WO2009084738A1 - Bmp9タンパク質を用いた癌を治療するための方法および医薬組成物 - Google Patents

Bmp9タンパク質を用いた癌を治療するための方法および医薬組成物 Download PDF

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WO2009084738A1
WO2009084738A1 PCT/JP2008/073980 JP2008073980W WO2009084738A1 WO 2009084738 A1 WO2009084738 A1 WO 2009084738A1 JP 2008073980 W JP2008073980 W JP 2008073980W WO 2009084738 A1 WO2009084738 A1 WO 2009084738A1
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bmp9
seq
mouse
cancer
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PCT/JP2008/073980
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Kazuma Tomizuka
Kiyoshi Shimizu
Makoto Kakitani
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Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to the use and usage of bone morphogenetic protein 9 (BMP9), a bone morphogenetic protein, as a therapeutic agent for cancer diseases.
  • BMP9 bone morphogenetic protein 9
  • Bone morphogenetic protein Bone development book Tanno Takumi group, TGF—beta-Sunoichi family, has been identified as a molecule with the ability to induce ectopic bone growth and cartilage formation (non-patent literature 1, 2). Recently, BMP family molecules are generally involved in the proliferation, differentiation and apoptosis of various cells, and have been found to be important for tissue and organ morphogenesis (Non-patent Documents 3 and 4).
  • BMP9 which belongs to the BMP family molecule, has been reported to promote hypertrophic chondrocyte formation and differentiation from mesenchymal cells into cartilage (Non-patent Document 5), as well as other BMP family molecules. It has also been reported that hepcidin expression regulation involved in the maintenance of iron ion homeostasis (Non-patent Document 6) and its potential for sugar metabolism (Non-patent Document 7). As for the expression organ, it has been reported that it is mainly expressed in the spinal cord and inter-segmental membrane in the fetal period and in the liver in the adult period (Non-patent Documents 7-9).
  • Non-Patent Document 10 As for the protein structure of BMP9, as in other BMP families, after synthesis as a single-chain precursor protein (pre-pro), the signal peptide region is cleaved and C The cysteine residue present on the terminal side forms a dimer (pro dimer) via a disulfide bond. Then, it is cleaved by furin-like protease into the active substance, C-terminal side (mature dimer) and N-terminal propeptide region without disulfide bond. Two cleaved N-terminal peptide regions form a complex with a single C-terminal mature dimer and a non-covalent bond, and are secreted from the cell in the form of the complex. (Non-Patent Document 10).
  • Non-patent Document 10 a complex with the N-terminal propeptide region bound (complex bodies) are also known to have signal transduction ability.
  • tumor cells need to grow blood vessels with the thickness of very fine hair in order to acquire the necessary oxygen and nutrients and carry out waste products. It is known that it cannot grow to more than l-2mm. This process is called angiogenesis, and inhibition of this process is thought to be important for suppressing tumor growth and metastasis (Non-patent Document 11).
  • the angiogenesis-promoting factors include vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived endothelial cell growth factor (PDECGF), fibroblast growth factor (FGF) ), Tumor lobe death factor a (TNF c, Interleukin 8 (IL-8), Insulin-like growth factor (IGF), etc.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDECGF platelet-derived endothelial cell growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • TNF c Tumor lobe death factor a
  • IL-8 Interleukin 8
  • IGF Insulin-like growth factor
  • Solubilized VEGFR-1, angiotensin II (Angll), MMP inhibitory protein (RECK), etc. have been identified (Non-patent Document 11).
  • VEGF which was discovered in the 1980s, is considered to be the protein that plays the most important role in tumor angiogenesis, and anti-VEGF antibodies with its inhibitory activity have various suppressive effects on tumor growth. It has been clarified using a tumor graft model (Non-patent Document 11). In 2004, anti-VEGF antibody (bevacizumab: trade name apastin) was approved by the US Food and Drug Administration (FDA) as a treatment for advanced colorectal cancer. 11).
  • FDA US Food and Drug Administration
  • SRA FENIB trade name Nexavar
  • Sunitinib trade name Sutent
  • BMP9 may be a ligand of ALK1 that is specifically expressed in vascular endothelium (Non-patent Documents 12-13).
  • ALK1 belongs to the type I receptor group of the TGF-beta superfamily and is considered to be a causative gene of hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) (Non-patent Document 14).
  • HHT hereditary hemorrhagic telangiectasia
  • Non-patent Document 17 In an in vitro test where a constitutively activated mutant of ALK1 was expressed in vascular endothelial cells, it was reported that ALK1 signal acts to suppress cell proliferation. On the other hand (Non-patent Document 17), there is a report that promotes the opposite (Non-Patent Document 18). The reason for the difference is that it was an in vitro test using vascular endothelium of different origin, that is, it was not a test that examined angiogenesis in adults.
  • Patent Document 1 International Publication No. W0 2007/040912 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Urist, M. R., Science, 150, 893-899 (1965)
  • Non-Patent Document 2 Wozney, JM, et al., Science, 242, 1528-1534 (1988)
  • Non-Patent Document 3 Hogan, BL, Curr. Opin. Genet. Dev., 6, 432-438 (1996)
  • Non-Patent Document 4 ten Dijke, P., et al., Mol. Cell Endocrinol., 211, 105-113 (2003) '
  • Non-Patent Document 5 Kang, Q, et al, Gene Ther., 11, 1312-1320 (2004)
  • Non-Patent Document 6 Truksa, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 10289-10293 (2006)
  • Non-patent literature 9 Lopez- Coviel la, I., J. Physiology-Paris, 96, 53-59 (2002) Non-patent literature 1 0 Brown, MA, et al., J. Biol. Chem., 280, 26 ,
  • Non-Patent Document 1 1 Molecular Biology of Cancer and Angiogenesis, Nanzando (2006)
  • Non-Patent Literature 1 2 David, L., et al., Blood, 109, 1953-1961 (2007)
  • Non-Patent Literature 1 3 Scharpfenecker, M., et al., J. Cell Sic., 120,
  • Non-Patent Literature 1 4 Johnson, D. W., et al., Nat. Genet., 13, 189-195 (1996) Non-Patent Literature 1 5 Oh, S. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97,
  • Non Patent Literature 1 6 Urness, LD, et al., At. Genet., 26, 328-331 (2000)
  • Non-patent literature 1 8 Goumans MJ., Et al., EMB0, 21, 1743—1753 (2002)
  • BMP9 has a growth inhibitory activity against tumor cells of solid cancer.
  • the present inventor created a mouse overexpressing BMP9, and found that BMP9 overexpression causes blood to accumulate in the abdominal cavity and thoracic cavity and causes redness due to blood leakage in lymph nodes. Furthermore, analysis using dyes confirmed that overexpression of BMP9 can enhance vascular permeability. Based on the above findings, the hypothesis that the action point of BMP9 is in blood vessels was examined for the inhibitory effect of BMP9 on the proliferation of human umbilical cord blood vein endothelial cells (HUVEC). The effect could not be confirmed. However, when BMP9 protein was administered to a tumor graft model transplanted with a human tumor line, it was surprisingly found that tumor growth could be significantly suppressed.
  • HUVEC human umbilical cord blood vein endothelial cells
  • BMP9 protein was administered to a tumor graft model in which a human tumor line was transplanted in combination with an anti-VEGF antibody as a VEGF inhibitor, it was found that tumor growth could be significantly suppressed.
  • angiogenesis inhibition therapy using anti-VEGF therapy is being established as a cancer treatment method, its effect is only slightly suppressed and sufficient treatment satisfaction has not been obtained, so further improvement in treatment results has been achieved. Is required. From the standpoint of the anti-angiogenic effect of anti-VEGF therapy, the effect of anti-VEGF inhibition in humans is significantly weaker than that in rodents, and tumor growth occurs even under anti-VEGF therapy This indicates that angiogenesis is only partially suppressed. In combination with BMP9 in anti-VEGF therapy, it may be useful as part of the further enhancement of angiogenesis inhibition therapy to improve the outcome of cancer treatment.
  • an antitumor agent containing BMP9 as an active ingredient can be provided as a new antitumor agent, and has completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer comprising at least one of the following (a) to (c):
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer according to [1] or [2].
  • FIG. 1 shows the structure of the pPSs mBMP9 vector.
  • enhancer 5 'enhancer region of mouse Ig f
  • PS promotei- mouse Ig ⁇ promoter region PS
  • signal peptide mouse Ig rc signal peptide coding region downstream of PS promoter
  • Intron mouse Ig ⁇ signal peptide coding region Intron region
  • mBMP9 (_SP) mouse BMP9 gene without a unique signal peptide coding region
  • ⁇ polyA mouse Ig ⁇ polyA signal region
  • 3 'enhancer 3' enhancer region of mouse Ig ⁇
  • Amp ampicillin resistance gene.
  • FIG. 2 shows the structure of the pUS mBMP9 KI vector in which the mouse BMP9 gene was inserted into the cloning site.
  • PS promoter Mouse Ig K promoter region
  • PS, Signal peptide cording region A region composed of the human promoter Ig / knanoreeptide coding region and the intron region sandwiched between the mouse Ig K signal peptide coding region.
  • MBMP9 (_SP): mouse BMP9 gene without unique signal peptide coding region
  • CK mouse Ig / c gene constant region
  • Total CK polyA mouse Ig K polyA signal region consisting of 436 bp downstream of C / c stop codon
  • C / c polyA Partial: Mouse Ig kappa polyA signal region consisting of 309 bp downstream of C kappa stop codon
  • loxPV-Puro Partial mutation sequence of ⁇ sequence A piuromycin resistance gene having loxPV sequences at both ends
  • DT-A Diphtheria toxin A chain gene
  • pBluescript Cloning vector.
  • Figure 3 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), mouse BMP9 (-SP) + drug resistance gene (loxpv-puro) force pUSmBMP9 Targeted allele structure using the KI vector, drug resistance It is a figure which shows the position of the probe for an allele structure and a Southern analysis from which the gene (loxp-neo, loxpv-puro) was removed.
  • mBMP9 (-SP): Mouse BMP9 gene without unique signal peptide coding region, CK: Mouse Ig fc gene constant region, loxpv-puro: Puro with a loxPV sequence at both ends, which is a partial mutant sequence of ⁇ sequence Loxp-neo: neomycin resistance gene with ⁇ ⁇ ⁇ sequences at both ends, Ck3, probe: mBMP9 (-SP) + loxpv-puro gene introduction and loxpv-puro gene removal clone selection Southern analysis Probe, 3, ⁇ -probe: Southern analysis probe for selection of clones from which the loxp-neo gene was introduced, E: EcoRI restriction enzyme site.
  • FIG. 4 shows the structure of an N-terminal His-tagged mBMP9 complex recombinant expression vector.
  • Kozak Kozak sequence
  • SP mouse BMP9 specific signal sequence
  • His-tag His-tag
  • FIG. 5 is a diagram showing an SDS-PAGE electrophoresis image of silver-stained purified N-terminal His-type mBMP9 complex.
  • FIG. 6 shows the effect of N-terminal His-type raBMP9 complex on HUVEC cell proliferation.
  • FIG. 7 shows the antitumor effect of N-terminal His-type ffiBMP9 complex on human lung cancer (LC-6) tumor model.
  • FIG. 8 is a graph showing the antitumor effect of N-terminal His-type mBMP9 complex on human knee cancer (BXPC3) tumor model.
  • FIG. 9 shows the structure of the pPSs hBMP9 vector.
  • 5 'enhancer Mouse Ig ⁇ 5, enhancer region
  • PS promoter Mouse Ig ⁇ promoter region
  • signal peptide Mouse Ig ⁇ signal peptide coding region downstream of PS promoter
  • Intron Mouse Ig ⁇ signal peptide coding region
  • hBMP9 (-SP) human BMP9 gene without unique signal peptide coding region
  • ⁇ polyA mouse Ig ⁇ polyA signal region
  • enhancer 3 enhancer region of mouse Ig ⁇
  • Amp Ampicillin resistance gene.
  • FIG. 10 shows the structure of the pUShBMP9 KI vector in which the human BMP9 gene was inserted into the cloning site.
  • PS promoter Mouse Ig ⁇ promoter region PS, Signal pept ide cording region ⁇ "A region composed of a mouse Ig ⁇ signal peptide coding region downstream of the PS promoter and an intron region sandwiched between the mouse Ig K signal peptide coding region , HBMP9 (-SP): human BMP9 gene without unique signal peptide coding region, C / c: mouse Ig K gene constant region, Total C / c polyA: mouse Ig / polyA consisting of 436 bp downstream of CK stop codon Signal region, C kappa polyA Partial: Mouse Ig kappa polyA signal region consisting of 309 bp downstream of C kappa stop codon, loxPV-Puro: A part of ⁇ sequence A piuromycin resistance gene having loxPV sequences at both
  • FIG. 4 is a diagram showing the allele structure targeted and the allele structure from which drug resistance genes (loxp-neo, loxpv-puro) have been removed and the position of the probe for Southern analysis.
  • hBMP9 human BMP9 gene without unique signal peptide coding region
  • C ⁇ mouse Ig / gene constant region
  • loxpv-puro loxPV sequence which is a partial mutant sequence of ⁇ sequence at both ends Puromycin resistance gene
  • loxp-neo neomycin resistance gene with ⁇ sequence at both ends
  • Ck3 probe: hBMP9 (-SP) + loxpv-puro gene introduction and loxpv-puro gene removal clone analysis
  • Probe, 3 'pro-probe Southern analysis probe for selecting clones from which the loxp-neo gene was introduced
  • E EcoRI restriction enzyme site.
  • Fig. 12 shows the structure of an N-terminal His-tagged hBMP9 complex recombinant expression vector.
  • Kozak Kozak sequence
  • SP signal sequence specific to human BMP9
  • His-tag Hi s 6 tag sequence
  • mBMP (-SP) human BMP9 gene without specific signal peptide coding region
  • SV40 polyA SV40-derived polyA signal region
  • 5 'neo 5' region of the neo H live gene
  • pLNlV5 A vector in which the V5 tag sequence is inserted into the pLNl vector.
  • Figure 13 shows an SDS-PAGE electrophoresis image of the N-terminal His-type hBMP9 complex purified sample by CBB staining.
  • Figure 14 shows the antitumor effect of N-terminal His-type hBMP9 in combination with a neutralizing antibody against DCI type I receptor (DC101) against human glioma (U87MG) tumor model.
  • DC101 DCI type I receptor
  • U87MG human glioma
  • the present invention provides a therapeutic and / or preventive cancer comprising, as an active ingredient, any one of a BMP9 protein, a nucleic acid encoding a BMP9 protein, an expression vector containing a nucleic acid encoding a BMP9 protein, or a combination thereof.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • BMP9 used in the present invention is publicly known and isolated from human, mouse, Sekigyake, etc., and its sequence information is disclosed. Sequence information of human or mouse BMP9
  • human BMP9 is registered in GenBank as accession numbers Q9UK05, AAD56960, etc.
  • mouse BMP9 is registered as accession numbers Q9WV56, NP-062379, etc., and these can be used.
  • the BMP9 protein or the nucleic acid encoding it is not particularly limited, but it is preferably derived from human or mouse.
  • the introduced and / or expressed genes and proteins are derived from humans. It is preferable.
  • a pharmaceutical for treating and / or preventing cancer comprising as an active ingredient any one of the BMP9 protein, the nucleic acid encoding the BMP9 protein, the expression vector containing the nucleic acid encoding the BMP9 protein, or a combination thereof.
  • the composition includes a BMP9 protein or functional fragment thereof.
  • the BMP9 protein a BMP9 protein having a known amino acid sequence registered in GenBank or the like can be used.
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 (mouse BMP9) or SEQ ID NO: 18 (human BMP9) is used.
  • a BMP9 protein having the sequence, particularly preferably a BMP9 protein having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 is used.
  • the sequences represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 18 include a signal sequence and a pro-region, and the pharmaceutical composition of the present invention includes at least a mature part excluding the signal sequence and the pro-region. It only has to be done.
  • the 3 1 9th to 4 2 8th sequences correspond to mature parts
  • the 3 20th to 4 2 9th sequences correspond to mature parts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a protein comprising a sequence comprising at least the 3 19th to 4 2 8th sequences of SEQ ID NO: 4, and at least 3 20th to 4 2 9 of SEQ ID NO: 18 Contains a protein consisting of a sequence containing the second sequence.
  • the protein includes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 18, at least 3 1 9th to 4 2 8th of SEQ ID NO: 4, or at least 3 20th to 4 2 9th of SEQ ID NO: 1
  • proteins having one to several amino acid deletions, substitutions, additions or insertions in the amino acid sequence having the sequence shown in the sequence, and having an activity of inhibiting cancer growth are not particularly limited. 20 or more, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, or 1 or 2.
  • Such proteins include, for example, orthologs of mammalian species different from mice.
  • the protein may be in the form of a fusion protein in which a labeled peptide is bound to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide.
  • Representative labeling peptides include histidine repeats of 6 to 10 residues (His tag), FLAG, myc peptide, GFP polypeptide, etc., but the labeling peptide is not limited to these.
  • the protein can be produced and purified using genetic engineering techniques, as is well known to those skilled in the art. That is, it is possible to incorporate DNA encoding the protein or a fragment thereof into an appropriate vector, introduce the vector into an appropriate host cell, and express the protein.
  • the host cell known cells such as E. coli, yeast, SF9, SF21, C0S1, C0S7, CH0, HEK293 can be used.
  • the expressed protein is extracted from the culture supernatant of the host cell by known methods used for protein purification, such as ammonium sulfate precipitation, precipitation separation with organic solvents (ethanol, methanol, acetone, etc.), ion exchange chromatography, isoelectricity, etc.
  • the functional fragment of BMP9 protein that can be contained in a pharmaceutical composition means a part of BMP9 protein that retains the activity of inhibiting the growth of cancer of BMP9 protein.
  • the active ingredient is any one of the BMP9 protein of the present invention, the nucleic acid encoding the BMP9 protein, the expression vector containing the nucleic acid encoding the BMP9 protein, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition include a pharmaceutical composition for gene therapy.
  • the pharmaceutical composition for gene therapy comprises a nucleic acid encoding BMP9, an expression vector containing a nucleic acid encoding BMP9, and BMP9 Any of the transformants containing the nucleic acid or BMP9 protein, or a combination thereof.
  • Nucleic acids encoding BMP9 contained in the pharmaceutical composition include mRNA and DNA, including fragments thereof. These nucleic acids can be transcribed and translated in the introduced target cells to express the BMP9 protein or a fragment thereof.
  • the mRNA can be prepared using genetic engineering techniques, as is well known to those skilled in the art. For example, it can be synthesized in vitro by chemical synthesis or a transcription system using a promoter and RNA polymerase.
  • DNA DNA having a known nucleotide sequence registered in the above GenBank or the like can be used, but it has the sequences shown in SEQ ID NO: 3 (mouse BMP9) and SEQ ID NO: 17 (human BMP9). DNA is preferred, and in particular, DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 17 is preferred.
  • the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 17 include a signal sequence, pro-region, and the pharmaceutical composition of the present invention includes at least a mature part excluding the signal sequence and pro-region.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises DNA consisting of a sequence comprising at least the 95 5th to 1 2 8 7th sequence of SEQ ID NO: 3, and from at least the 9 5 8th of SEQ ID NO: 17 1 2 90 Contains DNA consisting of a sequence containing the 0th sequence.
  • the DNA includes SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1 7, at least 9 5th to 1 2 8 7th of SEQ ID NO: 3, or at least 9 5 of SEQ ID NO: 1 8 to 1 2 9
  • DNA having the sequence shown in the 0th sequence there is also a DNA encoding a protein having a deletion, substitution, addition or insertion of 1 to several nucleotides and having an activity of inhibiting cancer growth included.
  • the range of “1 to several” is not particularly limited, but for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to Three, or one or two.
  • DNA includes at least SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1 7, SEQ ID NO: 9 5 5th to 1 2 8 7th, or at least 9 5 8th to 1 2 9 0 of SEQ ID NO: 1 7.
  • DNA consisting of a sequence complementary to the DNA consisting of the sequence shown in the second sequence
  • DNAs that encode proteins that hybridize under stringent conditions and have the activity of inhibiting cancer growth refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • the sodium concentration is 10 mM to 300 mM, preferably 20 to 100 mM, and the temperature Is 25 ° C to 70 ° C, preferably 42 ° (: to 55 ° C.
  • DNA includes at least 9 5 5 of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 3.
  • Such DNA includes, for example, DNA encoding an ortholog of a mammalian species different from mouse.
  • the nucleic acid fragment encoding BMP9 contained in the pharmaceutical composition means a nucleic acid encoding a functional fragment having an activity capable of inhibiting the growth of cancer of BMP9 protein.
  • Methods for introducing nucleic acids into a subject include methods using viral vectors and methods using non-viral vectors, and various methods are known (separate volume experimental medicine, basic gene therapy technology, Yodosha, 1996). ; Separate Experiment Medicine, Gene Transfer & Expression Analysis Experiment Method, Yodosha, 1997; edited by Japanese Society of Gene Therapy, Gene Therapy Development Research Handbook, NTS, 1999).
  • Typical viral vectors for gene transfer are methods using viral vectors such as adenovirus, adeno-associated virus, and retrovirus.
  • Genes targeted for DNA viruses or RNA viruses such as detoxified lettovirus, herpesvirus, Waxua Winores, box virus, Poliowinores, Shinbisuinores, Sendai virus, SV40, immunodeficiency virus (HIV) It is possible to introduce a gene into a cell by infecting the cell with a recombinant virus.
  • the expression vector can be appropriately expressed using genetic engineering techniques well known to those skilled in the art. It can be prepared by inserting a DNA encoding BMP9 or a fragment thereof into a vector in such a manner that it can function with a promoter and Z or other regulatory sequences. “Functionally linked and inserted” means that BMP9 protein is expressed under the control of a promoter and other regulatory sequences in a cell into which the expression vector has been introduced. It means that a promoter and / or other control sequences are combined and incorporated into a vector.
  • the nucleic acid can be once introduced into an appropriate host cell using the above method, and the transformant can be transplanted into a subject.
  • the origin of the host cell may be any of auto, allo, and xeno. However, when the present invention is applied to human therapy, preferably it is autologous or allogeneic. It is derived from the system, and most preferably it is a cell derived from itself. Heterogeneous sources include butterflies and other mammals.
  • the pharmaceutical composition used for the above gene therapy can deliver BMP9 to a subject by various administration methods used in the field of gene therapy. It force s is such gene therapy is effective, for example, hepatocyte growth factor (HGF;. Dai et, J. Am So Nephrol.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • EPO erythropoietin
  • a nucleic acid or an expression vector may be directly administered to a subject (in Vivo method), or introduced into a cell collected from the subject, and a transformed cell that expresses the target BMP9 is selected. The cells may then be administered to the subject (ex V i V o method).
  • Gene delivery mechanisms that can be used to administer the expression vector to the tissue or cell of interest include colloidal dispersion systems, liposome induction systems, artificial virus envelopes, and the like.
  • the delivery system can utilize macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, ribosomes, and the like.
  • Direct administration of the nucleic acid or expression vector can be performed, for example, by intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.
  • cell introduction (transformation) of an expression vector can be performed by using a general gene introduction method such as a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, an electoporation method, or a ribofusion method.
  • the amount of nucleic acid, expression vector or transformant used depends on the route of administration, the number of administrations, although it depends on the type of specimen, it can be determined as appropriate using a conventional method in this technical field.
  • Solid cancer is mentioned as cancer which can be treated using the pharmaceutical composition of this invention.
  • Solid cancer means tumor cells that grow as multicellular mass supported by blood vessels, such as oral cancer, colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, brain tumor, melanoma, renal cell cancer, stomach cancer, Knee cancer, uterine cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, liver cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, skin cancer, bladder cancer, urinary tract cancer, prostate cancer, choriocarcinoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer , Meningiomas, male embryos, endometrial hyperplasia, eclampsia, embryonal tumor, fibrosarcoma, force positive sarcoma, hemangioma, cavernous hemangioma, hemangioblastoma, retinoblastoma, star Cystocyst, neurofibromatosis, rare
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be directly administered to cancer by injection and / or transplantation, and is administered orally or parenterally (for example, intravenous administration, intraarterial administration, injection) (Local administration, intraperitoneal or thoracic administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, percutaneous absorption or rectal administration, etc.).
  • a transformant when included as a component of the pharmaceutical composition, it is also possible to fill the cells with a suitable carrier such as atelocollagen gel and inject locally.
  • compositions are commonly used excipients, fillers, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, antiseptics. It can be produced by conventional methods using agents, coloring agents, flavoring agents, and stabilizers.
  • Excipients include, for example, lactose, fructose, pudou sugar, corn starch, sorbite and crystalline cellulose, sterilized water, ethanol, glycerol, physiological saline, buffer solution, and disintegrants such as starch, sodium alginate, gelatin, Calcium carbonate, calcium citrate, dextrin, magnesium carbonate, and synthetic magnesium silicate include, for example, methyl cellulose or a salt thereof, ethyl cellulose, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl cellulose and polyvinylpyrrolidone.
  • lubricants examples include talc, magnesium stearate, polyethylene glycol and hydrogenated vegetable oil.
  • stabilizers include amino acids such as arginine, histidine, lysine and methionine, human serum albumin, gelatin, dextran. 40, methylcellulose, sodium sulfite, sodium metasulfite, etc.
  • Other additives include syrup, petrolatum, glycerin, ethanol, propylene glycol Kuen acid, sodium chloride, sodium nitrite and Natoriumu phosphoric acid, respectively.
  • a transformant When a transformant is included as a component of the pharmaceutical composition, known immunosuppressive agents such as cyclosporine, acrolimus hydrate, cyclophosphamide, azathioprine, mizoribine, and methotrexate may be used.
  • immunosuppressive agents such as cyclosporine, acrolimus hydrate, cyclophosphamide, azathioprine, mizoribine, and methotrexate may be used.
  • BMP9 contained in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the patient's age, weight, disease severity, etc., but mRNA, expression vector, and protein are 0. In the case of a transformant, an amount appropriately selected from the range of about 10 2 cells to about 10 9 cells can be included.
  • various delivery methods used in the field of gene therapy can be used for gene delivery to the target tissue or cell of the mRNA and expression vector contained in the pharmaceutical composition.
  • colloid dispersion systems ribosome induction systems, artificial virus envelopes, macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and ribosomes can be used.
  • the calcium phosphate method, DEAE dextran method, calcium chloride Z norevisum method, electoporation method, electoporation injection method, ribofusion method, gene gun method, etc. can also be used. is there.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with a VEGF inhibitor.
  • the VEGF inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the activity of VEGF and can suppress the growth of tumors.
  • anti-VEGF antibody bevacizumab
  • VEGF KDR VEGF KDR
  • receptor for KDR VEGF KDR
  • Sunitinib which are low-molecular-weight inhibitors, and the like.
  • “Combination” means that the pharmaceutical composition of the present invention and the VEGF inhibitor are contained in the same composition and administered simultaneously, and the pharmaceutical composition of the present invention and the VEGF inhibitor are separated from each other. Simultaneous administration, or administration of either the pharmaceutical composition of the present invention or a VEGF inhibitor, followed by administration of the other one after the other.
  • the present invention further includes a method for treating cancer using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Cancers that can be treated by the method include cancers as defined above.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a B cell specific expression knock-in chimeric mouse for analyzing the in vivo function of BMP9.
  • Kakitani et al. Kakitani, ⁇ ⁇ , et al., Nucleic Acids Res., 33, e85 (2005) have the following (i) to (iii) A method for producing a genetically modified mouse consisting of the above steps has been reported.
  • a mouse ES cell is prepared by inserting (knock-in) the expression unit of an exogenous cDN ligation linked to the Ig ⁇ promoter into the downstream region of the immunity globulin ⁇ chain gene by homologous recombination.
  • a chimeric mouse is prepared by injecting a genetically modified mouse ES cell into an embryo of a functional B cell and an immune globulin heavy chain knockout mouse deficient in antibody-producing ability.
  • the B cells of the obtained chimeric mice are derived from the genetically modified ES cells that were all injected regardless of the color ratio of the hair color.
  • the protein encoded by the knocked-in foreign cDNA is secreted from knock-in (K I) chimeric mouse B cells, but the expression level does not depend on the chimera rate for the above reasons.
  • K i Kim, KA, et al., Science 309, 1256-1259 (2005)
  • Kim, KA, et al., Science 309, 1256-1259 (2005) have described the phenotype (intestinal epithelium) of the knock-in mouse mouse of the unknown function gene, human R—spondinl, prepared according to the above method.
  • the method for producing a BMP9 knock-in chimeric mouse according to the present invention is a further modification of the method reported by Kakitani et al. (Kakitani, M., et al., Nucleic Acids Res., 33, e85 (2005)). .
  • the secretory signal sequence of BMP9 is replaced with the secretory signal sequence of the mouse Ig ⁇ gene.
  • Human or mouse BMP9 knock-in chimera mouse A control clone chimera mouse prepared using ES cells that have not been transfected with an exogenous cDNA expression kit (Kakitani, M., et al., Nucleic) Acids Res., 33, e85 (2005)) As described in the report of each tissue, pathological analysis of each tissue, immunohistochemical analysis, serum biochemical examination, blood cell component measurement, etc. Identify changes to be made.
  • Example 9 as a phenotype specific to mouse BMP9 knock-in chimera mice as compared to control chimera mice, ascites, pleural effusion, lymphoid tissue, and small intestine spleen are considered red due to bleeding However, in Example 10, an increase in vascular permeability was observed. Also. In Example 24, as compared with the control chimeric mice, redness that is considered to be caused by bleeding was observed in the ascites, pleural effusion, lymphoid tissue, small intestine and knee as a phenotype specific to human BMP9 knock-in chimeric mice It was revealed that the phenotype observed in the mouse BMP9 knock-in chimeric mouse was very similar.
  • a knock-in vector for specifically expressing BMP9 in mouse B cells.
  • a knock-in vector contains a nucleic acid encoding BMP9 and a transcriptional regulatory sequence that directs expression in B cells.
  • Expression in B cells Any sequence known to those skilled in the art can be used as a transcriptional regulatory sequence that directs the expression of, for example, a B cell-specific promoter, a secretory signal sequence of an immunoglobulin (I g) gene ( ⁇ chain gene). included.
  • a BMP9 knock-in mouse can be produced, for example, according to an established method (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yotsuya, 1995). Specifically, a BMP9 knock-in vector (nucleic acid construct) is introduced into a mouse embryonic stem (ES) cell, and this is introduced into a host embryo (preferably an embryo of a B cell-deficient strain) as a placental cyst or a capillary tube into an 8-cell stage embryo. Inject using etc.
  • ES mouse embryonic stem
  • This embryo placental cyst or 8-cell stage embryo is directly transplanted into the oviduct of the same-type temporary parental non-human animal, or one that has been cultured for one day and developed up to the blastocyst is transferred into the temporary parent's uterus. Then, pups are obtained by raising and giving birth to temporary parents. The contribution of ES cells in pups can be roughly determined by their coat color.
  • a B-cell-deficient embryo is used as the host embryo, there are no B-cells deficient from the host embryo, but only those derived from knock-in ES cells.
  • BMP9 nuclear acid
  • RT-PCR RT-PCR
  • Northern blotting using RNA derived from the cells. It can be detected by using a measurement method (ELISA) or Western blotting.
  • mBMP9 (-SP) FW: AAGCCGCTGCAGAACTGGGAACAAG (SEQ ID NO: 1)
  • mBMP9 (-SP) RV TTGGCCGGCCCTACCTACACCCACACTCAGCCACA (SEQ ID NO: 2): Underlined
  • the mixture was amplified for 30 cycles and incubated at 72 ° C for 3 minutes.
  • the obtained 1221 bp amplified fragment was separated and recovered on a 0.8% gel.
  • QIAquick Gel Extraction Kit Japan stock
  • the amplified fragment was recovered according to the package insert. Recovered
  • the PCR-amplified fragment was enzymatically digested with Fsel (New England Biolab Japan Co., Ltd., Japan), and the enzyme-treated fragment was recovered using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Japan) according to the package insert.
  • mice BMP9 signal sequence, pro-region, and mature body in SEQ ID NOS: 3 and 4 are shown in underlined, boxed, and italicized based on the f information of GenBank accession numbers NP_062379 and Q9WV56, respectively.
  • SEQ ID NO: 3 The mouse BMP9 signal sequence, pro-region, and mature body in SEQ ID NOS: 3 and 4 are shown in underlined, boxed, and italicized based on the f information of GenBank accession numbers NP_062379 and Q9WV56, respectively.
  • SEQ ID NO: 3 The amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3 (428 amino acids, SEQ ID NO: 4) is shown below.
  • SEQ ID NO: 4 The amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3 (428 amino acids, SEQ ID NO: 4) is shown below.
  • Example 1 of International Publication No. WO 2006/78072 Pamphlet Example 1 Prepared in Example 1 after digesting pPSs5.5 described in 8 with Sfol and Fsel and then terminally dephosphorylating using Escherichia coli-derived alphophosphatase After inserting the DNA fragment, it was introduced into DH5o; DNA was prepared from the obtained transformant, and the base sequence of the ligated portion was confirmed to obtain the pPSs mBMP9 vector (Fig. 1).
  • Example 4 of International Publication No. 2006/78072 pamphlet Example 4 3-1 After pCk loxPV AP was enzymatically digested with Pad and Fsel, it was terminally dephosphorylated using Escherichia coli C75-derived alphophosphatase.
  • the pPSs mBMP9 vector of Example 2 above was enzymatically digested with Pacl and Fsel, and an approximately 2 kb fragment separated and recovered from 0.8% agarose gel was inserted, and then the E. coli XL10-Gold Ultracompetent Cells (US
  • mouse I g K signal sequence contains the [underlined], mouse downstream thereof 1522 bp including the BMP9 pro body sequence, SEQ ID NO: 5
  • amino acid sequence encoded by the cDNA 426 amino acids, the boxed portion indicates the mouse Ig / c signal sequence, SEQ ID NO: 6
  • Mouse Ig ⁇ signal sequence information including intron region was obtained from GenBank
  • Junichi
  • the vector single-stranded with Notl was collected by centrifugation, and then sterilized with 70% ethanol. 70% ethanol was removed in a clean bench and air-dried for 1 hour. An HBS solution was added to a 0.5 g / L DNA solution, and the mixture was stored at room temperature for 1 hour to prepare a pUSmBMP9 KI vector for electroporation.
  • Example 5 pUSmBMP9 KI vector and RS element ⁇ Targeting ⁇ Acquisition of PLmBMP9 mouse ES cell line using mouse ES cell line
  • RS element targeting Mouse ES cells were cultured according to the method described (Shinichi Aizawa, supra), and feeder cells were treated with mitomycin C (Sigma Al Anlagensch Japan, Japan). (Purchased from Invitrogen, Japan) was used. First, multiply RS element targeting 'mouse ES cells by trypsinization and suspend in HBS to 3 x 10 7 cells / ml, then add 0.5 ml of cell suspension to lO ⁇ g It was mixed with vector DNA and subjected to electrification with a gene pulser (electrode distance: o. 4 cm, Bio-Rad Laboratories, Japan) (capacity: 960 F, voltage: 250 V, room temperature). ).
  • genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells by Puregene DNA Isolation Kits (Qiagen, Japan). These pure-mouthymycin-resistant RS element targeting 'mouse ES cell genomic DNA was digested with restriction enzyme EcoRI (Takara Bio Inc., Japan) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, a Southern plot was performed, and the 3 ′ end DNA fragment (XhoI to EcoRI) of Ig light chain J / c-CK genomic DNA used in the invention described in W 00/10383 pamphlet (see Example 48).
  • Example 6 Acquisition of USmBMP9 mouse ES cell line from which drug resistance gene was removed from PLmBMP9 mouse ES cell line
  • PLmBMP9 murine ES cell lines than two drug resistance gene (Purc, Neo r) for USmBMP9 transgenic ES cell lines acquired removing the, pCAGGS- Cre vector (Sunaga et al., Mol Reprod Dev, 46:. 109-113, 1997) was introduced into PLmBMP9 mouse ES cells in accordance with established methods (Shinichi Aizawa, Bio-Muary Series 8, Gene Tagging, Yodosha, 1995).
  • PLmBMP9 mouse ES cells were cultured in accordance with known methods (Shinichi Aizawa, supra), and feeder cells were treated with mitomycin C (Sigma Aldrich Japan, Japan) G418-resistant primary cultured cells (Invitrogen, Japan) Purchased from the company).
  • mitomycin C Sigma Aldrich Japan, Japan
  • G418-resistant primary cultured cells Invitrogen, Japan Purchased from the company.
  • the PLmBMP9 mouse ES cells grown were trypsinized after suspended in HBS to a 3 X 10 7 cells ZML, cell suspension 0. 5 ml of a 10 mu ⁇ mentioned Kuta one DNA mix Gene Pulser Cuvette (Electrode distance: 0.4 cm, Japanese Bio Elect port porcelain was made at Rad Laboratories Co., Ltd. (capacity:
  • mice ES cell genomic DNAs were digested with restriction enzyme EcoRI (Takara Bio Inc., Japan) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, a Southern plot was performed, and the DNA fragment at the 3rd end of the Ig light chain JK-C ⁇ genomic DNA used in the invention described in International Publication No. WO 00/10383 pamphlet (see Example 48) ( Xhol to EcoRI, about 1.4 kb, International Publication No. TO 00/10383 pamphlet Figure 5) ES cell line from which only the Pur gene sandwiched between loxPV sequences was removed was detected using Ck 3 'probe as a probe.
  • Example 7 USmBMP9 mouse ES cell line Oppi B lymphocyte-deficient mouse strain-derived host embryo USmBMP9 KI chimeric mouse production using embryo
  • the USmBMP9 mouse ES cell line obtained in Example 6 above and confirmed to have mouse BMP9-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin / c chain gene was established from a frozen stock, and these were expressed as immunoglobulin ⁇ c.
  • 8-10 embryos were injected into each 8-cell embryo obtained by mating male and female mice that were homozygous for chain knockout mice. After overnight culture in ES medium (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995) and developing to blastocysts, 2.5 days after treatment with pseudopregnancy MCH (ICR ) About 10 injection embryos were transferred to each mouse uterus in the uterus of mice (Japan Claire, Japan).
  • Example 8 Preparation of control chimeric mouse
  • Example 11 Chimeric mice prepared according to the method described in 1 were phenotypic analysis experiments of USmBMP9 KI chimeric mice performed in Example 9 below, and Evans Blue of Example 10 It was used as a control chimera individual in the vascular permeability test of USmBMP9KI chimera mice using.
  • Necropsy of 7 USmBMP9KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks. As a result, red pleural effusion was observed in 1 individual at 3 weeks of age and all individuals at 4 weeks and 5 weeks of age.
  • Necropsy of 7 USmBMP9KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks. As a result, mesenteric lymph node redness was observed in all individuals from 3 weeks to 5 weeks of age.
  • Necropsy of 7 USmBMP9KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks. As a result, reddening of the submandibular lymph nodes was observed in all individuals from 3 weeks to 5 weeks of age.
  • Necropsy of 7 USmBMP9KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks. As a result, elbows were observed in all individuals from 3 weeks to 5 weeks of age. Reddening of the lymph nodes was observed.
  • Necropsy of 7 USmBMP9 KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks. As a result, redness of the inguinal lymph nodes was observed in all individuals from 3 weeks to 5 weeks of age.
  • Necropsy of 7 USmBMP9 KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks. As a result, all three-week-old individuals, eight at four-week-old, and all five-week-old individuals showed reddening of popliteal lymph nodes.
  • Necropsy of 7 USmBMP9 KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks.
  • 5 individuals at 3 weeks of age, and all individuals at 4 weeks of age and 5 weeks of age had red spots or red spots on a part of the surface of the small intestine.
  • Necropsy of 7 USmBMP9 KI chimeric mice was performed at 7 weeks at 3 weeks, 9 at 4 weeks, and 6 at 5 weeks.
  • 2 individuals at 3 weeks of age, 5 individuals at 4 weeks of age, and 4 individuals at 5 weeks of age showed redness on part of the knee surface.
  • Intra-sinus red blood cells are characteristically observed in USmBMP9 KI chimeric mice, as observed using H & E-stained pathological sections of mesenteric and inguinal lymph nodes derived from 3-week-old control chimeric mice and USmBMP9 KI chimeric mice. It was. Sinus erythrocytes are images suggesting blood absorption through the lymphatics, indicating the possibility of hemorrhagic changes in the surrounding area. However, no obvious bleeding lesion was observed in the macroscopic / histological findings, suggesting the possibility of microhemorrhages such as leakage of erythrocytes outside the blood vessels.
  • Example 10 Vascular permeability test of USmBMP9 KI chimeric mice Evans blue and 30 mg / kg (E-L Inc., Japan) were prepared for the control chimera mouse and USmBMP9 KI chimera mouse, which were prepared according to the method described in Example 7 and Example 8, and reached 5 weeks of age, respectively. iv. After 60 minutes, the treated individuals were necropsied, and vascular permeability was evaluated using ascites, pleural effusion, organ properties and changes as indicators. As a result, blue-colored ascites and pleural effusion were observed only in the USmBMP9 KI chimeric mice administered with Evans Blue.
  • Example 1 Expression and preparation of recombinant N-terminal His-type mBMP9 complex
  • V5S 5'-GATCC 6CTA6C GTCGAG GQTAAGCCTATGCCTAACCCTCTCCTCGeTCTCGATTCTACQ TGA C-3 '(Alarm # 7) V5A & 3'-G CGATCG CAGCTG GCATTCGGATAGeGATrQQeAeAQQA6GGA6AQCTAA6ATGG ACTQ
  • the synthetic oligo DNA was introduced into the BamHI-Xhol site on the pLNl vector described in the report by Kakeda et al. (Gene Ther. 12: 852-856, 2005) to construct a pLNlV5 vector.
  • mBMP9 3HisRv ATGGTGATGGTGATGATG CTGCTGTGTGACACAGACCAGC
  • mBMP9 5HisFw CATCATCACCATCACCAT AAGCCGCTGCAGAACTGGGAA
  • mBMP9SalIRv ACGCGTCGACCTACCTACACCCACACTCAG
  • the obtained 1249 bp amplified fragment was separated and recovered on a 0.8% gel. Times The amplified fragment (His mBMP9 Sail) was recovered from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Japan) according to the package insert.
  • Example 1 1-1 1 The PCR-amplified fragments recovered in 1-2 were enzymatically digested with Nhel and Sail (Nipponguchi Shu-Diagnotics Co., Ltd.), and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the recovered gel using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Japan) according to the package insert. The obtained enzyme-treated fragment was introduced into the Nhel ⁇ Sail site of the PLN1V5 vector prepared in Example 1 1 1 1 1 to construct an N-terminal His-type mBMP9 complex recombinant expression vector (FIG. 4).
  • amino acid sequence including the polynucleotide sequence from the start codon to the stop codon of the N-terminal His-type mBMP9 complex recombinant cDNA (1305 bp, SEQ ID NO: 13) and the mBMP9 signal sequence encoded by the cDNA ( 434 amino acids, SEQ ID NO: 14).
  • the underlined portion indicates the signal sequence of mouse BMP9
  • the box indicates the histidine tag portion
  • the italic indicates the portion of mouse BMP9 pro body.
  • TAG SEQ ID NO: 1 4 (including mMP9 signal sequence [underlined part]):
  • Example 1 1 1 1 3
  • the N-terminal His-type mBMP9 complex recombinant Kutaichi was introduced into E. coli DH5a, and DNA was prepared from the resulting transformant using a plasmid purification kit (Qiagen plasmid Maxi kit; Qiagen, Japan).
  • a plasmid purification kit Qiagen plasmid Maxi kit; Qiagen, Japan.
  • the Free style 293F cells (Japan Invitrogen Corporation) using a Free style 293 Expression Medium (Japan Invitrogen Corporation), 37 ° (:, 5 ° / .C0 2, 125rpm conditions, cell density from IxlO 5 3xl0 cultured in 6 C ells / ml range.
  • the expression vector lmg of 35ml Opti- MEM I Reduced Serum medium (the Japan Lee Nbi preparative Rozhen Ltd.) was added, the 1.3ml 293 fectin Transfection Reagent (Invitoguchigen, Japan) 33.7ml Opti-MEM
  • the supernatant was collected and filtered with 0.22 jum FP (0.22 ⁇ m GP Express Membrane; Nihon Millipore, Japan), followed by cooling at 4 ° C (cold room). If stored frozen, it was thawed and filtered again with a 0.22 m filter.
  • the target protein was recovered by adding 50 ml of PBS containing Imidazole.
  • AKTAexplorerlOs (GE Healthcare Bioscience, Japan) was used for the separation and purification operation. Endotoxin removal treatment was performed before use.
  • Example 1 1 1 3 After replacing the buffer in the purified sample obtained in 3-3 with PBS using an ultrafiltration membrane VIVASPIN20 10,000 MWC0 PES (Sartorius Japan, Japan), sample was concentrated. After the concentration operation, it was filtered through a 0.22 ⁇ filter (Millex GV; Nippon Millipore, Japan). The operation was performed in a clean bench whenever possible.
  • Example 1 1 1 3 All processes performed in 3 were performed in a low greenhouse (+ 4 ° C) or on ice, except for work in a clean bench. SDS-PAGE (silver staining) of the final purified product shows mature dimer under non-reducing conditions, small amount of pro2 dimer, pro-region force S detection 5; region ⁇ A small pro monomer was detected (Fig. 5).
  • the purified product prepared by the above procedure mainly contains a complex (complex body) consisting of two molecules of pro-region and one molecule of mature dimer.
  • a cell line into which a reporter plasmid capable of detecting a BMP signal was stably introduced was used. Specifically, a reporter plasmid (p (GCCG) 12-Luc / neo) that can detect BMP signals was transferred to He P G2 (available from ATCC), a human liver cancer cell line. Then, a stably introduced strain HepG2 (38-5) was prepared.
  • BMP signal detection reporter plasmid (p (GCCG) 12- Luc / neo) is a luciferase gene
  • a plasmid (p (GCCG) 12-Luc / neo) in which 12 binding sequences of Smadl / 5/8, a BMP signaling factor, were linked in tandem was added to Mol. Biol. Cell., 2000, 11 (2): Prepared according to the method described by Kusanagi et al.
  • luciferase activity a solution containing various concentrations of BMP9 was added to this cell line and incubated for 5 hours, and then a chemiluminescent reagent (Steady Glo TM Lucif erase assay system, available from Promega Corporation, Japan) was used. Implemented.
  • Example 13 Effect of N-terminal His-type mBMP9 complex on proliferation of human cord blood vein endothelial cells (HUVEC)
  • HUVEC cells obtained from BioWhittaker Inc., USA
  • the medium was changed to growth medium 100 // 1 containing various concentrations of N-terminal His-type mBMP9 complexm, and the culture was continued at 37 ° C for 2 days.
  • EBM 2+ complete supplement Mix medium and a medium containing only EBM-2 + 2% FBS (Invitrogen, Japan) were used.
  • cell counting kit-8 (Nippon Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) of ⁇ 1 was directly added to the well to develop color, and the absorbance at 450 nm was measured using a plate reader.
  • an increase in the number of HUVEC cells was observed in the EBM-2 + complete supplement medium compared to the EBM-2 + 2% FBS medium. It had no effect on cell growth (Fig. 6).
  • Example 14 4 Antitumor activity of N-terminal His-type mBMP9 complex against human lung cancer (LC-6) tumor model
  • the tumor model is a block of approximately 2 mm square of a tumor block of human lung cancer cell LC-6 (distributed from Japan Central Laboratory for Experimental Animals) under physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Japan).
  • the cancer cell transplant needle CL- 4531 Japan Claire Japan
  • the right mouse in the nude mouse BALB-nu / nu: Japan Japan Chiarus' Ribaichi Company
  • the ventral part subcutaneously.
  • general-purpose grouping software (Visions, Japan) Using, grouping was performed (5 animals per group). The day of grouping was defined as Dayl of administration start.
  • the administered BMP9 protein was prepared by using N-terminal His-type mBMP9 complex in PBS to a protein concentration of 15, 50, 150 ig / mL, and 200 / L for each individual, 3 times a week for 2 weeks, tail vein Administered.
  • a PBS solution containing Endotoxin (Nihon Seikagaku Corporation) in the same amount as Endotoxin contained in the 150 ⁇ g / mL BMP9 solution of the highest dose group was prepared and administered. Tumor volume is measured by measuring the major axis (mm), minor axis (mm), and thickness (mm) of the subcutaneous tumor using calipers.
  • tumor volume (mm 3 ) major axis (mm) x minor axis (mm) ) Calculated as X thickness (mm) / 2>.
  • RTV relative tumor volume
  • Foil RTV x Tumor volume on day x
  • I Tumor volume on day 1 of administration (Dayl)> calculated.
  • ITG % Inhibition of Tumor Growth
  • the t test was used for the significance test.
  • mouse BMP9 complex with N-terminal His tag sequence has a dose-dependent and significant difference in LC-6 tumor growth from the dose of 10 g / head. Suppression was confirmed (Fig. 7).
  • Example 15 5 Antitumor activity of N-terminal His-type mBMP9 complex against human pancreatic cancer (BxPC-3) tumor model
  • Tumor model the solution nude mice by 100 1, including a 1 per 4xl0 6 pieces of human Fuji ⁇ cell lines BxPC_3 (purchased from ATCC): right of (BALB- nu / nu Japan Japan Chiyaru vinegar Lipa Co., Ltd.) Implanted subcutaneously in the ventral region.
  • BxPC-3 RPMI medium containing 10% FBS was used.
  • the administered BMP9 protein was prepared by using N-terminal His-type mBMP9 complex in PBS to a protein concentration of 15, 50, 150 / ig / mL, and 200 times for each individual, 3 times a week for 2 weeks. It was administered internally.
  • a PBS solution containing Endotoxin (Nippon Seikagaku Corporation) in the same amount as Endotoxin contained in the 150 / g / mL BMP9 solution of the highest dose group was prepared and administered.
  • RTV relative tumor volume
  • Foil RTV x Tumor volume on day x I Tumor volume on day 1 of administration (Dayl)> calculated.
  • the mouse BMP9 complex with N-terminal His tag sequence showed a significant difference in BxPC-3 tumor growth from the dose of 10 ⁇ g / head in a dose-dependent manner. Suppression was confirmed (Fig. 8).
  • hBMP9 (-SP) FW: AAGCCACTGCAGAGCTGGGGACGAG (SEQ ID NO: 15)
  • hBMP9 (-SP) RV TTGGCCGGCCCTACCTGCACCCACACTCTGCCACG (SEQ ID NO: 16): Underlined part includes Fsel site
  • Amplified fragments were recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Japan) according to the package insert. Enzymatic digestion of the recovered PCR amplified fragment with Fsel (New England Biolabs Japan Co., Ltd.) and recovery of the enzyme-treated fragment according to the package insert using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Co., Ltd., Japan) did.
  • Example 16 After digestion with Sfol and Fsel, the DNA fragment prepared in Example 16 was inserted into a product that had been terminally dephosphorylated using E. coli-derived alphophosphatase, and then introduced into DH5a. DNA was prepared from the obtained transformant, the base sequence of the ligation part was confirmed, and the pPSshBMP9 vector (FIG. 9) was obtained.
  • the polynucleotide sequence from the start codon to the stop codon of the pUShBMP9 KI vector hBMP9 expression unit (the human BMP9 signal sequence is replaced with the mouse Ig / c signal sequence [underlined portion] containing the intron region, and And 1525 bp including the BMP9 pro body sequence, SEQ ID NO: 19), and the amino acid sequence encoded by the cDNA (427 amino acids, the boxed portion indicates the mouse Ig fc signal sequence, SEQ ID NO: 20)
  • the Mouse Ig ⁇ signal sequence information including intron region was obtained from UCSC mouse genome database based on MUSIGKVR1 (accession number K02159) obtained from GenBank.
  • Example 20 pUShBMP9 KI vector and RS element targeting 'Acquiring PLhBMP9 mouse ES cell line using mouse ES cell line
  • a PLhBMP9 mouse ES cell line in which human BMP9-cDNA was inserted downstream of the immunoglobulin ⁇ light chain gene by homologous recombination the restriction enzyme Notl (Takara Bio, Japan) was obtained according to the method shown in Example 19.
  • the pUShBMP9 KI betater linearized by Co., Ltd. was introduced into RS element targeting mouse ES cells according to the established method (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995).
  • RS element targeting 'mouse ES cells were obtained by the method described in WO 10/78072, Example 10 of the pamphlet.
  • Mouse ES cells were cultured according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and feeder cells were treated with mitomycin C (Sigma Aldritch Japan, Japan). (Purchased from Invitrogen, Japan). First, the grown RS element 'targeting' mouse ES cells are trypsinized and suspended in HBS to 3 ⁇ 10 7 cells / ml, then 0.5 ml of the cell suspension is added to the lO g vector. The mixture was mixed with DNA and subjected to electrification with a gene pulser cuvette (electrode distance: 0.4 cm, Japan Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) (capacity: 960 ?, voltage: 250V, room temperature).
  • the remaining 1/3 was inoculated into 12-well gelatin coat plate, and cultured for 2 days 10 6 ⁇ ; was prepared by L0 7 cells, genomic DNA of the Puregene DNA Isolation Kits (Japan Ltd. Qiagen). These puromycin-resistant RS element targeting 'mouse ES cell genomic DNA was digested with the restriction enzyme EcoRI (Takara Bio Inc., Japan) and separated by agarose gel electrophoresis.
  • Example 2 1 UShBMP9 mouse ES cell line from which drug resistance gene was removed from PLhBMP9 mouse ES cell line
  • PLhBMP9 murine ES cell lines than two drug resistance genes (Puro r, Neo r) for UShBMP9 transgenic ES cell lines acquired removing the, pCAGGS- Cre vector (Sunaga et al., Mol Reprod Dev, 46:. 109-113 , 1997) was introduced into PLhBMP9 mouse ES cells according to established methods (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995).
  • PLhBMP9 mouse ES cells were cultured according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and feeder cells were treated with mitomycin C (Sigma-Aldrich Japan, Japan). G418-resistant primary cultured cells (Invitrogen, Japan) Purchased from the company).
  • the expanded PLhBMP9 mouse ES cells were treated with trypsin, and 3 X 10 7 After suspending in HBS to make PT / JP2008 / 073980 cells / ml, mix 0.5 ml of the cell suspension with 10 ⁇ g of vector DNA, and then Gene Pulser Cuvette (electrode distance: 0.4 cm) , Japan Bio Rad Laboratories Co., Ltd.) (capacity: 960 F, voltage: 250 V, room temperature). Suspended cells in the electroporation in 10 ml of ES medium (Shinichi Aizawa, supra), and 2.5 ml of the cells were pre-seeded with feeder cells.
  • tissue culture Falcon, Japan
  • Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. 60 petri dishes for tissue culture (Falcon, Japan) Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) One seed was sown. After 30 hours, 1000 ES cells were seeded on one 100 mm tissue culture plastic seeder (Falcon, Nippon Becton, Dickinson, Japan) pre-seeded with feeder cells. Pick up colonies that formed 6 days later and grow them to confluence in 24-well plates, and 2/3 of them to 0.2 ml of storage medium (FBS + 10% DMSO, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) Company) and stored at -80 ° C.
  • FBS + 10% DMSO Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.
  • genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Qiagen, Japan). These mouse ES cell genomic DNAs were digested with restriction enzyme EcoRI (Takara Bio Inc., Japan) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, Southern blotting was performed, and the 3 ′ end DNA fragment of the Ig light chain J ⁇ -C ⁇ genomic DNA used in the invention described in International Publication No.
  • W 00/10383 pamphlet (see Example 48) ( XhoI to EcoRI, about 1.4 kb, W00 / 00383 pamphlet Figure 5) Pur sandwiched between loxPV sequences using Ck3 and probe as probes. An ES cell line in which only the r gene was removed was detected. Two bands (15. 1 K and 13.3 K) were detected by digestion with EcoRI in ES cells carrying Pure / gene, and two cells were detected by digestion with EcoRI in ES cell lines from which only the pure gene had been removed. Bands (15.1 K and 11.6 K) were detected (Fig. 11).
  • a Southern plot membrane obtained by the same operation as described above was used, and a 3′ ⁇ -probe prepared by the method shown in Example 9 of International Publication No. W0 2006/78072 was used as a probe.
  • An ES cell line in which only the Ne 0 r gene sandwiched between the sequences was removed was detected.
  • two Pando (7. 4 K and 5. 7 K) are detected, by EcoRI digestion in the ES cell lines only Neo r gene was removed, 2 Two bands (5.7 K and 4.6 K) were detected (Fig. 11).
  • B lymphocytes In homozygous immunoglobulin chain gene knockouts, functional B lymphocytes are deficient and antibodies are not produced (Kitamura et al., Nature, 350: 423-426, 1991). Embryos obtained by mating of the homozygous male and female individuals raised in a clean environment were used as hosts for the production of chimeric mice performed in this Example. In this case, B lymphocytes that are functional in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells. In this example, the immunoglobulin chain gene knockout mouse described in the report of Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722-7, 2000) ) Individuals that had been backcrossed to the strain three or more times were used for host embryo preparation.
  • UShBMP9 mouse ES cell line obtained in Example 21 above and confirmed to have human BMP9-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin / c chain gene was established from a frozen stock, 8 to 10 embryos per embryo were injected into 8-cell embryos obtained by mating male and female mice homozygous for immunoglobulin ⁇ chain knockout mice.
  • ES medium Sudichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995
  • ICR pseudopregnancy MCH
  • Example 21 As a result of transplanting an infection embryo produced using the UShBMP9 mouse ES cell line of Example 1, offspring chimeric mice were born. Chimera individuals are judged by the presence of ES cell-derived wild color (dark brown) in the white color derived from the host embryo. Among the newborn chimera mice, individuals with clearly wild-colored hair color, ie, ES cell contributions were obtained. From these results, US hBMP9 mice in which human BMP9-cDNA is inserted downstream of the immunoglobulin / c chain gene
  • Example 1 of International Publication No. W0 2006/78072 Pamphlet A chimeric mouse prepared according to the method described in 1 was used as a control chimera individual in the phenotypic analysis experiment of the UShBMP9 KI chimeric mouse performed in Example 2 4 below. It was.
  • Necropsy was performed at 5 weeks of age. Only in UShBMP9 KI chimeric mice, ascites / pleural effusion, lymphoid tissue, small intestine and knees were reddened due to bleeding. The time when each change was observed and the number of individuals are described below.
  • Example 25 Expression and preparation of recombinant N-terminal His-type hBMP9 complex 25— 1. Construction of N-terminal His-type hBMP9 complex recombinant expression vector
  • V5S S'-GATCC GCTAGC GTCGAC eGTAAeCGTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCeATTCTACG TSA C-3 '(S3 ⁇ 4 number 7)
  • V5AS 3'-G CGATCG CAGCTG CCATOGGATAGGGAnGGGAeAGQAGCGAGAGGTAAGATGC ACTGAGCT-5' (Seta number 8 12: 852-856, 2005)
  • the pLNlV5 vector was constructed by introducing it into the BamHI-Xhol site on the pLNl vector. 25-1-2. Synthesis of hBMP9 DNA fragment with His tag sequence at N-terminus
  • hBMP9 3HisRv ATGGTGATGGTGATGATG CCCCTGTAGGGAGCCAGCCAG
  • hBMP9 5HisFw CATCATCACCATCACCAT AAGCCACTGCAGAGCTGGGG
  • hBMP9XhoIRv ACGCCTCGAG CTACCTGCACCCACACTCTG
  • SEQ ID NO: 24 Prepare a reaction solution according to the package insert using Prime STAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Japan). SEQ ID NOs: 2 1 and 2 2, 10 pmol of each of the two types of primers in the 50 zl reaction solution.
  • human BMP9-cDNA SEQ ID NO: 17 was added and incubated at 94 ° C for 5 minutes. C10 seconds, 57 ° C 5 seconds, and 72. The cycle of C2 was increased by 25 cycles, and the resulting lOlbp amplified fragment was separated and recovered on a 0.8% gel. The amplified fragment (Nhel His hBMP9) was recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Japan) according to the attached document.
  • Example 2 The PCR-amplified fragments recovered in 5-1-2 were enzymatically digested with Nhel and Sail (Roche Diagnostics, Japan) and separated and collected on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the recovered gel using a QIAquick Gel Extraction Kit (Kagen, Japan) according to the package insert. The obtained enzyme-treated fragment was used in the Nhel ⁇ Xhol site of the PLN1V5 vector prepared in Example 25-5-11. The N-terminal His-type hBMP9 complex recombinant expression vector (Fig. 12) was constructed.
  • polynucleotide sequence from the start codon to the stop codon of the N-terminal His-type hBMP9 complex recombinant cDNA (1308 bp, SEQ ID NO: 25), and the amino acid containing the hBMP9 signal sequence encoded by the cDNA
  • the sequence is shown (435 amino acids, SEQ ID NO: 26).
  • the underlined part represents the signal sequence part of human BMP9
  • the boxed line represents the histidine tag part
  • the italic form represents the human BMP9 pro body part.
  • SEQ ID NO: 2 6 (including hBMP9 signal sequence [underlined portion]): CGCR
  • Example 25-1-3 N-terminal His-type HBMP9 complex recombinant expression downy click terpolymers obtained by was introduced into E. coli DH5 a, DNA from transformants obtained a plasmid purification kit (Qiagen plasmid Maxi kit; Qiagen, Japan). 25-2-2. Introduction and secretion of vector into cultured cells
  • the supernatant was recovered, filtered through a 0.22 m filter (0.22 Aim GP Express Membrane 500 ml; Nihon Millipore, Japan), and then cooled at 4 ° C (cold room). If stored frozen, it was thawed and filtered again with a 0.22 m filter.
  • the pretreated 1 L culture supernatant was applied to a Ni Sepharose column (His Trap HP 5 ml; GE Healthcare Biosciences, Japan) equilibrated with PBS. Then, add the column in the following order: 0 ° / oB buffer 25ml, NaCl added to PBS and NaCl concentration adjusted to 1.85M 25ml, 0% B buffer 25ml, 9% B buffer 30ml, 11% B buffer 40ml Washed. After the washing operation, 50 ml of 16% B buffer was added to the column to recover the target protein. AKTAexplorerlOs (GE Healthcare Bioscience Japan, Inc.) was used for the separation and purification operation. Endotoxin removal treatment was performed before use.
  • PBS Dulecco's Phosphate Buffered Saline; SIGMA
  • a buffer a buffer prepared by adding NaCl to PBS and adjusting the NaCl concentration to 1.85 was used as the B buffer.
  • Example 2 5-3-2 Obtained in Example 2 5-3-2 under a flow rate of lmL / min on a strong anion exchange column equilibrated with PBS (Hi Trap Q HP 1 mL; GE Healthcare Piosciences, Japan) The target protein was added. The sequential column was washed with 10 ml of 0% B buffer 20 ml N 2% B buffer. After the washing operation was completed, 20 ml of 7% Buffer was applied to the column, and the target protein was recovered. AKTAexplorerlOs (GE Healthcare Bioscience, Japan) was used for the separation and purification operation. Endotoxin removal treatment was performed before use.
  • Example 2 Buffers in the purified sample obtained in 3-5-3 were used for ultrafiltration membrane VIVASPIN20
  • the sample was concentrated after replacement with PBS using 10,000 MWC0 PES (Sartorius Japan, Japan). After concentration, 0.22 m filter (Millex
  • a cell line stably transfected with a reporter 'plasmid capable of detecting a BMP signal was used.
  • a reporter 'plasmid (p (GCCG) 12_Luc / neo) that can detect BMP signals is gene-transfected into a human hepatoma cell line, HepG2 (available from ATCC) for stable introduction. Strain HepG2 (38-5) strain was prepared.
  • Plasmid (p (GCCG) 12 -Luc / neo) was prepared according to the method described by Kusanagi et al. In Mol. Biol. Cell., 2000, 11 (2): 555-65.
  • luciferase activity For the measurement of luciferase activity, a solution containing various concentrations of BMP9 was added to this cell line, incubated for 5 hours, and then a chemiluminescence reagent (Steady Glo (trademark) Luciferase assay system, available from Promega Corporation, Japan) Implemented.
  • a chemiluminescence reagent (Steady Glo (trademark) Luciferase assay system, available from Promega Corporation, Japan) Implemented.
  • Example 27 N-terminal His-type hBMP9 against human glioma (U87MG) tumor model
  • Tumor model is U2MG (available from ATCC) tumor block approximately 2mm square under physiological saline (Otsuka Pharmaceutical, Japan) Using a cancer cell transplant needle CL-4570 (Nippon Claire, Japan), a nude mouse (BALB-nu / nu: Japan Japan Chiarus. Ribaichi Co., Ltd.) It was prepared by transplanting subcutaneously into the right ventral region. When the tumor volume in the transplanted mice reached about 10 mm 3 , grouping was performed using a general-purpose grouping software (Visions, Japan) (5 animals per group). The day of grouping was defined as Dayl of administration start.
  • the N-terminal His-type human BMP9com P lex prepared before use by administration BMP9 protein PBS, at a dose of 0. 5 mg / kg, 3 times a week for two weeks, the tail 2008/073980 Intravenous administration.
  • BMP9 protein PBS a PBS solution containing the same amount of Endotoxin (Nippon Seikagaku Corporation) as the BMP9 administration solution was prepared as a control, and the same schedule as the BMP9 administration was used.
  • Neutralizing antibody against VEGF type II receptor purified from neutralizing antibody producing strain DC101 available from ATCC.
  • DC101 neutralizing antibody against VEGF type II receptor
  • PBS other than the group treated with DC101 was administered according to the same schedule as DC101.
  • Tumor volume was measured by measuring the major axis (mm), minor axis (mm), and thickness (mm) of the subcutaneous tumor using calipers.
  • ⁇ tumor volume (mm 3 ) major axis (mm) x minor axis ( mm) x thickness (mm) / 2>.
  • human BMP9 complex with N-terminal His tag sequence may show significant suppressive activity against tumor growth of U87MG strain even in combination with DC101 antibody, a VEGF inhibitor. It was confirmed (Fig. 14). Industrial applicability
  • the pharmaceutical composition of the present invention can inhibit tumor cell growth of solid cancer. Therefore, it becomes possible to treat various diseases or disorders related to solid cancer without causing side effects.
  • the present invention can inhibit the growth of solid cancer tumor cells. Therefore, various diseases or disorders associated with solid cancer and solid cancer can be treated without causing side effects.
  • SEQ ID NOS: 1, 2, 7-12, 1, 5, 16 show the synthetic oligonucleotide sequences.

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Abstract

固形癌および関連する様々な疾患又は障害を、副作用を引き起こすことなく、治療することが可能な癌治療薬の提供。　BMP9タンパク質、BMP9タンパク質をコードする核酸、BMP9タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターのいずれかあるいはそれらの組み合わせを有効成分とする、癌を治療および／または予防するための医薬組成物の提供。

Description

BMP9タンパク質を用いた癌を治療するための方法および医薬組成物
技術分野
本発明は、 骨形成タンパク質である Bone morphogenetic protein 9 (BMP9)の癌 疾患治療剤としての用途 ·用法に関するものである。
明 背景技術
Bone morphogenetic protein (BMP) 骨开成書タンノ ク質群 ίま、 TGF— betaスーノ一 フアミリーに属し、 異所性の骨成長や軟骨形成に対する誘導能を持つ分子として 同定されてきた （非特許文献 1, 2)。 また最近では、 BMPファミリー分子は、 一般 に種々の細胞の増殖、 分化、 アポトーシスに関わり、 組織、 臓器の形態生成に重 要であることが分かってきている （非特許文献 3, 4)。
一方、 BMPファミリー分子に属する BMP9は、他の BMPファミリー分子と同様に、 肥大軟骨細胞の形成や間葉細胞からの軟骨への分化に対する促進作用 （非特許文 献 5) が報告されている他、 鉄イオンの恒常性維持に関わる hepcidinの発現調節 (非特許文献 6) や糖代謝に関わる可能性も報告されている （非特許文献 7)。 その発現臓器に関しては、 胎児期では脊髄や体節間膜で、 成体期では肝臓で主 に発現していることが報告されている （非特許文献 7 - 9)。
また、 BMP9のタンパク質構造に関して言えば、 他の BMPファミリーと同様に、 一本鎖の前駆体タンパク質 （pre - pro 体） として合成された後、 シグナルぺプチ ド領域が切断され、 細胞内で C末端側に存在するシスティン残基がジスルフィ ド 結合を介し 2量体 （pro2量体） を形成する。 その後、 furin様プロテアーゼによ り、 活性本体である C末側 （mature 2量体） とジスルフィ ド結合を持たない N末 プロペプチド領域 （pro- region) に切断される。 切断された N末側のプロぺプチ ド領域 2分子は C末側の mature 2量体 1分子と非共有結合を介し複合体（complex 体） を形成し、 その複合体の形で細胞から分泌されることが知られている （非特 許文献 10)。 また、 mature 2量体同様、 N末プロペプチド領域が結合した複合体 (complex体）も、シグナル伝達能を有することが知られている（非特許文献 10)。 腫瘍細胞は成長の過程において、 必要な酸素 ·栄養を獲得し、 老廃物を運び出 すために、非常に微細な髪の毛ほどの太さをもつ血管を成長させる必要性があり、 これがない場合には、 l〜2mm以上には成長できないことが知られている。 このプ ロセスは、血管新生（angiogenesis)と呼ばれ、このプロセスの阻害は腫瘍の増大、 転移の抑制に重要であると考えられている （非特許文献 11)。
この腫瘍血管新生に関する研究では、 これまでに、 血管新生促進因子として、 血管内皮増殖因子 Vascular endothelial growth factor (VEGF)、 血小板由来内皮 細胞增殖因子（PDECGF)、 線維芽細胞増殖因子 fibroblast growth factor (FGF) , 腫瘍壌死因子 a (TNF c 、 インターロイキン 8 (IL- 8)、 インシュリン様増殖因子 insulin like growth factor (IGF)などが、 抑制性因子として、 ト口ンボスポンジ ン (TSP-1)、 可溶化型 VEGFR - 1、 アンジォテンシン II (Angll)、 MMP阻害タンパ ク質 （RECK) などが同定されている （非特許文献 11)。
中でも、 1980年代に発見された VEGFは、 腫瘍における血管新生においても最 も重要な役割を果たすタンパク質とされ、その阻害活性を有する抗 VEGF抗体は腫 瘍増殖に対して抑制的に働くことが種々の腫瘍移植片モデルを用いて明らかにさ れている （非特許文献 11)。 更に、 ヒトにおける有効性も確認され、 2004年には 抗 VEGF抗体（ベバシズマブ：商品名ァパスチン） が進行性大腸癌に対する治療剤 として米国食品医薬品局（FDA)により認可を受けている （非特許文献 11)。 また前 記抗体に加え、 VEGFのレセプターである KDRのキナーゼ阻害低分子薬であるソラ フエニブ soraf enib (商品名 Nexavar)およびスニチ-ブ Sunitinib (商品名 Sutent) についても、進行性腎細胞癌の治療薬として米国で認可され、血管新生の阻害は、 癌治療の有効な手段となりうることが証明されるに至った （非特許文献 11)。
BMP9は血管内皮に特異的に発現する ALK1のリガンドである可能性が示唆され ている（非特許文献 12- 13)。その ALK1に関して言えば TGF- beta スーパーファミ リーの I型レセプター群に属し、 遺伝性出血性毛細血管拡張症 （hereditary hemorrhagic telangiectasia： HHT) の原因遺伝子とされる （非特許文献 14)。 ま た ALK1欠損マウスを用いた解析から、 ALK1は血管構築に重要な分子であること も分かっている（非特許文献 15-16)。 しかし、 ALK1シグナルの血管新生への役割 については、 相反する報告がなされているため、 見解の一致までには至っていな い。 具体的には、 ALK1 の恒常的活性化型変異体を、 血管内皮細胞に発現させた、 in vitro試験においては、 ALK1シグナルは細胞増殖に対して抑制的に作用するこ とが報告されている一方 （非特許文献 17)、 反対に促進するといつた報告もある (非特許文献 18)。 その相違の原因としては、 由来の異なる血管内皮を用いた in vitro での試験であったこと、 即ち、 成体における血管新生を調べた試験ではな かったことが原因として挙げられる。
一方、 BMP9と血管新生との関係については、血管内皮細胞等を用いた解析から、 BMP9は細胞を用いだ in vitroでの血管新生に対して抑制的に働く可能性が報告 されているものの（非特許文献 13)、肝心の成体の血管新生に対する役割に関して は明らかにされていない。 また、 その in vitroの知見から成体での役割を推測す る場合においても、 in vitro試験にしばしば用いられる血管内皮細胞は、 2次元 培養により性質が変化することが知られているため （非特許文献 19)、 信頼性の 観点から、 予測は困難なものであった。
また BMP9と癌およぴ抗腫瘍作用との関連に関しても、それを記載した論文はな く、 不明であった。 血管新生抑制と抗腫瘍作用との関連で考えてみた場合におい ても、血管新生阻害が抗腫瘍活性に繋がらなかったケースも報告されているため、 BMP9と抗腫瘍作用との関連を容易に想像することも困難なものであった。血管新 生阻害が抗腫瘍活性に繋がらなかった具体的なケースとしては、抗 ALK1中和抗体 は、 成体での血管新生を非常に強く抑制するものの、 抗腫瘍作用には繋がらなか つたことが報告されている （特許文献 1)。 このように、 BMP9に抗腫瘍活性がある か否かについては、実際に腫瘍モデルを用いて評価するまで予測は困難であった。
特許文献 1 国際公開第 W0 2007/040912号パンフレツ ト
非特許文献 1 Urist, M. R.， Science, 150, 893-899 (1965)
非特許文献 2 Wozney, J. M. , et al. , Science, 242， 1528-1534 (1988) 非特許文献 3 Hogan, B. L. , Curr. Opin. Genet. Dev. , 6， 432-438 (1996) 非特許文献 4 ten Dijke, P. , et al. , Mol. Cell Endocrinol. , 211, 105-113 (2003)'
非特許文献 5 Kang, Q,， et al,， Gene Ther. , 11， 1312-1320 (2004) 非特許文献 6 Truksa, J.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 10289-10293 (2006)
非特許文献 7 Chen, C. , et al. , Nat. Biotechndlogy, 21, 294-301 (2003) 非特許文献 8 Mi l ler, A. F. , et al. , J. Biol. Chem.， 275， 17937-17945 (2000)
非特許文献 9 Lopez- Coviel la, I. , J. Physiology- Pari s, 96, 53 - 59 (2002) 非特許文献 1 0 Brown, M. A.， et al. , J. Biol. Chem. , 280, 26，
25111-25118 (2005)
非特許文献 1 1 癌と血管新生の分子生物学、 南山堂 （2006)
非特許文献 1 2 David, L. , et al. , Blood, 109, 1953-1961 (2007) 非特許文献 1 3 Scharpfenecker, M. , et al.， J. Cell Sic. , 120,
964-972 (2007)
非特許文献 1 4 Johnson, D. W. , et al. , Nat. Genet. , 13, 189 - 195 (1996) 非特許文献 1 5 Oh, S. P. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.， 97,
2626-2631 (2000)
非特許文献 1 6 Urness, L. D.， et al. , at. Genet. , 26, 328—331 (2000) 非特許文献 1 7 Lamouil le, S. , et al. , Blood, 15, 4495-4501 ( 2002) 非特許文献 1 8 Goumans MJ. , et al. , EMB0, 21, 1743—1753 (2002) 非特許文献 1 9 Seki, T.， et al. , Lab. Investigation, 86, 116—129 (2006) 発明の開示
本発明者は哺乳動物において BMP9 遺伝子産物の生理的作用について鋭意研究 を行った結果、 BMP9が固形癌の腫瘍細胞に対して増殖抑制活性を持つことを見出 した。 本発明者は BMP9を過剰発現するマウスを作製し、 BMP9過剰発現により腹 腔 ·胸腔内に血液が貯留することや、 リンパ節で血液漏出による赤色化が引き起 こされることを見出した。 さらに色素を用いた解析から、 BMP9過剰発現は、 血管 透過性を亢進させうることを確認した。 上記知見を受けて、 BMP9の作用点が血管 にあるのではとの仮説のもと、 ヒ ト臍帯血静脈内皮細胞 （HUVEC) の細胞増殖に対 する BMP9の増殖抑制効果を調べたところ、その効果は確認できなかった。 しかし ながら、 BMP9タンパク質を、 ヒ ト腫瘍株を移植した腫瘍移植片モデルに投与した ところ、 驚くべきことに、 腫瘍増殖を有意に抑制できることを見出した。
更には、 BMP9タンパク質を、 VEGF阻害剤としての抗 VEGF抗体と併用してヒ ト 腫瘍株を移植した腫瘍移植片モデルに投与したところ、 腫瘍増殖を有意に抑制で きることを見出した。
抗 VEGF療法を利用した血管新生阻害療法は、癌治療法として確立されつつある ものの、 その効果は若干の進行抑制に留まり、 十分な治療満足度は得られていな いため、更なる治療成績の向上が求められている。抗 VEGF療法の血管新生阻害効 果といった観点で見ると、ヒトでの抗 VEGF阻害の効果はげつ歯類でのものと比べ ると著しく弱く、 また抗 VEGF療法下においても腫瘍増殖は生じていることより、 血管新生は部分的にしか抑制できていないことが伺える。 癌治療の成績向上のた めの、 血管新生阻害療法の更なる強化の一環として、 抗 VEGF療法において BMP9 を併用することが有用であると考えられる。
本発明者はこのような知見に基づいて、 BMP9を有効成分とする抗腫瘍剤が、 新 たな抗腫瘍剤として提供できると考え、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 以下のとおりである。
[1] 以下の （a) 〜 （c) の少なくても 1つを含むことを特徴とする、 癌を 治療および Zまたは予防するための医薬組成物。
(a) BMP9タンパク質またはその機能的断片、
(b) BMP9タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸、
(c) BMP9タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸を含む発現べクタ
[2] BMP9 タンパク質またはその機能的断片がヒ トまたはマウス由来である、 [1] の医薬組成物。
[3] BMP9タンパク質またはその機能的断片が、
(a) 配列番号 4または配列番号 1 8で示されるアミノ酸配列を有する、
( b ) 配列番号 4の少なくとも 3 1 9番目から 428番目、 または配列番号 1 8 の少なくとも 320番目から 429番目の配列からなるアミノ酸配列を有する、 または ( c ) 配列番号 4の少なくとも 31 9番目から 428番目、 または配列番号 1 8 の少なくとも 3 20番目から 429番目の配列からなるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ、 癌の増殖を阻害する活性を有する
ものである、 [1] 又は [2] の癌を治療おょぴ Zまたは予防するための医薬組成 物。
[4] BMP9タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸が、
( a )配列番号 3または配列番号 1 7で示される塩基配列を有する、
( b ) 配列番号 3の少なくとも 955番目から 1 28 7番目、 または配列番号 1
7の少なくとも 9 58番目から 1 290番目の配列からなる塩基配列を有する、 または
( c ) 配列番号 3の少なくとも 955番目から 1 287番目、 または配列番号 1 7の少なくとも 9 58番目から 1 290番目の配列からなる塩基配列に相捕的な 配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 かつ、 癌の増殖を阻害する活性を有するタンパク質をコードする ものである、 [1] 又は [2] の癌を治療およびノまたは予防するための医薬組成 物。
[5] 癌が固形癌である、 [1] 〜 [4] のいずれかの医薬組成物。
[6] 固形癌が肺癌、 膝臓癌または神経膠腫である、 [5] の医薬組成物。
[7] VEGF阻害剤と併用することが可能な [1] 〜 [6] のいずれかの医 薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007- 3410%号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 pPSs mBMP9 ベクターの構造を示す図である。 5， enhancer:マウス Ig f の 5' enhancer領域、 PS promotei-：マウス Ig κプロモーター領域 PS、 signal peptide:PS promoter 下流のマウス Ig rcシグナルペプチドコード領域、 Intron: マウス Ig κシグナルぺプチドコード領域にはさまれたィントロン領域、 mBMP9 (_SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないマウス BMP9遺伝子、 κ polyA :マウス Ig κ polyAシクナル領域、 3 ' enhancer :マウス Ig κの 3 ' enhancer 領域、 Amp：アンピシリン耐性遺伝子。
図 2は、 マウス BMP9遺伝子がクローニングサイ トに揷入された pUS mBMP9 KI ベクターの構造を示す図である。 PS promoter :マウス Ig Kプロモーター領域 PS、 Signal peptide cording region : PS promoter 流のマ 'ノス Ig / ンクナノレへプテ ドコード領域とマウス Ig Kシグナルぺプチドコード領域にはさまれたィントロ ン領域から構成される領域、 mBMP9 (_SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持 たないマウス BMP9遺伝子、 C K ：マウス Ig /c遺伝子定常領域、 Total C K polyA： C /c終止コドン下流 436bpからなるマウス Ig K polyAシグナル領域、 C /c polyA Partial： C κ終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig κ polyAシグナル領域、 loxPV-Puro： ΙοχΡ配列の一部 mutant配列である loxPV配列をその両端に持つピ ユーロマイシン耐性遺伝子、 DT-A： ジフテリア トキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クローニングべグター。
図 3は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo) がターゲティングされたアレル構造、 マ ウス BMP9 (-SP) +薬剤耐性遺伝子 （loxpv- puro) 力 pUSmBMP9 KIベクターを用 いてターゲティングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo， loxpv- puro) が除去されたァレル構造およぴサザン解析用プローブの位置を示す図である。 mBMP9 (-SP) ： 固有のシグナルペプチドコード領域を持たないマウス BMP9遺伝子、 C K ：マウス Ig fc遺伝子定常領域、 loxpv- puro： ΙοχΡ配列の一部 mutant配列であ る loxPV配列をその両端に持つピューロマイシン而す性遺伝子、 loxp- neo： ΙοχΡ配 列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3， probe ： mBMP9 ( - SP ) +loxpv-puro遺伝子導入およぴ loxpv- puro遺伝子除去クローン選別用サザン解析 プローブ、 3， ΚΟ-probe： loxp- neo 遺伝子導入おょぴ除去クローン選別用サザン 解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 4は、 N末端 Hi sタグ付加 mBMP9 complex組換え体発現ベクターの構造を示 す図である。 Kozak :コザック配列、 SP :マウス BMP9固有のシグナル配列、 His- tag：
His6タグ配列、 mBMP (- SP) ： 固有のシグナルペプチドコード領域を持たないマウ ス BMP9遺伝子、 SV40 polyA： SV40由来 polyAシグナル領域、 5， neo： neo耐性遺 伝子の 5 ' 側領域、 pLNlV5 : pLNlベクターに V5タグ配列が揷入されたベクター。 図 5は、 N末 Hi s型 mBMP9 complex精製標品の銀染色による SDS- PAGE泳動像を 示す図である。
図 6は、 N末 Hi s型 raBMP9 complexの HUVEC細胞増殖に対する作用を示す図で ある。
図 7は、 ヒ ト肺癌 （LC- 6) 腫瘍モデルに対する N末 Hi s型 ffiBMP9 complexの抗 腫瘍効果を示す図である。
図 8は、 ヒ ト膝臓癌 （BXPC3) 腫瘍モデルに対する N末 Hi s型 mBMP9 complex の抗腫瘍効果を示す図である。
図 9は、 pPSs hBMP9 ベクターの構造を示す図である。 5 ' enhancer :マウス Ig κの 5， enhancer領域、 PS promoter :マウス Ig κプロモーター領域 PS、 signal peptide : PS promoter 下流のマウス Ig κシグナルペプチドコード領域、 Intron : マウス Ig κシグナルぺプチドコード領域にはさまれたイン トロン領域、 hBMP9 (-SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないヒ ト BMP9遺伝子、 κ polyA :マウス Ig κ polyAシグナル領域、 3， enhancer：マウス Ig κの 3 enhancer 領域、 Amp：アンピシリン耐性遺伝子。
図 1 0は、 ヒ ト BMP9 遺伝子がクローニングサイ トに揷入された pUShBMP9 KI ベクターの構造を示す図である。 PS promoter :マウス Ig κプロモーター領域 PS、 Signal pept ide cording region ·" PS promoter下流のマウス Ig κシグナノレへプチ ドコード領域とマウス Ig Kシグナルぺプチドコード領域にはさまれたィントロ ン領域から構成される領域、 hBMP9 (- SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持 たないヒ ト BMP9遺伝子、 C /c ：マウス Ig K遺伝子定常領域、 Total C /c polyA： C K終止コドン下流 436bp からなるマウス Ig / polyA シグナル領域、 C κ polyA Partial ： C κ終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig κ polyA シグナル領域、 loxPV-Puro ： ΙοχΡ配列の一部 mutant配列である loxPV配列をその両端に持つピ ユーロマイシン耐性遺伝子、 DT- A： ジフテリアトキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クローニングベクター。
図 1 1は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp-neo) がターゲティングされたアレル構造、 ヒ ト BMP9 (-SP) +薬剤耐性遺伝子 （loxpv - puro) 力 PUShBMP9 KIベクターを用 いてターゲテイングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo, loxpv-puro) が除去されたァレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す図である。 hBMP9 (-SP) ：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒ ト BMP9遺伝子、 C κ ：マウス Ig / 遺伝子定常領域、 loxpv- puro： ΙοχΡ配列の一部 mutant配列であ る loxPV配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、 loxp- neo： ΙοχΡ配 列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3， probe： hBMP9 ( - SP ) +loxpv-puro遺伝子導入およぴ loxpv- puro遺伝子除去クローン選別用サザン解析 プローブ、 3 ' ΚΟ-probe： loxp- neo 遺伝子導入おょぴ除去クローン選別用サザン 解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 1 2は、 N末端 Hi sタグ付加 hBMP9 compl ex組換え体発現ベクターの構造を 示す。
Kozak :コザック配列、 SP： ヒ ト BMP9固有のシグナル配列、 Hi s - tag： Hi s6タグ配 列、 mBMP (- SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないヒ ト BMP9遺伝子、 SV40 polyA： SV40由来 polyAシグナル領域、 5 ' neo： neo H生遺伝子の 5 ' 側領 域、 pLNlV5 : pLNlベクターに V5タグ配列が揷入されたベクター。
図 1 3は、 N末 Hi s型 hBMP9 complex精製標品の CBB染色による SDS- PAGE泳動 像を示す。
図 1 4は、 ヒ ト神経膠腫 （U87MG) 腫瘍モデルに対する、 N末 Hi s型 hBMP9の VEGFI I 型レセプターに対する中和抗体（DC101)との併用における抗腫瘍効果を示 す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、 BMP9タンパク質、 BMP9タンパク質をコードする核酸、 BMP9タンパ ク質をコードする核酸を含む発現ベクターのいずれかあるいはそれらの組み合わ せを有効成分とする、 癌を治療および/または予防するための医薬組成物を提供 する。
本発明に用いられる BMP9は公知であり、 ヒ ト、 マウス、 セキショクャケィなど から単離され、配列情報が公開されている。 ヒ ト又はマウス由来 BMP9の配列情報 は、 例えばヒ ト BMP9はァクセッション番号 Q9UK05, AAD56960等として、 マウス BMP9はァクセッション番号 Q9WV56， NP—062379等として、 GenBankに登録されて おりこれらを利用することが可能である。 本発明においては、 BMP9タンパク質ま たはこれをコードする核酸は、 特に限定されるものではないが、 ヒ ト又はマウス 由来であることが好ましい。 さらに、 導入および/または発現される遺伝子なら びにタンパク質の免疫拒絶反応を最小に抑えるために、 また、 治療の効果を上げ るために、 導入および/または発現される遺伝子ならびにタンパク質はヒ ト由来 のものであることが好ましい。
本発明の BMP9タンパク質、 BMP9タンパク質をコードする核酸、 BMP9タンパク 質をコードする核酸を含む発現ベクターのいずれかあるいはそれらの組み合わせ を有効成分とする、癌を治療およぴ /または予防するための医薬組成物には、 BMP9 タンパク質またはその機能的断片が含まれる。 BMP9タンパク質は、 GenBankなど に登録された公知のアミノ酸配列を有する BMP9 タンパク質を用いることができ るが、 好ましくは配列番号 4 (マウス BMP9) または配列番号 1 8 (ヒト BMP9)で 示されたァミノ酸配列を有する BMP9タンパク質、特に好ましくは配列番号 1 8で 示されたアミノ酸配列を有する BMP9タンパク質を用いる。 また、配列番号 4およ び配列番号 1 8で示される配列は、 シグナル配列、 pro- regionを含み、 本発明の 医薬組成物には、少なくともシグナル配列と pro- regionを除いたマチュア部分が 含まれていればよい。 配列番号 4においては、 3 1 9番目から 4 2 8番目の配列 がマチュア部分に相当し、 配列番号 1 8においては、 3 2 0番目から 4 2 9番目 の配列がマチュア部分に相当する。 すなわち、 本発明の医薬組成物は、 配列番号 4の少なくとも 3 1 9番目から 4 2 8番目の配列を含む配列からなるタンパク質 を含み、 また配列番号 1 8の少なくとも 3 2 0番目から 4 2 9番目の配列を含む 配列からなるタンパク質を含む。
また、 当該タンパク質には、 配列番号 4、 配列番号 1 8、 配列番号 4の少なく とも 3 1 9番目から 4 2 8番目、 または配列番号 1 8の少なくとも 3 2 0番目か ら 4 2 9番目の配列に示される配列を有するァミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸 の欠失、 置換、 付加又は揷入を有し、 かつ癌の増殖を阻害する活性を有するタン パク質も含まれる。 「1から数個」 の範囲は特には限定されないが、 例えば、 1か ら 20個、 好ましくは 1から 10個、 より好ましくは 1から 7個、 さらに好ましく は 1から 5個、 特に好ましくは 1から 3個、 あるいは 1個又は 2個である。 この ようなタンパク質には、 例えば、 マウスゃヒ トと異なる哺乳動物種のオルソログ などが含まれる。 また、 当該タンパク質は、 ポリペプチドの C末端または N末端 に標識べプチドを結合させた融合タンパク質の形態であっても良い。 代表的な標 識ペプチドには、 6〜1 0残基のヒスチジンリピート （H i sタグ）、 F L A G , m y cペプチド、 G F Pポリペプチドなどが挙げられるが、 標識ペプチドはこれ らに限られるものではない。
当該タンパク質は、 当業者にとって周知であるように、 遺伝子工学的手法を用 いて、製造 '精製することができる。すなわち、 当該タンパク質をコードする DNA またはその断片を適当なベクターに組込み、 このベクターを適当な宿主細胞に導 入し、当該タンパク質を発現させることが可能である。宿主細胞としては、 E. coli、 酵母、 SF9、 SF21、 C0S1、 C0S7、 CH0、 HEK293など周知の細胞を用いることが可能 である。 発現されたタンパク質は、 宿主細胞の培養上清より、 タンパク質精製に 用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒 (エタノール、 メタノール、 アセトン等） による沈殿分離、 イオン交換クロマトグラフィー、 等電点クロマト グラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 珠水性ク口マトグラフィー、 吸着力 ラムクロマトグラフィー、 基質または抗体などを利用したァフィ-ティークロマ トグラフィー、 逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、 精密 ろ過、 限外ろ過、 逆浸透ろ過等の濾過処理など、 を 1つまたは複数組み合わせて 用いて精製することが可能である。
また、 医薬組成物中に含まれ得る BMP9タンパク質の機能的断片とは、 BMP9タ ンパク質の癌の増殖を阻害できる活性を保持している、 BMP9タンパク質の一部分 を意味する。
さらに、 本発明の BMP9タンパク質、 BMP9タンパク質をコードする核酸、 BMP9 タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターのいずれかあるいはそれらの組 み合わせを有効成分とする、 癌を治療およびノまたは予防するための医薬組成物 として遺伝子治療用医薬組成物が挙げられる。該遺伝子治療用医薬組成物は、 BMP9 をコードする核酸、 BMP9をコードする核酸を含む発現ベクター、 BMP9をコードす る核酸を含む形質転換体、または BMP9タンパク質のいずれか、あるいはそれらの 組合せを含むことができる。 医薬組成物中に含有される、 BMP9をコードする核酸 には mRNAおよび DNAが含まれ、それらの断片をも含む。 これらの核酸は導入され た標的細胞において転写 ·翻訳され、 BMP9タンパク質またはその断片を発現する ことが可能である。
mRNAは、 当業者にとって周知であるように、 遺伝子工学的手法を用いて作製す ることが可能である。 例えば、 化学合成や、 プロモーターおよび RNAポリメラー ゼを用いた転写系によって in vitroで合成することができる。 DNAとしては、 上 記 GenBankなどに登録された公知のヌクレオチド配列を有する DNAを用いること ができるが、配列番号 3 (マウス BMP9)および配列番号 1 7 (ヒ ト BMP9)に示され る配列を有する DNAが好ましく、特に、配列番号 1 7に示される配列を有する DNA が好ましい。 また、 配列番号 3および 1 7に示される配列は、 シグナル配列、 pro-region を含み、 本発明の医薬組成物には、 少なく ともシグナル配列と pro-regionを除いたマチュア部分が含まれていればよい。配列番号 3においては、 9 5 5番目から 1 2 8 7番目の配列がマチュア部分をコードし、 配列番号 1 7に おいては、 9 5 8番目から 1 2 9 0番目の配列がマチュア部分をコードする。 す なわち、 本発明の医薬組成物は、 配列番号 3の少なくとも 9 5 5番目から 1 2 8 7番目の配列を含む配列からなる DNAを含み、 また配列番号 1 7の少なくとも 9 5 8番目から 1 2 9 0番目の配列を含む配列からなる DNAを含む。
また、 DNA には、 配列番号 3、 配列番号 1 7、 配列番号 3の少なくとも 9 5 5 番目から 1 2 8 7番目、 または配列番号 1 7の少なくとも 9 5 8番目から 1 2 9
0番目の配列に示される配列を有する DNAにおいて、 1から数個のヌクレオチド の欠失、 置換、 付加又は挿入を有し、 かつ癌の増殖を阻害する活性を有するタン パク質をコードする DNAも含まれる。 「1から数個」の範囲は特には限定されない が、例えば、 1から 20個、好ましくは 1から 10個、 より好ましくは 1から 7個、 さらに好ましくは 1から 5個、 特に好ましくは 1から 3個、 あるいは 1個又は 2 個である。 また、 DNA には、 配列番号 3、 配列番号 1 7、 配列番号 3の少なくと も 9 5 5番目から 1 2 8 7番目、 または配列番号 1 7の少なくとも 9 5 8番目か ら 1 2 9 0番目の配列に示される配列からなる DNAに相補的な配列からなる DNA とストリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、 かつ癌の増殖を阻害する活性 を有するタンパク質をコードする DNAも含まれる。 ここで、 ストリンジェントな 条件とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイブリッド が形成されない条件をいい、 例えば、 ナトリゥム濃度が、 10mM〜300mM、 好ましく は 20〜100mMであり、温度が 25°C〜70°C、好ましくは 42° (：〜 55°Cでの条件をいう。 さらに、 DNA には配列番号 3、 配列番号 1 7、 配列番号 3の少なくとも 9 5 5番 目から 1 2 8 7番目、 または配列番号 1 7の少なくとも 9 5 8番目から 1 2 9 0 番目の配列と BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (米国国立生物学情報センターの基本ローカルァラ インメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ） を用いて計算したときに、 80%以上、 より好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、 かつ癌の増殖を阻害する活性を有 するタンパク質をコードする DNAも含まれる。
このような DNAには、 例えば、 マウスゃヒ トと異なる哺乳動物種のオルソログ をコードする DNAが含まれる。医薬組成物中に含有される BMP9をコードする核酸 の断片とは、 BMP9タンパク質の癌の増殖を阻害できる活性を保持している機能的 断片をコードしている核酸を意味する。
核酸を被験体へ導入する方法として、 ウィルスベクターを用いる方法おょぴ非 ウィルスベクターを用いる方法があり、 種々の方法が公知である（別冊実験医学、 遺伝子治療の基礎技術、 羊土社、 1996；別冊実験医学、 遺伝子導入 &発現解析実験 法、 羊土社、 1997 ; 日本遺伝子治療学会編、 遺伝子治療開発研究ハンドブック、 ェヌ 'ティー 'エス、 1999)。 遺伝子導入のためのウィルスベクターとしては、 ァ デノウィルス、 アデノ随伴ウィルス、 レトロウイルス等のウィルスベクターを用 いた方法が代表的なものである。無毒化したレト口ウィルス、ヘルぺスウィルス、 ワクシュアウイノレス、 ボックスウィルス、 ポリオゥイノレス、 シンビスゥイノレス、 センダイウィルス、 SV40、 免疫不全症ウィルス（HIV)等の DNAウィルスまたは RNA ウィルスに目的とする遺伝子を導入し、 細胞に組換えウィルスを感染させること によって、 細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
当該発現ベクターは、 当業者に周知である遺伝子工学的手法を用いて、 適当な ベクターに、 BMP9をコードする DNAまたはその断片をプロモーターおよび Zまた はその他の制御配列と機能し得るかたちで連結して揷入することによつて作製す ることができる。 「機能し得るかたちで連結して揷入する」 とは、 当該発現べクタ 一が導入された細胞において、 プロモーターおよびノまたはその他の制御配列の 制御の下、 BMP9タンパク質が発現されるように、 プロモーターおよび/またはそ の他の制御配列を違結してベクターに組み込むことを意味する。
核酸を、 一旦、 適当な宿主細胞に上記方法を用いて導入し、 その形質転換体を 被験体に移植することも可能である。 宿主細胞の由来は、 自己 （auto)、 同種異系 (allo)、 および異種 （zeno) のいずれであってもよいが、 本発明をヒトの治療に 適用する場合、 好ましくは自己由来又は同種異系由来であり、 最も好ましくは自 己由来の細胞である。 異種供給源としては、 ブタゃサル、 その他の哺乳動物が挙 げられる。
上記の遺伝子治療に用いる医薬組成物は、 遺伝子治療の分野で用いられている 種々の投与方法で被験体に BMP9を送達することができる。このような遺伝子治療 が有効であること力 s、例えば肝細胞増殖因子（H G F ; Daiら、 J. Am. So Nephrol.
15： 2637-2647, 2004)、 エリスロポエチン （E P O ； Rivera ら、 Blood, 105：
1424-1430, 2004) などについて報告されている。 例えば、 核酸又は発現ベクター を被験体に直接投与 （ i n V i v o法） してもよいし、 又は被験体から採取し た細胞に導入して、目的の BMP9を発現する形質転換細胞を選択してからその細胞 を被験体に投与してもよい（e x V i V o法）。 目的の組織又は細胞に発現べク ターを投与するために使用し得る遺伝子送達機構には、 コロイド分散系、 リポソ ーム誘導系、 人工ウィルスエンベロープなどが含まれる。 例えば、 送達系は巨大 分子複合体、 ナノカプセル、 ミクロスフエア、 ビーズ、 水中油型乳剤、 ミセル、 混合ミセル、 リボソーム等を利用することができる。 核酸又は発現ベクターの直 接投与は、 例えば静脈内注射 （点滴を含む）、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射 などにより行うことができる。 また、 発現ベクターの細胞導入 （形質転換） は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 D E A Eデキストラン法、 エレクト口ポレーショ ン法、 又はリボフヱクシヨン法等の一般的な遺伝子導入法を用いて行うことがで きる。 核酸、 発現ベクター又は形質転換体の使用量は、 投与経路、 投与回数、 被 験体の種類によって異なるが、 当技術分野で慣例的な手法を用いて適宜決定する ことができる。
本発明の医薬組成物を用いて治療し得る癌としては、 固形癌が挙げられる。 固形癌とは、血管により支持される多細胞塊として成長する腫瘍細胞を意味し、 例えば、 口腔内癌、 大腸癌、 結腸直腸癌、 肺癌、 乳癌、 脳腫瘍、 黒色腫、 腎細胞 癌、 胃癌、 膝臓癌、 子宮類癌、 子宮内膜癌、 卵巣癌、 食道癌、 肝臓癌、 頭頸部扁 平上皮癌、 皮膚癌、 膀胱癌、 尿路癌、 前立腺癌、 絨毛癌、 咽頭癌、 喉頭癌、 きょ う膜腫、 男性胚腫、 子宮内膜過形成、 子宫内膜症、 胚芽腫、 線維肉腫、 力ポジ肉 腫、 血管腫、 海綿状血管腫、 血管芽腫、 網膜芽腫、 星状钾胞腫、 神経線維腫、 稀 突起謬腫、 髄芽腫、 神経芽腫、 神経膠腫、 横紋筋肉腫、 謬芽腫、 骨原性肉腫、 平 滑筋肉腫、 甲状肉腫おょぴウィルムス腫瘍などが挙げられるが、 これらに限定さ れない。 特に好ましくは、 肺癌および滕臓癌である。
本発明の医薬組成物は、 注射およぴ /または移植によって直接癌に対して投与 することが可能であり、 また、 経口投与又は非経口投与 （例えば、 静脈内投与、 動脈内投与、 注射による局所投与、 腹腔または胸腔への投与、 皮下投与、 筋肉内 投与、 舌下投与、 経皮吸収または直腸内投与など） によっても、 投与することが できる。
また、 投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。 具体的には注射剤、 懸濁剤、 乳化剤、 軟膏剤、 クリーム剤錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 丸剤、 細粒剤、 トローチ錠、 直腸投与剤、 油脂性坐剤、 水溶性坐剤等の各種製剤形態に 調製することができる。
また、 医薬組成物の成分として形質転換体を含む場合には、 ァテロコラーゲン ゲルなどの適当な担体に細胞を充填し局所的に注入することも可能である。
これらの各種製剤は、 通常用いられている賦形剤、 増量剤、 結合剤、 浸潤剤、 崩壌剤、 表面活性剤、 滑沢剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防腐剤、 着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。 賦形剤としては、 例えば、 乳糖、 果糖、 プドウ糖、 コーンスターチ、 ソルビッ トおよび結晶セルロース、 滅菌水、 エタノール、 グリセロール、 生理食塩水、 緩 衝液などが、 崩壊剤としては、 例えば澱粉、 アルギン酸ナトリウム、 ゼラチン、 炭酸カルシウム、 クェン酸カルシウム、 デキストリン、 炭酸マグネシウムおよび 合成ケィ酸マグネシウムなどが、 結合剤としては、 例えばメチルセルロース又は その塩、 ェチルセノレロース、 アラビアゴム、 ゼラチン、 ヒ ドロキシプロピルセノレ ロースおよびポリビニルピロリ ドンなどが、 滑沢剤としては、 タルク、 ステアリ ン酸マグネシウム、 ポリエチレングリコールおよび硬化植物油などが、 安定化剤 としては、例えばアルギニン、 ヒスチジン、 リジン、 メチォニンなどのアミノ酸、 ヒ ト血清アルブミン、 ゼラチン、 デキストラン 40、 メチルセルロース、 亜硫酸ナ トリウム、 メタ亜硫酸ナトリウムなどが、 その他の添加剤としては、 シロップ、 ワセリン、 グリセリン、 エタノーノレ、 プロピレングリコーノレ、 クェン酸、 塩化ナ トリウム、 亜硝酸ソーダおよびリン酸ナトリゥムなどがそれぞれ挙げられる。 医薬組成物の成分として形質転換体を含む場合には、 シクロスポリン、 ァクロ リムス水和物、 シクロホスフアミ ド、 ァザチォプリン、 ミゾリビン、 およびメ ト トレキセート等、 公知の免疫抑制剤を使用しても良い。
本発明の医薬組成物に含まれる BMP9は、 患者の年齢、 体重、 疾患の重篤度など の要因によって変化し得るが、 mRNA、 発現ベクター、 およびタンパク質であれば 1回につき体重 1kgあたり 0. 0001mg〜100mg、形質転換体であれば約 102細胞〜約 109細胞の範囲から適宜選択される量を含めることができる。
また、医薬組成物中に含有される mRNAおよぴ発現べクタ一の目的の組織又は細 胞への遺伝子送達は、 遺伝子治療の分野で用いられている種々の投与方法を利用 することが可能であり、 例えば、 コロイ ド分散系、 リボソーム誘導系、 人工ウイ ルスエンベロープ、 巨大分子複合体、 ナノカプセル、 ミクロスフエア、 ビーズ、 水中油型乳剤、 ミセル、 混合ミセル、 リボソーム等を利用することができる。 さ らに、 例えば、 リン酸カルシウム法、 D E A Eデキストラン法、 塩化カルシウム Z塩化ノレビジゥム法、 エレク ト口ポレーション法、 エレク ト口インジェクション 法、 リボフヱクシヨン法、 遺伝子銃などを用いる方法なども利用することが可能 である。
本発明の医薬組成物は、 VEGF阻害剤と併用することが可能である。 VEGF阻害剤 としては、 VEGFの活性を阻害し、 かつ腫瘍増殖に対して抑制的に働くことが可能 な物質であれば特に限定されないが、例えば、抗 VEGF抗体（ベバシズマブ）、 VEGF のレセプターである KDR のキぅ "一ゼ阻害低分子薬であるソラフェニブ sorafenib およぴスニチニブ Sunitinib、 などが挙げられる。
「併用する」 とは、本発明の医薬組成物と VEGF阻害剤とを同一の組成物中に含 めて同時に投与すること、本発明の医薬組成物と VEGF阻害剤とを別個の組成物と して同時に投与すること、または本発明の医薬組成物もしくは VEGF阻害剤のいず れかを投与した後に、 逐次的に残りの他方を投与することを意味する。
本発明の医薬組成物と VEGF阻害剤とを、癌に対して併用することにより、それ らを単独で投与した場合と比較して、 有意に優れた腫瘍増殖抑制効果を得ること が可能である。
本発明は、 さらに本発明の医薬組成物を用いた癌の治療法を包含する。 該方法 により治療し得る癌としては、 上に定義したような癌が含まれる。
本発明はまた、 BMP9の生体内機能を解析するための B細胞特異的発現ノックイ ンキメラマウスおょぴその作製法を提供することを目的とする。
機能不明の分泌タンパク質の生体内機能を効率的に解析する手法として柿谷ら (Kakitani, Μ· , et al. , Nucleic Acids Res.， 33， e85 (2005) ) は以下 ( i ) 〜 ( i i i ) の工程からなる遺伝子改変マウス作製方法を報告している。 （ i ) I g κプロモーターに連結した外来 c D N Αの発現ュニッ卜を、 相同組換えにより免 疫グロブリン κ鎖遺伝子下流域に挿入 （ノックイン） したマウス E S細胞を作製 する。 （ i i )遺伝子改変されたマウス E S細胞を機能的な B細胞および抗体産生 能を欠損する免疫グロプリン重鎖ノックァゥトマウスの胚に注入することにより キメラマウスを作製する。 （ i i i )得られたキメラマウスの B細胞は、 毛色のキ メラ率に関わらず全て注入した遺伝子改変 E S細胞に由来するものである。 ノッ クインされた外来 c D N Aがコードするタンパク質はノックイン （K I ) キメラ マウス B細胞から分泌されるが、 上記の理由によりその発現量はキメラ率に依存 しない。
発現個体を得るために多数の遺伝子挿入個体を解析する必要があり、 かつ子孫 伝達が必要であつた従来のトランスジエニックマウス作製法と比較して、 B細胞 特異的な発現が保証され、 かつキメラマウスでの機能解析が可能なこの方法は、 多数の機能未知遺伝子の機能を網羅的に解析するために有用である。 実際、 K i mら （Kim， K. A.， et al. , Science 309, 1256-1259 (2005) ) は、 上記の方法に 従って作製された機能未知遺伝子、 ヒ ト R— s p o n d i n lのノックインキメ ラマウスの表現型（腸管上皮の過増殖に起因する劇的な腸管の肥厚 '伸長）から、 R - s p o n d i n 1タンパク質が強力な腸管上皮増殖促進活性を有することを 見出し、本システムが分泌性因子の機能評価に非常に有用であることを実証した。 本発明における BMP9ノックインキメラマウスの作製法は、柿谷ら（Kakitani, M. , et al. , Nucleic Acids Res. , 33, e85 (2005) ) に報告された方法にさらに改変を 加えたものである。 例えば、 マウス B細胞におけるより効率的な分泌発現を可能 にするため、 BMP9の分泌シグナル配列をマウス I g κ遺伝子の分泌シグナル配列 と置換する。 ここでヒ ト BMP9をノックインする場合には、 ヒ ト BMP9タンパク質 の N末端から 2 2番目のグリシンまでの領域を、またマウス BMP9をノックインす る場合には、マウス BMP9タンパク質の N末端から 2 2番目のグルタミンまでの領 域を置換することが好ましい。ヒ トまたはマウス BMP9ノックインキメラマウスお ょぴ外来 c D N A発現ュュットを揷入していない E S細胞を用いて作製されたコ ントローノレキメラマウスについて柿谷ら （Kakitani, M. , et al. , Nucleic Acids Res. , 33， e85 (2005) ) の報告に記載された通り、 各組織の病理解析、 免疫組織化 学解析、 血清生化学検査、 血球成分測定等を実施して、 BMP9の発現に起因する変 化を特定できる。 本明細書の実施例 9においては、 コントロールキメラマウスに 比較しマウス BMP9ノックインキメラマウス特異的な表現型として、 腹水、 胸水、 リンパ組織、 小腸おょぴ滕臓に出血が原因と考えられる赤色化が、 実施例 1 0に おいては、 血管透過性の亢進が認められた。 また。 実施例 2 4において、 コント ロールキメラマウスに比較しヒ ト BMP9 ノックインキメラマウス特異的な表現型 として、 腹水、 胸水、 リンパ組織、 小腸および膝臓に出血が原因と考えられる赤 色化が観察され、マウス BMP9ノックインキメラマウスで認められた表現型と極め て類似していることが明らかにされた。
上記 BMP9ノックインマウスの作製においては、 BMP9をマウスの B細胞におい て特異的に発現させるためのノックインベクター （核酸構築物） を使用すること が好ましい。 かかるノックインベクター （核酸構築物） は、 BMP9をコードする核 酸と、 B細胞における発現を指令する転写調節配列を含む。 B細胞における発現 を指令する転写調節配列としては、 当業者に公知の任意の配列を用いることがで きるが、例えば、 B細胞特異的プロモーター、免疫グロブリン （ I g ) 遺伝子 （κ 鎖遺伝子） の分泌シグナル配列が含まれる。
BMP9ノックインマウスは、 例えば確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマ二 ュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 羊土社、 1995) に従って作製するこ とができる。 具体的には、 BMP9ノックインベクター （核酸構築物） をマウス胚性 幹 （E S ) 細胞に導入し、 これを宿主胚 （好ましくは B細胞欠損系統の胚） の胚 胎盤胞又は 8細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。 この胚胎盤胞又は 8細胞 期胚を、 直接同種の仮親非ヒ ト動物の卵管に移植するか、 一日培養して胚盤胞ま で発生したものを該仮親の子宮に移植する。 その後、 仮親を飼育出産させること により、 仔動物を得る。 仔動物における E S細胞の貢献率は、 その毛色により大 まかに判定することができる。 ここで宿主胚として B細胞欠損系統の胚を使用し た場合には、 宿主胚由来の欠損する B細胞は存在せず、 ノックイン E S細胞由来 のもののみ存在する。 また、 ノックイン E S細胞由来の細胞において揷入した核 酸 （BMP9) が発現するかどうかは、 当該細胞由来の R N Aを用いた R T— P C R 法又はノーザンブロット法など、 BMP9に対する抗体を用いた酵素免疫測定法 （E L I S A) 又はウェスタンブロット法などを利用して検出できる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 に限定されるものでない。
実施例 1 ：マウス BMP9 DNA断片 （シグナル配列無し） の作製
mBMP9 (-SP) FW： AAGCCGCTGCAGAACTGGGAACAAG (配列番号 1 )
mBMP9 (-SP) RV： TTGGCCGGCCCTACCTACACCCACACTCAGCCACA (配列番号 2 )：下線部は、
Fselサイ ト含む
KOD-plus- (日本国東洋紡績株式会社） を用い添付文書にしたがって反応液を調 製し、 50 Ai l 反応液中に上記 2 種のプライマー各 15pmol、 铸型としてマウス
BMP9- cDNA (開始コドンから終止コドンを含む 1287bp 配列番号 3 )を添加し、 94°C
3分保温した後、 98°C15秒、 63°C15秒および 68°C2分 30秒を 1サイクルとして
30サイクル増幅し、 72°C3分保温した。 得られた 1221bpの増幅断片を 0. 8%ゲル で分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株 式会社キアゲン) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。 回収された
PCR増幅断片を Fsel (日本国ニュー ·ィングランド ·バイオラボ · ジャパン株式 会社） で酵素消化し、 QIAquick PCR Purification Kit (日本国株式会社キアゲン） を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
以下に、 配列番号 3および 4におけるマウス BMP9シグナル配列、 pro- region、 mature体部分をそれぞれ GenBankァクセッション番号 NP_062379 ， Q9WV56の f 報を元に、 下線、 囲み線、 イタリック体で示す。 配列番号 3 ：
ATGTCCCCTGGGGCCTTCCGGGTGGCCCTGCTCCCGCTGTTCCTGCTGGTCTGT
GTCACACAGCAG1AAGCCGCTGCAGAACTGGGAACAAGCATCCCCTGGGGAAAAT
GCCCACAGCTCCCTGGGATTGTCTGGAGCTGGAGAGGAGGGTGTCTTTGACCTG
CAGATGTTCCTGGAGAACATGAAGGTGGATTTCCTACGCAGCCTTAACCTCAGC
GGCATTCCCTCCCAGGACAAAACCAGAGCGGAGCCACCCCAGTACATGATCGAC
ffTGTACAACAGATACACAACGGACAAATCGTCTACGCCTGCCTCCAACATCGTGC
GGAGCTTCAGCGTGGAAGATGCTATATCGACAGCTGCCACGGAGGACTTCCCCT
TTCAGAAGCACATCCTGATCTTCAACATCTCCATCCCGAGGCACGAGCAGATCAC
CAGGGCTGAGCTCCGACTCTATGTCTCCTGCCAAAATGATGTGGACTCCACTCAT
GGGCTGGAAGGAAGCATGGTCGTTTATGATGTTCTGGAGGACAGTGAGACTTGG
GACCAGGCCACGGGGACCAAGACCTTCTTGGTATCCCAGGACATTCGGGACGAA^
GGATGGGAGACTTTAGAAGTATCGAGTGCCGTGAAGCGGTGGGTCAGGGCAGA^
CTCCACAACAAACAAAAATAAGCTCGAGGTGACAGTGCAGAGCCACAGGGAGAG
CTGTGACACACTGGACATCAGTGTCCCTCCAGGTTCCAAAAACCTGCCCTTCTTT
GTTGTCTTCTCCAATGACCGCAGCAATGGGACCAAGGAGACCAGACTGGAGCTG
^AGGAGATGATCGGCCATGAGCAGGAGACCATGCTTGTGAAGACAGCCAAAAAT
GCTTACCAGGTGGCAGGTGAGAGCCAAGAGGAGGAGGGTCTAGATGGATACACA^
GCTGTGGGACCACTTTTAGCTAGAAGGAAGAGGLAGCACCGGAGCCAGCAGCCA
CTGCCAGAAGACTTCTCTCAGGGTGAACTTTGAGGACATCGGCTGGGACAGCTG
GATCATTGCACCCAAGGAATATGACGCCTATGAGTGTAAAGGGGGTTGCTTCTTC
CCATTGGCTGATGACQTGACACCCACCAAACATGCCATCGTGCAGACCCTGGTG
CATCTCAAGTTCCCCACAAAGGTGGGCAAAGCCTGCTGCGTTCCCACCAAACTG
AGTCCCATCTCCATCCTCTACAAGGATGACATGGGGGTGCCAACCCTCAAGTACC
ACTATGAGGGGATGAGTGTGGCTGAGTGTGGGTGTAGGTAG
以下に、 配列番号 3がコードするアミノ酸配列 （428 アミノ酸、 配列番号 4 ) を示す。 配列番号 4 ：
Figure imgf000023_0001
SLRVNFEDIGWDSWIIAPKEYDAYECKGGCFFPLADDVTPTKHAIVQTLVHLKFP TKVGKACCVPTKLSPISILYKDDMGVPTLKYHYEGMSVAECGCR
実施例 2 ： pPSs mBMP9 ベクターの構築 pPSs mBMP9
国際公開第 WO 2006/78072 号パンフレツトの実施例 1一 8記載の pPSs5. 5 を Sfolおよび Fselで消化後、 大腸菌由来アル力リフォスファターゼを用いて末端 脱リン酸化したものに、実施例 1で作製した DNA断片を揷入した後、 DH5 o;に導入 した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認して、 pPSs mBMP9ベクター （図 1 ) を取得した。
実施例 3 ： pUSmBMP9 KIベクターの構築 pUSraBMP9 KI
国際公開第冊 2006/78072号パンフレツ トの実施例 4 3— 1で作製された pCk loxPV A Pを Padおよび Fselで酵素消化後、大腸菌 C75由来アル力リフォスファ ターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記実施例 2の pPSs mBMP9ベクター を Paclおよび Fselで酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより分離回収された約 2 kb の断片を揷入した後、 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracompetent Cells (米国
STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩 基配列を確認して、 pUSmBMP9 KIベクター （図 2 ) を取得した。
以下に pUSmBMP9 KIベクター mBMP9発現ユエットの開始コドンから終止コドン までのポリヌクレオチド配列（マウス BMP9シグナル配列を、イントロン領域を含 んだマウス Ig Kシグナル配列 〔下線部分〕 に置換し、 その下流にマウス BMP9 pro 体配列を含む 1522bp、配列番号 5 )、および該 cDNAがコードするァミノ酸配列（426 アミノ酸、囲み線の部分はマウス Ig /cシグナル配列を示す、配列番号 6 )を示す。 イントロン領域を含んだマウス Ig κシグナル配列情報は GenBank より取得した
MUSIGKVRl (ァクセッション番号 K02159)をもとに、その上流のゲノム配列を UCSC マウスゲノムデータベースより取得した。 -zz- ^ ^ ^y^ · 国本 s) 、 （¾ :^ ¾ 。、/ ^^ η ^ Λ . ム 国本 g 0 " H^ w I ) i¾绺べ^■ 、¾ sw09— ^ 6cMa«isnd
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VOVOOVOOO^VXOOlXO OOVOWOOVOOOOOVOOOOVOOVOOOiJLOVOVOJ-O VDVOOVOO O^OXVOLLVi XOO DOJ^OOWOOWOO OOOOJiVOXOVOO OV
OOVOOOVOODOJiVOOlOJiVOWOLLJLOJVOLOOLLVOVOOWOVOlIiJLOOOOJi OVO OVOOOVODOXOOVOVOOXVlVJuOO VOWOOXOOOVOJ- OOVOOODJLOOAVOW OOIiOOOXOOOOVvLDJLOOJiWVDVOOOWDVDVJiVOVOWDVJiOlJ^OVOOJLVOI-VO VXOVOOOOVOOOVOOOOVOVOOWWOVOOVOOO OOO JiVOOODOVOXOOWJi
OIOOOVOOVOVOOJLOOVOOXD O XVDDO OOOXOOVOVOOOOIWWOOOOJLO
OJiOOOIiV OJiOViVOXVXJLVOOOOiLOXOJiOOWOOXVOOlIiOLLOWOVOVOOIiOV OVO OOVOOXiOOOI-OXOOJLOOIiOVJiOOOXV IiOJLOOJLOVOVOVOVOVOVOOJLV 86£L0 0ZdT/lOd 8 丽 6002； OAV ックス株式会社、 制限酵素用 Hバッファー） を用い、 Notl (日本国タカラバイオ 株式会社） を用いて 37°Cで 5時間消化し、 フニノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5 容量の 100%エタノール、 および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリウムを加え、 -20°Cで 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェタノ ールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間風乾 させた。 0. 5 g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で保存 し、 Electroporation用 pUSmBMP9 KIベクターの調製を行なった。
実施例 5 ： pUSmBMP9 KIベクターと RSエレメント · ターゲティング · マウス E S 細胞株を用いた PLmBMP9マウス E S細胞株の取得
マウス BMP9- cDNAが相同組換えにより免疫グロプリン κ軽鎖遺伝子下流に揷入 された PLmBMP9マウス E S細胞株取得のため、 実施例 4で示された方法に従い、 制限酵素 Notl (日本国タカラバイオ株式会社） で線状化された PUSmBMP9 KIベタ ターを確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンタ ーゲティング、 羊土社、 1995) に従って RSエレメント 'ターゲティング ·マウス E S細胞へ導入した。 国際公開第 TO 2006/78072号パンフレツ トの実施例 1 0に 記載された方法で RSエレメント'ターグティング ·マウス E S細胞は取得された。
RSエレメント ·ターグティング .マウス E S細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、 前記） に従い、 フィーダ一細胞はマイ トマイシン C (日本国シグマアル ドリツチジャパン株式会社）処理した G418耐性初代培養細胞（日本国インビトロ ジェン株式会社より購入） を用いた。 まず、 增殖させた RSエレメント ·ターゲテ イング 'マウス E S細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ ml となるように HBS に懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を lO ^ gのベクター DNAと混和し、 ジーンパ ルサーキュべット （電極距離： o. 4cm、 日本国バイオ · ラッド ラボラトリーズ株 式会社） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 F、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地 （相沢慎一、 前記） に 懸濁し、 あらかじめフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシ ヤーレ （ファルコン、 日本国べタ トン .ディッキンソン株式会社） 1枚に播種し た。 36時間後に 0. 8 § 1のピューロマイシン （日本国シグマアルドリッチジャ パン株式会社） を含む E S培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーをピック アップし、 それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、そ の 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10%DMSO、 日本国シグマアルドリツチジャパ ン株式会社） に懸濁し、 _80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコート プレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA I solati on Kits (日本国株式会社キアゲン） により調製した。 これらのピュ 一口マイシン耐性 RS エレメント · ターゲティング 'マウス E S細胞ゲノム DNA を制限酵素 EcoRI (日本国タカラバイオ株式会社） で消化し、 ァガロースゲル電 気泳動で分離した。 続いてサザンプロッ トを行い、 W 00/10383 号パンフレツト (実施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J /c - C Kゲノム DNAの 3 ' 端の DNA靳片（XhoI〜EcoRI、約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレツト 図 5 ) Ck 3， probeをプローブとして相同組換え体を検出した。 野生型 RSエレメント ·ターゲ ティング ·マウス E S細胞では EcoRI消化により、 1本のパンドが検出された。 相同組換え体においては、 このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出るこ とが予想される （図 3 ) 力 ピューロマイシン耐性株においてこの新たなパンド が確認された。 すなわち、 これらのクローンは一方のアレルの免疫グロプリン/ 鎖遺伝子下流にマウス BMP9- cDNAが揷入されたものである。
実施例 6 ： PLmBMP9マウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した USmBMP9マゥ ス ES細胞株の取得
PLmBMP9マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Purc ， Neor) を除去した USmBMP9遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS- Creベクター（Sunaga ら、 Mol Reprod Dev. , 46 : 109-113， 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマ- ュアルシリーズ 8、 ジーンターグティング、 羊土社、 1995) に従って PLmBMP9マ ウス ES細胞へ導入した。
PLmBMP9マウス ES細胞の培養法は、 公知の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 フ ィーダ一細胞はマイ トマイシン C (日本国シグマアルドリツチジャパン株式会社） 処理した G418耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン株式会社より購入） を 用いた。 まず、 増殖させた PLmBMP9マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107 個 Zml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 μ §のべクタ 一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュべッ ト （電極距離： 0. 4cm、 日本国バイオ · ラッドラボラトリーズ株式会社） にてエレク ト口ポレーシヨンを行 όた （容量：
960 μ F, 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培 地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細 胞を播種した 60mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 日本国べク ト ン .ディッキンソン株式会社） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあ らかじめフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （フ アルコン、 日本国べタ トン ·ディッキンソン株式会社） 1枚に播種した。 6 日後 に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを 2 穴プレートでコンフルーェン トになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%皿 S0、 日本国 シグマアルドリッチジャパン株式会社） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞 からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (日本国株式会社キアゲン） に より調製した。
これらマウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国タカラバイオ株式 会社） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサザンプロットを 行い、 国際公開第 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に記載の発明で 使用された、 I g軽鎖 J K - C κゲノム DNAの 3，端の DNA断片（Xhol〜EcoRI、約 1. 4kb、 国際公開第 TO 00/10383号パンフレッ ト 図 5 ) Ck 3 ' probeをプローブとして loxPV配列で挟まれた Pur 遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Puro1 遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のパンド（15. 1 Kと 13. 3 K) が検出され、 Puro 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2 本のパンド （15. 1 Kと 11. 6 K) が検出された （図 3 )。 また、 上記と同様の操作 で得られたサザンブロッ ト膜を用い、 国際公開第 W0 2006/78072号パンフレツト の実施例 9で示された方法により調製された 3' ΚΟ-probeをプロープとして loxP 配列で挟まれた Ne0r遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Ne0r遺伝子 を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のパンド （7. 4 Kと 5. 7 K) が検 出され、 Ne0r遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のパ ンド （5. 7 K と 4. 6 K) が検出された （図 3 )。 これらの結果から、 PLmBMP9マウ ス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Pure/, Neor) が同時に除去された ES細 胞株 （USmBMP9マウス ES細胞株） が得られた。
実施例 7 ： USmBMP9 マウス E S細胞株おょぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主 胚を用いた USmBMP9 KIキメラマウスの作製
免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991) 0清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した E S細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97： 722-7, 2000) に 記載された免疫グロプリン X鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア株式会社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製 用として用いた。
上記実施例 6で得られ、 免疫グロブリン/ c鎖遺伝子下流にマウス BMP9- cDNAが 挿入されていることが確認された USmBMP9マウス ES細胞株を凍結ストツクより立 ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌 雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注 入した。 E S培地 (相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティ ング、羊土社、 1995) で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア株式会社） の子宮に、 片側の子宫 あたりそれぞれ約 10 個のインジヱクション胚を移植した。 実施例 6の USmBMP9 マウス ES細胞株を用いて作製されたィンジヱクション胚を移植した結果、子キメ ラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白色の中に ES 細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。 誕生した 子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち E S細胞の 貢献の認められる個体が得られた。 これらの結果より、 免疫グロブリン κ鎖遺伝 子下流にマウス BMP9 - cDNAが揷入されている USmBMP9マウス ES細胞株はキメラ形 成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持して いることが示された。
実施例 8 ： コントロールキメラマウスの作製 国際公開第 WO 2006/78072号パンフレツトの実施例 1 1記載の方法に従い作製 されたキメラマウスは下記実施例 9で行われた USmBMP9 KIキメラマウスの表現型 解析実験、および実施例 1 0のエバンスブルーを用いた USmBMP9KIキメラマウス の血管透過性試験において、 コントロールキメラ個体として用いられた。
実施例 9 ： USmBMP9 KIキメラマウスの表現型解析
9— 1. 剖検所見
上記実施例 7および 8で作製されたキメラマウスを用い、 3週齢 · 4週齢 · 5 週齢においてそれぞれ剖検を実施した。 USmBMP9KIキメラマウスにおいてのみ腹 水、 胸水、 リンパ組織、 小腸おょぴ腌臓に出血が原因と考えられる赤色化が認め られた。 それぞれの変化を観察した時期およびその個体数を以下に記す。
9 - 1 - 1. 赤色化腹水貯留
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 腹水貯留は 3週齢全ての個体で観察されなか つたが、 4週齢 · 5週齢では全ての個体で赤色化した腹水の貯留が認められた。 9- 1 - 2. 赤色化胸水貯留
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 1個体、 4週齢 · 5週齢では全て の個体で赤色化した胸水の貯留が認められた。
9 - 1 - 3. 赤色化腸間膜リンパ節
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢以降 5週齢まで全ての個体において腸 間膜リンパ節の赤色化が認められた。
9 - 1 -4. 赤色化顎下リンパ節
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢以降 5週齢まで全ての個体において顎 下リンパ節の赤色化が認められた。
9- 1 - 5. 赤色化肘リンパ節
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢以降 5週齢まで全ての個体において肘 リンパ節の赤色化が認められた。
9一 1一 6 . 赤色化鼠径リンパ節
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢以降 5週齢まで全ての個体において鼠 径リンパ節の赤色化が認められた。
9 - 1 - 7 . 赤色化膝窩リンパ節
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢の全個体、 4週齢では 8個体、 5週齢 の全個体で膝窩リンパ節の赤色化が認められた。
9一 1一 8 . 小腸の赤色化
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 5個体、 4週齢 ' 5週齢では全個 体で小腸表面の一部に赤色点ないし赤色斑が認められた。
9 - 1 - 9 . 膝臓の赤色化
3週齢では 7個体、 4週齢では 9個体、 5週齢では 6個体 USmBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 2個体、 4週齢では 5個体、 5週 齢では 4個体で膝臓表面の一部に赤色化が認められた。
以上の結果より、 出血性変化が原因と考えられる腹水、 胸水、 リンパ組織、 小 腸および膝臓の赤色化はマウス BMP9 の過剰発現によって引き起こされた可能性 が示された。
9 - 2 . 病理所見
3週齢のコントロールキメラマウスおよび USmBMP9 KIキメラマウスから由来す る腸間膜リンパ節および鼠径リンパ節の H&E 染色病理切片を用いた観察から、 USmBMP9 KIキメラマウスにおいて洞内赤血球が特徴的に観察された。 洞内赤血球 は、 リンパ管を介した血液吸収を示唆する像であり、 周囲で出血性変化が起こつ た可能性が示された。 ただし、 肉眼 ·組織所見では明らかな出血巣は認められて いないことから、 血管外への赤血球漏出のような微小出血が起こっている可能性 も示された。
実施例 1 0 ： USmBMP9 KIキメラマウスの血管透過性試験 実施例 7および実施例 8で記載された方法に従って作製され、 5週齢に達した コントロールキメラマウスおよび USmBMP9 KIキメラマウスにそれぞれエバンスブ ルー、 30mg/kg (日本国 株式会社エル 'エス 'エル） を i. v.投与した。 60分後に 投与個体を剖検し、 腹水 ·胸水 ·臓器の性状 ·変化を指標に血管透過性を評価し た。その結果、エバンスブルーを投与した USmBMP9 KIキメラマウスにおいてのみ、 青く着色された腹水 '胸水が認められた。 また、 コントロールキメラ個体に比べ USmBMP9 KIキメラマウスの肺、 肝臓、 空腸、 回腸組織において青黒い濃染領域が 高頻度で認められた。 これらの結果から、 USmBMP9 KIキメラマウスにおいて血管 透過性が亢進し、 それによつて血中アルブミンが、 短時間で腹腔 ·胸腔に漏出し ていることが示唆された。
実施例 1 1 ： N末 His型 mBMP9 complex組換え体の発現 ·調製
1 1 - 1 . N末 His型 mBMP9 complex糸且換え体発現ベクターの構築
1 1 - 1 - 1 . pLNlV5ベクターの構築
5， 末端に BamHI · Nhel · Sail サイ トを 3， 末端に Xholサイ トを持つ (V5タグ +Stop codon)センスオリゴ DNAおよびそれに対するアンチセンスオリゴ腿: V5S および V5AS (日本国 北海道システムサイエンス株式会社） を合成した。 番号 7 ) 列番号 8 )
BamHI Nhel Sal V5 Stop Xhol
V5S: 5'- GATCC 6CTA6C GTCGAG GQTAAGCCTATGCCTAACCCTCTCCTCGeTCTCGATTCTACQ TGA C-3' (配 ¾番号 7) V5A& 3'-G CGATCG CAGCTG GCATTCGGATAGeGATrQQeAeAQQA6GGA6AQCTAA6ATGG ACTQAQCT-5' (E对番号 8)
上記合成オリゴ DNAを、 掛田らの報告 （Gene Ther. 12 : 852-856, 2005) に記載 された pLNlベクター上の BamHI - Xholサイ トに導入し、 pLNlV5ベクターを構築し た。
1 1一 1一 2 . N末端に Hisタグ配列を持つ mBMP9 DNA断片の合成 マウス BMP9全長配列の N末端に Hisタグを付加するための PCRプライマー mBMP9NheIkozakFw： CTA GCTAGC CGGCCACC ATGTCCCCTGGGGCCTTCCG
Nhel kozak ηιΒΜΡ9 (シグナル配列）
(配列番号 9 )
mBMP9 3HisRv： ATGGTGATGGTGATGATG CTGCTGTGTGACACAGACCAGC
His-タグ mBMP9 (シグナル配列）
(配列番号 1 0 )
mBMP9 5HisFw： CATCATCACCATCACCAT AAGCCGCTGCAGAACTGGGAA
His-タグ mBMP9 (シグナル直下の配列）
(配列番号 1 1 )
mBMP9SalIRv： ACGCGTCGACCTACCTACACCCACACTCAG
Sai l mBMP9 (Stop codon+C末端配列）
(配列番号 1 2 )
Prime STAR HS DNA Polymerase (日本国タカラバイオ株式会社） を用い添付文 書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1反応液中に配列番号 9および 1 0、 2種の プライマー各 10pmol、 铸型としマウス BMP9- cDNA (配列番号 3 ) を添加し、 94°C5 分保温した後、 98°C10秒、 57°C5秒、 および 72。C1分 20秒を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、得られた lOlbpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収 されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キアゲン） を用 い添付文書にしたがって増幅断片 （Nhel His mBMP9) を回収した。
Prime STAR HS DNA Polymerase (日本国タカラバイオ株式会社）を用い添付文書 にしたがって反応液を調製し、 50 ^ 1反応液中に配列番号 1 1および 1 2、 2種の プライマー各 10pmol、 铸型としマウス BMP9 - cDNA (配列番号 3 ) を添加し、 94°C5 分保温した後、 98°C10秒、 57°C5秒、 および 72°C1分 20秒を 1サイクルとして
25サイクル増幅し、 得られた 1249bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。 回 収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キアゲン) を 用い添付文書にしたがって増幅断片 （His mBMP9 Sail) を回収した。
上記 2回の PCRで得られた DNA増幅断片 （Nhel His mBMP9) および （His mBMP9 Sail) を PrimeSTAR bufferに加え全量を 100 μ 1 とし、 100°Cに 10分間加熱した 後、 室温に戻し、 His タグ領域をアニーリングさせた。 その後、 配列番号 9およ ぴ 1 2、 2種のプライマー各 lOpmol加え、 Prime STAR DNA Polymerase (日本国 タカラバイオ株式会社） を添加し伸長反応を 72°C3分間行い、 次に、 98°C 10秒、 57°C5秒、 および 72°C1分 20秒を 1サイクルとして 20サイクル増幅し、 最後に 72°C3分間ィンキュベート後、得られた 1332bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収 した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キア ゲン） を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。
1 1— 1— 3 . N末 His型 mBMP9 complex組換え体発現ベクターの構築
実施例 1 1— 1一 2で回収された PCR増幅断片を Nhelおよび Sail (日本国口 シュ ·ダイァグノスティックス株式会社） で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで 分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式 会社キアゲン） を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。 得られた 酵素処理断片を実施例 1 1一 1一 1で作製された PLN1V5ベクターの Nhel · Sail サイトに導入し、 N末 His型 mBMP9 complex組換え体発現ベクター （図 4 ) を構 築した。
以下に N末 His型 mBMP9 complex組換え体 cDNAの開始コドンから終止コドン までのポリヌクレオチド配列 （1305 bp, 配列番号 1 3 )、 および該 cDNAがコード する mBMP9のシグナル配列を含んだァミノ酸配列 （434アミノ酸、 配列番号 1 4 ) を示す。配列番号 1 3および 1 4において、下線部はマウス BMP9のシグナル配列 部分を、 囲み線はヒスチジンタグ部分を、 ィタリックはマウス BMP9 pro体部分を 示す。 配列番号 1 3 ：
ATGTCCCCTGGGGCCTTCCGGGTGGCCCTGCTCCCGCTGTTCCTGCTGGTCTGT
GTCAGACAGGAG\CATCATCACCATCACC ∑\AAGCCGCrGCAGAACTGGGAACAA
GCATCCCCTGGGGAAAATGCCCACAGCTCCCTGGGATTGTCTGGAGCTGGAGAG
GAGGGTGTCTTTGACCTGCAGATGTTCCTGGAGAACATGAAGGTGGATTTCCTA
CGCAGCCTTAACCTCAGCGGCATTCCCTCCCAGGACAAAACCAGAGCGGAGCCA
CCCCAGTACATGATCGACTTGTACAACAGATACACAACGGACAAATCGTCTACGC
CTGCCTCCAACATCGTGCGGAGCTTCAGCGTGGAAGATGCTATATCGACAGCTG
CCACGGAGGACTTCCCCTTTCAGAAGGACATCCTGATCTTCAACATCTCGATCCC
GAGGCACGAGCAGATCACCAGGGCTGAGCTCCGACTCTATGTCTCCTGCCAAAA
TGATGTGGACTCCACTCATGGGCTGGAAGGAAGCATGGTCGTTTATGATGTTCTG
GAGGACAGTGAGACTTGGGACCAGGCCACGGGGACCAAGACCTTCTTGGTATCC
CAGGACATTCGGGACGAAGGATGGGAGACTTTAGAAGTATCGAGTGCCGTGAAG
CGGTGGGTCAGGGCAGACTCCACAACAAACAAAAATAAGCTCGAGGTGACAGTG
CAGAGCCACAGGGAGAGCTGTGACACACTGGACATCAGTGTCCCTCCAGGTTCC
AAAAACCTGCCCTTCTTTGTTQTCTTCTCCAATGACCGCAGCAATGGGACCAAGG
AGACCAGACTGGAGCTGAAGGAGATGATCGGCCATGAGCAGGAGACCATGCTTG
TGAAGACAGCCAAAAATGCTTACCAGGTGGCAGGTGAGAGCCAAGAGGAGGAG
GGTCTAGATGGATACACAGCTGTGGGACCACTTTTAGCTAGAAGGAAGAGGAGC
ACCGGAGCCAGCAGCCACTGCCAGAAGACTTCTCTCAGGGTGAACTTTGAGGAC
ATCGGCTGGGACAGCTGGATCATTGCACCCAAGGAATATGACGCCTATGAGTGTA
AAGGGGGTTGCTTCTTCCCATTGGCTGATGACGTGACACCCACCAAACATGCCAT
CGTGCAGACCCTGGTGCATCTCAAGT CCCCACAAAGGTGGGCAAAOCCTGCTG
CGTTCCCACCAAACTGAGTCCCATCTCCATCCTCTACAAGGATGACATGGGGGTG
CCAACCCTCAAGTACCACTATGAGGGGATGAGTGTGGCTGAGTGTGGGTGTAGG
TAG 配列番号 1 4 (mMP9シグナル配列 〔下線部分〕 を含む） ：
MSPGAFRVALLPLFLLVCVTQQIHHHHHljgPム ^5¾!Α¾Ρ6^Λ¾£? "服 Z^G^G^
EGVFDLQMFLENMKVDFLRSLNLSGIPSQDKTRAEPPQYMIDLYNRYTTDKSSTP
ASNIVESFSVEDAISTAATEDFPFQKHILIFNISIPRHEQITRAELRLYVSCQNDVDS
THGLEGSMWYDVLEDSETWDQATGTKTFLVSQDIRDEGWETLEVSSAVKRWVR
ADSTTNKNKLEVTVQSHRESCDTLDISVPPGSKNLPFFVVFSNDRSNGTKETBLE
LKEMIGHEQETMLVKTAJKNAYQVAGESQEEEGLDGYTAVGPLLARRKRSTGASSH
CQKTSLRmFEDIGWDS iAPKEYDAYECKGGCFFPLADDVTPTKHAIVQTLVH
LKFPTKVGKACCVPTKLSPISILYKDDMGVPTLKYHYEGMSVAECGCR
1 1— 2 . N末 His型 mBMP9 complex組換え体発現ベクターを用いた N末 His型 mBMP9 complexの一過的発現
1 1 - 2 - 1 . 遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例 1 1一 1一 3 . で取得された N末 His型 mBMP9 complex組換え体発現べ クタ一を大腸菌 DH5aに導入し、 得られた形質転換体より DNAをプラスミ ド精製 キット （Qiagen plasmid Maxi kit; 日本国株式会社キアゲン） を用い調製した。 1 1 - 2- 2. 培養細胞へのベクター導入と分泌発現
Free style 293F細胞 （日本国インビトロジェン株式会社） を Free style 293 Expression Medium (日本国インビトロジェン株式会社） を用い、 37° (：、 5°/。C02、 125rpm条件下、 細胞密度が IxlO5から 3xl06 Cells/mlの範囲内で培養する。 培地 1Lを用いて培養した場合、 発現ベクター lmgに 35mlの Opti- MEM I Reduced Serum Medium (日本国イ ンビ ト ロジェン株式会社) を加え、 1.3ml の 293 fectin Transfection Reagent (日本国インビト口ジェン株式会社） に 33.7mlの Opti- MEM
I Reduced Serum Mediumを加え、 それぞれ 5分間室温でィンキュベートした。 ィ ンキュベート後この 2液を混合し、 更に 20-30分間室温でィンキュベートした。 その後、 1 X 109 cells/Lの Free style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理 された発現ベクターを添加し、 3日間培養した。
1 1 - 3. N末 His型 mBMP9 complexの精製 ·調製
1 1 - 3- 1. 培養上清前処理
培養後、上、清を回収し 0.22jumフイノレター（0.22 ^ m GP Express Membrane 500ml; 日本国日本ミリポア株式会社)で濾過処理を行った後 4°C (低温室）で冷却した。 凍結保存した場合には融解後、 再度 0.22 mフィルターで濾過した。
I I— 3— 2. Metal Chelate Affinityクロマトグラフィー
前処理された 1L培養上清を PBSで平衡化された Ni Sepharoseカラム（His Trap
HP 5ml; 日本国 GEヘルスケア バイォサイェンス株式会社) にアプライした。 そ の後、 PBS 25mlでカラムを洗浄し、 更に 2M NaClを含む PBS 25mlでカラムを洗 浄した。 次に、 25ml PBS, 30mM Imidazoleを含む PBS 10ml 40mM Imidazoleを 含む PBS 50ml の順番でカラムを洗浄した。 洗浄操作終了後、 カラムに 60mM
Imidazoleを含む PBS 50 ml を添加し目的タンパク質を回収した。 上記分離精製 操作には AKTAexplorerlOs (日本国 GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社） を用いた。 使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
1 1— 3— 3. イオン交換クロマトグラフィー
PBSで平衡化された強陰イオン交換カラム （Hi Trap Q HP 1 mL; 日本国 GEへ ルスケア バイォサイエンス株式会社) に流速： lmL/minの条件下、 実施例 1 1一 3一 2で得られた目的タンパク質を添加した。 PBS15ml、80mM NaClを含む PBS 10ml で順次力ラムを洗浄した。洗浄操作終了後、 lOOmMNaClを含む PBS 20ml, HOmMNaCl を含む PBS 25mlを順次カラムにアプライし、 目的タンパク質を回収した。 上記分 離精製操作には AKTAexplorerlOs (日本国 GEヘルスケア バイオサイエンス株式 会社） を用いた。 使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
1 1 - 3 -4. 精製標品調製
実施例 1 1一 3— 3で得られた精製標品中の bufferを限外濾過膜 VIVASPIN20 10, 000 MWC0 PES (日本国ザルトリ ウス 'ステディム · ジャパン株式会社) を用い て PBSに置換後、サンプルを濃縮した。濃縮操作後、 0. 22 μ πιフィルター （Millex GV; 日本国日本ミリポア株式会社） により濾過処理を行った。 操作は可能な限り クリーンベンチ内で行った。 実施例 1 1一 3で行われた全ての工程はクリーンべ ンチでの作業以外、 低温室 （+ 4°C) ないしは氷上で実施した。 最終精製品の SDS-PAGE (銀染色） より、 非還元条件下では mature 2量体、 少量の pro2量体、 pro— region力 S検出 5·れ、遠元条件 では mature卓量体、 pro-region^ 少直の pro 単量体が検出された （図 5 )。 この結果から、上記操作によって調製された精製標 品には pro- region2分子と mature 2量体 1分子が結合した複合体 （complex体） が主に含まれていると考えられた。 タンパク質濃度は A28。nraを測定し、分子吸光係 数 （E1¾, lcra=9. 6) より算出した。
抗 His抗体 Penta His HRP Conjugate (日本国株式会社キアゲン） を用いたゥ エスタンブロッテイングにより pro-regionと pro体を、 抗 hBMP9抗体 （米国 R&D Systems, Inc. )を用いたウェスタンブロッティングにより mature体を確認した。 実施例 1 2 ： インビトロでの N末 His型 ΙΏΒΜΡ9 complexの活性測定 （インビトロ 試験）
BMP9の活性評価には BMPシグナルを検出可能なレポーター'プラスミ ドを安定 導入した細胞株を用いた。具体的には、 BMPのシグナルを検出可能なレポーター · プラスミ ドである （p (GCCG) 12 - Luc/neo) を、 ヒ ト肝癌細胞株である HePG2 (ATCC より入手可能） に遺伝子導入し、安定導入株 HepG2 (38-5)株を作製した。 BMPシグ ナル検出用レポータープラスミ ド （p (GCCG) 12- Luc/neo) は、 ルシフェラーゼ遺伝 子の上流に、 BMPシグナル伝達因子である Smadl/5/8の結合配列をタンデムに 12 個連結させたプラスミ ド （p (GCCG) 12- Luc/neo) を Mol. Biol. Cell. , 2000, 11 (2) : 555- 65.の Kusanagiらの記載方法に準じて作製した。
ルシフヱラーゼ活性測定は、この細胞株に種々の濃度の BMP9を含む溶液を添加 し 5時間培養した後、化学発光試薬（Steady Glo (商標） Lucif erase assay system, 日本国プロメガ株式会社より入手可能） を用い実施した。
実施例 1 3 ： N末 His型 mBMP9 complexのヒ ト臍帯血静脈内皮細胞 （HUVEC) 増殖 に対する作用
HUVEC細胞 （米国 BioWhittaker Inc.より入手） を 2% FBS， hFGF- B， VGEF, hEGF, GA-1000, Hydrocortisone, Ascorbic Acid, Heparin, R3-IGF - 1を含む培地（EBM - 2+ コンプリートサプリ Mix) で培養し、 増殖が盛んになつたことを確認した後、 96well プレート lwellあたり 1. 2 xlO3個になるように、 100 1ずつ播種した。 翌日、種々の濃度の N末 His型 mBMP9 complexmを含む増殖培地 100 // 1に培地交 換し、 更に 37°Cにて 2日間培養を継続した。 なお、 培地交換後の培養には、 前記 の EBM 2+コンプリートサプリ Mix培地と、 EBM- 2+2% FBS (日本国ィンビトロジェ ン株式会社）のみの培地、 2種類を用いた。培養継続 2日後、 Ιθ Αί 1の cell counting kit- 8 (日本国和光純薬工業株式会社） を直接 well内に加え、 発色させた後、 プ レートリーダーを用いて 450nmにおける吸光度を測定した。 結果、 EBM- 2 + 2% FBS 培地と比べ EBM-2+コンプリ一トサプリ Mix培地において、 HUVEC細胞数の増加が 観察されたが、いずれの培養条件下においても、 BMP9タンパク質の添加は、 HUVEC 細胞の細胞増殖に対し影響を及ぼさなかった （図 6 )。
実施例 1 4：ヒト肺ガン（LC- 6)腫瘍モデルに対する N末 His型 mBMP9 complex の 抗腫瘍活性
腫瘍モデルは、 ヒ ト肺ガン細胞 LC- 6 (日本国 （財） 実験動物中央研究所より分 譲） の腫瘍ブロックを生理食塩液 （日本国大塚製薬株式会社） 下で約 2mm角のブ ロック状に切り出したものを、 癌細胞移植針 CL- 4531 (日本国日本クレア株式会 社） を用いて、 ヌードマウス （BALB- nu/nu： 日本国日本チヤ一ルス ' リバ一株式 会社） の右腹側部皮下に移植することにより作製した。 移植マウスでの腫瘍体積 が 10mm3程度となった時点で、 汎用群分けソフト （日本国株式会社ヴィジョンズ） を用いて、群分けを行なった （1群 5匹ずつ）。 なお、群分け日を投与開始日 Dayl とした。 投与した BMP9蛋白は N末 His型 mBMP9 complexを蛋白濃度 15、 50、 150 i g/mLになるように PBSで用時調製し、各個体に 200 / Lずつ、週 3回で 2週間、 尾静脈内に投与した。また、コントロール群には、最高用量群の 150 ^ g/mLの BMP9 溶液内に含まれる Endotoxinと同量の Endotoxin (日本国生化学工業株式会社） を含む PBS液を作製し、 投与した。 腫瘍体積は、 ノギスを用いて皮下腫瘍の長径 (mm) , 短径（mm)、 厚み（mm)を計測し、 以下の式く腫瘍体積（mm3) =長径（mm) x短 径（mm) X厚み（mm) /2 > にて算出した。 RTV (相対腫瘍体積） はく RTV x = x日 目の腫瘍体積 I 投与開始日 (Dayl ) の腫瘍体積 >として算出した。 ITG (% Inhibition of Tumor Growth： B重瘍增殖抑制率） は < (Control群の平均 RTVx— 各 BMP9投与群の平均 RTVx) I (Control群の平均 RTVx-1) χ100 >の式を用いて 算出した。 なお、 有意差検定には t検定を使用した。
結果、 N末端に His タグ配列を持つマウス BMP9 複合体 （N末 His 型 mBMP9 complex) は 10 g/headの用量より、 用量依存的に、 有意差を持って、 LC-6の腫 瘍增殖を抑制することが確認された （図 7 )。
実施例 1 5：ヒ ト滕臓癌（BxPC- 3)腫瘍モデルに対する N末 His型 mBMP9 complex の抗腫瘍活性
腫瘍モデルは、 1 あたり 4xl06個のヒト藤臓癌細胞株 BxPC_3 (ATCCより 購入） を含む溶液を 100 1ずつヌードマウス （BALB- nu/nu : 日本国日本チヤール ス · リパー株式会社） の右腹側部皮下に移植し、 作製した。 なお、 BxPC-3の培養 には、 10%FBSを含む RPMI培地を用いた。
移植マウスでの腫瘍体積が 10讓3程度となった時点で、 汎用群分けソフ ト （日 本国株式会社ヴィジョンズ）を用いて、群分けを行なった（ 1群 5匹ずつ）。なお、 群分け日を投与開始日 Daylとした。投与した BMP9蛋白は N末 His型 mBMP9 complex を蛋白濃度 15、 50、 150 /i g/mLになるように PBSで用時調製し、 各個体に 200 し ずつ、 週 3回で 2週間、 尾静脈内投与した。 また、 コントロール群には、 最高用 量群の 150 / g/mLの BMP9溶液内に含まれる Endotoxinと同量の Endotoxin (日 本国生化学工業株式会社） を含む PBS液を作製し、 投与した。 なお、 これらの投 与は、 週 3回、 2週にわたり、 実施した。 腫瘍体積は、 ノギスを用いて皮下腫瘍 の長径 (mm)、短径（mm)、厚み（mm)を計測し、以下の式く腫瘍体積（mm3) =長径（mm) X 短径 (mm) X厚み（mm) /2 > にて算出した。 RTV (相対腫瘍体積） はく RTV x = x 日目の腫瘍体積 I 投与開始日 （Dayl) の腫瘍体積 >として算出した。 ITG (% Inhibition of Tumor Growth：腫瘍増殖抑制率） はく （Control群の平均 RTVx— 各 BMP9投与群の平均 RTVx) I (Control群の平均 RTVx-1) χ100〉の式を用いて 算出した。 なお、 有意差検定には t検定を使用した。
結果、 N末端に His タグ配列を持つマウス BMP9 複合体 （N末 His 型 mBMP9 complex) は 10 μ g/headの用量より、 用量依存的に、 有意差を持って、 BxPC- 3の 腫瘍増殖を抑制することが確認された （図 8 )。
実施例 1 6 ： ヒ ト BMP9 DNA断片 （シグナル配列無し） の作製
hBMP9 (-SP) FW ： AAGCCACTGCAGAGCTGGGGACGAG (配列番号 1 5 )
hBMP9 (-SP) RV： TTGGCCGGCCCTACCTGCACCCACACTCTGCCACG (配列番号 1 6 ) :下線部 は、 Fselサイト含む
KOD- plus- (日本国東洋紡績株式会社） を用い添付文書にしたがって反応液を調 製し、 50 1 反応液中に上記 2 種のプライマー各 10pmol、 錶型としてヒ ト BMP9-cDNA (開始コドンから終止コドンを含む 1290bp 配列番号 1 7 ) を添加し、 94°C3分保温した後、 98°C15秒、 63°C15秒および 68°C2分を 1サイクルとして 30 サイクル増幅し、 68°C3分保温した。得られた 1224bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分 離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会 社キアゲン） を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。 回収された PCR 増幅断片を Fsel (日本国ニュー ·ィングランド ·バイオラボ ·ジャパン株式会社) で酵素消化し、 QIAquick PCR Purification Kit (日本国株式会社キアゲン） を用 い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
以下に、配列番号 1 7および 1 8におけるヒ ト BMP9シグナル配列、 pro- region、 mature体部分をそれぞれ GenBankァクセッション番号 Q9UK05, AAD56960の情報 を元に、 下線、 囲み線おょぴイタリック体で示す。 -8£-
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8f.f80/600r ΟΛ^ Sfolおよび Fselで消化後、 大腸菌由来アル力リフォスファターゼを用いて末端 脱リン酸化したものに、実施例 1 6で作製した DNA断片を揷入した後、 DH5 aに導 入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認し、 pPSs hBMP9ベクター （図 9 ) を取得した。
実施例 1 8 ： pUShBMP9 KIベクターの構築 pUShBMP9 KI
国際公開第 W0 2006/78072号パンフレツ トの実施例 4 3 - 1で作製された pCk loxPV Δ Ρを Paclおよび Fselで酵素消化後、大腸菌 C75由来アル力リフォスファ ターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記実施例 1 7の pPSs hBMP9ベクタ 一を Paclおよび Fselで酵素消化し、 0. 8°/oァガロースゲルより分離回収された約 2 kbの断片を揷入した後、 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracompetent Cel ls (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩 基配列を確認して、 pUShBMP9 KIベクター （図 1 0 ) を取得した。
以下に pUShBMP9 KIベクター hBMP9発現ュニットの開始コドンから終止コドン までのポリヌクレオチド配列（ヒ ト BMP9シグナル配列を、イントロン領域を含ん だマウス Ig /cシグナル配列 〔下線部分〕 に置換し、 その下流にヒ ト BMP9 pro体 配列を含む 1525bp、配列番号 1 9 )、およぴ該 cDNAがコードするァミノ酸配列（427 アミノ酸、 囲み線の部分はマウス Ig fcシグナル配列を示す、 配列番号 2 0 ) を示 す。イントロン領域を含んだマウス Ig κシグナル配列情報は GenBankより取得し た MUSIGKVR1 (ァクセッション番号 K02159) をもとに、 その上流のゲノム配列を UCSCマウスゲノムデータベースより取得した。
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086C.0/800Zdf/X3d 8£ム丽600 OAV pUShBMP9 ベクター 60 μ gを、スペルミジン添加（ l mM pH7. 0 日本国シグマ ァ ルドリツチ ジャパン株式会社) バッファー (日本国ロシュ ·ダイァグノスティッ クス株式会社、 制限酵素用 Hバッファー） を用い、 Notl (日本国タカラバイオ株 式会社） を用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5 容量の 100%エタノール、 および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリウムを加え、 - 20 で 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェタノ ールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間風乾 させた。 0. 5 w g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で保存 し、 Electroporation用 pUShBMP9 KIベクターの調製を行なった。
実施例 2 0 ： pUShBMP9 KIベクターと RSエレメント · ターゲティング 'マウス E S細胞株を用いた PLhBMP9マウス E S細胞株の取得
ヒ ト BMP9- cDNAが相同組換えにより免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子下流に挿入さ れた PLhBMP9マウス E S細胞株取得のため、 実施例 1 9で示された方法に従い、 制限酵素 Notl (日本国タカラバイオ株式会社） で線状化された pUShBMP9 KIベタ ターを確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンタ ーゲティング、 羊土社、 1995) に従って RSエレメント ·ターゲティング ·マウス E S細胞へ導入した。 国際公開第 W0 2006/78072号パンフレツ トの実施例 1 0に 記載された方法で RSエレメント ·ターゲティング 'マウス E S細胞は取得された。
RSエレメント ·ターグティング .マウス E S細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、前記） に従い、 フィーダ一細胞はマイ トマイシン C (日本国シグマ アル ドリツチ ジャパン株式会社） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本国ィンビト ロジェン株式会社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた RSエレメント 'ターゲ ティング 'マウス E S細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ ml となるように HBS に懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を lO gのベクター DNAと混和し、 ジーンパ ルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 日本国バイオ'ラッド ラボラトリーズ株 式会社） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 ？、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地 （相沢慎一、 前記） に 懸濁し、 あらかじめフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシ ヤーレ （ファルコン、 日本国日本べク トン .ディッキンソン株式会社） 1枚に播 種した。 36時間後に 0. 8 g/mlのピューロマイシン （日本国シグマアルドリッチ ジャパン株式会社） を含む E S培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーをピ ックアップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10°/。DMSO、 日本国シグマアルドリツチジャ パン株式会社） に懸濁し、 - 80。Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコー トプレートに播種し、 2 日間培養して 106〜； L07個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (日本国株式会社キアゲン） により調製した。 これ らのピューロマイシン耐性 RSエレメント ·ターゲティング 'マウス E S細胞ゲノ ム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国タカラバイオ株式会社） で消化し、 ァガロース ゲル電気泳動で分離した。 続いてサザンプロッ トを行い、 W0 00/10383 号パンフ レッ ト （実施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J K -C /Cゲノム DNA の 3， 端の DNA断片 （Xhol：〜 EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレッ ト 図 5 ) Ck3 ' probe をプローブとして相同組換え体を検出した。 野生型 RSエレメン ト ·ターゲティング ·マウス E S細胞では EcoRI消化により、 1本のバンドが検 出された。 相同組換え体においては、 このバンドに加えてその下部に新たなバン ドが出ることが予想される （図 1 1 ) 力 ピューロマイシン耐性株においてこの 新たなバンドが確認された。 すなわち、 これらのクローンは一方のアレルの免疫 グロプリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト BMP9 - cDNAが挿入されたものである。
実施例 2 1： PLhBMP9マウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した UShBMP9マ ウス ES細胞株の取得
PLhBMP9マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Puror， Neor) を除去した UShBMP9遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS- Creベクター（Sunaga ら、 Mol Reprod Dev. , 46 : 109-113， 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマ二 ュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 羊土社、 1995) に従って PLhBMP9 マ ウス ES細胞へ導入した。
PLhBMP9マウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 フ ィーダ一細胞はマイ トマイシン C (日本国シグマアルドリツチジャパン株式会社) 処理した G418耐性初代培養細胞（日本国インビトロジェン株式会社より購入） を 用いた。 まず、 増殖させた PLhBMP9マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107 P T/JP2008/073980 個/ mlとなるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 ^ gのべクタ 一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 日本国バイオ ' ラッド ラボラトリーズ株式会社）にてエレク トロポレーションを行った（容量： 960 F、 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培 地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細 胞を播種した 60画組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 日本国日本べ ク トン .ディッキンソン 株式会社） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000 個をあらかじめフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシヤー レ （ファルコン、 日本国日本べクトン .ディッキンソン 株式会社） 1枚に播種し た。 6日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを 24穴プレートでコン フルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10%DMSO、 日本国シグマアルドリツチジャパン株式会社） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。残 りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個 の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (日本国株式会社キアゲ ン） により調製した。 これらマウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本 国タカラバイオ株式会社） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続い てサザンブロットを行い、 国際公開第 W 00/10383 号パンフレツト （実施例 48 参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J κ -C κゲノム DNAの 3' 端の DNA断 片 （XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレッ ト 図 5 ) Ck3， probeを プローブとして loxPV配列で挟まれた Pur。r遺伝子のみが除去された ES細胞株を 検出した。 Pure/遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド (15. 1 K と 13. 3 K) が検出され、 Pure 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド （15· 1 Kと 11. 6 K) が検出された （図 1 1 )。 ま た、 上記と同様の操作で得られたサザンプロッ ト膜を用い、 国際公開第 W0 2006/78072 号パンフレツ トの実施例 9で示された方法により調製された 3 ' ΚΟ-probeをプローブとして ΙοχΡ配列で挟まれた Ne0r遺伝子のみが除去された ES 細胞株を検出した。 NeoT遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本の パンド （7. 4 Kと 5. 7 K) が検出され、 Neor遺伝子のみが除去された ES細胞株で は EcoRI消化により、 2本のバンド （5. 7 Kと 4. 6 K) が検出された （図 1 1 )。 これらの結果から、 PLhBMP9マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Puro^ Neor) が同時に除去された ES細胞株 （UShBMP9マウス ES細胞株） が得られた。 実施例 2 2 ： UShBMP9 マウス E S細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿 主胚を用いた UShBMP9 KIキメラマウスの作製
免疫グロプリン 鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な B リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した E S細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7， 2000) に 記載された免疫グロプリン 鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア株式会社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製 用として用いた。
上記実施例 2 1で得られ、 免疫グロブリン/ c鎖遺伝子下流にヒ ト BMP9- cDNAが 揷入されていることが確認された UShBMP9マウス ES細胞株を凍結ストツクより立 ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌 雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜： 10個注 入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティ ング、羊土社、 1995) でー晚培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア株式会社） の子宮に、 片側の子官 あたりそれぞれ約 10個のインジエタション胚を移植した。
実施例 2 1の UShBMP9マウス ES細胞株を用いて作製されたィンジヱクション胚を 移植した結果、 子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主 胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて 判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち E S細胞の貢献の認められる個体が得られた。 これらの結果より、 免疫 グロブリン/ c鎖遺伝子下流にヒ ト BMP9 - cDNAが揷入されている US hBMP9 マウス
ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化 する能力を保持していることが示された。 実施例 2 3 ·· コントロールキメラマウスの作製
国際公開第 W0 2006/78072号パンフレツトの実施例 1 1記載の方法に従い作製 されたキメラマウスは下記実施例 2 4で行われた UShBMP9 KIキメラマウスの表現 型解析実験において、 コントロールキメラ個体として用いられた。
実施例 2 4 ： UShBMP9 KIキメラマウスの表現型解析
剖検所見
上記実施例 2 2および 2 3で作製されたキメラマウスを用い、 3週齢 · 4週齢'
5週齢においてそれぞれ剖検を実施した。 UShBMP9 KIキメラマウスにおいてのみ 腹水 ·胸水、 リンパ組織、 小腸および膝臓に出血が原因と考えられる赤色化が認 められた。 それぞれの変化を観察した時期およびその個体数を以下に記す。
2 4 - 1 . 赤色化腹水貯留
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では全個体で腹水貯留は観察されなか つたが、 4週齢では全ての個体で、 5週齢では 8個体で赤色化した腹水貯留が認 められた。
2 4 - 2 . 赤色化胸水貯留
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 1個体、 4週齢では 4個体、 5週 齢では 7個体で赤色化した胸水貯留が認められた。
2 4 - 3 . 腸間膜リンパ節赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢以降 5週齢まで全ての個体において腸 間膜リンパ節の赤色化が認められた。
2 4— 4 . 顎下リンパ節赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 7個体、 以降 5週齢まで全ての個 体において顎下リンパ節の赤色化が認められた。
2 4 - 5 . 肘リンパ節赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9 KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 7個体、 以降 5週齢まで全ての個 体において肘リンパ節の赤色化が認められた。
24-6. 鼠径リンパ節赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 8個体、 以降 5週齢まで全ての個 体において鼠径リンパ節の赤色化が認められた。
24- 7. 膝窩リンパ節赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 8個体、 以降 5週齢まで全ての個 体において膝窩リンパ節の赤色化が認められた。
24-8. 胸腔内リンパ節赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 2個体、 4週齢では 3個体、 5週 齢では 3個体で胸腔内リンパ節の赤色化が認められた。
24- 9. 小腸赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 7個体、 4週齢以降全ての個体で 小腸表面の一部に赤色点ないし赤色斑が認められた。
24- 1 0. 膝臓赤色化
3週齢では 9個体、 4週齢では 8個体、 5週齢では 9個体 UShBMP9KIキメラマ ウスの剖検を実施した。 その結果、 3週齢では 2個体、 4週齢では 3個体、 5週 齢では 3個体で腌臓表面の一部に赤色化が認められた。
以上より、 UShBMP9KI キメラマウスにおいて観察された出血性変化は上記の実 施例 9で示された USmBMP9KIキメラマウスにおいて観察された表現型と極めて良 く類似していることが明らかになった。 実施例 14および 1 5で、 マウス BMP9 タンパク質は固形癌に対し増殖抑制活性を保持することが示されたが、 実施例 2 4で得られた結果からヒ ト BMP9 タンパク質においても固形癌に対し増殖抑制活 性を示す可能性が示された。
実施例 25 ： N末 His型 hBMP9 complex組換え体の発現 ·調製 25— 1. N末 His型 hBMP9 complex組換え体発現ベクターの構築
25- 1 - 1. PLN1V5ベクターの構築
5' 末端に BamHI'Nhel'Sall サイ トを 3， 末端に Xholサイ トを持つ（V5タグ +Stop codon) センスオリゴ DNA及ぴそれに対するアンチセンスオリゴ DNA： V5S及び V5AS (日本国 北海道システムサイエンス株式会社） を合成した。 番号 7) 列番号 8 )
BamNI Nhel Sal V5 Stop Xhol
V5S:S'-GATCC GCTAGC GTCGAC eGTAAeCGTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCeATTCTACG TSA C-3' (S¾番号 7) V5AS: 3'-G CGATCG CAGCTG CCATOGGATAGGGAnGGGAeAGQAGCGAGAGGTAAGATGC ACTGAGCT-5' (S¾番号 8) 上記合成オリゴ DNAを、 掛田らの報告 （Gene Ther. 12:852 - 856， 2005) に記載さ れた pLNlベクター上の BamHI- Xholサイ トに導入し、 pLNlV5ベクターを構築した。 25 - 1 - 2. N末端に Hisタグ配列を持つ hBMP9 DNA断片の合成
ヒ ト BMP9全長配列の N末端に Hisタグを付加するための PCRプライマー hBMP9NheIkozakFw： CTAGCTAGCCGGCCACC ATGTGTCCTGGGGCACTGTG
Nhel kozak hBMP9 (シグナル酉己列）
(配列番号 21 )
hBMP9 3HisRv： ATGGTGATGGTGATGATG CCCCTGTAGGGAGCCAGCCAG
His-タグ hBMP9 (シグナル配列)
(配列番号 22)
hBMP9 5HisFw： CATCATCACCATCACCAT AAGCCACTGCAGAGCTGGGG
His-タグ hBMP9 (シグナル直下の配列）
(配列番号 23)
hBMP9XhoIRv： ACGCCTCGAG CTACCTGCACCCACACTCTG
Xhol hBMP9 (Stop codon + C末端配列）
(配列番号 24 ) Prime STAR HS DNA Polymerase (日本国タカラバイオ株式会社） を用い添付文書 にしたがって反応液を調製し、 50 z l反応液中に配列番号 2 1及ぴ 2 2、 2種のプ ライマー各 10pmol、 铸型としてヒ ト BMP9- cDNA (配列番号 1 7 ) を添加し、 94°C5 分保温した後、 98。C10秒、 57°C5秒、及び 72。C2分を 1サイクルとして 25サイク ル增幅し、 得られた lOlbpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。 回収されたゲ ルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キアゲン） を用い添付文 書にしたがって増幅断片 （Nhel His hBMP9) を回収した。
Prime STAR HS DNA Polymerase (日本国タカラバイオ株式会社）を用い添付文書に したがって反応液を調製し、 50 μ ΐ反応液中に配列番号 2 3及び 2 4、 2種のプラ イマ一各 10pmol、 鎵型としてヒ ト BMP9 - cDNA (配列番号 1 7 ) を添加し、 94°C5 分保温した後、 98°C 10秒、 57°C5秒、及び 72°C2分を 1サイクルとして 25サイク ル増幅し、 得られた 1252bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。 回収された ゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キアゲン） を用い添付 文書にしたがって増幅断片 （His hBMP9 Xhol) を回収した。
上記 2回の PCRで得られた DNA増幅断片 （Nhel His hBMP9)及び（His hBMP9 Xhol) を PrimeSTAR bufferに加え全量を 100 1 とし、 100°Cに 10分間加熱した後、 室 温に戻し、 Hisタグ領域をァニーリングさせた。その後、配列番号 2 1及ぴ 2 4、 2種のプライマー各 lOpmol加え、 Prime STAR HS DNA Polymerase (日本国タカラ バイォ株式会社）を添加し、 伸長反応を 72°C3分間行い、 次に、 98°C10秒、 57°C 5秒、及び 72°C3分を 1サイクルとして 20サイクル増幅し、最後に 72°C3分間ィ ンキュベート後、 得られた 1335bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。 回収 されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キアゲン） を用 い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。
2 5 - 1 - 3 . N末 His型 hBMP9 complex組換え体発現ベクターの構築
実施例 2 5 - 1 - 2で回収された PCR増幅断片を Nhel及び Sail (日本国ロシュ · ダイァグノスティックス株式会社）で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで分離回 収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (日本国株式会社キ ァゲン） を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。 得られた酵素処 理断片を実施例 2 5— 1一 1で作製された PLN1V5ベクターの Nhel · Xholサイ ト に導入し、 N末 His型 hBMP9 complex組換え体発現ベクター （図 1 2 ) を構築し た。
以下に N末 His型 hBMP9 complex組換え体 cDNAの開始コドンから終止コドンま でのポリヌクレオチド配列 （1308 bp、 配列番号 2 5 )、 及ぴ該 cDNAがコードする hBMP9のシグナル配列を含んだァミノ酸配列 （435アミノ酸、 配列番号 2 6 ) を示 す。 配列番号 2 5及び 2 6において、 下線部はヒ ト BMP9のシグナル配列部分を、 囲み線はヒスチジンタグ部分を、 イタリック体はヒ ト BMP9 pro体部分を示す。 配列番号 2 5 :
Figure imgf000051_0001
GTGGGTGCAGGTAG
配列番号 2 6 (hBMP9シグナル配列 〔下線部分〕 を含む） ： CGCR
25- 2. N末 His型 hBMP9 complex組換え体発現ベクターを用いた N末 His型 hBMP9 complexの一過的発現 '
25- 2- 1. 遺伝子導入用発現ベクター調製
実施例 25— 1— 3. で取得された N末 His型 hBMP9 complex組換え体発現べク ターを大腸菌 DH5aに導入し、 得られた形質転換体より DNAをプラスミ ド精製キ ット （Qiagen plasmid Maxi kit; 日本国株式会社キアゲン） を用い調製した。 25 - 2 - 2. 培養細胞へのベクター導入と分泌発現
Free style 293F 細胞 （日本国インビトロジヱン株式会社） を Free style 293 Expression Medium (日本国インビトロジェン株式会社） を用レ、、 37°C 5°/。C02、 125rpm条件下、 細胞密度が lxlO5から 3xl06cells/mlの範囲内で培養する。 培地 1Lを用いて培養した場合、 発現ベクター lmgに 35mlの Opti- MEM I Reduced Serum Medium (日本国イ ンビ トロジェン株式会社） を加え、 1.3ml の 293 fectin Transfection Reagent (日本国ィンビトロジヱン株式会社） に 33.7mlの Opti- MEM
1 Reduced Serum Mediumを加え、 それぞれ 5分間室温でインキュベートした。 ィ ンキュベート後この 2液を混合し、 更に 20- 30分間室温でインキュベートした。 その後、 1 X 109 cells/Lの Free style 293F細胞を含む培地に前記方法で処理 された発現ベクターを添加し、 3日間培養した。
25- 3. N末 His型 hBMP9 complexの精製 ·調製
25- 3 - 1. 培養上清前処理
培養後、 上清を回収し 0.22 mフィルター （0.22 Aim GP Express Membrane 500ml; 日本国日本ミリポア株式会社）で濾過処理を行った後 4°C (低温室）で冷却した。 凍結保存した場合には融解後、 再度 0.22 mフィルターで濾過した。
25- 3 - 2. Metal Chelate Affinityクロマトグラフィー A bufferとして PBS (Dulecco' s Phosphate Buffered Saline； SIGMA) , B buffer として 0. 5M Imidazoleを含む PBSを用いた。
前処理された 1L培養上清を PBSで平衡化された Ni Sepharoseカラム（His Trap HP 5ml ; 日本国 GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）にアプライした。その後、 0°/oB buffer 25ml, PBSに NaClを添加し NaCl濃度を 1. 85M に調製した緩衝液 25ml, 0%B buffer 25ml, 9%B buffer 30ml , 11%B buffer 40mlの順番でカラムを洗浄し た。 洗浄操作終了後、 カラムに 16%B buffer 50 mlを添加し目的蛋白質を回収し た。 上記分離精製操作には AKTAexplorerlOs (日本国 GEヘルスケア バイオサイ エンス株式会社） を用いた。 使用前にエンドトキシン除去処理を行った。
2 5 - 3 - 3 . イオン交換ク口マトグラフィー
A bufferとして PBS (Dulecco ' s Phosphate Buffered Saline； SIGMA) B buffer として PBSに NaClを添加し NaCl濃度を 1. 85 に調製した緩衝液を用いた。
PBSで平衡化された強陰イオン交換カラム （Hi Trap Q HP 1 mL ; 日本国 GEヘル スケア パイォサイエンス株式会社) に流速： lmL/minの条件下、 実施例 2 5— 3 — 2で得られた目的蛋白質を添加した。 0%B buffer 20ml N 2%B buffer 10mlで順 次カラムを洗浄した。 洗浄操作終了後、 7%B buff er 20mlをカラムにアプライし、 目的蛋白質を回収した。 上記分離精製操作には AKTAexplorerlOs (日本国 GEヘル スケア バイオサイエンス株式会社） を用いた。使用前にエンドトキシン除去処理 を行った。
2 5 - 3 -4. 精製標品調製
実施例 2 5— 3— 3で得られた精製標品中の buffer を限外濾過膜 VIVASPIN20
10, 000 MWC0 PES (日本国ザルトリウス 'ステディム ·ジャパン株式会社） を用い て PBSに置換後、 サンプルを濃縮した。濃縮操作後、 0. 22 mフィルター （Millex
GV ; 日本国日本ミリポア株式会社） により濾過処理を行った。 操作は可能な限り クリーンベンチ内で行った。 実施例 2 5 - 3で行われた全ての工程はクリーンべ ンチでの作業以外、 4°C (低温室ないしは氷上）で実施した。最終精製品の SDS-PAGE
(CBB染色）より、非還元条件下では mature 2量体、少量の pro2量体、 pro-region が検出され、還元条件下では mature単量体、 pro- region、少量の pro単量体が検 出された （図 1 3 )。 この結果から、 上記操作によって調製された精製標品には pro- region2分子と mature 2量体 1分子が結合した複合体 （complex体） が主に 含まれていると考えられた。 蛋白質濃度は A28。nraを測定し、 分子吸光係数
(E1%i lcra=9. 6) より算出した。
抗 His抗体 Penta His HRP Conjugate (日本国株式会社キアゲン） を用いたゥヱ スタンプ口ッティングにより pro- region と pro体を、 抗 hBMP9抗体 （米国 R&D Systems, Inc. )を用いたウェスタンプロッティングにより mature体を確認した。 実施例 2 6 ： インビトロでの N末 His型 hBMP9 complexの活性測定 （インビトロ 試験）
BMP9の活性評価には BMPシグナルを検出可能なレポーター 'プラスミ ドを安定導 入した細胞株を用いた。 具体的には、 BMP のシグナルを検出可能なレポーター ' プラスミ ドである （p (GCCG) 12_Luc/neo) を、 ヒ ト肝癌細胞株である HepG2 (ATCC より入手可能） に遺伝子導入し、安定導入株 HepG2 (38-5)株を作製した。 BMPシグ ナル検出用レポータープラスミ ド （p (GCCG) 12- Luc/neo) は、ルシフェラーゼ遺伝 子の上流に、 BMPシグナル伝達因子である Smadl/5/8の結合配列をタンデムに 12 個連結させたプラスミ ド （p (GCCG) 12 - Luc/neo) を Mol. Biol. Cel l. , 2000, 11 (2) : 555- 65.の Kusanagiらの記載方法に準じて作製した。
ルシフ ラーゼ活性測定は、この細胞株に種々の濃度の BMP9を含む溶液を添加し 5時間培養した後、 化学発光試薬 （Steady Glo (商標） Luciferase assay system, 日本国プロメガ株式会社より入手可能） を用い実施した。
実施例 2 7 ： ヒ ト神経膠腫 （U87MG) 腫瘍モデルに対する、 N末 His型 hBMP9 の
VEGFI I型レセプターに対する中和抗体（DC 101 )との併用における抗腫瘍活性 腫瘍モデルは、 U87MG (ATCC より購入可能） の腫瘍ブロックを生理食塩液 （日本 国大塚製薬株式会社） 下で約 2mm角のブロック状に切り出したものを、 癌細胞移 植針 CL- 4570 (日本国日本クレア株式会社）を用いて、ヌードマウス（BALB - nu/nu : 日本国日本チヤ一ルス . リバ一株式会社） の右腹側部皮下に移植することにより 作製した。 移植マウスでの腫瘍体積が 10mm3程度となった時点で、 汎用群分けソ フト（日本国株式会社ヴィジョンズ）を用いて群分けを行なった（1群 5匹ずつ）。 なお、 群分け日を投与開始日 Daylとした。 投与 BMP9蛋白質は PBSにて用時調製 した N末 His型ヒト型 BMP9comPlexを、 0. 5mg/kgの用量にて、 週 3回 2週間、 尾 2008/073980 静脈内投与した。 BMP9投与群以外の群に対しては、そのコントロールとして、 BMP9 投与液内に含まれる Endotoxinと同量の Endotoxin (日本国生化学工業株式会社） を含む PBS液を作製し、 BMP9投与と同様のスケジュールにて尾静脈内投与した。 VEGF II 型レセプターに対する中和抗体 （ATCC より購入可能な中和抗体産生株 DC101より精製。 以降 VEGF II型レセプターに対する中和抗体を DC101 と記載） は、 40mg/kgの投与用量にて、 週 2回 2週間、 腹腔内投与した。 DC101投与群以外 の群に対しては、 そのコントロールとして、 PBS を DC101 と同様のスケジュール にて投与した。 腫瘍体積は、 ノギスを用いて皮下腫瘍の長径（mm)、 短径（mm)、 厚 み（mm)を計測し、以下の式 <腫瘍体積（mm3) =長径（mm) x短径（mm) x厚み（mm) /2 > にて算出した。
結果、 N末端に Hisタグ配列を持つヒ ト BMP9 複合体（N末 His型 hBMP9) は、 VEGF 阻害剤である DC101抗体併用下においても、 U87MG株の腫瘍増殖に対する有意な 抑制活性を示すことが確認された （図 1 4 )。 産業上の利用可能性
本発明の医薬組成物により、 固形癌の腫瘍細胞増殖を阻害することができる。 従って、 固形癌おょぴ関連する様々な疾患又は障害を、 副作用を引き起こすこと なく、 治療することが可能となる。
本発明により、 固形癌腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。 従って、 固形 癌おょぴ固形癌に関連する様々な疾患又は障害を、副作用を引き起こすことなく、 治療することが可能となる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 1、 2、 7〜1 2、 1 5、 1 6は、 合成オリゴヌクレオチド配列を示 す。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （a) 〜 （c) の少なくても 1つを含むことを特徴とする、 癌を 治療および Zまたは予防するための医薬組成物。
(a) BMP9タンパク質またはその機能的断片、
(b) BMP9タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸、
(c) BMP9タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸を含む発現べクタ
2. BMP9 タンパク質またはその機能的断片がヒ トまたはマウス由来である、 請求項 1記載の医薬組成物。
3. BMP9タンパク質またはその機能的断片が、
(a) 配列番号 4または配列番号 1 8で示されるアミノ酸配列を有する、
( b ) 配列番号 4の少なくとも 3 1 9番目から 428番目、 または配列番号 1 8 の少なくとも 3 20番目から 429番目の配列からなるアミノ酸配列を有する、 または
( c ) 配列番号 4の少なくとも 3.1 9番目から 428番目、 または配列番号 1 8 の少なくとも 3 20番目から 429番目の配列からなるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ、 癌の増殖を阻害する活性を有する
ものである、 請求項 1又は 2記載の癌を治療および Zまたは予防するための医薬 組成物。
4. BMP9タンパク質またはその機能的断片をコードする核酸が、
( a )配列番号 3または配列番号 1 7で示される塩基配列を有する、
( b ) 配列番号 3の少なくとも 95 5番目から 1 28 7番目、 または配列番号 1 7の少なくとも 958番目から 1 290番目の配列からなる塩基配列を有する、 または
( c ) 配列番号 3の少なくとも 9 5 5番目から 1 287番目、 または配列番号 1 7の少なくとも 958番目から 1 290番目の配列からなる塩基配列に相捕的な 配列の一部若しくは全体からなる核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 かつ、 癌の増殖を阻害する活性を有するタンパク質をコードする ものである、 請求項 1又は 2記載の癌を治療および/または予防するための医薬 組成物。
5. 癌が固形癌である、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の医薬組成物。
6. 固形癌が肺癌、 膝臓癌または神経膠腫である、 請求項 5記載の医薬組成 物。
7. VEGF阻害剤と併用することが可能な、 請求項 1〜 6のいずれか 1項 に記載の医薬組成物。
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