WO2007125940A1 - ネコノミ成虫由来ポリペプチド - Google Patents

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WO2007125940A1
WO2007125940A1 PCT/JP2007/058914 JP2007058914W WO2007125940A1 WO 2007125940 A1 WO2007125940 A1 WO 2007125940A1 JP 2007058914 W JP2007058914 W JP 2007058914W WO 2007125940 A1 WO2007125940 A1 WO 2007125940A1
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polypeptide
seq
dna
amino acid
acid sequence
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PCT/JP2007/058914
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsushi Morita
Kenjiro Shimada
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Filing date
Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/4359—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from fleas
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/0003—Invertebrate antigens
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    • A61P33/14—Ectoparasiticides, e.g. scabicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide derived from an adult cat flea, a DNA encoding the polypeptide, a cell producing the polypeptide, an antibody specifically reacting with the polypeptide, and uses thereof.
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2
  • Non-patent document 1 Opdebeeck JP and Slacek B. 1993. Int J Parasitol. 23 (8): 1063- 7.
  • Non-patent document 2 Heath AW, Arfsten A, Yamanaka M, Dryden MW and Dale B. 1994. Parasite Immunol 16 (4): 187—91.
  • the present invention relates to the following (1) to (12).
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence has one or several amino acids deleted, substituted, or added, and substantially consists of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide having equivalent biological activity is a polypeptide having equivalent biological activity.
  • DNA and string consisting of a sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 DNA encoding a polypeptide that has a biological activity substantially equivalent to that of a polypeptide that is normally visualized under normal conditions and that also has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
  • a transformed cell comprising the vector according to (4) above.
  • a method for producing a polypeptide derived from an adult cat flea characterized by culturing the transformed cell according to (5) and collecting the polypeptide according to (1) from the culture.
  • a vaccine for killing adult cat fleas comprising, as an active ingredient, a polypeptide containing an epitope site to which the monoclonal antibody according to (9) above binds.
  • a cat flea adult growth inhibitor comprising the monoclonal antibody according to (8) or (9) as an active ingredient.
  • a polypeptide derived from an adult cat flea a DNA encoding the polypeptide, a cell producing the polypeptide, an antibody recognizing the polypeptide, a monoclonal antibody capable of killing an adult cat flea, and the monoclonal antibody
  • an antibody recognizing the polypeptide a monoclonal antibody capable of killing an adult cat flea
  • the monoclonal antibody to provide a vaccine for killing adult cat fleas containing a polypeptide containing an epitope site to be recognized as an active ingredient, and an adult cat flea growth inhibitor and a feline flea killing agent containing the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the time course of the corrected mortality rate when the monoclonal antibody CFMA-1 of the present invention was administered to an adult cat flea by an artificial blood sucking system.
  • the vertical axis indicates the corrected survival rate, and the horizontal axis indicates the number of days after administration of the monoclonal antibody.
  • the present invention relates to a polypeptide derived from an adult cat flea, a DNA encoding the polypeptide, a cell producing the polypeptide, an antibody recognizing the polypeptide, a monoclonal antibody having the ability to kill an adult cat flea, the monoclonal
  • the present invention relates to a vaccine for killing adult cat fleas, which contains a polypeptide containing an epitope site recognized by an antibody as an active ingredient, and to an adult cat flea reproduction inhibitor and an adult flea killer containing the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • polypeptide of the present invention includes
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence has one or several amino acids deleted, substituted, or added, and substantially consists of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Mention may be made of polypeptides having equivalent biological activity.
  • the polypeptide described in (b) or (d) above has substantially the same biological activity as the polypeptide described in (a) or (c) above. If the activity is qualitatively the same, the quantitative factors such as the intensity of activity and the molecular weight may be different from the polypeptide described in (a) or (c) above.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 has one or more amino acids deleted, substituted or added, and is substantially the same as the polypeptide represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Polypeptides having biological activity are molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres s (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular ⁇ Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) ) (Hereinafter referred to as Current 'Protocols'in' Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the biological activity substantially equivalent to the polypeptide having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 1 or 2 of the present invention is, for example, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted, inserted or added by a known method such as the above-mentioned site-specific mutation method. 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: L0, and further preferably 1 to 5.
  • one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in one or more amino acid sequences in the same sequence at one or more positions. It means that there are deletions, substitutions, insertions or additions of amino acid residues, and substitutions, insertions or additions that may occur at the same time as deletions, substitutions, insertions or additions are natural and non-natural. Do not ask the type! / !.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-ferroalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, L-cysteine, etc.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues in the same group Groups can be substituted for each other.
  • Group A Leucine, Isoleucine, Norleucine, Norin, Norpaline, Alanine, 2-Aminobutanoic acid, Methionine, 0-Methylserine, t-Butylglycine, t-Butylalanine, Cyclohexinolealanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • polypeptide of the present invention In order for the polypeptide of the present invention to have substantially the same biological activity as the polypeptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2; It is preferred to have at least 60% homology, usually 80% or more, especially 95% or more.
  • the DNA of the present invention includes
  • a DNA encoding a polypeptide derived from an adult cat flea selected from the following (a) to (d): (a) a polypeptide having an amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence has one or several amino acids deleted, substituted, or added, and substantially consists of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide having an equivalent biological activity, and DNAs (e) to (h) below are also selected.
  • the DNA that can be hybridized under stringent conditions is a DNA hybridization method that uses a DNA having a complementary sequence to the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 as a probe
  • Plaque means DNA obtained by using the hybridization method or Southern blot hybridization method. Specifically, using a filter to which DNA derived from colonies or plaques is immobilized, 7 to 1. After hybridization at 65 ° C in the presence of Omol / 1 sodium chloride, 0.1 to 2 times the concentration of the SSC solution (the composition of the 1 time concentration of the SSC solution is 150 mmol DNA can be identified by washing the filter at 65 ° C under the conditions of (/ l sodium chloride, 15 mmol / l sodium quenate).
  • Hybridization is Molecular ⁇ Cloning 2nd Edition, Current Protocols in Molecular ⁇ ⁇ Biology, It can be performed according to the method described in DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995).
  • DNA that can be hybridized DNA having at least 60% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 when calculated using the above-mentioned BLAST or the like, preferably Examples thereof include DNA having 80% or more homology, more preferably DNA having 95% or more homology.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody such as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention may be any antibody that binds to the polypeptide of the present invention, but is preferably an antibody that binds to the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. More preferred is a monoclonal antibody that binds to a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and has the ability to kill adult cat fleas.
  • cDNA library preparation methods include Molecular 'Cloning 2nd Edition and Current' Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (199o The methods described or commercially available kits such as Superscript Plasmid System f or cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (manufactured by Gibco BRL) or Zap— and a method using a cDNA synthesis kit [ZAP-cDNA Synthesis Kit, manufactured by Stratagene Co., Ltd.] In addition, commercially available cDNA libraries such as human leukocytes manufactured by Life Technologies, Inc. A cDNA library or the like can also be used.
  • any phage vector, plasmid vector, etc. can be used as long as it can autonomously replicate in Escherichia coli K12.
  • ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)), pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ zap II (Stratagene) , ⁇ gtl0, ⁇ gtl l [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], ⁇ TriplEx (manufactured by Clontech), ⁇ BlueMid (manufactured by Clontech), ⁇ ExCell (manufactured by Pharmacia) PT7T318U (manufactured by Falmasia), pcD2 [Mol. Cell. Biol, 3, 280 (1983)], pU C18 [Gene, 33, 103 (1985)] and
  • Escherichia coli that belongs to Escherichia coli can be used as the Escherichia coli into which the vector incorporating the cDNA is introduced.
  • Escherichiacoli XL1-Blue MR F 'LStratagene ⁇ , Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichiacoli C600 [Genetics, 39, 4 40 (1954)], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 ( 1983)), Escherichia coli Y10 90 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichiacoli NM522 [J. Mol. Biol, 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol, 16, 118 (1966) Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] and the like can be used.
  • the cDNA library that can be prepared by the above method may be used as it is for the following analysis.
  • Oligo cap method developed by Kanno et al. [Gene, 138, 171 (1994), Gene, 200, 149 (1997), polypeptide nucleic acid enzyme, 41, 603 (1996), experimental medicine, U, 2491 (199 3),
  • a cDNA library prepared using cDNA Cloning, Yodosha (1996), Gene Library Preparation Method, Yodosha (1994)] may be used for the following analysis.
  • Each clone is isolated from the prepared cDNA library, and the cDNA base sequence of each clone is isolated from the end, and a commonly used base sequence analysis method, for example, Sidi et al. [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 74, 5463 (1977)] or A BI PRISM 377 DNA Sequencer (manufactured by PE Biosystems) and other base sequence analyzers can be used to determine the base sequence of the DNA. .
  • Whether or not the base sequence of cDNA has a novel sequence is determined by the above-mentioned BLAST or other phase.
  • BLAST BLAST
  • nucleotide sequences such as GenBank, EMBL, and DDBJ
  • nucleotide sequences that show clear homology that can be considered to be completely identical to the nucleotide sequences of existing genes in the database. This can be confirmed by the absence of.
  • Examples of the base sequence of cDNA containing the novel sequence obtained by the above method include the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • polypeptide obtained by translating the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is the BL AST described above. In the homology analysis using the DNA, it did not have homology with known DNA.
  • DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is obtained and the nucleotide sequence is determined, primers based on the nucleotide sequences at the 5 ′ end and 3 ′ end of the nucleotide sequence are added.
  • a cDNA or cDNA library prepared from and synthesized from mRNA contained in human or non-human animal tissues or cells is used as a saddle type for PCR amplification (PCR Protocols, Academic Press (1990)). By doing so, the DNA of the present invention can be obtained.
  • mRNA force contained in human or non-human animal tissue or cells is synthesized against a cDNA or cDNA library.
  • the DNA of the present invention can be obtained by performing hybridization or plaque hybridization (Molecular 1 Cloning 2nd Edition).
  • the nucleotide sequence of the DNA of the present invention for example, represented by SEQ ID NO: 3 or 4 Corresponding to 5 to 60 bases, preferably 10 to 60 bases, more preferably 20 to 60 bases, and further preferably 30 to 60 bases.
  • An oligonucleotide having a sequence or an oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide (hereinafter referred to as an antisense oligonucleotide) can be prepared.
  • the continuous 5 to 60 bases is a base sequence force arbitrarily represented by SEQ ID NO: 3 or 4, if the base sequence is arbitrarily selected, Even the wrong base sequence! /.
  • oligonucleotide of the present invention examples include oligonucleotides such as oligo DNA and oligo RNA, and derivatives of the oligonucleotide (hereinafter referred to as oligonucleotide derivatives).
  • the oligonucleotide or antisense oligonucleotide is, for example, detected! ⁇ a part of the base sequence of mRNA! /, And a sense primer corresponding to the base sequence on the 5 ′ end side, 3 'Antisense primer corresponding to the nucleotide sequence on the terminal side can be listed.
  • the base corresponding to uracil in mRNA is thymidine in the oligonucleotide primer.
  • the sense primer and the antisense primer are oligonucleotides whose melting temperature (Tm) and the number of bases do not change extremely, and are 5 to 60 bases, preferably 10 to 60, more preferably 20 One having about 60 to 60 bases, more preferably 30 to 60 bases can be used.
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which the phosphodiester bond in the oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and the phosphodiester bond in the oligonucleotide is converted to an N 3,1 P5 'phosphoramidate bond.
  • Oligonucleotide derivatives oligonucleotide derivatives in which the ribose and phosphodiester bonds in the oligonucleotide have been converted to peptide nucleic acid bonds, oligonucleotide derivatives in which the uracil in the oligonucleotide has been replaced with C5 propyl uracil, in oligonucleotides
  • Oligonucleotide derivatives in which uracil is substituted with C-5 thiazoleuracil oligonucleotide derivatives in which cytosine in oligonucleotide is substituted with C-5 propytocytosine, cytosine in oligonucleotide
  • Oligonucleotide derivatives emission is substituted with Fuenokisajin modified cytosine (phenoxazi ne-modified cytosine), in the oligonucleotide Examples include oligonucleotide derivatives in
  • polypeptide of the present invention can be obtained by using the method described in Molecular 'Crowning 2nd Edition' or 'Current Protocols' in' Molecular Biology, etc. And can be produced by
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the polypeptide is prepared.
  • a DNA is prepared by substituting the base sequence of the portion encoding the polypeptide of the present invention so as to be an optimal codon for host cell expression.
  • the DNA is useful for efficient production of the polypeptide of the present invention.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant vector is introduced into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any host cell can be used as long as it can express the target gene, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells.
  • the expression vector one that can replicate autonomously in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be transcribed is used.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention can replicate autonomously in the prokaryotic organism, and at the same time, a promoter,
  • the vector is composed of a binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. Genes that control the promoter may be included!
  • expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all sold by Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGE MEX-1 (Promega), pQE -8 (QIAGEN), pKYPIO (JP-A 58-110600), pKY P200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (198 9)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the promoter may be any as long as it functions in the host cell.
  • trp promoter P
  • lac promoter P promoter
  • P promoter P promoter
  • promoters derived from E. coli and phages such as the T7 promoter.
  • T7 promoters Two promoters in series (P X 2), tac promoter, lacT7 promoter
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacteria, Syudomonas, etc .; e.g., Escherichiacoli XL1-Blue, Escherichiacoli XL2-Blue , Escherichia coli DHK E scherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Eschericniacoli W1485, Escheric hia coli JM109, Escherichia coli HBlO Escherichiacoli No.49, Escherichia coli W31 10, Escherichiacoli NY49, Escherichia coli Serolaratiarica Serratiamarcescens, Bacillussubtilis, Bacillus amylolia efacines.
  • Escherichiacoli XL1-Blue Escherichiacoli XL2-Blue
  • Brevibacterium ammoniagenes BrevibacteriumimmarioDhilum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolvticum ATCC 14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentumATCC13869, Corynebacterium glutami cumATCC 13032, Corvnebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium acet oacidophilumATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATC C0put, 110 Pseudomonse
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-2483942
  • examples of expression vectors include YEP13 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • Any promoter can be used as long as it functions in a yeast strain.
  • Examples include promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, pGK promoter, Examples include GA p promoter, promoter, gal i promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF al promoter, CUP 1 promoter, and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electopore position method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)]
  • the spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]
  • Lithium acetate method J. Bacteriology, 153, 163 (1983)
  • examples of expression vectors include pcDNAU pC DM8 (manufactured by Invitrogen), pAGE107 (Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAS3-3 ( JP-A-2-227075), pcDNAI / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] and the like.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrowinores promoter examples include mouth tinein promoter, heat shock promoter, SRa promoter, and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector into animal cells any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] calcium phosphate And the ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973), and the like.
  • the recombinant virus is further infected with insect cells, The peptide can be expressed.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVLl393, pBlueBacIII (both manufactured by Invitorogen) and the like.
  • baculoviruses examples include the autografa californica nu virus, which is a virus that infects night-spotted insects. Can use clear polyhedrosis virus).
  • Insect cells include Spodoptera frugiperda egg yolk fine S19, S1 1 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusiani egg yolk fine High 5 (Invitrogen) can be used.
  • Examples of a method for co-introducing the recombinant gene introduction vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofuxion method [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors.
  • Any promoter can be used as long as it functions in plant cells. Examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin 1 promoter, and the like.
  • host cells include tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, barley and other plant cells.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium JP 59-140 885, JP 60-70080, WO94 / 00977
  • an elect mouth position method Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Patent No. 2606856, Patent No. 2517813 Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is collected from the culture.
  • a peptide can be produced.
  • the method of culturing the transformant of the present invention in a medium can be carried out according to a usual method used for culturing a host.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained using a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast as a host
  • the transformant is used as a medium for culturing the transformant.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the transformant, and can efficiently culture the transformant, it is possible to use natural media and synthetic media! / .
  • Alcohols such as acid, ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphates such as ammonium salts, and other ammonium salts. Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C, and the culture time is usually 16-7 days.
  • the pH during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium.
  • isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside or the like is used when cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using a promoter.
  • Etc. may be added to the medium.
  • RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519] is used as a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host. (1967)), Eagle's MEM medium (Science, 122, 501 (1952)), Dulbecco's modified MEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Me dicine, 73, 1 (1950)] or media supplemented with fetal calf serum etc. in these media.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Common media for culturing transformants obtained using insect cells as hosts include the commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, and ExCell405. (Both manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
  • Cultivation is usually performed for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, and the like.
  • antibiotics such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Transformants obtained using plant cells as hosts are cultured as cells or differentiated into plant cells and organs. can do.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, White medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums. It is possible to use the prepared medium.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 5-9 and 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector incorporating a DNA encoding the polypeptide of the present invention is cultured according to a normal culture method,
  • the polypeptide can be produced by accumulating the polypeptide and collecting the polypeptide from the culture.
  • polypeptide to which sugars or sugar chains have been added When expressed in yeast, animal cells, insect cells or plant cells, a polypeptide to which sugars or sugar chains have been added can be obtained.
  • a signal sequence was arranged according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. It can be produced as a secreted protein or as a fusion protein.
  • the proteins to be fused include j8-galatatosidase, protein A, IgA binding region of protein A, chloramphee-col 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (G1 u), protein G, maltose binding protein, Glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent' protein, FLAG peptide, and any anti-epitope [ Yamakawa Akio, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)].
  • a method for producing the polypeptide of the present invention there are a method for producing in the host cell, a method for secreting it outside the host cell, and a method for producing it on the outer membrane of the host cell.
  • the method can be selected by changing the structure of the polypeptide to be produced.
  • the polypeptide of the present invention is expressed by adding a signal peptide in front of the polypeptide containing the active site of the polypeptide of the present invention. It can be actively secreted extracellularly.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the transgenic animal transgenic non-human animal
  • individual plant transgenic plant
  • polypeptides can be used to produce the polypeptide of the present invention.
  • the transformant is an animal or plant individual, it is reared or cultivated according to a usual method, the polypeptide is produced and accumulated, and the polypeptide is collected from the animal individual or plant individual. Polypeptides can be produced.
  • the method of producing the polypeptide of the present invention in an animal constructed by introducing a gene according to Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)].
  • a transgenic non-human animal introduced with a DNA encoding the polypeptide of the present invention is bred, the polypeptide is produced and accumulated in the animal, and the polypeptide is produced from the animal.
  • the polypeptide can be produced.
  • Examples of the production 'accumulation site in the animal include milk of the animal (Japanese Patent Laid-Open No. 63-309192).
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animals.
  • a mammary cell specific promoter a chick casein promoter, an e casein promoter, an e lactoglobulin promoter, whey acidity.
  • a protein promoter or the like is preferably used.
  • a transgenic plant introduced with a DNA encoding the polypeptide of the present invention is known [tissue culture, 20 (1994). , Tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the polypeptide in the plant, and collecting the polypeptide from the plant.
  • tissue culture 20 (1994).
  • Tissue culture 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)
  • producing and accumulating the polypeptide in the plant and collecting the polypeptide from the plant.
  • a method for producing the polypeptide can be mentioned.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method can be used.
  • the polypeptide of the present invention when expressed in a dissolved state in cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a manton. Disrupt the cells with Gaurin homogenizer 1, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anions using resins such as tilaminoethyl (DE AE) -Sepharose and DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei) Exchange chromatography method, cation exchange chromatography method using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophobic chromatography method using resin such as butyl sepharose and ferrule sepharose, molecular sieve
  • the purified sample can be obtained by using a single method or a combination of gel filtration, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing.
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to obtain an insoluble form of the polypeptide as a precipitate fraction. to recover.
  • the recovered polypeptide insolubles are dissolved with a polypeptide denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the soluble solution and reducing the concentration of the polypeptide denaturant in the soluble solution.
  • a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention or a derivative such as a polypeptide having a sugar chain added to the polypeptide is secreted extracellularly, the polypeptide is present in the culture supernatant.
  • the derivative can be recovered. That is, the culture supernatant is obtained by treating the culture by the same method such as centrifugation as described above, and the purified standard is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Goods can be obtained.
  • polypeptide for example, a polypeptide having amino acid alignment ability described in SEQ ID NO: 1 or 2 can be mentioned.
  • polypeptide of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-ptyoxycarbonyl method).
  • chemical synthesis can be performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Perkin Elma, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthece U-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation.
  • an antigen for producing the antibody of the present invention a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 produced by the above method 2, an adult cat flea, or an extract of the midgut force of an adult cat flea Etc.
  • the following cat flea adult or cat flea adult A method for preparing an extract from the midgut of potato.
  • the buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, and a Tris-HCl buffer solution.
  • the buffer solution include a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, and a Tris-HCl buffer solution.
  • the extract obtained above or the polypeptide obtained in 2 above is immunized as an antigen.
  • the antigen may be administered as it is subcutaneously, intravenously, intramuscularly or intraperitoneally, but it is preferable to administer the antigen together with an appropriate adjuvant.
  • adjuvants examples include Freund's complete adjuvant (Complete Freund's Adjuvant), incomplete adjuvant (Incomplete Freund's Adjuvant), aluminum hydroxide gel, and pertussis vaccine.
  • immunized animals examples include non-human mammals such as rabbits, goats, mice, rats, and hamsters.
  • the administration of the antigen is performed 3 to L0 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to L00 g per animal.
  • blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal, and the reactivity of the serum with the antigen is determined by the enzyme immunoassay [Enzyme Immunoassay (ELISA): Medical School] Publication (1976)].
  • a non-human mammal whose serum exhibits a sufficient antibody titer is used as a source of serum or antibody-producing cells.
  • Monoclonal antibodies are prepared by fusing the antibody-producing cells and myeloma cells derived from a non-human mammal to produce a hyperidoma, and culturing the hybridoma or administering the cells to an animal to treat the cells with ascites cancer. Prepared by separating and purifying the culture solution or ascites Can do.
  • Antibody-producing cells are collected from spleen cells, lymph nodes, peripheral blood, etc. that have been challenged with non-human mammals.
  • an 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-Ul) [Eur. J. Immunol, 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3- X63- Ag8653 (653) [J. Im munoL, 123, 1548 (1979)]
  • Any myeloma cell that can proliferate in vitro such as P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)].
  • Antibodies For the culture and passage of these cell lines, known methods [Antibodies, Laboratories, Mue / Nore (Antibodies, A Laboratory Manual, old Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988); According to “Antibodies”, ensure a cell count of 2 X 10 7 or more by the time of cell fusion.
  • a cell aggregating medium such as polyethylene glycol 1000 (PEG-1000) is prepared, the cells are fused, and suspended in the medium.
  • PEG-1000 polyethylene glycol 1000
  • MEM medium or PBS disodium phosphate 1.83 g, phosphate-potassium 0.21 g, salt 7.65 g, distilled water 1 liter, pH 7.2
  • HAT medium normal medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 X 10 "5 M), Jiwentamaishin (10 ⁇ g / ml) and fetal calf serum (FCS) (CSL Ltd., 10%) was added medium] hypoxanthine (10- 4 M), thymidine (1.5 X 10 - 5 M) and aminopterin (4 X 10- 7 M) and using a medium ⁇ plus.
  • hypoxanthine 10- 4 M
  • thymidine 1.5 X 10 - 5 M
  • FCS fetal calf serum
  • a sample that reacts with the antigen protein and does not react with the non-antigen protein is selected by enzyme immunoassay.
  • cloning was performed by collecting single cells with a limiting dilution method or using a capillary pipette under a stereomicroscope. Monoclonal antibodies were confirmed to have stable high antibody titers by enzyme immunoassay. Select as production hyperpridoma strain. Coat the antigen protein or cells expressing the antigen protein on a 96 well plate.
  • the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained by the above method is reacted as the first antibody.
  • the plate is washed and the second antibody is added.
  • the second antibody is an antibody obtained by labeling an antibody capable of recognizing the immunoglobulin of the first antibody with piotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radiation compound. Specifically, if a mouse is used in the preparation of the hyperidoma, an antibody capable of recognizing mouse immunoglobulin is used as the second antibody.
  • the second antibody is reacted according to the labeled substance, and selected as a hyperidoma that produces a monoclonal antibody that specifically reacts with the antigen.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by intraperitoneally administering a culture solution obtained by culturing hyperpridoma cells or pristane-treated [2,6,10,14-tetramethylpentadecane (? 1 ⁇ & ⁇ ) 0.51 ⁇ for 2 weeks. It can be prepared by isolating and purifying from ascites tumor produced by intraperitoneal administration of monoclonal antibody-producing hyperpridoma cells to 8-10 week-old mice or nude mice that have been interbred.
  • Methods for separating and purifying monoclonal antibodies include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, force prillic acid precipitation, DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A (Or G) There is a method in which there is a column or a chromatography using a gel filtration column or the like alone or in combination. By this method, the IgG or IgM fraction can be recovered and a purified monoclonal antibody can be obtained.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined using a monoclonal antibody typing kit or the like.
  • the amount of protein can be calculated from the absorbance by the Raleigh method, Dye-Binding Assay or 280.
  • TRIZOL Extract total RNA using reagents (TRIZOL Reagent, GIBCO BRL, USA). If necessary, purify mRNA using oligo dT binding carrier.
  • cDNA is synthesized from total RNA or mRNA according to a conventional method. If necessary, after amplification by LD-PCR, phage DNA incorporating cDNA is prepared and packaged according to conventional methods to produce phage particles.
  • the phage solution is added to the E. coli culture solution and reacted at 20 to 40 ° C, preferably 37 ° C for 5 to 30 minutes, preferably 10 to 15 minutes, to adsorb the phages to E. coli.
  • IP TG Isopropy ⁇ j8-D-thiogalactopyranosid
  • a trocellulose filter or the like was brought into close contact, and the temperature was 20 to 40 ° C, preferably 37 ° C. Incubate further for ⁇ 6 hours, preferably 4 hours.
  • the protein derived from the inserted fragment is induced by IPTG soaked in the filter, and is adsorbed to the protein force S filter. Remove the filter from the plate and leave it in buffer at 4 ° C to block excess protein binding sites.
  • the monoclonal antibody of the present invention obtained by the above 3 or its culture supernatant is used as a primary antibody and reacted at room temperature for 0.5 to 3 hours, preferably 1 hour, and then washed with a buffer.
  • This washing is also performed after the secondary antibody reaction.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Phages are collected from plaques that show a positive reaction and subjected to secondary and tertiary screening using the above-described method. As a result, a polypeptide highly reactive with the present invention is selected.
  • a phage clone collected from a positive plaque is infected with E. coli BM2 5.8 by a conventional method and subcloned into a plasmid.
  • the inserted cDNA in the plasmid amplified by using E. coli can be sequenced by the method described in 1 above.
  • a protein reactive with a monoclonal antibody is obtained by expressing a protein using the nucleotide sequence of the predicted open reading frame region of the obtained nucleotide sequence, and this is used as an active ingredient of an adult cat flea vaccine.
  • the animal to which the antibody or vaccine of the present invention is administered may be any mammal, preferably a cat or the like.
  • the antibody obtained by the above 3 can be administered alone. Usually, it is mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and is used in the technical field of pharmaceutical sciences. It is desirable to provide it as a drug produced by any method well known in the art.
  • the vaccine obtained by the above 4 can also be administered alone. Usually, it is mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and used in the technical field of pharmaceutical formulation. It is desirable to provide it as a drug manufactured by any well-known method.
  • the route of administration includes oral administration where it is desirable to use the most effective treatment, or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • intravenous administration can be desirably mentioned.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol, and fructose, Daricols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, P- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoates and the like, flavors such as stove belly flavors and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules and the like are excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc. It can be produced using a binder such as an agent, polybulal alcohol, hydroxypropylcellulose, gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like as additives.
  • Suitable formulations for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a powder injection can be prepared by lyophilizing an antibody or vaccine according to a conventional method and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is the antibody or vaccine itself, or a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that facilitates absorption by dispersing the antibody or vaccine as fine particles. 1 is prepared.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible. Also
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but the amount of active ingredient is usually 10 / zg / kg to 20mg / kg of mammal per day. kg.
  • the drug obtained by the above method and containing the antibody of the present invention as an active ingredient can be used as an adult cat flea growth inhibitor or a cat flea adult drug.
  • an antibody against the vaccine can be produced in the living body of the mammal.
  • a mammal can take control of a cat flea by taking a vaccine.
  • a cat flea of the Livestock Product Chemical Safety Laboratory strain was infected with a non-cat flea-infected cat, and the cat flea eggs were collected according to the method of the Livestock Product Chemical Safety Laboratory.
  • a cat flea prepared according to the literature [Hudson, BW and Prince, M. (1958) A method for large-scale rearing or the cat flea, Ctenocep halides felis felis (Bouche). Bulletin of the World Health Organization 19: 1126—1129 The larvae food was mixed with crushed scallops that passed through a 1.0 mm mesh net to obtain a cat flea breeding medium.
  • a cat flea egg together with this medium was placed in a small food container made of polycarbonate (7.5 ⁇ 7.5 ⁇ 4.7 cm) and covered with PC V film (manufactured by Asahi Kasei). This small container was placed in a moist box and kept in a 27 ° C incubator for all stages until adults emerged. Only the adult cat flea that escaped by jumping from a small container containing the emerged adult was collected and used in the following steps.
  • BALB / c mice (5 weeks old, female, Saitama experimental animals) were used for immunization, and for the first immunization, an adult cat flea extract was inoculated intramuscularly with Freund's complete adjuvant (manufactured by Jatron). For booster immunization, an adult cat flea extract was inoculated intraperitoneally with hydroxyaluminum gel. The final immunization was inoculated intravenously with a cat flea midgut extract.
  • Spleen cells derived from immunized mice are treated with myeloma cells (P3 X 63-Ag8-U1: P3U1) using the cell fusion solution PEG / DMSO (Sigma) according to a conventional method.
  • the resultant was cultured in a HAT medium supplemented with serum free medium (GIBCO BRL) and hypoxanthine aminopterin thymidine (GIBCO BRL) to prepare a hyperidoma.
  • GABCO BRL serum free medium
  • GIBCO BRL hypoxanthine aminopterin thymidine
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to equid herpesvisur type 1 (EHV). Jpn. J. Vet. Sci. 48 (5): 1045-1048.
  • An enzyme immunoassay (hereinafter referred to as ELISA) was performed for screening.
  • Antigen cat flea extract diluted 200-fold with 0.05M sodium carbonate buffer (pH 9.6), was added as an antigen to an ELISA plate (IWAKI) at 100 ⁇ L / well and incubated at 4 ° C. I left it alone.
  • the plate was washed 4 times with 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.2, hereinafter referred to as PBS-T) containing 0.02% Tween 20 (manufactured by WAKO). This washing was performed after every incubation.
  • the culture supernatant of each hybridoma was added to the plate at 100 L / well and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • Horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgGs goat IgG (ICN Pharaceuticals, Inc.) diluted 2,000-fold with PBS-T was added to 100 ⁇ L / well and incubated at room temperature for 30 minutes. Reacted.
  • Substrate solution (0.2% sodium disodium phosphate 25 mL, 0.1 M citrate
  • Equivalent sample buffer 0.5 M-Tris-HCl-pH 6.8 12.5%, Glycelol 10%, 10%
  • SDS Sodium Dodesyl Sulfate 20%, 2-mercaptoethanol 5%, 1% Bromophenol blue 5%
  • SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • Membrane ELISA was performed according to the following method.
  • the PVDF membrane to which the protein obtained in (1) was transferred was cut into strips with a width of about 2 mm, and then left in SM? PBS at -4 ° C to block excess protein binding sites.
  • the culture supernatant of each clone containing 5% FCS obtained in Example 1 (3) was used as a primary antibody and reacted with each strip at 37 ° C for 2 hours. Thereafter, the plate was washed 3 times with PBS-T for 5 minutes. This washing operation was performed for each incubation.
  • HRP horseradish peroxidase
  • ICN Pharmaceuticals horseradish peroxidase -labeled anti-mouse IgGs goat IgG
  • the type and isotype of the monoclonal antibody were identified using Mouse MonoAB ID KIT (manufactured by ZYME D LABORATRIES) according to the instructions.
  • the type and isotype of the selected clone was IgGl.
  • mice In order to obtain a sufficient antibody amount in comparison with the monoclonal antibody CFMA-1 obtained in Example 2 (2), ascites of the monoclonal antibody was performed on mice.
  • BALB / c mice were inoculated intraperitoneally with a hybridoma producing a monoclonal antibody, and after 1 week, they were exsanguinated to obtain ascites.
  • This ascites was described in the literature [Warlow, R. S "Uko, G" Feeney, DJ and Kay, PH (1988) H LA, C4, Bf, Gm and autoantibodies in rheumatoid arthritis. Exp. Clin. Immunogenet .5 (2-3 ): 133-142.] Was purified by saturation with 50% ammonium sulfate (manufactured by WAKO) to obtain monoclonal antibody CFMA-1.
  • GUINEA PIG COMPLEMENT (INTER-CLL TECNOLOGIES, INC.) was added to the blood, and 50 ⁇ L of GUINEA PIG COMPLEMENT was added the day after the blood exchange.
  • the effect of the presence or absence of complementation on the reactivity of monoclonal antibodies was examined by placing a group with PBS instead of GUINEA PIG COMPLEMENT as a non-complementation addition group.
  • the blood thus prepared was sucked into a cat flea through a LABORATORY FILM and a mesh.
  • the whole blood was exchanged once every two days including the monoclonal antibody CFMA-1 and complement.
  • the number of cat fleas was observed daily, and after observation on the 6th day, which was the last observation day, all surviving cat fleas were placed in a chamber at -30 ° C and killed, and the total number of cat fleas was calculated. .
  • Survival rate (%) of control group The survival rate (%) of each group was subtracted, and this was divided by the survival rate (%) of the control group, and multiplied by 100 to obtain the corrected mortality rate (%).
  • SMART TM PCR cDNA Synthesis Kit manufactured by CLONTECH
  • cDNA was synthesized from total RNA according to user manual, amplified by LD-PCR, and then cDNA was incorporated according to user manual ⁇ TriplEx2 Phage DNA was prepared.
  • This phage DNA was packaged using Gigapack III (STRATAGENE, U.S.A.) to prepare phage particles.
  • TBS-T Tween20 (ICN Biomedicals) -containing TBS-SM (hereinafter referred to as TBS-T), further added with TBS-T, and washed 3 times for 5 minutes. This washing was also performed after the secondary antibody reaction.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Cappel horseradish peroxidase
  • TBS-T TBS-T
  • ECL Western blotting analysis system Amersham bioscience ⁇ A positive signal was detected for UbA. Phages were collected from plaques that showed a positive reaction, subjected to secondary and tertiary screening in the same manner, and the monoclonal antibody CFMA-1 was reacted using the obtained phages derived from a single plaque.
  • phage clones collected from plaques that showed a positive reaction were infected with E. coli BM25.8 and converted to pTriplEx2 plasmid. Purify the plasmid amplified using E. coli using the G FX Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Bioscience) and kit (according to the letter attached to this attachment) and extract from the 5 'end and 3' end of the target fragment.
  • the base sequence of the entire inserted cDNA fragment was determined by the primer walking method of approximately 400 bp.
  • the packaged phage had a titer of 2.3 X 10 7 pfo / ml, and 97.9% of the resulting blue / white screening was recombinant.
  • monoclonal antibody CF Two plaques were obtained that reacted with MA-1, and two fage clones with CFMA-1 reactive cDNA fragments were obtained. These two clones are hereinafter referred to as cffiAl-1 and cffiAl-2.
  • Insert lengths of cffiAl-1 and cffiAl-2 were 916 bp and 442 bp, respectively, but the expected open reading frames were considered to be 687 bp for cffiAl-1 and 307 bp for cffiAl_2.
  • Each translated amino acid was 229 and 74 residues.
  • the amino acid sequences of cffiAl-1 and cffiAl-2 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively. A high degree of homology was observed in the DNA and amino acid sequences between them. These are also the results of NCBI Blast searches! The sequences obtained this time are nothing more than DNA and amino acid sequences that are highly homologous to known DNA and amino acid sequences. Indicated.
  • Complementary primers were designed at the 5 and 3 of the putative translation region and at the end. 5.
  • a Sal I cleavage site was provided for the primer on the end side in accordance with the translation frame, and a Not I cleavage site was provided for the primer on the 3rd end, and each was added to the 5 'end of each primer.
  • CFEA1-1's 5, terminal primer and 3, terminal primer are SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6,
  • CFEA1-2's 5 'terminal primer and 3 terminal primer are SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively Show. Using this, the gene fragment of the translation region was amplified by PCR.
  • the PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel and the molecular weight was confirmed, it was excised, purified and extracted (Montage Gel Extraction Kit, manufactured by Amersham), and then TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) was used. It was ligated to the crawling vector pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogen). The ligation product was transformed into E. coli DH5 ⁇ -Tl.
  • PGEX-6p-3 (manufactured by Amersham bioscience) was used for expression of the recombinant protein of the inserted gene fragment.
  • coli BL21 (DE3) pLys S for expression.
  • a pGE X-6p-3 plasmid without insertion was also transformed into BL21 (DE3) pLysS for use as a negative control during protein expression.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis were cultured under IPTG with E. coli at a final concentration of 0.1, 0.4, 0.7, l.OmM, inserted gene-derived protein and Glutathione S Glutat hione Sepharose 4B (manufactured by Amersham bioscience) expressing a fusion protein with -transferase (GST) protein, ultrasonically crushing the cells, and then centrifuge the supernatant to specifically bind the GST protein moiety The product was purified using Each sample was mixed with an equal volume of SDS-PAGE sample buffer, denatured by heating at 100 ° C for 5 minutes, and used as an electrophoresis sample. Using SDS-PAGE, the gel after electrophoresis was stained with Kumashi Brilliant Blue (CBB) to confirm the molecular weight.
  • CBB Kumashi Brilliant Blue
  • the putative translation region was subcloned into the expression vector pGEX-6p-3, and the fusion protein with GST was expressed in E. coli.
  • a band was observed in the affinity purified sample of the disrupted cell supernatant at a location corresponding to the expected molecular weight of the recombinant protein (approximately 51 KDa). A band with strong reactivity with the antibody CFMA-1 was confirmed.
  • the putative open reading frame used in this study is a target molecule of a monoclonal antibody that has the effect of killing adult cat fleas, and the polypeptide encoded by this gene is useful as an antigen even when expressed in E. coli. It was shown that there is. In addition, the reactive band is almost not found in the purified sample of the sonicated cell supernatant. It was shown that a certain level of purification was possible even with one-step purification by affinity chromatography, and this polypeptide, or the epitopes contained in this polypeptide, was expected to kill cat flea adults. It can be used as a vaccine. Industrial applicability
  • a polypeptide derived from an adult cat flea a DNA encoding the polypeptide, an antibody recognizing the polypeptide, a monoclonal antibody capable of killing an adult cat flea, and a polypeptide comprising an eptope site recognized by the monoclonal antibody It is possible to provide a vaccine for killing adult cat fleas contained as an active ingredient, and an adult cat flea reproduction inhibitor and a feline flea killing agent containing the monoclonal antibody as an active ingredient.
  • SEQ ID NO: 5 artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 6 artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 7 artificial sequence: synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 8 artificial sequence: synthetic DNA

Abstract

　本発明は、ネコノミ成虫由来ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA、該ポリペプチドを認識する抗体、ネコノミ成虫を殺傷させる能力を有するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体が認識するエピトープ部位を含むポリペプチドを有効成分として含有する、ネコノミ成虫を殺傷させるためのワクチン、ならびに該モノクローナル抗体を有効成分として含有する、ネコノミ成虫繁殖抑制剤および殺ネコノミ成虫剤を提供する。

Description

明 細 書
ネコノミ成虫由来ポリペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、ネコノミ成虫由来ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする DNA、該ポリ ペプチドを生産する細胞、該ポリペプチドに特異的に反応する抗体、およびそれらの 使用に関する。
背景技術
[0002] 感染症の防除における各種ィヒ学薬剤の使用は、残留、コスト、副作用、環境への 影響さらには心理的理由力 世界的に消費者に避けられる傾向にあり、各種感染症 における生物学的防除、すなわちワクチンの重要性が高まって 、る。
一般に、細菌やウィルスに比べて免疫応答が複雑な寄生虫感染症を対象としたヮ クチン開発は困難である。特に節足動物感染症の感染源としては、人畜に対してマ ラリア、フィラリアあるいは黄熱病等の各種感染症を媒介する蚊類、吸血による病害 および各種リケッチア、ピロプラズマ病等の病原体も媒介するマダニ類、羊毛の生産 現場にお!、て大きな被害を及ぼすヒッジキンバエ、ヒトに身近な環境で人畜に被害を およぼすことから先進国における防除剤巿場が極めて大きいノミをあげることができる 。し力しながら、これまでに、実用化されているワクチンはォゥシマダニに対する組換 えワクチンのみである。
[0003] ォゥシマダニのワクチン開発においては、ダニの消ィ匕器官（中腸)抽出液を節足動 物に接種することにより感染防御能を付与することが示されたことから、中腸抽出液を 分画し、各分画溶液を動物に免疫した際の感染抵抗性を手がかりとして、抗原分子 が特定された。当該抗原分子のアミノ酸配列をコードする遺伝子が同定され、該遺伝 子を用いて大腸菌ないし酵母により製造された組換え蛋白質が、現在オーストラリア およびキューバで商品（TickGuardおよび GAVAC)として発売されている。
[0004] 一方、ノミの免疫学的防除に関する研究報告は少なぐノミ成虫から中腸を摘出し て調製した抽出液を免疫抗原とした研究が行われている。ネコにノミ成虫から抽出さ れた中腸抽出液で免疫処理を行った後に、ネコノミを実験感染させたが、感染防御 効果が認められな力 た (非特許文献 1)。また、ゥサギにノミ成虫から抽出した中腸 抽出液を免疫して得られた抗血清を粗精製し、粗精製された抗血清を牛の血液に添 加し、人工吸血装置にて該血液をノミ成虫に与えたところ、投与を受けたノミの寿命 を短縮する効果が認められた。さらにィヌに対しノミ中腸抽出液による免疫処理を行 い、ネコノミを実験感染させたところ感染防御効果が認められた (非特許文献 2)。し 力しながら、その後の報告はなされておらず、ノミ防除にあたってはいまだ種々の殺 虫剤に頼らざるを得ない状況にある。
非特許文献 1： Opdebeeck JP and Slacek B. 1993. Int J Parasitol. 23(8):1063- 7. 非特許文献 2 : Heath AW, Arfsten A, Yamanaka M, Dryden MW and Dale B. 1994. Parasite Immunol. 16(4): 187— 91.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] ネコノミを生物学的に防除するための物質が求められている。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、以下の（1)〜(12)に関する。
(1) 以下の（a)〜（d)から選ばれるポリペプチド。
(a)配列番号 1で示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列番号 1で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号 2で示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(d)配列番号 2で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド。
(2) 上記（1)記載のポリペプチドをコードする DNA。
(3) 以下の（a)〜（d)から選ばれる DNA。
(a)配列番号 3の塩基配列を含む DNA。
(b)配列番号 3の塩基配列を含む DNAと相補的な配列からなる DNAとストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列力もなるポリ ペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
(c)配列番号 4の塩基配列を含む DNA。
(d)配列番号 4の塩基配列を含む DNAと相補的な配列からなる DNAとストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列力もなるポリ ペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
(4) 上記（2)または（3)に記載の DNAを含むベクター。
(5) 上記 (4)に記載のベクターを含む形質転換細胞。
(6) 上記（5)に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物から上記（1)記載のポリ ペプチドを採取することを特徴とする、ネコノミ成虫由来ポリペプチドを製造する方法
(7) 上記（1)に記載のネコノミ成虫由来ポリペプチドと結合する抗体。
(8) 抗体が、モノクローナル抗体である上記（7)に記載の抗体。
(9) モノクローナル抗体が、ネコノミ成虫を殺傷させる能力を有する上記（8)記載の モノクローナル抗体。
(10) 上記（9)記載のモノクローナル抗体が結合するェピトープ部位を含むポリべ プチドを有効成分として含有する、ネコノミ成虫を殺傷させるためのワクチン。
(11) 上記（8)または（9)記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、ネ コノミ成虫繁殖抑制剤。
(12) 上記（8)または（9)記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、殺 ネコノミ成虫剤。
発明の効果
本発明により、ネコノミ成虫由来ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする DNA、該 ポリペプチドを生産する細胞、該ポリペプチドを認識する抗体、ネコノミ成虫を殺傷さ せる能力を有するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体が認識するェピトープ 部位を含むポリペプチドを有効成分として含有する、ネコノミ成虫を殺傷させるための ワクチン、ならびに該モノクローナル抗体を有効成分として含有する、ネコノミ成虫繁 殖抑制剤および殺ネコノミ成虫剤を提供することができる。 図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1は、本発明におけるモノクローナル抗体 CFMA-1を人工吸血システムにより ネコノミ成虫に投与した際の補正死亡率の経時的推移を示したものである。縦軸に は補正生存率を、横軸にはモノクローナル抗体投与後の日数をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明は、ネコノミ成虫由来ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする DNA、該ポリ ペプチドを生産する細胞、該ポリペプチドを認識する抗体、ネコノミ成虫を殺傷させる 能力を有するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体が認識するェピトープ部位 を含むポリペプチドを有効成分として含有する、ネコノミ成虫を殺傷させるためのワク チン、ならびに該モノクローナル抗体を有効成分として含有する、ネコノミ成虫繁殖抑 制剤および殺ネコノミ成虫剤に関する。
[0010] 本発明のポリペプチドとしては、
(a)配列番号 1で示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列番号 1で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号 2で示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(d)配列番号 2で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをあげるこ とがでさる。
[0011] 上記 (b)または (d)に記載のポリペプチドは、上記 (a)または（c)記載のポリべプチ ドの生物学的活性と実質的に同一の活性を有していればよぐ活性が質的に同一で あれば、活性の強度の程度、分子量などの量的要素は上記 (a)または（c)記載のポ リペプチドと異なって 、てもよ 、。
配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換また は付加されたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列が示 すポリペプチドと実質的に同一の生物学的活性を有するポリペプチドは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres s (1989) (以下、モレキュラ^ ~·クロー-ング第 2版と略す）、 Current Protocols in Mole cular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997) (以下、カレント'プロトコールズ'イン' モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Researc h, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特 異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1または 2で示されるアミノ酸配列を有す るポリペプチドをコードする DNAに部位特異的変異を導入することにより、取得する ことができる。
[0012] 本発明の、配列番号 1または 2で示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチドと実質 的に同等の生物学的活性とは、例えば配列番号 1または 2で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドが有する生物活性であれば特に制限はないが、例えば該ポリぺプ チドを異種生体内へ導入した際に、生体内での生体防御機能が惹起されることによ り、該ポリペプチドに結合する抗体を産生する活性などがあげられる。
[0013] 欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部 位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の 数であり、 1個から数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： L0個、さらに好ま しくは 1〜5個である。
本発明のポリペプチドの有するアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のアミノ酸 配列中の位置において、 1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加 があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよぐ置換、挿入 または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わな!/ヽ。天然型アミノ酸残 基としては、 L-ァラニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-グルタミン、 L-グルタ ミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フエ-ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオ-ン、 L-トリプトファン、 L-チロシ ン、 L-パリン、 L-システィンなどがあげられる。
[0014] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残 基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
また、本発明のポリペプチドが、配列番号 1または 2記載のアミノ酸配列が示すポリ ペプチドと実質的に同一の生物学的活性を有するためには、配列番号 1または 2記 載のアミノ酸配列と、少なくとも 60%以上、通常は 80%以上、特に 95%以上の相同 性を有して 、ることが好まし 、。
[0015] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータ一は 例えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによつ てアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score=50、 wordlength= 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフ オルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である (http:/ / www.ncbi.nlm. nih.gov.)。
[0016] 本発明の DNAとしては、
以下の（a)〜（d)から選ばれるネコノミ成虫由来ポリペプチドをコードする DNA。 (a)配列番号 1で示すアミノ酸配列力もなるポリペプチド
(b)配列番号 1で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド
(c)配列番号 2で示すアミノ酸配列力もなるポリペプチド
(d)配列番号 2で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド、 および以下の（e)〜（h)力も選ばれる DNA。
(e)配列番号 3の塩基配列を含む DNA
(f)配列番号 3の塩基配列を含む DNAと相補的な配列力 なる DNAとストリンジェン トな条件下でノ、イブリダィズし、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列力もなるポリべ プチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする DNA
(g)配列番号 4の塩基配列を含む DNA
(h)配列番号 4の塩基配列を含む DNAと相補的な配列からなる DNAとストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列力もなるポリ ペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする DNA をあげることができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAとは、配列番号 3または 4で 表される塩基配列を含む DNAと相補的な配列力 なる DNAをプローブとして、コロ 二一 ·ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブ ロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、具体的 には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7 〜1. Omol/1の塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmol/l塩ィ匕ナトリウム 、 15mmol/lクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄する ことにより同定できる DNAをあげることができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モレキュ ラ ~ .クロー-ング第 2版、カレント ·プロトコ一ルズ.イン .モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford U niversity (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダィズ可 能な DNAとして具体的には、上記した BLAST等を用いて計算したときに、配列番 号 3または 4で表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、好ま しくは 80%以上の相同性を有する DNA、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有 する DNAをあげることができる。
[0018] 抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などがあげられる力 モノク ローナル抗体が好ましい。
本発明の抗体としては、本発明のポリペプチドと結合する抗体であれば 、かなるも のでもよ 、が、好ましくは配列番号 1で示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを 結合する抗体があげられ、より好ましくは、配列番号 1で示されたアミノ酸配列を有す るポリペプチドに結合し、かつネコノミ成虫を殺傷させる能力を有するモノクローナル 抗体があげられる。
[0019] ネコノミ成虫を殺傷させる能力の測定方法としては、以下の方法があげられる。抗 体を含むゥシ血液および抗体を含まないゥシ血液を各ネコノミ成虫群に人工給餌さ せた後、得られた抗体を含むゥシ血液を吸血したネコノミ成虫群の生存数を計測し、 生存率を計算することにより、測定することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
[0020] 1. DNAの調製
(a)cDNAライブラリーの作製
cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー 'クローユング 第 2版やカレント' プロトコールズ.イン.モレキュラー.バイオロジー、 DNA Cloning 1: Core Techniques , A Practical Approach, second Edition, Oxford University Press (199oノ等に ci載 れた方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト 'プラスミド 'システム'フォ ~ · cDNA'シンセシス 'アンド'プラスミド 'クローニング [Superscript Plasmid System f or cDNA Synthesis and Plasmid Cloning ; Gibco BRL社製〕やザップ— cDNA.シンセ シス ·キット〔ZAP- cDNA Synthesis Kit,ストラタジーン社製〕を用いる方法などがあげ られる。更に、市販の cDNAライブラリー、例えば Life Technologies社製のヒト白血球 cDNAライブラリ一等を利用することもできる。
[0021] cDNAライブラリーを作成するためのクローユングベクターとしては、大腸菌 K12株 中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれで も使用できる。具体的には、 ZAP Express〔Stratagene社製、 Strategies, 5, 58 (1992)] 、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕、 λ zap II (Stratage ne社製）、 λ gtl0、 λ gtl l〔DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、 λ Tr iplEx (クローンテック社製）、 λ BlueMid (クローンテック社製）、 λ ExCell (フアルマシ ァ社製）、 PT7T318U (フアルマシア社製）、 pcD2〔Mol. Cell. Biol, 3, 280 (1983)〕、 pU C18〔Gene, 33, 103 (1985)〕等をあげることができる。
[0022] cDNAを組み込んだベクターを導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物 であればいずれでも用いることができる。具体的には、 Escherichiacoli XL1- Blue MR F' LStratagene社:^、 Strategies, 5, 81 (1992)]、 Escherichiacoli C600 [Genetics、 39, 4 40 (1954)]、 Escherichia coliY1088 [Science, 222, 778 (1983)〕、 Escherichia coli Y10 90 [Science, 222, 778 (1983)] , Escherichiacoli NM522 [J. Mol. Biol, 166, 1 (1983)〕 、 Escherichia coliK802 [J. Mol. Biol, 16, 118 (1966)〕、 Escherichia coli JM105 [Gene , 38, 275 (1985)〕等を用いることができる。
[0023] 上記の方法で作製することができる cDNAライブラリーを、そのまま以下の解析に 用いてもよいが、不完全長 cDNAの割合を下げ、完全長 cDNAをできるだけ効率よ く取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法〔Gene, 138, 171 (1994)、 Gene , 200, 149 (1997)、ポリペプチド核酸酵素， 41, 603 (1996)、実験医学， U, 2491 (199 3)、 cDNAクローユング，羊土社（1996)、遺伝子ライブラリーの作製法，羊土社 (1994 )〕を用いて調製した cDNAライブラリーを以下の解析に用いてもょ ヽ。
[0024] 作製した cDNAライブラリーから各クローンを単離し、それぞれのクローンについて cDNAの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは A BI PRISM 377DNAシークェンサ一（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置 を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定することができる。
[0025] cDNAの塩基配列が新規な配列を有しているかどうかは、上記の BLAST等の相 同性検索プログラムを用いて、 GenBank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列デー タベースを検索することにより、データベース中の既存の遺伝子の塩基配列と完全に 一致すると考えられるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認で きる。
上記の方法で得られる新規な配列を含む cDNAの塩基配列として、例えば配列番 号 3または 4で表される塩基配列があげられる。
[0026] 配列番号 3または 4で表される塩基配列からなる DNAを翻訳して得られるポリぺプ チド (配列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド）は、上記の BL ASTを用いた相同性解析にぉ 、て、既知の DNAと相同性を有しな力つた。
配列番号 3または 4で表される塩基配列からなる DNAがー且取得され、その塩基 配列が決定された後は、該塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に基づいたプライ マーを調製し、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれる mRNAから合成し た cDNAあるいは cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法〔PCR Protocols, Academ ic Press (1990)〕を用いて DNAの増幅を行うことにより、本発明の DNAを取得するこ とがでさる。
[0027] また、配列番号 3または 4で表される DNAの全長あるいは一部をプローブとして、ヒ トまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれる mRNA力 合成した cDNAあるいは cDNAライブラリーに対してコロニーハイブリダィゼーシヨンやプラークハイブリダィゼ ーシヨン（モレキユラ一'クロー-ング第 2版）を行うことにより、本発明の DNAを取得 することができる。
[0028] 決定された DNAの塩基配列に基づ 、て、フォスフォアミダイト法を利用したパーキ ン.エルマ一社の DNA合成機 model 392等の DNA合成機で化学合成することにより 、本発明の DNAを取得することもできる。
(b)オリゴヌクレオチドの調製
配列番号 3または 4で表される塩基配列またはその断片の塩基配列に関する情報 に基づき、常法または DNA合成機を用いることにより、本発明の DNAの塩基配列、 例えば配列番号 3または 4で表される塩基配列のうち、連続した 5〜60塩基、好ましく は 10〜60、より好ましくは、 20〜60塩基、さらに好ましくは 30〜60塩基に相当する 配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当す るオリゴヌクレオチド（以下、アンチセンス ·ォリゴヌクレオチドという）を調製することが きる。
[0029] 上記した配列番号 3または 4で表される塩基配列のうちの連続した 5〜60塩基は、 配列番号 3または 4で表される塩基配列力 任意に選ばれる塩基配列であれば、 、 ずれの塩基配列であってもよ！/、。
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、オリゴ DNA、オリゴ RNA等のオリゴヌクレオ チド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体 (以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等 があげられる。
[0030] 該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス ·ォリゴヌクレオチドとして、例えば、検出し た!ヽ mRNAの一部の塩基配列にお!/、て、 5'末端側の塩基配列に相当するセンスプ ライマー、 3'末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等をあげることが できる。ただし、 mRNAにおいてゥラシルに相当する塩基は、オリゴヌクレオチドプラ イマ一においてはチミジンとなる。
[0031] センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしては、両者の融解温度 (Tm)お よび塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドで、 5〜60塩基、好ましくは 10〜60、より好ましくは、 20〜60塩基、さらに好ましくは 30〜60塩基数のものがあ げられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が ホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド 中のリン酸ジエステル結合が N 3，一 P5'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌ クレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド 核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 5プロピ-ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド 中のゥラシルが C— 5チアゾールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ォ リゴヌクレオチド中のシトシンが C— 5プロピ-ルシトシンで置換されたオリゴヌクレオ チド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン（phenoxazi ne-modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中 のリボースが 2，—O—プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ある いはオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシエトキシリボースで置換されたオリ ゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学， 16, 1463 (1997)〕。
[0032] 2.本発明のポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、モレキュラー 'クローユング第 2版やカレント'プロトコール ズ'イン'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方 法により、本発明の DNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長 cDNAをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適 当な長さの DNA断片を調製する。
[0033] また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主 細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した DNAを調製する。該 DNAは 本発明のポリペプチドの効率的製造に有用である。
該 DNA断片、または全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に 挿入することにより、組換えベクターを作製する。
[0034] 該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、 目的とする遺 伝子を発現できるものであれば 、ずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードする DNAを転写できる位置にプロ モーターを含有して 、るものが用いられる。
[0035] 細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコード する DNAを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同 時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列、より構成 されたベクターであることが好ま U、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/ヽ てもよい。
発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガー マンハイム社より巿販）、 pKK233- 2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGE MEX-1 (Promega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKY P200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (198 9)〕、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (-) (Str atagene社製）、 pTrs30 [Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP— 5407)より調製〕 、 pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製〕、 pGHA2 [Esch erichiacoliIGHA2 (FERM B- 400)より調製、特開昭 60- 221091〕、 pGKA2 [Escherichia coHIGKA2 (FERM BP- 6798)より調製、特開昭 60- 221091〕、 pTerm2 (US4686191、 US 4939094、 US5160735)、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 [J. BacterioL, 172 , 2392 (1990)〕、 pGEX (Pharmacia社製）、 pETシステム（Novagen社製）等をあげること ができる。
[0036] プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。
例えば、 trpプロモーター（P )、 lacプロモーター、 Pプロモーター、 Pプロモーター、
tip L R
T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることがで きる。また を 2つ直列させたプロモーター（P X 2)、 tacプロモーター、 lacT7プロモ
Ptrp trp
一ター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いる ことができる。
[0037] リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。 本発明の組換えベクターにおいては、本発明の DNAの発現には転写終結配列は 必ずしも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ま しい。
宿主細胞としては、ェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、 コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シユードモナス属等に属する微生物、例 ； ^ば、 Escherichiacoli XL1— Blue、 Escherichiacoli XL2— Blue、 Escherichia coliDHK E scherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Eschericniacoli W1485、 Escheric hia coli JM109、 Escherichia coliHBlO Escherichiacoli No.49、 Escherichia coli W31 10、 Escherichiacoli NY49、 Escherichia coli GI698、 Escherichia coliTBK Serratiaficar ia^ Serratia fonticola、 Serratia liquefaciens. Serratiamarcescens、 Bacillussubtilis、 Bac illus amylolia efacines. Brevibacterium ammoniagenes、 BrevibacteriumimmarioDhilum ATCC 14068、 Brevibacterium saccharolvticumATCC 14066、 Brevibacterium flavum ATCC14067、 Brevibacterium lactofermentumATCC13869、 Corynebacterium glutami cumATCC 13032、 Corvnebacteriumglutamicum ATCC13869、 Corynebacterium acet oacidophilumATCC13870, Microbacterium ammoniaphilumATC C 15354、 Pseudomon asputida、 Pseudomonas sp. D- 0110等をあげることができる。
[0038] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭 63- 2483942)、または Ge ne, 17, 107 (1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法 等をあげることができる
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等をあげる ことができる。
[0039] プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05プ 口モーター、 pGKプロモーター、 GApプロモーター、 プロモーター、 gal iプロ モーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、 MF a lプロ モーター、 CUP 1プロモーター等をあげることができる。
[0040] fe十:細胞としては、 aaccharomvcesJfe. Schizosaccharomvces ¾ . Kluweromvces i¾ .
Trichosporon属、 Schwanniomvces , Pichia属、 Candida属等に属する微生物、 χ. は、 aaccharomvcescerevisiae. Schizosaccharomvces pombe、 Kluweromvces lactis. Trichosporonpullulans、 Schwanniomvcesalluvius、 Candida utilis等 あけ こと力でき る。
組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれば 、ずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチ ゥム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (19 78)記載の方法等をあげることができる。 [0041] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pC DM8 (Invitrogen社製）、 pAGE107〔特開平 3- 22979、 Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社 製）、 pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモ 一ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることができる。また 、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ!、。
[0042] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 29 9)等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する 方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法〔Cytotech nology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リボフヱクシヨン法〔P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]、 Virology, 52, 456 (1973)等をあげるこ とがでさる。
[0043] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント 'プロトコールズ'イン'モレ =Τュフ ~~ 'ノヽィォロン ~~、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記 載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよび欠損型バキュロウィルスゲノムを昆虫細胞 に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに該組換えウイ ルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
[0044] 該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 pVL1392、 pVLl 393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製）等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virus)等を用 ヽること力 Sできる。
[0045] 昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巢細朐である S19、 S1 1 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)]、 Trichoplusianiの卵巢細朐である High 5 (Invitrogen社製）等を用いることが できる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあ げることができる。
[0046] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いて もよぐ例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチ ン 1プロモーター等をあげることができる。
[0047] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) (特開昭 59-140 885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特開昭 60-251887 )、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 (特許第 2606856、特許第 2517813)等 をあげることができる。
[0048] 以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発 明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリべ プチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
[0049] 本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主と して得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質 転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を 効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/、ずれを用いてもょ 、。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよぐグルコース、フラタト ース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等 の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアル コール類等を用いることができる。
[0050] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物 等を用いることができる。
[0051] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度 は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中の pHは 3. 0 〜9. 0に保持することが好ましい。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液 、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
[0052] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 1 ^プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシド等を、 プロモーターを用い た組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等 を培地に添カ卩してもよい。
[0053] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変 MEM培地〔 Virology, 8, 396 (1959)〕、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Me dicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。
[0054] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カロ してちよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地（Pharmingen社製）、 Sf- 900 II SFM培地（Life Technologies社 製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
[0055] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。
[0056] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードする DN Aを組み込んだ組換え体べク ターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の 培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリぺプ チドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
[0057] 酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは 糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。 本発明のポリペプチドを生産させる形態としては、本発明のポリペプチドをそのまま の構造で生産させる以外に、モレキュラー ·クローユング第 2版に記載されて 、る方法 等に準じて、シグナル配列を配した分泌タンパク質として、あるいは融合タンパク質と して生産することができる。
[0058] 融合させるタンパク質としては、 j8 -ガラタトシダーゼ、プロテイン A、プロテイン Aの I gG結合領域、クロラムフエ-コール'ァセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Arg)、ポリ（G1 u)、プロテイン G、マルトース結合タンパク質、グルタチオン S-トランスフェラーゼ、ポ リヒスチジン鎖（His-tag)、 Sペプチド、 DNA結合タンパク質ドメイン、 Tac抗原、チォ レドキシン、グリーン 'フルォレツセント'プロテイン、 FLAGペプチド、および任意の抗 体のェピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学， 13, 469-474 (1995)〕。
[0059] 本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細 胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用す る宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択する ことができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)〕、または特開平 5 -336963、 WO94/23021等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主 細胞外に積極的に分泌させることができる。
[0060] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含 むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発 明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0061] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明のポリペプチドを製造することもで きる。 形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育また は栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリべ プチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
[0062] 動物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の 方法 [American Journal of し linical Nutrition, 63,り 39S (1996)、 American Journal of
Clinical Nutrition, 63, 627S (1996)、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕に準じて遺伝子 を導入して造成した動物中に本発明のポリペプチドを生産する方法があげられる。 動物個体の場合は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする DNAを導入したト ランスジヱニック非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成 ·蓄積させ、該 動物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができ る。該動物中の生成'蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク (特開昭 63-309192
)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現 できるものであればいずれも用いることができる力 例えば、乳腺細胞特異的なプロ モーターであるひカゼインプロモーター、 eカゼインプロモーター、 eラクトグロブリン プロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
[0063] 植物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば本発明 のポリペプチドをコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法〔組 織培養， 20 (1994)、組織培養， 21 (1995)、 Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] に準じて栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成 ·蓄積させ、該植物中より該ポリべ プチドを採取することにより、該ポリペプチドを生産する方法があげられる。
[0064] 本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常 の酵素の単離精製法を用いることができる。 例えば本発明のポリペプチドが、細胞 内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水 系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザ 一、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心 分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法 、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル (DE AE)ーセファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン 交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽ィ オン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレジン を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ-ティーク 口マトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の 手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
[0065] また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を 回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を 回収する。回収したポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶ィ匕する。該可 溶ィ匕液を希釈または透析し、該可溶ィ匕液中のポリペプチド変性剤の濃度を下げるこ とにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離 精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
[0066] 本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等 の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドある 、は該ポ リペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分 離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同 様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
[0067] このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、配列番号 1または 2記載のァ ミノ酸配列力もなるポリペプチドをあげることができる。
また、本発明のポリペプチドは、 Fmoc法（フルォレニルメチルォキシカルボ-ル法） 、 tBoc法 (t プチルォキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造すること ができる。また、 Advanced ChemTech社、パーキン 'エルマ一社、 Pharmacia社、 Prote in Technology Instrument社、 SyntheceU- Vega社、 PerSeptive社、島津製作所等のぺ プチド合成機を利用して化学合成することもできる。
3.ネコノミ成虫由来ポリペプチドを認識する抗体の作製方法
(1)抗原の調製
本発明の抗体を製造するための抗原としては、上記 2の方法で製造された配列番 号 1または 2に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ネコノミ成虫またはネコノミ 成虫の中腸力もの抽出液などがあげられる。以下にネコノミ成虫またはネコノミ成虫 の中腸からの抽出液の作製方法を示す。
(1)ネコノミ成虫抽出液の作製
ネコノミ成虫に重量比で 1〜200倍、好ましくは 10〜50倍量で pHを 6〜8に規定し た緩衝液を加え、成虫成分を破砕した後、凍結融解または氷冷下で超音波処理を 行い、遠心分離等で固形物を排除する。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝 液、トリス塩酸緩衝液があげられる。
(ii)ネコノミ中腸抽出液の作製
ネコノミ成虫から前胃および中腸を摘出し、緩衝液を加え破砕した後、凍結融解ま たは氷冷下で超音波処理を行い、遠心分離等で固形物を排除する。緩衝液としては 、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液があげられる。
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記で得られた抽出液または上記 2で得られたポリペプチドを抗原として免疫する 。免疫する方法としては、動物の皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内に抗原をそのま ま投与してもよいが、適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。
[0068] アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント (Complete Freund's Adjuvant) および不完全アジュバント (Incomplete Freund's Adjuvant),水酸化アルミニウムゲル と百日咳菌ワクチン等があげられる。
免疫動物としては、ゥサギ、ャギ、マウス、ラット、ハムスターなどの非ヒト哺乳動物が あげられる。
[0069] 抗原の投与は、 1回目の投与の後、 1〜2週間毎に 3〜： L0回行う。抗原の投与量は 動物 1匹当たり 50〜： L00 gが好ましい。各投与後、 3〜7日目に免疫動物の眼底静 脈叢あるいは尾静脈より採血し、該血清の抗原との反応性について、酵素免疫測定 法 [酵素免疫測定法 (ELISA法）：医学書院刊（1976年) ]などで確認する。
そして、該血清が十分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物を、血清または抗体産生細 胞の供給源とする。
[0070] モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融 合させてハイプリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該 細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製すること ができる。
抗体産生細胞は、抗原投与された非ヒト哺乳動物脾細胞、リンパ節、末梢血などか ら採取する。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウス力も得られた株化細胞である、 8-ァザグァニン耐性マ ウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- U1(P3- Ul) [Eur. J. Immunol, 6, 511 (1976)]、 SP2/0-Agl4(SP-2) [Nature, 276, 269(1978)]、 P3- X63- Ag8653(653)[J. Im munoL, 123, 1548(1979)]、 P3—X63—Ag8(X63) [Nature, 256, 495(1975)]など、イン 'ビ トロ（in vitro)で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞 株の培養および継代については公知の方法 [アンチボディズ―ァ 'ラボラトリー 'マ- ュ /ノレ (Antibodies, A Laboratory Manual, し old Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988)；以下、「アンチボディズ」と記す]に従 、、細胞融合時までに 2 X 107個以上 の細胞数を確保する。
(4)細胞融合とモノクローナル抗体の選択
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングライ コール 1000(PEG-1000)などの細胞凝集性媒体をカ卩え、細胞を融合させ、培地中 に懸濁させる。細胞の洗浄には MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1.83g、リ ン酸ーカリウム 0.21g、食塩 7.65g、蒸留水 1リットル、 pH7.2)などを用いる。また、融 合細胞を懸濁させる培地としては、 目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、 HAT培地 {正常培地 [RPMI-1640培地にグルタミン (1.5mM)、 2-メルカプトエタノール (5 X 10"5M)、ジヱンタマイシン (10 μ g/ml)および牛胎児血清 (FCS) (CSL社製、 10%)を 加えた培地]にヒポキサンチン（10— 4M)、チミジン（1.5 X 10— 5M)およびアミノプテリン (4 X 10— 7M)を加えた培地 }を用いる。
培養後、培養上清の一部をとり、酵素免疫測定法により、抗原蛋白質に反応し、非 抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。ついで、限界希釈法、あるいは実体 顕微鏡下でキヤビラリ一ピペットを用いて単一細胞を採取することによりクローユング を行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナ ル抗体産生ハイプリドーマ株として選択する。 抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した細胞などを 96ゥエルプレートにコートし
、 ハイブリドーマ培養上清もしくは上述の方法で得られる精製抗体を第一抗体として 反応させる。
[0072] 第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
第二抗体とは、第一抗体のィムノグロブリンを認識できる抗体を、ピオチン、酵素、 化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイプリ ドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスィムノグロブ リンを認識できる抗体を用 、る。
[0073] 反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応す るモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマとして選択する。
(5)モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ハイプリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはプリ スタン処理 [2,6,10,14-テトラメチルぺンタデカン(？1^ &^)0.51^を腹腔内投与し、 2週 間飼育する]した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、モノクローナル抗体産生 ハイプリドーマ細胞を腹腔内投与して腹水癌化させた腹水から、分離、精製すること により調製できる。
[0074] モノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、 40〜50%飽和硫酸 アンモ-ゥムによる塩析、力プリル酸沈殿法、 DEAE-セファロースカラム、陰イオン交 換カラム、プロテイン A (または G)カラムある 、はゲル濾過カラム等を用いるクロマトグ ラフィ一等を、単独または組み合わせて行う方法があげられる。この方法により、 IgG あるいは IgM画分を回収し、精製モノクローナル抗体を取得することができる。
[0075] 精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、モノクローナル抗体タイピングキッ トなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法、 Dye-Binding Assayあるい は 280應での吸光度より算出することができる。
4.ネコノミ体成分ワクチンの製造方法
(l) RNAの抽出
羽化直後のネコノミ成虫を凍結した後、破壊する。破砕された抽出液に、 TRIZOL 試薬（TRIZOL Reagent, GIBCO BRL、 U.S.A.)等を用いて全 RNAを抽出する。さらに 必要に応じて、オリゴ dT結合担体を用いて mRNAを精製する。
(2) cDNAの合成から組換えファージ作製
逆転写酵素を用いて、常法に従って全 RNAまたは mRNAから cDNAを合成する。必 要に応じて、 LD-PCRにより増幅した後、常法に従い cDNAを組み込んだファージ DN Aを調製してパッケージングを行 、、ファージ粒子を作製する。
(3)ネコノミ成虫を殺傷させる能力を有するモノクローナル抗体を用いた cDNA発現 蛋白質のスクリーニング
大腸菌培養液中にファージ液を添加させて、 20〜40°C、好ましくは 37°Cで、 5〜30 分間、好ましくは 10〜15分間反応させて、ファージを大腸菌へ吸着させる。該培養液 中に、融解した LB/MgS04ソフトトツプアガーを添カ卩し、あらかじめ 37°Cに温めた LB/ MgS04寒天プレートに直ちに注ぐ。寒天プレート上のトップァガーが固まった後、 20 〜40°C、好ましくは 37°Cで 6〜18時間、寒天プレートをインキュベートし、小プラーク を形成させる。該寒天プレート表面に Isopropy卜 j8 - D- thiogalactopyranosid (以下、 IP TGと略記する。）を浸漬した-トロセルロースフィルタ一等を密着させて、 20〜40°C、 好ましくは 37°Cで、 2〜6時間、好ましくは 4時間さらに培養する。該フィルターに浸漬 された IPTGにより、挿入断片由来の蛋白質が誘導され、該蛋白質力 Sフィルターに吸 着する。該フィルターをプレートから剥がし、緩衝液の中にー晚 4°Cで放置し、余剰の 蛋白結合部位をブロッキングする。上記 3により得られた本発明のモノクローナル抗 体またはその培養上清を一次抗体として、室温で、 0. 5〜3時間、好ましくは 1時間 反応させた後、緩衝液で洗浄を行う。
この洗浄は、二次抗体反応後にも行う。二次抗体としてホースラディッシュペルォキ シダーゼ（HRP)標識抗マウス IgG (CappeU U.S.A.)を緩衝液で 100〜2,000倍、好まし くは 1,000倍希釈した溶液を、室温で 0. 5〜3時間、好ましくは 1時間反応させた後、 ウェスタンプロテツング法により陽性シグナルを検出する。
陽性反応を示すプラークよりファージを回収し、上述の方法を用いて、二次および 三次スクリーニングを行った結果、本発明と反応性の高いポリペプチドを選択する。
(4)塩基配列決定 陽性反応を示したプラークより回収したファージクローンを、常法により大腸菌 BM2 5.8に感染させ、プラスミドへサブクローユングする。大腸菌を用いることにより増幅さ れたプラスミド中の挿入 cDNAは、上記 1に記載の方法により塩基配列を決定すること ができる。
[0077] 得られた塩基配列の推定オープンリーディングフレーム領域の塩基配列を用いて 蛋白質を発現させることにより、モノクローナル抗体と反応性のあるポリペプチドを得 、これをネコノミ成虫ワクチンの有効成分として用いる。
5.本発明の抗体およびワクチンの用途
本発明の抗体またはワクチンを投与する動物としては、哺乳動物であればいずれ でもよいが、好ましくはネコなどがあげられる。
[0078] 上記 3により得られた抗体は、単独で投与することも可能ではある力 通常は薬理 学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分 野においてよく知られる任意の方法により製造した薬剤として提供するのが望ましい 。また、上記 4により得られたワクチンも、単独で投与することも可能ではある力 通常 は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技 術分野においてよく知られる任意の方法により製造した薬剤として提供するのが望ま しい。
[0079] 投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげ ることができ、本発明の薬剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。 投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、 注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
[0080] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の 糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のダリコール類、ごま油、オリ ーブ油、大豆油等の油類、 P-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、スト口ベリ 一フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。 [0081] カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マン-トール等の 賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タル ク等の滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の 結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として 用いて製造できる。
[0082] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物カゝらなる担体等を用いて 調製される。または、抗体またはワクチンを常法に従って凍結乾燥し、これに塩ィ匕ナト リウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
[0083] また、噴霧剤は該抗体またはワクチンそのもの、な 、しは受容者の口腔および気道 粘膜を刺激せず、かつ該抗体またはワクチンを微細な粒子として分散させ吸収を容 易にさせる担体等を用 1、て調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体またはワクチンおよ び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また
、これらの非経口剤にぉ 、ても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することも できる。
[0084] 投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重等により異なるが、有効成分の量として、通常哺乳動物 1日当たり 10 /z g/kg〜20mg /kgである。
上記方法により得られた、本発明の抗体を有効成分とする薬剤は、ネコノミ成虫繁 殖抑制剤または殺ネコノミ成虫剤として使用することができる。
[0085] また上記方法により得られた、本発明のワクチンを哺乳動物に摂取させることにより 、哺乳動物の生体内にワクチンに対する抗体を産生させることができる。哺乳動物が ワクチンを摂取することにより、ネコノミを防除することができる。
以下に実施例を用いて、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例 に限定されるものでない。
実施例 1 [0086] ネコノミ成虫由来ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体の作製
(1)抗原の調製
畜産生物化学安全研究所株のネコノミを、非ネコノミ感染ネコに感染させ、同じく畜 産生物化学安全研究所の方法に従ってネコノミ卵を回収した。文献 [Hudson, B. W. and Prince, M. (1958) A method for large-scale rearing or the cat flea, Ctenocep halides felis felis (Bouche). Bulletin of the World Health Organization 19: 1126—1129 -]に従って調製したネコノミ幼虫エサを、 1.0 mmメッシュの網を通過した粉砕ォガタズ に混合してネコノミ飼育培地とした。この培地と共にネコノミ卵をポリカーボネート製の 食品用小容器 (7.5 X 7.5 X 4.7cm)に入れ、 PC Vフィルム（旭化成製）で覆った。この小 容器を湿潤箱内に入れ、さらに 27 °Cのインキュベーター内で成虫が羽化するまでの 全てのステージにわたり飼育した。羽化した成虫を含む小容器カゝら跳躍して脱出した ネコノミ成虫だけを回収し、以下の工程に用いた。
[0087] ネコノミ成虫に、重量比 20倍量の 10mmol/Lのリン酸緩衝食塩液 (pH 7.2、以下 PBS )を加え、乳鉢を用いてすりつぶした後、氷冷下で超音波処理を 40W、 30秒間の条 件で 20回行い、その後 4°C、 20,000 X gで 30分間遠心分離を行い、上清を回収し、 -3 0°Cで保存した。
次に、実体顕微鏡下で 2,000匹のネコノミ成虫を解剖して前胃および中腸を摘出、 P BS lmLに 30匹の割合で回収した。これを氷冷下で超音波処理を 40W、 30秒間の条 件で 20回行い、その後 4°C、 20,000 X gで 30分間遠心分離し、回収した上清を、分画 分子量 30kDaの限外ろ過膜 (ウルトラフリー C3、 日本ミリポア株式会社製)を用いて 6,0 00 X g, 5分間の条件で数回遠心分離し、約 10倍に濃縮後、 -30°Cで保存した。
(2)モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体の作製は、以下の方法に従って行った。免疫には BALB/cマウ ス（5週齢、メス、埼玉実験動物）を用い、初回免疫ではネコノミ成虫抽出液を Freund' s complete adjuvant (ャトロン社製）とともに筋肉内接種した。追加免疫にはネコノミ成 虫抽出液を水酸ィ匕アルミニウムゲルとともに腹腔内に接種した。最終免疫にはネコノ ミ成虫中腸抽出液を静脈内に接種した。免疫マウス由来の脾細胞を常法に従い、細 胞融合液 PEG/DMSO (Sigma社製）を用いて、ミエローマ細胞 (P3 X 63- Ag8- U1:P3U1 )と！ ¾合させ、 serum free medium(GIBCO BRL社製)に hypoxanthine aminopterin thym idine(GIBCO BRL社製)を添カ卩した HAT培地で培養し、ハイプリドーマを作製した。 (3) ELISAによるハイプリドーマの選抜とクロー-ング
ハイプリドーマの培養上清を用いて、文献 [Hohdatsu, T., Eiki, T.， Ide, S. and Yama gishi, H. (1988) Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to equid herpesvisur type 1 (EHV). Jpn. J. Vet. Sci. 48(5): 1045-1048.]に従って酵 素免疫測定法 (以下、 ELISAと称す)を行い、スクリーニングを行った。抗原としてネコ ノミ成虫抽出液を 0.05M炭酸ナトリウムバッファー（pH 9.6)で 200倍希釈したものを EL ISAプレート (IWAKI社製)に 100 μ L/ゥエルずつ添カ卩し、 4°Cでー晚放置した。プレー トを 0.02 %Tween 20(WAKO社製)をカ卩えた 10 mMリン酸緩衝食塩液（pH 7.2、以下、 PBS-Tと称す。）で 4回洗浄した。この洗浄はインキュベートの度に行った。各ハイプリ ドーマの培養上清を 100 L/ゥエルでプレートに添カ卩し、 37°C1時間でインキュベー トした。ホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP)標識抗マウス IgGsャギ IgG (ICN P harmaceuticals,Inc.社製）を PBS-Tで 2,000倍希釈したものを 100 μ L/ゥエルで添カロし 、室温で 30分間反応させた。基質液 (0.2 Μリン酸第 2ナトリウム 25 mL, 0.1 Mクェン酸
25 mL、 0-フエ-レンジァミン 20 mg, 30 %過酸化水素水 0.01 mL)を 100 μ L/ゥェ ルで添加し室温で 20分間反応させ、 3Ν硫酸 (WAKO社製）を 100 L/ゥエルで添カロ し反応を停止させ、 492 nm(690 nm対照)で吸光度を測定し、 OD値とした。高い OD値 を示したゥエル内のハイプリドーマを、実体顕微鏡下でガラスキヤピラリーを用いて一 つずつ回収し、各々を培養し、モノクローナル抗体を産生する細胞株として確立した 。これらのクローンの培養上清に対して ELISAを行い、高い OD値を示したクローンを スケールアップして培養上清を回収後、実施例 2以降に用いた。細胞株は 10 % DM SO含有 FCSに懸濁して液体窒素中に保存した。
実施例 2
ウェスタンブロッテイングによるモノクローナル抗体の選択
(1)ウェスタンブロッテイング法
ネコノミ成虫抽出液、ネコノミ中腸抽出液、およびネコノミ糞便溶液の各サンプルを 等量のサンプルバッファー（0.5 M-Tris-HCl-pH 6.8 12.5 %, Glycelol 10 %, 10 % Sodium Dodesyl Sulfate (以下 SDS)20 %, 2- mercaptoethanol 5 %,1% Bromophenol b lue 5 %)と混合し、室温で 10〜15分間反応させた。各溶液を泳動サンプルとし、それ ぞれをサンプルスロットに 100 μ L/ゲルで注入し、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳 動（以下 SDS-PAGE)を行った。
[0089] 泳動後、ゲルの一部を切り取り、銀染色（2D-銀染色試薬 ·Π「第一」、第一化学薬 品株式会社)を試薬の指示書に従い行った。残りのゲルは、 PVDF膜 (Millipore社製） に転写後、 PVDF膜の一部を切り取り、クマシ一ブリリアントブルー（CBB)染色液 (CB B 0.1 % ·メタノール 50 % ·酢酸 10 %含有 DW)で 30分間蛋白染色後、バンドが確認 できるまで脱色液 (メタノール 10 %，酢酸 10 %,DW 80 %)で脱染色した。残りの PVD F膜は 2 %スキムミルク（DIFC0)含有 PBS (以下 SM-PBS)でー晚ブロッキングした後、 後述の膜 ELISAを行った。
[0090] さらにネコノミ成虫抽出液をサンプルとして非変性条件下でのポリアクリルアミド電 気泳動（Native-PAGE)を行い、 PVDF膜に転写後、 PVDF膜の一部を切り取り、 CBB 染色すると共に、残りの PVDF膜は次項の膜 ELISAに供した。
(2)膜 ELISA
膜 ELISAは以下の方法に従って行った。 (1)で得られた蛋白質が転写された PVDF 膜を幅約 2 mmのストリップ状に切断した後、 SM?PBS中にー晚 4 °Cで放置し、余剰の 蛋白質結合部位をブロックした。実施例 1 (3)で得られた 5% FCSを含む各クローン の培養上清を一次抗体とし各ストリップと 37°Cで 2時間反応させた。その後 PBS— Tで 5分間 X 3回洗浄を行った。この洗浄の作業はインキュベートの度に行った。二次抗 体としてホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP)標識抗マウス IgGsャギ IgG (ICN Pharmaceuticals社製）を PBS- Tで 2,000倍希釈したものを 37°C、 1時間反応させた。基 質として 50mLの 0.015 %過酸化水素含有 0.05 M酢酸ナトリウム溶液（pH 5.0)に発色 剤として 3-ァミノ- 9-ェチルカルバゾール (Sigma Chemical社製） 20mgをカ卩えたものを 室温で 30分間反応させた。
[0091] 以上より、各クローンの培養上清の SDS- PAGEおよび native- PAGE後の膜 ELISAに おける反応性の良好なクローンを選択し、さらに ELISA法において抗体価が高力つた クローンを選択した。選択されたクローンにより生産されるモノクローナル抗体を CFM A- 1と命名した。
(3)アイソタイプの同定
モノクローナル抗体のタイプおよびアイソタイプは、 Mouse MonoAB ID KIT (ZYME D LABORATRIES社製)を用い指示書に従い同定した。
[0092] 選択されたクローンのタイプおよびアイソタイプは IgGlであった。
実施例 3
[0093] 人工吸血システムを用いたモノクローナル抗体のネコノミ成虫を殺傷させる能力の評 価
(1)モノクローナル抗体の腹水化
実施例 2 (2)で得られたモノクローナル抗体 CFMA-1につ ヽて十分な抗体量を得る ために、モノクローナル抗体のマウス腹水化を行った。 BALB/cマウスにモノクローナ ル抗体を産生するハイブリドーマを腹腔内接種し、一週間後に放血殺し、腹水を得 た。この腹水を文献 [Warlow, R. S" Uko, G" Feeney, D. J. and Kay, P. H. (1988) H LA, C4, Bf, Gm and autoantibodies in rheumatoid arthritis. Exp. Clin. Immunogenet .5(2-3):133-142.]の方法に従い、 50 %硫酸アンモ-ゥム (WAKO社製)飽和により粗 精製し、モノクローナル抗体 CFMA-1を取得した。
(2)人工吸血システムによるモノクローナル抗体のネコノミ成虫を殺傷させる能力の 評価
文献 [Wade, S. E. and ueorgi, J. R. (1988) Survival and reproduction of artificially fed cat fleas, ctenocephalides felis Bouche (Siphonaptera: Pulicidae). J. Med. Entom ol. 25(3): 186-190.]に従い、ネコノミにモノクローナル抗体 CFMA-1を含むゥシ血液 を人工給餌した。各ケージに一定量のネコ被毛を入れ、一定数のネコノミをカ卩えて蓋 をし、 LABORATORY FILM(American National Can™)により閉鎖された血液チャン バー内の 4 %クェン酸ナトリウム含有ゥシ血液（日本バイオテスト研究所製）に 2.5 mg /mLとなるよう PBSで希釈したモノクローナル抗体を 200 μ Lずつカロえた。コントロール 群として PBSのみをカ卩えたゥシ血液を使用した。補体添加群にはさらに文献 [Heath, A. W., Arfsten, A., Yamanaka, M., Dryden, M. W. and Dale, B. (1994) Vaccination against the cat flea Ctenocephalides felis felis. Parasite Immunol, lb: 187— 191.」に従 い GUINEA PIG COMPLEMENT(INTER- CLL TECNOLOGIES, INC.)を血液中に 12 5 μ L加え、さらに血液交換の翌日に GUINEA PIG COMPLEMENTを 50 μ L追加した 。非補体添加群として GUINEA PIG COMPLEMENTの代わりに PBSをカ卩えた群を置く ことで補体添加の有無がモノクローナル抗体の反応性にどのような影響を与えるかに ついて検討した。このように調製した血液を LABORATORY FILMおよびメッシュ越し にネコノミに吸血させた。血液はモノクローナル抗体 CFMA-1、補体を含め 2日に一 度、全量を交換した。ネコノミの死亡数を毎日観察し、観察最終日となる実験開始 6 日目の観察後、生存しているネコノミをチャンバ一ごと- 30°Cにいれて死亡させた後、 ネコノミの全数を算定した。コントロール群の生存率 (%)力 各群の生存率 (%)を引き、 これをコントロール群の生存率 (%)で除したものに 100を乗じて補正死亡率 (%)とした。
[0094] その結果を図 1に示す。図 1に示したように、モノクローナル抗体投与群においてコ ントロールに比べ補正死亡率は常時高値で推移し、実験開始後 6日目において補正 死亡率が 50%を超えた。以上のことから、モノクローナル抗体 CFMA-1はノミ成虫体 内に経口的に取り込まれることでその寿命を短縮することが示された。
実施例 4
[0095] ネコノミ成虫 cDNAライブラリーの発現スクリーニング
(1) RNAの抽出
羽化直後のネコノミ成虫を生きたまま液体窒素に投入し実験まで保存した。使用直 前に液体窒素内から取りだしたノミを液体窒素存在下、乳鉢内で破砕し TRIZOL試薬 (TRIZOL Reagent, GIBCO BRL社製）を用いて、使用法に従い全 RNAを抽出した。
(2) cDNAの合成から組換えファージの作製
SMART™PCR cDNA Synthesis Kit (CLONTECH社製）を用い、ユーザーマ-ユア ルに従って全 RNAから cDNAを合成し、 LD-PCRにより増幅した後、ユーザーマ-ユア ルに従 、cDNAを組み込んだ λ TriplEx2ファージ DNAを調製した。このファージ DNA を Gigapack III (STRATAGENE、 U.S.A.)を用いてパッケージングし、ファージ粒子を 作製した。
(3)ネコノミ成虫を殺傷させる能力を有するモノクローナル抗体を用いた発現スクリー ユング ファージ液を大腸菌 XLl-Blue培養液に添カ卩し、 37°Cで 10〜15分間にわたって吸 着させた後、さらに融解した LB/MgSOソフトトツプアガーを添加し、あら力じめ 37°Cに
4
温めた LB/MgSO寒天プレートに直ちに注いだ。トツプアガーが固まってから 37°Cで 6
4
〜18時間インキュベートし、小プラークを形成させた後、そのゲル表面に 20mM IPTG に浸漬後、乾燥させた-トロセルロースフィルター Hybond-c extra (Amersham Bioscie nce社製)を密着させ 37°C、 4時間培養し、挿入断片由来蛋白質の発現を誘導して、 合成された蛋白質を吸着させた。フィルターをプレートから剥がし、 TBS (10mM Tris- HCL、 150mM NaCl)で 15分間 X 2回洗浄後、 0.5%スキムミルク（DIFCO)含有 TBS (以 下 TBS-SM)中にー晚 4°Cで放置し、余剰の蛋白結合部位をブロッキングした。モノク ローナル抗体 CFMA-1の培養上清を混合したものを一次抗体として室温、 1時間反 応させた。その後、 0.05%Tween20 (ICN Biomedicals)含有 TBS- SM (以下 TBS- T)で 3回洗浄し、さらに TBS- Tを加え 5分間 X 3回洗浄を行った。この洗浄は、二次抗体反 応後にも行った。二次抗体としてホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗 マウス IgG (Cappel社製)を TBS-Tで 1,000倍希釈したものを室温、 1時間反応させた後 、 ECL Western blotting analysis system (Amersham bioscience^ U.b.A.) 用 ヽて陽 性シグナルを検出した。陽性反応を示したプラークよりファージを回収し、同様に二 次および三次スクリーニングを行い、得られた単一プラーク由来のファージを用いて 、モノクローナル抗体 CFMA-1を反応させた。
(4)塩基配列決定
陽性反応を示したプラークより回収したファージクローンを SMARTTM cDNA Librar y Construction Kit (CLONTECH社製）のユーザーマニュアルに従い、大腸菌 BM25 .8に感染させ pTriplEx2プラスミドへ変換した。大腸菌を用いて増幅したプラスミドを G FX Micro Plasmid Prep Kit (.Amersham bioscience社製)を用 ヽ、キット【こ添付の旨不 書に従って精製し、 目的断片の 5'末端側および 3'末端側から、およそ 400bp毎のプ ライマーウォーキング法により挿入 cDNA断片全長の塩基配列決定を行った。
パッケージングしたファージのカ価は、 2.3 X 107pfo/mlであり、青/白スクリーニング の結果力もその 97.9%が組み換え体であった。延べおよそ 105PFUの cDNA断片を組 み込んだファージにつ 、て発現スクリーニングを行った結果、モノクローナル抗体 CF MA-1と反応する 2個のプラークが得られ、 CFMA-1に反応性の cDNA断片を持つファ ージ 2クローンが得られた。以後、これら 2クローンを cffiAl-1および cffiAl-2と称す。
[0097] cffiAl-1および cffiAl-2の挿入断片長は、それぞれ 916bp、 442bpであったが、予想 されるオープンリーディングフレームは cffiAl-1では 687bp、 cffiAl_2では 307bpと考え られた。各々の翻訳アミノ酸は 229残基および 74残基であった。 cffiAl-1および cffiAl -2のアミノ酸配列を配列番号 1および 2に、塩基配列を配列番号 3および 4にそれぞ れ示す。これらの間の DNAおよびアミノ酸配列に高い相同性は認められな力つた。こ れらは 、ずれも NCBIの Blastによる検索にお!、て、既知の DNAおよびアミノ酸配列と 高い相同性を有するものはなぐ今回得られた配列は新規な DNAおよびアミノ酸配 列であることが示された。
実施例 5
[0098] 推定翻訳領域遺伝子断片の発現ベクターへのサブクローユングと大腸菌による発現
(1)推定翻訳領域遺伝子断片の発現ベクターへのサブクローユング
推定翻訳領域の 5，および 3，末端側に相補的なプライマーを設計した。 5，末端側の プライマーには翻訳フレームに合わせて Sal I切断サイトを、 3，末端側のプライマーに は Not I切断サイトをそれぞれ設け、それぞれ各プライマーの 5'末端側に付加するよ うにした。 CFEA1-1の 5，末端側プライマーおよび 3，末端側プライマーを配列番号 5 および配列番号 6、 CFEA1- 2の 5 '末端側プライマーおよび 3，末端側プライマーを配 列番号 7および配列番号 8にそれぞれ示す。これを用いて PCR法にて翻訳領域の遺 伝子断片を増幅させた。
[0099] PCR産物を 1%ァガロースゲルで電気泳動し分子量を確認後、切り出して精製、抽 出（Montage Gel Extraction Kit, Amersham社製）して、 TOPO TA Cloning Kit (Invitr ogen社製）を用いてクローユングベクター pCR2.1- TOPO (Invitrogen社製）に連結さ せた。該連結産物を大腸菌 DH5 α -Tlに形質転換させた。
(2)推定翻訳領域の発現ベクターへのサブクローユング
挿入遺伝子断片の組み換え蛋白質の発現には、 pGEX- 6p- 3(Amersham bioscienc e社製)を用いた。クローユングベクターに挿入されている目的遺伝子断片を制限酵 素 Sailおよび Notlで二重消化し、 目的とする遺伝子断片をァガロースゲル電気泳動 により精製した (Montage Gel Extraction Kit、 Amersham bioscience社製)。これを Sail および Notlで二重消化し、アルカリフォスファターゼ (TaKaRa社製）処理後、同様にァ ガロースゲルで精製した発現ベクター断片と T4DNAリガーゼ (TaKaRa)を用い 16°C 一晩連結した。 目的断片を挿入した発現プラスミドを発現用大腸菌 BL21 (DE3) pLys Sに形質転換させた。また、蛋白発現時の陰性対照として用いるため挿入無しの pGE X- 6p- 3プラスミドも BL21 (DE3) pLysSに形質転換させた。
(3)蛋白質発現と SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE)用のサンプルは、大腸菌を終濃 度 0.1、 0.4、 0.7、 l.OmMと変えた IPTG下で培養し、挿入断片遺伝子由来蛋白質およ び Glutathione S-transferase (GST)蛋白質との融合蛋白質を発現させ、菌体を超音 波破砕処理後、遠心分離した上清を GST蛋白部分と特異的に結合するビーズ Glutat hione Sepharose 4B(Amersham bioscience社製)を用いて精製した。各サンプルには 、等量の SDS-PAGEサンプルバッファーを混合して 100°C、 5分間加熱して変性させ、 泳動サンプルとした。 SDS-PAGEを用いて泳動後のゲルにクマシ一ブリリアントブル 一（CBB)で染色し、分子量の確認を行った。
(4)ウェスタンブロッテイングによるモノクローナル抗体との反応性の確認
SDS-PAGEで上記（3)で調製したサンプルを泳動分離後、ゲルを PVDF膜 (Millipor e Corp., U.S.A.)に転写し、発現スクリーニングと同じ方法でモノクローナル抗体 CFM A-1と反応させた。
cffiAl-1については、推定翻訳領域を発現ベクター pGEX- 6p-3へサブクローニン グし大腸菌にて GSTとの融合蛋白質の発現を行った。ゲルの CBB染色により、破砕 菌体上清のァフィ二ティー精製サンプルで組換え蛋白質の予想分子量 (約 51KDa) に相当する場所にバンドが認められ、さらにウェスタンブロッテイングでは 51KDa付近 の相当部位にモノクローナル抗体 CFMA-1と強い反応性を持つバンドが確認された 。以上のことから、今回用いた推定オープンリーディングフレームがネコノミ成虫を殺 傷させる効果を有するモノクローナル抗体の標的分子であり、さらに本遺伝子がコー ドするポリペプチドは大腸菌で発現させても抗原として有用であることが示された。ま た超音波破砕菌体上清のァフィユティー精製サンプルにおいて反応性バンドはほぼ 一本であり、ァフィユティークロマトグラフィーによる一段階の精製でも一定の精製が 可能なことが示され、本ポリペプチド、または本ポリペプチド中に含まれるェピトープ はネコノミ成虫を殺傷させる効果を期待したワクチンとして利用することができる。 産業上の利用可能性
本発明により、ネコノミ成虫由来ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする DNA、該 ポリペプチドを認識する抗体、ネコノミ成虫を殺傷させる能力を有するモノクローナル 抗体、該モノクローナル抗体が認識するェピトープ部位を含むポリペプチドを有効成 分として含有する、ネコノミ成虫を殺傷させるためのワクチン、ならびに該モノクローナ ル抗体を有効成分として含有する、ネコノミ成虫繁殖抑制剤および殺ネコノミ成虫剤 を提供することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号 3 人工配列： CFEA1-1の cDNA
配列番号 4 人工配列： CFEA1-2の cDNA
配列番号 5—人工配列：合成 DNA
配列番号 6—人工配列：合成 DNA
配列番号 7—人工配列：合成 DNA
配列番号 8—人工配列：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)〜（d)から選ばれるポリペプチド。
(a)配列番号 1で示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(b)配列番号 1で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド。
(c)配列番号 2で示すアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(d)配列番号 2で示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換 若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチド。
[2] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする DNA。
[3] 以下の（a)〜（d)から選ばれる DNA。
(a)配列番号 3の塩基配列を含む DNA。
(b)配列番号 3の塩基配列を含む DNAと相補的な配列からなる DNAとストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ配列番号 1で示されるアミノ酸配列力もなるポリ ペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
(c)配列番号 4の塩基配列を含む DNA。
(d)配列番号 4の塩基配列を含む DNAと相補的な配列からなる DNAとストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ配列番号 2で示されるアミノ酸配列力もなるポリ ペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする DNA。
[4] 請求項 2または 3に記載の DNAを含むベクター。
[5] 請求項 4に記載のベクターを含む形質転換細胞。
[6] 請求項 5に記載の形質転換細胞を培養し、その培養物力 請求項 1記載のポリぺプ チドを採取することを特徴とする、ネコノミ成虫由来ポリペプチドを製造する方法。
[7] 請求項 1に記載のネコノミ成虫由来ポリペプチドと結合する抗体。
[8] 抗体が、モノクローナル抗体である請求項 7に記載の抗体。
[9] モノクローナル抗体が、ネコノミ成虫を殺傷させる能力を有する請求項 8記載のモノク ローナル抗体。
[10] 請求項 9記載のモノクローナル抗体が結合するェピトープ部位を含むポリペプチドを 有効成分として含有する、ネコノミ成虫を殺傷させるためのワクチン。
[11] 請求項 8または 9記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、ネコノミ成虫 繁殖抑制剤。
[12] 請求項 8または 9記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、殺ネコノミ成 虫剤。
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