WO2006078072A1 - キメラ非ヒト動物およびその使用 - Google Patents

キメラ非ヒト動物およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2006078072A1
WO2006078072A1 PCT/JP2006/301379 JP2006301379W WO2006078072A1 WO 2006078072 A1 WO2006078072 A1 WO 2006078072A1 JP 2006301379 W JP2006301379 W JP 2006301379W WO 2006078072 A1 WO2006078072 A1 WO 2006078072A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
mouse
cell
cells
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/301379
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Kakitani
Kazuma Tomizuka
Original Assignee
Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirin Beer Kabushiki Kaisha filed Critical Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority to US11/795,693 priority Critical patent/US20090151011A1/en
Priority to JP2006554010A priority patent/JPWO2006078072A1/ja
Priority to EP06701439A priority patent/EP1849863A1/en
Publication of WO2006078072A1 publication Critical patent/WO2006078072A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric non-human animal with enhanced exogenous DNA expression ability, its progeny, and use thereof. Specifically, the present invention relates to a method for analyzing the function of a desired protein or a gene encoding the protein clarification and / or a method for producing a useful substance using such a chimeric non-human animal and its progeny.
  • chromosome 22 is the second smallest of the 24 human chromosomes, and the first complete nucleotide sequence was determined.
  • Presence of (excluding pseudogenes) was estimated. The breakdown is 247 genes with known base sequences and amino acid sequences, 150 new genes with homology to known genes, and
  • Embryonic stem cells are undifferentiated cell lines established from the inner cell mass of the blastocyst and retain the ability to differentiate into various body tissues including germ cells. To do. For example, in the case of mice, ES cells are injected into the mouse early embryo (host embryo) As a result, a chimeric mouse is born in which the cells of the body tissue consist of a mixture of cells derived from ES cells and host embryos. In particular, a chimeric mouse that retains ES cell-derived germ cells and can transmit the genetic information of ES cells to offspring is called a germline chimera. F1 mice that retain genetic information derived from ES cells are born by mating germline chimeras or germline chimeras with appropriate mouse strains.
  • K0 mice arbitrary knockout mice
  • Tg mice transgeneic mice
  • KI mice knockin mice
  • Many researchers have created a large number of K0 mice so far, but the results have not only provided important information in a wide range of fields from basic biology to clinical medicine, but also a large number of humans.
  • the K0 mouse is still the most widely used technique for elucidating in vivo functions of genes.
  • specific exogenous DNA can be transformed into specific genes by homologous recombination (Le Mouell ic et al., 2002, Japanese Patent No.
  • An inserted mouse is generally called a KI mouse, but a mouse created by inserting an expression unit consisting of a specific promoter, foreign DNA, and poly-A addition site into a specific chromosomal region is the origin of many genes. There is also a report that it is suitable for elucidation of internal functions (Tomizuka et al., 2003, W003 / 041495).
  • Mammalian cell lines that have been genetically modified and disrupted by homologous recombination as well as production of mice from mutant ES cells are themselves important materials for elucidating the function of the gene.
  • homologous recombination has been considered the ultimate treatment for diseases caused by genetic defects and mutations (hereditary diseases).
  • the ratio of homologous recombinants to random inserts in mammalian cell lines or primary cultured cells is the same as or lower than that in mouse ES, and it can be applied to cell-level gene function analysis and gene therapy. The improvement of the above ratio was desired (Yanez & Poter, Gene Therapy, 5: 149-159, 1998) 0
  • the present invention provides an embryonic stem (ES) cell having improved homologous recombination efficiency in a specific chromosomal region and improved expression of a protein encoded by the introduced DNA.
  • the purpose is to provide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a transgenic non-human animal that expresses a desired protein using genetically modified ES cells.
  • the present invention further provides a simple and highly reproducible method for analyzing the function of a target gene using a transgenic non-human animal and its progeny and / or for producing useful substances. Objective.
  • the present inventors can obtain an immunoglobulin gene CK exon region approximately 25 kb upstream from the RS element region. It was found that the ratio of homologous recombinants to random inserts of the gene targeting vector contained was greatly improved. It has not been known so far that alterations previously made to specific regions on chromosomes affect the efficiency of homologous recombination in gene targeting using targeting vectors that do not contain sequences in the same region. It was a good thing.
  • the present inventors further succeeded in producing a chimeric mouse by injecting genetically modified ES cells into a B cell-deficient host embryo.
  • a chimeric animal produced by this method the chimera rate of hair color was increased.
  • the present inventors have prepared a method for producing a chimeric non-human animal that expresses a desired protein, and a chimeric non-human animal that expresses the desired protein or its progeny, or cells derived from the animal, We have found a method for significantly increasing the expression level of the desired protein in relation to the tissue or high-pridoma compared to the conventional method.
  • transgenic animals have been created to produce useful proteins, including those for medical use, in the body fluids of animals, but in order to achieve sufficient expression, a large number of transgenic animals are obtained.
  • the present inventors have introduced a transgene in a chimeric non-human animal described in the PCT international application (W0 03/041495, published on March 2, 2000) filed by the applicant.
  • A relates to a gene fragment containing a promoter / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region contained in the transgene expression cassette
  • B relates to removal of a drug resistance gene marker present in the vicinity of the transgene.
  • I g for K promoter in addition to the promotion one terpolymer derived from the same Ig / c variable region disclosed above, different Ig ics rows promoter be used compared from the variable region ivy.
  • the original leader sequence coding region of the transgene was used, but in the present invention, the leader sequence coding region of the Ig fc variable region contained in the fragment shown in (3) and the original leader sequence coding Used artificially combined with the transgene from which the region was removed.
  • the serum concentration of human erythropoietin (hEPO) observed in the exemplary knock-in chimera mouse according to the method A, method and the combination of these two methods in the present invention is the same as that of the conventional transgenic (Tg) animal production method or This was a surprisingly high level compared to the exogenous DNA forced expression system using a single virus vector.
  • Endogenous EP0 concentration in the serum of normal animals are shorted with a 10 pg / ral believed to be less force S, that it is increased to more than 100 P g / ml by the expression of the foreign DNA, express the erythrocytosis The type appears.
  • hEPO-Tg mouse In sera, hEPO was detected in 100-150 pg / ml serum, and a phenotype of erythrocytosis was observed (Semenza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2301-2305, 1989). ). In a recently generated Tg mouse that expresses higher levels of hEPO, about 1250 pg / ml of serum hEPO was detected, spleen enlargement with extramedullary hematopoiesis, and a hematocrit value of 0.9 or higher.
  • Serum hEPO concentrations detected by forced expression of mice with adeno-associated virus containing hEPO gene expression cassette or lettovirus were approximately several ng / ml (Vil leval et al., Leukemia, 6: 107-115, 1992; Kessker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14082-14087, 1996).
  • the first aspect of the present invention in its first aspect, comprises a non-hypoprotein comprising a foreign DNA encoding the desired protein so that the expression of the desired protein is controlled by the control region of the gene expressed in a specific cell and / or tissue.
  • a nucleic acid fragment comprising a leader sequence coding region derived from a gene expressed in a specific cell and Z or tissue, wherein the nucleic acid fragment is bound to the foreign DNA. Characteristic The cell is provided.
  • the present invention includes a non-human DNA that contains, on the genome, foreign DNA that encodes a desired protein so that the expression of the desired protein is controlled by a regulatory region of the gene expressed in a specific cell and / or tissue.
  • the present invention provides the advantage that the foreign DNA encoding the desired protein is significantly overexpressed in the chimeric non-human animal derived from the cell or its progeny.
  • the gene expressed in the specific cell and / or tissue is an immune globulin gene, preferably an immune globulin light chain gene, more preferably an immune globulin c light chain gene.
  • the nucleic acid fragment may further comprise a promoter of a gene expressed in the specific cell and Z or tissue.
  • the nucleic acid fragment further contains, in addition to the promoter, part or all of the 5 ′ untranslated region between the promoter of the gene expressed in the specific cell and Z or tissue and the leader sequence coding region. Can do.
  • the nucleic acid fragment is a promoter of a gene expressed in the specific cell line Z or tissue 5 ′ part or all of the untranslated region. / Made of nucleic acid sequence including leader sequence code region. Such a nucleic acid fragment is particularly preferred in the present invention.
  • One specific example is a nucleic acid fragment containing a promoter / 5 ′ untranslated region part or all / leader sequence coding region of the non-human animal-derived immunoglobulin gene.
  • it is more preferable that the 5 ′ untranslated region is composed entirely of.
  • the nucleic acid fragment has a length greater than 300 base pairs.
  • the length of the nucleic acid fragment is, for example, a force such as 350 to 500 base pairs, 400 to 450 base pairs, and the like, but is not limited thereto.
  • the sequence encoding the poly A signal region is bound to the stream.
  • one or more drug resistance marker genes used for introducing the exogenous DNA into the genome in the cells having pluripotency have been removed.
  • all the drug resistance marker genes have been removed.
  • exogenous DNA when exogenous DNA is homologously recombined on the genome, it exists downstream of non-human animals, specifically mouse genomic immunoglobulin genes (especially immune globulin ⁇ light chain genes).
  • the drug resistance marker gene is inserted into the RS element or a region having a function equivalent to that, but this drug resistance marker gene is removed after homologous integration of foreign DNA.
  • the nucleic acid fragment further includes a part or all of a 5 ′ untranslated region between a promoter and a leader sequence coding region of a gene expressed in a specific cell and / or tissue, and the foreign Particularly preferred is a cell having pluripotency characterized by the fact that one or more drug resistance marker genes used for introducing DNA into the genome have been removed.
  • an allele of a gene expressed in said specific cell and / or tissue is inactivated.
  • the cell having pluripotency is an embryonic stem (ES) cell.
  • ES embryonic stem
  • the ES cell is, for example, a mouse ES cell.
  • a step of producing a cell having differentiation pluripotency derived from the above non-human animal and introducing it into a host embryo to obtain a chimeric embryo A step of selecting a chimeric non-human animal that expresses a foreign DNA encoding the desired protein from the pups obtained after the transplantation.
  • a method for producing a chimeric non-human animal that overexpresses an encoded foreign DNA is provided.
  • the chimeric non-human animal is a mouse.
  • the cell having pluripotency is an ES cell.
  • a chimeric non-human animal characterized in that foreign DNA produced by the above method and encoding a desired protein is overexpressed.
  • the chimeric non-human animal described above, or the chimeric non-human animal and a non-human animal of the same species are crossed and Provided is a progeny non-human animal characterized by overexpression of foreign DNA encoding the protein.
  • the present K also expresses a desired foreign DNA using the above-described chimeric non-human animal or offspring non-human animal, or a cell, tissue, or hybridoma derived from the animal. And a method for producing the protein, comprising recovering the protein encoded by the produced DNA.
  • the phenotype of the chimeric non-human animal or offspring non-human animal described above is used as a corresponding wild-type non-human animal that does not contain foreign DNA encoding a desired protein.
  • a method for analyzing the in vivo function of a desired protein or DNA encoding the desired protein which comprises comparing the phenotypes of the DNA and determining the difference between the phenotypes.
  • genomic refers to chromosomal DNA carrying genetic information contained in the nucleus of a living cell.
  • non-human animal means an animal that does not include humans and is generally selected from fish, reptiles, amphibians, birds, vertebrates composed of mammals, and preferably mammals. .
  • embryonic stem cells since it is preferable to use embryonic stem cells as cells having differentiation pluripotency in the production of chimeric non-human animals, non-human animals capable of establishing embryonic stem cells (for example, mice, ushi, Hidges, pigs, hamsters, monkeys, goats, rabbits, rats, etc.), and any other non-human animals that may be able to establish embryonic stem cells in the future are all non-human animals intended by the present invention. Is included.
  • Chimeric non-human animal means an animal composed of both differentiated cells derived from pluripotent cells (described later) and differentiated cells derived from a host embryo.
  • the term “cell having pluripotency” refers to the production of a chimeric non-human animal as described above by injection into a host embryo or formation of a collective embryo. A cell that can differentiate into two or more types of cells or tissues. Specific examples include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and embryonic tumor cells (EC cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • embryonic stem cell is also referred to as an ES cell (embryonic stem cell) and is characterized by being able to proliferate while maintaining undifferentiated (totipotent) characteristics. It means a cultured cell derived from.
  • embryonic stem cells are cells established by culturing cells of the inner cell mass, which are undifferentiated stem cells existing inside blastocysts in early embryos of animals, and continuing to proliferate while maintaining the undifferentiated state. Is a stock.
  • the “embryonic germ cells” are also called EG cells, and mean cultured cells derived from primordial germ cells, characterized by having almost the same ability as the embryonic stem cells. Embryonic germ cells should be grown several days to several weeks after fertilization, for example, in the case of mice, primordial germ cells obtained from embryos that are about 8.5 days old, and continue to proliferate while remaining undifferentiated. An established cell line.
  • a “desired protein” is a protein that is to be expressed in at least one cell and Z or tissue of a chimeric non-human animal produced by the method of the present invention, The function may be known or unknown.
  • the desired protein may be a mammalian-derived functional secretory protein, a functional membrane protein, a functional intracellular or nuclear protein, a soluble portion of a functional membrane protein to which a secretion signal is added, and the like. it can.
  • “functionality” means having a specific function, action or function in the living body.
  • the protein is at least one kind of cell of a chimeric non-human animal and
  • a “desired protein” is expressed in a chimeric non-human animal to be introduced, but is not expressed or only slightly expressed in a specific cell and / or tissue to be expressed. It may be of any kind, as long as it is derived from a heterologous animal and is of interest.
  • nucleic acid sequence encoding a desired protein may be either endogenous or exogenous DNA, and exogenous DNA includes human DNA.
  • structural gene encoding a desired protein is also used synonymously.
  • expression of a protein has the same meaning as expression of the gene encoding the protein.
  • a “leader sequence coding region” is a region 5 ′ upstream of the translation initiation codon of a gene expressed in a particular cell and Z or tissue, from a so-called precursor protein sequence to a mature protein sequence. This refers to the region containing the nucleic acid sequence encoding the N-terminal sequence portion excluding the portion, and refers to “secretory signal coding region” or “signal peptide coding region”.
  • control region means a general term such as “control sequence”, “regulatory sequence”, “regulatory region”, and controls gene expression (transcription, translation or protein synthesis). Or the area
  • control regions include, but are not limited to, promoters, enhancers, silencers, and the like.
  • the “control region” may include one functional element (for example, one array of one plotter), or one including a plurality of elements (for example, one A promoter sequence and an enhancer sequence).
  • the “promoter sequence” is one of the control regions well known to those skilled in the art, and refers to the base sequence upstream of the structural gene to which RNA polymerase binds at the start of transcription.
  • IRES internal ribosomal entry site
  • IRES internal ribosomal entry site
  • PI refers to the part that enables translation by. In mammals, IRES binds to the ribosomal decoding subunit, which leads to conformational changes that draw adjacent protein coding regions into the decoding site. It is presumed to be involved in events that initiate translation and protein synthesis (Spahn et al., Science 291: 1959, 2001).
  • poly A signal region refers to the base K that is located at the end of the transcription region and directs polyadenylate chain addition to the 3 ′ untranslated region of the post-transcriptional mRNA precursor. Refers to the column part.
  • upstream and downstream refer to directions toward the 5 ′ end and 3 ′ end, respectively, in nucleic acid sequences such as genomes and polynucleotides.
  • bp base pair
  • Kb tilt base pair
  • 1 bp represents one base pair
  • 1 Kb Corresponds to lOOObp.
  • allele refers to a functionally homologous gene located in a homologous region of a homologous chromosome in an organism having a polyploid genome. Alleles are usually all expressed. “Allele exclusion” means that when an individual organism is considered, only one of the alleles is expressed at random in individual cells, even though traits derived from both alleles are expressed. The expression of the other is excluded. For example, it is found in antibodies and T-cell receptor genes, and the recombination of one variable region gene is a signal that only one complete gene is completed.
  • soluble portion of a membrane protein to which a secretion signal is added refers to an extracellular domain of a membrane protein molecule to which a secretion signal (or signal sequence) is bound.
  • immunoglobulin light chain gene refers to a gene encoding the light chain (or light chain) of an immunoglobulin (Ig) molecule.
  • the light chain includes a cocoon chain and a ⁇ chain, and is composed of a variable (V) region and a constant (C) region.
  • the light chain gene is composed of one C region gene, multiple V region genes, and multiple junction (J) region genes.
  • the light chain constant region gene is preferred, and in particular, when using cells having murine pluripotency / light chain constant region gene is more preferred. Genome analysis of human mice, especially mammals, is almost complete, and genomic information is still available.
  • mice From the comparison of the sequence homology between the human and mouse, it is about 85% homology between human and mouse. It can be said that it is preferable to use it. However, in the present invention, it is possible to use animals other than mice (for example, ushi, hidge, pig, hamster, monkey, goat, usagi, rat, etc.), and immunoglobulin genes have already been sequenced. Information can be obtained from literature or databases such as GenBank (US NCBI), EMBL (European EBI), etc.
  • Gene sequencing can be determined by combining conventional techniques such as genome library creation, cloning, and (automatic) sequencing (by SB Primrose, translated by Akio Fujiyama, Genome Analysis Basic, 1996) , Springer 'Fairark Tokyo).
  • GenBank accession numbers NG004051 mouse IgG
  • V01569 mouse IgG K constant region
  • host embryo of a non-human animal lineage deficient in a specific cell and Z or tissue or “deficient host embryo” is used to refer to a non-host for injecting cells with pluripotency.
  • a human embryo that is deficient in the cell and Z or tissue is used to refer to a non-host for injecting cells with pluripotency.
  • “offspring” of a chimeric non-human animal refers to a cross between a chimeric non-human animal of the present invention or a chimeric non-human animal of the present invention and a non-human animal of the same species. It means a non-human animal obtained and expressing a desired protein in at least a specific cell and / or tissue.
  • phenotype refers to an animal's native trait or the trait of an animal that appears as a result of a transgene.
  • proliferative tumor cell means a cell that has a permanent proliferative ability by becoming a tumor, such as a plasmacytoma cell (such as a myeloma cell) that produces immunoglobulin. Is mentioned.
  • the term “hypridorma” refers to a hybrid produced by fusing a cell derived from a tissue or cell from the chimeric non-human animal of the present invention or its progeny with the proliferative tumor cell. Refers to a cell.
  • targeting vector refers to a vector used to introduce an expression unit of a gene encoding a desired protein into a target chromosomal region by homologous recombination and to express the desired protein. Point to.
  • knockout vector refers to a vector for inactivating or inactivating a target gene of a non-human animal by homologous recombination.
  • knockout or “gene knockout” means that a structure that inhibits the expression of the gene by homologous recombination is introduced into the target gene locus to destroy or inactivate the target gene. To do.
  • ⁇ RS (Recombining segment) element '' is located approximately 25 Kb downstream of the mouse immunoglobulin K light chain constant region gene on chromosome 6, and includes nonamer and heptamer s ignal sequence (underlined (1 gtttctgcacgggcagtcagttagcagcactcactgtg (Tatsumi column number " ⁇ 65)) (Daitch et al., J.
  • Mammals other than mice The same function as the RS element downstream of the genomic immunoglobulin gene To has an area, when integrate the foreign DNA into the genome homologous, by incorporating a drug resistance marker gene in this region like the RS element, can improve homologous recombination of the incoming DNA.
  • the present invention allows the chimeric non-human animal of the present invention or its progeny, or cells, tissues or hybridomas derived from the animal to express foreign DNA at a significantly higher level, for example, several hundred times higher than before. To give the advantage of.
  • Figure 1 shows the structure of the pPSs hEPO vector for in vitro.
  • 5 'Jenhancer Mau IgK 5, enhancer region
  • PS promoter mouse Ig / c promoter region
  • signal peptide coding region PS promoter downstream mouse IgK signal peptide coding region
  • intron mouse Ig / signal peptide Entron region sandwiched between peptide coding regions
  • hEP0 (-SP) human EP0 gene without unique signal peptide coding region
  • polyA mouse IgK polyA signal region
  • enhancer mouse IgK 3 enhancer Region
  • Amp Ampicillin resistance gene.
  • FIG. 2 shows the structure of the vector for pNPs hEPO in vitro.
  • 5 'enhancer mouse IgK 5, enhancer region
  • NP promoter mouse Igfc promoter region
  • signal peptide coding region mouse Igft signal peptide coding region downstream of NP promoter
  • intron rarely inserted in mouse IgK signal peptide coding region
  • hEPO (-SP) human EP0 gene without unique signal peptide coding region
  • poly A mouse Ig / poly A signal region
  • enhancer mouse Ig / c 3
  • enhancer region enhancer region
  • Amp Ampicillin resistance gene.
  • FIG. 3 shows the structure of the pCks hEPO in vitro vector.
  • 5 'enhancer mouse IgK 5' enhancer region
  • P2 promoter mouse Ig / c promoter region 2
  • hEPO human EP0 gene
  • poly A mouse IgK poly A signal region
  • 3 'enhancer mouse IgK 3 'enhancer region
  • Amp Ampicillin resistance gene.
  • Figure 4 shows the results of RT-PCR analysis using RNA obtained after introducing pNPs hEPO in vitro vector, pPSs hEPO in vitro vector, and pCks hEPO in vitro vector into myeloma cells.
  • hEPO human EP0
  • RT (-) PCR was performed without reverse transcription.
  • Figure 5 shows the results of measuring the human EP0 concentration in the culture supernatant using ELISA after introducing the pCks hEPO in vitro vector, pNPs hEPO in vitro vector, and pPSs hEPO in vitro vector into the myeloma moon Indicates.
  • Fig. 5A shows a bar graph of measured values
  • Fig. 5B shows an average value of measured values.
  • Figure 6 shows the structure of the mouse RS element collecting vector pBlueRS-LoxP-Neo-DT-A-3, KO-5'K0. 5, K0: Mouse RS elementary preparative 5 'upstream region, Neo r: neomycin resistance gene having a ⁇ sequence at both ends, 3 , K0: Mouse RS element 3, downstream region, DT-A: Diphtheria toxin A chain gene, and pBluescript: Cloning vector.
  • FIG. 7 shows the allele structure in which a neomycin resistance gene is inserted instead of the mouse RS element (FIG. 7A) and the position of the probe for Southern analysis (FIG. 7B).
  • 5 'Genome Mass RS element 5' Upstream region
  • 3 'Genome Mouse RS element 3' Downstream region
  • 5 'Probe Southern analysis probe for confirming 5' side insertion of targeting vector
  • 3 'Probe Southern analysis probe for confirming 5' side insertion of targeting vector
  • Probe Southern analysis probe for 3 'insertion confirmation of targeting vector
  • loxP-Neo-loxP Neomycin resistance gene with loxP sequence at both ends.
  • FIG. 8 shows the structure of the pC / c P2 KI vector.
  • Promoter 2 Mouse Ig K promoter—region 2 , MC s: Multiple cloning site, C / c: Mouse Ig / c gene constant region, full length C / c poly A: Mouse Ig consisting of 436 bp downstream of C ⁇ stop codon ⁇ poly ⁇ signal region, partial length C fc poly A: mouse Ig K poly A signal region consisting of 309 bp downstream of the CK stop codon, loxP-Puro: pure mouthmycin resistance gene with loxP sequences at both ends, DT- A: Diphtheria toxin A chain gene, and pBluescript: Clonin every one ' ⁇ o
  • Figure 9 shows the pC / P2 hEPO KI vector structure in which the human EP0 gene was inserted into the cloning site.
  • Promoter 2 Mouse Ig / promoter region 2
  • hEPO human EP0 gene
  • C ⁇ mouse Ig ⁇ gene constant region, full-length C ⁇ poly
  • A mouse Ig / c poly
  • A Mouse Ig / Poly
  • loxp-Puro Pumycin resistance gene with loxP sequences at both ends
  • DT-A Diphtheria toxin A Chain genes
  • pBluescript cloning vectors.
  • Figure 10 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted to the human EP0 gene + drug resistance gene (loxp-puro) using the pCkhEPO KI vector, two types The allele structure from which the drug resistance genes (loxp-neo and loxp-puro) were simultaneously removed and the position of the probe for Southern analysis are shown.
  • hEPO human EP0 gene
  • C fc mouse Ig / gene constant region
  • loxp-puro pyumycin resistance gene with loxP sequence at both ends
  • loxp-neo neomycin resistance gene with loxP sequence at both ends
  • Ck3 Probe: hEPO + loxp-puro gene transfer And loxp-puro gene removal clone selection Southern analysis probe
  • RS 3 ′ probe loxp-neo gene removal clone selection Southern analysis probe
  • E EcoRI restriction enzyme site.
  • Figure 11 shows the structure of the pNPhEPOKI vector in which the human EP0 gene without a unique signal peptide coding region was inserted into the cloning site.
  • NP promoter mouse IgK promoter region NP
  • signal peptide coding region mouse Igf signal peptide coding region downstream of the NP promoter
  • hEP0 (-SP) human EP0 gene without a unique signal peptide coding region
  • Mouse Ig K poly A signal region consisting of 436 bp downstream of C / c termination codon, Partial length C / c poly A: Mouse Ig kappa poly A signal region consisting of 309 bp downstream of C K termination codon
  • CK mouse Ig kappa gene constant region
  • loxp-Puro puromycin resistance gene with ⁇ sequences at both ends
  • DT-A diphtheria toxin A chain gene
  • pBluescript claw jung vector.
  • Figure 12 shows the allele structure in which the human EP0 gene + drug resistance gene (loxp-puro) was targeted using the pNPhEPOKI betater and the position of the probe for Southern analysis.
  • liEP0 (-SP) Human EP0 gene without unique signal peptide coding region,: Mouse IgK gene constant region
  • loxp-puro Puromycin H "gene, Ck3, probe with ⁇ sequences at both ends : HEP0 (-SP) + loxp-puro gene transfer clone-Southern analysis probe for selection
  • E EcoRI restriction enzyme site.
  • FIG. 13 shows the structure of the pPS hEPOKI vector in which a human EP0 gene without a unique signal peptide coding region was inserted into the cloning site.
  • PS promoter mouse IgK promoter region PS
  • signal peptide coding region mouse Ig / signal peptide coding region downstream of PS promoter
  • hEP0 (-SP) human EP0 gene without unique signal peptide coding region
  • Full length Cfc poly A mouse Ig / c poly A signal region consisting of 436 bp downstream of C / c termination codon, partial length C kappa poly A: mouse Ig kappa poly A signal region consisting of 309 bp downstream of C / c termination codon
  • C / i mouse Ig K gene constant region
  • loxp-Puro puromycin resistance gene with ⁇ sequences at both ends
  • DT-A diphtheria toxin A chain gene
  • pBluescript claw Jung vector.
  • Figure 14 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted to the human EP0 + drug resistance gene (loxp-puro) using the pPS hEPO KI vector, and drug resistance.
  • the allele structure from which the gene (loxp-neo, loxp-puro) has been removed and the position of the probe for Southern analysis are shown.
  • hEP0 human EP0 gene was removed unique leader sequence coding region
  • C / t mouse Ig K gene constant region
  • oxP-puro puromycin resistance gene with iota Omikuronkairo sequences at both ends thereof
  • loxp -neo Neomycin resistance gene with ⁇ sequences at both ends
  • Ck3 'probe Southern analysis probe for hEPO (-SP) + loxp-puro gene transfer and loxp-puro gene removal clone selection
  • RS3, probe loxp-neo Southern analysis probe for selection of transgenic and removed clones
  • E EcoRI restriction enzyme site.
  • Figure 15 shows the allele structure targeted by the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted by the human EP0 + drug resistance gene (loxp-puro) using the pCkP2 hEPO KI vector, and the drug resistance gene The allele structure from which (loxp-neo, loxp-puro) has been removed and the position of the probe for Southern analysis are shown.
  • hEPO human EP0 gene, CK;: mouse Ig K gene constant region, loxp-puro: piomycin resistance gene with ⁇ sequences at both ends, Ck3, probe: hEPO + loxp-puro gene transfer gene loxp -Southern analysis probe for selection of puro gene-removed clones, E: EcoRI restriction enzyme site.
  • Figure 16 shows CkP2 hEPO mouse ES cells, NP hEPO mouse ES cells, and PS hEPO mice
  • ES cell RS element targeting 'mouse RT-PCR analysis using RNA prepared from the spleen of a chimeric mouse (1 to 4 weeks old) prepared from ES cells (Results of band of agarose gel electrophoresis) Show).
  • CkP2 Results of samples obtained from spleens of chimeric mice prepared from CkP2 hEPO mouse ES cells.
  • NP Results of samples obtained from spleens of quinora mice prepared from NP hEPO mouse ES cells.
  • PS PS hEPO mice Samples obtained from spleens of chimeric mice prepared from ES cells.
  • RSe RS element ⁇ Targeting ⁇ Mouse Samples obtained from spleens of control chimeric mice prepared from ES cells As a result, EP0: Hit EP0,
  • GAPDH Mouse Grisel Aldehyde 3-phosphine Todehydrogenase
  • RT + PCR after reverse transcription Yes
  • RT- Perform PCR without reverse transcription.
  • Figure 17 shows CkP2 hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, NP hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, PS hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, CkP2 ⁇ ⁇ EPO mouse TT2F cell-derived chimeric mouse, CkP2 l oxP hEPO mouse ES Cell-derived chimeric mouse, PS loxP hEPO mouse Serum human EP0 concentration from 1 to 8 weeks of age in ES cell-derived chimeric mice is shown.
  • Fig. 17A shows the measured value graph
  • Fig. 17B shows the measured value. (Number): Indicates the number of samples to be measured.
  • FIG. 18 shows the structure of the pCk l oxPV KI vector.
  • Promoter 2 Mouse Ig ⁇ promoter region 2
  • MCS Multiple cloning site
  • CK Mouse IgK gene constant region
  • A Mouse Ig ⁇ poly
  • l oxPV- Puro Pugh port hygromycin resistance gene with the mutant loxP site at both ends
  • DT-a diphtheria toxin a-chain Gene
  • pBluescr ipt cloning vector.
  • Figure 19 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxpv-puro) using the pCk l oxPV KI vector, and the drug resistance gene (l oxp- The position of the probe for the Southern structure opal Southern analysis from which neo, l oxpv-puro) has been removed is shown.
  • C / c mouse Ig / c gene constant region
  • loxpv-puro l oxPV sequence, which is a partial mutated sequence of l oxP sequence
  • pucomycin resistance gene having both ends of l oxp-neo: l oxP sequence Neomycin metabolite gene at both ends
  • Ck3 probe: Southern analysis probe for loxpv-puro gene introduction and loxpv-puro gene removal clone selection
  • RS3 'probe Southern analysis probe for loxp-neo gene introduction and removal clone selection
  • E EcoRI restriction enzyme site.
  • FIG. 20 shows the pCkloxPV hEPOKI vector structure in which the human EP0 gene was inserted into the cloning site.
  • Promoter 2 Mouse IgK promoter region 2
  • hEPO human EP0 gene
  • C ⁇ mouse Ig ⁇ constant region
  • full-length C ⁇ polyA mouse Ig / polyA signal region consisting of 436 bp downstream of C ⁇ termination codon Partial length
  • C ⁇ Poly A Mouse Ig ⁇ poly A signal region consisting of 309 bp downstream of C ⁇ termination codon
  • loxPV-Puro is pCkloxPV hEPOKI vector structure in which the human EP0 gene was inserted into the cloning site.
  • Promoter 2 Mouse IgK promoter region 2
  • hEPO human EP0 gene
  • C ⁇ mouse Ig ⁇ constant region
  • full-length C ⁇ polyA mouse Ig / polyA signal region consisting of 436 bp downstream of C ⁇ termination codon
  • Partial length C
  • Figure 21 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted to the human EP0 gene + drug resistance gene (loxpv-puro) using the pCk loxPV hEPO KI vector, The allele structure from which drug resistance genes (loxp- neo , 1 oxpv-puro) have been removed and the position of the probe for Southern analysis are shown.
  • hEPO human EP0 gene
  • C fc mouse Ig f gene constant region
  • loxpv-puro puumycin resistance gene having loxPV sequences at both ends
  • loxPV sequences loxp-neo: ⁇ Neomycin resistance gene having both ends of the sequence
  • Ck3 'probe hEPO + loxpv-puro gene transfer and loxpv-puro gene removal clone selection Southern analysis probe
  • RS3' probe loxp-neo gene transfer and removal clone selection Southern analysis probe
  • E EcoRI restriction enzyme site.
  • Figure 22 shows the pNP loxPV hEPO KI vector structure with the human EP0 gene inserted into the cloning site.
  • NP Promoter mouse Ig K promoter region with about 300bp long upper stream sequence than the promoter 2, signal peptidase Puchidokodo region: NP-flop port motor downstream of the mouse I g K signal peptidase Puchidokodo region, hEP0 (- SP): Specific Shi Human EP0 gene without DNA peptide coding region, full-length C / c poly A: mouse Ig kappa poly A signal region consisting of 436 bp downstream of C / t stop codon, partial length C kappa poly A: C f?
  • Mouse IgK poly A signal region consisting of 309bp downstream, loxPV-Puro: 1 purifier resistance gene with 1 oxPV sequence at both ends, DT-A: diphtheria toxin A chain gene , And pBluescript: Cloning vector.
  • Figure 23 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted to the human EP0 gene + drug resistance gene (loxpv-puro) using the pNP loxPV hEPO KI vector, The allele structure from which drug resistance genes (loxp-neo, loxpv-puro) have been removed and the position of the probe for Southern analysis are shown.
  • hEPO (-SP) human EP0 gene without unique signal peptide coding region
  • CK mouse Ig / c gene constant region
  • loxpv-pur mouse Ig / c gene constant region
  • FIG. 24 shows the pUS hEPOKI vector structure with the human EP0 gene inserted into the cloning site.
  • PS promoter mouse Ig ⁇ promoter region PS, signal peptide coding region: mouse Ig / signanopeptide coding region downstream of the PS promoter, hEP0 (-SP): human EP0 gene without a unique signal peptide coding region, C / c : Mouse Ig / c gene constant region, full length C fc poly A: Mouse Ig K poly A signal region consisting of 436 bp downstream of C / stop codon, partial length CK poly A: Mouse Ig consisting of 309 bp downstream of C / c stop codon ) c Poly A signal region, loxPV-Puro: a puromycin resistance gene having loxPV sequences at both ends, a partial variation sequence of ⁇ sequence, DT-A: diphtheria toxin A chain gene, and pBluescript: cloning vector.
  • Figure 25 shows the allele structure targeted to the drug resistance gene (loxp-neo), the allele structure targeted to the human EP0 + drug resistance gene (loxpv-puro) using the pPS loxPV hEPO KI vector, and the drug resistance gene.
  • the allele structure from which (loxp-neo, loxpv-puro) has been removed and the position of the probe for Southern analysis are shown.
  • hEP0 (-SP) human EP0 gene without unique signal peptide coding region
  • C / c mouse Ig ⁇ gene constant region
  • loxpv-puro loxPV sequence, which is a partial variant of ⁇ sequence, at both ends
  • Loxp-neo a neomycin H!
  • a nucleic acid sequence for example, a structural gene
  • a multipotent differentiation derived from a non-human animal is included (or included in the genome), and a multipotent differentiation derived from a non-human animal.
  • a cell having sex is produced.
  • This nucleic acid sequence is arranged so that expression of a desired protein can be controlled by a regulatory region of a gene expressed in a specific cell and / or tissue.
  • mice having differentiation pluripotency in the present invention those listed above can be used, and mouse-derived embryonic stem cells (ES cells) are preferable.
  • ES cells mouse-derived embryonic stem cells
  • an RS element is preferable, and in particular, an RS element located about 25 Kb downstream of the immunoglobulin fc light chain constant region gene on mouse chromosome 6 is preferable.
  • a gene expressed in a specific cell and / or tissue may be expressed in a tissue-specific manner or may be constitutively expressed.
  • an expression unit containing a cDNA linked to a promoter of a gene expressed in a specific cell and / or tissue in the vicinity of the gene expressed in a specific cell and / or tissue, Is expressed in certain cells and / or tissues.
  • genes expressed in specific cells and / or tissues include not only endogenous genes on non-human animal genomes but also foreign genetic elements that can be maintained outside the chromosome of non-human animal individuals, such as plasmids. Kuter (E! Brecht et al., Mol.
  • the SC20 fragment contains the entire length of the human immunoglobulin heavy chain locus.
  • various human immunoglobulin heavy chains are expressed specifically in B lymphocytes, similar to those observed in humans. Has been shown to do.
  • B lymphocyte-specific expression of the cDNA is possible by inserting an expression unit in which the immunoglobulin heavy chain promoter and cDNA are linked in the vicinity of the human immunoglobulin heavy chain locus on the SC20 fragment. It becomes.
  • genes that are specifically expressed in tissues include immunoglobulin light or heavy chain genes, T cell receptor genes, myoglobin genes, crystallin genes, renin genes, lipase genes, and albumin genes.
  • Examples of the constitutively expressed gene include hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) gene.
  • HPRT hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • the arrangement (ie, ligation or insertion) of the nucleic acid sequence encoding the desired protein is such that expression of the desired protein is controlled by at least the regulatory region of the gene expressed in a particular cell and Z or tissue.
  • the nucleic acid sequence is located downstream of the regulatory region of a gene that is expressed in a particular cell and / or tissue.
  • the nucleic acid sequence encoding the desired protein can be expressed as an internal rib between the stop codon of the gene expressed in a specific cell and / or tissue and the sequence encoding the polyA signal region.
  • a somal entry site (IRES) will be placed downstream of the IRES. That is, the nucleic acid sequence exists between the stop codon of a gene expressed in a specific cell and / or tissue and a sequence encoding a poly A signal region in a state of being operably linked to IRES on the genome.
  • the poly A signal region of the gene generated in the specific cell and / or tissue can be used, but is not limited thereto.
  • Other polyA sequences known in the art such as, for example, a polyA signal region derived from simian virus 40 (SV40) can also be used.
  • the nucleic acid sequence encoding the desired protein is a specific cell and / or tissue.
  • a sequence encoding the second poly A signal region and a promoter sequence downstream of the poly A signal region between the stop codon of the gene expressed in FIG. Located downstream of the sequence. That is, the nucleic acid sequence exists on the genome in a state that is operably linked to a sequence encoding a promoter sequence and a poly A signal region, and is a specific sequence originally present on the genome.
  • Genes that are expressed in cells and / or tissues also exist in operably linked sequences that encode the promoter sequence and the polyA signal region.
  • the promoter sequence used here is not particularly limited as long as it regulates the expression in the specific cells and / or tissues, but preferably the specific cells and Z Alternatively, a promoter for genes expressed in tissues is used. If there are two promoters in the targeting vector, the two promoters may be the same or different as long as they control expression in the same cell and Z or tissue. Also good.
  • the sequence encoding the poly A signal region used for the construction of the targeting vector is not particularly limited as long as it is a poly A signal region known in the art, and for example, a promoter. And poly A signal region derived from Simian virus 40 (SV40). As in the case of the promoter, if the targeting vector contains sequences encoding two poly A signal regions, the two may be the same or different. .
  • nucleic acid sequence encoding the desired protein includes the specific cell and
  • a promoter sequence, a nucleic acid sequence, and a sequence encoding a poly A signal region can be arranged in the order downstream of the poly A signal region of a gene expressed in Z or tissue. That is, the nucleic acid sequence is a poly-A signal of a gene expressed in a specific cell and / or tissue in a state (eg, cassette format) operably linked to a promoter and a sequence encoding a poly-A signal region. Exists downstream.
  • the promoter sequence used here controls expression in the specific cells and / or tissues described above. If it is, it will not specifically limit, However, Preferably the promoter of the gene expressed in the said specific cell and Z or a structure
  • the sequence encoding the poly A signal region in the construction of the targeting vector is not particularly limited as long as it is a poly A signal region known in the art, for example, the poly A signal region derived from the same promoter as the promoter. And poly A signal region derived from simian virus 40 (SV40). If the targeting vector contains sequences encoding two poly A signal regions, the two may be the same or different.
  • the distance between the 3 ′ end of the poly A signal region of the gene expressed in the specific cell or tissue and the 5 ′ end of the promoter sequence controlling the expression of the nucleic acid sequence encoding the desired protein is The nucleic acid sequence is not particularly limited as long as the nucleic acid sequence can be expressed in specific cells and / or tissues.
  • the distance between the 3 'end of the poly A signal region and the 5' end of the promoter sequence that controls the expression of the nucleic acid sequence encoding the desired protein is preferably within 1 Kb.
  • the nucleic acid sequence encoding the desired protein is a promoter / derived from a gene expressed in the specific cell and / or tissue downstream of the poly A signal region of the gene expressed in the specific cell and Z or tissue. Sequence consisting of 5 'untranslated region / reader sequence code region, sequence obtained by removing leader sequence code region from nucleic acid sequence encoding desired protein, and sequence encoding poly A signal region It can also be arranged. That is, the nucleic acid sequence obtained by removing the leader sequence coding region from the nucleic acid sequence encoding the desired protein is a sequence comprising the promoter 1/5 ′ untranslated region / leader sequence coding region and the poly A signal region.
  • the sequence consisting of the promoter / 5, untranslated region / leader sequence coding region used here is There is no particular limitation as long as it controls expression in tissues, but preferably a promoter of a gene expressed in the specific cells and / or tissues described above / 5/5 untranslated region / reider sequence An array consisting of code regions is used.
  • the sequence consisting of the promoter / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region may be a continuous sequence existing on the genome, or the promoter, 5 ′ untranslated region, leader sequence code.
  • the 5 ′ untranslated region and leader sequence coding region used here may or may not contain introns.
  • the promoter / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region is derived from a mouse immunoglobulin / c light chain gene.
  • the mouse immunoglobulin K light chain gene has a large number of variable (V) region segments on the genome, each with its own promoter / 5′untranslated region / reider sequence code region .
  • Mouse immunoglobulin ⁇ light chain gene-derived promoter / 5, untranslated region / leader sequence coding region includes many promoters associated with any of the variable (V) regions / 5 ′ untranslated region / leader sequence
  • the code area may be used.
  • the promoter / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region derived from the mouse immunoglobulin fc light chain gene is preferably the NP type described in the Examples, and more preferably the PS type described in the Examples.
  • sequence encoding the poly A signal region in the construction of the targeting vector is not particularly limited as long as it is a poly A signal region known in the art, and for example, a poly A signal region derived from the same promoter as the promoter. Examples include poly A signal region derived from simian virus 40 (SV40). If the targeting vector contains sequences encoding two poly A signal regions, the two may be the same or different.
  • a preferred embodiment as a sequence encoding the poly A signal region is a poly A signal located downstream of the mouse immunoglobulin ⁇ chain gene C / c exon.
  • the distance between the 3 'end of the poly A signal region of the gene expressed in the specific cell and Z or tissue and the 5' end of the promoter sequence controlling the expression of the nucleic acid sequence encoding the desired protein is The nucleic acid sequence can be expressed in the specific cells and / or tissues. There is no particular limitation, but as the distance increases, the stability of the transcript mRNA may be adversely affected, and the structure of the targeting vector increases. It becomes difficult to produce a vector having such a configuration. For these reasons, the distance between the 3 'end of the poly A signal region and the 5' end of the promoter sequence that controls the expression of the nucleic acid sequence encoding the desired protein is preferably within 1 Kb.
  • nucleic acid sequence for example, a structural gene
  • the nucleic acid sequence may be inserted in the vicinity of the control region, or the ES cell
  • the allele on one side can be arranged in such a manner that the original structural gene is simply replaced immediately below the regulatory sequence of the gene expressed in the cell and / or tissue. Since the original structural gene substituted with the nucleic acid sequence encoding the desired protein is expressed by the allele on the other side, cells and / or tissues can remain normal.
  • Immunoglobulin kappa chain gene expression is caused by recombination of numerous V and J gene fragments as described above. As a result of this binding, a promoter sequence near the upstream of each V gene fragment is placed near the enhancer sequence present downstream of the J fragment. Under such circumstances, enhancer sequences can activate the promoter for the first time (Picard et al., Nature, 307: 80-2, 1984). That is, the nucleic acid sequence encoding the desired protein can be artificially linked to the promoter sequence of an immunoglobulin ⁇ chain gene and placed in the vicinity of the enhancer sequence.
  • the sequence obtained by removing the leader sequence code region from the nucleic acid sequence encoding the desired protein is a sequence artificially derived from the immunoglobulin K chain gene / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region. It can also be arranged in the vicinity of the enhancer sequence in a linked form. Immunoglobulin; c-chain gene locus is known to have an enhancer sequence downstream of the enhancer sequence (Meyer et al., EMBO J. 8: 1959-64, 1989). Thus, it can be highly expressed in B cells under the influence of multiple enhancers.
  • transgenic cell A cell having differentiation pluripotency derived from a non-human animal containing the nucleic acid sequence encoding the desired protein as described above on the genome is referred to as a transgenic cell or a transgenic ES. Also referred to as cells, these cells can be obtained, for example, but not limited to, as described below.
  • An RS element 'targeting vector is constructed in which a genomic sequence is located upstream and downstream of the mouse RS element sequence, and a selection marker is inserted instead of the RS element sequence.
  • Mouse RS Element 1 The sequence of the upstream and downstream genomic regions of the sequence only needs to be composed of a certain number of bases or more, for example, each composed of 2 Kb or more, and 7 Kb or more of both upstream and downstream. Is desirable.
  • a selection marker is inserted instead of the RS element sequence in the vector.
  • a neomycin resistance gene a puromycin resistance gene, a blasticidin resistance gene, a GFP gene, etc. can be used.
  • the structure of the targeting vector can be modified to increase the efficiency of homologous recombination.
  • the negative selection marker for eliminating cells with random insertion of the targeting vector in the genome is operated so that it is not exposed at the end of the vector when the targeting vector is linearized.
  • the efficiency of homologous recombination can be increased.
  • the 5 'and 3' ends of the gene structure that functions as a negative selection marker are at least 5 and 3, respectively, from the end of the targeting vector. It is desirable to operate at a distance of 1 Kb, preferably 2 Kb or more. Usually, a region for homologous recombination with the genome (homologous recombination region) is located at one of the 5 'end or 3' end of the negative selection marker, so the distance from the vector end is 3 Kb or more. Most of what happens. On the other hand, the other end of the negative selection marker is often close to one end of the vector.
  • the negative selection marker is manipulated so that the end not adjacent to the homologous recombination region is at least l kb from the end of the linearized vector, thereby increasing the efficiency of homologous recombination.
  • targeting vector The plasmid sequence such as pUC used for construction can be left as it is (that is, not deleted when linearized), or any new sequence that is not homologous to the target targeting region can be used. It is also possible to place a non-coding sequence next to one of the negative selections.
  • the restriction enzyme recognition site of the targeting vector used is closely examined, and an appropriate restriction enzyme site is selected so that the distance between the vector end and the negative selection marker end can be secured.
  • an appropriate restriction enzyme site is selected so that the distance between the vector end and the negative selection marker end can be secured.
  • By linearizing the DNA the effect of improving the homologous recombination efficiency can be achieved. Even if such an appropriate restriction enzyme site is not found, it can be appropriately detected by a method using PCR (Akiyama et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 16, E77.).
  • a unique restriction enzyme recognition sequence can be introduced at a desired position in the targeting vector.
  • the 5 ′ end and the 3 ′ end of the gene structure functioning as a negative selection marker in the targeting vector ⁇ are at least from the 5 ′ end and the 3 ′ end of the linearized targeting vector, respectively.
  • the present invention provides a gene targeting vector characterized by being separated by 1 Kb, preferably 3 Kb or more, and a gene targeting method using the targeting vector, which is known as a negative selection marker in the targeting vector. Any of these can be used, but the diphtheria toxin A gene is preferred.
  • Mouse ES cells can usually be established by the method described below.
  • the embryos that were obtained by mating male and female mice after 2.5 days after fertilization were collected, cultured in vitro in a medium for ES cells, and embryos that had developed to blastocysts were isolated from the cultured embryos, Then, the embryo is seeded and cultured in a feeder cell culture medium, and the cell mass of the embryo grown in the ES-like form is dispersed using an ES cell medium containing trypsin. And culture using feeder cell culture medium, and further using ES cell culture medium. Isolate cells that are subcultured and proliferate.
  • RS element targeting mouse ES cells using a targeting vector is a technique known in the art, for example, Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8 Gene Targeting, 1995, Yodosha (Japan) It can be performed by the method described in the above.
  • the targeting vector prepared above is introduced into mouse ES cells by electroporation, lipofection, etc., and mouse ES cells that lack the RS element and have a resistance gene inserted in that region are obtained. I can do it.
  • mouse ES cells with improved homologous recombination efficiency in the chromosomal region downstream of the immunoglobulin light chain constant region gene are obtained.
  • a sequence obtained by removing a leader sequence coding region from a nucleic acid sequence encoding a desired protein downstream from a gene expressed in a specific cell and / or tissue is a promoter / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region.
  • a targeting vector inserted in a functionally linked state eg, in cassette form with the sequence encoding the polyA signal region.
  • the nucleic acid sequence to be introduced includes the leader amino acid sequence predicted by signal P, which is a computer program for the secretory protein leader sequence test, and the mature tongue. However, it may be genomic DNA containing an intron, and any protein may be encoded by the nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid sequence used in the present invention may be used for high expression / secretion of the protein encoded thereby, or may be used for elucidating the function of the protein. Therefore, any nucleic acid sequence can be used as long as the nucleotide sequence is specified.
  • nucleic acid sequences include mammals, preferably humans, genes encoding functional proteins derived from them, such as genes encoding secreted proteins, genes encoding membrane proteins, intracellular Or a gene encoding a nuclear protein.
  • a sequence obtained by removing the leader sequence coding region from the nucleic acid sequence encoding the desired protein is promoted downstream of the gene expressed in a specific cell and Z or tissue.
  • the animal's genome so that it is inserted in a functionally linked form (eg, in cassette form) with a sequence consisting of a 5/5 untranslated region / leader sequence coding region and a sequence encoding a poly A signal region.
  • a targeting vector is prepared, and the sequence obtained by removing the leader sequence coding region from the nucleic acid sequence encoding the desired protein in this vector DNA is composed of a promoter / 5 ′ untranslated region / leader sequence coding region. And a nucleic acid sequence that is operably linked to a sequence encoding a polyA signal region (eg, in cassette format).
  • vectors that can be used for this purpose are plasmids and viruses. Those skilled in the art can easily select and obtain vectors that can be used as targeting vectors. Specific examples of vectors include, but are not limited to, p Ck l oxPV KI vectors
  • a restriction enzyme cleavage site suitable as an insertion site for the cassette is arranged downstream of the poly A signal region of a gene expressed in specific cells and cells or tissues.
  • the vector can contain a selection marker, for example, a puromycin resistance gene, a neomycin resistance gene, a blasticidin resistance gene, a GFP gene, etc., if necessary.
  • Transformation of non-human animal-derived pluripotent cells using a targeting vector can be performed by a method known in the art, for example, the method described in Shinichi Aizawa (above) and the like.
  • the targeting vector prepared above can be introduced into cells having pluripotency by electroporation, lipofection, or the like.
  • the structure of the targeting vector can be modified to increase the efficiency of homologous recombination.
  • the negative selection marker for eliminating cells with random insertion of the targeting vector in the genome is not exposed at the end of the vector when the targeting vector is linearized. By doing so, the efficiency of homologous recombination can be increased.
  • the 5 'end and 3' end of the gene structure that functions as a negative selection marker are targeted. It should be manipulated to be at least 1 Kb, preferably 2 Kb or more away from the 5 'and 3' ends, respectively.
  • a region for homologous recombination with the genome is located at one of the 5 'end or 3' end of the negative selection marker. Therefore, the distance from the vector end is 3 Kb or more. Most of what happens.
  • the other end of the negative selection marker is often close to one end of the vector.
  • the negative selection marker is manipulated so that the end not adjacent to the homologous recombination region is at least l kb from the end of the linearized vector, thereby increasing the efficiency of homologous recombination.
  • the plasmid sequence such as pUC used when constructing the targeting vector can be left as it is (that is, not deleted when linearizing). It is also possible to place any new non-coding sequence that is non-homologous to the target targeting region next to the negative selection marker.
  • the present invention relates to a targeting vector in which a 5 ′ end and a 3 ′ end of a gene structure functioning as a negative selection marker are at least 1 from the 5 ′ end and the 3 ′ end of the linearized targeting vector, respectively.
  • a gene targeting vector characterized by being separated by Kb, preferably 3 Kb or more, and a gene targeting method using the targeting vector.
  • Kb preferably 3 Kb or more
  • a negative selection marker in the above targeting vector Any known one can be used, but the diphtheria toxin A gene is preferred.
  • the pLoxP-Puro-derived pyomycin metabolite cassette described in PCT international application W0 00/10383 pamphlet filed by the present applicant (published internationally on March 2, 2000) was used.
  • This drug-resistant cassette contains a Lox-P sequence in the forward direction at both ends. Therefore, the resistance gene can be removed from the pluripotent cells into which the targeting vector has been inserted by the method described in WO 00/10383 pamphlet.
  • pLoxP described in PCT International Application No. WO 00/10383 pamphlet filed by the present applicant published internationally on March 2, 2000.
  • Neo resistance cassette derived from STneo can be used.
  • This drug resistance cassette contains a LoxP sequence in the forward direction at both ends. Therefore, the resistance gene can be removed from cells having pluripotency into which the targeting vector has been inserted by the method described in WO 00/10383 pamphlet.
  • the drug resistance for positive selection contained in the targeting vector for example, the resistance resistance of pure mouth
  • the drug resistance for positive selection inserted to remove the RS sequence for example, Neo resistance
  • a LoxP sequence that exists in the forward direction at both ends of the drug-resistant cassette a mutant LoxP sequence (Lee et al., Gene, 216: 55-65, 1998) is used. be able to.
  • mouse C K region experiment was replaced with human C fc region (Zou Raa Sc i ence, 262: 1271- 1274,1993 ) in the the presence of a drug-resistant marker associated with C / downstream region Nevertheless, high levels of mouse / human chimeric Ig K chain expression were observed. In other words, no conclusion has been reached on the effect of the presence of a drug-resistant cassette inserted in the region near Ig fc on Ig / chain expression. Furthermore, although the control region of IgK was used, the effect on the expression of genes contained in the expression unit independent of the endogenous Ig / c gene was not well understood.
  • the target gene can be placed downstream of the Ig ⁇ constant region. The efficiency of insertion can be increased.
  • mouse ES cell TT2F used in the Examples herein is a cell derived from an F1 individual between the C57BL / 6 line and the CBA line. As mentioned earlier (Deng & Capecchi, Mol.
  • TT2F cells when the sequence of the genomic homologous region contained in the targeting vector is derived from C57BL / 6, TT2F cells have a higher rate in C57BL / 6-derived alleles. It is envisioned that homologous recombination will occur. That is, for example, a G418 resistant marker can be inserted into a C57BL / 6-derived allele using a targeting vector containing C57BL / 6-derived genomic DNA in advance.
  • a puromycin resistant and G418 sensitive strain can be obtained by introducing a targeting vector containing a puromycin resistance marker and containing a C57BL / 6-derived genomic DNA. In this strain, the G418 resistance gene was removed by homologous recombination between the targeting vector and the gene expressed in the specific cell and / or tissue, and a nucleic acid sequence encoding the desired protein instead.
  • the puromycin resistance gene in the targeting vector is derived from the Lox-P Puro plasmid described in the W00 / 00383 pamphlet, and contains Lox-P sequences at both ends in the forward direction. Therefore, the resistance gene can be removed from the targeted differentiation pluripotent cells by the method described in W00 / 00383 pamphlet.
  • the above-described targeting vectors and techniques and means for improving homologous recombination efficiency can be applied to all cells into which genes can be introduced, and are not limited to the production of chimeric animals.
  • the targeting vector and the technology for improving homologous recombination efficiency described in this specification can be used to destroy a desired gene. Can be used to introduce.
  • a host embryo of a non-human animal line lacking the specific cells and Z or tissue (hereinafter also referred to as a defective host embryo) is prepared. To do.
  • a defective host embryo when an immunoglobulin light chain gene is used as a control region, a B cell-deficient embryo (Toraizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 18: 722-727, 2000), T-cell receptor gene is used as a regulatory region.
  • mice the host embryo is used for the production of chimeras from CBA X C57BL / 6 F1-derived TT2 cells or TT2F cells (wild color, Yagi et al., Analyti cal Biochemistry, 214: 70-76, 1993). Desirable genetic background of c (white, Japan Marie Japan), ICR (white, Japan Marie Japan), or MCH (ICR) (white, Japan Marie Japan). Therefore, it is desirable to use, as a defective host embryo, a non-human animal line deficient in the specific cells and cells or tissues and a non-human animal embryo (for example, an 8-cell stage embryo) obtained by backcrossing these lines.
  • the host-deficient embryo produces a chimeric animal. It can be embryonic lethal as long as it can develop up to the blastocyst stage. Such embryonic lethal embryos have a probability of a quarter in principle due to mating between animals with heterozygous gene deletions, so obtain multiple embryos obtained by mating and follow the procedure below to obtain quinola. An animal is produced, and a host embryo that has a defective embryo is selected. This selection can be performed by Southern analysis, PCR analysis, etc. using DNA extracted from the body tissue of a mammal.
  • a chimeric non-human animal can be produced from a cell line by the method described in Shinichi Aizawa (supra). ⁇ More specifically, the pluripotency of gene transfer Cells are injected into the embryonic placental blastocyst or 8-cell stage embryo of the defective host embryo described in the item “2. Host embryo deficient in specific cells and Z or tissue” using a capillary tube or the like. This embryo placental cyst or 8-cell stage embryo is transplanted directly into the oviduct of a homozygous foster parent non-human animal, or one that has been cultured for one day to develop into a blastocyst is transplanted into the foster parent's uterus. Then, pups are obtained by raising and giving birth to temporary parents.
  • the contribution rate in hair color correlates with the contribution rate of pluripotent cells into which cells and / or tissues other than the above-mentioned deficient cells and Z or tissues are matched. Sometimes not.
  • the above-mentioned deficient cells and Z or tissue derived from the host embryo do not exist, but only those derived from transgenic pluripotent cells.
  • Recovery of defective cells and / or tissues in chimeric non-human animals due to the contribution of transgenic pluripotent cells is detected by FACS analysis (Fluorescence-Activated Cell Sorter), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), etc. Is possible.
  • Gene transfer Whether the inserted nucleic acid sequence (structural gene) is expressed in a cell and / or tissue derived from a pluripotent cell is determined by RT-PCR using the cell and Z or tissue-derived RNA (Kawasaki et al., AS ⁇ ⁇ ⁇ AS, 85: 5698-5702, 1988), Northern blot 3 ⁇ 4 (. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).
  • DNA encoding the nucleic acid sequence to be introduced (for example, structural gene) is appropriately modified, and a tag peptide that can be detected with an antibody is attached. If added, the expression of a gene introduced with an antibody against the tag peptide can be detected (POD-labeled anti-His 6 , Roche Diagnostics (Japan)).
  • the chimeric non-human animal produced as described above highly expresses the introduced nucleic acid sequence (eg, structural gene) in at least specific cells and Z or tissues. If the desired protein produced is a system that secretes blood, milk, etc., it can be used as a production system for useful proteins. In addition, when a protein with unknown function is highly expressed, the function of the protein can be elucidated from the findings associated with the high expression.
  • nucleic acid sequence eg, structural gene
  • mice in animal species other than mice (usi, hidge, pig, etc.) by combining animal individual preparation from somatic cell nuclear transfer embryos and gene targeting in somatic cells ( McCreath et al., Nature, 405: 1066-1069, 2000).
  • somatic cell nuclear transfer embryos and gene targeting in somatic cells McCreath et al., Nature, 405: 1066-1069, 2000.
  • transgenes can be inserted into or near Ig genes such as mice, tusks, hedges, and pigs to generate unfertilized eggs transplanted with fibroblast nuclei, and ES cells can be prepared from blastocyst stage embryos It is.
  • Chimeric non-human animals can be produced between this ES cell and the above B cell-deficient host embryo (Cibel li et al., Nature Biotechnol., 16: 642-646, 1998). It is possible to highly express secreted proteins using a similar expression system. By using large animals, it can be applied not only to gene function analysis but also to production of useful substances. According to the method described herein, a foreign DNA expression unit constructed to be controlled by the control region of a mouse or ushiimmunoglobulin gene was prepared by Kuro iwa et al. (Nat. Genet. 36: 775-80, 2004).
  • the exogenous DNA is highly expressed in the sera of cloned lone individuals prepared from the obtained genetically modified ushi fibroblasts according to the method described in Kuroiwa et al. (Nat. Genet. 36: 775-80, 2004). It is expected to do.
  • the method for producing a chimeric non-human animal of the present invention further selects a transgenic (Tg) animal having a heterologous nucleic acid sequence introduced by mating with a non-human animal of the same species. And mating males and females of this Tg animal to obtain Tg animal progeny having the transgene homozygously.
  • Tg transgenic
  • tissues or cells derived from any of the above chimeric non-human animals or their progeny can be obtained.
  • the cell or tissue contains a nucleic acid sequence encoding the desired protein in such a manner that expression of the desired protein is controlled by a control region of a gene expressed in the cell or tissue, and expresses the desired protein. It is something that can be done.
  • the tissues and cells include any tissues and cells as long as they are derived from a chimeric non-human animal or its progeny and can express a desired protein, for example, B cells, spleen, lymph Examples include organizations.
  • the tissues and cells can be collected and cultured by a technique known in the art, and whether or not the tissues and cells express a desired protein can also be confirmed according to a conventional technique. Such tissues and cells are useful for the production of hyperidoma and protein production described below.
  • Hybridomas can be obtained by fusing with proliferative tumor cells (eg, myeloma cells).
  • proliferative tumor cells eg, myeloma cells.
  • the production method of Hypridor can be based on, for example, the technique described in Ando Chiba (Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures, 1991, Kodansha Scientefik (Japan)).
  • mice having no autoantibody-producing ability derived from mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits or humans can be used, but strains obtained from mice are generally used.
  • Cells such as 8-azaguanine resistant mice
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • IMDM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the cells that can be used as the cells that express the desired protein encoded by the introduced nucleic acid sequence are plasma cells (ie, plasma cells) and lymphocytes that are precursor cells thereof, which can be obtained from any part of the individual. In general, it can be obtained from the spleen, lymph nodes, bone marrow, squash, peripheral blood, or a combination of these appropriately, but spleen cells are most commonly used.
  • the most commonly used method for fusing spleen cells expressing the desired protein encoded by the introduced nucleic acid sequence with myeloma is to use polyethylene dalycol, which has relatively low cytotoxicity and is easy to fuse.
  • This method is used. Specifically, this can be done as follows. Spleen cells and myeloma are thoroughly washed with serum-free medium (eg DMEM) or phosphate buffered saline (generally called PBS), and the ratio of spleen cells to myeloma is usually about 5: 1 to about 10 : Mix to 1 and centrifuge. Remove the supernatant, dissociate the precipitated cells, and mix with stirring.
  • serum-free medium eg DMEM
  • PBS phosphate buffered saline
  • a serum-free medium containing 50% (w / v) polyethylene glycol (molecular weight 1000-4000) is dropped. Then slowly add 10 ml serum-free medium and centrifuge. Discard the supernatant again, suspend the precipitated cells in normal medium (commonly called HAT medium) containing the appropriate amount of hypoxanthine 'aminopterin' thymidine and human interleukin-6, and distribute them to each wall of the culture plate. Note and incubate at 37 ° C for 2 weeks in the presence of 5% carbon dioxide. Supplement HAT medium as needed during culture.
  • the myeloma cells are 8-azaguanine resistant, ie hypoxanth
  • HGPRT guanine phosphoribosyltransferase
  • the non-fused myeloma cells and the fusion cells of myeloma cells cannot survive in a HAT-containing medium.
  • fusion cells between spleen cells, or hybridomas between spleen cells and myeloma cells can survive. Fusion cells between spleen cells have a lifetime. Therefore, by continuing the culture in the HAT-containing medium, only the hybridoma of spleen cells and myeloma cells survives.
  • the resulting hybridoma produces the desired protein encoded by the introduced nucleic acid sequence by screening by ELISA with an antibody specific for the desired protein encoded by the introduced nucleic acid sequence. A high-priority can be selected.
  • the present invention further includes producing a desired protein using any of the above chimeric non-human animals or their progeny, or the above tissues or cells, or the above-described hybridoma, and then recovering the protein.
  • a method for producing a desired protein is provided. More specifically, a chimeric non-human animal or its offspring is bred under conditions that allow expression of the nucleic acid sequence encoding the desired protein introduced, and then the protein that is the expression product is removed from the animal blood, It can be recovered from ascites.
  • tissue or cell derived from a chimeric non-human animal or its progeny, or an immortalized version thereof eg, a hybridoma immortalized by fusion with a myeloma cell
  • an immortalized version thereof eg, a hybridoma immortalized by fusion with a myeloma cell
  • the expression product can be recovered according to a known method such as centrifugation, and further, ammonium sulfate fractionation, partition chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography (for example, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Affinity chromatography, etc.), preparative thin layer chromatography, HPLC and the like can be purified by one or more combinations of known methods.
  • a known method such as centrifugation, and further, ammonium sulfate fractionation, partition chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography (for example, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Affinity chromatography, etc.), preparative thin layer chromatography, HPLC and the like can be purified by one or more combinations of known methods.
  • the present invention further provides a phenotype of the above-described chimeric non-human animal or its progeny such as a chimeric non-human animal prepared from a corresponding wild-type ES cell not containing a nucleic acid sequence encoding the desired protein.
  • a method for analyzing the in vivo function of a desired protein or a gene encoding the desired protein comprising comparing the phenotype and determining the difference between the phenotypes.
  • any trait appearing in the living body corresponding to gene transfer can be detected by a physicochemical method, and the in vivo function of the introduced nucleic acid sequence or protein can be identified.
  • Non-human animal blood is collected and analyzed by a hemocytometer. By comparing the measured blood concentrations of leukocytes, erythrocytes, platelets, etc.
  • Immunoglobulin is one of the most produced proteins secreted in serum. For example, in humans, it accounts for 10-20% of serum protein, and its concentration reaches 10-100 mg / ml. Ig is produced in large quantities in B cells, mainly plasma cells that are terminally differentiated, but high transcriptional activity at the Ig locus, mRNA stability, plasma cell functions specialized for protein secretion, etc. Various factors contribute to the high level expression of Ig. Furthermore, in adults, B cells develop in the bone marrow, mature, and migrate to systemic lymphoid tissues such as the spleen, small intestine Peyer's patch, and lymph nodes, so the introduction of B cells produced under the control region of the Ig gene.
  • nucleic acid sequence for example, a structural gene
  • the transgene insertion site for efficient expression of the transgene may be the Ig light chain, preferably the / C light chain.
  • the transgene insertion site for efficient expression of the transgene may be the Ig light chain, preferably the / C light chain.
  • 95% of mouse immunoglobulins contain a kappa light chain and there is only one constant region gene.
  • the light chain is 5%, and there are 4 different genes, one of which is used.
  • In the heavy chain there are a total of 7 constant regions, ⁇ , (4 types), ⁇ , and ⁇ . In general, it is preferable to use the ⁇ chain in consideration of the insertion of the transgene at one place.
  • the further introduced nucleic acid sequence is expressed under the condition that a functional Ig light chain is produced.
  • the chimeric non-human animal of the present invention or its progeny includes a promoter portion of the above gene in the vicinity of the immune globulin light chain gene, and further, a nucleic acid sequence (that is, a transgene) encoding a desired protein is arranged downstream thereof. It is preferable that the gene expression unit thus obtained is contained on the genome.
  • a targeting vector In order to modify the genome of an animal so that it contains a promoter part of the above gene in the vicinity of the immunoglobulin chain and further contains a nucleic acid sequence encoding the desired protein (ie, a transgene), a targeting vector And a nucleic acid sequence encoding the desired protein is inserted into this vector DNA.
  • a CK P2 targeting vector As this vector, a CK P2 targeting vector (see Example 12 described later) is preferable.
  • the targeting vector contains the promoter part of the above gene in the vicinity of the immune globulin light chain gene, and further, the insertion site of the nucleic acid sequence for introducing the nucleic acid sequence (for example, transgene) encoding the desired protein downstream thereof.
  • a DNA cDNA, genomic DNA
  • a translation promoting sequence such as a Kozak sequence can be preferably arranged upstream of the initiation codon.
  • a drug resistance gene marker preferably a puromycin resistance gene, may be inserted in advance at the position where the foreign DNA is inserted.
  • the target gene is located in the vicinity of the Ig ⁇ constant region.
  • Transformation of non-human ES cells with the targeting vector can be performed by the method described in Shinichi Aizawa (supra). Similar to the method described in PCT international application W0 00/10383 pamphlet filed by the present applicant (published internationally on March 2, 2000), puromycin-resistant clones were picked up, genomic DNA was prepared, Homologous recombinants are identified by analytical methods.
  • the puromycin resistance gene in the targeting vector is derived from the Lox-P Puro plasmid described in the W00 / 00383 pamphlet, and contains a Lox-P sequence at both ends in the forward direction. Therefore, the resistance gene can be removed from the gene-introduced ES cell by the method described in WO 00/10383 pamphlet.
  • a defective host embryo for ES cell injection may be a non-human that is homologous to the immunoglobulin heavy chain gene disruption described in WO 00/10383. It is preferred to use animal strains.
  • the prepared gene-transferred ES cells are injected into the embryonic placental cyst of the defective host embryo or the 8-cell stage embryo using a capillary tube or the like. This embryo placental cyst or 8-cell stage embryo is transplanted directly into the oviduct of a homozygous foster parent non-human animal, or one that has been cultured for one day to develop into a blastocyst is transplanted into the foster parent's uterus.
  • a foster animal is obtained by breeding and giving birth to a temporary parent.
  • mature B lymphocytes derived from host embryos do not exist, but only those derived from transgenic ES cells. This is due to the absence of mature B lymphocytes (B220 positive) in immune globulin heavy chain knockout nonhuman animals used as host embryos (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad). .
  • Whether or not the inserted nucleic acid sequence is expressed in the ES cell-derived B cells depends on whether or not a site-specific recombination reaction occurs in the Ig light chain gene of the inserted allele (also called an allele). ing. In other words, if the Ig light chain gene of the insertion allele has been successfully recombined and the mRNA encodes a functional light chain, the inserted nucleic acid sequence (for example, a structural gene) that is present on the mRNA is also present.
  • B cells appear in fetal liver tissue from around day 12 of embryonic development, but the place of development moves to the bone marrow with birth.
  • B cells are mainly in the early stages of development, that is, cells that express membrane-type immunoglobulin receptors. Compared to adults, the number of B cells themselves is small, and in the cells that mainly express membrane-type Ig, the amount of mRNA encoding the immunoglobulin itself is small. It is thought that there are few.
  • Antibody production increases from the weaning period (3 weeks of age), but is thought to be due to an increase in the terminal differentiation stage of plasma cells.
  • B cells migrate to lymphoid tissues such as spleen, lymph nodes, and small intestine Peyer's patches to express antibodies and inserted nucleic acid sequences.
  • the desired protein encoded by the inserted nucleic acid sequence like immunoglobulins, is secreted into the blood and lymph and spread throughout the body.
  • the expression of the introduced nucleic acid sequence in B cells is confirmed as follows.
  • the expression of mRNA by the introduced gene is detected, for example, by RT-PCR or Northern blotting using RNA derived from tissues or cell populations containing B cells such as spleen and peripheral blood nucleated cells. Expression at the protein level can be detected using an enzyme immunoassay using a chimeric mouse serum, Western blotting, or the like if a specific antibody against the desired protein encoded by the introduced nucleic acid sequence already exists.
  • the DNA encoding the introduced nucleic acid sequence is appropriately modified and a tag peptide that can be detected with an antibody is added, the expression of the introduced nucleic acid sequence can be detected with an antibody against the tag peptide.
  • the chimeric non-human animal obtained as described above highly expresses a nucleic acid sequence encoding a desired protein efficiently and reliably introduced. This high efficiency, as mentioned above, is mainly based on the following points:
  • Immunoglobulin expression is very low in the early stages of development, and shows an explosive increase after the weaning period.Therefore, even when a gene whose high expression leads to embryonic lethality is introduced, the function in adults is suppressed. Can be considered.
  • pBluescriptllSK (-) (US STRATAGENE) was digested with restriction enzymes Sall and Hindlll (Roche), annealed with the following synthetic oligos, and introduced by ligation reaction using ligation kit ver. 2 (Takara Bio). DNA was prepared from the transformant obtained by introducing it into Escherichia coli DH5 (3), and the inserted fragment was sequenced.
  • S / PFN / Hd-S TCGACTTAATTAAGGCCGGCCCTAGCTAGCA (SEQ ID NO: 1)
  • S / PFN / Hd-AS AGCTTGCTAGCTAGGGCCGGCCTTAATTAAG (SEQ ID NO: 2)
  • MUSIGKVR1 accession K02159 obtained from GenBank
  • the upstream genome sequence was obtained from the UCSC mouse genome database.
  • PCR primers were designed to amplify the promoter region and the signal sequence containing introns.
  • the recovered PCR amplified fragments were enzymatically digested with Fsel and Pacl (NEB), and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Doc QIAGEN) according to the package insert.
  • the following DNA was synthesized from the genomic DNA sequence near the mouse Ig kappa gene obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • Amplified fragments were collected using Gel Extraction Kit (Do QIAGEN) according to the package insert.
  • the recovered PCR amplified fragments were enzymatically digested with Kpnl and Xhol, and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • pBluescriptllSK (-) (US STRATAGENE) was digested with Kpnl and Xhol, and 0.8% The recovered DNA fragment was inserted into a product that had been separated and purified from a galose gel and then terminally dephosphorylated using calf small intestine-derived alfa phosphatase, and introduced into Escherichia coli DH5. DNA was prepared from the obtained transformant, and the inserted fragment was sequenced. A clone without mutation by PCR was selected, digested with Kpnl and Xhol, and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments (5'enhancer fragments) were recovered from the recovered gel using QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • the following DNA was synthesized from the genomic DNA sequence near the mouse Ig kappa gene obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • the enzyme-treated fragments were collected using (Doi QIAGEN) according to the package insert.
  • pBluescriptllSK (-) (US STRATAGENE) was digested with Hindlll and BamHI, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then terminally dephosphorylated using calf intestine-derived al force phosphatase. It was inserted and introduced into E. coli DH5a. DNA was prepared from the obtained transformant, and the inserted fragment was sequenced. Clones without mutation due to PCR 'were selected, digested with Hindlll and BamHI, and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. QIAquick from recovered gel Enzyme-treated fragments (3, enhancer fragments) were recovered using Gel Extraction Kit (Do QIAGEN) according to the package insert.
  • the CkP2 KI vector was enzymatically digested with EcoRI and Hindlll, and an approximately 440 bp fragment was separated and recovered on a 0.8% gel.
  • the enzyme-treated fragment was recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Doc QIAGEN) according to the attached document, and then subjected to blunting using Blunting high (Toyobo) to obtain a cpolyA fragment.
  • the above pPSs3.8 from 1 and 2 were enzymatically digested with Xhol and Kpnl, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then terminally dephosphorylated using calf small intestine-derived alphophosphatase.
  • the inserted 5 ′ intron enhancer fragment was inserted and introduced into E. coli DH5a. DNA was prepared from the obtained transformant, and the ligated portion was sequenced.
  • the above 17 pPSsE2 was enzymatically digested with Hindlll, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then subjected to blunting using Blunting high (Toyobo). To those ends dephosphorylated with E. coli C75-derived Al force Li phosphatase, the 1 inserts the recovered / c poly A fragment in one 5, which was introduced into E. coli DH5 a. DNA was prepared from the obtained transformant, and the ligated portion was sequenced to select a clone inserted in the forward direction.
  • the recovered PCR amplified fragments were digested with Sfol and Fsel (NEB) and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were collected from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert. The recovered PCR amplified fragments were enzymatically digested with Sfol and Fsel (NEB) and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • the upstream genome sequence was obtained from the UCSC mouse genome database.
  • a PCR primer that amplifies the promoter region and a signal sequence containing introns.
  • the recovered PCR amplified fragments were enzymatically digested with Fsel and Pacl (NEB) and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Germany) according to the attached document.
  • the above 19 vector was enzymatically digested with Xhol and Kpnl, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then terminally dephosphorylated using calf small intestine-derived alphophosphatase.
  • DNA was prepared from the obtained transformant, and the ligated portion was sequenced.
  • the CkP2 KI vector was digested with Hindlll and Sail enzymes, and a fragment of about 210 bp was separated and recovered on a 0.8% gel.
  • the enzyme-treated fragments were collected from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Doc QIAGEN) according to the attached document, and then subjected to blunting using Blunting high (Toyobo).
  • the above 2-4 pNPs5.4 were enzymatically digested with Pacl and Sfol, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then subjected to blunting using Blunting high (Toyobo).
  • the P2-promoter fragment of 3-1 above was inserted into the one that had been terminally dephosphorylated using Alforce phosphatase derived from E. coli C75 and introduced into E. coli DH5a. DNA was prepared from the resulting transformant, and the ligated portion was sequenced to select a clone inserted in the forward direction.
  • the recovered PCR amplified fragments were enzymatically digested with BamHI and Xhol (Roche), and separated and recovered on a 0.8% agarose gel.
  • the enzyme-treated fragments were collected from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert, and then subjected to blunting using Blunting high (Toyobo).
  • PCks4.9 of 3-2 above was enzymatically digested with Fsel, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then subjected to blunting using Blunting high (Toyobo).
  • the above 3-3 human erythropoietin DNA fragment was inserted into E. coli C75-derived alphophosphatase and subjected to terminal dephosphorylation, and introduced into E. coli DH5.
  • DNA was prepared from the obtained transformants, the ligation sequence was performed, and a clone inserted in the forward direction was selected to obtain a vector for pCks hEPO in vitro (Fig. 3).
  • Transfection Reagent (US STRATAGENE) 6ul mixed with serum-free RPMI1640 medium lOOul, incubated at room temperature for 5 minutes, and prepared to 200ng / ul with sterile water pPSs hEPO in vitro vector, pNPs hEPO in vitro vector, pCks hEPO for in vitro 5ul of vector was added and incubated at room temperature for 10 minutes to form a complex.
  • Trans- full Nik Chillon reagent one vector complex was added dropwise to the cells seeded on 6 ⁇ El plates, 37 ° C, after 4 hours at 5% C0 2 under 6., the RPMI1640, 20% FBS 1. 1ml was added.
  • Example 5 After 24 hours, 1 ml of cultured cells was collected for RNA recovery. The culture supernatant 48 hours after the transfection was collected and subjected to human EP0 ELISA. DIMRIE-C Reagent (Invitrogen, USA) could be used in the same way as an introduction reagent for transfusion.
  • Example 5 DIMRIE-C Reagent (Invitrogen, USA) could be used in the same way as an introduction reagent for transfusion.
  • hEP0-RT FW5 GGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTC (SEQ ID NO: 15)
  • CkpolyA R2 CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (SEQ ID NO: 16)
  • ⁇ -actin RT-PCR was performed using Mouse, 8-actin RT-PCR Primer Set (Toyobo, Japan).
  • the reaction solution was prepared according to the LA-Taq (Japan Takara Bio) package insert with, 50 mu 1 reaction above two primers each 10 P mol in, cDNA was added and after incubation 94 ° C3 minutes Amplification was performed for 26, 29, and 32 cycles at 94 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 1 minute, followed by electrophoresis on a 2% agarose gel ( Figure 4).
  • the obtained results showed that the pNPs and pPSs types are more advantageous for expression at the transcription level than the pCks type.
  • LoxP-Neo The pLoxP-STneo plasmid described in W00 / 00383 Panflet (supra) was digested with Xhol to obtain a Neo resistance gene (LoxP-Neo) having LoxP sequences at both ends. Both ends of LoxP-Neo were smoothed using T4 DNA polymerase to obtain LoxP-Neo-B.
  • LinkAl TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC (SEQ ID NO: 1 7)
  • LinkA2 TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC (SEQ ID NO: 1 8)
  • LinkBl GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG (SEQ ID NO: 1 9)
  • LinkB2 AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC (SEQ ID NO: 20)
  • a reaction solution obtained by treating pBluescript II SK (-) with restriction enzymes Sail and Xhol was extracted with phenol / chloroform and ethanol precipitated.
  • LinkAl and LinkA2 were synthesized to add new restriction enzyme sites Nrul, SgrAI and Ascl to the plasmid.
  • the linker consisting of these two oligo DNAs was inserted into a restriction enzyme-treated plasmid and introduced into E. coli DH5. DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLA was obtained.
  • LinkBl and LinkB2 were synthesized to add Pacl, Fsel and Sail.
  • a linker consisting of these two oligo DNAs was inserted into a plasmid treated with a restriction enzyme and introduced into Escherichia coli DH5a.
  • DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLAB was obtained. After BlueLAB was digested with EcoRV, the reaction solution was extracted with phenol / formaldehyde, ethanol precipitated, LoxP-Neo-B was inserted, and then introduced into E. coli DH5. DNA was prepared from the resulting transformant, and the plasmid pBlueLAB-LoxP-Neo was obtained.
  • pMClDT-A (Lifetech Oriental, Japan) was applied to 0.8% agarose gel after extinguishing Xhol and Sail, and about 1 Kb band was separated and recovered, and attached using QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) The DT-A fragment was recovered according to the document.
  • the following DNA were synthesized from the genomic DNA sequence near the mouse RS element gene obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • the following DNA was synthesized from the genomic DNA sequence near the mouse RS element gene obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • RS3 'FW2 TTGGCGCCCTCCCTAGGACTGCAGTTGAGCTCAGATTTGA (SEQ ID NO: 2 3)
  • RS3' RV3 CCGCTCGAGTCTTACTGTCTCAGCAACAATAATATAAACAGGGG (SEQ ID NO: 2 4)
  • the recovered PCR amplified fragments were enzymatically digested with Ascl and Xhol, and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. Enzyme-treated fragments were recovered from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Doc QIAGEN) according to the package insert.
  • the genomic fragment prepared in (3) was inserted and then introduced into Escherichia coli XL10-Gold Ultracompetent Cells (STRATAGENE, USA). DNA was prepared from the obtained transformant, and the nucleotide sequence of the ligated portion was confirmed.
  • mice electronics Toro poration RS element targeting tee ring vector pBlueRS- LoxP- Neo- DT-A- 3 ' K0-5′ ⁇ 0-Notl was prepared.
  • RS5 'Southern RV2 GTCATTAATGGAAGGAAGCTCTCTA (SEQ ID NO: 2 6)
  • RS3 'Southern FW1 TCTTACTAGAGTTCTCACTAGCTCT (SEQ ID NO: 2 7)
  • RS3 'Southern RV2 GGAACCAAAGAATGAGGAAGCTGTT (SEQ ID NO: 2 8)
  • the reaction mixture was prepared in accordance with the instructions attached using Takara Z Taq (Takara Shuzo, Japan), 50 / z L reaction above two primers each 10 ⁇ ⁇ 1 during the clone number RP23-434I BAC-derived DNA as ⁇ And then incubate at 94 ° C for 2 minutes, amplify for 25 cycles with 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 1 minute as one cycle, and the resulting 600-mer amplified fragment is 0.8% Separated and recovered on an agarose gel. From the collected gel, the 3 ′ K0-probe was recovered using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • Mouse ES cells can usually be established by the method described below. Embryos obtained by mating male and female mice 2.5 days after fertilization are collected, cultured in vitro in an ES cell medium, and embryos that have developed to blastocysts are isolated from the cultured embryos. Then, the embryo is seeded and cultured in a feeder cell medium, and the cell mass of the embryo grown from the cultured embryo in an ES-like form is dispersed using an ES cell medium containing trypsin. The cells are cultured using feeder cell culture medium, and further subcultured using ES cell culture medium to isolate proliferating cells.
  • the TT2F cells were cultured using the G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA) according to the method described (Shinichi Aizawa, supra). First, the proliferated TT2F cells were treated with small ribsin,
  • the suspension was suspended in HBS at 3 ⁇ 10 7 cells / ml. After that, 0.5ral cell suspension was mixed with 10 g of vector DNA, and then erecting was performed with Gene Pulser Cuvette (electrode distance: 0.4 cm, BioRad, USA) (volume: 960 ⁇ ?, Voltage:
  • Homologous recombinants were detected using a DNA fragment (3 ′ KO-probe, see Example 9) located downstream of the 3 ′ homology region as a probe. In wild-type TT2F cells, one band (about 5.7 Kb) was detected by EcoRI digestion. In homologous recombinants, two bands
  • these clones were deleted from the nearby chromosomal region containing the mouse RS element, and replaced with a neomycin resistance gene (including restriction sites from the targeting vector at both ends). is there.
  • a neomycin resistance gene including restriction sites from the targeting vector at both ends.
  • Embryo obtained by mating of homozygous male and female individuals raised in a clean environment was used as a host for the production of chimeric mice in this example.
  • functional B lymphocytes in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells.
  • the immunoglobulin ⁇ chain gene knockout mouse described in the report of Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722-7, 2000) ) Individuals that had been backcrossed to the strain three or more times were used for host embryo preparation.
  • the puromycin-resistant mouse ES cell line (# 3 2) obtained in Example 10 above was launched from a frozen stock and crossed with male and female mice of the above-described immunoglobulin ⁇ chain knockout mouse homozygote. The resulting 8-cell stage embryos were each injected with 8 to 10 embryos per embryo.
  • ES medium Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan
  • ICR pseudopregnancy treatment
  • Example 1 2 As a result of transplanting a total of 4 80 embryo embryos prepared using # 3 2 of Example 10, 80 offspring chimeric mice were born. Chimera individuals are judged based on whether the ES cell-derived wild color (dark brown) is observed in the white color derived from the host embryo. Of the 80 animals born, there were 48 individuals with apparently wild-colored hair color, ie, ES cells contributed. Comparative experiments of human EP0 gene transcription levels performed in Example 3 2 below, EP0 concentration comparison experiments in serum performed in Example 33 below and peripheral blood performed in Example 34 below In the blood cell analysis experiment, the chimeric mouse obtained in Example 11 was used as a control individual. Example 1 2
  • Mouse immunoglobulin power chain Constant region downstream of the mouse immunoglobulin Brin ⁇ chain promoter (P2 promoter), restriction enzyme recognition sequence (Sail, Fsel, Nhel recognition sequence), mouse immunoglobulin ⁇ chain Produce genomic fragments with poly A signal region and puromycin resistant gene expression unit introduced in the order listed above did. The method is specifically described below.
  • igkc2 atgaattcctaacactcattcctgttgaagctcttgac (Tatsumi column number ⁇ "3 0)
  • pBluescript is a DNA fragment derived from ⁇ clones containing each primer lOpmol and Ig light chain C fc-JK SKIK +) (Toyobo, Japan) Crawled (W0 00/10383 pan fret) Add 25 ng and incubate at 94 ° C for 1 minute, then 94 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 3 minutes for 1 cycle 25 Cycle amplified.
  • the resulting reaction solution was extracted with phenol Z-form, precipitated with ethanol, digested with EcoRI and Xhol, DNA fragments were separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and GeneClean II (BiolOl, USA) was used.
  • the target fragment was recovered and amplified fragment A was obtained.
  • the following DNA was synthesized from the mouse IgG / c gene sequence obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • igkc3 atgaattcagacaaaggtcctgagacgccacc (SEQ ID NO: 3 1 j
  • igkc4 atggatcctcgagtcgactggatttcagggcaactaaacatt (Tatsumi column 3 2;
  • Lox-P Puro plasmid (W00 / 00383 pamphlet) was digested with EcoRI and Xhol, and the ends were blunted using T4 DNA polymerase. 0.8% agarose gel DNA fragments were separated by electrophoresis, and DNA fragments containing ⁇ -puromycin resistance gene were recovered using Gene Clean II (BiolOl, USA). The obtained ⁇ -puromycin resistance gene fragment was inserted into a plasmid in which plgC c AB was extinguished with Sail and blunt-ended, and introduced into E. coli DH5. DNA was prepared from the obtained transformant, the base sequence of the ligation part was confirmed, and the plasmid plgCfc ABP was obtained.
  • the following DNA was synthesized from the IRES gene sequence derived from encephalomyocarditis virus (encephalomyocarditis virus) obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • esIRESRV atgaattcgtcgacttgtggcaagcttatcatcgtgtt (3 4)
  • DNA was prepared from the obtained transformant, the nucleotide sequence was confirmed, and plasmid IRES-Sal / pGE was obtained.
  • This plasmid was digested with EcoRI, DNA fragments were separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and the target fragment was recovered using Gene Clean II (BiolOl, USA).
  • the obtained IRES gene was inserted into a plasmid obtained by digesting plgCKABP with EcoRI and introduced into Escherichia coli ⁇ .
  • DNA was prepared from the obtained transformant, the nucleotide sequence of the ligation part was confirmed, and the plasmid plgC ⁇ ABPIRES was obtained.
  • the immunoglobulin gene light chain / targeting targeting vector plasmid described in the W00 / 00383 pamphlet was digested with SacII and then partially digested with EcoRI.
  • the remaining 14.6 Kb DNA excised from the LoxP-PGKPuro part was separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and recovered using Gene Clean II (BiolOl, USA). Sail recognition sequences were introduced by inserting the following synthetic DNA into the obtained DNA.
  • Sallplus agtcgaca (SEQ ID NO: 3 5)
  • Sallminus aatttgtcgactgc ( ⁇ Self column number d ⁇ )
  • the obtained plasmid was introduced into Escherichia coli DH5, DNA was prepared from the obtained transformant, and the plasmid pACf Sal was obtained.
  • the plgCK ABPIRES plasmid obtained in (3) above is digested with Xhol, the DNA fragments are separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and C / C-IRES-loxP using GeneClean II (BiolOl, USA). -A DNA fragment containing the puromycin resistance gene was recovered.
  • the pACkSal prepared in (4) above was digested with Sail, and then the DNA fragment was inserted into the one that was terminally dephosphorylated using Escherichia coli alkaline phosphatase, and introduced into Escherichia coli DH5a. DNA was prepared from the obtained transformant, the nucleotide sequence of the ligation part was confirmed, and plasmid ⁇ was obtained.
  • plgCic AIRES fragment The plgC ⁇ ABPIRES plasmid obtained in (3) above is partially digested with EcoRI and Bglll, the DNA fragments are separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and the IRES portion is deleted using Gene Clean II (BiolOl, USA). The obtained DNA fragment (plgC ⁇ ⁇ IRES fragment) was recovered.
  • the following DNA was synthesized from the mouse Ig ⁇ promoter region gene sequence obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • P2F CCCAAGCTTTGGTGATTATTCAGAGTAGTTTTAGATGAGTGCAT (SEQ ID NO: 3 7)
  • P2R ACGCGTCGACTTTGTCTTTGAACTTTGGTCCCTAGCTAATTACTA (SEQ ID NO: 3 8)
  • the Hind III recognition sequence was added to the P2F, the 5th primer, and the Sail recognition sequence was added to the P2R, the 3 'primer.
  • the mouse genomic DNA was used as a cage, and the DNA fragment amplified by KODplus (Toyobo, Japan) was extracted with phenol chloroform and recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered DNA fragments were digested with Hind III and Sail, the DNA fragments were separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and recovered using Gene Clean II (BiolOl, USA). After digestion with Hind III and Sail, the recovered amplified fragment was inserted into the pBluescript IIKS-vector (Stratagene, USA), which had been terminally dephosphorylated using E.
  • the following DNA was synthesized from the mouse IgC kappa polyA region gene sequence obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • GAAGATCTCAAGTGCAAAGACTCACTTTATTGAATATTTTCTG (SEQ ID NO: 40) Sail, Fsel, and Nhel recognition sequences were added to the PPF, which is the 5 ′ primer, and Bglll recognition sequences were added to the PPR, which was the 3 ′ primer.
  • KOD plus Toyobo, Japan
  • the recovered DNA fragment was digested with Sail and Bglll, the DNA fragment was separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and recovered using Gene Clean II (BiolOl, USA).
  • the following DNA was synthesized from the mouse IgC / c polyA region gene sequence obtained from GenBank (NCBI, USA).
  • TPF GGAATTCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC (SEQ ID NO: 4 1)
  • TPR CCCAAGCTTGCCTCCTCAAACCTACCATGGCCCAGAGAAATAAG (SEQ ID NO: 4 2)
  • DNA fragment A was inserted into plgC / c AIRES fragment that had been terminally dephosphorylated using E. coli alkaline phosphatase, and introduced into E. coli DH5.
  • DNA was prepared from the obtained transformant, it was confirmed at the level of the base sequence that DNA fragment A was inserted, and plgC ⁇ IRES ProA plasmid containing the DNA fragment A gene sequence was obtained.
  • the DNA fragments were separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and the upstream genomic region of IgCfc, IgC K ;, DNA fragment A using GeneClean II (BiolOl, USA) DNA fragments composed of Lox-PPuro fragments were collected.
  • the recovered DNA fragment was inserted into pAC / c Sall that had been terminally dephosphorylated using Escherichia coli alkaline phosphatase, and introduced into Escherichia coli XL10-GOLD (Stratagene, USA).
  • DNA is prepared from the obtained transformant, and it is confirmed at the base sequence level that a DNA fragment composed of the IgC ⁇ upstream genomic region, IgC K , DNA fragment A, and Lox-P Puro fragment is inserted. C / cP2H plasmid was obtained.
  • 5GF ATAAGAATGCGGCCGCCTCAGAGCAAATGGGTTCTACAGGCCTAACAACCT (SEQ ID NO: 43) 5GR:
  • Notl recognition sequence was added to 5GF, 5 'primer, and EcoRI recognition sequence was added to 5GR, 3' primer.
  • DNA fragments amplified by KOD plus (Toyobo, Japan) were extracted with phenol chloroform and then recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered DNA fragment was digested with Notl and EcoRI, the DNA fragment was separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and recovered using Gene Clean 11 (BiolOl, USA).
  • the recovered amplified fragment was inserted into pBluescript IIKS-vector (Stratagene, USA), which had been terminally dephosphorylated using E. coli alfa phosphatase, and introduced into E. coli DH5a.
  • hEPO Np CCGCTCGAGCGGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG (SEQ ID NO: 4 5)
  • hEPO Rp CCGCTCGAGCGGTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA (SEQ ID NO: 4 6)
  • pBluescriptl lSK (-) (US STRATAGENE) was digested with Xhol, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then terminally dephosphorylated using calf small intestine-derived alphophosphatase. It was inserted and introduced into E. coli DH5. DNA was prepared from the obtained transformant, and the inserted fragment was sequenced. A clone without mutation by PCR was selected, digested with Xhol, and separated and recovered on a 0.8% agarose gel. From the recovered gel, the human E. coli poetin DNA fragment was recovered using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • pCkP2 hEPO KI vector 60 / ig was added with spermidine (1 ⁇ pH7.0 US Sigma) buffer (Roche Diagnostics, Japan, H buffer for restriction enzymes) at 37 ° C using Notl. After time digestion and phenol / chloroform extraction, 2.5 volumes of 100% ethanol and 0.1 volume of 3 M sodium acetate were added and stored at ⁇ 20 ° C. for 16 hours. The vector single-stranded with Notl was collected by centrifugation, and then sterilized with 70% ethanol. 70% ethanol was removed in a clean bench and air-dried for 1 hour. 0. 5 ⁇ g / L of HBS solution to a DNA solution added and stored at room temperature for one hour and subjected to preparation of p CKP2 hEPO KI vector for Elec Toroporeshiyon.
  • the pCkP2 hEPO KI vector prepared in Example 13 was obtained using the restriction enzyme Notl (Nippon Takara Shuzo) to obtain the MAVS ES cell line in which human EPO-cDNA was inserted downstream of the immunoglobulin fc light chain gene by homologous recombination. Linearization and introduction into RS element targeting mouse ES cells according to established methods (Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan).
  • RS element Targeting 'Mouse ES cell culture method is the same as described above (Shinichi Aizawa, supra), and vegetative cells were treated with mitomycin C (Sigma, USA) G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) ) Was used. First, the grown RS element targeting 'mouse ES cells were trypsinized, 3
  • the medium was replaced with ES medium containing 0.8 / g / ml puromycin (Sigma, USA). Pick up a total of 24 of the colonies that formed after 7 days, grow each to a confluent in a 24-well plate, and 2/3 of that to 0.2 ml of storage medium (FBS + 10% DMS0 (US Sigma) and stored at -80 ° C. The remaining 1/3 was seeded on a 12-well gelatin-coated plate, cultured for 2 days, and genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Gentra System, USA).
  • Embryos obtained by mating of the homozygous male and female individuals raised in a clean environment were used as hosts for the production of chimeric mice performed in this Example.
  • functional B lymphocytes in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells.
  • MCH ICR
  • ICR immune globulin ⁇ chain gene knock ⁇ ⁇ preparative mice
  • the CkP2 hEP0 mouse ES cell line (# 57, 69) obtained in Example 15 above and confirmed to contain human EP0-cDNA downstream of the immunoglobulin ⁇ chain gene was established from a frozen stock. They were injected into 8 cell stage embryos obtained by mating male and female mice of the above immunoglobulin / i chain knockout mouse homozygote, each with 8-10 embryos. In ES medium (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) After culm culture and development to blastocysts, temporary parents MCH ( About 10 infection embryos per uterus on one side were transplanted into the uterus of ICR) mice (Clea Japan, Japan).
  • Ascl top l inker GGCCAGGCGCGCCTTGC (SEQ ID NO: 4 7)
  • Ascl bottom linker GGCCGCAAGGCGCGCCT (SEQ ID NO: 4 8) After digesting pCkP2 KI vector with restriction enzyme Notl (Roche), separating and purifying from 0.8% agarose gel, Ascl linker was introduced by ligation reaction using ligation kit ver. 2 (Takara Bio). did. DNA was prepared from the transformant obtained by introducing it into Escherichia coli XL10-Gold Ultracorapetent Cells (US STRATAGENE), and the nucleotide sequence of the inserted fragment was confirmed.
  • Pac-Nhe-Fse S TAAGGGCTAGCTAGGGCCGG (SEQ ID NO: 4 9)
  • Pac-Nhe-Fse AS CCCTAGCTAGCCCTTAAT (SEQ ID NO: 50)
  • PCkpAP2 from 4 above was digested with restriction enzymes HindIII and Nhel (Roche). A fragment of about 4 kb was recovered from an 0.8% agarose gel. The following synthetic oligos were annealed and introduced by ligation reaction using ligation kit ver. 2 (Takara Bio, Japan). SPFN1 inker-S: AGCTGTCGACTTAATTAAGGCCGGCCG (SEQ ID NO: 5 3)
  • SPFNl inker-AS CTAGCGGCCGGCCTTAATTAAGTCGAC (SEQ ID NO: 5 4)
  • the above 5 pCkpAMCS was digested with restriction enzymes Hpal and Nhel (Roche), and an approximately 700 bp fragment containing Ck-polyA-MCS was recovered from 0.8% agarose gel.
  • pCkP2 + As KI was digested with the restriction enzyme Hpal-Nhel (Roche), and 19.6 kb was recovered from 0.8% agarose gel, and then subjected to terminal desalting using E. coli-derived alphophosphatase (Takara Bio, Japan). Oxidized.
  • the above-mentioned approximately 700 bp fragment was introduced by ligation reaction using ligation kit ver. 2 (Takara Bio, Japan). DNA was prepared from the transformant obtained by introducing it into Escherichia coli XL10-Gold Ultracorapetent Cells (STRATAGENE, USA); the base sequence of the ligation part was confirmed.
  • the pNP hEPO KI vector prepared in Example 18 was used as a restriction enzyme Notl (Japan Takara Shuzo). And then introduced into RS elements, targeting, and mouse ES cells according to established methods (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan).
  • Mouse ES cell culture method is the same as the method described by Shinichi Aizawa (supra), and vegetative cells were treated with mitomycin C (US GF). ) was used.
  • the grown RS element targeting mouse ES cells are trypsinized and suspended in HBS to 3 x 10 7 Zml, then 0.5 ml of the cell suspension is added to 10 ⁇ g It was mixed with vector DNA and electroporated with a gene pulser cuvette (electrode distance: 0.4 cm, BioRad, USA) (capacity: 960 ⁇ , voltage: 250 V, room temperature).
  • the electroporated cells were suspended in 10 ml of ES medium (Shinichi Aizawa, supra) and seeded on one 100 mm tissue culture plastic petri dish (Falcon, US Dickinson, USA) previously seeded with feeder cells. After 36 hours, the medium was replaced with ES medium containing O.S g / ml of pipmycin (Sigma, USA). Pick up a total of 24 of the colonies that occurred 7 days later and play each with 24 holes 1 2/3 of the suspension was suspended in 0.2 ml of storage medium (FBS + 10% DMS0, US Shimada) and stored at ⁇ 80 ° C.
  • ES medium Shinichi Aizawa, supra
  • tissue culture plastic petri dish Falcon, US Dickinson, USA
  • genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Gentra System, USA). These puromycin RS element targeting mouse ES cell genomic DNA was digested with restriction enzyme EcoRI (Nippon Takara Shuzo) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, Southern blotting was performed, and the DNA fragment (Xhol ⁇ ) of the Ig light chain J ⁇ -C ⁇ genomic DNA used in the invention described in WO 00/10383 pamphlet (see Example 48) was used.
  • Immunoglobulin / chain gene knockout homozygotes lack functional B lymphocytes and do not produce antibodies (Kitamura et al., Nature, 350: 423-426, 1991). Embryos obtained by mating of the homozygous male and female individuals raised in a clean environment were used as hosts for the production of chimeric mice performed in this Example. In this case, functional B lymphocytes in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells. In this example, the immunoglobulin i-chain gene knockout mouse described in the report of Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722-7, 2000) was used for MCH (ICR) (Japan Claire, Japan). ) Individuals that had been backcrossed to the strain three or more times were used for host embryo preparation.
  • the NP hEPO mouse ES cell line (# 10) confirmed to be inserted was launched from the frozen stock, and they were obtained by mating male and female mice of the above immunoglobulin ⁇ chain knockout mice homozygous. Each cell embryo was injected with 8-10 cells per embryo. After overnight culture in ES medium (Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) to develop blastocysts, 2.5 days after treatment with pseudopregnancy MCH ( About 10 injection embryos per one eclampsia were transferred to the uterus of ICR) mice (Clea Japan, Japan).
  • the pPSs hEPO in vitro vector of Example 1 was enzymatically digested with Sail and Fsel, and an approximately 1.3 kb fragment was separated and purified from 0.8% agarose gel, and then pCkP2 ⁇ P of Example 17 was sailed. And after enzymatic digestion with Fsel, insert into the terminal dephosphorylated using Escherichia coli C75-derived alkaline phosphatase. It was introduced into E. coli XL10-Gold Ultracompetent Cells (US STRATAGENE). DNA was prepared from the obtained transformant, the base sequence of the ligation part was confirmed, and the pPS hEPO KI vector (FIG. 13) was obtained.
  • Example 2 2 2
  • pPS hEPO KI vector 60 / zg spermidine added (1 raM pH7.0 US Sigma) Digest 5 hours at 37 ° C using Notl with buffer (Roche Japan Diagnostic, H buffer for restriction enzymes), extract with phenol / chloroform form, 2.5 volumes of 100% ethanol , And 0.1 volume of 3 M sodium acetate and stored at -20 ° C for 16 hours.
  • the vector single-stranded with Notl was collected by centrifugation, and then sterilized with 70% ethanol. 70% ethanol was removed in a clean bench and air-dried for 1 hour.
  • the HBS solution was added to a 0.5 ⁇ g / L DNA solution and stored at room temperature for 1 hour to prepare a pPS hEPO KI vector for electroporation.
  • the pPS hEPO KI vector prepared in Example 21 was used as a restriction enzyme Notl (Japan Takara Shuzo). ) And RS element targeting 'introduced into mouse ES cells according to established methods (Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan).
  • Targeting 'Mouse ES cell culture method is in accordance with the method described (Shinichi Aizawa, supra) and vegetative cells are treated with mitomycin C (Sigma, USA) G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) Was used. First, the grown RS element targeting 'mouse ES cells were trypsinized, 3
  • PS hEPO mouse Production of chimeric mouse using ES cell line and host embryo derived from B lymphocyte-deficient mouse strain
  • the PS hEPO mouse ES cell line (# 6) obtained in Example 23 above and confirmed to contain human EP0-cDNA downstream of the immunoglobulin chain gene was frozen stock. They were further injected, and 8 to 10 embryos were injected into each 8-cell embryo obtained by mating male and female mice of the above-mentioned immunoglobulin ⁇ chain knockout mice homozygous. After overnight culture in ES medium (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) to develop blastocysts, 2.5 days after pseudopregnancy treatment MCH (ICR) Approximately 10 injection embryos per uterus on one side were transplanted into the uterus of a mouse (Clea Japan, Japan).
  • mice ES cell line in which human EPO-cDNA was inserted downstream of the immunoglobulin ⁇ light chain gene by homologous recombination the pCkP2 hEPO KI vector prepared in Example 13 was used as a restriction enzyme Notl (Japan Takara Shuzo).
  • mouse ES cells TT2F Yamamoto et al., Analytical Biochem., 214: 70 according to established methods (Shinichi Aizawa, Bioman Yuanore Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) , 1993).
  • the mouse TT2F cells were cultured according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and vegetative cells were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA).
  • Electroporated cells were suspended in 10 ml of ES medium (Shinichi Aizawa, above), and seeded on one 100 mm tissue culture plastic petri dish (Falcon, US Dickinson, USA) pre-seeded with feeder cells. . After 36 hours, the medium was replaced with ES medium containing 0.8 ⁇ / ⁇ 1 puromycin (Sigma, USA). Pick up a total of 96 colonies from 7 days later and grow them to confluence in 24-well plates, and 2/3 of them to 0.2 ml of storage medium (ES medium + 10% (S0, Sigma, USA) and stored at -80 ° C.
  • CkP2 hEP0 mouse TT2F cells were cultured according to the method described (Shinichi Aizawa, supra) using G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA).
  • the grown CkP2 hEPO mouse TT2F 'cells are trypsinized and suspended in HBS to 3 ⁇ 10 7 cells / ml, and then 0.5 ml of the cell suspension is added to a 10 / g vector.
  • the mixture was mixed with DNA, and the electrode was placed in a gene pulser (electrode distance: 0.4 cm, US Bio-Rad) (capacity: 960 ⁇ ⁇ , voltage: 250 V, room temperature).
  • the electroporated cells were suspended in 10 ml of ES medium (Shinichi Aizawa, supra), and 2.5 ml of the suspension was pre-seeded with feeder cells. 60 Petri dishes for awakening tissue culture (Falcon, Betaton, USA). Dickinson) 1 seeded. After 30 hours, 1000 ES cells were seeded in advance on one sheet of plastic petri dish for tissue culture (Falcon, Betaton, Dickinson, USA) seeded with one feeder cell. Pick up a total of 48 of the colonies that occurred after 6 days, grow each to confluence in a 24-well plate, and 2/3 of it to 0.2 ml storage medium (FBS + 10% DMS0, USA) (Sigma) and stored at -80 ° C.
  • FBS + 10% DMS0, USA 0.2 ml storage medium
  • genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Gentra System, USA). These mouse ES cell genomic DNAs were digested with restriction enzyme EcoRI (Nippon Takara Shuzo) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, Southern blotting was performed, and the DNA fragment (XhoI to EcoRI) of Ig light chain-C / c genomic DNA used in the invention described in W00 / 00383 pamphlet (see Example 48) was used.
  • EcoRI EcoRI
  • EcoRI EcoRI
  • the CkP2 ⁇ hEPO mouse TT2F cell line (# 8) obtained in Example 26 above and confirmed to have human EP0-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin / c-chain gene was established from a frozen stock. They were injected into 8 cell embryos obtained by mating male and female mice homozygous for the above-mentioned immunoglobulin ⁇ chain knockout mice. After overnight culture in ES medium (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Tagging, 1995, Yodosha, Japan) and developing to blastocysts, 2.5 days after treatment with pseudopregnancy About 10 injection embryos per uterus on one side were transplanted into the uterus of each temporary parent MCH (ICR) mouse (CLEA, Japan).
  • ICR temporary parent MCH
  • Example 2 As a result of transplanting a total of 80 infection embryos produced using # 8 in 6-6, 14 offspring chimeric mice were born. Chimera individuals are judged by the presence of ES cell-derived wild color (dark brown) in the white color derived from the host embryo. Of the 14 animals born, there were 10 individuals with apparently wild-colored hair color, that is, ES cells contributed. These results indicate that the CkP2 ⁇ hEPO mouse TT2F cell line (# 8), in which human EPO-cDNA is inserted downstream of the immune globulin K chain gene, retains the ability to form chimeras, ie, normal tissue of individual mice. It has been shown to retain the ability to differentiate.
  • Example 2 8 the CkP2 ⁇ hEPO mouse TT2F cell line
  • CkP2 hEPO mouse CkP2 'loxP hEPO gene transfer from which two types of drug resistance genes (Neo f , Pure /) have been removed from ES cell line.
  • pCAGGS-Cre vector (Sunaga et al., Mol R sign rod Dev , 46: 109-113, 1997) according to the established method (Shinichi Aizawa, Neuro Manual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) according to CkP2 hEPO mouse ES cells (# 30) Introduced.
  • CkP2 hEPO mouse ES cells were cultured according to the method described (Shinichi Aizawa, supra), and vegetative cells used were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA). First, CkP2 hEPO mouse ES cells grown were trypsinized and suspended in HBS to 3 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • the suspension was suspended in S medium (Shinichi Aizawa, supra), and 2.5 ml of the suspension was seeded on one plastic petri dish for tissue culture (Falcon, US Dickinson, USA) previously seeded with one feeder cell. After 30 hours, 1000 ES cells were seeded in advance on one 100 mm tissue culture plastic petri dish (Falcon, Dickinson, USA) seeded with one feeder cell. Pick up a total of 46 colonies from 6 days later and grow them to confluence in 24-well plates, and 2/3 of them to 0.2 ml of storage medium (FBS + 10% DMS0, US Sigma) And stored at -80 ° C. The remaining 1/3 is seeded on a 12-well gelatin-coated plate and cultured for 2 days. From 10 6 to 10 7 cells, genomic DNA is purified.
  • S medium Shinichi Aizawa, supra
  • 1000 ES cells were seeded in advance on one 100 mm tissue culture plastic petri dish (Falcon, Dickinson, USA) seeded
  • a DNA fragment (XhoI to EcoRI, approximately 1.4 kb, Fig. 5) was sandwiched between LoxP sequences as a probe An ES cell line from which only the pure gene was removed was detected. Two bands (15.6 K and 13 ⁇ 1 K) were detected by EcoRI digestion in ES cells carrying Pure / gene, and two in ES cell lines from which only the Puro ⁇ gene had been removed by EcoRI digestion. Bands (15.6 K and 10.2 K) are detected (Fig. 10).
  • Ne cells sandwiched between LoxP sequences using the 3 ′ ⁇ -prob used in Example 10 as a probe was detected strain.
  • CkP2 loxP hEPO mouse Production of chimeric mouse using ES cell line and host embryo derived from B lymphocyte-deficient mouse strain
  • the CkP2 loxP hEPO mouse ES cell line (# 18) obtained in Example 28 above and confirmed to have human EP0-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin chain gene was launched from frozen stocks.
  • Each of the 8-cell embryos obtained by mating male and female mice homozygous for the above immunoglobulin ⁇ chain knockout mice 8 to 10 were injected.
  • ES medium Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995
  • sputum culture and development to blastocysts 2.5 days after pseudopregnancy treatment MCH (ICR )
  • About 10 injection embryos were transferred per mouse uterus to the uterus of a mouse (Japan Claire, Japan).
  • Example 30 As a result of the transplantation of a total of 240 engineered embryos produced using # 18 of Example 28, 80 offspring chimeric mice were born. Chimera individuals are judged by the presence of ES cell-derived wild color (dark brown) in the white color derived from the host embryo. Of the 80 animals born, 52 were clearly wild-colored in their coat color, ie, ES cells contributed. From these results, the CkP2 loxP hEPO mouse ES cell line (# 18) in which human EP0-cDNA is inserted downstream of the immune globulin kappa chain gene retains the chimera-forming ability, ie, normal tissue of the mouse individual. It was shown to retain the ability to differentiate into Example 30
  • PS hEPO mouse PS loxP hEPO gene transfer from which two types of drug resistance genes (Neo r , Puro r ) have been removed from the ES cell line. 109-113, 1997) was introduced into PS hEPO mouse ES cells (# 6) according to established methods (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan).
  • PS hEPO mouse ES cell culture method was according to the method described (Shinichi Aizawa, supra), and cultivated cells were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA). .
  • proliferated PS hEPO mouse ES cells were trypsinized and suspended in HBS to 3 ⁇ 10 7 cells / ml, and then 0.5 ml of the cell suspension was mixed with lO ⁇ ug vector DNA. Then, the electric mouth poration was performed with Gene Pulser Cuvette (Electrode distance: 0.4 cm, US BioRad) (capacity:
  • Genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Gentra System, USA). These mouse ES cell genomic DNAs were digested with the restriction enzyme EcoRI (Nippon Takara Shuzo) and separated by agarose gel electrophoresis. , Ran a Southern plot, and used the DNA fragment (Xhol to EcoRI) of Ig light chain J / C-CK genomic DNA used in the invention described in W00 00/10383 pamphlet (see Example 48). Pur, sandwiched between LoxP sequences with a probe of about 1.4 kb, 0 00/10383 pamphlet ( Figure 25).
  • PS loxP hEPO mouse Production of chimeric mouse using ES cell line and host embryo derived from B lymphocyte-deficient mouse strain
  • functional lymphocytes are deficient and antibodies are not produced (Kitamura et al., Nature, 350: 423-426, 1991).
  • Embryos obtained by mating of the homozygous male and female individuals raised in a clean environment were used as hosts for the production of chimeric mice performed in this Example.
  • functional B lymphocytes in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells.
  • MCH immunoglobulin // chain gene knockout mouse
  • the PS loxP hEPO mouse ES cell line (# 48) obtained in Example 30 above and confirmed to have human EP0-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin chain gene was launched from the frozen stock. They were injected into 8 cell embryos obtained by mating male and female mice of the above-mentioned immunoglobulin ⁇ chain knockout mouse homozygote, each with 8 to 10 embryos.
  • PS loxP hEPO mouse ES cell line # 48 in which human EP0-cDNA is inserted downstream of the immune globulin / c-chain gene retains the chimera-forming ability, that is, normal tissue of the mouse individual. It has been shown to retain the ability to differentiate into Example 3 2
  • mice derived from the RS element 'targeting mouse ES cell line # 32 prepared in Example 11 above as a control mouse CkP2 hEPO mouse ES cell line prepared in Example 16 above # A total of 3 chimeric mice derived from 57 (chimera rate 100-70%), 3 chimeric mice derived from NP hEPO mouse ES cell line # 10 prepared in Example 20 above (chimera rate 100%)
  • Example 2 From a total of 3 chimera mice derived from the PS hEPO mouse ES cell line # 6 prepared in 4 (chimera rate 100%), 1 mouse each at 1 week, 2 weeks and 4 weeks A spleen sample was taken out, and immediately after that, about 50 mg of the spleen was frozen in liquid nitrogen.
  • RNA sample 1 ml of IS0GEN (Nippon Gene, Japan) was added to each obtained frozen sample, and the sample was crushed using a homogenizer, and RNA was extracted according to the attached manual.
  • the obtained RNA sample was subjected to DNase treatment (WAKO Deoxyribonuclease RT grade, Japan for 15 minutes for 15 minutes. Further, a purified RNA sample was obtained using RNasy Mini (DQIAGEN).
  • cDNA was synthesized from purified RNA samples 2 50 ng was obtained. Then 3 7. C, RNase treatment was performed for 20 minutes, and 2.0 ⁇ 1 of a 10-fold diluted solution with RNase-free sterilized water was used for subsequent PCR.
  • hEP0-RT FW5 GGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTC (SEQ ID NO: 5 5)
  • CkpolyAR2 CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (SEQ ID NO: 5 6)
  • PCR for confirming human EP0 gene expression was performed under the following conditions. Using LA taq (Nippon Kokuho Shuzo), incubation was carried out at 94 ° C for 10 seconds, followed by 35 cycles of 2-step reaction at 68 ° C for 1 minute. As a result, in the control group, no amplified band was detected in all of 1 to 4 weeks of age, but in the spleen tissues of all chimeric mice prepared using mouse ES cells into which the human EP0 gene was introduced. An amplified band was detected from 1 week of age. NP hEPO mouse ES cell-derived chimeric mice and PS hEPO mouse ES cell-derived chimeric mice have almost the same amplification band concentration as those at 2 and 4 weeks of age. CkP2h EP0 mouse ES cell-derived chimeric mice have an amplification band concentration of 1379 Compared to these, it was confirmed to be slightly lower (Fig. 16).
  • oligo DNA was synthesized as a mouse Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene expression confirmation primer in order to confirm that there was no bias in the amount of mRNA used in each sample group.
  • GPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • mGAPDH5 CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (SEQ ID NO: 5 7)
  • mGAPDH3 ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (SEQ ID NO: 5 8)
  • RS element 'targeting mouse prepared in Example 11 above 1 10 chimeric mice derived from ES cell line # 32 (chimeric rate 80-20%), CkP2 hEPO prepared in Example 16 above Chimera mouse derived from mouse ES cell line # 69
  • mice (chimera rate 80-20%), 4 chimeric mice derived from NP hEPO mouse ES cell line # 10 prepared in Example 20 above (chimera rate 100%), prepared in Example 24 above.
  • PS hEPO mouse 10 chimeric mouse derived from ES cell line # 6 (chimera rate 80-20%), CkP2 ⁇ P hEPO mouse TT2F cell derived chimeric mouse prepared in Example 27 above
  • Example 11 The concentration of human EP0 in serum derived from a total of 10 chimeric mice derived from mouse ES cell line # 32 (chimera rate 80-20%) was All were below the limit of detection (12.5 pg / ml), but derived from a total of 6 chimeric mice (chimeric rate 80-20%) derived from the CkP2 hEP0 mouse ES cell line # 69 prepared in Example 16 above.
  • the average value of serum EP0 concentration in the serum was 5.3 ng / ml, and the NP hEPO mouse ES cell line prepared in Example 20 above.
  • Serum human EP0 concentration derived from a total of 4 chimera mice derived from # 10 (chimera rate 100%) is 14.7 ng / ml
  • PS hEPO mouse ES cell line prepared in Example 24 Serum human EP0 concentration derived from a total of 10 chimeric mice derived from # 6 (chimera rate 80-20%) is 47.9 ng / ml
  • CkP2 ⁇ ⁇ hEPO mice prepared in Example 27 above A total of 9 TT2F cell-derived chimeric mice (chimera rate 60-100 ° /.)
  • Serum human EP0 concentration was 63.4 ng / ml
  • Total 20 human serum EP0 concentrations from 20 (chimera rate 90 to 10%) is 211 ng / ml
  • PS loxP hEPO prepared in Example 31 above The mean value of serum EPO concentration from 3 mouse mice derived from mouse
  • FIG. 17 and Tablell show human EP0 concentration values measured at 1, 2, 4, 6, and 8 weeks of age using the sera of the chimeric mice prepared in the above Examples. From these results, CkP2 hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, NP hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, PS hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, CkP2 ⁇ ⁇ hEPO mouse TT2F cell-derived chimeric mouse, CkP2 loxP hEPO mouse ES cell-derived The increase in serum human EP0 concentration was observed in the order of chimeric mice and PS loxP hEPO mice ES cell-derived chimeric mice.
  • CkP2 hEPO mouse ES (TT2F) cells CkP2 loxP hEPO type, CkP2 AP hEPO type
  • T2F CkP2 hEPO mouse ES
  • the serum concentration increased synergistically with the increase obtained by each single operation, which was extremely interesting. Deep results were obtained.
  • mice (chimera rate 80-20%), 4 chimeric mice derived from NP hEPO mouse ES cell line # 10 prepared in Example 20 above (chimera rate 100%), prepared in Example 24 above
  • chimera mice into which the human EP0 gene was introduced showed an average increase of 1.64 times or more in all groups. However, there was no significant difference in the number of red blood cells between groups. In addition, the average hematocrit value of the control group was 58%, but chimera mice into which the human EP0 gene was introduced showed an average value of 90% or more in all the above groups, which was significantly increased by the introduction of the human EP0 gene. An increase in hematocrit was observed. However, there was no significant difference between the groups as in the red blood cell count. Although there is a significant difference in serum human EP0 concentration among the groups in Examples 33 above, there is no significant difference in blood cell analysis.
  • Lox-P Puro plasmid (W00 / 00383 pamphlet) was digested with restriction enzyme BamHI and separated by 0.8% agarose gel electrophoresis. 1. Gel containing 7kb fragment Using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN), the PGK'Puro fragment was recovered according to the package insert.
  • Ck pA Nhel F CCTAGCTAGCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCAC (SEQ ID NO: 5 7)
  • Ck pA Pad R CCTTAATTAATGGATTTCAGGGCAACTAAAC (SEQ ID NO: 5 8)
  • the reaction solution was prepared according to the package insert using KOD-plus- (Toyobo, Japan). Add 9.5 pmol of each of the above 2 primers in a 50 ⁇ reaction solution, and add TT2F mouse ES genome as a saddle type and incubate at 94 ° C for 2 minutes, then 94 ° C for 15 seconds / 58 ° C for 30 seconds / 68 ° Amplification was performed 32 cycles, with C30 seconds as one cycle. The obtained amplified fragment of about 300 bp was separated and recovered with a 2% gel. The QIAquick Gel Extraction Kit was used from the collected genoles, and the amplified fragments were collected according to the package insert.
  • the recovered PCR amplified fragment was digested with restriction enzymes Nhel / Pacl and size-fractionated on a 2% agarose gel. Enzyme-treated fragments were collected from the gel using the QIAquick Gel Extraction Kit according to the package insert. This fragment was subcloned into the NBS / Pacl site of pBS + PFN of Example 1 above and introduced into E. coli Competent high DH5 (Toyobo, Japan). DNA was prepared from the obtained transformant, and the sequence was confirmed. Compared with the full length Ck poly A of the CkP2 KI vector, p (partial length Ck poly A) in which no amplification error was found was digested with Pacl / Nhel. 2 ° /. The 303 bp fragment was separated on a gel and the partial length Ck poly A fragment was recovered using the QIAquick Gel Extraction Kit according to the package insert.
  • Ascl top l inker GGCCAGGCGCGCCTTGC (SEQ ID NO: 4 7)
  • Ascl bottom l inker GGCCGCAAGGCGCGCCT (SEQ ID NO: 4 8)
  • the pCkP2 KI vector was digested with restriction enzyme Notl (Roche), separated and purified from 0.8% agarose gel, and then introduced into Ascl linker by ligation reaction using ligation kit ver. 2 (Takara Bio, Japan). did.
  • E. coli XL10- Gold DNA was prepared from the transformant obtained by introduction into Ultracompetent Cells (US STRATAGENE), and the nucleotide sequence of the inserted fragment was confirmed.
  • the above 35-3 pCkP2 + As KI was digested with the restriction enzyme Hpy99I, and an 8820 bp fragment was separated on a 0.8% agarose gel.
  • the gel containing the target fragment was cut out and DNA was collected using the QIAquick Gel Extraction Kit according to the package insert.
  • the collected DNA was blunted using Blunting high (Toyobo, Japan) according to the package insert.
  • the 8280 bp fragment was separated on an 0.8% agarose gel, the gel containing this target fragment was cut out, and the Ck 3 ′ genomic fragment was recovered using the QIAquick Gel Extraction Kit according to the package insert.
  • loxP-Bglll Pmel- synthesized from the following oligo DNA was used: An Hpal linker was inserted.
  • DNA was prepared from the resulting transformant after introduction into E. coli Competent high DH5a.
  • the base sequence of the ligation part was confirmed, and PBS2272 in which the linker was inserted in the target direction was obtained.
  • PBS2272 was digested with restriction enzyme Bglll, terminally dephosphorylated with calf small intestine-derived alphophosphatase, and then introduced into c Escherichia coli Competent high DH5 ligated with the PGK-Puro fragment prepared in 3-5 above. Then, DNA was prepared from the obtained transformant. The base sequence of the ligation part was confirmed, and a plasmid ploxPV-puro in which the PGK-Puro fragment was cloned in the desired direction was obtained. This plasmid was digested with the restriction enzyme Nhel / Pacl, and the end was dephosphorylated using alkaline phosphatase derived from calf small intestine.
  • the partial length Ck poly A fragment prepared in the above 35 1 2 was inserted here.
  • XL10-Gold Ultracompetent Cels (STRATAGENE, USA) was transformed, and plasmid DNA was prepared from the resulting clone and the nucleotide sequence was confirmed. The junction and the internal sequence were confirmed, and a ploxPV-Puro-poly A plasmid without error was obtained.
  • pCk loxPV KI vector 60 g added with spermidine (1 mM pH7.0 US Sigma) buffer (Roche Diagnostics, Japan, H buffer for restriction enzymes), using Notl for 5 hours at 37 ° C After digestion and phenol / black mouth form extraction,
  • loxPV Puro r Ck LoxPV mouse ES cell lines acquired by Ri immunoglobulin / c light chain gene downstream homologous recombination with variant 'Iotaomikuronkairo sequence at both ends, in Example 3 5
  • the prepared pCk loxPV KI vector was linearized with the restriction enzyme Notl (Takara Shuzo, Japan) and RS element according to established methods (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) ⁇ Targeting ⁇ Introduced into mouse ES cells.
  • RS element Targeting.
  • Mouse ES cells were cultured according to the method described (Shinichi Aizawa, supra), and vegetative cells were treated with mitomycin C (Sigma, USA). G418-resistant primary cultured cells (from Invitrogen, Japan) Purchase). First, try to trypsinize the expanded RS element, targeting, and mouse ES cells.
  • Example 48 Referring) were used in the invention according to, Ig light chain J ⁇ - C / c genomic DNA of 3, DNA fragment ends (XhoI ⁇ EcoRI, about 1. 4 kb, W0 00/10383 Patent pamphlet, especially Homologous recombinants were detected using the probe in Fig. 25). As a result, 6 out of 24 strains (25%) were found to be homologous yarns and substitutes. Wild type RS element targeting 'Mouse ES cell cell was detected by EcoRI digestion. In the homologous recombinant, a new band is expected to appear in addition to this band (Fig. 19). This new band was confirmed in the puromycin resistant strain. Ie, these clones had immunoglobulin ⁇ chain ⁇ Ko downstream drug-resistant gene of one Areru (loxPV Puro r) is ⁇ .
  • CkloxPV mouse ES cells were cultured according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and vegetative cells were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA).
  • the grown Ck loxPV mouse ES cells are trypsinized, suspended in HBS to 3 x 10 7 Zml, and then 0.5 ml of the cell suspension is mixed with 10 g of vector DNA. Electroporation was performed using a gene pulser (electrode distance: 0.4 cm, BioRad, USA) (capacity: 960 ⁇ 960, voltage: 250 V, room temperature). 10 ml of E cell
  • the suspension was suspended in S medium (Shinichi Aizawa, supra), and 2.5 ml of the suspension was seeded on one 60 mm tissue culture plastic petri dish (Falcon, US Dickinson, USA) previously seeded with one feeder cell. 30 hours later, 100 mm tissue culture plastic petri dish (Fualco) in which 1000 ES cells were pre-seeded and feeder cells were seeded. And US Becton, Dickinson). Pick up a total of 24 colonies after 6 days, grow each to confluence in a 24-well plate, and 2/3 of it to 0.2 ml of storage medium (FBS + 10% DMS0, Suspended in US Sigma) -80. Stored in C.
  • S medium Shinichi Aizawa, supra
  • genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Gentra System, USA). These mouse ES cell genomic DNAs were digested with restriction enzyme EcoRI (Nippon Takara Shuzo) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, Southern blotting was performed, and the 3 ′ end DNA fragment (Xho) of the Ig light chain JK-CK genomic DNA (Xho): ⁇ EcoRI used in the invention described in W00 / 00383 pamphlet (see Example 48) , about 1. 4 kb, W0 00/10 38 3 No.
  • hEPO Np CCGCTCGAGCGGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG (SEQ ID NO: 4 5)
  • hEPO Rp CCGCTCGAGCGGTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA (SEQ ID NO: 4 6)
  • the recovered PCR amplified fragments were digested with Xhol and separated and recovered on a 0.8% agarose gel.
  • the enzyme-treated fragments were collected from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • pBluescriptll SK (-) (US STRATAGENE) was digested with Xhol, separated and purified from 0.8% agarose gel, and then terminally dephosphorylated using calf intestine-derived al force phosphatase. It was inserted and introduced into E. coli DH5a. DNA was prepared from the resulting transformant and the insert fragment was sequenced. Clones without mutation by PCR were selected, digested with Xhol, and separated and recovered on 0.8% agarose gel. Using the QIAquick Gel Extraction Kit (Doc QIAGEN), the enzyme-treated fragments were collected from the collected gel according to the package insert.
  • the above 3 9-1 CkP2 ver. 3.1 vector was digested with Sail and then terminally dephosphorylated with calf intestine-derived Al force phosphatase. After inserting the DNA fragment, it was introduced into E. coli XL10_Gold Ultracompetent Cells (STRATAGENE, USA). DNA was prepared from the obtained transformant, and the base sequence of the ligated portion was confirmed to obtain a pCloxPV hEPO KI vector (FIG. 20).
  • the pCk loxPV hEPO KI vector prepared in Example 39 was used as a restriction enzyme NotI (Japan). Introduced into RS element targeting mouse ES cells according to established methods (Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Tagging, 1995, Yodosha, Japan).
  • RS element targeting 'Mouse ES cells were cultured according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and vegetative cells were treated with mitomycin C (Sigma, USA) G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) Was used. First, the grown RS element targeting 'mouse ES cells were trypsinized, 3
  • Embryo obtained by mating of homozygous male and female individuals raised in a clean environment was used as a host for the production of chimeric mice in this example.
  • functional B lymphocytes in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells.
  • MCH immunoglobulin / chain gene knockout mouse
  • Individuals that had been backcrossed to the strain three or more times were used for host embryo preparation.
  • the CL hEPO mouse ES cell line obtained in Example 41 above and confirmed to have human EPO-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin ⁇ chain gene was established from a frozen stock, 8-10 embryos were injected into each 8-cell embryo obtained by mating male and female mice homozygous for immunoglobulin ⁇ chain knockout mice. After culturing overnight in ES medium (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) to develop blastocysts, 2.5 days after treatment with pseudopregnancy About 10 injection embryos were transferred to each uterus of the uterus of MCH (ICR) mice (Clea Japan, Japan).
  • ES medium Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan
  • Example 41 As a result of transplantation of an induction embryo produced using the CL hEPO mouse ES cell line of 1, offspring chimeric mice are born. Chimera individuals are judged by the presence of ES cell-derived wild color (dark brown) in the white color derived from the host embryo. Among the offspring chimera mice, individuals with clearly wild-colored hair color, ie, ES cell contribution can be obtained. Based on these results, the CL hEPO mouse ES cell line in which human ⁇ -cDNA is inserted downstream of the immunoglobulin ⁇ chain gene retains the ability to form a chimera, that is, retains the ability to differentiate into normal tissues of individual mice. Is shown.
  • the CkP2 ver. 3.1 vector prepared in Example 39-1 was digested with restriction enzymes Hpal / Nhel, and an approximately 19.5 kb fragment was recovered by 0.8% agarose gel fractionation. The ends were dephosphorylated using calf small intestine-derived al force phosphatase.
  • This vector First 5 pCkpAMCS of Example 17 was digested with restriction enzymes Hpal and Nhel (Roche), and an approximately 700 bp fragment containing Ck-polyA-MCS recovered from 0.8% agarose gel was introduced. The linking portion and the internal nucleotide sequence were confirmed, and pCk ⁇ ⁇ ⁇ was obtained.
  • the pNPs hEPO in vitro vector prepared in Example 2 above was enzymatically digested with Sail and Fsel, and an approximately 1.2 kb fragment was separated and purified from 0.8% agarose gel. After enzymatic digestion with Sail and Fsel, it was inserted into terminal dephosphorylated using Escherichia coli C75-derived alkaline phosphatase. It was introduced into E. coli XLIO-Gold Ultracorapetent Cells (STRATAGENE, USA). DNA was prepared from the obtained transformant, the base sequence of the ligation part was confirmed, and the pNP loxPV hEPO KI vector (FIG. 22) was obtained.
  • Example 4 4 4
  • pNP loxPV hEPO KI vector 60 ⁇ g was added with spermidine (1 mM pH 7.0 US fertilizer) buffer (Roche Diagnostix, H buffer for restriction enzyme) in Japan at 37 ° C using Notl. After time digestion and phenol / chloroform extraction, 2.5 volumes of 100% ethanol and 0.1 volume of 3 M sodium acetate were added and stored at -20 ° C for 16 hours. The vector single-stranded with No 1 was collected by centrifugation, and then sterilized by adding 70% ethanol. 70% ethanol was removed in a clean bench and air-dried for 1 hour. An HBS solution was added to a 0.5 g / L DNA solution, and the mixture was stored at room temperature for 1 hour to prepare a pNP loxPV hEPO KI vector for electroporation.
  • Human EP0-cDNA was inserted into the immunoglobulin downstream of the light chain gene by homologous recombination NL hEPO mouse pNP loxPV hEPO prepared in Example 43 to obtain ES cell line
  • the KI vector is linearized with the restriction enzyme Notl (Nippon Treasure Shuzo) and RS Element Tag according to established methods (Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan) Ting 'introduced into mouse ES cells.
  • Mouse ES cell culture method is in accordance with the method described by Shinichi Aizawa (supra), and vegetative cells are treated with mitomycin C (Sigma, USA) G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) ) Was used.
  • mitomycin C Sigma, USA
  • G418-resistant primary cultured cells purchased from Invitrogen, Japan
  • the NL hEPO mouse ES cell line obtained in Example 45 above and confirmed to have human EPO-cDNA inserted downstream of the immunoglobulin K chain gene was established from a frozen stock, and these were 8-10 embryos were injected into each 8-cell embryo obtained by mating male and female mice homozygous for immunoglobulin ⁇ chain knockout mice.
  • ES medium Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan
  • Approximately 10 injection embryos per uterus on one side were transplanted into the uterus of temporary parent MCH (ICR) mice (Clea Japan, Japan).
  • Example 4 8 The pPSs hEPO in vitro vector of Example 1 was enzymatically digested with Sail and Fsel, and an approximately 1.3 kb fragment was separated and purified from a 0.8% agarose gel, and then the pCk loxPV prepared in Example 43 above. After AP was enzymatically digested with Sail and Fsel, it was inserted into E. coli C75-derived alphophosphatase. It was introduced into E. coli XLIO-Gold Ultracompetent Cells (STRATAGENE, USA). DNA was prepared from the obtained transformant, and the base sequence of the ligated portion was confirmed, and the pUS hEPO KI vector (FIG. 24) was obtained. ⁇ Example 4 8
  • pUS hEPO KI vector 60 ⁇ 8 was added to spermidine-added (1 mM pH7.0 US Sigma) buffer (Roche, Japan, H buffer for restriction enzymes) at 37 ° C using Notl. After time digestion and phenol / chloroform extraction, 2.5 volumes of 100% ethanol and 0.1 volume of 3 M sodium acetate were added and stored at ⁇ 20 ° C. for 16 hours. The vector that had been single-stranded with Notl was collected by centrifugation, and then sterilized with 70% ethanol. 70% ethanol was removed in a clean bench and air-dried for 1 hour. The HBS solution was added to a 0.5 g / ⁇ L DNA solution and stored at room temperature for 1 hour to prepare a pUS hEPO KI vector for electroporation.
  • the pUS hEPO KI vector prepared in Example 47 was used as a restriction enzyme Notl. Established in Kokuho Shuzo) and established method (phase Introduced into RS element targeting mouse ES cells according to Shinichi Sawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan).
  • RS element 'targeting' mouse ES cell culture method is according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and vegetative cells are treated with mitomycin C (Sigma, USA) G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) Was used.
  • the grown RS element targeting mouse ES cells are trypsinized and suspended in HBS to 3 x 10 7 cells / ml, then 0.5 ml of the cell suspension is added to the vector DNA
  • the mixture was then mixed with a pulsar cuvette (electrode distance: 0, 4 cm, US Bio-Rad) and subjected to electrification (capacity: 960 F, voltage: 250 V, room temperature).
  • the electroporated cells were suspended in 10 ml of ES medium (Shinichi Aizawa, supra) and seeded on one 100 mm tissue culture plastic dish (Falcon, US Dickinson, USA) previously seeded with feeder cells. After 36 hours, the medium was replaced with ES medium containing 0.8 // g / ml puromycin (Sigma, USA). Pick up colonies that formed after 7 days, grow each to confluence in a 24-well plate, and suspend 2/3 of it in 0.2 ml of storage medium (FBS + 10% DMS0, US Sigma). ,-Stored at 80 ° C.
  • genomic DNA was prepared from 10 6 to 10 7 cells using Puregene DNA Isolation Kits (Gentra System, USA). These puromycin-resistant RS elements, targeting, and mouse ES cell genomic DNA were digested with the restriction enzyme EcoRI (Nippon Takara Shuzo) and separated by agarose gel electrophoresis.
  • Example 4 9 immunoglobulin ⁇ chain gene downstream human EP0 - cDNA is raised from the freezing Sutotsuku the PL hEPO mouse ES cell line was confirmed to have been ⁇ entrance, they, the immune 8-10 embryos were injected into each 8-cell embryo obtained by mating male and female mice homozygous for globulin globulin knockout mice.
  • ES medium Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1999 Yodosha, Japan
  • EXAMPLE 4 As a result of transplantation of an induction embryo produced using the PL hEPO mouse ES cell line of Example 9, offspring chimeric mice are born. Chimera individuals are judged by the presence of ES cell-derived wild color (dark brown) in the white color derived from the host embryo. Among the offspring chimera mice, individuals with clearly wild-colored hair color, ie, ES cell contribution can be obtained. These results indicate that the PL hEPO mouse ES cell line in which human EP0-cDNA is inserted downstream of the immunoglobulin / chain gene retains the ability to form a chimera, that is, has the ability to differentiate into a normal mouse tissue. It is shown to hold.
  • Example 5 1 Example 5
  • CL hEPO mouse ES cells were cultured using the G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA) according to the method described above (Shinichi Aizawa, supra). .
  • the grown CL hEPO mouse ES cells are trypsinized, suspended in HBS to 3 x 10 7 Zml, and then mixed with 0.5 ml of the cell suspension with the vector DNA. Electroporation was performed with a circut (electrode distance: 0.4 cm, US Bio-Rad) (capacity: '960, u F N voltage: 250 V, room temperature). 10 ml of ES medium
  • B lymphocytes In homozygous immunoglobulin chain gene knockouts, functional B lymphocytes are deficient and antibodies are not produced (Kitamura et al., Nature, 350: 423-426, 1991). Embryos obtained by mating of the homozygous male and female individuals raised in a clean environment were used as hosts for the production of chimeric mice performed in this Example. In this case, B lymphocytes that are functional in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells. In this example, the immunoglobulin ⁇ -chain gene knockout mouse described in Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722-7, 2000) ) Individuals that had been backcrossed to the strain three or more times were used for host embryo preparation.
  • the Ck loxPV hEPO mouse ES cell line obtained in Example 51 above and confirmed to have human ⁇ -cDNA inserted downstream of the immunoglobulin / c chain gene was frozen and stored.
  • ES medium Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan
  • pseudopregnant MCH About 10 injection embryos were transferred to each uterus on the uterus of ICR mice (Clea Japan, Japan).
  • NL hEPO murine ES cell lines than two drug resistance gene (Nee, Puro r) for NP loxPV hEPO transgenic ES cell lines acquired removing the, pCAGGS - Cre vector (Sunaga et al., Mol eprod Dev, 46:. 109 -113, 1997) is introduced into NL hEPO mouse ES cells according to established methods (Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8, Gene Targeting, 1995, Yodosha, Japan).
  • the culture method of NL hEPO mouse ES cells was according to the method described (Shinichi Aizawa, supra), and the cultivated cells were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA). .
  • the grown NL hEPO mouse ES cells are trypsinized and suspended in HBS to 3 ⁇ 10 7 cells / ml, and then 0.5 ml of the cell suspension is mixed with 10 / _ig vector DNA.
  • the mixture was mixed and subjected to electroporation with a Gene Pulser Cuvette (electrode distance: 0.4 cm, US Bio-Rad) (volume:
  • NP loxPV hEPO mouse ES cell line Oppi B chimera mouse production using B lymphocyte-deficient mouse strain host embryo
  • Lymphocytes are deficient and no antibodies are produced (Kitamura et al., Nature, 350: 423-426, 1991). Embryos obtained by mating of the homozygous male and female individuals raised in a clean environment were used as hosts for the production of chimeric mice performed in this Example. In this case, functional B lymphocytes in chimeric mice are mostly derived from injected ES cells.
  • the MCH ICR
  • the immunoglobulin chain gene knockout mouse described in the report of Tomizuka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722-7, 2000). Individuals that had been backcrossed to the strain three or more times were used for host embryo preparation.
  • PL hEPO mouse ES cells were cultured according to the method described by Shinichi Aizawa (supra), and cultivated cells were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen, Japan) treated with mitomycin C (Sigma, USA). .
  • the grown PL hEPO mouse ES cells are trypsinized and suspended in HBS to 3 ⁇ 10 7 cells / ml, and then 0.5 ml of the cell suspension is mixed with 10 vector DNAs. Electroporation was performed using Gene Pulser Cuvette (electrode distance: 0.4 cm, US Bio-Rad) (capacity:
  • mice ES cell genomic DNAs were digested with restriction enzyme EcoRI (Nippon Takara Shuzo) and separated by agarose gel electrophoresis. Subsequently, Southern blotting was performed, and the 3 ′ end DNA fragment (Xho) of the Ig light chain J ⁇ -C fc genomic DNA (Xho) used in the invention described in WO 00/10383 pamphlet (see Example 48 ): An ES cell line from which EcoRI, approximately 1.4 kb, W0 00/10383 pamphlet, especially Fig. 25, was sandwiched between LoxP sequences was detected using a LoxP sequence. by EcoRI digestion in cells, two bands (15. 6 K and I 2.
  • Example 5 As a result of transplanting an expression embryo prepared using the US hEPO mouse ES cell line of 5; A child chimeric mouse was born. Chimera individuals are judged by the presence of ES cell-derived wild color (dark brown) in the white color derived from the host embryo. Among the offspring chimera mice, individuals with clearly wild-colored hair color, ie, ES cell contribution can be obtained. Based on these results, the US hEPO mouse ES cell line in which human EP0-cDNA is inserted downstream of the immunoglobulin / c-inducible gene retains the ability to form a chimera, that is, differentiates into normal tissue of a mouse individual. It is shown that you have the ability.
  • Example 5 7 Example 5 7
  • Example 11 As a control, the RS element 'targeting mouse produced in Example 11 above 1 chimeric mouse derived from ES cell line, CL hEPO mouse ES cell derived chimeric mouse produced in Example 42 above, and Example 46 above Created NL hEPO mice
  • ES cell-derived chimeric mouse, PL hEPO mouse prepared in Example 50 above From the ES cell-derived chimeric mouse, a spleen sample was extracted from one mouse in each group at 1 week, 2 weeks, and 4 weeks, respectively. Immediately after that, freeze about 50 mg of spleen with liquid nitrogen. Add 1 ml of IS0GEN (Nippon Gene) to each frozen sample, crush the sample using a homogenizer, and extract RNA according to the attached manual. The obtained RNA sample was treated with DNase (WAK0 Deoxyribonuclease RT grade) at 37 ° C for 15 minutes. In addition, obtain a purified RNA sample using RNasy Mini (QIAGEN). Comparison of human EP0 gene transcription levels:
  • cDNA was synthesized from 250 ng of the obtained purified RNA sample. Then, perform RNase treatment at 37 ° C for 20 minutes, and use sterile water 1
  • hEP0-RT FW5 GGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTC (SEQ ID NO: 6 1)
  • CkpolyAR2 CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (SEQ ID NO: 6 2)
  • PCR for confirming human EP0 gene expression was performed under the following conditions. Using LA taq (Nippon Kokuho Shuzo), incubation was carried out at 94 ° C for 10 seconds, followed by 35 cycles of 2-step reaction at 68 ° C for 1 minute. As a result, in the control group, no amplified band was detected in all of 1 to 4 weeks of age, but in the spleen tissues of all chimeric mice prepared using mouse ES cells into which the human EP0 gene was introduced. An amplified band was detected from 1 week of age.
  • NL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mice and PL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mice have almost the same amplification band concentrations as those at 2 and 4 weeks of age.
  • CL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mice have these amplification band concentrations. It is confirmed that it is slightly low when compared.
  • oligo DNA was used as a primer for confirming the expression of mouse Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene in order to confirm that there is no bias in the amount of mRNA used in each sample group. Synthesized.
  • mGAPDH5 CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (SEQ ID NO: 6 3)
  • mGAPDH3 ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (SEQ ID NO: 6 4)
  • PCR was performed under the following conditions to confirm mouse GAPDH gene expression. Using LA taq (Nippon Kokuho Shuzo), (94 ° C, 30 seconds) ⁇ (65 ° C, 30 seconds) ⁇ (72 ° C, 30 seconds) Cycled. As a result, mouse GAPDH expression was detected at almost the same level in all samples, and the difference in the band concentration between the samples detected using the primer for confirming human EP0 gene expression was the human EP0 in the spleen tissue of the chimeric mouse. It is shown to reflect the difference in gene expression level.
  • CL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse CL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, NL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, PL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, Ck loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, NP loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, US hEPO mouse Comparison of serum EP0 concentration in ES cell-derived chimeric mice
  • RS element 'targeting produced in Example 11 as a control mouse Chimeric mouse derived from mouse ES cell line, CL hEPO mouse ES cell derived chimeric mouse produced in Example 42 above, Example above 46 NL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse prepared in 6; PL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse prepared in Example 50 above; CloxPV hEPO mouse ES cell derived in Example 52 above Chimera mouse, NP loxPV hEPO mouse prepared in Example 54 above, ES cell-derived chimeric mouse, US hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse prepared in Example 56 above, orbital blood can be collected at 8 weeks of age
  • the human EP0 concentration in the obtained serum was measured using an ELISA kit (Quantikine VD In Vitro Diagnostic human Erythropoietin.
  • CL hEPO mouse ES cyst-derived chimeric mouse In addition, CL hEPO mouse ES cyst-derived chimeric mouse, NL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, PL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, Ck loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, NP loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse.
  • an increase in serum human EP0 concentration was observed.
  • CL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse NL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, PL hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, Ck loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, NP loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse, US hEPO mouse
  • Example 11 Chimera mouse derived from mouse ES cell line, CL hEPO mouse prepared in Example 42 above 2 'ES cell derived chimeric mouse, Example 4 above NL hEPO mice made in 6
  • ES cell-derived chimeric mouse PL hEPO mouse produced in Example 50 above ES cell-derived chimeric mouse, CloxPV hEPO mouse produced in Example 52 above ES cell-derived chimeric mouse, Example 54 above NP loxPV hEPO mouse ES cell-derived chimeric mouse prepared, US hEPO mouse ES cell-derived chimera prepared in Example 56 above Orbital blood was collected at 8 weeks of age from the mouse, and peripheral blood cell analysis was performed using a blood cell measuring device (ADVIA 120 HEMATOLOGY SYSTEM, manufactured by Bayer Medical Co., Ltd.). Compared with the control mouse group, chimera mice introduced with the human EP0 gene show a significant increase in the number of red blood cells in all the groups.
  • ADVIA 120 HEMATOLOGY SYSTEM manufactured by Bayer Medical Co., Ltd.
  • the present invention provides that the chimeric non-human animal of the present invention or its progeny, or cells, tissues or hybridomas derived from the animal have a significantly higher level of foreign DNA expression than conventional ones, such as a level several hundred million higher. This can be used as a high production method for the desired protein, and by using a chimeric non-human animal or its progeny into which a foreign gene of unknown function has been introduced, It can be used to analyze the in vivo function.
  • Sequence number 3 Primer. SEQ ID NO: 4 Primer SEQ ID NO: 5 Primer SEQ ID NO: 6 Primer ⁇ ⁇ ⁇ 1. Number 7 Primer SEQ ID NO: 8 Primer SEQ ID NO: 9 Primer SEQ ID NO: 1 0: Primer SEQ ID NO: 1 1: Primer SEQ ID NO: 1 2: Primer SEQ ID NO: 1 3: Primer SEQ ID NO: 1 4: Primer SEQ ID NO: 1 5: Primer SEQ ID NO: 1 6: Primer SEQ ID NO: 1 7: Primer SEQ ID NO: 1 8: Primer arrangement I—No. 1 9: Primer arrangement 1-No.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　この発明は、特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする外来DNAを含む、非ヒト動物由来の分化多能性を有する細胞であって、該特定の細胞および／または組織において発現する遺伝子由来のプロモーター／５'非翻訳領域の一部もしくは全部／リーダー配列コード領域を含む核酸断片が該外来DNAに結合されていること、および該外来DNAのゲノムへの導入のために使用された１もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されていること、を特徴とする細胞、この細胞を用いて作製されたかつ所望の蛋白質を高発現するキメラ非ヒト動物またはその子孫、ならびにこれらの動物を用いて所望蛋白質を製造する方法および遺伝子の生体内機能を解析する方法を提供する。

Description

キメラ非ヒ ト動物おょぴその使用
技術分
本発明は、 外来 DNAの発現能が増強されたキメラ非ヒ ト動物及びその子孫、 並 びにその使用に関する。 具体的には、 そのようなキメラ非ヒト動物及びその子孫 を用いて、 所望の蛋白質または該蛋明白質をコードする遺伝子の機能を解析する方 法、 および/または有用物質を生産する方法に関する。
書
背景技術
ヒ トゲノム全塩基配列決定という歴史的な研究成果 （Internat ional Human
Genome Sequencing Consortium, Nature, 409 : 860 - 921， 2001) は、 同時に膨大な 数の新規遺伝子の機能解明という新たな研究課題をもたらした。例えば 24本のヒ ト染色体中 2番目に小さく、 最初に全塩基配列が決定されたヒ ト 22 番染色体
(Dunhamら、 Nature, 402 : 489 - 495, 1999) を例にとれば、 合計 545個の遺伝子
(偽遺伝子を.除く） の存在が推定された。 その内訳は、 塩基配列およびアミノ酸 配列が既知の遺伝子が 247個、 既知遺伝子と相同性を示す新規遺伝子が 150個、
Expressed Sequense Tag (EST) データベースに登録されている機能未知の配列と 相同な新規遺伝子が 148個であった。 加えてゲノム配列から遺伝子を直接予測す るソフトウェア （GENESCAN) による解析では、 さらに 325個の転写産物未確認の 新規遺伝子が予測された （Dunham ら、 前記）。 遺伝子とその産物である蛋白質の 生体内における機能を明らかにすることは、 生命活動のプログラムを理解する上 で重要なばかりでなく、 様々なヒ ト疾患を克 するための新たな医薬品の開発に つながる可能性がある。 すなわち、 新規遺伝子の効率的な機能解析のための技術 開発は、 ポス トゲノム時代の生命科学、 医学研究における大きな課題である。 胚性幹細胞 (embryoni c stem cel l : ES 細胞） は、 胚盤胞の内部細胞塊より樹 立される未分化な株化細胞を言い、 生殖細胞を含む様々な体組織に分化する能力 を保持する。 例えばマウスの場合、 ES細胞をマウス初期胚 （宿主胚） に注入する ことにより体組織の細胞が ES細胞由来、及び宿主胚由来の細胞の混合物からなる キメラマウスが誕生する。 特に ES細胞由来の生殖細胞を保持し、 ES細胞の遺伝 情報を子孫に伝達できるキメラマウスをジャームラインキメラと呼ぶ。 ジャーム ラインキメラ同士あるいはジャームラインキメラと適当なマウス系統を交配する ことにより E S細胞由来の遺伝情報を保持する F1マウスが生まれる。このことを 利用して、 あらかじめ E S細胞において特定の遺伝子を改変もしくは挿入してお く と、 任意のノックアウト （K0) マウス、 トランスジエニック （Tg) マウスおよ びノックイン (KI) マウスを作製することができる。 これまでに多くの研究者に よって多数の K0マウスが作製されてきたが、その解析結果は基礎生物学から臨床 医学に至る広範な分野に重要な情報をもたらしてきただけでなく、 多数のヒ ト疾 患モデル動物を提供してきた。 K0マウスは今日においても遺伝子の生体内機能解 明のために最も広く用いられている手法である。 一方、 特定の外来 DNAが特定の 遺伝子内に相同組換え （Le Mouell ic ら、 2002年、 日本国特許 3298842号） ある いはランダム挿入 （Gosslerら、 Science, 244： 463-465, 1989) により挿入され たマウスを一般的に KIマウスと呼ぶが、 さらに特定のプロモーター、 外来 DNA、 ポリ A付加部位からなる発現ュニットを特定の染色体領域に挿入することにより 作製されるマウスは多数の遺伝子の生体内機能解明に適している （富塚ら、 2003 年、 W003/041495) という報告もある。
.しかしながら Tgマウス、 KIマウスおょぴ K0マウスは共に 1つの遺伝子を扱う だけでも多大な時間と労力を必要とする。 相同組換えの効率は、 通常ランダム揷 入クローン 1万個から 100個に 1個程度とされている。 ランダム挿入体に対する 相同組換え体の比率を向上させるために、 これまで様々な検討がなされてきた。 例えばベクターに含まれる相同領域ゲノム DNA の長さが長いほど好ましいこと
(Deng & Capecchi, Mol. Cel l. Biol.， 12 : 3365-71， 1992)、 あるいはターゲテ ィングを行うマウス ES細胞の系統と同じマウス系統のゲノム DNA (アイソジェ二 ック DNA) を用いることが好ましいことなどが報告された （Deng & Capecchi、 前 記）。 さらに現在最も広く用いられている方法は、 上記選択マーカーに加えて、 相 同領域ゲノム DNAの外側にネガティブ選択マーカーを含む K0ベクターを用いるこ とである。 この方法は、 ランダム挿入体においては有毒なネガティブマーカーが 発現して細胞が死ぬが、 相同組換え体ではそれが起こらないという現象を利用し ている。 ネガティブ選択マーカーとしては Mansour らにより報告 （Nature, 336 : 348 - 352， 1988) された HSV- tk遺伝子 （培地中にガンシクロビル、 FIAUなど のチミジンアナログを入れる必要がある）、 または Yagi ら （Anal. Biochem,， 214 : 77 - 86， 1993) により報告された DT - A (ジフテリア毒素 A鎖） などが知られ ている。 このネガティブ選択法が理論通りに機能した場合、 全てのコロニーが相 同組換え体という結果が予想されるが、 実際には報告により大きなばらつきがあ り、 その濃縮効果は一般的に数倍程度とされている。
変異型 ES細胞からのマウス作製だけでなく、相同組換えにより遺伝子改変、破 壊が施された哺乳動物細胞株は、 それ自体が該遺伝子の機能を解明する上で重要 な材料となる。 さらに、 相同組換えは遺伝子欠損や変異に起因する疾患 （遺伝性 疾患） の究極的な治療法と考えられてきた。 しかし、 哺乳動物細胞株または初代 培養細胞における相同組換え体とランダム挿入体の比率は、マウス ESにおける比 率と同等か、 さらに低いものであり、 細胞レベルの遺伝子機能解析や遺伝子治療 での応用は、 上記比率の改善が望まれていた (Yanez & Poter, Gene Therapy, 5：149-159, 1998) 0
ヒトゲノム全塩基配列が決定した現在、 望まれるのは、 多数の新規遺伝子につ いて網羅的な生体内機能解析を行うことができるようなシステムである。 そのた めには導入遺伝子を高レベルで発現する動物個体を確実、 容易、 かつ多種類同時 に作製できることが必要である。 ヒ トゲノム情報がもたらす新規遺伝子のうち、 サイ ト力イン、 増殖因子、 ホルモンなどと相同性を持つ分泌性の蛋白質をコード するものは、そのものが医薬品となり得る点で非常に興味深い研究対象といえる。 すなわち、 分泌性蛋白質をコードする遺伝子とその産物の生体内機能解析のため の新たな効率的手法の開発は、 ヒ ト疾患治療のための医薬品開発を大きく進展さ せることができると想像される。 発明の開示
本発明は、 特定の染色体領域における相同組換え効率が向上した、 かつ導入さ れた DNAによってコードされる蛋白質の発現量が向上した、 胚性幹 （ES) 細胞を 提供することを目的とする。
本発明はまた、遺伝子改変された ES細胞を用いて所望の蛋白質を発現する遺伝 子組換え非ヒ ト動物を作製する方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、 遺伝子組換え非ヒ ト動物およびその子孫を用いて対象遺伝子 の機能を解析するため、および/または有用物質を生産するためのの簡便かつ再現 性の高い方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、特定の染色体領域、すなわち RSエレメント領域に薬剤耐性マー カー遺伝子発現ュニットが挿入された ES細胞を用いることで、 RSエレメント領 域より約 25kb上流の免疫グロプリン遺伝子 C Kェクソン領域を含む遺伝子ターゲ ティングベクターのランダム揷入体に対する相同組換え体の比率が大きく改善さ れることを見出した。 染色体上の特定の領域にあらかじめ施された改変が同領域 の配列を含まないターゲティングベクターを利用した遺伝子ターゲティングにお ける相同組換え効率に影響を与えることは今までに知られておらず、 驚くべきこ とであった。
本発明者らはさらに、遺伝子改変された ES細胞を B細胞欠損宿主胚に注入する ことによりキメラマウスを作製することに成功し、 この方法により作製されたキ メラ動物において、 毛色のキメラ率に関わらず、 導入された構造遺伝子由来の産 物の過剰発現効果を観察した。 このシステムの利用により、 従来法と比較して効 率良くカつ確実に導入遺伝子を高発現するキメラ動物を得ることができることが 確認された。
このように、 本発明者らは、 所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒ ト動物の作製 方法、 ならびに所望の蛋白質を発現するキメラ非ヒ ト動物またはその子孫、 ある いは該動物由来の細胞、 組織またはハイプリ ドーマに関して、 所望の蛋白質の発 現量を従来と比較してさらに飛躍的に高める方法を見出した。
本出願人によって出願された PCT国際出願 W0 00/10383号パンフレツト （2000 年 3月 2日国際公開） に記載された発明の目的の一つである、 分泌性機能未知遺 伝子の生体内における機能同定を考慮した場合、 キメラ非ヒ ト動物における発現 量 （血清中濃度） を更に向上させることによって、 該遺伝子の機能同定の効率が 高まると考えられる。 例えば機能未知遺伝子を発現させた非ヒ ト動物において何 ら変化が認められなかった場合には、 該遺伝子の B細胞からの分泌量が十分でな いために、 該遺伝子のターゲットとなる組織周辺で作用に必要な臨界濃度に達し ていない可能性を考えなければならない。 こうしたケースの場合、 より高いレべ ルの発現が可能となれば、 臨界濃度を超える該遺伝子産物が供給され、 表現型が 観察される可能性がある。 また医療用を含む有用蛋白質を動物の体液中に生産さ せるために、 様々なトランスジエニック動物が作製されてきたが、 十分な発現量 を達成するためには多数のトランスジエニック個体を得た上で選抜する必要があ り、 導入遺伝子が高発現する個体を得ることは容易ではなかった。 それゆえ、 本 発明による髙レベルの外来 DNA発現を可能にするシステムは産業上利用価値が高 レ、。
本発明者らは、 本出願人によって出願された PCT国際出願 （W0 03/041495号パ ンフレッ ト （2000 年 3月 2日国際公開）） に記載されたキメラ非ヒ ト動物におけ る導入遺伝子の発現量 （血清中濃度） のさらなる向上を目的として鋭意努力を重 ねた結果、 既に開示された方法よりさらに発現量を高める方法を見出した。 本発 明には上記目的を達成するための、 以下 A、 Bの 2種の異なる方法が含まれる。 A は、 導入遺伝子発現カセットに含まれる、 プロモーター /5'非翻訳領域/リーダー 配列コード領域を含む遺伝子断片に関する、 また、 B は、 導入遺伝子近傍に存在 する薬剤耐性遺伝子マーカーを除去することに関する。さらに驚くべきことに、 A、 B 方法を同時に実施することによる相乗的な効果により、従来の Tgマウス作製 法と比較して非常に高いレベルの外来 DNA発現が可能であることを示した。
以下に方法 A、 Bの概要について記載する。
A:導入遺伝子発現カセットに含まれるプロモータ一 /5'非翻訳領域/リ一ダー配 列コード領域を含む遺伝子断片について W0 03/041495号パンフレツトに開示され た方法と比較し以下の変更を加えた。
( 1 ) Ig Kプロモーターについて上記開示と同じ Ig /c可変領域に由来するプロモ 一ターに加えて、異なる Ig ic可変領域に由来するプロモーターも用いて比較を行 つた。
( 2 ) Ig /cプロモーターについて上記開示 （約 300塩基対） より上流側に長いゲ ノム断片 （約 450塩基対） を用いた。 ( 3 ) ( 1 )、 ( 2 ) に示したプロモーターから転写開始点、 イントロンを経てリー ダー配列コ一ド領域に至る配列を、 マウス免疫グロブリン κ遺伝子ゲノムより取 得して用いた。
( 4 ) 上記開示においては導入遺伝子本来のリーダー配列コード領域を使用して いたが 本発明では （3 ) に示した断片に含まれる Ig fc可変領域のリーダー配列 コード領域と、 本来のリーダー配列コード領域部分を除去した導入遺伝子と人為 的に結合して用いた。
B： W0 03/041495 号パンフレツトに開示された方法に加えて、 取得されたノッ クイン ES細胞について以下の処理を実施した。
( 1 ) 導入遺伝子下流域に存在するピューロマイシン耐性遺伝子カセッ トを Cre/loxPシステムにより除去した。
( 2 ) 導入遺伝子下流域に存在するピューロマイシン耐性遺伝子カセット、 及び RS領域に存在するネオマイシン耐性遺伝子カセットを Cre/loxP システムにより 除去した。
W0 03/041495号パンフレツトに開示された方法に加えて、 上記 Aに示された方 法を実施した結果、従来の開示と比較して 10倍以上の発現量 （血清中濃度） 向上 が観察された。 従来の開示と同じプロモーター領域と、 今回新たに検討した異な るプロモーター領域の比較では、 後者の方がその効果は大きかった。 また、 W0 03/041495号パンフレツトに開示された方法に加えて上記 Bに示された方法を実 施しても、従来の開示と比較して 10倍以上の発現量（血清中濃度） 向上が観察さ れた。 さらに驚くべきことに、 A と Bを同時に実施することにより、 従来の開示 と比較して 100倍以上の発現量 （血清中濃度） 向上が観察された。
本発明における方法 A、 方法 及びこの 2種を組み合わせた方法 ABによる例 示的ノックインキメラマウスにおいて観察されたヒ トエリスロポエチン （hEPO) の血清中濃度は、 従来のトランスジ ニック （Tg) 動物作製法あるいはウィルス ベクタ一投与による外来 DNA強制発現システムと比較して驚くべき高いレベルで あった。 正常動物の血清中における内在性 EP0濃度は 10pg/ral以下であると考え られている力 S、それが外来 DNAの発現により 100Pg/ml以上に高められることによ り、 赤血球増加の表現型が現われる。 例えば初めて作製された hEPO- Tgマウスに おいては、 100 - 150pg/mlの血清中 hEPOが検出されるとともに、 赤血球増加の表 現型が観察された （Semenza ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 86： 2301-2305、 1989)。 さらに最近になって作製されたより高いレベルの hEPOを発現する Tgマウスにお いては約 1250pg/mlの血清中 hEPOが検出され、髄外造血を伴う脾臓の肥大や 0. 9 以上のへマトクリツト値など、前記 Tgマウスと比較してよりシビアな表現型が観 察された（Ruschitzkaら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 11609-11613)。 一方、 W0 03/041495号パンフレツトに開示された Ig Kプロモーターを含む hEPO発現ュニッ トが C κェクソンポリ A付加部位下流に挿入されたノックインキメラマウスにお いては、 数 ng/mlの血清中 hEPO濃度が検出され、 前記した従来法による Tgマウ スより高い発現量であることが示された。 hEPO遺伝子発現カセットを含むアデノ 随伴ウィルス、 あるいはレト口ウィルスのマウスへの投与による強制発現におい て検出された血清中 hEPO 濃度は概ね数 ng/ml 程度であった（Vil leval ら、 Leukemia、 6 : 107-115、 1992 ; Kesskerら、 Proc. Natl. Acad. Sci . USA、 93： 14082- 14087、 1996)。
後述の実施例に記載するように、 W0 03/041495号パンフレツトに開示された方 法に加えて、 方法 Aのみを実施した場合 45ng/ml以上、 また方法 Bのみを実施し た場合にも 50ng/ml以上の血清中 hEPOが検出された。 さらに方法 A、 Bを同時に 実施した場合には 1000ng/ml以上という驚くべきレベルの血清中 hEPOが検出され た。 この値は、 従来法により作製された hEPO発現 T gマウスの最も高発現な例と 比較して実に数百倍以上のレベルであった。 すなわち、 本発明の方法はトランス ジエニック動物における外来 DNA発現のために有用であることが示された。 発明の概要
上記の知見に基づく本発明は、 要約すると以下のとおりである。
本発明は、 その第 1の態様において、 特定の細胞および/または組織において 発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望 の蛋白質をコードする外来 DNAを含む、 非ヒ ト動物由来の分化多能性を有する細 胞であって、 該特定の細胞および Zまたは組織において発現する遺伝子由来のリ ーダー配列コード領域を含む核酸断片が該外来 DNAに結合されていることを特徴 とする前記細胞を提供する。
あるいは、 本発明は、 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子 の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコー ドする外来 DNAをゲノム上に含む、 非ヒ ト動物由来の分化多能性を有する細胞で あって： 該特定の細胞および Zまたは組織において発現する遺伝子由来のリーダ 一配列コード領域を含む核酸断片が該外来 DNAに結合されていることを特徴とす る前記細胞を提供する。
このような構成のために、 本発明は、 前記細胞に由来するキメラ非ヒ ト動物ま たはその子孫において前記所望の蛋白質をコードする外来 DNAが有意に過剰発現 するという利点を提供する。
本発明の一実施形態において、 前記特定の細胞および/または組織において発 現する遺伝子は、免疫グロプリン遺伝子、好ましくは免疫グロプリン軽鎖遺伝子、 さらに好ましくは免疫グロプリン c軽鎖遺伝子である。
本発明の別の実施形態において、 前記核酸断片は、 前記特定の細胞および Zま たは組織において発現する遺伝子のプロモーターをさらに含むことができる。 核 酸断片はさらに、 プロモーターに加えて、 前記特定の細胞および Zまたは組織に おいて発現する遺伝子のプロモーターとリーダー配列コード領域との間の 5 '非 翻訳領域の一部もしくは全部をさらに含むことができる。
.本発明'の別の実施形態において、 前記核酸断片は、 前記特定の細胞おょぴ Zま たは組織におレ、て発現する遺伝子のプロモーター 5 '非翻訳領域の一部もしく は全部/リーダー配列コ一ド領域を含む核酸配列からなる。 このような核酸断片 は、 本発明において特に好ましいものである。 その一具体例が、 前記非ヒ ト動物 由来の免疫グロプリン遺伝子のプロモーター / 5 '非翻訳領域の一部もしくは全 部/リーダー配列コード領域を含む核酸断片である。 ここで、 5 '非翻訳領域は全 体からなることがさらに好ましい。
本発明の別の実施形態において、 前記核酸断片は 300塩基対より大きい長さを 有する。核酸断片の長さは、例えば 350〜 500塩基対、 400〜450塩基対などである力 これに限定されない。
本発明の別の実施形態において、 前記所望の蛋白質をコードする外来 DNAの下 流にポリ Aシグナル領域をコードする配列が結合されている。
本発明の別の実施形態において、 前記分化多能性を有する細胞において前記外 来 DNAのゲノムへの導入のために使用された 1もしくは複数の薬剤耐性マーカー 遺伝子が除去されている。 好ましくは、 すべての該薬剤耐性マーカー遺伝子が除 去されている。 例えば後述の実施例では、 外来 DNAをゲノム上に相同的に組み換 える際に非ヒ ト動物、 具体的にはマウスのゲノム免疫グロブリン遺伝子 （特に免 疫グロプリン κ軽鎖遺伝子）の下流に存在する RSエレメントまたはそれと同等の 機能を有する領域に薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入するが、 外来 DNAを相同的に 組み込んだあとに、 この薬剤耐性マーカー遺伝子が除去される。
本発明においては、 前記核酸断片が特定の細胞および/または組織において発 現する遺伝子のプロモーターとリーダー配列コード領域との間の 5 '非翻訳領域 の一部もしくは全部をさらに含むこと、 ならびに前記外来 DNAのゲノムへの導入 のために使用された 1もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されている こと、 を特徴とする分化多能性を有する細胞が特に好ましい。
本発明の別の実施形態において、 前記特定の細胞および/または組織において 発現する遺伝子の対立遺伝子は不活性化されている。
本発明の別の実施形態において、 前記分化多能性を有する細胞は胚性幹 （ES) 細胞である。 ES細胞は、 例えばマウス ES細胞である。
.本発明せまた、 その第 2の態様において、 上記の非ヒ ト動物由来の分化多能性 を有する細胞を作製し、 宿主胚に導入し、 キメラ胚を得る工程、 該キメラ胚を同 種の仮親非ヒト動物に移植する工程、 移植したのち得られた仔動物の中から、 所 望の蛋白質をコードする外来 DNAを発現するキメラ非ヒト動物を選抜する工程を 含む、 該所望の蛋白質をコードする外来 DNAを過剰発現するキメラ非ヒ ト動物の 作製方法を提供する。
—実施形態において、 前記キメラ非ヒト動物はマウスである。
別の実施形態において、 前記分化多能性を有する細胞は ES細胞である。
本発明はさらに、 その第 3の態様において、 上記の方法によって作製された、 かつ所望の蛋白質をコードする外来 DNAが過剰発現することを特徴とするキメラ 非ヒ ト動物を提供する。 本発明はさらに、 その第 4の態様において、 上記のキメラ非ヒ ト動物同士、 ま たは該キメラ非ヒ ト動物とそれと同種の非ヒ ト動物、 を交配することにより作製 された、 かつ所望の蛋白質をコードする外来 DNAが過剰発現することを特徴とす る子孫非ヒ ト動物を提供する。
本発 Kはまた、 その第 5の態様において、 上記のキメラ非ヒ ト動物または子孫 非ヒ ト動物、 あるいは該動物由来の細胞、 組織またはハイプリ ドーマのいずれか を用いて所望の外来 DNAを発現し、 産生される該 DNAによってコードされる蛋白 質を回収することを含む、 蛋白質の製造方法を提供する。
本発明はまた、 その第 6の態様において、 上記のキメラ非ヒ ト動物または子孫 非ヒ ト動物の表現型を、 所望の蛋白質をコードする外来 DNAを含まない対応の野 生型非ヒ ト動物の表現型と比較し、それらの表現型の違いを決定することを含む、 所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする DNAの生体内機能を解析する方法 を提供する。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中で使用される 「ゲノム」 という用語は、 生物細胞の核に含まれる、 遺伝情報を担う染色体 DNAをいう。
本明細書中で使用される 「非ヒ ト動物」 という用語は、 ヒトを含まない動物を 意味し、 一般に魚類、 爬虫類、 両生類、 鳥類、 哺乳類からなる脊椎動物、 好まし くは哺乳類から選ばれる。 本発明ではキメラ非ヒ ト動物の作製において、 分化多 能性を有する細胞として胚性幹細胞を利用することが好ましいため、 胚性幹細胞 の樹立が可能な非ヒ ト動物 （たとえばマウス、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、ハムスター、 サル、 ャギ、 ゥサギ、 ラットなど）、 および将来的に胚性幹細胞の樹立が可能であ ろうその他の非ヒ ト動物のすべてが、本発明の意図する非ヒ ト動物に包含される。
「キメラ非ヒ ト動物」 とは、 分化多能性を有する細胞 （後述） に由来する分化 した細胞と、 宿主胚に由来する分化した細胞の両者から成り立つ動物を意味する
(Bradley ら， Nature, 309 : 255-6， 1984)。 実験的には、 すべての細胞が宿主胚 に由来する動物 （0 %キメラ） や、 すべての細胞が分化多能性を有する細胞に由 来する動物（100%キメラ）も誕生しうるものであり、厳密にはこれらの動物は「キ メラ」 ではないが、 便宜上 「キメラ非ヒ ト動物」 に包含されるものとする。 本明細書中で使用される 「分化多能性を有する細胞」 とは、 上述したキメラ非 ヒ ト動物を作製するにあたり、 宿主胚への注入、 あるいは集合胚形成によって、 キメラ非ヒ ト動物の 2種類以上の細胞または組織に分化可能な細胞を意味する。 具体的には、 胚性幹細胞 （ES細胞）、 胚性生殖細胞 （EG細胞）、 胚性腫瘍細胞 （EC 細胞） どが挙げられる。
本明細書中で使用される 「胚性幹細胞」 とは、 ES細胞 (embryonic stem cel l) とも称され、 未分化性 （全能性） を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初 期胚由来の培養細胞を意味する。 すなわち胚性幹細胞は、 動物の初期胚中の胚盤 胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、 未分化状態 を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。 また 「胚性生殖細 胞」 とは、 EG細胞とも称され、 上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを 特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。 胚性生殖細胞は、 受精後数 日〜数週間、 例えばマウスの場合には約 8. 5日経過した胚から得た始原生殖細胞 を培養し、 未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株であ る。
本明細書中で使用される 「所望の蛋白質」 とは、 本発明の方法により作製され るキメラ非ヒ ト動物の少なくとも 1種類の細胞および Zまたは組織において発現 させることが試みられる蛋白質であり、 その機能については既知である場合も、 未.知である場合もある。前記所望の蛋白質は、哺乳動物由来の機能性分泌蛋白質、 機能性膜蛋白質、 機能性細胞内または核内蛋 S質、 分泌シグナルが付加された機 能性膜蛋白質の可溶性部分などとすることができる。 ここで 「機能性」 とは、 生 体内において特定の働き、 作用または機能をもつことを意味する。 機能既知の蛋 白質の場合は、 当該蛋白質がキメラ非ヒ ト動物の少なくとも 1種類の細胞および
Zまたは組織における高発現の影響を観察することによって、 蛋白質の機能の相 互的関連について新たな知見を f导られる可能性がある。 機能未知の蛋白質の場合 は、 同じく高発現の影響を観察することによって、 当該蛋白質の機能解明につな がる知見を得られる可能性がある。 本発明において 「所望の蛋白質」 は、 導入す るキメラ非ヒト動物において発現するが、 発現させる対象となる特定の細胞およ び/または組織においては発現しないかもしくはわずかにしか発現しないものあ つてもよいし、 または異種動物由来のものであってもよく、 関心のあるものであ ればその種類を問わないものとする。
本明細書中で使用される 「所望の蛋白質をコードする核酸配列」 は、 内因性ま たは外因性 DNAのいずれでもよく、 また外因性 DNAにはヒ ト由来 DNAが包含され る。 ま こ本明細書においては、 「所望の蛋白質をコードする構造遺伝子」 という用 語も同義として用いる。
本明細書中で使用される、 蛋白質の 「発現」 とは、 その蛋白質をコードする遺 伝子の発現と同等の意味を有する。
本明細書中で使用される 「リーダー配列コード領域」 は、 特定の細胞および Z または組織において発現する遺伝子の翻訳開始コドンの 5 '上流の領域であって、 いわゆる前駆体蛋白質配列から成熟蛋白質配列部分を除いた N末端側配列部分を コードする核酸配列を含む領域を指し、 「分泌シグナル配列」 または 「シグナルぺ プチドコード領 」 (s ignal peptide coding region) をノ aむ。
本明細書中で使用される 「制御領域」 とは、 「制御配列」、 「調節配列」、 「調節領 域」 などの総称を意味し、 遺伝子発現 （転写、 翻訳または蛋白質合成） を制御ま たは調節する機能を有する領域を指す。 そのような制御領域としては、 限定する ものではないが、 プロモーター、 ェンハンサー、 サイレンサ一などが含まれる。 また、 本発明において 「制御領域」 とは、 1つの機能的なエレメント （例えば 1 つのプロ ータ一配列） を含むものであってもよいし、 または複数のエレメント を含むもの （例えば、 1つのプロモーター配列と 1つのェンハンサー配列など） であってもよい。 さらに 「プロモーター配列」 とは、 当業者に周知の制御領域の 1種であり、 転写開始時に RNAポリメラーゼが結合する構造遺伝子上流の塩基配 列を指す。
本明細書中で使用する 「インターナルリポゾ一マルエントリーサイ ト」 とは、
IRES ( internal ribosomal entry s ite) と PI各称され、 ポリシスト口ニックな発現 を可能にするェレメントとして知られており、 特殊な RNA二次構造を形成し、 そ の下流にある開始コドンからのリボソームによる翻訳開始を可能にする部位を指 す。 哺乳動物の場合、 IRESはリボゾームのデコードサブユニットに結合し、 これ により隣接する蛋白質コード領域をデコード部位に引き込むような立体構造変化 を起こして、 翻訳および蛋白質合成を開始する事象に関わると推定されている (Spahnら， Science 291 : 1959, 2001)。
本明細書中で使用する 「ポリ Aシグナル領域」 とは、 転写領域の終わりの部分 に位置し、転写後 mRNA前駆体の 3 ' 非翻訳領域へポリアデ二ル酸鎖付加を指令す る塩基 K列部分を指す。
本明細書中で使用する 「上流」 および 「下流」 とは、 ゲノム、 ポリヌクレオチ ドなどの核酸配列において、 それぞれ 5 ' 末端及び 3 ' 末端への方向を指す。 本明細書中で使用する 「bp (塩基対）」 及び 「Kb (キロ塩基対）」 とは、 核酸配 列の長さ及ぴ距離を指し、 1 bpが 1つの塩基対を表し、 1 Kbは lOOObpに相当す る。
本明細書中で使用する 「対立遺伝子」 とは、 倍数体のゲノムを有する生物にお いて、 相同染色体の相同な領域に位置し、 機能的にも相同な遺伝子をいう。 対立 遺伝子は通常全てが発現される。 また 「対立遺伝子排除」. とは、 生物個体で考え た場合、対立遺伝子の両方に由来する形質が表現されているにもかかわらず、個々 の細胞では対立遺伝子のどちらかのみがランダムに発現し、 他方の発現が排除さ れていることをいう。 例えば抗体や T細胞受容体の遺伝子に見られ、 一方の可変 領域遺伝子の組換えが信号となって完全な遺伝子が 1つしか完成されないことに よる。
本明細書中で使用する 「分泌シグナルを付加された膜蛋白質の可溶性部分」 と いう用語は、 膜蛋白質分子のうち、 分泌シグナル （またはシグナル配列） が結合 した細胞外ドメインを意味する。
本明細書中で使用する 「免疫グロブリン軽鎖遺伝子」 という用語は、 免疫グロ ブリン （Ig) 分子の軽鎖 （または L鎖） をコードしている遺伝子を指す。 軽鎖に は Κ鎖と λ鎖が含まれており、 可変 （V) 領域と定常 （C) 領域から構成されてい る。 また軽鎖遺伝子は、 1個の C領域遺伝子、 複数の V領域遺伝子、 および複数 の結合 （J)領域遺伝子から構成されている。本発明では軽鎖定常領域遺伝子が好 ましく、 特にマウスの分化多能性を有する細胞を使用する場合/ 軽鎖定常領域遺 伝子がさらに好ましい。 哺乳動物の中でも特にヒ トゃマウスのゲノム解析はほぼ 終了しており、 ゲノム情報は入手可能な状態にあること、 また解析の結果、 ゲノ ムにおける配列の相同性比較から、 ヒ トとマウスの間では約 85%の相同率であり、 かなり類似していることを考慮するならば、 動物種としてマウスの分化多能性を 有する細胞を使用するのが好ましいといえる。 しかし、 本発明では、 マウス以外 の動物 (例えば、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタ、 ハムスター、 サル、 ャギ、 ゥサギ、 ラッ トなど） の使用も可能であり、 免疫グロブリン遺伝子の配列決定がすでになされ ているものについては文献又は GenBank (米国 NCBI)、 EMBL (欧州 EBI)などのデー タベースからその情報を入手することができるし、 配列が不明の場合には、 制限 酵素によるゲノム DNAの断片化、 マッピング、 ゲノムライブラリ一の作成、 クロ 一二ング、 （自動）シークェンシングなどの慣用技術を組み合わせることによって 遺伝子の配列を決定できる （S. B.プリムローズ著、 藤山秋佐夫監訳、 ゲノム解析 ベーシック、 1996 年、 シュプリンガー ' フエアラーク東京）。 免疫グロブリン遺 - 伝子の配列情報は、例えば GenBank受託番号 NG004051 (マウス IgGえ）、 V01569 (マ ウス IgG K定常領域） として記載されており利用可能である。
本明細書中で使用する 「特定の細胞および Zまたは組織が欠損した非ヒト動物 系統の宿主胚」 または 「欠損宿主胚」 という用語は、 分化多能性を有する細胞を 注入するための宿主非ヒ ト動物胚であって、 当該細胞および Zまたは組織を欠損 する胚を意味する。
本明細書中で使用するキメラ非ヒ ト動物の 「子孫」 とは、 本発明のキメラ非ヒ ト動物同士、 あるいは本発明のキメラ非ヒ ト動物とそれと同種の非ヒ ト動物、 の 交配により得られ、 少なくとも特定の細胞および/または組織において所望の蛋 白質を発現する非ヒ ト動物を意味する。
本明細書中で使用する 「表現型」 とは、 動物が本来持つ形質、 または導入遺伝 子の結果現れる動物の形質を指す。
本明細書中で使用する 「増殖可能な腫瘍細胞」 とは、 腫瘍化することにより永 続的な増殖能を有する細胞を意味し、 例えば免疫グロプリンを産生する形質細胞 腫細胞 （ミエローマ細胞など） が挙げられる。
本明細書中で使用する 「ハイプリ ドーマ」 という用語は、 本発明のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫からの組織または細胞に由来する細胞と、 上記増殖可能な 腫瘍細胞とを融合させてできる雑種細胞を指す。 本明細書中で使用する 「ターゲティングベクター」 とは、 相同組換えにより目 的とする染色体領域に所望の蛋白質をコードする遺伝子の発現ュニットを導入し、 該所望の蛋白質を発現させるために用いるベクターを指す。 本明細書中で使用す る 「ノックアウトベクター」 とは、 相同組換えにより非ヒ ト動物の目的とする遺 伝子を ίί皮壌または不活性化するためのベクターを指す。 また 「ノックアウト」 も しくは 「遺伝子ノックアウト」 とは、 目的とする遺伝子座位に相同組換えにより 当該遺伝子の発現を阻害する構造を導入し、 該目的の遺伝子を破壊または不活性 化することを意味する。
本明細書中で使用する「RS (Recombining segment)エレメント」 という用語は、 6番染色体上のマウス免疫グロブリン K軽鎖定常領域遺伝子の約 25Kb 下流に位 置し、 nonamer 及び heptamer s ignal sequence (下線部分) を持つ以下の酉己歹 (1 gtttctgcacgggcagtcagttagcagcactcactgtg (酉己列番"^ 65) ) 指す (Daitch ら、 J. Immunol . , 149： 832-840， 1992)。 λ鎖発現 B細胞の多くは解析の結果、 C κエタソンないしは J κ - C /c領域が欠失しているが、 これらの欠失はマウス 6番 染色体上の C Kエタソン下流 25Kbに位置する DNA配列 (Recombining sequence or RS エレメント） との糸且み換えによるものであることが報告されている （Durdik ら、 Nature, 307， 749-752, 1984； Moore ら、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA；)。 マ ウス以外の哺乳動物にもゲノム免疫グロブリン遺伝子の下流に RS エレメントと 同等の機能を有する領域があり、 外来 DNAをゲノムに相同的に組み込む際に、 RS エレメントと同様にこの領域に薬剤耐性マーカー遺伝子を組み込むことによって、 外来 DNAの相同組換え率を向上させることができる。
本発明は、 本発明のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫、 あるいは該動物由来の 細胞、 組織またはハイプリ ドーマは、 従来と比べて有意に高いレベル、 例えば数 百倍高いレベル、 の外来 DNA発現を可能にするという利点を付与する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-014826号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 pPSs hEPO in vitro用ベクターの構造を示す。 5 ' ェンハンサー：マウ ス IgKの 5， ェンハンサー領域、 PSプロモーター：マウス Ig/cプロモーター領域 PS、 シグナルペプチドコード領域 (Signal peptide cording region) ： PSプロモ —ター下流のマウス IgKシグナルぺプチドコード領域、 イントロン：マウス Ig/ シグナルぺプチドコード領域にはさまれたィントロン領域、 hEP0(- SP)：固有のシ グナルペプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 polyA:マウス IgKポリ A シグナル領域、 3， ェンハンサー：マウス IgKの 3， ェンハンサー領域、 Amp:アン ピシリン耐性遺伝子。
図 2は、 pNPs hEPO in vitro用ベクターの構造を示す。 5' ェンハンサー：マウ ス IgKの 5， ェンハンサー領域、 NPプロモーター：マウス Igfcプロモーター領域 NP、 シグナルぺプチドコード領域： NPプロモーター下流のマウス Igftシグナルぺ プチドコード領域、 イントロン：マウス IgKシグナルぺプチドコード領域にはさ まれたィントロン領域、 hEPO(-SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たな ぃヒ ト EP0遺伝子、 ポリ A:マウス Ig/ ポリ Aシグナル領域、 3， ェンハンサー： マウス Ig/cの 3， ェンハンサー領域、 Amp:アンピシリ ン耐性遺伝子。
図 3は、 pCks hEPO in vitro用ベクターの構造を示す。 5' ェンハンサー：マウ ス IgKの 5' ェンハンサー領域、 P2プロモーター：マウス Ig/cプロモーター領域 2、 hEPO:ヒ ト EP0遺伝子、 ポリ A:マウス IgKポリ Aシグナル領域、 3' ェンノヽン サー：マウス IgKの 3' ェンハンサー領域、 Amp:アンピシリン耐性遺伝子。
図 4は； ミエローマ細胞に pNPs hEPO in vitro用ベクター、 pPSs hEPO in vitro 用ベクター、 pCks hEPO in vitro用ベクターを導入後、 取得された RNAを用いた RT-PCR 解析実施結果を示す。 hEPO： ヒ ト EP0、 RT (-) ：逆転写反応を行わず PCR を実施。
図 5は、 ミエローマ細月包に pCks hEPO in vitro用ベクター、 pNPs hEPO in vitro 用ベクター、 pPSs hEPO in vitro用ベクターを導入後、 ELISAを用いて培養上清 中のヒ ト EP0濃度を測定した値を示す。 図 5Aは測定値の棒グラフを、 図 5Bは測 定値の平均値をそれぞれ示す。
図 6 は 、 マ ウ ス RS エ レ メ ン ト タ 一 ゲテ ィ ン グ用 ベ ク タ ー pBlueRS- LoxP - Neo- DT - A- 3， KO-5' K0の構造を示す。 5， K0：マウス RSエレメン ト 5' 上流領域、 Neor： ΙοχΡ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 3 ，K0：マウス RSエレメント 3，下流領域、 DT-A： ジフテリァトキシン A鎖遺伝子、 およぴ pBluescript： クロ一ユングベクター。
図 7は、マウス RSエレメントの代わりにネオマイシン耐性遺伝子が挿入された アレル構造 （図 7A) およびサザン解析用プローブの位置（図 7B)を示す。 5 ' ゲノ ム： マ ス RSエレメント 5 ' 上流領域， 3 ' ゲノム： マウス RSエレメント 3 ' 下流 領域， 5 ' プローブ：ターゲティングベクタ一の 5 ' 側揷入確認用サザン解析プロ ープ， 3， プローブ： ターゲティングベクターの 3 ' 側挿入確認用サザン解析プロ ーブ， loxP- Neo- loxP : loxP配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子。 図 8は、 pC /c P2 KIベクターの構造を示す。 プロモーター 2 ：マウス Ig Kプロ モータ—領域 2、 MCs： マルチクローニング部位、 C /c ： マウス Ig /c遺伝子定常領 域、 完全長 C /cポリ A： C κ終止コドン下流 436bpからなるマウス Ig κポリ Αシグ ナル領域、部分長 C fcポリ A： C K終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig Kポリ Aシグナル領域、 loxP- Puro： loxP配列をその両端に持つピュー口マイシン耐性遺 伝子、 DT- A： ジフテリァ トキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript ： クローニン 々ベ々タ ' ~~ o
図 9は、 ヒ ト EP0 遺伝子がクローユングサイ トに揷入された pC / P2 hEPO KI ベクター構造を示す。 プロモーター 2 ： マウス Ig / プロモーター領域 2、 hEPO ： ヒ ト EP0遺伝子、 C κ ：マウス Ig κ遺伝子定常領域、 完全長 C κポリ A ： C κ終止 コドン下流 436bpからなるマウス Ig /cポリ Aシグナル領域、 部分長 C /cポリ A： C κ終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig / ポリ Aシグナル領域、 loxp - Puro ： loxP配列をその両端に持つピュー口マイシン耐性遺伝子、 DT-A：ジフテリアトキ シン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クローニングベクター。
図 1 0は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo) がターゲテイングされたアレル構造、 ヒ ト EP0遺伝子 +薬剤耐性遺伝子 （loxp- puro) が pCk hEPO KIベクターを用いて ターゲティングされたアレル構造、 2種の薬剤耐性遺伝子（loxp- neo， loxp-puro) が同時に除去されたァレル構造およびサザン解析用プロ一ブの位置を示す。 hEPO： ヒト EP0遺伝子、 C fc ：マウス Ig / 遺伝子定常領域、 loxp- puro： loxP配列 をその両端に持つピュー口マイシン耐性遺伝子、 loxp- neo： loxP配列をその両端 に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3， プローブ： hEPO+loxp- puro 遺伝子導入お よび loxp- puro遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、 RS3' プローブ ： loxp-neo 遺伝子導入おょぴ除去クローン選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI 制限酵素サイ ト。
図 1 1は、 固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子がク ローニングサイ トに揷入された pNPhEPOKI ベクターの構造を示す。 NPプロモー ター：マウス IgKプロモーター領域 NP、 シグナノレペプチドコード領域： NPプロモ 一ター下流のマウス Igf シグナルぺプチドコード領域、 hEP0(- SP)：固有のシグナ ルぺプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 完全長 C κポリ A： C /c終止コ ドン下流 436bpからなるマウス Ig Kポリ Aシグナル領域、 部分長 C/cポリ A： CK 終止コ ドン下流 309bpからなるマウス Ig κポリ Aシグナル領域、 C K ：マウス Ig κ遺伝子定常領域、 loxp- Puro： ΙοχΡ 配列をその両端に持つピューロマイシン耐 性遺伝子、 DT- A： ジフテリァトキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クロー ユングべクター。
図 1 2は、 ヒ ト EP0遺伝子 +薬剤耐性遺伝子 （loxp - puro) が pNPhEPOKIベタ ターを用いてターゲティングされたァレル構造およびサザン解析用プローブの位 置を示す。 liEP0(- SP)：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺 伝子、 ：マウス IgK遺伝子定常領域、 loxp- puro： ΙοχΡ配列をその両端に持つ ピューロマイシン H"性遺伝子、 Ck3， プローブ： hEP0(-SP)+loxp- puro遺伝子導入 クローン—選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 1 3は、 固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子がク ローニングサイ トに揷入された pPS hEPOKI ベクターの構造を示す。 PSプロモー ター：マウス IgKプロモーター領域 PS、 シグナノレぺプチドコード領域： PSプロモ 一ター下流のマウス Ig/ シグナルぺプチドコード領域、 hEP0(- SP)：固有のシグナ ルペプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 完全長 Cfcポリ A : C/c終止コ ドン下流 436bpからなるマウス Ig /cポリ Aシグナル領域、 部分長 C κポリ A： C /c 終止コ ドン下流 309bpからなるマウス Ig κポリ Aシグナル領域、 C /i ：マウス Ig K遺伝子定常領域、 loxp- Puro： ΙοχΡ 配列をその両端に持つピューロマイシン耐 性遺伝子、 DT- A： ジフテリァトキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript ： クロー ユングべクター。 図 1 4は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo) がターゲテイングされたアレル構造、 ヒ ト EP0 +薬剤耐性遺伝子 （loxp- puro) が pPS hEPO KIベクターを用いてターゲ ティングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp-neo, loxp- puro) が除去され たアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。 hEP0 (- S P )：固有のリ ーダー配列コード領域を除去したヒ ト EP0遺伝子、 C /t ： マウス Ig K遺伝子定常 領域、 loxp- puro： Ι οχΡ 配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、 loxp-neo： ΙοχΡ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3 ' プローブ： hEPO (-SP) +loxp-puro遺伝子導入および loxp- puro遺伝子除去クローン選別用サ ザン解析プローブ、 RS3， プローブ： loxp- neo 遺伝子導入および除去クローン選 別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 1 5は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp-neo) がターゲティングされたアレル構造、 ヒ ト EP0 +薬剤耐性遺伝子 （loxp- puro) が pCkP2 hEPO KIベクターを用いてター ゲティングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo, loxp - puro) が除去さ れたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。 hEPO : ヒ ト EP0遺伝 子、 C K; ：マウス Ig K遺伝子定常領域、 loxp- puro： ΙοχΡ配列をその両端に持つピ ユーロマイシン耐性遺伝子、 Ck3， プローブ： hEPO+loxp- puro 遺伝子導入おょぴ loxp- puro遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サ ィ 卜。
図 1 6—は、 CkP2 hEPOマウス ES細胞、 NP hEPOマウス ES細胞、 PS hEPOマウス
ES細胞、 RSエレメント · ターゲテイング 'マウス ES細胞より作製されたキメラ マウス （1週齢から 4週齢） の脾臓より調製された RNAを用いた RT - PCR解析実施 結果 （ァガロースゲル電気泳動のバンドを示す）。 CkP2： CkP2 hEPOマウス ES細 胞より作製されたキメラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、 NP： NP hEPO マウス ES細胞より作製されたキノラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、
PS： PS hEPOマウス ES細胞より作製されたキメラマウスの脾臓から得られたサン プルの結果、 RSe： RSエレメント ·ターゲテイング ·マウス ES細胞より作製され たコントロールキメラマウスの脾臓から得られたサンプルの結果、 EP0 :ヒ ト EP0、
GAPDH ： マ ウスグリセルアルデヒ ドー 3—ホス フエ一 トデヒ ドロゲナーゼ
(Glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase) , RT+：逆転写反応後に PCRの実 施、 RT-：逆転写反応を行わず PCRの実施。
図 1 7は、 CkP2 hEPOマウス E S細胞由来キメラマウス、 NP hEPOマウス ES細 胞由来キメラマウス、 PS hEPO マウス ES 細胞由来キメラマウス、 CkP2 Δ Ρ EPO マウス TT2F細胞由来キメラマウス、 CkP2 l oxP hEPOマウス ES細胞由来キメラマ ウス、 PS l oxP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウスにおける 1週齢から 8週齢 までの血清中ヒ ト EP0濃度を示す。 図 17Aは測定値のグラフを、 図 17Bは測定値 をそれぞれ示す。 （数字） ：測定検体数を示す。
図 1 8は、 pCk l oxPV KI ベクターの構造を示す。 プロモーター 2 ：マウス Ig κプロモーター領域 2、 MCS： マルチクローニング部位、 C K ： マウス I g K遺伝子 定常領域、 完全長 C κポリ A： C κ終止コドン下流 436bpからなるマウス Ig κポリ Aシグナル領域、 部分長 C icポリ A： C K終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig Kポリ Aシグナル領域、 l oxPV- Puro：変異型 loxP配列をその両端に持つピュー口 マイシン耐性遺伝子、 DT-A：ジフテリアトキシン A鎖遺伝子、および pBluescr ipt： クローニングべクター。
図 1 9は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp-neo) がターゲティングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxpv- puro) が pCk l oxPV KIベクターを用いてターゲティング されたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （l oxp- neo， l oxpv - puro) が除去されたァレ ル構造おょぴサザン解析用プローブの位置を示す。 C /c ： マウス Ig /c遺伝子定常 領域、 loxpv- puro： l oxP配列の一部変異配列である l oxPV配列をその両端に持つ ピュー口マイシン耐性遺伝子、 l oxp-neo： l oxP配列をその両端に持つネオマイシ ン而ォ性遺伝子、 Ck3， プローブ： loxpv - puro遺伝子導入および loxpv- puro遺伝子 除去クローン選別用サザン解析プローブ、 RS3 ' プローブ： l oxp- neo 遺伝子導入 および除去クローン選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 2 0は、ヒ ト EP0遺伝子がクローニングサイ トに揷入された pCk loxPV hEPOKI ベクター構造を示す。 プロモーター 2 ： マウス I g Kプロモーター領域 2、 hEPO： ヒ ト EP0遺伝子、 C κ ：マウス Ig κ遺伝子定常領域、 完全長 C κポリ A： C κ終止 コドン下流 436bpからなるマウス Ig / ポリ Aシグナル領域、 部分長 C Κポリ A： C κ終止コ ドン下流 309bpからなるマウス Ig κポリ Aシグナル領域、 loxPV-Puro：
1 oxP配列の一部変異配列である 1 oxPV配列をその両端に持つピューロマイシン耐 性遺伝子、 DT- A： ジフテリァトキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クロー ユングベクター。
図 2 1は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp-neo) がターゲテイングされたアレル構造、 ヒ ト EP0遺伝子 +薬剤耐性遺伝子 （loxpv-puro) が pCk loxPV hEPO KIベクター を用いてターゲティ ングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp - neo， 1 oxpv-puro)が除去されたァレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。 hEPO ： ヒ ト EP0遺伝子、 C fc ： マウス Ig f 遺伝子定常領域、 loxpv-puro： ΙοχΡ配 列の一部変異配列である loxPV配列をその両端に持つピュー口マイシン耐性遺伝 子、 loxp-neo： ΙοχΡ 配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3 ' プロ ーブ： hEPO+loxpv-puro遺伝子導入および loxpv- puro遺伝子除去クローン選別用 サザン解析プローブ、 RS3 ' プローブ： loxp- neo 遺伝子導入および除去クローン 選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 2 2は、 ヒ ト EP0遺伝子がクローニングサイ トに揷入された pNP loxPV hEPO KIベクター構造を示す。 NPプロモーター：プロモーター 2よりも約 300bp長い上 流配列を持つマウス Ig Kプロモーター領域、 シグナルぺプチドコード領域： NP プ 口モーター下流のマウス I g Kシグナルぺプチドコード領域、 hEP0 (- SP)：固有のシ ダナルぺプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 完全長 C /cポリ A : C /t終 止コドン下流 436bpからなるマウス Ig κポリ Aシグナル領域、部分長 C κポリ A： C f?終止 ドン下流 309bpからなるマウス Ig Kポリ Aシグナル領域、 loxPV- Puro： 1 oxP配列の一部変異配列である 1 oxPV配列をその両端に持つピューロマイシン耐 性遺伝子、 DT- A： ジフテリァトキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クロー ニングべクター。
図 2 3は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo) がターゲティングされたァレル構造、 ヒ ト EP0遺伝子 +薬剤耐性遺伝子 （loxpv - puro) が pNP loxPV hEPO KIベクター を用いてターグティ ングされたア レル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp - neo， loxpv-puro)が除去されたァレル構造およびサザン解析用プロ一ブの位置を示す。 hEPO (-SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 C K ： マウス Ig /c遺伝子定常領域、 loxpv- pur。： Ι οχΡ配列の一部変異配列である loxPV 配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、 loxp-neo： ΙοχΡ配列をその 両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3， プローブ： hEPO+loxpv- puro遺伝子導 入および loxpv- puro遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、 RS3 ' プロ ーブ： loxp- neo 遺伝子導入おょぴ除去クローン選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 2 4は、 ヒ ト EP0遺伝子がクローニングサイ トに揷入された pUS hEPOKIべク ター構造を示す。 PSプロモーター：マウス Ig κプロモーター領域 PS、 シグナル ぺプチドコード領域： PSプロモーター下流のマウス Ig / シグナノレぺプチドコード 領域、 hEP0 (- SP)：固有のシグナルぺプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 C /c ： マウス Ig /c遺伝子定常領域、 完全長 C fcポリ A： C / 終止コ ドン下流 436bp からなるマウス Ig Kボリ Aシグナル領域、 部分長 C Kポリ A： C /c終止コドン下流 309bpからなるマウス Ig )cポリ Aシグナル領域、 loxPV - Puro： ΙοχΡ配列の一部変 異配列である loxPV配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、 DT - A： ジフテリアトキシン A鎖遺伝子、 および pBluescript： クローニングベクター。 図 2 5は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo) がターゲティングされたアレル構造、 ヒ ト EP0 +薬剤耐性遺伝子 （loxpv- puro) が pPS loxPV hEPO KIベクターを用い てターゲティングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp - neo, loxpv- puro) が除去されたアレル構造およびサザン解析用プローブの位置を示す。 hEP0 (- SP) ： 固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒ ト EP0遺伝子、 C /c ： マウス Ig κ遺伝子定常領域、 loxpv- puro： ΙοχΡ配列の一部変異配列である loxPV配列をそ の両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、 loxp-neo： ΙοχΡ配列をその両端に持 つネオマイシン H!生遺伝子、 Ck3， プローブ： hEPO+loxpv- puro遺伝子導入および loxpv-puro 遺伝子除去クローン選別用サザン解析プローブ、 RS3 ' プローブ ： loxp- neo 遺伝子導入および除去クローン選別用サザン解析プローブ、 E： EcoRI 制限酵素サイ ト。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 特定の染色体領域に薬剤耐性マーカー遺伝子発現ュニットが挿入された分化 多能性を有する細胞の作製 . 本発明のキメラ非ヒ ト動物の作製方法では、 まず、 所望の蛋白質をコードする 核酸配列 （例えば、 構造遺伝子） を含む （あるいは、 ゲノム上に含む）、 非ヒ ト動 物由来の分化多能性を有する細胞を作製する。 この核酸配列は、 特定の細胞およ び/または組織において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現 が制御きれるように配置されたものである。
本発明において分化多能性を有する細胞としては、 上記定義に挙げたものを利 用することができるが、 マウス由来の胚性幹細胞 （ES細胞） が好ましい。 改変さ れる染色体領域としては、 RSエレメントが好ましく、 特にマウス 6番染色体上の 免疫グロプリン fc軽鎖定常領域遺伝子の約 25Kb下流に位置する RSエレメントが 好ましい。
また、 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子は、 組織特異的 に発現するものであってもよいし、または構成的に発現するものであってもよい。 本発明においては、 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の 近傍に、特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のプロモーターと 連結された cDNAを含む発現ュニットを挿入することにより、 該 cDNAが特定の細 胞および/または組織において発現する。 ここで特定の細胞および/または組織に おいて発現する遺伝子としては、非ヒト動物ゲノム上の内因性遺伝子だけでなく、 非ヒト動物個体の染色体外で維持され得る外来遺伝因子、 例えばプラスミ ドべク ター （E!brechtら、 Mol . Cel l Biol.， 7： 1276 - 1279， 1987)、 ヒ ト染色体あるい はその断片（Tomizukaら、 Nat. Genet. 16 133 - 143, 1997； Tomizukaら、 Proc. Natl .
Acad. Sc i . USA , 97， 722-727, 2000)、 またはヒ ト人工染色体ベクター （Kuroiwa ら、 Gene Therapy, 9, 708 - 712， 2002) などに含まれる遺伝子を用いることがで きる。 さらに、 非ヒ ト動物個体の染色体に挿入された外来遺伝子断片上の遺伝子 を用いることもできる （Mendez ら、 Nat. Genet. , 15， 146-156, 1997) 0 例えば、 富塚らはヒ ト 14番染色体断片 (SC20) を保持し、子孫伝達するトランスクロモソ ミックマウス系統について報告している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,
722-727, 2000)。 SC20断片はヒ ト免疫グロプリン重鎖遺伝子座全長を含み、 該ト ランスクロモソミックマウスにおいては、 ヒトで観察されるのと同様に多様なヒ ト免疫グロブリン重鎖が、 B リンパ球特異的に発現することが示されている。 す なわち、 SC20断片上のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座近傍に、 免疫グロブリン 重鎖プロモーターと cDNAが連結されている発現ュニットを揷入することにより、 Bリンパ球特異的な該 cDNAの発現が可能となる。
例えば組織特異的に発現する遺伝子としては、 免疫グロプリン軽鎖または重鎖 遺伝子、 T 細胞受容体遺伝子、 ミオグロビン遺伝子、 クリスタ リン遺伝子、 レニ ン遺伝子、 リパーゼ遺伝子、 アルブミン遺伝子などが挙げられる。 また構成的に 発現する遺伝子としては、 ヒポキサンチングァニンホスホリボシルトランスフエ ラーゼ （HPRT) 遺伝子などが挙げられる。 当該遺伝子がキメラ非ヒ ト動物におい て組織特異的に発現する遺伝子の場合には、 後述する宿主胚として、 当該遺伝子 の発現する細胞および/または組織が欠損した系統の胚を採用する。 当該遺伝子 が構成的に発現する遺伝子の場合は、 後述する宿主胚として、 任意の細胞おょぴ Zまたは組織が欠損した系統の胚を採用する。
所望の蛋白質をコードする核酸配列の配置 （すなわち、 連結または挿入） は、 少なくとも特定の細胞および Zまたは組織において発現する遺伝子の制御領域に よって所望の蛋白質の発現が制御されるような形態である必要がある。 従って、 該核酸配列は、 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領 域の下流に配置される。
あるいは、 該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、 特定の細胞および /また は.組織に'おレ、て発現する遺伝子の終止コドンとポリ Aシグナル領域をコードする 配列の間に、 インターナルリボゾーマルエントリーサイト （IRES) を配置し、 そ の IRESの下流に配置される。 すなわち、該核酸配列は、 ゲノム上において、 IRES と機能的に連結された状態で、 特定の細胞および/または組織において発現する 遺伝子の終止コドンとポリ Aシグナル領域をコードする配列との間に存在する。 ターゲティングベクターの構築に際して、 ポリ Aシグナル領域は上記特定の細胞 および/または組織において発 ¾する遺伝子のポリ Aシグナル領域を用いること ができるが、これに限定されるものではなレ、。例えば、シミアンウィルス 40 (SV40) 由来のポリ Aシグナル領域などの当技術分野で公知の他のポリ A配列を用いるこ ともできる。
また該所望の蛋白質をコードする核酸配列は、 特定の細胞および/または組織 において発現する遺伝子の終止コ ドンとポリ Aシグナル領域をコードする配列の 間に、 第 2のポリ Aシグナル領域をコードする配列、 そのポリ Aシグナル領域の 下流にプロモーター配列を配置し、 さらに該プロモーター配列の下流に配置され る。 すなわち、 該核酸配列は、 ゲノム上において、 プロモーター配列おょぴポリ A シグ+ル領域をコードする配列と機能的に連結された状態で存在し、 かつもと もとゲノム上に存在する特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子 もまたそのプロモーター配列おょぴポリ Aシグナル領域をコードする配列と機能 的に連結された状態で存在する。 ターゲティングベクターの構築に際して、 ここ で使用されるプロモータ一配列は、 上記特定の細胞および/または組織において 発現を制御するものであれば特に限定されることはないが、 好ましくは上記特定 の細胞および Zまたは組織において発現する遺伝子のプ口モーターが用いられる。 またターゲティングベクターにプロモーターが 2つ存在する場合には、 その 2つ のプロモーターは、 同じ細胞および Zまたは組織において発現を制御するもので あれば、 同じものであってもよいし異なるものであってもよい。 さらにターゲテ イングべクタ一の構築におレ、て使用されるポリ Aシグナル領域をコードする配列 としては、 当技術分野で公知のポリ Aシグナル領域であれば特に限定されるもの ではなく、 例えばプロモーターと同じ由来のポリ Aシグナル領域ゃシミアンウイ ルス 40 (SV40) 由来のポリ Aシグナル領域などが挙げられる。 またプロモーター の場合と同様に、 タ一ゲティングベクターに 2つのポリ Aシグナル領域をコード する配列が存在する場合には、 その 2つは同じものであってもよいし異なるもの であってもよレヽ。
さらにまた前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、 上記特定の細胞および
Zまたは組織において発現する遺伝子のポリ Aシグナル領域の下流に、 プロモー タ一配列、 核酸配列、 およびポリ Aシグナル領域をコードする配列の順に配置す ることもできる。 すなわち、 該核酸配列は、 プロモーターおよびポリ Aシグナル 領域をコードする配列と機能的に連結された状態 （例えば、 カセッ ト形式） で、 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリ Aシグナルの下流 に存在する。 ターゲティングベクターの構築に際して、 ここで使用されるプロモ 一ター配列は、 上記特定の細胞および/または組織において発現を制御するもの であれば特に限定されることはないが、 好ましくは上記特定の細胞および Zまた は組織において発現する遺伝子のプロモーターが用いられる。 さらにターゲティ ングベクターの構築においてポリ Aシグナル領域をコードする配列としては、 当 技術分野で公知のポリ Aシグナル領域であれば特に限定されるものではなく、 例 えばプロモーターと同じ由来のポリ Aシグナル領域やシミアンウィルス 40 (SV40) 由来のポリ Aシグナル領域などが挙げられる。 またターゲテイングベクターに 2 つのポリ Aシグナル領域をコードする配列が存在する場合には、 その 2つは同じ ものであってもよいし異なるものであってもよい。 前記特定の細胞おょぴ Zまた は組織において発現する遺伝子のポリ A シグナル領域の 3 ' 端と、 所望の蛋白質 をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の 5 ' 端の距離は、 上 記特定の細胞および/または組織において該核酸配列の発現が可能であれば特に 限定されるものではないが、距離が離れるに従い、転写産物である mRNAの安定性 に好ましくない影響が生じる可能性があり、 またターゲッティングベクターの構 造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。 これら の理由からポリ Aシグナル領域の 3 ' 端と、 所望の蛋白質をコードする核酸配列 の発現を制御するプロモーター配列の 5 ' 端の距離は 1 Kb以内であることが好ま しい。
また前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、 上記特定の細胞および Zまた は組織において発現する遺伝子のポリ Aシグナル領域の下流に、 上記特定の細胞 および/または組織において発現する遺伝子由来のプロモーター /5'非翻訳領域/ リ一ダー配列コ一ド領域からなる配列、 所望のタンパク質をコードする核酸配列 よりリーダー配列コ一ド領域を除去した配列、 およびポリ Aシグナル領域をコー ドする配列の順に配置することもできる。 すなわち、 該所望のタンパク質をコー ドする核酸配列より リーダー配列コ一ド領域を除去した核酸配列は、 プロモータ 一 /5'非翻訳領域/リーダー配列コード領域からなる配列およびポリ Aシグナル領 域をコ一ドする配列と機能的に連結された状態 (例えば、 カセット形式) で、 特 定の細胞および/または組織において発現する遺伝子のポリ Aシグナルの下流に 存在する。 ターゲティングベクターの構築に際して、 ここで使用されるプロモー ター /5，非翻訳領域/リーダー配列コード領域からなる配列は、 上記特定の細胞お よび/または組織において発現を制御するものであれば特に限定されることはな いが、 好ましくは上記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の プロモーター /5'非翻訳領域/リ一ダー配列コ一ド領域からなる配列が用いられる。 また、 プロモーター /5'非翻訳領域/リーダー配列コード領域からなる配列は、 ゲ ノム上に存在する一続きの配列のままであってもよいし、 プロモーター、 5'非翻 訳領域、 リーダー配列コード領域、 の各機能領域を人工的に連結させることによ り作製されたものであってもよい。 また、 ここで使用される 5 ' 非翻訳領域及ぴ リーダー配列コード領域にはイントロンが含まれてもよいし、 含まれなくてもよ い。 本発明における好ましい様態として、 プロモーター /5'非翻訳領域/リーダー 配列コード領域はマウス免疫グロブリン/ c軽鎖遺伝子由来のものである。 マウス 免疫グロブリン K軽鎖遺伝子においては、 ゲノム上に多数の可変 （V)領域セグメ ントが存在し、 それぞれが固有のプロモーター /5'非翻訳領域/リ一ダー配列コ一 ド領域を伴っている。マウス免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子由来のプロモータ一 /5， 非翻訳領域/リーダー配列コード領域としては、 多数存在する可変 （V) 領域のい ずれに付随するプロモータ一 /5'非翻訳領域/リーダー配列コ一ド領域を使用して もよい。 マウス免疫グロブリン fc軽鎖遺伝子由来のプロモーター /5'非翻訳領域/ リーダー配列コード領域として好ましくは、実施例記載の NP型であり、 さらに好 ましくは実施例記載の PS型である。
さらにターゲティングベクターの構築においてポリ Aシグナル領域をコードす る配列としては、 当技術分野で公知のポリ Aシグナル領域であれば特に限定され るものではなく、 例えばプロモーターと同じ由来のポリ Aシグナル領域ゃシミア ンウィルス 40 (SV40) 由来のポリ Aシグナル領域などが挙げられる。 またターゲ ティングベクターに 2つのポリ Aシグナル領域をコードする配列が存在する場合 には、 その 2つは同じものであってもよいし異なるものであってもよレ、。 ポリ A シグナル領域をコードする配列として好ましい様態はマウス免疫グロプリン κ鎖 遺伝子 C /cェクソン下流に位置するポリ Aシグナルである。 前記特定の細胞およ ぴ Zまたは組織において発現する遺伝子のポリ Aシグナル領域の 3 ' 端と、 所望 の蛋 ή質をコードする核酸配列の発現を制御するプロモーター配列の 5， 端の距 離は、 上記特定の細胞および/または組織におレ、て該核酸配列の発現が可能であ れば特に限定されるものではないが、 距離が離れるに従い、 転写産物である mRNA の安定性に好ましくない影響が生じる可能性があり、 またターゲツティングべク ターの構造が大きくなることからそのような構成のベクターの作製が困難になる。 これらの理由からポリ Aシグナル領域の 3 ' 端と、 所望の蛋白質をコードする核 酸配列の発現を制御するプロモーター配列の 5 ' 端の距離は 1 Kb以内であること が好ましい。
所望の蛋白質をコードする核酸配列 （例えば、 構造遺伝子など） を前記制御領 域の近傍に配置する場合には、核酸配列を該制御領域の近傍に挿入してもよいし、 または、 E S細胞の片側のアレルについて、 単に当該細胞および/または組織に おいて発現する遺伝子の制御配列の直下に、 本来の構造遺伝子を置換するような 態様で配置することもできる。 所望の蛋白質をコードする核酸配列に置換された 本来の構造遺伝子は、 もう片側のアレルによって発現されるので、 細胞および/ または組織は正常な状態を保ちうる。
免疫グロプリン κ鎖遺伝子の発現は、 前述した通り多数の Vおよび J遺伝子断 片が、 組換えにより結合することより起こる。 この結合の結果、 各 V遺伝子断片 の上流近傍にあるプロモータ一配列は J断片下流に存在するェンハンサー配列の 近傍に配置される。 このような状況において、 ェンハンサー配列は初めて該プロ モーターを活性化することができる （Picard ら、 Nature, 307 : 80-2, 1984)。 す なわち、 前記所望の蛋白質をコードする核酸配列は、 人為的に免疫グロブリン κ 鎖遺伝子のプロモータ一配列と連結した形で、 前記ェンハンサー配列の近傍に配 置することもできる。 また所望のタンパク質をコードする核酸配列よりリーダー 配列コ一ド領域を除去した配列は、 人為的に免疫グロブリン K鎖遺伝子由来のプ 口モーター /5'非翻訳領域/リーダ一配列コード領域からなる配列と連結した形で、 前記ェンハンサー配列の近傍に配置することもできる。 免疫グロブリン; c鎖遺伝 子座には前記ェンハンサ一配列以外にもさらに下流にェンハンサー配列が存在す ることが知られており （Meyer ら、 EMBO J. 8 : 1959-64， 1989) , 該遺伝子はこの ように複数のェンハンサ一の影響のもと B細胞において高発現することができる。 上述したような所望の蛋白質をコードする核酸配列をゲノム上に含む非ヒ ト動 物由来の分化多能性を有する細胞を、.以下遺伝子導入細胞または遺伝子導入 ES 細胞とも呼び、 これらの細胞は、 限定するものではないが、 例えば以下に記載す るように得ることができる。
1 - 1 · 遺伝子導入 ES細胞の取得
( 1 ) RSエレメント · ターゲティングベクターの構築
マウス RSエレメント配列の上流及び下流領域にゲノム配列を持ち、 RS エレメ ント配列の位置に選択マ一カーが代わりに揷入された RSエレメント 'ターゲティ ングベクターを構築する。
マウス RSエレメン 1、配列の上流及び下流ゲノム領域の配列は、ある一定以上の 塩基数で構成されていればよく、 例えばそれぞれ 2 Kb以上、 上流及ぴ下流合わせ て 7 Kb以上の配列で構成されるのが望ましい。
更に、ベクターには RSエレメント配列の位置に選択マーカーが代わりに挿入さ れるが、 例えばネオマイシン耐性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺伝子、 ブラス トサイジン耐性遺伝子、 GFP遺伝子などを用いることが出来る。
更に、 ターゲティングベクターの構造に、 相同組換えの効率を上げるための改 変を施すことができる。 すなわち、 ゲノム中にターゲテイングべクタ一がランダ ム挿入された細胞を排除するためのネガテイブセレクションマーカーが、 ターゲ ティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように操作す ることによって、 相同組換えの効率を上げることができる。
具体的'には、 線状化されたターゲテイングベクターにおいて、 ネガティブセレ クシヨンマーカーとして機能する遺伝子構造の 5 ' 端および 3 ' 端が、 ターゲティ ングベクターのそれぞれ 5， および 3， 端から少なく とも 1 Kb、 好ましくは 2 Kb 以上離れるよう操作することが望ましい。 通常、 ネガティブセレクショ ンマーカ 一の 5 ' 端または 3 ' 端の一方には、 ゲノムとの相同組換えのための領域 （相同組 換え領域） が位置するため、 ベクター端からの距離は 3 Kb以上となることがほと んどである。 一方、 ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、 ベクタ 一端に近接している場合が多い。 本発明では、 ネガティブセレクションマーカー の、 相同組換え領域と隣接していない端に、 線状化ベクターの末端から少なく と も l kb の距離を設けるよう操作し、 それにより相同組換えの効率を上昇させる。 ベクター端からの距離を確保するための配列としては、 ターゲティングベクター 構築の際に使用する pUCなどのプラスミ ドの配列をそのまま残して （すなわち線 状化する際に削除しない） 利用することもできるし、 また、 目的とするターゲテ ィング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブセレクシ ヨンマ一力一の隣に配置することも可能である。 ベクターの線状化は、 使用して いるターゲティングベクターの制限酵素認識部位を精査し、 ベクター端とネガテ ィブセレクションマーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位 を選択してベクターを線状化することによって、 相同組換え効率を改善させると いう効果を達成することができる。 また、 そのような適当な制限酵素部位が見つ からない場合であっても、 PCRを用いた手法（Akiyamaら、 Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 16, E77. ) により、 適当な制限酵素認識配列をターゲティング ベクターの所望の位置に導入することができる。
上述したようなターゲティングべクタ一構造をとることにより、 ネガティブセ レクションマーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、 相同 組換えの効率が上昇するものと考えられる。
すなわち、 本発明は、 ターゲティングべクタ^"において、 ネガティブセレクシ ョンマーカーとして機能する遺伝子構造の 5 ' 端および 3 ' 端が、 線状化したター ゲティングベクターのそれぞれ 5 ' 端および 3 ' 端から少なく とも 1 Kb、 好ましく は 3 Kb以上離れていることを特徴とする遗伝子ターゲティングベクター、ならび に該ターゲティングベクターを用いた遺伝子ターゲティング方法を提供する。 前 記ターゲティングベクターにおいて、 ネガティブセレクションマーカーとしては 公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、 好ましくは'ジフテリァト キシン A遺伝子である。
( 2 ) RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞の取得
マウス ES細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウ スを交配することにより得られる受精後 2 . 5日の胚を採取し、 ES細胞用培地中 でインビトロ培養し、 該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、 そし て該胚を、 フィーダ一細胞培地中に播種して培養し、該培養胚から ES様形態で生 育しているものの細胞塊をトリプシンを含有する ES 細胞用培地を用いて分散処 理、 及び、 フィーダ一細胞培地を用いて培養し、 更には ES細胞用培地を用いて継 代培養し増殖する細胞を単離する。
ターグティングベクタ一を用いた、 RSエレメント ·ターゲティング ·マウス ES 細胞の取得は、 当技術分野で公知の手法、 例えば相沢慎一、 バイオマニュアルシ リーズ 8 ジーンターゲティング、 1995 年、 羊土社 （日本国） 等に記載された方' 法によって行うことができる。例えば、上記作製したターゲティングベクターを、 エレク トロポレーション、リポフエクション法などによりマウス ES細胞に導入し、 RSエレメントを欠失し、 かつその領域に耐性遺伝子が挿入されたマウス ES細胞 を取得することが出来る。 上記操作によって、 免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝 子下流の染色体領域における相同組み換え効率が向上したマウス ES 細胞が取得 される。
( 3 ) ターゲテイングベクターの構築
最初に、 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の下流に、 所 望の蛋白質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列が プロモーター /5'非翻訳領域/リーダー配列コード領域からなる配列およびポリ A シグナル領域をコードする配列と機能的に連結された状態 （例えば、 カセット形 式） で挿入されたターゲティングべクタ一を構築する。
導入する核酸配列は、 分泌タンパク質のリーダー配列検定用のコンピューター プログラムであるシグナル P等により予測されるリーダーアミノ酸配列と成熟タ ン.パク質'産物の境界点から終止コドンまでを含んでいれば cDNA でもイントロン を含むゲノム DNAであってもよく、 該核酸配列によってコードされる蛋白質の種 類はいかなるものでもよい。 本発明で使用される核酸配列は、 それによつてコー ドされる蛋白質の高発現 ·分泌のために使用されてもよいし、 該蛋白質の機能を 解明するために使用されてもよい。 したがって、 導入する核酸配列はその塩基配 列が特定されるならば、 いずれの種類のものでも使用可能である。 核酸配列 （構 造遺伝子） の例としては、 哺乳動物、 好ましくはヒ ト、 由来の機能性蛋白質をコ ードする遺伝子、 たとえば分泌蛋白質をコードする遺伝子、 膜蛋白質をコードす る遺伝子、 細胞内または核内蛋白質をコードする遺伝子、 などが挙げられる。 特定の細胞および Zまたは組織において発現する遺伝子の下流に、 所望の蛋白 質をコードする核酸配列よりリーダー配列コード領域を除去した配列がプロモー ター /5'非翻訳領域/リーダー配列コード領域からなる配列およびポリ Aシグナル 領域をコードする配列と機能的に連結された状態 （例えば、 カセッ ト形式） で挿 入されるように動物のゲノムを改変するために、 ターゲティングベクターを準備 し、 このベクター DNA に所望の蛋白質をコードする核酸配列より リーダー配列コ 一ド領域を除去した配列がプロモーター /5'非翻訳領域/リーダー配列コード領域 からなる配列およびポリ Aシグナル領域をコードする配列と機能的に連結された 状態 （例えば、 カセット形式） の核酸配列を挿入する。 この目的のために使用可 能なベクターの例は、 プラスミ ド、 ウィルスなどであり、 当業者であればターゲ ティングベクターとして使用可能なベクターを容易に選択し、 入手することがで きる。 ベクターの具体例は、 限定するものではないが、 p Ck l oxPV KIベクター
(後述の実施例参照） である。 ターゲティングベクターは、 特定の細胞およびノ または組織において発現する遺伝子のポリ Aシグナル領域の下流に、 前記カセッ トの揷入部位として適当な制限酵素切断部位が配置される。更に、ベクターには、 必要に応じて選択マーカー、 たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、 ネオマイシ ン耐性遺伝子、ブラス トサイジン耐性遺伝子、 GFP遺伝子等を含むことができる。
( 4 ) 非ヒ ト動物由来の分化多能性を有する細胞へのターゲティングベクターの 導入、 および相同組換え体の選択
ターゲティングベクターによる非ヒ ト動物由来の分化多能性を有する細胞の形 質 換は—、 当技術分野で公知の手法、 例えば相沢慎一 （上記） 等に記載された方 法によって行うことができる。例えば、上記作製したターゲテイングベクターを、 エレク トロポレーション、 リポフエクション法などにより分化多能性を有する細 胞に導入することができる。
さらに、 ターゲテイングベクターの構造に、 相同組換えの効率を上げるための 改変を施すことができる。 すなわち、 ゲノム中にターゲテイングベクターがラン ダム挿入された細胞を排除するためのネガティブセレクションマーカ一が、 ター ゲテイングベクターが線状化された際にべクタ一の端部に露出しないように操作 することによって、 相同組換えの効率を上げることができる。
具体的には、 線状化されたターゲテイングベクターにおいて、 ネガティブセレ クシヨンマーカーとして機能する遺伝子構造の 5 ' 端および 3 ' 端が、 ターゲティ ングベクターのそれぞれ 5' および 3 ' 端から少なく とも 1 Kb、 好ましくは 2 Kb 以上離れるよう操作することが望ましい。 通常、 ネガティブセレクションマーカ 一の 5 ' 端または 3 ' 端の一方には、 ゲノムとの相同組換えのための領域 （相同組 換え領域） が位置するため、 ベクター端からの距離は3 Kb以上となることがほと んどである。 一方、 ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、 ベクタ 一端に近接している場合が多い。 本発明では、 ネガテイブセレクションマーカー の、 相同組換え領域と隣接していない端に、 線状化ベクターの末端から少なく と も l kb の距離を設けるよう操作し、 それにより相同組換えの効率を上昇させる。 ベクター端からの距離を確保するための配列としては、 ターゲティングベクター 構築の際に使用する pUCなどのプラスミ ドの配列をそのまま残して （すなわち線 状化する際に削除しない） 利用することもできるし、 また、 目的とするターゲテ ィング領域に非相同な任意の新たなノンコーディング配列をネガティブセレクシ ヨンマーカーの隣に配置することも可能である。 ベクターの線状化は、 使用して いるターゲテイングベクターの制限酵素認識部位を精查し、 ベクタ一端とネガテ イブセレクションマーカーの端とが距離を確保できるような適当な制限酵素部位 を選択してベクターを線状化することによって、 相同組換え効率を改善させると いう効果を達成することができる。 また、 そのような適当な制限酵素部位が見つ からない場合であっても、 PCRを用いた手法（Akiyamaら、 Nucleic Acids Research, 20.00， Vol . 28, No. 16, E77. ) により、 適当な制限酵素認識配列をターゲティング ベクターの所望の位置に導入することができる。
上述したようなターゲティングベクタ一構造をとることにより、 ネガティブセ レクションマーカーが細胞中でヌクレアーゼの攻撃を受ける頻度が低下し、 相同 組換えの効率が上昇するものと考えられる。
すなわち、 本発明は、 ターゲテイングベクターにおいて、 ネガティブセレクシ ヨンマーカーとして機能する遺伝子構造の 5 ' 端および 3 ' 端が、線状化したター ゲティングベクターのそれぞれ 5 ' 端および 3 ' 端から少なく とも 1 Kb、 好ましく は 3 Kb以上離れていることを特徴とする遗伝子ターゲティングベクター、 ならび に該ターゲティングべクターを用いた遺伝子ターゲテイング方法を提供する。 前 記ターゲティングベクターにおいて、 ネガティブセレクションマーカーとしては 公知のものであればいずれのものも利用可能であるが、 好ましくはジフテリアト キシン A遺伝子である。
ポジティブセレクションマーカーとしては、 本出願人によって出願された PCT 国際出願 W0 00/10383号パンフレッ ト （2000年 3月 2日国際公開） に記載された pLoxP-Puro由来のピュー口マイシン而忖生カセットを用いることができる。 この薬 剤耐性カセッ トは、 その両端に順方向に Lox-P 配列を含んでいる。 よって W0 00/10383号パンフレツトに記載された方法により、同耐性遺伝子をターゲティン グベクターが挿入された分化多能性を有する細胞から除去することができる。 さらに、前記 RS配列を除去する際に用いるポジティブセレクションマーカーと しては、 本出願人によって出願された PCT国際出願 W0 00/10383号パンフレツト (2000年 3月 2日国際公開） に記載された pLoxP-STneo由来の Neo耐性カセット を用いることができる。 この薬剤耐性カセットは、その両端に順方向に LoxP配列 を含んでいる。 よって W0 00/10383号パンフレッ トに記載された方法により、 同 耐性遺伝子をターゲティングベクターが挿入された分化多能性を有する細胞から 除去することができる。
さらにまたターゲティングベクターに含まれるポジティブセレクション用薬剤 耐性マ一力一（例えばピュー口マイシン耐性力セット） あるいは RS配列を除去す るために挿入されたポジティブセレクション用薬剤耐性マ一力一 （例えば Neo耐 性.力セッ'ト） のいずれかについて、 該薬剤耐性カセッ トの両端に順方向で存在す る LoxP配列として、 変異型 LoxP配列 (Lee ら、 Gene、216 : 55- 65、1998) を用いる ことができる。 この方法により、 C Kポリ A部位直下、 ターグティングベクターに 含まれるピュー口マイシン耐性カセット両端の LoxP配列と約 25kb下流に存在す る RS配列領域に存在する Neo耐性カセット両端の LoxP配列間ゲノム配列の組換 えによる欠失を防ぐことが可能であり、 上記 2種の薬剤耐性カセットのみを同時 に除去したレ、場合に有用である。
これまでの研究で免疫グロブリン/ c鎖遺伝子座内のィントロンェンハンサ一部 位 （Xuら、 Immunity 4 : 377- 385、 1996)、 あるいは C κェクソン下流約 9kbの 3 ' ェンハンサー領域 （Gormanら、 Immunity、 5： 241 - 252、 1996) に揷入された薬剤而ォ 性カセットが、 免疫グロブリン /C鎖遺伝子の VDJ組換えを阻害し、 κ鎖の発現量 が低下する現象が報告されていた。 これらの報告においては、 Cre/Lo x P システ ムの利用により、 薬剤耐性カセットを除去した結果、 いずれの場合もその発現が ある程度回復することから、 薬剤耐性カセットの存在が κ;鎖の発現に影響を与え ていることが示唆されていた。一方、マウス C K領域をヒ ト C fc領域と置換した実 験 (Zou らヽ Sc i ence、262 : 1271- 1274、1993) においては、 C / 下流域に付随する薬 剤耐性マーカーの存在に関わらず、 高いレベルのマウス/ヒ トキメラ Ig K鎖の発 現が観察された。 すなわち、 I g fc近傍領域に挿入された薬剤耐性カセッ トの存在 が、 Ig / 鎖の発現に与える影響については、結論は得られていなかった。 さらに、 Ig Kの制御領域を利用しているが、内在性 Ig /c遺伝子とは独立した発現ュニッ ト に含まれる遺伝子の発現への影響についても良く分かっていない状況であった。 更に、 マウス E S細胞として免疫グロプリン κ軽鎖遺伝子の下流約 25Kbの RS エレメント領域に薬剤耐性マーカーが揷入された胚性幹細胞を用いることで Ig κ定常領域下流に目的とする遺伝子を、 ターゲティングベクターを用いて挿入す る効率を上げることが出来る。
相同組換え体を簡便に同定するために、 外来 DNAがターゲティングされる位置 に薬剤耐性遺伝子マーカーをあらかじめ挿入しておくこともできる。 例えば、 本 明細書中実施例で用いられているマウス ES細胞 TT2Fは、 C57BL/6系統と CBA系 統との間の F 1個体由来の細胞である。 先述したように （Deng & Capecchi , Mol .
Cel l . Biol . , 12 : 3365 - 71， 1992)、 ターゲティングベクターに含まれるゲノム相 同領域の配列が C57BL/6に由来する場合、 TT2F細胞においては C57BL/6由来のァ レルにおいてより高率に相同組換えが起こると想像される。 すなわち、 あらかじ め C57BL/6由来ゲノム DNAを含むターゲテイングベクターを用いて C57BL/6由来 のアレルに例えば G418耐性マー力一を挿入することができる。次に得られた G418 耐性株について、 ピューロマイシン耐性マーカーを含み、 かつ C57BL/6由来ゲノ ム DNAを含むターゲティングベクターを導入してピュー口マイシン耐性かつ G418 感受性株を取得することができる。 この株においては、 ターゲテイングベクター と、 前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子との相同組換え により G418耐性遺伝子が除去され、代わりに所望の蛋白質をコードする核酸配列
(例えば、構造遺伝子など）とピュー口マイシン耐性マーカーが挿入されている。 このような方法により、 相同組み換え体同定におけるサザン解析等の手間を省く ことができる。
本出願人によって出願された PCT国際出願 W0 00/10383号パンフレツト （2000 年 3月 2日国際公開） に記載された方法と同様に、 ピューロマイシン耐性クロー ンをピックアップし、 ゲノム DNAを調製し、 サザン解析法により相同組換え体を 同定することが可能である。 タ一ゲティングベクター中のピュー口マイシン耐性 遺伝子は、 W0 00/10383号パンフレツトに記載された Lox- P Puroプラスミ ドに由 来し、 その両端に順方向に Lox- P配列を含んでいる。 よって W0 00/ 10383号パン フレツトに記載された方法により、 同耐性遺伝子をターゲティングされた分化多 能性を有する細胞から除去することができる。
上述したターゲティングベクター、 ならびに相同組換え効率を向上させる技術 および手段は、 遺伝子導入可能な細胞すべてに応用が可能であり、 キメラ動物の 作製に限定されない。 例えば、 ヒ トおよびヒト細胞 （例えば血液細胞や免疫細胞 など） を対象とした遺伝子治療において、 本明細書に記載のターゲティングべク ターおよび相同組換え効率を向上させる技術を所望の遺伝子を破壊または導入す るために使用することができる。
2 . 特定の細胞および/または組織が欠損した宿主胚
本発明のキメラ非ヒ ト動物の作製方法では、 次に、 前記特定の細胞および Zま た.は組織が欠損した非ヒ ト動物系統の宿主胚 （以下、 欠損宿主胚ともいう） を用 意する。 そのような欠損宿主胚としては、 免疫グロブリン軽鎖遺伝子を制御領域 として利用する場合には、 免疫グロプリン重鎖遺伝子ノックァゥトによる B細胞 欠損胚 (Toraizukaら、 Proc. Natl . Acad. Sc i. USA. , 18 : 722-727， 2000)、 T細 胞受容体遺伝子を制御領域として利用する場合には、 T 細胞受容体 鎖欠損によ る Τ リ ンパ球細胞欠損胚 （Mombaerts ら、 Nature, 360： 225-227, 1992)、 ミオグ 口ビン遗伝子を制御領域として利用する場合には、 マイォゲニン遗伝子ノックァ ゥトによる筋肉組織の欠損胚 （Nabeshima ら、 Nature, 364 : 532-535， 1993) , ク リスタリン遺伝子を制御領域として用いる場合には、 水晶体を欠損するマウスの 突然変異体である aphakia (ak)系統由来の胚（Liegeoi sら、 Proc. Natl . Acad. Sci .
USA.， 93： 1303-1307, 1996)、 レニン遺伝子を制御領域として利用する場合には、 Sal l l 遺伝子ノ ックァゥ トによる腎臓組織の欠損胚 （Nishinakamura ら、 Development, 128 : 3105-3115， 2001)、 アルブミン遺伝子を制御領域として利用 する場合には、 c - Met遺伝子欠損による肝臓組織の欠損胚（Bladt ら、 Nature, 376 : 768-770, 1995)、 リパーゼ遺伝子を制御領域として用いる場合には、 Pdxl遺伝子 ノックナウトによる腌臓組織欠損胚 （Jonsson ら、 Nature, 371： 606-9, 1994) などが挙げられる。 好ましい欠損宿主胚を上記例示したが、 本発明で使用可能な 欠損宿主胚は上記のものに限定されない。
また、 効率的なキメラ非ヒ ト動物作製を行うための宿主胚の発生時期、 遺伝的 背景等の選択については、それぞれの ES細胞株について既に検討された条件を用 いることが望ましい。 例えばマウスの場合、 CBA X C57BL/6 F1由来の TT2細胞ま たは TT2F細胞 （野性色、 Yagi ら、 Analyti cal Biochemistry, 214 : 70-76, 1993) からのキメラ作製については宿主胚が Balb/c (白色、 日本国日本クレア社）、 ICR (白色、 日本国日本クレア社）、 または MCH (ICR) (白色、 日本国日本クレア社） の遺伝的背景であることが望ましい。 よって前記特定の細胞およびノまたは組織 が欠損した非ヒ ト動物系統とこれらの系統の戻し交配により得られる非ヒ ト動物 の胚 （例えば 8細胞期胚） を欠損宿主胚として用いるのが望ましい。
宿主胚において欠損する細胞および/または組織は、 ブラストシスト · コンプ リメンテーシヨン （BC) によって、 分化多能性を有する細胞により補填されるた め.、 前記宿主欠損胚は、 キメラ動物を作製するための胚盤胞期まで発生しうるも のであれば、 胚性致死のものであってもかまわない。 このような胚性致死胚は、 遺伝子の欠損がヘテロである動物同士の交配によって原理的には 4分の 1の確率 で生じるため、 交配により得られた胚を複数取得して下記手順に従ってキノラ動 物を作製し、 その中から宿主胚が欠損胚であるものを選抜する。 この選抜は、 キ メラ動物の体組織より抽出した DNAを用いたサザン解析、 PCR解析等により行う ことができる。
3 . キメラ胚の作製および仮親への移植
上記 「1 . 分化多能性を有する細胞の作製」 の項目で得られた遺伝子導入 （E
S ) 細胞株からのキメラ非ヒ ト動物の作製は、 相沢慎一 （前記） 等に記載された 方法で行うことができる。 · 具体的に説明すると、 作製した遺伝子導入分化多能性 細胞を、 上記 「2 . 特定の細胞および Zまたは組織が欠損した宿主胚」 の項目に 記載の欠損宿主胚の胚胎盤胞または 8細胞期胚に毛細管などを用いて注入する。 この胚胎盤胞または 8細胞期胚を、 直接同種の仮親非ヒ ト動物の卵管に移植する か、 一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮親の子宮に移植する。 その後、 仮親を飼育出産させることにより、 仔動物を得る。
4 . キメラ非ヒ ト動物における導入遺伝子の発現
上記 「3 . キメラ胚の作製および仮親への移植」 の項目に従って作製される遺 伝子導入分化多能性細胞注入胚に由来する仔動物における分化多能性細胞の貢献 率は、 その毛色により大まかに判定することができる。 例えば、 TT2F細胞 （野生 色） 由来の遺伝子導入細胞株を MCH (ICR) (白色） バックグラウンドの宿主マウス 胚に注入した場合、 野生色 （濃茶） の割合が分化多能性細胞の貢献率を示してい る。 ここで毛色における貢献率は、 前記欠損する細胞および Zまたは組織以外の 細胞および/または組織における遺伝子導入分化多能性細胞の貢献率と相関があ るが、 組織によっては毛色の貢献率と一致しない場合もある。 一方、 上記キメラ 非ヒ ト動物においては、 宿主胚由来の前記欠損する細胞および Zまたは組織は存 在せず、 遺伝子導入分化多能性細胞由来のもののみ存在する。 遺伝子導入分化多 能性細胞の貢献による、 キメラ非ヒ ト動物における欠損細胞および/または組織 の回復は、 FACS 解析 （Fluorescence - Activated Cel l Sorter ) , ELISA 法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 等によって検出可能である。 遺伝子導入 分化多能性細胞由来の細胞および/または組織において挿入した核酸配列 （構造 遺伝子） が発現するかどうかは、 当該細胞および Zまたは組織由来の RNAを用い た RT- PCR法 （Kawasaki ら、 Ρ· Ν· A. S.， 85 : 5698—5702， 1988)、 ノーザンブロッ ト ¾ (.Ausubelら， Current protocols in mol ecular biology, John Wi ley & Sons, Inc. , 1994) などにより検出される。 蛋白質レベルの発現は、 導入した核酸配列 がコードする所望の蛋白質に対する特異的抗体が既にある場合は、 キメラマウス 血清を用いた酵素免疫測定法 （ELISA；富山 ·安東、 単クローン抗体実験マ二ユア ル、 1987、講談社サイェンティフイク （日本国））、ウェスタンブロット法（Ausubel ら， 前記） 等を利用して検出できる。 また、 導入される核酸配列 （例えば、 構造 遺伝子） をコードする DNAを適当に改変し、 抗体で検出可能なタグペプチドを付 加しておけば、 該タグぺプチドに対する抗体等で導入した遺伝子の発現を検出で きる （POD標識抗 Hi s6、 ロシュ ' ダイァグノスティックス （日本国））。
上述のようにして作製されたキメラ非ヒ ト動物は、 少なくとも特定の細胞およ び Zまたは組織において、 導入した核酸配列 （例えば、 構造遺伝子） が高発現す る。 発 mした所望の蛋白質が、 血液、 乳などの分泌されるような系であれば、 有 用蛋白質の生産系として利用することができる。 また、 機能未知の蛋白質を高発 現させた場合には、 前記高発現に伴う所見から、 当該蛋白質の機能を解明してい くことができる。
さらに近年、 体細胞核移植胚からの動物個体作製法と体細胞におけるジーンタ ーゲティングとを組み合わせて、 マウス以外の動物種 (ゥシ、 ヒッジ、 ブタ等） でもマウス同様の遺伝子改変が可能になった （McCreath ら、 Nature, 405： 1066-1069， 2000)。 例えば免疫グロプリン重鎖のノックアウトにより B細胞を欠 損するゥシを作製可能である。 さらにマウス、 ゥシ、 ヒッジ、 ブタなどの Ig遺伝 子あるいはその近傍に導入遺伝子を挿入し、 線維芽細胞の核を移植した未受精卵 を発生させ、 胚盤胞期胚より E S細胞を調製可能である。 この ES 細胞と上記 B 細胞欠損宿主胚との間でキメラ非ヒ ト動物が作製可能であり（Cibel l i ら， Nature Biotechnol . , 16 : 642-646, 1998)、 マウスだけでなくその他の動物種においても 同様の発現系を利用した分泌蛋白質の高発現が可能である。大動物の利用により、 遺伝子機能解析だけでなく有用物質生産への適用も考えられる。 本明細書に記載 の方法に従って、 マウスあるいはゥシ免疫グロプリン遺伝子の制御領域により制 御されるべく構築された外来 DNA 発現ュニッ トを Kuro iwa ら （Nat. Genet. 36 : 775-80， 2004)に記された方法によってゥシ胎児由来繊維芽細胞の内在性免疫 グロブリン遺伝子座近傍に挿入することができる。 得られる遺伝子改変ゥシ繊維 芽細胞から前記 Kuroiwaら (Nat. Genet. 36 : 775-80， 2004) に記された方法に従 つて作製されたクローンゥシ個体の血清中には該外来 DNAが高発現することが期 待される。
5 . キメラ非ヒ ト動物の子孫の作製
本発明のキメラ非ヒ ト動物の作製方法は、 さらに、 それと同種の非ヒ ト動物と 交配させて導入した核酸配列をへテロにもつトランスジエニック （Tg) 動物を選 択して得、 この Tg動物の雄と雌を交配させて導入遺伝子をホモにもつ Tg動物子 孫を得ることを含む。
6 . キメラ非ヒ ト動物またはその子孫に由来する組織または細胞
本発明においては、 前記いずれかのキメラ非ヒ ト動物またはその子孫に由来す る組織または細胞を得ることができる。 該細胞または組織は、 該細胞または組織 において発現する遺伝子の制御領域によって所望の蛋白質の発現が制御されるべ く該所望の蛋白質をコードする核酸配列をゲノム上に含み、 所望の蛋白質を発現 することができるものである。
前記組織および細胞には、 キメラ非ヒト動物またはその子孫に由来し、 かつ所 望の蛋白質を発現することができるものであればいずれの組織および細胞も含ま れ、 例えば、 B細胞、 脾臓、 リンパ組織などが挙げられる。
前記組織および細胞は、 当技術分野で公知の手法により採取 ·培養することが でき、 該組織および細胞が所望の蛋白質を発現しているかどうかも慣例的な手法 に従って確認することができる。 このような組織および細胞は、 以下で記載する ハイプリ ドーマの作製、 蛋白質の製造などに有用である。
7 . ハイブリ ドーマの作製
本発明においては、 導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列を発現するキ メラ非ヒ ト動物の細胞、 特に B細胞もしくは B細胞を含む脾臓、 リンパ節などの リ.ンパ組織からの細胞と、 増殖可能な腫瘍細胞 （たとえばミエローマ細胞） とを 融合することによって、 ハイブリ ドーマを得ることができる。 ハイプリ ドーマの 作製法は、 たとえば安東 ·千葉 （単クローン抗体実験操作法入門、 1991、 講談社 サイェンテフイク （日本国）） に記載される手法に基くことができる。
ミエローマとしては、 マウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギまた はヒ ト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができる が、 一般的にはマウスから得られた株化細胞、 例えば 8 -ァザグァニン耐性マウス
(BALB/c 由来） ミエローマ株 P3X63Ag8U. 1 (P3-U1) [Yelton, D. E.ら， Current
Topics in Microbiology and Immunology, 81 : 1-7 (1978) ]、 P3/NSI/ト Ag4- 1 (NS - 1)
[Kohler, G.ら， European J. Immunology, 6 : 511 - 519 (1976) ]、 Sp2/0- AgU (SP - 2)
[Shulman, M.ら， Nature, 276 : 269 - 270 (1978) ]、 P3X63Ag8. 653 (653) [Kearney, J. F.ら, J. Immunology, 123 : 1548-1550 ( 1979) ]、 P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256 : 495 - 497 (1975) ] などを用いることが好ましい。 これらの細胞株は、 適当な培地、 例えば 8-ァザグァニン培地 [グルタミン、 2-メ ルカプトエタノール、 ゲンタマイシンおよびゥシ胎児血清 （以下 「FCS」 という） を加え RPMI- 1640培地に 8-ァザグァニンを加えた培地] 、 イスコフ改変ダル ベッコ培地 (Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium；以下 「IMDM」 という)、 またはダルべッコ改変ィーグル培地 (Dulbecco ' s Modified Eagl e Medium；以下
「DMEMJ という）で継代培養するが、細胞融合の 3〜 4日前に正常培地（例えば、 10% FCSを含む DMEM培地） で継代培養し、 融合当日に 2 X 107以上の細胞数を確 保しておく。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する細胞として使用可能な ものは、 プラズマ細胞 （すなわち、形質細胞）、 およびその前駆細胞であるリンパ 球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、 リンパ節、 骨髄、 扁挑、 末梢血、 またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることがで きるが、 脾細胞が最も一般的に用いられる。
導入した核酸配列がコードする所望の蛋白質を発現する脾細胞をミエローマと 融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、 細胞毒性が比較的少 なく融合操作も簡単なポリエチレンダリコールを用いる方法である。 具体的には 次のように行うことができる。脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えば DMEM)、 またはリン酸緩衝生理食塩液 （一般に PBSと呼ばれる） でよく洗浄し、 脾細胞と ミエローマの細胞数の比が通常約 5 ： 1〜約 10 : 1になるように混合し、 遠心分 離する。 上清を除去し、 沈澱した細胞群をよくほぐした後、 撹拌しながら l mlの
50% (w/v)ポリエチレングリコール （分子量 1000〜4000) を含む無血清培地を滴 下する。 その後、 10mlの無血清培地をゆつく りと加えた後遠心分離する。 再び上 清を捨て、 沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン 'アミノプテリン 'チミジン液 およびヒトインターロイキン- 6を含む正常培地（一般に HAT培地と呼ばれる） 中 に懸濁して培養用プレートの各ゥヱルに分注し、 5 %炭酸ガス存在下、 37°Cで 2 週間程度培養する。 培養途中に適宜 HAT培地を補う。
ミエローマ細胞が 8-ァザグァニン耐性株である場合、 すなわち、 ヒポキサンチ ン .グァニン .ホスホリボシルトランスフェラーゼ （HGPRT) 欠損株である場合に は、 融合しなかった該ミエローマ細胞、 およびミエローマ細胞どうしの融合細胞 は、 HAT含有培地中では生存できない。 一方、 脾臓細胞どうしの融合細胞、 ある いは、脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイブリ ドーマは生存することができる力 脾臓細]^どうしの融合細胞には寿命がある。 従って、 HAT 含有培地中での培養を 続けることによって、 脾臓細胞とミエローマ細胞とのハイプリ ドーマのみが生き 残る。
得られたハイプリ ドーマは、 前記の導入した核酸配列がコードする所望の蛋白 質に対して特異的な抗体による ELISAでスクリーユングすることにより、 導入し た核酸配列がコードする所望の蛋白質を産生するハイプリ ドーマを選択すること ができる。
8 . 蛋白質の製造方法
本発明はさらに、 上記のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫、 あるいは上記の組 織または細胞、 あるいは上記のハイプリ ドーマのいずれかを用いて所望の蛋白質 を産生させた後、 該蛋白質を回収することを含む、 所望の蛋白質を製造する方法 を提供する。 具体的に説明すると、 キメラ非ヒ ト動物またはその子孫の個体を、 導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現しうる条件下で飼育し、 その 後発現産物である蛋白質を動物の血液、 腹水などから回収することができる。 あ るいはまた、 キメラ非ヒ ト動物またはその子孫に由来する組織または細胞、 ある いはそれを不死化したもの （例えば、 ミエローマ細胞との融合により不死化した ハイプリ ドーマ） などを、 導入した所望の蛋白質をコードする核酸配列が発現し うる条件下で培養し、 その後発現産物である蛋白質を培養物、 培養上清などから 回収することができる。 発現産物は、 遠心分離などの公知の方法に従って回収す ることができ、 さらに硫安分画、 分配クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグ ラフィー、 吸着クロマトグラフィー (例えばィオン交換クロマトグラフィー、 疎 水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなど）、分取薄層ク ロマトグラフィー、 HPLCなどの公知の方法の 1種または複数の組み合わせによつ て精製することができる。
9 . 生体内機能の解析方法 本発明はさらにまた、 上記のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫の表現型を、 所 望の蛋白質をコードする核酸配列を含まない対応の野生型 ES 細胞より作製され たキメラ非ヒ ト動物などの表現型と比較し、 それらの表現型の違いを決定するこ とを含む、 所望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする遺伝子の生体内機能を 解析する方法を提供する。
本方法では、 遺伝子導入に対応して生体内に現れる任意の形質を物理化学的方 法によって検出し、 これによつて導入した核酸配列または蛋白質の生体内機能を 同定することができる。 たとえば、所望の蛋白質をコードする核酸配列を含む ES 細胞より作製されたキメラ非ヒト動物またはその子孫、 および前記所望の蛋白質 をコードする核酸配列を含まない対応の野生型の ES 細胞より作製されたキメラ 非ヒト動物の血液を採取し、血球数測定機によって分析する。測定された白血球、 赤血球、 血小板などの血中濃度を前記 2種のキメラ非ヒ ト動物間で比較すること によって、 導入した核酸配列によってコードされる該所望の蛋白質の血球系細胞 の増殖 ·分化に対する作用を検討することができる。 後述の実施例では、 導入し た核酸配列としてエリスロポエチン （EP0) をコードする DNAを用いたが、 この場 合、 キメラマウスにおいて顕著な赤血球増加 （形質） が観察された。
以下に、 本発明の好ましい実施形態として、 免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用 したシステムを例に挙げて記載する。
免疫グロブリン （Ig) は血清中に分泌される蛋白質の中でも最も大量に生産さ れるものの一つである。 例えばヒトにおいては血清蛋白質の 10〜20%を占め、 そ の濃度は 10〜100mg/mlに達する。 Igは B細胞、 主にその終末分化型であるプラ ズマ細胞において多量に生産されるが、 Ig遺伝子座における高い転写活性、 mRNA の安定性、 蛋白質の分泌生産に特化したプラズマ細胞の機能など、 様々な要因が その Igの高レベルの発現に寄与している。 さらに、 成体において、 B細胞は骨髄 で発生し、 成熟すると共に脾臓、 小腸パイエル板、 リンパ節など全身のリンパ組 織に移行することから、 B細胞の Ig遺伝子の制御領域下で産生された導入遺伝子 産物は Ig同様に血中またはリンパ液中に放出され、全身に速やかに行き渡る。本 発明においては、このような高発現をもたらす Igの発現系を利用して所望の蛋白 質をコードする核酸配列 （例えば、 構造遺伝子） を発現させることに利点を有す る。
導入遺伝子の効率的な発現のための導入遺伝子揷入箇所は、 Ig軽鎖、 好ましく は /C軽鎖が望ましいと考えられる。 例えば、 マウス免疫グロブリンの 95%は κ軽 鎖を含み、 その定常領域遺伝子は 1つしか存在しない。 一方で、 軽鎖えは 5 %で あり、 4種の異なる遺伝子が存在してそのいずれかが使用される。 また、 重鎖に おいても定常領域は μ、 ( 4種）、 αおよび ε の計 7種あり、 通常、 導入遺伝子 の挿入は 1箇所であることを考慮すると、 κ鎖の利用が好ましい。
発現形態としては、機能的な Ig軽鎖が産生される条件でさらに導入した核酸配 列が発現することが望ましい。 本発明のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫は、 免 疫グロプリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、 さらにそ の下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列 （すなわち、 導入遺伝子） が配置さ れてなる遺伝子発現ュニットをゲノム上に含むことが好ましい。 免疫グロプリン 軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含み、 さらにその下流に所望 の蛋白質をコードする核酸配列 （すなわち、 導入遺伝子） を含むように動物のゲ ノムを改変するために、 ターゲテイングベクターを準備し、 このベクター DNA に 該所望の蛋白質をコードする核酸配列を挿入する。 このベクターとしては、 C K P2 ターゲテイングベクター (後述の実施例 12参照) が好ましい。 タ一ゲティングべ クタ一は、 免疫グロプリン軽鎖遺伝子近傍に上記遺伝子のプロモーター部分を含 み、 さら その下流に所望の蛋白質をコードする核酸配列 （例えば、導入遺伝子） を導入する核酸配列の挿入部位として適当な制限酵素切断部位が挿入され、 該制 限酵素切断部位には導入する核酸配列の開始コ ドンから終止コドンまでを含む DNA (cDNA、 ゲノム DNA) が挿入される。 また、 好ましくは開始コドンの上流にコ ザック配列等の翻訳促進配列を配置することができる。 さらに、 相同組換え体を 簡便に同定するために、 外来 DNAが挿入される位置に薬剤耐性遺伝子マーカー、 好ましくはピュー口マイシン耐性遺伝子をあらかじめ揷入しておくこともできる。 更に、 マウス ES細胞として免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子の下流約 25Kbの RS エレメント領域に薬剤耐性マーカ一が挿入された胚性幹細胞を用いることで Ig κ定常領域近傍に目的とする遺伝子を、 ターゲティングベクターを用いて挿入す る効率を上げることが出来る。 ターゲティングベクタ一による非ヒ ト動物 ES細胞の形質転換は、相沢慎一（前 記） 等に記載された方法によって行うことができる。 本出願人によって出願され た PCT国際出願 W0 00/10383号パンフレツト （2000年 3月 2日国際公開） に記載 された方法と同様に、 ピューロマイシン耐性クローンをピックアップし、 ゲノム DNA を調製し、 サザン解析法により相同組換え体を同定する。 タ一ゲティングべ クタ一中のピューロマイシン耐性遺伝子は W0 00/10383号パンフレツトに記載さ れた Lox - P Puroプラスミ ドに由来し、その両端に順方向に Lox-P配列を含んでい る。 よって W0 00/10383号パンフレツトに記載された方法で同耐性遺伝子を遺伝 子導入された ES細胞から除去することができる。
本発明において、 免疫グロブリン軽鎖遺伝子を利用する場合、 ES細胞注入のた めの欠損宿主胚としては、 W0 00/10383 号パンフレツトに記載された免疫グロブ リン重鎖遺伝子破壊についてホモである非ヒト動物系統を用いることが好ましい。 作製した遺伝子導入 ES細胞を、上記欠損宿主胚の胚胎盤胞または 8細胞期胚に 毛細管などを用いて注入する。 この胚胎盤胞または 8細胞期胚を、 直接同種の仮 親非ヒ ト動物の卵管に移植するか、 一日培養して胚盤胞まで発生したものを該仮 親の子宮に移植する。その後、仮親を飼育出産させることにより、仔動物を得る。 キメラ非ヒ ト動物においては、 宿主胚由来の成熟 B リンパ球は存在せず、 遺伝 子導入 ES細胞由来のもののみ存在する。 これは、宿主胚として用いる免疫グロプ リン重鎖ノックアウト非ヒ ト動物は、 成熟 B リンパ球 （B220陽性） を欠損し、 血 中に免疫グロブリンが検出されないことによる （Tomizukaら， Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 97 : 722 - 727， 2000)。 遺伝子導入 E S細胞の貢献による、 キメラ非ヒ ト 動物における成熟 Bリンパ球おょぴ抗体産生の回復は、 FACS解析、 ELISA法等に よって検出可能である。ターグティング ES細胞由来 B細胞において挿入した核酸 配列が発現するかどうかは、挿入したアレル（対立遺伝子ともいう） の Ig軽鎖遺 伝子において、 部位特異的組換え反応が起こるかどうかに依存している。 すなわ ち挿入アレルの Ig軽鎖遺伝子の組換えが成功し、 その mRNAが機能的な軽鎖をコ ードする場合、 mRNA上に同時に存在する挿入核酸配列 （例えば、 構造遺伝子） も
IRESの働きにより蛋白質に翻訳される。 さらに、挿入アレルの κ鎖遺伝子の組換 えが失敗し、 もう一方のアレルの / c鎖あるいは; L鎖が機能的な軽鎖をコードする 場合でも、非機能的な κ鎖および導入核酸配列をコードする mRNAの転写は起こる ため、 挿入核酸配列由来の蛋白質は発現する。 挿入核酸配列の発現が起こらない のは、 もう一つのアレルの κ鎖あるいは λ鎖が先に機能的な組換えに成功し、 揷 入アレルの Ig K鎖の組換えが対立遺伝子排除の機構によりシャツトオフされる 場合である。非ヒ ト動物において B細胞は胎生 12日目頃より胎児肝組織に出現す るが、 出生と共に発生の場は骨髄に移動する。 胎児期においては、 B細胞は発生 の初期段階、 すなわち膜型免疫グロプリン受容体を発現する細胞が主体である。 成体と比較して B細胞自体の数が少ないことおよび膜型 Igを主に発現する細胞で は免疫グロブリンをコードする mRNA量自体が少ないことによって、挿入核酸配列 の発現も成体と比較して非常に少ないと考えられる。抗体産生は離乳期（3週齢） より増加するが、 終末分化段階であるブラズマ細胞の増加によるものと想像され る。 以後、 B 細胞は、 脾臓、 リンパ節、 小腸パイエル板などのリンパ組織に移動 して抗体および挿入核酸配列を発現する。 挿入核酸配列がコードする所望の蛋白 質は免疫グロブリン同様、 血液やリンパ液中に分泌され、 全身に行き渡る。
導入核酸配列の B細胞における発現は以下のようにして確認される。 導入遺伝 子による mRNAの発現は例えば脾臓、 末梢血有核細胞など、 B細胞を含む組織や細 胞集団由来 RNAを用いた RT- PCR法、 ノーザンブロット法などにより検出される。 蛋白質レベルの発現は、 導入核酸配列がコードする所望の蛋白質に対する特異的 抗体が既にある場合は、 キメラマウス血清を用いた酵素免疫測定法、 ウェスタン ブロット法等を利用して検出できる。 また、 導入核酸配列をコードする DNAを適 当に改変して抗体で検出可能なタグぺプチドを付加すれば、 該タグぺプチドに対 する抗体等で導入核酸配列の発現を検出できる。
上述のようにして得られたキメラ非ヒト動物は、 効率よくかつ確実に導入した 所望の蛋白質をコードする核酸配列を高発現する。 この効率の高さは、 前述した が、 主として以下の点に基づく ：
( 1 ) B リンパ球欠損宿主胚の利用によって、 キメラ動物の B リンパ球がキメラ 率に関わらず全て ES細胞に由来する。
( 2 )マウス ES細胞として免疫グロプリンに軽鎖遺伝子の下流約 25Kbの RSエレ メント領域に薬剤耐性マーカーが挿入された胚性幹細胞を用いることで Ig fc遺 伝子近傍における相同組換え効率が 30%以上の効率で起こる。
( 3 ) 免疫グロブリンの発現系を利用している。
( 4 ) 免疫グロブリンの発現は発生初期には非常に少なく、 離乳期以降に爆発的 な増加を示すため、 高発現が胚性致死をもたらすような遺伝子を導入する場合で も、 成体における機能を検討することができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの 実施例によって限定されるものでない。 実施例 1
pPSs hEPO in vitro用ベクターの構築
1— 1 . pBluescriptllSK (―)の Sail- Hindlll 間への Pad— Fsel— Nhel サイト導 Λ pBS + PFN
pBluescriptllSK (-) (米国 STRATAGENE) を制限酵素 Sall、 Hindlll (Roche) で 消化し、 以下の合成オリゴをァニールさせて l igation kit ver. 2 (タカラバイオ) を使用したライゲーション反応により導入した。 それを大腸菌 DH5 (¾に導入して 得られた形質転換体より DNAを調整し、 挿入断片のシーケンスを行った。
S/PFN/Hd-S： TCGACTTAATTAAGGCCGGCCCTAGCTAGCA (配列番号 1 )
S/PFN/Hd-AS： AGCTTGCTAGCTAGGGCCGGCCTTAATTAAG (配列番号 2 )
1— 2 . プロモーター、 シグナノレ酉己列の持つ小ベクターの構築 pPSs3. 8
GenBankより取得した MUSIGKVR1 (accession K02159) をもとに、 その上流のゲ ノム配列を UCSCマウスゲノムデータベースより取得した。プロモータ領域と、ィ ントロンを含むシグナル配列を増幅する PCRプライマーを設計した。
PsecSP FW1：
CCTTAATTAAAGTTATGTGTCCTAGAGGGCTGCAAACTCAAGATC (配列番号 3 、 Pad サイト含 む）
PsecSP RV：
TTGGCCGGCCTTGGCGCCAGTGGAACCTGGAATGATAAACACAAAGATTATTG (配列番号 4、 Sfol · Fsel含む）
K0D - plus - (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、 MgS04 1. 6mM, 铸型としてマウス ES 細胞由来の DNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15秒および 68°C1分を 1サ ィクルとして 30サイクル増幅し、 得られた 0. 8Kbの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離 回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片 （PSプロモーター断片） を回収した。 回収 された PCR増幅断片を Fselおよび Pacl (NEB) で酵素消化し、 0. 8%ァガロース ゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィ ッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
上記 1— 1の pBS + PFNを Fselおよび Pacl (NEB) 消化した後、 反応液をフエ ノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、上記回収された DNA断片を揷入し、 それを大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 挿入断 片のシーケンスを行った。 PCRに起因する変異が無いクローンを選択した。
1 - 3 . . κ 5， intron enhancer領域 DNA断片の取得
GenBank (米国 NCBI)より取得したマウス Ig κ遺伝子近傍ゲノム DNA配列より以 下の DNA (プライマー) を合成した。
5 enhancerFW Kp ：
GGGGTACCAGCTTTTGTGTTTGACCCTTCCCTA (配列番号 5、 Kpnlサイ ト付加）
5 enhancerRV Xh：
CCGCTCGAGAGCTAAACCTACTGTATGGACAGGG (配列番号 6、 Xholサイ ト付加）
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、铸型として BACクローン RP23-435I4
(GenBank Accession Number ： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C3分保温し た後、 94°C15秒およぴ 68°C40秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、 得られ た約 0. 48kbの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick
Gel Extraction Kit (ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回 収した。回収された PCR増幅断片を Kpnlおよび Xholで酵素消化し、 0. 8%ァガロ ースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ド イツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
pBluescriptllSK (-) (米国 STRATAGENE) を Kpnlおよび Xhol消化し、 0. 8%ァ ガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リ フォスファタ一ゼを用 いて末端脱リン酸化したものに、 上記回収された DNA断片を挿入し、 それを大腸 菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 挿入断片のシーケ ンスを行った。 PCRによる変異の無いクローンを選択し Kpnlおよび Xhol消化し た後、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片 （5 ' ェンハンサー断片） を回収した。
1—4 . κ 3 ' ェンハンサー領域 DNA断片の取得
GenBank (米国 NCBI)より取得したマウス Ig κ遺伝子近傍ゲノム DNA配列より以 下の DNA (プライマー) を合成した。
3'ェンハンサー FW Hd：
CCCAAGCTTAGCTCAAACCAGCTTAGGCTACACA (配列番号 7、 Hindlllサイ ト付）
3'ェンハンサー RV Bm-2：
CGGGATCCCTAGAACGTGTCTGGGCCCCATGAA (配列番号 8、 BamHIサイ ト付）
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製し、 50 /i 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、鎵型として BACクローン RP23- 43514
(GenBank Accession Number： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C3分保温し た後、 94°C15秒および 68°C40秒を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、 得られ た約 0. 8 bの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) 'を用い添付文書にしたがって増幅断片を回 収した。回収された PCR増幅断片を Hindlllおよび BamHIで酵素消化し、 0. 8%ァ ガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit
(ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
pBluescriptllSK (-) (米国 STRATAGENE) を Hindlllおよび BamHI消化し、 0. 8% ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを 用いて末端脱リン酸化したものに、 上記回収された DNA断片を挿入し、 それを大 腸菌 DH5 aに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 挿入断片のシー ケンスを行った。 PCR 'による変異の無いクローンを選択し Hindlllおよび BamHI 消化した後、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片 (3， ェンハンサー断片）を回収した。
1一 5 . κ polyA断片の取得
CkP2 KIベクターを EcoRI及ぴ Hindlllで酵素消化し、 約 440bpの断片を 0.8% ゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィ ッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて末端平滑を行い、 c polyA断片を取得した。
1一 6 . κ 5 'ェンハンサーを含むベクターの構築 pPSsEl
上記 1一 2の pPSs3.8を Xhol及び Kpnlで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルよ り分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン 酸化したものに、 上記 1 _ 3で回収された 5' イントロンェンハンサー断片を挿 入し、 それを大腸菌 DH5 aに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分のシーケンスを行った。
1 - 7. κ 5' と 3' ェンハンサーを含むベクターの構築 pPSsE2 上記 1一 6の pPSsElを BamHIおよび Hindlllで酵素消化し、 0.8%ァガロース ゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて末端 脱リン酸化したものに、上記 1一 4で回収された 3'ェンハンサー断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5 αに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 連結部 分のシー"ケンスを行った。
1一 8 . PS型 in vitro用ベクターの構築 pPSs5.5
上記 1一 7の pPSsE2を Hindlllで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルより分離 精製した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて末端平滑化を行った。 大腸菌 C75 由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 上記 1一 5 で回収された/ cポリ A断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5 aに導入した。 得られた 形質転換体より DNAを調製し、 連結部分のシーケンスを行って、 順方向に挿入さ れているクローンを選択した。
1一 9 . ヒ ト erythropoietin DNA断片 （シグナル配列無し） の作製
EP0 (- SP) FW：
CAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCT (配列番号 9、 EP0の Sfolサイ トをそのまま利用） EPO (-SP) RV：
TTGGCCGGCCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCC (配列番号 1 0、 Fselサイト含む）
KOD- plus -（日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、鍀型としてヒ ト EPO cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15秒および 68°C1分を 1サイクルとして 30サイクル 増幅し、 得られた 500bpの増幅断片を 0, 8%ゲルで分離回収した。 回収されたゲル から QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがつ て増幅断片を回収した。 回収された PCR増幅断片を Sfolおよび Fsel (NEB) で酵 素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 酵素処理断片を回収した。 回収された PCR増幅断片を Sfolおよび Fsel (NEB) で 酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Extract ion Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 酵素処理断片を回収した。
1 - 1 0 . pPSs hEPO in vitro用ベクターの構築 pPSs hEPO
上記 1 _ 8の pPSs5. 5を Sailおよび Fselで消化後、 大腸菌由来アル力リフォ スファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 1—9で作製した DNA断片を 挿入した後、 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部分 の埠基配列を確認して、 pPSs hEPO in vitro用ベクター （図 1 ) を取得した。 実施例 2
pNPs hEPO in vitro用ベクターの構築
2— 1 . プロモーター、 シグナル配列を持つ小ベクターの構築 pNPs3. 7
GenBankより取得した MMU231225 (access ion No. AJ231225) をもとに、 その上 流のゲノム配列を UCSCマウスゲノムデータベースより取得。 プロモータ領域と、 イントロンを含むシグナル配列を増幅する PCRプライマ一を設計した。
P2SP FW1 ：
CCTTAATTAAATATTTTCCTCCTTCTCCTACCAGTACCCACTCTT (配列番号 1 1、 Pa サイ ト
'含む） ， P2SP RV：
TTGGCCGGCCTTGGCGCCTCTGGACAGTATGACTAGAAAAAAGCAAAATAGAG (配列番号 1 2 、 Sfol · Fselサイ ト含む）
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製し、 50 / 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、 MgS04 1.6mM, 铸型としてマウス ES 細胞由来の DNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15秒および 68°C1分を 1サ ィクルとして 30サイクル増幅し、 得られた 0.5Kbの増幅断片を 0.8%ゲルで分離 回収した。 回収されたゲノレから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。 回収された PCR 増幅断片を Fselおよび Pacl (NEB) で酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルで分離回収した。 回 収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文 書にしたがって酵素処理断片を回収した。
上記 1一 1の pBS+PFNを Fselおよび Pacl (NEB) 消化した後、 反応液をフエノ ール /クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿し、 上記回収された DNA断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 揷入断 片のシーケンスを行った。 PCRに起因する変異が無いクローンを選択した。
2 — 2. κ 5，ェンハンサーを含むベクターの構築 ' · · · pNPsEl
上記 1一 9のベクターを Xhol及び Kpnlで酵素消化し、 0.8%ァガロースゲルよ り .分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン 酸化したものに、 上記 1 — 3で回収された 5' イントロンェンハンサー断片を挿 入し、 それを大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 連結部分のシーケンスを行った。
2 — 3 · κ 5， と 3， ェンハンサーを含むベクターの構築 pNPsE2 上記 2 — 2の pNPsElを BamHIおよび Hindlllで酵素消化し、 0.8%ァガロース ゲルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて末端 脱リン酸化したものに、上記 1一 4で回収された 3'ェンハンサー断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部 分のシーケンスを行った。
2 — 4. NP型 in vitro用ベクターの構築 pNPs5.4 上記 2— 1の pNPs3. 7を Hindi 11で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより分離 精製した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて末端平滑化を行った。 大腸菌 C75 由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 上記 1― 5 で回収された κポリ A断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた 形質転痪体より DNAを調整し、 連結部分のシーケンスを行って、 順方向に挿入さ れているクローンを選択した。
2— 5 . pNPs hEPO in vitro用ベクターの構築
上記 2— 4の pNPs5. 4を Sailおよび Fselで消化後、 大腸菌由来アル力リフォス ファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 上記 1一 9で作製した DNA断片 を挿入した後、 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、連結部 分の塩基配列の確認して、 pNPs hEPO in vitro用ベクター (図 2 ) を取得した。 実施例 3
pCks hEPO in vitro用ベクターの構築
3 - 1 . P2プロモーター DNA断片の取得
CkP2 KIベクターを Hindlllおよび Sail酵素消化し、 約 210bpの断片を 0· 8% ゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィ ッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて末端平滑化を行った。
3 - 2 . Ck型 in vitro用ベクターの構築 pCks4. 9
上記 2— 4の pNPs5. 4を Paclおよび Sfolで酵素消化し 0. 8%ァガロースゲル より分離精製した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて末端平滑化を行った。 大 腸菌 C75由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 上 記 3— 1の P2プロモーター断片を揷入し、 それを大腸菌 DH5 aに導入した。 得ら れた形質転換体より DNAを調整し、 連結部分のシーケンスを行って、 順方向に揷 入されているクローンを選択した。
3— 3 . ヒ ト erythropoietin DNA断片 （シグナル配列有り） の作製
hEP0-BI FW：
CGGGATCCCGGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCT (配列番号 1 3、 BamHIサイ ト含む） hEPO-Xh RV：
CCGCTCGAGCGCTATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCC (配列番号 1 4、 Xholサイ ト含む）
KOD- plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、 MgS04 1. 6mM、 鐯型としてマウス ES 細胞由 ¾の DNAを添加し、 94°C3分保温した後、 94°C 15秒および 68°C 1分を 1サ ィクルとして 30サイクル増幅し、得られた 0. 68Kbの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離 回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。 回収された PCR 増幅断片を BamHIおよび Xhol (Roche)で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付 文書にしたがって酵素処理断片を回収した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて 末端平滑化を行った。
3 - 4 . pCks hEPO in vitro用ベクターの構築 pCks hEPO
上記 3— 2の pCks4. 9を Fselで酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより分離精 製した後、 Blunting high (東洋紡） を用いて末端平滑化を行った。 大腸菌 C75 由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 上記 3— 3 のヒ トエリスロポエチン（erythropoietin) DNA断片を挿入し、それを大腸菌 DH5 ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 連結部分のシーケンスを 行.つて、 順方向に挿入されているクローンを選択し、 pCks hEPO in vitro用べク ター （図 3 ) を取得した。 実施例 4
ミエローマ細胞へのベクター導入
37°C、 6. 5%C02下で RPMI1640 10%FBS培地を用いて 4回から 5回継代し、 lxlO6 程度まで培養した P3- X63. Ag653細胞を一度 PBSで Washしたのち、無血清 RPMI 1640 培地で 6xl05/ml に懸濁して 6well プレートに 1ml ずつ播種した。 Genejammer
Transfection Reagent (米国 STRATAGENE) 6ulを無血清 RPMI1640培地 lOOul と混 合した後、室温で 5分インキュベートし、滅菌水で 200ng/ulに調製した pPSs hEPO in vitro用ベクター、 pNPs hEPO in vitro用ベクター、 pCks hEPO in vitro用 ベクターを 5ul添加して室温で 10分ィンキュベートして複合体を形成させた。ト ランスフニクシヨン試薬一ベクター複合体を、 6 ゥエルプレートに播種した細胞 に滴下して加え、 37°C、 6. 5%C02下で 4時間培養した後、 RPMI1640 、 20%FBSを 1. 1ml加えた。 24時間後、 RNA回収のため、 培養細胞 1mlを回収した。 トランス フエクシヨンから 48時間後の培養上清を回収し、 ヒ ト EP0 ELISAに供した。 トラ ンスフヱクシヨン用導入試薬として DIMRIE - C Reagent (米国 Invitrogen) も同様 に用いることが出来た。 実施例 5
導入ヒ ト EP0遺伝子の転写レベルの比較
上記実施例 4で行った、トランスフ クシヨン 24時間後の培養細胞 1mlを回収 し、 Isogen (日本国二ツボンジーン） を用いて添付のプロトコールに従い全 RNA を精製した。 DNase処理をした後、 RNaseを含まない滅菌水に溶解した。 50ng の 全 RNAを Superscript III First-Strand Synthes is System (米国 Invitrogen) を用いて添付のプロ トコールに従い、 逆転写反応を行った。 逆転写反応後、 以下 のプライマーを用いて、 hEPOの RT - PCRを行った。
hEP0-RT FW5 ： GGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTC (配列番号 1 5 )
CkpolyA R2 ： CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 1 6 )
.内部標準として、 Mouse ,8 -actin RT- PCR Primer Set (日本国東洋紡） を用い て β -actinの RT - PCRを行つた。
LA-Taq (日本国タカラバイオ） を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1反応液中に上記 2種のプライマー各 10Pmol、 cDNAを添加し、 94°C3分保温 した後、 94°C15秒および 68°C1分を 1サイクルとして 26、 29、 32サイクル増幅 し、 2 %ァガロースゲルにて電気泳動した （図 4 )。 得られた結果から、 ベクター 構造が pCks タイプよりも、 pNPs や pPSs タイプのほうが転写レベルで発現に有 利であることが示された。 実施例 6
培養上清中のヒ ト EP0濃度の比較 1379 トランスフ-クシヨン 48時間後の培養上清を回収し、 Quantikine IVD Human EPO Immunoassay (米国 R&D SYSTEMS)を用いて添付のプロトコールに従い、 培養上清 中のヒ トエリスロポエチンを定量した （図 5、 Tablel)。得られた結果はベクター 構造が pCks タイプ、 pNPs タイプ、 pPSs タイプの順番に培養上清中のヒト EP0 分泌量 増加することを示した。 また、 実施例 5の転写レベルの比較実験におい て pNPs タイプ、 pPSsタイプ両者で優位な差が認められなかったことから、 転写 後段階の差によって pNPsタイプと pPSsタィプの培養上清中ヒ ト EP0濃度の顕著 な違いが生じたと考えられた。 実施例 7
マウス RSエレメントターゲティング用ベクター
( 1 ) K0基本ベクターの構築
W0 00/10383号パンフレツト （前掲） に記載された pLoxP- STneoプラスミ ドを Xhol消化し、 両端に LoxP配列を持つ Neo耐性遺伝子 （LoxP- Neo) を取得した。 LoxP-Neoの両末端を T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、 LoxP - Neo - Bを取得 した。
pBluescript II SK (-) (日本国東洋紡） に新たな制限酵素サイ トを付加するた め以下の DNAを合成した。
LinkAl： TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC (配列番号 1 7 )
LinkA2： TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC (配列番号 1 8 )
LinkBl： GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG (配列番号 1 9 )
LinkB2： AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC (配列番号 2 0 )
pBluescript II SK (-)を制限酵素 Sailおよび Xholで処理した反応液をフエノ ール /クロロホルム抽出、エタノール沈殿した。プラスミ ドに新たな制限酵素サイ ト Nrul、 SgrAIおよび Asclを付加するため、 LinkAlおよび LinkA2を合成した。 この 2つのオリゴ DNAからなるリンカーを制限酵素処理したプラスミ ドに挿入し、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNA を調製し、 プラスミ ド pBlueLAを取得した。
続いて、 pBlueLAを制限酵素 Notlおよび EcoRIで処理した反応液をフエノール /クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿した。 プラスミ ドに新たな制限酵素サイ ト
Pacl、 Fselおよび Sailを付加するため、 LinkBlおよび LinkB2を合成した。 この 2つのオリゴ DNAからなるリンカ一を制限酵素処理したプラスミ ドに揷入し、 大 腸菌 DH5 aに導入した。 得られた形質転換体より DNA を調製し、 プラスミ ド pBlueLABを取得した。 BlueLABを EcoRV消化後、反応液をフヱノール /ク口口ホル ム抽出、エタノール沈殿し、 LoxP-Neo-Bを挿入した後、大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 プラスミ ド pBlueLAB- LoxP- Neoを取得し た。
pMClDT-A (日本国ライフテックオリエンタル株式会社) を Xholおよび Sail消 化後、 0. 8 %ァガロースゲルにアプライ し、 約 1 Kb のバンドを分離回収し、 QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって DT - A フラグメントを回収した。
pBlueLAB-LoxP-Neoを Xhol消化後、 反応液をフエノール/クロロホルム抽出、 エタノール沈殿し、 DT - Aフラグメントを挿入した後、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 K0基本ベクター pBlueLAB - LoxP - Neo- DT - A を取得した。
( 2 ) マウス RSエレメント 5， 上流ゲノム領域断片の取得
GenBank (米国 NCBI)より取得したマウス RSエレメント遺伝子近傍ゲノム DNA配 列より以下の DNA (プライマー） を合成した。
RS5 ' FW3：
ATAAGAATGCGGCCGCAAAGCTGGTGGGTTAAGACTATCTCGTGAAGTG (配列番号 2 1 )
RS5 ' RV3：
ACGCGTCGACTCACAGGTTGGTCCCTCTCTGTGTGTGGTTGCTGT (配列番号 2 2 )
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、錄型として BACクローン RP23 - 43514
(GenBank Accession Number： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C 2分保温し た後、 94°C 15秒および 68°C5分を 1サイクルとして 33サイクル増幅し、 得られ た 5kbの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel
Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収し た。回収された PCR増幅断片を Notlおよび Sailで酵素消化し、 0. 8%ァガロース ゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィ ッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
pBlueLABを Notlおよび Sail消化した後、 反応液をフエノール/ク口口ホルム 抽出、 エタノール沈殿し、 上記回収された DNA断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5 αに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 挿入断片のシーケンスを 行った。 PCRに起因する変異が無いクローンを選択し Notlおよび Sail消化して 得られる 5kbの断片を、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルか ら QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 酵素処理断片を回収した。
( 3 ) マウス RSエレメント 3， 下流ゲノム領域断片の取得
GenBank (米国 NCBI)より取得したマウス RSエレメント遺伝子近傍ゲノム DNA配 列より以下の DNA (プライマ一) を合成した。
RS3 ' FW2： TTGGCGCGCCCTCCCTAGGACTGCAGTTGAGCTCAGATTTGA (配列番号 2 3 ) RS3 ' RV3： CCGCTCGAGTCTTACTGTCTCAGCAACAATAATATAAACAGGGG (配列番号 2 4 )
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、鎵型として BACクローン RP23- 43514 (GenBank Accession Number： AC090291) 由来の DNAを添加し、 94°C 2分保温し た後、 94°C 15秒および 68°C2分を 1サイクルとして 33サイクル増幅し、 得られ た 2kbの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収し た。回収された PCR増幅断片を Asclおよぴ Xholで酵素消化し、 0. 8%ァガロース ゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィ ッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
pBlueLABを Asclおよび Xhol消化した後、 反応液をフヱノール/ク口口ホルム 抽出、 エタノール沈殿し、 上記回収された DNA断片を揷入し、 それを大腸菌 DH5 ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 揷入断片のシーケンスを 行った。 PCRに起因する変異が無いクローンを選択し Asclおよび Xhol消化して 得られる 2kbの断片を、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。回収されたゲルか ら QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 酵素処理断片を回収した。
(4) 基本ベクターへのマウス RSエレメント 3， 下流ゲノム領域断片の挿入 pBlueLAB- LoxP- Neo-DT- Aを Asclおよび Xholで消化後、 得られる約 7.6 Kbの
DNA断片を 0.8%ァガロースゲルより分離精製したものに、 （3) で作製したゲノ ム断片を挿入した後、大腸菌 XL10- GoldUltracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列の確認 を行った。
(5) マウス RSエレメント 3' 下流ゲノム領域断片を持つ K0基本ベクターへの マウス RS領域 5' 上流ゲノム領域断片の挿入
( 4 ) で得られたプラスミ ドを Notlおよび Sail消化後、得られる 9· 6kbの DNA 断片を 0.8%ァガロースゲルより分離精製したものに、 （2) で作製したゲノム断 片を揷入した後、 大腸菌 XL10- GoldUltracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に 導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認し て、 マウス RSエレメントターゲティング用べクター pBlueRS—LoxP— Neo— DT— A— 3' K0-5' K0 (図 6) を取得した。 実施例 8
ElectropSration用マウス RSエレメントターゲティングベクターの調製
pBlueRS— LoxP— Neo— DT— A— 3' K0— 5' K060 gを、 スぺノレミジン添カロ （lmMpH7.0 米国シグマ) バッファー (日本国ロシュ ' ダイァグノスティックス、 制限酵素用 Hバッファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口 ホルム抽出後、 2.5容量の 100%エタノール、 および 0.1容量の 3 M酢酸ナトリウ ムを加え、 - 20°Cで 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して 回収後、 70%エタノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノール を除き、 1時間風乾させた。 0·5μδ/μίの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で保存し、エレク トロポレーション用マウス RSエレメントターゲティ ング用ベクター pBlueRS- LoxP- Neo- DT-A- 3' K0 - 5' Κ0- Notlの調製を行なった。 実施例 9
ゲノムサザン解析用プローブの調製
BACクローン RP23- 43514 (GenBank Accession Number： AC090291) を用レヽた塩 基配列情報を基に、 5 ' K0の上流域 573merを含むオリゴ DNAを取得するため以下 の DNAを合成した。
RS5 ' Southern FW1： CATACAAACAGATACACACATATAC (配列番号 2 5 )
RS5 ' Southern RV2： GTCATTAATGGAAGGAAGCTCTCTA (配列番号 2 6 )
Takara Z Taq (日本国宝酒造） を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 // L 反応液中に上記 2種のプライマー各 10pmol、 鎵型としてクローン番号 RP23- 4341の BAC由来 DNAを添力 Dし、 94°C 2分保温したのち、 94°C30秒、 60°C20 秒、 および 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、 得られた 573merの 増幅断片を 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 5 ' 側ゲノム サザン用プローブ、 5 ' K0-プローブを回収した。
BACクローン RP23-435I4 (GenBank Accession Number： AC090291) を用レヽた塩 基配列情報を基に、 3 ' K0の下流域 600merを含むオリゴ DNAを取得するため以下 の DNAを合成した。
RS3 ' Southern FW1： TCTTACTAGAGTTCTCACTAGCTCT (配列番号 2 7 )
RS3 ' Southern RV2： GGAACCAAAGAATGAGGAAGCTGTT (配列番号 2 8 )
Takara Z Taq (日本国宝酒造） を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 /z L 反応液中に上記 2種のプライマー各 10ρηιΟ1、 錄型としてクローン番号 RP23-434Iの BAC由来 DNAを添加し、 94°C 2分保温したのち、 94°C30秒、 60°C20 秒、 および 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅し、 得られた 600merの 増幅断片を 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 3 ' 側ゲノム サザン用プローブ、 3 ' K0 -プローブを回収した。 実施例 1 0
RSエレメント · ターゲテイング 'マウス ES細胞の取得 マウス ES細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウ スを交配することにより得られる受精後 2 . 5 日の胚を採取し、 ES細胞用培地中 でインビト口培養し、 該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、 そし て該胚を、 フィーダ一細胞培地中に播種して培養し、該培養胚から ES様形態で生 育しているものの細胞塊をトリプシンを含有する ES 細胞用培地を用いて分散処 理、 及び、 フィーダ一細胞培地を用いて培養し、 更には ES細胞用培地を用いて継 代培養し増殖する細胞を単離する。
相同組換えにより、 RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞の取得の ため、 実施例 7において作製した pBlueRS- LoxP- Neo- DT- A- 3 ' K0- 5 ' Κ0を制限酵 素 Notl (日本国宝酒造） で線状化し、 確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマ ニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従って マウス E S細胞 TT2F (Yagi ら、 Analytical Biochem.， 214： 70, 1993) へ導入し た。
TT2F細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本国インビトロ ジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた TT2F細胞を小リブシン処理し、
3 X 107個/ ml となるように HBSに懸濁した。 その後、 0. 5ral の細胞懸濁液を 10 gのベクター DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベッ ト （電極距離： 0. 4cm、 米 国バイオラッド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 ^ ?、 電圧：
240V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地に懸濁し、 あ らかじめフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （フ アルコン、 米国べク トン. ディッキンソン) 1枚に播種した。 24時間後に 200 g/mlのネオマイシン (米国シグマ) を含む E S培地と置き換えた。 7日後に生じ たコロニーをピックァップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントにな るまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS+ 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播 種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation
Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらネオマイシン耐性 TT2F 細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 0. 8%ァガロースゲ ル電気泳動で分離した。 続いてサザンブロットを行い、 ターゲティングベクター
3 '相同領域の下流に位置する DNA断片 （3 ' KO-プローブ、実施例 9参照） をプロ ーブとして相同組換え体を検出した。 野生型 TT2F細胞では EcoRI消化により、 1 本のバンド （約 5. 7 Kb) が検出された。 相同組換え体においては， 2本のバンド
(約 5. 7Kb と約 7. 4Kb) が検出されることが予想されたが、 ネオマイシン耐性株 において約 7. 4Kbの新たなバンドが確認された （図 7 )。 更に、 3 ' K0-プローブに よるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノム DNAを制限酵素 Pstl
(日本国宝酒造） で消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサ ザンブロットを行い、 ターゲティングベクター 5，相同領域の上流に位置する DNA 断片 （5 ' KO -プローブ、 実施例 9参照） をプローブとして相同組換え体を検出し た。 野生型 TT2F細胞では Pstl消化により、 1本のバンド （約 6. 1 Kb) が検出さ れた。 相同組換え体においては， 2本のバンド （約 6. 7Kbと約 6. 1Kb) が検出され ることが予想されたが、 ネオマイシン耐性株において約 6. 7Kbの新たなバンドが 確認された（図 7 )。すなわち、 これらのクローンはマウス RSエレメントを含む近 傍染色体領域 欠失し、 代わりにネオマイシン耐性遺伝子 （両端にはタ一ゲティ ングベクター由来の制限酵素サイ ト部位を含む） が揷入されたものである。 3 ' お よび 5， K0-プロープによるサザン解析の結果、 pBlueRS- LoxP- Neo- DT- A- 3， K0-5 ' K0を制限酵素 Notlで線状化した場合には 72株中 9株 （12. 5%) が相同組換え体 で:あるどいう結果を得た。
取得された RSエレメント ·ターゲティング ·マウス ES細胞の核型解析を記載 (相沢慎一、前記） の方法に従い実施し、取得された ES細胞に異常核型が検出さ れないことを確認した。 実施例 1 1
RSエレメント ·ターゲティング 'マウス ES細胞株および Bリンパ球欠損マウス 系統由来宿主胚を用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリン ί鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426,
1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7, 2000) に 記載された免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 1 0で得られたピュローマイシン耐性マウス ES細胞株（# 3 2 ) を 凍結ス トックより立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリ ン^鎖ノックアウトマ ウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1 つあたり 8〜： 10個注入した。 ES培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲテイング、 1995、 羊土社、 日本国） でー晚培養して胚盤胞まで発生 させた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約 1 0個のィンジェクション胚を移植した。 実施例 1 0の # 3 2を用いて作製されたィンジヱクション胚を計 4 8 0個移植し た結果、 8 0匹の子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿 主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつ て判定される。 誕生した 8 0匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すな わち E S細胞の貢献の認められる個体は 4 8匹であった。 下記実施例 3 2で行わ れ.たヒ ト 'EP0遺伝子転写レベルの比較実験、 下記実施例 3 3で行われた血清中の EP0濃度比較実験及ぴ下記実施例 3 4で行われた末梢血液の血球解析実験におい て、 実施例 1 1で得られたキメラマウスはコントロール個体として用いられた。 実施例 1 2
pC f P2 KIベクターの作製
( 1 ) クローニング部位近傍断片の作製
マウス免疫グロブリン力ッパ鎖 ( Ig K ) 定常領域遗伝子下流にマウス免疫グ口 ブリン κ鎖プロモーター（P2プロモーター）、制限酵素認識配列（Sail, Fsel, Nhel 認識配列）、マウス免疫グロブリン κ鎖ポリ Aシグナル領域およびピューロマイシ ン耐性遺伝子発現ュニットが上に記載された順番に導入されたゲノム断片を作製 した。 以下にその方法を具体的に記す。
(1. 1) クローニング部位上流の断片の調製
GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgG ic遺伝子配列より以下の DNAを合 成した。
l kcl： atctcgaggaaccactttcctgaggacacagtgatagg (酉己列 号 2 9 )
igkc2： atgaattcctaacactcattcctgttgaagctcttgac (酉己列番^" 3 0 )
5 '側プライマーである igkclの末端には Xhol認識配列を、 3 '側プライマーで ある igkc2には EcoRI認識配列を付加した。 TakaLa LA-Taq (日本国宝酒造） の添 付文書にしたがって反応液を調製し、 反応液中にプライマー各 lOpmolおよ ぴ錄型として Ig軽鎖 C fc - J Kを含む λクローン由来 DNA 断片を pBluescript SKIK+) (日本国東洋紡） クローユングしたもの （W0 00/10383号パンフレッ ト） 25ngを添加し、 94°Cで 1分保温したのち、 94°C30秒および 68°C 3分を 1サイク ルとして 25サイクル増幅した。得られた反応液をフエノール Zク口口ホルム抽出 し、 エタノール沈殿した後、 EcoRIおよび Xholで消化し、 0. 8%ァガロースゲル 電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて目的 の断片を回収して増幅断片 Aを得た。 EcoRIおよび Xholで消化した後、 大腸菌ァ ルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript2 KS-ベクター (米国ストラタジーン） に該増幅断片 Aを挿入し、 それを大腸菌 DH5 aに導入し た。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 塩基配列を確認し、 プラスミ ド plgC κ Aを取得した。
(1. 2) クローニング部位下流の断片の調製
GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgG /c遺伝子配列より以下の DNAを合 成した。
igkc3： atgaattcagacaaaggtcctgagacgccacc (配列番号 3 1 j
igkc4： atggatcctcgagtcgactggatttcagggcaactaaacatt (酉己列 3 2 ;
5 ' 側プライマーである igkc3の末端には EcoRI認識配列を、 3 ' 側プライマー である igkc4にはプライマーの 5 ' 側から BamHI、 Xholおよび Sail認識配列を付 加した。 TakaLa LA-Taq (日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、
50 // L反応液中にプライマー各 lOpmolおよぴ铸型として Ig軽鎖 C K - J Kを含むえ クローン由来 DNA断片を pBluescript SKI I (+) (日本国東洋紡） クローニングし たもの（W0 00/10383号パンフレツト） 25ngを添加し、 94°Cで 1分保温したのち、 94°C30秒、 55。C30秒および 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅した。 得られた反応液をフエノール /クロ口ホルム抽出し、 ェタノール沈殿した後、 EcoRI よび BamHIで消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離 し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて目的の断片を回収して増幅断片 B を得た。 EcoRIおよび BamHIで消化した後、 大腸菌アル力リホスファタ一ゼを用 いて末端脱リン酸化した plgC /c Aベタターに得られた増幅断片 Bを揷入し、 大腸 菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、 プラスミ ド plgC /c ABを取得した。
( 2 ) ピューロマイシン耐性遺伝子の導入
Lox-P Puro プラスミ ド （W0 00/10383号パンフレツ ト） を EcoRI および Xhol で消化し、 T4DNAポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。 0. 8%ァガロースゲル 電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl)を用いて ΙοχΡ - ピューロマイシン耐性遺伝子を含む DNA断片を回収した。 plgC c ABを Sailで消 化して末端平滑化したプラスミ ドに、 得られた ΙοχΡ-ピューロマイシン耐性遺伝 子断片を挿入し、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製 し、 連結部分の塩基配列を確認し、 プラスミ ド plgC fc ABPを取得した。
(.3 ) IR 遺伝子の導入
GenBank (米国 NCBI) より取得した encephalomyocarditis virus (脳心筋炎ゥ ィルス） 由来の IRES遺伝子配列より以下の DNAを合成した。
e丄 RESFW： atgaattcgcccctctccctccccccccccta (酉己列番号 d 3 )
esIRESRV： atgaattcgtcgacttgtggcaagcttatcatcgtgtt (酉己歹幡号 3 4 )
5 ' 側プライマーである eIRESFWの末端には EcoRI認識配列を、 3 ' 側プライマ 一である esIRESRVにはプライマーの 5' 側から EcoRIおよび Sail認識配列を付 加した。 TakaLa LA- Taq (日本国宝酒造）の添付文書にしたがつて反応液を調製し、
50 し反応液中にプライマー各 lOpmolおよび鎳型として pIREShygプラスミ ド（米 国クロンテック） 150ngを添加し、 94。Cで 1分保温したのち、 94°C30秒、 55°C30 秒および 72°C 1分を 1サイクルとして 25サイクル増幅した。 得られた反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動にかけて DNA断片を分離し、ジーンクリーン 11(米 国 BiolOl) を用いて目的の断片を回収した。 pGEM - Tベクター （米国プロメガ） に 得られた DNA断片を挿入し、 大腸菌 DH5aに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 塩基配列を確認し、 プラスミ ド IRES- Sal/ pGE を取得した。 この プラスミ ドを EcoRIで消化し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離 し、ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて目的の断片を回収した。 plgCKABP を EcoRIで消化したプラスミ ドに、 得られた IRES遺伝子を挿入し、 大腸菌 ϋΗδα に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認 し、 プラスミ ド plgC κ ABPIRESを取得した。
(4) pACfcSalプラスミ ドの作製
W0 00/10383 号パンフレッ トに記載されている免疫グロブリ ン遺伝子軽鎖/ タ ーゲティング用ターゲティングベクタ一プラスミ ドを SacIIで消化した後、 EcoRI を用いて部分消化した。 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて LoxP- PGKPuro部分を 切り出した残りの 14.6Kbの DNAを分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を 用いて回収した。 得られた DNAに以下の合成 DNAを挿入することにより、 Sail認 識配列を導入した。
Sallplus： agtcgaca (配列番号 3 5)
Sallminus： aatttgtcgactgc (酉己列番号 d ο )
.得られ'たプラスミ ドを大腸菌 DH5ひに導入し、 得られた形質転換体より DNAを 調製し、 プラスミ ド pACf Salを取得した。
(5) ρΚΙ κプラスミ ドの作製
上記 （3) で得られた plgCK ABPIRESプラスミ ドを Xholで消化し、 0.8%ァガ ロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を 用いて C/C - IRES-loxP-ピュー口マイシン耐性遺伝子を含む DNA断片を回収した。 上記 （4) で作製された pACkSalを Sailで消化した後、 大腸菌アルカリホスフ ァターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 前記 DNA断片を挿入し、 それを大 腸菌 DH5aに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基 配列を確認して、 プラスミ ド ρΚΙ κを取得した。
(6) plgCic AIRES断片の作製 上記 （ 3 ) で得られた plgC κ ABPIRESプラスミ ドを EcoRIと Bglllで部分消化 し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米 国 BiolOl) を用いて IRES部分を削除した DNA断片 （plgC κ Δ IRES断片） を回収 した。
( 7) P 2プロモーター断片の調製
GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス Ig κプロモーター領域遺伝子配列よ り以下の DNAを合成した。
P2F： CCCAAGCTTTGGTGATTATTCAGAGTAGTTTTAGATGAGTGCAT (配列番号 3 7)
P2R： ACGCGTCGACTTTGTCTTTGAACTTTGGTCCCTAGCTAATTACTA (配列番号 3 8 )
5， 側プライマーである P2Fには Hind III認識配列を、 3' 側プライマーである P2Rには Sail認識配列を付加した。マウスゲノム DNAを铸型として、 KODplus (日 本国東洋紡） により増幅された DNA断片をフヱノ一ルクロロフオルム抽出後、 ェ タノール沈殿で回収した。回収された DNA断片を Hind IIIおよび Sailで消化し、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて回収した。 Hind IIIおよび Sailで消化した後、 大腸菌アル力 リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript IIKS-ベクター （米 国 Stratagene社） に回収された増幅断片を挿入し、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得 られた形質転換体より DNAを調製し、 塩基配列を確認し、 Igfcプロモーター領域 遺.伝子配列を含むプラスミ ドを取得した。得られたプラスミ ドを Hind IIIおよび Sailで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジー ンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて P 2プロモーター断片を回収した。
( 8) 部分長 C fcpolyA断片の作製
GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgC κ polyA領域遺伝子配列より以下 の DNAを合成した。
PPF:
3 9)
PPR：
GAAGATCTCAAGTGCAAAGACTCACTTTATTGAATATTTTCTG (配列番号 4 0 ) 5 ' 側プライマーである PPFには Sail, Fsel, Nhel認識配列を、 3 ' 側プライマ 一である PPRには Bglll認識配列を付加した。 マウスゲノム DNAを铸型として、 KOD plus (日本国東洋紡） により増幅された DNA断片をフヱノールクロロフオル ム抽出後、 エタノール沈殿で回収した。 回収された DNA断片を Sailおよび Bglll で消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて回収した。 Sailおよび Bglllで消化した後、 大腸菌ァ ルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した PSP72ベクター（米国 Promega 社） に回収された増幅断片を揷入し、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転 換体より DNAを調製し、塩基配列を確認し、部分長 C fc polyA領域遺伝子配列を含 むプラスミ ドを取得した。得られたプラスミ ドを Sailおよび Bglllで消化した後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて部分長 C K polyA断片を回収した。
( 9 )完全長 C κ polyA断片の作製
GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgC /c polyA領域遺伝子配列より以下 の DNAを合成した。
TPF : GGAATTCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCC (配列番号 4 1 )
TPR : CCCAAGCTTGCCTCCTCAAACCTACCATGGCCCAGAGAAATAAG (配列番号 4 2 )
5 '側プライマーである TPFには EcoRI認識配列を、 3 '側プライマーである TPR に.は Hindlll認識配列を付加した。マウスゲノム DNAを鎵型として、 KOD plus (日 本国東洋紡） により増幅された DNA断片をフニノールクロロフオルム抽出後、 ェ タノール沈殿で回収した。回収された DNA断片を EcoRIおよび Hindlllで消化し、
0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA 断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国
BiolOl) を用いて回収した。 EcoRIおよび Hindlllで消化した後、 大腸菌アル力 リホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript IIKS-ベクター （米 国 Stratagene社） に回収された増幅断片を挿入し、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得 られた形質転換体より DNAを調製し、 塩基配列を確認し、 完全長 C /cポリ A領域 遺伝子配列を含むプラスミ ドを取得した。 得られたプラスミ ドを EcoRI および
Hindlllで消化した後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、 ジ ーンクリーン Π (米国 BiolOl) を用いて完全長 C K;ポリ A断片を回収した。 (10) 完全長 C Kポリ A断片、 P2プロモーター断片、 部分長 C /cポリ A断片から 構成される DNA断片 Aの作製
EcoRIおよび Bglllで消化した後、 大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末 端脱リン酸化した pBluescript IIKS-ベクター （米国 Stratagene社） に完全長 C KpolyA断片、 P2プロモーター断片、 部分長 C κ polyA断片を挿入し、 大腸菌 DH5 に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、完全長 Cfc polyA断片、 P2 プロモーター断片、部分長 CfcpolyA断片の順番に DNA断片が挿入されていること を塩基配列のレベルで確認し、 DNA断片 A遺伝子配列を含むプラスミ ドを取得し た。得られたプラスミ ドを EcoRIと Bglllで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電 気泳動にて DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて DNA 断片 Aを回収した。
( 1 1 ) plgC/c AIRES ProAプラスミ ドの作製
大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン酸化した plgC/c AIRES 断 片に DNA断片 Aを挿入し、大腸菌 DH5ひに導入した。得られた形質転換体より DNA を調製し、 DNA 断片 A が挿入されていることを塩基配列のレベルで確認し、 DNA 断片 A遺伝子配列を含む plgC κ Δ IRES ProAプラスミ ドを取得した。
( 1 2) CK P2Hプラスミ ドの作製
plgC /c AIRES ProAプラスミ ドを Xholで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気 泳動にで DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて IgCfc上 流ゲノム領域、 IgC K；、 DNA断片 A、 Lox - PPuro断片より構成される DNA断片を回 収した。 Sailで消化した後、 大腸菌アルカリホスファターゼを用いて末端脱リン 酸化した pAC /c Sall に回収した DNA 断片を挿入し、 大腸菌 XL10 - GOLD (米国 Stratagene社） に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 IgC κ上流 ゲノム領域、 IgCK、 DNA断片 A、 Lox - P Puro断片より構成される DNA断片が挿入 されていることを塩基配列のレベルで確認し、 C /cP2Hプラスミ ドを取得した。
( 1 3) C K 5' genomicプラスミ ドの作製
GenBank (米国 NCBI) より取得したマウス IgC κ及び上流ゲノム領域遺伝子配列 より以下の DNAを合成した。
5GF: ATAAGAATGCGGCCGCCTCAGAGCAAATGGGTTCTACAGGCCTAACAACCT (配列番号 43 ) 5GR:
CCGGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGG (配列番号 44 )
5' 側プライマーである 5GFには Notl認識配列を、 3' 側プライマーである 5GR には EcoRI認識配列を付加した。 マウスゲノム DNAを鐯型として、 KOD plus (日 本国東洋紡） により増幅された DNA断片をフエノールクロロフオルム抽出後、 ェ タノール沈殿で回収した。回収された DNA断片を Notlおよび EcoRIで消化し、 0.8% ァガロースゲル電気泳動にて DNA断片を分離し、ジーンクリーン 11(米国 BiolOl) を用いて回収した。 Notlおよび EcoRIで消化した後、 大腸菌アル力リホスファタ ーゼを用いて末端脱リン酸化した pBluescript IIKS-ベクター （米国 Stratagene 社） に回収された増幅断片を挿入し、 大腸菌 DH5aに導入した。 得られた形質転 換体より DNAを調製し、 塩基配列を確認し、 CK5' ゲノム領域遺伝子配列を含む Cfc5' ゲノムプラスミ ドを取得した。
(14) CicP2KIADTプラスミ ドの作製
C κ P2Hプラスミ ドを EcoRIおよび Xholで消化した後、 0.8°/。ァガロースゲル電 気泳動にて 11Kbの DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用い て 5' 末端に EcoRIサイ トを 3' 末端に Xholサイ トを持つ DNA断片を回収した。 EcoRIおよび Xholで消化した後、大腸菌アル力リホスファターゼを用いて末端脱 リ.ン酸イビした CK5' ゲノムプラスミ ドに回収した DNA 断片を挿入し、 大腸菌 XL10-G0LD (米国 Stratagene社） に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調 製し、 回収された断片が C K 5' ゲノムプラスミ ドに揷入されていることを塩基配 列のレベルで確認し、 C KP2KI ADTプラスミ ドを取得した。
(1 5) DT- A断片の調製
pKI fcプラスミ ドを Xholおよび Kpnlで消化した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳 動にて約 1Kbの DNA断片を分離し、 ジーンクリーン II (米国 BiolOl) を用いて DT-A断片を取得した。
(1 6) pC/ P2 KIベクターの作製
Xholおよび Kpnlで消化した後、 大腸菌アル力リホスファタ一ゼを用いて末端 脱リン酸化した C κ Ρ2ΚΙΔ0Τプラスミ ドに DT - A断片を挿入し、大腸菌 XL10-G0LD (米国 Stratagene社） に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 DT-A 断片が C κ P2KI A DTプラスミ ドに揷入されていることを塩基配列のレベルで確認 し、 PC ic P2 KIベクター （図 8 ) を取得した。 実施例 1 3
pC fc P2 KIベクターへのヒ ト EP0遺伝子の揷入
(6. 1) ヒ ト Erythropoietin DNA断片の作製
hEPO Np： CCGCTCGAGCGGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG (配列番号 4 5 )
hEPO Rp： CCGCTCGAGCGGTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA (配列番号 4 6 )
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製し、 50 1 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、錶型としてヒ ト EPO cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 15秒および 68°C 1分を 1サイクルとして 30サイクル 増幅し、 得られた 580bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収した。 回収されたゲル 力 ら QIAquick Gel Extraction Ki t (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがつ て増幅断片を回収した。 回収された PCR増幅断片を Xholで酵素消化し、 0. 8%ァ ガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲノレから QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回 収した。
pBluescriptl lSK (-) (米国 STRATAGENE) を Xhol消化し、 0. 8%ァガロースゲル より分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リ ン酸化したものに、 上記回収された DNA断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5 に導 入した。得られた形質転換体より DNAを調整し、挿入断片のシーケンスを行った。 PCRによる変異の無いクローンを選択し Xhol消化した後、 0. 8%ァガロースゲル で分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN)を用い添付文書にしたがつてヒ トエリス口ポェチン DNA断片を回収した。
(6. 2) pCkP2 hEPO KIベクターの構築
pC κ Ρ2 ΚΙベクターを Sai lで消化後、 仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼ を用いて末端脱リン酸化したものに、（6. 1)で作製したヒ トエリスロポエチン DNA 断片を揷入した後、 大腸菌 XL10- Gold Ul tracompetent Cel ls (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認 して、 pCkP2 hEPO KIベクター （図 9 )を取得した。 実施例 1 4
エレク トロポレーション用 pCkP2 hEPOKIベクターの調製
pCkP2 hEPO KIベクター 60 /i gを、 スペルミジン添加 ( 1 ηι pH7. 0米国シグマ) バッファー (日本国ロシュ ·ダイァグノスティックス、 制限酵素用 Hバッファー) を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、. フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリ ゥムを加え、- 20°C で 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェ タノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間 風乾させた。 0. 5 μ g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で 保存し、 エレク トロポレーシヨン用 pCkP2 hEPO KIベクターの調製を行なった。 実施例 1 5
pCkP2 hEPO KIベクターと RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞株を 用いた CkP2 hEPOマウス ES細胞株の取得
ヒ ト EPO-cDNA が相同組換えにより免疫グロプリン fc軽鎖遺伝子下流に挿入さ れたマヴス ES細胞株取得のため、実施例 13で作製した pCkP2 hEPO KIベクターを 制限酵素 Notl (日本国宝酒造） で線状化し、 確立されている方法 （相沢慎一、 バ ィォマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に 従って RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞へ導入した。
RSエレメント . ターゲティング 'マウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、前記） に従い、栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ）処理した G418 耐性初代培養細胞 （日本国インビトロジ ン社より購入） を用いた。 まず、 増殖 させた RSエレメント ·ターゲティング 'マウス E S細胞をトリプシン処理し、 3
X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 μ εのべ クタ一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオ ラッド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 μ Ρ、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地 （相沢慎一、 前記） に 懸濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシ ヤーレ （ファルコン、 米国べク トン. ディッキンソン) 1枚に播種した。 36時間 後に 0. 8 / g/ml のピューロマイシン （米国シグマ） を含む ES培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーのうち計 24個をピックアップし、 それぞれを 24穴プレ 一トでコンフルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS + 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼ ラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 こ れらのピュー口マイシン耐性 RSエレメント ·ターゲティング ·マウス E S細胞ゲ ノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動 で分離した。 続いてサザンプロットを行い、 W0 00/10383 号パンフレツト （実施 例 48参照）に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J κ - C ゲノム DNAの 3 '端の DNA 断片（XhoI〜EcoRI、約 1. 4kb、図 5 )をプローブとして相同組換え体を検出した。 その結果、 24株中 15株 （62. 5%) が相同組換え体であるという結果を得た。 野 生型 TT2F細胞では EcoRI消化により、 1本のバンドが検出された。相同組換え体 においては、 このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想され る （図 1 0 ) 力 ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認され た。 すなわち、 これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリン κ鎖遺伝子下 流にヒ ト EP0- cDNAが揷入されたものである。 実施例 1 6
CkP2 hEPO マウス E S細胞株および B リンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用い たキメラマウスの作製
免疫グロプリン/ /鎖遺伝子ノ； クァゥトのホモ接合体においては、 機能的な B リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426,
1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722 -7, 2000) に 記載された免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 1 5で得られ、免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが揷 入されていることが確認された CkP2 hEP0マウス ES細胞株 （# 57, 69) を凍結ス トツクより立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン/ i鎖ノックアウトマウスホ モ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあた り 8〜10個注入した。 ES培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーン ターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） でー晚培養して胚盤胞まで発生させた 後、 偽妊娠処理後 2· 5日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮 に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のィンジヱクション胚を移植した。実施例 1 5の # 57, 69を用いて作製されたインジェクション胚をそれぞれ計 100個移植 した結果、 23匹、 36匹それぞれ子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色 において、宿主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるか どうかによって判定される。 誕生した 23匹、 36匹のうち毛色に明らかに野生色 の部分のある、 すなわち ES細胞の貢献の認められる個体はそれぞれ 15匹、 29匹 であった。 これらの結果より、 免疫グロプリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNA が挿入されている Ck EP0マウス E S細胞株 # 57， 69はキメラ形成能を保持して いる、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示さ れた。 実施例 1 7
pNP hEPO KIベクターの構築
1 . 上記実施例 1 2の pCkP2 KIベクターに一本鎖化サイ ト Asclを加えたベタタ 一作製 · · · pCkP2+As KI
以下の合成オリゴをァニールさせて、 Asclリンカ一を合成した。
Ascl top l inker： GGCCAGGCGCGCCTTGC (配列番号 4 7 )
Ascl bottom linker： GGCCGCAAGGCGCGCCT (配列番号 4 8 ) pCkP2 KIベクターを制限酵素 Notl (Roche)で消化し、 0. 8%ァガロースゲルよ り分離精製した後に ligation kit ver. 2 (タカラバイオ） を使用したライゲーシ ヨ ン反応によ り Ascl リ ンカ一を導入した。 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracorapetent Cells (米国 STRATAGENE)に導入して得られた形質転換体より DNA を調製し、 挿入断片の塩基配列を確認した。
2 . pBlueLABの Pacl · Fsel間に Nhelサイ ト導入 pBlueLAB+Nhの構築 pBlueLABを制限酵素 Pa (NEB) で消化後、 核酸精製用マイクロスピンカラム
S-200HR (アマシャム） を用いてバッファー置換し、 続いて制限酵素 Fsel (NEB) で消化。 0. 8%ァガロースゲルより分離精製した後に以下の合成オリゴをァニール させて、 l igation kit ver. 2 (日本国タカラバイオ) を使用したライゲ一ション 反応により導入した。それを大腸菌 DH5 aに導入して得られた形質転換体より DNA を調整し、 挿入断片のシーケンスを行った。
Pac-Nhe-Fse S： TAAGGGCTAGCTAGGGCCGG (配列番号 4 9 )
Pac-Nhe-Fse AS： CCCTAGCTAGCCCTTAAT (配列番号 5 0 )
3 . pBlueLAB+Nhの Sail- Hindlll間に Hpalサイ ト導入 pBlueLAB+NhHp の構築
pBlueLAB+Nhを制限酵素 Sall、 Hindlll (Roche) で消化し、 0. 8%ァガロースゲ ルょり分離精製した後に以下の合成オリゴをァニールさせて、 l igat ion kit ver. 2 (.曰本国タカラバイオ） を使用したライゲーシヨン反応により導入した。 それを 大腸菌 DH5 aに導入して得られた形質転換体より DNAを調整し、 挿入断片のシー ケンスを行った。
S/Hpal/Hd-S： TCGAGTTAAC (配列番号 5 1 )
S/Hpal/Hd-AS： AGCTGTTAAC (配列番号 5 2 )
4 . PCkP2+As KIより Ck- polyAを含む P2プロモーター部分除いたベクター' · · · pCkpAP2の構築
pCkP2+As KIを制限酵素 Hpal - Nhel (Roche) で消化して生じる 952bpの断片を
0. 8%ァガロースゲルより分離精製し回収した。 pBlueLAB+NhHp を制限酵素 Hpal および Nhel (Roche) 消化し、 0. 8%ァガロースゲルより分離精製した後に仔牛小 腸由来アルカリフォスファターゼ (日本国タカラバイオ) を用いて末端脱リン酸 化した。 上記 952bpの断片を ligation kit ver. 2 (日本国タカラバイオ） を使用 したライゲーシヨン反応により導入した。 それを大腸菌 DH5 に導入して得られ た形質転換体より DNAを調整し、 連結部分のシーケンスを行った。
5 . P2プロモーターを除去してマノレチクローニングサイ ト (Sai l , Fsel、 Pad)を 導入しこベクター ' · · p CkpAMCS
上記 4の pCkpAP2を制限酵素 HindIII、 Nhel (Roche) 消化。 0. 8%ァガロース ゲルより約 4kbの断片を回収した。以下の合成オリゴをァニールさせて、 l igation ki t ver. 2 (日本国タカラバイオ)を使用したライゲーション反応により導入した。 SPFN1 inker- S ： AGCTGTCGACTTAATTAAGGCCGGCCG (配列番号 5 3 )
SPFNl inker-AS ： CTAGCGGCCGGCCTTAATTAAGTCGAC (配列番号 5 4 )
6 . KI 大ベクタ一の構築 p CkP2厶 P
上記 5の pCkpAMCSを制限酵素 Hpal、 Nhel (Roche) で消化し、 0. 8%ァガロー スゲルより Ck- polyA- MCSを含む約 700bp断片を回収した。 pCkP2+As KIを制限酵 素 Hpal- Nhel (Roche)で消化し、 19. 6kbを 0. 8%ァガロースゲルより回収した後、 大腸菌由来アル力リフォスファターゼ （日本国タカラバイオ） を用いて末端脱リ ン酸化した。 前述の約 700bp断片を l igation kit ver. 2 (日本国タカラバイオ） を使用したライゲーシヨ ン反応により導入した。 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracorapetent Cell s (米国 STRATAGENE)に導入して得られた形質転換体より DNA を調製し； 連結部分の塩基配列を確認した。
7. pNP hEPO KIベクターの構築
上記実施例 2の pNPshEPO in vitro用ベクターを Sail及び Fselで酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより約 1. 2kbの断片を分離精製した後、 上記 6の p CkP2厶 P を Sailおよび Fselで酵素消化後、 大腸菌 C75由来アル力リフォスファターゼを 用いて末端脱リン酸化したものに挿入。 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認して、 pNP hEPO KIベクター（図 1 1 )を取得した。 実施例 1 8
エレク トロポレーション用 pNP hEPO KIベクターの調製 pNP hEPO KIベクター 60 ^ gを、 スペルミジン添加 ( 1 mM ρΗ7· 0米国シグマ） バッファー （日本国ロシュ ·ダイァグノスティックス、 制限酵素用 Ηバッファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリ ゥムを加え、 - 20°C で 16 B 間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェ タノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間 風乾させた。 0. 5 μ g/ μ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で 保存し、 エレク トロポレーシヨン用 pNP hEPO KIベクターの調製を行なった。 実施例 1 9
pNP hEPO KIベクターと RSエレメント · ターゲティング ·マウス E S細胞株を用 いた NP hEPOマウス E S細胞株の取得
ヒ ト EP0 - cDNA が相同組換えにより免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子下流に挿入さ れたマウス E S細胞株取得のため、 実施例 1 8で作製した pNP hEPO KIベクター を制限酵素 Notl (日本国宝酒造） で線状化し、'確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従って RSエレメント · ターゲテイング ·マウス ES細胞へ導入した。
RSエレメント . ターゲティング .マウス ES細胞の培養法は、記載の方法（相沢 慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシン C (米国シ Γマ）処理した G418耐性初代培養細 胞 （日本国インビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた RSエレメ ント · ターゲティング ·マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個 Zml とな るように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 μ gのベクター DNAと混和 し、 ジーンパルサーキュベッ ト （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオラッド） にてエレ ク トロポレーションを行った （容量： 960 μ Ρ、 電圧： 250V、 室温）。 エレク トロポ レーションした細胞を 10mlの E S培地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 あらかじめ フィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ（フアルコン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間後に O. S g/mlのピュ 一口マイシン （米国シグマ） を含む ES培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニ 一のうち計 24個をピックアップし、 それぞれを 24穴プレー 1、でコンフルーェン トになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、米国シ ダマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレー トに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらのピューロマ ィシン 性 RSエレメント ·ターゲティング 'マウス ES細胞ゲノム DNAを制限酵 素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続い てサザンブロットを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に記載 の発明で使用された、 I g軽鎖 J κ - C κゲノム DNAの 3，端の DNA断片（Xhol〜EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレツ ト、 特に図 25) をプローブとして相同組換 え体を検出した。 その結果、 24株中 11株 （45. 8%) が相同組換え体であるとい う結果を得た。野生型 TT2F細胞では EcoRI消化により、 1本のバンドが検出され た。 相同組換え体においては、 このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出 ることが予想される (図 1 2 ) が、 ピューロマイシン耐性株においてこの新たな バンドが確認された。 すなわち、 これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブ リン fc鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNAが挿入されたものである。 実施例 2 0
NP hEPOマウス ES細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキ メ.ラマヴスの作製
免疫グロプリン/ 鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な B リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423 - 426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97： 722-7, 2000) に 記載された免疫グロプリン i鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 1 9で得られ、免疫グロブリン κ;鎖遺伝子下流にヒ ト EPO-cDNAが挿 入されていることが確認された NP hEPOマウス ES細胞株 （# 10) を凍結ス トック より立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン^鎖ノックアウトマウスホモ接合 体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあたり 8〜 10個注入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンター ゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側の子宫あたりそれぞれ約 10個のィンジェクション胚を移植した。実施例 1 9 の # 10を用いて作製されたィンジヱクション胚をそれぞれ計 100個移植した結果、 18匹それぞれ子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚 由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判 定される。 誕生した 23匹、 36匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 す なわち E S細胞の貢献の認められる個体は 13匹であった。 これらの結果より、免 疫グロプリン 鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されている NP hEPOマウス E S細胞株 # 10はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に 分化する能力を保持していることが示された。 · 実施例 2 1
pPS hEPO KIベクターの構築
上記実施例 1の pPSs hEPO in vitro用ベクターを Sail及び Fselで酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより約 1. 3kbの断片を分離精製した後、上記実施例 1 7の p CkP2 Δ Pを Sailおよび Fsel で酵素消化後、 大腸菌 C75由来アル力リフォスファ ターゼを用いて末端脱リ ン酸化したものに挿入。 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNA を調製し、 連結部分の塩基配列を確認して、 pPS hEPO KI ベクター（図 1 3 ) を取得した。 実施例 2 2
エレク トロポレーション用 pPS hEPO KIベクターの調製
pPS hEPO KIベクター 60 /z gを、 スペルミジン添加 （ 1 raM pH7. 0米国シグマ） バッファー （日本国ロシュ 'ダイァグノスティックス、 制限酵素用 Hバッファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリゥムを加え、 - 20°C で 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェ タノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70 %エタノールを除き、 1時間 風乾させた。 0. 5 μ g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で 保存し、 エレク ト口ポレーション用 pPS hEPO KIベクターの調製を行なった。 実施例 2 3
pPS hEPO KIベクターと RSエレメント · ターグティング 'マウス ES細胞株を用 いた PS hEPOマウス ES細胞株の取得
ヒ ト EP0 - cDNA が相同組換えにより免疫グロブリン / 軽鎖遺伝子下流に揷入さ れたマウス E S細胞株取得のため、 実施例 2 1で作製した pPS hEPO KIベクター を制限酵素 Notl (日本国宝酒造） で線状化し、 確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従って RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞へ導入した。
RSエレメント . ターゲティング 'マウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、前記） に従い、栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ)処理した G418 耐性初代培養細胞 （日本国インビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖 させた RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3
X 107個 Zml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5ralの細胞懸濁液を 10 μ δのべ クタ一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュべット （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオ ラッ ド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 F、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク トロポレーシヨンした細胞を 10mlの ES培地 （相沢慎一、 前記） に懸 濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャ ーレ （ファルコン、 米国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間後 に 0. 8 /i g/mlのピューロマイシン （米国シグマ） を含む E S培地と置き換えた。
7日後に生じたコロニーのうち計 24個をピックアップし、 それぞれを 24穴プレ 一トでコンフルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2 mlの保存用培地（FBS + 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼ ラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 こ れらのピュー口マイシン耐性 RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞ゲ ノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動 で分離した。 続いてサザンブロットを行い、 W0 00/10383 号パンフレツ ト （実施 例 48参照）に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J fc - Cにゲノム DNAの 3 '端の DNA 断片 (XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 00/10383号パンフレツト、 特に図 25) をプロ一 ブとして相同組換え体を検出した。 その結果、 24株中 9株 （37. 5%) が相同組換 え体であるという結果を得た。野生型 TT2F細胞では EcoRI消化により、 1本のバ ンドが検出された。 相同組換え体においては、 このバンドに加えてその下部に新 たなバンドが出ることが予想される （図 1 4 ) 力 ピューロマイシン耐性株にお いてこの新たなバンドが確認された。 すなわち、 これらのクローンは一方のァレ ルの免疫グロプリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されたものである。 実施例 2 4
PS hEPOマウス ES細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキ メラマウスの作製
免疫グ プリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない (Kitamura ら， Nature, 350 : 423 - 426， 1991 )。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad.' Sci. USA, 97： 722-7, 2000) に 記載された免疫グロブリン μ鎖遺伝子ノックアウトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 2 3で得られ、免疫グロブリ ン 鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNAが揷 入されていることが確認された PS hEPOマウス ES細胞株 （# 6) を凍結ス トック より立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合 体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ 1つあたり 8〜 10個注入した。 ES培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ 8、ジーンターゲテ イング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊 娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側 の子宮あたりそれぞれ約 10 個のインジェクショ ン胚を移植した。 実施例 2 3の PS EP0マウス ES細胞株 （# 6) を用いて作製されたインジェクション胚を計 160 個移植した結果、 53匹の子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色におい て、 宿主胚由来の白色の中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうか によって判定される。 誕生した 53匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち ES細胞の貢献の認められる個体は 26匹であった。 これらの結果より、 免疫グロプリン/ c鎖遺伝子下流にヒト EP0- cDNAが揷入されている PS hEPOマウス ES細胞株 # 6はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に 分化する能力を保持していることが示された。 実施例 2 5
pCkP2 hEPO KIベクターとマウス TT2F細胞株を用いた CkP2 hEPOマウス TT2F細 胞株の取得
ヒ ト EPO- cDNA が相同組換えにより免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子下流に挿入さ れたマウス E S細胞株取得のため、 実施例 1 3で作製した pCkP2 hEPO KIベクタ 一を制限酵素 Notl (日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相沢慎一、 バイオマ二ユアノレシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従ってマウス E S細胞 TT2F (Yagiら、 Analytical Biochem. , 214 : 70, 1993) へ導入した。
マウス TT2F細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞 はマイ トマイシン C (米国シグマ) 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本国ィン ビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、増殖させた TT2F細胞をトリプシン処 理し、 3 X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁液を lO ^i gのベクター DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオラッド） にてエレク トロポレーションを行った （容量： 960 /x F、電圧： 240V、 室温）。 エレク トロポレーションした細胞を 10mlの ES培地 （相沢慎一、 前 記） に懸濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチ ックシャーレ （ファルコン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間後に 0. 8 μ /ηι1のピューロマイシン （米国シグマ） を含む ES培地と置き 換えた。 7日後に生じたコロニーのうち計 96 個をピ,ックアップし、 それぞれを 24穴プレートでコンフル一ェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存 用培地 （ES 培地 + 10%應 S0、 米国シグマ) に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残り の 1/3 は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の 糸田月包力 ¾らゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。これらのピュー口マイシン耐性マウス ES細胞ゲノム DNAを制限 酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続 いてサザンブロッ トを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に記 載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J /c - C /cゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片 （XhoI〜 EcoRI , 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレッ ト、 特に図 25) をプローブとして相 同組換え体を検出した。 その結果、 96株中 11株 （11. 5%) が相同組換え体であ るという結果を得た。野生型 TT2F細胞では EcoRI消化により、 1本のバンドが検 出された。 相同組換え体においては、 このバンドに加えてその下部に新たなバン ドが出ることが予想される （図 1 5 ) 力 S、 ピューロマイシン耐性株においてこの 新たなバンドが確認された。 すなわち、 これらのクローンは一方のアレルの免疫 グロブリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EPO-cDNAが挿入されたものである。 実施例 2 6
CkP2 hEPOマウス TT2F細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した CkP2 Δ P hEPOマゥ ス TT2F細胞株の取得
CkP2 hEPOマウス TT2F細胞株より薬剤耐性遺伝子 （Puro を除去した CkP2 Δ
P hEPO遺伝子導入 TT2F細胞株取得のため、 pCAGGS-Creベクター（Sunaga ら、 Mol
Reprod Dev. , 46 : 109-113， 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマ- ュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、羊土社、 日本国) に従って CkP2 hEPOマウス TT2F細胞へ導入した。
CkP2 hEP0マウス TT2F細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記） に従い、 栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日 本国インビトロジヱン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた CkP2 hEPOマウ ス TT2F'細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してか ら、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 / gのベクター DNAと混和し、 ジーンパルサーキュべ ッ ト （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオラッ ド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行つ た （容量： 960 ^ Ρ、 電圧： 250V、 室温）。 エレク トロポレーションした細胞を 10ml の E S培地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2, 5ml分を、 あらかじめフィ ーダー細胞を播種した 60醒組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、米国 ベタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあら かじめフィーダ一細胞を播種した lOOmm組織培養用プラスチックシャーレ （ファ ルコン、 米国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロ ニーのうち計 48個をピックアップし、 それぞれを 24穴プレートでコンフルーェ ントになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 米国 シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレ 一トに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolat ion Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらマウス E S細 胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気 泳動で分離した。 続いてサザンブロッ トを行い、 W0 00/10383号パンフレツ ト （実 施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 - C /cゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片 （XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 図 5 ) をプローブとして LoxP配列で挟まれた Pure 遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Puro1"遺伝子を保持した ES 細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 Kと 13. 1 K) が検出され、 Puror 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 K と 10. 2 K) が検出される （図 1 5 )。 その結果、 48株中 4株 （8. 3%) が CkP2 hEPO マウス TT2F細胞株より薬剤耐性遺伝子 （Pure/) が除去された TT2F細胞株 （CkP2 厶 P hEPOマウス TT2F細胞株） であるという結果を得た。 実施例 2 7
CkP2 A P hEPOマウス TT2F細胞株おょぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を 用いたキメラマウスの作製
免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722 - 7, 2000) に 記載された免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 2 6で得られ、免疫グロプリン / c鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿 入されていることが確認された CkP2 Δ Ρ hEPOマウス TT2F細胞株 （# 8) を凍結 ストックより立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウス ホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあ たり 8〜10個注入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジ ーンターグティング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晩培養して胚盤胞まで発生さ せた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の 子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のインジェクション胚を移植した。実 施例 2 6の # 8を用いて作製されたィンジヱクション胚を計 80個移植した結果、 14匹の子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の 白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判定され る。誕生した 14匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち E S細胞 の貢献の認められる個体は 10匹であった。 これらの結果より、免疫グロプリン K 鎖遺伝子下流にヒ ト EPO-cDNAが挿入されている CkP2 Δ Ρ hEPOマウス TT2F細胞 株（# 8) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化 する能力を保持していることが示された。 実施例 2 8
CkP2 hEPOマウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した CkP2 loxP hEPOマゥ ス ES細胞株の取得
CkP2 hEPOマウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Neof， Pure/) を除去し た CkP2 'loxP hEPO遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS - Creベクター（Sunaga ら、 Mol R印 rod Dev. ， 46 : 109 - 113， 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 ノ ィォマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に 従って CkP2 hEPOマウス ES細胞 (#30) へ導入した。
CkP2 hEPOマウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日 本国インビトロジヱン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた CkP2 hEPOマウ ス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ mlとなるように HBSに懸濁してから、
0, 5mlの細胞懸濁液を のベクター DNAと混和し、ジーンパルサーキュべッ ト
(電極距離： 0. 4cm、米国バイオラッド）にてエレク トロポレーションを行った（容 量： 960 ;/ Ρ、 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E
S培地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ 一細胞を播種した 60匪組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじ めフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （フアルコ ン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロニー のうち計 46個をピックアップし、 それぞれを 24穴プレートでコンフルーェント になるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS+ 10%DMS0、 米国シグ マ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレート に播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA
Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらマウス E S細 胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気 泳動で分離した。 続いてサザンブロッ トを行い、 W0 00/10383号パンフレツ ト （実 施例 48参照） に記載の発明で使用された、 IG軽鎖 J K - C Kゲノム DNAの 3 ' 端の
DNA断片 （XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 図 5 ) をプローブとして LoxP配列で挟まれた Pure 遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Pure/遺伝子を保持した ES 細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 Kと 13· 1 K) が検出され、 Puro^ 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 K と 10. 2 K) が検出される （図 1 0 )。 また、 上記と同様の操作で得られたサザン ブロット膜を用い、 実施例 1 0で用いられた 3 ' ΚΟ-probをプローブとして LoxP 配列で挟まれた Ne (/遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Nee 遺伝子 を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （7. 4 Kと 5. 7 K) が検 出され、 Neor遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバ ンド （5. 7 Kと 4. 4 K) が検出される（図 1 0 )。 その結果、 46株中 1株 （2. 2%) が CkP2 ヒ ト EP0遺伝子導入 ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Nec， Puror) が同時に除去された ES細胞株 （CkP2 loxP hEPOマウス ES細胞株） であるという 結果を得た。 実施例 2 9
CkP2 loxP hEPOマウス ES細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を 用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7, 2000) に 記載された免疫グロプリン/ 鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 2 8で得られ、免疫グロブリン 鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNAが揷 入されていることが確認された CkP2 loxP hEPOマウス ES細胞株 （# 18) を凍結 ストックより立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウス ホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあ たり 8〜10個注入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジ ーンターゲティング、 羊土社、 1995) でー晚培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のィンジェクシヨン胚を移植した。実施例 2 8 の # 18を用いて作製されたィンジ工クション胚を計 240個移植した結果、 80匹の 子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白色の 中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。誕 生した 80匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち E S細胞の貢献 の認められる個体は 52匹であった。 これらの結果より、免疫グロプリン κ鎖遺伝 子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されている CkP2 loxP hEPOマウス ES細胞株（# 18) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力 を保持していることが示された。 実施例 3 0
PS hEPOマウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した PS loxP hEPOマウス ES 細胞株の取得
PS hEPOマウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Neor， Puror) を除去した PS loxP hEPO遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS - Creベクター（Sunagaら、 Mol Reprod Dev. , 46 : 109 - 113， 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオ マニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国) に従つ て PS hEPOマウス ES細胞 （#6) へ導入した。
PS hEPOマウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄 養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本 国インビトロジヱン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた PS hEPOマウス ES 細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ mlとなるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁液を lO ^u gのベクター DNA と混和し、 ジーンパルサーキュベット （電 極距離： 0. 4cm、米国バイオラッド）にてエレク ト口ポレーションを行った（容量：
960 / F、 電圧： 250V、 室温）。 エレクト口ポレーシヨンした細胞を l Oralの E S培 地 （相沢慎一、 前記） に懸濁しそれより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細胞 を播種した 60mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじめフィ ーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 米 国べタ トン. ディ ッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロニーのうち 計 192個をピックアツプし、それぞれを 24穴プレートでコンフル一ェン 1、になる まで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%皿 S0、 米国シグマ） に 懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種 し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらマウス E S細胞ゲノム DNA を制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離し た。 ，铳いてサザンプロットを行い、 W0 00/10383号パンフレツト （実施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J /C - C Kゲノム DNAの 3 '端の DNA断片 （Xhol 〜EcoRI、 約 1. 4kb、 0 00/10383号パンフレッ ト 図 25) をプローブとして LoxP 配列で挟まれた Pur。r遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Pur。r遺伝 子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド (15. 6 Kと 12. 7 K) が検出され、 Pure 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI 消化により、 2 本のバンド （15. 6 Kと 9. 8 K) が検出される（図 1 4 )。 また、 上記と同様の操作 で得られたサザンプロッ ト膜を用い、実施例 1 0で用いられた 3 ' K0_probをプロ ーブとして LoxP配列で挟まれた Nee 遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出し た。 Neor遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （7. 4 K と 5. 7 K) が検出され、 Ne0r遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化に より、 2本のバンド （5. 7 Kと 4. 4 K) が検出される（図 1 4 )。 その結果、 I92株 中 2株 (1. 0%)が PSEP0マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 (Neor, Pure/) が同時に除去された ES細胞株 （PS loxP hEPOマウス ES細胞株） であるという結 果を得た。 実施例 3 1
PS loxP hEPOマウス E S細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用 いたキメラマウスの作製 免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7， 2000) に 記載された免疫グロプリン/ /鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 3 0で得られ、免疫グロプリン 鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿 入されていることが確認された PS loxP hEPOマウス E S細胞株 （#48) を凍結ス トツクより立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホ モ接合体の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあた り 8〜10個注入した。 ES培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーン ターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） でー晚培養して胚盤胞まで発生させた 後、 偽妊娠処理後 2. 5日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮 に、片側の子宮あたりそれぞれ約 10個のインジェクション胚を移植した。実施例 3 0の # 48を用いて作製されたィンジヱクション胚を計 240個移植した結果、 70 匹の子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白 色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判定される。 誕生した 70匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち ES細胞の貢 献の認められる個体は 34匹であった。 これらの結果より、免疫グロプリン/ c鎖遺 伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されている PS loxP hEPOマウス E S細胞株 #48 はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力 を保持していることが示された。 実施例 3 2
CkP2 hEPOマウス E S細胞由来キメラマウス、 NP hEPOマウス ES細胞由来キメラ マウス、 PS hEPOマウス ES細胞由来キメラマウスにおける、 ヒ ト EP0遺伝子転写 レベルの比較
キメラマウス脾臓より mRNAサンプルの調製：
コント口ールとして上記実施例 1 1で作製された RSエレメント 'ターゲティン グ ·マウス ES細胞株 #32由来のキメラマウス計 3匹、 上記実施例 1 6で作製され た CkP2 hEPOマウス ES細胞株 #57由来のキメラマウス計 3匹（キメラ率 100-70%)、 上記実施例 2 0で作製された NP hEPOマウス ES細胞株 #10由来のキメラマウス計 3匹 (キメラ率 100%)、 上記実施例 2 4で作製された PS hEPOマウス ES細胞株 #6 由来のキメラマウス計 3匹 （キメラ率 100%) より、 1週齢、 2週齢、 4週齢そ れぞれで各群 1匹より脾臓サンプルを摘出し、 その直後に脾臓約 50 mgを液体窒 素で凍結した。 得られた各凍結サンプルに IS0GEN (日本ジーン、 日本国） 1 ml を加え、 ホモジナイザ一を用いてサンプルを破砕後、 添付されたマニュアルに従 い RNAを抽出した。 得られた RNAサンプルに 3 7 ° ( 、 1 5分間、 DNase処理 （日 本国 WAKODeoxyribonuclease RT等級）を行った。更に、 RNasy Mini (ドィッ QIAGEN) を用いて、 精製 RNAサンプルを取得した。
ヒ ト EP0遺伝子転写レベルの比較：
SuperScriptlll (Invitrogen) を用い、 得られた精製 RNAサンプル 250 ngより cDNAを合成した。 その後、 3 7。C、 2 0分間 RNase処理を行い、 RNaseフリーの 滅菌水による 1 0倍希釈液 2.0μ 1をその後の PCRに用いた。
ヒ ト EP0遺伝子発現確認用プライマーとして、 以下のオリゴ DNAを合成した。 hEP0-RT FW5: GGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTC (配列番号 5 5 )
CkpolyAR2: CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 5 6 )
ヒ ト EP0遺伝子発現を確認するための PCRを以下のような条件で実施した。 LA taq (日本国宝酒造） を用い、 9 4°C、 1 0秒インキュベート後 6 8 °C、 1分間ィ ンキュペートの 2段階反応を 3 5サイクル行った。 その結果、 コントロール群で は 1週齢から 4週齢全てで増幅バンドが検出されなかったが、 ヒ ト EP0遺伝子が 導入されたマウス ES 細胞を用いて作製された全てのキメラマウスの脾臓組織で は、 1週齢から増幅バンドが検出された。 NP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウ スと PS hEPOマウス E S細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度は 2週齢、 4週 齢とほぼ等しく、 CkP2h EP0マウス ES細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度は 1379 これらと比較するとやや低いことが確認された （図 1 6 )。
また、各サンプル群で用いられている mRNA量に偏りが生じていないかを確認す る為、 マウス Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 遺伝子発現 確認用プライマーとして、 以下のオリゴ DNAを合成した。
mGAPDH5 : CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (配列番号 5 7 )
mGAPDH3： ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (配列番号 5 8 )
マウス GAPDH遺伝子発現を確認するため PCRを以下のような条件で実施した。 LA taq (日本国宝酒造） を用い、 （9 4 °C、 3 0秒） → ( 6 5 °C、 3 0秒） → ( 7 2 °C、 3 0秒） 3段階のインキュベート反応を 2 5サイクル行った。 その結果、 全てのサンプルでマウス GAPDHの発現がほぼ等しいレベルで検出され、 ヒ ト EP0 遺伝子発現確認用プライマーを用いて検出された各サンプル間のバンドの濃度差 がキメラマウス脾臓組織におけるヒ ト EP0遺伝子発現レベルの差を反映している ことが示された （図 1 6 )。 これらの結果は、 ベクター構造が pCkP2 タイプより も、 pNP や pPS タイプのほうが転写レベルで発現に有利であることを示し、 上記 実施例 5の in vitro実験で得られた結果との相関が認められた。 実施例 3 3
CkP2 hEPOマウス E S細胞由来キメラマウス、 NP hEPOマウス ES細胞由来キメラ マウス、 PS hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 Ck Δ Ρ hEPOマウス TT2F細胞 由来キメラマウス、 CkP2 loxP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 PS loxP hEPO マウス ES細胞由来キメラマウスにおける血清中ヒ ト EP0濃度の比較
コントロールとして上記実施例 1 1で作製された RSエレメント 'ターゲティン グ ·マウス ES細胞株 #32由来のキメラマウス計 10匹 （キメラ率 80〜20%)、 上記 実施例 1 6で作製された CkP2 hEPOマウス E S細胞株 #69由来のキメラマウス計
6匹 （キメラ率 80〜20%)、 上記実施例 2 0で作製された NP hEPOマウス ES細胞 株 #10由来のキメラマウス計 4匹（キメラ率 100%)、上記実施例 2 4で作製された
PS hEPOマウス ES細胞株 #6由来のキメラマウス計 10匹 （キメラ率 80〜20%)、 上記実施例 2 7で作製された CkP2 Δ P hEPOマウス TT2F細胞由来キメラマウス計
9匹 （キメラ率 60〜 10%)、 上記実施例 2 9で作製された CkP2 loxP hEPOマウス E S細胞株 #18由来キメラマウス計 2 0匹（キメラ率 90〜10%)、上記実施 3 1で作 製された PS loxP hEPOマウス E S細胞株 #48由来キメラマウス計 1 3匹 （キメラ 率 90〜10%) より 8週齢の時点で眼窩採血し得られた血清中のヒ ト EP0 濃度を
ELISAキッ ト (Quantikine IVD In Vitro Diagnostic human Erythropoietin. R&D system) を用いて測定した。 その結果、 コントロールとして上記実施例 1 1で作 製された RSエレメント · ターゲティング .マウス ES細胞株 #32由来のキメラマ ウス計 10匹（キメラ率 80〜20%)由来の血清中ヒ ト EP0濃度は全て検出限界（12. 5 pg/ml) 以下であつたが、 上記実施例 1 6で作製された CkP2 hEP0マウス E S細胞 株 #69由来のキメラマウス計 6匹 （キメラ率 80〜20%) 由来の血清中ヒ ト EP0濃 度の平均値は 5. 3 ng/ml、 上記実施例 2 0で作製された NP hEPOマウス ES細胞株
#10由来のキメラマウス計 4匹 （キメラ率 100%) 由来の血清中ヒ ト EP0濃度の平 均値は 14. 7 ng/ml、 上記実施例 2 4で作製された PS hEPO マウス E S細胞株 #6 由来のキメラマウス計 10匹 （キメラ率 80〜20%) 由来の血清中ヒ ト EP0濃度の 平均値は 47. 9 ng/ml、 上記実施例 2 7で作製された CkP2 Δ Ρ hEPOマウス TT2F 細胞由来キメラマウス計 9匹 （キメラ率 60〜10°/。） 由来の血清中ヒ ト EP0濃度の 平均値は 63. 4 ng/ml、 上記実施例 2 9で作製された C κ P2 loxP hEPOマウス E S 細胞株 #18由来キメラマウス計 2 0匹（キメラ率 90〜10%)由来の血清中ヒ ト EP0 濃度の平均値は 211 ng/ml , 上記実施 3 1で作製された PS loxP hEPOマウス E S 細胞株 #4—8由来キメラマウス計 1 3匹（キメラ率 90〜10%)由来の血清中ヒ EPO 濃度の平均値は 1103 ng/mlであった。 更に、 図 1 7及び Tablellに、 上記実施例 で作製されたキメラマウスの血清を用い、 1、 2、 4、 6、 8週齢で測定したヒ ト EP0濃度値を示す。 これらの結果から、 CkP2 hEPOマウス E S細胞由来キメラ マウス、 NP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 PS hEPOマウス ES細胞由来キ メラマウス、 CkP2 Δ Ρ hEPOマウス TT2F細胞由来キメラマウス、 CkP2 loxP hEPO マウス ES細胞由来キメラマウス、 PS loxP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス の順に血清中ヒ ト EP0濃度の増加が認められた。
これらの結果はベクター構造が pC /c P2 タイプ、 pNPタイプ、 pPS タイプの順番 にキメラマウス血中のヒ ト EP0 量が増加することを示し、 上記実施例 6の in vitro で得られた結果との相関が認められた。 実施例 6の結果との相関が認めら れたことから、 ミエローマ細胞を用いた in vitro アツセィ系によって、 本発現 システムを用いて作製されるキメラマウス血清中の導入遺伝子発現量が推測され うることが示された。 また、 CkP2 hEPOマウス ES (TT2F) 細胞より薬剤耐性遺伝 子を除去 （CkP2 loxP hEPOタイプ、 CkP2 A P hEPOタイプ） することによつても、 血清中 t ト EP0濃度が増加することが示された。更に PS hEPOマウス ES細胞より 薬剤耐性遺伝子を除去した ES細胞を用いキメラマウスを作製した場合、その血清 中濃度はそれぞれ単独の操作で得られた増加量に比べ相乗的に増加し、 極めて興 味深い結果が得られた。 すなわち、 用いる Ig fcプロモーター領域の変更と導入遺 伝子固有のリーダー配列コード領域からィントロン領域を含む Ig k由来のリ一 ダー配列コード領域への変更ないし導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝子 の除去操作はそれぞれ単独であってもキメラマウスにおける導入遺伝子発現量の 向上に有用であることを示しているが、更に用いる Ig /cプロモーター領域の変更 と導入遺伝子固有のリーダー配列コード領域からイント口ン領域を含む Ig / 由 来のリーダー配列コード領域への変更及び導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性 遺伝子の除去操作を全て行うことによって、 キメラマウスにおける導入遺伝子発 現量がそれぞれ単独の操作によって向上した発現量に比べ相乗的に向上すること を示し、 本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能 解析に極めて有用であることを示している。 実施例 3 4
CkP2 hEPOマウス E S細胞由来キメラマウス、 NP hEPOマウス ES細胞由来キメラ マウス、 PS hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 CkP2 Δ Ρ hEPOマウス TT2F 細胞由来キメラマウス、 CkP2 1oxP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 PS loxP hEPOマウス ES細胞由来キメラマウスにおける末梢血血球解析
コントローノレとして上記実施例 1 1で作製された RSエレメント 'ターゲティン グ■マウス ES細胞株 #32由来のキメラマウス計 10匹 （キメラ率 80〜20%)、 上記 実施例 1 6で作製された CkP2 hEPOマウス E S細胞株 #69由来のキメラマウス計
6匹 （キメラ率 80〜20%)、 上記実施例 2 0で作製された NP hEPOマウス ES細胞 株 #10由来のキメラマウス計 4匹（キメラ率 100%)、上記実施例 2 4で作製された PS hEPOマウス ES細胞株 #6由来のキメラマウス計 10匹 （キメラ率 80〜20%)、 上記実施例 2 7で作製された CkP2 Δ P hEPOマウス TT2F細胞由来キメラマウス計 9匹 （キメラ率 60〜10°/。）、 上記実施例 2 9で作製された CkP2 loxP hEPOマウス E S細胞株 #18由来キメラマウス計 2 0匹（キメラ率 90〜10%)、上記実施 3 1で作 製されだ PS loxP hEPOマウス ES細胞株 #48由来キメラマウス計 1 3匹 （キメラ 率 90〜10%)より 8週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（日本国 Bayer Medical (株） 製、 ADVIA 120 HEMATOLOGY SYSTEM) を用いて末梢血血球解析を実施した。 コントロールマウス群にく らべ、 ヒ ト EP0遺伝子が導入されたキメラマウスは上 記全ての群において平均 1. 64倍以上の赤血球数増加が認められた。しかしながら, 各群間の赤血球数には有意な差は認められなかった。 また、 コントロール群のへ マトクリツト値は平均 58%であったが、 ヒ ト EP0遺伝子が導入されたキメラマウ スは上記全ての群において平均 90%以上の値を示し、 ヒ ト EP0遺伝子導入により 有意なへマトクリツ ト値の増加が認められた。 しかしながら赤血球数と同様各群 間に有意な差は認められなかった。 上記実施例 3 3の各群間で血清中ヒ ト EP0濃 度の有意な差が認められるにも係わらず、 血球解析において有意な差が認められ ない理由として、 最も発現量の少ない C k P2 hEPOマウス ES細胞より作製された キメラマウスのヒ ト EP0発現量においても既に増加の上限値に達していることが 原因と考えられる。 従って、 本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の 生体内における機能解析に有用であることを示している。 実施例 3 5
pCk loxPV KIベクターの構築
LoxP配列の一部に変異が導入 （34bpで構成される loxP配列の 5 ' 側から 1 5 番目の Tが Aに、 2 0番目の G力 Cに置換。 Lee ら、 Gene, 216： 55 - 65， 1998) された loxPVを薬剤耐性遺伝子 （Pure/) の両端に持つ pCkP2 KIベクターである pCk loxPV KIベクター (図 1 8 ) の構築を行った。
3 5 - 1 . PGK-Puro断片の調製
Lox-P Puroプラスミ ド （W0 00/10383号パンフレツ ト） を制限酵素 BamHI消化 し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動によって分離した。 1. 7kb の断片を含むゲルよ り QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって PGK'Puro断片を回収した。
3 5 - 2 . Ck polyA partial断片の調製
上記実施例 1 2の PCkP2 KIベクターを元に、 以下の DNA (プライマー) を設計 した。 '
Ck pA Nhel F : CCTAGCTAGCAGACAAAGGTCCTGAGACGCCAC (配列番号 5 7 )
Ck pA Pad R : CCTTAATTAATGGATTTCAGGGCAACTAAAC (配列番号 5 8 )
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがつて反応液を調製した。 50 μ ΐ反応液中に上記 2種のプライマー各 7. 5pmol、铸型として TT2Fマウス ESゲノ ムを添加し、 94°C2分保温した後、 94°C 15秒/ 58°C30秒 /68°C30秒を 1サイクルと して 32サイクル増幅した。 得られた約 300bpの増幅断片を 2%ゲルで分離回収し た。 回収したゲノレから QIAquick Gel Extraction Kitを用レ、、 添付文書にしたが つて増幅断片を回収した。 回収された PCR増幅断片を制限酵素 Nhel/Paclで消化 し、 2%ァガロースゲルでサイズ分画した。 QIAquick Gel Extraction Kitを用い 添付文書にしたがって、 ゲルから酵素処理断片を回収した。 この断片を上記実施 例 1の pBS+ PFN の Nhel/Paclサイ トにサブクローニングし、 大腸菌 Competent high DH5 (日本国東洋紡） に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 シ ークエンスを確認した。 CkP2 KIベクターの完全長 Ckポリ Aと比較して、 増幅ェ ラーの見ちれなかった p (部分長 Ckポリ A)を Pacl/Nhel消化した。 2° /。ゲルで 303bp の断片を分離、 QIAquick Gel Extraction Kit を用い添付文書にしたがって部分 長 Ckポリ A断片を回収した。
3 5 - 3 . PCkP2 KI ベクターに一本鎖化サイ ト Ascl を加えたベクター ' · · pCkP2+As KI
以下の合成オリゴをァニールさせて、 Asclリンカ一を合成した。
Ascl top l inker： GGCCAGGCGCGCCTTGC (配列番号 4 7 )
Ascl bottom l inker： GGCCGCAAGGCGCGCCT (配列番号 4 8 )
pCkP2 KIベクターを制限酵素 Notl (Roche)で消化し、 0. 8%ァガロースゲルよ り分離精製した後に l igation kit ver. 2 (日本国タカラバイオ） を使用したライ ゲーション反応により Ascl リ ンカ一を導入した。 それを大腸菌 XL10- Gold Ultracompetent Cell s (米国 STRATAGENE)に導入して得られた形質転換体より DNA を調製し、 揷入断片の塩基配列を確認した。
3 5 - 4 . Ck 3 ' ゲノム断片の調製
上記 3 5— 3の pCkP2+As KIを制限酵素 Hpy99Iで消化し、 0. 8%ァガロースゲル で 8820bpの断片を分離した。 この目的断片を含むゲルを切り出し、 QIAquick Gel Extraction Kit を用い添付文書にしたがって DNA を回収した。 回収した DNAは Blunting high (日本国東洋紡） を用いて、 添付文書にしたがって末端の平滑化を 行った。 フ ノール抽出によって DNA精製後、 制限酵素 Xhol で消化した。 0. 8% ァガロースゲルで 8280bpの断片を分離し、この目的断片を含むゲルを切り出して、 QIAquick Gel Extraction Kitを用い添付文書にしたがって Ck 3 ' ゲノム断片を 回収した。
3 5 - 5 . loxPV Nhel/Xhol断片の調製
上記実施例 1の pBS+PFNを制限酵素 Sailで消化し、仔牛小腸由来アル力リフォ スファターゼを用いて末端の脱リン酸化を行った後に、 以下のオリゴ DNAより合 成した loxP- Bgl ll Pmel-Hpal リンカーを挿入した。
変異型 loxP F ：
TCGATAACTTCGT
GTTATGTTTAAACGTTAACG (配列番号 5 9 )
変異型 lbxP R :
TCGACGTTAACGTT GGATACTTTATACGAAGTTA (配列番号 6 0 )
大腸菌 Competent high DH5 aに導入し、 得られた形質転換体より DNAを調製し た。 連結部分の塩基配列を確認し、 リンカ一が目的の方向に挿入されていた PBS2272を取得した。
PBS2272を制限酵素 Bgl ll消化し、 仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを 用いて末端脱リン酸化した後、上記 3 5— 1で調製した PGK- Puro断片を連結した c 大腸菌 Competent high DH5ひに導入し、得られた形質転換体より DNAを調製した。 連結部分の塩基配列を確認し、 PGK-Puro断片が目的の方向にクローニングされて いたプラスミ ド ploxPV- puroを得た。 このプラスミ ドを制限酵素 Nhel/Paclで消化し、 末端を仔牛小腸由来アルカリ フォスファターゼを用いて脱リン酸化した。 ここに上記 3 5一 2で調製した部分 長 Ckポリ A断片を挿入した。 XL10- Gold Ultracompetent Cel ls (米国 STRATAGENE) に形質転換し、 得られたクローンよりプラスミ ド DNAを調製して塩基配列の確認 を行つ 。 つなぎ目及び内部の配列を確認し、 エラーの無いプラス ミ ド ploxPV- Puro-ポリ Aを取得した。
続いて制限酵素 Hpal/Xholで消化し、 末端を仔牛小腸由来アル力リフォスファ ターゼを用いて脱リン酸化した後に上記 3 5— 4で調製した Ck 3 ' ゲノム断片を 導入した。 XL10 - Gold Ultracompetent Cellsに形質転換し、 得られたクローンよ りプラスミ ド DNAを調製して塩基配列の確認を行った。 つなぎ目の塩基配列を確 認して、 予定通りの連結をしていたプラスミ ド ploxPV Nhel/XhoIを得た。 このプ ラスミ ドを制限酵素 Nhel/Xhol消化し、約 10. 5kbの loxPV Nhel/Xhol断片を回収 した。
3 5 - 6 . pCk loxPV KIベクターの構築
上記 3 5— 3の pCkP2+As KIを Nhel/Xhol消化し、 9968bpの断片を 0. 8%ァガロ ースゲル分画によって回収した。 末端を仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼ を用いて脱リン酸化し、 上記 3 5一 5で調製した loxPV Nhel/Xhol断片と連結し た。 連結部分の塩基配列を確認し、 pCk loxPV KIベクター （図 1 8 ) を得た。 実施例 3 6
エレク トロポレーション用 pCk loxPV KIベクターの調製
pCk loxPV KIベクター 60 gを、 スペルミジン添加 （ 1 mM pH7. 0米国シグマ） バッファー (日本国ロシュ ·ダイァグノスティックス、 制限酵素用 Hバッファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム抽出後、
2. 5容量の 100%エタノール、および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリ ゥムを加え、- 20°C で 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェ タノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間 風乾させた。 0. 5 μ g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で 保存し、 エレク トロポレーシヨン用 pCk loxPV KIベクターの調製を行なった。 実施例 3 7
pCk loxPV KIベクターと RSエレメント · ターゲティング 'マウス E S細胞株を 用いた Ck loxPVマウス E S細胞株の取得
変異 'ΙοχΡ配列を両端に持つ薬剤耐性遺伝子 （loxPV Puror) が相同組換えによ り免疫グロブリン/ c軽鎖遺伝子下流に挿入された Ck loxPVマウス E S細胞株取得 のため、 実施例 3 5で作製した pCk loxPV KIベクターを制限酵素 Notl (日本国 宝酒造） で線状化し、 確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリー ズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国) に従って RSエレメント · ターゲティング ·マウス E S細胞へ導入した。
RSエレメント . ターゲテイング.マウス E S細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、前記） に従い、栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ）処理した G418 耐性初代培養細胞 （日本国インビトロジ ン社より購入） を用いた。 まず、 増殖 させた RSエレメント · ターグティング ·マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3
X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 μ §のべ クタ一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオ ラッド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 /i F、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地 （相沢慎一、 前記） に 懸濁し、 あらかじめフィーダー細胞を播種した 100讓組織培養用プラスチックシ ヤーレ （ファルコン、 米国べク トン. ディ ッキンソン） 1枚に播種した。 36時間 後に 0. 8 i g/mlのピュー口マイシン（米国シグマ）を含む E S培地と置き換えた。
7日後に生じたコロニーのうち計 2 4個をピックアップし、それぞれを 24穴プレ 一トでコンフルーェントになるまで増殖させ、その 2/3を 0. 2mlの保存用培地（FBS
+ 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼ ラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 こ れらのピュー口マイシン耐性 RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞ゲ ノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動 で分離した。 続いてサザンブロッ トを行い、 W0 00/10383 号パンフレツ ト （実施 例 48参照）に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J κ - C /cゲノム DNAの 3，端の DNA 断片 （XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレッ ト、 特に図 25) をプロ ーブとして相同組換え体を検出した。 その結果、 24株中 6株 （25 %) が相同糸且換 え体であるという結果を得た。 野生型 RSエレメント ·ターグティング 'マウス E S細胞セは EcoRI消化により、 1本のバンドが検出された。 相同組換え体におい ては、 このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される （図 1 9 ) 力 ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。 す なわち、 これらのクローンは一方のァレルの免疫グロブリン κ鎖遗伝子下流に薬 剤耐性遺伝子 （loxPV Puror) が揷入されたものである。 実施例 3 8
Ck loxPVマウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した Δ GPマウス ES細胞株の 取得
Ck l oxPVマウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （NecT, Pure/) を除去し た A GPマウス ES細胞株取得のため、 pCAGGS- Creベクター（Sunagaら、 Mol Reprod Dev. , 46 : 109 - 1 13， 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマニュアル シリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国) に従って Ck l oxPV マウス ES細胞株 16) へ導入した。
Ck loxPVマウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日 本国インビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた Ck loxPVマウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個 Zml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 gのベクター DNAと混和し、ジーンパルサーキュべッ ト (電極距離： 0. 4cm、米国バイオラッド）にてエレク トロポレーションを行った（容 量： 960 μ Ρ、 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E
S培地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ 一細胞を播種した 60mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじ めフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （フアルコ ン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロニー のうち計 2 4個をピックアツプし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェント になるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、米国シグ マ） に懸濁し、 - 80。Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレート に播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらマウス E S細 胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気 泳動で分離した。 続いてサザンブロットを行い、 W0 00/10383号パンフレツト （実 施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J K -C Kゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片 （Xho]：〜 EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレッ ト、 特に図 2δ) を プローブとして LoxP配列で挟まれた Puro1"遺伝子のみが除去された ES細胞株を 検出した。 Pur (/遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド (15. 6 K と 12. 5 K) が検出され、 Pure/遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド（15. 6 Kと 9. 6 K)が検出される（図 1 9 )。また、 上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、 実施例 1 0で用いられた 3 ' ΚΟ-probをプローブとして LoxP配列で挟まれた Neo3"遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Nee 遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2 本のバンド （7· 4 Kと 5. 7 K) が検出され、 Neor遺伝子のみが除去された ES細胞 株では EcoRI消化により、 2本のバンド（5· 7 Kと 4. 4 K)が検出される（図 1 9 )。 その結果、 24株中 23株 （96%) という極めて高い効率で Ck loxPVマウス ES細 胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Ne0r, Puror) が同時に除去された ES細胞株 （Δ GPマウス ES細胞株） が取得された （図 1 9 )。 上記実施例 2 8、 3 0においても 2種の薬剤耐性遺伝子を Cre酵素によって同時に除去する操作を実施したが、 2 種の薬剤耐性遺伝子のみが同時に除去された細胞株が取得された効率はそれぞれ
2. 2% 1%と極めて低くかった。 これらの結果から、 同じ ΙοχΡ配列を両端に持つ 2 種の薬剤耐性遺伝子のみをゲノム上から同時かつ特異的に除去することは困難で あるが、 変異配列を持つ loxP (loxPV) を用いることで、 2種の薬剤耐性遺伝子 のみを同時かつ特異的に除去することが極めて容易に達成されることが示された, 実施例 3 9
pCk loxPV hEPO KIベクターの構築
3 9 - 1 . CkP2 ver. 3. 1ベクターの構築
上記実施例 3 5で構築された PCk loxPV KIの Pacl認識サイ トをなくすため、 Pacl消 ¾を行い、 Blunting highを用いて平滑化反応を行った。 次いで自己環状 化を行ってシークェンスにより Pacl 認識サイ トがなくなった事を確認し、 CkP2 ver. 3. 1ベクターを得た。
3 9 - 2 . ヒ ト erythropoietin DNA断片の作製
hEPO Np： CCGCTCGAGCGGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG (配列番号 4 5 )
hEPO Rp： CCGCTCGAGCGGTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA (配列番号 4 6 )
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ ΐ 反応液中に上記 2種のプライマー各 lOpmol、铸型としてヒ ト EPO cDNAを添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15秒および 68。C1分を 1サイクルとして 30サイクル 増幅し、得られたシグナル配列を含む 580bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収し た。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い 添付文書にしたがつて増幅断片を回収した。回収された PCR増幅断片を Xholで酵 素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって 酵素処理'断片を回収した。
pBluescriptll SK (-) (米国 STRATAGENE) を Xhol消化し、 0. 8%ァガロースゲ ルより分離精製した後に仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱 リン酸化したものに、 上記回収された DNA断片を挿入し、 それを大腸菌 DH5 aに 導入した。 得られた形質転換体より DNAを調整し、 挿入断片のシーケンスを行つ た。 PCRによる変異の無いクローンを選択し Xhol消化した後、 0. 8%ァガロース ゲルで分離回収した。 回収さ;^たゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィ ッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。
3 9 - 3 . pCkloxPV hEPO KIベクターの構築
上記 3 9— 1の CkP2 ver. 3. 1ベクターを Sailで消化後、 仔牛小腸由来アル力 リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 3 9 - 2で作製した DNA断片を挿入した後、大腸菌 XL10_Gold Ultracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認 して、 pCk loxPV hEPO KIベクター （図 2 0 ) を取得した。
実施例 4 0
Electroporation用 pCk loxPV hEPO KIベクターの調製
pCk loxPV hEPO KIベクター 60 gを、 スペルミジン添加 （ 1 mM pH7. 0米国シ ダマ） バッファー (日本国ロシュ ·ダイァグノスティ ックス、 制限酵素用 Hバッ ファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム 抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、 および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリゥムを加 え、 - 20°Cで 16時間保存した。 No 11で一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%エタノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間風乾させた。 0. 5 μ g/ μ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間 室温で保存し、 Electroporation用 pCk loxPV hEPO KIベクターの調製を行なつ た。 実施例 4 1
pCk loxPV hEPO KIベクターと RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞 株を用いた CL hEPOマウス ES細胞株の取得
ヒ ト EP0 - cDNA が相同組換えにより免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子下流に挿入さ れた CL hEPOマウス ES細胞株取得のため、 実施例 3 9で作製した pCk loxPV hEPO KIベクターを制限酵素 NotI (日本国宝酒造）で線状化し、確立されている方法（相 沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターグティング、 1995、 羊土社、 曰本国) に従って RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞へ導入した。
RSエレメント · ターゲティング 'マウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、前記） に従い、栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ）処理した G418 耐性初代培養細胞 （日本国インビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖 させた RSエレメント · ターグティング 'マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3
X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を lO gのべ クタ一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオ ラッド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 i F、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク トロポレーションした細胞を 10mlの ES培地 （相沢慎一、 前記） に懸 濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100讓組織培養用プラスチックシャ ーレ （ファルコン、 米国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間後 に O. S ^ g/mlのピューロマイシン （米国シグマ） を含む ES培地と置き換えた。 7 日後に生じたコ口ニーをピックアツプし、それぞれを 24穴プレートでコンフルー ェントになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 米 国シグマ) に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプ レートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらのピューロマ ィシン耐性 RSエレメント ·ターゲテイング ·マウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵 素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続い てサザンプロットを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に記載 の発明で使用された、 Ig軽鎖 J κ - C κゲノム DNAの 3 '端の DNA断片（Xhol：〜 EcoRI、 約 1. 4kb、 WO 00/10383号パンフレツ ト、 特に図 25) をプローブとして相同組換 え体を検出した。野生型 RSエレメント 'ターゲティング'マウス ES細胞では EcoRI 消化により、 1本のバンドが検出された。 相同組換え体においては、 このバンド に加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される (図 2 1 ) が、 ピュー ロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。 すなわち、 これらの クローンは一方のアレルの免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNA が挿 入されたものである。 実卿 4 2
CL hEPOマウス ES細胞株おょぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキ メラマウスの作製
免疫グロブリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な Β リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426,
1991 )。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97： 722-7, 2000) に 記載された免疫グロブリン/ 鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 4 1で得られ、免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EPO-cDNAが揷 入されていることが確認された CL hEPOマウス E S細胞株を凍結ストツクより立 ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌 雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注 入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティ ング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠 処理後 2. 5日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側の 子宫あたりそれぞれ約 10個のィンジェクション胚を移植した。 実施例 4 1の CL hEPOマウス ES細胞株を用いて作製されたインジヱクション胚を移植した結果、 子キメラマウスが誕生する。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白色の 中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。誕 生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち ES 細胞の貢献の認められる個体が得られる。 これらの結果より、 免疫グロブリン κ 鎖遺伝子下流にヒト ΕΡΟ-cDNAが挿入されている CL hEPOマウス E S細胞株はキメ ラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持 していることが示される。 実施例 4 3
pNP loxPV hEPO KIベクターの構築
4 3 - 1 . pCk loxPV A Pの構築 （mutant ΙοχΡ 大ベクター）
上記実施例 3 9— 1で作製された CkP2 ver. 3. 1ベクターを制限酵素 Hpal/Nhel で消化し、 約 19. 5kb の断片を 0. 8%ァガロースゲル分画によって回収した。 末端 は仔牛小腸由来アル力リフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。 このべクタ 一に上記実施例 1 7の 5の pCkpAMCSを制限酵素 Hpal、 Nhel (Roche) で消化し、 0. 8%ァガロースゲルより回収した Ck- polyA- MCSを含む約 700bpの断片を導入し た。 連結部分及び内部の塩基配列を確認し、 pCk ΙοχΡν Δ Ρを得た。
4 3 - 2 . pNP loxPV hEPO KIベクターの構築
上記実施例 2で作製された pNPs hEPO in vitro用ベクターを Sail及び Fsel で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより約 1. 2kbの断片を分離精製した後、上記 4 3 — 1の pCk loxPV A Pを Sailおよび Fselで酵素消化後、大腸菌 C75由来アル 力リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに揷入。 それを大腸菌 XLIO-Gold Ultracorapetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質 転換体より DNA を調製し、 連結部分の塩基配列を確認して、 pNP loxPV hEPO KI ベクター （図 2 2 ) を取得した。 実施例 4 4
Electroporation用 pNP loxPV hEPO KIベクターの調製
pNP loxPV hEPO KIベクター 60 μ g を、 スペルミジン添加 ( 1 mM pH7. 0米国シ ダマ） バッファー (日本国ロシュ ·ダイァグノスティ ックス、 制限酵素用 Hバッ ファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロロホルム 抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、 および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリゥムを加 え、 - 20°C 16時間保存した。 No 1で一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%エタノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間風乾させた。 0. 5 g/ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間 室温で保存し、 Electroporation用 pNP loxPV hEPO KIベクターの調製を行なつ た。 実施例 4 5
pNP loxPV hEPO KIベクターと RSエレメント ·ターゲティング 'マウス E S細胞 株を用いた NL hEPOマウス ES細胞株の取得
ヒ ト EP0- cDNA が相同組換えにより免疫グロブリンに軽鎖遺伝子下流に挿入さ れた NL hEPOマウス E S細胞株取得のため、実施例 4 3で作製した pNP loxPV hEPO KIベクターを制限酵素 Notl (日本国宝酒造）で線状ィヒし、確立されている方法（相 沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従って RSエレメント · ターグティング 'マウス ES細胞へ導入した。
RSエレメント . ターゲティング . マウス E S細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一；前記） に従い、栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ）処理した G418 耐性初代培養細胞 （日本国インビトロジ ン社より購入） を用いた。 まず、 増殖 させた RSエレメント .ターゲティング 'マウス E S細胞をトリプシン処理し、 3
X 107個 Zml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁液を 10 μ gのべ クタ一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュベット （電極距離： 0. 4cm、 米国バイオ ラッド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 μ Ρ、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地 （相沢慎一、 前記） に 懸濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシ ヤーレ （ファルコン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間 後に 0. 8 i g/mlのピューロマイシン （米国シグマ） を含む ES培地と置き換えた。
7曰後に生じたコ口ニーをピックァップし、それぞれを 24穴プレートでコンフル 一ェントになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコート プレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene
DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらのピュー 口マイシン耐性 RSエレメント · ターゲテイング ·マウス ES細胞ゲノム DNAを制 限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサザンプロッ トを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト (実施例 48参照) に 記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J K - C Kゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片 （Xhol
〜EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレッ ト、 特に図 25) をプローブとして 相同組換え体を検出した。 野生型 RSエレメント · ターゲテイング ·マウス ES細 胞では EcoRI消化により、 1本のバンドが検出された。相同組換え体においては、 このバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される (図 2 3 ) が、ピュー口マイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。すなわち、 これらのクローンは一方のァレルの免疫グロブリ ン K鎖遺伝子下流にヒ ト EPO-cDNAが揷入されたものである。 実施例 4 6
NL hEPO マウス E S細胞株おょぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた キメラマウスの作製
免疫グロプリン 鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な B リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7， 2000) に 記載された免疫グロブリン; u鎖遺伝子ノックアウトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。 +
上記実施例 4 5で得られ、免疫グロブリン K鎖遺伝子下流にヒ ト EPO-cDNAが挿 入されていることが確認された NL hEPOマウス E S細胞株を凍結ストツクより立 ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌 雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注 入した。 —E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティ ング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠 処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側の 子宮あたりそれぞれ約 10個のインジェクション胚を移植した。 実施例 4 5の NL hEPO マウス E S細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、 子キメラマウスが誕生する。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白色の 中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。 誕 生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち E S 細胞の貢献の認められる個体が得られる。 これらの結果より、 免疫グロブリン κ 鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが揷入されている NL hEPOマウス ES細胞株はキメ ラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持 していることが示される。 実施例 4 7
pUS hEPO KIベクターの構築
上記実施例 1の pPSs hEPO in vitro用ベクターを Sail及び Fselで酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより約 1. 3kbの断片を分離精製した後、上記実施例 4 3で作 製された pCk loxPV A Pを Sailおよび Fselで酵素消化後、大腸菌 C75由来アル力 リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに挿入。 それを大腸菌 XLIO-Gold Ultracompetent Cells (米国 STRATAGENE) に導入した。 得られた形質 転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列を確認して、 pUS hEPO KIベクタ 一 （図 2 4 ) を取得した。 ■ 実施例 4 8
Electroporation用 pUS hEPO KIべクターの調製
pUS hEPO KIベクター 60 μ 8 を、 スペルミジン添加 （ 1 mM pH7. 0米国シグマ） バッファー （日本国ロシュ .ダイァグノスティックス、 制限酵素用 Hバッファー） を用い、 Notlを用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5容量の 100%エタノール、および 0. 1容量の 3 M酢酸ナトリゥムを加え、- 20°C で. 16時間保存した。 Notlで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、 70%ェ タノールを加えて滅菌した。 クリーンベンチ内で 70%エタノールを除き、 1時間 風乾させた。 0. 5 g/ μ Lの DNA溶液となるように HBS溶液を加え、 1時間室温で 保存し、 エレク トロンポレーシヨン用 pUS hEPO KIベクターの調製を行なった。 実施例 4 9
pUS hEPO KIベクターと RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞株を用 いた PL hEPOマウス ES細胞株の取得
ヒ ト EP0 - cDNA が相同組換えにより免疫グロブリン κ軽鎖遺伝子下流に揷入さ れた PL hEPOマウス E S細胞株取得のため、 実施例 4 7で作製した pUS hEPO KI ベクターを制限酵素 Notl (日本国宝酒造） で線状化し、 確立されている方法 （相 沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従って RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞へ導入した。
RSエレメント 'ターゲティング 'マウス E S細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、前記） に従い、栄養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ）処理した G418 耐性初代培養細胞 （日本国インビトロジヱン社より購入） を用いた。 まず、 増殖 させた RSエレメント · ターゲティング ·マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を のべ クタ一 DNAと混和し、 ジーンパルサーキュべット （電極距離： 0, 4cm、 米国バイオ ラッ ド） にてエレク ト口ポレーシヨンを行った （容量： 960 F、 電圧： 250V、 室 温）。 エレク トロポレーシヨンした細胞を 10mlの ES培地 （相沢慎一、前記） に懸 濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャ ーレ （ファルコン、 米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 36時間後 に 0. 8 // g/mlのピューロマイシン （米国シグマ） を含む E S培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーをピックアツプし、それぞれを 24穴プレートでコンフル 一ェントになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコート プレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらのピュー 口マイシン耐性 RSエレメント · ターゲテイング ·マウス ES細胞ゲノム DNAを制 限酵素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離し.た。 続いてサザンプロッ トを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に 記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J /C - C Kゲノム DNAの 3 ' 端の DNA断片 （Xhol 〜EcoRI、 約 1. 4kb、 TO 00/10383号パンフレッ ト 図 25) をプローブとして相同 組換え体を検出した。 野生型 RSエレメント ' ターグティング 'マウス ES細胞で は EcoRI消化により'、 1本のバンドが検出された。 相同組換え体においては、 こ のバンドに加えてその下部に新たなバンドが出ることが予想される（図 2 5 )が、 ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認される。 すなわち、 こ れらのクローンは一方のァレルの免疫グロブリ ン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されたものである。 実施例 5 0
PL hEPO マウス E S細胞株おょぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いた キメラマウスの作製
免疫グロブリン μ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においてば、 機能的な Β リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991 )。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した E S細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7, 2000) に 記載された免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 4 9で得られ、免疫グロブリン Κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが揷 入されていることが確認された PL hEPOマウス ES細胞株を凍結ストツクより立ち 上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄 マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入 した。 E S培地 (相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティン グ.、 1999 羊土社、 日本国） でー晚培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠処 理後 2. 5 日の仮親 11 (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側の子 宫あたりそれぞれ約 10 個のインジェクション胚を移植した。 実施例 4 9の PL hEPOマウス ES細胞株を用いて作製されたインジヱクション胚を移植した結果、 子キメラマウスが誕生する。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白色の 中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。 誕 生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち ES 細胞の貢献の認められる個体が得られる。 これらの結果より、 免疫グロブリン/ 鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNAが挿入されている PL hEPOマウス ES細胞株はキメ ラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持 していることが示される。 実施例 5 1
CL hEPOマウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した Ck loxPV hEPOマウス ES 細胞株の取得
CL hEPOマウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （NeoV Puror) を除去した Ck loxPV hEPO遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS-Creベクター（Sunagaら、 Mol Reprod Dev. , 46 : 109 - 113, 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオ マニュアルシリーズ 8、 ジーンターグティング、 1995、 羊土社、 日本国) に従つ て hEPOマウス ES細胞へ導入する。
CL hEPOマウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄 養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本 国インビトロジヱン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた CL hEPOマウス ES 細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個 Zmlとなるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁液を のベクター DNA と混和し、 ジーンパルサーキュべット （電 極距離： 0. 4cm、米国バイオラッ ド） にてエレク トロポレーションを行った（容量：' 960 ,u FN 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10ml の ES培地
(相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細胞 を播種した 60mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 米国べク トン. デ.ィッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじめフィ 一ダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 米 国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロニーをピッ クアップし、 それぞれを 24穴プレ一トでコンフルーェン 1、になるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS+ 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°C にて保存した。残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養 して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国
Gentra System社） により調製した。 これらマウス ES細胞ゲノム DNAを制限酵素
EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサ ザンプロッ トを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に記載の発 明で使用された、 Ig軽鎖 J K - C Kゲノム DNAの 3， 端の DNA断片 （XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 WO 00/10383号パンフレッ ト、 特に図 25) をプローブとして LoxP配列 で挟まれた Puror遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Purc^遺伝子を 保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 Kと 13. 1 K) が検 出され、 Pur (/遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本の バンド '（15. 6 Kと 10. 2 K) が検出される（図 2 1 )。 また、 上記と同様の操作で得 られたサザンブロット膜を用い、実施例 1 0で用いられた 3 ' K0 - probをプローブ として LoxP配列で挟まれた Ne (/遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Neo17遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド（7. 4 Kと 5. 7 K) が検出され、 Nec 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のバンド（5. 7 Kと 4. 4 K)が検出される（図 2 1 )。これらの結果から、 CL hEPO マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Nec , Pure ) が同時に除去された ES細胞株 （Ck loxPV hEPOマウス ES細胞株） が得られた。 実施例 5 2
Ck loxPV hEPO マウス E S細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を 用いたキメラマウスの作製
免疫グロプリン 鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な B リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426， 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した E S細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7， 2000) に 記載された免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 5 1で得られ、免疫グロプリン / c鎖遺伝子下流にヒ ト ΕΡΟ-cDNAが挿 入されていることが確認された Ck loxPV hEPOマウス ES細胞株を凍結ストツクょ り立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体 の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあたり 8〜10 個注入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲ ティング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晚培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽 妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片 側の子宫あたりそれぞれ約 10個のインジェクション胚を移植した。実施例 5 1の Ck loxPV hEPOマウス ES細胞株を用いて作製されたィンジヱクション胚を移植し た結果、 子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来 の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶） が認められるかどうかによつて判定さ れた。 誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すな わち E S細胞の貢献の認められる個体が得られた。 これらの結果より、 免疫グロ プリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0- cDNAが挿入されている Ck loxPV hEPOマウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している すなわちマウス個体の正常組織に分化 する能力を保持していることが示された。 実施例 5 3
NL hEPOマウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した NP loxPV hEPOマウス ES 細胞株の取得
NL hEPOマウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Nee , Puror) を除去した NP loxPV hEPO遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS - Creベクター（Sunagaら、 Mol eprod Dev. , 46 : 109-113, 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオ マニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 1995、 羊土社、 日本国） に従つ て NL hEPOマウス ES細胞へ導入する。
NL hEPOマウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄 養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本 国インビトロジヱン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた NL hEPOマウス ES 細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ mlとなるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁液を 10 /_i gのベクター DNA と混和し、 ジーンパルサーキュべッ ト （電 極距離： 0. 4cm、米国バイオラッ ド）にてエレク ト口ポレーションを行った（容量：
960 /i F、 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培 地 （相沢慎一.、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細 胞を播種した 60讓組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国べク トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじめフィ ーダー細胞を播種した 100讓組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 米 国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコ ロ ニーをピッ クアップし、 それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°C にて保存した。残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養 して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。 これらマウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵 素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続い てサザンプロットを行い、 W0 00/10383号パンフレッ ト （実施例 48参照） に記載 の発明で使用された、 Ig軽鎖 J /C - C κゲノム DNAの 3 '端の DNA断片（XhoI〜EcoRI、 約 1. 4kb、 WO 00/10383号パンフレッ ト、 特に図 25) をプローブとして LoxP配列 で挟まれた Pure/遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Pure/遺伝子を 保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 Kと 12. 9 K) が検 出され、 Pure 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本の バンド （15. 6Kと 10. 0K) が検出される（図 2 3 )。 また、 上記と同様の操作で得ら れたサザンブロット膜を用い、実施例 1 0で用いられた 3 ' ΚΟ-probをプローブと して LoxP配列で挟まれた Nee 遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Neor 遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （7. 4 Kと 5. 7 K) が検出され、 Nee 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本 のバンド （5. 7 Kと 4. 4 K) が検出された （図 2 3 )。 これらの結果から、 CL hEPO マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Ne< , Puror) が同時に除去された ES細胞株 （NP loxPV hEPOマウス ES細胞株） が得られた。 実施例 5 4
NP loxPV hEPO マウス E S細胞株おょぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を 用いたキメラマウスの作製
免疫グロブリ ン μ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、 機能的な Β リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した E S細胞に由来する。 本実施^では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97： 722-7, 2000) に 記載された免疫グロブリン 鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 5 3で得られ、免疫グロブリン κ;鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿 入されていることが確認された NP loxPV hEPOマウス ES細胞株を凍結ストツクょ り立ち上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体 の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあたり 8〜10 個注入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲ ティング、 1995、 羊土社、 日本国） で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽 妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片 側の子宫あたりそれぞれ約 10個のインジェクション胚を移植した。実施例 5 3の NP loxPV hEPOマウス ES細胞株を用いて作製されたィンジヱクション胚を移植し た結果、 子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来 の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶） が認められるかどうかによつて判定さ れる。 誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すな わち E S細胞の貢献の認められる個体が得られる。 これらの結果より、 免疫グロ ブリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されている NP loxPV hEPO マウス ES細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化 する能力を保持していることが示される。 実施例 5 5
PL hEPOマウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した US hEPOマウス ES細胞 株の取得
PL hEPOマウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Neor， Pure/) を除去した US hEPO遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS - Creベクター（Sunaga ら、 Mol
Reprod Dev. , 46： 109-113, 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオマ二 ュアルシリーズ 8、ジーンターグティング、 1995、羊土社、日本国）に従って PL hEPO マウス ES細胞へ導入する。
PL hEPOマウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄 養細胞はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （日本 国インビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた PL hEPOマウス ES 細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ mlとなるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁液を 10 のベクター DNA と混和し、 ジーンパルサーキュべット （電 極距離： 0. 4cm、米国バイオラッ ド）にてエレク トロポレーションを行った（容量：
960 F、 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培 地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより 2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細 胞を播種した 60讓組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、米国べタ トン. ディ ッキンソン） 1枚に播種した。 30時間後に ES細胞 1000個をあらかじめフィ 一ダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （ファルコン、 米 国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 6日後に生じたコロニーをピッ クアップし、 それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで增殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMSO、 米国シグマ） に懸濁し、 - 80°C にて保存した。残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養 して 106〜107個の細胞からゲノム DNA を Puregene DNA Isolation Kits (米国
Centra System社） により調製した。 これらマウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵 素 EcoRI (日本国宝酒造） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続い てサザンブロットを行い、 W0 00/10383号パンフレツト （実施例 48参照） に記載 の発明で使用された、 Ig軽鎖 J κ - C fcゲノム DNAの 3 '端の DNA断片（Xho]：〜 EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフレツ ト、 特に図 25) をプローブとして LoxP配列 で挟まれた Pur (/遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Pure 遺伝子を 保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 6 Kと I2. 7 K) が検 出され、 Pure/遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本の バンド （15. 6 Kと 9. 8 K) が検出された（図 2 5 )。 また、 上記と同様の操作で得 られたサザンプロット膜を用い、実施例 1 0で用いられた 3 ' K0 - probをプローブ として LoxP配列で挟まれた Neor遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Neor遺伝子を保持した ES細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド（7. 4 Kと 5. 7 K) が検出され、 Nec 遺伝子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2 本のバンド （5. 7 Kと 4· 4 K) が検出された （図 2 5 )。 これらの結果から、 PL hEPO マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Nee/, Puror) が同時に除去された ES細胞株 （US hEPOマウス ES細胞株） が得られた。 実施例 5 6
US hEPOマウス ES細胞株および Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたキ メラマウスの作製
免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、 機能的な B リンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423-426, 1991 )。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、 大部分が注入した ES細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722 - 7， 2000) に 記載された免疫グロプリン i鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH (ICR) (日 本国日本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用とし て用いた。
上記実施例 5 5で得られ、免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿 入されていることが確認された US hEPOマウス ES細胞'株を凍結ストツクょり立ち 上げ、 それらを、 上記免疫グロブリン μ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄 マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入 した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターグティン グ、 1995、 羊土社、 日本国） で一晚培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠処 理後 2. 5日の仮親 11 (ICR) マウス （日本国日本クレア社） の子宮に、 片側の子 宫あたりそれぞれ約 10 個のインジェクション胚を移植した。 実施例 5 5の US hEPOマウス ES細胞株を用いて作製されたィンジヱクション胚を移植した結果、 子キメラマウスが誕生した。 キメラ個体は、 毛色において、 宿主胚由来の白色の 中に ES細胞由来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。 誕 生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち E S 細胞の貢献の認められる個体が得られる。 これらの結果より、 免疫グロブリン/ c 鎮遺伝午下流にヒ ト EP0 - cDNAが挿入されている US hEPOマウス ES細胞株はキメ ラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持 していることが示される。 実施例 5 7
CL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 NL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウ ス、 PL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウスにおける、 ヒ ト EP0遺伝子転写レべ ルの比較
( 1 ) キメラマウス脾臓より mRNAサンプルの調製
コントロールとして上記実施例 1 1で作製された RSエレメント 'ターゲティン グ ·マウス ES細胞株由来のキメラマウス、 上記実施例 4 2で作製された CL hEPO マウス E S細胞由来キメラマウス、 上記実施例 4 6で作製された NL hEPOマウス
ES細胞由来キメラマウス、 上記実施例 5 0で作製された PL hEPOマウス ES細胞 由来キメラマウスより、 1週齢、 2週齢、 4週齢それぞれで各群 1匹より脾臓サ ンプル 摘出し、 その直後に脾臓約 50 mgを液体窒素で凍結する。 得られた各凍 結サンプルに IS0GEN (日本ジーン) 1 mlを加え、 ホモジナイザ一を用いてサンプ ルを破砕後、 添付されたマニュアルに従い RNAを抽出する。 得られた RNAサンプ ルに 3 7 °C、 1 5分間、 DNase処理 (WAK0 Deoxyribonuclease RT grade) を行つ た。 更に、 RNasy Mini (QIAGEN) を用いて、 精製 RNAサンプルを取得する。 ヒ ト EP0遺伝子転写レベルの比較：
SuperScriptlll (Invitrogen) を用レ、、 得られた精製 RNAサンプル 250 ngより cDNAを合成した。 その後、 3 7 °C、 2 0分間 RNase処理を行い、 滅菌水による 1
0倍希釈液 2. Ο μ ΐをその後の PCRに用いる。
ヒ ト EP0遺伝子発現確認用プライマーとして、 以下のオリゴ DNAを合成した。 hEP0-RT FW5 : GGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTC (配列番号 6 1 ) CkpolyAR2 : CGCTTGTGGGGAAGCCTCCAAGACC (配列番号 6 2 )
ヒ ト EP0遺伝子発現を確認するための PCRを以下のような条件で実施した。 LA taq (日本国宝酒造） を用い、 9 4 °C、 1 0秒インキュベート後 6 8 °C、 1分間ィ ンキュペートの 2段階反応を 3 5サイクル行った。 その結果、 コントロール群で は 1週齢から 4週齢全てで増幅バンドが検出されなかったが、 ヒ ト EP0遺伝子が 導入されたマウス ES 細胞を用いて作製された全てのキメラマウスの脾臓組織で は、 1週齢から増幅バンドが検出された。 NL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウ スと PL hEPOマウス E S細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度は 2週齢、 4週 齢とほぼ等しく、 CL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウスの増幅バンド濃度はこ れらと比較するとやや低いことが確認される。
また、各サンプル群で用レヽられてレ、る mRNA量に偏りが生じていないかを確認す る為、 マウス Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 遺伝子発現 確認用プライマーとして、 以下のオリゴ DNAを合成した。
mGAPDH5： CACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCAC (配列番号 6 3 )
mGAPDH3： ATCATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG (配列番号 6 4 )
マウス GAPDH遺伝子発現を確認するため PCRを以下のような条件で実施した。 LA taq (日本国宝酒造） を用い、 （9 4 °C、 3 0秒） → ( 6 5 °C、 3 0秒） → ( 7 2 °C、 3 0秒） 3段階のインキュベート反応を 2 5サイクル行った。 その結果、 全てのサンプルでマウス GAPDHの発現がほぼ等しいレベルで検出され、 ヒ ト EP0 遺伝子発現確認用プライマーを用いて検出された各サンプル間のバンドの濃度差 がキメラマウス脾臓組織におけるヒ ト EP0遺伝子発現レベルの差を反映している ことが示される。 これらの結果から、 ベクター構造が pCk loxPVタイプよりも、 pNP loxPVや pPS loxPVタイプのほうが転写レベルで発現に有利であることが示 され、 上記実施例 5および上実施例 3 2の in vitro, in vivo実験で得られた結 果との相関も認められる。 また、 これらの結果は、 ES細胞ゲノムより薬剤耐性遺 伝子 （Puro を選択的に除去するため両末端に付加された ΙοχΡ配列の配列構造 を一部変更することが導入遺伝子の発現になんら影響を及ぼさないことを示唆し ている。 実施例 5 8
CL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 NL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウ ス、 PL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 Ck loxPV hEPOマウス ES細胞由来 キメラマウス、 NP loxPV hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 US hEPOマウス ES細胞由来キメラマウスにおける、 血清中ヒ ト EP0濃度の比較
コント口ールとして上記実施例 1 1で作製された RSエレメント 'ターゲティン グ .マウス ES細胞株由来のキメラマウス、 上記実施例 4 2で作製された CL hEPO マウス E S細胞由来キメラマウス、 上記実施例 4 6で作製された NL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 上記実施例 5 0で作製された PL hEPOマウス ES細胞 由来キメラマウス、 上記実施例 5 2で作製された Ck loxPV hEPOマウス ES細胞由 来キメラマウス、 上記実施例 5 4で作製された NP loxPV hEPOマウス ES細胞由来 キメラマウス、上記実施例 5 6で作製された US hEPOマウス ES細胞由来キメラマ ウスより 8週齢の時点で眼窩採血し得られた血清中のヒ ト EP0濃度を ELISAキッ 卜 (Quantikine 丄 VD In Vitro Diagnostic human Erythropoietin. R&D system) を用いて測定した。 その結果、 コントロールとして上記実施例 1 1で作製された RSエレメント · ターゲティング ' マウス ES細胞株由来のキメラマウス由来の血 清中ヒ ト EP0濃度は全て検出限界 （12. 5 pg/ml) 以下であつたが、 全てのヒ EPO 遺伝子導入キメラマウスでは有意な発現が認められた。 また、 CL hEPO マウス E S鉀胞由来キメラマウス、 NL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 PL hEPOマ ウス ES細胞由来キメラマウス、 Ck loxPV hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 NP loxPV hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 US hEPOマウス ES細胞由来キメ ラマウスの順に血清中ヒ ト EP0濃度の増加が認められる。
これらの結果はベクター構造が pCk loxPVタイプ、 pNP loxPVタイプ、 pUSタイ プの順番にキメラマウス血中のヒ ト EP0量が増加することを示し、 薬剤耐性遺伝 子 （Pure/) を選択的に除去するため両末端に付加された ΙοχΡ配列の配列構造が 一部変更されたにも係わらず、上記実施例 6の in vitroで得られた結果や上記実 施例 3 3の in vivoで得れらた結果との相関が認められる。 実施例 6の結果との 相関が認められたこと力ゝら、 ミエローマ細胞を用いた in vitroアツセィ系によつ て、 本発現システムを用いて作製されるキメラマウス血清中の導入遺伝子発現量 が推測されうることが示される。 また、 CL hEPOマウス ES細胞より薬剤耐性遺伝 子を除去 （Ck loxPV hEPOマウス ES細胞） することによつても、 血清中ヒ ト EP0 濃度が増加することが示される。 更に NL hEPOや PL hEPOマウス ES細胞より薬剤 耐性遺伝子を除去した ES細胞を用いキメラマウスを作製した場合、その血清中濃 度はそれぞれ単独の操作で得られた増加量に比べ相乗的に増加し、 極めて興味深 い結果が得られる。 すなわち、 用いる Ig f プロモーター領域の変更と導入遺伝子 固有のリーダー配列コード領域からィントロン領域を含む Ig /c由来のリーダー 配列コード領域への変更ないし導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝子の除 去操作はそれぞれ単独であってもキメラマウスにおける導入遺伝子発現量の向上 に有用であることを示しているが、更に用いる Ig fcプロモーター領域の変更と導 入遺伝子固有のリーダー配列コード領域からィントロン領域を含む Ig /c由来の リーダー配列コード領域への変更及び導入遺伝子の近傍に位置する薬剤耐性遺伝 子の除去操作を全て行うことによって、 キメラマウスにおける導入遺伝子発現量 がそれぞれ単独の操作によつて向上した発現量に比べ相乗的に向上することを示 し、 本発明に記載された方法が遺伝子およびその産物の生体内における機能解析 に極めて有用であることを示している。 実施例 5 9
CL hEPO々ウス ES細胞由来キメラマウス、 NL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウ ス、 PL hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 Ck loxPV hEPOマウス ES細胞由来 キメラマウス、 NP loxPV hEPOマウス ES細胞由来キメラマウス、 US hEPOマウス
ES細胞由来キメラマウスにおける末梢血血球解析
コントロールとして上記実施例 1 1で作製された' RSエレメント 'ターゲティン グ .マウス ES細胞株由来のキメラマウス、 上記実施例 4 2で作製された CL hEPO マウス' ES細胞由来キメラマウス、 上記実施例 4 6で作製された NL hEPOマウス
ES細胞由来キメラマウス、 上記実施例 5 0で作製された PL hEPOマウス ES細胞 由来キメラマウス、 上記実施例 5 2で作製された Ck loxPV hEPOマウス ES細胞由 来キメラマウス、 上記実施例 5 4で作製された NP loxPV hEPOマウス ES細胞由来 キメラマウス、上記実施例 5 6で作製された US hEPOマウス ES細胞由来キメラマ ウスより 8週齢の時点で眼窩採血し、血球測定装置（Bayer Medical (株）製、 ADVIA 120 HEMATOLOGY SYSTEM) を用いて末梢血血球解析を実施した。 コントロールマウ ス群にくらべ、 ヒ ト EP0遺伝子が導入されたキメラマウスは上記全ての群におい て有意な赤血球数増加が認められる。 しかしながら各群間の赤血球数には有意な 差は認められない。 また、 コントロール群のへマトクリツト値は平均 58%であつ たが、 ヒ ト EP0遺伝子が導入されたキメラマウスは上記全ての群において有意な 増加を示し、 ヒ ト EP0遺伝子導入により有意なへマトクリツト値の増加が認めら れる。 しかしながら赤血球数と同様各群間に有意な差は認められない。 上記実施 例 5 8の各群間で血清中ヒト EP0濃度の有意な差が認められるにも係わらず、 血 球解析において有意な差が認められない理由として、最も発現量の少ない CL hEPO マウス ES細胞より作製されたキメラマウスのヒト EP0発現量においても既に増加 の上限値に達していることが原因と考えられる。 従って、 本発明に記載された方 法が遺伝子おょぴその産物の生体内における機能解析に有用であることを示して いる。 産業上の利用可能性
本発明は、 本発明のキメラ非ヒ ト動物またはその子孫、 あるいは該動物由来の 細胞、 組織またはハイプリ ドーマは、 従来と比べて有意に高いレベル、 例えば数 百倚高いレベル、 の外来 DNA発現を可能にするため、 所望蛋白質の高生産法とし て利用できるし、 また機能未知の外来遺伝子が導入されたキメラ非ヒ ト動物また はその子孫を用いることによって、 表現型の違いなどから、 その遺伝子の生体内 機能を解析するために利用することができる。
本明細書で引用された全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考とし て本明細書中にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ： プライマー
配列番号 2 ：プライマー
配列番号 3 ：プライマー . 配列番号 4 プライマー 配列番号 5 プライマー 配列番号 6 プライマー 酉己歹 1.番号 7 プライマー 配列番咅 8 プライマー 配列番号 9 プライマ一 配列番号 1 0 ： プライマ 配列番号 1 1 ： プライマ 配列番号 1 2 ： プライマ 配列番号 1 3 ： プライマ 配列番号 1 4 ： プライマ 配列番号 1 5 ： プライマ 配列番号 1 6 ： プライマ 配列番号 1 7 ： プライマ 配列番号 1 8 ： プライマ 配歹 I—番号 1 9 ： プライマ 配歹 1-番号 2 0 ： プライマ 配歹 ί番号 2 1 ： プライマ 配.歹 I,番号- 2 2 ： プライマ 配歹 1—番号 2 3 ： プライマ 配歹 I- 1番号 2 4 ： プライマ 配歹 1. 1番号 2 5 ： プライマ 配歹 1-番号 2 6 ： プライマ 配歹 I,番号 2 7 ： プライマ 配歹 I番号 2 8 ： プライマ 配歹 (番号 2 9 ： プライマ 配歹 1.番号 3 0 ： プライマ 配歹 1. 1番号 3 1 ：プライマ 配歹 1,番号 3 2 ： プライマ 配歹 ί番号 3 3 プライマー 配歹 1番号 3 4 プライマー 配歹 t番号 3 5 プライマー 配歹 I,番号 3 6 プライマー 配歹 I-番告 3 7 プライマー 配歹'，番号 3 8 プライマー 配列番号 3 9 プライマー 配歹 1番号 4 0 プライマー 配列番号 4 1 プライマー 配列番号 4 2 プライマー 配歹 1番号 4 3 プライマー 配列番号 4 4 プライマー 配列番号 4 5 プライマー 配列番号 4 6 プライマー 配列番号 4 7 リンカー 配列番号 4 8 リンカー 配歹 1.番号 4 9 リンカー 配列番号 5 0 リンカー 配列番号 5 1 リンカー 配列番号 5 2 リンカー 配列番号 5 3 リンカー 配列番号 5 4 リンカー 配列番号 5 5 プライマー 配列番号 5 6 プライマー 配列番号 5 7 プライマ一 配列番号 5 8 プライマー 配列番号 5 9 リンカー 配列番号 6 0 リンカー 配列番号 6 1 プライマー 配列番号 6 2 プライマ一 配列番号 6 3 プライマー 配列番号 6 4 プライマー

Claims

請求の範囲
I . 特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の制御領域によ つて所望の蛋白質の発現が制御されるべく該所望の蛋白質をコードする外来 DNA を含む、' 非ヒ ト動物由来の分化多能性を有する細胞であって、 該特定の細胞およ び/または組織において発現する遺伝子由来のリーダー配列コード領域を含む核 酸断片が該外来 DNAに結合されていることを特徴とする前記細胞。
2 . 前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子が免疫グ口 ブリン遺伝子である請求項 1記載の細胞。
3 . 前記免疫グ口ブリン遺伝子が免疫グ口ブリン軽鎖遺伝子である請求項 2 記載の細胞。
4 . 前記核酸断片が、 前記特定の細胞および Zまたは組織において発現する 遺伝子のプロモーターをさらに含む請求項 1記載の細胞。
5 . 前記核酸断片が、 前記特定の細胞おょぴ Zまたは組織において発現する 遺伝子のプロモーターとリーダー配列コード領域との間の 5 '非翻訳領域の一部 もしくは全部をさらに含む請求項 4記載の細胞。
6 . 前記核酸断片が、 前記特定の細胞および Zまたは組織において発現する 遺伝子のプロモーター / 5 '非翻訳領域の一部もしくは全部 Zリーダー配列コー ド.領域を含む請求項 1記載の細胞。
7 . 前記核酸断片が、 前記非ヒ ト動物由来の免疫グロブリン遺伝子のプロモ 一ター / 5 '非翻訳領域の一部もしくは全部/リーダー配列コード領域を含む請 求項 6記載の細胞。
8 . 前記核酸断片の長さが 3 0 0塩基対より大きい請求項 1記載の細胞。
9 . 前記所望の蛋白質をコードする外来 DNAの下流にポリ Aシグナル領域を コードする配列が結合されている、 請求項 1〜8のいずれか一項記載の細胞。
1 0 . 前記分化多能性を有する細胞において前記外来 DNAのゲノムへの導入 のために使用された 1もしくは複数の薬剤耐性マーカー遺伝子が除去されている 請求項 1記載の細胞。
I I . 前記特定の細胞および/または組織において発現する遺伝子の対立遺 伝子が不活性化されている請求項 1記載の細胞。
1 2 . 前記分化多能性を有する細胞が胚性幹 （E S ) 細胞である請求項 1記 載の細胞。
1 3 . 前記非ヒ ト動物がマウスである請求項 1記載の細胞。
1 4： 請求項 1 〜 1 3のいずれか一項記載の非ヒト動物由来の分化多能性を 有する細胞を作製し、 宿主胚に導入し、 キメラ胚を得る工程、 該キメラ胚を同種 の仮親非ヒ ト動物に移植する工程、 移植したのち得られた仔動物の中から、 所望 の蛋白質をコードする外来 DNAを発現するキメラ非ヒ ト動物を選抜する工程を含 む、 該所望の蛋白質をコードする外来 DNAを過剰発現するキメラ非ヒ ト動物の作 製方法。
1 5 . 前記キメラ非ヒト動物がマウスである請求項 1 4記載の方法。
1 6 . 前記分化多能性を有する細胞が E S細胞である請求項 1 4記載の方法。
1 7 . 請求項 1 4〜 1 6のいずれか一項に記載の方法によって作製された、 かつ所望の蛋白質をコードする外来 DNAが過剰発現することを特徴とするキメラ 非ヒ ト動物。
1 8 . 請求項 1 7記載のキメラ非ヒト動物同士、 または該キメラ非ヒ ト動物 とそれと同種の非ヒ ト動物、 を交配することにより作製された、 かつ所望の蛋白 質をコードする外来 DNAが過剰発現することを特徴とする子孫非ヒ ト動物。
1 9 . " 請求項 1 7記載のキメラ非ヒト動物または請求項 1 8記載の子孫非ヒ ト動物、 あるいは該動物由来の細胞、 組織またはハイブリ ドーマのいずれかを用 いて所望の外来 DNAを発現し、 産生される該遺伝子によってコードされる蛋白質 を回収することを含む、 蛋白質の製造方法。
2 0 . 請求項 1 7記載のキメラ非ヒト動物または請求項 1 8記載の子孫非ヒ ト動物の表現型を、 所望の蛋白質をコードする外来 DNAを含まない対応の野生型 非ヒ ト動物の表現型と比較し、 それらの表現型の違いを決定することを含む、 所 望の蛋白質または所望の蛋白質をコードする DNAの生体内機能を解析する方法。
PCT/JP2006/301379 2005-01-21 2006-01-23 キメラ非ヒト動物およびその使用 WO2006078072A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/795,693 US20090151011A1 (en) 2005-01-21 2006-01-23 Chimeric Non-Human Animal and Use Thereof
JP2006554010A JPWO2006078072A1 (ja) 2005-01-21 2006-01-23 キメラ非ヒト動物およびその使用
EP06701439A EP1849863A1 (en) 2005-01-21 2006-01-23 Non-human chimeric animal and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-014826 2005-01-21
JP2005014826 2005-01-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006078072A1 true WO2006078072A1 (ja) 2006-07-27

Family

ID=36692431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/301379 WO2006078072A1 (ja) 2005-01-21 2006-01-23 キメラ非ヒト動物およびその使用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20090151011A1 (ja)
EP (1) EP1849863A1 (ja)
JP (1) JPWO2006078072A1 (ja)
WO (1) WO2006078072A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006094849A (ja) * 2004-08-30 2006-04-13 Kirin Brewery Co Ltd 相同組換え効率が向上した分化多能性細胞及びその利用
WO2008099969A1 (ja) 2007-02-14 2008-08-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗fgf23抗体及びそれを含む医薬組成物
WO2010038756A1 (ja) 2008-09-30 2010-04-08 協和発酵キリン株式会社 Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物
US7923012B2 (en) 2001-12-28 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody against fibroblast growth factor-23
US7981419B2 (en) 2000-08-11 2011-07-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for treating hypophosphatemic bone diseases using FGF-23 antibody
WO2014007198A1 (ja) 2012-07-02 2014-01-09 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000010383A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for modifying chromosomes
WO2003041495A1 (fr) * 2001-11-15 2003-05-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique
JP2006094849A (ja) * 2004-08-30 2006-04-13 Kirin Brewery Co Ltd 相同組換え効率が向上した分化多能性細胞及びその利用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000010383A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for modifying chromosomes
WO2003041495A1 (fr) * 2001-11-15 2003-05-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Animal chimerique
JP2006094849A (ja) * 2004-08-30 2006-04-13 Kirin Brewery Co Ltd 相同組換え効率が向上した分化多能性細胞及びその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KITAMOTO T. ET AL.: "Follicular dendritic cell of the knock-in mouse provides a new bioassay for human prions", BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN., vol. 294, 2002, pages 280 - 286, XP008057468 *
KITAMOTO T. ET AL.: "Humanized prion protein knock-in by Cre-induced site-specific recombination in the mouse", BIOCHEM. BIOPHYS.RES.COMMUN., vol. 222, 1996, pages 742 - 747, XP002930995 *
ZOU Y-R. ET AL.: "Cre-loxP-mediated gene replacement: a mouse strain producing humanized antibodies", CURR.BIOL., vol. 4, no. 12, 1994, pages 1099 - 1103, XP009034794 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7981419B2 (en) 2000-08-11 2011-07-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for treating hypophosphatemic bone diseases using FGF-23 antibody
US7923012B2 (en) 2001-12-28 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody against fibroblast growth factor-23
JP2006094849A (ja) * 2004-08-30 2006-04-13 Kirin Brewery Co Ltd 相同組換え効率が向上した分化多能性細胞及びその利用
WO2008099969A1 (ja) 2007-02-14 2008-08-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗fgf23抗体及びそれを含む医薬組成物
US7883705B2 (en) 2007-02-14 2011-02-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
EP2502996A2 (en) 2007-02-14 2012-09-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-FGF23 antibody and pharmaceutical composition comprising the same
US9290569B2 (en) 2007-02-14 2016-03-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
EP3181691A1 (en) 2007-02-14 2017-06-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti fgf23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
US10202446B2 (en) 2007-02-14 2019-02-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
WO2010038756A1 (ja) 2008-09-30 2010-04-08 協和発酵キリン株式会社 Frizzled1、Frizzled2又はFrizzled7細胞外システインリッチドメインを含む蛋白質を含有する骨疾患治療用医薬組成物
WO2014007198A1 (ja) 2012-07-02 2014-01-09 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
EP1849863A1 (en) 2007-10-31
JPWO2006078072A1 (ja) 2008-06-19
US20090151011A1 (en) 2009-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3571337B2 (ja) 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
JP4087338B2 (ja) キメラ非ヒト動物
JP4997544B2 (ja) ヒトチトクロームｐ４５０遺伝子（クラスター）を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物
KR20170098800A (ko) 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물
WO1997007671A1 (fr) Animal chimerique et procede de constitution
US20110088106A1 (en) Compositions and methods for mediating cell cycle progression
EP3978607A1 (en) Exon-humanized mouse
WO2006078072A1 (ja) キメラ非ヒト動物およびその使用
US20060123490A1 (en) Pluripotent cells with improved efficiency of homologous recombination and use of the same
WO2008075796A1 (ja) 血球回復促進剤
CA2526814A1 (en) Non-glycosylated human alpha-fetoprotein, methods of production, and uses thereof
WO2001005987A1 (fr) Vecteur piege et procede de piegeage de genes utilisant ledit vecteur
US5532158A (en) Interleukin-2 receptor deficient mammals
US8980627B2 (en) Method for enabling stable expression of transgene
US20090007283A1 (en) Transgenic Rodents Selectively Expressing Human B1 Bradykinin Receptor Protein
USH2056H1 (en) Model for von Hippel-Lindau disease
US20030051267A1 (en) Targeted disruption of kinase suppressor of RAS
WO2001043539A1 (fr) Animaux presentant une expression insuffisante d&#39;uridine phosphorylase
JP4030342B2 (ja) 遺伝子欠損細胞
JPH1033087A (ja) グルタミン酸トランスポーター遺伝子機能欠損非ヒト動物
WO2006022361A1 (ja) Psf1遺伝子欠損動物およびその利用方法
JP2005510220A (ja) プロスタグランジンｅ合成酵素２遺伝子の破壊
WO2001013716A1 (en) α-TOCOPHEROL TRANSPORT PROTEIN KNOCKOUT ANIMAL
JP2003092956A (ja) チミジンホスホリラーゼ発現不全動物
JPH10295216A (ja) ボンベシン様ペプチド受容体遺伝子機能欠損非ヒト動物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006554010

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006701439

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006701439

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11795693

Country of ref document: US