제 활성을 가진다.
"반응원성"은 아쥬반트, 면역성 또는 백신 조성물의 투여에 반응하여 대상체에게서 유도된 부작용을 의미한다. 이것은 투여부위에서 발생할 수 있고, 일반적으로 여러 증상들의 발생의 관점에서 평가된다. 이러한 증상들은 염증, 홍조, 및 종기를 포함할 수 있다. 또한, 발생, 지속 및 심각성의 관점에서 평가된다. 예를 들면, "낮은" 반응은 육안이 아닌 오로지 심계 항진(palpitation)으로 검출가능한 부기를 포함하며, 또는 짧은 지속을 갖는다. 보다 심각한 반응은 예를 들면, 육안으로 볼 수 있는 부기이며, 또는 더 긴 지속을 갖는다.
"실온"은 18 내지 25℃의 온도를 의미한다.
"사포닌"은 스테로이드 또는 트리테르페노이드 구조의 소수성 영역과 관련된 친수성 영역으로 조성된 식물기원의 표면-활성 글리코시드의 기(보통 여러 개의 당쇄)를 의미한다.
"스테로이드"는 지질의 생화학적 부류에 속하며, 유기 용매에 쉽게 용해할 수 있고, 물에 약간 용해성인 유기 화합물들의 임의의 군을 의미한다. 스테로이드는 3개의 융합 시클로헥산(6개의 탄소) 고리 + 4개의 시클로펜탄(5개의 탄소) 고리의 4-융합 고리 시스템을 포함한다.
"스테롤"은 테르페노이드 전구체들로부터 생물학적으로 생성된 동물내 화합물들을 의미한다. 이들은 보통 탄소-3에 부착된 하이드록실(OH)기를 갖는, 스테로이드 고리구조를 포함한다. 지방산 치환기의 탄화수소쇄는 길이가 다양하며, 보통 16 내지 20개의 탄소 원자들이며, 포화 또는 불포화일 수 있다. 스테롤은 보통 고리구조에 1개 이상의 이중결합들 및 고리들에 부착된 다양한 치환기들을 함유한다. 스테롤 및 이들의 지방산 에스테르는 기본적으로 물에 불용성이다.
"대상체"는 아쥬반트 조성물의 투여가 요망되는 임의의 동물을 의미한다. 그것은 영장류, 가축, 반려동물, 실험실 테스트용 동물, 억류된 야생동물, 조류(난 포함), 파충류, 및 어류를 포함하는, 포유동물들 및 비-포유동물들을 포함한다. 따라서, 이 용어는 원숭이, 사람, 돼지; 소, 양, 염소, 말, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 닭, 칠면조, 오리, 다른 가금류, 개구리 및 도마뱀을 포함하며, 여기에 제한되지 않는다.
"TCID50"은 "조직 배양 감염량"을 의미하며, 접종된 세포 배양액의 주어진 배치의 50%를 감염시키기 위해 요구되는 바이러스의 희석량으로 정의된다. TCID50을 계산하기 위해 다양한 방법들이 사용될 수 있고, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 스피어맨-카버(Spearman-Karber) 방법을 포함한다. 스피어맨-카버 방법에 대한 설명은 B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996)을 참조한다.
"치료적으로 효과적인 양"은 바이러스 또는 세균과 같은, 병원체에 의한 감염에 의해 야기된, 건강 부작용 또는 이들의 합병 등을 포함한, 질환의 징후 또는 증상을 예방 또는 감소시키기에 적당한 항원 또는 백신을 수용하는 대상체에서 면역반응을 유도하는 항원 또는 백신의 양을 의미한다. 체액성 면역력 또는 세포-매개 면역력 또는 체액성 및 세포-매개 면역력 둘 다 유도될 수 있다. 백신에 대한 동물의 면역반응은 예를 들면, 항체 역가의 측정을 통해 간접적으로, 림프구 증식 분석법을 통해, 또는 야생형 균주에 의한 시험감염후 징후 및 증상을 모니터링함으로써 직접 평가될 수 있다. 백신에 의해 부여받은 보호성 면역은, 예를 들면 사망률, 이환율, 온도 수, 전체 건강상태 및 대상체의 전반적인 건강 및 성능과 같은 임상 징후 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 사용된 특정 아쥬반트, 사용된 특정 항원, 또는 대상체의 상태에 따라 다양할 수 있고, 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 측정될 수 있다.
"치료하는"은 상기 용어가 적용되는 장애, 질환 또는 질환을 예방하는 것, 또는 상기 장애, 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상들을 예방 또는 감소시키는 것을 의미한다.
"치료"는 상기 정의된 "치료하는"의 행위를 의미한다.
"트리테르페노이드"는 수천개의 방법으로 결집 및 변형될 수 있는, 6개의 5-탄소 이소프렌(2-메틸-1,3-부타디엔) 단위들로부터 유도된, 자연발생 유기분자들의 크고 다양한 부류를 의미한다. 대부분은 작용기 및 이들의 기본 탄소골격에 있어서 서로 다른 다중고리 구조들이다. 상기 분자들은 모든 생물체 부류에서 발견될 수 있다.
"백신"은 본 명세서에 정의된, 항원을 포함하는 조성물을 의미한다. 대상체에 백신을 투여하면, 하나 이상의 특정 질환들에 대하여 보통 면역반응을 일으킨다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 사용된 특정 항원, 또는 대상체의 상태에 따라 다양할 수 있고, 당해 분야에 숙련자에 의해 측정될 수 있다.
아쥬반트 제형 및 제조방법
본 발명은 본 발명에 적당한 여러 아쥬반트 제형들을 개시하고 있다. 상기 아쥬반트의 일반적인 특징은 오일 및 하나 이상의 유화제가 존재한다는 점이며, 상기 유상은 본 명세서에 개시된 아쥬반트 제형들을 포함하는 백신 조성물의 50% 이상을 포함한다.
여러 오일들 및 이들의 조합들은 본 발명에 사용하기에 적당하다. 이러한 오일들은 제한 없이, 동물성 오일, 식물성 오일 뿐만 아니라 비-대사가능한 오일들을 포함한다. 본 발명에 적당한 식물성 오일의 비제한적인 예들은 옥수수 오일, 땅콩유, 대두유, 코코넛 오일 및 올리브유이다. 동물성 오일의 비제한적인 예는 스쿠알렌이다. 비-대사가능한 오일들의 적당한 비-제한적인 예들은 경 미네랄 오일, 직쇄형 또는 분지쇄형 포화 오일 등을 포함한다.
구현예 세트에서, 본 발명의 아쥬반트 제형에 사용된 오일은 경 미네랄 오일이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "미네랄 오일"은 증류 기술을 통해 광유로부터 얻어진 액체 탄화수소의 혼합물을 의미한다. 상기 용어는 "액화 파라핀", "액체 광유" 및 "백색 미네랄 오일"과 동의어이다. 상기 용어는 "경 미네랄 오일", 즉 광유의 증류에 의해 유사하게 얻어지지만, 백색 미네랄 오일보다 약간 낮은 비중을 가지는 오일을 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, at pages 788 and 1323)을 참조한다. 미네랄 오일은 다양한 상업용 공급원, 예를 들면, J. T. Baker(미국 펜실베니아주 필스버그 소재), USB Corporation(미국 오하이오주 클리블랜드 소재)으로부터 입수될 수 있다. 바람직한 미네랄 오일은 상표명 DRAKEOL®로 상업용으로 사용가능한 경 미네랄 오일이다.
전형적으로, 유상의 백신 조성물의 50 내지 95% v/v의 양으로; 바람직하게는 50% 내지 60% v/v 이상의 양으로, 보다 바람직하게는 50 내지 52% v/v 이상의 양으로 존재한다. 유상은 임의의 유화제가 존재하는 경우, 오일 및 유화제들(예를 들면, SPAN® 80, TWEEN® 80 등)을 포함한다. 유상의 부피는 오일 및 유화제(들)의 부피 합으로 계산된다. 따라서, 예를 들면, 오일의 부피가 조성물의 40%이고, 유화제(들)의 부피가 조성물의 12%이면, 유상은 조성물의 52% v/v로 존재한다. 이와 유사하게, 오일이 조성물의 약 45%의 양으로 존재하고, 유화제(들)가 조성물의 약 6%의 양으로 존재하는 경우, 유상은 조성물의 약 51% v/v로 존재한다.
본 발명의 아쥬반트는 본 발명의 백신의 일부만 형성하므로, 유상이 본 발명의 아쥬반트 각각의 50 내지 95% v/v; 바람직하게는 50 내지 85% v/v 이상의 양으로; 보다 바람직하게는 50 내지 60% v/v의 양으로, 보다 바람직하게는 50 내지 52% v/v의 양으로 존재한다는 것도 이해되어야 한다.
본 발명의 모든 아쥬반트들/백신들에 적용가능한, 구현예의 서브세트에서, 오일 및 유용성 유화제 모두의 부피%는 백신 조성물의 50% v/v 이상, 예를 들면 50 내지 95% v/v; 바람직하게는 50 내지 85% v/v 이상의 양; 보다 바람직하게는 50 내지 60% v/v의 양, 보다 바람직하게는 50 내지 52% v/v의 양이다. 따라서, 예를 들면, 제한 없이, 오일은 45% v/v의 양으로 존재할 수 있고, 지질-용해성 유화제는 5% v/v 이상의 양으로 존재한다. 따라서, 오일 및 유용성 유화제 모두의 부피%는 50% 이상이다.
본 발명의 모든 백신들에 적용가능한 또다른 서브세트에서, 오일의 부피%는 백신 조성물의 40% v/v 이상, 예를 들면 40 내지 90% v/v; 40 내지 85% v/v; 43 내지 60% v/v, 44 내지 50% v/v이다.
본 발명의 에멀젼에 사용하기에 적당한 유화제들은 천연 생물학적으로 양립가능한 유화제들 및 비-천연 합성 계면활성제를 포함한다. 생물학적으로 양립가능한 유화제는 인지질 화합물 또는 인지질들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린(레시틴), 예를 들면 콩 또는 난 레시틴이다. 레시틴은 조질의 식물성 오일을 수-세척하고, 얻어진 수화된 검을 분리 및 건조함으로써, 포스파티드 및 트리글리세리드의 혼합물로서 얻어질 수 있다. 정제된 생성물은 아세톤 세척에 의해 트리글리세리드 및 식물성 오일을 제거한 후, 남은 아세톤 불용성 인지질 및 당지질을 위한 혼합물을 분획화함으로써 얻어질 수 있다. 선택적으로, 레시틴은 다양한 상업용 공급원들로부터 얻어질 수 있다. 다른 적당한 인지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 카디올리핀, 및 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 인지질은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 관습적으로 합성될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명에서 사용된 유화제들은 레시틴을 포함하지 않으며, 면역학적으로 효과적이지 않은 양으로 레시틴을 사용한다.
본 발명의 아쥬반트 제형에 사용하기에 적당한 비-천연 합성 유화제는 소르비탄-계 비-이온성 계면활성제, 예를 들면 지방산-치환된 소르비탄 계면활성제(상표명 SPAN® 또는 ARLACEL®로 상업용으로 사용가능함), 폴리에톡시화 소르비톨의 지방산 에스테르(TWEEN®), 피마자유와 같은 공급원으로부터의 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스테르(EMULFOR®); 폴리에톡시화 지방산(예를 들면, 상표명 SIMULSOL® M-53으로 사용가능한 스테아르산), 폴리에톡시화 이소옥틸페놀/포름알데히드 폴리머(TYLOXAPOL®), 폴리옥시에틸렌 지방산 알콜 에테르(BRIJ®); 폴리옥시에틸렌 논페닐 에테르(TRITON® N), 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐 에테르(TRITON® X)를 포함한다. 바람직한 합성 계면활성제는 상표명 SPAN® 및 TWEEN®으로 사용가능한 계면활성제, 예를 들면 TWEEN®-80(폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트) 및 SPAN®-80(소르비탄 모노올레이트)이다.
일반적으로 말하면, 유화제(들)는 0.01 내지 40부피%, 바람직하게는 0.1 내지 15부피%, 보다 바람직하게는 2 내지 10부피%의 양으로 백신 조성물내에 존재할 수 있다.
본 아쥬반트 제형내에 존재하는 추가의 성분들은 양이온성 담체, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 모노인지질 A 및 이의 유사체들(MPL-A), 폴리이노신산:폴리시티딜산(폴리 I:C), 사포닌, 4차 암모늄, 스테롤, 당지질, 알루미늄의 공급원(예를 들면, REHYDRAGEL® 또는 VAC 20® 습식 겔) 및 이들의 조합물을 포함한다.
적당한 양이온성 담체들은 제한 없이, 덱스트란, 덱스트란 DEAE(및 이들의 유도체들), PEG, 구아 검, 키토산 유도체, 폴리셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시에틸 셀룰로스(HEC) 폴리에틸렌이멘, 폴리아미노, 예컨대 폴리리신 등을 포함한다.
적당한 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 ODN(DNA-기반), ORN(RNA-기반) 올리고뉴클레오타이드, 또는 키메릭 ODN-ORN 구조들을 포함하며, 제한 없이 포스포로티오에이트 변형, 할로겐화, 알킬화(예를 들면, 에틸- 또는 메틸-변형), 및 포스포디에스테르 변형을 포함하는 변형된 백본을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리 이노신산-시티딜산 또는 이들의 유도체(폴리 I:C)가 사용될 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오타이드는 특정 염기-서열 문맥에서 비메틸화 CG 디뉴클레오타이드의 존재에 의해 특징화되는 약물요법제들의 최근 설명된 부류이다(CpG 모티프). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, 이후에 참고문헌으로 통합됨). 상기 CpG 모티프들은 진핵 DNA에서 발견되지 않으며, CG 디뉴클레오타이드가 억제되고, 존재할 경우 보통 메틸화되지만, 세균성 DNA내에 존재하여, 면역자극성을 부여한다.
선택된 구현예에서, 본 발명의 아쥬반트는 소위 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 변형된 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 더욱더 바람직하게는 E-변형된 P-등급 올리고뉴클레오타이드들을 사용한다. P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 6 내지 20개의 뉴클레오타이드들 길이의 회문(palindrome)의 존재에 의해 특징화되는 CpG 올리고뉴클레오타이드이다. P-등급 올리고뉴클레오타이드는 시험관내에서 및/또는 생체내에서 연쇄체로 자발적으로 자가-조립하는 능력을 가지고 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 엄밀한 의미로 단일-가닥이지만, 회문의 존재는 연쇄체 또는 가능하게는 스템-및-루프 구조를 형성시킨다. P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 전체 길이는 19 내지 100개의 뉴클레오타이드들, 예를 들면 19 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90 내지 100개의 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 한 측면에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 5' TLR 활성화 도메인 및 2개 이상의 회문 영역들을 함유하며, 1개의 회문 영역은 6개 이상의 뉴클레오타이드들 길이의 5' 회문 영역이며, 8개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 3' 회문 영역에 직접 또는 스페이서를 통해 연결된다.
P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 기술들에 따라 변형될 수 있다. 예를 들면, J-변형은 요오도-변형된 뉴클레오타이드들을 의미한다. E-변형은 에틸-변형된 뉴클레오타이드(들)를 의미한다. 따라서, E-변형된 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드들은 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드들이며, 1개 이상의 뉴클레오타이드(바람직하게는 5' 뉴클레오타이드)가 에틸화된다. 추가의 변형들은 6-니트로-벤즈이미다졸의 부착, O-메틸화, 프로이닐-dU에 의한 변형, 이노신 변형, 2-브로모비닐 부착(바람직하게는 우리딘에 부착)을 포함한다.
P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 또한, 제한 없이 포스포디에스테르 결합들 및 포스포로티오에이트 결합들을 포함하는, 변형된 뉴클레오타이드간 결합을 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 상업용 공급원들로부터 합성 또는 수득될 수 있다.
P-등급 올리고뉴클레오타이드들 및 변형된 P-등급 올리고뉴클레오타이드들은 공개된 국제 특허공개 제WO2008/068638호(2008년 6월 12일자로 공개)에 추가로 개시되어 있다. 변형된 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드들의 적당한 비-제한적인 예들은 하기에 제공되어 있다(서열번호 1 내지 10에서, "*"는 포스포로티오에이트 결합을 의미하고, "_"는 포스포디에스테르 결합을 의미한다). 서열번호 11 내지 14에서, 모든 결합들은 포스포디에스테르 결합들이다.
서열번호 1 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
서열번호 2 5' T*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
서열번호 3 5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
서열번호 4 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
서열번호 5 5' JU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'
서열번호 6 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C* G*T 3'
서열번호 7 5' EU*C_G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'
서열번호 8 5' JU*C_G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'
서열번호 9 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C* G*T 3'
서열번호 10 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
서열번호 11 5'-UUGUUGUUGUUGUUGUUGUU-3'
서열번호 12 5'-UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU-3'
서열번호 13 5'-AAACGCUCAGCCAAAGCAG-3'
서열번호 14 5'-dTdCdGdTdCdGdTdTdTdTrGrUrUrGrUrGrUdTdTdTdT-3'
아쥬반트 조성물에 사용하기 위한 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 양은 사용된 P-등급 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 의도된 종류들의 성질에 따라 다르다.
구조적으로 또는 합성적으로 세균 유도성 천연 LPS 변형 또는 비변형될 수 있는 MPL-A의 적당한 유사체들은 제한 없이, 글루코피라노실 지질 아쥬반트(GLA), 퍼탁틴(pertactin), 환원 당의 3-O-위치에서의 다양한 치환체들, 낮은 내독성을 갖는 지질 A 유사체의 합성 형태들을 포함한다.
스테롤은 탄소-3에 보통 부착되는 하이드록실(OH)기를 갖는 스테로이드 고리 구조인 공통의 화학적 중심을 공유한다. 지방산 치환기의 탄화수소쇄는 길이가 16 내지 20개의 탄소 원자들로 다양하며, 포화 또는 불포화일 수 있다. 스테롤은 보통 고리 구조내에 하나 이상의 이중결합들 및 고리들에 부착된 다양한 치환기들을 함유한다. 스테롤 및 이들의 지방산 에스테르는 기본적으로 물 불용성이다. 상기 화학적인 유사성의 관점에서, 상기 화학적 중심을 공유하는 스테롤은 본 발명의 백신 조성물에 사용될 때 유사한 특성들을 가지는 것 같다. 스테롤은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 상업용으로 구입할 수 있다. 예를 들면, 콜레스테롤은 Merck Index, 12th Ed., p.369에 개시되어 있다. 적당한 스테롤은 제한 없이, β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤, 및 콜레스테롤을 포함한다.
적당한 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌을 포함한다. 상기 트리테르페노이드는 식물 기원의 표면-활성 글리코시드의 기를 포함하며, 스테로이드 또는 트리테르페노이드 구조의 소수성 영역과 연합하여 친수성 영역(보통 여러 개의 당쇄)으로 조성된 화학적 중심을 공유한다. 상기 유사성 때문에, 상기 화학적 중심을 공유하는 사포닌은 유사한 아쥬반팅 특성들을 가지기 쉽다. 아쥬반트 조성물에 사용하기에 적당한 트리테르페노이드는 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria), 토마틴, 인삼 추출물, 버섯, 및 스테로이드 사포닌과 구조적으로 유사한 알칼로이드 글리코사이드를 포함하는 식물유도성 또는 합성균등물인 많은 공급원들로부터 유도될 수 있고, 여기에 한정되지 않는다.
사포닌이 사용된다면, 아쥬반트 조성물은 보통 퀼라야 사포나리아의 바크(bark)로부터의 면역학적으로 활성인 사포닌 분획을 함유한다. 예를 들면, 사포닌은 Quil A, 또는 다른 정제된 또는 부분 정제된 사포닌 제조물일 수 있고, 상업용으로 입수될 수 있다. 따라서, 사포닌 추출물은 QS-7, QS-17, QS-18, 및 QS-21과 같은 혼합물 또는 정제된 각 성분들로서 사용될 수 있다. 한 구현예에서, Quil A는 85% 이상의 순도이다. 다른 구현예에서, Quil A는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 순도이다.
4차 아민 화합물은 4개의 탄화수소기들을 갖는 암모늄 기반 화합물이다. 실제로, 탄화수소기들은 일반적으로, 알킬기 또는 아릴기로 제한된다. 구현예 세트에서, 4차 아민 화합물은 4개의 알킬쇄로 조성되며, 이들 중 둘은 C10-20 알킬이며, 남은 둘은 C1-4 알킬들이다. 한 구현예 세트에서, 4차 아민은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 클로라이드 또는 약학적으로 허용가능한 카운터이온(DDA)이다.
적당한 당지질은 일반적으로 Th2 반응을 활성화하는 것들이다. 당지질은 제한 없이, 미국 특허공개 제2007/0196384호(Ramasamy et al)에 일반적으로 설명되어 있고, 하기 화학식 I로 나타낸 것들을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pat00001
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 또는 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 포화 알킬 라디칼이고;
X는 -CH2-, -O- 또는 -NH-이고;
R2는 수소, 또는 20개 이하의 탄소 원자들을 갖는 포화 또는 불포화 알킬 라디칼이고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, -SO4 2-, -PO4 2- 또는 -COC1-10 알킬이고;
R6은 L-알라닐, L-알파-아미노부틸, L-아르기닐, L-아스파르기닐, L-아스파르틸, L-시스테이닐, L-글루타밀, L-글라이실, L-히스티딜, L-하이드록시프롤릴, L-이소류실, L-류실, L-라이실, L-메티오닐, L-오니티닐, L-페닐알라닐, L-프롤릴, L-세릴, L-트레오닐, L-티로실, L-트립토파닐, L-발릴 또는 이들의 D-이성질체이다.
구현예 세트에서, 적당한 당지질은 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아미드 또는 이의 아세테이트이다.
알루미늄은 공지의 아쥬반트, 또는 아쥬반트 제형의 성분이며, Reheis, Inc, Brentag Alhydrogel REHYDRAGEL® 또는 VAC 20® 습식 겔과 같은 형태로 상업적으로 사용가능하다. REHYDRAGEL®은 보에마이트로서 미네랄적으로 알려져 있는, 결정질 알루미늄 옥시하이드록사이드이다. 음하전된 단백질을 결합하기 위해 필요할 때 백신에 효과적이다. Al2O3의 함량은 등급에 따라 2 내지 10%이고, 이의 점도는 1000 내지 1300cP이다. 일반적으로, 그것은 흡착제 수산화알루미늄 겔로 설명될 수 있다. VAC® 20 습식 겔은 백색 또는 거의 백색, 반투명한, 점성 콜로이드성 겔이다. 특정 구현예에서, Al2O3의 함량은 약 2% w/v이다.
다른 구현예에서, 알루미늄의 공급원은 침전된 수산화알루미늄 공정들에 의해 제조될 수도 있다.
특정 구현예 세트에서, 오일 및 임의의 하나 이상의 유화제에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체, 스테롤 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 성분들을 함유하는 아쥬반트는 "TCMO"로 언급된다. TCMO 아쥬반트 제형은 또한, 선택적으로 폴리 I:C("TCMYO") 및/또는 사포닌을 포함할 수 있다. 따라서, 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체, 스테롤, 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 조합 및 사포닌을 포함하는, 또는 필수적으로 구성된, 또는 구성된 아쥬반트 제형은 "QTCMO"로 언급된다. 게다가, 아쥬반트 제형은 또한, 폴리 I:C를 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 "QTCMYO"로 언급된다.
구현예 세트에서, TCMO 아쥬반트는 백신 조성물의 전체 부피의 40 내지 50% v/v의 양으로 경 미네랄 오일을 포함한다. 소르비탄 모노올레이트 및 오일이 조성물의 약 50.5 내지 52% v/v를 함께 포함한다는 조건하에, 유화제는 백신 조성물의 총 부피의 총량 0.1 내지 40% v/v로 TWEEN-80 및 SPAN-80을 포함한다. 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 ODN, 선택적으로, 변형된 백본과 함께, 바람직하게는 ODN을 함유하는 회문이다.
특정 구현예에서, TCMO의 1 투여량은 약 1 내지 약 400μg의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 약 1 내지 약 1000μg의 스테롤, 약 0.1 내지 500μg의 MPL-A 또는 이의 유사체를 함유한다.
투여량 당 다른 화합물들의 양은 대상체 종류에 기초하여 선택된다.
예를 들면, 소, 양 또는 성체 돼지에 적당한 일부 구현예에서, TCMO의 1 투여량은 약 50 내지 400μg(예를 들면, 성체 돼지에 대하여 50 내지 300μg, 또는 100 내지 250μg, 또는 약 50 내지 약 100μg 및 소에 대하여 약 100 내지 약 250μg)의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 약 100 내지 약 1000μg(예를 들면, 200 내지 1000μg, 250 내지 700μg, 또는 약 400 내지 500μg)의 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤, 및 약 5 내지 약 500μg(예를 들면, 5 내지 100μg, 또는 5 내지 50μg, 또는 10 내지 25μg)의 MPL-A 또는 이의 유사체를 함유한다.
반려동물 또는 새끼 돼지에 적당한 일부 구현예에서, TCMO의 1 투여량은 약 5 내지 100μg(예를 들면, 10 내지 80μg, 또는 20 내지 50μg)의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 약 5 내지 100μg(예를 들면, 10 내지 80μg, 또는 20 내지 50μg)의 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤, 및 약 0.5 내지 약 200μg(예를 들면, 1 내지 100μg, 또는 5 내지 50μg, 또는 5 내지 20μg)의 MPL-A 또는 이의 유사체를 함유한다.
가금류에 적당한 일부 구현예에서, TCMO 아쥬반트의 1 투여량은 약 0.1 내지 약 5μg(예를 들면, 0.5 내지 3μg, 또는 0.9 내지 1.1μg)의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 약 0.5 내지 약 50μg(예를 들면, 1 내지 20μg, 또는 1 내지 10μg)의 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤, 및 약 0.1 내지 10μg(예를 들면, 0.5 내지 5μg, 또는 1 내지 5μg)의 MPLA 또는 이의 유사체를 함유한다. MPL-A는 0.1μg/투여량 내지 2,000μg/투여량의 양으로 존재한다.
특정 구현예에서, TCMO 아쥬반트는 하기와 같이 제조된다:
a) 소르비탄 모노올레이트, MPL-A 및 콜레스테롤은 경 미네랄 오일내에 용해된다. 얻어진 오일 용액은 살균 여과되며;
b) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트가 수상내에 용해되어, 수용액을 형성하며;
c) 연속 균질화하에 오일 용액에 수용액이 첨가되어, 아쥬반트 제형 TCMO를 형성한다.
TCMYO 아쥬반트에서, 콜레스테롤, 오일, 임의의 유화제, MPL-A, 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 각 종류에 대하여 TCMO 아쥬반트 제형내에 존재한다. 폴리 I:C는 일반적으로 투여량 당 약 1 내지 약 100μg의 양으로 존재할 수 있다.
보다 구체적으로는, 폴리 I:C는 소, 성체 돼지, 또는 양에 적당한 특정 구현예에서, 투여량 당 5 내지 100μg(예를 들면, 5 내지 50μg 또는 10 내지 30μg)의 양으로 존재할 수 있다. 반려동물 또는 새끼 돼지에 적당한 특정 구현예에서, TCMYO의 1 투여량은 약 1 내지 약 50μg(예를 들면, 5 내지 50μg 또는 10 내지 20μg)의 폴리 I:C를 함유한다. 가금류 백신에 적당한 특정 구현예에서, TCMYO의 1 투여량은 약 1 내지 약 10μg(예를 들면, 1 내지 5μg, 또는 3 내지 5μg)의 폴리 I:C를 함유한다.
특정 구현예에서, TCMYO 아쥬반트는 TCMO 아쥬반트로 유사하게 제조되며, 폴리 I:C가 수용액에 첨가된다.
구현예 세트에서, QTCMO 아쥬반트에서, 콜레스테롤, 오일, 임의의 유화제, MPL-A 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 각 종류에 대한 TCMO 아쥬반트 제형내에서와 같이 존재한다. 사포닌은 바람직하게는 Quil A 또는 이의 정제된 분획물이며, 투여량 당 약 0.1μg 내지 약 1000μg의 양으로 존재할 수 있다.
보다 구체적으로, 사포닌은 가금류 백신에 적당한 특정 구현예에서 투여량 당, 백신 조성물의 50μL 당 0.1 내지 5μg(예를 들면, 조성물의 50μL 당 0.5 내지 30μg, 보다 바람직하게는 1 내지 10μg)의 양으로 존재할 수 있다. 반려동물 및 새끼 돼지에 적용하기에 적당한 특정 구현예에서, 사포닌, 예를 들면 Quil A 또는 이의 정제된 분획물은 투여량 당 약 10 내지 약 100μg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 50μg 또는 20 내지 50μg)의 양으로 존재한다. 소, 성체 돼지, 또는 양에 적당한 특정 구현예에서, 사포닌, 예를 들면 Quil A 또는 이의 정제된 분획물은 투여량 당 약 100 내지 약 1000μg(예를 들면, 투여량 당 200 내지 800μg 또는 250 내지 500μg)의 양으로 존재한다.
특정 구현예에서, QTCMO 아쥬반트는 TCMO 아쥬반트와 유사하게 제조되며, 사포닌이 수용액에 첨가된다.
구현예 세트에서, QTCMYO 아쥬반트에서, 사포닌은 QTCMO 아쥬반트로서 존재하며, 나머지 성분들은 각 종류에 대하여 TCMYO로서 존재한다.
특정 구현예에서, QTCMYO 아쥬반트는 TCMYO 아쥬반트와 유사하게 제조되며, 사포닌이 수용액에 첨가된다.
선택적인 구현예에서, 오일 및 임의의 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체 및 다가양이온성 담체의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 아쥬반트는 “XOM”으로 언급된다.
구현예 세트에서, 반려동물 또는 새끼 돼지를 위한 XOM 아쥬반트에서, 다가양이온성 담체는 투여량 당 1 내지 50mg(예를 들면, 투여량 당 1 내지 25mg, 또는 투여량 당 10 내지 25mg)의 양으로 존재하며, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 1 내지 50μg(예를 들면, 투여량 당 1 내지 25μg, 또는 투여량 당 10 내지 25μg)의 양으로 존재한다.
소, 양 및 성체 돼지에 적당한 특정 구현예에서, 다가양이온성 담체는 투여량 당 약 5 내지 약 500mg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 500mg, 또는 10 내지 300mg, 또는 50 내지 200mg)의 양으로 존재하고, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 1 내지 약 100μg(예를 들면, 5 내지 100μg, 또는 5 내지 50μg, 또는 10 내지 30μg)의 양으로 존재한다.
반려동물 및 새끼 돼지에 적당한 특정 구현예에서, 다가양이온성 담체는 투여량 당 약 1 내지 약 50mg(예를 들면, 투여량 당 1 내지 25mg, 또는 투여량 당 10 내지 25mg)의 양으로 존재하고, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 0.5 내지 약 200μg(예를 들면, 1 내지 100μg, 또는 5 내지 50μg, 또는 5 내지 20μg)의 양으로 존재한다.
가금류 백신에 적당한 특정 구현예에서, 다가양이온성 담체는 투여량 당 0.5 내지 25mg(예를 들면, 1 내지 20mg, 또는 1 내지 10mg, 또는 5 내지 10mg)의 양으로 존재하며, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 0.5 내지 10μg(예를 들면, 1 내지 10μg, 또는 1 내지 5μg, 또는 2 내지 5μg)의 양으로 존재한다.
특정 구현예에서, XOM 아쥬반트는 하기와 같이 제조된다:
a) 소르비탄 모노올레이트, MPL-A 및 콜레스테롤이 경 미네랄 오일에 용해된다. 얻어진 오일 용액은 살균여과되며;
b) 덱스트란 DEAE 및 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트가 수상에 용해되어, 수용액을 형성하며;
c) 연속 균질화하에 수용액이 오일 용액에 첨가되어, 아쥬반트 제형 XOM을 형성한다.
추가의 대체 구현예에서, 오일 및 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 상기 다가양이온성 담체가 덱스트란 DEAE라면, 그후 항원이 대장균 J-5 박테린이라는 단서하에, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 아쥬반트는 “TXO"로 언급된다. 특정 구현예에서, TXO에 의해 아쥬반팅된 백신들은 소, 양, 말 또는 돼지를 감염시키는 병원균을 포함하는 항원(들)을 함유한다. 다른 구현예에서, 항원들은 상기 병원균들로부터 유도된다. 다른 구현예에서, TXO에 의해 아쥬반팅된 백신들은 가금류 또는 고양이를 감염시키는 병원균을 포함하는 항원(들)을 함유하거나, 항원들은 상기 병원균들로부터 유도될 수 있다. 구현예 세트에서, TXO 아쥬반트는 또한, Al(OH)3 겔과 같은 알루미늄의 공급원을 포함할 수 있다. 알루미늄을 갖는 TXO 아쥬반트는 “TXO-A”로 언급된다.
구현예 세트에서, TXO 아쥬반트에서, 회문 서열, 및 선택적으로, 변형된 백본을 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 ODN은 투여량 당 0.5 내지 400μg의 양으로 존재할 수 있고, 다가양이온성 담체는 투여량 당 0.5 내지 400mg의 양으로 존재할 수 있다. 투여량은 대상체 종류에 따라 다양할 수 있다.
예를 들면, 소, 양 또는 성체 돼지에 적당한 특정 구현예에서, TXO의 1 투여량은 약 50 내지 400μg(예를 들면, 성체 돼지에 대하여 50 내지 300μg, 또는 100 내지 250μg, 또는 약 50 내지 약 100μg, 및 소에 대하여 약 100 내지 약 250μg)의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 다가양이온성 담체는 투여량 당 약 5 내지 약 500mg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 500mg, 또는 10 내지 300mg, 또는 50 내지 200mg)의 양으로 존재할 수 있다.
반려동물 또는 새끼 돼지에 적당한 특정 구현예에서, TXO의 1 투여량은 약 5 내지 100μg(예를 들면, 10 내지 80μg, 또는 20 내지 50μg)의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 반면, 다가양이온성 담체는 투여량 당 1 내지 50mg(예를 들면, 투여량 당 1 내지 25mg, 또는 투여량 당 10 내지 25mg)의 양으로 존재할 수 있다.
가금류에 적당한 특정 구현예에서, TXO 아쥬반트의 1 투여량은 약 0.1 내지 약 5μg(예를 들면, 0.5 내지 3μg, 또는 0.9 내지 1.1μg)의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드이며, 다가양이온성 담체는 투여량 당 0.5 내지 25mg(예를 들면, 1 내지 20mg, 1 내지 10mg 또는 5 내지 10mg)의 양으로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, TXO 아쥬반트는 하기와 같이 제조된다:
a) 소르비탄 모노올레이트가 경 미네랄 오일내에 용해되고, 얻어진 오일 용액은 살균 여과되고;
b) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 덱스트란 DEAE 및 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트가 수상내에 용해되어, 수용액을 형성하고;
c) 연속 균질화하에 수용액을 오일 용액에 첨가하여, 아쥬반트 제형 TXO를 형성한다.
구현예 세트에서, TXO-A 아쥬반트에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 TXO 아쥬반트로서 존재하며, 알루미늄의 공급원은 40% v/v 이하(예를 들면, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%)의 양으로 존재한다. 구현예 세트에서, 알루미늄의 공급원은 백신 조성물의 2 내지 20% v/v, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 17% v/v로 존재한다.
특정 구현예에서, TXO-A 아쥬반트는 TXO 아쥬반트와 유사하게 제조되고, 알루미늄의 공급원이 수용액에 첨가된다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 아쥬반트는 오일, 임의의 유화제(들), 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 알루미늄의 공급원을 함유한다. 상기 화합물들은 TXO-A 아쥬반트에 대하여 개시된 범위로 존재하되, 다가양이온성 담체가 TOA내에 부재한다. TOA 아쥬반트는 TXO 아쥬반트와 유사하게 제조되되, 수상이 DEAE 덱스트란보다는 알루미늄의 공급원을 함유한다.
특정 구현예에서, 오일 및 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 다가양이온성 담체 및 알루미늄의 공급원의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 아쥬반트는 AXO로 언급된다. 상기 화합물은 각 종류에 대한 아쥬반트 TXO-A내에 존재하는 것들과 유사한 양으로 존재할 수 있고, 아쥬반트 AXO는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 첨가가 없는 것 외에, TXO-A와 유사하게 제조될 수 있다.
특정의 다른 구현예에서, 오일 및 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 사포닌 및 스테롤의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 아쥬반트는 QCO로 언급된다. QCO의 성분들의 성질 및 양은 아쥬반트 QTCMO내 사포닌, 스테롤, 오일 및 유화제(들)의 양과 유사하다. QCO는 연속 균질화하에, 사포닌 및 스테롤을 포함하는 수용액, 및 바람직하게는 수용성 유화제를 오일, 및 바람직하게는 유용성 유화제를 포함하는 유상에 첨가함으로써 제조될 수 있다.
또다른 추가의 대체 구현예에서, 오일 및 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 4차 아민, 당지질, MPL-A 또는 이의 유사체, 및 폴리 I:C의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 아쥬반트는 “ODYRM”으로 언급된다.
ODYRM 아쥬반트에서, 오일은 일반적으로 포스파티딜 콜린들과 같은 인지질들의 혼합물이다. 암피겐(AMPHIGEN)®은 상기 오일의 적당한 예이며, 상기 설명한 바와 같이 오일의 양과 유사한 양으로 존재한다.
구현예 세트에서, ODYRM 아쥬반트에서, 4차 아민, 예를 들면 DDA는 투여량 당 약 1 내지 약 200μg의 양으로 존재하며, 폴리 I:C는 투여량 당 약 0.5 내지 100μg의 양으로 존재하며, 당지질은 투여량 당 약 0.5 내지 약 2000μg의 양으로 존재하고, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 0.5 내지 100μg의 양으로 존재한다.
보다 구체적으로는, 소, 성체 돼지 또는 양에 투여하기에 적당한 특정 구현예에서, 4차 아민은 투여량 당 약 50 내지 약 200μg(예를 들면, 50 내지 150μg, 또는 약 100μg)의 양으로 존재할 수 있고, 폴리 I:C는 투여량 당 약 1 내지 약 100μg(예를 들면, 1 내지 50μg 또는 5 내지 50μg)의 양으로 존재할 수 있고, 당지질은 투여량 당 약 500 내지 약 2000μg(예를 들면, 500 내지 100μg 또는 약 1000μg)의 양으로 존재할 수 있고, MPLA 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 5 내지 약 100μg(예를 들면, 5 내지 50μg 또는 10 내지 50μg)의 양으로 존재할 수 있다.
반려동물 및 새끼 돼지에 투여하기에 적당한 특정 구현예에서, 4차 아민은 투여량 당 약 5 내지 약 500μg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 100μg, 또는 투여량 당 20 내지 50μg)의 양으로 존재할 수 있고, 폴리 I:C는 투여량 당 약 5 내지 약 25μg(예를 들면, 50 내지 20μg 또는 약 10μg)의 양으로 존재할 수 있고, 당지질은 투여량 당 약 10 내지 약 100μg(예를 들면, 20 내지 100μg 또는 25 내지 50μg)의 양으로 존재할 수 있고, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 약 5 내지 약 50μg(예를 들면, 5 내지 20μg 또는 10 내지 20μg)의 양으로 존재할 수 있다.
가금류 백신에 적당한 특정의 다른 구현예에서, 1 투여량은 약 1 내지 약 10μg의 4차 암모늄 화합물(예를 들면, 5 내지 10μg 또는 약 5μg), 약 0.5 내지 약 10μg(예를 들면, 1 내지 10μg 또는 1 내지 5μg)의 폴리 I:C, 약 0.5 내지 10μg(예를 들면, 1 내지 10μg, 5 내지 10μg, 또는 1 내지 5μg)의 당지질, 및 약 0.5 내지 약 5μg(예를 들면, 0.5 내지 5μg 또는 1 내지 5μg)의 MPL-A 또는 이의 유사체를 함유한다.
특정 구현예에서, ODYRM 아쥬반트는 하기와 같이 제조된다:
a) 소르비탄 모노올레이트, MPL-A가 경 미네랄 오일내에 용해되고, 얻어진 오일 용액이 살균 여과되고, 일부 계면활성제, 에탄올 및 아세트산과 함께 수중에 분산되고;
b) 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트, 4차 아민, 예를 들면 DDA, 및 폴리 I:C가 수상에 용해되어, 수용액을 형성하고;
c) 연속 균질화하에 수용액이 오일 용액에 첨가되어, 아쥬반트 제형 ODYRM을 형성한다.
또다른 구현예 세트에서, 오일 및 유화제(들)에 더해, 아쥬반트 제형은 또한, 다가양이온성 담체가 덱스트란 DEAE라면, 항원이 대장균 J-5 박테린이 아니라는 조건하에, 사포닌, 스테롤, 4차 아민, 다가양이온성 담체의 조합을 포함한다(또는 필수적으로 구성되거나, 구성된다). 상기 아쥬반트는 “QCDXO”로 언급된다.
QCDXO 아쥬반트에서, 특정 구현예에서, 사포닌, 예를 들면 Quil A는 투여량 당 약 0.1 내지 약 1000μg의 양으로 존재할 수 있고, 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤은 투여량 당 약 1 내지 약 1000μg의 양으로 존재하며, 4차 아민, 예를 들면 DDA는 투여량 당 약 1 내지 약 200μg의 양으로 존재하고, 다가양이온성 담체는 투여량 당 0.5 내지 400mg의 양으로 존재할 수 있다. 투여량은 대상체 종류에 따라 다르다.
소, 양, 및 성체 돼지에 적당한 특정 구현예에서, 사포닌은 투여량 당 약 100 내지 약 1000μg(예를 들면, 투여량 당 200 내지 800μg, 또는 250 내지 500μg)의 양으로 존재하며, 스테롤은 약 100 내지 약 1000μg(예를 들면, 200 내지 1000μg, 250 내지 700μg, 또는 약 400 내지 500μg)의 양으로 존재하며, 4차 아민은 투여량 당 약 50 내지 약 200μg(예를 들면, 50 내지 150μg, 또는 약 100μg)의 양으로 존재할 수 있고, 다가양이온성 담체는 투여량 당 약 5 내지 약 500mg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 500mg, 10 내지 300mg, 또는 50 내지 200mg)의 양으로 존재할 수 있다.
반려동물 및 새끼 돼지에 적용하기에 적당한 특정 구현예에서, 사포닌, 예를 들면 Quil A 또는 이의 정제된 분획물은 투여량 당 약 10 내지 약 100μg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 50μg 또는 20 내지 50μg)의 양으로 존재하며, 스테롤은 약 5 내지 100μg(예를 들면, 10 내지 80μg 또는 20 내지 50μg)의 양으로 존재하며, 4차 아민은 투여량 당 약 5 내지 약 500μg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 100μg 또는 투여량 당 20 내지 50μg)의 양으로 존재할 수 있고, 다가양이온성 담체는 투여량 당 1 내지 50mg(예를 들면, 투여량 당 1 내지 25mg, 또는 투여량 당 10 내지 25mg)의 양으로 존재할 수 있다.
가금류 백신에 적당한 일부 구현예에서, 사포닌은 투여량 당 백신 조성물의 50μL 당 0.1 내지 5μg(예를 들면, 조성물의 50μL 당 0.5 내지 30μg, 보다 바람직하게는 1 내지 10μg)의 양으로 존재할 수 있고, 스테롤은 약 0.5 내지 약 50μg(예를 들면, 1 내지 20μg, 또는 1 내지 10μg)의 양으로 존재할 수 있고, 4차 아민은 투여량 당 약 5 내지 약 500μg(예를 들면, 투여량 당 10 내지 100μg, 또는 투여량 당 20 내지 50μg)의 양으로 존재할 수 있고, 다가양이온성 담체는 투여량 당 0.5 내지 25mg(예를 들면, 1 내지 20mg, 1 내지 10mg 또는 5 내지 10mg)의 양으로 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, QCDXO 아쥬반트는 하기와 같이 제조된다:
a) 소르비탄 모노올레이트가 오일내에 용해되고, 얻어진 오일 용액이 살균 여과되고;
b) 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트, 4차 아민, 예를 들면 DDA, 다가양이온성 담체, 스테롤 및 사포닌이 수상에 용해되어, 수용액을 형성하고;
c) 연속 균질화하에, 수용액이 오일 용액에 첨가되어, 아쥬반트 제형 QCDXO를 형성한다.
때때로, 특히 상업적인 용도로 규모를 확대하여, 항원을 농축하는 것이 불가능 또는 실행불가능하며, 저농도의 항원 용액이 사용되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 상기 설명된 아쥬반트 제형들을 포함하며, 상기 아쥬반트 제형내 유상의 함량은 희석되며, 백신 조성물은 유중수형 에멀젼이다.
실제로, 유중수형 에멀젼을 생성할 수 있고, 유상은 50% v/v 미만이다.
간단히 말하면, 첫째, 본 발명의 아쥬반트 제형은 상기 설명된 바대로 제조된다. 상기 아쥬반트 제형에서, 유상은 아쥬반트 제형의 50% v/v 이상으로 포함된다. 오일 및 유화제(들)와 다른 성분들의 양은 각각 최종 표적 농도 및 원하는 희석에 기초하여 규모가 확대된다. 예를 들면, 아쥬반트 제형이 80% v/v를 포함하는 백신 조성물을 제조하고자 한다면, 오일 이외의 성분들의 양은 1.25(1/0.8)의 요소까지 규모가 확대된다. 유화제의 양은, 있는 경우(예를 들면, TWEEN®80 및/또는 SPAN®) 반드시 규모 확대될 필요가 없다면, 오일과 유화제(들) 사이의 부피비는 아쥬반트 제형 및 최종 백신 조성물내에서 같게 유지된다.
그후, 항원 용액이 아쥬반트 제형에 첨가된다.
유중수형 에멀젼의 완전성(integrity)은 분산된 구형 물방울들이 단일분산 액적의 무작위 충전에 대한 최대 충전 분율, 즉, 0.64보다 많이 농축된 형태로 존재하지 않는 한, 길게 유지될 수 있다. Tadros, Emulsion Formation, Stability and Rheology, 1st ed. 2013, Wiley-VCH GmbH & Co KGaA를 참조한다. 수성 액적에 의해 차지되는 총 부피 분율은 가능한 한 길게 0.64, 즉 64% v/v를 초과하지 않는다. 역으로, 이것은 유상이 36% v/v 이하로 떨어지지 않아야 한다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 본 측면의 다른 구현예에서, 항원 화합물, 및 상기 설명된 구현예에 따른 희석된 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 제형이 제공되며, 유상은 백신 조성물의 36% 이상을 포함하며, 백신 조성물은 유중수형 에멀젼이다. 제한 없이, 본 발명의 본 측면에 적당한 아쥬반트 제형은 TCMO, TCMYO, QTCMO, QTCMYO, XOM, TXO, TXO-A, TAO, AXO, QCO, ODYRM, QCDXO를 포함한다. 유상의 부피는 다른 구현예에서, 백신 조성물의 37% v/v, 38% v/v, 39% v/v, 40% v/v, 41% v/v, 42% v/v, 43% v/v, 44% v/v, 45% v/v, 46% v/v, 47% v/v, 48% v/v, 49% v/v, 또는 50% v/v이다.
유상의 농도는 저장소 효과를 생성하고 숙주의 면역시스템에 의한 신속한 분해로부터 항원 및 면역조절제를 보호하기에 충분히 높아야 하며, 바람직하게는 백신 조성물의 20% v/v 이상이다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명의 백신 조성물에서, 아쥬반트 제형내 유상의 양은 백신 제형이 수중유형 에멀젼 또는 수중유중수형 에멀젼이 되도록 희석되며, 유상은 백신 조성물의 20% v/v 이상을 포함한다. 오일 및 유화제 이외의 성분들의 양은 각각 최종 목표 농도 및 원하는 희석에 기초하여 규모확대된다. 예를 들면, 아쥬반트 제형이 33.3% v/v를 포함하는 백신 조성물을 제조하기 위해, 오일 및 유화제(들) 이외의 성분들의 양은 3(1/0.333)의 요소까지 규모가 확대된다. 유화제의 양은, 있는 경우(예를 들면, TWEEN®80 및/또는 SPAN®) 반드시 규모 확대될 필요가 없지만, 오일과 유화제(들) 사이의 부피비는 아쥬반트 제형 및 최종 백신 조성물내에서 같게 유지된다.
다른 구현예에서, 백신 조성물은 수중유형 에멀젼 또는 수중유중수형 에멀젼이며, 유상은 백신 조성물의 21% v/v, 22% v/v, 23% v/v, 24% v/v, 25% v/v, 26% v/v, 27% v/v, 28% v/v, 29% v/v, 30% v/v, 31% v/v, 32% v/v, 33% v/v, 34% v/v, 35% v/v, 36% v/v, 37% v/v, 38% v/v, 39% v/v, 40% v/v, 41% v/v, 42% v/v, 43% v/v, 44% v/v, 45% v/v, 46% v/v, 47% v/v, 48% v/v, 49% v/v, 또는 50% v/v를 포함한다.
본 발명의 본 측면에 적당한 아쥬반트 제형은 아쥬반트 제형내 유상이 최종 백신 조성물의 50% v/v 이하이지만, 20% v/v 이상일 수 있다는 조건하에, TCMO, TCMYO, QTCMO, QTCMYO, XOM, TXO, TXO-A, TAO, AXO, QCO, ODYRM, QCDXO를 포함한다.
항원 및 질환
조성물은 1개 이상의 항원들을 함유할 수 있다. 항원은 대상체내 원하는 면역반응을 일으킬 수 있는 임의의 광범위한 물질들일 수 있고, 제한 없이, 하나 이상의 바이러스들(불활성화된, 약화된 및 변형된 생물), 박테리아, 기생충, 뉴클레오타이드들(제한 없이, 핵산계 항원들, 예를 들면 DNA 백신들 포함), 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 재조합 단백질, 합성 펩타이드, 단백질 추출물, 세포(종양세포 포함), 조직들, 다당류, 탄수화물, 지방산, 테이코산, 펩티도글리칸, 지질 또는 당지질을 개별적으로 또는 이들의 임의의 조합으로 포함한다.
본 발명의 아쥬반트와 함께 사용된 항원들은 또한, 본 명세서에서 언급된 유기체들로부터 분리될 수 있는, 뉴클레오타이드들, 폴리뉴클레오타이드들, 펩타이드들, 폴리펩타이드들의 면역성 단편들을 포함한다.
대상체내에서 질환을 일으키지 않는 생(live), 변형된-생, 및 약화된 바이러스 균주들은 비-악성 형태로 분리되거나, 당해 분야에 잘 알려진 방법들을 사용하여 약화되며, 적당한 세포주내 연속계대, 또는 자외선광 또는 화학적 뮤타젠에 대한 노출을 포함한다. 불활성화 또는 살해된 바이러스 균주들은 당해 분야의 숙련된 자들에게 알려져 있는 방법들에 의해 불활성화된 균주들이며, 상기 방법은 포르말린, 베타프로프리오락톤(BPL), 2원 에틸렌이민(BEI), 살균 방사선, 가열, 또는 다른 상기 방법들을 포함한다.
병원균들에 의해 야기되는 광범위한 질환들에 대하여 대상체를 보호할 수 있는 다가 조성물을 제조하기 위해서는 2개 이상의 항원들이 조합될 수 있다. 현재, 백신의 상업적 제조사 뿐만 아니라 최종 사용자들도 다가 백신 제품들을 선호한다. 종래의 아쥬반트는 이들이 효과적으로 사용될 수 있는 여러 항원들(일가 또는 다가)로 종종 한정되는 반면, 본 발명에 설명된 아쥬반트들은 일가 및 다가의 광범위한 항원들에 의해 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 설명된 항원들은 본 명세서에 설명된 아쥬반트들을 포함하는 단일 조성물내에서 조합될 수 있다.
아쥬반트 조성물에 의해 항원으로서 사용될 수 있는 세균의 일부 예들은 비제한적으로, 아세네토박터 칼코아세티쿠스(Aceinetobacter calcoaceticus), 아세토박터 파세루이아누스(Acetobacter paseruianus), 악티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 알리사이클로바실러스 악시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 아르해글로부스 풀기더스(Arhaeglobus fulgidus), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로터모필러스(Bacillus stearothermophillus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 터모카테누라투스(Bacillus thermocatenulatus), 보데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 하이오인테스티날리스(Campylobacter hyointestinalis), 클라미디아 프시타치(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라마이도필라(Chlamydophila) 종, 크로모박테리움 비스코섬(Chromobacterium viscosum), 에리시펠로트릭스 루시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathieae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에를리치아 캐니스(Ehrlichia canis), 대장균(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 헬리코박터 수이스(Helicobacter suis), 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophilia), 모락셀사(Moraxellsa) 종, 마이코박테리움 보비스(Mycobactrium bovis), 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라스마 마이코이데스(Mycoplasma mycoides) 아종, 마이코이데스(mycoides) LC, 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 오도리박터 덴티카니스(Odoribacter denticanis), 파스튜렐라(Pasteurella)(만헤이미아(Mannheimia)) 하에몰리티카(haemolytica), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 포토하브드더스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 포르파이로모나스 굴라에(Porphyromonas gulae), 포르파이로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 포르파이로모나스 살리보사(Porphyromonas salivosa), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) C9, 슈도모나스 플루오레센스 SIKW1, 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi), 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 종 B11-1, 알칼리게스 유트로퍼스(Alcaliges eutrophus), 사이크로박터 임모빌리스(Psychrobacter immobilis), 리케차 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 리케차 리케차(Rickettsia rickettsia), 예를 들면, 살모넬라 엔테리카 타이피뮤리움(Salmonella enterica Typhimurium), 살모넬라 엔테리카 본고리(Salmonella enterica Bongori), 살모넬라 엔테리카 두블린(Salmonella enterica Dublin), 살모넬라 엔테리카 콜레라세우이스(Salmonella enterica Choleraseuis), 및 살모넬라 엔테리카 뉴포트(Salmonella enterica Newport)를 포함하는, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 모든 혈청형들, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스피를리나 플라텐시스(Spirlina platensis), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlyoccocus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphyloccoccus epidermidis), 스타필로코쿠스 하이쿠스(Staphylococcus hyicus), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 신나모네우스(Streptomyces cinnamoneus), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis), 스트렙토마이세스 엑스폴리아테스(Streptomyces exfoliates), 스트렙토마이세스 스카비에스(Streptomyces scabies), 설폴로버스 악시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 시에코사이스티스(Syechocystis) 종, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 트레포네마 미누툼(Treponema minutum), 트레포네마 파제데니스(Treponema phagedenis), 트레포네마 레프린겐스(Treponema refringens), 트레포네마 빈센티이(Treponema vincentii), 트레포네마 팔라듐(Treponema palladium), 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes: T. 파이오게네스) 및 렙토스피라(Leptospira) 종, 예컨대 공지된 병원체 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포타이포사(Leptospira grippotyposa), 렙토스피라 하드조(Lmeptospira hardjo), 렙토스피라 보르그페테르세니이 하드조-보비스(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis), 렙토스피라 보르그페테르세니이 하드조-프라지트노(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 익테로하에모라지애(Leptospira icterohaemorrhagiae), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 및 렙토스피라 브라티슬라바(Leptospira bratislava), 및 이들의 조합을 포함한다.
불활성화 바이러스 및 약화된 생 바이러스들 모두 아쥬반트 조성물에 사용될 수 있다. 항원으로서 사용될 수 있는 바이러스들의 일부 예들은 비제한적으로, 조류 헤르페스바이러스, 소 헤르페스바이러스, 개 헤르페스바이러스, 말 헤르페스바이러스, 고양이 바이러스 비기관염 바이러스, 마렉(Marek)병 바이러스, 양 헤르페스바이러스, 돼지 헤르페스바이러스, 돼지 유행병 설사증 바이러스(PEDv), 가성광견병 바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 개 홍역 바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 개 아데노바이러스, 개 파보바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 3, 양 파라인플루엔자 3, 린더페스트 바이러스, 경계 질환 바이러스, 소 바이러스 설사증 바이러스(BVDV), BVDV 타입 I, BVDV 타입 II, 고전적 돼지 콜레라 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 소 결핵, 말 감염성 빈혈 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 뉴캐슬병 바이러스, 양 진행성 폐렴 바이러스, 양 폐 선암종 바이러스, 개 코로나바이러스(CCV), 범친화성 CCV, 개 호흡기 코로나바이러스, 소 코로나바이러스, 고양이 칼리시바이러스, 고양이 장의 코로나바이러스, 고양이 감염성 복막염, 바이러스, 돼지 유행병 설사증 바이러스, 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스, 돼지 파보바이러스, 돼지 써코바이러스(PCV) 타입 I, PCV 타입 II, 돼지 재생성 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 칠면조 코로나바이러스, 소 유행열 바이러스, 광견병, 로토바이러스, 소포성 구내염 바이러스, 렌티바이러스, 조류 인플루엔자, 리노바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 개 인플루엔자 바이러스, 고양이 인플루엔자 바이러스, 인간 인플루엔자 바이러스, 동부형 말 뇌염 바이러스(EEE), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 웨스턴 말 뇌염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, B형 간염 바이러스, 리노바이러스, 및 홍역 바이러스, 및 이들의 조합을 포함한다.
펩타이드 항원들의 예들은 보데텔라 브론치셉티카 p68, GnRH, IgE 펩타이드, Fel d1, 및 암 항원, 및 이들의 조합을 포함한다. 다른 항원들의 예들은 뉴클레오타이드, 탄수화물, 지질, 당지질, 펩타이드, 지방산, 리포테이코산 및 테이코산, 및 펩티도글리칸, 및 이들의 조합을 포함한다.
아쥬반트 조성물에 의해 항원으로서 사용될 수 있는 기생충들의 일부 예들은 비제한적으로, 아나플라즈마, 간질(간 디스토마), 콕시디아, 아이메리아 종, 네오스포라 카니눔(neospora caninum), 톡소플라스마 곤디이(toxoplasma gondii), 기아르디아(giardia), 디로필라리아(심장사상충), 십이지장충(구충), 쿠페리아, 해몬쿠스 콘토르투스(바버 폴 벌레(Barber pole worm)) 오스터타크위충(위충), 딕타이오카울러스 비비라포스(dictyocaulus viviparous)(폐충), 트라이파노소마(trypanosoma) 종, 레슈마니아(leishmania) 종, 트리코모나스(trichomonas) 종, 크립토스포리디움 파븀(cryptosporidium parvum), 바베시아, 주혈흡충, 촌충, 스트론길로이데스(strongyloides), 회충, 트리키넬라(trichinella), 사르코사이스티스(sarcocystis), 함몬디아(hammondia), 및 이소프소라(Isopsora), 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 비제한적으로, 참진드기, 개진드기, 데르마센토르(Dermacentor), 뭉뚝참진드기(Amblyomma), 꼬리소진드기(Boophilus), 히알로마(Hyalomma) 및 가시들피참진드기(Haemaphysalis) 종을 포함하는 진드기 및 이들의 조합을 포함하는, 외부 기생충들이 고려된다.
면역반응을 유도하기 위해 사용된 항원의 양은 사용된 항원, 대상체, 및 원하는 반응의 수준에 따라 상당히 다양할 것이며, 당해 분야의 숙련자들에 의해 측정될 수 있다. 변형된 생 바이러스 또는 약화된 바이러스들을 함유하는 백신에 대하여, 항원의 치료적으로 효과적인 양은 일반적으로 102 조직 배양 감염량(Tissue Culture Infective Dose, TCID)50 내지 약 1010 TCID50 포함이다. 많은 상기 바이러스들에 대하여, 치료적으로 효과적인 투여량은 일반적으로 약 102 TCID50 내지 약 108 TCID50 포함이다. 일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 투여량의 범위는 약 103 TCID50 내지 약 106 TCID50 포함이다. 일부 다른 구현예에서, 치료적으로 효과적인 투여량의 범위는 약 104 TCID50 내지 약 105 TCID50 포함이다.
불활성화 바이러스를 함유하는 백신에 대하여, 항원의 치료적으로 효과적인 양은 투여량 당 약 100 이사의 관련단위들, 및 종종 투여량 당 약 1,000 내지 약 4,500의 관련단위들 포함이다. 다른 구현예에서, 항원의 치료적으로 효과적인 양은 투여량 당 적어도 약 250 내지 약 4,000의 관련단위들 포함, 투여량 당 약 500 내지 약 3,000의 관련단위들 포함, 투여량 당 약 750 내지 약 2,000의 관련단위들 포함, 또는 투여량 당 약 1,000 내지 약 1,500의 관련단위들 포함이다.
불활성화 바이러스들을 함유하는 백신에서 항원의 치료적으로 효과적인 양은 mL 당 상대역가(RP)의 관점에서 측정될 수도 있다. 치료적으로 효과적인 양은 종종, mL 당 약 0.1 내지 약 50RP 포함의 범위이다. 다른 구현예에서, 항원의 치료적으로 효과적인 양은 mL 당 약 0.5 내지 약 30RP 포함, mL 당 약 1 내지 약 25RP 포함, mL 당 약 2 내지 약 20RP 포함, mL 당 약 3 내지 약 15RP 포함, 또는 mL 당 약 5 내지 약 10RP 포함의 범위이다.
백신내에 투여된 세균성 항원의 세포수는 투여량 당 약 1x106 내지 약 5x1010 콜로니 형성 단위(CFU) 포함이다. 다른 구현예에서, 세포수는 약 1x107 내지 약 5x1010 CFU/투여량 포함, 또는 약 1x108 내지 약 5x1010 CFU/투여량 포함이다. 또다른 구현예에서, 세포수는 약 1x102 내지 약 5x1010 CFU/투여량 포함, 또는 약 1x104 내지 약 5x109 CFU/투여량 포함, 또는 약 1x105 내지 약 5x109 CFU/투여량 포함, 또는 약 1x106 내지 약 5x109 CFU/투여량 포함 또는 약 1x106 내지 약 5x108 CFU/투여량 포함, 또는 약 1x107 내지 약 5x109 CFU/투여량 포함 범위이다.
백신내에 투여된 기생충 항원의 세포수는 투여량 당 약 1x102 내지 약 1x1010 포함이다. 다른 구현예에서, 세포수는 투여량 당 약 1x103 내지 약 1x109 포함, 또는 투여량 당 약 1x104 내지 약 1x108 포함, 또는 투여량 당 약 1x105 내지 약 1x107 포함, 또는 투여량 당 약 1x106 내지 약 1x108 포함 범위이다.
종래의 아쥬반트에 의하면, 혈청반응의 비교가능한 수준을 자극하기 위해, 변형된 생 또는 약화된 바이러스들보다 실질적으로 많은 양의 불활성화 바이러스들이 필요하다는 사실이 당해 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 그러나, 본 명세서에 설명된 아쥬반트 조성물에 의하면, 대략 같은 양의 불활성화 바이러스 및 변형된 생 바이러스가 유사한 수준의 혈청반응을 자극한다. 게다가, 같은 수준의 혈청 반응을 얻기 위해 종래의 아쥬반트와 비교할때, 본 명세서에 설명된 아쥬반트에 의해 소량의 변형된 생, 약화된, 및 불활성화된 바이러스가 필요하다. 상기 예상치 못한 발견들은 면역성 조성물 및 백신 조성물을 제조하는 동안 공급원의 보존 및 비용감소를 입증한다. 광범위한 용도를 갖는 백신에 대하여, 연간 백만 투여량들이 요구되며, 그래서 상기 절감은 실질적일 수 있다.
조성물의 투여
조성물의 투여량 크기는 전형적으로 대상체 및 항원에 의존하여, 약 1 내지 약 5mL 포함의 범위이다. 예를 들면, 개 또는 고양이에 대하여, 약 1mL의 투여량이 전형적으로 사용되는 반면, 소에는 약 2 내지 5mL의 투여량이 전형적으로 사용된다. 그러나, 상기 아쥬반트들은 미세투여량으로 배합될 수 있는 반면, 약 100.mu.L의 투여량이 사용될 수 있다.
아쥬반트 조성물을 위한 투여경로는 비경구, 경구, 구비강, 비강내, 기관내, 국소, 피하, 근육내, 경피, 진피내, 복강내, 안구내, 정맥내 투여 및 난을 포함한다. 주사기, 점적기, 무바늘 주사 디바이스, 패치 등을 포함하는 임의의 적당한 디바이스가 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 사용하기 위해 선택한 경로 및 디바이스는 아쥬반트의 조성, 항원 및 대상에 따라 다를 것이며, 이는 당해 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.
조성물의 용도
상업적으로 사용하기 위해 임의의 아쥬반트 제제를 위한 요건들 중 하나는 긴 저장기간동안 아쥬반트 용액의 안정성을 정립하는 것이다. 제조하기 쉽고, 적어도 18개월동안 안정적인 아쥬반트 제형이 본 명세서에 제공된다. 한 구현예에서, 제형은 약 18개월동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 제형은 약 18 내지 24개월동안 안정적이다. 다른 구현예에서, 제형은 약 24개월동안 안정적이다. 가속시험 과정들은 또한, 본 명세서에 설명된 제형이 안정적이라는 점을 가리키고 있다.
본 아쥬반트 조성물의 유익한 특징은 이들이 광범위한 대상체들에 안전하게 및 효과적으로 투여될 수 있다는 점이다. 당해 분야에서, 아쥬반트의 조합이 각 성분들보다 많은 반응원성을 입증할 것으로 기대되고 있다. 그러나, 본 명세서에 설명된 조성물은 임의의 1개 또는 2개의 성분들이 사용된 조성물과 비교할 때 감소된 반응원성을 나타내는 반면, 아쥬반트 효과가 유지된다. 본 명세서에 설명된 아쥬반트 조성물은 다른 아쥬반트 조성물과 비교할 때 안전성이 개선된 것을 입증하였음을 놀랍게도 발견하였다.
본 명세서에 설명된 아쥬반트 조성물은 대상체의 원하는 면역반응을 유도하기 위해 사용가능하다. 이들은 여러 종류들에서 효과가 있다. 적당한 대상체는 아쥬반트 조성물의 투여를 원하는 임의의 동물이다. 그것은 영장류, 가축, 반려동물, 실험실 시험 동물, 사로잡힌 야생동물, 조류(난내의 조류 포함), 파충류, 및 어류를 포함하는 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 따라서, 이 용어는 원숭이, 인간, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 닭, 칠면조, 오리, 다른 가금류, 개구리, 및 도마뱀을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다.
본 명세서에 설명된 아쥬반트는 감염된 동물과 백신접종을 한 동물들 사이에 혈청학적 구별을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 이들은 백신내 항원이 백신접종된 동물들내에서 야생형 바이러스의 패턴과 다른 항체 패턴을 유도하는 마커 백신에 사용될 수 있다. 마커 백신은 일반적으로 항체 패턴의 차이를 측정하는 반려 진단시험과 접합하여 사용되며, 동물이 백신접종받고, 동물들이 야생형 바이러스에 의해 감염된 것을 입증한다. 상기 기술은 대상체 군집으로부터의 바이러스 박멸 및 대조군에 사용가능하다.
본 발명은 또한, 모두 본 명세서에 따라 아쥬반팅된, 헨드라 바이러스 G 단백질(및 이의 단편, 이량체, 다량체, 및 이의 변형된 형태)로부터 제공된 항원을 사용하여, 니파 바이러스 및/또는 헨드라 바이러스에 의해 야기된 전염병 및 질환에 대하여 보호하는데 사용가능한 신규한 백신 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 아쥬반트는 TXO, TAO 및 TXO-A로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 백신들은 예를 들면, 말, 개, 돼지 및 인간의 전염병 및 질환을 예방하는데 사용가능하다. 대부분의 바람직한 구현예에서, 돼지 및 개 모두 헨드라 및 니파 바이러스 모두로부터 보호된다.
상당수의 인간 사망자를 낸 NiV의 재발되는 발생은 최근에 문제가 되고 있고, 예를 들면, Butler, Nature, vol. 429, at page 7 (2000); 및 Gurley et al., Emerging Infectious Diseases, vol. 13(7), pp. 1031-1037 (2007)을 참조한다. 사례 연구는 돼지로부터 동물원성 전파(zoonotic transmission)되는 사람의 질환에 연결되어 있고, Parashar et al., J. Infect. Dis.vol 181, pp. 1755-1759 (2000)을 참조한다. 헨드라 바이러스는 또한, 말로부터 전파에 의해 사람에게 사망으로 분명하게 결부시켰었다. 현재는 니파 바이러스 감염을 위해 어떠한 허가된 백신이 존재하지 않더라도, 말에 사용하기 위해 인증된 헨드라 바이러스(Equivac® HeV; Zoetis)에 의해 야기된 전염병 또는 질환의 예방을 위한 허가된 백신이 있다. 임상적으로 효과적일 수 있는 니파 바이러스 또는 헨드라 바이러스 백신이 여전히 필요하다.
헨드라 바이러스 및 니파 바이러스와 같은 파라믹소바이러스는 바이러스 입자의 엔벨로프내에 2개의 주요 막-결합 당단백을 가지고 있다. 한 당단백은 숙주세포 상에서 수용체에 대한 비리온 부착을 위해 요구되며, 혈구응집소-뉴라미니다제 단백질(HN) 또는 혈구응집소 단백질(H)로 지정되며, 다른 당단백은 혈구응집반응 또는 뉴라미니다제 활성을 갖고 있지 않은 당단백(G)이다. 부착 당단백은 타입 II 막 단백질이며, 분자의 아미노(N) 말단은 세포질쪽으로 배향되어 있고, 단백질의 카르복시(C) 말단은 세포외에 있다. 다른 주요 당단백은 융합(F) 당단백이며, 이는 2개의 헵타드 반복(Heptad Repeat, HR) 영역 및 소수성 융합 펩타이드를 함유하는 삼량체 등급 I 융해성 엔벨로프 당단백이다. 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스는 수용체 결합후 이들의 부착 G 당단백 및 F 당단백의 협동 작용을 통해, 수용체 숙주 세포로 pH-독립적 막 융합과정을 통해 세포들을 감염시킨다.
헨드라 바이러스 G 당단백은 감염에 대하여 잠재적으로 교차보호할 수 있었으며, 니파 바이러스에 의한 질환은 K. Bossart et al.,Journal of Virology, vol. 79, pp. 6690-6702 (2005), 및 B. Mungall et al., Journal of Virology, vol. 80, pp. 12293-12302 (2006)에 제시되어 있다. 그러나, 종래의 연구는 임의의 포유동물 종류들에 대하여, 이 점과 관련하여 실제로 임상적으로 효과적인 백신 조성물을 제공하지 않는다. 따라서, 본 발명은 헨드라 바이러스 G 단백질, 본 발명의 실시에 따라 설명된 아쥬반트, 및 1개 이상의 부형제를 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대한 임상적으로 효과적인 보호를 유도하기에 효과적인 양으로 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다.
본 발명의 실시에 사용가능한 헨드라 바이러스 G 당단백 폴리펩타이드, 및 이들의 재조합 발현과 관련하여, 공개된 국제 특허공개 제WO2012/158643호 및 제WO2006/085979호의 전문을 참조하며, 상기 정보는 명확하게 개시되어 있다. 본 발명에 사용가능한 구체적 헨드라 바이러스 G 단백질 폴리펩타이드들의 바람직한 예들은 국제 특허공개 제WO2012/158643호에 개시되어 있고, 예를 들면, 전장 G 단백질(이의 서열번호 2); 이의 가용성 단편(국제 특허공개 제WO2012/158643호의 서열번호 2의 아미노산 73-604를 인코딩); 및 lg(카파) 리더 서열을 갖는 그 안에 개시된 추가의 단편(국제 특허공개 제WO2012/158643호의 서열번호 16)을 포함한다. 일반적으로, 헨드라 바이러스 G 당단백의 가용성 형태는 엑토도메인의 전부 또는 일부를 포함하며, G 당단백의 막통과 도메인의 전부 또는 일부, 및 세포질 꼬리의 전부 또는 일부를 삭제함으로써 생성된다. 바람직하게, 인코딩 유전자 서열은 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
일부 구현예에서, 헨드라 G 당단백은 이량체 및/또는 사량체 형태일 수 있다. 상기 이량체는 G 당단백내 시스테인 잔기들 사이에 형성된 디설파이드 결합들의 형성에 의존한다. 상기 디설파이드 결합은 원상태 G 당단백에서 형성된 결합들에 대응할 수 있거나, 다른 디설파이드 결합이 형성되어, 항원성을 개선하는 G 당단백의 다른 이량체 및/또는 사량체 형태가 얻어진다. 추가로, 비-이량체화된 및 사량체화된 형태는 본 발명의 실시에 따라 사용가능하며, G 당단백이 수많은 형태-의존성 에피토프들(즉, 4차 3차원 구조로부터 발생)을 제공한다는 점 및 중화 항체반응을 부여하기 위해 상기 수많은 천연 에피토프들의 보존이 그에 맞춰 매우 바람직하다는 점을 다시 고려한다.
일반적으로 말하면, 헨드라 G 단백질을 위한 발현 벡터들은 국제 특허공개 제WO2012/158643호의 실시예 1에 설명된 바와 같이 구조될 수 있고, CHO 세포들로부터의 얻어진 단백질은 이의 실시예 2에 설명된 바와 같이, 또는 선택적으로 백시니아 시스템(이의 실시예 3 참조) 또는 293개의 세포들(이의 실시예 4 참조)을 사용하여 발현된다. 구체적인 바람직한 실시예에서, 가용성 G 단백질은 원상태 헨드라 바이러스 G 당단백의 아미노산 73-604로 제공된다(국제 특허공개 제WO2012/158643호의 서열번호 2 참조). 이의 이량체화는 CHO 세포들의 발현에 부수적으로 자발적으로 일어나고, 얻어진 G 단백질은 약 50% 이량체 및 50% 사량체이며, 모노머가 거의 남지 않는다. 293F 세포들의 발현은 약 70% 이량체로 안내한다. 얻어진 단백질 분획물은 본 명세서 전반에 걸쳐 설명된 바와 같이 아쥬반트와 혼합된다. 국제 특허공개 제WO2012/158643호에 설명한 바와 같이, 대형 동물들에 대한 항원의 바람직한 투여량은 투여량 당 50 내지 200μg의 범위내에 있고, 100μg이 가장 바람직한 투여량이다. 개와 같은 소형 동물들에 대하여는, 25 내지 50μg과 같은 더 적은 양이 필요하며, 당해 분야의 숙련자들에 의해 인정될 것이다.
게다가, 상기 설명된 임의의 구현예들에 따른 아쥬반트는 진단용 또는 치료용 항체들의 발생을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이 측면에서, 공급원 동물은 본 발명의 아쥬반트 조성물 및 항원을 함유하는 제형에 의해 면역화된다. 항원의 선택은 상기 치료용 또는 진단용 항체들을 얻을 필요가 있는 사람에 의해 결정되며, 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 바이러스 입자, 추출물, 재조합 항원들, 세포벽 구조물 등을 포함한다. 항원들은 또한, 뱀에 물렸을 때 쓰는 약물을 제조하기 위한 독을 포함할 수도 있다.
본 발명의 본 측면에 적당한 항원들은 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 양 또는 조류 기원일 수 있다. 특정 구현예에서, 항원은 FeLV gp70, 소 파라인플루엔자-3 BPI-3(HN 단백질), 히스토필러스 솜니(Histophilus somni) p31, 보데텔라 FHA, 파라폭스, BVDV1 gp53, BVDV2 gp53, 클로스트리듐 독소, 개 써코바이러스, 브라키스피라 효다이센테리애(돼지 종) 항원; 불활성화된 전체 세포 및 불활성화된 펩신 소화물로부터 선택될 수 있다.
면역화후 특정 시간후, 공급원 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 기니아 피그, 토끼, 염소, 양, 가금류, 소, 말)로부터 항체 공급원이 추출된다. 특정의 다른 구현예에서, 공급원 동물은 고양이 또는 개이다. 항체들의 공급원은 궁극적으로 단일클론 또는 다중클론 항체들이 필요한지의 여부에 따라 다르다. 다중클론 항체들을 위해서는, 혈청 또는 우유를 사용하는 것을 고려할 수 있다. 단일클론 항체들을 위해서는, 비장 세포가 적당한 공급원이다. 상기 항체들은 제한 없이, 해독제, 이식 거부 약물치료, 혈청 중화 분석, ELISA, ELISPOT, 웨스턴 블랏, 세포 기반 분석, 효력 분석, 및 면역조직화학을 포함한, 진단, 연구 또는 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 제한 없이, 해독제, 이식 거부 약물치료, 혈청 중화 분석, ELISA, ELISPOT, 웨스턴 블랏, 세포 기반 분석, 효력 분석, 및 면역조직화학을 포함한, 진단 및 치료 용도에 사용하기 위해 공급원 동물로부터 추출된 단일클론 및 다중클론 항체들을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의한 면역화는 하나 이상의 동물(바람직하게는 2개 이상의 동물, 또는 3개 이상의 동물, 또는 처리된 동물의 50%에서, 또는 처리된 동물의 75% 이상에서, 가장 바람직하게는 모든 처리된 동물에서), 원하는 항원으로 충분히 높은 혈청학 역가(1000 이상, 더 바람직하게는 5000 이상, 또는 더 바람직하게는 10000 이상, 더 바람직하게는, 50000 이상, 더 바람직하게는 100000 이상, 더 바람직하게는 250000 이상, 더 바람직하게는 500000 이상, 더 바람직하게는 1000000 이상)를 유도해내어, 진단용도 또는 연구용도를 위한 충분한 양의 항체들을 얻는다.
전형적으로, 면역글로불린 G(IgG) 이소타입의 항체들이 본 용도에 사용되지만, 다른 이소타입들의 항체들, 예를 들면 면역글로불린 M(IgM)도 또한 사용된다. 항체 공급원은 궁극적으로, 다중클론 또는 단일클론 항체가 요구되는지의 여부에 따라 다르다. 다중클론 항체들을 위해, 항체들의 공급원으로서 혈청 또는 우유를 사용할 수 있다. 단일클론 항체들을 위해, 비장세포가 적당한 항체 공급원이다. 항체들의 추가 정제, 필요하다면, 또는 단일클론 항체들의 제조는 문헌에 광범위하게 설명되어 있고, 당해 분야의 숙련자는 상기 과정을 수행하는데 큰 어려움이 없었다. 또한, 항체들은 필요하다면, 목표 종류들에 적응될 수 있다(예를 들면, 시성됨(canonized) 또는 펠리나이즈됨(felinized)). 다시, 이를 위한 기술들은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 본 출원에 설명될 필요는 없다.
항체의 적용
항체들은 혈청 중화 분석, ELISA, ELISPOT, 웨스턴 블랏, 세포 기반 분석, 효력 분석, 및 면역조직화학을 위한 시약으로서 적당하다. 상기 기술들은 당해 분야에 알려져 왔다.
본 발명의 항체들은 이식 거부, 예를 들면, 항흉선세포성 글로불린(ATG) 제제의 발생을 위한 치료제로서 사용될 수도 있다. 현재, 2개의 상기 제제들이 시판되고 있다: Atgam® 및 Thymoglobulin®. 항-흉선세포성 글로불린의 제조방법은 일반적으로, 미국 특허공개 제US2004/0023340호에 설명되어 있다.
해독제 약품을 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 상기 구현예에서, 뱀 독 성분들은 항원으로서 사용되었다. 독 및 이들의 성분도 또한 당해 분야에 잘 알려져 있다.
제한 없이, 가금류, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 돼지, 소 및 말 종을 포함하는 많은 종의 동물들이 공급원 동물로서 사용될 수 있다. 공급원 동물의 선택은 당해 분야의 숙련자의 직무 및 판단에 의존한다.
구체적인 비-제한적인 구현예들은 하기와 같다:
제1 구현예에서, 본 발명은 유상 및 수상을 포함하는 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 유상은 제형의 50% v/v 이상으로 포함되고, 상기 제형은 하나 이상의 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하되,
a) 상기 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 부재할 경우, 제형은:
i. 폴리 I:C, 당지질 및 선택적으로 4차 아민; 또는
ii. 다가양이온성 담체를 포함하며;
b) 상기 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체가 부재할 경우, 제형이 알루미늄의 공급원을 포함한다.
제2 구현예에서, 본 발명은 제1 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는, 존재하는 경우, CpG 또는 올리고리보뉴클레오타이드이며; 다가양이온성 담체는, 존재하는 경우, 덱스트란, 덱스트란 DEAE(및 이의 유도체), PEG, 구아 검, 키토산 유도체, 폴리셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시에틸 셀룰로스(HEC) 폴리에틸렌이멘 및 폴리아미노로 구성된 군으로부터 선택되고; 4차 아민은 존재하는 경우, DDA 및 아브리딘으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제3 구현예에서, 본 발명은 제1 또는 제2 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 존재하는 경우, CpG이며, 다가양이온성 담체가 존재하는 경우, 덱스트란 DEAE이고, 4차 아민은 존재하는 경우, DDA이다.
제4 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제3 구현예들 중 어느 하나에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 당지질은 존재하는 경우, 하기 화학식 I의 화합물을 포함한다:
화학식 I
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상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 또는 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 포화 알킬 라디칼이고;
X는 -CH2-, -O- 또는 -NH-이고;
R2는 수소, 또는 20개 이하의 탄소 원자들을 갖는 포화 또는 불포화 알킬 라디칼이고;
R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, -SO4 2-, -PO4 2- 또는 -COC1-10 알킬이고;
R6은 L-알라닐, L-알파-아미노부틸, L-아르기닐, L-아스파르기닐, L-아스파르틸, L-시스테이닐, L-글루타밀, L-글라이실, L-히스티딜, L-하이드록시프롤릴, L-이소류실, L-류실, L-라이실, L-메티오닐, L-오니티닐, L-페닐알라닐, L-프롤릴, L-세릴, L-트레오닐, L-티로실, L-트립토파닐, L-발릴 또는 이의 D-이성질체이다.
제5 구현예에서, 본 발명은 제4 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 당지질은 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아미드 또는 이의 염이다.
제6 구현예에서, 본 발명은 제5 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 염이 아세테이트이다.
제7 구현예에서, 본 발명은 제4 구현예로 생각되는 임의의 하나의 피스트의 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체를 포함하며, 스테롤 및 폴리 I:C 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
제8 구현예에서, 본 발명은 스테롤을 포함하고 사포닌을 추가로 포함하는, 제7 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공한다.
제9 구현예에서, 본 발명은 제7 및 제8 구현예들 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 사포닌은 존재하는 경우, 트리테르페노이드 사포닌이고, 스테롤은 존재하는 경우, 에르고스테롤, 라노스테롤 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된다.
제10 구현예에서, 본 발명은 제9 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 사포닌은 존재하는 경우, Quil A이고, 스테롤은 존재하는 경우, 콜레스테롤이다.
제11 구현예에서, 본 발명은 제7 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 폴리 I:C를 포함하며, 4차 아민 및 당지질 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
제12 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제11 구현예들 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 투여량 당 0.5 내지 100μg의 양으로 MPL-A 또는 이의 유사체를 포함한다.
제13 구현예에서, 본 발명은 제12 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, MPL-A 또는 이의 유사체는 투여량 당 5 내지 50μg, 또는 투여량 당 5 내지 20μg, 또는 투여량 당 1 내지 5μg의 양으로 존재한다.
제14 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제13 구현예들 중 임의의 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 투여량 당 0.5 내지 400μg의 양으로 포함한다.
제15 구현예에서, 본 발명은 제14 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 투여량 당 약 100 내지 약 250μg, 또는 투여량 당 약 20 내지 약 50μg, 또는 투여량 당 약 1μg의 양으로 존재한다.
제16 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 0.5 내지 약 400mg의 양으로 다가양이온성 담체를 포함하는, 제1 내지 제15 구현예들 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공한다.
제17 구현예에서, 본 발명은 제16 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 다가양이온성 담체는 투여량 당 50 내지 300mg, 투여량 당 1 내지 25mg, 또는 투여량 당 1 내지 10mg의 양으로 존재한다.
제18 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제17 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 투여량 당 약 0.5 내지 약 2000μg의 양으로 당지질을 포함한다.
제19 구현예에서, 본 발명은 제18 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 당지질은 투여량 당 약 1000μg, 투여량 당 25 내지 50μg, 또는 투여량 당 1 내지 10μg의 양으로 존재한다.
제20 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 0.1 내지 약 1000μg의 양으로 스테롤을 포함하는, 제1 내지 제19 구현예들 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공한다.
제21 구현예에서, 본 발명은 제20 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 스테롤이 투여량 당 250 내지 500μg, 투여량 당 20 내지 50μg, 또는 투여량 당 1 내지 10μg의 양으로 존재한다.
제22 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 0.1 내지 1000μg의 양으로 사포닌을 포함하는, 제1 내지 제21 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공한다.
제23 구현예에서, 본 발명은 제22 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 사포닌이 투여량 당 250 내지 500μg, 투여량 당 20 내지 50μg, 또는 투여량 당 1 내지 10μg의 양으로 존재한다.
제24 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 0.5 내지 약 100μg의 양으로 폴리 I:C를 포함하는, 제1 내지 제23 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공한다.
제25 구현예에서, 본 발명은 제24 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 폴리 I:C가 투여량 당 5 내지 50μg, 투여량 당 5 내지 20μg, 또는 투여량 당 1 내지 5μg의 양으로 존재한다.
제26 구현예에서, 본 발명은 수산화알루미늄 겔인 알루미늄의 공급원을 포함하는, 제1 내지 제25 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공한다.
제27 구현예에서, 본 발명은 제26 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 알루미늄의 공급원은 제형의 5 내지 20% v/v의 양으로 존재한다.
제28 구현예에서, 본 발명은 제27 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 알루미늄의 공급원은 제형의 10% v/v의 양으로 존재한다.
제29 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제28 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 유상이 오일 및 유용성 유화제를 포함한다.
제30 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제29 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 유상이 85% v/v 이하의 양으로 존재한다.
제31 구현예에서, 본 발명은 제30 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 유상이 51%의 양으로 존재한다.
제32 구현예에서, 본 발명은 제29 내지 제31 구현예 중 어느 하나의 아쥬반트 제형을 제공하며, 오일이 제형의 40 내지 84% v/v를 포함하고, 유용성 유화제는 제형의 1 내지 11% v/v를 포함한다.
제33 구현예에서, 본 발명은 제32 구현예의 아쥬반트 제형을 제공하며, 오일이 제형의 45% v/v를 포함하고, 유용성 유화제는 제형의 6% v/v를 포함한다.
제34 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제33 구현예 중 어느 하나에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 오일은 스쿠알렌, 식물성 오일, 트리글리세라이드, 비-대사성 직쇄형 알칸 오일 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제35 구현예에서, 본 발명은 제34 구현예에 따른 아쥬반트 제형을 제공하며, 상기 오일이 경 미네랄 오일이다.
제36 구현예에서, 본 발명은 제1 내지 제35 구현예 중 어느 하나에 따른 아쥬반트 제형 및 유효량의 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 조성물의 유상이 50% v/v 이상이다.
제37 구현예에서, 본 발명은 유효량의 항원 및, 유상 및 수상을 포함하는 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 유상이 제형의 50% v/v 이상으로 포함되고; 다가양이온성 담체; 및
a. 상기 아쥬반트 제형이 DEAE 덱스트란, Quil A, 콜레스테롤 및 DDA로 구성된 경우, 항원이 대장균 J-5 박테린이 아니라는 조건하에, 사포닌 및 스테롤, 및 선택적으로 4차 아민의 조합; 또는
b. 상기 아쥬반트 제형이 DEAE 덱스트란 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드로 구성된 경우, 항원이 소, 양, 말 또는 돼지를 감염시키는 병원균을 포함하거나, 상기 병원균으로부터 유도되고, 대장균 J-5 박테린이 아니라는 조건하에, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드
를 포함한다.
제38 구현예에서, 본 발명은 제37 구현예에 따른 백신 조성물을 제공하며, 사포닌은 존재하는 경우 트리테르페노이드 사포닌이며, 스테롤은 존재하는 경우 에르고스테롤, 라노스테롤 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택되며, 다가양이온성 담체가 존재하는 경우 덱스트란, 덱스트란 DEAE(및 이의 유도체), PEG, 구아 검, 키토산 유도체, 폴리셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시에틸 셀룰로스(HEC) 폴리에틸렌이민, 폴리아미노로 구성된 군으로부터 선택되고, 4차 아민은 존재하는 경우 DDA 및 아브리드신(avridcine)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제39 구현예에서, 본 발명은 제38 구현예에 따른 백신 조성물을 제공하며, 사포닌이 Quil A이고, 스테롤이 콜레스테롤이며, 다가양이온성 담체가 덱스트란 DEAE이고, 4차 아민이 DDA이다.
제40 구현예에서, 본 발명은 제37 내지 제39 구현예들 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공하며, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 CpG이다.
제41 구현예에서, 본 발명은 제37 내지 제40 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공하며, 상기 다가양이온성 담체는 투여량 당 약 0.5 내지 약 400mg의 양으로 존재한다.
제42 구현예에서, 본 발명은 제41 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 상기 다가양이온성 담체가 투여량 당 50 내지 300mg, 투여량 당 1 내지 25mg, 또는 투여량 당 1 내지 10mg의 양으로 존재한다.
제43 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 0.1 내지 약 1000μg의 양으로 사포닌을 포함하는, 제37 내지 제42 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공한다.
제44 구현예에서, 본 발명은 제43 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 사포닌이 투여량 당 250 내지 500μg, 투여량 당 20 내지 50μg, 또는 투여량 당 1 내지 10μg의 양으로 존재한다.
제45 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 0.1 내지 약 1000μg의 양으로 스테롤을 포함하는, 제37 내지 제44 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공한다.
제46 구현예에서, 본 발명은 제45 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 스테롤이 투여량 당 250 내지 500μg, 투여량 당 20 내지 50μg, 또는 투여량 당 1 내지 10μg의 양으로 존재한다.
제47 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 1 내지 약 200μg의 양으로 4차 아민을 포함하는, 제37 내지 제46 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공한다.
제48 구현예에서, 본 발명은 제47 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 4차 아민은 투여량 당 약 100μg, 투여량 당 약 10 내지 약 100μg, 또는 투여량 당 약 5μg의 양으로 존재한다.
제49 구현예에서, 본 발명은 투여량 당 약 0.5 내지 약 400μg의 양으로 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 제37 내지 제48 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공한다.
제50 구현예에서, 본 발명은 제49 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 투여량 당 100 내지 250μg, 투여량 당 20 내지 50μg, 또는 투여량 당 약 1μg의 양으로 존재한다.
제51 구현예에서, 본 발명은 제37 내지 제50 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공하며, 유상은 오일 및 유용성 유화제를 포함한다.
제52 구현예에서, 본 발명은 제37 내지 제51 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 85% v/v의 양으로 존재한다.
제53 구현예에서, 본 발명은 제52 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 51% v/v의 양으로 존재한다.
제54 구현예에서, 본 발명은 제51 내지 제53 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공하며, 오일은 백신 조성물의 40 내지 84% v/v를 포함하고, 유용성 유화제는 백신 조성물의 1 내지 11% v/v를 포함한다.
제55 구현예에서, 본 발명은 제53 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 오일은 제형의 45% v/v를 포함하며, 유용성 유화제는 제형의 6% v/v를 포함한다.
제56 구현예에서, 본 발명은 아이메리아 맥시마(Eimeria maxima) 또는 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfingens) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하고, 아쥬반트 제형은
a) 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상, 다가양이온성 담체, 및 선택적으로 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 또는
b) 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상; 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 스테롤 및 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체
를 포함한다.
제57 구현예에서, 본 발명은 아이메리아 맥시마(Eimeria maxima) 또는 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfingens)에 대한 항원들을 포함하는, 제56 구현예의 백신 조성물을 제공한다.
제58 구현예에서, 본 발명은 제56 구현예 또는 제57 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 상기 다가양이온성 담체가 DEAE-덱스트란이다.
제59 구현예에서, 본 발명은 가금류에서 아이메리아 맥시마(Eimeria maxima) 또는 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfingens)에 의해 야기된 전염병을 치료 또는 예방하기 위해, 제56 내지 제58 구현예에 따른 백신 조성물을 사용하는 것을 제공한다.
제60 구현예에서, 본 발명은 네오스포라(Neospora) 항원 및, 유상 및 하기 a) 또는 b)를 포함하는 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다:
a) 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체; 또는
b) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체의 조합.
제61 구현예에서, 본 발명은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 덱스트란 DEAE의 조합을 포함하는, 제60 구현예의 백신 조성물을 제공한다.
제62 구현예에서, 본 발명은 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체를 포함하고, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 제60 구현예의 백신 조성물을 제공한다.
제63 구현예에서, 본 발명은 스테롤을 추가로 포함하는 제62 구현예의 백신을 제공한다.
제64 구현예에서, 본 발명은 제63 구현예의 백신을 제공하며, 스테롤은 콜레스테롤이다.
제65 구현예에서, 본 발명은 제60 내지 제64 구현예 중 어느 하나에 따른 백신을 제공하며, 네오스포라 항원이 네오스포라 캐니늄(Neospora caninum) 항원이다.
제66 구현예에서, 본 발명은 네오스포라에 의해 야기된 감염의 치료 또는 예방을 위한 제60 내지 제65 구현예 중 어느 하나에 따른 백신의 용도를 제공한다.
제67 구현예에서, 본 발명은 클라마이도필라 아보티스(Chlamydophila abortis) 항원 및 유상; 스테롤; 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 모노포스포릴 지질 A(MPL-A) 또는 이의 유사체; 및 폴리 I:C를 포함하는 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제68 구현예에서, 본 발명은 암양에서 클라마이도필라 아보티스(Chlamydophila abortis)에 의해 야기된 유산의 치료 또는 예방을 위한, 제67 구현예에 따른 백신의 용도를 제공한다.
제69 구현예에서, 본 발명은 마이오스타틴 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트 제형은 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 및 a) 다가양이온성 담체; 또는 b) MPL-A 또는 이의 유사체를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제70 구현예에서, 본 발명은 MPL-A 또는 이의 유사체를 포함하는 제69 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 상기 제형은 상기 조성물의 50μL 당 0.5μg 미만의 스테롤을 함유한다.
제71 구현예에서, 본 발명은 스테롤을 함유하지 않는, 제70 구현예의 백신 조성물을 제공한다.
제72 구현예에서, 본 발명은 제70 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 스테롤은 콜레스테롤이다.
제73 구현예에서, 본 발명은 동물에서 마이오스타틴의 양을 저하시키기 위한, 제69 내지 제72 구현예 중 어느 하나에 따른 백신의 용도를 제공한다.
제74 구현예에서, 본 발명은 제73 구현예에 따른 용도를 제공하며, 상기 동물이 가금류 동물이다.
제75 구현예에서, 본 발명은 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 아쥬반트 제형은 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제76 구현예에서, 본 발명은 제75 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes) 항원은 파이오리신이다.
제77 구현예에서, 본 발명은 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes)에 의해 야기된 감염의 치료 또는 예방을 위한, 제74 또는 제75 구현예의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
제78 구현예에서, 본 발명은 대장균 항원, BRV 항원 또는 BCV 항원, 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트 제형은 상기 백신 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및, 다가양이온성 담체 및 알루미늄의 공급원 중 하나 이상을 포함한다.
제79 구현예에서, 본 발명은 대장균 항원, BRV 항원 및 BCV 항원을 포함하는, 제78 구현예의 백신 조성물을 제공한다.
제80 구현예에서, 본 발명은 제78 또는 제79 구현예의 백신 조성물을 제공하며,
a. 대장균 항원은, 존재하는 경우, 대장균 K99, 대장균 F41 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며;
b. BRV 항원은, 존재하는 경우, BRV G6, BRV G10 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
제81 구현예에서, 본 발명은 제78 내지 제80 구현예 중 하나 이상에 따른 백신 조성물을 제공하며, 다가양이온성 담체가 존재하는 경우, 덱스트란 DEAE이고, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 CpG이다.
제82 구현예에서, 본 발명은 알루미늄 수산화알루미늄 겔인, 알루미늄의 공급원을 포함하는, 제78 내지 제81 구현예 중 어느 하나에 따른 백신 조성물을 제공한다.
제83 구현예에서, 본 발명은 제82 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 상기 알루미늄의 공급원은 5 내지 20% v/v의 양으로 존재한다.
제84 구현예에서, 본 발명은 제83 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 상기 알루미늄의 공급원은 10 내지 17% v/v의 양으로 존재한다.
제85 구현예에서, 본 발명은 소에서, 대장균, BCV 또는 BRV에 의해 야기된 장염의 치료 또는 예방을 위한, 제78 내지 제84 구현예 중 어느 하나에 따른 백신 조성물의 용도를 제공한다.
제86 구현예에서, 본 발명은 제91 구현예에 따른 용도를 제공하며, 상기 백신은 상기 항원(들)에 6개월 이상 지속된 면역력을 일으킨다.
제87 구현예에서, 본 발명은 리피세팔러스 마이크로플러스(Rhipicephalus microplus) 항원 및 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트는 하기 a) 및 b)로 구성된 군으로부터 선택된다:
a) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 사포닌, 스테롤, 4차 아민, 폴리아크릴성 폴리머, 및 당지질을 포함하는 수성 아쥬반트; 및
b) 백신 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상을 포함하며, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함하는 유성 아쥬반트.
제88 구현예에서, 본 발명은 제87 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 사포닌이 Quil A이며, 스테롤이 콜레스테롤이며, 4차 아민이 DDA이고, 당지질이 N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아미드 또는 이의 염이고, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 CpG이다.
제89 구현예에서, 본 발명은 제87 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 다가양이온성 담체가 덱스트란 DEAE이고, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 CpG이다.
제90 구현예에서, 본 발명은 제87 내지 제89 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물을 제공하며, 리피세팔러스 마이크로플러스(Rhipicephalus microplus) 항원이 Bm86 단백질이다.
제91 구현예에서, 본 발명은 리피세팔러스 마이크로플러스(Rhipicephalus microplus)에 의해 야기된 감염의 치료 또는 예방을 위한, 제87 내지 제90 구현예 중 어느 하나에 따른 백신 조성물의 용도를 제공한다.
제92 구현예에서, 본 발명은 구제역(FMD) 항원 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 아쥬반트 제형은 상기 백신 조성물의 36% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 다가양이온성 담체를 포함하며, 상기 백신 조성물은 유중수형 에멀젼이다. 다른 구현예에서, 상기 구제역 바이러스 항원은 야생형 FMDV, 유전자조작된 및/또는 약화된 FMDV 균주들, 또는 재조합 발현된 FMDV 구조단백질, 예를 들면 혈청형 A, C, O, Asia1, SAT1, SAT2 또는 SAT3의 바이러스 유사 입자들(VLP)일 수 있다.
제93 구현예에서, 본 발명은 제92 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 CpG이고, 다가양이온성 담체가 DEAE 덱스트란이다.
제94 구현예에서, 본 발명은 제92 또는 제93 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 항원은 소 및 돼지에서 약화된 유전자조작된 FMD-LL3B3D 플랫폼 바이러스, 구체적으로는 FMD-LL3B3D-A24 크루제이로(Cruzeiro)로부터 유도된다.
제95 구현예에서, 본 발명은 소에서 FMD의 치료 또는 예방을 위한, 제92 또는 제94 구현예 중 어느 하나의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
제96 구현예에서, 본 발명은 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis) 항원; 및 유상, 다가양이온성 담체, 및 a) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, b) 사포닌, 스테롤 및 4차 아민을 포함하는 조합, 또는 c) 이들의 조합을 포함하는 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 유상은 조성물의 50% v/v 이상의 양으로 존재한다.
제97 구현예에서, 본 발명은 제96 구현예의 백신 조성물을 제공하며, 항원이 스트렙토코쿠스 우베리스 부착 분자 또는 이의 면역성 단편이다.
제98 구현예에서, 본 발명은 스트렙토코쿠스 우베리스에 의해 야기된 감염의 치료 또는 예방을 위한, 제96 또는 제97 구현예 중 어느 하나에 따른 백신의 용도를 제공한다.
하기 실시예들은 구체적인 구현예로서 개진되지만, 본 발명의 범주를 제한하기 위한 것으로 고려되지 않는다. 본 발명의 많은 변경들, 변화들, 변형들, 및 다른 용도들 및 적용들은 당해 분야의 숙련자들에게 분명할 것이다.
실시예
실시예 1. 괴저성 장염에 대한 면역력을 개선하기 위한 재조합 백신접종 전략의 개발
본 연구의 목적은 괴저성 장염 질환 모델에서, 아이메리아 맥시마 및 클로스트리듐 페르프린겐스에 의한 생 시험감염 감염(live challenge infection)에 대한 아쥬반팅된 재조합 클로스트리디아 백신에 의한 생체내 백신접종의 효과를 평가하는 것이다.
재료 및 방법
재조합 단백질: 클로스트리듐 페르프린겐스(ATCC 13124, 미국 종균 협회, 미국 버지니아주 마나사스 소재) NetB 및 EF-Tu를 인코딩하는 유전자를 위한 전장 코딩 서열이 NH2-말단 폴리히스티딘 에피토프 태그에 의해 pET32a(+) 벡터로 PCR에 의해 클로닝되었다. 클로닝된 유전자가 능숙한 대장균으로 형질전환되며, 37℃에서 16시간동안 박테리아가 배양되고, 1.0mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드에 의해 37℃에서 5시간동안 유도하였다(Amresco, 미국 오하이오주 클리블랜드 소재). 박테리아를 4℃에서 10,000rpm에서 10분간 원심분리에 의해 수확하고, PBS내에 재현탁하고, 초음파처리에 의해 파괴하고, 10,000rpm에서 15분동안 원심분리하였다. 상청액을 Ni-NTA 아가로스(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)와 함께 22℃에서 1시간동안 배양하고, 수지를 PBS에 의해 세척하고, 정제된 클로스트리듐 단백질을 pH 9.2의, PBS내 250mM 이미다졸에 의해 용출하였다. 쿠마씨 블루-염색된 SDS-아크릴아미드 겔 상에서 단백질 순도를 확인하였다. Sigma제 상업용 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
동물들: Longeneckers Hatchery(미국 펜실베니아주 엘리자베스타운 소재)에서 부화된 1일령 새들(Ross/Ross)을 BARC-East, 빌딩 1082로 수송하고, BARC Small Animal Care Committee의 확립된 지침에 따른 Petersime 스타터 부화기 유닛에 병아리들을 하우징하였다. 새들을 무-아이메리아(Eimeria) 시설내 부화기 펜에 두었으며, 큰 벽걸이 새장으로, 분리된 위치에 옮기고, 생 시험감염 감염연구동안 실험기간이 끝날 때까지 여기에서 감염 및 부었다. 수송, 체중 측정, 감염, 및 혈액 및 비장 수집과 관련된 모든 절차들은 BARC 작은 동물 Care Committee에 의해 승인되었다(SOP 부착됨). ARS BARC Small Animal Care Committee는 BARC에서 동물실험을 위한 가이드라인을 정립하고, 모든 동물 설비들의 정기 점검을 진행하였다.
면역화: 1차 면역화는 1일령 영계에게 100μL 백신(Ag 100μg/투여량)을 피하 주사하여 수행하였다. 2차 면역화는 짝수-일령 영계에게 100μL 백신(Ag 100μg/투여량)을 피하 주사하여 수행하였다.
아이메리아 시험감염(Eimeria Challenge): 아이메리아(Eimeria) 종의 BARC 균주를 동물 기생충 질환 실험실에서 보존하고, 확립된 절차에 따라 번식시켰다. 아이메리아 맥시마(Eimeria maxima)(41A)를 5% 하이포아염소산나트륨 상에서 부유에 의해 세정하고, PBS에 의해 3회 세척하고, 혈구계를 사용하여 생존력을 트립판 블루에 의해 열거하였다. 접합자 수는 분열홀씨에만 기반을 두고 있다. 부스터 면역화후 6일후, 접종바늘을 사용하여, 닭이 10,000의 아이메리아 맥시마에 의해 식도로 접종되었다.
클로스트리듐 페르프린겐스 시험감염: 아이메리아 감염후 4일후, NE 군의 새들이 접종바늘을 사용하여 1×109 CFU 클로스트리듐 페르프린겐스에 의해 식도로 접종되었다.
분석: 도착한 날, EM으로 시험감염하기 직전, 클로스트리듐 페르프린겐스(CP)에 의해 시험감염하기 전, CP 시험감염후 2일후 및 CP 시험감염후 10일후, 새들의 중량을 재고, 체중 증가를 계산하였다.
장내 병변들을 채점하기 위해, CP. 감염후 2일후 새들(5마리의 새들/군)을 희생시켰다. 게실의 전후방 10cm 확대하는 약 20cm 장내 세그먼트들을 얻고, 세로로 절단하였다. 병변의 심각도의 오름차순으로 병변 점수를 0으로부터 4까지 2명의 독립적인 관찰자들에 의해 평가하였다.
닭에서 2개의 주요 클로스트리듐 페르프린겐스 독성 인자들은 알파독소 및 NetB(괴저성 장염 B-형) 독소이며, 이들은 모두 NE의 발병에 연류되어 있다. 피루베이트를 포함하는, 세균성 발병 및 숙주보호성 면역력에 관련될 수 있는 추가의 클로스트리듐 페르프린겐스 단백질: 페레독신 산화환원효소(PFO) 및 신장인자 G(EF-G)는 클로스트리듐 페르프린겐스에 의한 실험적 시험감염에 대한 보호 면역력을 유도하는 것으로 이미 보고되어 있다. 따라서, 상기 요소들에 대한 항체 역가들은 하기 설명된 대로 측정되었다.
안락사 직후 심장천자에 의해 수집한 혈액에 대하여 무작위로, 군 당 5마리의 새들을 선택하였다. 저속 원심분리에 의해 혈청을 얻고, 효소-연결 면역흡수 측정검사(ELISA)에 사용하여, α-독소- , NetB- , EF, 및 PFO-특이적 항체 수준을 측정하였다. 간단히 말하면, 1.0 ㎍/웰의 정제된 재조합 α-독소- , NetB- , EF, 및 PFO-단백질에 의해 96-웰 미세적정 플레이트를 밤새 코팅하였다. 이 플레이트들을 0.05% Tween을 함유하는 PBS(PBS-T)에 의해 세척하고, 1% BSA를 함유하는 PBS에 의해 차단하였다. 혈청(100 ㎕/웰)을 실온에서 조심스럽게 교반하면서 2시간동안 배양하였다. 플레이트들을 PBS-T로 세척하고, 퍼옥시다제-접합된 토끼 항-닭 IgG(Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 퍼옥시다제-특이적 기질에 의해, 결합된 항체를 검출하였다. 450nm에서의 광학밀도(OD)를 자동화된 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 리치몬드 소재)에 의해 측정하였다.
통계적인 분석: 모든 값들은 평균 ± SEM으로 표시한다. 체중 증가 및 병변 점수에 대한 평균값들을 윈도우에 대하여 SPSS 15.0을 사용하여 ANOVA후 터키(Turkey) 시험에 의한 군들 사이에서 비교하였다(SPSS Inc., 미국 일리노이주 시카고 소재). 평균들 사이의 차이들은 p < 0.05에서 유의미한 것으로 간주될 것이다.
실험 디자인은 표 1에 실증되어 있다.
[표 1]
Figure pat00003
닭은 경구로, 14 부화후 14일째에 1.0 × 104 접합자/새의 아이메리아 맥시마(EM) 그리고 18일째에 1.0 × 109 CFU/새의 클로스트리듐 페르프린겐스(CP)로 감염되었다.
아쥬반트 조성은 하기와 같았다(50μL 당):
TXO: 서열번호 8은 1μg의 양으로 존재하며, 덱스트란 DEAE는 5μg의 양으로 존재하고, 경 미네랄 오일은 조성물의 51% v/v의 양으로 존재하였다.
TCMO: 서열번호 8은 1μg의 양으로 존재하고, 콜레스테롤은 1μg의 양으로 존재하고, MPL-A는 투여량 50μL 당 1μg의 양으로 존재하고, 경 미네랄 오일은 조성물의 51% v/v의 양으로 존재하였다.
XO: 덱스트란 DEAE는 5μg의 양으로 존재하고, 경 미네랄 오일은 조성물의 51% v/v의 양으로 존재하였다.
XOM: 덱스트란 DEAE는 5μg의 양으로 존재하고, 경 미네랄 오일은 조성물의 51% v/v의 양으로 존재하고, MPL-A는 1μg의 양으로 존재하였다.
5% 암피겐(AMPHIGEN)® + 폴리 I:C: 폴리 I:C는 1μg의 양으로 존재하였다.
5% 암피겐(AMPHIGEN)® + CpG: 서열번호 8은 1μg의 양으로 존재하였다.
5% 암피겐(AMPHIGEN)® + DEAE 덱스트란: DEAE 덱스트란은 25μg의 양으로 존재하였다.
5% 암피겐(AMPHIGEN)® + DDA: DDA는 1μg의 양으로 존재하였다.
NE 대조군(P<0.05)에서 EM 및 CP 감염에 의해 체중 증가가 유의미하게 감소하였다. 그러나, 체중 증가는 일반적으로 재조합 CP 단백질(Net B + EF)에 의해 면역화된 군에서 4 내지 21%까지 증가하였다. TCMO 아쥬반트와 접합된 CP 단백질에 의해 면역화된 Prot TCMO 군에서, NE 대조군과의 유의미한 차이가 발견되었다.
[표 2]
Figure pat00004
[표 3]
Figure pat00005
EM 감염후 6일후, 및 CP 감염후 2일후, α-독소, Net-B, EF 및 PFO에 대한 혈청 항체 반응들을 평가하였다. 결과는 표 4에 제공되어 있다. 요약하면, CP 단백질은 CP 단백질에 의해 면역화된 새들에서 CP 항원들에 대한 AB 역가를 일반적으로 증가시켰다. Net-B, EF 및 PFO 항원들에 대한 AB 반응들은 α-독소에 대한 반응보다 훨씬 높았다.
[표 4]
Figure pat00006
실시예 2. 암탉 항-마이오스타틴 백신
마이오스타틴은 근육 분화 및 성장을 억제하는 TGF 베타 단백질과의 일원인 분비성 성장분화인자이다. 마이오스타틴은 골격근육 세포에서 주로 생성되며, 악티빈 타입 II 수용체라고 불리우는 세포-결합 수용체를 결합시킴으로써, 혈액내에서 순환하고, 근육 조직 상에 작용한다. 따라서, 마이오스타틴을 억제시킴으로써, 증가량의 육류/근육을 갖는 동물이 얻어진다. 동물내에서 마이오스타틴의 양을 낮추기 위한 한가지 접근방법은 항-마이오스타틴 면역반응을 생성시키는 것이며, 이는 항-마이오스타틴 항체의 역가에 의해 편리하게 측정될 수 있다. 본 실시예에서, 암탉 모델이 사용되었다.
마이오스타틴 접합 펩타이드 및 아쥬반트 제형을 함유하는 백신으로 Cobb 500 모 스톡(Parent Stock) 및 Ross 308 암탉들(각각 12 내지 10주령)을 감작하였다. 본 연구에 사용된 아쥬반트 제형들은 표 5에 개시되어 있다.
[표 5]
치료군
Figure pat00007
표시법 "200μg/50μg"은 프라임/부스트 용량내 항원의 양, 용적 0.2mL를 의미한다.
아쥬반트내 성분들은 표 6에 설명되어 있다.
Cobb 500 모 스톡(Parent Stock) 및 Ross 308 암탉들은 12주 또는 10주에 감작되었고, 18주에 부스트되었다. 항-마이오스타틴 항체의 혈청 역가는 22주령 및 20주령까지, 백신 접종전 및 감작(prime)후 매 2주마다 각각 ELISA에 의해 측정하였다.
군 T06, T07, T09 및 T10이 가장 높은 반응들을 생성했다(22주에, 항체평균 기하학적 역가 50000 내지 15000). 상기 4개의 군들 중에서, 군 T06 및 T07의 Cobb 500 새들은 100,000 이상의 기하학적 역가를 입증하였다.
[표 6]
Figure pat00008
실시예 3. 트루에퓨렐라 파이오게네스에 대한 백신
트루에퓨렐라 파이오게네스(Truepurella pyogenes)[예전에 아르카노박테리움 파이오게네스(Arcanobacterium pyogenes), 및 예전에 악티노마이세스 파이오게네스(Actinomyces pyogenes) 및 또한, 코라이네박테리움 파이오게네스(Corynebacterium pyogenes)]는 종종 소에서 중증 임상 자궁근염을 일으키며, 진한, 화농성 분비를 특징으로 한다. 때때로 이 질환과 관련된 악취는, 아마도 존재해도 통상적인 배양방법에 의해 검출되지 않는 혐기성 세균에 의해 유발된다. 이 질환은 분만 전에 또는 분만 시에 건유우 또는 어린 암소에서 가장 빈번하며, 가끔 젖꼭지 또는 젖통 손상의 결과로서 수유 동물에서 발생한다. 상기 미생물에 의해 야기된 경제적으로 중요한 질환은 자궁근염, 젖소의 낙태, 및 사육장 소에서 간 농양을 포함한다. 트루에퓨렐라 파이오게네스에 의해 발현된 콜레스테롤-의존성 사이토라이신인, 파이오라이신(PLO)은 중요한 숙주-보호 항원이다.
약 14개월령의 앵거스(Angus) 교배종 가축이 본 연구에 사용되었다. 동물들은 전체적으로 건강이 양호했으며, 등록 시에 임의의 합병증들이 없었다. 동물들은 무제한 급이 및 급수되었다.
제형: 투여량 당 1×109로 모든 세균들(대장균 및 트루에퓨렐라 파이오게네스). 파이오라이신은 군 T02 내지 T07의 동물에 투여량 당 150μg으로 투여되었다. 군 T01은 대조군으로 사용하였다.
본 연구에서 시험된 아쥬반트 제형은 하기와 같았다:
ISC/폴리 I:C - 2mL 투여량에서 ISC 1000㎍/폴리 I:C 50㎍
ISC/CpG - 2mL 투여량에서 ISC 1000㎍/100㎍ CpG(서열번호 8)
TXO - 2mL 투여량에서 CpG 100㎍(서열번호 8)/DEAE 덱스트란/미네랄 오일 5LT NF
QCDCRT- 2mL 투여량에서 Quil A 150㎍/콜레스테롤 150㎍/DDA 100㎍/카보폴® (폴리아크릴 폴리머) 0.0375%/R1005 1000㎍/CpG(서열번호 8) 100㎍
QAC- 2mL 투여량에서 Quil A 500㎍/콜레스테롤 500㎍/암피겐(AMPHIGEN)®(레시틴 오일 에멀젼) 2.5%
간접 ELISA를 사용하여 파이오라이신 항체를 측정하고, 플레이트 상의 항원 뒤에, 혈청 샘플(1차 항체) 뒤에, 항-소 IgG 콘쥬게이트를 0일, 28일 및 56일에 측정하였다.
모든 샘플들 및 대조군들을 1:2000으로 희석하고, 양성 대조군의 OD에 대한 샘플의 OD의 비율을 계산하여 반응을 측정하였다(양성 대조군은 요양중 동물들로부터의 혈청 풀임). HRP-접합된 양 항-소 IgG에 의해 항체가 검출되었다.
[표 7]
Figure pat00009
결과는 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
Figure pat00010
군 T04 및 T06(아쥬반트 TXO 및 QAC)은 대조군으로 유의하게 양호하게 수행하였다(P<0.05). 게다가, (P<0.1인 차이로 선택된) 다른 치료군들 중 여러 경향들이 발견되었다. 이러한 경향들은 표 9에 요약되어 있다.
[표 9]
제0일(제1 변수), 제28일(제2 변수), 제56일(제3 변수) 간의 차이. "Y"는 P < 0.1를 나타낸다.
Figure pat00011
실시예 4. 자궁근염 시험감염에 대한 수유 젖소에서 파이오라이신 백신 제형의 평가
본 연구의 목적은 인공 자궁근염 시험감염 모델을 사용하여, 비-임신 수유 홀스타인 또는 홀스타인 교배 젖소에서, TXO에 의해 아쥬반팅된, 천연 및 재조합 파이오라이신 백신 제형의 효능을 평가하는 것이다.
동물들은 전반적으로 건강이 양호했으며, 임의의 합병증이 없었으며, 백신접종 및 시험감염 전후 7일간 임의의 화학요법, 전신성 항생제 또는 다른 항-염증 약물치료를 받지 않았다. 이들은 첫번째 내지 세번째 출산경력을 가지고 있고, 이전의 자궁근염 이력이 없었으며, 시험감염 전에(1일전 또는 0일전), 트루에퓨렐라 파이오게네스에 대하여 양성으로 배양하지 않았다. 연구하는 동안 임상적으로 유의미한 동시발생 질환이 발병한 동물들은 제적하였다.
각 24-시간내에 적어도 20시간동안 동물들이 사료에 임의로 접근하였으며, 단, 이들이 젖을 짤 때는 예외로 하였다. 낙농산업의 대표인, 기본적인 관습적 혼합급식 배급량을 사용하였다. 연구를 시작하기 전 적어도 7일간 동물들을 순응시켰다. 암소에 투여된 제형 백신들(군 당 n=20)은 하기 성분들: T01 - 식염수; T02 - TXO + 천연 파이오라이신(nPLO); T08 - TXO + 재조합 파이오라이신(rPLO)을 함유하였다. 재조합 파이오라이신은 코라이네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 항원을 클로닝, 발현 및 정제하여 얻어졌다. 그후, 정제된 단백질은 포르말린 처리에 의해 불활성화되었다. 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes)로부터 발현 및 정제된, 천연 파이오라이신도 또한, 포르말린 처리에 의해 불활성화되었다. TXO 아쥬반트는 CpG 올리고뉴클레오타이드, DEAE-덱스트란, 미네랄 오일 및 계면활성제 Span 80 및 Tween 80을 함유하였다.
예방접종일에, 피하 경로를 통해 적당한 IVP(표 10)를 투여하였다. 0일에 백신을 목에 투여하고, 28일에 목의 반대부위에 투여하였다. 백신 투여부위는 연구일수 0, 1, 2, 3, 7, 28, 29, 30, 31, 35, 49 및 77일에, 주사부위 반응에 대하여 평가하였다. 예방접종일에, 투여 부위를 평가하여, 백신 투여 전에 팽윤이 없었는지 확인하였다. 연구일수 28, 49 및 77일에, 목의 양쪽 부분을 관찰하였다. 주사부위 평가를 기록하였다. 연구 일수 0(첫번째 예방접종전), 1, 2, 3, 7, 28(두번째 예방접종전), 29, 30, 31 및 35일 백신접종 단계동안, 직장온도도 또한 측정하고, 기록하였다. 시험감염 일수 0 내지 28일에 직장온도를 또한 측정하고, 기록하였다.
백신접종후 임상 관찰은 연구일수 0, 1, 2, 3, 7, 28, 29, 30, 31 및 35일(백신접종 단계동안)에 기록하였다. 그리고, 49 내지 77일에 시작한 시험감염 단계동안 임상 관찰을 관찰 및 기록하였다.
파이오라이신에 대한 항체 반응들을 연구일수 0, 28, 49일, 및 연구 최종일(d77)에 ELISA에 의해 측정하였다. 각 혈청 샘플 상에서 용혈 억제분석도 또한 수행하였다. 이 분석은 항-파이오라이신 항체 반응을 측정하며, 이는 생물학적 활성(보호)과 서로 관련이 있다.
[표 10]
Figure pat00012
시험감염하기 전, 모든 젖소들의 난소주기가 동시통합화되었다. 시험감염하기 전, 및 28일 시험감염기간내내 매일 프로게스테론을 투여하였다. 브리딩 캐뉼라(breeding cannula)와 유사한 멸균 캐뉼라를 사용하여, 각각 별도의 주사기에 넣어, 10mL의 대장균 시험감염 균주 및 10mL의 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes) 시험감염 균주(예정된 시험감염 투여량)를 시험감염일 0일에 모든 젖소의 자궁에 주입하였다. 시험감염 물질의 완전한 전달을 보장하기 위해, 10mL의 멸균된 배양 매질로 캐뉼라를 씻어냈다.
치료군 T01(대조군)에서 동물들의 60% 이상에서 자궁근염이 발생했다면 시험감염이 성공적인 것으로 간주되었다. 자궁근염 존재는 2 이상의 점수를 갖는 점액농즙성 자궁/질 분비의 존재에 의해 표시되었다. (이 점수 시스템은 Sheldon et al., Theriogenology, 65:1516-1530, 2006에 설명된 방법으로부터 채택되었으며; 0 및 1의 점수들이 정상인 것으로 간주되었다.)
1차 변수는 2 이상의 점수를 갖는 점액농즙성 자궁/질 분비의 존재였으며, 이는 자궁근염이 존재한다는 것을 보여준다. 자궁/질 분비는 무균 컵을 갖춘 무균 Simcro MetriCheckTM 디바이스를 사용하여 수집하고, 시험감염일수 0 내지 28일(연구일수 49일 내지 77일)에 시작하여 점수를 매겼다.
T01 젖소만 임상적 자궁근염이 발생했다면, 또는 점액농즙성 자궁 분비(점수≥2)의 지속 및/또는 일수의 비율이 대조군과 비교하여 유의하게 짧다면(p=<0.1), 치료가 효과있는 것으로 간주되었다. 자궁근염 지속 및 일수 비율에 대하여 군간 큰 차이가 없었다면, 자궁용 세균성 면봉으로부터 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes) 분리의 빈도를 백신 효능에 대한 지지 데이터로 사용하였다. 각 백신들의 안전성은 주사부위 평가, 직장온도 및 수유시 임의의 부작용에 기초하여 평가하였다.
수집된 자궁근염 데이터(질/자궁 분비가 존재하는지, 예/아니오; 질/자궁 분비 점수)를 각 시점에서 각 동물에 대하여 요약하고, 각 시점에서 각 치료동안 각 카테고리의 도수 분포를 측정하기 위해 사용하였다. 동물이 각 자궁근염 징후에 대하여 정상/비정상(정상은 점수=0 또는 1; 비정상은 점수≥2)인지의 도수 분포(예를 들면, 질/자궁 분비 점수)는 치료 및 시점에 의해 요약되었다. 동물이 비정상의(점수≥2) 자궁 분비 점수를 갖는지의 여부를 이항식 오차분포 및 로짓 연결함수(logit link function)를 갖는, 일반화 선형 혼합모델(Proc Glimmix)을 사용한, 처리에 의해 요약하였다. 통계적인 모델은 치료의 고정효과 및 배치의 무작위 효과를 포함했다. 치료군들 사이에서 뚜렷한 차이가 있었다. 이는 본 단락에 설명된 각 자궁근염 변수에 대하여 반복되었다. Proc Glimmix가 자궁근염 변수에 대하여 집중되지 않는다면, 그후 치료군들을 대조하는 것 대신에, 피셔의 정확한 검사(Fisher's Exact Test)를 사용하였다.
(각 자궁근염 변수에 대한) 비정상적인 점수가 각 동물에 대하여 지속되는 것으로 측정되며, "(지속 시점 비정상 - 제1 시점 비정상) + 1"로 계산되었다. 비정상적 점수의 지속은 자궁근염 변수에 대한 비정상적 점수를 갖는 시점들이 없었던 동물들에 대하여 0으로 설정되었다. 비정상적 점수의 지속은 자궁근염 변수에 대하여 최종 계획된 데이터 수집-지점 전에 연구로부터 제적된 동물들에 대하여 "(데이터 수집의 최종 계획된 시점 - 제1 시점 비정상) + 1"로 계산되었다. (각 자궁근염 변수에 대한) 비정상적 점수의 지속은 로그 변환되었으며, 그후 고쳐진 효과: 처리, 및 무작위 효과: 잔류 효과를 갖는 일반적인 선형 혼합 모델에 의해 분석하였다. 파라미터 추정의 선형 조합들은 유의한(P≤0.10) 치료효과에 대한 시험후, 연역적으로 사용되었다. 치료군들 사이를 비교하였다. 후방-변환된 최소제곱 평균, 이들의 표준오차 및 이들의 90% 신뢰구간을 각 치료군에 대하여, 분석으로부터 얻은 최소제곱 파라미터 추정으로부터 계산하였다.
(각 자궁근염 변수에 대한) 비정상적 점수를 갖는 일수의 비율 뿐만 아니라, 분비로부터 정상적인 대장균 및 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes)가 부재한 일수(부재한 것은 값<=1+인 것으로 간주됨)의 비율을 각 동물에 대하여 측정하였다. 그후, 각각 분석 전에 아크 신 제곱근 변형(arc sin square root transformation)을 사용하여 변형되었다. 그후, 상기 일수의 변형된 비율 변수들은 고쳐진 효과: 치료, 및 무작위 효과: 잔류를 갖는 일반적인 선형 혼합 모델에 의해 각각 분석되었다. 파라미터 추정의 선형 조합들은 유의한(P≤0.10) 치료효과에 대한 시험후, 연역적으로 사용되었다. 치료군들 사이를 비교하였다. 후방-변환된 최소제곱 평균, 이들의 표준오차 및 이들의 90% 신뢰구간을 각 치료군에 대하여, 분석으로부터 얻은 최소제곱 파라미터 추정으로부터 계산하였다. 동물에 대장균이 존재하는지(존재를 값>1+로 간주됨), 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes)가 존재하는지(존재를 값>1+로 간주됨), 및 대장균 및 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes) 둘 다 존재하는지(존재를 값>1+로 간주됨)의 여부의 도수 분포가 각 시점에서의 치료에 의해 요약되었다.
결과: 파이오라이신에 대한 항체반응은 혈청 IgG 수준을 측정하여, ELISA에 의해 평가하였다. 최소 제곱평균(LSM) 역가로 표현되는 결과들(표 11)은 연구일수 28, 49 및 77일에 T01에 비해 T02 및 T03의 젖소에서 역가가 유의하게 높았음을 가리킨다. 이것은 군들 T02 및 T03의 역가들 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었음을 제시하는 것이다. ELISA에 의해 평가된, 자궁내 항체 역가와 관련하여, 결과들(표 12)은 같은 날짜에, T01에 비해, T02 및 T03의 젖소에서 49일 및 77일에 유의하게 높은 역가가 있었음을 입증했다. 용혈-억제 항체들에 있어서, 표 13의 결과들은 T02의 동물들이 군들 T01 및 T03의 동물들보다 연구일수 49일 및 77일에 유의하게 높은 역가를 가졌음을 가리킨다.
[표 11]
Figure pat00013
[표 12]
Figure pat00014
[표 13]
Figure pat00015
자궁근염 지속이 측정되었을 때, 평가된 1차 변수, 점액농즙성 자궁/질 분비의 수준(질 배출 점수, 또는 VDS)과 관련하여, 세균에 의한 시험감염후 7일 및 10일에 측정된 바와 같이, 군 T01 및 T03에 비해, 군 T02에서 유의하게 더 짧았다(표 14, 15).
[표 14]
Figure pat00016
[표 15]
Figure pat00017
시험감염후 10일내에 자궁근염이 분명한(즉, VDS≥2) 일수의 %에 있어서(표 16 및 17), 군 T02는 군 T01 및 T03에 비해, 더 적은 비정상적인 일수를 가졌음이 분명하다. 또한, 트루에페렐라 파이오게네스(Trueperella pyogenes)가 군 T03의 젖소로부터 가장 빈번하게 분리되었음이 입증되었다(데이터는 도시되지 않음). 따라서, 백신 효과는 군 T02(천연 파이오라이신 + TXO)에서 가장 현저했다.
[표 16]
Figure pat00018
[표 17]
Figure pat00019
임신한 젖소내에서 신규한 아쥬반트 제형에서 실험적인 자궁근염 백신들의 효능을 평가하기 위해 추가 연구를 진행하였다. 본 연구에서, 건조한 기간동안, 임신한 젖소들에게 예방접종하였다. 분만(출산)후 처음 10일동안 효능을 평가하였다.
임신한 홀스타인 또는 홀스타인 교배 젖소들을 이들의 제1 내지 제3 수유시에 본 연구를 위해 선택하였다. 모든 선택된 젖소들은 전반적으로 건강이 양호했으며, 자궁근염의 이력이 예전에 없었으며, 예상 분만일이 알려져 있었다. 이들은 또한, 임의의 합병증이 없었으며, 예방접종 전후로 7일동안 임의의 화학요법제, 전신성 항생제 또는 다른 항-염증 약물치료를 받지 않았다. 연구하는 동안 임상적으로 유의미한 동시발생 질환이 발병한 동물들은 제적하였다. 연구과정동안, 각 24-시간내에 적어도 20시간동안 동물들이 사료에 임의로 접근하였으며, 단, 이들이 젖을 짤 때는 예외로 하였다. 연구 내내 동물들이 물에 임의로 접근하도록 하였다.
군들에 투여된 백신들(n=15/군)은 하기와 같았다: T01의 동물들은 식염수로 구성된 2mL 백신을 맞고; T02의 동물들은 ISCOMS/폴리 I:C로 구성된 2mL 백신을 맞고; T03의 동물들은 TXO + nPLO로 구성된 2mL 백신을 맞고; T04의 동물들은 TXO + 대장균 + 트루에페렐라 파이오게네스 + nPLO로 구성된 2mL 백신을 맞았다. (모든 백신 항원들은 포르말린-불활성화되었다.)
접종후, 동물들은 7일동안 순응시켰다. 분만전 약 2개월전에(연구일수 0), 동물들이 목의 왼쪽에 피하로, 첫번째 백신접종을 맞았으며, 단 군 02의 동물들은 비강내로 백신을 맞았다(표 18). 28일후, 모든 동물들이 목의 오른쪽에 피하로, 두번째 백신접종을 맞았다(표 18). 첫번째 백신접종으로부터 시작하여, 모든 젖소들의 몸을 건조시켰다.
[표 18]
Figure pat00020
분만일에 시작하고, 그후 21일간 연속하여, 자궁/질 분비의 존재를 평가하고, 존재하는 경우, 점수를 수집 및 할당하였으며, 2 이상의 점수는 자궁근염이 존재함을 나타냈다. 대장균, 트루에페렐라 파이오게네스 및 파이오라이신에 대한 항체 반응을 ELISA로 측정하기 위해, 약 30mL의 혈액을 수집하였다(연구 일수 0, 28, 및 49). 절차적 데이터 수집의 일부로 별도로 지정하지 않는 한, 임의의 부작용을 문서로 기록하였다.
1차 변수는 점액농즙성 자궁/질 분비의 존재였으며, 2 이상의 점수는 자궁근염이 존재한다는 것을 보여준다. T01 젖소만 임상적 자궁근염이 발생했다면, 또는 점액농즙성 자궁 분비(점수≥2)의 지속이 대조군과 비교하여 유의하게 짧다면(p=<0.1), 치료가 효과있는 것으로 간주되었다. 존재하는 경우, 점액농즙성 분비는 분만 후에 수집하였다.
각 시점에서 치료군들 사이를 비교하였다. (혈청학 데이터를 위해 후방-변환된) 최소제곱 평균, 이들의 표준오차 및 이들의 90% 신뢰구간을 분석으로부터 얻은 최소제곱 파라미터 추정으로부터 계산하였다. 데이터에 의한 동물들의 범위 및 수는 각 시점에서 각 치료군에 대하여 계산되었다.
수집된 자궁근염 데이터(질/자궁 분비가 존재하는지, 예/아니오; 질/자궁 분비 점수; 임상 징후들)를 각 시점에서 각 동물에 대하여 요약하고, 각 시점에서 각 치료동안 각 카테고리의 도수 분포를 측정하기 위해 사용하였다. 동물이 각 자궁근염 징후에 대하여 정상/비정상(정상은 점수=0 또는 1; 비정상은 점수≥2)인지의 도수 분포(예를 들면, 질/자궁 분비 점수)는 치료 및 시점에 의해 요약되었다. 동물이 비정상(점수≥2)의 자궁 분비 점수를 갖는지의 여부를 치료에 의해 요약하고, 이항식 오차분포 및 로짓 연결함수(logit link function)를 갖는, 일반화 선형 혼합모델(Proc Glimmix)을 사용하여 분석하였다. 통계적인 모델은 치료의 치료효과 및 배치의 무작위 효과를 포함했으며, 배치내에 블록을 포함했다. 치료군들 사이에서 뚜렷한 차이가 있었다(이는 본 단락에 설명된 각 자궁근염 변수에 대하여 반복되었다). Proc Glimmix가 자궁근염 변수에 대하여 집중되지 않는다면, 그후 치료군들을 대조하는 것 대신에, 피셔의 정확한 검사(Fisher's Exact Test)를 사용하였다.
(각 자궁근염 변수에 대한) 비정상적인 점수가 각 동물에 대하여 지속되는 것으로 측정되며, "(지속 시점 비정상 - 제1 시점 비정상) + 1"로 계산되었다. 비정상적 점수의 지속은 자궁근염 변수에 대한 비정상적 점수를 갖는 시점들이 없었던 동물들에 대하여 0으로 설정되었다. 비정상적 점수의 지속은 자궁근염 변수에 대하여 최종 계획된 데이터 수집-지점 전에 연구로부터 제적된 동물들에 대하여 "(데이터 수집의 최종 계획된 시점 - 제1 시점 비정상) + 1"로 계산되었다. 비정상적 점수의 지속은 고쳐진 효과: 치료, 및 무작위 효과 배치, 배치내 블록 및 잔류 효과를 갖는 일반적인 선형 혼합 모델에 의해 분석하였다. 파라미터 추정의 선형 조합들은 유의한(P≤0.10) 치료효과에 대한 시험후, 연역적으로 사용되었다. 치료군들 사이를 비교하였다. 각 치료군에 대하여 최소제곱 평균, 이들의 표준오차 및 이들의 90% 신뢰구간을 분석으로부터 얻은 최소제곱 파라미터 추정으로부터 계산하였다.
결과: 젖소를 자궁근염에 걸리게 하고, 데이터를 왜곡시킬 수 있는, 쌍둥이를 출산한 모든 젖소들은 본 연구에서 제적하였다. 제적된 젖소들은 대조군 T01에서 6마리, 군 T02 및 T03에서 각각 2마리, 및 군 T04에서 1마리를 포함했다. 각 군에 남은 젖소들 중에서, 자궁근염의 발생률, 및 자궁근염의 추정일을 계산하였다. 표 19에서 알 수 있는 바와 같이, 군 T03 및 T04에서 자궁근염의 발생률은 다른 군들과 대조적으로 숫적으로 낮았다. 이 데이터는 또한, 군 T03 및 T04가 군 T01 및 T02의 동물들보다 분만후 처음 10일내에 자궁근염의 지속이 더 짧았음을 보여주었다. 따라서, 천연 파이오라이신은 단독으로든 또는 대장균, 및 트루에페렐라 파이오게네스 박테린들과 조합하든, TXO에 의해 아쥬반팅될 때 소에서 천연 자궁근염의 발생률을 감소시키는데 효과적이었다고 결론지을 수 있다.
[표 19]
Figure pat00021
실시예 5. 소의 유방염 백신
대장균 박테린 J-5는 유방염을 치료하기 위한 공지 항원이다. 본 연구에서, J-5 박테린들과 조합된 다른 아쥬반트를 항-유방염 효과에 대하여 평가하였다.
본 연구 디자인은 표 20에 요약되어 있다. 약 49일에 분만이 발생하였다. 혈액 및 우유의 샘플들을 일수 0, 7, 28, 35, 49, 63, 70, 및 84일에 얻었다. 젖소를 70일에 시험감염시켰다.
[표 20]
Figure pat00022
군 T01 내지 T06의 대장균에 의해 야기된 전염병의 지속은 하기와 같았다: T01 - 252.1시간, T02 - 213시간, T03 - 191.6시간, T04 - 190.2시간, T05 - 198.7시간. VACCIMAX®에 의한 치료로, 전염병의 지속이 가장 짧아졌다. VACCIMAX®는 다중층 리포좀을 포함하는 수중유형 에멀젼이며, 항원은 리포좀들의 이중층들 사이에 패키징된다.
치료의 보호효과들은 계층화된 완화 분획물을 측정함으로써 평가하였다. 계층화된 완화 분획물이 높을수록, 보호효과가 커졌다. 다시, VACCIMAX®를 갖는 제형들은 가장 큰 효과를 가졌지만(대조군보다 13.95 내지 17.19배), TXO에 의한 치료도 효과적이었다(대조군보다 6.24배).
전체 세포 혈청 J-5 특이적 IgG 총 항체반응을 간접 포획 ELISA를 사용하여 측정하였다. 결과들은 표 21 및 22에 요약되어 있다.
[표 21]
Figure pat00023
[표 22]
Figure pat00024
실시예 6. 네오스포라 카니늄 백신
네오스포라 카니늄(Neospora caninum)은 1988년 종으로 확인된 콕시디안 기생체(coccidian parasite)이다. 이것은 감염된 가축의 자연유산의 중요한 원인이다. 소 유산의 중요한 원인인데다가, 네오스포라증(neosporosis)은 전세계적으로 개의 유의한 질환이다. 질환이 초기에 잡힌다면, 개들은 클린다마이신 및 다른 항원충 약물들에 의해 성공적으로 치료될 수 있다. 그러나, 이 질환은 종종 어린 강아지들에게 치명적이다. 예방용 백신들을 소에 시험하였다. 불활성화 백신이 상업용으로 시판되었지만, 엇갈리는 결과들을 냈었다. 약화된 네오스포라 카니늄 급분열소체(tachyzoite)를 사용한 생 백신은 보다 성공적이었지만, 제조비용이 비싸다. 본 연구에서, 본 발명은 항원으로서 네오스포라 카니늄 시클로필린(NcCYP) 및 프로필린(NcPro)을 사용하여 네오스포라 카니늄에 대한 백신의 특성들에 미치는 다른 아쥬반트들의 효과들을 측정하였다.
8 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스들을 본 실험에 사용하였다. 지시된 아쥬반트의 존재하에 모든 동물들을 3주 간격으로 rNcCyP 및 rNcProf에 의해 2회 면역화하였다. 두번째 면역화후 3주후, 모든 동물들을 안락사시키고, 비장 및 혈액을 수집하였다. NcCyP/NcProf-특이적 비장세포 증식반응을 증식분석에 의해 측정하였다(3 내지 4-일). NcCyP/NcProf-특이적 비장세포 사이토카인 반응은 48시간동안 네오스포라 항원에 의해 비장세포들을 자극시킴으로써 측정하고, 상층액내 사이토카인 레벨은 사이토카인-특이적 ELISA에 의해 측정하였다. 혈청 항체수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 표 23에 요약한 바대로 동물들을 처리하였다.
[표 23]
Figure pat00025
상기 치료군들의 특성들은 표 24에 요약되어 있다.
[표 24]
Figure pat00026
종합하면, 상기 데이터들은 TXO 및 TCMO를 사용하여 우수한 결과들이 얻어졌음을 입증한다.
실시예 7. 클라마이도필라 아보르투스( Chlamydophila abortus )에 의한 생식관 감염에 대한 면역반응에 다른 아쥬반트가 미치는 효과
클라마이도필라 아보르투스(Chlamydophila abortus)는 양 및 염소에서 유산을 일으키는 세포내 세균이다. 유산된 물질(예를 들면, 태반, 체액, 태아)에 순수한 암양이 노출된 동안 보통 감염이 일어난다. 세균 내포(bay)는 감염된 암양에서 번식때까지, 및 임신 중반 또는 후반동안 잠복되어 있고, 태반내에 존재하여, 항체 반응에도 불구하고 괴사성 태반염을 일으킨다. 유산후, 암양은 통상적으로 재감염에 대하여 면역력이 있다.
백신접종이 초기 감염을 예방하고, 세균이 태반에 귀소하는 것을 예방하기 때문에, 노출되기 전에 하는 것이 유익할 수 있는 것으로 믿어지고 있다. 유산후 면역력에서, 항체반응과 관련된 높은 IFNg는 보호와 상관관계가 있는 핵심이다. IFNg는 또한, 비-임신 암양에서 보여진 지속력과 관련될 수도 있다.
암양을 0일 및 28일에 백신접종하고, 49일에 시험감염시켰다. 동물들을 63일에 희생시키고, 검시를 진행하였다. 0일에, 질 및 전혈 샘플들을 qPCR을 위해 채혈하였다. 혈청학 결과를 위해 매주, 및 사이토카인 및 엘리스포트(Elispot) 측정을 위해 0일, 7일, 28일 및 35일에 혈액을 샘플링하였다.
치료군들은 표 25에 나타나 있다.
[표 25]
Figure pat00027
낙태된 양의 태아 신장으로부터 항원을 제조하고, 맥코이(McCoy) 세포 상에서 증식시켰다. 원심분리 및 초음파처리에 의해 기본소체를 정제하였다. 백신접종을 위해 0.9% 염화나트륨내 0.1% 포름알데하이드에서 100μg/투여량으로 항원을 고정하였다.
[표 26]
Figure pat00028
혈청학 결과는 체크-잇(Chek-it) ELISA 키트를 사용하여 얻어졌으며, 상기 표 26에 요약되어 있다.
클라미디아(Chlamydia) AG에 의해 활성화된 양 PMBC내 IFNg, IL-2 및 IL-4 발현 수준들을 측정하였다. 결과는 표 27에 개시되어 있다.
[표 27]
클라미디아 AG에 의해 활성화된 양 PMBC내 IFNg, IL-2 및 IL-4 발현 수준
Figure pat00029
클라미디아 아보르투스(Chlamydia abortus) 항원에 대한 소 PBMC의 반응은 표 28에 요약되어 있다.
[표 28]
클라미디아 아보르투스( Chlamydia abortus ) 항원에 대한 소 PBMC의 반응
Figure pat00030
그리고, 백혈구의 양을 분석하였다(데이터는 나타내지 않음). 2-웨이 ANOVA는 군 F가 군 A 및 B보다 유의하게 높은 WBC 양을 가지고, 군 E가 군 B보다 유의하게 높은 WBC 양을 가졌음을 나타냈다.
주사시간에 결절(nodule)도 또한 분석하였다. 예상대로, 군 A 내지 C는 군 D 내지 F보다 큰 결절을 가졌다. 사용된 3개의 아쥬반트(군 A 내지 C) 중에서, 군 C가 가장 큰 결절 크기를 가졌으며, 그 다음 군 B, 그 다음 군 A 순이었다.
결절 용적을 측정하였다. 다시, 군 A 내지 C는 군 D 내지 F보다 큰 결절 용적을 가졌다. 군들 A 내지 C 중에서, 군 A는 가장 작은 용적을 가졌다. 군 A 및 B에서 결절은 출혈성 및/또는 괴저성 조직을 더 가졌다. 군 C에서 결절들은 섬유증을 더 가졌다. 세포 특징들은 3개의 모든 결절들과 유사하지만, 군 C는 림프구 성분을 더 가질 수 있다.
실시예 8. TXO에 알루미늄을 첨가하면 안정성이 개선된다
본 발명의 TXO 혼합 제형은 50 mg/mL의 DEAE 덱스트란을 함유한다. 덱스트란은 피하 주사에 고농도로 존재할 때, 동물에 주사 부작용을 유발할 수 있다. 이런 이유로, 백신 제형의 안정성을 손상시키지 않으면서, 안전성 및 양호한 치료값이 얻어질 수 있는지 체크하기 위해 DEAE 덱스트란에 대한 농도를 변화시키는 시도가 제시된다.
특징화 및 안정성 시험은 본 백신이 일관되게 배합될 수 있고, 제조를 위한 양호한 저장수명을 갖는지의 여부를 우리에게 알려주므로 중요하다. 점도 시험은 비-뉴톤유체의 유량 특성인, 전단 감소(전단율이 올라감에 따라 겉보기 점도 하락) 또는 전단 후화(전단율이 올라감에 따라 겉보기 점도 증가)를 위해 찾기 위한 전단율의 범위에서 수행하였다. 주사기 힘 시험은 당해 분야에서 다수의 투여량동안, 백신을 꺼내기 용이하고, 투여하기 용이해질 것을 보증하기 위해 수행된다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 제형의 안정성을 변경시킬 것으로 기대되지 않기 때문에, 본 실시예에서 아쥬반트 혼합물에 첨가하지 않았다. 대조군으로서 XO(덱스트란 + 오일) 혼합물을 사용하여, 점도, 주사기 력 및 침강을 위해, 다양한 REHYDRAGEL®(5 내지 16%) 및 DEAE 덱스트란(50 내지 10mg/mL) 농도를 갖는 AXO(알루미늄 + 덱스트란 + 오일) 혼합물을 배합하여 시험하였다. 시험된 조성물은 하기와 같았다:
약 10mL의 샘플을 5개의 15-mL 코팅(Corning) 원심분리관에 채우고, 관의 좁은 치수 및 원추형 바닥에 기인하는, 에멀젼에 가속된 침강 효과를 관찰하기 위해 1주일동안 그대로 두었다. 샘플들을 주사가능성(syringeability) 및 점도에 대하여 시험하였다. 결과는 하기에 나타나 있다.
[표 29]
Figure pat00031
상기 데이터는 원심분리관에서 침강이 가속화될 때, 16% REHYDRAGEL®과의 혼합물이 가장 안정적이라는 사실을 보여준다. 그리고, 본 발명자들에 의한 예전 작업으로부터, 높은 DEAE 덱스트란 농도가 높은 점도 및 가능한 전단 감소와 관련되어 있음이 알려져 있었다. 상기 실험결과들은 REHYDRAGEL®을 첨가하면, DEAE 덱스트란에 의해 부여된 전단 감소(의가소성) 특성들을 손실시킬 것으로 예상한 것에 대하여 더욱 보상한다는 것을 보여준다. 16% REHYDRAGEL® 제형이 더 높은 주사기 력을 가졌음에도 불구하고, 주사하기가 두드러지게 더 어렵지 않았다는 것이 관찰되었다(물에 대한 주사기 력이 3N임).
[표 30]
Figure pat00032
전체 데이터로부터, 16% REHYDRAGEL® 및 10 mg/mL DEAE 덱스트란과의 혼합물이 백신 제형에 사용하기에 최적이며, 특히 내독소가 없는 결합을 필요로 하는 것 및/또는 더 긴 에멀젼 보존기간이 바람직할 수 있음이 분명하다.
실시예 9. BRV, BCV 및 대장균 항원
본 실시예에서, 본 발명자들은 장염에 대한 백신에 본 발명의 아쥬반트를 사용하는 것을 연구했다. 장염은 세균, 바이러스 및/또는 기생충 감염에 의해 야기된다. 소, 특히 신생 젖소 및 소 송아지들은 태어난 후 처음 몇시간동안에는 면역시스템이 완전히 발달되지 않았으며 많은 스트레스를 받기 때문에, 송아지 설사증에 취약하다. 송아지 설사증으로 인해 체액이 손살되면, 탈수되며, 종종 죽음에까지 이르게 된다. 송아지 설사증에서 생존한 동물들은 종종 살아있는 내내 약하고, 상태가 좋지 못하다. 설사증과 관련된 제제는 박테리아, 특히 대장균 K99 및 F41, 및 바이러스, 예컨대 소 코로나바이러스(BCV) 및 소 로타바이러스(BRV)를 포함한다.
10개월령 홀스타인 거세소(Holstein steer)들을 본 연구에 사용하였다. 이 동물들은 대장균(K99 및 F41), BRV(B223 및 Lincoln) 및 BCV에 대하여 혈청반응음성이거나 낮은 역가를 가졌다.
치료군들은 하기와 같았다:
[표 31]
Figure pat00033
혈청학을 위해 6개월동안 매 21일마다 혈액 샘플을 수집하였다. 0일(백신접종전), 1일, 2일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 그후에는 매 21일마다 주사부위 반응을 측정하였다. 선택된 날에 항체역가를 정량화함으로써, 대장균 K96, 대장균 F41, BRV Lincoln, BRV B223 및 BCV에 대한 반응을 측정하였다. 결과들은 하기에 요약되어 있다(다른 문자들은 α=0.1에서의 차이를 가리킴):
[표 32]
Figure pat00034
치료군 T05 및 T06은 연구가 끝날 때까지(189일), 21일로부터 가장 높은 항체 역가를 얻었다. 특히, 장염의 바이러스 성분들에 대한 항체들을 유도하는데 있어서 T05 및 T06 뿐만 아니라 상업용 백신(ROTAVEC®)은 수행하지 않았다.
[표 33]
Figure pat00035
치료군 T02, T05 및 T06은 K99에 대한 반응을 이끌어내는데 있어서 유사하게 잘 수행하였다. 치료군 T02는 대장균 F41에 대한 최상의 반응을 이끌어냈다. 치료군 T05는 상기 항원에 대한 반응을 유도하는데 있어서 두번째로 가장 효과적이었다.
종합하면, 상기 데이터는 T05 및 T06이 가장 적합한 제형임을 입증한다. 둘 다 189일내내 다중 분획물에 대하여 표적 IgG 반응들에 전달되었다. T05 및 T06 모두 SQ 투여에 의해 ROTAVEC®(T02, IM)과 대조되는 우수한 또는 동등한 혈청학적 효능을 제공하는 것으로 나타난다. T03 및 T04는 T05 및 T06보다 짧은 지속을 위한 높아진 혈청학적 역가를 보유했다. 단회 투여량 백신접종에 의해, T03, T04, T05 및 T06이 BRV G6, BRV G10 및 BCV에 대한 표적 수준 혈청 역가 이상으로 도달되었다. 단회 투여량 백신접종에 의해, T04, T05 및 T06은 대장균 K99에 대한 표적 수준 혈청 역가 이상으로 도달되었다. T04, T05 및 T06은 6개월동안 표적 수준 이상으로 항-바이러스 혈청 역가를 보유하였다. T05 및 T06은 6개월동안 표적 수준 이상으로 항-대장균 K99 혈청 역가를 보유하였다. 평가된 모든 제형들은 홀스타인 거세소에서 적당한 안전성을 입증하였다.
일수 0일, 1일, 2일 및 3일에 직장 온도를 측정하였다. 군 T01(대조군) 및 군들 T02 내지 T06 사이에 통계적으로 유의한 차이들이 있었지만, 온도에 있어서의 차이(LSM)는 크지 않았다(1℉내에서).
[표 34]
Figure pat00036
임신한 젖소에서 제형의 예비 시험은 안전성을 입증하였다. 군들 T01, T03 및 T05를 각 군에서 5마리의 젖소를 시험하였다. 15마리의 젖소들 중 12마리가 새끼를 낳았으며, 12마리의 송아지들은 정상이며, 한마리는 사산되었다.
실시예 10. 항-진드기 백신(anti-tick vaccine)
실험 디자인
Bm86 항원에 기반을 둔 2개의 백신 제형들을 시험하였다. 아래에 요약된 바와 같이, 한 제형은 수성 아쥬반트(QCDCRT)를 함유했으며, 다른 제형은 유성 아쥬반트(TXO)를 함유하였다.
[표 35]
Figure pat00037
상기 설명한 바와 같이, 아쥬반트가 80% 부피로 사용되었으므로, 군 T03에 투여된 백신 조성물의 1 투여량은 100μg 서열번호 8/100mg DEAE-덱스트란, 36% v/v의 미네랄 오일, 4.8% v/v SPAN®80, 및 1.16% v/v TWEEN® 80을 함유하였다. QCDCRT에는 오일이 없었기 때문에, 성분들의 농도는 표 35에서와 같았다.
24마리의 송아지들을 각 8마리로 송아지의 3개의 치료군들 중 하나에 무작위 배정하였다. 각 치료군의 송아지들은 2개의 Bm86+아쥬반트 제형 또는 식염수(대조군) 중 하나의 2cc에 의해 각각 백신접종하였다. 0일 및 28일에 백신접종을 실시했다. 41일에, 소를 스탄치온(stanchion)에 넣고, 42일에 250mg의 알. 아뉼라투스(R. annulatus) 유충으로 감염시켰다. 본 연구에 사용한 진드기는 텍사스의 발베르데 카운티의 목장으로부터 본래 수집되었다. 모든 분리된 충혈된 성체 암컷들은 63 내지 84일에 각 송아지들로부터 매일 수집하였다. 송아지들을 85일에 스탄치온으로부터 제거하였다. 수집된 진드기 수를 세고, 각 송아지로부터 10마리 이하를 중량을 재고, 13일동안 각 수집일에 환경 챔버에 넣었다. 소비된 암컷들을 수집후 14일에 폐기하고, 생산된 난 덩어리를 칭량하였다. 첫번째 부화후 14일에 부화된 및 온전한 알들의 수를 기록하고, 부화율을 측정하여 계산하였다. 각 백신을 주사하기 전에 및 주사후 3일동안, 각 송아지의 주사부위를 덩어리에 대하여 모니터링하고, 직장온도를 측정하였다. ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 연구 내내 Bm86 항체 역가를 측정하는 동안 -7, 0, 14, 28, 42, 및 85일에 혈청을 각 송아지로부터 수집하였다.
결과
예비결과들은 T02 및 T03 제형으로부터 각각 98.6% 및 99.6% 제어를 나타내며, 이는 T01보다 유의하게 높다. 상기 제어율 계산은 충혈된 암컷들 및 난 덩어리 중량에 있어서의 감소만 고려한다. 부화율 감소는 차후 날짜에 측정될 것이며, 최종 결과에 부가될 것이다. 본 연구에서, 24마리의 송아지들 중 1마리가 각 주사후(오일 아쥬반트를 함유하는 제형), 작은 덩어리를 생성한다. 상기 덩어리들은 길이가 10cm 미만이며, 깊이가 3cm이었다. 덩어리는 부드러우며, 동물에 고통을 주는 것으로 보이지 않았다. 연구내내 처리된 동물들로부터 직장온도 증가는 없었다.
혈청학 결과는 각 시점에서 치료군 각각 사이에 통계적으로 유의한 차이들을 입증하되, 14일 시점에 QCDCRT 및 TXO에 의한 처리 사이에 통계적인 유의성(p=0.114)이 없다. QCDCRT 및 TXO는 모두 시험된 각 시점에서 BM86 항체 역가를 효과적으로 증가시켰다. TXO는 14일(p=0.114)을 제외하고는 시험된 각 시점에서 QCDCRT(p<0.05)보다 우수했다.
[표 36]
Figure pat00038
실시예 11. 구제역(기니아 피그)
본 연구의 목적은 다른 아쥬반트 제형들에 의해 아쥬반팅된 3가 FMD 백신들에 의해 백신접종된 기니아 피그에서 체액성 면역반응들을 비교하는 것이었다. 표 37에 요약된 바와 같이, 기니아 피그들을 0일 및 28일에 백신접종하였다.
T03 내지 T07의 각 투여량에서, 항원은 FMVD Type O(9 μg), A(5 μg) 및 Asia1(5 μg/mL)의 조합이었다. T02에서 항원 조성은 제조사의 독점 정보이며, 따라서 이용불가능했다.
-3, 25 및 53일에 혈청학 연구를 위해 혈액 샘플들을 수집하였다. 혈청형 O, A 및 Asia1에 대한 항체들의 혈청 역가들은 하기에 요약되어 있다.
혈청 타입 O 및 A에 대한 반응들이 양성 대조군(T02)에서보다 낮았던 반면, Asia1에 대한 반응은 양성 대조군에서보다 T07(TXO 아쥬반트)이 높았으며, 임의의 다른 치료에서보다 높았다. 혈청형 O 및 A에 대한 낮은 반응들은 제형내 O 및 A 항원들이 낮은 수준으로 존재하는 것을 버릴 수 있다.
특히, 리포좀-기반 VACCIMAX® 군들(T03 내지 T05)은 임의의 항원들(O, A, Asia1)에 대한 유의한 반응을 입증하지 않았다.
[표 37]
Figure pat00039
N은 제1/제2 백신접종에서 생존한 동물들의 수는 나타낸다.
상기 설명한 바와 같이 아쥬반트 TXO 및 QCDCRT는 80부피%로 사용되었기 때문에, 군 T07에 투여된 백신 조성물의 1 투여량은 100μg 서열번호 8/100mg DEAE-덱스트란, 36% v/v의 미네랄 오일, 5.04% v/v SPAN®80, 및 1.16% v/v TWEEN® 80을 함유하였다. QCDCRT에는 오일이 없었기 때문에, 성분들의 농도는 표 37에서와 같았다.
[표 38]
Figure pat00040
실시예 12. 구제역(소)
본 연구에서, 시험감염 모델에서 FMD에 대한 백신에 사용된 다른 아쥬반트들의 효과를 측정하였다. 3개의 아쥬반트들이 연구되었다. 백신은 PIADC에 의해 개발된 시험감염 모델에서 FMD에 대한 ARS 실험 백신이었다. FMD-LL3B3D-A24 크루제이로(Cruzeiro)는 백신의 항원성 성분(10μg)으로서 사용되었으며, 야생형 FMDV A-24 크루제이로는 시험감염 바이러스로서 사용되었다. 항원은 미국 특허공개 제2012/0315295호(Rieder at al, 2011년 6월 9일 출원 및 2012년 12월 13일 공개됨)에 이전에 설명되었다. 요컨대, FMD-LL3B3D-A24 크루제이로는 유전자조작 FMDV(구제역 바이러스)를 포함한다. FMDV는 유전자조작되어 있고, 즉 리더(Lpro) 단백질 코딩 영역의 결실을 함유하는 무리더 바이러스이며, 이 단백질이 없는 FMD 바이러스는 소 및 돼지에서 약화된다. 특정 항체들에 의해 인지된 2개의 항원성 에피토프를 제거시키는 2개의 비-구조적 바이러스 단백질내에 도입된 돌연변이(네가티브 마커)를 포함하며, 하나는 단백질 3B에 위치되고, 다른 하나는 단백질 3D에 위치되어, (상기 단백질내 네가티브 항원성 에피토프로서 제공하는 소 리노바이러스의 대응 서열에 의해 대체됨), DIVA(백신접종된 동물로부터 천연감염된 분화) 혈청학적 시험을 위한 2개의 가능한 표적들을 제공한다.
각 군에 4 내지 7마리의 소들을 사용하였다. 주사된 총 용량은 2mL이었다. IM 주사(투여량 당 2.0mL)에 의해 0일에 동물들을 백신접종하고, 21일에 야생형 FMDV에 의한 피내 경로에 의해 시험감염하였다. 하기 등급에 따라 0, 3, 7 및 10일에 임상 점수를 평가하였다: 임상징후 없음: 0, 소포성 발 병변들: 감염된 각 발에 대하여 1점. 최대 점수는 4이다. 실험결과는 하기와 같다:
[표 39]
Figure pat00041
T01 및 T02 사이의 차이 및 T01 및 T04 사이의 차이는 통계적으로 유의미했다.
상기 표로부터, 임상점수에 적어도 기초하여, 아쥬반트 TXO 및 MONTANIDE®ISA 206 VG가 거의 동일하게 유효하다고 결론지을 수 있다. 그러나, FMDV-A24에 대한 혈청 중화 활성을 측정하기 위한 혈청학 분석은 군 T04(아쥬반트 TXO)가 군 T02(MONTANIDE®ISA 206 VG)보다 높은 역가를 가졌음을 입증한다.
[표 40]
Figure pat00042
다른 문자들은 통계적으로 유의미한 차이(p<=0.05)를 나타낸다.
상기 결과들은 TXO 아쥬반트가 소에서 FMD 유발제로 시험감염한 것에 대하여 100% 보호를 제공할 수 있고, 시험된 식염수 대조군 및 다른 2개의 아쥬반트들보다 높은 항체 역가를 부여하였음을 입증하고 있다.
FMDV RNA(복제량/mL)의 양을 코 면봉 및 혈청에서 측정하였다. 데이터는 표 41 내지 44에 제공되어 있다. 요컨대, 상기 데이터는 군 T02 및 T04가 코 면봉내 FMDV의 양을 낮췄음을 증명하고 있다. T02 및 T04 중에서, 군 T04내 동물들이 FMDV RNA양의 초기 감소(또는 증가 부족)를 입증했으며, 따라서, 아쥬반트 TXO의 우수한 특성들을 다시 입증했다.
[표 41]
비강 면봉내 FMDV(rRT-PCR에 의해 측정된 mL 당 "흘림" FMDV RNA 카피 수; LS 평균)
Figure pat00043
[표 42]
통계적 유의(비강 면봉)
Figure pat00044
[표 43]
혈청내 FMDV("바이러스혈증", rRT-PCR에 의해 측정된 mL 당 FMDV RNA 카피 수; LS 평균)
Figure pat00045
[표 44]
통계적 유의(혈청)
Figure pat00046
군 T01내 모든 동물들이 시험감염후 열이 났던 반면, 군 T04내 어떤 동물들도 열이 없었다. 군 T02 및 T03에서 반응은 일관성이 없었다(어떤 동물은 열이 있고, 어떤 동물은 열이 없었음). 상기 관찰은 본 연구에 사용된 다른 아쥬반트들과 대조된 TXO의 일반적인 우수성의 결론을 확인한다.
실시예 13. TXO는 세포-매개 면역력을 활성화시킨다
이전 실시예에서 설명된 동물 모델에서 예시 항원으로서 FMD를 사용하여, 세포-매개 면역력에 아쥬반트가 미치는 효과를 분석하였다. 백신접종후 4, 7, 14 및 21일에 수집된 소 전혈로부터 말초혈액 단핵세포들(PBMC)을 정제하였다. FMDV-특이적 T 세포 증식 반응은 카복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 염색을 사용하여 평가하였다.
결과는 표 45에 제공되어 있다.
[표 45]
증식 지수(평균 ±SD)
Figure pat00047
상기 데이터는 14일 및 21일에 세포-매개 면역력에 TXO가 미치는 우수한 효과를 입증한다. 상기 데이터도 또한, 세포-매개 면역력이 면역력 지속실패에 반응할 수 있으므로, 아쥬반트 TXO는 가능하게 MONTANIDE®ISA 206 VG보다 더 긴 면역력 지속을 제공할 수 있다.
실시예 14. 진단용도를 위한 항체의 발생
본 발명의 아쥬반트 TXO는 진단용도를 위한 항체들을 생성시키는데 사용되었다. 요컨대, 공급원 동물들은 TXO에 의해 아쥬반팅된 선택된 재조합 항원들을 포함하는 제형들에 의해 매 2 내지 4주마다 면역화하고, 이들 조성은 하기와 같았다: 서열번호 8 - 125μg; DEAE 덱스트란 - 125mg; 미네랄 오일 - 제형의 46.56% v/v; TWEEN® 80 - 제형의 1.5% v/v; SPAN®80 - 제형의 6.518% v/v.
아쥬반트 제형은 백신 조성물의 80% v/v로 사용되었다. 따라서, 아쥬반트 제형의 성분의 최종 농도는 하기와 같았다: 서열번호 8 - 100μg; DEAE 덱스트란- 100mg; 미네랄 오일 - 백신 조성물의 37.248% v/v; TWEEN® 80 - 백신 조성물의 1.2% v/v; SPAN®80 - 백신 조성물의 5.214% v/v. 최종 용적은 2mL이었다.
주사후 작은 가시적인 주사부위반응이 관측되었지만, 예측된 반응크기내에 있었다. 매일 관찰에 기초하여, 늑골위에서 관찰된 반응들은 염소에게 고통스러운 것으로 보이지 않았다.
각 면역화후 2 내지 3주 후에 혈액 샘플들을 수집하였으며, 항체 역가를 평가하기 위해 다양한 분석들을 진행하였다. 1000 이상의 혈청학 ELISA 역가는 항체 수확을 시작하기에 충분한 것으로 고려되었다.
동물들은 매주 채혈하였다(몸무게에 기초한 혈액 용적의 7.5%). 연구 마무리에서, 말단 방혈에 의해 염소들을 안락사시키고, 항체 수확을 위해, 또한 혈액을 수집하였다. 필요에 따라, 동물들을 추가 연구를 위해 다른 목적에 맞게 하였다.
[표 46]
Figure pat00048
미국 메인주 포틀랜드 소재 Maine Biotechnology Services(MBS)에서 단백질 A 또는 소규모 정제를 위한 단백질 G 컬럼 인-하우스, 또는 대규모 정제를 위한 단백질 G 크로마토그래피를 사용하여 FeLV gp70을 위한 혈청 항체들을 성공적으로 정제하였다. 밀리포어 30K 울트라 필터 유닛들을 사용하여, 폴리클론 항체들을 약 1 mg/mL의 최종농도로 농축하였다. 표 46에 개시된 다른 항원들에 대한 항체들이 정제되지 않았다.
하기 단계들을 포함하는 방법에 따라 FeLV gp70에 의해 면역화된 자연유산 염소로부터 얻은 우유로부터 항체들을 분리하였다:
a) 우유의 pH를 2M HCl에 의해 4.6으로 적정하고, 카제인 침전을 위해 30분간 실온에서 교반하는 단계;
b) 17,000 x g에서 30분간 우유를 원심분리하여, 상층액을 수집하는 단계;
c) 3.3M NaCl, 0.3M 글리신 및 0.2M 트리스 염기에 상청액에 평형 완충액을 첨가하는 단계;
d) 3000 x g에서 15분간 원심분리하여 상청액을 투명하게 하는 단계;
e) 단계 c)에서 완충액에 의해 평형화된 MabSelect 컬럼에 상기 투명해진 우유 상청액을 가하는 단계;
f) 평형 완충액에 의해 컬럼을 세척하고, pH 3.0의 0.15M 글리신에 의해 용출하는 단계;
g) 용출 프랙션을 0.2M Na 포스페이트에 의해 중화하는 단계.
비-제한적인 실시예로서, 항-PI-3 및 항 FeLV gp70을 생성하는 방법이 하기에 제공된다.
목적들 중 하나는 시험관내 분석에 사용하기 위해 정제된 소 파라인플루엔자-3(BPI-3) HN 단백질에 대한 염소 폴리클론 항혈청을 생성하는 것이다. 본 연구는 항원으로서 사용된 TXO 아쥬반트 소 파라인플루엔자-3(BPI-3) HN 단백질과 배합된 정제된 소 파라인플루엔자-3(BPI-3) HN 단백질에 의해 염소들을 백신접종하기 위해 설계되었다.
첫번째 주사후 약 7주에, 4마리 염소 모두 충분히 높은 혈청 항체 농도(1000 이상의 SN)를 가져서 혈청을 위한 블리드를 제조하기 시작했다고 결정되었다. 3주간 1주 간격으로 혈청을 위해 혈액을 수집했다. 각 염소로부터의 혈청을 각 제조 블리드를 위해 풀링하였다. 블리드를 제조하는 약 3주동안 총 3,187.50mL의 혈청을 수집하였다. 혈청을 처리하고, BPI-3HN-기반 분석에서 평가를 위해 -80℃에서 저장하였다.
3마리의 염소들(#30, 31 및 35)에서 수집된 모든 혈청을 실온에서 해동하였다. 염소번호 34로부터의 혈청은 스크리닝 ELISA에서 낮은 항체반응으로 인해 사용하지 않았다. 표 47을 참조한다(PI3-NH 폴리클론 항체 제조: SN 반응 및 항원 효력 ELISA).
2013년 11월 30일 수집된, 염소 번호 35는 117mL의, 최저 용적의 이용가능한 혈청을 가졌다. 따라서, 수집당 각 염소로부터 117mL를 멸균된 1L Nalgene PETG 병에서 풀링하였다. 약 1053mL(9 x 117mL)의 혈청을 멸균된 60mL Nalgene PETG 병에 20, 50mL 분취량으로, 및 50, 1.0mL 분취량으로 분배하였다.
[표 47]
Figure pat00049
결과적으로, 본 연구는 완료시에, 제조 블리드의 3주 기간동안, TXO와 배합된 정제된 BPI-3 단백질에 의해 반복적으로 면역화된 4마리의 염소들로부터 수확된 총 3,187.5mL의 전혈을 성공적으로 생성하였다. 혈청내에서 양호한 폴리클론 항체 역가가 생성되었다. 시험관내 분석적용에 사용하기 위해, 충분한 양의 정제된 시약을 얻었다.
2010년에, USDA는 LEUKOCELL® 및 VERSIFEL® 분석을 위해 사용된 FeLV gp85/70 포착제가 더 이상 공급되지 않는다고 산업에 공지하였다. 따라서, 본 연구의 목적은 시험관내 분석에 사용하기 위해 재조합 FeLV gp70 단백질에 대한 염소 폴리클론 항혈청을 생성하는 것이었다.
프로인드 아쥬반트에 의한 백신접종후 항체를 생성하기 위한 이전의 시도들은 성공적이지 않았다. 본 연구는 아쥬반트와 배합된 재조합 대장균-발현된 FeLV gp70 단백질의 444개의 아미노산 단편으로 염소들을 백신접종하기 위해 설계되었다. 4번째 주사로 시작하여, 주사 투여량이 100㎍ FeLV gp70 단백질(원래 투여량의 282㎍ FeLV gp70 단백질 대신에)로 감소되었다. 282 ㎍/mL의 초기 투여량이 주사부위 반응의 높은 발생률을 일으켰기 때문에, 투여량이 변화되었다. 투여량은 초기에 100 ㎍/mL로 저하되었지만, 그후 7번째 면역화를 위해 150 ㎍/mL로 높아졌으며, 그 수준에서 연구 종반까지 유지되었다(총 15회의 면역화). 투여량 부피의 차이를 채우기 위해 PBS 완충액을 사용하여 1mL를 유지하였다.
염소로부터 혈액을 수집하고, 충분히 높은 직접 및 샌드위치 ELISA 분석에 의해 항체 역가가 측정되면, 혈청을 수확하고, 폴리클론 항체를 정제하였다.
1 내지 3년령 및 100lb보다 많은 중량의 라만차(LaMancha) 및 알파인(Alpine) 브리드의 6마리의 건강한 암컷 염소들을 본 연구에 사용하기 위해 얻었다. 염소들에게 건초와 곡물을 먹이고, 연구하는 내내 물에 임의로 접근하도록 하였다. 일반적인 건강 관찰은 매일 1회 수행하였다. 1mL 투여량의 실험용 백신을 각 염소에 21-일 간격으로 피하 투여하고, 연구를 완료한 각 5마리의 염소들에게 총 15회 면역화를 투여하였다. 다음 면역접종을 위해, 방향과 부위를 변경하면서 목 또는 뒷다리에 면역접종을 초기 투여하였다. 면역접종후 작은 가시적인 주사부위반응이 관찰되었다. 루스한 피부로 염소에 투여한 면역접종이 모든 염소들에서 다음날 작은 팽윤, 유연함, 및 중간의 유연함(tenderness) 및 중간의 불충분함을 거의 일으키지 않는 것으로 보고되었다. 늑골 위의 영역 또는 목의 교대쪽에서 이후 주사들을 투여하고, 일반적으로 잘 관용되었다. 그러나, 늑골 위의 영역은 염소에 의해 관용된 최상위 위치로 궁극적으로 발견되었다.
첫번째 주사후 약 8주에, 6마리의 염소들 중 4마리(21, 22, 24, 25)가 충분히 높은 혈청 항체 농도를 가져서 혈청을 위한 블리드를 제조하기 시작하였다. 남은 2마리의 염소들(23, 26)에 남은 것으로부터 블리드 제조는 5주 후에 개시하였다. 1주일 간격으로 혈청에 대하여 혈액을 수집하였다. 제조 혈액 수집 6주후 연구로부터 염소 25를 제적하였다. 그것은 도착시에 절룩거렸으며, 바나마인(Banamine) 치료에도 불구하고, 지속적인 절룩거림을 나타냈다. 최종 블리드를 위해 안락사를 명시하고, 부위 과정마다 투여하여, 최대 혈액용량을 수집하였다. 각 염소로부터의 혈청을 각 제조 블리드를 위해 풀링하였다. 총 26.7L의 혈청을 약 7개월의 제조 블리드동안 수집하였다.
예상외로, 염소 24가 연구동안 가-임신을 하였다. 3개월 초과 동안 본 염소로부터 우유를 수집하고, 총 300L의 우유가 항체 수확을 위해 사용가능하다. 우유로부터 FeLV gp70 폴리클론 항체의 고수준 정제를 위해 프로토콜을 개발하였다.
Maine Biotechnology Services에서 단백질 G 친화도 크로마토그래피를 사용하여 염소 24로부터 풀링된 혈청 500mL로부터 2개의 다른 날짜에 항체들을 정제하였다. 총 6388mg(19.9 mg/mL의 321mL) 및 7343mg(21.1 mg/mL의 348mL)의 정제된 염소 항-FeLV gp70 항체들을 FeLV-기반 분석에서 평가하기 위해 제조하였다.
항체 농도를 FeLV gp70으로 측정하기 위해, 각 백신접종후 14일에 혈액 샘플들(약 25mL/샘플)을 12.5mL 혈청 분리기 튜브(SST)에 수집하였다. SST를 염소 ID 및 수집날짜로 라벨링하였다. 동물에 대한 ELISA 신호 세기에 기반을 둔 FeLV gp70 항체 역가가 수용가능한 농도에 있다고 분석에서 측정되면, 그 동물로부터 생산 수집이 시작되었다. 각 염소로부터 추출된 혈액 부피는 염소의 체중에 기초하여 측정되며, 최대 혈액 부피를 얻었다. IACUC 가이드라인은 수집을 위해, 혈액 부피를 매주 7.5%까지 높인다.
생산 수집동안 12.5mL SST에 혈액을 수집하였다. 연구를 결론지을 때, 말단 방혈에 의해 염소를 안락사시키고, 항체 수확을 위해 혈액을 수집하였다. 모든 튜브들에 염소의 ID 및 수집 날짜를 라벨링하였다.
혈액을 실온에서 응괴시켰다. 원심분리후, 혈청을 수확하고, 폴리프로필린 바이알로 옮겼다. 수집일에 같은 염소로부터 수집된 다른 SST로부터의 혈청을 풀링하였다. 정제를 위해 쉬핑될때까지 혈청을 얼음 상에 두었다. 생산 요약은 표 48에 제공된다.
[표 48]
Figure pat00050
염소 24는 모든 염소들 중 가장 높은 항체 농도를 갖는 혈청을 생산하였다.
샌드위치 ELISA 분석에서 FeLV gp70 C11D8 검출 mAb를 사용하여 포획제로서 USDA 94-06과 대조되는 염소 24로부터의 정제된 혈청 항체들은 유사한 투여량 반응을 나타냈다. 염소 24로부터의 정제된 혈청을, FeLV gp85/70 단백질을 검출할 수 있는 능력에 대하여 웨스턴 블롯에 의해 USDA 94-06과 대조하였다. 현 포착, 94-06 및 새로운 염소 24 포착 사이에 유사한 웨스턴 블롯 프로필이 관찰되었으며, 단 추가의 약 15kD 밴드가 염소 24 포착에 의해 관찰되었다. 새로운 포착 항체를 사용한 데이터는 현 참조가 시험된 참조 및 시리얼을 포착하기 위해 사용될 때 현 제제와 다른 투여량 반응곡선 모양을 가진다는 것을 나타냈다.
Anrendati-FeLV gp70 모두 FeLV ELISA 분석에서 포착제로서 잘 기능하는 혈청 및 우유로부터 정제되었다.
표 49에 제공된 바와 같이, 추가의 연구들이 진행중이다.
각 제형들(표 49에 개시되고, TXO와 함께 아쥬반팅된 항원들)은 1마리 이상의 동물(바람직하게는 2마리 이상의 동물들, 보다 바람직하게는 3마리 이상의 동물들, 가장 바람직하게는 처리된 모든 동물들)에서, 충분히 높은 혈청학 역가(1000 이상, 보다 바람직하게는 5000 이상, 보다 바람직하게는 10000 이상, 보다 바람직하게는 50000 이상, 보다 바람직하게는 100000 이상, 보다 바람직하게는 250000 이상, 보다 바람직하게는 500000 이상, 보다 바람직하게는 1000000 이상)를 유도하여, 진단 또는 연구 용도를 위해 충분한 양의 항체들이 얻어졌다.
[표 49]
Figure pat00051
본 명세서에 인용된 모든 공보들, 특허공보 및 비-특허공보 모두 본 발명이 속하는 분야에서 숙련자들의 수준을 보여준다. 각 개개의 공보들이 참고문헌으로 통합된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타났다면, 상기 모든 공보들은 본 명세서에 같은 정도로 참고문헌으로 전문통합된다.
본 발명이 특정 구현예들을 참조하여 설명되었지만, 상기 구현예들이 본 발명의 원칙 및 적용을 단지 예시하는 것이라고 이해된다. 그러므로, 예시 구현예들이 많이 변형될 수 있고, 하기 청구범위에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다른 배열들이 고안될 수 있다고 이해되고 있다.
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Claims (10)

  1. 니파 바이러스 및/또는 헨트라 바이러스 항원, 및 아쥬반트 제형을 포함하는 백신 조성물로서,
    상기 백신 조성물이 백신 조성물의 36% v/v 이상의 양으로 존재하는 유상; 면역자극성 올리고뉴클레오타이드; 및 다가양이온성 담체를 포함하고,
    추가로 상기 백신 조성물이 유중수형 에멀젼인,
    백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    유상이, 부피 기준으로 조성물의 50% 이상의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 CpG이고, 다가양이온성 담체가 DEAE 덱스트란인, 백신 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 가용성 헨드라 G 단백질인, 백신 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 투여량 당 50 내지 200 ㎍의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    항원이 투여량 당 약 100 ㎍의 양으로 존재하는, 백신 조성물.
  7. 대상체에서 헨드라 감염의 치료 또는 예방을 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 백신 조성물의 용도.
  8. 제 7 항에 있어서,
    대상체가 말인, 용도.
  9. 대상체에서 니파 감염의 치료 또는 예방을 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 백신 조성물의 용도.
  10. 제 9 항에 있어서,
    대상체가 돼지인, 용도.
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