TWI422593B

TWI422593B - An anti-FGF23 antibody and a pharmaceutical composition containing the same

Info

Publication number: TWI422593B
Application number: TW097105234A
Authority: TW
Inventors: 山崎雄司; 浦川到; 吉田均; 青野友紀子; 山下武美; 島田孝志; 長谷川尚
Original assignee: 協和醱酵麒麟有限公司
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2014-01-11
Also published as: KR20090114452A; DK2502996T3; LT2502996T; LTC2502996I2; PL2128253T3; NL300945I2; CN102702355B; CN102702355A; AU2008215346A1; US20090148461A1; LUC00081I2; DK2128253T3; SI3181691T1; ES2530670T3; HK1140228A1; SI2502996T1; US20190106485A1; AU2008215346B2; CY2018021I1; DK3181691T3

Description

抗FGF23抗體及含有其之醫藥組合物

本發明係關於一種與FGF23抗原特異性結合之抗FGF23抗體。進而，本發明係關於一種以抗FGF23抗體為有效成分之針對由於FGF23過量產生或其他原因所導致的礦物質代謝性疾病之預防或治療劑，尤其是關於一種低磷血症性佝僂症/骨質軟化病之治療劑。

纖維母細胞生長因子(Fibroblast growth factor)，最初是作為刺激纖維母細胞株NIH3T3的生長之物質而自牛腦下垂體中純化而得。之後，自各種組織鑑定出類似的蛋白質，而此等之一群物質形成多肽家族(FGF家族)。目前為止，作為屬於FGF家族者，於脊椎動物中鑑定出22種蛋白質。作為該等蛋白質之生物活性，不僅已知有纖維母細胞生長活性，而且已知有中胚層或神經外胚層之生長或血管生成作用、發育階段之肢芽形成等涉及多方面的作用。FGF之基因的表現部位、表現時期係多種多樣，僅在發育階段或成人的特定部位表現者亦較多。作為編碼FGF的受體之基因，已知有FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4之至少4種；又，已知有於FGFR1、FGFR2、FGFR3中，由於剪接的不同而分別存在細胞外區域為不同之受體蛋白質。又，已知有肝素或硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG，heparan sulfate proteoglycans)，藉由與FGF或FGF受體產生相互作用而調節其作用。又，根據構造類似性而屬於FGF家族，但對於其生物活性或受體結合性等幾乎未瞭解者亦較多。對於此種FGF家族的特徵，已作為總論而獲得總結(參照非專利文獻1)。

FGF23(通常表示為FGF-23)，係藉由利用與FGF15的同源性之資料庫檢索及PCR法最初自小白鼠中選殖，進而再利用小白鼠FGF23的序列同源性而選殖出人類FGF23而成之蛋白質，人類的FGF23係由251個胺基酸殘基之多肽所構成。又，可預測作為分泌訊息序列之直至24號的胺基末端側序列，於分泌時會被切斷(參照非專利文獻2)。繼而，於體染色體顯性低磷血症性佝僂症/骨質軟化病(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalachia：以下稱為ADHR)之研究中，當對準ADHR患者的突變基因區域進行責任基因之鑑定時，於ADHR患者之FGF23的基因上特徵性地發現有錯義突變(missense mutation)(參照非專利文獻3)。根據該發現，強烈暗示FGF23在生物體內之生理重要性。另一方面，FGF23之生物活性，係藉由對低磷血症性佝僂症、骨質軟化病之一的腫瘤性骨質軟化病進行研究而確定。一般認為該疾病係因患者的責任腫瘤分泌產生液性的致病因子、且藉由該致病因子之作用而導致低磷血症、骨質軟化病等病態。

於對該責任腫瘤所產生之致病因子的探索中揭示有：藉由選殖作為在腫瘤中高度表現的基因之FGF23，進而投予該因子，而再現低磷血症或骨質軟化病(參照非專利文獻4及專利文獻1)。根據該研究揭示，FGF23與生物體內和磷或鈣有關連之代謝調節有關，並且暗示FGF23作為在生物體內循環而表現作用之全身性因子而發揮作用。進而，於其後的研究中亦揭示，實際上腫瘤性骨質軟化病患者血液中之FGF23濃度高於健康者(參照非專利文獻5及6)。

又，作為ADHR或腫瘤性骨質軟化病及臨床觀察結果中呈現類似症狀之疾病，已知有X性染色體低磷血症性佝僂病(X-linked hypophosphatemic rickets，以下稱為XLH)，於此病態中血中之FGF23濃度亦成為較高值(參照非專利文獻5及6)。

亦即，揭示有目前為止原因不明的腫瘤性骨質軟化病、於XLH等中所觀察到的抗維生素D佝僂病/骨質軟化病之分泌性致病因子為FGF23。進而，報告有於纖維性發育不良(fibrous dysplasia)、馬科恩-亞白特氏症侯群(McCune-Albright syndrome)、體染色體隱性低磷血症性佝僂病等其他礦物質代謝性疾病中，血液中之FGF23濃度的高值與低磷血症或佝僂症/骨質軟化病有關(參照非專利文獻7~9)。

根據以上報告揭示，生物體內之FGF23過剩狀態誘發了低磷血症或伴隨其之佝僂症/骨質軟化病等。進而，報告有，於慢性腎衰竭高磷血症中，血清FGF23亦為異常高的值，亦暗示過剩的FGF23與腎衰竭時之礦物質代謝性疾病等有部分關連之可能性(參照非專利文獻10及11)。

一般認為，於該等由於FGF23的過剩而誘發之疾病中，抑制FGF23的作用或者除去FGF23係疾病之治療方法。目前為止，作為抑制FGF23的作用者，報告有抗FGF23小白鼠單株抗體(參照專利文獻2)。若將該報告中所使用之抗FGF23小白鼠單株抗體2C3B及3C1E投予正常小白鼠，則藉由抑制內在性的小白鼠FGF23的功能，且抑制磷自腎的排泄，且改變腎中維生素D代謝酶的表現，從而顯示可提昇血清中之磷濃度及1α,25-二羥基維生素D(以下稱為1,25D)濃度。進而，對血清中之FGF23濃度為較高值且呈現低磷血症及骨伸長障礙或鈣化障礙之XLH模型小白鼠即Hyp小白鼠反覆投予抗FGF23小白鼠單株抗體，結果看見於Hyp小白鼠體內血中磷濃度上升，且改善骨的伸長障礙及鈣化障礙。根據該結果可認為：作為針對FGF23過剩疾病之藥劑，適宜使用抑制FGF23作用之抗體。然而，本報告中所使用之2C3B或3C1E抗體係來自小白鼠之抗體。被人類宿主識別為外來物之小白鼠抗體，有時會引起所謂「人類抗小白鼠抗體」即「HAMA」應答，且顯示嚴重的副作用(參照非專利文獻12)。

作為用以避免此種問題的方法之一，開發有嵌合抗體(參照專利文獻3及4)。嵌合抗體包含來自2種或2種以上的抗體的一部分(小白鼠抗體之可變區域及人類抗體之恆定區域等)。此種嵌合抗體之優點為，保持作為原來的小白鼠抗體的性質即與抗原之結合性等特徵，但另一方面仍然會引起「人類抗嵌合抗體」即「HACA」應答(參照非專利文獻13)。

進而，開發有經置換的抗體僅有一部分為互補決定區域(亦即「CDR」)之重組抗體(參照專利文獻5及6)。可使用 CDR移植技術，而產生由小白鼠CDR、人類可變部構架及恆定區域所構成之抗體(亦即「人類化抗體」)(參照非專利文獻14)。已知有，藉由使用此種方法將小白鼠抗體置換為人類抗體的序列，而使2C3B抗體等之抗FGF23小白鼠抗體人類化。然而，於人類化之情形時，有可能會產生與抗原之親和性降低等情形。

又，於XLH等中的低磷血症性佝僂病的目前的治療中，主要是採用除維生素D製劑以外再間歇性經口投予磷酸之方法，但每次的投予量及每日的投予次數較多，因此對患者強加很大的負擔之狀況亦成為問題。因此，業者期待有一種旨在減輕患者及其家庭的負擔，而具有如延長投予間隔的持續性，且顯示提昇血清磷濃度、血清1,25D濃度的作用之低磷血症治療藥。

專利文獻1：國際公開第WO02/14504號手冊

專利文獻2：國際公開第WO03/057733號手冊

專利文獻3：歐州專利申請公開第120694號說明書

專利文獻4：歐州專利申請公開第125023號說明書

專利文獻5：英國專利第GB2188638A號說明書

專利文獻6：美國專利第5585089號說明書

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非專利文獻14：Riechmann, L.等人，Nature, 332:323-327, 1988

本發明之目的在於提供一種抗FGF23之人類抗體、以及對患者的副作用較少之預防或治療劑等之醫藥組合物；該醫藥組合物係藉由使用上述抗體來抑制FGF23的作用而能夠進行預防或治療。

進而，本發明之目的在於提供一種抗FGF23抗體以及使用該抗體之FGF23相關疾病之預防或治療劑等之醫藥組合物；該抗FGF23抗體可作為低磷血症治療藥使用，與現有的抗FGF23抗體相比，以單次投予而具有更強的持續提昇血清磷濃度、血清1,25D濃度之作用。

作為目前低磷血症性佝僂病之治療方法，主要是採用一日數次同時間歇性經口投予維生素D製劑及磷酸的方法，但每次的投予量及每日的投予次數較多因此對患者強加很大的負擔之狀況會成為問題。本發明中所取得之抗FGF23人類單株抗體、C10抗體，顯示具有持續提昇血中磷濃度及1,25D之作用亦即強力的FGF23中和活性。於單次投予本研究中之C10抗體時，觀察到持續地提昇血清磷濃度、血清1,25D濃度之作用，從而暗示作為低磷血症治療藥，與目前的治療相比，C10抗體能夠進行具有顯著優越性之治療。

亦即，本發明如下所示。

[1]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其具有由融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772)所產生之抗體的重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域。

[2]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其包含序列號12之自20號的Q至136號的S中所示之重鏈胺基酸序列及/或序列號14之自23號的A至128號的K中所示之輕鏈胺基酸序列。

[3]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其係包含重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之胺基酸序列者，重鏈可變區域之胺基酸序列係以序列號12之自20號的Q至136號的S來表示，輕鏈可變區域之胺基酸序列係以序列號14之自23號的A至128號的K來表示。

[4]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其係由融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772)產生。

[5]一種抗體或其功能性片段，其係與由融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772)所產生抗體所結合之人類FGF23上的抗原決定區的全部或一部分相結合。

[6]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其係上述[3]之重鏈可變區域包含序列編號40的胺基酸序列中所示之互補決定區域(complementarity determining region，CDR)1、序列編號41的胺基酸序列中所示之CDR2、及序列編號42的胺基酸序列中所示之CDR3中之任一個或全部者。

[7]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其係上述[3]之輕鏈可變區域包含序列編號43的胺基酸序列中所示之CDR1、序列編號44的胺基酸序列中所示之CDR2、及序列編號45的胺基酸序列中所示之CDR3中之任一個或全部者。

[8]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其係重鏈可變區域包含序列編號40的胺基酸序列中所示之CDR1、序列編號41的胺基酸序列中所示之CDR2、及序列編號42的胺基酸序列中所示之CDR3中之任一個或全部者；係輕鏈可變區域包含序列編號43的胺基酸序列中所示之CDR1、序列編號44的胺基酸序列中所示之CDR2、及序列編號45的胺基酸序列中所示之CDR3中之任一個或全部者。

[9]如[1]至[8]中任一項之抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其中功能性片段係選自由Fab、Fab'、F(ab')₂ 、二硫鍵Fv(dsFv)、二聚物化V區域(diabody)、單鏈Fv(scFv)及CDR所組成群中之肽片段。

[10]如[1]至[8]中任一項之抗人類FGF23之抗體或其功能性片段，其包含具有於重鏈及/或輕鏈的胺基酸序列中有1個或數個胺基酸發生缺失、置換或附加的胺基酸序列之重鏈及/或輕鏈。

[11]如[1]至[10]中任一項之抗人類FGF23抗體，其中抗體之類型為IgG、IgA、IgE或IgM。

[12]如[11]之抗人類FGF23之抗體，其中抗體之亞型為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

[13]一種醫藥組合物，其含有如[1]至[12]中任一項之抗人類FGF23之抗體或其功能性片段作為有效成分。

[14]一種醫藥組合物，其含有如[1]至[12]中任一項之抗人類FGF23之抗體或其功能性片段作為有效成分，且可調節FGF23的磷代謝及/或維生素D代謝。

[15]一種伴有礦物質代謝異常之疾病之預防或治療用醫藥組合物，其含有如[1]至[12]中任一項之抗人類FGF23之抗體或其功能性片段作為有效成分。

[16]如[15]之醫藥組合物，其中伴有礦物質代謝異常之疾病，係選自由腫瘤性骨質軟化病、ADHR、XLH、纖維性發育不良、馬科恩-亞白特氏症侯群(McCune-Albright syndrome)及體染色體隱性低磷血症所組成之群。

[17]一種醫藥組合物，其係用於預防或治療選自由骨質疏鬆症、佝僂病、高鈣血症、低鈣血症、異位性鈣化、骨硬化症、佩吉特氏病(Paget's disease)、副甲狀腺機能亢進、副甲狀腺機能降低及搔癢所組成群之疾病，且含有如[1]至[12]中任一項之抗人類FGF23抗體或其功能性片段作為有效成分。

[18]一種融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772)。

[19]一種核酸，其對被編碼為序列號11中所示的鹼基序列的自58號的C至408號的A中所示的鹼基序列之重鏈可變區域的胺基酸序列加以編碼。

[20]一種核酸，其對被編碼為序列號13所示之鹼基序列的自67號的G至384號的A中所示的鹼基序列之輕鏈可變區域的胺基酸序列加以編碼。

[21]一種載體，其含有如[19]或[20]之核酸。

[22]一種宿主細胞，其含有如[21]之載體。

[23]一種抗人類FGF23之抗體或其功能性片段之製造方法，其包括培養如[22]之宿主細胞，且使抗人類FGF23之抗體或其功能性片段得以表現之步驟。

本說明書包含作為本申請案優先權基礎之日本專利申請2007-34018號之說明書及/或圖示中所記載之內容。

以下，藉由明確本發明中所使用語句之意義而詳細說明本發明。

I.本發明之抗體 1.抗FGF23抗體及其功能性片段

本發明之抗體係纖維母細胞生長因子(FGF)家族之一即抗FGF23之抗體。

本發明之所謂「抗FGF23之抗體」，係指與FGF23或其一部分相結合之抗體、與FGF23或其一部分具有反應性之抗體、或者可識別FGF23或其一部分之抗體。有時亦將抗FGF23之抗體稱為抗FGF23抗體。於本發明中，所謂抗體，係指構成免疫球蛋白之重鏈可變區域及重鏈恆定區域以及包含輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域在內之全部區域，係指由編碼免疫球蛋白的基因所產生之免疫球蛋白。抗體較好的是單株抗體。此處，所謂FGF23之一部分，係指序列號4中所表示的FGF23之全長胺基酸序列的一部分胺基酸序列，係指由連續的胺基酸序列所構成之FGF23的片段肽。較好的是含有由序列號12中自20號的Q至136號的S所構成之胺基酸序列、及/或由序列號14中自23號的A至128號的K所構成之胺基酸序列之抗體；更好的是由融合瘤C10所產生之抗體。序列號12係含有抗FGF23之抗體的重鏈可變區域的引導序列之胺基酸序列；由序列編號12中自20號的Q至136號的S所構成之胺基酸序列，係除引導序列部分以外之成熟體部分的胺基酸序列。又，序列號14係含有抗FGF23之抗體的輕鏈可變區域的引導序列之胺基酸序列；由序列號14中自23號的A至128號的K所構成之胺基酸序列，係除引導序列部分以外之成熟體部分的胺基酸序列。作為抗體之類型，係使用免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)及免疫球蛋白M(IgM)，較好的是IgG。進而，作為IgG之亞型，係使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，較好的是IgG1、IgG2及IgG4，更好的是IgG1。

本申請發明之抗體，亦包含含有新穎的互補決定區域(complementarity determining region，CDR)胺基酸序列之抗FGF23抗體。

於抗體之可變區域內有CDR存在，該部分發揮著特異性識別抗原之作用。可變區域的除CDR以外之部分，具有保持CDR構造之作用，稱為架構區域(FR)。重鏈及輕鏈之C末端側有恆定區域存在，分別被稱為重鏈恆定區域(CH)、輕鏈恆定區域(CL)。

於重鏈可變區域中，存在有第1互補決定區域(CDR1)、第2互補決定區域(CDR2)及第3互補決定區域(CDR3)之3個互補決定區域。將重鏈可變區域中之3個互補決定區域總稱為重鏈互補決定區域。於輕鏈可變區域中，亦同樣存在有第1互補決定區域(CDR1)、第2互補決定區域(CDR2)及第3互補決定區域(CDR3)之3個互補決定區域。將輕鏈可變區域中之3個互補決定區域總稱為輕鏈互補決定區域。該等CDR，可利用Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,(1991)等來確定。

作為本申請發明之抗體，較好的是，作為重鏈互補決定區域，具有CDR1為序列號40者、CDR2為序列號41者、CDR3為序列號42者中之至少一個或者全部。又，作為輕鏈互補決定區域，具有CDR1為序列編號43者、CDR2為序列編號44者、CDR3為序列編號45者中之至少一個或者全部。更好的是，與作為重鏈互補決定區域，CDR1具有序列號40、CDR2具有序列號41、CDR3具有序列號42，且作為輕鏈互補決定區域，CDR1具有序列號43、CDR2具有序列號44、CDR3具有序列號45之FGF23相結合之抗體。

對於本發明之抗體之CDR序列未必有限定，較好的是，含有序列號40至45中所示的CDR序列中的任一個1以上、較好的是重鏈的3個CDR、更好的是6個CDR之抗體。對於除CDR以外之胺基酸序列並無特別限定，除CDR以外之胺基酸序列係來自其他抗體尤其是其他種類的抗體之所謂CDR移植抗體，亦可包含於本發明之抗體中。其中，較好的是除CDR以外的胺基酸序列係來自人類之人類化抗體或者人類抗體，亦可根據需要於FR上有1個至數個胺基酸殘基產生附加、缺失、置換及/或插入。人類化抗體或人類抗體之製作方法可採用公知的方法。

所謂「功能性片段」，係指抗體之一部分(部分片段)，係指具有1個以上的抗體對抗原之作用者，亦即保持對抗原的結合能力、對抗原的反應性或抗原識別能力者，可舉出：Fv、二硫鍵Fv(dsFv)、單鏈Fv(scFv)、及該等之聚合物等。具體而言，可舉出：Fab、Fab'、F(ab')₂ 、scFv、diabody、dsFv及含有CDR之肽等[D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.,1998 T.J.International Ltd]。

Fab係如下之抗體片段：以蛋白質分解酶木瓜蛋白酶對與FGF23相結合的抗體進行處理而獲得之片段中，重鏈(H鏈)的胺基末端側的約一半與輕鏈(L鏈)全體以二硫鍵進行鍵結的分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。

本發明之Fab，可利用蛋白質分解酶木瓜蛋白酶對與FGF23相結合之抗體進行處理而獲得。或者，可將編碼該抗體的Fab之DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造Fab。

F(ab')₂ 係如下之抗體片段：以蛋白質分解酶胃蛋白酶對IgG進行處理而獲得之片段中，Fab大於經由鉸鏈區(hinge region)的二硫鍵而鍵結者，且分子量約為10萬之具有抗原結合活性之抗體片段。

本發明之F(ab')₂ ，可利用蛋白質分解酶胃蛋白酶對本發明之與FGF23相結合的抗體進行處理而獲得。或者，可使下述Fab'以硫醚鍵或二硫鍵進行鍵結而製作。

Fab'係將上述F(ab')₂ 的鉸鏈區的二硫鍵加以切斷的分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。

本發明之Fab'，可利用還原劑二硫蘇糖醇對本發明之與FGF23相結合的F(ab')₂ 進行處理而獲得。或者，可將編碼該抗體的Fab'片段之DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造Fab'。

scFv，係利用適當的肽連結子(以下表示為P)將1條重鏈可變區域(以下表示為VH)與1條輕鏈可變區域(以下表示為VL)連結而成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，係具有抗原結合活性之抗體片段。

本發明之scFv可藉由如下方法而製造：取得編碼本發明之與FGF23相結合之抗體的VH及VL之cDNA，構建編碼scFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造scFv。

diabody係scFv經二聚物化之抗體片段，係具有二價之抗原結合活性之抗體片段。二價之抗原結合活性可為相同的抗原結合活性，亦可使其中一個具有不同的抗原結合活性。

本發明之diabody可藉由如下方法而製造：取得編碼本發明之與FGF23相結合之抗體的VH及VL之cDNA，以肽連結子的胺基酸序列長度成為8個殘基以下之方式構建編碼scFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造diabody。

dsFv，係指使將VH及VL中的各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基的多肽，經由該半胱胺酸殘基間的二硫鍵進行鍵結而成者。被置換為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基，可依照Reiter等人所揭示之方法(Protein Engineering,7：697-704,1994)，基於抗體的立體構造之預測來選擇。

本發明之dsFv可藉由如下方法而製造：取得編碼本發明之與FGF23相結合之抗體的VH及VL之cDNA，構建編碼dsFv之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造dsFv。

含有CDR之肽，係含有VH或VL之CDR的至少1個以上之區域而構成。含有複數個CDR之肽，可直接使其鍵結或者經由適當的肽連結子使其鍵結。

本發明之含有CDR之肽可藉由如下方法而製造：構建編碼本發明之與FGF23相結合之抗體的VH及VL的CDR之DNA，將該DNA插入原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造含有CDR之肽。

又，含有CDR之肽，亦可藉由Fmoc法(茀基甲氧基羰基法)、tBoc法(第三丁氧基羰基法)等化學合成法而製造。

進而，「功能性片段」係抗體之片段，係可與抗原(FGF23)結合之片段。較好的是，「功能性片段」係可與包含由序列號12之自20號的Q至136號的S所構成之胺基酸序列、及/或由序列號14之自23號的A至128號的K所構成之胺基酸序列之FGF23相結合之片段。較好的是，「功能性片段」係具有序列號40至45所示之CDR中的至少1個或全部，且可與FGF23結合之片段。更好的是，「功能性片段」係源於由融合瘤C10所產生之抗體的可變區域者，係可與FGF23相結合之片段。

本發明之抗體，包含以化學方式或基因工程學方式，使放射性同位素、低分子藥物、高分子藥物、蛋白質等與本發明之抗FGF23的抗體或抗體的功能性片段相結合而成的抗體之衍生物。

本發明之抗體之衍生物，可藉由化學方法(抗體工學入門，金光修著，地人書館，1994)等，使放射性同位素、低分子藥物、高分子藥物、蛋白質等與本發明之抗FGF23之抗體或者抗體的功能性片段之H鏈(重鏈)或L鏈(輕鏈)的胺基末端側或羧基末端側、抗體或者抗體的功能性片段中之適當的置換基或側鏈相結合、進而與抗體或抗體的功能性片段中的糖鏈等相結合而製造。

又，使蛋白質相結合而成之抗體之衍生物，可藉由使編碼本發明之抗FGF23之抗體及抗體的功能性片段之DNA與編碼欲結合的蛋白質的DNA相連接，將其插入表現用載體中，再將該表現載體導入適當的宿主細胞中，使其表現而製造。

至於放射性同位素，可舉出¹³¹ I、¹²⁵ I等，例如可藉由氯胺T法等使放射性同位素與抗體結合。

至於低分子藥物，可舉出：氮芥、環磷醯胺等之烷化劑，5-氟尿嘧啶、甲胺喋呤(methotrexate)等之代謝拮抗劑，道諾黴素(daunomycin)、博萊黴素(bleomycin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(adriamycin)等之抗生素，如長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)之植物生物鹼，他莫昔芬(tamoxifen)、地塞米松(dexamethasone)等荷爾蒙劑等之抗癌劑(臨床腫瘤學，日本臨床腫瘤研究會編，癌與化學療法出版社，1996)；氫化可體松(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)等之類固醇劑，阿司匹靈(aspirin)、吲哚美辛(indometacin)等之非類固醇劑，硫蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)、青黴胺(penicillamine)等之免疫調節劑；環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)等之免疫抑制劑；如馬來酸氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)、氯馬斯汀(clemastine)之抗組織胺劑等之抗發炎劑(發炎與抗發炎療法，醫齒藥出版股份有限公司，1982)等。該等低分子藥物與抗體之結合，可藉由公知方法進行。例如，使道諾黴素與抗體結合之方法，可舉出：經由戊二醛使道諾黴素與抗體的胺基之間結合之方法、經由水溶性碳化二醯亞胺使道諾黴素的胺基與抗體的羧基結合之方法等。藉由使該等低分子藥物與抗體結合，而獲得具有低分子藥物所具有功能的抗體之衍生物。

至於高分子藥物，可舉出：聚乙二醇(以下表示為 PEG)、白蛋白、聚葡萄糖(dextran)、聚氟乙烯、苯乙烯-馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與抗體或抗體的功能性片段結合，而期待獲得(1)提昇針對化學性、物理性或生物性的各種因素之穩定性，(2)血中半衰期之顯著延長，(3)免疫原性之消失、抑制抗體產生等效果(生物結合醫藥品，廣川書店，1993)。例如，作為使PEG與抗體結合之方法，可舉出與PEG化修飾試劑反應之方法等(生物結合醫藥品，廣川書店，1993)。至於PEG化修飾試劑，可舉出：離胺酸的ε-胺基之修飾劑(日本專利特昭61-178926號公報)、天冬胺酸及麩胺酸的羧基之修飾劑(日本專利特昭56-23587號公報)、精胺酸的胍基之修飾劑(日本專利特平2-117920號公報)等。

與蛋白質結合之抗體，可作為融合抗體之形式而獲得。亦即，使編碼特定蛋白質之cDNA與編碼抗體或抗體的功能性片段之cDNA相連結，而構建對特定蛋白質與抗體所形成融合蛋白質加以編碼之DNA，將該DNA插入原核生物或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入原核生物或真核生物中，藉此使其表現，而製造上述與特定蛋白質相結合之融合抗體。

本發明之抗FGF23之抗體或者抗體之功能性片段，可藉由ELISA(Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14,1988；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,Academic Press Limited,1996)等的免疫學方法、或者以生物感測器Biacore所測定的結合解離常數(Journal of Immunological Methods,145：229-240,1991)、以及測定對使用klotho表現細胞之人類FGF23刺激所引起的早期生長應答基因-1(Early growth response gene-1)之啟動子活性化的抑制活性(Nature,444：770-774,2006)等，來對與人類FGF23之結合活性、抑制人類FGF23的功能之活性進行評價。

本發明中所謂「人類抗體」，意指作為源自人類之抗體基因的表現產物之抗體。人類抗體可藉由如下方法而獲得：以下述方式導入人類抗體基因座，將抗原投予給具有可產生源自人類的抗體之能力的基因轉殖動物。至於該基因轉殖動物，可舉出小白鼠；可產生人類抗體之小白鼠的製作方法，例如記載於國際公開第WO02/43478號手冊中。

至於本發明之抗體，例如可舉出：下述實施例所記載之由C10融合瘤所產生之抗體(C10抗體)。C10融合瘤，係以寄存號碼FERM BP-10772(為了識別而表示為C10)並基於布達佩斯條約，於2007年2月2日國際寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(日本國茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6)；並已於2008年5月6日寄存於食品工業發展研究所，且授予寄存號碼為BCRC 960353。

於本發明之抗體或功能性片段中，亦包含：含有由構成抗體或功能性片段之重鏈及/或輕鏈的各個胺基酸序列中有1個或數個胺基酸產生缺失、置換或附加的胺基酸序列所構成之重鏈及/或輕鏈之單株抗體或其功能性片段。此處，所謂「1或數個」之「數個」，係指9個以下、較好的是5個以下、更好的是3個以下、尤其好的是2個。如上述之胺基酸之部分改變(缺失、置換、插入、附加)，可藉由部分地改變編碼其胺基酸序列之鹼基序列，而將其導入本發明之抗體或功能性片段的胺基酸序列中來實現。該鹼基序列之部分改變，可利用已知的部位特異性突變導入法(site specific mutagenesis)，藉由常規方法將其導入而實現[Proc Natl Acad Sci USA.,81：5662-5666,1984]。本發明之抗體亦包含具有任一免疫球蛋白類型及同型之抗體。

本發明之抗FGF23之抗體，可藉由如下製造方法來製造。亦即，例如使用FGF23、其一部分或其一部分與用以提昇抗原的抗原性之適當的載體物質(例如，牛血清白蛋白等)的結合物、並且根據需要使用免疫活化劑(Freund之完全或不完全助劑等)，而對人類抗體產生基因轉殖小白鼠等之非人類哺乳動物進行免疫。FGF23可使用天然之FGF23，亦可使用重組FGF23。或者，亦可藉由將編碼FGF23之基因導入表現載體中，於動物內使FGF23蛋白質得以表現，而進行免疫致敏。單株抗體可藉由以下方法而獲得：藉由將自免疫致敏動物中獲得的抗體產生細胞與無自身抗體產生能力的骨髓腫瘤系細胞(骨髓瘤細胞)加以融合而獲得融合瘤，再培養該融合瘤，選擇出產生對用於免疫的抗原顯示有特異親和性的單株抗體之細胞株。

本發明之抗體，亦包含藉由業者所熟知之基因工程學改變(例如，參照歐州專利EP314161號公報)而轉換為不同的亞型而成者。亦即，使用編碼本發明之抗體的可變區域之DNA，且利用基因工程學方法，可獲得與原來的亞型不同亞型之抗體。

2.本發明之抗體之製造

單株抗體之製造包括下述步驟。亦即：(1)製備作為免疫原而使用之抗原蛋白質或者抗原蛋白質表現載體，(2)藉由將抗原注入動物體內或者使抗原於動物體內得以表現而進行免疫後，進行採血，鑑定其抗體價以決定脾臟等的摘取時期，而製備抗體產生細胞之步驟，(3)製備骨髓腫瘤細胞(骨髓瘤)，(4)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合，(5)篩選產生目標抗體之融合瘤群，(6)分割為單一細胞株(選殖)，(7)根據情況，培養用於大量製造單株抗體之融合瘤、或者飼養移植有融合瘤之動物，然後(8)鑑定如此製造之單株抗體的生理活性及其識別特異性、或者鑑定作為標記試劑之特性等。

以下，依上述步驟對抗FGF23單株抗體之製作方法進行詳細說明，但該抗體之製作方法並不限定於此，例如亦可使用除脾細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。

(1)抗原之純化

作為抗原，可使用利用基因重組技術將編碼FGF23之DNA序列整合於合適的表現質體中，於大腸桿菌或動物細胞等宿主內外進行生產後加以純化而成之FGF23蛋白質。人類FGF23之蛋白質的一次結構為公知[基因庫GenBank accession No.AAG09917，序列號4]，因此亦可藉由業者所熟知的方法，根據FGF23的胺基酸序列來化學合成部分肽，再將其作為抗原使用。

(2)抗體產生細胞之製備步驟

將(1)中所獲得之抗原與Freund完全或不完全助劑或如鉀明礬之助劑加以混合，將其作為免疫原對實驗動物實行免疫。作為實驗動物，最適宜使用具有可產生源自人類的抗體之能力的基因轉殖小白鼠，此種小白鼠係記載於富塚等人的文獻[Tomizuka.等人，Proc Natl Acad Sci USA.,97：722-727,2000]中。

實行小白鼠免疫時之免疫原投予法，可為皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、肌內注射、足墊注射等中之任一種，較好的是腹腔注射、足墊注射或靜脈注射。

免疫可進行一次，或者以適當的間隔重複進行數次。其後，測定針對經免疫動物血清中的抗原之抗體價，若將抗體價充分提高之動物作為抗體產生細胞之供給源使用，則可提高以後的操作之效率。一般而言，較好的是將最終免疫後3~5日後的源自動物之抗體產生細胞用於後面的細胞融合。

此處所使用之抗體價的測定方法，可舉出：放射性同位素免疫定量法(以下稱為「RIA法」)、固相酶免疫定量法(以下稱為「ELISA法」)、螢光抗體法、被動血球凝集反應法等各種公知技術，就檢測靈敏度、快速性、正確性、及自動化操作之可能性等觀點而言，更適宜的是RIA法或ELISA法。

本發明之抗體價的測定，例如若利用ELISA法，則可依以下所記載的步驟進行。首先，使抗人類抗體之抗原吸附於ELISA用96孔培養盤等的固相表面，進而利用與抗原無關的蛋白質例如牛血清白蛋白(BSA)覆蓋未吸附有抗原的固相表面，清洗該表面後，作為一次抗體使其與經階段稀釋之試料(例如具有產生源自人類的抗體之能力的基因轉殖小白鼠之血清)接觸，從而使試料中之抗FGF23抗體與上述抗原結合。進而，加入經酶標記的抗人類抗體之抗體作為二次抗體，使其與人類抗體結合，清洗後加入該酶之基質，再基於基質分解測定由於顯色而造成之吸光度變化等，藉此算出抗體價。

(3)骨髓瘤之製備步驟

作為骨髓瘤，可使用源自小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人類等哺乳動物的無自身抗體產生能力之細胞，一般而言，較好的是使用自小白鼠獲得之株化細胞，例如耐8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine)性小白鼠(源自BALB/c)骨髓瘤株P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton,D.E.等人。Current Topics in Microbiology and Immunology,81：1-7,1978]、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler,G.等人。European J.Immunology,6：511-519,1976]、Sp2/O-Ag14(SP2/O)[Shulman,M.等人。Nature,276：269-270,1978]、P3X63Ag8.653(653)[Kearney,J.F.等人。J.Immunology, 123：1548-1550,1979]、P3X63Ag8(X63)[Horibata,K.and Harris,A.W.Nature,256：495-497,1975]等。該等細胞株，係於適當的培養基例如8-氮鳥嘌呤培養基[於加入有麩胺酸、2-巰基乙醇、gentamicin及牛胎血清(以下，將牛胎血清稱為「FCS」)之RPMI-1640培養基中，進一步加入8-氮鳥嘌呤之培養基]、Iscove改良Dulbecco培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium；以下稱為「IMDM」)、或Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)中進行繼代培養，於細胞融合的3~4日前於正常培養基(例如，含有10%FCS之DMEM培養基)中進行繼代培養，且於融合當日確保有2×10⁷ 以上之細胞數。

(4)細胞融合

抗體產生細胞係漿細胞及作為其前驅細胞之淋巴球，其可自個體的任一部位獲得，一般而言，可自脾臟、淋巴結、骨髓、扁桃體、末梢血液、或適當組合該等而成者等中獲得，最常用的是脾細胞。

於最終免疫後，自達到特定抗體價之小白鼠中摘取抗體產生細胞所存在之部位例如脾臟，製備作為抗體產生細胞之脾細胞。繼而，若使脾細胞與骨髓瘤融合即可。作為使該脾細胞與步驟(3)中所獲得的骨髓瘤相融合之方法，現在最常用的方法係細胞毒性較小且融合操作亦簡單之使用聚乙二醇之方法。該方法例如由以下步驟構成。

以無血清培養基(例如DMEM)或磷酸緩衝生理食鹽液(以下稱為「PBS」)，對脾細胞及骨髓瘤進行充分清洗，以脾細胞與骨髓瘤的細胞數之比成為5：1~10：1左右之方式將其混合，再進行離心分離。除去上清液，將沈澱之細胞群充分地分開後，一面攪拌一面滴加1mL之含有50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000~4000)之無血清培養基。其後，緩慢加入10mL之無血清培養基後，進行離心分離。再次除去上清液，將沈澱之細胞懸浮於含有適量的次黃嘌呤/胺基喋呤/胸腺嘧啶(以下稱為「HAT」)液及人類介白素-6(以下稱為「IL-6」)之正常培養基(以下稱為「HAT培養基」)中，再分別注入培養用培養盤(以下稱為「培養盤」)的各孔中，於5%二氧化碳的存在下於37℃下培養2週左右。中途可適當補充HAT培養基。

(5)融合瘤群之選擇

於上述骨髓瘤細胞為耐8-氮鳥嘌呤性株之情形時，亦即為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺損株之情形時，未經融合之該骨髓瘤細胞、及骨髓瘤細胞間之融合細胞，於含有HAT之培養基中無法生存。另一方面，抗體產生細胞彼此間之融合細胞、或者抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤可生存，但抗體產生細胞彼此間之融合細胞有一定壽命。因此，藉由持續於含有HAT之培養基中進行培養，而僅使作為抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞之融合瘤生存，結果可選擇出融合瘤。

對於生長成群落狀之融合瘤，係與自HAT培養基中除去胺基喋呤之培養基(以下稱為「HT培養基」)進行培養基交換。以後，採取培養上清液的一部分，再例如藉由ELISA法測定抗FGF23抗體價。

以上，例示有使用耐8-氮鳥嘌呤之細胞株的方法，但亦可根據融合瘤的選擇方法使用其他細胞株，此時所使用之培養基組成亦有變化。

(6)選殖步驟

藉由以與(2)之抗體價測定方法同樣之方法測定抗體價，而將判明產生特異性抗體之融合瘤移入其他培養盤中進行選殖。至於該選殖法，可舉出：以培養盤的1個孔含有1個融合瘤之方式進行稀釋再進行培養之限數稀釋法、於軟瓊脂培養基中進行培養再回收群落之軟瓊脂法、利用顯微操作器逐個取出細胞再進行培養之方法、利用細胞分類器分離出1個細胞之「分類選殖」等，而限數稀釋法較為簡便，因而被經常採用。

對於經確認抗體價之孔，例如可藉由限數稀釋法重複進行2~4次選殖，待其穩定後，將經確認抗體價者作為抗FGF23單株抗體產生融合瘤株而進行選擇。

(7)藉由融合瘤培養而製備單株抗體

對於選殖結束之融合瘤，係將培養基自HT培養基換成正常培養基進行培養。大量培養，係藉由使用大型培養瓶之旋轉培養、攪拌式培養，或者使用中空纖維系統等之培養而進行。採用凝膠過濾等業者所熟知的方法對該大量培養中的上清液進行純化，藉此可獲得抗FGF23單株抗體。又，可藉由於相同系統的小白鼠(例如BALB/c)或者nu/nu 小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠或兔等的腹腔內使該融合瘤生長，而獲得含有大量抗FGF23單株抗體之腹水。作為簡便的純化方法，亦可利用市售之單株抗體純化試劑盒(例如，MAbTrap GII試劑盒，GE Healthcare Bioscience公司)等。

如此獲得之單株抗體對FGF23具有較高的抗原特異性。

或者，自融合瘤等抗體產生細胞中選殖出編碼人類單株抗體之基因，將其整合入適當的載體中，再導入宿主(例如哺乳類細胞細胞株、大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)中，亦可製備利用基因重組技術所產生之重組型抗體(Delves,P.J.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、Shepherd,P.and Dean C.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。

本發明亦包含含有產生本發明之抗體的融合瘤所保有的抗體的基因序列之核酸，尤其是包含下述本發明之融合瘤所產生之抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之核酸。此處，核酸中含有DNA及RNA。進而，本發明亦包含自上述重鏈可變區域及輕鏈可變區域之核酸中除去編碼訊息序列之區域的成熟體部分之核酸。又，本發明之核酸，除上述核酸以外，亦包含具有與本發明之抗體的胺基酸序列及該抗體的抗體重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域的胺基酸所對應之密碼子的核酸。

自融合瘤製備編碼單株抗體之基因，係採用如下方法：利用PCR法等，製備分別編碼單株抗體的L鏈V區域、L鏈C區域、H鏈V區域及H鏈C區域之DNA。此時，作為引子，可使用根據抗FGF23抗體基因或胺基酸序列而設計之寡DNA；作為模板，可使用由融合瘤所製備之DNA。將該等DNA整合於1個適當的載體中，將其導入宿主中使其表現，或者分別將該等DNA整合於適當的載體中，再使其共同表現。

作為載體，係使用可於宿主微生物內自律性生長之噬菌體或質體。至於質體DNA，可舉出：源自大腸桿菌、枯草桿菌或酵母之質體等；至於噬菌體DNA，可舉出λ噬菌體。

作為用於基因轉殖之宿主，若係可表現目標基因者，則無特別限定。例如可舉出：細菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞。

向宿主中導入基因之方法係眾所周知者，可舉出任意方法(例如，使用鈣離子之方法、電穿孔法、原生質球狀體法、醋酸鋰法、磷酸鈣法、脂質體轉染法(lipofection)等)。又，至於將基因導入下述動物體內之方法，可舉出：顯微注射法、利用電穿孔或脂質體轉染法將基因導入ES細胞中之方法、細胞核移植法等。

於本發明中，抗FGF23抗體，可藉由培養基因轉殖體再自其培養物中採集而得。此處，所謂「培養物」，意指(a)培養上清液、(b)培養細胞或者培養菌體或其粉碎物、以及(c)基因轉殖體之分泌物中之任一個。在培養基因轉殖體中，係使用適於所使用宿主的培養基，且採用靜置培養法、使用旋轉瓶之培養法等。

於培養後在菌體內或細胞內生產目標抗體之情形時，係藉由粉碎菌體或細胞而採取抗體。又，於菌體外或細胞外生產目標抗體之情形時，係直接使用培養液，或者利用離心分離等除去菌體或細胞。其後，可藉由單獨或適當組合利用使用有蛋白質分離純化中所使用的各種層析法之普通生物化學方法，而自上述培養物中分離純化出目標抗體。

進而，亦可利用基因轉殖動物製作技術，製作將目標抗體的基因整合於內在性基因中之動物宿主例如基因轉殖牛、基因轉殖山羊、基因轉殖綿羊或基因轉殖豬，從由此基因轉殖動物分泌的乳汁中取得大量源自其抗體基因之單株抗體(Wright,G.，等人。Bio/Technology 9：830-834,1991)。於將融合瘤進行體外培養之情形時，可按照所培養之細胞種的特性、試驗研究的目的及培養方法等之各種條件，使融合瘤生長、維持及保存，於培養上清液中使用用以產生單株抗體之已知營養培養基或者由已知的基本培養基所誘導製備之所謂營養培養基而實施。

(8)單株抗體之鑑定

如此獲得之單株抗體之同型及亞型，可以如下方式來決定。首先，作為鑑定方法，可舉出歐氏雙向擴散 (Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法。歐氏雙向擴散法較為簡便，但於單株抗體的濃度較低之情形時，需要進行濃縮操作。另一方面，於採用ELISA法或RIA法之情形時，可藉由直接使培養上清液與抗原吸附固相相反應，進而使用與各種免疫球蛋白同型、亞型相對應的抗體作為二次抗體，而鑑定單株抗體之同型、亞型。

進而，蛋白質之定量，可藉由Folin-Lowry法、及由280nm處之吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/mL]進行計算之方法等而進行。

單株抗體之識別抗原決定區之鑑定(抗原決定點分析)，可藉由如下方式進行。首先，製作識別單株抗體之分子的各種部分結構。當製作部分結構時，則有使用公知的寡肽合成技術來製作其分子的各種部分肽之方法；以及利用基因重組技術將編碼目標部分肽之DNA序列整合於合適的表現質體中，再於大腸桿菌等宿主內外進行生產之方法等；但為了達成上述目的，通常是組合使用兩者。例如，利用業者所熟知的基因重組技術，製作依序自抗原蛋白質的羧基末端或胺基末端縮短適當長度而成之一系列多肽，然後研究單株抗體對其等的反應性，以決定大致的識別部位。

其後，更詳細而言，利用業者所熟知的寡肽合成技術來合成其對應部分之寡肽、或該肽之突變體等，再調查本發明之預防或治療劑中作為有效成分而含有的單株抗體對於其等肽之結合性，或者調查肽對於該單株抗體與抗原的結合之競爭抑制活性，藉此來限定抗原決定區。作為用以獲得多種寡肽之簡便方法，亦可利用市售之試劑盒(例如，SPOTs試劑盒(Genosys Biotechnologies公司)、利用多中心合成法(Multipin Method)之一系列多中心/肽合成試劑盒(Chiron公司)等)。

(9)抗體片段之製作

抗體片段，可將上述(7)所記載之抗體作為起始物，藉由基因工程學方法或蛋白質化學方法來製作。

至於基因工程學方法，可舉出：構建編碼目標抗體片段之基因，使用動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌等適當的宿主，進行表現、純化等之方法。

至於蛋白質化學方法，可舉出：使用胃蛋白酶、木瓜酶等蛋白質分解酶進行部位特異性切斷、純化等之方法。

至於抗體片段，可舉出含有Fab、F(ab')₂ 、Fab'、scFv、diabody、dsFv、CDR之肽等。以下，詳細說明各抗體片段之製作方法。

(i)Fab之製作

Fab，可藉由於蛋白質化學方面，以蛋白質分解酶木瓜酶對IgG進行處理而製作。木瓜酶處理後，若原來的抗體係具有蛋白質A結合性之IgG亞型，則可藉由通入蛋白質A管柱，而與IgG分子或Fc片段分離，製成均勻的Fab，再加以回收(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,third edition,1995)。於不具有蛋白質A結合性之IgG亞型抗體之情形時，藉由離子交換層析法，可將Fab回收至以低鹽濃度溶出之溶離份中(Monoclonal Antibodies： Principles and Practice,third edition,1995)。又，Fab在基因工程學上大多使用大腸桿菌來製作，又，可使用昆蟲細胞或動物細胞等來製作Fab。例如，可將上述2(7)中所記載之編碼抗體的V區域之DNA選殖入Fab表現用載體中，而製作Fab表現載體。作為Fab表現用載體，若係可將Fab用DNA加以整合再加以表現者，則可使用任意者。例如可舉出pIT106(Science,240：1041-1043,1988)等。將Fab表現載體導入適當的大腸桿菌中，且使Fab生成蓄積於包涵體或者周質(periplasm)層中。可藉由通常蛋白質中所使用之重褶皺法，而由包涵體製作具有活性之Fab，又，於使其於周質層中表現之情形時，具有活性之Fab會漏出至培養上清液中。於重褶皺後或者自培養上清液漏出後，可藉由使用結合抗原之管柱，而純化出均勻的Fab(Antibody Engineering,A Practical Guide,W.H.Freeman and Company,1992)。

(ii)F(ab')₂ 之製作

F(ab')₂ ，可藉由於蛋白質化學方面以蛋白質分解酶胃蛋白酶對IgG進行處理而製作。於胃蛋白酶處理後，可藉由與Fab同樣的純化操作而作為均勻的F(ab')₂ 加以回收(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,third edition,Academic Press,1995)。又，亦可藉由如下方法製作F(ab')₂ ：以如o-PDM或雙馬來醯亞胺己烷等的馬來醯亞胺，對下述(iii)中所記載之Fab'進行處理，使其產生硫醚鍵鍵結之方法；或以DTNB[5,5'-二硫基-雙(2-硝基苯甲酸)，5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]進行處理，使其產生S-S鍵相鍵結之方法(Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。

(iii)Fab'之製作

Fab'，可利用二硫蘇糖醇等還原劑對上述(ii)中所記載的F(ab')₂ 進行處理而獲得。又，Fab'，在基因工程學上大多使用大腸桿菌來製作，又，可使用昆蟲細胞或動物細胞等來製作。例如，可將編碼上述2(7)中所記載之抗體的V區域之DNA選殖於Fab'表現用載體中，而製作Fab'表現載體。作為Fab'表現用載體，若係可將Fab'用DNA加以整合再加以表現者，則可使用任意者。例如可舉出pAK19(BIO/TECHNOLOGY,10：163-167,1992)等。可將Fab'表現載體導入適當的大腸桿菌中，且使Fab'生成蓄積於包涵體或周質層中。可藉由通常蛋白質中所使用之重褶皺法，而由包涵體製造具有活性之Fab'，又，於使其於外周質層表現之情形時，可藉由利用溶菌酶之部分消化、滲透休克法(osmotic shock)、超音波粉碎等處理來使細菌破碎，再將其於菌體外加以回收。於重褶皺後或者自細菌的破碎液，可使用蛋白質G管柱等純化出均勻的Fab'(Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。

(iv)scFv之製作

scFv在基因工程學上使用噬菌體或大腸桿菌來製作，又，可使用昆蟲細胞或動物細胞等來製作。例如，可將上述2(7)中所記載之編碼抗體的V區域之DNA選殖於scFv表現用載體中，而製作scFv表現載體。作為scFv表現用載體，若係可將scFv之DNA加以整合再加以表現者，則可使用任意者。例如可舉出：pCANTAB5E(GE Healthcare Bioscience公司)、pHFA(Human Antibodies & Hybridomas,5：48-56,1994)等。可藉由將scFv表現載體導入適當的大腸桿菌中，且使輔助噬菌體感染，而獲得於噬菌體表面上scFv係與噬菌體表面蛋白質相融合的形式進行表現之噬菌體。又，可於導入有scFv表現載體之大腸桿菌的包涵體或周質層中，生成蓄積scFv。可藉由通常蛋白質中所使用之重褶皺法，而由包涵體製造具有活性之scFv，又，於使其於周質層表現之情形時，可藉由利用溶菌酶之部分消化、滲透休克法、超音波粉碎等處理來破碎細菌，再將於菌體外加以回收。於重褶皺後或者自細菌的破碎液，可藉由使用陽離子交換層析法等而純化出均勻的scFv(Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。

(v)diabody之製作

Diabody在基因工程學上大多使用大腸桿菌來製作，又，可使用昆蟲細胞或動物細胞等來製作。例如，可製作以連結子所編碼的胺基酸殘基成為8個殘基以下之方式將上述2(7)中所記載之抗體的VH與VL加以連結而成之DNA，再將其選殖於diabody表現用載體中，而製作diabody表現載體。作為diabody表現用載體，若係可將diabody的DNA加以整合再加以表現者，則可使用任意者。例如可舉出：pCANTAB5E(GE Healthcare Bioscience 公司)、pHFA(Human Antibodies Hybridomas,5,48,1994)等。可於導入有diabody表現載體之大腸桿菌的包涵體或周質層，生成蓄積diabody。藉由通常蛋白質中所採用之重褶皺法，可由包涵體製作具有活性之diabody，又，於使其於外周質層中表現之情形時，可藉由利用溶菌酶之部分消化、滲透休克法、超音波粉碎等處理來破碎細菌，於菌體外進行回收。於重褶皺後，或者由細菌的粉碎液中，可藉由採用陽離子交換層析法等而純化出均勻的scFv(Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。

(vi)dsFv之製作

dsFv在基因工程學上大多使用大腸桿菌來製作，又，可使用昆蟲細胞或動物細胞等來製作。首先，於上述(ii)、(iv)及(v)中所記載之編碼抗體的VH及VL之DNA的適當位置導入突變，而製作將所編碼的胺基酸殘基置換為半胱胺酸之DNA。可將所製作之各DNA選殖於dsFv表現用載體中，而製作VH及VL之表現載體。作為dsFv表現用載體，若係可將dsFv用DNA加以整合再加以表現者，則可使用任意者。例如可舉出pULI9(Protein Engineering,7：697-704,1994)等。可將VH及VL之表現載體導入適當的大腸桿菌中，使其生成蓄積於包涵體或周質層中。於自包涵體或周質層獲得VH及VL，將其混合，藉由通常蛋白質中所採用之重褶皺法，可製成具有活性之dsFv。於重褶皺後，可藉由離子交換層析法及凝膠過濾等，而進一步進行純化 (Protein Engineering,7：697-704,1994)。

(vii)CDR肽之製作

含有CDR之肽，可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法來製作。又，可製作編碼含有CDR的肽之DNA，將所製作之DNA選殖於適當的表現用載體中，而製作CDR肽表現載體。作為表現用載體，若係可將編碼CDR肽之DNA加以整合再加以表現者，則可使用任意者。例如可舉出：pLEX(Invitrogen公司)、pAX4a+(Invitrogen公司))等。可將表現載體導入適當的大腸桿菌中，而使其生長蓄積於包涵體或周質層。於包涵體或周質層獲得CDR肽，可藉由離子交換層析法及凝膠過濾等而進行純化(Protein Engineering,7：697-704,1994)。

3.本發明之抗體或功能性片段之性質

本發明之抗體或功能性片段具有下述之任一特性。

(a)FGF23結合試驗：結合於具有FGF23蛋白質之序列編號4的第25號至第251號的胺基酸殘基之全長物上。

(b)體外試驗：於可檢測FGF23的作用之檢定中，FGF23之作用受到抑制。作為於體外試驗檢測FGF23的作用的方法之一例，可舉出：藉由使用klotho表現細胞之人類FGF23刺激，使早期生長應答基因-1之啟動子活性化(Nature,444：770-774,2006)。

(c)活體內試驗：於投予人類時，內在性FGF23之作用受到抑制，使血清磷濃度及血清1,25D濃度上升。血清磷濃度及血清1,25D濃度之上升程度，大於作為現有抗體之2C3B 抗體(國際公開第WO 03/057733號手冊中所揭示之抗FGF23蛋白質之小白鼠單株抗體，寄存號碼FERM BP-7838之由融合瘤所產生之抗FGF23抗體)，又，血清磷濃度及血清1,25D濃度之上升時間亦較長。例如，於投予給食蟹獼猴之情形時，上升之血清磷濃度的持續時間為2C3B抗體的約3倍以上、較好的是約5倍；上升之血清1,25D濃度之持續時間為2C3B抗體的約1.5倍以上、較好的是約2.5倍。

本發明進而亦包括編碼本發明之抗FGF23之抗體的胺基酸序列之核酸。核酸可為DNA，亦可為RNA。本發明之核酸，較好的是編碼由融合瘤C10所產生的抗體的胺基酸序列之核酸。例如可舉出編碼重鏈可變區域之胺基酸序列的核酸，該重鏈可變區域之胺基酸序列係由序列編號11所示之鹼基序列的第58號的C至第408號的A所示之鹼基序列進行編碼。進而可舉出編碼輕鏈可變區域的胺基酸序列之核酸，該輕鏈可變區域之胺基酸序列係由序列編號13所示之鹼基序列的第67號的G至第384號的A所示之鹼基序列進行編碼。

II.醫藥組合物

作為含有本發明之人類抗FGF23抗體或其功能性片段的醫藥組合物之製劑，亦包括在本發明之範圍內。此種製劑，較好的是除抗體或功能性片段以外，尚含有生理學所容許之稀釋劑或載體，亦可為與其他抗體或如抗生素的其他藥劑之混合物。適當的載體中包含生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水葡萄糖液、及緩衝生理食鹽水，但並不限定於該等。又，抗體，亦可將其進行冷凍乾燥(freeze-dry)，必要時添加如上述的緩衝水溶液，藉此進行再構成而使用。投予途徑，可舉出：經口投予，或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內及靜脈內等之非經口投予，較好的是靜脈內投予。作為投予形態，可以各種形態進行投予，至於其等形態，可舉出：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、貼劑等。

如乳劑及糖漿劑之液體製備物，可使用水；蔗糖、山梨糖醇、果糖等之糖類；聚乙二醇、丙二醇等之二醇類；芝麻油、橄欖油、大豆油等之油類；對羥基苯甲酸酯類等之防腐劑；草莓香精、胡椒薄荷等之香料類等作為添加劑而製造。

膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑等，可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等之賦形劑；澱粉、海藻酸鈉等之崩散劑；硬脂酸鎂、滑石粉等之潤滑劑；聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等之黏合劑；脂肪酸酯等之界面活性劑；甘油等之塑化劑等作為添加劑而製造。

注射劑中，可使用水、蔗糖、山梨糖醇、木糖、海藻糖、果糖等之糖類；甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇等之糖醇；磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、麩胺酸緩衝液等之緩衝液；脂肪酸酯等之界面活性劑等作為添加劑。

至於適於非經口投予之製劑，可舉出：注射劑、栓劑、噴霧劑等。於注射劑之情形時，通常係以單位投予量之小瓶或多投予量之容器的狀態而提供注射劑。亦可為使用時以適當的載體例如不含發熱物質的滅菌水使其再溶解之粉體。該等劑形，通常於其等之組合物中含有製劑上所一般使用之乳化劑、懸浮劑等之添加劑。至於注射方法，例如可舉出：靜脈內點滴注射、靜脈內注射、肌內注射、腹腔內注射、皮下注射、皮內注射等。又，其投予量，則根據投予對象的年齡、投予途徑、投予次數而不同，可在大範圍內變化。

栓劑，係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等之載體而製備。又，噴霧劑，亦可直接使用本發明之抗體或抗體之功能性片段本身而製備，或者使用載體等而製備，該載劑不會刺激接受者(患者)的口腔及呼吸道黏膜，且作為微細粒子的形式使上述抗體或抗體之功能性片段分散，以使其易於吸收。

至於載體，具體而言，可例示乳糖、甘油等。根據上述抗體或抗體之功能性片段的性質或所使用載體的性質，可為氣溶膠、乾粉等之製劑。又，於該等非經口劑中，亦可添加經口劑中作為添加劑而例示之成分。

其投予量，則根據症狀、年齡、體重等而不同，通常於經口投予時，對於成人而言，1日約為0.01mg~1000mg，可1次投予該等或者分多次投予。又，於非經口投予時，可經由皮下注射、肌肉注射或靜脈注射1次投予約0.01mg~1000mg。

本發明亦包括使用本發明之抗體或其功能性片段或者含有其等之醫藥組合物之下述疾病之預防或治療法，進而，本發明亦包括本發明之抗體或其功能性片段於下述疾病之預防或治療劑的製造中之用途。

能夠利用本發明之抗體或其功能性片段進行預防/治療之疾病，可舉出：顯示FGF23的過剩作用之腫瘤性骨質軟化病、ADHR、XLH、纖維性發育不良、馬科恩-亞白特氏症侯群(McCune-Albright syndrome)及體染色體隱性低磷血症等之伴有礦物質代謝異常之疾病。進而，對於該等疾病中可見之低磷血症、骨骼鈣化不全、骨痛、肌力下降(muscle weakness)、骨架變形、生長發育不良、低1,25D血症等，可期待有改善效果。又，因FGF23於生理條件下發揮重要的作用，故利用本發明之抗體或其功能性片段來控制經由FGF23的磷代謝調節、維生素D代謝調節之鈣代謝調節作用，藉此可用於治療及預防骨質疏鬆症、佝僂症(包含低磷血症性佝僂症、抗維生素D佝僂症)、高鈣血症、低鈣血症、異位性鈣化、骨硬化症、佩吉特氏病(Paget's disease)、副甲狀腺機能亢進、副甲狀腺機能降低及搔癢等由於礦物質代謝或維生素D代謝異常所引起之疾病。進而，於腎衰竭中，報告有血中FGF23濃度上升的情況，因此亦可用於治療及預防以腎性骨營養不良、透析性骨病、腎小管功能障礙等為代表之腎衰竭或與腎衰竭時人工透析併發之疾病。另一方面，1,25D不僅可抑制上述之鈣等礦物質之代謝，亦報告有細胞增生抑制能力、細胞分化促進能力等，因此利用本發明之抗體或其功能性片段，可治療及預防由於因1,25D而使增生或分化等受到控制的細胞所引起的疾病。

又，腫瘤性骨質軟化病，已知係因腫瘤過剩產生FGF23而發病，亦認為藉由使用使放射性同位素等放射性物質或低分子藥物等的各種毒素等治療試藥與本抗體相結合而成者，而使本抗體聚集於FGF23過剩產生腫瘤中，且誘導腫瘤消退。

III.製劑例

含有本發明之抗體或其功能性片段之製劑，係溶解於水或除水以外的藥理學所容許的溶液中製成無菌性溶液或懸浮液，而作為小瓶劑供於使用。又，亦可將無菌粉末製劑(較好的是將本發明之分子進行冷凍乾燥)預先填充於小瓶中，於使用時再以藥理學所容許之溶液加以稀釋後使用。

[實施例]

以下，利用實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不僅限定於此實施例中所記載之態樣。

實施例1 重組體人類FGF23表現載體之製作 (1)人類FGF23H蛋白質表現載體之構建

編碼人類FGF23之cDNA，可藉由如下方式進行擴增：以腫瘤性骨質軟化病之責任腫瘤之人類cDNA基因庫為模板，使用F1EcoRI引子(序列編號1)、LHisNot引子(序列編號2)及LA-Taq DNA聚合酶，於96℃下保溫1分鐘後，將於96℃下保溫30秒、於55℃下保溫30秒、於72℃下保溫30秒的步驟作為1個循環，實施35個循環之PCR。F1EcoRI引子，係於編碼人類FGF23之鹼基序列的進一步存在於5'側上游的序列處進行黏合，將EcoRI制限酶部位附加於編碼其擴增片段的人類FGF23之區域的5'側。LHisNot引子包含：與編碼人類FGF23之序列的終始密碼子的5'側之序列相黏合之序列、與編碼His6-tag序列(His-His-His-His-His-His)之序列相連接之終始密碼子、及NotI制限酶序列。其結果，擴增片段係藉由對將His6-tag序列附加於人類FGF23蛋白質的羧基末端而成者加以編碼，而於其下游具有NotI制限酶部位。以EcoRI及NotI消化該擴增片段，將其與同樣地以EcoRI及NotI進行消化之動物細胞表現載體即pcDNA3.1Zeo(Invitrogen公司)相連結。對如此製作之表現載體進行選殖，再決定鹼基序列，確認其編碼附加有目標His6-tag序列之人類FGF23蛋白質。將該載體稱為pcDNA/hFGF23H。

F1EcoRI：CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(序列編號1)

LHisNot：ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(序列編號2)

(2)人類FGF23蛋白質表現載體之構建

以pcDNA/hFGF23H為模板，使用F1EcoRI引子、LNot引子(序列編號3)及LA-Taq DNA聚合酶，於94℃下保溫1分鐘後，將於94℃下保溫30秒、於55℃下保溫30秒、於72℃下保溫1分的步驟作為1個循環，實施25個循環之PCR，藉此進行擴增。反應結束後，以EcoRI及NotI消化編碼人類 FGF23之片段後，進行純化。將其插入動物細胞表現載體即pEAK8(Edge Biosystem公司)上連結有分子內核糖體進入序列(IRES)及增強型綠色螢光蛋白質(EGFP)之pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoRI、及NotI制限酶部位，再進行選殖。決定所獲得質體之鹼基序列，確認其編碼人類FGF23蛋白質。將該載體稱為pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23。

LNot：ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(序列編號3)

(實施例2)重組體人類FGF23蛋白質及重組體突變人類FGF23H蛋白質之表現

(1)於載體中之耐安比西林性基因內之FspI制限酶部位，將pcDNA/hFGF23H加以切斷，將其直鏈化，進行純化。將上述純化物與CHO Ras clone-1細胞(Shirahata,S.，等人。Biosci Biotech Biochem,59：345-347,1995)加以混合，使用Gene Pulser II(Bio Rad公司)，以電穿孔法將基因導入細胞中。於含有10%FCS之MEMα培養液(Gibco BRL公司)中，將該細胞培養24小時後，以最終濃度達到0.5mg/ml之方式添加吉歐黴素(Zeocin，Invitrogen公司)，再培養1週。以胰蛋白酶將經黏接生長的細胞游離，於最終濃度0.3mg/ml的吉歐黴素存在下，藉由限數稀釋法進行選殖，獲得複數個選殖細胞。，以西方墨點法對該等細胞中最佳表現人類FGF23H蛋白質之細胞進行鑑定。採取各選殖細胞之培養上清液，進行SDS-聚丙烯醯胺電泳後，將蛋白質轉錄至PVDF膜(Millipore公司)上，使用抗His-tag(羧基末端)抗體(Invitrogen公司)及ECL發光系統(GE Healthcare BioSciences公司)檢測源自約32kDa附近的FGF-23H蛋白質之訊息。其結果，稱為#20之選殖體中可見最高的表現，將其命名為CHO-OST311H，於2000年8月11日寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(日本國茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6)(寄存號碼：FERM BP-7273)。本說明書中，將CHO-OST311H稱為CHO-hFGF23H。

(2)人類FGF23表現細胞之獲得

pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23載體向CHO Ras clone-1細胞之導入，係藉由使用膜融合脂質之基因導入法而進行。培養CHO Ras clone-1細胞，至細胞覆蓋6孔培養盤的底面約60%之程度。然後，除去培養液，添加1ml不含血清之MEMα培養液。分別將2.5μg之導入的載體、及10μl之Transfectam(註冊商標)(Promega公司)與50μl之不含血清的MEMα培養液加以混合，於混合兩者靜置10分鐘後，將兩者混合，再添加至預先準備之6孔培養盤中。於培養2小時後，除去含有該DNA之培養液，置換成含有10%的FCS之培養液，進行整夜培養。次日，以最終濃度達到5μg/ml之方式添加Puromycin(Sigma公司)，選擇抗藥性細胞。對於如此獲得之抗藥性細胞，以限數稀釋法進行選殖。進而，藉由西方墨點法獲得最佳表現目標蛋白質之細胞株。將該細胞稱為CHO-hFGF23。

(3)重組體人類FGF23蛋白質於動物細胞中之表現及檢測

若使用針對羧基末端的His6-tag序列之抗體且以西方墨點法檢測CHO-hFGF23H於培養上清液中之重組體，則可見約32kDa之帶及約10kDa之帶。自凝膠中切出此兩個帶，決定胺基末端側之胺基酸序列，分子量較大之約32kDa之帶，檢測出自序列編號4之第25號起之胺基酸序列，認為其係於分泌過程中自人類FGF23蛋白質中除去訊息序列而成者。另一方面，自分子量較小之蛋白帶中，確認有自序列編號4之第180號起之胺基酸序列，判明其係藉由將第179號與第180號之間加以切斷而產生之羧基末端側片段。又，藉由使用識別人類FGF23的胺基末端側之多株抗體進行檢測，而確認亦存在被認為具有自179號起向胺基末端側的序列之多肽(胺基末端側片段)(國際公開第WO 02/14504號手冊)。

同樣地，於未附加His6-tag序列之CHO-hFGF23的培養上清液中，確認於第179號與第180號的胺基酸殘基之間被切斷(國際公開第WO02/14504號手冊)。因此，為了將認為未被切斷之活性體的自序列編號4之第25號至第251號之全長人類FGF23蛋白質(有時稱為FGF23全長體)與胺基末端或羧基末端側片段加以分離再進行純化，而進行以下之操作。

(4)重組體全長人類FGF23蛋白質之純化

以孔徑為0.2μm之薄膜即SuperCap(註冊商標)(Pall Gelman Laboratory公司)對CHO-hFGF23之培養上清液進行過濾，將經過濾之溶液通入SP-瓊脂糖凝膠FF(GE Healthcare BioSciences公司)中。以50mM之磷酸鈉緩衝液(pH值為6.7)清洗與管柱親和性較弱的物質，使其溶出。該溶離份中含有第179號與第180號之間被切斷而產生之羧基末端側的片段。以自0至0.7M之NaCl濃度梯度使管柱所保持之蛋白溶出，於以約0.3M之NaCl所溶出之溶離份中看見全長人類FGF23蛋白質。其次，使其吸附於作為金屬親和性管柱之Talon Superflow(註冊商標)(Clontech公司)上，以50mM之磷酸鈉緩衝液(pH值為6.7)進行清洗後，改變咪唑的濃度再進行添加，溶出純化全長人類FGF23蛋白質。進而，使含有目標蛋白質之溶離份吸附於SP瓊脂糖凝膠FF管柱上，使其溶出進行純化。

人類FGF23胺基酸序列(序列編號4)

(實施例3)人類抗體產生小白鼠(KM小白鼠)之製作

產生用以製作人類單株抗體的完全人類抗體之小白鼠，於內因性Ig重鏈及κ輕鏈之破壞兩方面具有同型合子之遺傳學背景，且同時保持有含人類Ig重鏈基因座之14號染色體片段(SC20)及人類Igκ鏈轉殖基因(KCo5)。該小白鼠，係藉由使具有人類Ig重鏈基因座之系統A的小白鼠、與具有人類Igκ鏈轉殖基因之系統B的小白鼠交配而製作。系統A就內因性Ig重鏈及κ輕鏈破壞兩方面而言係同型合子，係保持有可遺傳的第14號染色體片段(SC20)之小白鼠系統，例如揭示於富塚等人之報告[Tomizuka.等人，Proc Natl Acad Sci USA.,97：722-727,2000]中。又，系統B就內因性Ig重鏈及κ輕鏈破壞兩方面而言係同型合子，係保持有人類Igκ鏈轉殖基因(KCo5)之小白鼠系統(基因轉殖小白鼠)，例如記載於Fishwild等人之報告[Nat Biotechnol.,14：845-851,1996]中。

將使系統A之雄小白鼠與系統B之雌小白鼠、或者使系統A之雌小白鼠與系統B之雄小白鼠交配而獲得之、血清中同時檢出人類Ig重鏈及κ輕鏈之個體[Ishida & Lonberg,IBC's 11th Antibody Engineering,Abstract 2000]，用於以下之免疫實驗。再者，上述人類抗體產生小白鼠，係藉由簽訂合約自Kirin Pharma股份有限公司購入。

(實施例4)抗人類FGF23之人類單株抗體之製作 (1)抗人類FGF23之人類單株抗體產生融合瘤之獲得

本實施例之單株抗體，係依照如單株抗體實驗操作入門(安東民衛等人著，講談社發行1991)等中所記載的一般方法進行製備。作為免疫原，係使用實施例2中所製備之全長人類FGF23蛋白質。被免疫動物，係使用實施例3中所製作之產生人類免疫球蛋白之人類抗體產生小白鼠。

首先，為了製備抗FGF23之人類單株抗體，而對每隻人類抗體產生小白鼠腹腔內注射20μg之實施例2中所製作之純化全長人類FGF23蛋白質，使其於腹腔內與RIBI佐劑(Corixa公司)相混合，以進行初次免疫。以與初次免疫同樣之方式，以2週為間隔以純化FGF23及RIBI佐劑進行免疫，合計進行3次免疫。對5隻小白鼠實行免疫，於第3次免疫後進行採血，藉由下述酶標記免疫吸附分析(ELISA)法確認血清中有抗FGF23之人類IgG抗體的存在。使用國際公開第WO03/057733號手冊中所揭示之抗FGF23蛋白質之小白鼠單株抗體3C1E抗體(寄存號碼FERM BP-7839之融合瘤所產生之抗FGF23抗體)，選出於使用固相化FGF23之ELISA中顯示最高值的血清之小白鼠，於以下所述之獲取脾臟3日前，對每隻小白鼠個體尾靜脈投予20μg之全長人類FGF23蛋白質。

以外科方法自經免疫之小白鼠中獲取脾臟，將其置於含有350mg/mL碳酸氫鈉、50單位/mL青黴素、50μg/mL鏈黴素之無血清DMEM培養基(Invitrogen公司(以下稱為「無血清DMEM培養基」)10mL中，使用刮勺於篩網(Streiner：Falcon公司)上將其壓碎。將通過篩網之細胞懸浮液進行離心使細胞沈澱，然後以無血清DMEM培養基將該細胞清洗2次，再懸浮於無血清DMEM培養基中，測定細胞數。另一方面，於含有10%FCS(Sigma公司)之DMEM培養基(Invitrogen公司)(以下稱為「加入有血清之DMEM培養基」)中，於37℃、5%二氧化碳的存在下，以細胞濃度不超過1×10⁶ 細胞/mL之方式進行培養，將培養所得之骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC No.CRL-1581)同樣地以無血清DMEM培養基進行清洗，將其懸浮於無血清DMEM培養基中，測定細胞數。將經回收之脾臟細胞懸浮液與小白鼠骨髓瘤懸浮液，以細胞數5：1之比例加以混合，離心後，完全除去上清液。一面以移液管的前端部攪拌顆粒物，一面向該顆粒物緩慢添加作為融合劑之50%(w/v)聚乙二醇1500(Beringer Mannheim公司)1mL後，分2次緩慢添加預先加溫至37℃之無血清DMEM培養基1mL，進而添加無血清DMEM培養基7mL。離心後，將除去上清液而得之融合細胞，供於以下記載之限數稀釋法之篩選中。融合瘤之選擇，係藉由於含有10%FCS、IL-6(10ng/mL)(或10%融合瘤選殖因子(以下稱為「HCF」，BIOBASE公司))及次黃嘌呤(H)、胺基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)(以下稱為「HAT」，Sigma公司)之DMEM培養基中進行培養而進行。進而，使用含有HT(Sigma公司)、10%FCS、10%HCF之DMEM培養基，藉由限數稀釋法製成單株。培養，係於96孔微量滴定盤(Beckton Dickinson公司)中進行。產生抗FGF23人類單株抗體之融合瘤株的選擇(篩選)以及由各融合瘤所產生之人類單株抗體的特徵鑑定，係藉由下述酶標記免疫吸附分析法(ELISA)進行。其結果，獲得產生具有人類免疫球蛋白γ鏈(hIgγ)及人類免疫球蛋白輕鏈κ、且對人類FGF23具有特異反應性的人類單株抗體之多個融合瘤。自所得多個融合瘤中，特別可獲得2個作為產生識別FGF23蛋白質的抗體的融合瘤之細胞株(C10及C15)。再者，於包括本實施例在內的以下任一實施例中，各個產生本發明之抗FGF23人類單株抗體之融合瘤株，係使用記號來命名。又，於該記號之前後附有「抗體」者，意指由融合瘤所產生之抗體、或者由保持有自該融合瘤中分離的抗體基因(全長或者可變區域)之宿主細胞所生產之重組抗體。又，於前後文關係明確的範圍內，融合瘤株之名稱有時表示抗體之名稱。將融合瘤株C10以寄存號碼FERM BP-10772(為了識別而表示為C10)，於2007年2月2日寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(日本國茨城縣築波市東1丁目1番地1中央第6)；

(2)自融合瘤上清液純化C10及C15抗體

將實施例4(1)中所得C10及C15融合瘤於含有牛胰島素(5μg/ml，Invitrogen公司)、人類轉鐵蛋白(5μg/ml、Invitrogen公司)、乙醇胺(0.01mM，Sigma公司)、亞硒酸鈉(2.5×10^-5 mM，Sigma公司)、1%低IgG胎牛血清(HyClone公司)之eRDF培養基(極東製藥社)中進行馴化(naturalization)。於燒瓶中進行培養，回收培養上清液。使用Protein G Fast Flow gel(GE Healthcare Bioscience公司)，使用PBS(-)作為吸附緩衝液，使用0.1M之甘胺酸緩衝液(pH值為2.8)作為溶出緩衝液，對培養上清液進行親和純化。向溶離份中添加1M之Tris(pH值為9.0)將pH值調節至7.2附近。使用葡聚糖凝膠G25脫鹽管柱(NAP管柱：GE Healthcare Bioscience公司)將所製備的抗體溶液置換為PBS，以孔徑0.22μm之薄膜過濾器MILLEX-GV(Millipore公司)進行過濾滅菌，獲得純化C10及C15抗體。純化抗體之濃度，係測定於280nm處的吸光度，且將1mg/mL作為1.4OD而算出。

(實施例5)編碼C10抗體之抗體基因之獲得及序列之確定 (1)C10抗體之cDNA合成

為了獲得於C10融合瘤中所表現的含有人類抗體重鏈、及輕鏈之抗體的可變區域之DNA片段，而藉由使用特異性引子之5'RACE(5' rapid amplification of cDNA ends)法，於人類抗體重鏈、及輕鏈之各恆定區域進行選殖。具體而言，使用BD SMART RACE cDNA Amplification試劑盒(Becton Dickinson Bioscience Clonetech公司)，依照所附的說明書實施。

作為cDNA合成之材料，可向C10融合瘤中添加作為RNA萃取用試藥之ISOGEN(NIPPON GENE公司)，依照操作說明書純化15μg之總RNA。自所純化之總RNA中，各使用約1μg作為模板，製作第一鏈cDNA。除RNA以外之試藥及酶類，係使用BD SMART RACE cDNA Amplification試劑盒所附帶者。

第一鏈cDNA之合成，係將具有下述組成總RNA 1μg/3μl

5'CDS 1μl

SMART Oligo 1μl

之反應液於70℃下培養2分鐘後，加入

5×緩衝液 2μl

DTT 1μl

dNTP mix 1μl

Powerscript逆轉錄酶 1μl ，於42℃下培養1.5小時。

進而，加入50μl之Tricine-EDTA緩衝液後，於72℃下培養7分鐘，獲得第一鏈cDNA。

(2)藉由PCR來擴增重鏈基因、輕鏈基因及鹼基序列之確認 (2)-1：藉由PCR來擴增重鏈基因、輕鏈基因

為了擴增編碼C10抗體之基因的cDNA，而使用與利用具有人類抗體特異性序列之3'引子(具體的序列如下述)及以BD SMART RACE cDNA Amplification試劑盒所合成之向附加於cDNA的5'末端之序列進行特異性雜交的5'引子(通用引子A mix)作為PCR用引子組，又，使用KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司)作為PCR用酶，製備下述反應液以供於PCR。

重鏈基因之擴增反應中，使用SMART RACE cDNA Amplification試劑盒所附帶之UPM引子及IgG1p引子(序列編號5)；另一方面，輕鏈基因之擴增中，使用UPM引子及 hk-2(序列編號6)引子之各組。

IgG1p：TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG(序列編號5)

hk-2：GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC(序列編號6)

又，反應溫度條件如下。

以94℃/30秒鐘、72℃/3分鐘為1個循環，反覆進行5次循環；以94℃/30秒鐘、70℃/30秒鐘、72℃/3分鐘為1個循環，反覆進行5次循環；以94℃/30秒鐘、68℃/30秒鐘、72℃/3分鐘為1個循環，反覆進行25次循環。

進而，將向該反應液2μl中加入Tricine-EDTA緩衝液98μl加以稀釋者5μl作為模板，實施第二(套)PCR。PCR反應溶液之組成所示如下。

作為上述反應之引子組，於重鏈基因擴增用之情形時，係使用NUP引子(SMART RACE cDNA amplification試劑盒付屬：Becton Dickinson Bioscience Clonetech公司)及hh2引子(序列編號7)；又，於擴增輕鏈基因之情形時，係使用NUP引子及hk-5引子(序列編號8)。作為反應溫度條件，係將於94℃的初期溫度下加熱1分鐘後、於94℃下加熱5秒鐘、於68℃下加熱10秒以及於72℃下加熱3分鐘作為1個循環，反覆進行20次循環，最後於72℃下加熱7分鐘。

hh2：GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC(序列編號7)

hk-5：AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC(序列編號8)

(2)-2：決定抗體基因之鹼基序列

經擴增之重鏈PCR片段(以下表示為HV[C]：係由H鏈的5'非轉譯區域-引導序列、可變區域(HV)及恆定區域的一部分([C])所構成)、及輕鏈之PCR擴增片段(以下表示為LV[C]：係由L鏈的5'非轉譯區域-引導序列、可變區域(LV)及恆定區域的一部分([C])所構成)，於進行乙醇沈澱再加以回收後，以瓊脂糖凝膠電泳加以回收，以作為使用薄膜之DNA純化試劑盒之QIAquick Gel Extraction試劑盒(QIAGEN公司製造)進行純化。將經純化之HV[C]擴增片段或者LV[C]擴增片段，分別次選殖於Zero Blunt TOPO PCR Cloning試劑盒(Invitrogen公司製造)之PCR 4 Blunt-TOPO載體中，再對於所獲得細胞株之質體DNA，分析插入DNA的鹼基序列。作為用於決定DNA鹼基序列之引子，係使用M13-20FW(序列編號9)及M13RV(序列編號10)。

M13-20FW：GTAAAACGAC GGCCAGTG(序列編號9)

M13RV：CAGGAAACAGCTATGAC(序列編號10)

編碼C10抗體的重鏈可變區域及輕鏈可變區域之DNA鹼基序列、以及重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列分別所示如下。

<C10重鏈核酸序列>(自ATG起始密碼子起至編碼可變區域羧基末端胺基酸殘基的DNA序列為止)(序列編號11)

<C10重鏈胺基酸序列>(至引導序列及可變區域為止)(序列編號12)(下劃線所表示之胺基酸殘基，表示成為分泌訊息之引導序列)

<C10輕鏈核酸序列>(自ATG起始密碼子起至編碼可變區域羧基末端胺基酸殘基之DNA序列為止)(序列編號13)

<C10輕鏈胺基酸序列>(至引導序列及可變區域為止)(序列編號14)(下劃線所表示之胺基酸殘基，表示成為分泌訊息之引導序列)

又，於次選殖至PCR 4 Blunt-TOPO載體中之C10抗體的基因序列中，人類抗體序列之恆定區域亦被部分選殖，因此對於此區域，亦分析其DNA鹼基序列。其結果，可確認Kabat等人所著之EU索引所示的編碼重鏈恆定區域的第118號至第191號胺基酸殘基之序列，此區域與人類IgG1的胺基酸序列完全一致，判明C10抗體之亞型為IgG1。進而，使用同樣的方法，獲得編碼C15抗體之抗體基因，亦進行序列決定。

(實施例6)重組C10抗體表現載體之構建 C10抗體表現載體之製作(步驟圖示於圖1)

以含有所獲得C10抗體的LV[C]鏈之質體DNA為模板，使用以在末端附加有用於連結的制限酶部位(5'末側BglII、3'末側BsiWI)之方式設計而成之引子、C10_L5_Bgl(序列編號15)及C10_L3_Bsi(序列編號16)，以使用KOD-Plus-DNA聚合酶之PCR對C10抗體的LV(輕鏈的引導序列+可變區域)之DNA進行擴增。作為反應溫度條件，係於94℃之初期溫度下加熱1分鐘後，以於94℃下加熱5秒鐘及於68℃下加熱45秒鐘作為1個循環，反覆進行35次循環，最後於72℃下加熱7分鐘。以制限酶BglII及BsiWI消化經擴增之DNA片段，以瓊脂糖凝膠電泳回收約400bp之DNA，進行純化。另一方面，對於作為載體之N5KG1-Val Lark載體(IDEC Pharmaceuticals,N5KG1(美國專利6001358)之改變載體)，同樣地依序進行制限酶BglII、BsiWI處理後，以鹼性磷酸酶(E.coli C75)(寶酒造公司)進行處理作為脫磷酸化處理，然後以瓊脂糖凝膠電泳及DNA純化試劑盒回收小於約9kb之DNA。使用T4 DNA連接酶將該等2個片段加以連接，再將其導入大腸桿菌DH10B中，而獲得基因轉殖體。對於含插入DNA之基因轉殖體的質體DNA，分析其DNA鹼基序列，於N5KG1-Val Lark中，獲得於編碼N5KG1-Val Lark之人類抗體輕鏈恆定區域之5'上游、於框架中插入有C10抗體之LV而成之質體DNA、 N5KG1_C10_Lv。繼而，於插入有LV之質體載體(N5KG1_C10_Lv)中，插入C10抗體的HV(重鏈的引導序列+可變區域)。以含有次選殖於pCR4Blunt-TOPO載體中之C10抗體的HV[C]之質體DNA為模板，使用以在末端附加有用於連結的制限酶部位(5'末側SalI、3'末側NheI)之方式而設計之引子、C10_H5_Sal(序列編號17)及C10_H3_Nhe(序列編號18)，以PCR對HV進行擴增。作為反應溫度條件，係於94℃之初期溫度下加熱1分鐘後，將於94℃下加熱5秒鐘及於68℃下加熱45秒鐘作為1個循環，反覆進行35次循環，最後於72℃下加熱7分鐘。將所純化之HV之擴增DNA片段次選殖於pCR4Blunt-TOPO載體中，對於所獲得選殖體的質體DNA，分析插入DNA之鹼基序列。作為用於決定DNA鹼基序列之引子，係使用上述M13-20FW及M13RV。對於次選殖體，分析插入部分之DNA鹼基序列，選擇具有插入部分的DNA鹼基序列與作為模板之HV無差異而且引子部分亦具有與設計相同的序列之質體DNA(TOPO_C10_Hv)。以制限酶SalI及NheI消化此DNA，以瓊脂糖凝膠電泳回收約420bp之DNA，進行純化，使用T4 DNA連接酶將其與同樣經制限酶處理(SalI及NheI)及脫磷酸化處理之N5KG1_C10_Lv的DNA(約9kb)相連接後，導入大腸桿菌DH10B中以獲得基因轉殖體，自該基因轉殖體中選擇目標質體DNA。大量純化如此獲得之抗體表現質體DNA、N5KG1_C10_LH(選殖體#1)，確認L鏈全區域及H鏈全區域、以及其插入部位周圍的DNA鹼基序列於選殖步驟中未產生突變(圖2及圖3)。DNA鹼基序列之確認，進而使用序列編號19~25之各引子。將完成之C10抗體表現載體的簡單圖示示於圖4。進而利用同樣的方法，構建重組C15抗體表現載體。

C10_L5_Bgl：AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT(序列編號15)

C10_L3_Bsi：AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC(序列編號16)

C10_H5_Sal：AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC(序列編號17)

C10_H3_Nhe：AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC(序列編號18)

hh-4：GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG(序列編號19)

hh-1：CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC(序列編號20)

CMVH903F：GACACCCTCATGATCTCCCGGACC(序列編號21)

CMVHR1303：TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT(序列編號22)

SEQU4618：TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC(序列編號23)

hk-1：TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC(序列編號24)

SEQU1783：GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA(序列編號25)

(實施例7)重組C10抗體之製備

將所構建之C10抗體表現載體導入宿主細胞中，而製作C10抗體表現細胞。用於表現之宿主細胞，係使用將二氫葉酸還原酶(DHFR)缺乏的CHO DG44細胞(以下表示為 CHO細胞，IDEC Pharmaceuticals公司)於作為無血清培養基之EX-CELL 325-PF培養基(含有2mM之麩醯胺、100units/ml之青黴素、100μg/ml之鏈黴素、次黃嘌呤及胸苷(HT)之補充物(1：100)(Invitrogen公司)，JRH公司)中進行馴化之細胞株。將載體導入宿主細胞，係藉由電穿孔來實施。電穿孔，係以制限酶AscI使C10約2μg之抗體表現載體線狀化，使用BioRad電穿孔轉殖器以350V、500μF之條件，將基因導入4×10⁶ 個CHO細胞中，再將細胞播種於96孔培養盤上。於載體之導入處理後，添加G418繼續進行培養。於確認群落後，選出抗體表現株。將所選擇之CHO細胞株，於EX-CELL325-PF培養基(含有2mM之麩醯胺、100units/ml之青黴素、100μg/ml之鏈黴素、次黃嘌呤與胸苷(HT)之補充物(1：100)(Invitrogen公司))，以5% CO₂ 之條件進行培養。將培養上清液吸附於Mabselect Protein A管柱(GE Healthcare Bioscience公司)中後，以PBS加以清洗，再以20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl(pH值為3.4)緩衝液進行溶出。將溶出液以50mM之磷酸鈉(pH值為7.0)進行中和。以離子交換水稀釋至約1.5倍，將導電度調整為4.0ms/cm以下。其次，將樣品加入連結有Q-瓊脂糖凝膠(Hitrap Q HP，GE Healthcare Bioscience公司)及SP-瓊脂糖凝膠(HiTrap SP FF，GE Healthcare Bioscience公司)之管柱中使其吸附，再以20mM磷酸鈉緩衝液(pH值為5.0)進行清洗，然後以PBS(-)進行溶出。將所製備之抗體溶液，以孔徑0.22μm之薄膜過濾器MILLEX-GV(Millipore公司)進行過濾滅菌。所純化之C10抗體之濃度，係測定於280nm處的吸光度，且將1mg/mL作為1.4OD而算出。又，以同樣的方法製備重組C15抗體。

(實施例8)食蟹獼猴FGF23蛋白質表現載體之構建食蟹獼猴FGF23蛋白質表現載體之構建

以2：1的比例，將懸浮於PBS(-)中之5%葡聚糖T-2000(GE Healthcare Bioscience公司)混合於食蟹獼猴之添加有EDTA之靜脈血中，使紅血球沈澱後，使上清液於淋巴球分離液(Ficoll-Paque)(GE Healthcare Bioscience公司)中進行積層，進行離心，藉此獲得淋巴球部分。將所得淋巴球懸浮於ISOGEN-LS(NIPPON GENE公司)中，依照所附的操作說明書獲得食蟹獼猴淋巴球總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司)，依照所附的操作說明書，由該食蟹獼猴淋巴球總RNA製作食蟹獼猴淋巴球cDNA基因庫。編碼食蟹獼猴FGF23之cDNA，係以食蟹獼猴淋巴球cDNA基因庫為模板，使用猴FGF23FW引子(序列編號26)、猴FGF23RV引子(序列編號27)及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司)，於94℃下保溫5分鐘後，將於94℃下保溫20秒、於55℃下保溫30秒、於72℃下保溫50秒之步驟作為1個循環，實施45次循環之PCR，藉此進行擴增。將猴FGF23FW引子黏著於存在於編碼人類FGF23之鹼基序列的5'側上游之序列上，將EcoRI制限酶部位附加於編碼其擴增片段的FGF23之區域的5'側。猴FGF23RV引子含有：黏著於含有編碼人類FGF23的序列之終始密碼子的序列上之序列、及NotI制限酶序列。以EcoRI及NotI消化該擴增片段，於作為表現載體之pEAK8(Edge Biosystem公司)中，將分子內核糖體進入序列(IRES)及增強型綠色螢光蛋白質(EGFP)插入經連結之pEAK8/IRES/EGFP載體之EcoRI及NotI制限酶部位，而進行選殖。決定所獲得質體之鹼基序列，確認其編碼食蟹獼猴FGF23蛋白質。將該載體稱為pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23。又，將由本實施例所獲得之食蟹獼猴FGF23的核酸序列及胺基酸序列分別記載於序列編號28及29中。

猴FGF23FW：CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT(序列編號26)

猴FGF23RV：ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC(序列編號27)

食蟹獼猴FGF23核酸序列(序列編號28)

食蟹獼猴FGF23胺基酸序列(序列編號29)

(2)食蟹獼猴FGF23表現細胞上清液之製作

藉由磷酸鈣法，將pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23暫時性導入PEAK rapid細胞(Edge Biosystem公司)中，而獲得其表現培養上清液。

(實施例9)C10抗體與食蟹獼猴FGF23之結合性的驗證

藉由使用三明治型ELISA之以下方法查明：C10抗體不僅可與人類FGF23結合，而且同樣亦可與食蟹獼猴FGF23結合。將實施例4中所製作之C10抗體、2C3B抗體及人類IgG1對照抗體，於50mM NaHCO₃ 溶液中稀釋成5μg/ml之濃度，將其加入ELISA用96孔微孔培養盤(Maxisorp(註冊商標)，Nunc公司)的各孔中，於4℃下培養12小時，使C10抗體、2C3B抗體及作為對照之人類IgG1對照抗體吸附於微孔培養盤上。其次，除去該溶液，向各孔中加入阻滯劑(SuperBlock(註冊商標)阻滯緩衝液，PIERCE公司)，於室溫下培養30分鐘後，以含有0.1%之Tween20的Tris緩衝生理鹽水(T-TBS)將各孔清洗2次。將實施例2中純化之全長人類FGF23蛋白質或實施例8中製作之食蟹獼猴FGF23表現細胞上清液稀釋至適當的濃度，將其加入如上述般塗佈有抗FGF23抗體之微孔培養盤的各孔中，使其與固相化抗體反應2小時後，以含有0.1%之Tween20的Tris緩衝生理鹽水(T-TBS)將各孔清洗2次。繼而，將經生物素標記的3μg/mL之3C1E抗體，於各孔中於室溫下培養1.5小時，使經生物素標記的3C1E抗體與結合於固相化抗體上的人類或食蟹獼猴FGF23相結合。以T-TBS清洗後，進而與稀釋至 5000倍的辣根過氧化物酶(Horseraddish peroxidase)標記抗生蛋白鏈菌素(DAKO公司)反應1小時後，以T-TBS清洗3次。其次，將含有四甲基聯苯胺(DAKO公司)的基質緩衝液加入至各孔中，於室溫下培養30分鐘。繼而，將0.5M硫酸加入至各孔中使反應終止。將參照波長設為570nm，以微盤分析儀(MTP-300，CORONA ELECTRIC公司)測定於波長450nm處之吸光度。同樣地以公比3倍將人類全長FGF23蛋白質及食蟹獼猴FGF23表現培養上清液加以稀釋，對此時之反應性進行比較。將此時之結果示於圖5A及5B。由圖5A之結果可明瞭：將C10抗體或2C3B抗體固相化時，該等與人類全長FGF23蛋白質之反應性為相同程度。於此條件下，針對食蟹獼猴FGF23表現培養上清液的稀釋系列之反應性，於C10抗體與2C3B抗體之間觀察有較大的差異(圖5B)。亦即，證明C10抗體與2C3B抗體同樣地與人類及食蟹獼猴FGF23具有結合性。

(實施例10)C10抗體及2C3B抗體對正常食蟹獼猴的血中磷濃度及血中1α,25-二羥基維生素D濃度之作用的比較

FGF23具有於小白鼠體內自腎臟排泄磷，使血清磷濃度減少，又抑制腎臟中的維生素D活性酶，使血中1α,25-二羥基維生素D濃度(以下稱為1,25D)減少之作用(國際公開第WO 02/14504號手冊)。若將2C3B抗體等對FGF23具有抑制作用即中和活性之抗體投予給正常小白鼠，則可表現出抑制內在性的FGF23的作用，而使血清磷濃度及血清1,25D濃度上升(國際公開第WO 03/057733號手冊)。因此，強烈暗示，對FGF23具有中和活性之抗體，對包括由於FGF23過剩所引起之腫瘤性骨質軟化病、XLH等在內的人類疾病具有治療效果。因此，對作為本研究中所獲得人類抗體之C10抗體在生物體內的FGF23中和活性進行了研究。尤其期待具有人體內的藥理效果，因此抑制作為在進化上較齧齒類等更接近於人類的動物種類之猿猴的內在性FGF23的功能，以其血清磷濃度及血清1,25D濃度之上升作為指標，測定中和活性能力。使用作為小白鼠抗體之2C3B抗體作為C10抗體的比較對照，進行實驗。

使用未處理之正常食蟹獼猴，以如下方法對C10抗體與2C3B抗體之血清磷濃度上升作用進行比較。C10抗體係使用實施例4中所製作者。實驗動物如下：使用2~3歲、體重2~4kg之雌性食蟹獼猴作為介質投予群；2C3B抗體投予群中每群為3隻，C10抗體投予群中使用4隻。分別將C10抗體及2C3B抗體以PBS(-)調整為3mg/mL之濃度，製成投予液。陰性對照係使用作為介質之PBS(-)。C10抗體及2C3B抗體，係以分別成為3mg/kg之方式、以1mL/kg之容量、自上臂橈側皮靜脈以1mL/分之流速進行單次投予。血清磷濃度，係使用L-type Wako無機磷(和光純藥工業公司)試藥，以日立自動分析裝置7180(日立製作所公司)進行測定。血清1,25D濃度，係使用1,25(OH)₂ D RIA試劑盒「TFB」(Immunodiagnostic Systems公司)進行測定。測定係於投予抗體後，分別於第0.5日、第1日、第2日、第3日、第5日、第7日、第10日、第14日、第21日、第28日、第35日、第42日、第49日進行。數據係以平均值+/-標準誤差來表示。將投予各抗體後進行經時採血所測得之血清磷濃度至第10日為止的變化情況示於圖6。於PBS(-)投予群中，血清磷濃度於試驗期間為大致固定的濃度，相對於此C10抗體投予群及2C3B抗體投予群，與投予前及PBS(-)投予群相比，看到有血清磷濃度的明顯上升。於C10抗體投予群及2C3B抗體投予群中看見最高的血清磷濃度之時期，均為投予抗體後第5日，此時之血清磷濃度於PBS(-)投予群中為5.28mg/dl，於2C3B抗體投予群中為8.10mg/dl，於C10抗體投予群中為9.59mg/dl。對於投予該抗體後第5日之2C3B抗體投予群與C10抗體投予群之血清磷濃度，若對自同時期的PBS(-)投予群的血清磷濃度之上升值進行比較，則2C3B投予群中之血清磷濃度為2.82mg/dl，相對於此C10抗體投予群為4.31mg/dl，C10抗體高度誘導與2C3B抗體相比為1.5倍以上之血清磷濃度(圖7)。如此般，C10抗體投予群之血清磷濃度上升作用，顯著高於2C3B抗體投予群。又，2C3B抗體投予群之血清磷濃度，於投予後第10日達到與PBS(-)之血清磷濃度同等之值，但C10抗體投予群之血清磷濃度(8.76mg/dl)依然保持高於2C3B抗體投予群之最高值(8.10mg/dl)之值(圖6)。進而，由於C10抗體所引起的血清磷濃度上升之持續時間，大大長於由於2C3B抗體所引起的血清磷濃度上升之持續時間，2C3B抗體投予群中與PBS(-)投予群具有顯著性差異之上升期間為7日，相對於此C10抗體投予群中上升期間驚人地達到35日，持續時間亦延長約5倍。同樣地，關於投予抗體後之1,25D濃度，C10抗體投予群與2C3B抗體投予群相比亦顯示出顯著的上升以及其持續時間的延長(圖8)。此結果顯示，與作為現有的FGF23中和抗體之2C3B抗體相比，於食蟹獼猴中，C10抗體投予群具有更強力的血清磷濃度上升及血清1,25D上升作用，亦即具有強力的FGF23中和活性。目前，於XLH等之低磷血症性佝僂症之症狀治療中，一日中複數次大量投予磷或維生素D製劑，但僅能勉強進行保持正常範圍的磷濃度之治療。亦有多次服用之依從性較差之報告。於本研究之單次投予C10抗體時，觀察到血清磷濃度、血清1,25D濃度之持續上升作用，此情況暗示，作為低磷血症治療藥，C10抗體與目前的治療相比，能夠達成具有顯著的優越性之治療。

(實施例11)C15抗體對人類及食蟹獼猴FGF23之反應性的確認

藉由磷酸鈣法，將實施例1中製作之pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23或實施例8中製作之pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23，短暫性地基因導入至PEAK rapid細胞(Edge Biosystem公司)中。自導入起第3日，回收各培養上清液，使用實施例13中製作之C15抗體作為一次抗體，進行西方墨點分析(圖9)。其結果顯示，C15與人類FGF23結合之情形同樣，C15亦與食蟹獼猴FGF23結合。

(實施例12)C10抗體及C15抗體對正常食蟹獼猴之血中磷濃度及血中1α,25二羥基維生素D濃度之作用的比較

由實施例11顯示，C15抗體與C10抗體同樣，對人類及食蟹獼猴FGF23重組蛋白具有結合活性。因此，對於C10抗體及C15抗體，藉由將其等投予給正常食蟹獼猴，而對兩者於生物體內之FGF23中和活性進行比較。針對食蟹獼猴內在性FGF23之中和活性的評價，係以血清磷濃度上升作為指標而實施。C10抗體或C15抗體，係使用實施例7中所製作者。實驗動物如下：使用2~3歲、體重2~3kg之正常食蟹獼猴，每群中使用2隻雄性、1隻雌性，合計3隻。稀釋介質係使用PBS(-)，將C10抗體濃度調整為1mg/mL及3mg/mL，將C15抗體濃度調整為3mg/mL。C10抗體，係以投予量達到1mg/kg及3mg/kg之方式、以1mL/kg之容量、以1mL/分之流速自隱靜脈進行單次投予；又，C15抗體係以投予量達到3mg/kg之方式、以1mL/kg之容量、以1mL/分之流速自隱靜脈進行單次投予。血清磷濃度，係使用L-type Wako無機磷(和光純藥工業公司)試藥，以日立自動分析裝置7180(日立製作所公司)進行測定。採血，係於投予抗體前、及投予1、3、5、7、10、14、21及28日後實施，於全部採血點均進行血清磷濃度之測定。C10抗體1mg/kg群、C10抗體3mg/kg群及C15抗體3mg/kg群於投予抗體前之血清磷濃度分別為5.37、5.70及5.58mg/dL，無群間差異。於投予後顯示，全部食蟹獼猴中均看到血清磷濃度之上升，不僅是C10抗體而且C15抗體亦對食蟹獼猴內在性FGF23具有中和活性。C10抗體1mg/kg群、C10抗體3mg/kg群及C15抗體3mg/kg群之各自血清磷濃度，於投予3 日後分別為9.03、9.10及8.64mg/dL。此時，C10抗體1mg/kg群及C15抗體3mg/kg群之血清磷濃度顯示最高值。另一方面，C10抗體3mg/kg群之血清磷濃度進一步上升，於投予5日後顯示最大值，其值為9.75mg/dL。投予前後之血清磷濃度的最大上升幅度，C10抗體1mg/kg群、C10抗體3mg/kg群及C15抗體3mg/kg群中分別為3.67、4.65及3.06mg/dL。該結果顯示，於3mg/kg之相同用量下，C10抗體之血清磷濃度上升作用比C15抗體強，不僅如此令人吃驚的是，1mg/kg用量之C10抗體比3mg/kg之C15抗體更能提昇血中磷濃度。其次，對與投予前相比，對血清磷濃度上升之期間進行比較。其結果，C10抗體1mg/kg群、C10抗體3mg/kg群及C15抗體3mg/kg群中分別為14、28及7日。該結果顯示，於3mg/kg之相同用量下，C10抗體之血清磷濃度上升作用比C15抗體更持久，不僅如此令人吃驚的是，1mg/kg用量的C10抗體，與3mg/kg之C15抗體相比，可於更長的期間內將血中磷濃度維持於較高值。以上結果表明，C10抗體，與C10抗體同時獲得之C15抗體相比，具有更強的食蟹獼猴之血清磷濃度上升作用及血清磷上升持續作用。亦即表明，C10抗體對食蟹獼猴FGF23之中和活性，顯著地強於C15抗體。

(實施例13)人類FGF23 DNA片段(無訊息序列)之製作

使用KOD-plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司)且依照所附帶的說明書製備反應液，於50μl反應液中各添加15pmol之FGF23(-SP)FW引子(序列編號34)及FGF23(-SP)RV引子(序列編號35)，添加人類FGF23-cDNA(含有起始密碼子至終止密碼子之756bp序列編號36)作為模板，於94℃下保溫3分鐘後，將於98℃下保溫15秒、於63℃下保溫15秒及於68℃下保溫2分30秒作為1個循環，進行30次循環之擴增，再於72℃下保溫3分鐘。以0.8%凝膠將所獲得之684bp之擴增片段分離回收。使用QIAquick Gel Extraction試劑盒(QIAGEN公司)，依照所附帶之說明書，自經回收之凝膠中回收擴增片段。以FseI(New England Biolabs Japan公司)，對經回收之PCR擴增片段進行酶消化，使用QIAquick PCR Purification試劑盒(QIAGEN公司)且依照所附帶之說明書回收酶處理片段。其結果，獲得與不含有人類FGF23之訊息序列之成熟體部分相當之部分DNA片段。

FGF23(-SP)FW：TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG(序列編號34)

FGF23(-SP)RV：TTGGCCGGCC CTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG(序列編號35，含有FseI位點 )

人類FGF23鹼基序列(以下劃線來表示訊息序列部分，以線框來表示自全長體中除去訊息序列部分之成熟體部分。)(序列編號36)

以序列編號36為基準之人類FGF23胺基酸序列(以下劃線來表示訊息序列部分，以線框來表示自全長體中除去訊息序列部分之成熟體部分。)(序列編號37)

(實施例14)pPSs FGF23載體之構建

以SfoI及FseI消化國際公開第WO2006/78072手冊之實施例1-8中所記載之pPSs5.5，然後使用源自大腸桿菌的鹼性磷酸酶進行末端脫磷酸化，於所製成者中插入實施例13中所製作之含人類FGF23的DNA片段後，再導入DH5α中。由所獲得之基因轉殖體製備DNA，確認連結部分之鹼基序列，而取得pPSs FGF23載體(圖10)。

(實施例15)pUS FGF23 KI載體之構建

以SalI及FseI對國際公開第WO 2006/78072號手冊之實施例43-1中所製作之pCk loxPV△P進行酶消化，然後使用源自大腸桿菌C75之鹼性磷酸酶進行末端脫磷酸化，於所製成者中插入以SalI及FseI消化上述實施例14之pPSs FGF23載體且藉由0.8%瓊脂糖凝膠而分離回收之約1.5kb之片段後，將其導入大腸桿菌XL10-Gold Ultracompetent Cells(STRATAGENE公司)中。由所獲得之基因轉殖體製備DNA，確認連結部分之鹼基序列，而獲得pUS FGF23 KI載體(圖11)。

以下表示將pUS FGF23 KI載體人類FGF23表現單元之自起始密碼子至終止密碼子之多核苷酸序列(FGF23訊息序列)置換成含有插入子區域之小白鼠Igκ訊息序列[序列編號38之下劃線部分]，且於其下游含有FGF23成熟體序列之985bp序列編號38；及由該cDNA所編碼之胺基酸序列(247胺基酸，下劃線部分表示小白鼠Igκ訊息序列，序列編號39)。含有插入子區域之小白鼠Igκ訊息序列資訊，係以自基因庫取得之MUSIGKVR1(登陸號K02159)為基礎，自UCSC小白鼠基因組資料庫中取得其上游之基因組序列。

序列編號38：

序列編號39：

(實施例16)電穿孔用pUS FGF23 KI載體之製備

使用添加有精三胺(spermidine)(1mM、pH值7.0，Sigma Aldrich Japan公司)之緩衝液(Roche Diagnostics公司，制限酶用H緩衝液)，且使用NotI(Takara Bio公司)，於37℃下對pUS FGF23 KI載體60μg消化5小時，以苯酚/氯仿進行萃取後，加入2.5倍容量之100%乙醇、及0.1倍容量之3M醋酸鈉，於-20℃下保存16小時。將以NotI進行單鏈化之載體進行離心且回收後，加入70%乙醇進行滅菌。於無塵無菌操作檯內除去70%乙醇，將其風乾1小時。以成為0.5μg/μL的DNA溶液之方式加入HBS溶液，於室溫下保存1小時，而製備電穿孔用pUS FGF23 KI載體。

(實施例17)使用pUS FGF23 KI載體及RS element targeting小白鼠ES細胞株而取得PL FGF23小白鼠ES細胞株

為了藉由同源重組而取得於免疫球蛋白κ輕鏈基因下游插入有人類FGF23-cDNA之PL FGF23小白鼠ES細胞株，依照實施例16中所揭示之方法，依照經確立之方法(相澤慎一，Biomanual Series 8、Gene targeting，羊土社，1995)將以制限酶NotI進行線狀化之pUS FGF23 KI載體導入RS element targeting小白鼠ES細胞中。以國際公開第WO 2006/78072號手冊之實施例10中所記載之方法，取得RS element targeting小白鼠ES細胞。

RS element targeting小白鼠ES細胞之培養法，係依照上述記載之方法(相澤慎一，上述)；營養細胞係使用經絲裂黴素C(Sigma Aldrich Japan公司)處理之G418抗性初代培養細胞(自Invitrogen公司購入)。首先，對經增殖之RS element targeting小白鼠ES細胞進行胰蛋白酶處理，以達到3×10⁷ 個/ml之方式將其懸浮於HBS中，將0.5ml細胞懸浮液與10μg載體DNA加以混合，以基因脈衝管(Gene pulser cuvette，電極距離：0.4cm，Bio-Rad Laboratories公司)進行電穿孔(容量：960μF，電壓：250V，室溫)。將經電穿孔之細胞懸浮於10ml之ES培養基(相澤慎一，上述)中，再將其播種於1個預先播種有餵養細胞之100mm組織培養用塑膠培養皿(Falcon，Becton Dickinson公司)中。於36小時後，更換為含有0.8μg/ml嘌呤黴素(Sigma Aldrich Japan公司)之ES培養基。取出7日後所生成之群落，使各群落於24孔培養盤中生長，直至融合(confluent)，將其中的2/3懸浮於0.2ml保存用培養基(FBS+10%DMSO，Sigma Aldrich Japan公司)中，於-80℃下保存。剩餘的1/3係播種於12孔塗佈有明膠之培養盤中，培養2日，利用Puregene DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)由10⁶ ~10⁷ 個細胞製備基因組DNA。以制限酶EcoRI(Takara Bio公司)消化該等嘌呤黴素抗性RS element targeting小白鼠ES細胞基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳進行分離。繼而，進行南方墨點分析，以WO 00/10383號手冊(參照實施例48)所記載之發明中所使用的Ig輕鏈Jκ-Cκ基因組DNA之3'端的DNA片段(XhoI~EcoRI，約1.4kb，WO 00/10383號手冊圖5)Ck 3'探針作為探針，檢測同源重組體。野生型RS element targeting小白鼠ES細胞藉由EcoRI消化，檢測出1條蛋白帶(15.1kb)。於同源重組體中，除該蛋白帶以外，推測於其下部會出現新的蛋白帶(12.8kb)(圖12)，但於嘌呤黴素抗性株中，確認有此新的蛋白帶。亦即，該等選殖體係於一個對偶基因之免疫球蛋白κ鏈基因下游插入有人類FGF23-cDNA者。

(實施例18)自PL FGF23小白鼠ES細胞株中除去抗藥性基因之US FGF23小白鼠ES細胞株之取得

為了取得自PL FGF23小白鼠ES細胞株中除去2種抗藥性基因(Puro^r ,Neo^r )之US FGF23基因導入ES細胞株，而依照經確立之方法(相澤慎一，Biomanual Series 8，Gene targeting，羊土社，1995)，將pCAGGS-Cre載體(Sunaga等人，Mol Reprod Dev.,46：109-113,1997)導入PL FGF23小白鼠ES細胞中。

PL FGF23小白鼠ES細胞之培養法，係依照上述記載之方法(相澤慎一，上述)；營養細胞，係使用經絲裂黴素C(Sigma Aldrich Japan公司)處理之G418抗性初代培養細胞(自Invitrogen公司購入)。首先，對經增殖之PL FGF23小白鼠ES細胞進行胰蛋白酶處理，以達到3×10⁷ 個/ml之方式將其懸浮於HBS中，再將0.5ml此細胞懸浮液與10μg載體DNA加以混合，以基因脈衝管(電極距離：0.4cm，Bio-Rad Laboratories公司)進行電穿孔(容量：960μF，電壓：250V，室溫)。將經電穿孔之細胞懸浮於10ml之ES培養基(相澤慎一，上述)中，自其中取出2.5ml播種於1個預先播種有餵養細胞之60mm組織培養用塑膠培養皿(Falcon，Becton Dickinson公司)中。於30小時後，將1000個ES細胞播種於1個預先播種有餵養細胞之100mm組織培養用塑膠培養皿(Falcon，Becton Dickinson公司)中。6日後取出生成之群落，使各群落於24孔培養盤中生長直至融合，將其中的2/3懸浮於0.2ml保存用培養基(FBS+10%DMSO，Sigma Aldrich Japan公司)中，於-80℃下保存。將剩餘之1/3播種於12孔塗佈有明膠之培養盤中，培養2日，利用Puregene DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)由10⁶ ~10⁷ 個細胞製備基因組DNA。以制限酶EcoRI(Takara Bio公司)消化該等小白鼠ES細胞基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳進行分離。繼而，進行南方墨點分析，以WO 00/10383號手冊(參照實施例48)所記載之發明中使用之Ig輕鏈Jκ-Cκ基因組DNA之3'端的DNA片段(XhoI~EcoRI，約1.4kb，WO 00/10383號手冊圖5)Ck 3'探針作為探針，檢測出僅除去被loxPV序列所夾住的Puro^r 基因之ES細胞株。對於保持有Puro^r 基因之ES細胞，藉由EcoRI消化，檢測出2條蛋白帶(15.1kb及12.8kb)；僅除去Puro^r 基因之ES細胞株中，藉由EcoRI消化，檢測出2條蛋白帶(15.1kb及10.9kb)(圖12)。又，使用以與上述同樣的操作而獲得之南方墨點膜，以藉由國際公開第WO 2006/78072號手冊之實施例9中所揭示方法所製備之3'KO-探針作為探針，檢測出僅除去被loxP序列夾住之Neo^r 基因之ES細胞株。於保持有Neo^r 基因之ES細胞中，藉由EcoRI消化，檢測出2條蛋白帶(7.4K及5.7K)；於僅除去Neo^r 基因之ES細胞株中，藉由EcoRI消化，檢測出2條蛋白帶(5.7K及4.6K)(圖12)。該等之結果為，獲得自PL FGF23小白鼠ES細胞株中同時除去2種抗藥性基因(Puro^r ,Neo^r )之ES細胞株(US FGF23小白鼠ES細胞株)。

(實施例19)使用US FGF23小白鼠ES細胞株及源自B淋巴球缺損小白鼠系統之宿主胚胎來製作US FGF23 KI嵌合小白鼠

於免疫球蛋白μ鏈基因踢除之同型合子中，功能性的B淋巴球有缺損，未產生抗體(Kitamura等人，Nature,350：423-426,1991)。利用藉由使在清浄環境中飼養的上述同型合子的雌雄個體交配而獲得之胚胎，作為本實施例中所進行的嵌合小白鼠製作時之宿主。於此情形時，於嵌合小白鼠中，功能性的B淋巴球係源自注入有大部分之ES細胞。於本實施例中，將對富塚等人之報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97：722-7,2000)中所記載之免疫球蛋白μ鏈基因踢除小白鼠進行3次以上向MCH(ICR)(日本Clea公司)系統之返回交配的個體，用於製備宿主胚胎。

將於上述實施例18中所獲得的確認於免疫球蛋白κ鏈基因下游插入有人類FGF23-cDNA之US FGF23小白鼠ES細胞株自冷凍庫中取出，將其等注入藉由使上述免疫球蛋白μ鏈踢除小白鼠同型合子的雌雄性小白鼠交配而獲得之8細胞期胚胎中，於每個胚胎中注入8~10個。於ES培養基(相澤慎一，Biomanual Series 8，Gene targeting，羊土公司，1995)中培養一晚直至生成囊胚後，將注射胚胎移植入於假孕處理後2.5日的假親MCH(ICR)小白鼠(日本Clea公司)的子宮中，每一側子宮中分別移植約10個注射胚胎。將使用實施例18之US FGF23小白鼠ES細胞株而製作之注射胚胎進行移植，結果生出子代嵌合小白鼠。嵌合個體，可根據於毛色方面在源自宿主胚胎之白色中是否看見源自ES細胞之野生色(濃茶色)來進行判定。於所生出之子代嵌合小白鼠中，獲得毛色中明顯有野生色的部分亦即看見ES細胞的貢獻之個體。由該等結果顯示，於免疫球蛋白κ鏈基因下游插入有人類FGF23-cDNA之US FGF23小白鼠ES細胞株，保持有嵌合形成能力、亦即保持有分化成小白鼠個體的正常組織之能力。又，如下述實施例21所示，US FGF23 KI嵌合小白鼠之血中FGF23濃度較高，可將其作為表現出低磷血症性佝僂症樣症狀之病態模型動物使用。

(實施例20)對照嵌合小白鼠之製作

含有依照國際公開第WO 2006/78072號手冊之實施例11所記載方法而製作的人類FGF23-cDNA且未插入功能基因之嵌合小白鼠，於下述實施例21之向US FGF23 KI嵌合小白鼠投予C10抗體之實驗中，係作為對照嵌合小白鼠個體(WT小白鼠)使用。

(實施例21)C10抗體在使用US FGF23 KI嵌合小白鼠中之病態改善效果的驗證

實施例10及12中顯示，C10抗體與2C3B抗體或C15抗體相比，可顯著抑制正常食蟹獼猴之內在性FGF23之作用，可提昇其血清磷濃度及血清1,25D濃度。強烈暗示，對人類FGF23具有中和活性之抗體，對包括由於FGF23過剩所造成的腫瘤性骨質軟化病、XLH等在內之低磷血症性佝僂病/骨質軟化病等人類疾病具有治療效果。為了研究本研究中所取得之C10抗體對由於人類FGF23過剩所造成之病態的改善效果，而使用實施例19中所製作之US FGF23 KI嵌合小白鼠(以下稱為hFGF23KI小白鼠)來進行實驗。將12隻作為病態動物之hFGF23 KI小白鼠、及6隻作為其比較對象之同週齡正常對照小白鼠(WT小白鼠，實施例20中所製作者)用於實驗。於7週齡時，採取hFGF23 KI小白鼠的血清，分別測定FGF23(FGF-23 ELISA試劑盒，Kainos公司)及磷之血清濃度。與WT小白鼠相比，於hFGF23 KI小白鼠中顯示有血清FGF23濃度顯著上升(WT小白鼠：n=6，163pg/mL；hFGF23KI小白鼠：n=12，1467pg/mL)。由此結果顯示，將人類FGF23基因導入正確地導入hFGF23 KI小白鼠中，進而顯示外源性人類FGF23於hFGF23 KI小白鼠血中過剩存在。進而顯示，與WT小白鼠相比，hFGF23 KI小白鼠之血清磷濃度顯著降低(WT小白鼠：n=6，5.82mg/dL；hFGF23KI小白鼠：n=12，2.62mg/dL)，於hFGF23 KI小白鼠中，由於過剩的人類FGF23作用而誘發低磷血症。此時，以FGF23濃度達到均等之方式，將12隻hFGF23 KI小白鼠分為2群，C10抗體及對照IgG1投予群各為6隻(圖13)。其次，自8週齡起，以30mg/kg之用量，以每週1次之頻率，於靜脈內反覆投予5次C10抗體或同型對照用之純化人類IgG1(對照抗體)。於初次投予前及投予3日後，自小白鼠中採取血液，取得血清。四肢握力之測定，係於第4次投予的24小時後，使用齋藤式小白鼠用握力測定裝置(GRIP STRENGTH METER,MK-380S，室町機械)而實施。四肢握力之評價，係使小白鼠抓住測定用網格(網)，用手沿水平方向拉伸小白鼠的尾巴，以動物無法耐受拉力而脫離網格為止之最大力(握力)作為指標而實施。關於骨評價，係於第5次投予的24小時後，於麻醉下藉由心臟採血而將小白鼠處死後，取出大腿骨及頸骨，以70%乙醇進行固定。血清磷濃度，係使用初次投予前、初次投予3日後及第5次投予的24小時後之血清來進行測定。對於大腿骨，係於非脫灰樹脂包埋後，進行Villanueva-Goldner染色，而實施組織學評價。對於頸骨，係藉由灰化而測定礦物質含量。

其結果，hFGF23KI小白鼠之對照抗體投予群中的血清磷濃度，於分群及處死時，與WT小白鼠之對照抗體投予群相比，同時顯示出顯著的較低值，確認係持續性的低磷血症狀態(圖14)。另一方面，可確認，hFGF23KI小白鼠投予C10抗體之群中的血清磷濃度，於3日後上升至與WT小白鼠之對照抗體投予群相同的水平(圖14)。又，顯示C10抗體於第5次投予後之血清磷濃度亦與WT小白鼠之對照抗體投予群為相同水平，即使於投予5次後，亦維持投予C10抗體所造成之血清磷上升作用(圖15)。

作為低磷血症患者之病例，臨床報告有骨骼肌之肌力下降[Baker and Worthley,Crit Care Resusc.,4：307-315,2000]。於本試驗中，因hFGF23KI小白鼠亦呈現出顯著的低磷血症，故推測肌力低下。因此，作為肌力低下之指標，以上述方法測定四肢握力，並在各群之間進行比較。其結果，hFGF23KI小白鼠之對照抗體投予群的握力，與 WT小白鼠之對照抗體投予群相比，顯示出顯著的較低值，於此病態模型小白鼠中亦觀察到肌力低下(圖16)。相對於此，hFGF23KI小白鼠之C10抗體投予群中，亦看見對握力之顯著的改善效果(圖16)。

其次，若以Villanueva-Goldner法，對大腿骨之硬組織標本進行組織染色並進行觀察，則與投予對照抗體之WT小白鼠相比，投予對照抗體之hFGF23KI小白鼠中確認有大量的類骨(於圖17中以紅色表示)，因此暗示引起了鈣化障礙。此情形作為佝僂症的特徵性症狀而廣為人知。相對於此，投予C10抗體之hFGF23KI小白鼠中，確認類骨減少，預測類骨正在轉化為石灰化骨(於圖17中以綠色表示)。由此結果暗示，C10抗體可改善由於FGF23過剩所誘發之骨鈣化障礙。因此，將頸骨灰化，測定礦物質含量，於各群之間進行比較。hFGF23KI小白鼠之對照抗體投予群之頸骨之礦物質含量，與WT小白鼠之對照抗體投予群相比顯著地下降(圖18)。相對於此，確認於hFGF23KI小白鼠之C10投予群中，礦物質含量得以改善(圖18)。由以上結果確認，於hFGF23KI小白鼠中，投予C10抗體，可中和生物體內過剩作用之人類FGF23作用，且改善低磷血症、肌力下降、骨鈣化障礙等低磷血症性佝僂症之各種症狀。亦即，顯示C10抗體可成為有FGF23參與的人類各種疾病之有效治療藥。

[產業上之可利用性]

本發明之抗FGF23之抗體即C10抗體，與公知之抗FGF23 之抗體相比，持續提昇於體內試驗中的血清磷濃度之活性及/或持續提昇血清1,25D濃度之活性較高，從而作為由於FGF23的過剩作用所導致之疾病、或預計可藉由調節FGF23的作用而改善病態之疾病之預防及治療劑，具有顯著的效果。

序列表自由文本序列編號1~3、5~27、30~33、40~45合成

直接將本說明書中所引用之全部發行物、專利及專利申請作為參考，且將該等摘錄於本說明書中。

圖1係模式性表示C10表現載體之構建過程之圖。

圖2表示於N5KG1_C10_LH中之抗體基因重鏈之鹼基序列(序列編號30)及胺基酸序列(序列編號31)。圖中，被方框包圍之胺基酸序列表示分泌訊息序列(引導序列)。

圖3表示於N5KG1_C10_LH中之抗體基因輕鏈之鹼基序列(序列編號32)及胺基酸序列(序列編號33)。圖中，被方框包圍之胺基酸序列表示分泌訊息序列(引導序列)。

圖4係表示C10表現載體之構造之圖。

圖5A係表示以將2C3B抗體或C10抗體作為固相抗體且將3C1E抗體作為檢測抗體之三明治型ELISA法，檢測經純化之全長人類FGF23蛋白質之測定結果之圖。

圖5B係表示以將2C3B抗體或C10抗體作為固相抗體且將3C1E抗體作為檢測抗體之三明治型ELISA法，檢測食蟹獼猴FGF23表現細胞上清液之測定結果之圖。

圖6係經時地測定投予有介質、2C3B抗體或C10抗體之食蟹獼猴的血清磷濃度之圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於使用學生t檢驗進行與同日的介質投予群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.05)之測定值，於圖表上附加上「*」。

圖7係表示以投予介質第5日之食蟹獼猴之血清磷濃度作為基準之、投予2C3B抗體或C10抗體後第5日之食蟹獼猴之血清磷濃度的上升值之圖表。

圖8係經時地測定投予介質、2C3B抗體或C10抗體之食蟹獼猴之血清1,25D濃度之圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於使用學生t檢驗進行與同日之介質投予群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.05)之測定值，於圖表上附加上「*」。

圖9係使用C15抗體，藉由西方墨點法對未強制表現的細胞之培養上清液(對照)、人類及食蟹獼猴FGF23表現細胞培養上清液進行檢測之照片。

圖10係表示pPSs FGF23載體之構造之圖。

圖11係表示pUS FGF23 KI載體之構造之圖。

圖12表示靶向抗藥性基因(loxp-neo^r )之對偶基因構造、使用pUS hFGF23 KI載體來靶向人類FGF23(-SP)+抗藥性基因(loxpv-puro^r )之對偶基因構造、除去抗藥性基因(loxp-neo^r ,loxpv-puro^r )之對偶基因構造及南方雜交分析用探針之位置。圖中所記載術語之詳細說明如下。

hFGF23(-SP)：不具有固有訊息肽編碼區域之人類 FGF23基因；Cκ：小白鼠Igκ基因恆定區域；loxpv-puro：於兩端具有作為loxP序列的一部分突變序列之loxPV序列的耐嘌呤黴素性基因；loxp-neo^r ：於兩端具有loxP序列之新黴素抗性基因；Ck3'探針：用於導入hFGF23(-SP)+loxpv-puro^r 基因及篩選loxpv-puro^r 基因除去選殖體的南方墨點分析探針；3'KO-探針：用於導入loxp-neo^r 基因及篩選除去選殖體之南方墨點分析探針；E：EcoRI制限酶位點。

圖13係表示投予對照抗體或C10抗體7日前之血清FGF23濃度之圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於使用學生t檢驗進行與WT小白鼠群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之測定值，於圖表上附加上「***」。

圖14係表示投予對照抗體或C10抗體7日前及初次投予3日後之血清磷濃度之圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於在同一日內，使用學生t檢驗進行與WT小白鼠群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之測定值，於圖表上附加上「***」。進而，對於在同一日內，進行與hFGF23KI小白鼠對照抗體投予群的顯著性差異，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之hFGF23KI小白鼠C10抗體投予群，於圖表上附加上「###」。

圖15係表示第5次投予對照抗體或C10抗體1日後之血清磷濃度之圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於使用學生t檢驗進行與WT小白鼠群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之群，於圖表上附加上「***」。進而，對於進行與hFGF23KI小白鼠對照抗體投予群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之hFGF23KI小白鼠C10抗體投予群，於圖表上附加上「###」。

圖16係第4次投予對照抗體或C10抗體1日後之握力之圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於使用學生t檢驗進行與WT小白鼠群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之群，於圖表上附加上「***」。進而，對於進行與hFGF23KI小白鼠對照抗體投予群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之hFGF23KI小白鼠C10抗體投予群，於圖表上附加上「###」。

圖17係表示於第5次投予對照抗體或C10抗體1日後進行解剖且採取小白鼠的大腿骨，以Villanueva-Goldner法對其進行組織染色之圖像之照片。

圖18係表示於第5次投予對照抗體或C10抗體1日後進行解剖且採取之頸骨的灰重量相對於乾燥重量之比例的圖表。測定值係以平均值+/-標準誤差來表示。又，對於使用學生t檢驗進行與WT小白鼠群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異(p<0.001)之群，於圖表上附加上「***」。進而，對於進行與hFGF23KI小白鼠對照抗體投予群的顯著性差異之分析，結果觀察到顯著性差異 (p<0.001)之hFGF23KI小白鼠C10抗體投予群，於圖表上附加上「###」。。

<110> 日商麒麟醫藥股份有限公司<120> 抗FGF23抗體及含有其之醫藥組合物<130> PH－3490－PCT <140> 097105234 <141> 2008－02－14 <150> JP 2007－34018 <151> 2007－02－14 <160> 45 <170> PatentIn第34版<210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 合成<400> 1<210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 2<210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 3<210> 4 <211> 251 <212> PRT <213> 現代智人<400> 4 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 5<210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 6<210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 7<210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 8<210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 9<210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 10<210> 11 <211> 408 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 合成<400> 11<210> 12 <211> 136 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 12 <210> 13 <211> 384 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 13<210> 14 <211> 128 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 14 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> 人工.<220> <223> 合成<400> 15<210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成 <400> 16<210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 17<210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 18<210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 19<210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 20<210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 21<210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 22<210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 23<210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 24<210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 25<210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 26<210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 27<210> 28 <211> 756 <212> DNA <213> 食蟹獼猴<400> 28 <210> 29 <211> 251 <212> PRT <213> 食蟹獼猴<400> 29 <210> 30 <211> 1417 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 30<210> 31 <211> 466 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 31 <210> 32 <211> 724 <212> DNA <213> 人工<220> <223> 合成<400> 32 <210> 33 <211> 235 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 33 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> 現代智人<400> 34<210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> 現代智人<400> 35<210> 36 <211> 756 <212> DNA <213> 現代智人<400> 36<210> 37 <211> 251 <212> PRT <213> 現代智人<400> 37 <210> 38 <211> 985 <212> DNA <213> 家鼷鼠<400> 38<210> 39 <211> 247 <212> PRT <213> 家鼷鼠<400> 39 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 40<210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 41<210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 42<210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 43<210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成<400> 44<210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> 人工<220> <223> 合成 <400> 45

Claims

一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係包含：與由融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772；國內寄存號碼BCRC 960353)所產生之抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域相同的胺基酸序列。
一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係包含：包括序列編號12之自第20號胺基酸至第136號胺基酸所示之胺基酸序列的重鏈可變區域；及包括序列編號14之自第23號胺基酸至第128號胺基酸所示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係包含：序列編號40所示之CDR1、序列編號41所示之CDR2及序列編號42所示之CDR3作為重鏈可變區域；以及序列編號43所示之CDR1、序列編號44所示之CDR2及序列編號45所示之CDR3作為輕鏈可變區域。
一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係由融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772；國內寄存號碼BCRC 960353)所產生。
如請求項1至4中任一項之經純化之抗人類FGF23抗體，其中抗體之類型係選自由IgG、IgA、IgE及IgM所組成之群者。
如請求項5之經純化之抗人類FGF23抗體，其中抗體之亞型係選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4所組成之群者。
一種醫藥組合物，其係含有如請求項1至6中任一項之經純化之抗人類FGF23抗體作為有效成分。
一種融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772；國內寄存號碼BCRC 960353)。
一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係包含與由融合瘤C10(寄存號碼FERM BP-10772；國內寄存號碼BCRC 960353)所產生之抗體之重鏈可變區域及輕鏈可變區域相同的胺基酸序列；且該抗體之亞型為IgG1。
一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係包含包括序列編號12之自第20號胺基酸至第136號胺基酸所示之胺基酸序列的重鏈可變區域；及包括序列編號14之自第23號胺基酸至第128號胺基酸所示之胺基酸序列的輕鏈可變區域；且該抗體之亞型為IgG1。
一種經純化之抗人類FGF23抗體，其係包含序列編號40所示之CDRI、序列編號41所示之CDR2及序列編號42所示之CDR3作為重鏈可變區域；以及序列編號43所示之CDR1、序列編號44所示之CDR2及序列編號45所示之CDR3作為輕鏈可變區域；且該抗體之亞型為IgG1。