JP4800396B2 - 抗ｆｇｆ２３抗体及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明はＦＧＦ２３抗原に特異的に結合する抗ＦＧＦ２３抗体に関する。さらに本発明は、抗ＦＧＦ２３抗体を有効成分とする、ＦＧＦ２３過剰産生に若しくは他の原因に起因するミネラル代謝性疾患に対する予防又は治療剤、特に低リン血症性クル病・骨軟化症治療剤に関する。

線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、最初に線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３の増殖を刺激する物質としてウシの下垂体より精製された。以降、種々の組織より類似の蛋白質が同定されており、それら一群の物質はポリペプチドファミリー（ＦＧＦファミリー）を形成している。現在までのところ、ＦＧＦファミリーに属するものとして脊椎動物において２２種の蛋白質が同定されている。これらの蛋白質の生物活性としては、線維芽細胞増殖活性だけでなく中胚葉や神経外胚葉の増殖や血管新生作用、発生段階における肢芽形成など多岐にわたる作用が知られている。ＦＧＦはその遺伝子の発現部位、発現時期についても多様であり、発生段階や成人における特定部位においてのみ発現しているというものも多い。ＦＧＦの受容体をコードする遺伝子としてはＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４の少なくとも４種が知られており、またＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３においてはスプライシングの違いにより細胞外ドメインの異なる受容体蛋白質がそれぞれにおいて存在することが知られている。また、ヘパリンやヘパラン硫酸プロテオグリカンがＦＧＦやＦＧＦ受容体と相互作用することにより作用を調節することが知られている。また、構造的類似性よりＦＧＦファミリーに属するが、その生物活性や受容体結合性等について、ほとんど解明されていないものも多い。このようなＦＧＦファミリーの特徴については、総説としてまとめられている（非特許文献１を参照）。
ＦＧＦ２３（一般的にＦＧＦ−２３と表されることもある）は、ＦＧＦ１５との相同性を利用したデータベース検索とＰＣＲ法にて最初にマウスよりクローニングされ、さらにマウスＦＧＦ２３の配列相同性を利用してヒトＦＧＦ２３がクローニングされた蛋白質であり、ヒトのＦＧＦ２３は２５１アミノ酸残基のポリペプチドからなる。また、分泌シグナル配列として２４番目までのアミノ末端側配列が分泌時に切断されることが予想されている（非特許文献２を参照）。続いて常染色体優性低リン血症性クル病・骨軟化症（Ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ ｒｉｃｋｅｔｓ／ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｈｉａ：以下ＡＤＨＲという）の研究において、ＡＤＨＲ患者における変異遺伝子領域を絞り込み、責任遺伝子の同定を進めるなかで、ＡＤＨＲ患者のＦＧＦ２３の遺伝子にミスセンス変異が特徴的に見出された（非特許文献３を参照）。この発見により生体内におけるＦＧＦ２３の生理的重要性が強く示唆された。一方、ＦＧＦ２３の生物活性を決定づけたのは低リン血症性クル病、骨軟化症のひとつである腫瘍性骨軟化症の研究であった。この疾患では、疾患の責任腫瘍が液性の疾患惹起因子を分泌産生し、この疾患惹起因子の作用により低リン血症、骨軟化症等の病態に陥ることが考えられていた。
この責任腫瘍が産生する疾患惹起因子の探索において、腫瘍に高発現する遺伝子としてＦＧＦ２３がクローニングされ、さらにこの因子を投与することにより、低リン血症や骨軟化症が再現されることが示された（非特許文献４及び特許文献１を参照）。この研究により、ＦＧＦ２３が生体内のリンやカルシウムに関連する代謝調節に関わることが示されるとともに、生体内を循環して作用を発現する全身性因子として作用することが示唆された。さらにその後の研究において、実際に腫瘍性骨軟化症患者血中のＦＧＦ２３濃度が健常人に比較して高値であることも示された（非特許文献５及び６を参照）。
また、ＡＤＨＲや腫瘍性骨軟化症と臨床的所見において類似した様態を呈する疾患としてＸ染色体連鎖低リン血症性クル病（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ ｒｉｃｋｅｔｓ、以下ＸＬＨという）が知られているが、この病態においても血中のＦＧＦ２３濃度は高値となっていることが示された（非特許文献５及び６を参照）。
すなわちこれまで原因不明であった腫瘍性骨軟化症、ＸＬＨなどで観察されるビタミンＤ抵抗性クル病・骨軟化症の分泌性の疾患原因因子がＦＧＦ２３であるということが示された。さらに、ｆｉｂｒｏｕｓ ｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、常染色体劣性低リン血症性クル病など他のミネラル代謝性疾患においても血中のＦＧＦ２３濃度の高値と低リン血症やクル病・骨軟化症との関係が報告されている（非特許文献７〜９を参照）。
以上の報告により、生体内のＦＧＦ２３過剰状態は低リン血症やそれに伴うクル病・骨軟化症などを誘導することが示された。さらに慢性腎不全高リン血症においても血清ＦＧＦ２３の異常高値が報告されており、過剰なＦＧＦ２３が腎不全時におけるミネラル代謝性疾患などの一部に関わっている可能性も示唆されている（非特許文献１０及び１１を参照）。
これらのＦＧＦ２３の過剰が原因となり誘導される疾患において、ＦＧＦ２３作用の抑制あるいはＦＧＦ２３の除去が疾患の治療方法となりうることが考えられる。これまでに、ＦＧＦ２３の作用を抑制するものとして、抗ＦＧＦ２３マウスモノクローナル抗体の報告がある（特許文献２を参照）。この報告において使用されている抗ＦＧＦ２３マウスモノクローナル抗体２Ｃ３Ｂ及び３Ｃ１Ｅは正常マウスに投与すると内在性のマウスＦＧＦ２３の機能を阻害し、腎からのリン排泄を抑制し、腎におけるビタミンＤ代謝酵素の発現を変動させることにより、結果的に血清中のリン濃度及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（以下１，２５Ｄという）濃度を上昇させることが示されている。さらに、血清中のＦＧＦ２３濃度が高値であり、かつ低リン血症と骨の伸長障害や石灰化障害を呈するＸＬＨのモデルマウスであるＨｙｐマウスへの抗ＦＧＦ２３マウスモノクローナル抗体の反復投与を行った結果、Ｈｙｐマウスにおいて血中リン濃度の上昇を認め、かつ骨の伸長障害と石灰化障害が改善された。この結果より、ＦＧＦ２３過剰疾患に対する薬剤として、ＦＧＦ２３作用抑制抗体の使用が適切であると考えられた。しかしながら本報告によって使用された２Ｃ３Ｂや３Ｃ１Ｅ抗体はマウス由来の抗体である。ヒト宿主によって外来物として認識されるマウス抗体は、いわゆる「ヒト抗マウス抗体」すなわち「ＨＡＭＡ」応答を惹起し、重篤な副作用を示す場合がある（非特許文献１２を参照）。
このような問題を回避するためのアプローチのひとつとしてキメラ抗体が開発された（特許文献３及び４を参照）。キメラ抗体は、２つ又はそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域など）を含む。このようなキメラ抗体の利点は元のマウス抗体の性質である抗原への結合性などの特徴は保持することであるが、一方で依然として「ヒト抗キメラ抗体」すなわち「ＨＡＣＡ」応答を惹起する（非特許文献１３を参照）。
さらに、置換された抗体の一部のみが相補性決定領域（すなわち「ＣＤＲ」）である組換え抗体が開発された（特許文献５及び６を参照）。ＣＤＲ移植技術を使用してマウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク及び定常領域からなる抗体（すなわち「ヒト化抗体」）が産生されている（非特許文献１４を参照）。このような方法を用いて、マウス抗体をヒト抗体の配列に置換させることにより、２Ｃ３Ｂ抗体などの抗ＦＧＦ２３マウス抗体をヒト化することが知られている。しかしながら、ヒト化した場合、抗原へのアフィニティが下がるなどの可能性がある。
また、ＸＬＨなどにおける低リン血症性クル病の現状の治療においてはビタミンＤ製剤に加えリン酸を間歇的に経口投与する方法が主流であるが、一回あたりの投与量及び一日あたりの投与回数の多さから患者に対し多大な負担を強いる状況であることも問題となっている。そのため、患者やその家族の負担を減らす意味でも、投与間隔を延ばせるような持続性のある血清リン濃度、血清１，２５Ｄ濃度上昇作用を示す低リン血症治療薬が望まれている。
国際公開第ＷＯ０２／１４５０４号パンフレット 国際公開第ＷＯ０３／０５７７３３号パンフレット 欧州特許出願公開第１２０６９４号明細書 欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書 英国特許第ＧＢ２１８８６３８Ａ号明細書 米国特許第５５８５０８９号明細書 Ｏｒｎｉｔｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ，２：３００５．１−３００５．１２，２００１ Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２７７：４９４−４９８，２０００ Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，２６：３４５−３４８，２０００ Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：６５００−６５０５，２００１ Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８７：４９５７−４９６０，２００２． Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｋ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：１６５６−１６６３，２００３ Ｒｉｍｉｎｕｃｃｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：６８３−６９２，２００３ Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｍｅｔａｂ．，２３：２３１−２３７，２００５ Ｌｏｒｅｎｚ−Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３８：１２４８−１２５０，２００６ Ｇｕｐｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８９：４４８９−４４９２，２００４ Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，６４：２２７２−２２７９，２００３ Ｖａｎ Ｋｒｏｏｎｅｎｂｅｒｇｈ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．９：９１９−９３０，１９８８ Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０：２１５３−２１５７，１９８９ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８

本発明の目的は、ＦＧＦ２３に対するヒト抗体、並びに該抗体を用いてＦＧＦ２３の作用を抑制することにより予防又は治療が可能な疾患に対するより副作用が少ない予防又は治療剤などの医薬組成物を提供することにある。
さらに本発明の目的は、低リン血症治療薬として用いることが出来る抗ＦＧＦ２３抗体であって、既存の抗ＦＧＦ２３抗体に比べ、単回の投与で、より血清リン濃度、血清１，２５Ｄ濃度の持続的な上昇作用を有する抗体並びに、該抗体を用いてＦＧＦ２３が関連する疾患の予防又は治療剤などの医薬組成物を提供することにある。
現在の低リン血症性クル病の治療方法としてはビタミンＤ製剤と共にリン酸を一日に数度、間歇的に経口投与する方法が主流であるが、一回あたりの投与量及び一日あたりの投与回数の多さから患者に対し多大な負担を強いる状況であることが問題となっている。本発明において取得された抗ＦＧＦ２３ヒトモノクローナル抗体、Ｃ１０抗体はより持続的な血中リン濃度上昇及び１，２５Ｄ上昇作用すなわち強力なＦＧＦ２３中和活性を有することを示している。本研究におけるＣ１０抗体の単回の投与において、血清リン濃度、血清１，２５Ｄ濃度の持続的な上昇作用が観察されたことは、低リン血症治療薬として現状の治療に比して、Ｃ１０抗体は顕著な優位性を有する治療である可能性が示唆された。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ ハイブリドーマＣ１０（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７２）が産生する抗体の重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域を有する、ヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［２］ ヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片であって、配列番号１２の２０番目のＱから１３６番目のＳで示される重鎖アミノ酸配列及び／又は配列番号１４の２３番目のＡから１２８番目のＫで示される軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［３］ 重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２の２０番目のＱから１３６番目のＳで示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４の２３番目のＡから１２８番目のＫで示されるヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［４］ ハイブリドーマＣ１０（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７２）より産生されるヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［５］ ハイブリドーマＣ１０（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７２）が産生する抗体が結合するヒトＦＧＦ２３上のエピトープの全部または一部に結合する抗体またはその機能的断片。
［６］ 上記［３］の重鎖可変領域が、配列番号４０のアミノ酸配列で示される相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）１、配列番号４１のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ２、および配列番号４２のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ３のいずれか又は全てを含むものであるヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［７］ 上記［３］の軽鎖可変領域が、配列番号４３のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ２、および配列番号４５のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ３のいずれか又は全てを含むものであるヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［８］ 重鎖可変領域が、配列番号４０のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ２、および配列番号４２のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ３のいずれか又は全てを含むものであり、軽鎖可変領域が、配列番号４３のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ２、および配列番号４５のアミノ酸配列で示されるＣＤＲ３のいずれか又は全てを含むものであるヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［９］ 機能的断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及びＣＤＲからなる群から選択されるペプチド断片である［１］〜［８］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［１０］ ［１］〜［８］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片であって、その重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖を含むヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片。
［１１］ 抗体のクラスがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭである［１］〜［１０］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体。
［１２］ 抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である［１１］のヒトＦＧＦ２３に対する抗体。
［１３］ ［１］〜［１２］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、医薬組成物。
［１４］ ［１］〜［１２］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、ＦＧＦ２３のリン代謝及び／又はビタミンＤ代謝を調節し得る医薬組成物。
［１５］ ［１］〜［１２］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、ミネラル代謝異常を伴う疾患の予防又は治療用医薬組成物。
［１６］ ミネラル代謝異常を伴う疾患が、腫瘍性骨軟化症、ＡＤＨＲ、ＸＬＨ、ｆｉｂｒｏｕｓｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ及び常染色体劣性低リン血症からなる群から選択される、［１５］の医薬組成物。
［１７］ ［１］〜［１２］のいずれかのヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片を有効成分として含む、骨粗鬆症、クル病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症及び掻痒からなる群から選択される疾患の予防又は治療用医薬組成物。
［１８］ ハイブリドーマＣ１０（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７２）。
［１９］ 配列番号１１に示される塩基配列の５８番目のＣから４０８番目のＡで示される塩基配列にコードされる重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸。
［２０］ 配列番号１３に示される塩基配列の６７番目のＧから３８４番目のＡで示される塩基配列にコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸。
［２１］ ［１９］又は［２０］の核酸を含むベクター。
［２２］ ［２１］のベクターを含む宿主細胞。
［２３］ ［２２］の宿主細胞を培養し、ヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片を発現させる工程を含む、ヒトＦＧＦ２３に対する抗体又はその機能的断片の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−３４０１８号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

図１は、Ｃ１０発現ベクターの構築過程を模式的に表した図である。
図２は、Ｎ５ＫＧ１＿Ｃ１０＿ＬＨにおける抗体遺伝子重鎖の塩基配列（配列番号３０）及びアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。図中、四角で囲ったアミノ酸配列は分泌シグナル配列（リーダー配列）を示す。
図３は、Ｎ５ＫＧ１＿Ｃ１０＿ＬＨにおける抗体遺伝子軽鎖の塩基配列（配列番号３２）及びアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。図中、四角で囲ったアミノ酸配列は分泌シグナル配列（リーダー配列）を示す。
図４は、Ｃ１０発現ベクターの構造を示した図である。
図５Ａは、精製した全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質を２Ｃ３Ｂ抗体若しくはＣ１０抗体を固相抗体とし、３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡで検出した測定結果を表した図である。
図５Ｂは、カニクイザルＦＧＦ２３発現細胞上清を２Ｃ３Ｂ抗体若しくはＣ１０抗体を固相抗体とし、３Ｃ１Ｅ抗体を検出抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡで検出した測定結果を表した図である。
図６は、媒体、２Ｃ３Ｂ抗体又はＣ１０抗体を投与したカニクイザルの血清リン濃度を経時的に測定したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。またＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて同日時の媒体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．０５）が観察された測定値に関しては、グラフ上に＊を付加した。
図７は、媒体投与５日目のカニクイザルの血清リン濃度を基準とした、２Ｃ３Ｂ抗体又はＣ１０抗体の投与後５日目のカニクイザルの血清リン濃度の上昇値を示したグラフである。
図８は、媒体、２Ｃ３Ｂ抗体又はＣ１０抗体を投与したカニクイザルの血清１，２５Ｄ濃度を経時的に測定したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。またＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて同日時の媒体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．０５）が観察された測定値に関しては、グラフ上に＊を付加した。
図９は、強制発現していない細胞の培養上清（コントロール）、ヒト及びカニクイザルＦＧＦ２３発現細胞培養上清をＣ１５抗体を用いてウエスタンブロット法により検出した写真である。
図１０は、ｐＰＳｓ ＦＧＦ２３ベクターの構造を示した図である。
図１１は、ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターの構造を示した図である。
図１２は、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ^ｒ）がターゲティングされたアレル構造、ヒトＦＧＦ２３（−ＳＰ）＋薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ^ｒ）がｐＵＳ ｈＦＧＦ２３ ＫＩベクターを用いてターゲティングされたアレル構造、薬剤耐性遺伝子（ｌｏｘｐ−ｎｅｏ^ｒ，ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ^ｒ）が除去されたアレル構造及びサザン解析用プローブの位置を示す。図中に記載された用語の詳細な説明は以下の通り。
ｈＦＧＦ２３（−ＳＰ）：固有のシグナルペプチドコード領域を持たないヒトＦＧＦ２３遺伝子、Ｃκ：マウスＩｇκ遺伝子定常領域、ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ：ｌｏｘＰ配列の一部ｍｕｔａｎｔ配列であるｌｏｘＰＶ配列をその両端に持つピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘｐ−ｎｅｏ^ｒ：ｌｏｘＰ配列をその両端に持つネオマイシン耐性遺伝子、Ｃｋ３’ ｐｒｏｂｅ：ｈＦＧＦ２３（−ＳＰ）＋ｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ^ｒ遺伝子導入及びｌｏｘｐｖ−ｐｕｒｏ^ｒ遺伝子除去クローン選別用サザンブロット解析プローブ、３’ＫＯ−ｐｒｏｂｅ：ｌｏｘｐ−ｎｅｏ^ｒ遺伝子導入及び除去クローン選別用サザンブロット解析プローブ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。
図１３は、コントロール抗体又はＣ１０抗体投与７日前の血清ＦＧＦ２３濃度を示したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。またＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いてＷＴマウス群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察された群に関しては、グラフ上に＊＊＊を付加した。
図１４は、コントロール抗体又はＣ１０抗体投与７日前及び初回投与３日後の血清リン濃度を示したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。また同一日内でＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いてＷＴマウス群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察された群に関しては、グラフ上に＊＊＊を付加した。さらに、同一日内でｈＦＧＦ２３ＫＩマウスコントロール抗体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察されたｈＦＧＦ２３ＫＩマウスＣ１０抗体投与群に関しては、グラフ上に＃＃＃を付加した。
図１５は、コントロール抗体又はＣ１０抗体の５回目投与１日後の血清リン濃度を示したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。またＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いてＷＴマウス群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察された群に関しては、グラフ上に＊＊＊を付加した。さらに、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスコントロール抗体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察されたｈＦＧＦ２３ＫＩマウスＣ１０抗体投与群に関しては、グラフ上に＃＃＃を付加した。
図１６は、コントロール抗体又はＣ１０抗体の４回目投与１日後の握力を示したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。またＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いてＷＴマウス群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察された群に関しては、グラフ上に＊＊＊を付加した。さらに、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスコントロール抗体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察されたｈＦＧＦ２３ＫＩマウスＣ１０抗体投与群に関しては、グラフ上に＃＃＃を付加した。
図１７は、コントロール抗体又はＣ１０抗体の５回目投与１日後に解剖し採取したマウスの大腿骨をＶｉｌｌａｎｕｅｖａ−Ｇｏｌｄｎｅｒ法で組織染色した像を示した写真である。
図１８は、コントロール抗体又はＣ１０抗体の５回目投与１日後に解剖し採取した脛骨の乾燥重量に対する灰重量の割合を示したグラフである。測定値は平均値＋／−標準誤差で示した。またＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いてＷＴマウス群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察された群に関しては、グラフ上に＊＊＊を付加した。さらに、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスコントロール抗体投与群と有意差検定を行った結果、有意な差（ｐ＜０．００１）が観察されたｈＦＧＦ２３ＫＩマウスＣ１０抗体投与群に関しては、グラフ上に＃＃＃を付加した。

以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
Ｉ．本発明の抗体
１．抗ＦＧＦ２３抗体及びその機能的断片
本発明の抗体は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのひとつであるＦＧＦ２３に対する抗体である。
本発明における「ＦＧＦ２３に対する抗体」とは、ＦＧＦ２３若しくはその一部と結合する抗体、ＦＧＦ２３若しくはその一部と反応性を有する抗体、又はＦＧＦ２３若しくはその一部を認識する抗体である。ＦＧＦ２３に対する抗体を抗ＦＧＦ２３抗体と呼ぶこともある。本発明において、抗体とは、イムノグロブリンを構成する重鎖可変領域及び重鎖定常領域、並びに軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む全ての領域が、イムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。ここで、ＦＧＦ２３の一部とは、配列番号４で表わされるＦＧＦ２３の全長アミノ酸配列の一部アミノ酸配列であって、連続したアミノ酸配列からなるＦＧＦ２３の断片ペプチドをいう。好ましくは配列番号１２の２０番目のＱから１３６番目のＳからなるアミノ酸配列、及び／又は配列番号１４の２３番目のＡから１２８番目のＫからなるアミノ酸配列を含む抗体であり、さらに好ましくは、ハイブリドーマＣ１０が産生する抗体である。配列番号１２はＦＧＦ２３に対する抗体の重鎖可変領域のリーダー配列を含むアミノ酸配列であり、配列番号１２の２０番目のＱから１３６番目のＳからなるアミノ酸配列は、リーダー配列部分を除いた成熟体部分のアミノ酸配列である。また、配列番号１４はＦＧＦ２３に対する抗体の軽鎖可変領域のリーダー配列を含むアミノ酸配列であり、配列番号１４の２３番目のＡから１２８番目のＫからなるアミノ酸配列は、リーダー配列部分を除いた成熟体部分のアミノ酸配列である。抗体のクラスとしてはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、同Ａ（ＩｇＡ）、同Ｅ（ＩｇＥ）及び同Ｍ（ＩｇＭ）が用いられるが、好ましくはＩｇＧである。更にＩｇＧのサブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が用いられるが、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４であり、更に好ましくはＩｇＧ１である。
本願発明の抗体には、新規な相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）アミノ酸配列を含有する抗ＦＧＦ２３抗体又も包含される。
抗体の可変領域内にはＣＤＲが存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖のＣ末端側には定常領域が存在し、それぞれ重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）と呼ばれる。
重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決定領域と呼ぶ。軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。これらのＣＤＲはシーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅ ａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）などを用いて決定することができる。
本願発明の抗体として、好ましくは、重鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４０、ＣＤＲ２が配列番号４１、ＣＤＲ３が配列番号４２の少なくともいずれか一つ若しくは全てを有するものである。また、軽鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４３、ＣＤＲ２が配列番号４４、ＣＤＲ３が配列番号４５の少なくともいずれか一つ若しくは全てを有するものである。より好ましくは、重鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４０、ＣＤＲ２が配列番号４１、ＣＤＲ３が配列番号４２を有し、軽鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４３、ＣＤＲ２が配列番号４４、ＣＤＲ３が配列番号４５を有するＦＧＦ２３に結合する抗体である
本発明の抗体のＣＤＲ配列は必ずしも限定されないが、好ましくは配列番号４０から４５に示されるＣＤＲ配列のうち、いずれか１つ以上、好ましくは重鎖の３つ、より好ましくは６つのＣＤＲを含有する抗体である。ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が他の抗体、特に、他種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体が本発明の抗体に包含される。この内、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列がヒト由来であるヒト化抗体又はヒト抗体が好ましく、必要に応じてＦＲに１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／または挿入を伴っていてもよい。ヒト化抗体又はヒト抗体の作製方法は公知の方法を用いることができる。
「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するもの、すなわち抗原への結合能、抗原への反応性又は抗原の認識能を保持したものを意味し、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる。具体的にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる［Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８ Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ］。
Ｆａｂは、ＦＧＦ２３と結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖（Ｈ鎖）のアミノ末端側約半分と軽鎖（Ｌ鎖）全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ＦＧＦ２３と結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。又は、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものより大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）_２は、本発明のＦＧＦ２３と結合する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。又は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のＦＧＦ２３に結合するＦ（ａｂ’）_２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。又は、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）と１本の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬ又はＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、本発明のＦＧＦ２３と結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のＦＧＦ２３と結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明のＦＧＦ２３と結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＦＧＦ２３と結合する抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
さらに、「機能的断片」は、抗体の断片であって抗原（ＦＧＦ２３）と結合しうる断片である。好ましくは「機能的断片」が配列番号１２の２０番目のＱから１３６番目のＳからなるアミノ酸配列、及び／又は配列番号１４の２３番目のＡから１２８番目のＫからなるアミノ酸配列を含むＦＧＦ２３と結合しうる断片である。好ましくは「機能的断片」が配列番号４０から４５に示されるＣＤＲの少なくとも一つ又は全てを有しＦＧＦ２３と結合しうる断片である。さらに好ましくは「機能的断片」がハイブリドーマＣ１０が産生する抗体の可変領域由来のものであって、ＦＧＦ２３と結合しうる断片である。
本発明の抗体は、本発明のＦＧＦ２３に対する抗体又は抗体の機能的断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のＦＧＦ２３に対する抗体若しくは抗体の機能的断片のＨ鎖（重鎖）あるいはＬ鎖（軽鎖）のアミノ末端側あるいはカルボキシ末端側、抗体若しくは抗体の機能的断片中の適当な置換基又は側鎖、さらには抗体又は抗体の機能的断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）等により結合させることにより製造することができる。
また、蛋白質を結合させた抗体の誘導体は、本発明のＦＧＦ２３に対する抗体及び抗体の機能的断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、^１３１Ｉ、^１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）；ハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミン等の免疫調節剤；サイクロフォスファミド、アザチオプリン等の免疫抑制剤；マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）等があげられる。これらの低分子の薬剤と抗体の結合は公知の方法により行なうことができる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。これらの低分子の薬剤を抗体に結合させることにより、低分子薬剤が有する機能を有する抗体の誘導体が得られる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体又は抗体の機能的断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭５６−２３５８７号公報）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特平２−１１７９２０号公報）などがあげられる。
蛋白質と結合した抗体は、融合抗体として得ることができる。すなわち、抗体又は抗体の機能的断片をコードするｃＤＮＡに特定の蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、特定の蛋白質と抗体との融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、前記特定の蛋白質と結合した融合抗体を製造することができる。
本発明のＦＧＦ２３に対する抗体又は抗体の機能的断片について、ＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）等の免疫学的手法により、あるいはバイオセンサービアコアで測定される結合解離定数（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５：２２９−２４０，１９９１）、及びｋｌｏｔｈｏ発現細胞を用いたヒトＦＧＦ２３刺激によるＥａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ−１のプロモーター活性化に対する阻害活性（Ｎａｔｕｒｅ，４４４：７７０−７７４，２００６）などを測定することにより、ヒトＦＧＦ２３に対する結合活性、ヒトＦＧＦ２３の機能を阻害する活性を評価することができる。
本発明で「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。ヒト抗体は、後述のようにヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号パンフレットに記載されている。
本発明の抗体としては、例えば、後述の実施例に記載される、Ｃ１０ハイブリドーマにより産生される抗体（Ｃ１０抗体）を挙げることができる。Ｃ１０ハイブリドーマは、２００７年２月２日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７２（識別のための表示：Ｃ１０）としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
本発明の抗体又は機能的断片には、抗体又は機能的断片を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖及び／又は軽鎖を含むモノクローナル抗体又はその機能的断片も包含される。ここで、「１又は数個」の「数個」とは９個以下、好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下、特に好ましくは２個である。前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより本発明の抗体又は機能的断片のアミノ酸配列中に導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて定法により導入することができる［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，８１：５６６２−５６６６，１９８４］。本発明の抗体は、いずれのイムノグロブリンクラス及びアイソタイプを有する抗体をも包含する。
本発明のＦＧＦ２３に対する抗体は、下記のような製造方法によって製造することができる。すなわち、例えば、ＦＧＦ２３、その一部又はその一部と抗原の抗原性を高めるための適当なキャリア物質（例えば、牛血清アルブミン等）との結合物を、必要に応じて免疫賦活剤（フロインドの完全又は不完全アジュバント等）とともに、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどの非ヒト哺乳動物に免疫する。ＦＧＦ２３は、天然のＦＧＦ２３もリコンビナントＦＧＦ２３も用いることもできる。あるいは、ＦＧＦ２３をコードする遺伝子を発現ベクターに導入し、動物内でＦＧＦ２３蛋白質を発現させることによって免疫感作を行うこともできる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。
本発明の抗体は、当業者に周知である遺伝子工学的改変（例えば、欧州特許ＥＰ３１４１６１号公報を参照のこと）により異なるサブクラスのものに変換されたものも包含する。すなわち、本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法を用いて元のサブクラスとは異なるサブクラスの抗体を得ることができる。
２．本発明の抗体の製造
モノクローナル抗体の製造は、下記の工程を包含する。すなわち、（１）免疫原として使用する抗原蛋白質若しくは抗原蛋白質発現ベクターの調製、（２）抗原を動物体内に注入し、若しくは抗原を動物体内で発現させることにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓等の摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、（３）骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製、（４）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、（５）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、（６）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、（７）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、そして（８）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性及びその認識特異性の検定、又は標識試薬としての特性の検定、等である。
以下、抗ＦＧＦ２３モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
（１）抗原の精製
抗原としては、遺伝子組換え技術を用いてＦＧＦ２３をコードするＤＮＡ配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌や動物細胞等の宿主内外で生産したのち精製したＦＧＦ２３蛋白質を使用できる。ヒトＦＧＦ２３の蛋白質の一次構造は公知である［ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＧ０９９１７、配列番号４］ので、当業者に周知の方法により、ＦＧＦ２３のアミノ酸配列から部分ペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
（２）抗体産生細胞の調製工程
（１）で得られた抗原と、フロインドの完全若しくは不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、ヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスが最も好適に用いられるが、そのようなマウスは富塚らの文献［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９７：７２２−７２７，２０００］に記載されている。
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射、足蹠注射などいずれでもよいが、腹腔内注射、足蹠注射又は静脈内注射が好ましい。
免疫は、一回、又は、適当な間隔で複数回繰返し行えばよい。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を、後の細胞融合に用いることが好ましい。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下、「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下、「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、及び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法がより好適である。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、ヒト抗体に対する抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆い、該表面を洗浄後、一次抗体として段階希釈した試料（例えばヒト由来の抗体を産生する能力を有するトランスジェニックマウスの血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗ＦＧＦ２３抗体を結合させる。さらに二次抗体として酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えてヒト抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
（３）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のない細胞を用いることができるが、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：１−７，１９７８］、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：５１１−５１９，１９７６］、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ２／Ｏ）［Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）［Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３：１５４８−１５５０，１９７９］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｈｏｒｉｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン及びウシ胎児血清（以下、ウシ胎児血清を「ＦＣＳ」という）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地にさらに８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下、「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下、「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地（例えば、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地）で継代培養し、融合当日に２×１０^７以上の細胞数を確保しておく。
（４）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾臓、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。次いで、脾細胞とミエローマを融合させればよい。この脾細胞と工程（３）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な、ポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）、又はリン酸緩衝生理食塩液（以下、「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液及びヒトインターロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」という）を含む正常培地（以下、「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下、「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
（５）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、及びミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下、「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗ＦＧＦ２３抗体価を測定する。
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
（６）クローニング工程
（２）の抗体価測定方法と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便であり、よく用いられる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗ＦＧＦ２３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（７）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養する。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステム等を用いた培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲルろ過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、抗ＦＧＦ２３モノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えばＢＡＬＢ／ｃ）若しくはｎｕ／ｎｕマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹腔内で該ハイブリドーマを増殖させることにより、抗ＦＧＦ２３モノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、ＦＧＦ２３に対して高い抗原特異性を有する。
又はハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えば哺乳類細胞細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を調製することもできる（Ｄｅｌｖｅｓ，Ｐ．Ｊ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｐ．ａｎｄ Ｄｅａｎ Ｃ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。
本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマが保有する抗体の遺伝子配列を含む核酸、特に後述の本発明のハイブリドーマの産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の核酸も包含する。ここで、核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。さらに、本発明は上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の核酸からシグナル配列をコードする領域を除いた成熟体部分の核酸も包含する。また、本発明の核酸は、上述の核酸以外に、本発明の抗体のアミノ酸配列及び当該抗体の抗体重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸に対応するコドンを有する核酸も包含する。
ハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子を調製するには、モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域、Ｌ鎖Ｃ領域、Ｈ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｃ領域をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ法等により調製する方法が採用される。この際、プライマーとしては、抗ＦＧＦ２３抗体遺伝子又はアミノ酸配列から設計したオリゴＤＮＡを使用することができ、鋳型としてはハイブリドーマから調製したＤＮＡを使用することができる。これらのＤＮＡを１つの適当なベクターに組み込み、これを宿主に導入して発現させるか、あるいはこれらのＤＮＡをそれぞれ適当なベクターに組み込み、共発現させる。
ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌、枯草菌又は酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージが挙げられる。
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。また、後述の動物に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションやリポフェクション法を使用して遺伝子を導入する方法、核移植法などが挙げられる。
本発明において、抗ＦＧＦ２３抗体は、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。ここで、「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物、並びに（ｃ）形質転換体の分泌物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養するには、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボトルによる培養法などが採用される。
培養後、目的抗体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抗体を採取する。また、目的抗体が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、蛋白質の単離精製に用いられる各種クロマトグラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の抗体を単離精製することができる。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて、目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれた動物宿主、例えばトランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニックヒツジ又はトランスジェニックブタを作製し、そのトランスジェニック動物から分泌されるミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８３０−８３４，１９９１）。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
（８）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ］より算出する方法等により行うことができる。
モノクローナル抗体の認識エピトープの同定（エピトープマッピング）は以下のようにして行うことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペプチドをコードするＤＮＡ配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるのが一般的である。例えば、抗原蛋白質のカルボキシ末端又はアミノ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定する。
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、又は該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、本発明の予防又は治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調べるか、又は該モノクローナル抗体と抗原との結合に対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピトープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社）等）を利用することもできる。
（９）抗体断片の作製
抗体断片は、上記（７）に記載の抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。以下にそれぞれの抗体断片の作製方法を詳述する。
（ｉ）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（７）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２の作製
Ｆ（ａｂ’）_２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）_２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記（ｉｉｉ）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（ｉｉｉ）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記（ｉｉ）に記載のＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（７）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０：１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（ｉｖ）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージ又は大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（７）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（ｖ）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（７）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（ｖｉ）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記（ｉｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）に記載の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨ及びＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨ及びＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層に生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨ及びＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４，１９９４）。
（ｖｉｉ）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層に生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４，１９９４）。
３．本発明の抗体又は機能的断片の性質
本発明の抗体又は機能的断片は下記のいずれかの特性を有する。
（ａ）ＦＧＦ２３結合試験；ＦＧＦ２３蛋白質の配列番号４の２５番目から２５１番目のアミノ酸残基を有する全長物に結合する。
（ｂ）インビトロ試験；ＦＧＦ２３の作用を検出できるようなアッセイにおいてＦＧＦ２３の作用を抑制する。ＦＧＦ２３の作用をインビトロで検出する方法の一例としては、ｋｌｏｔｈｏ発現細胞を用いたヒトＦＧＦ２３刺激によるＥａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ−１のプロモーター活性化（Ｎａｔｕｒｅ，４４４：７７０−７７４，２００６）があげられる。
（ｃ）インビボ試験；ヒトに投与したときに内在性のＦＧＦ２３の作用を阻害し、血清リン濃度及び血清１，２５Ｄ濃度を上昇させる。血清リン濃度及び血清１，２５Ｄ濃度の上昇程度は既存の抗体である２Ｃ３Ｂ抗体（国際公開第ＷＯ０３／０５７７３３号パンフレットで開示したＦＧＦ２３蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３８のハイブリドーマが産生する抗ＦＧＦ２３抗体）に比較して大きく、また血清リン濃度及び血清１，２５Ｄ濃度の上昇期間も長い。例えば、カニクイザルに投与した場合、上昇した血清リン濃度の持続期間は、２Ｃ３Ｂ抗体の約３倍以上、好ましくは約５倍であり、上昇した血清１，２５Ｄ濃度の持続期間は、２Ｃ３Ｂ抗体の約１．５倍以上、好ましくは約２．５倍である。
本発明は、さらに本発明のＦＧＦ２３に対する抗体のアミノ酸配列をコードする核酸をも包含する。核酸はＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい。本発明の核酸は、好ましくはハイブリドーマＣ１０が産生する抗体のアミノ酸配列をコードする核酸である。例えば、配列番号１１に示される塩基配列の５８番目のＣから４０８番目のＡで示される塩基配列にコードされる重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸が挙げられる。さらに、配列番号１３に示される塩基配列の６７番目のＧから３８４番目のＡで示される塩基配列にコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸が挙げられる。
ＩＩ．医薬組成物
本発明のヒト抗ＦＧＦ２３抗体又はその機能的断片を含有する医薬組成物である製剤もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体又は機能的断片に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与経路は経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与である。投与形態としては、種々の形態で投与することができ、それらの形態としては噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
注射剤は、水、ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。これらの剤形は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。注射手法としては、例えば点滴静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射等が挙げられる。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は本発明の抗体又は抗体の機能的断片そのものを用いて調製することもでき、あるいは受容者（患者）の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ前記抗体又は抗体の機能的断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせるための担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。前記抗体又は抗体の機能的断片の性質や用いる担体の性質に応じて、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
本発明は、本発明の抗体若しくはその機能的断片又はそれらを含む医薬組成物を用いた下記の疾患の予防又は治療法をも包含し、さらに本発明は本発明の抗体又はその機能的断片の下記の疾患の予防又は治療剤の製造への使用をも包含する。
本発明の抗体又はその機能的断片により予防・治療が可能な疾患はＦＧＦ２３の過剰作用が示されている腫瘍性骨軟化症、ＡＤＨＲ、ＸＬＨ、ｆｉｂｒｏｕｓ ｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＭｃＣｕｎｅ−Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ及び常染色体劣性低リン血症などのミネラル代謝異常を伴う疾患があげられる。さらに、これらの疾患に対して認められる低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低１，２５Ｄ血症などについて改善効果が期待される。またＦＧＦ２３が生理的条件下で重要な役割を果たしていることから、ＦＧＦ２３のリン代謝調節、ビタミンＤ代謝調節を介したカルシウム代謝調節作用を本発明の抗体又はその機能的断片が制御することによって骨粗鬆症、クル病（低リン血症性クル病、ビタミンＤ抵抗性クル病を含む）、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症及び掻痒等の、ミネラル代謝やビタミンＤ代謝の異常に起因する疾患に対して治療的及び予防的に用いることができる。さらに、腎不全において血中のＦＧＦ２３濃度の上昇が報告されていることから、腎性骨異栄養症、透析骨症、尿細管機能障害等に代表される腎不全や腎不全時人工透析に合併する疾患に対しても治療的及び予防的に用いることができる。一方で１，２５Ｄは上述したカルシウムなどのミネラル代謝のみならず、細胞増殖抑制能、細胞分化促進能なども報告されていることから、本発明の抗体又はその機能的断片により１，２５Ｄによって増殖や分化などの制御を受ける細胞に起因する疾患に対して治療的及び予防的に用いることができる。
また、腫瘍性骨軟化症においては腫瘍がＦＧＦ２３を過剰産生して病態を惹起させていることが知られているが、本抗体に放射性同位元素等の放射性物質若しくは低分子の薬剤等の各種毒素など治療試薬を結合させたものを用いることにより、本抗体がＦＧＦ２３過剰産生腫瘍に集積し、腫瘍の退縮を誘導することも考えられる。
ＩＩＩ．製剤例
本発明の抗体又はその機能的断片を含む製剤は、水又は水以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液又は懸濁液のアンプルとして使用に供される。また、無菌粉末製剤（本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈して用いてもよい。

以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される態様のみに限定されるものではない。
実施例１ 組換え体ヒトＦＧＦ２３発現ベクターの作製
（１） ヒトＦＧＦ２３Ｈ蛋白質発現ベクターの構築
ヒトＦＧＦ２３をコードするｃＤＮＡは、腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍のヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｆ１ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号１）とＬＨｉｓＮｏｔプライマー（配列番号２）とＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて９６℃で１分間保温した後、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲを実施することにより増幅した。Ｆ１ＥｃｏＲＩプライマーはヒトＦＧＦ２３をコードする塩基配列のさらに５‘側上流に存在する配列にアニールし、その増幅断片のヒトＦＧＦ２３をコードする領域の５’側にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を付加する。ＬＨｉｓＮｏｔプライマーはヒトＦＧＦ２３をコードする配列の終始コドンの５‘側の配列とアニールする配列とＨｉｓ６−ｔａｇ配列（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）をコードする配列に続く終始コドンとＮｏｔＩ制限酵素配列を含む。その結果、増幅断片はヒトＦＧＦ２３蛋白質のカルボキシ末端にＨｉｓ６−ｔａｇ配列を付加したものをコードすることになり、その下流にＮｏｔＩ制限酵素部位を有する。この増幅断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、同様にＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のＨｉｓ６−ｔａｇ配列が付加されたヒトＦＧＦ２３蛋白質をコードしていることを確認した。このベクターをｐｃＤＮＡ／ｈＦＧＦ２３Ｈと称す。
（２） ヒトＦＧＦ２３蛋白質発現ベクターの構築
ｐｃＤＮＡ／ｈＦＧＦ２３Ｈを鋳型としてＦ１ＥｃｏＲＩプライマーとＬＮｏｔプライマー（配列番号３）とＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて９４℃で１分間保温した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分からなる工程を１サイクルとした２５サイクルのＰＣＲを実施することにより増幅した。反応終了後、ヒトＦＧＦ２３をコードする断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化したのち精製した。これを、動物細胞発現ベクターであるｐＥＡＫ８（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）に分子内リボゾームエントリー配列（ＩＲＥＳ）と増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）を連結したｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、ヒトＦＧＦ２３蛋白質をコードしていることを確認した。このベクターをｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ｈＦＧＦ２３と称す。
（実施例２）組換え体ヒトＦＧＦ２３蛋白質及び組換え体変異ヒトＦＧＦ２３Ｈ蛋白質の発現
（１）ｐｃＤＮＡ／ｈＦＧＦ２３Ｈをベクター中のアンピシリン耐性遺伝子内にあるＦｓｐＩ制限酵素部位で切断して直鎖化し、精製した。ＣＨＯ Ｒａｓ ｃｌｏｎｅ−１細胞（Ｓｈｉｒａｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５９：３４５−３４７，１９９５）と混和してＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を用いて電気穿孔法にて細胞への遺伝子導入を行った。この細胞を１０％ＦＣＳを含むＭＥＭα培養液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）で２４時間培養したのち、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して１週間培養した。接着し増殖した細胞をトリプシンで遊離して、終濃度０．３ｍｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ存在下で限界希釈法によるクローニングを行い、クローン化細胞を複数得た。これらの細胞の中でヒトＦＧＦ２３Ｈ蛋白質を最もよく発現する細胞をウエスタンブロッティングにて同定した。各クローン化細胞の培養上清を採取して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行ったのち、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に蛋白質を転写し、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ（カルボキシ末）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＥＣＬ発光システム（ＧＥヘルスケア バイオサイセンス社）を用いて約３２ｋＤａ付近のＦＧＦ−２３Ｈ蛋白質に由来するシグナルを検出した。その結果、＃２０と称すクローンにおいて最も高い発現が認められ、これをＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈと命名して２０００年８月１１日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７２７３）。本明細書では、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＨをＣＨＯ−ｈＦＧＦ２３Ｈと称する。
（２）ヒトＦＧＦ２３発現細胞の取得
ｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ｈＦＧＦ２３ベクターのＣＨＯ Ｒａｓ ｃｌｏｎｅ−１細胞への導入は膜融合脂質を用いた遺伝子導入法により行った。ＣＨＯ Ｒａｓ ｃｌｏｎｅ−１細胞を６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに底面の約６０％を細胞が覆う程度に培養する。そして培養液を除去し、血清を含まないＭＥＭα培養液を１ｍｌ添加する。導入するベクター２．５μｇと１０μｌのＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれ５０μｌの血清を含まないＭＥＭα培養液と混和して、両者を混合して１０分間静置したのち、両者を混合して予め準備しておいた６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに添加した。２時間培養した後、このＤＮＡを含む培養液を除去して１０％のＦＣＳを含む培養液に置換して終夜培養した。翌日、終濃度が５μｇ／ｍｌとなるようにＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ社）を添加して、薬剤耐性細胞を選択した。このようにして得られた薬剤耐性細胞は限界希釈法にてクローン化を行った。さらにウエスタンブロットにより目的の蛋白質を最もよく発現する細胞株を取得した。この細胞をＣＨＯ−ｈＦＧＦ２３と称す。
（３） 組換え体ヒトＦＧＦ２３蛋白質の動物細胞での発現と検出
ＣＨＯ−ｈＦＧＦ２３Ｈの培養上清中の組換え体をカルボキシ末端のＨｉｓ６−ｔａｇ配列に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにて検出すると、約３２ｋＤａのバンドと約１０ｋＤａのバンドが認められた。この二つのバンドをゲルから切り出し、アミノ末端側のアミノ酸配列を決定したところ、分子量の大きい約３２ｋＤａのバンドは配列番号４の２５番目からのアミノ酸配列が検出され、ヒトＦＧＦ２３蛋白質から分泌過程でシグナル配列が除去されたものと考えられた。一方、分子量の小さいバンドからは配列番号４の１８０番目からのアミノ酸配列が確認され、１７９番目と１８０番目の間での切断により生じたカルボキシ末端側断片であることが判明した。また、ヒトＦＧＦ２３のアミノ末端側を認識するポリクローナル抗体を用いて検出することで、１７９番目よりアミノ末端側の配列を持つと考えられるポリペプチド（アミノ末端側断片）の存在も認められた（国際公開第ＷＯ０２／１４５０４号パンフレット）。
同様にＨｉｓ６−ｔａｇ配列の付加されていないＣＨＯ−ｈＦＧＦ２３の培養上清においても、１７９番目と１８０番目のアミノ酸残基の間で切断されることを確かめた（国際公開第ＷＯ０２／１４５０４号パンフレット）。そこで、切断を受けない活性体と思われる配列番号４の２５番目から２５１番目の全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質（ＦＧＦ２３全長体と呼ぶことがある）を、アミノ末端又はカルボキシ末端側断片と分離して精製する目的で以下の操作を行った。
（４）組換え体全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質の精製
ＣＨＯ−ｈＦＧＦ２３の培養上清をポアサイズが０．２μｍのメンブレンであるＳｕｐｅｒＣａｐ（登録商標）（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）でろ過し、ろ過された溶液をＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア バイオサイセンス社）に通した。カラムとの親和性が弱い物質を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．７で洗浄、溶出させた。この画分に１７９番目と１８０番目の間で切断されて生じたカルボキシ末端側の断片が含まれていた。カラム保持された蛋白を０から０．７ＭまでのＮａＣｌ濃度勾配で溶出させたところ、約０．３ＭのＮａＣｌで溶出される画分に全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質が認められた。次に金属アフィニティカラムであるＴａｌｏｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に吸着させたのち、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ６．７で洗浄したのち、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅの濃度を変化させて添加し全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質を溶出精製した。さらに、目的の蛋白質を含む画分をＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに吸着、溶出させて精製した。
（実施例３）ヒト抗体産生マウス（ＫＭマウス）の作製
ヒトモノクローナル抗体作製のための完全ヒト抗体を産生するマウスは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製された。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，９７：７２２−７２７，２０００］に記載されている。また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告［Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：８４５−８５１，１９９６］に記載されている。
系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体［Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ‘ｓ １１ｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０００］を、以下の免疫実験に用いた。なお、上記ヒト抗体産生マウスは、契約を結ぶことによって、キリンファーマ株式会社より入手可能である。
（実施例４） ヒトＦＧＦ２３に対するヒトモノクローナル抗体の作製
（１）ヒトＦＧＦ２３に対するヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行 １９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としては、実施例２で調製した全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質を用いた。被免疫動物は、実施例３で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
まずＦＧＦ２３に対するヒトモノクローナル抗体の調製を目的として、ヒト抗体産生マウスに、実施例２で作製した精製全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質を腹腔内にＲＩＢＩアジュバント（コリクサ社）と混合して、マウスあたり２０μｇを初回免疫した。初回免疫と同様に精製ＦＧＦ２３とＲＩＢＩアジュバントを２週間間隔で免疫し、計３回免疫した。５個体のマウスに免疫し、３回目の免疫後に採血し、血清中のＦＧＦ２３に対するヒトＩｇＧ抗体の存在を、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法によって確認した。国際公開第ＷＯ０３／０５７７３３号パンフレットで開示したＦＧＦ２３蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体３Ｃ１Ｅ抗体（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８３９のハイブリドーマが産生する抗ＦＧＦ２３抗体）を用いて固相化したＦＧＦ２３を用いたＥＬＩＳＡにおいて最も高い値を示した血清のマウスを選んで、以下に述べる脾臓の取得３日前に、全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、３５０ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（以下「無血清ＤＭＥＭ培地」という）１０ｍＬ中に入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社）上でスパーテルを用いてつぶした。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して細胞を沈澱させた後、この細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄してから、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。一方、１０％ＦＣＳ（シグマ社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（以下、「血清入りＤＭＥＭ培地」という）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０^６細胞／ｍＬを越えないように培養したミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）を同様に無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。回収した脾臓細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心後、上清を完全に除去した。このペレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社）１ｍＬを、ピペットの先でペレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬを２回に分けてゆっくり添加し、さらに７ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地を添加した。遠心後、上清を除去して得られた融合細胞を、以下に記載する限界希釈法によるスクリーニングに供した。ハイブリドーマの選択は、１０％ＦＣＳ、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）（又は１０％ハイブリドーマクローニングファクター（以下「ＨＣＦ」という。：バイオベース社））及びヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）（以下、「ＨＡＴ」という。：シグマ社）を含有するＤＭＥＭ培地中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ（シグマ社）、１０％ＦＣＳ、１０％ＨＣＦを含有するＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６穴マイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社）中で行った。抗ＦＧＦ２３ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により行った。その結果、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつヒトＦＧＦ２３に特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する多数のハイブリドーマを得た。得られた多数のハイブリドーマから、ＦＧＦ２３蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマとして特に２つのクローン（Ｃ１０及びＣ１５）を得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中においては、各々の本発明の抗ＦＧＦ２３ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。また、当該記号の前後に「抗体」を付したものは、ハイブリドーマにより産生される抗体、又は当該ハイブリドーマから単離された抗体遺伝子（全長あるいは可変領域）を保持する宿主細胞により生産された組換え抗体を意味する。また文脈上明らかな範囲において、ハイブリドーマクローンの名称が抗体の名称をあらわす場合がある。ハイブリドーマクローンＣ１０は、２００７年２月２日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７２（識別のための表示：Ｃ１０）として寄託されている。
（２）ハイブリドーマ上清からのＣ１０及びＣ１５抗体の精製
実施例４（１）で得られたＣ１０及びＣ１５ハイブリドーマはウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社）、亜セレン酸ナトリウム（２．５×１０^−５ｍＭ、シグマ社）、１％Ｌｏｗ ＩｇＧ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ハイクローン社）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社）に馴化した。フラスコにて培養し、培養上清を回収した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｇｅｌ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５脱塩カラム（ＮＡＰカラム；ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用いてＰＢＳに置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過滅菌し、精製Ｃ１０及びＣ１５抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４０Ｄとして算出した。
（実施例５） Ｃ１０抗体をコードする抗体遺伝子の取得と配列の決定
（１）Ｃ１０抗体のｃＤＮＡ合成
Ｃ１０ハイブリドーマで発現するヒト抗体重鎖、及び軽鎖の抗体の可変領域を含むＤＮＡ断片を取得するために、ヒト抗体重鎖、及び軽鎖の各々の定常領域に特異的なプライマーを用いた５’ＲＡＣＥ（５’ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法によるクローニングを行なった。具体的には、ＢＤ ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社）を用い、添付の説明書にしたがって実施した。
ｃＤＮＡ合成の材料としては、Ｃ１０ハイブリドーマにＲＮＡ抽出用試薬であるＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を添加し、取扱説明書にしたがってＴｏｔａｌ ＲＮＡ １５μｇを精製した。精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡより各約１μｇを鋳型として用いて、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。ＲＮＡ以外の試薬、及び、酵素類はＢＤ ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ付属のものを使用した。
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成は、
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇ／３μｌ
５’ＣＤＳ １μｌ
ＳＭＡＲＴ Ｏｌｉｇｏ １μｌ
上記組成の反応液を７０℃で２分間インキュベートした後、
５×Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
ＤＴＴ １μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ １μｌ
ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μｌ
を加え４２℃で１．５時間インキュベートした。
さらに、５０μｌのＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒを加えた後、７２℃で７分間インキュベートし、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを取得した。
（２）ＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅と塩基配列の確認
（２）−１；ＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅
Ｃ１０抗体をコードする遺伝子のｃＤＮＡを増幅するために、ヒト抗体特異的配列を有する３’プライマー（具体的な配列は後述）とＢＤ ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで合成されたｃＤＮＡの５’末端に付加された配列に特異的にハイブリダイズする５’プライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ Ａ ｍｉｘ）をＰＣＲ用のプライマーセットとして、またＰＣＲ用酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社）を用いて、下記の反応液を調製してＰＣＲに供した。
ｓｔｅｒｉｌｅ Ｈ_２Ｏ ２８μｌ
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ２．５μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ） ５μｌ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（２ｍＭ） ５μｌ
ＭｇＳＯ_４（２５ｍＭ） ２μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１ｕｎｉｔ／μｌ） １μｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ Ａ ｍｉｘ（ＵＰＭ）（１０Ｘ） ５μｌ
Ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＳＰ）（１０μＭ） １．５μｌ
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ５０μｌ
重鎖遺伝子の増幅反応には、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ付属のＵＰＭプライマーとＩｇＧ１ｐプライマー（配列番号５）を用い、他方、軽鎖遺伝子の増幅にはＵＰＭプライマーとｈｋ−２（配列番号６）プライマーの各セットを使用した。
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃／３０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／３０秒間、７０℃／３０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／３０秒間、６８℃／３０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復した。
さらに、この反応液２μｌにＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ９８μｌを加えて希釈したもの５μｌを鋳型とし、第二（ネスト）ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応溶液の組成を次に示す。
ｓｔｅｒｉｌｅ Ｈ_２Ｏ ３０μｌ
第一ＰＣＲ反応液（５０倍希釈） ５μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ） ５μｌ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（２ｍＭ） ５μｌ
ＭｇＳＯ_４（２５ｍＭ） ２μｌ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１ｕｎｉｔ／μｌ） １μｌ
Ｎｅｓｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ Ａ（ＮＵＰ；１０μＭ） １μｌ
Ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＧＳＰ）（１０μＭ） １μｌ
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ５０μｌ
上記反応のプライマーセットとして、重鎖遺伝子増幅用の場合は、ＮＵＰプライマー（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 付属；ベクトン・ディキンソン・バイオサイエンス・クローンテック社）とｈｈ２プライマー（配列番号７）を使用して、また、軽鎖遺伝子の増幅の場合は、ＮＵＰプライマーとｈｋ−５プライマー（配列番号８）を用いた。反応温度条件としては、９４℃の初期温度で１分間の後、９４℃／５秒間、６８℃／１０秒及び７２℃／３分間のサイクルを２０回反復、最後に７２℃／７分間の加熱を行なった。
（２）−２；抗体遺伝子の塩基配列決定
増幅した重鎖ＰＣＲ断片（以下ＨＶ［Ｃ］と記載：Ｈ鎖の５’非翻訳領域−リーダー配列、可変領域（ＨＶ）及び定常領域の一部（［Ｃ］）より構成される）、及び、軽鎖のＰＣＲ増幅断片（以下ＬＶ［Ｃ］と記載：Ｌ鎖の５’非翻訳領域−リーダー配列、可変領域（ＬＶ）及び定常領域の一部（［Ｃ］）より構成される）は、エタノール沈殿で回収した後、アガロースゲル電気泳動で回収し、メンブランを用いるＤＮＡ精製キットであるＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。精製したＨＶ［Ｃ］増幅断片あるいはＬＶ［Ｃ］増幅断片は、それぞれＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）のＰＣＲ ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドＤＮＡについてインサートＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列決定のためにプライマーとして、Ｍ１３−２０ＦＷ（配列番号９）及びＭ１３ＲＶ（配列番号１０）を用いた。
Ｃ１０抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ塩基配列、並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
また、ＰＣＲ ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングしたＣ１０抗体の遺伝子配列には、ヒト抗体配列の定常領域も一部クローニングされてくることから、その領域についてもＤＮＡ塩基配列を解析した。その結果、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される重鎖定常領域の１１８番目から１９１番目のアミノ酸残基をコードする配列が確認でき、その領域においてヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と完全に一致し、Ｃ１０抗体のサブクラスはＩｇＧ１であることが判明した。さらに同様な方法を用いて、Ｃ１５抗体をコードする抗体遺伝子の取得と配列の決定も行った。
（実施例６） 組換えＣ１０抗体発現ベクターの構築
Ｃ１０抗体発現ベクターの作製（図１に工程図を示す）
取得したＣ１０抗体のＬＶ［Ｃ］鎖を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位（５’末側ＢｇｌＩＩ、３’末側ＢｓｉＷＩ）を付加するようにデザインしたプライマー、Ｃ１０＿Ｌ５＿Ｂｇｌ（配列番号１５）及びＣ１０＿Ｌ３＿Ｂｓｉ（配列番号１６）を用いて、Ｃ１０抗体のＬＶ（軽鎖のリーダー配列＋可変領域）のＤＮＡをＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲで増幅した。反応温度条件としては、９４℃の初期温度で１分間の加熱後、９４℃／５秒間と６８℃／４５秒間のサイクルを３５回反復し、最後に７２℃／７分間の加熱を行なった。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩとＢｓｉＷＩで消化して、アガロースゲル電気泳動で約４００ｂｐのＤＮＡを回収し精製した。他方、ベクターであるＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋベクター（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６００１３５８）の改変ベクター）については同様に制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩ処理を順次行った後、脱リン酸化処理としてＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５）（宝酒造社）にて処理した後に、アガロースゲル電気泳動とＤＮＡ精製キットで約９ｋｂ弱のＤＮＡを回収した。これら２つの断片をＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションして、大腸菌ＤＨ１０Ｂへ導入して形質転換体を得た。インサートＤＮＡを含む形質転換体のプラスミドＤＮＡについてＤＮＡ塩基配列を解析して、Ｎ５ＫＧ１−Ｖａｌ ＬａｒｋにＣ１０抗体のＬＶがＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｌａｒｋのヒト抗体軽鎖定常領域をコードする５’上流にｉｎ−ｆｒａｍｅに挿入されたプラスミドＤＮＡ、Ｎ５ＫＧ１＿Ｃ１０＿Ｌｖを取得した。引き続いて、ＬＶが挿入されたプラスミドベクター（Ｎ５ＫＧ１＿Ｃ１０＿Ｌｖ）にＣ１０抗体のＨＶ（重鎖のリーダー配列＋可変領域）の挿入を行なった。ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングしたＣ１０抗体のＨＶ［Ｃ］を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、末端に連結のための制限酵素部位（５’末側ＳａｌＩ、３’末側ＮｈｅＩ）を付加するようにデザインしたプライマー、Ｃ１０＿Ｈ５＿Ｓａｌ（配列番号１７）及びＣ１０＿Ｈ３＿Ｎｈｅ（配列番号１８）を用いて、ＨＶをＰＣＲで増幅した。反応温度条件としては、９４℃の初期温度で１分間の加熱後、９４℃／５秒間と６８℃／４５秒間のサイクルを３５回反復し、最後に７２℃／７分間の加熱を行なった。精製したＨＶの増幅ＤＮＡ断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングを行い、得られたクローンのプラスミドＤＮＡについてインサートＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列決定のためにプライマーとして、上記のＭ１３−２０ＦＷ及びＭ１３ＲＶを用いた。サブクローンについて挿入部分のＤＮＡ塩基配列解析を行い、鋳型としたＨＶと相違がなく、また、プライマー部分もデザインどおりの配列を有するプラスミドＤＮＡ（ＴＯＰＯ＿Ｃ１０＿Ｈｖ）を選択した。そのＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩとＮｈｅＩで消化して、アガロースゲル電気泳動で約４２０ｂｐのＤＮＡを回収し精製し、同様に制限酵素処理（ＳａｌＩとＮｈｅＩ）と脱リン酸化処理したＮ５ＫＧ１＿Ｃ１０＿ＬｖのＤＮＡ（約９ｋｂ）にＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションした後、大腸菌ＤＨ１０Ｂへ導入して得られた形質転換体より、目的のプラスミドＤＮＡを選択した。こうして得られた抗体発現プラスミドＤＮＡ、Ｎ５ＫＧ１＿Ｃ１０＿ＬＨ（クローン＃１）の大量精製を行い、Ｌ鎖全領域とＨ鎖全領域、及び、その挿入部位周辺のＤＮＡ塩基配列にクローニング工程での変異がないことを確認（図２、及び図３）した。ＤＮＡ塩基配列の確認には、さらに配列番号１９〜２５の各プライマーを使用した。完成したＣ１０抗体発現ベクターの簡単なマップを図４に示した。さらに同様な方法を用いて、組換えＣ１５抗体発現ベクターの構築を行った。
（実施例７） 組換えＣ１０抗体の調製
構築したＣ１０抗体発現ベクターを宿主細胞に導入して、Ｃ１０抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＤＨＦＲ）欠損のＣＨＯ ＤＧ４４細胞（以下ＣＨＯ細胞と表記、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）を無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ ３２５−ＰＦ培地（２ｍＭ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（ＨＴ）サプリメント（１：１００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有。ＪＲＨ社）に馴化した細胞株を用いた。宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションにより実施した。エレクトロポレーションはＣ１０抗体発現ベクター約２μｇを制限酵素ＡｓｃＩで線状化し、ＢｉｏＲａｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒをもちいて３５０Ｖ、５００μＦの条件で、４×１０^６個のＣＨＯ細胞に遺伝子を導入し、９６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに播種した。ベクターの導入処理後、Ｇ４１８を添加して培養を継続した。コロニーを確認した後、抗体発現株を選別した。選択したＣＨＯ細胞株をＥＸ−ＣＥＬＬ３２５−ＰＦ培地（２ｍＭ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（ＨＴ）サプリメント（１：１００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有）で５％ＣＯ_２条件下で培養した。培養上清をＭａｂｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に吸着後、ＰＢＳで洗浄して、２０ｍＭクエン酸−Ｎａ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ３．４）バッファーで溶出した。溶出液は５０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｎａ，ｐＨ７．０にて中和した。イオン交換水にて、約１．５倍に希釈してＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙを４．０ｍｓ／ｃｍ以下に調製した。次に、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）と、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を連結したカラムに、サンプルをチャージして吸着し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）にて洗浄後、ＰＢＳ（−）にて溶出した。調製された抗体溶液は、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過滅菌した。精製したＣ１０抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。また、同様な方法で、組換えＣ１５抗体の調製を行った。
（実施例８）カニクイザルＦＧＦ２３蛋白質発現ベクターの構築
カニクイザルＦＧＦ２３蛋白質発現ベクターの構築
カニクイザルのＥＤＴＡ添加静脈血にＰＢＳ（−）で懸濁した５％ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−２０００（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を２対１の割合で混和し、赤血球を沈殿させた後に上清をリンパ球分離液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）に重層し、遠心することによりリンパ球画分を得た。得られたリンパ球をＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン社）に懸濁し、添付のプロトコルに従いカニクイザルリンパ球総ＲＮＡを得た。このカニクイザルリンパ球総ＲＮＡよりＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のプロトコルに従いカニクイザルリンパ球ｃＤＮＡライブラリーを作製した。カニクイザルＦＧＦ２３をコードするｃＤＮＡは、カニクイザルリンパ球ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３ＦＷプライマー（配列番号２６）とｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３ＲＶプライマー（配列番号２７）とＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用いて９４℃で５分間保温した後、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で５０秒からなる工程を１サイクルとした４５サイクルのＰＣＲを実施することにより増幅した。ｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３ＦＷプライマーはヒトＦＧＦ２３をコードする塩基配列の５’側上流に存在する配列にアニールし、その増幅断片のＦＧＦ２３をコードする領域の５’側にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を付加する。ｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３ＲＶプライマーはヒトＦＧＦ２３をコードする配列の終始コドンを含む配列にアニールする配列とＮｏｔＩ制限酵素配列を含む。この増幅断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し，発現ベクターであるｐＥＡＫ８（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）に分子内リボゾームエントリー配列（ＩＲＥＳ）と増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）を連結したｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、カニクイザルＦＧＦ２３蛋白質をコードしていることを確認した。このベクターをｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３と称す。また、本実施例によって得られたカニクイザルＦＧＦ２３の核酸配列及びアミノ酸配列を配列番号２８及び２９にそれぞれ記載する。
（２） カニクイザルＦＧＦ２３発現細胞上清の作製
ｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３をＰＥＡＫ ｒａｐｉｄ細胞（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にリン酸カルシウム法により一過性に導入し、その発現培養上清を得た。
（実施例９）カニクイザルＦＧＦ２３へのＣ１０抗体の結合性の検証
Ｃ１０抗体がヒトＦＧＦ２３のみならずカニクイザルＦＧＦ２３に同様に結合することをサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた以下の方法で調べた。実施例４で作製したＣ１０抗体、２Ｃ３Ｂ抗体及びヒトＩｇＧ１コントロール抗体を５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３の溶液に５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに加え、４℃で１２時間インキュベートし、Ｃ１０抗体、２Ｃ３Ｂ抗体及び対照としてヒトＩｇＧ１コントロール抗体をマイクロプレートに吸着させた。次にこの溶液を除去し、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、ＰＩＥＲＣＥ社）を加え室温で３０分間インキュベートしたのち、各ウェルを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。このように抗ＦＧＦ２３抗体をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、実施例２で精製した全長ヒトＦＧＦ２３蛋白質又は実施例８で作製したカニクイザルＦＧＦ２３発現細胞上清を適当な濃度に希釈して各ウェルに加え、固相化抗体と２時間反応させた後、各ウェルを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（Ｔ−ＴＢＳ）で２回洗浄した。次いで、各ウェルにビオチン標識した３μｇ／ｍＬの３Ｃ１Ｅ抗体を室温下で１．５時間インキュベートし、固相化抗体に結合したヒト又はカニクイザルＦＧＦ２３にビオチン標識した３Ｃ１Ｅ抗体を結合させた。Ｔ−ＴＢＳで洗浄後、さらに、５０００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社）を１時間反応させた後、Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄した。次にテトラメチルベンジジン（ＤＡＫＯ社）を含む基質緩衝液を各ウェルに加え、室温下で３０分間インキュベートした。次いで、０．５Ｍ硫酸を各ウェルに加え、反応を止めた。参照波長を５７０ｎｍとして波長４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００、コロナ電気社）で測定した。ヒト全長ＦＧＦ２３蛋白質及びカニクイザルＦＧＦ２３発現培養上清を同様に公比３倍で希釈したときの反応性を比較した。このときの結果を図５Ａ及びＢに示す。図５Ａの結果から明らかなようにＣ１０抗体又は２Ｃ３Ｂ抗体を固相化したとき、ヒト全長ＦＧＦ２３蛋白質への反応性は同程度である。この条件で、カニクイザルＦＧＦ２３発現培養上清の希釈系列に対する反応性に関して、Ｃ１０抗体と２Ｃ３Ｂ抗体に大きな違いは観察されない（図５Ｂ）。すなわち、Ｃ１０抗体は２Ｃ３Ｂ抗体と同様にヒト及びカニクイザルＦＧＦ２３と結合性を有することが証明された。
（実施例１０）Ｃ１０抗体と２Ｃ３Ｂ抗体の正常カニクイザルの血中リン濃度及び血中１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ濃度に対する作用の比較
ＦＧＦ２３はマウスにおいて腎臓からリンを排泄し、血清リン濃度を減少させ、また腎臓におけるビタミンＤ活性化酵素を阻害し血中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度（以下１，２５Ｄという）を減少させる作用をもつ（国際公開第ＷＯ０２／１４５０４号パンフレット）。２Ｃ３Ｂ抗体などＦＧＦ２３に対して抑制作用すなわち中和活性を有するような抗体を正常マウスに投与すると、内在性のＦＧＦ２３の作用が抑制され、血清リン濃度及び血清１，２５Ｄ濃度が上昇することが示されている（国際公開第ＷＯ０３／０５７７３３号パンフレット）。よってＦＧＦ２３に対する中和活性を有する抗体はＦＧＦ２３過剰に由来する腫瘍性骨軟化症、ＸＬＨなどを含むヒトの疾患において治療効果を有することが強く示唆される。そこで、本研究において取得されたヒト抗体であるＣ１０抗体の生体内でのＦＧＦ２３中和活性を検討した。特に、ヒトでの薬理効果を期待することからげっ歯類などに比較して、進化上ヒトに近い動物種であるサルの内在性ＦＧＦ２３の機能を抑制し、その血清リン濃度及び血清１，２５Ｄ濃度の上昇を指標として、中和活性能を測定した。Ｃ１０抗体の比較対照として、マウス抗体である２Ｃ３Ｂ抗体を用いて実験を行った。
Ｃ１０抗体と２Ｃ３Ｂ抗体の血清リン濃度上昇作用を、無処置の正常カニクイザルを用いて以下の方法で比較した。Ｃ１０抗体は実施例４で作製したものを用いた。実験動物には、雌性カニクイザル、２〜３歳、体重２〜４ｋｇを媒体投与群、２Ｃ３Ｂ抗体投与群は群３頭ずつ、Ｃ１０抗体を投与した群は４頭使用した。Ｃ１０抗体及び２Ｃ３Ｂ抗体は、それぞれＰＢＳ（−）で３ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、投与液とした。陰性対照には、媒体であるＰＢＳ（−）を用いた。Ｃ１０抗体及び２Ｃ３Ｂ抗体は、それぞれ３ｍｇ／ｋｇとなるように１ｍＬ／ｋｇの容量で上腕橈側皮静脈より１ｍＬ／分の流速で単回投与した。血清リン濃度はＬタイプワコー無機リン（和光純薬工業社）試薬を用いて日立自動分析装置７１８０（日立製作所社）で測定した。血清１，２５Ｄ濃度は１，２５（ＯＨ）_２Ｄ ＲＩＡキット「ＴＦＢ」（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。測定は抗体投与後、０．５、１、２、３、５、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９日目にそれぞれ行なった。データは平均値＋／−標準誤差で示した。各抗体投与後の経時的採血による血清リン濃度の１０日目までの推移を図６に示す。ＰＢＳ（−）投与群では、血清リン濃度は試験期間を通してほぼ一定の濃度であったのに対し、Ｃ１０抗体投与群及び２Ｃ３Ｂ抗体投与群では、投与前及びＰＢＳ（−）投与群と比較して、明らかな血清リン濃度の上昇が認められた。Ｃ１０抗体投与群及び２Ｃ３Ｂ抗体投与群とも、最も高い血清リン濃度が認められた時期は、ともに抗体投与後５日目であり、このときの血清リン濃度は、ＰＢＳ（−）投与群、２Ｃ３Ｂ抗体投与群及びＣ１０抗体投与群でそれぞれ５．２８ｍｇ／ｄｌ、８．１０ｍｇ／ｄｌ、９．５９ｍｇ／ｄｌであった。この抗体投与後５日目の２Ｃ３Ｂ抗体投与群とＣ１０抗体投与群の血清リン濃度について同時期のＰＢＳ（−）投与群の血清リン濃度からの上昇値を比較すると、２Ｃ３Ｂ投与群の血清リン濃度が２．８２ｍｇ／ｄｌであるのに対し、Ｃ１０抗体投与群では４．３１ｍｇ／ｄｌであり、Ｃ１０抗体は２Ｃ３Ｂ抗体に比べ約１．５倍以上血清リン濃度を高く誘導した（図７）。このように、Ｃ１０抗体投与群の血清リン濃度上昇作用は、２Ｃ３Ｂ抗体投与群に比較して、顕著に高かった。また、２Ｃ３Ｂ抗体投与群の血清リン濃度は、投与後１０日目でＰＢＳ（−）の血清リン濃度と同等の値になっていたが、Ｃ１０抗体投与群の血清リン濃度（８．７６ｍｇ／ｄｌ）は依然として２Ｃ３Ｂ抗体投与群の最高値（８．１０ｍｇ／ｄｌ）よりも高い値を維持していた（図６）。さらに、Ｃ１０抗体による血清リン濃度の上昇の持続期間は２Ｃ３Ｂ抗体によるものよりもはるかに長く、ＰＢＳ（−）投与群との有意差を有する上昇期間が２Ｃ３Ｂで７日間であったのに対し、Ｃ１０抗体では驚くべきことに３５日間と持続期間が約５倍も長くなった。同様に、抗体投与後の１，２５Ｄ濃度に関しても、２Ｃ３Ｂ抗体に比較して、Ｃ１０抗体は顕著な上昇及びその持続期間の延長を示した（図８）。この結果は、既存のＦＧＦ２３中和抗体である２Ｃ３Ｂ抗体と比較して、カニクイザルにおいて、Ｃ１０抗体はより強力な血清リン濃度上昇及び血清１，２５Ｄ上昇作用を有する、すなわち強力なＦＧＦ２３中和活性を有することを示している。現在、ＸＬＨなどにおける低リン血症性クル病の現状の治療においては一日に複数回のリンやビタミンＤ製剤の大量の投与を行い、かろうじて正常域のリン濃度に保つ治療が行われている。頻回の服用のコンプライアンスも悪いという報告もある。本研究におけるＣ１０抗体の単回の投与において、血清リン濃度、血清１，２５Ｄ濃度の持続的な上昇作用が観察されたことは、低リン血症治療薬として現状の治療に比して、Ｃ１０抗体は顕著な優位性を有する治療である可能性が示唆された。
（実施例１１） Ｃ１５抗体のヒト及びカニクイザルＦＧＦ２３への反応性の確認
実施例１で作製したｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ｈＦＧＦ２３又は実施例８で作製したｐＥＡＫ８／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ／ｍｏｎｋｅｙＦＧＦ２３をＰＥＡＫ ｒａｐｉｄ細胞（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にリン酸カルシウム法により一過性に遺伝子導入した。導入から３日目に、各培養上清を回収し、一次抗体として、実施例１３で作製したＣ１５抗体を用い、ウエスタンブロットを行った（図９）。その結果、Ｃ１５はカニクイザルＦＧＦ２３もヒトＦＧＦ２３と同様に結合することが示された。
（実施例１２）Ｃ１０抗体とＣ１５抗体の正常カニクイザルの血中リン濃度及び血中１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ濃度に対する作用の比較
実施例１１によってＣ１５抗体がＣ１０抗体と同様に、ヒト及びカニクイザルＦＧＦ２３組換え蛋白に対し結合活性を有することを示された。そこで、Ｃ１０抗体及びＣ１５抗体について、正常カニクイザルに投与することにより、生体内でのＦＧＦ２３中和活性を比較した。カニクイザル内在性ＦＧＦ２３に対する中和活性の評価は、血清リン濃度上昇を指標として実施した。Ｃ１０抗体又はＣ１５抗体は実施例７で作製したものを用いた。実験動物には、２〜３歳、体重２〜３ｋｇの正常カニクイザルを使用し、１群あたりオス２頭、メス１頭の計３頭とした。希釈媒体にはＰＢＳ（−）を使用し、Ｃ１０抗体は１ｍｇ／ｍＬ及び３ｍｇ／ｍＬ、Ｃ１５抗体は３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した。Ｃ１０抗体は投与量が１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇとなるように、またＣ１５抗体は３ｍｇ／ｋｇとなるように、１ｍＬ／ｋｇの容量で伏在静脈より約１ｍＬ／分の流速で単回投与した。血清リン濃度はＬタイプワコー無機リン（和光純薬工業社）試薬を用いて日立自動分析装置７１８０（日立製作所社）で測定した。採血は、抗体投与前、及び投与１、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日後に実施し、すべての採血ポイントについて血清リン濃度の測定を行なった。Ｃ１０抗体１ｍｇ／ｋｇ群、Ｃ１０抗体３ｍｇ／ｋｇ群及びＣ１５抗体３ｍｇ／ｋｇ群の抗体投与前の血清リン濃度は、それぞれ５．３７、５．７０及び５．５８ｍｇ／ｄＬであり、群間の差はなかった。投与後、すべてのカニクイザルで、血清リン濃度の上昇が認められ、Ｃ１０抗体のみならずＣ１５抗体もカニクイザル内在性ＦＧＦ２３に対し中和活性を有することが示された。Ｃ１０抗体１ｍｇ／ｋｇ群、Ｃ１０抗体３ｍｇ／ｋｇ群及びＣ１５抗体３ｍｇ／ｋｇ群のそれぞれの血清リン濃度は投与３日後で、９．０３、９．１０及び８．６４ｍｇ／ｄＬであった。この時、Ｃ１０抗体１ｍｇ／ｋｇ群及びＣ１５抗体３ｍｇ／ｋｇ群の血清リン濃度は最高値を示した。一方で、Ｃ１０抗体３ｍｇ／ｋｇ群の血清リン濃度はさらに上昇し投与５日後に最大値を示し、その値は９．７５ｍｇ／ｄＬであった。投与前後の血清リン濃度の最大上昇幅は、Ｃ１０抗体１ｍｇ／ｋｇ群、Ｃ１０抗体３ｍｇ／ｋｇ群及びＣ１５抗体３ｍｇ／ｋｇ群でそれぞれ３．６７、４．６５及び３．０６ｍｇ／ｄＬとなった。この結果より、３ｍｇ／ｋｇの同用量においては、Ｃ１０抗体がＣ１５抗体に比べて、血清リン濃度上昇作用が強いことが示されただけでなく、驚くべきことに、１ｍｇ／ｋｇの用量のＣ１０抗体は３ｍｇ／ｋｇのＣ１５抗体よりも血中リン濃度を上昇させた。次に、投与前に比べて血清リン濃度が上昇している期間を比べた。その結果、Ｃ１０抗体１ｍｇ／ｋｇ群、Ｃ１０抗体３ｍｇ／ｋｇ群及びＣ１５抗体３ｍｇ／ｋｇ群でそれぞれ１４、２８及び７日間となった。この結果より、３ｍｇ／ｋｇの同用量においては、Ｃ１０抗体がＣ１５抗体に比べて、血清リン濃度上昇作用を持続することが示されただけでなく、驚くべきことに、１ｍｇ／ｋｇの用量のＣ１０抗体は３ｍｇ／ｋｇのＣ１５抗体よりも血中リン濃度を長期に渡り高値に維持した。以上の結果より、Ｃ１０抗体はＣ１０抗体と同時に取得したＣ１５抗体に比べてカニクイザルにおける血清リン濃度上昇作用及び血清リン上昇持続作用が強いことが明らかになった。すなわち、Ｃ１０抗体はＣ１５抗体に比べてカニクイザルＦＧＦ２３に対する中和活性が顕著に強いことが明らかになった。
（実施例１３）ヒトＦＧＦ２３ ＤＮＡ断片（シグナル配列無し）の作製
ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（トーヨーボー社）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、５０μｌ反応液中にＦＧＦ２３（−ＳＰ）ＦＷプライマー（配列番号３４）とＦＧＦ２３（−ＳＰ）ＲＶプライマー（配列番号３５）を各１５ｐｍｏｌ、鋳型としてヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡ（開始コドンから終止コドンを含む７５６ｂｐ配列番号３６）を添加し、９４℃３分保温した後、９８℃１５秒、６３℃１５秒及び６８℃２分３０秒を１サイクルとして３０サイクル増幅し、７２℃３分保温した。得られた６８４ｂｐの増幅断片を０．８％ゲルで分離回収した。回収されたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。回収されたＰＣＲ増幅断片をＦｓｅＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン社）で酵素消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い添付文書にしたがって酵素処理断片を回収した。その結果、ヒトＦＧＦ２３のシグナル配列を含まないｍａｔｕｒｅ体部分に相当する部分ＤＮＡ断片を得た。
（実施例１４）ｐＰＳｓ ＦＧＦ２３ベクターの構築
国際公開第ＷＯ２００６／７８０７２パンフレットの実施例１−８記載のｐＰＳｓ５．５をＳｆｏＩ及びＦｓｅＩで消化後、大腸菌由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、実施例１３で作製したヒトＦＧＦ２３を含むＤＮＡ断片を挿入した後、ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＰＳｓ ＦＧＦ２３ベクター（図１０）を取得した。
（実施例１５）ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターの構築
国際公開第ＷＯ ２００６／７８０７２号パンフレットの実施例４３−１で作製されたｐＣｋｌｏｘＰＶΔＰをＳａｌＩ及びＦｓｅＩで酵素消化後、大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼを用いて末端脱リン酸化したものに、上記実施例１４のｐＰＳｓ ＦＧＦ２３ベクターをＳａｌＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、０．８％アガロースゲルより分離回収された約１．５ｋｂの断片を挿入した後、それを大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡを調製し、連結部分の塩基配列を確認して、ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクター（図１１）を取得した。
以下にｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターヒトＦＧＦ２３発現ユニットの開始コドンから終止コドンまでのポリヌクレオチド配列（ＦＧＦ２３シグナル配列）を、イントロン領域を含んだマウスＩｇκシグナル配列〔配列番号３８の下線部分〕に置換し、その下流にＦＧＦ２３ ｍａｔｕｒｅ体配列を含む９８５ｂｐ、配列番号３８）、及び該ｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列（２４７アミノ酸、下線の部分はマウスＩｇκシグナル配列を示す、配列番号３９）を示す。イントロン領域を含んだマウスＩｇκシグナル配列情報はＧｅｎＢａｎｋより取得したＭＵＳＩＧＫＶＲ１（アクセッション番号Ｋ０２１５９）をもとに、その上流のゲノム配列をＵＣＳＣマウスゲノムデータベースより取得した。
（実施例１６）エレクトロポレーション用ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターの調製
ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクター６０μｇを、スペルミジン添加（１ｍＭ ｐＨ７．０シグマアルドリッチジャパン社）バッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社、制限酵素用Ｈバッファー）を用い、ＮｏｔＩ（タカラバイオ社）を用いて３７℃で５時間消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、２．５倍容量の１００％エタノール、及び０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−２０℃で１６時間保存した。ＮｏｔＩで一本鎖化されたベクターを遠心して回収後、７０％エタノールを加えて滅菌した。クリーンベンチ内で７０％エタノールを除き、１時間風乾させた。０．５μｇ／μＬのＤＮＡ溶液となるようにＨＢＳ溶液を加え、１時間室温で保存し、エレクトロポレーション用ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターの調製を行なった。
（実施例１７）ｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターとＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞株を用いたＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株の取得
ヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡが相同組換えにより免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子下流に挿入されたＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株取得のため、実施例１６で示された方法に従い、制限酵素ＮｏｔＩで線状化されたｐＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩベクターを、確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従ってＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞へ導入した。国際公開第ＷＯ ２００６／７８０７２号パンフレットの実施例１０に記載された方法でＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞は取得された。
ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（シグマアルドリッチジャパン社）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０^７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社）１枚に播種した。３６時間後に０．８μｇ／ｍｌのピューロマイシン（シグマアルドリッチジャパン社）を含むＥＳ培地と置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、シグマアルドリッチジャパン社）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０^６〜１０^７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（キアゲン社）により調製した。これらのピューロマイシン耐性ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ ００／１０３８３号パンフレット 図５）Ｃｋ３’ｐｒｏｂｅをプローブとして相同組換え体を検出した。野生型ＲＳエレメント・ターゲティング・マウスＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、１本のバンド（１５．１ｋｂ）が検出された。相同組換え体においては、このバンドに加えてその下部に新たなバンド（１２．８ｋｂ）が出ることが予想される（図１２）が、ピューロマイシン耐性株においてこの新たなバンドが確認された。すなわち、これらのクローンは一方のアレルの免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡが挿入されたものである。
（実施例１８）ＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株より薬剤耐性遺伝子を除去したＵＳ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株の取得
ＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ^ｒ，Ｎｅｏ^ｒ）を除去したＵＳ ＦＧＦ２３遺伝子導入ＥＳ細胞株取得のため、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅベクター（Ｓｕｎａｇａら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．，４６：１０９−１１３，１９９７）を確立されている方法（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従ってＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞へ導入した。
ＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞の培養法は、記載の方法（相沢慎一、前記）に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（シグマアルドリッチジャパン社）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（インビトロジェン社より購入）を用いた。まず、増殖させたＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞をトリプシン処理し、３×１０^７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから、０．５ｍｌの細胞懸濁液を１０μｇのベクターＤＮＡと混和し、ジーンパルサーキュベット（電極距離：０．４ｃｍ、バイオ・ラッドラボラトリーズ社）にてエレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２５０Ｖ、室温）。エレクトロポレーションした細胞を１０ｍｌのＥＳ培地（相沢慎一、前記）に懸濁し、それより２．５ｍｌ分を、あらかじめフィーダー細胞を播種した６０ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社）１枚に播種した。３０時間後にＥＳ細胞１０００個をあらかじめフィーダー細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社）１枚に播種した。６日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれを２４穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その２／３を０．２ｍｌの保存用培地（ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、シグマアルドリッチジャパン社）に懸濁し、−８０℃にて保存した。残りの１／３は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して１０^６〜１０^７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（キアゲン社）により調製した。これらマウスＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。続いてサザンブロットを行い、ＷＯ ００／１０３８３号パンフレット（実施例４８参照）に記載の発明で使用された、Ｉｇ軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡの３’端のＤＮＡ断片（ｘｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、約１．４ｋｂ、ＷＯ ００／１０３８３号パンフレット 図５）Ｃｋ３’ｐｒｏｂｅをプローブとしてｌｏｘＰＶ配列で挟まれたＰｕｒｏ^ｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｐｕｒｏ^ｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．１ｋｂと１２．８ｋｂ）が検出され、Ｐｕｒｏ^ｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（１５．１ｋｂと１０．９ｋｂ）が検出された（図１２）。また、上記と同様の操作で得られたサザンブロット膜を用い、国際公開第ＷＯ ２００６／７８０７２号パンフレットの実施例９で示された方法により調製された３’ＫＯ−ｐｒｏｂｅをプローブとしてｌｏｘＰ配列で挟まれたＮｅｏ^ｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株を検出した。Ｎｅｏ^ｒ遺伝子を保持したＥＳ細胞ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（７．４Ｋと５．７Ｋ）が検出され、Ｎｅｏ^ｒ遺伝子のみが除去されたＥＳ細胞株ではＥｃｏＲＩ消化により、２本のバンド（５．７Ｋと４．６Ｋ）が検出された（図１２）。これらの結果から、ＰＬ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株より２種の薬剤耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ^ｒ，Ｎｅｏ^ｒ）が同時に除去されたＥＳ細胞株（ＵＳ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株）が得られた。
（実施例１９）ＵＳ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株及びＢリンパ球欠損マウス系統由来宿主胚を用いたＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩキメラマウスの作製
免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトのホモ接合体においては、機能的なＢリンパ球が欠損し、抗体が産生されない（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：４２３−４２６，１９９１）。清浄な環境で飼育した上記ホモ接合体の雌雄個体の交配により得られる胚を本実施例で行うキメラマウス作製の際の宿主として利用した。この場合、キメラマウスにおいて機能的なＢリンパ球は、大部分が注入したＥＳ細胞に由来する。本実施例では富塚らの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７，２０００）に記載された免疫グロブリンμ鎖遺伝子ノックアウトマウスについてＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）系統への戻し交配を３回以上行った個体を宿主胚調製用として用いた。
上記実施例１８で得られ、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡが挿入されていることが確認されたＵＳ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株を凍結ストックより立ち上げ、それらを、上記免疫グロブリンμ鎖ノックアウトマウスホモ接合体の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＭＣＨ（ＩＣＲ）マウス（日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個のインジェクション胚を移植した。実施例１８のＵＳ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株を用いて作製されたインジェクション胚を移植した結果、子キメラマウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において、宿主胚由来の白色の中にＥＳ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによって判定される。誕生した子キメラマウスのうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわちＥＳ細胞の貢献の認められる個体が得られた。これらの結果より、免疫グロブリンκ鎖遺伝子下流にヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡが挿入されているＵＳ ＦＧＦ２３マウスＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。また、実施例２１で後述するように、ＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩキメラマウスは血中ＦＧＦ２３濃度が高値であり、低リン血症性クル病様の所見を示す病態モデル動物として使用することが可能であった。
（実施例２０）コントロールキメラマウスの作製
国際公開第ＷＯ ２００６／７８０７２号パンフレットの実施例１１記載の方法に従い作製されたヒトＦＧＦ２３−ｃＤＮＡを含め機能遺伝子が挿入されていないキメラマウスは後述する実施例２１のＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩキメラマウスへのＣ１０抗体投与実験において、コントロールキメラマウス個体（ＷＴマウス）として用いられた。
（実施例２１） ＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩキメラマウスを用いたＣ１０抗体の病態改善効果の検証
実施例１０及び１２において、Ｃ１０抗体が２Ｃ３Ｂ抗体やＣ１５抗体に比べ顕著に正常カニクイザルの内在性ＦＧＦ２３の作用を抑制し、その血清リン濃度及び血清１，２５Ｄ濃度を上昇させることを示した。ヒトＦＧＦ２３に対する中和活性を有する抗体は、ＦＧＦ２３過剰に由来する腫瘍性骨軟化症、ＸＬＨなどを含む低リン血症性くる病・骨軟化症などのヒト疾患において治療効果を有することが強く示唆される。本研究において取得されたＣ１０抗体によるヒトＦＧＦ２３過剰に由来する病態の改善効果について検討するために、実施例１９で作製したＵＳ ＦＧＦ２３ ＫＩキメラマウス（以下ｈＦＧＦ２３ＫＩマウス）を用いて実験を行った。病態動物としてｈＦＧＦ２３ ＫＩマウスを１２匹、その比較対象として同週齢の正常コントロールマウス（ＷＴマウス、実施例２０で作製）６匹を実験に使用した。７週齢の時点で、ｈＦＧＦ２３ ＫＩマウスの血清を採血しＦＧＦ２３（ＦＧＦ−２３ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ、カイノス社）及びリンの血清濃度をそれぞれ測定した。ＷＴマウスに比して、ｈＦＧＦ２３ ＫＩマウスにおいては顕著に血清ＦＧＦ２３濃度が上昇していることが示された（ＷＴマウス；ｎ＝６、１６３ｐｇ／ｍＬ ｈＦＧＦ２３ＫＩマウス；ｎ＝１２、１４６７ｐｇ／ｍＬ）。この結果より、ｈＦＧＦ２３ ＫＩマウスへのヒトＦＧＦ２３遺伝子導入は正確に行われ、さらにｈＦＧＦ２３ ＫＩマウス血中に外来性のヒトＦＧＦ２３が過剰に存在していることが示された。さらに、ＷＴマウスに比して、ｈＦＧＦ２３ ＫＩマウスにおいては血清リン濃度が顕著に低下していることが示され（ＷＴマウス；ｎ＝６、５．８２ｍｇ／ｄＬ ｈＦＧＦ２３ＫＩマウス；ｎ＝１２、２．６２ｍｇ／ｄＬ）、ｈＦＧＦ２３ ＫＩマウスにおいては過剰なヒトＦＧＦ２３作用により、低リン血症が誘導されていることが示された。このとき、ｈＦＧＦ２３ ＫＩマウス１２匹をＦＧＦ２３濃度が均等になるように、それぞれＣ１０抗体又はコントロールＩｇＧ１投与群の６匹ずつ２群に分けた（図１３）。次に、８週齢から、Ｃ１０抗体又はアイソタイプコントロール用の精製ヒトＩｇＧ１（コントロール抗体）を３０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に週１回の頻度で５回反復投与した。初回投与前及び投与３日後にマウスより採血し、血清を取得した。四肢握力の測定は、４回目投与の２４時間後に齋藤式マウス用握力測定装置（ＧＲＩＰ ＳＴＲＥＮＧＴＨ ＭＥＴＥＲ，ＭＫ−３８０Ｓ 室町機械）を用いて実施した。四肢握力の評価は、マウスを測定用グリッド（網）に掴まらせ、尾を手で水平に引き、動物が引かれた力に耐え切れずにグリッドを離すまでの最大の力（握力）を指標に実施した。骨評価については、５回目投与の２４時間後に、麻酔下において心採血により屠殺後、大腿骨及び頸骨を採取し、７０％エタノールで固定した。血清リン濃度は、初回投与前、初回投与の３日後及び５回目投与の２４時間後の血清を用いて測定した。大腿骨は、非脱灰樹脂包埋後にＶｉｌｌａｎｕｅｖａ−Ｇｏｌｄｎｅｒ染色し、組織学的評価を実施した。頸骨は、灰化によりミネラル含量を測定した。
その結果、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスのコントロール抗体投与群では血清リン濃度は群分け時及び屠殺時共に、ＷＴマウスのコントロール抗体投与群に比して有意に低値を示し、持続的な低リン血症状態であることが確認された（図１４）。一方、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスにＣ１０抗体を投与した群では血清リン濃度は３日後にＷＴマウスのコントロール抗体投与群と同レベルまで上昇することが確認された（図１４）。また、Ｃ１０抗体の５回目投与後の血清リン濃度もＷＴマウスのコントロール抗体投与群と同レベルであり、５回の投与後でもＣ１０抗体投与による血清リン上昇作用は維持されていることが示された（図１５）。
低リン血症患者の症例として、骨格筋の筋力低下が臨床的に報告されている［Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｗｏｒｔｈｌｅｙ，Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｒｅｓｕｓｃ．，４：３０７−３１５，２０００］。本試験においても、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスは有意な低リン血症を呈していることから、筋力の低下が予想される。そこで、筋力の低下の指標として前述の方法で四肢握力を測定し、各群間で比較した。その結果、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスのコントロール抗体投与群の握力はＷＴマウスのコントロール抗体投与群に比して有意に低値を示し、この病態モデルマウスにおいても、筋力の低下が観察された（図１６）。これに対し、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスのＣ１０抗体投与群では握力の有意な改善効果も認められた（図１６）。
次に、大腿骨の硬組織標本をＶｉｌｌａｎｕｅｖａ−Ｇｏｌｄｎｅｒ法で組織染色し、観察すると、コントロール抗体を投与したＷＴマウスに比してコントロール抗体を投与したｈＦＧＦ２３ＫＩマウスには多量の類骨（図１７で赤色で示される）が確認されることから石灰化障害が引き起こされていることが示唆された。これはクル病に特徴的な症状として広く知られている。これに対し、Ｃ１０抗体を投与したｈＦＧＦ２３ＫＩマウスでは、類骨が減っていることが確認され、類骨が石灰化骨（図１７で緑色で示される）に置き換わっていることが予想された。この結果から、ＦＧＦ２３過剰によって誘導された骨の石灰化障害をＣ１０抗体は改善することが示唆された。そこで、頸骨を灰化しミネラル含量を測定し、各群間で比較した。ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスのコントロール抗体投与群の頸骨のミネラル含量はＷＴマウスのコントロール抗体投与群に比して有意に低下していた（図１８）。これに対し、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスのＣ１０投与群ではミネラル含量が改善していることが確認された（図１８）。以上の結果から、ｈＦＧＦ２３ＫＩマウスにおいて、Ｃ１０抗体投与は生体内で過剰に作用しているヒトＦＧＦ２３作用を中和し、低リン血症、筋力低下、骨石灰化障害などの低リン血症性クル病のさまざまな症状を改善することが確認された。すなわちＣ１０抗体は、ＦＧＦ２３が関与するヒトのさまざま疾患の有効な治療薬となることが示された。

本発明のＦＧＦ２３に対する抗体であるＣ１０抗体は、公知のＦＧＦ２３に対する抗体に比べ、ｉｎ ｖｉｖｏでの血清リン濃度を持続的に上昇させる活性及び／又は血清１，２５Ｄ濃度を持続的に上昇させる活性が高く、ＦＧＦ２３の過剰作用が原因となり得る疾患、又はＦＧＦ２３の作用を調節することにより病態の改善が見込まれる疾患の予防及び治療剤として顕著な効果をもって使用することができる。

配列番号１〜３、５〜２７、３０〜３３、４０〜４５ 合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (11)

1. ハイブリドーマC10（受託番号 FERM BP-10772）が産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を含む、ヒトFGF23に対する単離された抗体。
2. 配列番号１２の20番目のアミノ酸から配列番号１２の136番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４の23番目のアミノ酸から配列番号１４の128番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトFGF23に対する単離された抗体。
3. 重鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４０、ＣＤＲ２が配列番号４１、ＣＤＲ３が配列番号４２を有し、軽鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４３、ＣＤＲ２が配列番号４４、ＣＤＲ３が配列番号４５を有する、ヒトFGF23に対する単離された抗体。
4. ハイブリドーマC10（受託番号 FERM BP-10772）により産生されるヒトFGF23に対する単離された抗体。
5. 抗体のクラスがIgG、IgA、IgE及びIgMからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載のヒトFGF23に対する単離された抗体。
6. IgG抗体のサブクラスがIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4からなる群から選択される、請求項５記載のヒトFGF23に対する単離された抗体。
7. 請求項１から６のいずれか１項に記載のヒトFGF23に対する単離された抗体を有効成分として含む、医薬組成物。
8. ハイブリドーマC10（受託番号 FERM BP-10772）。
9. ハイブリドーマC10（受託番号 FERM BP-10772）が産生する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と同一のアミノ酸配列を含み、サブクラスがIgG1である、ヒトFGF23に対する単離された抗体。
10. 配列番号１２の20番目のアミノ酸から配列番号１２の136番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４の23番目のアミノ酸から配列番号１４の128番目のアミノ酸で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、サブクラスがIgG1である、ヒトFGF23に対する単離された抗体。
11. 重鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４０、ＣＤＲ２が配列番号４１、ＣＤＲ３が配列番号４２を有し、軽鎖相補性決定領域として、ＣＤＲ１が配列番号４３、ＣＤＲ２が配列番号４４、ＣＤＲ３が配列番号４５を有し、サブクラスがIgG1である、ヒトFGF23に対する単離された抗体。