JP6298762B2 - 抗bmp9抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤 - Google Patents
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Description
(1)以下の(a)〜(e)から選ばれる1の抗体、もしくは該抗体と競合してヒトBMP9に結合し、かつ、ヒトBMP9への結合解離定数が1×10−10mol/L以下であるモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(a)相補鎖決定領域(complementarity determining region、以下CDRと記す)1〜3がそれぞれ配列番号54〜56で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号57〜59で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号60〜62で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号63〜65で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含む抗体
(c)配列番号48で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号51で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
(d)配列番号49で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号52で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
(e)配列番号128で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号132で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
(2)前記(a)〜(e)から選ばれる1の抗体が結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体である、(1)に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(3)遺伝子組換え抗体である、(1)に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(4)ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(3)に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(5)以下の(a)〜(c)から選ばれる1のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(a)CDR1〜3がそれぞれ配列番号54〜56で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号57〜59で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号60〜62で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号63〜65で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
(c)配列番号128で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号132で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体及び抗体断片
(6)配列番号67で表されるヒトBMP9 mature領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、87番目Lys、89番目Asp、90番目Met、及び93番目Proに結合する、(1)〜(5)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
(7)Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)及びCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である(1)〜(6)のいずれか1に記載の抗体断片。
(8)(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするDNA。
(9)(8)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(10)(9)に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
(11)(10)に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
(12)ヒトBMP9に結合し、かつヒトBMP9とヒトBMPRIIとの結合を阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、BMP9が関与する貧血を伴う疾患の治療剤。
(13)(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトBMP9の免疫学的検出又は測定方法。
(14)(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
(15)(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトBMP9が関与する貧血の治療方法。
(16)ヒトBMP9に結合し、かつヒトBMP9とヒトBMPRIIとの結合を阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、BMP9が関与する貧血の治療方法。
(i)CDR1〜3がそれぞれ配列番号54〜56で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖(以下、H鎖と記す)を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号57〜59で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖(以下、L鎖と記す)を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
(ii)CDR1〜3がそれぞれ配列番号60〜62で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号63〜65で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
(a)配列番号48で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域(以下、VHと記す)を含み、かつ配列番号51で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域(以下、VLと記す)を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
(b)配列番号49で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVHを含み、かつ配列番号52で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVLを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
(c)配列番号128で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVHを含み、かつ配列番号132で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVLを含む抗体及びその抗体断片
さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体が結合するヒトBMP9に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片を挙げることができる。
(a)配列番号116のアミノ酸配列、又は配列番号116のアミノ酸配列の8番目のGly、18番目のLeu、49番目のGly、79番目のAsn、81番目のLeu、94番目のAla、95番目のVal、99番目のAla、及び100番目のArgから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVH
(b)配列番号118のアミノ酸配列、又は配列番号118アミノ酸配列中の4番目のMet、40番目のTyr、81番目のSer、82番目のLeu、89番目のVal、及び91番目のTyrから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の8番目のGly、18番目のLeu、49番目のGly、79番目のAsn、81番目のLeu、94番目のAla、95番目のVal、99番目のAla、及び100番目のArgが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の8番目のGly、18番目のLeu、49番目のGly、81番目のLeu、94番目のAla、99番目のAla、及び100番目のArgが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の8番目のGly、18番目のLeu、49番目のGly、79番目のAsn、94番目のAla、99番目のAla、及び100番目のArgが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の49番目のGly、95番目のVal、99番目のAla、及び100番目のArgが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の8番目のGly、18番目のLeu、79番目のAsn、及び100番目のArgが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の49番目のGly、99番目のAla、及び100番目のArgが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むVH
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号116アミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(8)配列番号116アミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(9)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、及び99番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、49番目のGlyをAlaに81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(8)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、79番目のAsnをSerに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、及び99番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、49番目のGlyをAlaに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、49番目のGlyをAlaに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、18番目のLeuをMetに、79番目のAsnをSerに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、95番目のValをIleに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、及び99番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、81番目のLeuをValに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、94番目のAlaをGlyに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、81番目のLeuをValに、94番目のAlaをGlyに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、81番目のLeuをValに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、94番目のAlaをGlyに、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、81番目のLeuをValに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、94番目のAlaをGlyに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、99番目のAlaをThrに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに、及び49番目のGlyをAlaに置換したアミノ酸配列
(8)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに、及び49番目のGlyをAlaに置換したアミノ酸配列
(9)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、及び81番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(10)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、及び94番目のAlaをGlyに置換したアミノ酸配列
(11)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、及び99番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列
(12)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに、及び100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号116のアミノ酸配列中の、8番目のGlyをArgに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号116のアミノ酸配列中の、18番目のLeuをMetに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号116のアミノ酸配列中の、49番目のGlyをAlaに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号116のアミノ酸配列中の、79番目のAsnをSerに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号116のアミノ酸配列中の、81番目のLeuをValに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号116のアミノ酸配列中の、94番目のAlaをGlyに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号116のアミノ酸配列中の、95番目のValをIleに置換したアミノ酸配列
(8)配列番号116のアミノ酸配列中の、99番目のAlaをThrに置換したアミノ酸配列
(9)配列番号116のアミノ酸配列中の、100番目のArgをGlyに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMet、40番目のTyr、81番目のSer、82番目のLeu、89番目のVal、及び91番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(2)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMet、81番目のSer、82番目のLeu、及び89番目のValが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(3)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyr、81番目のSer、及び91番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(4)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyr、及び91番目のTyrが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のVL
(1)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、40番目のTyrをPheに、82番目のLeuをMetに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、82番目のLeuをMetに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに、81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、81番目のSerをProに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、82番目のLeuをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号118のアミノ酸配列中の82番目のLeuをMetに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに、89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに、82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、及び81番目のSerをProに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、及び82番目のLeuをMetに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに、及び82番目のLeuをMetに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(7)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(8)配列番号118のアミノ酸配列中の82番目のLeuをMetに、及び89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(9)配列番号118のアミノ酸配列中の82番目のLeuをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(10)配列番号118のアミノ酸配列中の89番目のValをMetに、及び91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(1)配列番号118のアミノ酸配列中の4番目のMetをLeuに置換したアミノ酸配列
(2)配列番号118のアミノ酸配列中の40番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
(3)配列番号118のアミノ酸配列中の81番目のSerをProに置換したアミノ酸配列
(4)配列番号118のアミノ酸配列中の82番目のLeuをMetに置換したアミノ酸配列
(5)配列番号118のアミノ酸配列中の89番目のValをMetに置換したアミノ酸配列
(6)配列番号118のアミノ酸配列中の91番目のTyrをPheに置換したアミノ酸配列
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2、4−ジアミノブタン酸、2、3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
1.モノクローナル抗体の製造方法
(1)抗原の調製
抗原となるBMP9又はBMP9を発現した組織は、BMP9全長又はその部分長をコードするcDNAを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、BMP9を多量に発現しているヒト組織からBMP9を精製し、得ることが出来る。また、該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Fmoc法、又はtBoc法などの化学合成法によりBMP9の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
3〜20週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、(1)で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、BMP9ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、8−アザグアニン耐性マウス(Balb/C由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology、18、1(1978)]、P3−NS1/1Ag41(NS−1)[European J.Immunology、6、511(1976)]、SP2/0−Ag14(SP−2)[Nature、276、269(1978)]、P3−X63−Ag8653(653)[J.Immunology、123、1548(1979)]、又はP3−X63−Ag8(X63)[Nature、256、495(1975)]などが用いられる。
(2)で得られる融合用抗体産生細胞と(3)で得られる骨髄腫細胞をMinimum Essential Medium(MEM)培地又はPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
プリスタン処理[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウス又はヌードマウスに、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgG又はIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びBiacoreによるkinetics解析により行う。
(6−a)バインディングアッセイ
抗原としては、(1)で得られるBMP9をコードするcDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、BSA又はKLHなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いても良い。
Biacore T100を用い、抗原と被験物の間の結合におけるkineticsを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスIgG抗体をセンサーチップCM5にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR移植抗体の作製方法を示す。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
ヒト型CDR移植抗体のVH又はVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
ヒト型CDR移植抗体は、非ヒト抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する[BIO/TECHNOLOGY、9、266(1991)]。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
(3)及び(6)で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
(3)及び(6)で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、BMP9が関与する貧血を伴う疾患の治療に用いることができる。
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
マウスBMP9 遺伝子ノックアウト用ターゲティングベクターの構築
1−1)カセットベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−Aの構築
ノックアウト(KO)用ターゲティングベクターを作製するための基本ベクターとなるカセットベクターpBlueLAB−LoxP−Neo−DT−Aは、pBluescriptに制限酵素サイトを付加した後、ネオマイシン耐性マーカー遺伝子発現ユニットの両端にLoxP配列を有するLoxP−Neo及びジフテリア毒素A鎖遺伝子(DT−A)を挿入したベクターで、国際公開第2006/078072号公報の実施例7で記載したベクターと同一である。以下に、当該ベクター作製の概略を記載する。
Ensemble Genome Browserより取得したマウスBMP9(GDF2)遺伝子を含むゲノムDNA配列(アクセッション番号:ENSMUSG00000072625)よりプライマー(配列番号5、6)を設計した。
Ensemble Genome Browserより取得したマウスBMP9遺伝子を含むゲノムDNA配列(アクセッション番号:ENSMUSG00000072625)よりプライマー(配列番号7、8)を設計した。
実施例1−1で得られたpBlueLAB−Lox−Neo−DT−AをClaI及びAscIで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、QIAquick Gel Extraction Kitを用いてDNA断片を回収した。回収した約7.6kbpのDNA断片に、実施例1−2で得られた酵素処理断片を挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。得られた形質転換体よりDNA断片が挿入されているクローンを選択した。連結部分の塩基配列に問題がないことを確認した。
実施例1−4で得られたプラスミドをPacI及びFseIで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて酵素処理断片を回収した。回収した9.7kbpのDNA断片に、実施例1−3で作製した酵素処理断片を挿入した後、大腸菌DH5αに導入した。
マウスBMP9遺伝子ターゲティングベクターの調製
実施例1−5で得られたpBluemBmp9−Lox−Neo−DT−A−3’KO−5’KO 60μgを、終濃度が1mmol/Lとなるようにスペルミジン(シグマ社製)を添加し、pHを7.0に調製した、制限酵素用Hバッファー(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)中で、NotIで酵素消化した。
ゲノムサザンブロット解析用プローブの調製
3−1)マウスBMP9遺伝子の5’側ゲノム確認用プローブの作製
BACクローンRP23−181N8の塩基配列情報を基に、マウスBMP9遺伝子の5’側ゲノム領域約500bpを含むプローブを取得するため、プライマー(配列番号9、10)を設計した。
BACクローンRP23−181N8の塩基配列情報を基に、マウスBMP9遺伝子の3’側ゲノム領域約500bpを含むプローブを取得するため、プライマー(配列番号11、12)を設計した。
マウスBMP9 KO ES細胞株の取得
相同組換えを用いたマウスBMP9遺伝子KO ES細胞の取得のため、確立されている方法(相沢慎一著、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲティング、羊土社、1995)に従って、実施例2において調製したpBluemBmp9−Lox−Neo−DT−A−3’KO−5’KO−NotIをマウスES細胞TT2(Yagiら、Analytical Biochem.、214:70、1993)へ導入した。詳細な方法を以下に記載する。
BMP9 KOヘテロ接合型マウスの作製
実施例4において取得したES細胞は、毛色が濃茶色CBA×C57BL/6 F1マウス由来(Yagiら、Analytical Biochemistry、214:70−76、1993)のTT2細胞である。そこで、ES細胞由来の遺伝子を有するキメラマウスと、ES細胞由来の遺伝子を有さない宿主マウスを簡便に判別するため、宿主マウスには、毛色が白色のICRマウスを選択した。
BMP9KOホモ接合型マウスの作製
実施例5で作製されたBMP9KO(+/−)の雌雄個体を交配させ、子マウスを得た。実施例5と同様に、マウスの尻尾からPuregene DNA Isolation Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型とし、実施例5と同様にPCRを行った。さらに、アガロース電気泳動を行うことにより、BMP9KOへテロ接合型[BMP9KO(+/−)]とホモ接合型[BMP9KO(−/−)]を選抜した。
抗ヒトBMP9モノクローナル抗体の作製
7−1)免疫原の調製
免疫原として用いたヒトBMP9組換えタンパク質は、国際公開第2010/126169号の実施例12に記載された方法に従い調製した。
アジュバントに、RIBIアジュバント(Corixa社製)、又はTiter Max Gold(Titermax社製)を用いて、実施例7−1で調製したヒトBMP9組換えタンパク質を、実施例6で得られたBMP9 KO(−/−)マウスに免疫した。具体的には、RIBIアジュバントの添付文書に従って、ヒトBMP9組換えタンパク質の懸濁液を調製した後、1匹あたり25μgのヒトBMP9組換えタンパク質が投与されるよう、該懸濁液をKOマウスの腹腔内に投与した。
マウス骨髄腫細胞株(Sp2/0,ATCC:CRL1581)を10%ウシ胎児血清添加DMEMにて培養し、細胞融合の親株として用いた。
実施例7―2で得られたマウス脾細胞と実施例7−3で得られた骨髄腫細胞を5:1になるよう混合し、遠心分離(1500rpm、3分間)した。得られた沈殿画分(細胞群)に対して、ポリエチレングリコール−1500(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)1mLを、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。次に、該細胞液にDMEM培地5mLを穏やかに揺らしながら加え、更にDMEM培地を10mL添加した。次に、上記の該細胞液を含むチューブを37℃で5分間インキュベートし、遠心分離(1500rpm、3分間)した。
ALK1/BMP9サンドイッチELISAは、抗ヒトBMP9マウスモノクローナル抗体(R&Dシステムズ社製、クローンNo.360107、以下R&D抗体と記載)、及びヒトBMP9のタイプI受容体として知られているヒトALK1細胞外領域ヒトIgG1 Fc領域フュージョンタンパク質(hsALK1−Fc)を用いて、以下のように構築した。
実施例7−5で構築したサンドイッチELISAにおいて、ヒトmature2量体BMP9組換えタンパク質の添加の際に、1ng/mL濃度のヒトmature2量体BMP9組換えタンパク質、及び50%濃度の実施例7−4で作製したハイブリドーマの培養上清を含むように調製した10% SuperBlock in PBS−T溶液を、100μL/ウェルで分注した。
抗体を大量取得するため、ハイブリドーマの培地をコンプリート培地からeRDF培地[Ultra−Low IgG FBS(GIBCO社製)1v/v%、Transfelin 5μg/mL、インシュリン 5μg/mL、エタノールアミン 10μmol/L、及びSodium Selenite 25nmol/Lを含むe−RDF培地(極東製薬製)]に、段階的に置換し、ハイブリドーマ細胞のeRDF培地への馴化を行った。
実施例7−8で馴化したハイブリドーマを、細胞密度1〜2×105cells/mLでローラーボトル(850cm2、BDサイエンス社製)100本に播種した。培地にはeRDF培地を用いた。播種したローラーボトルをローラーボトル回転培養機で転回させながら、37℃で6−8日間培養した後、細胞を含む培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を0.22μmフィルターによりろ過した。
固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法(ELISA)による取得抗体の特異性の評価
取得した抗体のヒトBMP9への特異性を確かめるため、ヒトBMP9及びヒトBMP9とホモロジーが最も高い分子であるヒトBMP10への結合性を比較する実験を行った。まず、96ウェルのELISA用プレート(F96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社製、Cat#442404)に、ヒトmature2量体BMP9組換えタンパク質(R&Dシステムズ社製、Cat#3209−BP)、又はヒトmature2量体BMP10組換えタンパク質(R&Dシステムズ社製Cat#2926−BP)を、50mmol/L NaHCO3緩衝液(Wako社製、Cat#191−01305)で100ng/mLに調製したものを50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩静置して吸着させた。
取得抗体のヒトBMP9組換えタンパク質に対する結合性の評価
取得された抗ヒトBMP9抗体のヒトBMP9への結合活性を測定するために、以下の実験を行った。
ヒトBMP9とR&D抗体の結合に対する取得抗体の作用
実施例7で用いた系の特徴より、取得抗体はhsALK1−Fcとヒトmature2量体BMP9組換えタンパク質の相互作用、もしくはヒトmature2量体BMP9組換えタンパク質とR&D抗体の相互作用のいずれかを阻害する抗体であると考えられる。そこで、まず、ヒトBMP9とR&D抗体の結合アッセイ系を構築した。
ヒトBMP9とヒトALK1の結合に対する取得抗体の作用
次に、ヒトBMP9とヒトALK1の結合アッセイ系を構築した。
96ウェルのELISA用プレート(F96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社製、Cat#439454)に、実施例7−1で調製したヒトBMP9組換えタンパク質を50mmol/L NaHCO3緩衝液で100ng/mLに希釈したものを100μL/ウェルで分注し、室温で1時間静置して吸着させた。
ヒトBMP9とヒトBMPRIIの結合に対する取得抗体の作用
BMP9の受容体はBMPタイプI受容体とBMPタイプII受容体から構成され、BMP9はそれら両方のタイプの受容体に結合することが知られている。実施例11から、10D5−2−3抗体、6D10−1−1抗体及びR&D抗体は、ヒトBMP9とヒトALK1の結合を阻害しないことが明らかとなり、これらの抗体は、BMP9とBMPタイプI受容体の結合を阻害しないことが示唆された。
取得抗体のヒトBMP9組換えタンパク質に対する結合活性(ビアコア解析)
取得抗体のヒトBMP9組換えタンパク質に対する結合活性(アフィニティー)をBIAcore 2000(GE Healthcare社製)を用いて検討した。Mouse Antibody Capture Kit(GE Healthcare社製)を用いて、抗マウスIgG抗体をセンサーチップCM5上に固定化した後、抗ヒトBMP9抗体をRU値として700−1100になるように結合させた。
正常Balb/cマウスの赤血球造血に対する取得抗体の作用(短期投与)
実施例9で明らかとなったように、6D10−1−1抗体及び10D5−2−3抗体は、ヒトBMP9 mature2量体に結合する抗体である。配列番号67で表される、ヒトBMP9のmature領域110アミノ酸のうち、マウスBMP9は106アミノ酸、ラットBMP9は104アミノ酸が完全一致することから、BMP9は種間の保存性が非常に高いことが知られている。従って、これらの抗体は、げっ歯類のBMP9にヒトBMP9と同様に結合することが推測される。
正常BALB/cマウス赤血球造血に対する取得抗体の作用(長期投与)
BALB/cマウスを用いて、6D10−1−1体及び10D5−2−3抗体の赤血球造血に対する長期投与の効果を検討した。6週齢の雄性BALB/cマウス(日本チャールズリバー社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR−2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。
種々のマウス系統の赤血球造血に対する抗ヒトBMP9抗体の作用
BALB/c以外の系統のマウスを用いて、10D5−2−3抗体の赤血球造血に対する作用を検討した。BALB/c以外の系統として、CBA/J及びICRマウスを用いた。いずれも7週齢の雄性マウス(日本チャールズリバー社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR−2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。
正常ラットの赤血球造血に対する取得抗体の作用
Wistarラットを用いて、6D10−1−1抗体及び10D5−2−3抗体のラットの赤血球造血に対する作用を評価した。5週齢の雄性Wistarラット(日本クレア社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR−2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。
腎不全ラットの貧血に対する抗ヒトBMP9抗体の作用
Wistarラットに5/6腎摘手術を施した腎不全ラットを用いて、6D10−1−1抗体及び10D5−2−3抗体の腎性貧血に対する作用を検討した。5週齢の雄性Wistarラット(日本クレア社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR−2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。
抗ヒトBMP9モノクローナル抗体のVH及びVLをコードする遺伝子配列の単離
19−1)抗ヒトBMP9モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総RNAの調製
実施例7に記載の6D10−1−1抗体、10D5−2−3抗体及び3B7−3−3抗体を産生するハイブリドーマ 1×106個より、RNAeasy Mini Kit(QIAGEN社製、Cat#74104)及びQIA shredder(QIAGEN社製、Cat#79654)を用いて、総RNAを調製した。
19−2)抗ヒトBMP9モノクローナル抗体のVH及びVLの遺伝子クローニング
実施例19−2で得られた6D10−1−1抗体、10D5−2−3抗体、3B7−3−3抗体のVHの全塩基配列を配列番号30、31、32に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVHの全アミノ酸配列を配列番号33、34、35に、VLの全塩基配列を配列番号36、37、38に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだVLの全アミノ酸配列を配列番号39、40、41にそれぞれ示す。
取得抗体のエピトープ解析
20−1)取得抗体の組換え発現
6D10−1−1、10D5−2−3抗体の軽鎖、重鎖可変領域(シグナル配列含む)の塩基配列を、それぞれマウス軽鎖(κ鎖)、重鎖(IgG1)定常領域の塩基配列と結合させ、抗体発現用のベクターにサブクローニングした。BMP9抗体の可変領域部分の塩基配列の増幅には、実施例19にて作製したプラスミドを鋳型として、それぞれ配列番号72〜79で示される塩基配列からなるプライマーを用いてPCRを行った。
ヒトBMP9 mature領域のうち、配列番号86で表されるアミノ酸配列をヒトBMP9領域C、ヒトBMP10 mature領域のうち、配列番号139で表されるアミノ酸配列をヒトBMP10領域Cと定義する。
キメラタンパク質を用いて、取得抗体の固相抗原ELISAを行った。実施例20−2で調製したヒトBMP9、BMP10、BMP9/10キメラ組換えタンパク質を50mmol/L NaHCO3緩衝液で3μg/mLに調製し、96ウェルのELISA用プレート(F96 MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社製、Cat#442404)に50μL/ウェル加えて4℃で一晩静置して吸着させた。
BMP9と取得複合体のBMP10シグナル阻害作用
実施例11、12の結果より、10D5−2−3抗体、6D10−1−1抗体は、ともに、ヒトBMP9とヒトALK1との結合は阻害せず、ヒトBMP9とヒトBMPRIIとの結合を特異的に阻害する抗体であることが判明した。
ヒトALK1発現レポーター細胞は、国際公開第2010/126169号の実施例2に記載のBMPシグナル検出株[p(GCCG)12−Luc/HepG2(38.5)]に全長ヒトALK1遺伝子を強制発現させることにより[ALK1/p(GCCG)12−Luc/HepG2(38.5)]、作製した。
上記の方法により作出したヒトALK1レポーター細胞株[ALK1/p(GCCG)12−Luc/HepG2(38.5)]を1μg/mLのhsALK1−Fcを含むDMEM増殖培地[FCSを10%になるように添加したDMEM(Invitrogen社製)]に懸濁し、1.5×104個/ウェルになるように96ウェル白色プレート(パーキンエルマー社製)に播種した。
10D5−2−3キメラ抗体(c10D5−2−3抗体)及びヒト化抗体の作製
22−1)10D5−2−3ヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
10D5−2−3ヒト化抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。10D5−2−3VHのCDR1〜3のアミノ酸配列(配列番号60、61及び62)の移植に適したヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするDNAは、10D5−2−3抗体VHおよび10D5−2−3抗体VLのアミノ酸配列をコードするDNA(それぞれ配列番号31、37)で用いられているコドンを利用して設計し、アミノ酸改変を行う場合には、哺乳動物細胞で高頻度に使用されるコドンを用いて設計し、各々作製した。これらDNA配列を用いて、抗体発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現を行った。
配列番号49で示される10D5−2−3抗体のVH、および実施例22−1)で設計した10D5−2−3抗体ヒト化抗体のVHのアミノ酸配列HV0(配列番号116)、および実施例22−1)の方法により設計したHV3、HV4a、HV4b、HV7a、HV7b、HV9をコードするcDNAを全合成にて作成した。
配列番号52で示される10D5−2−3抗体のVL、および実施例22−1)で設計した10D5−2−3抗体ヒト化抗体のVLのアミノ酸配列LV0(配列番号118)、および実施例22−1)の方法により設計したLV2、LV3、LV4、LV6をコードするcDNAを全合成にて作成した。
国際公開第97/10354号に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の適当な位置に10D5−2−3抗体のVH、実施例22−3)で得られたHV0、HV3、HV4a、HV4b、HV7a、HV7b、HV9のいずれかをコードするcDNA、および10D5−2−3抗体のVL、実施例22−4)で得られたLV0、LV2、LV3、LV4、LV6のいずれかをコードするcDNAを挿入し、各種10D5−2−3抗体ヒト化抗体発現ベクターを構築した。
実施例22−5)にて構築した動物細胞用の抗体発現ベクターの遺伝子導入は、CHO−S細胞株(invitrogen社製)を用いた。
0.8cm径のカラムにMabSelect SuRe(GE Healthcare社製)0.5mLを充填し、精製水3.0mL、0.1Mクエン酸緩衝液(pH 3.5)2.0mL、および150mM NaCl,0.2Mホウ酸ナトリウム酸緩衝液(pH 7.5)1.5mLを順次通塔し、担体の平衡化を行った。
抗BMP9ヒト化抗体の活性評価
23−1)ビアコアによるc10D5−2−3抗体およびヒト化抗体のヒトBMP9蛋白質への結合活性評価
実施例22−7で得られたc10D5−2−3抗体および22種類の10D5−2−3抗体ヒト化抗体のヒトBMP9に対する反応性を比較することを目的とし、ヒトBMP9組換え蛋白質(R&D systems社)に対する結合活性を、表面プラズモン共鳴法(SPR法)によるBiacoreT100(GE ヘルスケアバイオサイエンス社製)を用いて測定した。
正常BALB/cマウスの赤血球造血に対する10D5−2−3抗体ヒト化抗体の作用
次に10D5−2−3抗体ヒト化抗体に実際に赤血球増加作用が保持されているか、BALB/cマウスを用いて4種類のヒト化抗体(HV9LV2,HV9LV3,HV7aLV2,HV7bLV2)の赤血球造血に対する作用を評価した。7週齢の雄性BALB/cマウス(日本チャールズリバー社製)を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料FR−2(フナバシファーム社製)を自由摂取で与えた。
配列番号2:LinkA2の塩基配列
配列番号3:LinkB1の塩基配列
配列番号4:LinkB2の塩基配列
配列番号5:Bmp9KOClaI−3’Fwの塩基配列
配列番号6:Bmp9KOAscI−3’Rvの塩基配列
配列番号7:Bmp9KOPacI−5’Fwの塩基配列
配列番号8:Bmp9KOFseI−5’Rvの塩基配列
配列番号9:Bmp9KO5’probe FW2の塩基配列
配列番号10:Bmp9KO5’probe RV2の塩基配列
配列番号11:Bmp9KO3’probe FW2の塩基配列
配列番号12:Bmp9KO3’probe RV2の塩基配列
配列番号13:mBMP9_FW5915の塩基配列
配列番号14:mBMP9_RV17165の塩基配列
配列番号15:mBMP9_FW1の塩基配列
配列番号16:mBMP9_RV1の塩基配列
配列番号17:マウスIgG1に特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号18:マウスIgG1に特異的なプライマーRV2の塩基配列
配列番号19:マウスIgG2aに特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号20:マウスIgG2aに特異的なプライマーRV2の塩基配列
配列番号21:マウスIgG2bに特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号22:マウスIgG2bに特異的なプライマーRV2の塩基配列
配列番号23:マウスIgG2cに特異的なプライマーRVの塩基配列
配列番号24:マウスIgG3に特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号25:マウスIgG3に特異的なプライマーRV2の塩基配列
配列番号26:マウスIg(κ)特異的プライマーRV1の塩基配列
配列番号27:マウスIg(κ)特異的プライマーRV2の塩基配列
配列番号28:マウスIg(λ)特異的なプライマーRV1の塩基配列
配列番号29:マウスIg(λ)特異的なプライマーRV2の塩基配列
配列番号30:6D10−1−1抗体のVH全塩基配列
配列番号31:10D5−2−3抗体のVH全塩基配列
配列番号32:3B7−3−3抗体のVH全塩基配列
配列番号33:6D10−1−1抗体のVH全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号34:10D5−2−3抗体のVH全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号35:3B7−3−3抗体のVH全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号36:6D10−1−1抗体のVL全塩基配列
配列番号37:10D5−2−3抗体のVL全塩基配列
配列番号38:3B7−3−3抗体のVL全塩基配列
配列番号39:6D10−1−1抗体のVL全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号40:10D5−2−3抗体のVL全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号41:3B7−3−3抗体のVL全アミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号42:6D10−1−1抗体のVH塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号43:10D5−2−3抗体のVH塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号44:3B7−3−3抗体のVH塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号45:6D10−1−1抗体のVL塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号46:10D5−2−3抗体のVL塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号47:3B7−3−3抗体のVL塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号48:6D10−1−1抗体のVHアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号49:10D5−2−3抗体のVHアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号50:3B7−3−3抗体のVHアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号51:6D10−1−1抗体のVLアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号52:10D5−2−3抗体のVLアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号53:3B7−3−3抗体のVLアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号54:6D10−1−1抗体VHのCDR1アミノ酸配列
配列番号55:6D10−1−1抗体VHのCDR2アミノ酸配列
配列番号56:6D10−1−1抗体VHのCDR3アミノ酸配列
配列番号57:6D10−1−1抗体VLのCDR1アミノ酸配列
配列番号58:6D10−1−1抗体VLのCDR2アミノ酸配列
配列番号59:6D10−1−1抗体VLのCDR3アミノ酸配列
配列番号60:10D5−2−3抗体VHのCDR1アミノ酸配列
配列番号61:10D5−2−3抗体VHのCDR2アミノ酸配列
配列番号62:10D5−2−3抗体VHのCDR3アミノ酸配列
配列番号63:10D5−2−3抗体VLのCDR1アミノ酸配列
配列番号64:10D5−2−3抗体VLのCDR2アミノ酸配列
配列番号65:10D5−2−3抗体VLのCDR3アミノ酸配列
配列番号66:ヒトBMP9蛋白質のアミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号67:ヒトBMP9 mature領域のアミノ酸配列
配列番号68:ヒトBMP9蛋白質をコードする塩基配列(シグナル配列含む)
配列番号69:ヒトBMP9 mature領域をコードする塩基配列
配列番号70:ヒトBMPRIIのアミノ酸配列
配列番号71:ヒトALK1のアミノ酸配列
配列番号72:6D10−1−1抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号73:6D10−1−1抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号74:6D10−1−1抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号75:6D10−1−1抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号76:10D5−2−3抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号77:10D5−2−3抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号78:10D5−2−3抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号79:10D5−2−3抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号80:マウス軽鎖(κ鎖)定常領域の鋳型とした塩基配列
配列番号81:マウス重鎖(IgG1)定常領域の鋳型とした塩基配列
配列番号82:マウス軽鎖(κ鎖)定常領域の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号83:マウス軽鎖(κ鎖)定常領域の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号84:マウス重鎖(IgG1)定常領域の増幅に用いたプライマーFwdの塩基配列
配列番号85:マウス重鎖(IgG1)定常領域の増幅に用いたプライマーRvの塩基配列
配列番号86:ヒトBMP9領域Cのアミノ酸配列
配列番号87:ヒトBMP9/BMP10キメラタンパク質1の領域Cのアミノ酸配列
配列番号88:ヒトBMP9/BMP10キメラタンパク質2の領域Cのアミノ酸配列
配列番号89:ヒトBMP9/BMP10キメラタンパク質3の領域Cのアミノ酸配列
配列番号90:ヒトBMP9/BMP10キメラタンパク質4の領域Cのアミノ酸配列
配列番号91:ヒトBMP9/BMP10キメラタンパク質5の領域Cのアミノ酸配列
配列番号92:キメラタンパク質作製用プライマー1の塩基配列
配列番号93:キメラタンパク質作製用プライマー2の塩基配列
配列番号94:キメラタンパク質作製用プライマー3の塩基配列
配列番号95:キメラタンパク質作製用プライマー4の塩基配列
配列番号96:キメラタンパク質作製用プライマー5の塩基配列
配列番号97:キメラタンパク質作製用プライマー6の塩基配列
配列番号98:キメラタンパク質作製用プライマー7の塩基配列
配列番号99:キメラタンパク質作製用プライマー8の塩基配列
配列番号100:キメラタンパク質作製用プライマー9の塩基配列
配列番号101:キメラタンパク質作製用プライマー10の塩基配列
配列番号102:ヒトBMP10クロニーニング用プライマーFwd−1の塩基配列
配列番号103:ヒトBMP10クロニーニング用プライマーRv−1の塩基配列
配列番号104:ヒトBMP10クロニーニング用プライマーFwd−2の塩基配列
配列番号105:ヒトBMP10クロニーニング用プライマーRv−2の塩基配列
配列番号106:ヒトBMP10蛋白質のアミノ酸配列(シグナル配列を含む)
配列番号107:ヒトBMP10 mature領域のアミノ酸配列
配列番号108:ヒトBMP10蛋白質をコードする塩基配列(シグナル配列含む)
配列番号109:ヒトBMP10 mature領域をコードする塩基配列
配列番号110:pLN1V5_ヒトBMP10ベクターによって発現されるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号111:pLN1V5_ヒトBMP10ベクターにより発現されるアミノ酸をコードする塩基配列
配列番号112:ヒトALK1の全長cDNA
配列番号113:hALK1 FPNの塩基配列
配列番号114:hALK1 RP配列番号115:ヒト化抗体改変体VH(HV0)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号116:ヒト化抗体改変体VH(HV0)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号117:ヒト化抗体改変体VL(LV0)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号118:ヒト化抗体改変体VL(LV0)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号119:ヒト化抗体改変体VH(HV3)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号120:ヒト化抗体改変体VH(HV3)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号121:ヒト化抗体改変体VH(HV4a)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号122:ヒト化抗体改変体VH(HV4a)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号123:ヒト化抗体改変体VH(HV4b)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号124:ヒト化抗体改変体VH(HV4b)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号125:ヒト化抗体改変体VH(HV7a)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号126:ヒト化抗体改変体VH(HV7a)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号127:ヒト化抗体改変体VH(HV7b)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号128:ヒト化抗体改変体VH(HV7b)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号129:ヒト化抗体改変体VH(HV9)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号130:ヒト化抗体改変体VH(HV9)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号131:ヒト化抗体改変体VL(LV2)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号132:ヒト化抗体改変体VL(LV2)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号133:ヒト化抗体改変体VL(LV3)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号134:ヒト化抗体改変体VL(LV3)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号135:ヒト化抗体改変体VL(LV4)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号136:ヒト化抗体改変体VL(LV4)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号137:ヒト化抗体改変体VL(LV6)の塩基配列(シグナル配列を除く)
配列番号138:ヒト化抗体改変体VL(LV6)のアミノ酸配列(シグナル配列を除く)
配列番号139:ヒトBMP10領域Cのアミノ酸配列
Claims (12)
- ヒトBMP9に結合する、以下の(c)のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
(c)配列番号128で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号132で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体及び抗体断片。 - 前記(c)のモノクローナル抗体又は該抗体断片であり、且つ配列番号67で表されるヒトBMP9 mature領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、87番目Lys、89番目Asp、90番目Met、及び93番目Proに結合する、請求項1に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
- 遺伝子組換え抗体である、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
- ヒト化抗体である、請求項3に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
- Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(diabody)及びジスルフィド安定化V領域(dsFv)から選ばれる抗体断片である請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体断片。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするDNA。
- 請求項6に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
- 請求項8に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
- ヒトBMP9に結合し、かつヒトBMP9とヒトBMPRIIとの結合を阻害するモノクローナル抗体又はヒトBMP9に結合し、かつヒトBMP9とヒトBMPRIIとの結合を阻害する該抗体断片を有効成分として含有する、BMP9が関与する貧血を伴う疾患の治療剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトBMP9の免疫学的検出又は測定方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
US8178488B2 (en) | 2009-06-08 | 2012-05-15 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing thermogenic adipocytes |
KR20190090049A (ko) | 2009-06-12 | 2019-07-31 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 절두된 ActRIIB-FC 융합 단백질 |
IN2012DN02766A (ja) * | 2009-09-09 | 2015-09-18 | Acceleron Pharma Inc | |
ES2658292T3 (es) | 2009-11-17 | 2018-03-09 | Acceleron Pharma, Inc. | Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular |
US20120121576A1 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-17 | Jasbir Seehra | Actriia binding agents and uses thereof |
US9809636B2 (en) * | 2012-04-06 | 2017-11-07 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9 |
CA2890217C (en) | 2012-11-02 | 2021-07-20 | Yifu FANG | Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders |
AU2015274277B2 (en) | 2014-06-13 | 2021-03-18 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods and compositions for treating ulcers |
MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
DK3227675T3 (da) | 2014-12-03 | 2023-05-30 | Celgene Corp | Activin-actrii-antagonister og anvendelser til behandling af myelodysplastisk syndrom |
UY36449A (es) | 2014-12-19 | 2016-07-29 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6 |
US11933786B2 (en) | 2015-03-30 | 2024-03-19 | Stcube, Inc. | Antibodies specific to glycosylated PD-L1 and methods of use thereof |
JP2018518461A (ja) | 2015-04-29 | 2018-07-12 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 進行性骨化性線維異形成症の治療 |
CA2982237A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Novartis Ag | Antibodies targeting bone morphogenetic protein 9 (bmp9) and methods therefor |
CN109152798B (zh) * | 2015-12-02 | 2022-10-21 | 斯特库比股份有限公司 | 特异于糖基化的pd-1的抗体及其使用方法 |
US11434269B2 (en) | 2016-06-15 | 2022-09-06 | Novartis Ag | Methods for treating disease using inhibitors of bone morphogenetic protein 6 (BMP6) |
JP2019528251A (ja) | 2016-07-20 | 2019-10-10 | エスティーキューブ,インコーポレイテッド | グリコシル化pd−l1に結合する抗体の組合せを使用するがんの処置および治療の方法 |
AU2018384239A1 (en) | 2017-12-12 | 2020-07-02 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Anti-BMP10 antibody, and therapeutic agent for hypertension and hypertensive diseases comprising said antibody as active ingredient |
US20230218659A1 (en) * | 2020-05-20 | 2023-07-13 | Hess Pharmaceuticals, Inc. | Selenium-Based Compositions and Therapeutic Methods |
WO2023125289A1 (zh) * | 2021-12-31 | 2023-07-06 | 上海宏成药业有限公司 | 抗pd-1抗体及其用途 |
WO2023233330A1 (en) * | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Pfizer Inc. | Anti-bmp9 antibodies and methods of use thereof |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5623587A (en) | 1979-08-03 | 1981-03-05 | Mitsuwa Seiki Co Ltd | Vane type compressor |
JPS58110600A (ja) | 1981-12-25 | 1983-07-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド |
WO1985003934A1 (en) | 1984-03-06 | 1985-09-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein and process for its preparation |
JPS60221091A (ja) | 1983-12-21 | 1985-11-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プロモ−タ− |
JP2564268B2 (ja) | 1985-08-28 | 1996-12-18 | 協和醗酵工業株式会社 | 融合抗原ポリペプチド |
ZA872705B (en) | 1986-04-22 | 1987-10-05 | Immunex Corporation | Human g-csf protein expression |
JP2958019B2 (ja) | 1988-05-06 | 1999-10-06 | 住友製薬株式会社 | ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 |
JP2928287B2 (ja) | 1988-09-29 | 1999-08-03 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ポリペプチド |
JPH02257891A (ja) | 1989-03-31 | 1990-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 組換え動物細胞による蛋白質の製造 |
JPH0322979A (ja) | 1989-06-19 | 1991-01-31 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規プラスミノーゲン活性化因子 |
JP3131322B2 (ja) | 1991-12-17 | 2001-01-31 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規α2→3シアリルトランスフェラーゼ |
JP3756946B2 (ja) | 1993-03-29 | 2006-03-22 | 協和醗酵工業株式会社 | α1,3−フコシルトランスフェラーゼ |
CA2205007C (en) | 1995-09-11 | 2010-12-14 | Masamichi Koike | Antibody against human interleukin-5 receptor .alpha. chain |
TWI255853B (en) | 1998-08-21 | 2006-06-01 | Kirin Brewery | Method for modifying chromosomes |
CN103333860B (zh) | 2000-10-06 | 2015-07-08 | 协和发酵麒麟株式会社 | 产生抗体组合物的细胞 |
AU2004279742A1 (en) | 2003-10-08 | 2005-04-21 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Fused protein composition |
EP1849863A1 (en) | 2005-01-21 | 2007-10-31 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | Non-human chimeric animal and use thereof |
US8642031B2 (en) * | 2006-11-02 | 2014-02-04 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of BMP9, BMP10, ALK1 and other ALK1 ligands, and uses thereof |
MX2009012934A (es) * | 2007-06-01 | 2009-12-15 | Wyeth Corp | Metodos y composiciones para modular la actividad de bmp-10. |
WO2009084738A1 (ja) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Bmp9タンパク質を用いた癌を治療するための方法および医薬組成物 |
WO2010126169A1 (ja) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 協和発酵キリン株式会社 | Alk1阻害剤を有効成分とする血管障害を抑制するための医薬組成物 |
US20120183543A1 (en) | 2009-05-08 | 2012-07-19 | Novartis Ag | Diagnostic biomarkers for fibrotic disorders |
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