WO2008099969A1 - 抗fgf23抗体及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

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Yuji Yamazaki
Itaru Urakawa
Hitoshi Yoshida
Yukiko Aono
Takeyoshi Yamashita
Takashi Shimada
Hisashi Hasegawa
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Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an anti-FGF23 antibody that specifically binds to an FGF23 antigen. Further, the present invention provides an anti-FGF23 antibody as an active ingredient, a prophylactic or therapeutic agent for mineral metabolic diseases caused by FGF23 overproduction or other causes, particularly hypophosphatemic Kur disease / osteomalacia treatment It relates to the agent.
  • Fibroblast growth factor was first purified from the pituitary gland as a substance that stimulates the growth of the fibroblast cell line NIH3T3. Since then, similar proteins have been identified from various tissues, and a group of these substances forms the polypeptide family (FGF family). To date, 22 proteins have been identified in vertebrates as belonging to the FGF family. As biological activity of these proteins, not only fibroblast proliferation activity but also various effects such as proliferation of mesoderm and neuroectoderm, angiogenesis, and limb bud formation in developmental stage are known. FGF also varies in its gene expression site and expression time, and is often expressed only at specific stages in the developmental stage or in adults.
  • FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4 genes are known as FGF receptor-encoding genes.
  • FGF receptor-encoding genes In FGFR1, FGFR2, and FGFR3, different receptor proteins have different extracellular domains due to differences in splicing. It is known to exist.
  • many of them belong to the FGF family due to their structural similarity, but their biological activity and receptor binding properties are still largely unknown. Such features of the FGF family have been summarized as a review (see Non-Patent Document 1).
  • FGF23 (commonly referred to as FGF-23) takes advantage of homology with FGF15 A protein that was first cloned from a mouse by a database search and PCR method conducted in 2008/052918, and further cloned from human FGF23 using the sequence homology of mouse FGF23.
  • Human FGF23 has 251 amino acid residues. It consists of a polypeptide.
  • it is expected that up to the 24th amino-terminal sequence as a secretory signal sequence is cleaved during secretion (see Non-Patent Document 2).
  • ADHR autosomal dominant hypopnosphatemic rickets / osteomalachia
  • X-linked hypophosphatemic rickets (hereinafter referred to as XLH) is known as a disease that is similar in clinical findings to ADHR and neoplastic osteomalacia. It was shown that the FGF23 concentration in the blood was high even in the pathological condition (see Non-Patent Documents 5 and 6).
  • FGF23 is the secretory disease-causing factor of tumor-induced osteomalacia, XLH, etc., which has been unknown for some time, and is observed in the vitamin D-resistant clough disease / osteomalacia. Furthermore, in other mineral metabolic diseases such as fibrous dysplasia, McCune—Albright syndrome A relationship between a high FGF23 concentration and hypophosphatemia, Kur disease or osteomalacia has been reported (see Non-Patent Documents 7 to 9).
  • a chimeric antibody comprises a portion of an antibody from two or more species (such as the variable region of a mouse antibody and the constant region of a human antibody).
  • the advantage of such a chimeric antibody is that it retains the characteristics of the original mouse antibody, such as its ability to bind to an antigen. Invoke a “HACA” response (see Non-Patent Documents 13).
  • CDR complementarity determining region
  • humanized antibody an antibody consisting of mouse CDR, human variable region framework and constant region (ie, “humanized antibody”) has been produced using CDR grafting technology (see Non-Patent Document 14).
  • human anti-FGF23 mouse antibodies such as 2C3B antibodies are humanized by substituting mouse antibodies with human antibody sequences.
  • affinity to the antigen will decrease.
  • Patent Document 1 International Publication No. W002 / 14504 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. W003 / 057733 Pamphlet
  • Patent Document 3 European Patent Application Publication No. 120694
  • Patent Document 4 European Patent Application Publication No. 125023
  • Patent document 5 GB GB2188638A specification
  • Patent Document 6 US Patent No. 5585089
  • Non-patent literature 2 Yamashita, T. et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 277: 494 -498, 2000
  • Non-patent literature 3 White, K. ⁇ . Et al., Nature Genet., 26: 345-348, 2000
  • Non-patent literature 4 Shimada, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98: 6500- 6505,
  • Non-Patent Document 5 Yamazaki, Y. et al., J. Clin. Endocrinol.
  • Non-patent literature 7 Riminucci, M. et al., J. Clin. Invest., 112: 683-692, 2003
  • Non-patent literature 8 Yamamoto, T. et al., J. Bone Miner. Metab., 23: 231- 237,
  • Non-Patent Document 9 Lorenz-Depiereux, B. et al., Nat. Genet., 38: 1248-1250,
  • Non-Patent Literature 1 0 Gupta, A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 89: 4489-4492, 2004
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  • Non-patent literature 1 2 Van Kroonenbergh, MJ et al., Nucl. Med. Commun. 9: 919-930, 1988
  • Non-patent literature 1 3 Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med., 170: 2153-2157, 1989
  • Non-patent literature 1 4 Riechmann, L. et al., Nature, 332: 323-327, 1988 invention Disclosure of
  • An object of the present invention is to provide a human antibody against FGF23, and a pharmaceutical composition such as a prophylactic or therapeutic agent with fewer side effects for diseases that can be prevented or treated by suppressing the action of FGF23 using the antibody. There is.
  • the object of the present invention is an anti-FGF23 antibody that can be used as a hypophosphatemia therapeutic agent, which has a serum phosphorus concentration and serum 1,25D concentration that are higher than those of existing anti-FGF23 antibodies.
  • An object of the present invention is to provide an antibody having a continuous ascending action, and a pharmaceutical composition such as a prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with FGF23 using the antibody.
  • the current method of treatment for hypophosphatemic Kur disease is to intermittently orally administer phosphoric acid together with vitamin D preparations several times a day.
  • the problem is that it is a situation that places a heavy burden on patients due to the large number of doses per patient.
  • the anti-FGF23 human monoclonal antibody, C10 antibody obtained in the present invention has been shown to have a more sustained blood phosphorus concentration increase and 1,25D increase action, that is, a strong FGF23 neutralizing activity.
  • sustained administration of serum phosphorus and serum 1,25D concentrations was observed after a single administration of C10 antibody. This suggests that the C10 antibody may have a significant advantage over the current treatment as a hypophosphatemia drug.
  • the present invention is as follows.
  • An antibody against human FGF23 or a functional fragment thereof comprising the heavy chain variable region and / or light chain variable region amino acid sequence, wherein the heavy chain variable region amino acid sequence is position 20 of SEQ ID NO: 12
  • An antibody against human FGF23 which is represented by S at position 136 from Q and whose amino acid sequence of the light chain variable region is represented by K at positions 23 to A in SEQ ID NO: 14 or a functional fragment thereof.
  • CDR complementarity determining region
  • CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43
  • CDR 2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44
  • CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45
  • CDR 2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41
  • CDR 3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient the antibody against human FGF23 of any one of [1] to [12] or a functional fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition capable of regulating phosphorous metabolism and / or vitamin D metabolism of FGF23 comprising as an active ingredient the antibody against human FGF23 of any one of [1] to [12] or a functional fragment thereof.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease associated with abnormal mineral metabolism comprising as an active ingredient the antibody against human FGF23 of any one of [1] to [12] or a functional fragment thereof.
  • nucleic acid that encodes the amino acid sequence of the heavy chain variable region encoded by the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence represented by the 58th C to the 408th A of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • nucleic acid encoding the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the nucleotide sequence represented by the nucleotide sequence represented by the 67th G to the 384th A of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13;
  • [2 1] A vector comprising the nucleic acid according to [19] or [20].
  • a host cell comprising the vector according to [2 1].
  • a method for producing an antibody against human FGF23 or a functional fragment thereof comprising culturing the host cell of [22] and expressing an antibody against human FGF23 or a functional fragment thereof.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the construction process of a C10 expression vector.
  • FIG. 4 shows the structure of the C10 expression vector.
  • FIG. 5A is a diagram showing the measurement results detected by sandwich ELISA using the purified full-length human FGF23 protein as a solid phase antibody with 2C3B antibody or C10 antibody and with 3C1E antibody as a detection antibody.
  • FIG. 5B is a diagram showing the measurement results detected by sandwich ELISA using the 2CSB antibody or C10 antibody as the solid phase antibody and the 3C1E antibody as the detection antibody in the power cynomolgus FGF23-expressing cell supernatant.
  • FIG. 6 is a graph obtained by measuring the serum phosphorus concentration of the power cynomolgus monkey administered with vehicle, 2C3B antibody or C10 antibody over time. The measured values are shown as mean values +/ ⁇ standard error. In addition, as a result of performing a significant difference test with the vehicle administration group on the same date and time using Student 'st-test, * was added to the graph for the measured value in which a significant difference (p 0. 05) was observed. .
  • FIG. 7 is a graph showing the increase in serum phosphorus concentration in cynomolgus monkeys on the fifth day after administration of 2C3B antibody or C10 antibody, based on the serum phosphorus concentration in two-day power monkeys on day 5 of vehicle administration.
  • FIG. 11 shows the structure of the pUS FGF23 KI vector.
  • hFGF23 human FGF23 gene without a unique signal peptide coding region
  • CK Mouse Ig kappa gene constant region
  • loxpv-puro ⁇ Rooster puromycin ⁇ raw gene with loxPV sequence portion mutant sequences der Ru of himself columns at opposite ends thereof
  • loxp- neo r a Iotaomikuronkairo sequences at both ends Neomycin resistance gene
  • FIG. 13 is a graph showing the serum FGF23 concentration 7 days before administration of the control antibody or C10 antibody. The measured value was shown as an average value +/- standard error. In addition, as a result of performing a significant difference test with the WT mouse group using Student's t-test, *** was added to the graph for the group in which a significant difference (p ⁇ 0.001) was observed.
  • FIG. 14 is a graph showing serum phosphorus concentrations 7 days before administration of the control antibody or C10 antibody and 3 days after the first administration. The measured values are shown as mean values +/ ⁇ standard error.
  • *** is indicated on the graph for the group in which a significant difference (p ⁇ 0.001) was observed.
  • a significant difference p 0.001 was observed.
  • Added # a significant difference test with the hFGF23KI mouse control antibody administration group within the same day.
  • Fig. 15 is a graph showing the serum phosphorus concentration one day after the fifth administration of the control antibody or C10 antibody. The measured values are shown as mean values +/ ⁇ standard error.
  • *** was added to the graph for the group in which a significant difference (p ⁇ 0.001) was observed.
  • FIG. 16 is a graph showing grip strength one day after the fourth administration of control antibody or C10 antibody.
  • the measured value was shown as an average value +/- standard error.
  • *** was added to the graph for the group in which a significant difference (p ⁇ 0.001) was observed.
  • a significant difference test with the hFGF23KI mouse control antibody administration group for the hFGF23KI mouse C10 antibody administration group in which a significant difference (p ⁇ 0.001) was observed, is added on the graph.
  • Fig. 17 is a photograph showing an image obtained by tissue staining of the femur of a mouse dissected and collected one day after the fifth administration of the control mouth antibody or C10 antibody by the Villanueva-Goldner method.
  • Figure 18 shows dissection and collection one day after the fifth administration of control antibody or C10 antibody. It is the graph which showed the ratio of the ash weight with respect to the dry weight of the tibia. Measured value is average value
  • the antibody of the present invention is an antibody against FGF23, which is one of the fibroblast growth factor (FGF) families.
  • the “antibody against FGF23” in the present invention is an antibody that binds to FGF23 or a part thereof, an antibody that is reactive with FGF23 or a part thereof, or an antibody that recognizes FGF23 or a part thereof.
  • An antibody against FGF23 is sometimes called an anti-FGF23 antibody.
  • an antibody refers to a gene in which all regions including the heavy chain variable region and the heavy chain constant region constituting the immunoglobulin, and the light chain variable region and the light chain constant region code for the immunoglobulin. It is an imnogropurine derived from The antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the part of FGF23 refers to a partial peptide of the full-length amino acid sequence of FGF23 represented by SEQ ID NO: 4 and a fragment peptide of FGF23 consisting of a continuous amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 1 2 Preferably of SEQ ID NO: 1 2
  • SEQ ID NO: 12 is an amino acid sequence containing the leader sequence of the heavy chain variable region of the antibody against FGF23.
  • the amino acid sequence consisting of the 20th Q from 1 2 to the 136th S is the amino acid sequence of the mature part excluding the leader part.
  • SEQ ID NO: 14 corresponds to FGF23
  • the amino acid sequence consisting of the 23rd A to 128th K of SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of the mature part excluding the leader sequence part. is there.
  • Immunoglobulin G (IgG), A (IgA), E (IgE) and M (IgM) are used as the antibody class, and IgG is preferred.
  • the antibody of the present invention also includes an anti-FGF23 antibody containing a novel complementarity determining region (CDR) amino acid sequence.
  • CDR complementarity determining region
  • the CDR exists in the variable region of the antibody, and this part is responsible for the specificity of antigen recognition.
  • the part other than the CDR of the variable region has a role of retaining the CDR structure and is called a framework region (FR).
  • FR framework region
  • the heavy chain variable region contains three complementarity determination regions: a first complementarity determining region (CDR 1), a second complementarity determining region (CDR 2) and a third complementarity determining region (CDR 3).
  • a region exists.
  • the three complementarity determining regions in the heavy chain variable region are collectively referred to as the heavy chain complementarity determining region.
  • CDR 1 the first complementarity determining region
  • CDR 2 the second complementarity determining region
  • CDR3 the third complementarity determining region
  • the antibody of the present invention preferably has, as a heavy chain complementarity determining region, CDR1 has at least one or all of SEQ ID NO: 40, CDR2 has SEQ ID NO: 41, and CDR3 has SEQ ID NO: 42. Further, as the light chain complementarity determining region, CDR1 has at least one or all of SEQ ID NO: 43, CDR2 has SEQ ID NO: 44, and CDR3 has SEQ ID NO: 45. More preferably, as the heavy chain complementarity determining region, CDR1 has SEQ ID NO: 40, CDR2 has SEQ ID NO: 41, CDR3 has SEQ ID NO: 42, and as the light chain complementarity determining region, CDR1 has SEQ ID NO: 43, CDR2. Is SEQ ID NO: 44, CDR3 Is an antibody that binds to FGF23 having SEQ ID NO: 45
  • the CDR sequence of the antibody of the present invention is not necessarily limited, but preferably any one or more of the CDR sequences shown in SEQ ID NOs: 40 to 45, preferably 3 of the heavy chain, more preferably 6 CDRs It is an antibody containing.
  • the amino acid sequence other than CDR is not particularly limited, and so-called CDR grafted antibodies in which the amino acid sequence other than CDR is derived from other antibodies, particularly, other types of antibodies are encompassed by the antibody of the present invention.
  • humanized antibodies or human antibodies whose amino acid sequences other than CDRs are derived from humans are preferred, and one to several amino acid residues are added, deleted, substituted, and substituted as necessary. May be accompanied by Z or insertion.
  • a known method can be used for producing a humanized antibody or human antibody.
  • a “functional fragment” is a part (partial fragment) of an antibody that retains at least one action of the antibody on the antigen, ie, the ability to bind to the antigen, the reactivity to the antigen, or the recognition of the antigen.
  • Fv disulfide bond Fv (dsFv)
  • dsFv disulfide bond Fv
  • Fab is a fragment obtained by treating an antibody that binds to FGF23 with proteolytic enzyme papain. The half of the heavy chain (H chain) and the entire light chain (L chain) are bound by disulfide bonds. It is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight.
  • F (ab ') 2 is larger than the fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme pepsin, and Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region. It is an antibody fragment having activity.
  • the F (ab ′) 2 of the present invention can be obtained by treating an antibody that binds to the FGF23 of the present invention with a proteolytic enzyme pepsin. Or the following Fab., Or thioether bond or Can be made by disulfide bonding.
  • Fab ′ is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab,) 2 .
  • Fab ′ of the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 that binds to FGF23 of the present invention with a reducing agent dithiothreitol.
  • the DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of the antibody that binds to the FGF23 of the present invention, constructs a DNA encoding scFv, and uses the DNA to express the prokaryotic expression vector or eukaryotic organism.
  • ScFv can be produced by inserting into an expression vector for use and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen-binding activity can be the same, or one can be a different antigen-binding activity.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7: 697-704, 1994).
  • the dsFv of the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding the VH and VL of the antibody that binds to the FGF23 of the present invention, constructing a DNA encoding dsFv, and using the DNA for a prokaryotic expression vector or eukaryotic DsFv can be produced by inserting into an expression vector and expressing the expression vector by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a “functional fragment” is a fragment of an antibody that can bind to an antigen (FGF23).
  • the “functional fragment” is an amino acid sequence consisting of 20th Q to 136th S of SEQ ID NO: 1 2 and / or an amino acid sequence consisting of 23rd A to 128th K of SEQ ID NO: 14 It is a fragment that can bind to FGF23.
  • the “functional fragment” is a fragment having at least one or all of the CDRs shown in SEQ ID NOs: 40 to 45 and capable of binding to FGF23. More preferably, the “functional fragment” is derived from the variable region of an antibody produced by hybridoma C10, and is a fragment capable of binding to FGF23.
  • radioisotope examples include 131 1, 125 1, and can be bound to an antibody by, for example, the chloramine T method.
  • Low molecular weight drugs include nitrogen 'mustard, cyclophosphamide and other alkylating agents, 5-fluorouracil, methotrexate and other metabolic antagonists, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, doxorubicin, etc.
  • low-molecular-weight drugs and antibodies can be bound by known methods.
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or by combining the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. The method of combining them can be used.
  • antibody derivatives having the functions of low-molecular-weight drugs can be obtained.
  • a cDNA encoding a specific protein is linked to a cDNA encoding an antibody or a functional fragment of the antibody, and a DNA encoding a fusion protein of the specific protein and the antibody is constructed.
  • a fusion antibody bound to the specific protein can be produced by inserting into an expression vector for nuclei and expressing the expression vector by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • human antibody means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene.
  • a human antibody can be obtained by introducing a human antibody locus as described below and administering an antigen to a transgenic animal having the ability to produce a human-derived antibody.
  • the transgenic animal include mice, and a method for producing a mouse capable of producing a human antibody is described in, for example, International Publication No. W002 / 43478 Pamphlet. JP2008 / 052918
  • Examples of the antibody of the present invention include an antibody (C10 antibody) produced by a C10 hybridoma described in Examples described later.
  • one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences of the heavy chain and / or light chain constituting the antibody or functional fragment.
  • monoclonal antibodies or functional fragments thereof comprising heavy and / or light chains consisting of an amino acid sequence.
  • “one or several” “several” means 9 or less, preferably 5 or less, more preferably 3 or less, and particularly preferably 2.
  • the partial modification (deletion, substitution, insertion, addition) of the amino acid as described above is performed in the amino acid sequence of the antibody or functional fragment of the present invention by partially modifying the base sequence encoding the amino acid sequence. Can be introduced.
  • the antibodies of the invention include antibodies having any immunoglobulin class and isotype.
  • the antibody against FGF23 of the present invention can be produced by the following production method. That is, for example, a combination of FGF23, a part thereof or a part thereof and a suitable carrier substance (for example, bovine serum albumin) for enhancing the antigenicity of the antigen, if necessary, an immunostimulator ( Immunize non-human mammals such as human antibody-producing transgenic mice.
  • a suitable carrier substance for example, bovine serum albumin
  • an immunostimulator Immunize non-human mammals such as human antibody-producing transgenic mice.
  • FGF23 both natural FGF23 and recombinant FGF23 can be used.
  • immunization can be performed by introducing a gene encoding FGF23 into an expression vector and expressing the FGF23 protein in an animal.
  • Monoclonal antibodies are obtained by culturing a hybridoma obtained by fusing an antibody-producing cell obtained from an immunized animal and a myeloma cell (myeloma cell) that does not have autoantibody-producing ability, and used as an antigen for immunization. Clones producing monoclonal antibodies with specific affinity for Can be obtained by selecting.
  • the production of a monoclonal antibody includes the following steps. (1) Preparation of an antigen protein or antigen protein expression vector to be used as an immunogen, (2) Immunization by injecting the antigen into the animal or expressing the antigen in the animal, and then collecting blood The process of preparing antibody-producing cells after determining the timing of removal of the spleen by testing the antibody titer, (3) Preparation of myeloma cells (myeloma), (4) Between antibody-producing cells and myeloma Cell fusion, (5) selection of hybridomas producing the desired antibody, (6) splitting into single cell clones (cloning), and (7) in some cases, to produce large quantities of monoclonal antibodies Culturing of hybridomas, or rearing of animals transplanted with hybridomas, and (8) assaying the biological activity of the monoclonal antibody thus produced and its recognition specificity, or Test of properties as a labeling reagent, etc.
  • a FGF23 protein purified by incorporating a DNA sequence encoding FGF23 into a suitable expression plasmid using a gene recombination technique and producing it inside or outside a host such as E. coli or animal cells can be used. Since the primary structure of the human FGF23 protein is known [GenBank accession No. AAG09917, SEQ ID NO: 4], a partial peptide is chemically synthesized from the amino acid sequence of FGF23 by using a method well known to those skilled in the art, and this is used as an antigen. It can also be used.
  • the antigen obtained in (1) is mixed with Freund's complete or incomplete adjuvant, or an auxiliary agent such as Calimiyoban, and an experimental animal is immunized as an immunogen.
  • Transgenic mice having the ability to produce human-derived antibodies are most preferably used as experimental animals. Such mice are described in Tomizuka et al. [Tomizuka. Et al., Proc Natl Acad Sci USA , 97: 722-727, 2000].
  • the immunogen administration method for mouse immunization may be subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, intramuscular injection, footpad injection, but intraperitoneal injection, footpad injection or intravenous Injection is preferred.
  • Spleen cells and myeloma are thoroughly washed with serum-free medium (eg, DMEM) or phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”), and the ratio of the number of splenocytes to myeloma is 5: 1 Mix to about 10: 1 and centrifuge. After removing the supernatant and loosening the precipitated cells, add serum-free medium containing 1 mL of 50% (w / v) polyethylene glycol (molecular weight 1000-4000) dropwise with stirring. Then, gently add lOmL of serum-free medium and centrifuge.
  • serum-free medium eg, DMEM
  • PBS phosphate buffered saline
  • HAT hypoxanthine 'aminopterin' thymidine
  • IL-6 human interleukin-6
  • This cloning method includes the limiting dilution method in which one well of the plate is diluted so that one hyperidoma is contained, and is cultured in a soft agar medium.
  • the soft agar method for collecting ronnies, the method of extracting and culturing cells one by one with a micromanipulator, and the ⁇ sorter clone '' for separating individual cells with a cell sorter, etc. Used.
  • a gene encoding a human monoclonal antibody is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma and incorporated into an appropriate vector, which is then used as a host (eg, a mammalian cell line, E. coli, yeast cell, insect cell, plant cell, etc.
  • a host eg, a mammalian cell line, E. coli, yeast cell, insect cell, plant cell, etc.
  • Recombinant antibodies produced using genetic recombination technology can also be prepared.
  • the anti-FGF23 antibody can be obtained by culturing a transformant and collecting it from the culture.
  • “culture” refers to (a) culture supernatant, (b) cultured cells or cultured cells or disrupted products thereof, and (c) secreted product of the transformant. It also means a gap.
  • a medium suitable for the host to be used is used, and a stationary culture method, a culture method using a roller bottle, or the like is employed. After the culture, if the target antibody is produced in cells or cells, the antibody is collected by disrupting the cells or cells.
  • Fab can be proteochemically produced by treating IgG with the proteolytic enzyme papain. After papain treatment, if the original antibody is an IgG subclass with protein A binding properties, it can be separated from IgG molecules and Fc fragments by passing through a protein A column and recovered as a uniform Fab ( Monoclonal Antibodies Principles and Practice, third edition, 1995). For IgG subclass antibodies that do not have floorin A binding, Fab can be recovered in fractions eluted at low salt concentrations by ion exchange chromatography (Monoclonal Antibodies Principles and Practice, third edition, 1995). In addition, Fab can be produced using E. coli, insect cells, animal cells, etc.
  • Amino acids encoded by introducing mutations at appropriate positions in DNA encoding VH and VL Create DNA with residues replaced by cysteine.
  • Each of the prepared DNAs can be cloned into a dsFv expression vector to prepare VH and VL expression vectors.
  • Any dsFv expression vector can be used as long as it can incorporate and express dsFv DNA.
  • pULI9 Protein Engineering, 7: 697-704, 1994.
  • VH and VL expression vectors can be introduced into appropriate E. coli and produced and accumulated in inclusion bodies or periplasma layers.
  • VH and VL can be obtained from the inclusion body or periplasma layer, mixed and made into an active dsFv by the refolding method usually used for proteins. After refolding, it can be further purified by ion exchange chromatography and gel filtration (Protein Engineering, 7: 697-704, 1994).
  • the antibody or functional fragment of the present invention has any of the following characteristics.
  • the present invention further includes a nucleic acid encoding the amino acid sequence of the antibody against FGF23 of the present invention.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • the nucleic acid of the present invention is preferably a nucleic acid encoding the amino acid sequence of an antibody produced by hybridoma C10.
  • a nucleic acid that encodes the amino acid sequence of the heavy chain variable region encoded by the nucleotide sequence represented by the 58th C to the 408th A of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 can be mentioned.
  • the nucleic acid which codes the amino acid sequence of the light chain variable region encoded by the base sequence shown by 67th G to 384th A of the base sequence shown by sequence number 13 is mentioned.
  • a pharmaceutical composition which is a pharmaceutical composition containing the human anti-FGF23 antibody of the present invention or a functional fragment thereof is also included within the scope of the present invention.
  • Such a preparation preferably contains a physiologically acceptable diluent or carrier in addition to the antibody or functional fragment, and is a mixture with other agents such as other antibodies or antibiotics. It may be.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the antibody may be freeze-dried (freeze-dried) and reconstituted by adding a buffered aqueous solution as described above when necessary.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • an injection it is usually provided in the form of a unit dose ampoule or a multi-dose container.
  • the powder may be redissolved with a suitable carrier, for example, pyrogen-free sterilized water.
  • a suitable carrier for example, pyrogen-free sterilized water.
  • These dosage forms usually contain additives such as emulsifiers and suspending agents that are commonly used in pharmaceutical compositions.
  • Examples of the injection method include intravenous drip intravenous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and intradermal injection.
  • the dose varies depending on the age of administration subject, administration route, and number of administrations, and can be varied over a wide range.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant can be prepared using the antibody of the present invention or the functional fragment of the antibody itself, or does not irritate the oral cavity and airway mucosa of the recipient (patient), and the functional of the antibody or antibody. It is prepared using a carrier to disperse the fragments as fine particles and facilitate absorption.
  • the present invention also includes a method for preventing or treating the following diseases using the antibody of the present invention or a functional fragment thereof or a pharmaceutical composition containing the antibody, and the present invention further comprises the antibody of the present invention or a functional fragment thereof.
  • Diseases that can be prevented or treated with the antibodies of the present invention or functional fragments thereof are neoplastic osteomalacia, ADHR, XLH, fibrous dysplasia, McCune-Albright syndrome, and autosomal recessive low Examples include diseases associated with abnormal mineral metabolism such as phosphate.
  • hypophosphatemia bone mineralization failure, bone pain, muscle weakness, skeletal deformity, growth disorder, low 1,25D blood, etc.
  • the blood FGF23 level since an increase in the blood FGF23 level has been reported in renal failure, it can be used for renal failure such as renal osteodystrophy, dialysis osteopathy, tubular dysfunction, and artificial dialysis during renal failure. It can also be used therapeutically and prophylactically for comorbidities.
  • 1,25D since 1,25D has been reported not only for the metabolism of minerals such as calcium as described above, but also for cell growth inhibition ability, cell differentiation promotion ability, etc., it is proliferated by 1,25D using the antibody of the present invention or a functional fragment thereof. It can be used therapeutically and prophylactically for diseases caused by cells undergoing control of differentiation and differentiation.
  • tumor osteomalacia it is known that tumors overproduce FGF23 and cause pathology.
  • the LHisNot primer is a codon that follows the 5 'sequence of the stop codon of the sequence encoding human FGF23 and the sequence encoding the His6-tag sequence (His-His-His-His-His). And the Notl restriction enzyme sequence.
  • the amplified fragment is coded by adding the His6-tag sequence to the carboxy terminus of human FGF23 protein, and has a Notl restriction enzyme site downstream of it.
  • PcDNA3.lZeo an animal cell expression vector that was digested with EcoRI and Notl and digested with EcoRI and Notl.
  • the culture supernatant of each cloned cell is collected and subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, then the protein is transferred to a PVDF membrane (Millipore), and the anti-His-tag antibody (Invitrogen) ) And the ECL luminescence system (GE Healthcare Biosciences) were used to detect signals derived from the FGF-23H protein around 32 kDa. As a result, the highest expression was found in the clone named # 20, and this was named CH0-0ST311H.
  • the pEAK8 / IRES / EGFP / hFGF23 vector was introduced into CHO Ras clone-1 cells by a gene transfer method using a membrane fusion lipid. Incubate CHO Ras clone-1 cells on a 6iell plate so that the cells cover about 60% of the bottom. Remove the culture medium and add 1 ml of MEM ⁇ medium without serum. Vectors to be introduced 2.5 g and 10 1 of Transfectam (Promega) were mixed with MEM ⁇ culture medium without serum of 1 ⁇ l respectively, and both were mixed and allowed to stand for 10 minutes. The two were mixed and added to a previously prepared 6-well plate.
  • the culture solution containing this DNA was removed and replaced with a culture solution containing 10% FCS and cultured overnight.
  • drug-resistant cells were selected by adding Puromycin (Sigma) to a final concentration of 5 g / ml.
  • the drug-resistant cells obtained in this way were cloned by limiting dilution.
  • a cell line that best expresses the protein of interest was obtained by Western blot. This cell is referred to as CH0-hFGF23.
  • Example 2 In accordance with general methods such as those written by Ando Minhe et al., Published by Kodansha 1991) Prepared.
  • the immunogen the full-length human FGF23 protein prepared in Example 2 was used.
  • the immunized animal the human antibody-producing mouse producing the human immunoglobulin produced in Example 3 was used.
  • the spleen was surgically obtained from the immunized mouse and 350 mg / mL sodium bicarbonate,
  • Serum-free DMEM medium containing 50 units / mL penicillin, 50; U g / mL streptomycin
  • GSP Gene specific primers
  • the constructed C10 antibody expression vector was introduced into host cells to produce C10 antibody expression cells.
  • host cells for expression dihydrofolate reductase (DHFR) -deficient CHO DG44 cells (hereinafter referred to as CHO cells, IDEC Pharmaceuticals) EX-CELL 325-PF medium (2niM glutamine, 100units / ml) A cell line conditioned to penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, hypoxanthine and thymidine (HT) supplement (1: 100) (Invitrogen), JRH) was used.
  • the vector was introduced into the host cells by electroporation.
  • monkeyFGF23Fff CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT (SEQ ID NO: 2 6) monkeyFGF23RV: ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC (SEQ ID NO: 2 7) Forced quizal FGF23 nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2 8)
  • the serum phosphorus concentration-increasing effect of C10 antibody and 2C3B antibody was compared by the following method using untreated normal force-quizal.
  • the C10 antibody prepared in Example 4 was used.
  • the test animals used were female cynomolgus monkeys, 2 to 3 years old, body weight 2 to 4 kg, vehicle administration group, 2C3B antibody administration group 3 animals each, and C10 antibody administration group 4 animals.
  • C10 antibody and 2C3B antibody were adjusted to a concentration of 3 mg / mL with PBS (-), respectively, and used as administration solutions.
  • PBS (-) as a medium was used as a negative control.
  • C10 antibody and 2C3B antibody were each administered at a flow rate of 1 mL / min from the brachiocephalic vein in a volume of 1 mL / kg so that each would be 3 mg / kg.
  • Serum phosphorus concentration was measured with Hitachi autoanalyzer 7180 (Hitachi, Ltd.) using L-type KOKO inorganic phosphorus (Wako Pure Chemical Industries) reagent.
  • Serum 1,25D concentrations were measured using the 1,25 (0H) 2 D RIA kit “TFB” (Immunodiagnostic Systems). Measurements were made on the 0.5th, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, and 49 days after antibody administration. Data are shown as mean +/- standard error.
  • Example 11 demonstrated that the C15 antibody has a binding activity to human and force cynomolgus FGF23 recombinant protein in the same manner as the C10 antibody.
  • the C10 antibody and C15 antibody were administered to normal-powered cynomolgus monkeys to compare the FGF23 neutralizing activity in vivo. Evaluation of neutralizing activity against FGF23 endogenous cynomolgus monkey was performed using the increase in serum phosphorus concentration as an index.
  • the C10 antibody or C15 antibody prepared in Example 7 was used.
  • the experimental animals used were normal-powered monkeys aged 2 to 3 years and weighing 2 to 3 kg, with 3 males per group and 1 female.
  • PBS (-) was used as the dilution medium, and the C10 antibody was prepared at a concentration of 1 mg / mL and 3 mg / mL, and the C15 antibody was prepared at a concentration of 3 mg / mL.
  • C10 antibody is administered at a flow rate of about 1 mL / min from the saphenous vein in a volume of 1 mL / kg so that the dose is 1 mg / kg and 3 mg / kg, and C15 antibody is 3 mg / kg.
  • Serum phosphorus concentration was measured with a Hitachi automated analyzer 7180 (Hitachi, Ltd.) using L-type KOKO inorganic phosphorus (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) reagent. Blood sampling should be done prior to antibody administration and administration 1, 3,
  • the C10 antibody ameliorates bone mineralization induced by FGF23 excess. Therefore, the tibia was incinerated and the mineral content was measured and compared between the groups. The mineral content of the tibia in the control antibody-administered group of hFGF23KI mice was significantly lower than that of the control antibody-administered group of WT mice (Fig. 18). In contrast, it was confirmed that the mineral content was improved in the C10 administration group of hFGF23KI mice (FIG. 18). Based on the above results, in hFGF23KI mice, C10 antibody administration neutralizes human FGF23, which is acting excessively in vivo, and hypophosphatemia such as hypophosphatemia, muscle weakness, and bone mineralization disorders. It was confirmed to improve various symptoms of Kuru disease. In other words, the C10 antibody was shown to be an effective therapeutic agent for various human diseases involving FGF23. Industrial applicability

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Abstract

　FGF23に対する抗体、並びに該抗体を用いてFGF23の作用を抑制することにより予防又は治療が可能な疾患の予防又は治療剤などの医薬組成物の提供。　ハイブリドーマC10（受託番号　FERM BP-10772）より産生されるヒトFGF23に対する抗体又はその機能的断片。

Description

抗 FGF23抗体及ぴそれを含む医薬組成物
技術分野
本発明は FGF23抗原に特異的に結合する抗 FGF23抗体に関する。 さらに本発明 は、 抗 FGF23抗体を有効成分とする、 FGF23過剰産生に若しくは他の原因に起因 するミネラル代謝性疾患に対する予明防又は治療剤、 特に低リン血症性クル病 ·骨 軟化症治療剤に関する。
田 背景技術
線維芽細胞増殖因子 （Fibroblast growth factor) は、 最初に線維芽細胞株 NIH3T3の増殖を刺激する物質としてゥシの下垂体より精製された。 以降、 種々の 組織より類似の蛋白質が同定されており、 それら一群の物質はポリぺプチドファ ミリ一 （FGFフアミリー） を形成している。 現在までのところ、 FGFフアミリーに 属するものとして脊椎動物において 22種の蛋白質が同定されている。これらの蛋 白質の生物活性としては、 線維芽細胞増殖活性だけでなく中胚葉ゃ神経外胚葉の 増殖や血管新生作用、 発生段階における肢芽形成など多岐にわたる作用が知られ ている。 FGF はその遺伝子の発現部位、 発現時期についても多様であり、 発生段 階や成人における特定部位においてのみ発現しているというものも多い。 FGF の 受容体をコードする遺伝子としては FGFR1、 FGFR2、 FGFR3、 FGFR4の少なくとも 4 種が知られており、 また FGFR1、 FGFR2、 FGFR3においてはスプライシングの違い により細胞外ドメィンの異なる受容体蛋白質がそれぞれにおいて存在することが 知られている。 また、 へパリンやへパラン硫酸プロテオダリカンが FGFや FGF受 容体と相互作用することにより作用を調節することが知られている。 また、 構造 的類似性より FGFファミリ一に属するが、 その生物活性や受容体結合性等につい て、 ほとんど解明されていないものも多い。 このような FGFファミリーの特徴に ついては、 総説としてまとめられている （非特許文献 1を参照）。
FGF23 (一般的に FGF-23 と表されることもある） は、 FGF15 との相同性を利用 2008/052918 したデータベース検索と PCR法にて最初にマウスよりクローニングされ、 さらに マウス FGF23の配列相同性を利用してヒ ト FGF23がクローニングされた蛋白質で あり、 ヒ トの FGF23は 251アミノ酸残基のポリペプチドからなる。 また、 分泌シ グナル配列として 24番目までのァミノ末端側配列が分泌時に切断されることが 予想されている （非特許文献 2を参照）。続いて常染色体優性低リン血症性クル病 •骨車夂化 ¾£ (Autosomal dominant hypopnosphatemic rickets/osteomalachia：以 下 ADHRという） の研究において、 ADHR患者における変異遺伝子領域を絞り込み、 責任遺伝子の同定を進めるなかで、 ADHR患者の FGF23の遺伝子にミスセンス変異 が特徴的に見出された （非特許文献 3を参照）。 この発見により生体内における FGF23の生理的重要性が強く示唆された。一方、 FGF23の生物活性を決定づけたの は低リン血症性クル病、骨軟化症のひとつである腫瘍性骨軟化症の研究であった。 この疾患では、 疾患の責任腫瘍が液性の疾患惹起因子を分泌産生し、 この疾患惹 起因子の作用により低リン血症、骨軟化症等の病態に陥ることが考えられていた。 この責任腫瘍が産生する疾患惹起因子の探索において、 腫瘍に高発現する遺伝 子として FGF23がクロ一ニングされ、 さらにこの因子を投与することにより、 低 リン血症や骨軟化症が再現されることが示された （非特許文献 4及び特許文献 1 を参照）。 この研究により、 FGF23が生体内のリンやカルシウムに関連する代謝調 節に関わることが示されるとともに、 生体内を循環して作用を発現する全身性因 子として作用することが示唆された。 さらにその後の研究において、 実際に腫瘍 性骨軟化症患者血中の FGF23濃度が健常人に比較して高値であることも示された (非特許文献 5及び 6を参照）。
また、 ADHRや腫瘍性骨軟化症と臨床的所見において類似した様態を呈する疾患 として X染色体連鎖低ジン血症性クル病 （X - linked hypophosphatemic ricketsヽ 以下 XLHという） が知られているが、 この病態においても血中の FGF23濃度は高 値となっていることが示された （非特許文献 5及び 6を参照）。
すなわちこれまで原因不明であった腫瘍性骨軟化症、 XLH などで観察されるビ タミン D抵抗性クル病 ·骨軟化症の分泌性の疾患原因因子が FGF23であるという ことカ され 。 さらに、 fibrous dysplasia 、 McCune— Albright syndrome 常 染色体劣性低リン血症性クル病など他のミネラル代謝性疾患においても血中の FGF23 濃度の高値と低リン血症やクル病 ·骨軟化症との関係が報告されている (非特許文献 7〜 9を参照）。
以上の報告により、 生体内の FGF23過剰状態は低リン血症やそれに伴うクル病 •骨軟化症などを誘導することが示された。 さらに慢性腎不全高リン血症におい ても血清 FGF23の異常高値が報告されており、 過剰な FGF23が腎不全時における ミネラル代謝性疾患などの一部に関わっている可能性も示唆されている （非特許 文献 1 0及び 1 1を参照）。
これらの FGF23の過剰が原因となり誘導される疾患において、 FGF23作用の抑 制あるいは FGF23の除去が疾患の治療方法となりうることが考えられる。 これま でに、 FGF23の作用を抑制するものとして、 抗 FGF23マウスモノクローナル抗体 の報告がある （特許文献 2を参照）。 この報告において使用されている抗 FGF23 マウスモノク口ーナル抗体 2C3B及び 3C1Eは正常マゥスに投与すると内在性のマ ウス FGF23の機能を阻害し、 腎からのリン排泄を抑制し、 腎におけるビタミン D 代謝酵素の発現を変動させることにより、 結果的に血清中のリン濃度及び 1 α， 25-ジヒ ドロキシビタミン D (以下 1，25Dという） 濃度を上昇させることが示され ている。 さらに、 血清中の FGF23濃度が高値であり、 かつ低リン血症と骨の伸長 障害や石灰化障害を呈する XLHのモデルマウスである Hypマウスへの抗 FGF23マ ウスモノクローナル抗体の反復投与を行った結果、 Hyp マウスにおいて血中リン 濃度の上昇を認め、かつ骨の伸長障害と石灰化障害が改善された。この結果より、 FGF23過剰疾患に対する薬剤として、 FGF23作用抑制抗体の使用が適切であると考 えられた。 しかしながら本報告によって使用された 2C3Bや 3C1E抗体はマウス由 来の抗体である。 ヒ ト宿主によって外来物として認識されるマウス抗体は、 いわ ゆる 「ヒ ト抗マウス抗体」 すなわち 「HAMA」 応答を惹起し、 重篤な副作用を示す 場合がある （非特許文献 1 2を参照）。
このような問題を回避するためのアプローチのひとつとしてキメラ抗体が開発 された （特許文献 3及び 4を参照）。 キメラ抗体は、 2つ又はそれ以上の種由来の 抗体の一部 （マウス抗体の可変領域及びヒ ト抗体の定常領域など） を含む。 この ようなキメラ抗体の利点は元のマウス抗体の性質である抗原への結合性などの特 徴は保持することであるが、 一方で依然として 「ヒ ト抗キメラ抗体」 すなわち 「HACA」 応答を惹起する （非特許文献 1 3を参照）。
さらに、 置換された抗体の一部のみが相補性決定領域 （すなわち 「CDR」） であ る組換え抗体が開発された （特許文献 5及び 6を参照）。 CDR移植技術を使用して マウス CDR、 ヒ ト可変部フレームワーク及ぴ定常領域からなる抗体（すなわち「ヒ ト化抗体」） が産生されている （非特許文献 1 4を参照）。 このような方法を用い て、 マウス抗体をヒ ト抗体の配列に置換させることにより、 2C3B 抗体などの抗 FGF23 マウス抗体をヒ ト化することが知られている。 しかしながら、 ヒ ト化した 場合、 抗原へのァフィ二ティが下がるなどの可能性がある。
また、 XLHなどにおける低リン血症性クル病の現状の治療においてはビタミン D 製剤に加えリン酸を間歇的に経口投与する方法が主流であるが、 一回あたりの投 与量及び一日あたりの投与回数の多さから患者に対し多大な負担を強いる状況で あることも問題となっている。 そのため、 患者やその家族の負担を減らす意味で も、 投与間隔を延ばせるような持続性のある血清リン濃度、 血清 1, 25D濃度上昇 作用を示す低リン血症治療薬が望まれている。
特許文献 1 国際公開第 W002/14504号パンフレッ ト
特許文献 2 国際公開第 W003/057733号パンフレツト
特許文献 3 欧州特許出願公開第 120694号明細書
特許文献 4 欧州特許出願公開第 125023号明細書
特許文献 5 英国特許第 GB2188638A号明細書
特許文献 6 米国特許第 5585089号明細書
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非特許文献 6 Jonsson, Κ. Β·， et al. , N. Engl. J. Med.， 348 : 1656- 1663， 2003
非特許文献 7 Riminucci, M. et al. , J. Clin. Invest. , 112 : 683- 692， 2003 非特許文献 8 Yamamoto, T. et al.， J. Bone Miner. Metab. ，23 : 231 - 237,
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非特許文献 9 Lorenz-Depiereux, B. et al. , Nat. Genet. , 38 : 1248-1250，
2006
非特許文献 1 0 Gupta, A. et al.， J. Clin. Endocrinol. Metab. , 89 : 4489-4492, 2004
非特許文献 1 1 Larsson, T. et al. , Kidney Int. , 64： 2272-2279, 2003 非特許文献 1 2 Van Kroonenbergh, M. J. et al. , Nucl. Med. Commun. 9 : 919 - 930， 1988
非特許文献 1 3 Bruggemann, M. et al.， J. Exp. Med. , 170 : 2153 - 2157， 1989 非特許文献 1 4 Riechmann, L. et al. , Nature, 332 : 323—327, 1988 発明の開示
本発明の目的は、 FGF23に対するヒト抗体、 並びに該抗体を用いて FGF23の作 用を抑制することにより予防又は治療が可能な疾患に対するより副作用が少ない 予防又は治療剤などの医薬組成物を提供することにある。
さらに本発明の目的は、 低リン血症治療薬として用いることが出来る抗 FGF23 抗体であって、 既存の抗 FGF23抗体に比べ、 単回の投与で、 より血清リン濃度、 血清 1, 25D濃度の持続的な上昇作用を有する抗体並びに、 該抗体を用いて FGF23 が関連する疾患の予防又は治療剤などの医薬組成物を提供することにある。
現在の低リン血症性クル病の治療方法としてはビタミン D製剤と共にリン酸を 一日に数度、 間歇的に経口投与する方法が主流であるが、 一回あたりの投与量及 び一日あたりの投与回数の多さから患者に対し多大な負担を強いる状況であるこ とが問題となっている。 本発明において取得された抗 FGF23ヒ トモノクローナル 抗体、 C10抗体はより持続的な血中リン濃度上昇及び 1，25D上昇作用すなわち強 力な FGF23中和活性を有することを示している。 本研究における C10抗体の単回 の投与において、 血清リン濃度、 血清 1，25D濃度の持続的な上昇作用が観察され たことは、 低リン血症治療薬として現状の治療に比して、 C10 抗体は顕著な優位 性を有する治療である可能性が示唆された。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[1] ハイプリ ドーマ C10 (受託番号 FERMBP- 10772) が産生する抗体の重鎖可 変領域及び/または軽鎖可変領域を有する、ヒト FGF23に対する抗体又はその機能 的断片。
[2] ヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片であって、配列番号 1 2の 20 番目の Qから 136番目の Sで示される重鎖アミノ酸配列及び/又は配列番号 14の 23番目の A力 ら 128番目の Kで示される軽鎖アミノ酸配列を含む、 ヒ ト FGF23に 対する抗体又はその機能的断片。
[3] 重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むヒ ト FGF23 に 対する抗体又はその機能的断片であって、 重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番 号 1 2の 20番目の Qから 136番目の Sで示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が 配列番号 14の 23番目の Aから 128番目の Kで示されるヒ ト FGF23に対する抗体 又はその機能的断片。
[4] ハイプリ ドーマ C10 (受託番号 FERMBP- 10772)より産生されるヒ ト FGF23 に対する抗体又はその機能的断片。
[5] ハイプリ ドーマ C10 (受託番号 FERMBP- 10772) が産生する抗体が結合す るヒ ト FGF23上のェピトープの全部または一部に結合する抗体またはその機能的 断片。
[6] 上記 [3]の重鎖可変領域が、 配列番号 40のアミノ酸配列で示される相補 性決定領域 （complementarity determining region 、 CDR) 1、 配列番号 4 1のァ ミノ酸配列で示される CDR 2、およぴ配列番号 42のァミノ酸配列で示される CDR 3のいずれか又は全てを含むものであるヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的 断片。
[7] 上記 [3]の軽鎖可変領域が、配列番号 43のアミノ酸配列で示される CDR1、 配列番号 44のァミノ酸配列で示される CDR 2、 および配列番号 45のアミノ酸 配列で示される CDR3のいずれか又は全てを含むものであるヒ ト FGF23に対する 抗体又はその機能的断片。 [8] 重鎖可変領域が、 配列番号 40のアミノ酸配列で示される CDR1、 配列番号 41のァミノ酸配列で示される CDR 2、 およぴ配列番号 42のァミノ酸配列で示 される CDR 3のいずれか又は全てを含むものであり、 軽鎖可変領域が、 配列番号 43のアミノ酸配列で示される CDR1、 配列番号 44のアミノ酸配列で示される CDR2、および配列番号 45のアミノ酸配列で示される CDR3のいずれか又は全て を含むものであるヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片。
[9] 機能的断片が Fab、 Fab' 、. F(ab' )2、 ジスルフィ ド結合 Fv(dsFv) 、 二量 体化 V領域 （diabody)、 一本鎖 Fv (scFv) 及ぴ CDRからなる群から選択されるぺ プチド断片である [1]〜[8]のいずれかのヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能 的断片。
[10] [1]〜[8]のいずれかのヒト FGF23に対する抗体又はその機能的断片で あって、 その重鎖及び/又は軽鎖のアミノ酸配列において、 1又は数個のアミノ酸 が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び/又は軽鎖を含む ヒト FGF23に対する抗体又はその機能的断片。
[1 1] 抗体のクラスが IgG、 IgA、 IgE又は IgMである [1]〜[： L 0]のいずれか のヒト FGF23に対する抗体。
[1 2] 抗体のサブクラスが IgGl、 IgG2、 IgG3 又は IgG4 である [1 1]のヒ ト FGF23に対する抗体。
[1 3] [1]〜[1 2]のいずれかのヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片 を有効成分として含む、 医薬組成物。
[14] [1]〜[1 2]のいずれかのヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片 を有効成分として含む、 FGF23のリン代謝及び/又はビタミン D代謝を調節し得る 医薬組成物。 ·
[1 5] [1]〜[1 2]のいずれかのヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片 を有効成分として含む、 ミネラル代謝異常を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成 物。
[1 6] ミネラル代謝異常を伴う疾患が、 腫瘍性骨軟化症、 ADHR、 XLH fibrous dysplasia 、 McCune-Albright syndrome及び常染色体劣性低リン血症からなる群 から選択される、 [1 5]の医薬組成物。 [1 7] [1：]〜 [1 2]のいずれかのヒト FGF23に対する抗体又はその機能的断片 を有効成分として含む、 骨粗鬆症、 クル病、 髙カルシウム血症、 低カルシウム血 症、 異所性石灰化、 骨硬化症、 パジェット病、 副甲状腺機能亢進症、 副甲状腺機 能低下症及ぴ搔痒からなる群から選択される疾患の予防又は治療用医薬組成物。
[1 8] ハイプリ ドーマ C10 (受託番号 FERM BP- 10772)。
[1 9] 配列番号 1 1に示される塩基配列の 58番目の Cから 408番目の Aで示さ れる塩基配列にコードされる重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸。
[20] 配列番号 1 3に示される塩基配列の 67番目の Gから 384番目の Aで示さ れる塩基配列にコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸。
[2 1] [1 9]又は [20]の核酸を含むベクター。
[22] [2 1]のベクターを含む宿主細胞。
[23] [2 2]の宿主細胞を培養し、 ヒト FGF23に対する抗体又はその機能的断 片を発現させる工程を含む、 ヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片の製造 方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-34018 号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 C10発現ベクターの構築過程を模式的に表した図である。
図 2は、 N5KGし C10_LHにおける抗体遺伝子重鎖の塩基配列 （配列番号 30) 及 びアミノ酸配列 （配列番号 3 1) を示す。 図中、 四角で囲ったアミノ酸配列は分 泌シグナル配列 （リーダー配列） を示す。
図 3は、 N5KG1_C10_LHにおける抗体遺伝子軽鎖の塩基配列 （配列番号 32) 及 ぴアミノ酸配列 （配列番号 3 3) を示す。 図中、 四角で囲ったアミノ酸配列は分 泌シグナル配列 （リーダー配列） を示す。
図 4は、 C10発現ベクターの構造を示した図である。
図 5Aは、精製した全長ヒ ト FGF23蛋白質を 2C3B抗体若しくは C10抗体を固相 抗体とし、 3C1E抗体を検出抗体としたサンドィツチ ELISAで検出した測定結果を 表した図である。 図 5 Bは、力二クイザル FGF23発現細胞上清を 2CSB抗体若しくは C10抗体を固 相抗体とし、 3C1E抗体を検出抗体としたサンドィツチ ELISAで検出した測定結果 を表した図である。
図 6は、 媒体、 2C3B抗体又は C10抗体を投与した力二クイザルの血清リン濃度 を経時的に測定したグラフである。 測定値は平均値 +/ -標準誤差で示した。 また Student ' s t - test を用いて同日時の媒体投与群と有意差検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 05) が観察された測定値に関しては、 グラフ上に *を付加した。 図 7は、 媒体投与 5日目の力二クイザルの血清リン濃度を基準とした、 2C3B抗 体又は C10抗体の投与後 5日目のカュクイザルの血清リン濃度の上昇値を示した グラフである。
図 8は、 媒体、 2C3B抗体又は C10抗体を投与した力-クイザルの血清 1，25D濃 度を経時的に測定したグラフである。測定値は平均値 +/ -標準誤差で示した。また Student ' s t - test を用いて同日時の媒体投与群と有意差検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 05) が観察された測定値に関しては、 グラフ上に *を付加した。 図 9は、 強制発現していない細胞の培養上清（コントロール）、 ヒト及ぴカニク ィザル FGF23発現細胞培養上清を C15抗体を用いてウェスタンプロット法により 検出した写真である。
図 1 0は、 pPSs FGF23ベクターの構造を示した図である。
図 1 1は、 pUS FGF23 KIベクターの構造を示した図である。
図 1 2は、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo がターグティングされたァレル構造、 ヒ ト FGF23 (- SP) +薬剤耐性遺伝子 （loxpv- puror) が pUS hFGF23 KIベクター を用いてターゲテイングされたアレル構造、 薬剤耐性遺伝子 （loxp- neo^ loxpv-puror) が除去されたァレル構造及ぴサザン解析用プロ一ブの位置を示す。 図中に記載された用語の詳細な説明は以下の通り。
hFGF23 (-SP) ：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒ ト FGF23遺伝子、
C K ：マウス Ig κ遺伝子定常領域、 loxpv-puro： ΙοχΡ酉己列の一部 mutant配列であ る loxPV 配列をその両端に持つピューロマイシン耐个生遺伝子、 loxp- neor： ΙοχΡ 配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、 Ck3， probe： hFGF23 (-SP)
+loxpv- puror遺伝子導入及び loxpv-puro 遺伝子除去クローン選別用サザンブロ ット解析プロ一プ、 3 ' ΚΟ-probe： loxp- neo^遺伝子導入及ぴ除去クローン選別用 サザンブロット解析プローブ、 E： EcoRI制限酵素サイ ト。
図 1 3は、 コントロール抗体又は C10抗体投与 7日前の血清 FGF23濃度を示し たグラフである。 測定値は平均値 +/-標準誤差で示した。 また Student ' s t - testを用いて WTマウス群と有意差検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 001) が 観察された群に関しては、 グラフ上に ***を付加した。
図 1 4は、 コント口ール抗体又は C10抗体投与 7日前及ぴ初回投与 3日後の血 清リン濃度を示したグラフである。測定値は平均値 +/ -標準誤差で示した。また同 一日内で Student ' s t - testを用いて WTマウス群と有意差検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 001) が観察された群に関しては、 グラフ上に ***を付加した。 さ らに、同一日内で hFGF23KIマウスコント口ール抗体投与群と有意差検定を行つた 結果、 有意な差 （pく 0. 001) が観察された hFGF23KIマウス C10抗体投与群に関し ては、 グラフ上に ###を付加した。
図 1 5は、 コント口ール抗体又は C10抗体の 5回目投与 1 日後の血清リン濃度 を示したグラフである。 測定値は平均値 +/ -標準誤差で示した。 また Student ' s t - testを用いて WTマウス群と有意差検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 001) が観察された群に関しては、 グラフ上に ***を付加した。 さらに、 hFGF23KI マウ スコントロール抗体投与群と有意差検定を行った結果、 有意な差（pく 0. 001) が観 察された hFGF23KIマウス C10抗体投与群に関しては、グラフ上に を付加した。 図 1 6は、 コントロール抗体又は C10抗体の 4回目投与 1 日後の握力を示した グラフである。 測定値は平均値 +/-標準誤差で示した。 また Student ' s t -test を用いて WTマウス群と有意差検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 001) が観察さ れた群に関しては、 グラフ上に ***を付加した。 さらに、 hFGF23KI マウスコント ロール抗体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（pく 0. 001) が観察された hFGF23KIマウス C10抗体投与群に関しては、 グラフ上に を付加した。
図 1 7は、 コント口ール抗体又は C10抗体の 5回目投与 1 日後に解剖し採取し たマウスの大腿骨を Villanueva- Goldner 法で組織染色した像を示した写真であ る。
図 1 8は、 コントロール抗体又は C10抗体の 5回目投与 1 日後に解剖し採取し た脛骨の乾燥重量に対する灰重量の割合を示したグラフである。 測定値は平均値
+/ -標準誤差で示した。 また Student ' s t -testを用いて WTマウス群と有意差 検定を行った結果、 有意な差 （pく 0. 001) が観察された群に関しては、 グラフ上に ***を付加した。 さらに、 hFGF23KI マウスコントロール抗体投与群と有意差検定 を行った結果、 有意な差 （pく 0. 001) が観察された hFGF23KIマウス C10抗体投与 群に関しては、 グラフ上に を付加した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、 本発明を詳細に 説明する。
I. 本発明の抗体
1 . 抗 FGF23抗体及びその機能的断片
本発明の抗体は、 線維芽細胞増殖因子 （FGF) フアミリーのひとつである FGF23 に対する抗体である。
本発明における 「FGF23に対する抗体」 とは、 FGF23若しくはその一部と結合す る抗体、 FGF23若しくはその一部と反応性を有する抗体、 又は FGF23若しくはそ の一部を認識する抗体である。 FGF23に対する抗体を抗 FGF23抗体と呼ぶことも ある。 本発明において、 抗体とは、 ィムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及 び重鎖定常領域、 並びに軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む全ての領域が、 ィ ムノグロプリンをコ一ドする遺伝子に由来するィムノグロプリンである。抗体は、 好ましくはモノクローナル抗体である。 ここで、 FGF23 の一部とは、 配列番号 4 で表わされる FGF23の全長アミノ酸配列の一部アミノ酸配列であって、 連続した アミノ酸配列からなる FGF23の断片ペプチドをいう。 好ましくは配列番号 1 2の
20番目の Qから 136番目の Sからなるァミノ酸配列、 及び/又は配列番号 1 4の
23番目の Aから 128番目の Kからなるァミノ酸配列を含む抗体であり、 さらに好 ましくは、 ハイプリ ドーマ C10が産生する抗体である。 配列番号 1 2は FGF23に 対する抗体の重鎖可変領域のリーダー配列を含むァミノ酸配列であり、 配列番号
1 2の 20番目の Qから 136番目の Sからなるァミノ酸配列は、リーダー配列部分 を除いた成熟体部分のアミノ酸配列である。 また、 配列番号 1 4は FGF23に対す る抗体の軽鎖可変領域のリーダー配列を含むァミノ酸配列であり、 配列番号 14 の 23番目の Aから 128番目の Kからなるアミノ酸配列は、リーダー配列部分を除 いた成熟体部分のアミノ酸配列である。 抗体のクラスとしてはィムノグロプリン G (IgG) , 同 A (IgA)、 同 E(IgE)及ぴ同 M (IgM) が用いられるが、 好ましくは IgG である。 更に IgGのサブクラスとしては、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4が用いられ るが、 好ましくは IgGl、 02及び^04でぁり、 更に好ましくは IgGlである。 本願発明の抗体には、 新規な相補性決定領域 （complementarity determining region, CDR) アミノ酸配列を含有する抗 FGF23抗体又も包含される。
抗体の可変領域内には CDRが存在し、 この部分が抗原認識の特異性を担ってい る。 可変領域の CD R以外の部分は、 CDRの構造を保持する役割を有し、 フレ ームワーク領域 （FR) と呼ばれる。 重鎖おょぴ軽鎖の C末端側には定常領域が 存在し、 それぞれ重鎖定常領域 （CH)、 軽鎖定常領域 （CL) と呼ばれる。 重鎖可変領域中には、 第 1の相補性決定領域（CDR 1)、第 2の相補性決定領 域 （CDR 2) および第 3の相補性決定領域 （CDR 3) の 3つの相補性決定領 域が存在する。 重鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決 定領域と呼ぶ。 軽鎖可変領域中にも同様に、 第 1の相補性決定領域 （CDR 1)、 第 2の相補性決定領域 （CDR 2) および第 3の相補性決定領域 （CDR3) の 3つの相補性決定領域が存在する。 軽鎖可変領域中の 3つの相補性決定領域をま とめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。 これらの CDRはシーケンシズ.ォプ .プロテ インズ - ォブ · ィムノ ロジカノレ · インタレス 卜（Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. He alth and Human Services, (1991)などを 用いて決定することができる。
本願発明の抗体として、 好ましくは、 重鎖相補性決定領域として、 CDR1が配列 番号 40、 CDR2が配列番号 41、 CDR3が配列番号 42の少なくともいずれか一つ 若しくは全てを有するものである。 また、 軽鎖相補性決定領域として、 CDR1が配 列番号 4 3、 CDR2が配列番号 44、 CDR3が配列番号 45の少なくともいずれか一 つ若しくは全てを有するものである。 より好ましくは、 重鎖相補性決定領域とし て、 CDR1が配列番号 40、 CDR2が配列番号 4 1、 CDR3が配列番号 42を有し、 軽鎖相補性決定領域として、 CDR1 が配列番号 43、 CDR2 が配列番号 44、 CDR3 が配列番号 4 5を有する FGF23に結合する抗体である
本発明の抗体の C D R配列は必ずしも限定されないが、 好ましくは配列番号 4 0から 4 5に示される CDR配列のうち、 いずれか 1つ以上、 好ましくは重鎖の 3 つ、 より好ましくは 6つの C D Rを含有する抗体である。 C D R以外のアミノ酸 配列は特に限定されず、 C D R以外のアミノ酸配列が他の抗体、 特に、 他種の抗 体由来である、 いわゆる C D R移植抗体が本発明の抗体に包含される。 この内、 C D R以外のアミノ酸配列がヒ ト由来であるヒ ト化抗体又はヒ ト抗体が好まし く、 必要に応じて F Rに 1ないし数個のアミノ酸残基の付加、 欠失、 置換及ぴ Z または挿入を伴っていてもよい。 ヒト化抗体又はヒ ト抗体の作製方法は公知の方 法を用いることができる。
「機能的断片」 とは、 抗体の一部分 （部分断片） であって、 抗体の抗原への作 用を 1つ以上保持するもの、 すなわち抗原への結合能、 抗原への反応性又は抗原 の認識能を保持したものを意味し、 Fv、 ジスルフィ ド結合 Fv (dsFv)、 一本鎖 Fv
(scFv)、及びこれらの重合体等が挙げられる。具体的には Fab、 Fab ' 、F (ab， ) 2、 scFv、 diabody、 dsFv 及ぴ CDR を含むペプチドなどがあげられる [D. J. King.， Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.， 1998 T. J. International Ltd] D
Fabは、 FGF23と結合する抗体を蛋白質分解酵素パパィンで処理して得られる断 片のうち、 重鎖 （H鎖） のァミノ末端側約半分と軽鎖 （L鎖） 全体がジスルフィ ド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fabは、 FGF23 と結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して 得ることができる。 又は、 該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現べク ターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該ベクターを原核生物あるいは 真核生物へ導入することにより発現させ、 Fabを製造することができる。
F (ab ' ) 2は、 IgG を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、 Fab がヒンジ領域のジスルフイ ド結合を介して結合されたものより大きい、 分子 量約 10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の F (ab' ) 2は、本発明の FGF23と結合する抗体を蛋白質分解酵素ぺプシ ンで処理して得ることができる。 又は、 下記の Fab.， をチォエーテル結合あるい はジスルフィ ド結合させ、 作製することができる。
Fab' は、 上記 F (ab， ）2のヒンジ領域のジスルフィ ド結合を切断した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fab' は、 本発明の FGF23に結合する F (ab ' ) 2を還元剤ジチオスレィ トール処理して得ることができる。 又は、 該抗体の Fab' 断片をコードする DNA を原核生物用発現べクタ一あるいは真核生物用発現べクタ一に揷入し、 該ベクタ 一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 Fab' を製造する ことができる。
scFvは、 1本の重鎖可変領域（以下、 VHと表記する） と 1本の軽鎖可変領域（以 下、 VLと表記する） とを適当なペプチドリンカ一 （以下、 Pと表記する） を用い て連結した、 VH- P-VL又は VL-P- VHポリぺプチドで、 抗原結合活性を有する抗体 断片である。 ·
本発明の scFvは、 本発明の FGF23 と結合する抗体の VH及ぴ VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現べクタ 一あるいは真核生物用発現べクタ一に揷入し、 該発現べクタ一を原核生物あるい は真核生物へ導入することにより発現させ、 scFvを製造することができる。 diabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片で、 二価の抗原結合活性を有する抗 体断片である。 二価の抗原結合活性は、 同一であることもできるし、 一方を異な る抗原結合活性とすることもできる。
本発明の diabodyは、 本発明の FGF23と結合する抗体の VH及ぴ VLをコードす る cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAをぺプチドリンカーのアミノ酸配列の 長さ力 S 8残基以下となるように構築し、 該 DNAを原核生物用発現べクターあるい は真核生物用発現べクタ一に揷入し、 該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生 物へ導入することにより発現させ、 diabodyを製造することができる。
dsFvは、 VH及び VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換した ポリべプチドを該システィン残基間のジスルフィ ド結合を介して結合させたもの をいう。システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 (Protein Engineering, 7 : 697-704, 1994) に従って、 抗体の立体構造予測に基づ いて選択することができる。 本発明の dsFvは、 本発明の FGF23 と結合する抗体の VH及び VLをコードする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現べクタ 一あるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、 該発現ベクターを原核生物あるい は真核生物へ導入することにより発現させ、 dsFvを製造することができる。
CDRを含むぺプチドは、 VH又は VLの CDRの少なく とも 1領域以上を含んで構成 される。 複数の CDRを含むペプチドは、 直接又は適当なペプチドリンカ一を介し て結合させることができる。
本発明の CDRを含むぺプチドは、 本発明の FGF23 と結合する抗体の VH及び VL の CDRをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真 核生物用発現ベクターに揷入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ 導入することにより発現させ、 CDRを含むぺプチドを製造することができる。 また、 CDRを含むぺプチドは、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカルボニル 法）、 tBoc法 ( t -ブチルォキシカルボニル法) などの化学合成法によって製造す ることもできる。
さらに、 「機能的断片」 は、 抗体の断片であって抗原（FGF23)と結合しうる断片 である。 好ましくは 「機能的断片」 が配列番号 1 2の 20番目の Qから 136番目の Sからなるァミノ酸配列、及び/又は配列番号 1 4の 23番目の Aから 128番目の K からなるアミノ酸配列を含む FGF23と結合しうる断片である。 好ましくは 「機能 的断片」 が配列番号 4 0から 4 5に示される C D Rの少なくとも一つ又は全てを 有し F G F 2 3と結合しうる断片である。 さらに好ましくは 「機能的断片」 がハ イブリ ドーマ C10が産生する抗体の可変領域由来のものであって、 FGF23 と結合 しうる断片である。
本発明の抗体は、 本発明の FGF23に対する抗体又は抗体の機能的断片に放射性 同位元素、 低分子の薬剤、 高分子の薬剤、 蛋白質などを化学的あるいは遺伝子ェ 学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、 本発明の FGF23に対する抗体若しくは抗体の機能的 断片の H鎖 （重鎖） あるいは L鎖 （軽鎖） のァミノ末端側あるいはカルボキシ末 端側、 抗体若しくは抗体の機能的断片中の適当な置換基又は側鎖、 さらには抗体 又は抗体の機能的断片中の糖鎖などに放射性同位元素、 低分子の薬剤、 高分子の 薬剤、 蛋白質などを化学的手法 （抗体工学入門、 金光修著、 地人書館、 1994) 等 により結合させることにより製造することができる。
また、 蛋白質を結合させた抗体の誘導体は、 本発明の FGF23に対する抗体及ぴ 抗体の機能的断片をコードする DNAと、 結合させたい蛋白質をコードする DNAを 連結させて発現用ベクターに揷入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、 発現させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、 1311、 1251などがあげられ、 例えば、 クロラミン T法 などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、 ナイ トロジェン 'マスタード、 サイクロフォスファミ ドなどのアルキ^^化剤、 5—フルォロゥラシル、 メソトレキセ一トなどの代謝拮 抗剤、 ダウノマイシン、 ブレオマイシン、 マイ トマイシン C、 ダウノルビシン、 ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシン のような植物ァノレカロイ ド、 タモキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤 等の抗癌剤 （臨床腫瘍学、 日本臨床腫瘍研究会編、 癌と化学療法社、 1996) ；ハイ ドロコーチゾン、 プレドニゾンなどのステロイド剤、 ァスピリン、 インドメタシ ンなどの非ステロイ ド剤、 金チォマレート、 ぺニシラミン等の免疫調節剤；サイ クロフォスフアミ ド、 ァザチォプリン等の免疫抑制剤；マレイン酸クロルフエ二 ラミン、 クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤 （炎症と抗炎症療 法、 医歯薬出版株式会社、 1982) 等があげられる。 これらの低分子の薬剤と抗体 の結合は公知の方法により行なうことができる。 例えば、 ダウノマイシンと抗体 を結合させる方法としては、 ダルタールアルデヒ ドを介してダウノマイシンと抗 体のアミノ基間を結合させる方法、 水溶性カルポジイミ ドを介してダウノマイシ ンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。 これ らの低分子の薬剤を抗体に結合させることにより、 低分子薬剤が有する機能を有 する抗体の誘導体が得られる。
高分子の薬剤としては、 ポリエチレングリコール （以下、 PEGと表記する）、 ァ ノレブミン、デキス トラン、ポリォキシエチレン、スチレンマレイン酸コボリマー、 ポリ ビュルピロ リ ドン、 ピランコポリマー、 ヒ ドロキシプロピノレメタク リルァミ ドなどがあげられる。 これらの高分子化合物を抗体又は抗体の機能的断片に結合 させることにより、 （1 )化学的、 物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安 定性の向上、 （2 ) 血中半減期の顕著な延長、 （3 ) 免疫原性の消失、 抗体産生の 抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、 1993)。 例えば、 PEGと抗体を結合させる方法としては、 PEG化修飾試薬と反応させる方法 などがあげられる (バイオコンジュゲート医薬品、 廣川書店、 1993)。 PEG化修筚 試薬としては、 リジンの ε—ァミノ基の修飾剤 （特昭 61-178926号公報）、 ァス パラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭 56-23587号公報）、 アルギニンのグァニジノ基の修飾剤 （特平 2-117920号公報） などがあげられる。 蛋白質と結合した抗体は、 融合抗体として得ることができる。 すなわち、 抗体 又は抗体の機能的断片をコードする cDNAに特定の蛋白質をコードする cDNAを連 結させ、 特定の蛋白質と抗体との融合蛋白質をコードする DNAを構築し、 該 DNA を原核生物あるいは真核生物用発現べクターに揷入し、 該発現べクターを原核生 物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 前記特定の蛋白質と結合し た融合抗体を製造することができる。
本発明の FGF23 に対する抗体又は抗体の機能的断片について、 ELISA (Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988； Monoclonal Antibodies Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996)等の免疫学的手法により、あるいはバイオセンサービアコアで測定 される結合解離定数 (Journal of Immunological Methods, 145： 229-240， 1991)、 及ぴ klotho 発現細胞を用いたヒ ト FGF23 刺激による Early growth response gene_lのプロモーター活性化に対する阻害活性 （Nature, 444 : 770-774， 2006) な どを測定することにより、 ヒト FGF23に対する結合活性、 ヒ ト FGF23の機能を阻 害する活性を評価することができる。
本発明で 「ヒ ト抗体」 とは、 ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意 味する。 ヒト抗体は、 後述のようにヒ ト抗体遺伝子座を導入し、 ヒト由来抗体を 産生する能力を有するトランスジエニック動物に抗原を投与することにより得る ことができる。 該トランスジエニック動物としてマウスが挙げられ、 ヒ ト抗体を 産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第 W002/43478号パンフレツト に記載されている。 JP2008/052918 本発明の抗体としては、 例えば、 後述の実施例に記載される、 C10 ハイプリ ド 一マにより産生される抗体（C10抗体） を挙げることができる。 C10ハイプリ ドー マは、 2007年 2月 2日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンター （日本国 茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1'中央第 6 ) に受託番号 FERM BP - 10772 (識別のための表示： C10) としてプタぺスト条約に基づき国際寄託され ている。
本発明の抗体又は機能的断片には、 抗体又は機能的断片を構成する重鎖及び/ 又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において、 1 又は数個のアミノ酸が欠失、 置換若 しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖及び/又は軽鎖を含むモノクローナ ル抗体又はその機能的断片も包含される。 ここで、 「 1又は数個」 の 「数個」 とは 9個以下、 好ましくは 5個以下、 さらに好ましくは 3個以下、 特に好ましくは 2 個である。 前記のようなアミノ酸の部分的改変 （欠失、 置換、 挿入、 付加） は、 そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより本発明の 抗体又は機能的断片のアミノ酸配列中に導入することができる。 この塩基配列の 部分的改変は、 既知の部位特異的変異導入法 （site specific mutagenesis) を用 いて定法により導入することができる [Proc Natl Acad Sci USA. , 81： 5662-5666, 1984] o本発明の抗体は、いずれのィムノグロブリンクラス及ぴアイソタイプを有 する抗体をも包含する。
本発明の FGF23に対する抗体は、 下記のような製造方法によって製造すること ができる。 すなわち、 例えば、 FGF23、 その一部又はその一部と抗原の抗原性を高 めるための適当なキャリア物質 （例えば、 牛血清アルブミン等） との結合物を、 必要に応じて免疫賦活剤 （フロインドの完全又は不完全アジュバント等） ととも に、 ヒ ト抗体産生トランスジヱユックマウスなどの非ヒト哺乳動物に免疫する。 FGF23は、 天然の FGF23もリコンビナント FGF23も用いることもできる。 あるい は、 FGF23をコードする遺伝子を発現ベクターに導入し、 動物内で FGF23蛋白質 を発現させることによって免疫感作を行うこともできる。モノクローナル抗体は、 免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、 自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞 （ミ エローマ細胞） を融合することにより得られるハイプリ ドーマを培養し、 免疫に 用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローン を選択することによって取得することができる。
本発明の抗体は、 当業者に周知である遺伝子工学的改変 (例えば、 欧州特許
EP314161号公報を参照のこと） により異なるサブクラスのものに変換されたもの も包含する。 すなわち、 本発明の抗体の可変領域をコードする DNAを用いて遺伝 子工学的手法を用いて元のサブクラスとは異なるサブクラスの抗体を得ることが できる。
2 . 本発明の抗体の製造
モノクローナル抗体の製造は、 下記の工程を包含する。 すなわち、 （1) 免疫原 として使用する抗原蛋白質若しくは抗原蛋白質発現ベクターの調製、 （2) 抗原を 動物体内に注入し、若しくは抗原を動物体内で発現させることにより免疫した後、 血液を採取しその抗体価を検定して脾臓等の摘出の時期を決定してから、 抗体産 生細胞を調製する工程、 （3) 骨髄腫細胞 （ミエローマ） の調製、 （4) 抗体産生細 胞とミエローマとの細胞融合、 （5) 目的とする抗体を産生するハイブリ ド一マ群 の選別、 （6) 単一細胞クローンへの分割 （クローニング）、 (7) 場合によっては、 モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイプリ ドーマの培養、 又はハイブ リ ドーマを移植した動物の飼育、 そして （8) このようにして製造されたモノクロ ーナル抗体の生理活性及びその認識特異性の検定、 又は標識試薬としての特性の 検定、 等である。
以下、 抗 FGF23モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、 該抗体の作製法はこれに制限されず、 例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及ぴミエ ローマを使用することもできる。
(1) 抗原の精製
抗原としては、 遺伝子組換え技術を用いて FGF23をコードする DNA配列を好適 な発現プラスミ ドに組み込み、 大腸菌や動物細胞等の宿主内外で生産したのち精 製した FGF23蛋白質を使用できる。 ヒ ト FGF23の蛋白質の一次構造は公知である [GenBank accession No. AAG09917、 配列番号 4 ] ので、 当業者に周知の方法に より、 FGF23 のアミノ酸配列から部分ペプチドを化学合成し、 これを抗原として 使用することもできる。
(2) 抗体産生細胞の調製工程 (1) で得られた抗原と、 フロインドの完全若しくは不完全アジュバント、 又は カリミヨウバンのような助剤とを混合し、 免疫原として実験動物に免疫する。 実 験動物としては、 ヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジエニックマ ウスが最も好適に用いられるが、そのようなマウスは富塚らの文献 [Tomizuka. et al. , Proc Natl Acad Sci USA. , 97 : 722 - 727， 2000] に記載されている。 ' マウス免疫の際の免疫原投与法は、 皮下注射、 腹腔内注射、 静脈内注射、 皮内 注射、 筋肉内注射、 足躕注射などいずれでもよいが、 腹腔内注射、 足摭注射又は 静脈内注射が好ましい。
免疫は、 一回、 又は、 適当な間隔で複数回繰返し行えばよい。 その後、 免疫し た動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、 抗体価が十分高くなつた動物を 抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。 一般的には、最終免疫後 3〜5日後の動物由来の抗体産生細胞を、後の細胞融合に 用いることが好ましい。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下、 「RIA法」 という）、 固相酵素免疫定量法 （以下、 「ELISA法」 という）、 蛍光抗体 法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、 正確性、 及び操作の自動化の可能性などの観点から、 RIA法又は ELISA法がより 好適である。
本発明における抗体価の測定は、 例えば ELISA法によれば、 以下に記載するよ うな手順により行うことができる。 まず、 ヒ ト抗体に対する抗原を ELISA 用 96 穴プレート等の固相表面に吸着させ、 さらに抗原が吸着していない固相表面を抗 原と無関係な蛋白質、 例えばゥシ血淸アルブミン (BSA) により覆い、 該表面を洗 浄後、 一次抗体として段階希釈した試料 （例えばヒ ト由来の抗体を産生する能力 を有するトランスジヱニックマウスの血清） に接触させ、 上記抗原に試料中の抗 FGF23 抗体を結合させる。 さらに二次抗体として酵素標識されたヒト抗体に対す る抗体を加えて. ト抗体に結合させ、 洗浄後該酵素の基質を加え、 基質分解に基 づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、 抗体価を算出する。
(3) ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギ又は ヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができる力 s、 一般的にはマウスから得られた株化細胞、 例えば 8-ァザグァニン耐性マウス (BALBん由来） ミエローマ株 P3X63Ag8U. 1 (P3- Ul) [Yelton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81 : 1—7， 1978]、 P3/NSI/1— Ag4— 1 (NS— 1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6 : 51ト 519, 1976]、 Sp2/0-Agl4 (SP2/0) [Shulman, M. et al. Nature, 276 : 269- 270， 1978]、 P3X63Ag8. 653 (653) [Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123 : 1548—1550, 1979]、 P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256： 495-497, 1975] などを用いる ことが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば 8-ァザグァ-ン培地 [グ ルタミン、 2-メルカプトエタノール、 ゲンタマィシン及びゥシ胎児血清 (以下、 ゥシ胎児血清を 「FCS」 という） を加えた RPMI - 1640培地にさらに 8 -ァザグァニ ンを加えた培地]、 イスコフ改変ダルベッコ培地 （Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium；以下、 「IMDM」 という）、 又はダルベッコ改変ィーグノレ培地 (Dulbecco' s Modified Eagle Medium；以下、 「DMEM」 という） で継代培養するが、 細胞融合の 3〜4日前に正常培地 （例えば、 10% FCSを含む DMEM培地） で継代培養し、 融合 当日に 2 X 107以上の細胞数を確保しておく。
(4) 細胞融合
抗体産生細胞は、 形質細胞、 及ぴその前駆細胞であるリンパ球であり、 これは 個体のいずれの部位から得てもよく、 一般には脾臓、 リンパ節、 骨髄、 扁桃、 末 梢血、 又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、 脾細胞が 最も一般的に用いられる。
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、 例えば脾臓を摘出し、 抗体産生細胞である脾細胞を調製する。 次いで、 脾細胞と ミエローマを融合させればよい。 この脾細胞と工程（3) で得られたミエローマを 融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、 細胞毒性が比較的少 なく融合操作も簡単な、 ポリエチレングリコールを用いる方法である。 この方法 は、 例えば以下の手順よりなる。
脾細胞とミエローマとを無血清培地 （例えば、 DMEM)、又はリン酸緩衝生理食塩 液 （以下、 「PBS」 とレ、う） でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が 5 : 1 〜10 : 1程度になるように混合し、 遠心分離する。 上清を除去し、 沈澱した細胞群 をよくほぐした後、撹拌しながら lmLの 50% (w/v) ポリエチレングリコール（分 子量 1000〜4000) を含む無血清培地を滴下する。 その後、 lOmLの無血清培地をゆ つくりと加えた後遠心分離する。 再び上清を捨て、 沈澱した細胞を適量のヒポキ サンチン 'アミノプテリン 'チミジン （以下 「HAT」 とレヽう） 液及ぴヒ トインター ロイキン - 6 (以下、 「IL- 6」 という） を含む正常培地 （以下、 「HAT培地」 という） 中に懸濁して培養用プレート （以下、 「プレート」 とレ、う） の各ゥエルに分注し、 5%炭酸ガス存在下、 37°Cで 2週間程度培養する。 途中適宜 HAT培地を補う。
(5) ハイプリ ドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、 8-ァザグァニン耐性株である場合、 すなわち、 ヒポキ サンチン ·グァニン ·ホスホリポシルトランスフェラーゼ (HGPRT) 欠損株である 場合、 融合しなかった該ミエローマ細胞、 及びミエローマ細胞どうしの融合細胞 は、 HAT 含有培地中では生存できない。 一方、 抗体産生細胞どうしの融合細胞、 あるいは、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイプリ ドーマは生存することが できるが、 抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。 従って、 HAT含有培 地中での培養を続けることによって、 抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細 胞であるハイプリ ドーマのみが生き残り、 結果的にハイプリ ドーマを選択するこ とができる。
コロニー状に生育してきたハイブリ ドーマについて、 HAT 培地からァミノプテ リンを除いた培地 (以下、 「HT培地」 とレ、う） への培地交換を行う。 以後、 培養 上清の一部を採取し、 例えば、 ELISA法により抗 FGF23抗体価を測定する。
以上、 8-ァザグァニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、 その他の細胞 株もハイプリ ドーマの選択方法に応じて使用することができ、 その場合使用する 培地組成も変化する。
(6) クローニング工程
(2) の抗体価測定方法と同様の方法で抗体価を測定することにより、 特異的抗 体を産生することが判明したハイプリ ドーマを、 別のプレートに移しクローニン グを行う。 このクローニング法としては、 プレートの 1ゥエルに 1個のハイプリ ドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、 軟寒天培地中で培養しコ ロニーを回収する軟寒天法、 マイクロマニュピレーターによって 1個ずつの細胞 を取り出し培養する方法、 セルソーターによって 1個の細胞を分離する 「ソータ クローン」 などが挙げられるが、 限界希釈法が簡便であり、 よく用いられる。 抗体価の認められたゥヱルについて、 例えば限界希釈法によるクローニングを
2〜4回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗 FGF23モノクローナル抗体 産生ハイプリ ドーマ株として選択する。
(7) ハイプリ ドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリ ドーマは、培地を HT培地から正常培地に換え て培養する。 大量培養は、 大型培養瓶を用いた回転培養、 スピナ一培養、 あるい はホローフアイバーシステム等を用レ、た培養で行われる。 この大量培養における 上清を、ゲルろ過等、 当業者に周知の方法を用いて精製することにより、抗 FGF23 モノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス （例えば BALBん） 若しくは nu/nuマウス、 ラット、 モルモット、 ハムスター又はゥサギ等の腹腔内 で該ハイブリ ドーマを増殖させることにより、 抗 FGF23モノクローナル抗体を大 量に含む腹水を得ることができる。 精製の簡便な方法としては、 市販のモノクロ, ーナル抗体精製キット (例えば、 MAbTrap GIIキット ； GEヘルスケア バイオサ ィエンス社） 等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、 FGF23 に対して高い抗原特異性を有 する。
又はハイプリ ドーマ等の抗体産生細胞からヒ トモノクローナル抗体をコードす る遺伝子をクローユングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主 （例えば 哺乳類細胞細胞株、 大腸菌、 酵母細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など） に導入し、 遺 伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を調製することもできる
(Delves, P. J. , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. , 1997 WILEY, Shepherd, P. and Dean C. , Monoclonal Antibodies. , 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Goding, J. W. , Monoclonal Antibodies : principles and practice. , 1993 ACADEMIC PRESS)。
本発明は、 本発明の抗体を産生するハイプリ ドーマが保有する抗体の遺伝子配 列を含む核酸、 特に後述の本発明のハイプリ ドーマの産生する抗体の重鎖可変領 域及び軽鎖可変領域の核酸も包含する。 ここで、 核酸には DNA及び RNAが含まれ る。 さらに、 本発明は上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の核酸からシグナル配 列をコードする領域を除いた成熟体部分の核酸も包含する。 また、 本発明の核酸 は、 上述の核酸以外に、 本発明の抗体のアミノ酸配列及ぴ当該抗体の抗体重鎖可 変領域及び/又は軽鎖可変領域のアミノ酸に対応するコドンを有する核酸も包含 する。
ハイブリ ドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を調製するには、 モノクローナル抗体の L鎖 V領域、 L鎖 C領域、 H鎖 V領域及ぴ H鎖 C領域をそれ ぞれコードする DNAを PCR法等により調製する方法が採用される。 この際、 プラ イマ一としては、 抗 FGF23抗体遺伝子又はアミノ酸配列から設計したオリゴ DNA を使用することができ、 鎵型としてはハイプリ ドーマから調製した DNAを使用す ることができる。 これらの DNAを 1つの適当なベクターに組み込み、 これを宿主 に導入して発現させる力 あるいはこれらの DNAをそれぞれ適当なベクターに組 み込み、 共発現させる。
ベクターとしては、 宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミ ド が使用される。 プラスミ ド DNAとしては、 大腸菌、 枯草菌又は酵母由来のプラス ミ ドなどが挙げられ、 ファージ DNAとしては Iファージが挙げられる。
形質転換に使用する宿主としては、 目的の遺伝子を発現できるものであれば特 に限定されるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌等）、 酵母、 動物細胞 (COS細胞、 CH0細胞等）、 昆虫細胞が挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、 任意の方法 （例えばカルシウムィォ ンを用いる方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウ ム法、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法等） が挙げられる。 また、 後述 の動物に遺伝子を導入する方法としては、 マイクロインジヱクシヨン法、 ES細胞 にエレクトロポレーションゃリポフエクション法を使用して遺伝子を導入する方 法、 核移植法などが挙げられる。
本発明において、 抗 FGF23抗体は、 形質転換体を培養し、 その培養物から採取 することにより得ることができる。 ここで、 「培養物」 とは、 （a) 培養上清、 （b) 培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物、並びに （c)形質転換体の分泌物のい ずれをも意味するものである。 形質転換体を培養するには、 使用する宿主に適し た培地を用い、 静置培養法、 ローラーボトルによる培養法などが採用される。 培養後、 目的抗体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又は細胞を 破砕することにより抗体を採取する。 また、 目的抗体が菌体外又は細胞外に生産 される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により菌体又は細胞 を除去する。 その後、 蛋白質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを 用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、 前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
さらに、 トランスジ ニック動物作製技術を用いて、 目的抗体の遺伝子が内在 性遺伝子に組み込まれた動物宿主、 例えばトランスジエニックゥシ、 トランスジ エニックャギ、トランスジェエックヒッジ又はトランスジエニックブタを作製し、 そのトランスジエニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来 するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である （Wright, G. , et al. Bio/Technology 9 : 830-834, 1991)。 ハイブリ ドーマをインビトロで培養する場合 には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わ せて、 ハイブリ ドーマを増殖、 維持及ぴ保存させ、 培養上清中にモノクローナル 抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、 あるいは既知の基本培 地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
(8) モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は 以下のよ うに行う ことができる。 まず、 同定法と してはォクテルロニー
(Ouchterlony) 法、 ELISA法、 又は RIA法が挙げられる。 ォクテル口-一法は簡 便ではある力 モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
—方、 ELISA法又は RIA法を用いた場合は、 培養上清をそのまま抗原吸着固相と 反応させ、 さらに二次抗体として各種ィムノグロプリンアイソタイプ、 サブクラ スに対応する抗体を用いることにより、 モノクローナル抗体のアイソタイプ、 サ ブクラスを同定することが可能である。
さらに、 蛋白質の定量は、 フォーリンロウリー法、 及び 280nmにおける吸光度
[1. 4 (0D280) =ィムノグロブリン lmg/mL] より算出する方法等により行うこと ができる。
モノクローナル抗体の認識ェピトープの同定 （ェピトープマッピング） は以下 のようにして行うことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々 な部分構造を作製する。 部分構造の作製にあたっては、 公知のオリゴペプチド合 成技術を用いてその分子の様々な部分ぺプチドを作成する方法、 遺伝子組換え技 術を用いて目的の部分ペプチドをコードする DNA配列を好適な発現プラスミ ドに 組み込み、 大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、 上記目的のためには 両者を組み合わせて用いるのが一般的である。 例えば、 抗原蛋白質のカルボキシ 末端又はアミノ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリべプチドを当業者 に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、 それらに対するモノクローナル 抗体の反応性を検討し、 大まかな認識部位を決定する。
その後、 さらに細かく、 その対応部分のオリゴペプチド、 又は該ペプチドの変 異体等を、 当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、 本発明 の予防又は治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらべプチ ドに対する結合性を調べるか、 又は該モノク口ーナル抗体と抗原との結合に対す るぺプチドの競合阻害活性を調べることによりェピトープを限定する。 多種のォ リゴペプチドを得るための簡便な方法として、 市販のキット （例えば、 SPOTs キ ット (ジエノシス ·バイオテクノ口ジーズ社）、マルチピン合成法を用いた一連の マルチピン 'ペプチド合成キット （カイロン社） 等） を利用することもできる。
( 9 ) 抗体断片の作製
抗体断片は、 上記 （7 ) に記載の抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質 化学的手法により、 作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、 目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 動 物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、 精製を行 うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、 ペプシン、 パパインなどの蛋白質分解酵素を用い た部位特異的切断、 精製などの方法があげられる。
抗体断片としては、 Fab、 F (ab， ）2、 Fab' 、 scFv、 diabody、 dsFv、 CDRを含む ぺプチドなどがあげられる。 以下にそれぞれの抗体断片の作製方法を詳述する。 (i) Fabの作製
Fabは、 蛋白質化学的には IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理することによ り、 作製することができる。 パパインの処理後は、 元の抗体がプロテイン A結合 性を有する IgGサブクラスであれば、 プロテイン Aカラムに通すことで、 IgG分 子や Fc 断片と分離し、 均一な Fab として回収することができる （Monoclonal Antibodies Principles and Practice, third edition, 1995)。 フ—ロアイン A結合 性を持たない IgGサブクラスの抗体の場合は、 イオン交換クロマトグラフィーに より、 Fab は低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる （Monoclonal Antibodies Principles and Practice, third edition, 1995)。 また、 Fab は這 子工学的には、 多くは大腸菌を用いて、 また、 昆虫細胞や動物細胞などを用いて 作製することができる。 例えば、 上記 2 ( 7 ) に記載の抗体の V領域をコードす る DNAを、 Fab発現用ベクターにクローニングし、 Fab発現ベクターを作製するこ とができる。 Fab発現用ベクターとしては、 Fab用の DNAを組み込み発現できるも の で あればい 力 な る も の も 用 い る こ と 力 S で き る 。 例 え ば、 pIT106 (Science， 240 : 1041 - 1043， 1988)などがあげられる。 Fab 発現ベクターを適 当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリプラズマ層に Fabを生成蓄積させるこ とができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法によ り、 活性のある Fabとすることができ、 また、 ペリプラズマ層に発現させた場合 は、 培養上清中に活性を持った Fabが漏出する。 リフォールデイング後あるいは 培養上清からは、 抗原を結合させたカラムを用いることにより、 均一な Fabを精 製 I -ること力、でさる (Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992)。
(i i) F (ab ' ) 2の作製
F (ab' ) 2は、 蛋白質化学的には IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理すること により、 作製することができる。 ペプシンの処理後は、 Fab と同様の精製操作に よ り 、 均一な F (ab' ) 2 と して回収する こ と がで き る （Monoclonal
Antibodies Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995)。 ま た、 下記（i i i) に記載の Fab， を。- PDMやビスマレイミ ドへキサンなどのような マ レ イ ミ ド で 処理 し 、 チ ォ エ ー テ ル結合 さ せ る 方 法や 、 DTNB [5，5， -dithiobis (2-nitrobenzoic acid) ]で処理し、 S- S 結合させる方法に よ っ て も 作製する こ と カ でき る （Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(iii) Fab' の作製
Fab ' は、 上記 （ii) に記載の F (ab， ）2をジチオスレィ トールなどの還元剤で 処理して得ることができる。 また、 Fab' は遺伝子工学的には、 多くは大腸菌、 ま た、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 2 ( 7 ) に記載の抗体の V領域をコードする DNAを、 Fab， 発現用ベクターにクローニング し、 Fab， 発現ベクターを作製することができる。 Fab' 発現用ベクターとしては、 Fab' 用の DNA を組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることが できる。 例えば、 pAK19 (BI0/TECHN0L0GY, 10： 163 - 167， 1992)などがあげられる。 Fab' 発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリプラズマ層に Fab' を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリ フォールデイング法により、 活性のある Fab' とすることができ、 また、 ペリプ ラズマ層に発現させた場合は、 リゾチームによる部分消化、 浸透圧ショック、 ソ 二ケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、 菌体外へ回収させることができる。 リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、 プロティン Gカラムなどを用 いることにより、 均一な Fab， を精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(iv) scFvの作製 '
scFvは遺伝子工学的には、 ファージ又は大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細胞な どを用いて作製することができる。 例えば、 上記 2 ( 7 ) に記載の抗体の V領域 をコードする DNAを、 scFv発現用べクターにクローニングし、 scFv発現ベクター を作製することができる。 scFv発現用ベクターとしては、 scFvの DNAを組み込み 発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCANTAB5E
(GEヘルスケア バイオサイエンス社）、 pHFA (Human Antibodies & Hybridomas,
5 : 48- 56， 1994)などがあげられる。 scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面に scFvがファージ表面蛋白 質と融合した形で発現するファージを得ることができる。 また、 scFv発現べクタ 一を導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層に scFv を生成蓄積させる ことができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法に より、 活性のある scFvとすることができ、 また、 ペリプラズマ層に発現させた場 合は、 リゾチームによる部分消化、 浸透圧ショック、 ソニケーシヨンなどの処理 により菌を破砕し、 菌体外へ回収することができる。 リフォールデイング後ある いは菌の破砕液からは、 陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることによ り、 均一な scFv を精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(v) diabodyの作製
diabody は遺伝子工学的には、 多くは大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細胞など を用いて作製することができる。 例えば、 上記 2 ( 7 ) に記載の抗体の VH と VL をリンカーがコードするアミノ酸残基が 8残基以下となるように連結した DNAを 作製し、 diabody発現用ベクターにクローニングし、 diabody発現ベクターを作製 することができる。 diabody発現用べクターとしては、 diabodyの DNAを組み込み 発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 PCANTAB5E ( GE へ /レス ケ ア バイ 才サイ エ ンス 社） 、 pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994)などがあげられる。 diabody発現べクタ一を導入した大腸 菌の封入体あるいはペリプラズマ層に diabodyを生成蓄積させることができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、 活性のあ る diabodyとすることができ、 また、 ペリプラズマ層に発現させた場合は、 リゾ チームによる部分消化、 浸透圧ショック、 ソニケーシヨンなどの処理により菌を 破砕し、 菌体外へ回収することができる。 リフォールデイング後あるいは菌の破 砕液からは、 陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、 均一な scFvを精製すること力 Sできる (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(vi) dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、 多くは大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細胞などを用 いて作製することができる。 まず、 上記 （ii)、 (iv) 及ぴ （V) に記載の抗体の
VH及ぴ VLをコードする DNAの適当な位置に変異を導入し、 コードするアミノ酸 残基がシスティンに置換された DNAを作製する。作製した各 DNAを dsFv発現用べ クタ一にクローユングし、 VH及ぴ VLの発現ベクターを作製することができる。 dsFv発現用ベクターとしては、 dsFv用の DNAを組み込み発現できるものであれば いかなるものも用いることができる。 例えば、 pULI9 (Protein Engineering, 7： 697-704, 1994)などがあげられる。 VH及ぴ VLの発現べクタ一を適当な大腸菌に 導入し、 封入体あるいはペリプラズマ層に生成蓄積させることができる。 封入体 あるいはペリプラズマ層から VH及び VLを得、 混合し、 通常蛋白質で用いられる リフォールディング法により、活性のある dsFvとすることができる。 リフォール デイング後は、 イオン交換クロマトグラフィー及ぴゲル濾過などにより、 さらに 精製することができる (Protein Engineering, 7： 697 - 704， 1994)。
(vii) CDRペプチドの作製
CDRを含むぺプチドは、 Fmoc法あるいは tBoc法等の化学合成法によって作製す ることができる。 また、 CDRを含むペプチドをコードする DNAを作製し、 作製し た DNAを適当な発現用ベクターにクロー-ングし、 CDRぺプチド発現ベクターを 作製することができる。発現用ベクターとしては、 CDRぺプチドをコ一ドする DNA を組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pLEX (Invitrogen社）、 pAX4a+ (Invitrogen社））などがあげられる。発現ベクターを 適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリプラズマ層に生成蓄積させることが できる。 封入体あるいはペリプラズマ層から CDRペプチドを得、 イオン交換クロ マトグラフィ一及びゲル濾過などにより、 精製することができる（Protein Engineering, 7 : 697-704, 1994)。
3 . 本発明の抗体又は機能的断片の性質
本発明の抗体又は機能的断片は下記のいずれかの特性を有する。
(a) FGF23結合試験； FGF23蛋白質の配列番号 4の 25番目から 251番目のアミノ酸 残基を有する全長物に結合する。
(b)インビト口試験； FGF23の作用を検出できるようなアツセィにおいて FGF23の 作用を抑制する。 FGF23 の作用をインビトロで検出する方法の一例としては、 klotho発現細胞を用いたヒ ト FGF23朿激による Early growth response gene - 1 のプロモータ一活性化（Nature, 444： 770-774, 2006)があげられる。 (c)ィンビボ試験； ヒトに投与したときに内在性の FGF23の作用を阻害し、血清リ ン濃度及び血清 1, 25D濃度を上昇させる。 血清リン濃度及び血清 1，25D濃度の上 昇程度は既存の抗体である 2C3B抗体（国際公開第 W003/057733号パンフレツトで 開示した FGF23 蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体、 受託番号 FERM BP- 7838 のハイプリ ドーマが産生する抗 FGF23抗体） に比較して大きく、 また血 清リン濃度及び血清 1，25D濃度の上昇期間も長い。 例えば、 力二クイザルに投与 した場合、 上昇した血清リ ン濃度の持続期間は、 2C3B抗体の約 3倍以上、 好まし くは約 5倍であり、 上昇した血清 1， 25D濃度の持続期間は、 2C3B抗体の約 1. 5倍 以上、 好ましくは約 2. 5倍である。
本発明は、 さらに本発明の FGF23に対する抗体のアミノ酸配列をコードする核 酸をも包含する。核酸は DNAであっても、 RNAであってもよい。本発明の核酸は、 好ましくはハイブリ ドーマ C10が産生する抗体のアミノ酸配列をコードする核酸 である。例えば、配列番号 1 1に示される塩基配列の 58番目の Cから 408番目の A で示される塩基配列にコードされる重鎖可変領域のァミノ酸配列をコードする 核酸が挙げられる。 さらに、配列番号 1 3に示される塩基配列の 67番目の Gから 384番目の Aで示される塩基配列にコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を コードする核酸が挙げられる。
II. 医薬組成物
本発明のヒ ト抗 FGF23抗体又はその機能的断片を含有する医薬組成物である製 剤もまた、 本発明の範囲内に含まれる。 このような製剤は、 好ましくは、 抗体又 は機能的断片に加えて、 生理学的に許容され得る希釈剤又はキヤリアを含んでお り、 他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。 適切な キヤリァには、 生理的食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水グ ルコース液、 及ぴ緩衝生理食塩水が含まれるが、 これらに限定されるものではな い。 また、 抗体は凍結乾燥 （フリーズドライ） し、 必要とされるときに上記のよ うな緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。 投与経路は経 口投与、 又は口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内及び静脈内などの非経口投 与をあげることができ、 望ましくは静脈内投与である。 投与形態としては、 種々 の形態で投与することができ、それらの形態としては噴霧剤、カプセル剤、錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤などがあげられる。 乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖 などの糖類； ポリエチレングリコール、 プロピレングリコールなどのグリコール 類； ごま油、 ォリーブ油、 大豆油などの油類； P—ヒ ドロキシ安息香酸エステル 類などの防腐剤；スト口べリーフレーバー、 ペパーミントなどのフレーパー類な どを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤などは、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マン-ト ールなどの賦形剤；デンプン、 アルギン酸ナトリゥムなどの崩壊剤；ステアリン 酸マグネシウム、 タルクなどの滑沢剤；ポリビュルアルコール、 ヒドロキシプロ ピルセルロース、 ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グ リセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
注射剤は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 キシロース、 トレハロース、 果糖など の糖類；マンニトーノレ、 キシリ トール、 ソルビトールなどの糖アルコール； リン 酸緩衝液、 クェン酸緩衝液、 ダルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステル などの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤などがあげられる。 注射剤の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。 使用する際に適当な担体、 例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体 であってもよい。 これらの剤形は、 通常それらの組成物中に製剤上一般に使用さ れる乳化剤、 懸濁剤などの添加剤を含有する。 注射手法としては、 例えば点滴静 脈内注射、 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 皮内注射等が挙げ られる。 また、 その投与量は、 投与対象の年齢、 投与経路、 投与回数により異な り、 広範囲に変えることができる。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は本発明の抗体又は抗体の機能的断片そのものを用いて調製するこ ともでき、 あるいは受容者 （患者） の口腔及び気道粘膜を刺激せず、 かつ前記抗 体又は抗体の機能的断片を微細な粒子として分散させ、 吸収を容易にさせるため の担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリンなどが例示される。 前記抗体又は抗体 の機能的断片の性質や用いる担体の性質に応じて、 エアロゾル、 ドライパウダー などの製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤と して例示した成分を添加することもできる。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、 成人に対して、 1 日約 0. Olmg〜： LOOOmgであり、 これらを 1回、 又は数回に分けて 投与することができる。 また、 非経口投与では、 1回約 0. 01mg〜1000mgを皮下注 射、 筋肉注射又は静脈注射によつて投与することができる。
本発明は、 本発明の抗体若しくはその機能的断片又ほそれらを含む医薬組成物 を用いた下記の疾患の予防又は治療法をも包含し、 さらに本発明は本発明の抗体 又はその機能的断片の下記の疾患の予防又は治療剤の製造への使用をも包含する。 本発明の抗体又はその機能的断片により予防 ·治療が可能な疾患は FGF23の過 剰作用が示されている腫瘍性骨軟化症、 ADHR、 XLH、 fibrous dysplasia 、 McCune- Albright syndrome及び常染色体劣性低リン血症などのミネラル代謝異常 を伴う疾患があげられる。さらに、これらの疾患に対して認められる低リン血症、 骨石灰化不全、 骨痛、 筋力低下、 骨格の変形、 成長障害、 低 1，25D血症などにつ いて改善効果が期待される。 また FGF23が生理的条件下で重要な役割を果たして いることから、 FGF23のリン代謝調節、 ビタミン D代謝調節を介したカルシウム 代謝調節作用を本発明の抗体又はその機能的断片が制御することによって骨粗鬆 症、 クル病 (低リン血症性クル病、 ビタミン D抵抗性クル病を含む）、 高カルシゥ ム血症、 低カルシウム血症、 異所性石灰化、 骨硬化症、 パジェット病、 副甲状腺 機能亢進症、 副甲状腺機能低下症及ぴ搔痒等の、 ミネラル代謝やビタミン D代謝 の異常に起因する疾患に対して治療的及び予防的に用いることができる。さらに、 腎不全において血中の FGF23濃度の上昇が報告されていることから、 腎性骨異栄 養症、 透析骨症、 尿細管機能障害等に代表される腎不全や腎不全時人工透析に合 併する疾患に対しても治療的及ぴ予防的に用いることができる。 一方で 1，25Dは 上述したカルシウムなどのミネラル代謝のみならず、 細胞増殖抑制能、 細胞分化 促進能なども報告されていることから、 本発明の抗体又はその機能的断片により 1， 25D によって増殖や分化などの制御を受ける細胞に起因する疾患に対して治療 的及ぴ予防的に用いることができる。 また、 腫瘍性骨軟化症においては腫瘍が FGF23を過剰産生して病態を惹起させ ていることが知られているが、 本抗体に放射性同位元素等の放射性物質若しくは 低分子の薬剤等の各種毒素など治療試薬を結合させたものを用いることにより、 本抗体が FGF23過剰産生腫瘍に集積し、腫瘍の退縮を誘導することも考えられる。 III. 製剤例
本発明の抗体又はその機能的断片を含む製剤は、 水又は水以外の薬理学的に許 容し得る溶液に溶解した無菌性溶液又は懸濁液のアンプルとして使用に供される。 また、 無菌粉末製剤 （本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい） をアンプルに 充填しておき、 使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈して用いてもよい。
[実施例]
以下、 実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明がその実施例に 記載される態様のみに限定されるものではない。 実施例 1 組換え体ヒ ト FGF23発現べクタ一の作製
(1) ヒ ト FGF23H蛋白質発現ベクターの構築
ヒト FGF23をコードする cDNAは、 腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍のヒト cDNAライ ブラリーを錶型とし、 FlEcoRIプライマー （配列番号 1 ) と LHi sNotプライマー
(配列番号 2 )と LA-Taq DNA polymeraseを用いて 96°Cで 1分間保温した後、 96°C で 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒からなる工程を 1サイクルとした 35サイク ルの PCRを実施することにより増幅した。 FlEcoRIプライマーはヒト FGF23をコ ードする塩基配列のさらに 5 '側上流に存在する配列にァニールし、 その増幅断 片のヒ ト FGF23 をコードする領域の 5， 側に EcoRI 制限酵素部位を付加する。
LHisNotプライマーはヒ ト FGF23をコードする配列の終始コドンの 5 '側の配列と ァニールする配列と His6 - tag配列 (His-His- His- His- His- His) をコードする配 列に続く終始コドンと Notl制限酵素配列を含む。その結果、増幅断片はヒ ト FGF23 蛋白質のカルボキシ末端に His6 - tag配列を付加したものをコ一ドすることにな り、 その下流に Notl制限酵素部位を有する。 この増幅断片を EcoRIと Notlで消 化し、同様に EcoRIと Notlで消化した動物細胞発現ベクターである pcDNA3. lZeo
(Invitrogen社） と連結した。 このように作製した発現ベクターをクローユング し、塩基配列を決定して目的の His6- tag配列が付加されたヒ ト FGF23蛋白質をコ ードしていることを確認した。 このベクターを pcDNA/hFGF23Hと称す。
FlEcoRI： CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG (配列番号 1 )
LHisNot： ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA (配列番号
2 )
(2) ヒ ト FGF23蛋白質発現べクタ一の構築
pcDNA/hFGF23Hを錄型として FlEcoRIプライマーと LNotプライマー（配列番号 3 ) と LA-Taq DNA polymeraseを用いて 94°Cで 1分間保温した後、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分からなる工程を 1サイクルとした 25サイクルの PCRを 実施することにより增幅した。反応終了後、ヒ ト FGF23をコードする断片を EcoRI と Notl で消化したのち精製した。 これを、 動物細胞発現ベクターである pEAK8 (Edge Biosystem社） に分子内リボゾームエントリー配列 （IRES) と増強型緑色 蛍光蛋白質（EGFP) を連結した pEAK8/IRES/EGFPベクターの EcoRIと Notl制限酵 素部位に揷入してクローユングした。 取得したプラスミ ドの塩基配列を決定し、 ヒ ト FGF23 蛋白質をコードしているこ とを確認した。 このベクターを pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23と称す。
LNot： ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA (配列番号 3 ) (実施例 2)組換え体ヒ ト FGF23蛋白質及び組換え体変異ヒ ト FGF23H蛋白質の発 a
(l) pcDNA/hFGF23Hをベクター中のアンピシリン耐性遺伝子内にある Fspl制限酵 素部位で切断して直鎖化し、 精製した。 CHO Ras clone- 1細胞 （Shirahata, S.， et al. Biosci Biotech Biochem, 59 : 345-347, 1995) と混和して Gene Pulser II
(Bio Rad社） を用いて電気穿孔法にて細胞への遺伝子導入を行った。 この細胞 を 10% FCS を含む ΜΕΜ ο;培養液 （Gibco BRL社） で 24時間培養したのち、 終濃 度 0. 5mg/ml となるように Zeocin (Invitrogen社） を添加して 1週間培養した。 接着し増殖した細胞をトリプシンで遊離して、 終濃度 0. 3mg/mlの Zeocin存在下 で限界希釈法によるクロー-ングを行い、 クローン化細胞を複数得た。 これらの 細胞の中でヒ ト FGF23H蛋白質を最もよく発現する細胞をウェスタンプロッティ ングにて同定した。 各クローン化細胞の培養上清を採取して、 SDS -ポリアクリル アミ ド電気泳動を行ったのち、 PVDF膜 （Millipore 社） に蛋白質を転写し、 抗 His-tag (カルボキシ末） 抗体 （Invitrogen社） と ECL発光システム （GEヘルス ケア バイオサイセンス社） を用いて約 32kDa付近の FGF-23H蛋白質に由来する シグナルを検出した。 その結果、 #20 と称すクローンにおいて最も高い発現が認 められ、これを CH0 - 0ST311Hと命名して 2000年 8月 11日付けで独立行政法人 産 業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 地 1中央第 6 )に寄託した（受託番号： FERM BP- 7273)。本明細書では、 CHO- 0ST311H を CH0 - hFGF23Hと称する。
(2)ヒト FGF23発現細胞の取得
pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23ベクターの CHO Ras clone- 1細胞への導入は膜融合脂 質を用いた遺伝子導入法により行った。 CHO Ras clone- 1細胞を 6iell plateに 底面の約 60%を細胞が覆う程度に培養する。 そして培養液を除去し、 血清を含ま ない MEM α培養液を l ml 添加する。 導入するベクター 2. 5 g と 10 1 の Transfectam (登録商標） （Promega社） をそれぞれ μ 1 の血清を含まない MEM α培養液と混和して、両者を混合して 10分間静置したのち、两者を混合して予め 準備しておいた 6- well plateに添加した。 2時間培養した後、 この DNAを含む培 養液を除去して 10%の FCSを含む培養液に置換して終夜培養した。 翌日、 終濃度 が 5 g/mlとなるように Puromycin (Sigma社） を添加して、薬剤耐性細胞を選択 した。 このようにして得られた薬剤耐性細胞は限界希釈法にてクローン化を行つ た。 さらにウェスタンブロットにより目的の蛋白質を最もよく発現する細胞株を 取得した。 この細胞を CH0-hFGF23と称す。
(3) 組換え体ヒ ト FGF23蛋白質の動物細胞での発現と検出
CH0-hFGF23Hの培養上清中の組換え体をカルボキシ末端の Hi s 6- tag配列に対す る抗体を用いてウェスタンブロッティングにて検出すると、 約 32kDaのパンドと 約 lOkDaのバンドが認められた。 この二つのバンドをゲルから切り出し、 ァミノ 末端側のァミノ酸配列を決定したところ、 分子量の大きい約 32kDaのパンドは配 '列番号 4の 25番目からのァミノ酸配列が検出され、ヒ ト FGF23蛋白質から分泌過 程でシグナル配列が除去されたものと考えられた。 一方、 分子量の小さいパンド からは配列番号 4の 180番目からのァミノ酸配列が確認され、 179番目と 180番 目の間での切断により生じたカルボキシ末端側断片であることが判明した。また、 ヒト FGF23のァミノ末端側を認識するポリクローナル抗体を用いて検出すること で、 179番目よりァミノ末端側の配列を持つと考えられるポリペプチド （ァミノ 末端側断片） の存在も認められた （国際公開第 W002/14504号パンフレッ ト）。 同様に His6- tag配列の付加されていない CH0- hFGF23の培養上清においても、 179番目と 180番目のアミノ酸残基の間で切断されることを確かめた （国際公開 第 W002/14504号パンフレッ ト）。 そこで、 切断を受けない活性体と思われる配列 番号 4の 25番目から 251番目の全長ヒ ト FGF23蛋白質（FGF23全長体と呼ぶこと がある） を、 ァミノ末端又はカルボキシ末端側断片と分離して精製する目的で以 下の操作を行った。
(4)組換え体全長ヒ ト FGF23蛋白質の精製
CH0 - hFGF23の培養上清をポアサイズが 0. 2 μ ηιのメンブレンである SuperCap (登 録商標） （Pall Gelman Laboratory社） でろ過し、 ろ過された溶液を SP-Sepharose FF (GEヘルスケア バイオサイセンス社） に通した。 カラムとの親和性が弱い物 質を 50mMのリン酸ナトリゥム緩衝液， pH6. 7で洗浄、溶出させた。この画分に 179 番目と 180 番目の間で切断されて生じたカルボキシ末端側の断片が含まれてい た。 力ラム保持された蛋白を 0から 0. 7Mまでの NaCl濃度勾配で溶出させたとこ ろ、 約 0. 3Mの NaClで溶出される画分に全長ヒ ト FGF23蛋白質が認められた。 次 に金属ァフィ-ティカラムである Talon Superf low (登録商標） （Clontech社） に 吸着させたのち、 50mM のリン酸ナトリウム緩衝液， pH6. 7 で洗浄したのち、 Imidazoleの濃度を変化させて添加し全長ヒ ト FGF23蛋白質を溶出精製した。 さ らに、 目的の蛋白質を含む画分を SP Sepharose FFカラムに吸着、 溶出させて精 製した。 ヒ ト FGF23ァミノ酸配列 （配列番号 4 ) MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPG画 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
(実施例 3) ヒ ト抗体産生マウス （KMマウス） の作製
ヒ トモノクローナル抗体作製のための完全ヒ ト抗体を産生するマウスは内因性 Ig重鎖及び/ 軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、か つ、 ヒ ト Ig重鎖遺伝子座を含む 14番染色体断片 （SC20) 及びヒ ト Ig /c鎖トラン スジーン （KCo5) を同時に保持する。 このマウスはヒ ト Ig重鎖遺伝子座を持つ系 統 Aのマウスと、 ヒ ト Ig K鎖トランスジーンを持つ系統 Bのマウスとの交配によ り作製された。 系統 Aは、内因性 Ig重鎖及び K軽鎖破壊の両者についてホモ接合 体であり、子孫伝達可能な 14番染色体断片（SC20)を保持するマウス系統であり、 例えば富塚らの報告 [Tomizuka. et al.， Proc Natl Acad Sci USA. , 97 : 722 - 727， 2000]に記載されている。 また、 系統 Bは内因性 Ig重鎖及ぴ κ軽鎖破壌の両者に ついてホモ接合体であり、 ヒ ト Ig /c鎖トランスジーン （KCo5) を保持するマウス 系統 (トランスジエニックマウス） であり、 例えば Fishwild らの報告 [Nat Biotechnol. , 14 : 845 - 851, 1996]に記載されている。
系統 Αの雄マウスと系統 Βの雌マウス、 あるいは系統 Aの雌マウスと系統 Bの 雄マウスの交配により得られた、血清中にヒト Ig重鎖及び κ軽鎖が同時に検出さ れる個体 [Ishida&Lonberg, IBC ' s 11th Antibody Engineering, Abstract 2000] を、 以下の免疫実験に用いた。 なお、 上記ヒ ト抗体産生マウスは、 契約を結ぶこ とによって、 キリンファーマ株式会社より入手可能である。
(実施例 4) ヒ ト FGF23に対するヒ トモノクローナル抗体の作製
(1)ヒ ト FGF23に対するヒトモノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマの取得 本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、 単クローン抗体実験操作入門
(安東民衛ら著作、講談社発行 1991)等に記載されるような一般的方法に従って 調製した。免疫原としては、実施例 2で調製した全長ヒ ト FGF23蛋白質を用いた。 被免疫動物は、 実施例 3で作製したヒ ト免疫グロブリンを産生するヒ ト抗体産生 マウスを用いた。
まず FGF23に対するヒ トモノクローナル抗体の調製を目的として、 ヒ ト抗体産 生マウスに、実施例 2で作製した精製全長ヒ ト FGF23蛋白質を腹腔内に RIBIアジ ュバント （コリクサ社） と混合して、 マウスあたり 20 gを初回免疫した。 初回 免疫と同様に精製 FGF23と RIBIアジュバントを 2週間間隔で免疫し、計 3回免疫 した。 5個体のマウスに免疫し、 3回目の免疫後に採血し、血清中の FGF23に対す るヒ ト IgG抗体の存在を、後述する酵素標識免疫吸着アツセィ （ELISA) 法によつ て確認した。 国際公開第 W003/057733号パンフレツ トで開示した FGF23蛋白質に 対するマウスモノクローナル抗体3 C1E抗体 （受託番号 FERM BP- 7839のハイブリ ドーマが産生する抗 FGF23抗体） を用いて固相化した FGF23を用いた ELISAにお いて最も高い値を示した血清のマウスを選んで、 以下に述べる脾臓の取得 3 日前 に、 全長ヒ ト FGF23蛋白質 20 g/マウス個体を尾静脈投与した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、 350mg/mL炭酸水素ナトリウム、
50 単位/ mLぺニシリン、 50 ;U g/mL ストレプトマイシンを含む無血清 DMEM培地
(Invitrogen社（以下「無血清 DMEM培地」 という） 10mL中に入れ、 メッシュ （セ ルス トレイナー ： ファルコン社） 上でスパーテノレを用いてつぶした。 メッシュを 通過した細胞懸濁液を遠心して細胞を沈澱させた後、この細胞を無血清 DMEM培地 で 2回洗浄してから、無血清 DMEM培地に懸濁して細胞数を測定した。 一方、 10%
FCS (シグマ社） を含む DMEM培地 （Invitrogen社） （以下、 「血清入り DMEM培地」 という） にて、 37°C、 5%炭酸ガス存在下で細胞濃度が 1 X 106細胞/ mLを越えない ように培養したミエローマ細胞 SP2/0 (ATCC No. CRL-1581) を同様に無血清 DMEM 培地で洗浄し、無血清 DMEM培地に懸濁して細胞数を測定した。回収した脾臓細胞 の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数 5 : 1で混合し、 遠心後、 上清を完 全に除去した。 このペレットに、 融合剤として 50% (w/v) ポリエチレングリコ
—ル 1500 (ベーリンガーマンハイム社) lmLを、 ピペッ トの先でペレッ トを撹拌 しながらゆつく り添加した後、 予め 37°Cに加温しておいた無血清 DMEM培地 lmL を 2回に分けてゆつく り添力卩し、 さらに 7mLの無血清 DMEM培地を添加した。遠心 後、 上清を除去して得られた融合細胞を、 以下に記載する限界希釈法によるスク リーニングに供した。 ハイプリ ドーマの選択は、 10%FCS、 IL-6 ( lOng/mL) (又は 10%ハイプリ ドーマクローニングファクター （以下 「HCF」 という。 ：バイオべ一 ス社））及びヒポキサンチン （H)、 アミノプテリン （A)、 チミジン （T) (以下、 「HATJ という。 ：シグマ社） を含有する DMEM培地中で培養することにより行った。 さら に、 HT (シグマ社）、 10%FCS、 10% HCFを含有する DMEM培地を用いて限界希釈法 によりシングルクローンにした。 培養は、 96穴マイクロタイタープレート （べク トンディッキンソン社) 中で行った。 抗 FGF23 ヒ トモノクローナル抗体を産生す るハイブリ ドーマクローンの選択 （スクリーニング） 及び各々のハイブリ ドーマ が産生するヒ トモノクローナル抗体の特徴付けは、 後述する酵素標識免疫吸着ァ ッセィ （ELISA) により行った。 その結果、 ヒ ト免疫グロブリン γ鎖 （hlg y ) 及 ぴヒ ト免疫グロブリン軽鎖 fcを有し、 かつヒ ト FGF23に特異的な反応性を有する ヒ トモノクローナル抗体を産生する多数のハイプリ ドーマを得た。 得られた多数 のハイプリ ドーマから、 FGF23 蛋白質を認識する抗体を産生するハイプリ ドーマ として特に 2つのクローン （C10及ぴ C15) を得た。 なお、 本実施例を含め以下の いずれの実施例中においては、 各々の本発明の抗 FGF23ヒ トモノクローナル抗体 を産生するハイプリ ドーマクローンは記号を用いて命名した。 また、 当該記号の 前後に 「抗体」 を付したものは、 ハイプリ ドーマにより産生される抗体、 又は当 該ハイプリ ドーマから単離された抗体遺伝子 （全長あるいは可変領域） を保持す る宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。 また文脈上明らかな範囲に おいて、 ハイプリ ドーマクローンの名称が抗体の名称をあらわす場合がある。 ハ ィプリ ドーマクローン C10は、 2007年 2月 2日付で独立行政法人 産業技術総合 研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に受託番号 FERM BP-10772 (識別のための表示： C10) として寄託されてい る。
(2)ハイプリ ドーマ上清からの C10及び C15抗体の精製
実施例 4 (1)で得られた C10及び C15ハイプリ ドーマはゥシインシュリン g/ml、 Invitrogen社)、 ヒ ト トランスフェリン (5 μ g/ l ^ Invi trogen社)、 エタ ノールァミン （0. 01mM、 シグマ社）、 亜セレン酸ナトリ ウム (2. 5 X 10-5mM、 シグ マ社）、 1% Low IgG Fetal Bovine Serum (ハイクローン社） 含有 eRDF培地 （極 東製薬社） に馴化した。 フラスコにて培養し、 培養上清を回収した。 培養上清を Protein G Fast Flow gel (GE ヘルスケア バイオサイエンス社） を用い、 吸着 緩衝液として PBS (-)、 溶出緩衝液として 0. 1Mグリシン緩衝液 （PH2. 8) を用いて ァフィ二ティー精製した。 溶出画分は lM Tris (pH9. 0) を添加して PH7. 2付近に 調整した。 調製された抗体溶液は、 Sephadex G25 脱塩カラム （NAP カラム； GE ヘルスケア バイオサイエンス社) を用いて PBSに置換し、 孔径 0. 22 ;u mのメン プランフィルター MILLEX-GV (Mi llipore社） でろ過滅菌し、 精製 C10及び C15抗 体を得た。 精製抗体の濃度は 280nmの吸光度を測定し、 Img/mLを 1. 0Dとして算 出した。
(実施例 5) C10抗体をコードする抗体遺伝子の取得と配列の決定
( 1 ) C10抗体の cDNA合成
C10 ハイプリ ド一マで発現するヒ ト抗体重鎖、 及び軽鎖の抗体の可変領域を含 む DNA断片を取得するために、 ヒ ト抗体重鎖、 及び軽鎖の各々の定常領域に特異 的なプライマーを用いた 5 ' RACE (5， rapid amplification of cDNA ends) 法に よるクロ一二ングを行なった。具体的には、 BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (ベタ トン ·ディキンソン ·バイオサイエンス · クローンテック社) を用い、 添 付の説明書にしたがって実施した。
cDNA合成の材料としては、 C10ハイブリ ドーマに RNA抽出用試薬である IS0GEN (二ツボンジーン社） を添加し、 取扱説明書にしたがって Total RNA 15 x gを精 製した。 精製した total RNAより各約 1 z gを铸型として用いて、 1st strand cDNA を作製した。 RNA以外の試薬、 及び、 酵素類は BD SMART RACE cDNA Ampl ification Kit付属のものを使用した。
1st strand cDNAの合成は、
Total RNA l n g/Ζ μ Ι
5 ' CDS 1 μ 1
SMART Oligo Ι μ ΐ
上記組成の反応液を 70°Cで 2分間ィンキュベートした後、 5 X Buffer 2μ Ι
DTT Ιμ ΐ
dNTP mi Ιμ ΐ
PowerScript Reverse Transcriptase 1 μ 1
を加え 42°Cで i.5時間ィンキュベートした。
さらに、 50 1 の Tricine- EDTA Bufferを加えた後、 72°Cで 7分間インキュべ ートし、 1st strand cDNAを取得した。
(2) PCRによる重鎖遺伝子、 軽鎖遺伝子の増幅と塩基配列の確認
(2) 一 1 ； PCRによる重鎖遺伝子、 軽鎖遺伝子の増幅
o
C10抗体をコードする遺伝子の cDNAを増幅するために、 ヒト抗体特異的配列を 有する 3， プライマー（具体的な配列は後述）と BD SMART RACE cDNA Amplification Kitで合成された cDNAの 5， 末端に付加された配列に特異的にハイブリダイズす る 5， プライマー (Universal primer A mix) を PCR用のプライマーセットとし て、 また PCR用酵素として K0D- Plus - DNAポリメラーゼ （トーョーポー社） を用い 下記の反応液を調製して PCRに供した。
sterile H20 28 t 1
1st strand cDNA 2.5
KOD- Plus- buffer (10X) 5/ 1
dNTP Mix (2mM) 5 1
MgS04 (25 mM) 2μ 1
KOD-Plus- (1 unit/V D 1/i 1
Universal primer A mix (UPM) (10X) 5/x 1
Gene specific primers (GSP) 1.5
Total volume 50 μ 1
重鎖遺伝子の增幅反応には、 SMART RACE cDNA Amplification Kit 付属の UPM プライマーと IgGlpプライマー （配列番号 5) を用い、 他方、 軽鎖遺伝子の増幅 には UPMプライマーと hk_2 (配列番号 6) プライマーの各セットを使用した。
IgGlp： TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG (配列番号 5 ) hk- 2: GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC (配列番号 6 )
また反応温度条件は次のとおりである。
94°C/30秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、
94°C/30秒間、 70°C/30秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、
94°C/30秒間、 68°C/30秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復した。
さらに、 この反応液 2// 1に Tricine - EDTABuffer 98 1を加えて希釈したもの 5β 1 を錶型とし、 第二 （ネス ト） PCRを実施した。 PCR反応溶液の組成を次に示 す。 sterile H20 30 μ ΐ
第一 PCR反応液 （50倍希釈） 5^ 1
KOD-Plus- buffer (10X) 5 1
dNTP Mix (2mM) 5 μ 1
MgS04 (25 mM) 2μ 1
KOD-Plus- (1 unit/ Ai l) Ιμ ϊ
Nested Universal primer A (NUP; 10 μ M) Ιβ ΐ
Gene specific primers (GSP) (10 μΜ) Ιμ ΐ
Total volume 50 μ ΐ 上記反応のプライマーセットとして、 重鎖遺伝子増幅用の場合は、 而 Ρ プライ マー （SMART RACE cDNA amplification Kit 付属；べク トン 'ディキンソン 'バ ィォサイエンス . クローンテック社） と hh2プライマー （配列番号 7) を使用し て、 また、 軽鎖遺伝子の増幅の場合は、 NUPプライマーと hk- 5プライマー （配列 番号 8) を用いた。 反応温度条件としては、 94°Cの初期温度で 1分間の後、 94°C /5秒間、 68°C/10秒及び 72°C/3分間のサイクルを 20回反復、最後に 72°C/7分間 の力 0熱を行なった。
hh2： GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC (配列番号 7 )
hk- 5： AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC (配列番号 8 )
(2) -2 ；抗体遺伝子の塩基配列決定
増幅した重鎖 PCR断片 （以下 HV[C]と記載： H鎖の 5' 非翻訳領域-リーダー配 列、 可変領域 （HV) 及び定常領域の一部 （[C]) より構成される）、 及び、 軽鎖の PCR増幅断片（以下 LV [C]と記載： L鎖の 5 ' 非翻訳領域-リーダー配列、可変領域 (LV) 及び定常領域の一部 （[C] ) より構成される） は、 エタノール沈殿で回収し た後、 ァガロースゲル電気泳動で回収し、 メンブランを用いる DNA精製キットで ある QIAquick Gel Extract ion Kit (キアゲン社製） にて精製した。精製した HV [C] 増幅断片あるいは LV [C]増幅断片は、それぞれ Zero Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (ィ ンビトロジェン社製）の PCR 4 Blunt-TOPOベクターにサブクローニングを行い、 得られたクローンのプラスミ ド DNAについてィンサート DNAの塩基配列を解析し た。 DNA塩基配列決定のためにプライマーとして、 M13- 20FW (配列番号 9 ) 及ぴ M13RV (配列番号 1 0 ) を用いた。
M13-20FW : GTAAAACGAC GGCCAGTG (配列番号 9 )
M13RV : CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号 1 0 )
C10抗体の重鎖可変領域、 及び軽鎖可変領域をコードする DNA塩基配列、 並びに 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。 く C10重鎖核酸配列〉（ATG開始コドンより可変領域カルボキシ末端アミノ酸残基を コードする DNA配列まで） （配列番号 1 1 )
10 20 30 40 50 60
ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CTCCAGGTGC TCACTCCCAG
70 80 90 100 110 120
GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTTTCC
130 140 150 160 170 180
TGCAAGGCAT CTGGATACAC CTTCACCAAC CACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT
190 200 210 220 230 240
GGACAAGGGC TTGAGTGGAT GGGAATAATC AACCCTATTA GTGGTAGCAC AAGTAACGCA
250 260 270 280 290 300
CAGAAGTTCC AGGGCAGAGT CACCATGACC AGGGACACGT CCACGAGCAC AGTCTACATG
310 320 330 340 350 360
GAGCTGAGCA GCCTGAGATC TGAGGACACG GCCGTGTATT ATTGTGCGAG AGATATTGTG 370 380 390 400 408
GATGCTTTTG ATTTCTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCTTCA く CIO重鎖ァミノ酸配列〉 （リーダー配列及び可変領域まで） （配列番号 1 2 ) (下線で示すァミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す）
10 20 30 40 50 60
MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN HYMHWVRQAP
70 80 90 100 110 120
GQGLE丽 Gi l NPISGSTSNA QKFQGRVTMT RDTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCARDIV
130 136
DAFDFWGQGT MVTVSS く CIO軽鎖核酸配列〉（ATG開始コドンより可変領域カルポキシ末端ァミノ酸残基を コードする DNA配列まで） （配列番号 1 3 )
10 20 30 40 50 60
ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC
70 80 90 100 110 120
AGATGTGCCA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA
130 140 150 160 170 180
GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGGGC ATTAGCAGTG CTTTAGTCTG GTATCAGCAG
190 200 210 220 230 240
AAACCAGGGA AAGCTCCTAA GCTCCTGATC TATGATGCCT CCAGTTTGGA AAGTGGGGTC
250 260 270 280 290 300
CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG
310 320 330 340 350 360
CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTTTA ATGATTACTT CACTTTCGGC
370 380 384
CCTGGGACCA AAGTGGATAT CAAA く CIO軽鎖アミノ酸配列〉 （リーダー配列及び可変領域まで） （配列番号 1 4 ) (下線で示すァミノ酸残基は分泌シグナルとなるリーダー配列を示す）
10 20 30 40 50 60
MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCAIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALVWYQQ
70 80 90 100 110 120
KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNDYFTFG
128
PGTKVDIK また、 PCR 4 Blunt- T0P0ベクターにサブクローニングした C10抗体の遺伝子配 列には、 ヒト抗体配列の定常領域も一部クローニングされてくることから、 その 領域についても DNA塩基配列を解析した。 その結果、 Kabatらによる EUインデッ クスにより示される重鎖定常領域の 118番目から 191番目のアミノ酸残基をコー ドする配列が確認でき、その領域においてヒ ト IgGlのアミノ酸配列と完全に一致 し、 C10抗体のサブクラスは IgGlであることが判明した。 さらに同様な方法を用 いて、 C15抗体をコードする抗体遺伝子の取得と配列の決定も行った。
(実施例 6) 組換え C10抗体発現べクターの構築
C10抗体発現ベクターの作製 （図 1に工程図を示す）
取得した C10抗体の LV [C]鎖を含むプラスミ ド DNAを錶型として、 末端に連結 のための制限酵素部位 （5 ' 末側 BglII、 3' 末側 BsiWI) を付加するようにデザィ ンしたプライマー、 C10_L5— Bgl (配列番号 1 5 )及び C10_L3_Bsi (配列番号 1 6 ) を用いて、 C10抗体の LV (軽鎖のリーダー配列 +可変領域）の DNAを K0D- Plus- DNA ポリメラーゼによる PCRで増幅した。 反応温度条件としては、 94°Cの初期温度で
1分間の加熱後、 94°C/5秒間と 68°C/45秒間のサイクルを 35回反復し、 最後に
72°C/7分間の加熱を行なった。増幅された DNA断片を制限酵素 Bglllと BsiWIで 消化して、 ァガロースゲル電気泳動で約 400bpの DNAを回収し精製した。 他方、 ベクターである N5KG卜 Val Larkベクター （IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 (US patent 6001358) の改変ベクター） については同様に制限酵素 BglII、 BsiWI処理 を順次行った後、 脱リン酸化処理として Alkaline Phosphatase (E. coli C75) (宝 酒造社） にて処理した後に、 ァガロースゲル電気泳動と DNA精製キットで約 9kb 弱の DNAを回収した。 これら 2つの断片を T4 DNA ligase を用いてライゲーショ ンして、 大腸菌 DH10Bへ導入して形質転換体を得た。 ィンサート DNAを含む形質 転換体のプラスミ ド DNAについて DNA塩基配列を解析して、 N5KG1-Val Larkに C10 抗体の LV が N5KG1- Val Lark のヒ ト抗体軽鎖定常領域をコードする 5' 上流に in-frameに挿入されたプラスミ ド DNA、 N5KGl_C10_Lvを取得した。 引き続いて、
LVが挿入されたプラスミ ドベクター （N5KGし C10_Lv) に C10抗体の HV (重鎖のリ ーダー配列 +可変領域） の揷入を行なった。 pCR4Blunt- T0POベクターにサブクロ 一ユングした C10抗体の HV [C]を含むプラスミ ド DNAを錶型として、 末端に連結 のための制限酵素部位 （5' 末側 Sall、 3' 末側 Nhel) を付加するようにデザイン したプライマー、 C10_H5— Sal (配列番号 1 7 ) 及ぴ C10_H3_Nhe (配列番号 1 8 ) を用いて、 HVを PCRで増幅した。 反応温度条件としては、 94°Cの初期温度で 1分 間の加熱後、 94°C/5秒間と 68°C/45秒間のサイクルを 35回反復し、 最後に 72°C
/7分間の加熱を行なった。 精製した HVの増幅 DNA断片を pCR4Blunt - T0P0 べク ターにサブクローニングを行い、 得られたクローンのプラスミ ド DNAについてィ ンサート DNAの塩基配列を解析した。 DNA塩基配列決定のためにプライマーとし て、 上記の M13- 20FW及び M13RVを用いた。 サブクローンについて挿入部分の DNA 塩基配列解析を行い、鎵型とした HVと相違がなく、 また、 プライマー部分もデザ インどおりの配列を有するプラスミ ド DNA (T0P0_C10_Hv) を選択した。 その DNA を制限酵素 Sailと Nhelで消化して、 ァガロースゲル電気泳動で約 420 bpの DNA を回収し精製し、 同様に制限酵素処理 （Sail と Nhel) と脱リン酸化処理した
N5KGl_C10_Lvの DNA (約 9kb) に T4 DNA ligase を用いてライゲーションした後、 大腸菌 DH10Bへ導入して得られた形質転換体より、 目的のプラスミ ド DNAを選択 した。 こうして得られた抗体発現プラスミ ド DNA、 N5KG1_C10_LH (クローン #1) の大量精製を行い、 L鎖全領域と H鎖全領域、 及び、 その揷入部位周辺の DNA塩 基配列にクローニング工程での変異がないことを確認（図 2、及び図 3) した。 DNA 塩基配列の確認には、 さらに配列番号 1 9〜2 5の各プライマーを使用した。 完 成した C10抗体発現ベクターの簡単なマップを図 4に示した。 さらに同様な方法 を用いて、 組換え C15抗体発現ベクターの構築を行った。
C10—L5— Bgl： AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT (配列番号 1 5 )
CIO— L3— Bsi： AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC (配列番号 1 6 )
CIO— H5— Sal： AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC (配列番号 1 7 )
C10_H3_Nhe： AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC (配列番号 1 8 ) hh-4: GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG (配列番号 1 9)
hh - 1： CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC (配列番号 2 0 )
CMVH903F: GACACCCTCATGATCTCCCGGACC (配列番号 2 1 )
CMVHR1303: TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT (配列番号 2 2)
SEQU4618: TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC (配列番号 2 3)
hk-1： TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC (配列番号 2 4 )
SEQU1783: GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA (配列番号 2 5)
(実施例 7) 組換え C10抗体の調製
構築した C10抗体発現ベクターを宿主細胞に導入して、 C10抗体発現細胞を作 製した。 発現のための宿主細胞には、 dihydrofolate reductase (DHFR)欠損の CHO DG44細胞 （以下 CHO細胞と表記、 IDEC Pharmaceuticals社） を無血清培地である EX-CELL 325-PF 培地 （2niM glutamine, 100units/ml penicillin, 100 μ g/ml streptomycin 、 hypoxanthine and thymidine (HT) サ プ リ メ ン ト (1:100) (Invitrogen社）を含有。 JRH社） に馴化した細胞株を用いた。 宿主細胞へ のベクターの導入はエレク ト口ポレーションにより実施した。 エレク トロポレー シヨンは C10 抗体発現ベクター約 を制限酵素 Ascl で線状化し、 BioRad Electroporatorをもちいて 350V、 500 ^uFの条件で、 4X106個の CH0細胞に遺伝 子を導入し、 96well culture plate に播種した。 ベクターの導入処理後、 G418 を添加して培養を継続した。 コロニーを確認した後、 抗体発現株を選別した。 選 択した CH0細胞株を EX - CELL325 - PF培地（2mMglutamine、100units/ml penicillin, 100 μ g/n streptomycin、 hypoxanthine and thymidine (HT)サプリ メ ン ト (1:100) (Invitrogen 社）を含有） で 5% C02条件下で培養した。 培養上清を
Mabselect Protein A カラム（GE へノレスケアバイオサイエンス社）に吸着後、 PBS JP2008/052918 で洗浄して、 20mM クェン酸 _Na、 50mM NaCl (pH3. 4)バッファーで溶出した。 溶出 液は 50mM Phosphate- Na, pH7. 0にて中和した。 イオン交換水にて、 約 1. 5倍に 希釈して Conductivityを 4. Oms/cm以下に調製した。 次に、 Q- Sepharose (Hitrap Q HP、 GE へ/レスケア ノ ィォサイエンス社） と、 SP— Sepharose (Hi Trap SP FF、 GEヘルスケア バイオサイエンス社） を連結したカラムに、 サンプルをチャージ して吸着し、 20mM リン酸ナトリウム緩衝液 （pH5. 0) にて洗浄後、 PBS (-) にて 溶出した。 調製された抗体溶液は、 孔径 0. 22 111 のメ ンプランフィルター MILLEX-GV (Mi llipore社） でろ過滅菌した。 精製した C10抗体の濃度は 280nm の吸光度を測定し、 Img/mLを 1. 40Dとして算出した。 また、 同様な方法で、 組換 え C15抗体の調製を行った。
(実施例 8)力-クイザル FGF23蛋白質発現ベクターの構築
力二クイザル FGF23蛋白質発現べクタ一の構築
力二クイザルの EDTA添加静脈血に PBS (-)で懸濁した 5 % Dextran T- 2000 (GE ヘルスケア バイオサイエンス社） を 2対 1の割合で混和し、 赤血球を沈殿させ た後に上清をリンパ球分離液 （Ficoll— Paque) (GEヘルスケア バイオサイェン ス社） に重層し、 遠心することによりリンパ球画分を得た。 得られたリンパ球を
IS0GEN-LS (二ツボンジーン社） に懸濁し、添付のプロトコルに従い力二クイザル リンパ球総 RNAを得た。 この力-クイザルリンパ球総 RNAより First Strand cDNA
Synthesis Kit (Invitrogen社）を用いて添付のプロトコルに従い力-クイザルリ ンパ球 cDNAライブラリ一を作製した。力二クイザル FGF23をコードする cDNAは、 力二クイザルリンパ球 cDNAライブラリーを鎵型とし、 monkeyFGF23FWプライマー
(配列番号 2 6 ) と monkeyFGF23RVプライマー （配列番号 2 7 ) と K0D plus DNA polymerase (東洋紡社）を用いて 94°Cで 5分間保温した後、 94°Cで 20秒、 55°Cで
30秒、 72。Cで 50秒からなる工程を 1サイクルとした 45サイクルの PCRを実施す ることにより増幅した。 monkeyFGF23FWプライマーはヒ ト FGF23をコードする塩 基配列の 5'側上流に存在する配列にァニールし、その増幅断片の FGF23をコード する領域の 5'側に EcoRI制限酵素部位を付加する。 monkeyFGF23RVプライマーは ヒト FGF23をコードする配列の終始コドンを含む配列にァニールする配列と Notl 制限酵素配列を含む。 この増幅断片を EcoRIと Notlで消化し，発現ベクターであ る pEAK8 (Edge Biosystem社） に分子内リポゾームェントリ一配列 （IRES) と増 強型緑色蛍光蛋白質（EGFP)を連結した pEAK8/IRES/EGFPベクターの EcoRIと Notl 制限酵素部位に挿入してクローニングした。 取得したプラスミ ドの塩基配列を決 定し、 力-クイザル FGF23蛋白質をコードしていることを確認した。 このべクタ 一を pEAK8/IRES/EGFP/monkeyFGF23と称す。 また、 本実施例によって得られた力 二クイザル FGF23の核酸配列及びアミノ酸配列を配列番号 2 8及ぴ 2 9にそれぞ れ記載する。
monkeyFGF23Fff ： CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT (配列番号 2 6 ) monkeyFGF23RV： ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC (配列番号 2 7 ) 力二クイザル FGF23核酸配列 （配列番号 2 8 )
Figure imgf000051_0001
CCGGAAGCCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG 力-クイザル FGF23ァミノ酸配列 （配列番号 2 9 )
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VIRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH
VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFGG NIFGSHYFNP ENCRFRHWTL
ENGYDVYHSP QHHFLVSLGR AKRAFLPG丽 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPRPRRHTRS
AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPVA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEACRPFAKF I
( 2 ) 力二クイザル FGF23発現細胞上清の作製
pEAK8/IRES/EGFP/monkeyFGF23を PEAK rapid細胞 （Edge Biosystem社） にリン 酸カルシウム法により一過性に導入し、 その発現培養上清を得た。
(実施例 9) 力二クイザル FGF23への C10抗体の結合性の検証
C10抗体がヒ ト FGF23のみならず力二クイザノレ FGF23に同様に結合することを サンドィツチ ELISAを用いた以下の方法で調べた。実施例 4で作製した C10抗体、
2C3B抗体及びヒ ト IgGlコントロール抗体を 50mM NaHC03の溶液に 5 ;ι g/mlの濃度 に希釈し、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Maxisorp (登録商標）、 Nunc社） の 各ゥヱルに加え、 4 °Cで 12時間インキュベートし、 C10抗体、 2C3B抗体及ぴ対照 としてヒ ト IgGlコントロール抗体をマイクロプレートに吸着させた。次にこの溶 液を除去し、 各ゥエルにブロッキング試薬 （SuperBlock (登録商標） Blocking
Buffer, PIERCE社） を加え室温で 30分間インキュベートしたのち、 各ゥヱルを
0. 1%の Tween20を含有する Tris_buf f ered sal ine (T- TBS) で 2回洗浄した。 こ のように抗 FGF23抗体をコーティングしたマイクロプレートの各ゥエルに、 実施 例 2で精製した全長ヒ ト FGF23蛋白質又は実施例 8で作製した力二クイザル FGF23 発現細胞上清を適当な濃度に希釈して各ゥ ルに加え、 固相化抗体と 2時間反応 させた後、各ゥエルを、 0· 1%の Tween20を含有する Tris- buff ered saline (T-TBS) で 2回洗浄した。次いで、各ゥエルにビォチン標識した 3 /z g/mLの 3C1E抗体を室 温下で 1. 5時間インキュベートし、 固相化抗体に結合したヒ ト又は力二クイザノレ
FGF23にビォチン標識した 3C1E抗体を結合させた。 T-TBSで洗浄後、さらに、 5000 倍に希釈した Horseraddish peroxidase標識ストレプトアビジン （DAK0社） を 1 時間反応させた後、 T-TBS で 3回洗浄した。 次にテトラメチルベンジジン (DAK0 社） を含む基質緩衝液を各ゥヱルに加え、 室温下で 30分間インキュベートした。 次いで、 0. 5M硫酸を各ゥヱルに加え、 反応を止めた。 参照波長を 570nmとして波 長 450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー （MTP- 300、 コロナ電気社） で測 定した。 ヒト全長 FGF23蛋白質及ぴカニクイザル FGF23発現培養上清を同様に公 比 3倍で希釈したときの反応性を比較した。 このときの結果を図 5 A及び Bに示 す。 図 5 Aの結果から明らかなように C10抗体又は 2C3B抗体を固相化したとき、 ヒ ト全長 FGF23 蛋白質への反応性は同程度である。 この条件で、 力二クイザル FGF23発現培養上清の希釈系列に対する反応性に関して、 C10抗体と 2C3B抗体に 大きな違いは観察されない （図 5 B)。 すなわち、 C10抗体は 2C3B抗体と同様にヒ ト及び力二クイザル FGF23と結合性を有することが証明された。
(実施例 10) C10抗体と 2C3B抗体の正常力二クイザルの血中リン濃度及び血中 1 a , 25ジヒドロキシビタミン D濃度に対する作用の比較
FGF23 はマウスにおいて腎臓からリンを排泄し、 血清リン濃度を減少させ、 ま た腎臓におけるビタミン D活性化酵素を阻害し血中 1 α， 25-ジヒドロキシビタミ ン D濃度 （以下 1，25Dという） を減少させる作用をもつ （国際公開第 W002/14504 号パンフレツト）。 2C3B抗体など FGF23に対して抑制作用すなわち中和活性を有 するような抗体を正常マウスに投与すると、 内在性の FGF23の作用が抑制され、 血清リ ン濃度及び血清 1, 25D 濃度が上昇することが示されている （国際公開第
W003/057733 号パンフレッ ト）。 よって FGF23 に対する中和活个生を有する抗体は
FGF23過剰に由来する腫瘍性骨軟化症、 XLHなどを含むヒ トの疾患において治療効 果を有することが強く示唆される。 そこで、 本研究において取得されたヒ ト抗体 である C10抗体の生体内での FGF23中和活性を検討した。 特に、 ヒ トでの薬理効 果を期待することからげつ歯類などに比較して、 進化上ヒトに近い動物種である サルの内在性 FGF23の機能を抑制し、 その血清リン濃度及び血清 1， 25D濃度の上 昇を指標として、 中和活性能を測定した。 C10 抗体の比較対照として、 マウス抗 体である 2C3B抗体を用いて実験を行った。
C10抗体と 2C3B抗体の血清リン濃度上昇作用を、無処置の正常力-クイザルを 用いて以下の方法で比較した。 C10抗体は実施例 4で作製したものを用いた。 実 験動物には、 雌性力二クイザル、 2〜3歳、 体重 2〜4 k gを媒体投与群、 2C3B抗 体投与群は群 3頭ずつ、 C10抗体を投与した群は 4頭使用した。 C10抗体及ぴ 2C3B 抗体は、 それぞれ PBS (-）で 3mg/mLの濃度に調製し、 投与液とした。 陰性対照に は、 媒体である PBS (-)を用いた。 C10抗体及ぴ 2C3B抗体は、 それぞれ 3mg/kgと なるように lmL/ k gの容量で上腕橈側皮静脈より lmL/分の流速で単回投与した。 血清リン濃度は Lタイプヮコー無機リン （和光純薬工業社） 試薬を用いて日立自 動分析装置 7180 (日立製作所社） で測定した。 血清 1，25D濃度は 1，25 (0H) 2D RIA キット 「TFB」 （Immunodiagnostic Systems社） を用いて測定した。 測定は抗体投 与後、 0. 5、 1、 2、 3、 5、 7、 10、 14、 21、 28、 35、 42、 49日目にそれぞれ行なつ た。データは平均値 +/-標準誤差で示した。各抗体投与後の経時的採血による血清 リン濃度の 10 日目までの推移を図 6に示す。 PBS (-)投与群では、血清リン濃度は 試験期間を通してほぼ一定の濃度であつたのに対し、 C10抗体投与群及ぴ 2C3B抗 体投与群では、 投与前及び PBS (-)投与群と比較して、 明らかな血清リン濃度の上 昇が認められた。 C10抗体投与群及び 2C3B抗体投与群とも、最も高い血清リン濃 度が認められた時期は、 ともに抗体投与後 5日目であり、 このときの血清リン濃 度は、 PBS (-)投与群、 2C3B抗体投与群及び C10抗体投与群でそれぞれ 5. 28mg/dl、
8. 10mg/dl、 9. 59mg/dlであった。 この抗体投与後 5日目の 2C3B抗体投与群と C10 抗体投与群の血清リン濃度について同時期の PBS (-)投与群の血清リン濃度から の上昇値を比較すると、 2C3B投与群の血清リン濃度が 2. 82mg/dlであるのに対し、
C10抗体投与群では 4. 31mg/dlであり、 C10抗体は 2C3B抗体に比べ約 1. 5倍以上 血清リン濃度を高く誘導した （図 7 )。 このように、 C10抗体投与群の血清リン濃 度上昇作用は、 2C3B抗体投与群に比較して、 顕著に高かった。 また、 2C3B抗体投 与群の血清リン濃度は、 投与後 10 日目で PBS (-)の血清リン濃度と同等の値にな つていたが、 C10抗体投与群の血清リン濃度（8. 76mg/dl)は依然として 2C3B抗体 投与群の最高値 （8. 10mg/dl) よりも高い値を維持していた （図 6 )。 さらに、 C10 抗体による血清リン濃度の上昇の持続期間は 2C3B 抗体によるものよりもはるか に長く、 PBS (-)投与群との有意差を有する上昇期間が 2C3Bで 7 日間であつたのに 対し、 C10抗体では驚くべきことに 35日間と持続期間が約 5倍も長くなつた。 同 様に、 抗体投与後の 1，25D濃度に関しても、 2C3B抗体に比較して、 C10抗体は顕 著な上昇及ぴその持続期間の延長を示した （図 8 )。 この結果は、 既存の FGF23 中和抗体である 2C3B抗体と比較して、 力二クイザルにおいて、 C10抗体はより強 力な血清リン濃度上昇及び血清 1，25D上昇作用を有する、 すなわち強力な FGF23 中和活性を有することを示している。 現在、 XLH などにおける低リン血症性クル 病の現状の治療においては一日に複数回のリンゃビタミン D製剤の大量の投与を 行い、 かろうじて正常域のリン濃度に保つ治療が行われている。 頻回の服用のコ ンプライアンスも悪いという報告もある。 本研究における C10抗体の単回の投与 において、 血清リン濃度、 血清 1，25D濃度の持続的な上昇作用が観察されたこと は、 低リン血症治療薬として現状の治療に比して、 C10 抗体は顕著な優位性を有 する治療である可能性が示唆された。
(実施例 11) C15抗体のヒト及ぴカュクイザル FGF23への反応性の確認
実施例 1 で作製した pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23 又は実施例 8 で作製した pEAK8/IRES/EGFP/monkeyFGF23を PEAK rapid細胞 （Edge Biosystem社） にリン酸 カルシウム法により一過性に遺伝子導入した。 導入から 3日目に、 各培養上清を 回収し、 一次抗体として、実施例 13で作製した C15抗体を用い、 ウェスタンプロ ットを行った （図 9 )。 その結果、 C15は力-クイザル FGF23もヒト FGF23と同様 に結合することが示された。
(実施例 12) C10抗体と C15抗体の正常力二クイザルの血中リン濃度及び血中 1 a , 25ジヒ ドロキシビタミン D濃度に対する作用の比較
実施例 11によって C15抗体が C10抗体と同様に、 ヒ ト及ぴ力二クイザル FGF23 組換え蛋白に対し結合活性を有することを示された。 そこで、 C10抗体及び C15 抗体について、 正常力二クイザルに投与することにより、 生体内での FGF23中和 活性を比較した。 力二クイザル内在性 FGF23に対する中和活性の評価は、 血清リ ン濃度上昇を指標として実施した。 C10抗体又は C15抗体は実施例 7で作製した ものを用いた。 実験動物には、 2〜3歳、体重 2〜3 k gの正常力-クイザルを使用 し、 1群あたりォス 2頭、 メス 1頭の計 3頭とした。 希釈媒体には PBS (-）を使用 し、 C10抗体は lmg/mL及び 3mg/mL、 C15抗体は 3mg/mLの濃度となるように調製 した。 C10抗体は投与量が lmg/kg及ぴ 3mg/kgとなるように、また C15抗体は 3mg/kg となるように、 lmL/kgの容量で伏在静脈より約 lmL/分の流速で単回投与した。血 清リン濃度は Lタイプヮコー無機リン （和光純薬工業社） 試薬を用いて日立自動 分析装置 7180 (日立製作所社）で測定した。採血は、抗体投与前、及ぴ投与 1、 3、
5、 7、 10、 14、 21及び 28 日後に実施し、 すべての採血ポイントについて血清リ P T/JP2008/052918 ン濃度の測定を行なった。 C10抗体 lmg/kg群、 C10抗体 3mg/kg群及ぴ C15抗体 3mg/kg群の抗体投与前の血清リン濃度は、 それぞれ 5. 37、 5. 70及び 5. 58mg/dL であり、 群間の差はなかった。 投与後、 すべての力二クイザルで、 血清リン濃度 の上昇が認められ、 C10抗体のみならず C15抗体も力-クイザル内在性 FGF23に 対し中和活性を有することが示された。 C10抗体 lmg/kg群、 C10抗体 3mg/kg群及 ぴ C15抗体 3mg/kg群のそれぞれの血清リン濃度は投与 3 日後で、 9. 03、 9. 10及 び 8. 64mg/dLであった。 この時、 C10抗体 lmg/kg群及ぴ C15抗体 3mg/kg群の血 清リン濃度は最高値を示した。 一方で、 C10抗体 3mg/kg群の血清リン濃度はさら に上昇し投与 5日後に最大値を示し、 その値は 9. 75 mg/dLであった。 投与前後の 血清リン濃度の最大上昇幅は、 C10抗体 lmg/kg群、 C10抗体 3mg/kg群及び C15 抗体 3mg/kg群でそれぞれ 3. 67、 4. 65及ぴ 3. 06mg/dLとなつた。 この結果より、 3mg/kgの同用量においては、 C10抗体が C15抗体に比べて、 血清リン濃度上昇作 用が強いことが示されただけでなく、驚くべきことに、 lmg/kg の用量の C10抗体 は 3mg/kgの C15抗体よりも血中リン濃度を上昇させた。次に、投与前に比べて血 清リン濃度が上昇している期間を比べた。 その結果、 C10抗体 lrag/kg群、 C10抗 体 3mg/kg群及び C15抗体 3mg/kg群でそれぞれ 14、 28及ぴ 7日間となった。 この 結果より、 3mg/kgの同用量においては、 C10抗体が C15抗体に比べて、 血清リン 濃度上昇作用を持続することが示されただけでなく、驚くべきことに、 lmg/kg の 用量の C10抗体は 3mg/kgの C15抗体よりも血中リン濃度を長期に渡り高値に維 持した。 以上の結果より、 C10抗体は C10抗体と同時に取得した C15抗体に比べ て力-クイザルにおける血清リン濃度上昇作用及び血清リン上昇持続作用が強い ことが明らかになった。すなわち、 C10抗体は C15抗体に比べて力-クイザル FGF23 に対する中和活性が顕著に強いことが明らかになった。
(実施例 13) ヒ ト FGF23 DNA断片 （シグナル配列無し） の作製
K0D - plus - DNAポリメラーゼ （トーョーボー社） を用い添付文書にしたがって反 応液を調製し、 50 1 反応液中に FGF23 (- SP) FW プライマー （配列番号 34) と
FGF23 (-SP) RVプライマー（配列番号 35)を各 15pmol、錶型としてヒ ト FGF23- cDNA
(開始コドンから終止コドンを含む 756bp 配列番号 36) を添加し、 94°C3分保温 した後、 98°C15秒、 63°C15秒及び 68°C2分 30秒を 1サイクルとして 30サイクル 増幅し、 72°C3分保温した。 得られた 684bpの増幅断片を 0. 8%ゲルで分離回収し た。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社） を用い添 付文書にしたがって増幅断片を回収した。 回収された PCR増幅断片を Fsel (ニュ 一 . イングランド . バイオラボ · ジャパン社） で酵素消化し、 QIAquick PCR Purification Kit (キアゲン社） を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回 収した。その結果、 ヒ ト FGF23のシグナル配列を含まない mature体部分に相当す る部分 DNA断片を得た。
FGF23 (-SP) FW： TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG (配列番号 34)
FGF23 (-SP) RV： TTGGCCGGCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG (配列番号
35、 Fselサイト含む） ヒ ト FGF23 塩基配列 （シグナル配列部分を下線、 全長体からシグナル配列部分 を除いた mature.体部分を囲み線で示す。） （配列番号 36)
Figure imgf000057_0001
配列番号 36を基準にしたヒ ト FGF23ァミノ酸配列 （シグナル配列部分を下線、 全長体からシグナル配列部分を除いた mature体部分を囲み線で示す。）（配列番号 37)
Figure imgf000058_0001
iDNSPMASDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGCRPFAKFl]
(実施例 14) pPSs FGF23ベクターの構築
国際公開第 W02006/78072パンフレツ トの実施例 1一 8記載の pPSs5. 5を Sfol 及び Fselで消化後、大腸菌由来アル力リフォスファターゼを用いて末端脱リン酸 化したものに、 実施例 13で作製したヒ ト FGF23 を含む DNA断片を揷入した後、 DH5 a に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分の塩基配列 を確認して、 pPSs FGF23ベクター （図 1 0 ) を取得した。
(実施例 15) pUS FGF23 KIベクターの構築
国際公開第 TO 2006/78072号パンフレツトの実施例 4 3 - 1で作製された pCk loxPV A Pを Sail及ぴ Fselで酵素消化後、大腸菌 C75由来アル力リフォスファタ ーゼを用いて末端脱リン酸化したものに、 上記実施例 14の pPSs FGF23ベクター を Sail 及び Fsel で酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルより分離回収された約 1. 5kb の断片を揷入した後、 それを大 S昜菌 XL10- Gold Ultracorapetent Cells (STRATAGENE社） に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 連結部分 の塩基配列を確認して、 pUS FGF23 KIベクター （図 1 1 ) を取得した。
以下に pUS FGF23 KIベクターヒ ト FGF23発現ュニットの開始コドンから終止コ ドンまでのポリヌクレオチド配列 (FGF23 シグナル配列) を、 イントロン領域を 含んだマウス Ig Kシグナル配列 〔配列番号 38の下線部分〕 に置換し、 その下流 に FGF23 mature体配列を含む 985bp、 配列番号 38)、 及ぴ該 cDNAがコードするァ ミノ酸配列 （247アミノ酸、 下線の部分はマウス Ig κシグナル配列を示す、 配列 番号 39)を示す。イントロン領域を含んだマウス Ig f シグナル配列情報は GenBank より取得した MUSIGKVR1 (ァクセッション番号 K02159) をもとに、 その上流のゲ ノム配列を UCSCマウスゲノムデータベースより取得した。 08 052918 配列番号 38
Figure imgf000059_0001
TGGGGGAACGGGCCCGGAAGGCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG 配列番号 39：
Figure imgf000059_0002
SDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGCRPFAKFI
(実施例 16) エレク トロポレーシヨン用 pUS FGF23 KIベクターの調製
pUS FGF23 KIベクター 60 μ gを、 スペルミジン添加 （ 1 mM pH7. 0 シグマアルド リッチジャパン社） バッファー （ロシュ 'ダイァグノスティックス社、 制限酵素 用 Hバッファー） を用い、 Notl (タカラバイオ社） を用いて 37°Cで 5時間消化し、 フエノール/クロ口ホルム抽出後、 2. 5倍容量の 100%エタノール、 及び 0. 1倍容 量の 3M酢酸ナトリウムを加え、 - 20°Cで 16時間保存した。 Notlで一本鎖化され たベクターを遠心して回収後、 70%エタノールを加えて滅菌した。 クリーンベン JP2008/052918 チ内で 70%ェタノールを除き、 1時間風乾させた。 0. 5 g/ μ Lの DNA溶液となる ように HBS 溶液を加え、 1時間室温で保存し、 エレク トロポレーシヨ ン用 pUS FGF23 KIベクターの調製を行なった。
(実施例 17) pUS FGF23 KIベクターと RSエレメント · ターゲテイング ·マウス E S細胞株を用いた PL FGF23マウス E S細胞株の取得
ヒ ト FGF23- cDNAが相同組換えにより免疫グロプリン K 軽鎖遺伝子下流に揷入 された PL FGF23マウス E S細胞株取得のため、実施例 16で示された方法に従い、 制限酵素 Notlで線状化された pUS FGF23 KIベクターを、確立されている方法（相 沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 羊土社、 1995) に従って RSエレメント · ターゲテイング · マウス E S細胞へ導入した。国際公開 第 W0 2006/78072号パンフレツ トの実施例 1 0に記載された方法で RSエレメント
• ターグティング ·マウス E S細胞は敢得された。
RSエレメント ·ターグティング .マウス E S細胞の培養法は、 記載の方法 （相 沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞はマイ トマイシン C (シグマアルドリッチジャ パン社） 処理した G418耐性初代培養細胞 （ィンビトロジヱン社より購入） を用い た。 まず、増殖させた RSエレメント · ターゲティング ·マウス E S細胞をトリプ シン処理し、 3 X 107個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 0. 5ml の細胞懸濁 液を 10 ^ gのべクタ一 DNAと混和し、ジーンパルサーキュべット（電極距離：0. 4cm, バイオ ' ラッド ラボラトリーズ社）にてエレク トロポレーションを行った（容量：
960 n F, 電圧： 250V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培 地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 100匪組 織培養用プラスチックシャーレ (ファルコン、 べク トン ·ディッキンソン社) 1 枚に播種した。 36時間後に 0. 8 ;z g/mlのピューロマイシン （シグマアルドリッチ ジャパン社） を含む E S培地と置き換えた。 7日後に生じたコロニーをピックァ ップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで増殖させ、その
2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 シグマアルドリッチジャパン社） に 懸濁し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種 し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (キアゲン社） により調製した。 これらのピューロマイシン耐性 RSエレメン ト · ターゲテイング ·マウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (タカラバイ ォ社） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサザンブロットを 行い、 W0 00/10383号パンフレツト （実施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖： - C K ゲノム DNAの 3， 端の DNA断片（XhoI〜EcoRI、約 1. 4kb、W0 00/10383 号パンフレッ ト 図 5 ) Ck 3 ' probeをプローブとして相同組換え体を検出した。 野生型 RSエレメント · ターゲテイング ·マウス E S細胞では EcoRI消化により、 1本のバンド（15. 1 kb)が検出された。 相同組換え体においては、 このパンドに加 えてその下部に新たなバンド（12. 8 kb)が出ることが予想される （図 1 2 ) 力 ピ ユーロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。 すなわち、 これ らのクローンは一方のア レルの免疫グロブリ ン κ 鎖遺伝子下流にヒ ト FGF23- cDNAが揷入されたものである。
(実施例 18) PL FGF23マウス ES細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去した US FGF23 マウス ES細胞株の取得
PL FGF23マウス ES細胞株より 2種の薬剤耐性遺伝子 （Puro1, Neor) を除去し た US FGF23遺伝子導入 ES細胞株取得のため、 pCAGGS- Creベクター（Sunagaら、 Mol Reprod Dev. , 46： 109-113, 1997) を確立されている方法 （相沢慎一、 バイオ マニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 羊土社、 1995) に従って PL FGF23 マウス ES細胞へ導入した。
PL FGF23 マウス ES細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞はマイ トマイシン C (シグマアルドリッチジャパン社） 処理した G418 耐性初代培養細胞 （インビトロジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた
PL FGF23マウス ES細胞をトリプシン処理し、 3 X 107個/ ml となるように HBSに 懸濁してから、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 z gのベクター DNAと混和し、 ジーンパル サーキュベッ ト （電極距離： 0. 4cm、 バイオ . ラッドラボラトリーズ社） にてエレ タ トロポレーシヨンを行った （容量：960 /i F、 電圧： 250V、 室温）。 エレク トロポ レーシヨンした細胞を 10ml の E S培地 （相沢慎一、 前記） に懸濁し、 それより
2. 5ml分を、 あらかじめフィーダ一細胞を播種した 60mm組織培養用プラスチック 2008/052918 シャーレ （ファルコン、 ベタトン 'ディッキンソン社） 1枚に播種した。 30時間 後に ES細胞 1000個をあらかじめフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プ ラスチックシャーレ （ファルコン、 べクトン ·ディッキンソン社） 1枚に播種し た。 6日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを 24穴プレートでコン フルーェントになるまで増殖させ、 その 2/3 を 0. 2ml の保存用培地 （FBS+ 10% DMS0、 シグマアルドリッチジャパン社） に懸濁し、 _80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞 からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (キアゲン社） により調製した。 これらマウス E S細胞ゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (タカラバイオ社） で消化し、 ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサザンプロットを行い、 W0 00/10383 号パンフレツト （実施例 48参照） に記載の発明で使用された、 Ig軽鎖 J K - C /c ゲノム DNAの 3， 端の DNA断片 （XhoJ：〜 EcoRI、 約 1. 4kb、 W0 00/10383号パンフ レッ ト 図 5 ) Ck 3 ' probeをプローブとして loxPV配列で挟まれた Pure 遺伝子 のみが除去された ES 細胞株を検出した。 Pure 遺伝子を保持した ES 細胞では EcoRI消化により、 2本のバンド （15. 1 kb と 12. 8 kb) が検出され、 Puror遺伝 子のみが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のパンド （15. 1 kbと 10. 9 kb) が検出された （図 1 2 )。 また、 上記と同様の操作で得られたサザンブ ロット膜を用い、 国際公開第 TO 2006/78072号パンフレツ トの実施例 9で示され た方法により調製された 3 ' ΚΟ-probeをプローブとして ΙοχΡ配列で挟まれた Neo17 遺伝子のみが除去された ES細胞株を検出した。 Neo1^遺伝子を保持した ES細胞で は EcoRI消化により、 2本のパンド （7. 4 Kと 5. 7 K) が検出され、 Neor遺伝子の みが除去された ES細胞株では EcoRI消化により、 2本のパンド （5. 7 Kと 4. 6 K) が検出された （図 1 2 )。 これらの結果から、 PL FGF23マウス ES細胞株より 2種 の薬剤耐性遺伝子 （Puror， Neor) が同時に除去された ES細胞株 （US FGF23マウ ス ES細胞株） が得られた。
(実施例 19) US FGF23マウス E S細胞株及ぴ Bリンパ球欠損マウス系統由来宿主 胚を用いた US FGF23 KIキメラマウスの作製
免疫グロプリン μ鎖遺伝子ノックァゥトのホモ接合体においては、機能的な Β 2008/052918 リ ンパ球が欠損し、 抗体が産生されない （Kitamura ら， Nature, 350 : 423 - 426， 1991)。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚 を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。 この場合、 キメ ラマウスにおいて機能的な Bリンパ球は、大部分が注入した E S細胞に由来する。 本実施例では富塚らの報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 : 722-7， 2000) に 記載された免疫グロプリン β鎖遺伝子ノックァゥトマウスについて MCH(ICR) (日 本クレア社） 系統への戻し交配を 3回以上行った個体を宿主胚調製用として用い た。
上記実施例 18で得られ、 免疫グロプリン κ 鎖遺伝子下流にヒト FGF23- cDNA が挿入されていることが確認された US FGF23マウス ES細胞株を凍結ストツクょ り立ち上げ、それらを、上記免疫グロプリン μ鎖ノックァゥトマウスホモ接合体 の雌雄マウスの交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあたり 8〜10 個注入した。 E S培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲ ティング、 羊土社、 1995) でー晚培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠処理 後 2. 5日の仮親 MCH (ICR) マウス （日本クレア社） の子宮に、 片側の子宮あたり それぞれ約 10個のィンジェクション胚を移植した。実施例 18の US FGF23マウス ES細胞株を用いて作製されたィンジェクシヨン胚を移植した結果、子キメラマウ スが誕生した。 キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中に ES細胞由 来の野生色 （濃茶） が認められるかどうかによつて判定される。 誕生した子キメ ラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、 すなわち E S細胞の貢献の 認められる個体が得られた。 これらの結果より、免疫グロブリン κ鎖遺伝子下流 にヒ ト FGF23 - cDNAが揷入されている US FGF23マウス ES細胞株はキメラ形成能を 保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持しているこ とが示された。 また、 実施例 21で後述するように、 US FGF23 KIキメラマウスは 血中 FGF23濃度が高値であり、 低リン血症性クル病様の所見を示す病態モデル動 物として使用することが可能であった。
(実施例 20) コントロールキメラマウスの作製
国際公開第 W0 2006/78072号パンフレツトの実施例 1 1記載の方法に従い作製 52918 されたヒ ト FGF23- cDNA を含め機能遺伝子が挿入されていないキメラマウスは後 述する実施例 21の US FGF23 KIキメラマウスへの C10抗体投与実験において、 コ ントロールキメラマウス個体 （WTマウス） として用いられた。
(実施例 21) US FGF23 KIキメラマウスを用いた C10抗体の病態改善効果の検 実施例 10及び 12において、 C10抗体が 2C3B抗体や C15抗体に比べ顕著に正常 力二クイザルの内在性 FGF23の作用を抑制し、 その血清リン濃度及び血清 1，25D 濃度を上昇させることを示した。 ヒト FGF23に対する中和活性を有する抗体は、
FGF23過剰に由来する腫瘍性骨軟化症、 XLHなどを含む低リン血症性くる病'骨軟 化症などのヒ ト疾患において治療効果を有することが強く示唆される。 本研究に おいて取得された C10抗体によるヒ ト FGF23過剰に由来する病態の改善効果につ いて検討するために、 実施例 19 で作製した US FGF23 KI キメラマウス （以下 hFGF23KI マウス） を用いて実験を行った。 病態動物として hFGF23 KI マウスを
12匹、 その比較対象として同週齢の正常コントロールマウス （WTマウス、実施例
20で作製） 6匹を実験に使用した。 7週齢の時点で、 hFGF23 KIマウスの血清を採 血し FGF23 (FGF-23 ELISA KIT、 カイノス社） 及びリンの血清濃度をそれぞれ測 定した。 WTマウスに比して、 hFGF23 KIマウスにおいては顕著に血清 FGF23濃度 が上昇していることが示された (WTマウス ； n=6、 163pg/raL hFGF23KIマウス; n=12、 1467pg/mL) 0 この結果より、 hFGF23 KIマウスへのヒト FGF23遺伝子導入 は正確に行われ、 さらに hFGF23 KIマウス血中に外来性のヒト FGF23が過剰に存 在していることが示された。 さらに、 WTマウスに比して、 hFGF23 KI マウスにお いては血清リン濃度が顕著に低下していることが示され （WT マウス ； n=6、
5. 82mg/dL hFGF23KIマウス； n=12、 2. 62mg/dL)、 hFGF23 KIマウスにおいては過 剰なヒ ト FGF23作用により、 低リン血症が誘導されていることが示された。 この とき、 hFGF23 KI マウス 12匹を FGF23濃度が均等になるように、 それぞれ C10 抗体又はコントロール IgGl投与群の 6匹ずつ 2群に分けた（図 1 3 )。 次に、 8週 齢から、 C10抗体又はアイソタイプコントロール用の精製ヒ ト IgGl (コントロー ル抗体） を 30mg/kgの用量で静脈内に週 1回の頻度で 5回反復投与した。 初回投 8 052918 与前及び投与 3日後にマウスより採血し、血清を取得した。 四肢握力の測定は、 4 回目投与の 24 時間後に齋藤式マウス用握力測定装置（GRIP STRENGTH METER, MK-380S 室町機械）を用いて実施した。 四肢握力の評価は、 マウスを測定用ダリ ッド（網）に掴まらせ、 尾を手で水平に引き、 動物が引かれた力に耐え切れずにグ リツドを離すまでの最大の力（握力）を指標に実施した。 骨評価については、 5 回 目投与の 24時間後に、麻酔下において心採血により屠殺後、大腿骨及ぴ頸骨を探 取し、 70%エタノールで固定した。 血清リ ン濃度は、 初回投与前、 初回投与の 3 日後及び 5回目投与の 24時間後の血清を用いて測定した。大腿骨は、非脱灰樹脂 包埋後に Villanueva- Goldner染色し、組織学的評価を実施した。 頸骨は、灰化に よりミネラル含量を測定した。
その結果、 hFGF23KIマウスのコントロール抗体投与群では血清リン濃度は群分 け時及ぴ屠殺時共に、 WTマウスのコントロール抗体投与群に比して有意に低値を 示し、持続的な低リン血症状態であることが確認された（図 1 4 )。一方、 hFGF23KI マウスに C10抗体を投与した群では血清リン濃度は 3日後に WTマウスのコント口 ール抗体投与群と同レベルまで上昇することが確認された （図 1 4 )。 また、 C10 抗体の 5回目投与後の血清リン濃度も WTマウスのコントロール抗体投与群と同レ ベルであり、 5回の投与後でも C10抗体投与による血清リン上昇作用は維持され ていることが示された（図 1 5 )。
低リン血症患者の症例として、 骨格筋の筋力低下が臨床的に報告されている [Baker and orthley, Crit Care Resusc,， 4 : 307- 315， 2000]。 本試験において も、 hFGF23KIマウスは有意な低リン血症を呈していることから、 筋力の低下が予 想される。 そこで、 筋力の低下の指標として前述の方法で四肢握力を測定し、 各 群間で比較した。 その結果、 hFGF23KIマウスのコントロール抗体投与群の握力は WTマウスのコントロール抗体投与群に比して有意に低値を示し、 この病態モデル マウスにおいても、 筋力の低下が観察された （図 1 6 )。 これに対し、 hFGF23KI マウスの C10抗体投与群では握力の有意な改善効果も認められた （図 1 6 )。 次に、大腿骨の硬組織標本を Villanueva-Goldner法で組織染色し、観察すると、 コントロール抗体を投与した WT マウスに比してコントロール抗体を投与した hFGF23KI マウスには多量の類骨（図 1 7で赤色で示される）が確認されることか ら石灰化障害が引き起こされていることが示唆された。 これはクル病に特徴的な 症状として広く知られている。 これに対し、 C10抗体を投与した hFGF23KIマウス では、 類骨が減っていることが確認され、 類骨が石灰化骨 （図 1 7で緑色で示さ れる） に置き換わっていることが予想された。 この結果から、 FGF23過剰によつ て誘導された骨の石灰化障害を C10抗体は改善することが示唆された。 そこで、 頸骨を灰化しミネラル含量を測定し、 各群間で比較した。 hFGF23KIマウスのコン トロール抗体投与群の頸骨のミネラル含量は WT マウスのコントロール抗体投与 群に比して有意に低下していた （図 1 8 )。 これに対し、 hFGF23KI マウスの C10 投与群ではミネラル含量が改善していることが確認された（図 1 8 )。以上の結果 から、 hFGF23KIマウスにおいて、 C10抗体投与は生体内で過剰に作用しているヒ ト FGF23作用を中和し、 低リン血症、 筋力低下、 骨石灰化障害などの低リン血症 性クル病のさまざまな症状を改善することが確認された。 すなわち C10抗体は、 FGF23が関与するヒ トのさまざま疾患の有効な治療薬となることが示された。 産業上の利用可能性
本発明の FGF23に対する抗体である C10抗体は、 公知の FGF23に対する抗体に 比べ、 in vivoでの血清リン濃度を持続的に上昇させる活性及び/又は血清 1， 25D 濃度を持続的に上昇させる活性が高く、 FGF23の過剰作用が原因となり得る疾患、 又は FGF23の作用を調節することにより病態の改善が見込まれる疾患の予防及び 治療剤として顕著な効果をもって使用することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号；！〜 3、 5〜2 7、 3 0〜3 3、 4 0〜4 5 合成 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . ハイプリ ドーマ C10 (受託番号 FERM BP- 10772) が産生する抗体の重鎖可 変領域及び/または軽鎖可変領域を有する、ヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能 的断片。
2 . ヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断片であって、 配列番号 1 2の 20 番目の Qから 136番目の Sで示される重鎖アミノ酸配列及び/又は配列番号 1 4の 23番目の Aから 128番目の Kで示される軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒ ト FGF23に 対する抗体又はその機能的断片。
3 . 重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むヒト FGF23に対 する抗体又はその機能的断片であって、 重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号 1 2の 20番目の Qから 136番目の Sで示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配 列番号 1 4の 23番目の Aから 128番目の Kで示されるヒ ト FGF23に対する抗体又 はその機能的断片。
4 . ハイプリ ドーマ C10 (受託番号 FERM BP - 10772) より産生されるヒ ト FGF23 に対する抗体又はその機能的断片。
5 . ハイブリ ドーマ C10 (受託番号 FERM BP-10772) が産生する抗体が結合す るヒ ト FGF23上のェピトープの全部または一部に結合する抗体またはその機能的 断片。
6 . 機能的断片が Fab、 Fab' 、 F (ab ' ) 2、 ジスルフィ ド結合 Fv (dsFv) 、 二量 体化 V領域 （diabody)、 一本鎖 Fv (scFv) 及び CDRからなる群から選択されるぺ プチド断片である請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のヒ ト FGF23に対する抗体 又はその機能的断片。
7 . 請求項 1 〜 5のいずれか 1項に記载のヒ ト FGF23に対する抗体又はその機 能的断片であって、 その重鎖及び/又は軽鎖のアミノ酸配列において、 1又は数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び/又は 軽鎖を含むヒ ト FGF23に対 る抗体又はその機能的断片。
8 . 抗体のクラスが IgG、 IgA、 IgE又は IgMである請求項 1 〜 7のいずれか 1 項に記載のヒ ト FGF23に対する抗体。 9 . 抗体のサブクラスが IgGl、IgG2、IgG3又は IgG4である請求項8のヒ ト FGF23 に対する抗体。
1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のヒ ト FGF23に対する抗体又はその 機能的断片を有効成分として含む、 医薬組成物。
1 1 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のヒト FGF23に対する抗体又はその 機能的断片を有効成分として含む、 FGF23のリン代謝及び/又はビタミン D代謝を 調節し得る医薬組成物。
1 2 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のヒ ト FGF23に対する抗体又はその 機能的断片を有効成分として含む、 ミネラル代謝異常を伴う疾患の予防又は治療 用医薬組成物。
1 3 . ミネラル代謝異常を伴う疾患が、 腫瘍性骨軟化症、 ADHR、 XLH、 fibrous dysplasia 、 McCune- Albright syndrome及び常染色体劣性低リン血症からなる群 から選択される、 請求項 1 2に記載の医薬組成物。
1 4 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のヒ ト FGF23に対する抗体又はその 機能的断片を有効成分として含む、 骨粗鬆症、 クル病、 高カルシウム血症、 低力 ルシゥム血症、 異所性石灰化、 骨硬化症、 パジェット病、 副甲状腺機能亢進症、 副甲状腺機能低下症及ぴ搔痒からなる群から選択される疾患の予防又は治療用医 薬組成物。
1 5 . ハイブリ ドーマ C10 (受託番号 FERM BP-10772)。
1 6 . 配列番号 1 1に示される塩基配列の 58番目の Cから 408番目の Aで示さ れる塩基配列にコードされる重鎖可変領域のァミノ酸配列をコードする核酸。
1 7 . 配列番号 1 3に示される塩基配列の 67番目の Gから 384番目の Aで示さ れる塩基配列にコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸。
1 8 . 請求項 1 6又は 1 7に記載の核酸を含むベタタ一。
1 9 . 請求項 1 7に記載のベクターを含む宿主細胞。
2 0 . 請求項 1 9に記載の宿主細胞を培養し、ヒ ト FGF23に対する抗体又はその 機能的断片を発現させる工程を含む、 ヒ ト FGF23に対する抗体又はその機能的断 片の製造方法。
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