CN104411720A - 以抗bmp9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂 - Google Patents

以抗bmp9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供与人BMP9(Bone morphogenetic protein-9)结合的抗BMP9单克隆抗体或其抗体片段、产生该抗体或该抗体片段的杂交瘤、编码该抗体或该抗体片段的DNA、含有该DNA的载体、导入该载体而得到的转化体、使用该杂交瘤或该转化体的该抗体或该抗体片段的制造方法、以该抗体或该抗体片段作为有效成分的治疗剂。另外，本发明提供含有该抗体或该抗体片段作为有效成分的、用于治疗肾性贫血、癌性贫血等贫血的药物组合物以及使用该药物组合物的肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗方法。

Description

以抗BMP9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂
技术领域
本发明涉及与人BMP9(Bone morphogenetic protein-9，骨形态发生蛋白-9)结合的抗BMP9单克隆抗体或其抗体片段、产生该抗体或该抗体片段的杂交瘤、编码该抗体或该抗体片段的DNA、含有该DNA的载体、导入该载体而得到的转化体、使用该杂交瘤或该转化体的该抗体或该抗体片段的制造方法、以该抗体或该抗体片段作为有效成分的治疗剂。
另外，本发明涉及含有该抗体或该抗体片段作为有效成分的、用于治疗肾性贫血、癌性贫血等贫血的药物组合物以及使用该药物组合物的肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗方法。
背景技术
BMP9为Bone morphogenetic protein 9的简称，别名也称为GDF2。BMP9属于包含约20个种类的BMP(骨形态发生蛋白)家族分子，人BMP9为由429个氨基酸构成的分泌蛋白质(非专利文献1)。
已知BMP9在胎儿期主要在脊髓或体节间膜表达，在成体期主要在肝脏表达(非专利文献2、3、4)，人BMP9为在血液中以2-12ng/mL的浓度存在的血液循环因子(非专利文献5)。
关于BMP9在生物体内的作用，迄今为止还没有基于BMP9缺陷小鼠或抗BMP9抗体对动物的施用的报道，但有一些基于体外发现的报道。例如，表现出对肥大软骨细胞形成或从间叶细胞向软骨分化的促进作用(非专利文献6、7、8)，或者表现出对血液前体细胞产生或集落形成的促进作用(非专利文献9)。但是，根据这些报道，极难预料到抗BMP9抗体在生物体内具有红细胞造血作用。
另外，作为抗BMP9单克隆抗体，对BMP9具有中和活性的单克隆抗体(克隆号360107)已由安迪生物科技公司市售，但尚未获知其他抗体。
贫血是指“单位容积血液中的红细胞数、血红素浓度和血细胞比容值比正常降低的状态”(非专利文献10)。在红细胞产生调节中，各种各样的因子发挥作用，但最重要且最特异性的因子为促红细胞生成素(以下记作EPO)。
EPO促进晚期红系祖细胞集落形成单位(colony-formingunit-erythroid：CFU-E)的增殖、分化，结果使生物体内的红细胞增加(非专利文献10)。EPO为由165个氨基酸构成的分子量30kDa的糖蛋白激素，主要由肾脏产生(非专利文献10)。
肾脏疾病所伴有的贫血(肾性贫血)是由于作为EPO的产生组织的肾脏受到损伤而使EPO的产生减少、红细胞数减少的、慢性肾脏病(CKD)患者中频率最高的并发症(非专利文献11)。已知肾性贫血不仅会影响QOL，而且还会影响心血管病变的发病、发展、肾功能障碍的恶化(非专利文献11、12)。
作为肾性贫血治疗剂的基因重组人促红细胞生成素和最近销售的血中半衰期长的持续型的第二代EPO制剂被广泛称为ESA(erythropoiesis-stimulating agent，红细胞生成刺激剂)(非专利文献13)。
ESA具有强有力的红细胞造血作用，但肾衰竭透析患者中存在15～20％的、即使施用ESA贫血改善效果也不足的病例(将其称为ESA抵抗性贫血或ESA低反应性贫血)(非专利文献13)。
由大规模干预临床试验(CREATE试验和CHOIR试验)的结果表明，对这样的呈现ESA抵抗性的患者过量施用ESA会引起生命预后的恶化(非专利文献11、12、13)。基于这样的背景，克服ESA抵抗性成为肾性贫血治疗的一大课题，强烈期望开发出具有与EPO不同的机制的新的红细胞造血药。
另一方面，恶性肿瘤所伴有的贫血(癌性贫血)是在各种癌症中观察到的症状，作为其原因，有如下两点：与包括失血在内的病情的恶化相随、与化学疗法或放射线疗法等有关(非专利文献14)。
虽然已表明ESA对癌性贫血也有效，但也指出了对于由施用ESA引起的促进癌增殖的可能性或血栓梗塞增加的担心(非专利文献14)，对于癌性贫血，也期望开发出具有与EPO不同的机制的新的红细胞造血药。
如上所述，对于肾性贫血和癌性贫血，要求具有与EPO不同的机制的红细胞造血药。当然，药效的强度对药剂而言也是必要的。具体而言，日本的开始施用ESA的基准是：对于透析患者而言，设定为血红素浓度低于10g/dL，要求药剂具有能够将血红素浓度控制在10～11g/dL之间的药效。另一方面，对于透析前期慢性肾脏病患者而言，设定为血红素浓度低于11g/dL的时刻，要求药剂具有能够将血红素浓度控制在11～13g/dL之间的药效(非专利文献15)。
即，要求新的红细胞造血药具有EPO非依赖性、以及使血红素浓度至少升高1～2g/dL的程度的药效这两个特征。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：J.Biol.Chem.,280,26,25111(2005)
非专利文献2：Nat.Biotechnology,21,294(2003)
非专利文献3：J.Biol.Chem.,275,24,17937(2000)
非专利文献4：J.Physiology-Paris,96,53(2002)
非专利文献5：Circ.Res.,102,8,914(2008)
非专利文献6：Gene Ther.,11,17,1312(2004)
非专利文献7：J.Biol.Chem.,284,1,649(2009)
非专利文献8：J.Boneminer.Res.,26,6,1166(2011)
非专利文献9：Growth Factors,21,2,71(2003)
非专利文献10：标准血液病学(医学书院)(2000)
非专利文献11：血液フロンティア(血液学前沿),18,2,17(2008)
非专利文献12：肾与透析,71,2,247(2011)
非专利文献13：临床透析,26,2,59(2010)
非专利文献14：临床透析,26,2,276(2010)
非专利文献15：日本透析医学会杂志,41,10,661(2008)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明所要解决的问题在于，通过提供以抗BMP9抗体作为有效成分的治疗剂来改善肾性贫血、癌性贫血等贫血。
用于解决问题的手段
为了弄清楚抗BMP9抗体在生物体内的作用，本发明人尝试了使用BMP9缺陷小鼠来获得抗BMP9抗体，结果，成功地获得了与现有抗体相比对BMP9的结合性显著提高的抗BMP9抗体。
进而，使用所获得的抗体对抗BMP9抗体在生物体内的作用进行了深入研究，结果，令人惊奇地发现，这些抗BMP9抗体具有红细胞造血作用，而且该红细胞造血作用优于现有抗体的作用强度，这些抗体抑制人BMP9与人BMPRII的结合。
另外，由其作用机制分析明确了：获得的抗体的红细胞造血作用并非由血中EPO浓度的升高介导，即，基于与EPO不同的机制产生。进而，由使用作为肾性贫血模型的5/6肾切除大鼠的分析还明确了：抗BMP9抗体对肾性贫血具有改善作用。
基于上述发现，本发明人认为能够提供以抗BMP9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述(1)～(16)。
(1)一种单克隆抗体或该抗体片段，其为选自下述(a)～(e)中的一种抗体、或者与该抗体竞争地与人BMP9结合且与人BMP9的结合解离常数为1×10-10mol/L以下，
(a)包含互补决定区(complementarity determining region，以下记作CDR)1～3分别含有序列号54～56表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号57～59表示的氨基酸序列的抗体的轻链的抗体，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号60～62表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号63～65表示的氨基酸序列的抗体的轻链的抗体，
(c)包含含有序列号48表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号51表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体，
(d)包含含有序列号49表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号52表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体，
(e)包含含有序列号128表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号132表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体。
(2)如(1)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为与选自所述(a)～(e)中的一种抗体所结合的表位结合的单克隆抗体。
(3)如(1)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为基因重组抗体。
(4)如(3)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的基因重组抗体。
(5)选自下述(a)～(c)中的一种单克隆抗体或该抗体片段，
(a)包含CDR1～3分别含有序列号54～56表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号57～59表示的氨基酸序列的抗体的轻链的单克隆抗体及该抗体片段，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号60～62表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号63～65表示的氨基酸序列的抗体的轻链的单克隆抗体及该抗体片段，
(c)包含含有序列号128表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号132表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体及抗体片段。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的单克隆抗体及该抗体片段，其与序列号67表示的人BMP9成熟区的氨基酸序列中的至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第93位的Pro结合。
(7)如(1)～(6)中任一项所述的抗体片段，其为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双价抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。
(8)一种DNA，其编码(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(9)一种重组载体，其含有(8)所述的DNA。
(10)一种转化株，其通过将(9)所述的重组载体导入宿主细胞中而获得。
(11)(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，将(10)所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，并从培养物中收集该抗体或该抗体片段。
(12)一种伴有BMP9相关的贫血的疾病的治疗剂，其含有与人BMP9结合并且抑制人BMP9与人BMPRII的结合的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。
(13)一种人BMP9的免疫学检测或测定方法，其使用(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(14)一种药物组合物，其包含(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段和药理学上容许的载体。
(15)一种人BMP9相关的贫血的治疗方法，其包括施用(1)～(7)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(16)一种BMP9相关的贫血的治疗方法，其包括施用与人BMP9结合并且抑制人BMP9与人BMPRII的结合的单克隆抗体或该抗体片段。
发明效果
本发明的抗体是与现有抗体相比对BMP9的结合性显著提高的抗BMP9抗体，具有优于现有抗体的作用强度的红细胞造血作用，抑制人BMP9与人BMPRII的结合。另外，本发明的抗体的红细胞造血作用并非由血中EPO浓度的升高介导。此外，本发明的抗体对肾性贫血具有改善作用。通过以具有这种特性的本发明的抗体作为有效成分，能够提供对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂。
附图说明
图1是表示小鼠BMP9基因敲除用载体的结构的图。小鼠5’基因组表示BMP9基因敲除载体5’同源区，Neor表示新霉素抗性基因，小鼠3’基因组表示BMP9基因敲除载体3’同源区，DT-A表示白喉毒素A链基因，T3表示T3启动子，T7表示T7启动子，pBluescript表示克隆载体。
图2是通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定获得的抗BMP9单克隆抗体与人BMP9的结合特异性而得到的图。纵轴表示吸光度(450-570nm)。固相化的抗原为人BMP9时用黑色表示，固相化的抗原为人BMP10时用白色表示。
图3是通过ELISA测定获得的抗BMP9单克隆抗体与人BMP9的结合性而得到的图。横轴表示抗体浓度(ng/mL)，纵轴表示各抗体浓度下的吸光度(450-570nm)。6D10-1-1抗体用△表示，10D5-2-3抗体用□表示，3B7-3-3抗体用■表示，R&D抗体用●表示。
图4是表示获得的抗BMP9单克隆抗体对人BMP9与标记的R&D抗体的结合的抑制作用的图。横轴表示未标记的抗体浓度(ng/mL)，纵轴表示抑制活性(％)。6D10-1-1抗体用△表示，10D5-2-3抗体用□表示，3B7-3-3抗体用■表示，R&D抗体用●表示。
图5是表示获得的抗BMP9单克隆抗体对人BMP9与BMPRII的结合的抑制作用的图。纵轴表示抑制活性(％)。
图6A是表示短期施用(2周)获得的抗BMP9单克隆抗体对小鼠红细胞造血产生的作用的图。图6A的图表示红细胞数的变化。图的横轴表示抗体施用量(mg/kg)，纵轴表示红细胞数(×104/μL)。6D10-1-1抗体用△表示，10D5-2-3抗体用□表示，R&D抗体用●表示。图中的0mg/kg的值表示介质施用组的值，误差线表示标准误差(SE、n＝6)。
图6B是表示短期施用(2周)获得的抗BMP9单克隆抗体对小鼠红细胞造血产生的作用的图。图6B的图表示血红素浓度的变化。图的横轴表示抗体施用量(mg/kg)，纵轴表示血红素浓度(g/dL)。6D10-1-1抗体用△表示，10D5-2-3抗体用□表示，R&D抗体用●表示。图中的0mg/kg的值表示介质施用组的值，误差线表示标准误差(SE、n＝6)。
图7A是表示长期施用(2个月)获得的抗BMP9单克隆抗体对小鼠红细胞造血产生的作用的图。图7A的图表示红细胞数的变化。图的纵轴表示红细胞数(×104/μL)。图中的误差线表示标准误差(SE、n＝8)。各种抗体施用组的测定值相对于介质施用组的测定值的统计学显著性差异检验使用学生t检验(Student’s t-test)来分析，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
图7B是表示长期施用(2个月)获得的抗BMP9单克隆抗体对小鼠红细胞造血产生的作用的图。图7B的图表示血红素浓度的变化。图的纵轴表示血红素浓度(g/dL)。图中的误差线表示标准误差(SE、n＝8)。各种抗体施用组的测定值相对于介质施用组的测定值的统计学显著性差异检验使用学生t检验来分析，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
图8是表示长期施用获得的抗BMP9单克隆抗体对小鼠血中促红细胞生成素(EPO)浓度产生的影响的图。纵轴表示小鼠EPO浓度(pg/mL)。图中的误差线表示标准误差(SE、n＝8)。
图9A是表示短期施用(2周)获得的抗BMP9单克隆抗体对大鼠红细胞造血产生的作用的图。图9A的图表示红细胞数的变化。图的纵轴表示红细胞数(×104/μL)。图中的误差线表示标准误差(SE、n＝6)。各种抗体施用组的测定值相对于介质施用组的测定值的统计学显著性差异检验使用学生t检验来分析，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
图9B是表示短期施用(2周)获得的抗BMP9单克隆抗体对大鼠红细胞造血产生的作用的图。图9B的图表示血红素浓度的变化。图的纵轴表示血红素浓度(g/dL)。图中的误差线表示标准误差(SE、n＝6)。各种抗体施用组的测定值相对于介质施用组的测定值的统计学显著性差异检验使用学生t检验来分析，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
图10A是表示施用获得的抗BMP9单克隆抗体对肾性贫血大鼠模型产生的作用的图。图10A的图表示红细胞数的变化。图的横轴表示抗体施用后的经过时间(周)，图的纵轴表示红细胞数(×104/μL)。假手术个体的介质施用组用○表示，5/6肾切除手术个体的介质施用组用●表示，5/6肾切除手术个体的6D10-1-1抗体施用组用△表示，5/6肾切除手术个体的10D5-2-3抗体施用组用□表示。图中0mg/kg的值表示介质组的值，误差线表示标准偏差(SE、介质施用组n＝5、除此以外的组n＝8)。
图10B是表示施用获得的抗BMP9单克隆抗体对肾性贫血大鼠模型产生的作用的图。图10B的图表示血红素浓度的变化。图的横轴表示抗体施用后的经过时间(周)，图的纵轴表示血红素浓度(g/dL)。假手术个体的介质施用组用○表示，5/6肾切除手术个体的介质施用组用●表示，5/6肾切除手术个体的6D10-1-1抗体施用组用△表示，5/6肾切除手术个体的10D5-2-3抗体施用组用□表示。图中0mg/kg的值表示介质组的值，误差线表示标准偏差(SE、介质施用组n＝5、除此以外的组n＝8)。
图11A是表示获得的抗BMP9单克隆抗体与人BMP9的复合物对来源于人BMP10依赖性人ALK1的信号的作用的图。图11A的图表示6D10-1-1抗体与人BMP9的复合物的结果。图的横轴表示人BMP10的添加浓度，纵轴表示相对的荧光素酶发光量(Relative Luciferase Unit，相对荧光素酶活性单位)。抗BMP9单克隆抗体(3μg/mL)单独添加组用■表示，抗BMP9单克隆抗体(3μg/mL)与2ng/mL人BMP9的复合物添加组用△表示，抗BMP9单克隆抗体(3μg/mL)与10ng/mL人BMP9的复合物添加组用○表示。
图11B是表示获得的抗BMP9单克隆抗体与人BMP9的复合物对来源于人BMP10依赖性人ALK1的信号的作用的图。图11B的图表示10D5-2-3抗体与人BMP9的复合物的结果。图的横轴表示人BMP10的添加浓度，纵轴表示相对的荧光素酶发光量(Relative Luciferase Unit)。抗BMP9单克隆抗体(3μg/mL)单独添加组用■表示，抗BMP9单克隆抗体(3μg/mL)与2ng/mL人BMP9的复合物添加组用△表示，抗BMP9单克隆抗体(3μg/mL)与10ng/mL人BMP9的复合物添加组用○表示。
图12表示制作的10D5-2-3抗体人源化抗体的重链可变区。
图13表示制作的10D5-2-3抗体人源化抗体的轻链可变区。
具体实施方式
本发明涉及与人BMP9结合的单克隆抗体。
本发明中，与抗体竞争地与人BMP9结合的抗体是指人BMP9上具有与本发明的单克隆抗体的表位相同或部分相同的表位(也称为抗原决定簇)并与该表位结合的抗体。
同与本发明的单克隆抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体是指识别并结合与本发明的单克隆抗体所识别的人BMP9的氨基酸序列相同的序列的抗体。
人BMP9具有序列号66表示的氨基酸序列并以单链的前体蛋白质(Pre-Pro体)的形式合成。该单链的Pre-Pro体的序列号66表示的氨基酸序列中的第1位至第22位的信号肽区域在高尔基体中被切断后，经由存在于第392位的半胱氨酸残基间的二硫键形成二聚体(Pro二聚体)。
然后，利用弗林蛋白样蛋白酶在序列号66表示的氨基酸序列的第319位与第320位的氨基酸残基间切断，分割为不具有二硫键的N末端侧片段的前肽区域(包含序列号66表示的氨基酸序列中第23位的氨基酸至第319位的氨基酸的肽)和由序列号67表示的氨基酸序列构成的C末端侧片段(成熟区)。
在切掉前肽区域后，上述成熟区通过序列号67的第73位上残留的半胱氨酸残基间的二硫键形成二聚体(以下记作成熟二聚体)。2分子被切掉的N末端侧的前肽区域与1分子的该成熟二聚体通过非共价键形成复合物，并以该复合物的形式从细胞中分泌[J.Biol.Chem.,280(26),25111(2005)]。成熟二聚体和在成熟二聚体上结合有N末端前肽区域的复合物均具有BMP9的功能。
因此，作为本发明中的人BMP9，也包括包含序列号66或GenBank登记号NP_057288表示的氨基酸序列中与成熟区相当的第320位至第429位的氨基酸序列(序列号67)且具有人BMP9的功能的多肽、包含在与成熟区相当的第320位至第429位的氨基酸序列(序列号67)中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列且具有人BMP9的功能的多肽、具有与序列号67表示的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽、包含与序列号67表示的氨基酸序列具有最优选95％以上的同源性的氨基酸序列且具有人BMP9的功能的多肽、以及上述成熟二聚体和在成熟二聚体上结合有N末端前肽区域的复合物。
作为上述的BMP9的功能，是指BMP9参与细胞内的信号转导。在细胞内的信号转导中，BMP9与属于TGFβ超家族的I型和II型这两种受体结合，由此使该受体活化，使Smad1/5/8磷酸化，进而，通过磷酸化而被活化的Smad1/5/8与Smad4形成复合物后，移动到核内，作为转录因子发挥作用。
作为I型受体，可以列举ALK1和ALK2。另外，作为II型受体，可以列举BMP II型受体(BMPRII)、激活素IIa型受体(ActRIIa)和激活素IIb型受体(ActRIIb)。
作为得到具有在序列号67表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽的方法，可以列举如下方法：使用定点诱变法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版(冷泉港实验室出版社，1989)；Current Protocols inmolecular Biology(最新分子生物学实验方法),约翰威立父子出版公司(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，在例如编码具有序列号67表示的氨基酸序列的多肽的基因中导入定点突变。
缺失、取代或添加的氨基酸数没有特别限定，优选为一个至数十个、例如1～20个的氨基酸，更优选为一个至数个、例如1～5个的氨基酸。
作为编码人BMP9的基因，可以列举序列号68或GenBank登记号NM_016204表示的碱基序列。其中，由在与成熟区相当的序列号69表示的碱基序列中缺失、取代或添加一个以上的碱基而成的碱基序列构成并且包含编码具有人BMP9的功能的多肽的DNA的基因、由与序列号69表示的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列、优选具有80％以上的同源性的碱基序列、更优选具有95％以上的同源性的碱基序列构成并且包含编码具有人BMP9的功能的多肽的DNA的基因、以及由在严格条件下与具有序列号69表示的碱基序列的DNA杂交的DNA构成并且包含编码具有人BMP9的功能的多肽的DNA的基因等也包括在本发明的编码人BMP9的基因中。
作为在严格条件下杂交的DNA，是指使用具有序列号69表示的碱基序列的DNA作为探针，通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹(Southern blot)杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。
具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的过滤器或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下在65℃下进行杂交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inmolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)；DNA Cloning 1:Coretechniques,APractical Approach(DNA克隆1：核心技术与实用方法)，第二版，牛津大学，(1995)]，然后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mmol/L的氯化钠、15mmol/L的柠檬酸钠构成)，在65℃的条件下清洗过滤器或载玻片，由此进行鉴定。
作为能够杂交的DNA，可以列举与序列号69表示的碱基序列具有至少60％以上的同源性的DNA，优选具有80％以上的同源性的DNA，进一步优选具有95％以上的同源性的DNA。
编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列常常可以观察到基因的多态性。本发明的编码BMP9的基因还包括使本发明中使用的基因由于这样的多态性而在碱基序列中产生小规模的突变而得到的基因。
除特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值，对于碱基序列而言，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数计算出的数值等，对于氨基酸序列而言，可以列举使用BLAST2[NucleicAcids Res.,25,3389(1997)；Genome Res.,7,649(1997)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中默认的参数计算出的数值等。
作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost toextend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotide mismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，word size)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y(非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)forblast extensions in bits)在blastn的情况下为20，在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，X dropoff value for gapped alignment inbits)为15；Z(最终空位比对的下降值，final X dropoff value for gappedalignment in bits)在blastn的情况下为为50，在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
由序列号66或GenBank登记号NP_057288表示的氨基酸序列的部分序列构成的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作，例如，可以通过使编码序列号66表示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。
另外，基于使用上述方法制作的多肽或DNA，通过与上述同样的方法，可以得到具有在序列号66或GenBank登记号NP_057288表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。
此外，由序列号66或GenBank登记号NP_057288表示的氨基酸序列的部分序列构成的多肽或者具有在序列号66或GenBank登记号NP_057288表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽也可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)法和叔丁氧羰基(tBoc)法等化学合成法来制造。
本发明的单克隆抗体(以下，也称为本发明的抗体)为识别并且结合人BMP9的氨基酸序列或其空间结构的抗体或其抗体片段，或者具有与人BMP9的氨基酸序列或其空间结构结合、抑制BMP9与BMPRII的结合且不抑制BMP9与ALK1的结合的性质。作为本发明的单克隆抗体，可以列举与人BMP9结合并且与人BMP9的结合解离常数为1×10-10mol/L以下的单克隆抗体或该抗体片段。
作为本发明的抗体，具体而言，可以列举与序列号67表示的人BMP9成熟区的氨基酸序列中的至少第84位的Val、第95位的Leu、第97位的Tyr和第98位的His结合的抗体、或者与至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第93位的Pro结合的抗体。更优选列举与第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第93位的Pro结合的抗体。
作为本发明中的人BMP9的氨基酸序列，可以列举例如包含2个序列号67表示的人BMP9成熟区的氨基酸序列且第73位的半胱氨酸残基间形成有二硫键的氨基酸序列。
作为本发明中的人BMP9的空间结构，只要具有与包含序列号66、GenBank登记号NP_057288或序列号67表示的氨基酸序列的人BMP9在天然状态下可以形成的结构同等的结构，则可以为任意一种结构。人BMP9在天然状态下可以形成的空间结构是指人BMP9的天然型的空间结构。
作为本发明中的BMPRII，可以列举：包含序列号70或GenBank登记号NP_001195表示的氨基酸序列中相当于胞外域的从第27位至第150位的氨基酸序列的多肽。
作为本发明中的ALK1，可以列举：包含序列号71或GenBank登记号AAH42637表示的氨基酸序列中相当于胞外域的从第22位至第118位的氨基酸序列的多肽。
本发明的抗体的结合解离常数(Kd值)可以通过由使用Biacore系统(通用电气医疗集团制造)测定的传感图利用单周期动力学算法(BIA评价软件第3版，通用电气医疗集团制造)进行分析来计算。
作为上述抗体，具体而言，可以列举下述(i)～(ii)的单克隆抗体及其抗体片段。
(i)包含CDR1～3分别含有序列号54～56表示的氨基酸序列的抗体的重链(以下记作H链)且包含CDR1～3分别含有序列号57～59表示的氨基酸序列的抗体的轻链(以下记作L链)的单克隆抗体及其抗体片段
(ii)包含CDR1～3分别含有序列号60～62表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号63～65表示的氨基酸序列的抗体的L链的单克隆抗体及其抗体片段
另外，作为本发明的单克隆抗体，更具体而言，可以列举下述(a)、(b)和(c)的单克隆抗体及其抗体片段。
(a)包含含有序列号48表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区(以下记作VH)且包含含有序列号51表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区(以下记作VL)的单克隆抗体及其抗体片段
(b)包含含有序列号49表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含含有序列号52表示的氨基酸序列的抗体的VL的单克隆抗体及其抗体片段
(c)包含含有序列号128表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含含有序列号132表示的氨基酸序列的抗体的VL的抗体及其抗体片段
此外，作为本发明的单克隆抗体，可以列举同与上述单克隆抗体所结合的人BMP9上存在的表位相同的表位结合的单克隆抗体及其抗体片段。
本发明的抗体或其抗体片段与人BMP9的氨基酸序列或其空间结构的结合可以通过使用固相抗原的酶联免疫吸附法(ELISA)等针对人BMP9或表达人BMP9的组织的公知的免疫学检测法、能够考察特定抗原与抗特定抗原的抗体的结合性的方法等来确认。
可以列举例如：使用Biacore系统(通用电气医疗集团制造)等的表面等离子体共振法、使用ITC(DKSH公司制造)等的等温滴定量热法等方法。
抗体对抗原的结合解离常数(Kd值)可以通过利用ELISA、表面等离子体共振法、等温滴定量热法中的任意一种方法进行斯卡查德作图(scatchard plot)、或者依照各装置的附带资料进行分析来求出。
另外，也可以将公知的免疫学检测方法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice(单克隆抗体的原则与实践)，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验指南)，冷泉港实验室(1988)；単クローン抗体実験マニュアル(单克隆抗体实验指南)，講談社サイエンティフィック(1987)]等组合来进行确认。
作为表达人BMP9的组织，只要表达该BMP9则可以为任意一种组织，可以列举例如血液、肝脏等。
作为本发明的单克隆抗体，可以列举：由杂交瘤生产的抗体、或者由利用包含抗体基因的表达载体进行转化而得到的转化体生产的基因重组抗体。
单克隆抗体为单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，其特征在于，仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并且构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)一致。
作为表位，可以列举例如：单克隆抗体所识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的空间结构、结合有糖链的氨基酸序列以及由结合有糖链的氨基酸序列构成的空间结构等。
本发明的单克隆抗体优选与人BMP9的氨基酸序列结合。
本发明的单克隆抗体所结合的表位优选包含在人BMP9的氨基酸序列中。
杂交瘤例如可以通过如下方法来制备：制备上述人BMP9作为抗原，利用经该抗原免疫后的动物诱导出具有抗原特异性的抗体生产细胞，进而，使该抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对该杂交瘤进行培养或者对动物施用该杂交瘤细胞而使该动物产生癌性腹水并对该培养液或腹水进行分离、纯化，可以获得抗BMP9单克隆抗体。
作为进行抗原免疫的动物，只要能够制作杂交瘤则均可以使用，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠、鸡或兔等。另外，由如下制作的杂交瘤生产的抗体等也包括在本发明的抗体中：从上述动物中获取具有抗体产生能力的细胞，在体外对该细胞实施免疫，然后与骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤。
作为本发明中的基因重组抗体，包括人嵌合抗体、人CDR移植抗体、人抗体或抗体片段等通过基因重组制造的抗体。基因重组抗体中，具有单克隆抗体的特征、抗原性低且血中半衰期延长的基因重组抗体优选作为治疗剂。基因重组抗体可以列举例如使用基因重组技术对上述本发明的单克隆抗体进行修饰而得到的抗体。
人嵌合抗体是指由人以外的动物的抗体的VH和VL与人抗体的重链恒定区(以下记作CH)和轻链恒定区(以下记作CL)构成的抗体。本发明的人嵌合抗体可以如下制造：由上述杂交瘤获取编码VH和VL的cDNA，将它们分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人嵌合抗体表达载体，将上述载体导入动物细胞中使其进行表达。
作为人嵌合抗体的CH，只要属于人免疫球蛋白(以下记作hIg)则均可以使用，优选hIgG类的CH，并且，可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亚类中的任意一种。另外，作为人嵌合抗体的CL，可以是属于hIg的任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。
作为本发明的人嵌合抗体，具体而言，可以列举：包含含有序列号48表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含含有序列号51表示的氨基酸序列的抗体的VL的嵌合抗体。另外，可以列举：包含含有序列号49表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含含有序列号52表示的氨基酸序列的抗体的VL的嵌合抗体。
人CDR移植抗体有时也称为人源化抗体，是指将人以外的动物的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的适当位置而得到的抗体。本发明的人CDR移植抗体可以如下制造：构建编码可变区(以下记作V区)的cDNA，所述可变区是将由产生特异性识别人BMP9并与人BMP9的氨基酸序列或其空间结构结合的人以外的动物的单克隆抗体的杂交瘤产生的人以外的动物的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到任意的人抗体的VH和VL的框架区(以下记作FR)中而形成的可变区，将上述cDNA分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人CDR移植抗体表达载体，并将其导入动物细胞中，由此进行表达，从而制造人CDR移植抗体。
作为人CDR移植抗体的CH，只要属于hIg则可以是任意一种CH，优选使用hIgG类的CH，并且，可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亚类中的任意一种。另外，作为人CDR移植抗体的CL，只要属于hIg则可以是任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。
作为本发明的人CDR移植抗体，具体而言，可以列举：包含CDR1～3分别含有序列号54～56表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含CDR1～3分别含有序列号57～59表示的氨基酸序列的抗体的VL的人源化抗体。另外，可以列举：包含CDR1～3分别含有序列号60～62表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含CDR1～3分别含有序列号63～65表示的氨基酸序列的抗体的VL的人源化抗体。
作为本发明的人源化抗体，具体而言，可以列举包含下述(a)VH和(b)VL中的至少一者的人源化抗体。
(a)包含序列号116的氨基酸序列或者序列号116的氨基酸序列中的选自第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的Gly、第79位的Asn、第81位的Leu、第94位的Ala、第95位的Val、第99位的Ala和第100位的Arg中的至少一个氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VH
(b)包含序列号118的氨基酸序列或者序列号118的氨基酸序列中的选自第4位的Met、第40位的Tyr、第81位的Ser、第82位的Leu、第89位的Val和第91位的Tyr中的至少一个氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
此外，作为本发明的人源化抗体中包含的VH，优选下述(1)～(6)。
(1)包含序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的Gly、第79位的Asn、第81位的Leu、第94位的Ala、第95位的Val、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(2)包含序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的Gly、第81位的Leu、第94位的Ala、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(3)包含序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的Gly、第79位的Asn、第94位的Ala、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(4)包含序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly、第95位的Val、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(5)包含序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly、第18位的Leu、第79位的Asn和第100位的Arg被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(6)包含序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly、第99位的Ala和第100位的Arg被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
作为上述VH的氨基酸序列，可以列举例如导入有选自下述修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列：将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr或者将第100位的Arg取代成Gly。
作为导入有9个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如：将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列。
作为导入有8个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(9)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(8)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(9)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile并且将第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有7个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(8)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第49位的Gly取代成Ala将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(8)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有6个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(7)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly并且将第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有5个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第49位的Gly取代成Ala、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有4个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(7)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第79位的Asn取代成Ser并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly并且将第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有3个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第81位的Leu取代成Val并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala、将第94位的Ala取代成Gly并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第94位的Ala取代成Gly、将第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有2个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(12)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第94位的Ala取代成Gly并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第99位的Ala取代成Thr并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg并且将第49位的Gly取代成Ala的氨基酸序列
(8)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met并且将第49位的Gly取代成Ala的氨基酸序列
(9)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且将第81位的Leu取代成Val的氨基酸序列
(10)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且将第94位的Ala取代成Gly的氨基酸序列
(11)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且将第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(12)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala并且将第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有1个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(9)的氨基酸序列。
(1)将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg的氨基酸序列
(2)将序列号116的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met的氨基酸序列
(3)将序列号116的氨基酸序列中的第49位的Gly取代成Ala的氨基酸序列
(4)将序列号116的氨基酸序列中的第79位的Asn取代成Ser的氨基酸序列
(5)将序列号116的氨基酸序列中的第81位的Leu取代成Val的氨基酸序列
(6)将序列号116的氨基酸序列中的第94位的Ala取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号116的氨基酸序列中的第95位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(8)将序列号116的氨基酸序列中的第99位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(9)将序列号116的氨基酸序列中的第100位的Arg取代成Gly的氨基酸序列
另外，作为本发明的人源化抗体中含有的VL，优选下述(1)～(4)。
(1)包含序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met、第40位的Tyr、第81位的Ser、第82位的Leu、第89位的Val和第91位的Tyr被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
(2)包含序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met、第81位的Ser、第82位的Leu和第89位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
(3)包含序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr、第81位的Ser和第91位的Tyr被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
(4)包含序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr和第91位的Tyr被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
作为上述VL的氨基酸序列，可以列举例如导入有选自下述修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列：将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met或者将第91位的Tyr取代成Phe。
作为导入有6个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如：将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列。
作为导入有5个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(2)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(6)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
作为导入有4个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(2)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(6)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
作为导入有3个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(2)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(3)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe、将第82位的Leu取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro、将第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(6)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
作为导入有2个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(10)的氨基酸序列。
(1)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且将第81位的Ser取代成Pro的氨基酸序列
(2)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且将第82位的Leu取代成Met的氨基酸序列
(3)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(4)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro并且将第82位的Leu取代成Met的氨基酸序列
(6)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(7)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(8)将序列号118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met并且将第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(9)将序列号118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(10)将序列号118的氨基酸序列中的第89位的Val取代成Met并且将第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
作为导入有1个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu的氨基酸序列
(2)将序列号118的氨基酸序列中的第40位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号118的氨基酸序列中的第81位的Ser取代成Pro的氨基酸序列
(4)将序列号118的氨基酸序列中的第82位的Leu取代成Met的氨基酸序列
(5)将序列号118的氨基酸序列中的第89位的Val取代成Met的氨基酸序列
(6)将序列号118的氨基酸序列中的第91位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
另外，作为本发明的人源化抗体的具体例，可以列举：抗体的VH包含序列号116的氨基酸序列和/或抗体的VL包含序列号118的氨基酸序列的人源化抗体、抗体的VH包含序列号116的氨基酸序列和/或抗体的VL包含图12所示的任意一个氨基酸序列的人源化抗体、或者抗体的VH包含图11所示的氨基酸序列和/或抗体的VL包含序列号118的氨基酸序列的人源化抗体等。
人抗体原本是指天然存在于人体内的抗体，但也包括从利用最近的基因工程、细胞工程、发育工程的技术进步而制作的人抗体噬菌体文库和产生人抗体的转基因动物中得到的抗体等。
天然存在于人体内的抗体例如可以如下获得：分离人末梢血淋巴细胞，使其感染EB病毒等而永生化，并进行克隆，由此可以培养出产生该抗体的淋巴细胞，并可以从培养上清中纯化出该抗体。
人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中而使Fab、scFv等抗体片段在噬菌体表面进行表达而得到的文库。可以以抗体片段对固定有抗原的底物的结合活性为指标，从该文库中回收在表面表达具有期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步通过基因工程方法转变为由两条完整的H链和两条完整的L链构成的人抗体分子。
产生人抗体的转基因动物是指细胞内整合有人抗体基因的动物。具体而言，例如，向小鼠ES细胞中导入人抗体基因，将该ES细胞移植到小鼠的早期胚胎中，然后使其发育，由此可以制作产生人抗体的转基因小鼠。来自于产生人抗体的转基因动物的人抗体可以如下制作：使用通常的在人以外的动物中进行的杂交瘤制作方法，获取产生人抗体的杂交瘤并进行培养，由此，在培养上清中产生并蓄积人抗体。
在构成上述抗体或抗体片段的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一个以上的氨基酸并且具有与上述抗体或其抗体片段相同的活性的单克隆抗体或其抗体片段也包括在本发明的单克隆抗体或其抗体片段中。
缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸数为一个以上，其数量没有特别限定，为利用定点诱变法[Molecular Cloning，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inmolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；NucleicAcids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等公知的技术可以缺失、取代或添加的程度的数量。例如优选为一个至数十个，更优选为1～20个，进一步优选为1～10个，特别优选为1～5个。
在上述抗体的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一个以上的氨基酸残基表示如下含义。即，意味着在同一序列中的任意且一个或多个氨基酸序列中，存在一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加。另外，既存在同时发生缺失、取代、插入或添加的情况，也存在被取代、插入或添加的氨基酸残基为天然型和非天然型中的任意一种的情况。
作为天然型氨基酸残基，可以列举例如：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸或L-半胱氨酸等。
以下，示出可相互取代的氨基酸残基的优选例。同一组中所含的氨基酸残基可以相互取代。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
本发明中，作为抗体片段，可以列举：Fab、F(ab’)2、Fab’、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(diabody)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽等。
Fab是将IgG用作为蛋白分解酶的木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处切断)、N末端侧约一半的H链与整个L链通过二硫键结合而成的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的Fab可以通过将本发明的单克隆抗体用木瓜蛋白酶进行处理而得到。另外，也可以将编码该抗体的Fab的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中，由此使其进行表达，从而制造Fab。
F(ab’)2是将IgG的铰链区的二硫键的下部用作为蛋白分解酶的胃蛋白酶分解而得到的、两个Fab区在铰链部分结合而构成的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的片段。
本发明的F(ab’)2可以通过将本发明的单克隆抗体用胃蛋白酶进行处理而得到。另外，也可以通过使下述Fab’以硫醚键或二硫键结合来制作。
Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的二硫键切断而得到的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的Fab’可以通过将本发明的F(ab’)2用二硫苏糖醇等还原剂进行处理而得到。另外，也可以将编码该抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中，由此使其进行表达，从而制造Fab’。
scFv是使用适当的肽接头(以下记作P)将一条VH与一条VL连接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的scFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
双价抗体为scFv二聚体化而得到的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。二价抗原结合活性可以相同，也可以使其中之一为不同的抗原结合活性。
本发明的双价抗体可以通过如下方法制造：获取编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，以使肽接头的氨基酸序列的长度为8个残基以下的方式构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
dsFv是指使VH和VL中的各一个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基的多肽借助该半胱氨酸残基之间的二硫键结合而得到的抗体片段。取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以根据已知的方法[ProteinEngineering,7,697(1994)]基于抗体的空间结构预测来进行选择。
本发明的dsFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
包含CDR的肽包含VH或VL的CDR中的至少一个以上的区域而构成。包含多个CDR的肽可以直接结合或者借助肽接头而结合。
本发明的包含CDR的肽可以通过如下方法制造：构建编码本发明的单克隆抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。另外，包含CDR的肽也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。
本发明的单克隆抗体包括：利用化学或基因工程方法在本发明的单克隆抗体或其抗体片段上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质等而得到的抗体的衍生物。在使用抗体的衍生物作为检测方法、定量方法、检测用试剂或定量用试剂的情况下，作为本发明的单克隆抗体或其抗体片段上结合的药剂，可以列举通常的免疫学检测或测定方法中使用的标记物。
本发明中的抗体的衍生物可以通过利用化学方法[抗体工学入門(抗体工程入门)，地人书馆(1994)]在本发明的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或其抗体片段中的适当的取代基或侧链、以及单克隆抗体或其抗体片段中的糖链等上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质等来制造。
另外，本发明中的抗体的衍生物也可以通过基因工程方法来制造，即，使编码本发明的单克隆抗体或抗体片段的DNA与编码要结合的蛋白质的DNA连接后插入表达载体中，并将该表达载体导入适当的宿主细胞中，使其进行表达。
作为放射性同位素，可以列举例如：131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素可以通过氯胺T法等直接与抗体结合。另外，也可以在抗体上结合用于螯合放射性同位素的物质。作为螯合剂，可以列举1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作为低分子药剂，可以列举例如：吖啶酯或洛粉碱等发光物质、或者异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)等荧光物质等。
作为使低分子药剂与抗体结合的方法，可以列举例如：通过戊二醛使药剂与抗体的氨基之间结合的方法、或者通过水溶性碳二亚胺使药剂的氨基与抗体的羧基结合的方法等。
作为高分子药剂，可以列举例如：聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过使这些高分子化合物与抗体或抗体片段结合，可以期待发挥如下效果：(1)提高对化学性、物理性或生物性的各种因素的稳定性；(2)显著延长血中半衰期；(3)免疫原性消失或抑制抗体产生；等[バイオコンジュゲート医薬品，广川书店(1993)]。例如，作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举与PEG化修饰试剂进行反应的方法等[バイオコンジュゲート医薬品，广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举：赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926号公报)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587号公报)或精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报)等。
作为蛋白质，可以列举例如碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶等酶。
另外，本发明涉及含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段作为有效成分的伴有BMP9相关的贫血的疾病的治疗剂。
作为伴有BMP9相关的贫血的疾病，可以列举：以血液或造血功能本身为原因的原发性贫血和以其他疾病为原因而引起的继发性贫血。原发性贫血有缺铁性贫血、巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等，继发性贫血有肾脏疾病、感染症(结核、感染性心内膜炎、肝脓肿等)、胶原病(慢性风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)、癌症等恶性疾病、肝脏疾病、内分泌疾病等。
作为癌症，可以列举例如：血癌、乳腺癌、子宫癌、大肠癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌、小肠癌、前列腺癌或胰腺癌等，优选列举血癌、食道癌、胃癌、大肠癌、肝癌或前列腺癌。
作为血癌，可以列举例如：急性骨髓性白血病(acute myeloidleukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、皮肤T细胞性淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma，CTCL)、末梢T细胞性淋巴瘤(peripheral T cell lymphoma，PTCL)、间变性大细胞性淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma，ALCL)、急性淋巴细胞性白血病(acute lympatic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lympatic leukemia，CLL)、其他淋巴细胞性白血病、NK细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、或者以伯基特淋巴瘤为代表的非霍奇金淋巴瘤等。
作为肝脏疾病，可以列举例如慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭等，作为内分泌疾病，可以列举例如甲状腺功能减退症、肾上腺皮质功能减退症、垂体功能减退症、甲状旁腺功能亢进症等。
本发明的治疗剂含有上述的本发明的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。
含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，但通常优选以与药理学上可容许的一种以上的载体一同混合并通过制剂学技术领域中公知的任意方法制造而成的医药制剂的形式来提供。
施用途径优选使用治疗时最有效的途径，可以列举：经口施用、或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非经口施用，优选列举静脉内施用或皮下施用。
作为施用形式，可以列举例如：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或胶带剂等。
施用量或施用次数根据目标治疗效果、施用方法、治疗时间、年龄和体重等而不同，通常成人每天为10μg/kg～10mg/kg。
此外，本发明涉及含有特异性识别并结合BMP9的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体或其抗体片段作为有效成分的、BMP9的免疫学检测或测定方法。
作为本发明中检测或测定BMP9的量的方法，可以列举任意的公知方法。例如，可以列举免疫学检测或测定方法等。
免疫学检测或测定方法是指使用实施过标记的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。作为免疫学检测或测定方法，可以列举：放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescent immunoassay)、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
以下，对本发明的抗体的制造方法、疾病的治疗方法和疾病的诊断方法进行具体说明。
1.单克隆抗体的制造方法
(1)抗原的制备
作为抗原的BMP9或表达BMP9的组织可以通过将包含编码全长或部分长度的BMP9的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到。另外，可以从大量表达BMP9的人组织中纯化得到BMP9。另外，也可以直接使用该组织等作为抗原。此外，也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成方法制备具有BMP9的部分序列的合成肽来作为抗原使用。
本发明中使用的BMP9可以通过使用Molecular Cloning,ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)或CurrentProtocols inmolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)等中记载的方法等利用例如以下的方法使编码该BMP9的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。
首先，将包含编码BMP9的部分的全长cDNA插入到适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。也可以使用基于全长cDNA而制备的、包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段来代替上述全长cDNA。接着，将得到的该重组载体导入到适合于该表达载体的宿主细胞中，由此可以得到生产多肽的转化体。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中自主复制或者能够整合到染色体中并且在能够转录编码多肽的DNA的位置含有适当的启动子的表达载体，则均可以使用。
作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等能够表达目的基因的宿主细胞，则均可以使用。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，重组载体优选为在原核生物中能够自主复制的同时包含启动子、核糖体结合序列、包含编码BMP9的部分的DNA和转录终止序列的载体。另外，该重组载体不一定需要转录终止序列，但优选在紧邻结构基因的下游配置转录终止序列。该重组载体可以进一步含有调控启动子的基因。
作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列(也称为SD序列)与起始密码子的间隔调节至适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。
另外，作为编码该BMP9的DNA的碱基序列，可以对碱基进行取代以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此，能够提高目标BMP9的生产率。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中发挥功能的载体则均可以使用，可以列举例如：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(法玛西亚公司制造)、pSE280(英杰公司制造)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制造)、pQE-8(凯杰公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[AgriculturalBiological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agricbiol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(ストラタジーン公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP6798)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4686191号说明书、美国专利第4939094号说明书、美国专利第5160735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.、172、2392(1990)]、pGEX(法玛西亚公司制造)、pET系统(ノバジェン公司制造)或pME18SFL3等。
作为启动子，只要是能够在所使用的宿主细胞中发挥功能的启动子则均可使用。可以列举例如：trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个Ptrp串联而得到的串联启动子、tac启动子、lac T7启动子或let I启动子等经过人为设计修饰的启动子等。
作为宿主细胞，可以列举例如：大肠杆菌XL-1Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。
作为向宿主细胞中导入重组载体的方法，只要是向所使用的宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用，可以列举例如：使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)；Gene,17,107(1982)；Molecular&General Genetics,168,111(1979)]。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要是能够在动物细胞中发挥功能的表达载体则均可以使用，可以列举例如：pcDNA I、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pcDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNA I/Amp(英杰公司制造)、pcDNA3.1(英杰公司制造)、pREP4(英杰公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(国际公开第97/10354号)等。
作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子则均可以使用，可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或者莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一同使用。
作为宿主细胞，可以列举例如：人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猿细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞(Journal ofExperimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cellgenetics,Appendix I,II(pp.883-900))、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。
作为向宿主细胞中导入重组载体的方法，只要是向动物细胞中导入DNA的方法则均可以使用。可以列举例如：电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
将如上得到的包含整合有编码BMP9的DNA的重组载体的来源于微生物或动物细胞等的转化体在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积该BMP9，并从该培养物中进行收集，由此可以制造BMP9。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以根据宿主的培养中使用的通常的方法来进行。
在来源于真核生物的细胞中进行表达时，能够得到附加有糖或糖链的BMP9。在对利用使用诱导性启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，在对利用使用lac启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，在对利用使用trp启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为用于培养以动物细胞为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用例如通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the AmericanMedical Association,199,519(1967)]、伊戈尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜尔贝科(Dulbecco)改良的MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、伊思考夫(Iscove)改良的杜尔贝科培养基(IMDM)或者向这些培养基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等条件下进行1～7天。另外，在培养中，可以根据需要向培养基中添加卡那霉素或青霉素等抗生素。
作为编码BMP9的基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以使用分泌生产或融合蛋白表达等方法[Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]。
作为BMP9的生产方法，有在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法或者在宿主细胞外膜上生产的方法，可以通过改变所使用的宿主细胞或所生产的BMP9的结构来选择适当的方法。
在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产BMP9的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，可以使BMP9主动地分泌到宿主细胞外。
另外，还可以利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平2-227075号公报)来提高BMP9的生产量。所得到的BMP9例如可以如下进行分离、纯化。在BMP9在细胞内以溶解状态进行表达的情况下，在培养结束后通过离心分离来回收细胞，悬浮于水性缓冲液中，然后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、MANTON-GULIN匀浆器或卧式砂磨机等将细胞破碎，得到无细胞提取液。
通过单独使用或组合使用通常的蛋白质的分离纯化方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(法玛西亚公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖和苯基琼脂糖等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法或者等电点电泳等电泳法等方法，可以从对上述无细胞提取液进行离心分离而得到的上清中得到纯化制备品。
在BMP9在细胞内形成包涵体而进行表达的情况下，与上述同样地将细胞回收后进行破碎，并进行离心分离，由此，以沉淀级分的形式回收该BMP9的包涵体。利用蛋白变性剂使回收的该BMP9的包涵体可溶化。通过对该可溶化液进行稀释或透析，使该BMP9恢复至正常的空间结构，然后，通过与上述同样的分离纯化方法，可以得到多肽的纯化制备品。
在BMP9或其糖基化物等衍生物被分泌到细胞外的情况下，可以在培养上清中回收该BMP9或其糖基化物等衍生物。将该培养物与上述同样地利用离心分离等方法进行处理，由此得到可溶性级分，通过使用与上述同样的分离纯化方法，可以从该可溶性级分中得到纯化制备品。
另外，本发明中使用的BMP9也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。另外，还可以利用アドバンストケムテック公司、珀金埃尔默公司、法玛西亚公司、プロテインテクノロジインストルメント公司、シンセセル－ベガ公司、パーセプチブ公司或岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。
(2)动物的免疫与融合用抗体产生细胞的制备
对3～20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等动物进行(1)中得到的抗原的免疫，收集该动物的脾脏、淋巴结、末梢血中的抗体产生细胞。另外，在免疫原性低而无法在上述动物中观察到充分的抗体效价的升高的情况下，也可以使用BMP9敲除小鼠作为被免疫动物。
免疫通过将抗原连同例如完全弗氏佐剂或者氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等适当的佐剂一同施用到动物的皮下、静脉内或腹腔内来进行。在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(钥孔血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白制成结合物，将其作为免疫原使用。
关于抗原的施用，在第一次施用之后，每隔1～2周施用2～10次。每次施用后第3～7天从眼底静脉丛采血，利用酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]等测定其血清的抗体效价。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。
在抗原的末次施用后第3～7天，从免疫后的动物中摘除脾脏等含有抗体产生细胞的组织，收集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏细细切碎并搅散后，进行离心分离，进而除去红细胞，得到融合用抗体产生细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的确立细胞系，可以使用例如：8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(Balb/C来源)骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
将该骨髓瘤细胞在正常培养基[添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPMI1640培养基]中传代，在细胞融合的3～4天之前传代到正常培养基中，以便在融合当天确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合与产生单克隆抗体的杂交瘤的制备
将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(MEM)或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、氯化钠7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分洗涤，以使细胞数达到融合用抗体产生细胞:骨髓瘤细胞＝5～10:1的方式进行混合，离心分离后，弃去上清。
将沉淀的细胞群充分搅散后，在37℃下边搅拌边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进而，每隔1～2分钟加入1～2mL的MEM培养基，重复数次后，加入MEM培养基至总量达到50mL。离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞群轻轻搅散后，将融合用抗体产生细胞轻轻地悬浮于HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基蝶呤的正常培养基]中。将该悬浮液在5％CO2的培养箱中在37℃下培养7～14天。
培养后，抽取一部分培养上清，通过后述的结合分析等杂交瘤的筛选方法筛选与包含BMP9的抗原反应且不与不含BMP9的抗原反应的细胞群。然后，利用有限稀释法重复进行两次克隆[第一次使用HT培养基(从HAT培养基中除去氨基蝶呤的培养基)，第二次使用正常培养基]，筛选稳定地观察到强抗体效价的细胞作为产生单克隆抗体的杂交瘤。
(5)纯化单克隆抗体的制备
对姥鲛烷处理[腹腔内施用0.5mL的2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)并饲养2周]后的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔内注射(4)中得到的产生单克隆抗体的杂交瘤。在10～21天杂交瘤产生癌性腹水。从该小鼠中收集腹水，离心分离除去固体成分后，用40～50％的硫酸铵进行盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，得到纯化单克隆抗体。
另外，将(4)中得到的产生单克隆抗体的杂交瘤在添加有10％FBS的RPMI1640培养基等中进行培养，然后，通过离心分离除去上清，悬浮于杂交瘤-SFM培养基中，培养3～7天。将得到的细胞悬浮液离心分离，由所得到的上清利用蛋白A柱或蛋白G柱进行纯化，收集IgG级分，由此也可以得到纯化单克隆抗体。另外，杂交瘤-SFM培养基中也可以添加5％ダイゴGF21。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量通过劳里法或280nm下的吸光度来计算。
(6)单克隆抗体的筛选
单克隆抗体的筛选通过以下所示的利用酶免疫测定法的结合分析、以及利用Biacore的动力学分析来进行。
(6-a)结合分析
作为抗原，使用将(1)中得到的包含编码BMP9的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到的基因导入细胞、重组蛋白或者由人组织得到的纯化多肽或部分肽等。在抗原为部分肽的情况下，可以与BSA或KLH等载体蛋白制成结合物并使用该结合物。
将抗原分注到96孔板等板中使其固相化，然后，分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化单克隆抗体等受试物质作为第一抗体，使其发生反应。用PBS或PBS-吐温等充分洗涤后，分注由生物素、酶、化学发光物质或放射线化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使其发生反应。用PBS-吐温充分洗涤后，进行与第二抗体的标记物质对应的反应，筛选出对免疫原发生特异性反应的单克隆抗体。
另外，本发明的单克隆抗体可以通过在上述结合分析体系中添加受试抗体并使其发生反应来获得。即，通过筛选出在加入受试抗体后单克隆抗体的结合受到抑制的抗体，能够获得与获得的单克隆抗体竞争性地与BMP9的氨基酸序列或其空间结构结合的单克隆抗体。
此外，同与本发明的单克隆抗体所识别的表位相同的表位结合的抗体可以通过鉴定利用上述结合分析体系获得的抗体的表位并制作所鉴定的表位的部分合成肽或模拟表位的空间结构的合成肽等并用其进行免疫来获得。
(6-b)利用Biacore的动力学分析
使用Biacore T100，测定抗原与受试物之间的结合的动力学，利用设备附带的分析软件对其结果进行分析。利用胺偶联法将抗小鼠IgG抗体固定到传感芯片CM5上，然后，使杂交瘤培养上清或纯化单克隆抗体等受试物质流过而使其以适当量进行结合，进而，使浓度已知的多种浓度的抗原流过，测定结合、解离。
使用设备附带的软件，利用1:1结合模型对所得到的数据进行动力学分析，得到各种参数。或者，利用例如胺偶联法将人BMP9固定到传感芯片上，然后，使浓度已知的多种浓度的纯化单克隆抗体流过，测定结合、解离。使用设备附带的软件，利用二价结合模型对所得到的数据进行动力学分析，得到各种参数。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，以下示出人嵌合抗体和人CDR移植抗体的制作方法。
(1)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体是整合有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆到动物细胞用表达载体中来构建。
人抗体的恒定区(以下记作C区)可以使用任意的人抗体的CH和CL。例如，使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。作为编码人抗体的CH和CL的DNA，使用cDNA，也可以使用包由外显子和内含子构成的染色体DNA。
作为动物细胞用表达载体，只要是能够整合并表达编码人抗体的C区的基因的载体则均可以使用。可以列举例如：pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。
作为动物细胞用表达载体中的启动子和增强子，使用SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。
从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链与L链在动物细胞内的表达量的平衡均衡等观点出发，作为基因重组抗体表达用载体，使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但也可以使用抗体H链和L链存在于不同载体上的类型。作为串联型基因重组抗体表达用载体，使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号公报)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。
(2)编码来源于人以外的动物的抗体的V区的cDNA的获得和氨基酸序列的分析
编码非人抗体的VH和VL的cDNA的获得和氨基酸序列的分析可以如下进行。
从产生非人抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA，并合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。
使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从上述文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的作为目标的小鼠抗体的VH或VL的全长碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全长氨基酸序列。
作为用于制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物，使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤细胞，则可以使用任意动物。
由杂交瘤细胞制备总RNA时，使用异硫氰酸胍三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或者RNA easy试剂盒(凯杰公司制造)等试剂盒等。
由总RNA制备mRNA时，使用固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]、或者Oligo-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(宝生物公司制造)等试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track mRNA分离试剂盒(英杰公司制造)或QuickPrep mRNA纯化试剂盒(法玛西亚公司制造)等试剂盒从杂交瘤细胞中制备mRNA。
在合成cDNA和制作cDNA文库时，使用公知的方法[MolecularCloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，附录1，约翰威立父子出版公司(1987-1997)]、或者用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(英杰公司制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(ストラタジーン公司制造)等试剂盒等。
制作cDNA文库时，作为用于整合以由杂交瘤细胞提取出的mRNA为模板而合成的cDNA的载体，只要是能够整合该cDNA的载体则均可以使用。例如，使用ZAP ExPress[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(ストラタジーン公司制造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A PracticalApproach(DNA克隆实用方法),I,49(1985)]、Lambda BlueMid(クローンテック公司制造)、λEx Cell、pT7T3-18U(法玛西亚公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
作为用于导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要是能够导入、表达和保持该cDNA文库的大肠杆菌则均可以使用。例如，使用XL-1Blue MRF[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
从cDNA文库中筛选编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用同位素或荧光标记的探针的菌落杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]等。
另外，也可以通过如下方法制备编码VH或VL的cDNA：制备引物，以由mRNA合成的cDNA或cDNA文库为模板来进行聚合酶链反应法[以下记作PCR法；Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocolsin Molecular Biology，附录1，约翰威立父子出版公司(1987-1997)]。
将筛选出的cDNA用适当的限制性酶等切割后，克隆到pBluescriptSK(-)(ストラタジーン公司制造)等质粒中，利用通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。作为碱基序列分析方法，例如，在进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用ABI PRISM3700(PE生物系统公司制造)或A.L.F.DNA测序仪(法玛西亚公司制造)等碱基序列自动分析装置等。
由确定的碱基序列分别推定VH和VL的全长氨基酸序列，并与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，由此，分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。
关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，能够推定分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够获知它们所属的亚类。另外，关于VH和VL的各CDR的氨基酸序列，也可以通过与已知的抗体的VH和VL的氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较来找出。
另外，使用所得到的VH和VL的完整氨基酸序列，对例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库进行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等同源性检索，能够确认VH和VL的完整氨基酸序列是否是新的氨基酸序列。
(3)人嵌合抗体表达载体的构建
将分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，由此，能够构建人嵌合抗体表达载体。
为了将编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH和VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸，并且成为适当的限制性酶识别序列。
将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人CDR移植抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而构建人嵌合抗体表达载体。
另外，也可以使用在两端具有适当的限制性酶的识别序列的合成DNA，通过PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，并将它们克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(4)编码人CDR移植抗体的V区的cDNA的构建
编码人CDR移植抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。
分别选择用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。作为所选择的FR的氨基酸序列，只要是人抗体来源的氨基酸序列则均可以使用。
例如，使用蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列或人抗体的FR的各亚群的共有氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。
接着，向所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，从而分别设计出人CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列。在考虑抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]的基础上，将所设计的氨基酸序列转换成DNA序列，从而分别设计出编码人CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
基于所设计的DNA序列，合成多条包含约100个碱基的长度的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR反应。这种情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA的长度考虑，优选对于H链、L链均设计6条合成DNA。
另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，可以容易地将编码人CDR移植抗体的VH或VL的cDNA克隆到(1)中得到的人CDR移植抗体表达用载体中。
或者，可以通过使用基于所设计的DNA序列合成为1条DNA的各H链、L链全长合成DNA来实施。
PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(ストラタジーン公司制造)等质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法来确定碱基序列，从而获得具有编码期望的人CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(5)人CDR移植抗体的V区的氨基酸序列的修饰
仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR中时，人CDR移植抗体的抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
在人CDR移植抗体中，鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基以及维持抗体的空间结构并间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，将这些氨基酸残基取代为原来的非人抗体的氨基酸残基，由此能够使降低的抗原结合活性升高。
为了鉴定与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机模拟分析[Protein Engineering,7,1501(1994)]等来进行抗体的空间结构的构建和分析。另外，通过针对各个抗体制作多种修饰体并反复研究它们与抗原结合活性的相关性来进行各种尝试，能够获得具有所需要的抗原结合活性的修饰人CDR移植抗体。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用修饰用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应来进行修饰。对于PCR反应后的扩增产物，通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标修饰。
(6)人CDR移植抗体表达载体的构建
将所构建的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人CDR移植抗体表达载体。
例如，通过向(4)和(5)中得到的构建人CDR移植抗体的VH或VL时使用的合成DNA中、位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，将所构建的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人CDR移植抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。
(7)基因重组抗体的瞬时表达
使用(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体或者对上述载体进行修饰后的表达载体来进行基因重组抗体的瞬时表达，从而能够有效地评价所制作的多种人CDR移植抗体的抗原结合活性。
作为用于导入表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞，例如，使用COS-7细胞(ATCC编号：CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC出版社,283(1991)]。向COS-7细胞中导入表达载体时，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods inNucleic Acids Res.,CRC出版社,(1991)]或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性使用酶免疫分析法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)；単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック(1987)]等进行测定。
(8)稳定表达基因重组抗体的转化株的获得和基因重组抗体的制备
通过将(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体导入适当的宿主细胞中，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
向宿主细胞中导入表达载体时，使用电穿孔法[日本特开平2-257891号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]等。作为用于导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞。
例如，使用：CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(LifeTechnologies,Cat#11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3-X63-Ag8653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因缺陷的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、获得了凝集素抗性的Lec13[Somatic cell and Molecular Genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号：CRL1662)等。
导入表达载体后，通过在含有G418硫酸盐等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养来筛选稳定表达基因重组抗体的转化株(日本特开平2-257891号公报)。
作为动物细胞培养用培养基，使用：RPMI1640培养基(英杰公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(英杰公司制造)、杂交瘤-SFM培养基(英杰公司制造)或者在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。
通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，在培养上清中表达并蓄积基因重组抗体。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA法等来测定。另外，可以利用DHFR扩增系统(日本特开平2-257891号公报)等使转化株的基因重组抗体的表达量升高。
基因重组抗体使用蛋白A柱从转化株的培养上清中进行纯化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换层析和超滤等蛋白质纯化中使用的方法进行组合。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]等来测定。
3.纯化单克隆抗体或其抗体片段的活性评价
纯化后的本发明的单克隆抗体或其抗体片段的活性评价可以如下进行。
与BMP9和BMP9表达组织的结合活性使用上述1-(6-a)中记载的结合分析和(6-b)中记载的利用Biacore系统等的表面等离子体共振法来测定。另外，可以使用荧光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]来测定。
4.使用本发明的抗BMP9单克隆抗体或其抗体片段的疾病的治疗方法
本发明的单克隆抗体或其抗体片段可以用于治疗伴有BMP9相关的贫血的疾病。
含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，但通常优选以与药理学上容许的一种以上的载体一同混合并通过制剂学技术领域中公知的方法制造而成的医药制剂的形式来提供。
作为施用途径，可以列举：经口施用、或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非经口施用。作为施用形式，可以列举例如：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或胶带剂等。
作为适于经口施用的制剂，可以列举例如：乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
乳剂或糖浆剂这样的液体制备物使用如下成分作为添加剂来制造：水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖类、聚乙二醇或聚丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等油类、对羟基苯甲酸酯等防腐剂或者草莓香料或薄荷等香料类等。
胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用如下成分作为添加剂来制造：乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂、淀粉或海藻酸钠等崩解剂、硬脂酸镁或滑石等润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂或者甘油等增塑剂等。
作为适于非经口施用的制剂，可以列举例如：注射剂、栓剂或喷雾剂等。
注射剂使用包含盐溶液、葡萄糖溶液或者这两者的混合物的载体等来制造。
栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造。
喷雾剂使用不刺激接受者的口腔和气管粘膜、并且使本发明的单克隆抗体或其抗体片段以微细粒子的形式分散从而易于吸收的载体等来制造。作为载体，例如使用乳糖或甘油等。另外，也可以制成气溶胶或干粉。
此外，上述非经口剂中，也可以添加在适于经口施用的制剂中作为添加剂所例示的成分。
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不限定于下述实施例。只要没有特别说明，则所使用的试剂类按照附带的使用说明书来使用。
实施例
[实施例1]
小鼠BMP9基因敲除用靶向载体的构建
1-1)表达盒载体pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A的构建
作为用于制作敲除(KO)用靶向载体的基本载体的表达盒载体pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A是在pBluescript中添加限制性酶切位点后、插入在新霉素抗性标记基因表达单元的两端具有LoxP序列的LoxP-Neo和白喉毒素A链基因(DT-A)而得到的载体，与国际公开第2006/078072号公报的实施例7中记载的载体相同。以下记载该载体制作的概略。
为了在pBluescript II SK(-)(东洋纺公司制造)载体中添加新的限制性酶切位点，合成了下述寡聚DNA(LinkA1：序列号1、LinkA2：序列号2、LinkB1：序列号3和LinkB2：序列号4)。
将pBluescript II SK(-)用限制性酶SalI和XhoI进行处理，用苯酚/氯仿从反应液中提取质粒片段，用乙醇沉淀。为了在该质粒片段中添加新的限制性酶切位点NruI、SgrAI和AscI，插入由LinkA1和LinkA2构成的接头，并导入到大肠杆菌DH5α中。从所得到的转化体中获得质粒pBlueLA。
将pBlueLA用限制性酶NotI和EcoRI进行处理，用苯酚/氯仿从反应液中提取质粒片段，用乙醇沉淀。为了在该质粒片段中添加新的限制性酶切位点PacI、FseI和SalI，插入由LinkB1和LinkB2构成的接头，并导入到大肠杆菌DH5α中。从所得到的转化体中获得质粒pBlueLAB。
将国际公开第00/10383号中记载的质粒pLoxP-STneo用XhoI进行酶消化，获得两端具有LoxP序列的Neo抗性基因(LoxP-Neo)。使用T4DNA聚合酶使LoxP-Neo的两末端成为钝端，获得LoxP-Neo-B。
将pBlueLAB用EcoRV进行酶消化，用苯酚/氯仿从反应液中提取质粒片段，用乙醇沉淀。在所得到的质粒片段中插入LoxP-Neo-B，并导入到大肠杆菌DH5α中。从所得到的转化体中获得质粒pBlueLAB-LoxP-Neo。
将pMC1DT-A(ライフテックオリエンタル公司制造)用XhoI和SalI进行酶消化后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)回收含有DT-A基因的片段。
将pBlueLAB-LoxP-Neo用XhoI进行酶消化，用苯酚/氯仿从反应液中提取质粒片段，用乙醇沉淀。在所得到的质粒片段中插入含有DT-A基因的片段，并导入到大肠杆菌DH5α中。从所得到的转化体中获得表达盒载体pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A。
1-2)小鼠BMP9基因3’侧基因组区域片段的获得
根据从Ensemble基因组浏览器(Ensemble Genome Browser)获得的包含小鼠BMP9(GDF2)基因的基因组DNA序列(登记号：ENSMUSG00000072625)来设计引物(序列号5、6)。
以来源于在大肠杆菌人工染色体[Bacterial ArtificialChromosome(BAC)]中包含C57BL/6J小鼠BMP9基因的克隆RP23-181N8的DNA作为模板，制备含有各10pmol的序列号5和6的引物以及KOD-plus-(东洋纺公司制造)的反应液50μL，在94℃下保温3分钟后，以98℃下10秒钟和68℃下5分钟作为1个循环，进行35个循环的PCR。
将所得到的PCR扩增片段供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)回收2.1kbp的片段。将回收的PCR扩增片段用ClaI和AscI进行酶消化，供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒来回收酶处理片段(ClaI-AscI片段)。
将pBlueLAB用ClaI和AscI进行酶消化，用虾碱性磷酸酶(SAP)处理后，用苯酚/氯仿提取该ClaI-AscI片段，用乙醇沉淀。插入上述中回收的ClaI-AscI片段，并导入到大肠杆菌DH5α中。
从所得到的转化体中筛选出含有未发生由PCR引起的突变的插入基因的克隆。将该质粒DNA用ClaI和AscI进行酶消化，供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒回收2.1kbp的含有小鼠BMP9基因的3’侧基因组序列的酶处理片段。
1-3)小鼠BMP9基因5’侧基因组区域片段的获得
根据从Ensemble基因组浏览器获得的包含小鼠BMP9基因的基因组DNA序列(登记号：ENSMUSG00000072625)来设计引物(序列号7、8)。
以来源于BAC克隆RP23-181N8的DNA作为模板，制备含有各10pmol的序列号7和8的引物以及KOD-plus-(东洋纺公司制造)的反应液50μL，在94℃下保温3分钟后，以98℃下10秒和68℃下5分钟作为1个循环，进行35个循环的PCR。
将所得到的PCR扩增片段供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)回收5.1kbp的片段。将回收的PCR扩增片段用PacI和FseI进行酶消化，供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒来回收酶处理片段(PacI-FseI片段)。
将pBlueLAB用PacI和FseI进行酶消化，进行SAP处理后，用苯酚/氯仿提取该PacI-FseI片段，用乙醇沉淀。插入上述中回收的PacI-FseI片段，并导入到大肠杆菌DH5α中。
从所得到的转化体中筛选出含有未发生由PCR引起的突变的插入基因的克隆。将该质粒DNA用PacI和FseI进行酶消化，供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒回收5.1kbp的含有小鼠BMP9基因的5’侧基因组序列的酶处理片段。
1-4)小鼠BMP9基因3’侧基因组区域片段向表达盒载体中的插入
将实施例1-1中得到的pBlueLAB-Lox-Neo-DT-A用ClaI和AscI进行酶消化，供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒回收DNA片段。在回收的约7.6kbp的DNA片段中插入实施例1-2中得到的酶处理片段后，导入到大肠杆菌DH5α中。从所得到的转化体中筛选出插入有DNA片段的克隆。确认连接部分的碱基序列没有问题。
1-5)小鼠BMP9基因5’侧基因组区域片段向具有小鼠BMP9基因3’侧基因组区域片段的表达盒载体中的插入
将实施例1-4中得到的质粒用PacI和FseI进行酶消化，供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒回收DNA片段。在回收的9.7kbp的DNA片段中插入实施例1-3中制作的酶处理片段后，导入到大肠杆菌DH5α中。
从所得到的转化体中筛选出插入有DNA片段的克隆。确认连接部分的碱基序列没有问题，获得了小鼠BMP9基因敲除用靶向载体pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3’KO-5’KO(图1)。
[实施例2]
小鼠BMP9基因靶向载体的制备
将60μg的实施例1-5中得到的pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3’KO-5’KO在以使终浓度为1mmol/L的方式添加有亚精胺(西格玛公司制造)并将pH调节为7.0的限制性酶用H缓冲液(罗氏诊断公司制造)中用NotI进行酶消化。
从反应液中用苯酚/氯仿提取载体片段，用乙醇沉淀。加入pH为7.05的HBS溶液[每1升中含有HEPES 5g、NaCl 8g、KCl 0.37g、Na2HPO4·2H2O 0.125g、右旋糖(D-葡萄糖)1g的溶液]，以使DNA浓度为0.5μg/μL，在室温下保存1小时，由此，制备电穿孔用小鼠BMP9基因靶向用载体pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3’KO-5’KO-NotI。
[实施例3]
基因组DNA印迹分析用探针的制备
3-1)用于确认小鼠BMP9基因的5’侧基因组的探针的制作
为了获得含有小鼠BMP9基因的5’侧基因组区域约500bp的探针，基于BAC克隆RP23-181N8的碱基序列信息，设计了引物(序列号9、10)。
以来源于BAC克隆RP23-181N8的DNA为模板，制备含有各10pmol的序列号9和10的引物以及TaKaRa Z Taq(宝酒造公司制造)的反应液50μL，在94℃下保温2分钟后，以94℃下30秒钟、60℃下20秒钟和72℃下1分钟作为1个循环，进行25个循环的PCR。将所得到的PCR扩增片段供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)回收约500bp的5’侧基因组DNA印迹用探针(5’KO-探针)。
3-2)用于确认小鼠BMP9基因的3’侧基因组的探针的制作
为了获得含有小鼠BMP9基因的3’侧基因组区域约500bp的探针，基于BAC克隆RP23-181N8的碱基序列信息，设计了引物(序列号11、12)。
以来源于BAC克隆RP23-181N8的DNA为模板，制备含有各10pmol的序列号11和12的引物以及TaKaRa Z Taq(宝酒造公司制造)的反应液50μL，在94℃下保温2分钟后，以94℃下30秒钟、60℃下20秒钟和72℃下1分钟作为1个循环，进行25个循环的PCR。将所得到的PCR扩增片段供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)回收约500bp的3’侧基因组DNA印迹用探针(3’KO-探针)。
[实施例4]
小鼠BMP9KO ES细胞株的获得
为了获得利用同源重组得到的小鼠BMP9基因KO ES细胞，根据已建立的方法(相泽慎一著，バイオマニュアルシリーズ8(生物手册丛书8)，基因靶向，羊土社，1995)，将实施例2中制备的pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3’KO-5’KO-NotI导入小鼠ES细胞TT2(Yagi等,Analytical Biochem.,214:70,1993)中。以下记载详细的方法。
使用利用丝裂霉素C(西格玛公司制造)处理后的G418抗性原代培养细胞(英杰公司制造)作为营养细胞，在37℃、5％CO2的条件下进行TT2细胞的培养增殖。对TT2细胞进行胰蛋白酶处理，以使其达到3×107个/mL的方式悬浮于实施例2记载的HBS溶液中。将0.5mL的细胞悬浮液与10μg的pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3’KO-5’KO-NotI混合，加入到基因脉冲池(电极距离：0.4cm，伯乐公司制造)中，进行电穿孔(容量：960μF，电压：240V，室温)。
将电穿孔后的细胞悬浮于ES培养基[每1升中含有胎牛血清(FBS)180mL、D-葡萄糖3.5g、杜尔贝科改良的伊戈尔培养基粉末(英杰公司制造)10g、非必需氨基酸溶液(100倍浓缩液；英杰公司制造)10mL、碳酸氢钠1.9g的溶液]10mL中，将其接种到一个预先接种有上述营养细胞的100mm组织培养用塑料皿(ファルコン公司制造)中。24小时后，将培养基更换为含有200μg/mL的新霉素(西格玛公司制造)的ES培养基。挑取7天后产生的菌落，分别接种到24孔板中。
在使其增殖至达到铺满状态后，将三分之一的细胞接种到12孔明胶包被板中，培养2天，由此，利用Puregene DNA分离试剂盒(GentraSystem公司制造)由106～107个细胞制备基因组DNA。将这些新霉素抗性TT2细胞基因组DNA用EcoRI进行酶消化，并供于琼脂糖凝胶电泳。接着，使用实施例3-2中得到的3’KO-探针来进行DNA印迹。在野生型TT2细胞中，检测到一个条带(约15.5kbp)，在同源重组体中，检测到两个条带(约11.5kbp和约15.5kbp)。
进而，将确认到同源重组的克隆的基因组DNA用NcoI进行酶消化，并供于琼脂糖凝胶电泳。接着，使用实施例3-1中得到的5’KO-探针来进行DNA印记。在野生型TT2细胞中，检测到一个条带(约13.4kbp)，在同源重组体中，检测到两个条带(约8.5kbp和约13.4kbp)。
根据上述结果，发现了7株预测到敲除了小鼠BMP9基因的同源重组体。接着，根据已有的报道(相泽慎一著，バイオマニュアルシリーズ8(生物手册丛书8)，基因靶向，羊土社，1995)进行了同源重组体的核型分析，结果确认，所发现的7株中的5株为具有正常核型的小鼠BMP9基因KO ES细胞。
[实施例5]
BMP9KO杂合子小鼠的制作
实施例4中获得的ES细胞是来源于毛色为深褐色的CBA×C57BL/6F1小鼠(Yagi等,Analytical Biochemistry,214:70-76,1993)的TT2细胞。因此，为了简便地区别具有来源于ES细胞的基因的嵌合小鼠与不具有来源于ES细胞的基因的宿主小鼠，选择毛色为白色的ICR小鼠作为宿主小鼠。
首先，将实施例4中能够确认到具有正常核型的小鼠BMP9基因KO ES细胞中的4株分别以每个胚胎8～10个注射到通过ICR品系的雌雄小鼠的交配得到的8细胞期胚胎中。然后，使用ES培养基培养过夜，由此使注射胚胎发育至囊胚，然后，将发育至囊胚的注射胚胎移植到假孕处理后2.5天的代孕ICR小鼠(日本クレア公司)的子宫中，每侧的子宫分别移植约10个。
总计移植了260个发育至囊胚的注射胚胎，结果出生了102只后代嵌合小鼠。出生的102只中，毛色包含深褐色的小鼠、即观察到ES细胞的贡献的嵌合小鼠为89只。上述89只中，毛色全部为深褐色而不含白色部分的小鼠、即来源于ES细胞的嵌合率高的嵌合小鼠为40只。
接着，使这些嵌合率高的雄性嵌合小鼠与C57BL/6的雌性交配，结果，出生了毛色为深褐色的后代小鼠，由此确认ES细胞基因组转移到生殖细胞系中。
BMP9基因靶向的杂合子小鼠的筛选通过以来源于尾部活检的DNA为模板的PCR分析来进行。为此，制作对实施例1中制作的小鼠BMP9基因敲除用载体pBluemBmp9-Lox-Neo-DT-A-3’KO-5’KO内的新霉素抗性基因区域具有特异性的引物mBMP9_FW5915(序列号13)和mBMP9_RV17165(序列号14)。
从出生后经过3周以上的小鼠获得尾巴(胜木元也著，発生工学実験マニュアル(发育工程实验指南)，講談社サイエンティフィック，1987)，使用Puregene DNA分离试剂盒提取基因组DNA。以该基因组DNA作为模板，制备含有各10pmol的序列号13和14的引物以及EX Taq(宝酒造公司制造)的反应液50μL，以95℃下30秒钟、60℃下1分钟和72℃下2分钟作为1个循环，进行35个循环的PCR。
进行琼脂糖凝胶电泳的结果是，存在多个检测到约1.3kbp的扩增产物的个体。该结果表明，得到了内源性BMP9基因发生了同源重组且插入有新霉素抗性基因的多只杂合子小鼠[BMP9KO(+/-)]。
[实施例6]
BMP9KO纯合子小鼠的制作
使实施例5中制作的BMP9KO(+/-)的雌雄个体交配，得到后代小鼠。与实施例5同样，使用Puregene DNA分离试剂盒，从小鼠的尾巴提取基因组DNA。以该基因组DNA作为模板，与实施例5同样地进行PCR。进而，进行琼脂糖电泳，由此选出BMP9KO杂合子[BMP9KO(+/-)]和纯合子[BMP9KO(-/-)]。
以选出的个体的基因组DNA作为模板，制备含有各10pmol的序列号15和16的引物以及EX Taq(宝酒造公司制造)的反应液50μL，以95℃下30秒钟、60℃下30秒钟和72℃下1分钟作为1个循环，进行35个循环的PCR。进行琼脂糖凝胶电泳的结果表明，存在检测到约200bp的扩增产物的个体和未检测到约200bp的扩增产物的个体。
在具有野生型等位基因的BMP9KO(+/-)中检测到约200bp的扩增产物，但在BMP9KO(-/-)中未检测到约200bp的扩增产物，因此，该结果表明，得到了BMP9KO(-/-)。为了获得抗BMP9单克隆抗体，使用所得到的雌雄纯合子[BMP9KO(-/-)]中的10只雌性小鼠。
[实施例7]
抗人BMP9单克隆抗体的制作
7-1)免疫原的制备
作为免疫原使用的人BMP9重组蛋白根据国际公开第2010/126169号的实施例12记载的方法来制备。
7-2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
使用RIBI佐剂(Corixa公司制造)或Titer Max Gold(Titermax公司制造)作为佐剂，对实施例6中得到的BMP9KO(-/-)小鼠进行实施例7-1中制备的人BMP9重组蛋白的免疫。具体而言，根据RIBI佐剂的附带资料制备人BMP9重组蛋白的悬浮液，然后，以每只施用25μg的人BMP9重组蛋白的方式将该悬浮液施用到KO小鼠的腹腔内。
在使用Titer Max Gold时，也同样根据附带的资料制备人BMP9重组蛋白的悬浮液，然后，以每只施用25μg的人BMP9重组蛋白的方式将该悬浮液施用到KO小鼠的皮下。包括最终加强在内，免疫均共计进行3次。在最终施用3天后摘除脾脏。
将摘除的脾脏在PBS(phosphate-buffered saline，磷酸盐缓冲液)中细细切碎后，通过离心分离(1500rpm、3分钟)回收脾细胞。所得到的脾细胞级分含有红细胞，因此，添加RED血细胞裂解缓冲液(西格玛公司制造)，在冰上进行处理，由此除去红细胞。将所得到的脾细胞用DMEM(杜尔贝科改良的伊戈尔培养基，英杰公司制造)培养基洗涤2次后，供于细胞融合。
7-3)小鼠骨髓瘤细胞的制备
将小鼠骨髓瘤细胞株(Sp2/0，ATCC：CRL1581)在添加有10％胎牛血清的DMEM中进行培养，作为细胞融合的亲本株使用。
7-4)杂交瘤的制作
将实施例7-2中得到的小鼠脾细胞与实施例7-3中得到的骨髓瘤细胞以达到5:1的方式进行混合，并离心分离(1500rpm、3分钟)。对于所得到的沉淀级分(细胞群)，在轻轻摇动的同时缓慢加入1mL聚乙二醇-1500(罗氏诊断公司制造)。接着，在轻轻摇动的同时，在该细胞液中加入5mL DMEM培养基，再添加10mL DMEM培养基。接着，将上述含有该细胞液的试管在37℃下孵育5分钟，并离心分离(1500rpm、3分钟)。
将所得到的沉淀级分(细胞群)使用完全培养基(含有FCS 10V/v％、β-巯基乙醇50μmol/L、胰岛素50μg/mL和IL-610ng/mL的DMEM培养基]进行悬浮，使得脾细胞数达到1×106个/mL，然后，在96孔板中接种各100μL。
在1.5小时后，将含有制造商推荐的终浓度的2倍的HAT培养基添加剂(西格玛公司制造，Cat#H0262-10VL)的完全培养基以各100μL加入到各孔中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。使用含有制造商推荐的终浓度的HAT培养基添加剂的完全培养基以每周3次的频率进行培养基更换，直至孔内的细胞达到适于筛选的细胞数。
7-5)ALK1/BMP9夹心ELISA的构建
使用抗人BMP9小鼠单克隆抗体(安迪生物科技公司制造，克隆号360107，以下记为R&D抗体)和作为人BMP9的I型受体已知的人ALK1胞外域人IgG1Fc段融合蛋白质(hsALK1-Fc)，以下述方式构建ALK1/BMP9夹心ELISA。
首先，在96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNOPLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100μL/孔分注通过将根据国际公开第2010/126169号的实施例1记载的方法制备的hsALK1-Fc用50mmol/L NaHCO3缓冲液(Wako公司制造，Cat#191-01305)制备成0.05μg/mL而得到的溶液，在4℃下静置过夜而使其吸附。
除去固相化液后，以250μL/孔加入SuperBlock(ThermoSCIENTIFIC公司制造，Cat#37535)，在室温下静置1小时来进行封闭，用含有0.1％的吐温-20的PBS(PBS-T)洗涤3次。
接着，将人成熟二聚体BMP9重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#3209-BP)用SuperBlock与PBS-T以1:9的比例混合而成的10％SuperBlock的PBS-T溶液制备成1ng/mL的浓度，将所得物以100μL/孔进行分注，在室温下静置1小时，用PBS-T洗涤4次。
接着，将使用SureLINK显色生物素标记试剂盒(KPL公司制造)进行了生物素标记的R&D抗体用10％SuperBlock的PBS-T溶液制备成30ng/mL，然后以100μL/孔进行分注，在室温下静置1小时。将该板用PBS-T洗涤4次后，以100μL/孔分注用10％SuperBlock的PBS-T溶液稀释500倍的链霉亲和素-聚HRP80(Stereospecific DetectionTechnologies公司制造，Cat#SP80D50)，在室温下静置30分钟～1小时。
将该板用PBS-T洗涤4次，以100μL/孔添加TMB显色液(TMB+底物-色原体，Dako公司制造，Cat#S1599)，使其显色，在得到适当的显色时，以100μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用ARVO(珀金埃尔默公司制造)测定450nm的吸光度。
7-6)使用ALK1/BMP9夹心ELISA的抗人BMP9抗体产生杂交瘤的筛选
实施例7-5中构建的夹心ELISA中，在添加人成熟二聚体BMP9重组蛋白时，以100μL/孔分注以含有浓度为1ng/mL的人成熟二聚体BMP9重组蛋白和浓度为50％的实施例7-4中制作的杂交瘤的培养上清的方式制备的10％SuperBlock的PBS-T溶液。
作为阴性对照，使用杂交瘤用培养基。以添加有杂交瘤用培养基的孔作为基准，将显色得到抑制的孔判断为阳性，挑选出产生抑制hsALK1-Fc与人成熟二聚体BMP9重组蛋白的相互作用或者抑制人成熟二聚体BMP9重组蛋白与R&D抗体的相互作用的抗体的杂交瘤株。
对于挑选出的杂交瘤，利用含有HT(西格玛公司制造，Cat#H0137-10VL)的完全培养基进行有限稀释，接种到96孔板中，进行克隆化。对来源于在第1次被判断为阳性的孔的杂交瘤总计进行3次克隆化。通过以上的操作，分离出产生6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和3B7-3-3抗体的杂交瘤株。
7-7)杂交瘤在eRDF培养基中的驯化
为了获得大量抗体，将杂交瘤的培养基从完全培养基分阶段地置换为eRDF培养基[含有Ultra-Low IgG FBS(GIBCO公司制造)1v/v％、转铁蛋白5μg/mL、胰岛素5μg/mL、乙醇胺10μmol/L和亚硒酸钠25nmol/L的e-RDF培养基(极东制药制造)]，进行杂交瘤细胞在eRDF培养基中的驯化。
7-8)由杂交瘤大量获得抗体
将实施例7-8中驯化后的杂交瘤以1～2×105个细胞/mL的细胞密度接种到100个转瓶(850cm2，BDサイエンス公司制造)中。作为培养基，使用eRDF培养基。在利用转瓶旋转培养机使接种后的转瓶旋转的同时，在37℃下培养6～8天，然后，回收含有细胞的培养基。对回收的培养基进行离心分离，将所得到的培养上清用0.22μm的过滤器进行过滤。
使用填充有Proteing Sepharose 4Fast Flow(通用电气医疗集团制造)的开放柱从使用过滤器过滤后的培养上清中纯化出抗人BMP9抗体。将所得到的抗体使用0.22μm的过滤器进行灭菌，然后供于体内试验。
[实施例8]
利用使用固相抗原的酶联免疫吸附法(ELISA)对获得抗体的特异性进行评价
为了确认获得的抗体对人BMP9的特异性，进行了用于比较获得的抗体与人BMP9的结合性和获得的抗体与作为人BMP9的同源性最高的分子的人BMP10的结合性的实验。首先，在96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#442404)中，以50μL/孔分注通过将人成熟二聚体BMP9重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#3209-BP)或人成熟二聚体BMP10重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#2926-BP)用50mmol/LNaHCO3缓冲液(Wako公司制造，Cat#191-01305)制备成100ng/mL而得到的溶液，在4℃下静置过夜而使其吸附。
除去固相化液后，以200μL/孔加入Super Block(ThermoSCIENTIFIC公司制造，Cat#37535)，在室温下静置1小时来进行封闭，用TBST(含有吐温20的Tris缓冲液；SANTA CRUZ公司制造，SC-24953)洗涤3次。
接着，将使用生物素标记试剂盒-NH2(コスモ·バイオ公司制造，Cat#LK03)进行了生物素标记的6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体、3B7-3-3抗体、R&D抗体或抗BMP10抗体(安迪生物科技公司制造，Cat#MAB2926)用SuperBlock与TBST以1:9的比例混合而成的10％Super Block的TBST溶液制备成100ng/mL后，作为一次抗体以50μL/孔进行分注，在室温下静置1小时。
将该板用TBST洗涤3次后，以100μL/孔分注用10％Super Block的TBST溶液稀释500倍的链霉亲和素-聚HRP80(StereospecificDetection Technologies公司制造，Cat#SP80D50)，在室温下静置1小时。
将该板用TBST洗涤5次，以50μL/孔添加TMB底物液(TMB+底物-色原体，Dako公司制造，Cat#S1599)，使其显色，在得到适当的显色时，以50μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用酶标仪(Spectra Max，分子仪器公司制造)测定样品波长450nm、参比波长570nm下的吸光度(450nm-570nm)。
将结果记载于图2中。如图2所示，6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和3B7-3-3抗体与R&D抗体同样地显示出：与人BMP9强结合，并且不与人BMP10结合。该结果表明，6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和3B7-3-3抗体为与人BMP9特异性结合的抗体。
[实施例9]
获得抗体对人BMP9重组蛋白的结合性的评价
为了测定获得的抗人BMP9抗体对人BMP9的结合活性，进行了下述实验。
首先，在96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNOPLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以50μL/孔分注将人成熟二聚体BMP9重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#3209-BP)用50mmol/L NaHCO3缓冲液制备成100ng/mL而得到的溶液，在4℃下静置过夜而使其吸附。
除去固相化液后，以200μL/孔加入Super Block(ThermoSCIENTIFIC公司制造，Cat#37535)，在室温下静置1小时来进行封闭，用TBST洗涤3次。接着，将生物素标记的6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体、3B7-3-3抗体或R&D抗体用10％Super Block的TBST溶液分别制备成1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、300ng/mL，将所得物以50μL/孔进行分注，在室温下静置1小时。
将该板用TBST洗涤3次后，以100μL/孔分注用10％Super Block的TBST溶液稀释500倍的链霉亲和素-聚HRP80，在室温下静置1小时。
将该板用TBST洗涤5次，以50μL/孔添加TMB底物液(TMB+底物-色原体，Dako公司制造，Cat#S1599)，使其显色，在得到适当的显色时，以50μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用酶标仪(Spectra Max，分子仪器公司制造)测定样品波长450nm、参比波长570nm下的吸光度(450nm-570nm)。
将结果记载于图3中。如图3所示，6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和3B7-3-3抗体与R&D抗体同样地，随着抗体浓度增高而与人BMP9结合。此外，明确了：6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体对人BMP9的结合活性比R&D抗体高。
[实施例10]
获得抗体对人BMP9与R&D抗体的结合的作用
根据实施例7中使用的体系的特征，认为获得抗体为抑制hsALK1-Fc与人成熟二聚体BMP9重组蛋白的相互作用、或者人成熟二聚体BMP9重组蛋白与R&D抗体的相互作用中的任意一种相互作用的抗体。因此，首先，构建了人BMP9与R&D抗体的结合分析体系。
在96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100μL/孔分注将实施例7-1中制备的人BMP9重组蛋白用50mmol/L NaHCO3缓冲液制备成100ng/mL而得到的溶液，在室温下静置1小时而使其吸附。除去固相化液后，以250μL/孔加入Super Block，在室温下静置1小时来进行封闭，用TBST洗涤3次。
接着，以100μL/孔分注含有用10％Super Block的PBS-T溶液分别制备成100～3000ng/mL的获得抗体和50ng/mL的生物素标记的R&D抗体的溶液，在室温下静置1小时。将该板用PBS-T洗涤4次后，以100μL/孔分注用10％Super Block的PBS-T溶液稀释500倍的链霉亲和素-聚HRP80(Stereospecific Detection Technologies公司制造，Cat#SP80D50)，在室温下静置30分钟～1小时。
将该板用PBS-T洗涤4次，以100μL/孔添加TMB显色液(TMB+底物-色原体，Dako公司制造，Cat#S1599)，使其显色，在得到适当的显色时，以100μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用ARVO(珀金埃尔默公司制造)测定450nm的吸光度。将结果记载于图4中。
如图4所示，人BMP9与生物素标记的R&D抗体的结合在添加未标记的R&D抗体时受到抑制，在添加10D5-2-3抗体或6D10-1-1抗体时也受到抑制。另一方面，在3B7-3-3抗体的情况下，未观察到抑制。
该结果暗示了：10D5-2-3抗体和6D10-1-1抗体对人BMP9的识别部位(表位)与R&D抗体的识别部位相同或者在其附近，3B7-3-3抗体对人BMP9的识别部位(表位)与R&D抗体的识别部位不同。
另外，与R&D抗体相比，从更低的浓度开始观察到抑制活性，由此明确，10D5-2-3抗体和6D10-1-1抗体对人BMP9的结合活性(亲和性)比R&D抗体高。
[实施例11]
获得抗体对人BMP9与人ALK1的结合的作用
接着，构建了人BMP9与人ALK1的结合分析体系。
在96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100μL/孔分注通过将实施例7-1中制备的人BMP9重组蛋白用50mmol/L NaHCO3缓冲液稀释成100ng/mL而得到的溶液，在室温下静置1小时而使其吸附。
将固相化液除去后，以250μL/孔加入Super Block，在室温下静置1小时来进行封闭，用PBS-T洗涤3次。接着，以100μL/孔分注含有用10％Super Block的PBS-T分别制备成100ng/mL、1000ng/mL或10000ng/mL的获得抗体或R&D抗体、和100ng/mL的进行了生物素标记的hsALK1-Fc蛋白质的溶液，在室温下静置1小时。
将该板用PBS-T洗涤4次后，以100μL/孔分注用10％Super Block的PBS-T稀释500倍而得到的链霉亲和素-聚HRP80(StereospecificDetection Technologies公司制造，Cat#SP80D50)，在室温下静置30分钟～1小时。
将该板用PBS-T洗涤4次，以100μL/孔添加TMB显色液(TMB+Substrate-Chromogen、Dako公司制造，Cat#S 1599)，使其显色，在得到适当的显色时以100μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用ARVO(パーキンエルマー公司制造)测定450nm的吸光度。
浓度为100ng/mL、1000ng/mL或10000ng/mL的3B7-3-3抗体将人BMP9与人ALK1的结合分别抑制为10.3％、29.2％、64％，与此相对，即使添加最高用量的浓度为10000ng/mL的6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和R&D抗体，也没有抑制人BMP9与人ALK1的结合。
由以上的结果明确，3B7-3-3抗体为抑制人BMP9与人ALK1的结合的抗BMP9抗体，与此相对，6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和R&D抗体为不抑制人BMP9与人ALK1的结合的抗BMP9抗体。
[实施例12]
获得抗体对人BMP9与人BMPRII的结合的作用
已知BMP9的受体由BMPI型受体和BMPII型受体构成，BMP9与这两种类型的受体结合。由实施例11明确，10D5-2-3抗体、6D10-1-1抗体和R&D抗体不抑制人BMP9与人ALK1的结合，暗示这些抗体不抑制BMP9与BMPI型受体的结合。
接着，为了研究这些抗体是否抑制BMP9与BMPII型受体的结合，构建人BMP9与作为人BMP9II型受体之一而已知的人BMPRII的结合分析体系。
在96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#439454)中，以100μL/孔分注通过将实施例7-1中制备的人BMP9重组蛋白用3μg/mL而得到的溶液，在室温下静置1小时而使其吸附。将固相化液除去后，以260μL/孔加入Super Block，在室温下静置1小时来进行封闭，用TBST洗涤4次。
接着，以100μL/孔分注含有用10％Super Block的TBST制备成1000ng/mL的获得抗体、R&D抗体或阴性对照小鼠IgG1单克隆抗体(DAKO公司制造，X0931)和制备成3μg/mL的BMPRII-Fc(人BMPRII的胞外域与人IgG1Fc区域的融合重组蛋白、安迪生物科技公司制造)的10％Super Block的TBST溶液，在室温下静置1小时。
将该板用TBST洗涤4次后，以100μL/孔分注用10％SuperBlock的TBST稀释20000倍而得到的山羊抗人IgG HRP(Thermo Scientific公司制造)，在室温下静置30分钟～1小时。
将该板用TBST洗涤4次，以100μL/孔添加TMB显色液(TMB+底物-色原体，Dako公司制造，Cat#S1599)，使其显色，在得到适当的显色时以100μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用Multiskan Ascent(Thermo Labsystems公司制造)测定450nm的吸光度。将结果示于图5。
如图5所示，人BMP9与人BMPRII的结合被6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和R&D抗体抑制，由此明确，这些抗体为抑制BMP9与BMPRII受体的结合的抗人BMP9抗体。
[实施例13]
获得抗体对人BMP9重组蛋白的结合活性(biacore分析)
使用BIAcore 2000(通用电气医疗集团制造)对获得抗体对人BMP9重组蛋白的结合活性(亲和性)进行研究。使用小鼠抗体捕获试剂盒(通用电气医疗集团制造)，将抗小鼠IgG抗体固定到传感芯片CM5上，然后，使抗人BMP9抗体以使RU值为700-1100的方式进行结合。
然后，将实施例7-1中制备的人BMP9重组蛋白用HBS-EP溶液(通用电气医疗集团制造)制备成0.152nmol/L、0.457nmol/L、1.37nmol/L、4.1nmol/L、12.3nmol/L、36.89nmol/L、110.67nmol/L、322nmol/L的浓度，将所得物作为分析物进行添加，测定结合强度。
基于所得到的值，利用单周期动力学计算法(BIA评价软件第三版，通用电气医疗集团制造)算出结合解离常数(Kd值)。将结果示于表1中。
[表1]
如表1所示可知，R&D抗体的Kd值为6.16×10-10mol/L，与此相对，6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体的Kd值分别显示出2.97×10-11mol/L、9.69×10-12mol/L，6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体对人BMP9的结合活性与R&D抗体相比显著高，为20.7倍、63.6倍。另外，以上的结果与实施例9和10的结果并不矛盾。
[实施例14]
获得抗体对正常Balb/c小鼠的红细胞造血的作用(短期施用)
如实施例9所明确的那样，6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体为与人BMP9成熟二聚体结合的抗体。序列号67表示的、人BMP9的成熟区110个氨基酸中，小鼠BMP9有106个氨基酸完全一致，大鼠BMP9有104个氨基酸完全一致，因此可知，BMP9在种族间的保守性非常高。因此推测，这些抗体以与人BMP9结合同样的方式与啮齿类的BMP9结合。
因此，使用BALB/c小鼠来评价6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体对红细胞造血的作用。购入6周龄的雄性BALB/c小鼠(日本チャールズリバー公司制造)，并供于实验。关于饮水，通过自由摄取来提供灭菌自来水，关于饮食，通过自由摄取来提供固体饲料FR-2(フナバシファーム公司制造)。
在预饲养后，以体重作为指标，分为7组(各组n＝6)，以达到1mg/kg、3mg/kg的施用量的方式皮下施用6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和R&D抗体。具体而言，将各抗体用生理盐水制备成0.1mg/mL或0.3mg/mL，将所得物以10mL/kg的用量进行施用。对于介质组，以10mL/kg的用量皮下施用生理盐水。
以每周1次的频率施用共计2次抗体或介质。从初次施用起2周后，在异氟烷麻醉下剖腹，然后，从后大静脉进行采血，添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品。
对于所得到的血液样品，使用全自动血细胞计数器Celltacα(日本光电公司制造)，测定血细胞数和血红素浓度。将结果示于图6A和图6B。
如图6A和图6B所示发现，红细胞数和血红素浓度随着任意一种抗人BMP9抗体的施用而增加，抗人BMP9抗体具有红细胞造血作用。R&D抗体在施用量为1mg/kg和3mg/kg时均显示出大致同等程度的红细胞数和血红素浓度的增加，因此可知，R&D抗体的最大活性为施用量1mg/kg以下。另外，显示最大活性的施用量1mg/kg时的血红素浓度的增加为约0.7g/dL。
另一方面，6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体显示出R&D抗体的约2倍的最大活性，特别是，观察到血红素浓度增加约1.5g/dL-约2g/dL。由以上的结果表明，6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体为不仅对BMP9的结合活性超过R&D抗体、而且红细胞造血作用也超过R&D抗体的抗体。
[实施例15]
获得抗体对正常BALB/c小鼠红细胞造血的作用(长期施用)
使用BALB/c小鼠来研究6D10-1-1体和10D5-2-3抗体对红细胞造血的长期施用的效果。购入6周龄的雄性BALB/c小鼠(日本チャールズリバー公司制造)，并供于实验。关于饮水，通过自由摄取来提供灭菌自来水，关于饮食，通过自由摄取来提供固体饲料FR-2(フナバシファーム公司制造)。
在预饲养后，以体重作为指标，分为3组(各组n＝8)，转变为自由摄取高脂肪食物(HFD-32；日本クレア公司制造)。接着，以达到1mg/kg的施用量的方式皮下施用6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体。具体而言，将各抗体用生理盐水制备成0.1mg/mL，将所得物以10mL/kg的用量进行施用。对于介质组，以10mL/kg的用量皮下施用生理盐水。
以每周1次的频率施用共计8次抗体或介质。从初次施用起8周后，在异氟烷麻醉下剖腹，然后，从后大静脉进行采血，将一部分添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品，将剩余部分作为血清样品。
对于所得到的血液样品，使用全自动血细胞计数器Celltacα(日本光电公司制造)，测定血细胞数和血红素浓度。将结果示于图7A和图7B。
如图7A和图7B所示可以确认，红细胞数和血红素浓度随着6D10-1-1抗体或10D5-2-3抗体的施用而显著增加，对于6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体而言，不仅通过短期施用显示出红细胞造血作用，通过长期施用(2个月施用)也显示出持续的红细胞造血作用。另外，在任意一种抗体中均未观察到对体重的影响。
接着，为了确认抗人BMP9抗体的红细胞造血作用是否由红细胞增加因子即血中促红细胞生成素(EPO)介导，使用所得到的血清样品来测定血中EPO浓度。测定使用Quantikine小鼠/大鼠促红细胞生成素ELISA试剂盒(安迪生物科技公司制造)。将结果示于图8。
如图8所示，血中EPO浓度仅有随着抗人BMP9抗体施用而减少的倾向，未观察到显著变化。因此，显示出抗人BMP9抗体的红细胞造血作用不通过EPO产生升高来介导的可能性。
[实施例16]
抗人BMP9抗体对各种小鼠系统的红细胞造血的作用
使用BALB/c以外的系统的小鼠来研究10D5-2-3抗体对红细胞造血的作用。作为BALB/c以外的系统，使用CBA/J和ICR小鼠。均购入7周龄的雄性小鼠(日本チャールズリバー公司制造)，并供于实验。关于饮水，通过自由摄取来提供灭菌自来水，关于饮食，通过自由摄取来提供固体饲料FR-2(フナバシファーム公司制造)。
在预饲养后，以体重作为指标，分为2组(各组n＝6)，以达到1mg/kg的施用量的方式皮下施用10D5-2-3抗体。具体而言，将用生理盐水制备成0.1mg/mL的10D5-2-3抗体以10mL/kg的用量进行施用。对于介质组，以10mL/kg的用量皮下施用生理盐水。
以每周1次的频率施用共计2次抗体或介质。从初次施用起14天后，在异氟烷麻醉下剖腹，然后，从后大静脉进行采血，将一部分添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品，将剩余部分作为血清样品。
对于所得到的血液样品，使用全自动血细胞计数器Celltacα(日本光电公司制造)，测定血细胞数和血红素浓度。结果，对于红细胞数(×104/μL)而言，在BALB/c、CBA/J和ICR中，介质组分别为958±8.0、789±25.3和717±22.9(平均值±标准误差)，与此相对，10D5-2-3抗体施用组分别为1028±18.1、853±8.1和777±13.2(平均值±标准误差)，通过施用10D5-2-3抗体，分别增加了70、64和60。
另外，对于血红素浓度(g/dL)而言，在BALB/c、CBA/J和ICR中，介质组分别为15.4±0.16、12.9±0.13和13.1±0.50(平均值±标准误差)，与此相对，10D5-2-3抗体施用组分别为16.6±0.26、13.6±0.13和13.7±0.25(平均值±标准误差)，通过施用10D5-2-3抗体，分别增加了1.2、0.7和0.6。
在任意一种系统中均观察到10D5-2-3抗体的红细胞造血作用，由此暗示，抗人BMP9抗体的红细胞造血作用为超越了系统的作用。
接着，为了确认10D5-2-3抗体的红细胞造血作用是否由EPO增加介导，使用所得到的血清样品来测定血中EPO浓度。测定使用Quantikine小鼠/大鼠促红细胞生成素ELISA试剂盒(安迪生物科技公司制造)。
对于血中EPO浓度(pg/mL)而言，在BALB/c、CBA/J和ICR中，介质组分别为88.5±8.7、181.2±28.5和291.5±106.4(平均值±标准误差)，与此相对，10D5-2-3抗体施用组分别为77.6±5.7、126.1±20.1和236.2±46.1(平均值±标准误差)，通过施用10D5-2-3抗体，分别减少了10.9、55.1和55.3。
由此，与实施例15同样地暗示了：10D5-2-3抗体的红细胞造血作用不通过EPO产生升高来介导。
[实施例17]
获得抗体对正常大鼠的红细胞造血的作用
使用Wistar大鼠来评价6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体对大鼠的红细胞造血的作用。购入5周龄的雄性Wistar大鼠(日本クレア公司制造)，并供于实验。关于饮水，通过自由摄取来提供灭菌自来水，关于饮食，通过自由摄取来提供固体饲料FR-2(フナバシファーム公司制造)。
在预饲养后，以体重作为指标，分为4组(各组n＝6)，以达到1mg/kg的施用量的方式皮下施用6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和R&D抗体。具体而言，将各抗体用生理盐水制备成0.5mg/mL，将所得物以2mL/kg的用量进行施用。对于介质组，以2mL/kg的用量皮下施用生理盐水。
以每周1次的频率施用共计2次抗体或介质。从初次施用起2周后，在异氟烷麻醉下剖腹，然后，从腹大动脉进行采血，将一部分添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品，将剩余部分作为血清样品。
对于所得到的血液样品，使用全自动血细胞计数器Celltacα(日本光电公司制造)，测定血细胞数和血红素浓度。将结果示于图9A和图9B。
如图9A和图9B所示可知，红细胞数和血红素浓度随着任意一种抗人BMP9抗体的施用而增加，不仅在小鼠中观察到抗人BMP9抗体的红细胞造血作用，在大鼠中也观察到抗人BMP9抗体的红细胞造血作用。另外，与小鼠同样地，在大鼠中也观察到6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体的红细胞造血作用比R&D抗体强的倾向。
[实施例18]
抗人BMP9抗体对肾衰竭大鼠的贫血的作用
使用对Wistar大鼠实施5/6肾切除手术而得到的肾衰竭大鼠来研究6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体对肾性贫血的作用。购入5周龄的雄性Wistar大鼠(日本クレア公司制造)，并供于实验。关于饮水，通过自由摄取来提供灭菌自来水，关于饮食，通过自由摄取来提供固体饲料FR-2(フナバシファーム公司制造)。
在预饲养后，首先，在戊巴比妥麻醉下剖开左侧背部，露出左肾脏，切除肾脏的2/3。在确认不从肾切除部出血后，将剖开部缝合。1周后，将该大鼠在戊巴比妥麻醉下剖开右侧背部，将右肾脏结扎后，摘除右肾脏，由此制作5/6肾切除大鼠。对于作为正常对照组设定的假手术大鼠，仅实施背部剖开、缝合手术。
在5/6肾切除大鼠制作2周后，在非麻醉下从各大鼠的尾静脉采血し，将一部分添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品，将剩余部分作为血清样品。
对于所得到的血液样品，使用全自动血细胞计数器Celltacα(日本光电公司制造)，测定血细胞数和血红素浓度。
接着，对于所得到的血清样品，使用日立自动分析装置7170(日立公司制造)，测定尿素氮(BUN)浓度和肌酸酐浓度。
基于所得到的红细胞值、血红素浓度、BUN浓度、肌酸酐浓度，以使各组的平均值尽量达到均等的方式分为3组(各组n＝8)，以达到1mg/kg的施用量的方式皮下施用6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体。
具体而言，将各抗体用生理盐水制备成0.5mg/mL，将所得物以2mL/kg的用量进行施用。对于介质组，以2mL/kg的用量施用生理盐水。此外，对于作为正常对照的介质施用假手术大鼠组(n＝5)，以2mL/kg的用量施用生理盐水。
以每周1次的频率施用抗体或介质。从初次施用起2周、4周、6周和8周后从尾静脉进行采血，将一部分添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品，将剩余部分作为血清样品。
对于所得到的血液样品，使用全自动血细胞计数器Celltacα(日本光电公司制造)，测定血细胞数和血红素浓度。将结果示于图10A和图10B。另外，各种抗体施用组相对于5/6肾切除大鼠介质施用组的测定值的统计学显著性检验使用学生t检验来进行分析，以P＜0.05作为显著。
如图10A和图10B所示，介质施用5/6肾切除组的红细胞数和血红素浓度与介质施用假手术大鼠组相比，在从0周起至8周为止的全部实验期间都减少。另一方面，施用了6D10-1-1抗体或10D5-2-3抗体的5/6肾切除组的红细胞数和血红素浓度在从抗体施用后2周以后至8周为止，除610D-1-1抗体的抗体施用后6周的样品以外，与介质施用5/6肾切除组相比均显著增加。另外，任意一种抗体对体重均没有影响。
由该结果可知，6D10-1-1抗体和10D5-2-3抗体具有改善肾性贫血的作用。
[实施例19]
编码抗人BMP9单克隆抗体的VH和VL的基因序列的分离
19-1)从抗人BMP9产生单克隆抗体的杂交瘤细胞制备总RNA
使用RNAeasy小量试剂盒(QIAGEN公司制造，Cat#74104)和QIA磨碎机(QIAGEN公司制造，Cat#79654)，从实施例7记载的产生6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和3B7-3-3抗体的杂交瘤1×106个中制备总RNA。
19-2)抗人BMP9单克隆抗体的VH和VL的基因克隆
使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制造，Cat#634924)，从实施例19-1中获得的各杂交瘤的总RNA 1μg制作cDNA。以所得到的cDNA作为模板，组合使用试剂盒附带的通用引物A mix(含有正向引物)与编码小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c重链恒定区的特异性不同的两种反向引物，由此确定VH的cDNA序列。
具体而言，使用小鼠IgG1特异性引物(序列号17和18)、小鼠IgG2a特异性引物(序列号19和20)、小鼠IgG2b特异性引物(序列号21和22)、小鼠IgG2c特异性引物(序列号23)或小鼠IgG3特异性引物(序列号24和25)，分别与通用引物A组合，由此进行PCR反应，扩增出各抗体的VH的cDNA片段。
另外，同样地使用小鼠Ig(κ)特异性引物(序列号26和27)或小鼠Ig(λ)特异性引物(序列号28和29)，分别与通用引物A组合，由此进行PCR反应，扩增出各抗体的VL的cDNA片段。
PCR如下：将由94℃下30秒钟、72℃下3分钟构成的反应循环进行5次，将由94℃下30秒钟、70℃下30秒钟、72℃下3分钟构成的反应循环进行5次，将由94℃下30秒钟、68℃下30秒钟、72℃下3分钟构成的反应循环进行25次。
进行琼脂糖凝胶电泳的结果是，6D10-1-1抗体、10D5-2-3产生和3B7-3-3抗体杂交瘤来源的cDNA在使用编码IgG1重链恒定区的特异性引物时得到了PCR扩增产物。
另外，两杂交瘤来源的cDNA在使用小鼠Ig(κ)特异性引物时也得到了PCR扩增产物。将各自的PCR扩增产物使用凝胶提取试剂盒(QIAEX II，QIAGEN公司制造，Cat#20021)来进行纯化。
使用测序用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司制造，Cat#K287540SP)将所得到的基因片段插入到pCR4载体(英杰公司制造)中。
将所得到的质粒导入到大肠杆菌DH5α株中。使用自动质粒提取机(クラボウ公司制造)从所得到的转化体中提取出质粒，并分析碱基序列。结果确认，获得了在cDNA的5’末端存在被推测为起始密码子的ATG序列的全长VH cDNA和VL cDNA。
19-3)抗人BMP9单克隆抗体V区的基因序列的分析
将实施例19-2中得到的6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体、3B7-3-3抗体的VH的全长碱基序列分别示于序列号30、31、32，将由该序列推测出的包含信号序列的VH的全长氨基酸序列分别示于序列号33、34、35，将VL的全长碱基序列分别示于序列号36、37、38，将由该序列推测出的包含信号序列的VL的全长氨基酸序列分别示于序列号39、40、41。
另外，将从序列号30、31、32中除去信号序列而得到的碱基序列分别示于序列号42、43、44，将从序列号36、37、38中除去信号序列而得到的碱基序列分别示于序列号45、46、47，将从序列号33、34、35中除去信号序列而得到的氨基酸序列分别示于序列号48、49、50，将从序列号39、40、41中除去信号序列而得到的氨基酸序列分别示于序列号51、52、53。
由与已知的小鼠抗体的序列数据[SEQUENCES of Proteins ofImmunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]的比较可以确认，分离出的各cDNA是编码包含分泌信号序列6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体、3B7-3-3抗体的全长cDNA。
通过与已知抗体的氨基酸序列进行比较，鉴定出各单克隆抗体的VH和VL的CDR。将6D10-1-1抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号54、55和56，将VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号57、58和59。
将10D5-2-3抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号60、61和62，将VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号63、64和65。
[实施例20]
获得抗体的表位分析
20-1)获得抗体的重组表达
使6D10-1-1、10D5-2-3抗体的轻链、重链可变区(包含信号序列)的碱基序列分别与小鼠轻链(κ链)、重链(IgG1)恒定区的碱基序列结合，并亚克隆到抗体表达用载体中。在BMP9抗体的可变区部分的碱基序列的扩增中，以实施例19中制作的质粒作为模板，使用分别包含序列号72～79表示的碱基序列的引物来进行PCR。
小鼠轻链(κ链)、重链(IgG1)恒定区部分的碱基序列的扩增中，以分别由人工基因合成(タカラバイオ公司)制作的、序列号80、81表示的碱基序列作为模板，使用序列号82～85表示的引物来进行PCR。
在任意一种PCR中，均使用PrimeSTAR HS(Premix)(タカラバイオ公司制造，R040A)，在96℃下保温2分钟后，以98℃下10秒钟、55℃下5秒钟和72℃下1～2分钟(根据扩增物的大小来进行调节)作为1个循环，进行30个循环反应。将所得到的PCR扩增片段供于琼脂糖凝胶电泳，然后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)进行纯化，得到插入物。
使用BglII、EcoRI对N5KG1载体(Biogen IDEC公司)进行酶处理，通过与上述相同的步骤进行纯化，得到插入物插入用载体。
使用In-fusion Advantage PCR克隆试剂盒(タカラバイオ公司制造)，将6D10-1-1抗体的轻链可变区和小鼠轻链恒定区的插入物重组到进行了酶处理的N5KG1载体中，并导入到大肠杆菌中。
从所得到的转化体中挑选出插入有正确序列的克隆。将该质粒DNA用SalI、BamHI进行酶消化，通过与上述相同的步骤进行纯化。将6D10-1-1抗体的重链可变区和小鼠重链恒定区的插入物重组到已插入有轻链的上述载体中，并导入到大肠杆菌中。
从所得到的转化体中挑选出插入有正确序列的克隆。通过与所得到的6D10-1-1抗体表达载体同样的步骤，也制作10D5-2-3抗体的表达载体。轻链可变区插入到限制性酶BglII、BsiWI切断位点之间，重链可变区插入到限制性酶SalI、NheI切断位点之间。
使用制作的6D10-1-1抗体或10D5-2-3抗体表达载体来转化大肠杆菌，利用NucleoBond Xtra Maxi(タカラバイオ公司制造)制备载体。使用FreeStyle 293表达系统(ライフテクノロジーズ公司制造)进行瞬时表达，使重组抗体进行表达。通过离心分离和使用0.22μm的过滤器的过滤，从培养液中获得培养上清。
接着，通过使用Proteing Sepharose 4Fast Flow(GE医疗集团制造)的亲和层析对抗体进行纯化。使用NAP-25柱(GE医疗集团制造)，将缓冲液置换为柠檬酸缓冲液(10mM柠檬酸-NaOH(pH 6.0)、150mMNaCl)。测定280nm的吸光度来确定浓度。使用1.4mL/(mg·cm)作为分子吸光系数。
20-2)人BMP9/BMP10嵌合蛋白质的制作
将人BMP9成熟区中序列号86表示的氨基酸序列定义为人BMP9区域C，将人BMP10成熟区中序列号139表示的氨基酸序列定义为人BMP10区域C。
与人BMP9的同源性最高的分子为人BMP10，但获得的6D10-1-1抗体、10D5-2-3抗体和R&D抗体对BMP10不具有交叉性。人BMP9区域C中含有的氨基酸残基中与人BMP10区域C不同的是序列号67表示的人BMP9成熟区中的第80位的Ser、第84位的Val、第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met、第93位的Pro、第95位的Leu、第97位的Tyr、第98位的His、第103位的Ser、第105位的Ala。
基于该区域C的差异，将BMP9的氨基酸残基取代成对应的BMP10的氨基酸残基，由此设计人BMP9/10的嵌合蛋白质1～5。
嵌合蛋白质1是将人BMP9中成熟区的第87位、第89位和第93位的氨基酸残基分别取代成Leu、Lys、Val并且使第90位的氨基酸残基缺失而得到的蛋白质。嵌合蛋白质2是将人BMP9中成熟区的第84位、第95位、第97位和第98位的氨基酸残基分别取代成Ile、Tyr、Phe和Lys而得到的蛋白质。
嵌合蛋白质3是将人BMP9中成熟区的第80位、第103位和第105位的氨基酸残基分别取代成Glu、Ala和Ser而得到的蛋白质。嵌合蛋白质4是将人BMP9中成熟区的第84位、第87位、第89位、第93位、第95位、第97位和第98位的氨基酸残基分别取代成Ile、Leu、Lys、Val、Tyr、Phe和Lys并且使第90位的氨基酸残基缺失而得到的蛋白质。
嵌合蛋白质5是将人BMP9中成熟区的第80位、第84位、第95位、第97位、第98位、第103位和第105位的氨基酸残基分别取代成Glu、Ile、Tyr、Phe、Lys、Ala和Ser而得到的蛋白质。将嵌合蛋白质1～5中的、与人BMP9区域C和人BMP10区域C相当的氨基酸序列示于序列号78～91。
将国际公开第2010/126169号的实施例12和图7记载的N末端His型hBMP9complex重组体表达载体(以下记作pLN1V5_人BMP9载体)用StuI和XhoI进行酶处理，并供于琼脂糖凝胶电泳，然后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)进行纯化。
人BMP9/10区域C的嵌合蛋白质1～5如下制作：将序列号92～101所示的嵌合蛋白质制作用引物的各Fwd、Rv以1/6、2/7、3/8、4/9、5/10的组合混合并杂交，将所得物使用In-fusion HD克隆试剂盒(タカラバイオ公司制造，Z9649N)插入到纯化后的载体中，从而制作嵌合蛋白质1～5。
另外，pLN1V5_人BMP10载体通过下述步骤来制作。将pLN1V5_人BMP9载体用NheI和XhoI进行酶处理，并供于琼脂糖凝胶电泳，然后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制造)进行纯化。
以人心脏PCR-Ready cDNA(Ambion公司，3326)作为模板，以序列号102～105所示的Fwd-1/Rv-1、Fwd-2/Rv-2的引物的组合来进行PCR。
关于PCR，使用PrimeSTAR HS(Premix)(タカラバイオ公司制造，R040A)，在96℃下保温2分钟后，以98℃下10秒钟、55℃下5秒钟和72℃下2分钟作为1个循环，进行32个循环反应。
将所得到的两个PCR扩增片段供于琼脂糖凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制造)进行纯化，得到插入物。使用In-fusion HD克隆试剂盒，将插入物插入到事先进行了纯化的pLN1V5载体中进行亚克隆，得到pLN1V5_人BMP10载体。
序列号106～109示出了人BMP10及其成熟区的氨基酸序列和碱基序列。序列号110、111示出了由pLN1V5_人BMP10载体表达的、N末端赋予了His标签的BMP10的氨基酸序列和碱基序列。
使用前项中制作的pLN1V5_人BMP10载体和pLN1V5_人BMP9载体来转化大肠杆菌，利用NucleoBond Xtra Maxi(タカラバイオ公司制造)制备载体。
使用FreeStyle 293表达系统(ライフテクノロジーズ公司制造)进行瞬时表达，使人BMP9、人BMP10和人BMP9/10区域C的嵌合蛋白质1～5进行表达。
通过离心分离和使用0.22μm的过滤器的过滤，从培养液中获得培养上清。接着，使用Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN公司制造)对各蛋白质进行纯化。作为结合缓冲液，使用20mM HEPES-NaOH(pH 7.4)、500mMNaCl 40mM咪唑，作为洗脱缓冲液，使用20mM HEPES-NaOH(pH 7.4)、500mM NaCl 200mM咪唑。使用NAP-25柱(GE医疗集团制造，17-0852-02)，将缓冲液置换为PBS。
测定280nm的吸光度来确定各蛋白质溶液的浓度。作为分子吸光系数，人BMP9、人BMP10分别使用1.05、0.96mL/(mg·cm)，嵌合1～5使用1.055mL/(mg·cm)。
20-3)获得抗体对嵌合蛋白质的特异结合性
使用嵌合蛋白质来进行获得抗体的固相抗原ELISA。将实施例20-2中制备的人BMP9、BMP10、BMP9/10嵌合重组蛋白用50mmol/LNaHCO3缓冲液制备成3μg/mL，以50μL/孔加入到96孔的ELISA用板(F96MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE，Thermo Fisher Scientific公司制造，Cat#442404)中，在4℃下静置过夜而使其吸附。
将固相化液除去后，以200μL/孔加入1％BSA-PBS，在室温下静置1小时来进行封闭，用PBST洗涤5次。接着，以50μL/孔加入用1％BSA-PBS制备成1000ng/mL的获得抗体(实施例20-1中制作的获得抗体)、R&D抗体、BMP10抗体(R&D公司制造，MAB2926)、BMP9山羊多克隆抗体(R&D公司制造，AF3209)、阴性对照小鼠IgG1、IgG2b单克隆抗体(MAB002、MAB004(均为R&D公司制造))，在室温下静置1小时。
将该板用PBST洗涤5次后，以50μL/孔加入用1％BSA-PBS稀释2000倍而得到的山羊抗小鼠IgG HRP(DAKO公司制造，P0447)或大鼠抗山羊IgG HRP(DAKO公司制造，P0160)，在室温下静置1小时。
将该板用PBST洗涤10次，以50μL/孔添加TMB显色液(TMB+底物-色原体，Dako公司制造，Cat#S1599)，使其显色，在得到充分的显色时以50μL/孔添加1N硫酸溶液(Wako公司制造，Cat#192-04755)，使用Multiskan Spectrum(Thermo Labsystems公司制造)测定450nm、570nm的吸光度。
将结果示于表2中。关于表内的+和-，将吸光度的值为1以上的情况记作+，将吸光度的值小于1的情况记作-。
[表2]
如表2所示，对于为了确认固相化有适当量抗原而使用的BMP9山羊多克隆抗体，对人BMP9和嵌合1～5中的任意一种蛋白质均显示出结合，确认到在板上能够固相化足够的抗原。
另一方面可知，6D10-1-1抗体和R&D抗体与嵌合蛋白质1、嵌合蛋白质3特异性地结合，与此相对，10D5-2-3抗体与嵌合蛋白质2、嵌合蛋白质3、嵌合蛋白质5特异性地结合。
这些结果表明，6D10-1-1抗体和R&D抗体与人BMP9成熟区的至少第84位的Val、第95位的Leu、第97位的Tyr、第98位的His结合，10D5-2-3抗体与人BMP9成熟区的至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met、第93位的Pro结合。由此可知，至少10D5-2-3抗体为识别与现有R&D抗体不同的BMP9的表位的抗体。
[实施例21]
BMP9和获得复合物的BMP10信号抑制作用
由实施例11、12的结果判明，10D5-2-3抗体、6D10-1-1抗体均为不抑制人BMP9与人ALK1的结合、特异性地抑制人BMP9与人BMPRII的结合的抗体。
另外，由实施例20的结果可知，10D5-2-3抗体、6D10-1-1抗体的BMP9表位不同。作为ALK1受体的配体，除了BMP9以外，还已知BMP10。假设如下的可能性：结合有6D10-1-1抗体或10D5-2-3抗体的BMP9与ALK1结合，由此抑制BMP10与ALK1的结合，使由BMP10产生的ALK1信号减弱。
为了验证该可能性，制作人ALK1表达报告细胞株，评价BMP9和获得抗体复合物对人BMP10依赖性人ALK1来源的信号的抑制作用。另外，同时对两者的识别表位的差异所引起的抗体间的作用的差异也进行了验证。
21-1)人ALK1表达报告细胞株的制作
关于人ALK1表达报告细胞，通过使国际公开第2010/126169号的实施例2记载的BMP信号检测株[p(GCCG)12-Luc/HepG2(38.5)]强制表达全长人ALK1基因来制作[ALK1/p(GCCG)12-Luc/HepG2(38.5)]。
人ALK1表达载体如下制作：将两端具有EcoRI和NotI限制性酶切位点的人ALK1的全长cDNA用EcoRI和NotI进行消化，将所得物重组到pEAK8表达载体(Edgebiosystems公司制造)中，由此制作ALK1表达载体。人ALK1的全长cDNA(cDNA的Genbank登记号：BC042637.1、序列号112，氨基酸序列的GenBank登记号：AAH42637、序列号71)通过使用人肺cDNA文库和引物(序列号113、114)的PCR来制作。
21-2)由人BMP9和获得抗体构成的复合物对BMP10依赖性ALK1来源的信号的作用
将通过上述方法制作出的人ALK1报告细胞株[ALK1/p(GCCG)12-Luc/HepG2(38.5)]悬浮到含有1μg/mL的hsALK1-Fc的DMEM增殖培养基[以达到10％的方式添加有FCS的DMEM(Invitrogen公司制造)]中，以达到1.5×104个/孔的方式接种到96孔白色板(パーキンエルマー公司制造)中。
第二天，将孔内用不含有200μL的血清的DMEM进行洗涤，然后，添加各100μL的含有2ng/mL或10ng/mL的人成熟二聚体BMP9重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#3209-BP)和3μg/mL的6D10-1-1抗体或10D5-2-3抗体的含有0.1％BSA(牛血清白蛋白)的DMEM培养基。
在之后30分钟后，以使终浓度为0.1ng/mL、0.3ng/mL、1.0ng/mL、3.0ng/mL、10ng/mL的方式，添加各5μL的使用0.1％BSA(牛血清白蛋白)制备得到的人成熟二聚体BMP10重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#2926-BP-0255)，培养6小时。6小时后，添加50μL化学发光试剂[Steadyglo Luciferase assay system(稳定荧光素酶检测系统)，普洛麦格公司制造]，测定荧光素酶活性。阴性对照孔中添加有含有0.1％BSA的DMEM培养基。将结果示于图11。
如图11所示可知，人BMP9与6D10-1-1抗体的复合物对BMP10依赖性ALK1来源的信号显示抑制作用，与此相对，人BMP9与10D5-2-3抗体的复合物不抑制BMP10依赖性ALK1来源的信号。已知通过使用基因缺陷动物的试验，已知BMP10是对于心脏的产生重要的分子[Development,131(9),2219(2004)]，从副作用的观点出发，作为抗BMP9抗体，要求是不影响对于心脏形成重要的BMP10信号的抗体。
因此暗示了：10D5-2-3抗体是从副作用的观点考虑比6D10-1-1抗体或R&D抗体更优选的抗BMP9抗体。
[实施例22]
10D5-2-3嵌合抗体(c10D5-2-3抗体)和人源化抗体的制作
22-1)10D5-2-3人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计
以下述方式设计10D5-2-3人源化抗体的VH的氨基酸序列。以下述方式选出适合于10D5-2-3VH的CDR1～3的氨基酸序列(序列号60、61和62)的移植的人抗体的VH的FR的氨基酸序列。
首先，关于已知的人抗体重链可变区序列，由美国生物技术信息国家中心(The National Center for Biotechnology Information)提供的IgGermline Genes数据库检索与10D5-2-3抗体VH的FR序列的同源性高的人抗体序列。结果，IGVH3-72是同源性最高的人抗体序列，因此选择该抗体的FR。将序列号60、61和62所示的10D5-2-3抗体VH的CDR1～3的氨基酸序列移植到到如上确定的人抗体FR序列的适当位置，由此设计出HV0(序列号116)。
接着，以下述方式设计10D5-2-3抗体人源化抗体的VL的氨基酸序列。以下述方式选出适合于移植10D5-2-3抗体VL的CDR1～3的氨基酸序列(序列号63、64和65)的人抗体的VL的FR的氨基酸序列。
卡巴特(Kabat)等人将已知的各种人抗体的VL根据其氨基酸序列的同源性分成四个亚组(HSG I～IV)，并报道了上述各亚组的共有序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]。因此，实施了人抗体的VL的亚组I～IV的共有序列的FR的氨基酸序列与10D5-2-3抗体VL的FR的氨基酸序列的同源性检索。
同源性检索的结果是，HSGI、HSGII、HSGIII和HSGIV的同源性分别为67.1％、67.1％、68.4％、75.9％。因此，10D5-2-3抗体VL的FR的氨基酸序列与亚组IV具有最高的同源性。
根据以上结果，将10D5-2-3抗体VL的CDR1～3的氨基酸序列(序列号63、64和65)移植到人抗体的VL的亚组IV的共有序列的FR的氨基酸序列的适当位置。但是，10D5-2-3抗体VL的氨基酸序列(序列号52)中的第108位的Leu不是卡巴特等人列举的人抗体FR的氨基酸序列的相应部位处使用频率最高的氨基酸残基，但是使用频率比较高的氨基酸残基，因此，决定使用在上述的10D5-2-3抗体VL的氨基酸序列中出现的氨基酸残基。这样，设计出作为10D5-2-3抗体人源化抗体的VL的氨基酸序列的10D5-2-3抗体LV0(序列号118)。
上述设计好的10D5-2-3抗体的VH的氨基酸序列10D5-2-3抗体HV0、和VL的氨基酸序列10D5-2-3抗体LV0是仅将来源于作为小鼠单克隆抗体的10D5-2-3抗体的CDR的氨基酸序列移植到选择好的人抗体的FR的氨基酸序列中而得到的序列。
但是，一般而言，制作人源化抗体时，仅单纯地将小鼠抗体的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的FR中时，结合活性大多会降低。为了避免这样的结合活性的降低，在移植CDR的氨基酸序列的同时，对人抗体与小鼠抗体不同的FR的氨基酸残基中认为给结合活性带来影响的氨基酸残基进行修饰。因此，本实施例中，也如下对认为给结合活性带来影响的FR的氨基酸残基进行了鉴定并进行修饰。
首先，使用计算机建模的方法，构建包含上述设计好的10D5-2-3抗体人源化抗体的VH的氨基酸序列10D5-2-3抗体HV0和VL的氨基酸序列10D5-2-3抗体LV0的抗体V区(以下记作HV0LV0)的三维结构。三维结构坐标制作和三维结构的表示使用Discovery Studio(アクセルリス公司)。
另外，也同样地构建10D5-2-3抗体的V区的三维结构的计算机建模。进而，在HV0LV0的VH和VL的FR的氨基酸序列中，选择与10D5-2-3抗体不同的氨基酸残基，制作修饰成10D5-2-3抗体的氨基酸残基的氨基酸序列，并同样地构建三维结构模型。
将上述制成的10D5-2-3抗体、HV0LV0和修饰体的各V区的三维结构进行比较，鉴定出预测给抗体的结合活性带来影响的氨基酸残基。
结果，作为HV0LV0的FR的氨基酸残基中认为改变抗原结合部位的三维结构而给抗体的结合活性带来影响的氨基酸残基，分别筛选出：10D5-2-3抗体HV0中序列号116的氨基酸序列的第8位的Gly、第18位的Leu、第49位的Gly、第79位的Asn、第81位的Leu、第94位的Ala、第95位的Val、第99位的Ala和第100位的Arg，10D5-2-3抗体LV0中序列号118的氨基酸序列的第4位的Met、第40位的Tyr、第81位的Ser、第82位的Leu、第89位的Val和第91位的Tyr。
将这些筛选出的氨基酸残基中的至少一个以上的氨基酸序列修饰成存在于10D5-2-3抗体的相同部位的氨基酸残基，从而设计出具有各种修饰的人源化抗体的VH和VL。
具体而言，对于VH而言，导入下述氨基酸修饰中的至少一种修饰：将序列号116的氨基酸序列中的第8位的Gly取代成Arg、将第18位的Leu取代成Met、将第49位的Gly取代成Ala、将第79位的Asn取代成Ser、将第81位的Leu取代成Val、将第94位的Ala取代成Gly、将第95位的Val取代成Ile、将第99位的Ala取代成Thr或将第100位的Arg取代成Gly。
另外，对于VL而言，导入下述氨基酸修饰中的至少一种修饰：将序列号118的氨基酸序列中的第4位的Met取代成Leu、将第40位的Tyr取代成Phe、将第81位的Ser取代成Pro、将第82位的Leu取代成Met、将第89位的Val取代成Met或将第91位的Tyr取代成Phe。
分别设计出HV0LV0、HV0LV2、HV0LV3、HV0LV4、HV0LV6、HV9LV0、HV9LV2、HV9LV3、HV9LV4、HV9LV6、HV3LV0、HV4aLV0、HV4bLV0、HV7aLV0、HV3LV2、HV3LV3、HV3LV6、HV4bLV2、HV4bLV3、HV4bLV6、HV7aLV2和HV7bLV2作为对存在于HV0LV0的FR的至少一个氨基酸残基进行修饰而得到的10D5-2-3抗体人源化抗体的抗体V区。
在以下的说明中，将包含上述V区的10D5-2-3抗体人源化抗体分别简记为HV0LV0、HV0LV2、HV0LV3、HV0LV4、HV0LV6、HV9LV0、HV9LV2、HV9LV3、HV9LV4、HV9LV6、HV3LV0、HV4aLV0、HV4bLV0、HV7aLV0、HV3LV2、HV3LV3、HV3LV6、HV4bLV2、HV4bLV3、HV4bLV6、HV7aLV2和HV7bLV2。
将H链可变区HV3(序列号120)、HV4a(序列号122)、HV4b(序列号124)、HV7a(序列号126)、HV7b(序列号128)、HV9(序列号130)、和L链可变区LV2(序列号132)、LV3(序列号134)、LV4(序列号136)、LV6(序列号138)的氨基酸序列分别示于图12和图13。
22-2)10D5-2-3抗体人源化抗体的可变区基因的设计
编码人源化抗体的可变区的氨基酸序列的DNA利用编码10D5-2-3抗体VH和10D5-2-3抗体VL的氨基酸序列的DNA(分别为序列号31、37)中使用的密码子来设计，在进行氨基酸修饰的情况下，使用在哺乳动物细胞中使用频率高的密码子来设计，从而分别进行制作。使用这些DNA序列来进行抗体表达载体的构建和人源化抗体的表达。
22-3)编码c10D5-2-3抗体和人源化抗体的VH的cDNA的构建
通过全合成来制作编码序列号49表示的10D5-2-3抗体的VH、和实施例22-1)中设计的10D5-2-3抗体人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0(序列号116)、和通过实施例22-1)的方法设计的HV3、HV4a、HV4b、HV7a、HV7b、HV9的cDNA。
22-4)编码c10D5-2-3抗体和人源化抗体的VL的cDNA的构建
通过全合成来制作编码序列号52表示的10D5-2-3抗体的VL、和实施例22-1)中设计的10D5-2-3抗体人源化抗体的VL的氨基酸序列LV0(序列号118)、和通过实施例22-1)的方法设计的LV2、LV3、LV4、LV6的cDNA。
22-5)c10D5-2-3抗体和人源化抗体表达载体的构建
将编码10D5-2-3抗体的VH、实施例22-3)中得到的HV0、HV3、HV4a、HV4b、HV7a、HV7b、HV9中的任意一个的cDNA以及编码10D5-2-3抗体的VL、实施例22-4)中得到的LV0、LV2、LV3、LV4、LV6中的任意一个的cDNA插入到国际公开第97/10354号记载的人源化抗体表达用载体pKANTEX93的适当位置，构建各种10D5-2-3抗体人源化抗体表达载体。
22-6)使用动物细胞的c10D5-2-3抗体和10D5-2-3抗体人源化抗体的表达
实施例22-5)中构建的动物细胞用抗体表达载体的基因导入使用CHO-S细胞株(invitrogen公司制造)。
以CHO-S作为宿主细胞，基于FreeStyleTM MAX CHO表达系统(invitrogen公司制造)的说明书进行瞬时导入。将312.5μL的FreeStyleTMMAX转染试剂(invitrogen公司制造)与OptiProTM SFM混合，使其为共计5mL。将表达载体质粒溶液与FreeStyleTM MAX转染试剂溶液混合，在室温下静置10分钟。对于利用FreeStyleTM CHO表达培养基(invitrogen公司制造)以1.0×106cells/mL的密度进行培养而得到的CHO-S 250mL，加入全量后，在37℃、8％CO2、135rpm的设定条件下培养5天～7天。
培养后，回收细胞悬浮液，在3000rpm、4℃的条件下进行20分钟的离心分离，回收培养上清，然后，通过孔径为0.22μm的Millex GV过滤器(MILLIPORE公司)进行过滤灭菌。
22-7)纯化c10D5-2-3抗体和10D5-2-3抗体人源化抗体的获得
在直径为0.8cm的柱中填充MabSelect SuRe(通用电气医疗集团制造)0.5mL，使纯化水3.0mL、0.1M柠檬酸缓冲液(pH 3.5)2.0mL、和150mM NaCl、0.2M硼酸钠缓冲液(pH 7.5)1.5mL依次从柱中通过，进行载体的平衡化。
接着，使实施例22-6)中回收的培养上清从柱中通过，然后，用150mM NaCl、0.2M硼酸钠缓冲液(pH 7.5)5.0mL进行洗涤。洗涤后，使用0.1M柠檬酸缓冲液(pH 3.5)2.0mL溶出吸附于载体上的抗体。溶出中，以各500μL分批获得4种级分。
接着，对所得到的纯化级分进行SDS-PAGE分析，收集确认到目标蛋白质的溶出的级分，使用150mM NaCl、10mM柠檬酸Na溶液(pH6.0)，在4℃进行一昼夜的透析。
透析后，回收c10D5-2-3抗体、人源化抗体溶液，使用孔径为0.22μm的MillexgV(MILLIPORE公司)进行灭菌过滤，然后，使用吸光光度计(SHIMADZU UV-1700)测定280nm的吸光度(OD280nm)，计算出各纯化c10D5-2-3抗体、人源化抗体的浓度。
结果，确认到制作了包含10D5-2-3抗体的VH和10D5-2-3抗体的VL的一种嵌合抗体c10D5-2-3抗体、以及抗体的VH包含HV0且VL包含LV0、或LV2、或LV3、或LV4、或LV6的人源化抗体HV0LV0、HV0LV2、HV0LV3、HV0LV4、HV0LV6、抗体的VH包含HV9且VL包含LV0、或LV2、或LV3、或LV4、或LV6的人源化抗体HV9LV0、HV9LV2、HV9LV3、HV9LV4、HV9LV6、抗体的VH包含HV3且VL包含LV0、或LV2、或LV3、或LV6的人源化抗体HV3LV0、HV3LV2、HV3LV3、HV3LV6、抗体的VH包含HV4a且VL包含LV0的人源化抗体HV4aLV0、抗体的VH包含HV4b且VL包含LV0、或LV2、或LV3、或LV6的人源化抗体HV4bLV0、HV4bLV2、HV4bLV3、HV4bLV6、抗体的VH包含HV7a且VL包含LV0、或LV2的人源化抗体HV7a LV0、HV7a LV2、抗体的VH包含HV7b且VL包含LV2的人源化抗体HV7bLV2这22种。
[实施例23]
抗BMP9人源化抗体的活性评价
23-1)利用biacore评价c10D5-2-3抗体和人源化抗体对人BMP9蛋白质的结合活性
为了对实施例22-7中得到的c10D5-2-3抗体和22种10D5-2-3抗体人源化抗体对人BMP9的反应性进行比较，使用利用表面等离子体共振法(SPR法)的BiacoreT100(GE医疗集团生命科学部门制造)来测定对人BMP9重组蛋白(R&D systems公司)的结合活性。
使用人抗体捕获试剂盒(GE医疗集团生命科学部门制造)，根据附带的使用说明书将抗人IgG抗体固定到CM5传感芯片(GE医疗集团生命科学部门制造)上。在固定有抗人IgG抗体的流动池中，以10μL/分钟的流速添加2分钟的、制备成0.4μg/mL的c10D5-2-3抗体或各人源化抗体。
接着，将从1nm起用2倍稀释分阶段地制备成5种浓度的人BMP9重组蛋白(安迪生物科技公司制造，Cat#3209-BP)以10μL/分钟的流速监测3分钟的结合反应、3分钟的解离反应。获得的传感图使用Bia评价软件(GE医疗集团生命科学部门制造)来进行分析，计算出各抗体的速度理论常数。
将算出的各抗体的结合速度常数(ka1)、解离速度常数(kd1)和解离常数[kd1/ka1＝KD]示于表3中。结果确认到，17种10D5-2-3抗体人源化抗体对人BMP9蛋白质具有10E-11以下的特异性的反应性。
[表3]
抗体 Kd(1/Ms) Ka(1/s) KD(M)
c10D5-2-3抗体 5.32X 10E7 2.40X 10E-4 4.52X 10E-12
HV0LV0 N.D.
HV0LV2 N.D.
HVDLV3 N.D.
HV0LV4 N.D.
HV0LV6 N.D.
HV9LV0 13.3X 10E7 8.59X 10E-4 6.45X 10E-12
HV9LV2 8.91X 10E7 3.47X 10E-4 3.89X 10E-12
HV9LV3 7.91X 10E7 2.79X 10E-4 3.52X 10E-12
HV9LV4 11.6X 10E7 7.39X 10E-4 6.38X 10E-12
HV9LV6 6.34X 10E7 3.25X 10E-4 5.13X 10E-12
HV3LV0 15.1X 10E7 17.2X 10E-4 11.4X 10E-12
HV4aLV0 15.7X 10E7 14.5X 10E-4 9.24X 10E-12
HV4bLV0 14.4X 10E7 16.4X 10E-4 11.4X 10E-12
HV7aLV0 14.7X 10E7 14.2X 10E-4 9.69X 10E-12
HV3LV2 5.12X 10E7 5.96X 10E-4 11.6X 10E-12
HV3LV3 5.43X 10E7 5.16X 10E-4 9.49X 10E-12
HV3LV6 4.67X 10E7 5.55X 10E-4 11.9X 10E-12
HV4bLV2 5.39X 10E7 5.88X 10E-4 10.9X 10E-12
HV4bLV3 5.50X 10E7 5.56X 10E-4 10.1X 10E-12
HV4bLV6 4.46X 10E7 5.31X 10E-4 11.9X 10E-12
HV7aLV2 4.98X 10E7 4.77X 10E-4 9.57X 10E-12
HV7bLV2 6.25X 10E7 3.07X 10E-4 4.91X 10E-12
N.D.：未检测到
[实施例24]
10D5-2-3抗体人源化抗体对正常BALB/c小鼠的红细胞造血的作用
接着，评价10D5-2-3抗体人源化抗体实际是否保持红细胞增加作用，使用BALB/c小鼠来评价4种人源化抗体(HV9LV2、HV9LV3、HV7aLV2、HV7bLV2)对红细胞造血的作用。购入7周龄的雄性BALB/c小鼠(日本チャールズリバー公司制造)，并供于实验。关于饮水，通过自由摄取来提供灭菌自来水，关于饮食，通过自由摄取来提供固体饲料FR-2(フナバシファーム公司制造)。
在预饲养后，以体重作为指标，分为7组(各组n＝6)，以达到1mg/kg的施用量的方式皮下施用4种人源化抗体(HV9LV2、HV9LV3、HV7aLV2、HV7bLV2)、以及c10D5-2-3抗体和10D5-2-3抗体。
具体而言，将各抗体用生理盐水制备成0.1mg/mL，将所得物以10mL/kg的用量进行施用。对于介质组，以10mL/kg的用量皮下施用生理盐水。从抗体施用起1周后，在异氟烷麻醉下从眼窝静脉进行采血，添加到加入有EDTA的采血管中，作为血液样品。
将所得到的血液样品用生理盐水稀释2倍，使用自动血细胞计数装置ADVIA120(バイエルメディカル公司制造)，测定各种血细胞数。关于各组的红细胞数(×104/μL)，盐水组为1036.3±10.9，与此相对，HV9LV2施用组、HV9LV3施用组、HV7aLV2施用组、HV7bLV2施用组、c10D5-2-3抗体施用组、10D5-2-3抗体施用组分别为1168.0±13.4、1157.3±8.7、1145.3±12.8、1144.3±14.4、1127.7±10.9、1106.0±7.5(平均值±标准误差)的值，确认到任意一种人源化抗体均具有显著的红细胞增加作用。
使用特定的方式对本发明详细进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的意图和范围的情况下可以进行各种变更和变形。另外，本申请基于2012年7月2日提出的美国临时专利申请(61/666981号)，将其整体通过引用进行援引。
[序列表自由文本]
序列号1：LinkA1的碱基序列
序列号2：LinkA2的碱基序列
序列号3：LinkB1的碱基序列
序列号4：LinkB2的碱基序列
序列号5：Bmp9KOClaI-3’Fw的碱基序列
序列号6：Bmp9KOAscI-3’Rv的碱基序列
序列号7：Bmp9KOPacI-5’Fw的碱基序列
序列号8：Bmp9KOFseI-5’Rv的碱基序列
序列号9：Bmp9KO5’探针FW2的碱基序列
序列号10：Bmp9KO5’探针RV2的碱基序列
序列号11：Bmp9KO3’探针FW2的碱基序列
序列号12：Bmp9KO3’探针RV2的碱基序列
序列号13：mBMP9_FW5915的碱基序列
序列号14：mBMP9_RV17165的碱基序列
序列号15：mBMP9_FW1的碱基序列
序列号16：mBMP9_RV1的碱基序列
序列号17：小鼠IgG1特异性引物RV1的碱基序列
序列号18：小鼠IgG1特异性引物RV2的碱基序列
序列号19：小鼠IgG2a特异性引物RV1的碱基序列
序列号20：小鼠IgG2a特异性引物RV2的碱基序列
序列号21：小鼠IgG2b特异性引物RV1的碱基序列
序列号22：小鼠IgG2b特异性引物RV2的碱基序列
序列号23：小鼠IgG2c特异性引物RV的碱基序列
序列号24：小鼠IgG3特异性引物RV1的碱基序列
序列号25：小鼠IgG3特异性引物RV2的碱基序列
序列号26：小鼠Ig(κ)特异性引物RV1的碱基序列
序列号27：小鼠Ig(κ)特异性引物RV2的碱基序列
序列号28：小鼠Ig(λ)特异性引物RV1的碱基序列
序列号29：小鼠Ig(λ)特异性引物RV2的碱基序列
序列号30：6D10-1-1抗体的VH全长碱基序列
序列号31：10D5-2-3抗体的VH全长碱基序列
序列号32：3B7-3-3抗体的VH全长碱基序列
序列号33：6D10-1-1抗体的VH全长氨基酸序列(包含信号序列)
序列号34：10D5-2-3抗体的VH全长氨基酸序列(包含信号序列)
序列号35：3B7-3-3抗体的VH全长氨基酸序列(包含信号序列)
序列号36：6D10-1-1抗体的VL全长碱基序列
序列号37：10D5-2-3抗体的VL全长碱基序列
序列号38：3B7-3-3抗体的VL全长碱基序列
序列号39：6D10-1-1抗体的VL全长氨基酸序列(包含信号序列)
序列号40：10D5-2-3抗体的VL全长氨基酸序列(包含信号序列)
序列号41：3B7-3-3抗体的VL全长氨基酸序列(包含信号序列)
序列号42：6D10-1-1抗体的VH碱基序列(不包含信号序列)
序列号43：10D5-2-3抗体的VH碱基序列(不包含信号序列)
序列号44：3B7-3-3抗体的VH碱基序列(不包含信号序列)
序列号45：6D10-1-1抗体的VL碱基序列(不包含信号序列)
序列号46：10D5-2-3抗体的VL碱基序列(不包含信号序列)
序列号47：3B7-3-3抗体的VL碱基序列(不包含信号序列)
序列号48：6D10-1-1抗体的VH氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号49：10D5-2-3抗体的VH氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号50：3B7-3-3抗体的VH氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号51：6D10-1-1抗体的VL氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号52：10D5-2-3抗体的VL氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号53：3B7-3-3抗体的VL氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号54：6D10-1-1抗体VH的CDR1氨基酸序列
序列号55：6D10-1-1抗体VH的CDR2氨基酸序列
序列号56：6D10-1-1抗体VH的CDR3氨基酸序列
序列号57：6D10-1-1抗体VL的CDR1氨基酸序列
序列号58：6D10-1-1抗体VL的CDR2氨基酸序列
序列号59：6D10-1-1抗体VL的CDR3氨基酸序列
序列号60：10D5-2-3抗体VH的CDR1氨基酸序列
序列号61：10D5-2-3抗体VH的CDR2氨基酸序列
序列号62：10D5-2-3抗体VH的CDR3氨基酸序列
序列号63：10D5-2-3抗体VL的CDR1氨基酸序列
序列号64：10D5-2-3抗体VL的CDR2氨基酸序列
序列号65：10D5-2-3抗体VL的CDR3氨基酸序列
序列号66：人BMP9蛋白质的氨基酸序列(包含信号序列)
序列号67：人BMP9成熟区的氨基酸序列
序列号68：编码人BMP9蛋白质的碱基序列(包含信号序列)
序列号69：编码人BMP9成熟区的碱基序列
序列号70：人BMPRII的氨基酸序列
序列号71：人ALK1的氨基酸序列
序列号72：6D10-1-1抗体的轻链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列
序列号73：6D10-1-1抗体的轻链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列
序列号74：6D10-1-1抗体的重链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列
序列号75：6D10-1-1抗体的重链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列
序列号76：10D5-2-3抗体的轻链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列
序列号77：10D5-2-3抗体的轻链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列
序列号78：10D5-2-3抗体的重链的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列
序列号79：10D5-2-3抗体的重链的扩增中使用的引物Rv的碱基序列
序列号80：作为小鼠轻链(κ链)恒定区的模板的碱基序列
序列号81：作为小鼠重链(IgG1)恒定区的模板的碱基序列
序列号82：小鼠轻链(κ链)恒定区的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列
序列号83：小鼠轻链(κ链)恒定区的扩增中使用的引物Rv的碱基序列
序列号84：小鼠重链(IgG1)恒定区的扩增中使用的引物Fwd的碱基序列
序列号85：小鼠重链(IgG1)恒定区的扩增中使用的引物Rv的碱基序列
序列号86：人BMP9区域C的氨基酸序列
序列号87：人BMP9/BMP10嵌合蛋白质1的区域C的氨基酸序列
序列号88：人BMP9/BMP10嵌合蛋白质2的区域C的氨基酸序列
序列号89：人BMP9/BMP10嵌合蛋白质3的区域C的氨基酸序列
序列号90：人BMP9/BMP10嵌合蛋白质4的区域C的氨基酸序列
序列号91：人BMP9/BMP10嵌合蛋白质5的区域C的氨基酸序列
序列号92：嵌合蛋白质制作用引物1的碱基序列
序列号93：嵌合蛋白质制作用引物2的碱基序列
序列号94：嵌合蛋白质制作用引物3的碱基序列
序列号95：嵌合蛋白质制作用引物4的碱基序列
序列号96：嵌合蛋白质制作用引物5的碱基序列
序列号97：嵌合蛋白质制作用引物6的碱基序列
序列号98：嵌合蛋白质制作用引物7的碱基序列
序列号99：嵌合蛋白质制作用引物8的碱基序列
序列号100：嵌合蛋白质制作用引物9的碱基序列
序列号101：嵌合蛋白质制作用引物10的碱基序列
序列号102：人BMP10克隆用引物Fwd-1的碱基序列
序列号103：人BMP10克隆用引物Rv-1的碱基序列
序列号104：人BMP10克隆用引物Fwd-2的碱基序列
序列号105：人BMP10克隆用引物Rv-2的碱基序列
序列号106：人BMP10蛋白质的氨基酸序列(包含信号序列)
序列号107：人BMP10成熟区的氨基酸序列
序列号108：编码人BMP10蛋白质的碱基序列(包含信号序列)
序列号109：编码人BMP10成熟区的碱基序列
序列号110：由pLN1V5_人BMP10载体表达的蛋白质的氨基酸序列
序列号111：编码由pLN1V5_人BMP10载体表达的氨基酸的碱基序列
序列号112：人ALK1的全长cDNA
序列号113：hALK1FPN的碱基序列
序列号114：hALK1RP序列号115：人源化抗体修饰体VH(HV0)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号116：人源化抗体修饰体VH(HV0)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号117：人源化抗体修饰体VL(LV0)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号118：人源化抗体修饰体VL(LV0)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号119：人源化抗体修饰体VH(HV3)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号120：人源化抗体修饰体VH(HV3)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号121：人源化抗体修饰体VH(HV4a)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号122：人源化抗体修饰体VH(HV4a)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号123：人源化抗体修饰体VH(HV4b)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号124：人源化抗体修饰体VH(HV4b)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号125：人源化抗体修饰体VH(HV7a)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号126：人源化抗体修饰体VH(HV7a)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号127：人源化抗体修饰体VH(HV7b)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号128：人源化抗体修饰体VH(HV7b)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号129：人源化抗体修饰体VH(HV9)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号130：人源化抗体修饰体VH(HV9)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号131：人源化抗体修饰体VL(LV2)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号132：人源化抗体修饰体VL(LV2)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号133：人源化抗体修饰体VL(LV3)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号134：人源化抗体修饰体VL(LV3)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号135：人源化抗体修饰体VL(LV4)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号136：人源化抗体修饰体VL(LV4)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号137：人源化抗体修饰体VL(LV6)的碱基序列(不包含信号序列)
序列号138：人源化抗体修饰体VL(LV6)的氨基酸序列(不包含信号序列)
序列号139：人BMP10区域C的氨基酸序列

Claims (16)

1.一种单克隆抗体或该抗体片段，其为选自下述(a)～(e)中的一种抗体、或者与该抗体竞争地与人BMP9结合且与人BMP9的结合解离常数为1×10-10mol/L以下，
(a)包含互补决定区(complementarity determining region，以下记作CDR)1～3分别含有序列号54～56表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号57～59表示的氨基酸序列的抗体的轻链的抗体，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号60～62表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号63～65表示的氨基酸序列的抗体的轻链的抗体，
(c)包含含有序列号48表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号51表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体，
(d)包含含有序列号49表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号52表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体，
(e)包含含有序列号128表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号132表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为与选自所述(a)～(e)中的一种抗体所结合的表位结合的单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为基因重组抗体。
4.如权利要求3所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的基因重组抗体。
5.选自下述(a)～(c)中的一种单克隆抗体或该抗体片段，
(a)包含CDR1～3分别含有序列号54～56表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号57～59表示的氨基酸序列的抗体的轻链的单克隆抗体及该抗体片段，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号60～62表示的氨基酸序列的抗体的重链且包含CDR1～3分别含有序列号63～65表示的氨基酸序列的抗体的轻链的单克隆抗体及该抗体片段，
(c)包含含有序列号128表示的氨基酸序列的抗体的重链可变区且包含含有序列号132表示的氨基酸序列的抗体的轻链可变区的抗体及抗体片段。
6.如权利要求1～5中任一项所述的单克隆抗体及该抗体片段，其与序列号67表示的人BMP9成熟区的氨基酸序列中的至少第87位的Lys、第89位的Asp、第90位的Met和第93位的Pro结合。
7.如权利要求1～6中任一项所述的抗体片段，其为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双价抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。
8.一种DNA，其编码权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
9.一种重组载体，其含有权利要求8所述的DNA。
10.一种转化株，其通过将权利要求9所述的重组载体导入宿主细胞中而获得。
11.权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，将权利要求10所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，并从培养物中收集该抗体或该抗体片段。
12.一种伴有BMP9相关的贫血的疾病的治疗剂，其含有与人BMP9结合并且抑制人BMP9与人BMPRII的结合的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。
13.一种人BMP9的免疫学检测或测定方法，其使用权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段和药理学上容许的载体。
15.一种人BMP9相关的贫血的治疗方法，其包括施用权利要求1～7中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
16.一种BMP9相关的贫血的治疗方法，其包括施用与人BMP9结合并且抑制人BMP9与人BMPRII的结合的单克隆抗体或该抗体片段。
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