WO2024034638A1 - 抗ｆｇｆ２３抗体又は該抗体断片 - Google Patents

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antibody
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acid sequence
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光 宮城
泰治 小葦
健太 中島
紗里 小笠原
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Definitions

  • the present invention relates to anti-FGF23 antibodies or antibody fragments thereof.
  • Fibroblast growth factor (hereinafter referred to as FGF) forms a family of structurally similar polypeptides, and it not only has fibroblast proliferation activity but also mesoderm and neuroectoderm proliferation.
  • FGF Fibroblast growth factor
  • Various effects have been reported, including angiogenic effects, angiogenic effects, and limb bud formation during developmental stages. In adults, it also functions as a homeostasis factor, such as tissue maintenance, repair, regeneration, and metabolism (Non-Patent Document 1).
  • FGF family In mammals, 22 types of proteins belonging to the FGF family are known. In humans, 22 types of FGF1 to FGF23, excluding FGF15, have been identified. Furthermore, the human FGF family is composed of about 150 to 300 amino acids, and the core sequence of about 120 amino acids has an identity of about 30 to 60%. The FGF family is classified into those that are expressed as secreted proteins and act on receptor tyrosine kinases, and those that are expressed as intracellular proteins and act on voltage-dependent sodium channels and other molecules (Non-patent Document 2). .
  • FGF23 is a secreted protein that was identified from mice using a database search and PCR method using homology with FGF15, and was subsequently identified by homology search.
  • Human FGF23 is composed of a polypeptide of 251 amino acid residues, and it is known that the N-terminal 24 residues function as a secretion signal and are cleaved during the protein maturation process (Non-Patent Document 3).
  • FGF23-related hypophosphatemic diseases for which the causative gene is known include X-linked hypophosphatemic rickets caused by phosphate-regulating endopeptidase homolog, X-linked (PHEX) mutations. rickets, hereinafter XLH) has the highest frequency, and a large number of PHEX gene mutations have been reported so far (Non-Patent Document 5).
  • PHEX is a single-transmembrane protein and is known to be expressed in large numbers in cartilage, osteoblasts, and odontoblasts (Non-patent Document 6 and Non-Patent Document 7), and XLH affects 20,000 people. It is said that the disease occurs in only one person (Non-Patent Document 8).
  • Tumor-induced osteomalacia (TIO) is a known example of an acquired disease.
  • Non-Patent Document 9 Non-Patent Document 10
  • Burosumab an FGF23 neutralizing antibody
  • Burosumab an FGF23 neutralizing antibody
  • Patent Document 1 the antibody described in Patent Document 1 is also known as a human FGF23 neutralizing antibody.
  • the present invention aims to provide a novel anti-FGF23 antibody whose degradation at a lower pH is suppressed than that of the anti-human FGF23 antibody described in WO 2008/099969.
  • the present inventors have developed an anti-FGF23 antibody in which the 100th amino acid residue or the 105th amino acid residue of the VH of the anti-FGF23 antibody described in WO 2008/099969 is substituted.
  • the inventors have discovered that the above-mentioned problems can be solved, and have completed the present invention.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the 100th amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in VH is an alanine residue, an asparagine residue, a glycine residue, a tyrosine residue, an arginine residue, an aspartic acid residue, a histidine residue, and a tryptophan residue.
  • 3. The antibody or antibody fragment according to 1 or 2 above, wherein the 100th amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in VH is substituted with an alanine residue or a tyrosine residue. 4.
  • the 105th amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in VH is an alanine residue, a phenylalanine residue, a glycine residue, a histidine residue, an isoleucine residue, a lysine residue, a leucine residue, a methionine residue. group, proline residue, glutamine residue, arginine residue, valine residue, tryptophan residue, tyrosine residue, threonine residue, asparagine residue, and serine residue. , the antibody or antibody fragment according to any one of 1 to 3 above. 5. 5. The antibody or antibody fragment according to any one of 1 to 4 above, wherein the antibody further comprises 1 substitution selected from (a1) to (a4) below.
  • At least one substitution selected from substitution with a histidine residue, substitution of the 57th amino acid residue with a threonine residue, and substitution of the 58th amino acid residue with a phenylalanine residue (a2) Substitution of the 91st amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in VL with a methionine or leucine residue, substitution of the 92nd amino acid residue with a tyrosine residue, substitution of the 94th amino acid residue with a tyrosine residue, at least one substitution selected from the substitution of an amino acid residue with an aspartic acid residue, and the substitution of the 96th amino acid residue with an asparagine residue or an aspartic acid residue; (a3) Substitution of the 28th amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in VL with an aspartic acid residue, substitution of the 29th amino acid residue with a valine residue, and 31st amino acid residue at least one substitution selected from substitution of a threon
  • (d1) Fc containing a substitution of the 252nd amino acid residue in the EU index with a tyrosine residue, the 254th amino acid residue with a threonine residue, and the 256th amino acid residue with a glutamic acid residue region
  • (d2) an Fc region comprising a substitution of the 428th amino acid residue in the EU index with a leucine residue and a substitution of the 434th amino acid residue with a serine residue
  • (d3) an Fc region containing a substitution of the 308th amino acid residue of the EU index with a proline residue
  • (d4) Fc region containing the substitution of the 250th amino acid residue of the EU index with a glutamine residue and the substitution of the 428th amino acid residue with a leucine residue, and (d5) the 434th amino acid residue of the EU index
  • a method for producing the antibody or antibody fragment according to any one of 1 to 10 above which comprises culturing the transformed cell according to 13 above in a medium and collecting the antibody or antibody fragment from the culture. 15.
  • a composition comprising the antibody or antibody fragment according to any one of 1 to 10 above.
  • a therapeutic agent for human FGF23-related diseases comprising the antibody or antibody fragment according to any one of 1 to 10 above.
  • a method for treating human FGF23-related diseases comprising the antibody or antibody fragment according to any one of 1 to 10 above.
  • the anti-FGF23 antibody of the present invention exhibits superior stability with suppressed decomposition at low pH compared to the anti-FGF23 antibody described in WO 2008/099969.
  • an anti-FGF23 antibody or the antibody fragment a nucleic acid having a base sequence encoding the antibody or the antibody fragment, a vector containing the nucleic acid, a transformed cell containing the vector, an anti-FGF23 antibody or the antibody fragment, Methods of production and compositions comprising the antibodies or antibody fragments can be provided.
  • the present invention provides an antibody that binds to fibroblast growth factor 23 (hereinafter referred to as FGF23) described in International Publication No. 2008/099969 (hereinafter referred to as a heavy chain variable antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1). (hereinafter referred to as an antibody containing a light chain variable region (hereinafter referred to as VL) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2), at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in VH.
  • the present invention relates to an antibody or an antibody fragment thereof that binds to FGF23 in which the 100th or 105th amino acid residue of the amino acid sequence is substituted with another amino acid residue (hereinafter referred to as the antibody of the present invention).
  • FGF23 is a type of fibroblast growth factor and a hormone derived from bone cells.
  • Human FGF is a protein consisting of 251 amino acids including a 24 amino acid secretion signal at the N-terminus, and the secretion signal is cleaved during the maturation process of the protein.
  • the functions of FGF23 are mainly through the FGF receptor 1 (hereinafter also referred to as FGFR1)/ ⁇ -Klotho complex on renal proximal tubular cells, and promotes phosphorus reabsorption and vitamin D in the kidney. Examples include suppressing activation.
  • human FGF23 includes a polypeptide comprising the amino acid sequence of NCBI Accession No. NP_065689, an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence with one or more amino acids deleted, substituted, or added to the amino acid sequence of NCBI Accession No. NP_065689, and From an amino acid sequence having 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more homology with a polypeptide having the function of human FGF23, or the amino acid sequence of NCBI accession number NP_065689.
  • Examples include polypeptides that have the same structure as human FGF23 and have the functions of human FGF23.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown by NCBI accession number NP_065689 can be obtained by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 ( 1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. It can be obtained by introducing site-directed mutations into DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence shown by NP_065689.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but preferably 1 to several tens of amino acids, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human FGF23 include the base sequence with NCBI accession number NM_020638.
  • a gene consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added in the base sequence of NM_020638, and containing DNA encoding a polypeptide having the function of human FGF23, at least 60% or more of the base sequence of NM_020638 , preferably 80% or more homology, more preferably 90% or more homology, and most preferably 95% or more homology.
  • a gene encoding human FGF23 of the present invention also includes a gene encoding human FGF23 of the present invention.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, DNA microarray method, etc. using DNA containing the base sequence of NM_020638 as a probe can be used. Refers to the resulting hybridizable DNA.
  • hybridizable DNA examples include DNA that has at least 60% homology with the base sequence of NM_020638, preferably DNA that has 80% or more homology, and more preferably 95% or more homology. be able to
  • Genetic polymorphisms are often observed in the base sequences of genes encoding eukaryotic proteins. Genes used in the present invention that have small-scale mutations in their base sequences due to such polymorphisms are also included in the gene encoding human FGF23 of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art.
  • amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters in ., 215, 403 (1990)]
  • BLAST2 Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997), Genome Res., 7, 649 (1997). )] using default parameters.
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, -E (Cost to extend gap) is 2 if it is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • -W (wordsize) ) is the base sequence
  • there are 11 residues and the amino acid sequence , 3 residues for -y [Dropoff(X) for blast extensions in bits], 20 for blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X(X dropoff value for gapped al ignment bits) is 15
  • - Z final X dropoff value for gapped alignment in bits
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence of NCBI Accession No. NP_065689 can be produced by methods known to those skilled in the art. Specifically, it can be produced by deleting a portion of the DNA encoding the amino acid sequence of NP_065689 and culturing a transformant into which an expression vector containing the deletion is introduced. Furthermore, a polypeptide having an amino acid sequence with one or more amino acids deleted, substituted, or added to the amino acid sequence of NCBI Accession No. NP_065689 can be obtained by a method similar to that described above. Furthermore, polypeptides consisting of the amino acid sequence of NCBI Accession No.
  • NP_065689 or polypeptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added to the amino acid sequence of NCBI Accession No. NP_065689, are It can also be produced by chemical synthesis methods such as the oxycarbonyl (Fmoc) method and the t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • Fmoc oxycarbonyl
  • tBoc t-butyloxycarbonyl
  • amino acid deletion, substitution, addition, etc. are also referred to as amino acid modifications.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and oligoclonal antibodies.
  • Polyclonal antibodies refer to a population of antibody molecules secreted by antibody-producing cells of different clones.
  • a monoclonal antibody is an antibody secreted by a single clone of antibody-producing cells, which recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant) and whose amino acid sequence (primary sequence) that constitutes the monoclonal antibody is uniform.
  • An oligoclonal antibody refers to a population of antibody molecules that is a mixture of multiple different monoclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies in the present invention include antibodies produced by hybridomas or genetically recombinant antibodies produced by transformants transformed with expression vectors containing antibody genes.
  • the epitope includes a single amino acid sequence, a three-dimensional structure consisting of an amino acid sequence, an amino acid sequence modified by post-translational modification, and a three-dimensional structure consisting of the amino acid sequence, which are recognized and bound by a monoclonal antibody.
  • Amino acid sequences modified by post-translational modification include O-linked sugar chains that have OH substituents and are bonded to Tyr and Ser, N-linked sugar chains that are bonded to Gln and Asn that have NH2 substituents, and Examples include amino acid sequences in which a sulfuric acid molecule has a sulfuric acid group bonded to Tyr and Ser having an OH substituent group.
  • the binding of the antibody of the present invention to human FGF23 can be confirmed by measuring the binding of the antibody of the present invention to human FGF23 using ELISA, surface plasmon resonance, and the like.
  • known immunological detection methods [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] and so on.
  • the amino acid residues or epitopes of human FGF23 to which the antibody of the present invention binds include a deletion form in which a part of the domain of human FGF23 is deleted, a mutant in which a domain derived from another protein is substituted, and a partial peptide fragment of human FGF23. It can be determined by conducting an antibody binding experiment using, for example,
  • the amino acid residue or epitope of human FGF23 to which the antibody of the present invention binds can be determined by adding the antibody of the present invention to a peptide fragment of human FGF23 digested with a proteolytic enzyme, and performing epitope mapping using known mass spectrometry. It can also be determined by doing
  • Antibody molecules are also called immunoglobulins (hereinafter referred to as Ig), and human antibodies are classified into IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, and IgM isotypes according to differences in molecular structure. be done.
  • IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, which have relatively high amino acid sequence homology, are also collectively referred to as IgG.
  • Antibody molecules are composed of polypeptides called heavy chains (hereinafter referred to as H chains) and light chains (hereinafter referred to as L chains).
  • the H chain consists of VH and H chain constant regions (also referred to as CH) from the N-terminal side
  • the L chain consists of VL and L chain constant regions (also referred to as CL) from the N-terminal side.
  • CH is further composed of a CH1 domain, a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain from the N-terminal side.
  • a domain refers to a functional structural unit that constitutes each polypeptide of an antibody molecule.
  • the CH2 domain and CH3 domain are collectively referred to as the Fc region or simply Fc.
  • CL is known as a C ⁇ chain and a C ⁇ chain.
  • the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, CH3 domain and Fc region in the present invention are referred to as the EU index [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] (hereinafter simply EU index). It can be specified by the amino acid residue number from the N-terminus. Specifically, CH1 is the amino acid sequence of EU index numbers 118 to 215, Hinge is the amino acid sequence of EU index numbers 216 to 230, CH2 is the amino acid sequence of EU index numbers 231 to 340, and CH3 is the amino acid sequence of EU index numbers 341 to 447. Each amino acid sequence is specified.
  • the antibodies of the present invention include, in particular, genetically engineered recombinant mouse antibodies, recombinant rat antibodies, recombinant rabbit antibodies, human chimeric antibodies (hereinafter simply referred to as chimeric antibodies), and humanized antibodies (human Also included are recombinant antibodies such as complementarity determining region CDR-grafted antibodies) and human antibodies.
  • the antibodies of the present invention also include genetically recombinant antibodies produced by recombining H chains (or VH) and L chains (or VL) derived from two different types of antibodies. The two different types of antibodies may be any of hybridoma-derived monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • the antibodies of the present invention also include genetically recombinant antibodies in which appropriate amino acid residues are substituted when producing the above-mentioned genetically recombinant antibodies.
  • Chimeric antibody refers to an antibody consisting of the VH and VL of an antibody from a non-human animal (non-human animal) and the CH and CL of a human antibody.
  • non-human animal any animal can be used as long as it is possible to produce a hybridoma, such as mouse, rat, hamster, rabbit, etc.
  • a hybridoma is a cell that produces a monoclonal antibody with desired antigen specificity and is obtained by fusing B cells obtained by immunizing a non-human animal with an antigen and myeloma cells derived from a mouse or the like. means. Therefore, the variable region of the antibody produced by the hybridoma consists of the amino acid sequence of a non-human animal antibody.
  • a chimeric antibody is produced by obtaining cDNA encoding the VH and VL of a monoclonal antibody from a hybridoma derived from non-human animal cells that produce the monoclonal antibody, and using an expression vector for animal cells having DNA encoding the CH and CL of a human antibody. It is possible to construct a human chimeric antibody expression vector by inserting the antibody into each antibody, and to express and produce the antibody by introducing it into animal cells.
  • a humanized antibody refers to an antibody in which the amino acid sequences of the VH and VL CDRs of a non-human animal antibody are grafted onto the corresponding CDRs of the VH and VL of a human antibody.
  • the area other than the CDR of VH and VL is called a framework area (hereinafter referred to as FR).
  • a humanized antibody consists of a cDNA encoding a VH amino acid sequence consisting of the amino acid sequence of the VH CDR of a non-human animal antibody and the amino acid sequence of the FR of the VH of any human antibody, and the amino acid sequence of the VL CDR of the non-human animal antibody.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of VL consisting of the sequence and the amino acid sequence of the FR of VL of an arbitrary human antibody is constructed, and cDNA is inserted into an expression vector for animal cells containing DNA encoding CH and CL of a human antibody, respectively, to produce a human antibody.
  • the antibody can be expressed and produced by constructing a modified antibody expression vector and introducing it into animal cells.
  • Human antibodies originally refer to antibodies that naturally exist in the human body, but human antibody phage libraries and human antibody-producing transducers created through recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering technologies are also used. Also included are antibodies obtained from genetic animals.
  • Human antibodies can be obtained by immunizing mice carrying human immunoglobulin genes (Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000) with the desired antigen. I can do it.
  • human antibodies can be obtained without immunization by selecting human antibodies with the desired binding activity ( Winter G. et al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994).
  • immortalizing human B cells using EB virus cells that produce human antibodies with desired binding activity can be created and human antibodies can be obtained (Rosen A. et al., Nature 267, 52-54.1977).
  • Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by immortalizing lymphocytes isolated from human peripheral blood by infecting them with EB virus, etc., and then cloning them to obtain lymphocytes that produce the antibodies.
  • the antibody can be purified from a culture in which the lymphocytes are cultured.
  • a human antibody phage library is a phage library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into phage genes. Phage expressing antibody fragments having a desired antigen-binding activity can be recovered from the library using the binding activity to a substrate on which an antigen is immobilized as an indicator.
  • the antibody fragment can also be converted by genetic engineering techniques into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains.
  • a human antibody-producing transgenic animal is an animal in which a human antibody gene has been integrated into the chromosome of a host animal.
  • human antibody-producing transgenic animals can be produced by introducing human antibody genes into mouse ES cells, transplanting the ES cells into early embryos of other mice, and then allowing them to develop.
  • the method for producing human antibodies from human antibody-producing transgenic animals is to obtain human antibody-producing hybridomas using the hybridoma production method normally used in mammals other than humans, and to culture them to produce human antibodies in the culture. It can be produced and accumulated.
  • the amino acid sequences of VH and VL of the antibody of the present invention may be any of the amino acid sequences of VH and VL of a human antibody, a non-human animal antibody, or a humanized antibody.
  • the amino acid sequence of CL in the antibody of the present invention may be the amino acid sequence of a human antibody or a non-human animal antibody, but preferably the amino acid sequence of human antibody C ⁇ or C ⁇ .
  • the CH of the antibody of the present invention may be of any type as long as it belongs to immunoglobulin, but subclasses belonging to the IgG class, such as ⁇ 1 (IgG1), ⁇ 2 (IgG2), ⁇ 3 (IgG3), and ⁇ 4 (IgG4), are preferable.
  • subclasses belonging to the IgG class such as ⁇ 1 (IgG1), ⁇ 2 (IgG2), ⁇ 3 (IgG3), and ⁇ 4 (IgG4), are preferable.
  • the antibodies of the present invention include Fc fusion proteins in which Fc is bound to an antibody fragment, Fc fusion proteins in which Fc is bound to a naturally occurring ligand or receptor (also referred to as immunoadhesin), and antibodies in which multiple Fc regions are fused. It also includes Fc fusion proteins and the like.
  • the antibodies or antibody fragments of the present invention include antibodies or antibody fragments containing any post-translationally modified amino acid residues.
  • Post-translational modifications include, for example, deletion of a lysine residue at the C-terminus of the H chain (lysine clipping) or conversion of a glutamine residue to pyroglutamine (pyroGlu) at the N-terminus of a polypeptide. [Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736 (2013)].
  • an antibody fragment refers to a human antibody whose decomposition at low pH is suppressed compared to an antibody containing a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • This is an antibody fragment that binds to FGF23.
  • antibody fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , single chain antibody (scFv), dimerized V region (Diabody), disulfide stabilized V region (dsFv), or multiple CDR Examples include peptides containing.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG antibody with the protease papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), and approximately half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain have disulfide bonds. It is an antibody fragment with a molecular weight of approximately 50,000 and having antigen-binding activity, which is bonded through (SS bond).
  • F(ab') 2 is one of the fragments obtained by treating IgG with the protease pepsin (cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain). It is an antibody fragment with an antigen-binding activity and a molecular weight of approximately 100,000, which is slightly larger than the antibody fragment bound to the antibody.
  • Fab' is an antibody fragment with a molecular weight of about 50,000 and an antigen-binding activity obtained by cleaving the SS bond in the hinge region of F(ab') 2 .
  • the scFv is produced using an appropriate peptide linker (P) such as a linker peptide that connects one VH and one VL with an arbitrary number of linkers (G4S) consisting of 4 Gly and 1 Ser residues. It is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide linked together, and is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • P peptide linker
  • G4S arbitrary number of linkers
  • Diabody is an antibody fragment in which scFvs with the same or different antigen binding specificities form a dimer, and is an antibody fragment that has bivalent antigen-binding activity to the same antigen or specific antigen-binding activity to different antigens.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue, and the polypeptides are linked via an SS bond between the cysteine residues.
  • a CDR-containing peptide is comprised of at least one region of a VH or VL CDR.
  • the CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • a DNA encoding the VH and VL CDRs of the modified antibody of the present invention is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into the prokaryote or eukaryote. It can be expressed and manufactured by Peptides containing CDRs can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • One embodiment of the antibody of the present invention includes the following antibodies (i) and (ii) or antibody fragments thereof.
  • (i) In an antibody that binds to FGF23 containing a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the VH
  • the 100th amino acid residue is selected from alanine residue, asparagine residue, glycine residue, tyrosine residue, arginine residue, aspartic acid residue, histidine residue, tryptophan residue, and methionine residue.
  • an antibody that binds to FGF23 which includes a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, at least the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the VH
  • the 105th amino acid residue is an alanine residue, a phenylalanine residue, a glycine residue, a histidine residue, an isoleucine residue, a lysine residue, a leucine residue, a methionine residue, a proline residue, a glutamine residue, an arginine residue.
  • An antibody or an antibody fragment thereof that binds to FGF23 substituted with one amino acid residue selected from a valine residue, a tryptophan residue, a tyrosine residue, a threonine residue, an asparagine residue, and a serine residue.
  • the antibody has higher stability at low pH and suppresses antibody degradation compared to antibodies containing a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody has at least the 100th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the VH.
  • the antibody binds to FGF23 in which the amino acid residue is replaced with an alanine residue or a tyrosine residue.
  • low pH refers to weak acidity or acidity with a pH of less than 6, and includes, for example, pH 5, pH 4.5, pH 4, etc., but is not particularly limited.
  • the antibody of the present invention has suppressed decomposition at low pH and has excellent stability compared to antibodies containing a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Show your gender.
  • antibody degradation can be measured by size exclusion chromatography (hereinafter referred to as SEC) or SDS polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as SDS-PAGE). can.
  • the antibody of the present invention degradation of the antibody at low pH is suppressed compared to an antibody containing a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • This can be confirmed, for example, by a method including the following steps (I) to (III), but is not particularly limited to this method.
  • the solvent of the antibody solution containing the antibody of the present invention or the antibody containing the VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is NAP (trademark). Using a column such as No.
  • an antibody solution with pH 4, 4.5, or 5 substituted with an appropriate solvent is prepared.
  • (II) After allowing the antibody solution prepared in (I) above to stand at 40 degrees for 1 month or 2 weeks or at 25 degrees for 3 months, the peak (%) corresponding to the antibody degradation products was detected using SEC. To detect.
  • SEC SEC
  • the peak (%) corresponding to the decomposition product of the antibody detected by SEC in (II) above contains the VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. If the antibody of the present invention is reduced in intensity than the antibody containing VL, or if the density of the band around 40 kDa in SDS-PAGE is lower than that of the antibody containing VL, the concentration of the band near 40 kDa is lower than that of the antibody containing VL, or if the density of the band around 40 kDa is lower than that of the antibody containing VL, If the antibody of the present invention is lower than the antibody containing the VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It can be confirmed that the antibody of the present invention suppresses the decomposition of the antibody at low pH compared to the antibody including the above-menti
  • the peak area ratio (%) of a band corresponding to a degraded product of the antibody (for example, 40 to 60 kDa) detected at a size about 10 to 20 kDa smaller than the peak of the full length of the H chain is , when the antibody of the present invention is lowered than the antibody comprising the VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, It can be confirmed that the antibody of the present invention suppresses the degradation of the antibody at low pH compared to the antibody containing the VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • examples of aspects showing the stability of the antibody of the present invention at low pH include the following. - At a low pH such as pH 4, 4.5 or 5 and at 40 degrees, compared to an antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. After standing for 1 month, 2 weeks, or 3 months at 25 degrees, the density of a band with a molecular weight around 40 kDa as determined by SDS-PAGE has decreased. The density of the band can be evaluated visually.
  • the peak (%) corresponding to the decomposed product of the antibody detected by SEC has decreased.
  • the peak (%) is 5% or more, 10% or more, and 20% compared to the antibody containing the VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the reduction is preferably 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more.
  • a low pH such as pH 4, 4.5 or 5 and at 40 degrees, compared to an antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • H The peak area ratio (%) of a band (eg, 40 to 60 kDa) corresponding to a decomposition product of the antibody detected to be about 10 to 20 kDa smaller than the peak of the full chain length is decreased.
  • the peak area ratio (%) is 5% or more, 10% or more, 20% higher than that of an antibody containing a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the reduction is preferably 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more.
  • One embodiment of the antibody of the present invention includes the above-mentioned antibody further comprising one substitution selected from (a1) to (a4) below.
  • At least one substitution selected from substitution with a histidine residue, substitution of the 57th amino acid residue with a threonine residue, and substitution of the 58th amino acid residue with a phenylalanine residue (a2) Substitution of the 91st amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in VL with a methionine or leucine residue, substitution of the 92nd amino acid residue with a tyrosine residue, substitution of the 94th amino acid residue with a tyrosine residue, at least one substitution selected from the substitution of an amino acid residue with an aspartic acid residue, and the substitution of the 96th amino acid residue with an asparagine residue or an aspartic acid residue; (a3) Substitution of the 28th amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in VL with an aspartic acid residue, substitution of the 29th amino acid residue with a valine residue, and 31st amino acid residue at least one substitution selected from substitution of a threon
  • the antibody of the present invention can improve the FGF23-binding activity and FGF23-neutralizing activity of the antibody by substituting one amino acid residue selected from (a1) to (a4) above.
  • FGF23 neutralizing activity refers to an activity that inhibits a signal generated when FGF23 binds to a receptor. Examples of receptors for FGF23 include a complex between FGFR1 and ⁇ Klotho.
  • the FGF23 neutralizing activity of the antibody of the present invention can be confirmed by the reporter assay (also referred to as promoter assay) described in Nature 2006 Dec 7; 444 (7120). Furthermore, the FGF23 neutralizing activity of the antibody of the present invention can be confirmed by reporter assay using ⁇ Klotho stably expressing HEK293 cells transformed with a luciferase expression vector having a promoter derived from the mouse Egr1 gene.
  • antibodies of the present invention include any one antibody selected from the following (b1) to (b5).
  • antibodies of the present invention include antibodies selected from the following (c1) to (c10), with (c1), (c8), (c9) or (c10) being preferred, and (c1) or (c10) being preferred. c9) is more preferred.
  • (c1) an antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • (c2) an antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • (c5) an antibody comprising a V
  • an Fc region in which amino acid residues are substituted can also be used in order to control binding to FcRn for the purpose of controlling blood half-life.
  • Examples of the Fc region in which amino acid residues are substituted to improve the binding of antibodies to FcRn include any one of the Fc regions (d1) to (d5) below.
  • the Fc region (d1) is preferred.
  • (d1) Fc containing a substitution of the 252nd amino acid residue in the EU index with a tyrosine residue, the 254th amino acid residue with a threonine residue, and the 256th amino acid residue with a glutamic acid residue region
  • (d3) an Fc region containing a substitution of the 308th amino acid residue of the EU index with a proline residue
  • (d4) Fc region containing the substitution of the 250th amino acid residue of the EU index with a glutamine residue and the substitution of the 428th amino acid residue with a leucine residue, and
  • amino acid sequences of heavy chain constant regions containing Fc regions in which amino acid residues have been substituted in order to improve binding of antibodies to FcRn include SEQ ID NOs: 48, 49, 50, Examples include amino acid sequences represented by 51 and 52. Among these, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is preferred.
  • the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment of the present invention that binds to human FGF23 of the present invention may be chemically or Includes genetically engineered antibodies or derivatives of antibody fragments thereof.
  • the antibody or the derivative of the antibody fragment is a monoclonal antibody that binds to human FGF23 of the present invention, or the N-terminal side or C-terminal side of the H chain or L chain of the antibody fragment, an appropriate substituent or side chain in the antibody molecule, or Binding of radioactive isotopes, low-molecular drugs, high-molecular drugs, immunostimulants, proteins, antibody drugs, nucleic acid drugs, etc. to sugar chains etc. by chemical methods [Introduction to Antibody Engineering, Chijinshokan (1994)] It can be manufactured by
  • a DNA encoding a monoclonal antibody that binds to human FGF23 of the present invention or an antibody fragment thereof and a DNA encoding a protein or antibody drug to be bound are ligated and inserted into an expression vector, and the expression vector is inserted into an appropriate host. It can be produced by genetic engineering techniques in which it is introduced into cells and expressed.
  • radioactive isotope examples include 111 In, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, and 211 At. Radioactive isotopes can be directly attached to antibodies, such as by the chloramine T method. Furthermore, a substance that chelates a radioactive isotope may be bound to the antibody. Examples of the chelating agent include 1-isothiocyanatebenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • low-molecular drugs examples include alkylating agents, nitrosoureas, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P-glycoprotein inhibitors, and platinum.
  • Complex derivatives, anticancer drugs such as M-phase inhibitors or kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy Co., Ltd.
  • anticancer drugs examples include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), and doxorubicin.
  • Examples of methods for bonding a low-molecular drug and an antibody include bonding the amino group of the drug and antibody via glutaraldehyde, or bonding the amino group of the drug and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carbodiimide. Examples include a method of binding.
  • polymeric drugs examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene-maleic acid copolymer, polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer, or hydroxypropyl methacrylamide.
  • methods for binding PEG and antibodies include a method of reacting with a PEGylation modification reagent [Bioconjugate Pharmaceuticals, Hirokawa Shoten (1993)].
  • PEGylation modification reagents include modifiers for modifying the ⁇ -amino group of lysine (Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-178926), modifying agents for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (Japanese Unexamined Patent Publication No. 56-23587); (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-117920), or a modifier for the guanidino group of arginine (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-117920).
  • the immunostimulant may be a natural product known as an immunoadjuvant; for example, the immunostimulatory agent may be ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (e.g. lentinan or schizophyllan) or ⁇ -galactosylceramide (KRN7000). ), etc.
  • the immunostimulatory agent may be ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (e.g. lentinan or schizophyllan) or ⁇ -galactosylceramide (KRN7000). ), etc.
  • proteins include cytokines, growth factors, and toxin proteins that activate immunocompetent cells such as NK cells, macrophages, and neutrophils.
  • cytokines or growth factors examples include interferon (hereinafter referred to as IFN)- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL)-2, IL-12, IL-15, IL- 18, IL-21, IL-23, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) or macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • IFN interferon
  • IFN- ⁇ interleukin-2
  • IL-12 interleukin
  • IL-15 interleukin
  • IL-15 interleukin- 18, IL-21
  • IL-23 granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte/macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • examples of the toxin protein include ricin, diphtheria tox
  • antibody drugs include antibodies against antigens that induce apoptosis upon antibody binding, antigens that are involved in tumor pathogenesis, antigens that regulate immune function, and antigens that are involved in angiogenesis at diseased sites.
  • antigens that induce apoptosis upon antibody binding include cluster of differentiation (hereinafter referred to as CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA)-Class II or Ep idermal Growth Factor Receptor (EGFR ), etc.
  • CD cluster of differentiation
  • antigens involved in tumor pathogenesis or antigens of antibodies that regulate immune function include CD4, CD40, CD40 ligand, B7 family molecules (e.g., CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7- H3 or B7-H4), ligands of the B7 family of molecules (e.g. CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 or BTLA), OX-40, OX-40 ligand, CD137, the tumor necrosis factor (TNF) receptor family molecules (e.g.
  • cytokine e.g., IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6 , IL -10, IL-13,
  • Antigens for antibodies that inhibit angiogenesis at lesion sites include, for example, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), angiopoietin, Fibroblast Growth Factor (FGF), EGF, Hepatocyte te Growth Factor (HGF), Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) , Insulin-like Growth Factor (IGF), erythropoietin (EPO), TGF ⁇ , IL-8, ephrin or SDF-1, or their receptors.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • EGF Hepatocyte te Growth Factor
  • HGF Hepatocyte te Growth Factor
  • PDGF Platelet-Derived Growth Factor
  • IGF Insulin-like Growth Factor
  • EPO erythropoietin
  • TGF ⁇ IL-8, ephrin or SDF-1, or their receptors.
  • nucleic acid medicines include medicines containing nucleic acids such as small interference ribonucleic acid (siRNA) or microRNA, which act on living bodies by controlling gene functions.
  • nucleic acids such as small interference ribonucleic acid (siRNA) or microRNA, which act on living bodies by controlling gene functions.
  • siRNA small interference ribonucleic acid
  • microRNA microRNA
  • a conjugate with a nucleic acid drug that suppresses the master transcription factor ROR ⁇ t of Th17 cells can be considered.
  • the drug that binds to the antibody is a drug that is used in ordinary immunological detection or measurement methods.
  • labeled substances include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, or luciferase, luminescent substances such as acridinium ester or lophine, or fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC). Can be mentioned.
  • one embodiment of the present invention is a composition comprising the antibody of the present invention or the antibody fragment.
  • the composition include compositions containing a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or a fragment thereof as an active ingredient.
  • a composition comprising the antibody of the present invention or the antibody fragment can be used to treat human FGF23-related diseases.
  • a therapeutic agent for human FGF23-related diseases is provided, which comprises the antibody of the present invention.
  • the present invention also relates to a method for treating human FGF23-related diseases, which includes administering a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or an antibody fragment thereof.
  • the human FGF23-related disease may be any disease that involves human FGF23 or human FGF23 receptors, such as tumor osteomalacia (TIO), autosomal dominant hypophosphatemic rickets, Osteomalacia (ADHR), X-linked hypophosphatemia (XLH), fibrous dysplasia, McCune-Albright syndrome, autosomal recessive hypophosphatemic rickets/osteomalacia (ARHR), osteoporosis, rickets (including hypophosphatemic rickets and vitamin D-resistant rickets), hypercalcemia, hypocalcemia, ectopic calcification, osteosclerosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, parathyroid glands
  • diseases associated with renal failure and artificial dialysis during renal failure such as hypofunction, pruritus, renal osteodystrophy, dialysis osteopathy, and renal tubular dysfunction.
  • the present invention also provides a method for treating hypophosphatemia found in diseases such as TIO, ADHR, XLH, fibrous dysplasia, McCune-Albright syndrome, and ARHR, which contains a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or a fragment thereof as an active ingredient. It also includes therapeutic agents for symptoms such as bone mineralization deficiency, bone pain, muscle weakness, skeletal deformities, growth disorders, and low 1,25 vitamin D levels.
  • Therapeutic agents containing the antibody or antibody fragment of the present invention may contain only the antibody or antibody fragment as an active ingredient, but usually together with one or more pharmacologically acceptable carriers. It is preferable to provide a pharmaceutical preparation prepared by any method known in the pharmaceutical field.
  • examples include oral administration, and parenteral administration such as intraorally, intratracheally, intrarectally, subcutaneously, intramuscularly, or intravenously, and preferably intravenous administration.
  • parenteral administration such as intraorally, intratracheally, intrarectally, subcutaneously, intramuscularly, or intravenously, and preferably intravenous administration.
  • examples include internal administration.
  • dosage forms include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, and tapes.
  • the dosage or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g/kg to 10 mg/kg per day for adults.
  • composition of the present invention includes a reagent for detecting or measuring FGF23, which contains a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or a fragment thereof.
  • the present invention also relates to a method for detecting or measuring FGF23 using a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or a fragment thereof.
  • methods for detecting or measuring human FGF23 include any known method. Examples include immunological detection or measurement methods.
  • An immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibodies or antigens using labeled antigens or antibodies.
  • Immunological detection or measurement methods include, for example, radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, Western Examples include blotting method or physicochemical method.
  • composition of the present invention includes a diagnostic agent for FGF23-related diseases, which includes a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or a fragment thereof.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing FGF23-related diseases, which includes detecting or measuring FGF23 using a monoclonal antibody that binds to human FGF23 or a fragment thereof. By detecting or measuring human FGF23 using the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment according to the method described above, a disease related to human FGF23 can be diagnosed.
  • biological samples to be detected or measured for human FGF23 may include tissues, cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluids, or culture fluids that may contain human FGF23. There is no particular limitation as long as it is.
  • a diagnostic agent containing the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof may include a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the intended diagnostic method.
  • Reagents for performing antigen-antibody reactions include buffers, salts, and the like.
  • Detection reagents include reagents used in conventional immunological detection or measurement methods, such as a labeled secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody or its antibody fragment, or a substrate compatible with a label.
  • One embodiment of the present invention relates to the use of anti-human FGF23 monoclonal antibodies or antibody fragments for the production of therapeutic or diagnostic agents for FGF23-related diseases. Further, one embodiment of the present invention relates to a method for treating or diagnosing FGF23-related diseases.
  • Human FGF23 as an antigen is obtained by introducing an expression vector containing a cDNA encoding full length human FGF23 or a partial length thereof into Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc. be able to.
  • human FGF23 can also be obtained by purifying human FGF23 from various human cell lines, human cells, human tissues, etc. that express large amounts of human FGF23. Further, these human cell lines, human cells, human tissues, etc. can also be used as antigens as they are.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of human FGF23 can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • a known tag such as FLAG or His may be added to the C-terminus or N-terminus of human FGF23 or a synthetic peptide having a partial sequence of human FGF23.
  • Human FGF23 used in the present invention can be obtained by methods described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), etc.
  • the human FGF23-encoding DNA can be expressed and produced in a host cell using, for example, the following method.
  • a recombinant vector is constructed by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding human FGF23 downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant that produces the polypeptide can be obtained.
  • Any expression vector can be used as long as it is capable of autonomous replication in the host cell used or integration into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a location where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can be done.
  • the host cell any cell that can express the gene of interest can be used, such as microorganisms belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells.
  • the recombinant vector When a prokaryote such as E. coli is used as a host cell, the recombinant vector is capable of autonomous replication in the prokaryote, and at the same time contains a promoter, a ribosome binding sequence, a DNA containing a portion encoding human FGF23, and a transcription termination sequence.
  • a vector containing the following is preferred.
  • the recombinant vector does not necessarily have a transcription termination sequence, it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls a promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • bases can be substituted so as to become optimal codons for expression within the host, thereby improving the production rate of the target human FGF23. Can be done.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell used, such as pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 ( pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-8 (manufactured by Qiagen), pKYP10 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad.
  • Any promoter may be used as long as it can function in the host cell used.
  • promoters derived from E. coli or phage such as the trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, or T7 promoter.
  • examples include artificially designed promoters such as a tandem promoter in which two Ptrps are arranged in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, or a let I promoter.
  • Examples of host cells include E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, or E. coli DH5 ⁇ .
  • any method that introduces DNA into the host cell to be used can be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells, such as pcDNAI, pCDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 [Japanese Patent Publication No. 3] -22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (manufactured by Invitrogen) , pcDNA3.1 (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells; for example, the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV), the early promoter of SV40, and the promoter of retroviruses. , metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer. Furthermore, the enhancer of the human CMV IE gene may be used together with the promoter.
  • IE immediate early
  • CMV cytomegalovirus
  • host cells examples include human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells [Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci.,60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.
  • CHO cells CHO/DG44 cells deficient in the dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as dhfr) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)]
  • CHO-K1 ATCC CCL-61
  • DUkXB11 ATCC CCL-9096
  • Pro-5 ATCC CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat#11619
  • Pro-3 rat myeloma cells YB2/3HL. P2.
  • mice 20 also referred to as YB2/0
  • mouse myeloma cells NSO mouse myeloma cells SP2/0-Ag14
  • Syrian hamster cells BHK or HBT5637 Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-000299.
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used, such as electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], calcium phosphate method. (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075) or the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell carrying a recombinant vector incorporating the DNA encoding human FGF23 obtained as described above is cultured in a medium, and the human FGF23 is produced and accumulated in the culture solution.
  • Human FGF23 can be produced by culturing and collecting from the culture solution.
  • the transformant can be cultured in a medium according to a conventional method used for culturing hosts.
  • human FGF23 When expressed in cells derived from eukaryotes, human FGF23 with added sugars or sugar chains can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used to culture a microorganism transformed with a recombinant vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Examples of media for culturing transformants obtained using animal cells as hosts include the commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science , 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or Iscove's Modified Examples include Dulbecco's Medium (IMDM) medium and a medium prepared by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • IMDM Dulbecco's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40°C, and the presence of 5% CO2 .
  • an antibiotic such as kanamycin or penicillin may be added to the medium as necessary during culturing.
  • Methods for expressing the gene encoding human FGF23 include, for example, in addition to direct expression, methods such as secretory production or fusion protein expression [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] are available. It will be done.
  • Examples of methods for producing human FGF23 include a method for producing it within a host cell, a method for secreting it outside the host cell, and a method for producing it on the outer membrane of the host cell. By changing the structure, an appropriate method can be selected.
  • human FGF23 When human FGF23 is produced within host cells or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Rowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. ., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], by using the method described in Japanese Patent Application Publication No. 05-336963 or International Publication No. 94/23021, etc. Human FGF23 can be actively secreted outside host cells. Furthermore, the production amount of human FGF23 can also be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-227075).
  • the obtained human FGF23 can be isolated and purified, for example, as follows.
  • human FGF23 When human FGF23 is expressed in a dissolved state within the cells, the cells are collected by centrifugation after the completion of culture, suspended in an aqueous buffer, and then homogenized using an ultrasonicator, French press, Manton-Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. Disrupt the cells to obtain a cell-free extract.
  • the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract is extracted using conventional protein isolation and purification methods, such as solvent extraction, salting out with ammonium sulfate, desalting, precipitation with organic solvents, and diethylaminoprotein extraction.
  • a purified sample can be obtained by using either alone or in combination.
  • human FGF23 is expressed by forming an insoluble form within cells, the cells are collected and disrupted in the same manner as above, and then centrifuged to recover the insoluble form of human FGF23 as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble form of human FGF23 is solubilized with a protein denaturing agent. After returning the human FGF23 to its normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • human FGF23 or a derivative such as a glycoform thereof When human FGF23 or a derivative such as a glycoform thereof is secreted extracellularly, the human FGF23 or a derivative such as a glycoform thereof can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction is obtained by treating the culture using techniques such as centrifugation in the same manner as above, and a purified sample can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as above. can.
  • human FGF23 used in the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • chemical synthesis can be performed using a peptide synthesizer manufactured by Advanced Chemtech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instruments, Synthecell-Vega, Perceptive, or Shimadzu Corporation. You can also.
  • mice, rats, or hamsters aged 3 to 20 weeks are immunized with the antigen obtained in (1).
  • a mouse FGF23 knockout mouse can also be used as an immunized animal.
  • Immunization is carried out by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal together with a suitable adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and Bordetella pertussis vaccine.
  • a suitable adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and Bordetella pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (keyhole limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks.
  • Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody-producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen
  • the spleen is shredded and loosened, centrifuged, and red blood cells are removed to obtain antibody-producing cells for fusion.
  • myeloma cells established cell lines obtained from mice are used, such as 8-azaguanine-resistant mouse (BALB/c-derived) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3- U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14 ( SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123, 1548 (1979)] or P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] etc. are used.
  • the myeloma cells were passaged in normal medium (RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine) and subcultured into normal medium 3-4 days before cell fusion. On the day of fusion, ensure a cell count of 2 x 10 7 or more.
  • normal medium RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine
  • HAT medium normal medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin. This suspension is cultured for 7-14 days at 37° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • a portion of the culture supernatant is removed, and a cell group that reacts with antigens containing human FGF23 and does not react with antigens that do not contain human FGF23 is selected using a hybridoma selection method such as binding assay described below.
  • cloning is performed by the limiting dilution method, and hybridomas with stable and strong antibody titers are selected as monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the supernatant is removed by centrifugation, suspended in Hybridoma SFM medium, and cultured for 3 to 7 days. It is also possible to obtain a purified monoclonal antibody by centrifuging the obtained cell suspension, purifying the obtained supernatant using a protein A column or protein G column, and collecting the IgG fraction. Note that 5% Daigo GF21 can also be added to the Hybridoma SFM medium.
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a subclass typing kit. Quantification of protein amount is calculated by the Lowry method or absorbance at 280 nm.
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant, or purified monoclonal antibody as a first antibody is dispensed and reacted.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme reagent or the like as a second antibody is dispensed and reacted.
  • a substrate is added and the extinction coefficient of each well is measured using a plate reader to select a monoclonal antibody that specifically reacts with human FGF23.
  • a genetically recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which DNA encoding CH and CL of human antibodies has been integrated. It can be constructed by cloning DNAs encoding CH and CL of antibodies, respectively.
  • CH and CL of any human antibody can be used.
  • CH of the ⁇ 1 subclass and CL of the ⁇ class of human antibodies are used.
  • cDNA is used as the DNA encoding CH and CL of human antibodies
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any animal cell expression vector can be used as long as it can integrate and express a gene encoding the C region of a human antibody. For example, pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Promoters and enhancers of expression vectors for animal cells include the SV40 early promoter [J. Biochem., 101, 1307 (1987)] and the Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 ( 1987)] or immunoglobulin heavy chain promoters [Cell, 41, 479 (1985)] and enhancers [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors are easy to construct, easy to introduce into animal cells, and have a well-balanced expression level of antibody H chain and L chain in animal cells. From the point of view of Immunol. Methods, 167, 271 (1994)], but a type in which the antibody H chain and L chain are present on separate vectors can also be used.
  • vectors for expressing tandem recombinant antibodies pKANTEX93 (International Publication No. 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)], etc. are used.
  • mRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to create a cDNA library.
  • a recombinant phage or a recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated using DNA encoding the C region or V region of a mouse antibody as a probe, respectively.
  • the entire nucleotide sequence of the VH or VL of the mouse antibody of interest on the recombinant phage or plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of the VH or VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • the non-human animal used to produce hybridoma cells that produce non-human antibodies is a mouse, rat, hamster, rabbit, etc., but any animal can be used as long as it is possible to produce hybridoma cells.
  • RNA from hybridoma cells use the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)] or a kit such as RNA easy kit (manufactured by Qiagen).
  • mRNA can also be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation (registered trademark) Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification (registered trademark) Kit (manufactured by Pharmacia).
  • kit such as Fast Track mRNA Isolation (registered trademark) Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification (registered trademark) Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector that can incorporate cDNA synthesized using mRNA extracted from hybridoma cells as a template can be used as long as it can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ZAPII (Stratagene)
  • ⁇ gt10, ⁇ gt 11 [DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)]
  • Lambda BlueMid (Clontech), ⁇ ExCell, pT7T3-18U (Pharmacia)
  • pCD2 Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)
  • pUC18 Gene , 33, 103 (1985)
  • E. coli that can introduce, express, and maintain the cDNA library can be used as the E. coli strain into which the cDNA library constructed using phage or plasmid vectors can be introduced.
  • E. coli strain into which the cDNA library constructed using phage or plasmid vectors can be introduced.
  • XL1-Blue MRF' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • primers are prepared and cDNA synthesized from mRNA or a cDNA library is used as a template to perform the Polymerase Chain Reaction method [hereinafter referred to as PCR method], Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). ), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)], cDNA encoding VH or VL can also be prepared.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction method
  • telomere sequence analysis After cutting the selected cDNA with an appropriate restriction enzyme, etc., it is cloned into a plasmid such as pBluescript SK(-) (manufactured by Stratagene), and the base sequence of the cDNA is determined by a commonly used base sequence analysis method. .
  • base sequence analysis for example, after performing a reaction such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], ABI PRISM3700 (manufactured by PE Biosystems) or A. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (manufactured by Pharmacia) is used.
  • the complete amino acid sequences of VH and VL are estimated from the determined base sequences, and compared with the complete amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] This confirms whether the obtained cDNA encodes the complete amino acid sequences of the antibody VH and VL, including the secretion signal sequence. Regarding the complete amino acid sequences of the VH and VL of the antibody, including the secretion signal sequence, compare them with the complete amino acid sequences of the VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.
  • Human chimeric antibody expression vectors can be constructed by cloning cDNAs encoding the VH or VL of non-human antibodies, respectively.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid
  • VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are placed upstream of the respective genes encoding CH or CL of the human antibody in the recombinant antibody expression vector obtained in (1) so that they are expressed in an appropriate form. Clone and construct a human chimeric antibody expression vector.
  • the cDNA encoding the non-human antibody VH or VL is amplified by PCR using synthetic DNA having recognition sequences for appropriate restriction enzymes at both ends, and the recombinant antibody expression vector obtained in (1) is obtained. It can also be cloned into.
  • a cDNA encoding the VH or VL of a humanized antibody can be constructed as follows.
  • the amino acid sequences of the FRs of the VH or VL of the human antibody are selected, respectively, into which the amino acid sequences of the CDRs of the VH or VL of the non-human antibody are to be transplanted.
  • Any amino acid sequence of the selected FR can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • the amino acid sequences of human antibody FRs registered in databases such as Protein Data Bank, or the common amino acid sequences of each subgroup of human antibody FRs [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services ( 1991)] etc.
  • an FR amino acid sequence is selected that has as high a homology as possible (at least 60% or more) to the FR amino acid sequence of the VH or VL of the original antibody.
  • the amino acid sequences of the CDRs of the original antibody are transplanted to the amino acid sequences of the FRs of the VH or VL of the selected human antibody, respectively, to design the amino acid sequences of the VH or VL of the humanized antibody, respectively.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence taking into consideration the frequency of codon usage found in the base sequence of the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] to create a humanized antibody.
  • a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is designed, respectively.
  • each amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK(-) (Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired humanized antibody is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is obtained.
  • a full-length VH and full-length VL each synthesized as a single long-strand DNA based on the designed DNA sequence can be used instead of the above PCR amplification product.
  • cDNA encoding the VH or VL of the humanized antibody can be easily transferred to the recombinant antibody expression vector obtained in (1). can be cloned into.
  • amino acid residues that are directly involved in binding to the antigen, amino acid residues that interact with amino acid residues in the CDRs, and amino acid residues in the FRs of the human antibody VH and VL are Reduced antigen binding by maintaining the tertiary structure and identifying amino acid residues that are indirectly involved in binding to the antigen, and substituting those amino acid residues with amino acid residues from the original non-human antibody. Activity can be increased.
  • Amino acid residues in the FRs of VH and VL of a human antibody can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using synthetic DNA for modification.
  • the base sequence of the amplified product after the PCR reaction is determined by the method described in (2) to confirm that the desired modification has been made.
  • a humanized antibody expression vector can be constructed by cloning the cDNA encoding each of the following.
  • an antibody expression vector in which the H chain (or VH) and L chain (or VL) derived from two different types of antibodies are recombined may be used.
  • a vector for expressing a VL-substituted chimeric antibody can be constructed.
  • Any host cell that can express the recombinant antibody can be used as the host cell into which the expression vector is introduced, but for example, COS-7 cells [American Type Culture Collection (ATCC) number: CRL1651] can be used. [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)].
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant were measured using the enzyme-linked immunosorbent method [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a transformed strain that stably expresses the recombinant antibody can be obtained by introducing the recombinant antibody into a suitable host cell.
  • An electroporation method Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990) is used to introduce the expression vector into host cells.
  • any host cell that can express the genetically recombinant antibody can be used.
  • CHO-K1 ATCC CCL-61
  • DUKXB11 ATCC CCL-9096
  • Pro-5 ATCC CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat #11619
  • mice 20 (ATCC number: CRL1662, or also referred to as YB2/0), mouse myeloma cell NS0, mouse myeloma cell SP2/0-Ag14 (ATCC number: CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cell (ATCC number: CRL1580), dihydro CHO cells (CHO/DG44 cells) lacking the folate reductase gene (dihydroforate reductase (hereinafter referred to as dhfr)) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)] are used.
  • dhfr dihydro CHO cells
  • proteins such as enzymes involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, sugar chain modification in which the 1st position of fucose is ⁇ -linked to the 6th position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain.
  • Host cells with reduced or deleted activity of proteins such as enzymes involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus such as CHO with a deletion of the ⁇ 1,6-fucosyltransferase gene.
  • Cells International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 02/31140
  • Lec13 that has acquired lectin resistance [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)], etc. can also be used.
  • a transformed strain that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing it in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418). (National Patent Publication No. 2-257891).
  • Media for animal cell culture include RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), or Hybridoma SFM medium (manufactured by Invitrogen). (manufactured by S.A. Co., Ltd.), or a medium prepared by adding various additives such as FBS to these mediums. By culturing the obtained transformed strain in a medium, the recombinant antibody is expressed and accumulated in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like. Furthermore, the expression level of the recombinant antibody produced by the transformed strain can be improved by using a dhfr gene amplification system (Japanese Patent Publication No. 2-257891).
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformed strain using a protein A column [Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. It is also possible to combine methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the H chain, L chain, or entire antibody molecule of a purified recombinant antibody can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting method [Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
  • Activity evaluation of purified monoclonal antibody or antibody fragment thereof Activity evaluation of the purified monoclonal antibody of the present invention or antibody fragment thereof can be performed as follows.
  • the binding activity of the antibody of the present invention or the antibody fragment to human FGF23 can be measured using an ELISA method, a surface plasmon resonance method, or the like.
  • the human FGF23 neutralizing activity of the antibody of the present invention or its antibody fragment can be measured using the reporter assay described above.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention can be used to treat diseases related to human FGF23.
  • Therapeutic agents containing the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention may contain only the antibody or antibody fragment as an active ingredient, but usually include one or more pharmacologically acceptable carriers. It is provided as a pharmaceutical preparation prepared by mixing together with the pharmaceutical preparation by a method known in the technical field of pharmaceutical science.
  • Examples of the administration route include oral administration, and parenteral administration such as intraoral, intratracheal, intrarectal, subcutaneous, intramuscular, or intravenous administration.
  • Examples of dosage forms include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, and tapes.
  • Preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups may contain water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid. It is manufactured using preservatives such as esters or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules may contain excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxyl, etc. It is manufactured using additives such as a binder such as propyl cellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxyl, etc. It is manufactured using additives such as a binder such as propyl cellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin.
  • Preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • Injectables are manufactured using a carrier consisting of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared with carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • the spray is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and respiratory tract mucous membranes, disperses the monoclonal antibody of the present invention or its antibody fragment as fine particles, and facilitates absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • the components exemplified as additives can be added in formulations suitable for oral administration.
  • Method for diagnosing diseases using the anti-human FGF23 monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention Diagnosis of human FGF23-related diseases by detecting or measuring human FGF23 using the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment Can be done.
  • Diagnosis of human FGF23-related diseases can be performed, for example, by detecting or measuring human FGF23 present in the patient's body using immunological techniques.
  • An immunological method is a method of detecting or measuring the amount of antibodies or antigens using labeled antigens or antibodies.
  • a radioactive substance-labeled immunoantibody method an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a luminescence immunoassay, a Western blotting method, a physicochemical method, or the like is used.
  • an antigen or a cell expressing the antigen is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and further reacted with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or the antibody fragment. Afterwards, measure using a scintillation counter.
  • Enzyme immunoassay is performed by, for example, reacting an antigen or cells expressing the antigen with the antibody of the present invention or its antibody fragment, and then reacting it with an anti-immunoglobulin antibody or binding fragment labeled with an enzyme or the like. , add the substrate, and measure the absorbance of the reaction solution using an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used.
  • a label used in enzyme immunoassay a known enzyme label [Enzyme Immunoassay, Igaku Shoin (1987)] can be used.
  • an alkaline phosphatase label, a peroxidase label, a luciferase label, a biotin label, or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method in which an antibody is bound to a solid phase, an antigen to be detected or measured is trapped, and a second antibody is reacted with the trapped antigen.
  • two types of antibodies or antibody fragments that recognize the antigen to be detected or measured and have different antigen recognition sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is plated in advance (for example, 96 Then, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the sandwich ELISA method As the antibody used in the sandwich ELISA method, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab' or F(ab) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or antibody fragment.
  • Fluorescence immunoassay is measured using the method described in literature [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)], etc.
  • a label used in the fluorescence immunoassay a known fluorescent label [Fluorescent antibody method, Soft Science Co., Ltd. (1983)] can be used.
  • FITC or RITC is used.
  • the luminescence immunoassay method is measured by the method described in the literature [Bioluminescence and Chemiluminescence Clinical Examination 42, Hirokawa Shoten (1998)]. Labels used in the luminescent immunoassay include known luminescent labels, such as acridinium ester or lophine.
  • Western blotting involves fractionating antigens or antigen-expressing cells using SDS (sodium dodecyl sulfate)-PAGE (polyacrylamide gel) [Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], and then dividing the gel. Blotting is performed on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or nitrocellulose membrane, and the membrane is reacted with an antibody or antibody fragment that recognizes the antigen, and the antibody is then labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label. The measurement is performed by visualizing the label after reacting with a mouse IgG antibody or binding fragment.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PAGE polyacrylamide gel
  • the physicochemical method is performed, for example, by binding the antigen human FGF23 with the monoclonal antibody of the present invention or its antibody fragment to form an aggregate, and detecting this aggregate.
  • a physicochemical method a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, or a latex immunoturbidimetric method [Recommendation of Clinical Testing Methods, Kanehara Publishing (1998)], etc. can also be used.
  • Latex immunoturbidimetry uses a carrier such as polystyrene latex with a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m sensitized with antibodies or antigens, and when an antigen-antibody reaction is caused by the corresponding antigen or antibody, the Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration in the test sample is measured.
  • a carrier such as polystyrene latex with a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m sensitized with antibodies or antigens
  • Example 1 Detection of degraded product of antibody A
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the anti-human FGF23 antibody described in WO 2008/099969 is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 2. Describe it.
  • a human IgG1 antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 will be referred to as antibody A.
  • Antibody A was prepared in the same manner as in Example 2, and the solvent of the antibody solution was replaced with a pH 4 solvent containing 10mM Sodium L-glutamate, 262mM D-Sorbitol, and 0.05mg/mL Polysorbate 80.
  • the obtained antibody solution was allowed to stand at 40 degrees for one month (hereinafter referred to as 1M sample at 40 degrees) or at -80 degrees for one month and then thawed (hereinafter referred to as initial sample).
  • band A located at a size approximately 10 kDa smaller than the H chain around 50 kDa was significantly darker in the 40° 1M sample than in the initial sample, and this correlated with The H chain band had become thinner. Therefore, it was suggested that band A is a decomposition product band of H chain, and that the 40° 1M sample is decomposed by H chain. As a result of analyzing the N-terminal amino acid sequence of band A, it was confirmed that it was cleaved at position 99D and position I of the heavy chain variable region of antibody A.
  • Example 2 Preparation of I100 modified antibody Regarding antibody A, an antibody was prepared in which I, the 100th amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in VH, was replaced with the amino acid residue listed in Table 1. It was produced by the method described below. Hereinafter, some or all of the antibodies listed in Table 1 will also be referred to as I100 modified antibodies.
  • the gene fragment corresponding to the base sequence encoding the amino acid sequence of the VH of each antibody listed in Table 1 was introduced into an expression vector using the seamless cloning method (contracted to Fasmac) to create the necessary plasmid.
  • As the H chain expression vector pCI-OtCAG_hG1 vector having a signal sequence and human ⁇ chain constant region sequence was used. In all clones, human IgG1 was used for the heavy chain constant region.
  • amino acid sequence of the VL of antibody A (SEQ ID NO: 2) was used as the amino acid sequence of the VL of the I100 modified antibody.
  • L chain expression vector pCI-OtCMV_hK vector having a signal sequence and human ⁇ chain constant region sequence was used.
  • the completed plasmid was prepared in large quantities using QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN).
  • each antibody was transiently expressed using Expi293 Expression System Kit (Life Technologies).
  • the method for introducing the plasmid was in accordance with the attached document.
  • the L chain expression vector and the H chain expression vector were mixed and introduced at a ratio of 1:2.
  • the cells after the plasmid introduction were cultured for 3 days under the conditions of 37 degrees, 5% CO 2 and 125 rpm. Thereafter, the cell culture suspension was centrifuged, and the culture supernatant was collected through a 0.2 ⁇ m filter (Thermo Scientific). Purified antibodies were obtained from the culture supernatant by affinity purification using MabSelect SuRe (GE Healthcare).
  • the obtained antibody solution was neutralized by adding 1/10 amount of neutralization buffer (1M phosphoric acid-NaOH, pH 7.0), and the solvent of the antibody solution was replaced with PBS using NAP25 (GE Healthcare).
  • the antibody solution after buffer replacement was concentrated by ultrafiltration using Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units (Millipore), and absorbance A280 was measured using Nanodrop (Thermo Scientific) to determine the concentration of the antibody solution. Measurements and adjustments were made.
  • the extinction coefficient is C. N. It was calculated from the amino acid sequence of each humanized antibody according to the method of Pace et al. (1995, Prot. Sci. 4:2411-2423).
  • Example 3 Evaluation of antigen binding activity of I100 modified antibody
  • the I100 modified antibody and A antibody obtained in Example 2 were evaluated against Recombinant Human FGF-23 (R&D Systems, Cat No. 2604-FG-025/CF). Binding activity was measured as follows.
  • the antibody prepared at 1 ⁇ g/mL was added to the flow cell on which the Anti-human IgG antibody was immobilized at a flow rate of 10 ⁇ L/min for 30 seconds.
  • Recombinant Human FGF-23 which was diluted stepwise from 130.5 ng/mL to 5 concentrations, was monitored at a flow rate of 30 ⁇ L/min for 2 minutes for binding reaction and 10 minutes for dissociation reaction. A single cycle method was used for the measurement.
  • the obtained sensorgrams were analyzed using Bia Evaluation Software (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.), and the kinetic constants of each antibody were calculated.
  • A_1, A_2, and A_3 in Table 3 all refer to antibody A.
  • antibodies I100W, I100S, I100K, and I100E have lower antigen-binding activity than antibody A, and that antibodies I100T, I100Q, I100M, and I100F have antigen-binding activity comparable to that of antibody A. did it.
  • Example 4 Confirmation of the degradation suppressing effect of the I100 modified antibody Regarding the I100 modified antibody and A antibody obtained in Example 2, the solvent of the antibody solution was mixed with 10 mM Sodium L-glutamate and 262 mM D using NAP25 (GE Healthcare). - Substituted with a pH 4 solvent containing Sorbitol. The obtained antibody solution was allowed to stand at 40 degrees for one month or two weeks, and then subjected to SDS-PAGE under reducing conditions. Table 4 shows the results of comparing the density of the band around 40 kDa, which corresponds to the decomposed product of the antibody, between each antibody and the A antibody. When the density of the band in the modified antibody was lower than that in the A antibody, it was determined that the modified antibody suppressed the degradation compared to the A antibody.
  • Example 5 Thermostability evaluation of antibody A and I100 modified antibody The thermal stability of each antibody domain (Fab, CH2, CH3) of antibody A and I100 modified antibody was evaluated by differential scanning calorimetry (hereinafter referred to as DSC). It was evaluated using the method described in
  • the measurement sample was prepared with D-PBS buffer to a concentration of 0.5 mg/mL.
  • Micro Cal VP-Capillary DSC system (Spectris Co., Ltd.) was used.
  • measurements were performed using a program that raised the temperature from 25 degrees to 100 degrees per minute. The results obtained are shown in Tables 5 and 6.
  • I100A, I100G, I100N, and I100R were detected with the Fab peak and CH2 peak overlapping, and the thermostability of Fab was improved by 3 to 8 degrees compared to antibody A. From the above, it was confirmed that I100A, I100G, I100N, and I100R have higher structural stability than antibody A.
  • Example 6 Production of D105 modified antibody
  • the 105th D of the amino acid sequence of VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of antibody A was replaced with the amino acid residue shown in Table 7.
  • An antibody hereinafter, part or all of the antibody will also be referred to as a D105 modified antibody
  • Example 7 Evaluation of antigen binding activity of D105 modified antibody The binding activity of the D105 modified antibody obtained in Example 6 to Recombinant Human FGF-23 (R&D Systems, Cat No. 2604-FG-025/CF) was evaluated. It was measured in the same manner as in Example 3. The results obtained are shown in Tables 8 and 9. Both A_1 and A_2 in Table 8 are the measurement results for antibody A.
  • Example 8 Confirmation of the decomposition-inhibiting effect of the D105 modified antibody Regarding the D105 modified antibody obtained in Example 6, the decomposition-inhibiting effect of the antibody was confirmed in the same manner as in Example 4. Note that the antibody solution was allowed to stand at 40 degrees for two weeks.
  • I100 modified antibody and D105 modified antibody against human FGF23 I100 modified antibody and D105 modified antibody (I00A , I100N, I100G, I100Y, I100R, I100D, I100H, D105A, D105F, D105G, D105H, D105I, D105K, D105L, D105M, D105P, D105Q, D105R, D105V, D105W, D105Y, D1 05T, D105N, and D105S) 24 types
  • the neutralizing activity against human FGF23 was measured using the method described below.
  • mEgr1/ ⁇ KL/HEK293 ⁇ Klotho stably expressing HEK293 cells transformed with a luciferase expression vector having a promoter derived from the mouse Egr1 gene was used.
  • mEgr1/ ⁇ KL/HEK293 was produced by a method similar to that described in Nature 2006 Dec 7; 444 (7120).
  • the antibody was diluted to 100 ⁇ g/ml with a buffer containing 10 mM Sodium L-glutamate and 262 mM D-Sorbitol, and used as a stock solution.
  • a buffer containing 10 mM Sodium L-glutamate and 262 mM D-Sorbitol As a standard culture medium for mEgr1/ ⁇ KL/HEK293, DMEM medium (Thermofisher) supplemented with 10 (vol%) FetalBovine Serum (Thermofisher) and 1 (vol%) penicillin/streptomycin was used.
  • the maximum concentration was a concentration obtained by diluting the antibody 1000 times with the above standard culture medium (100 ng/ml), and an 8-step dilution series with ⁇ 10 times dilution was prepared and used for evaluation.
  • the evaluation was performed using a 384-well plate. The number of cells was 2000 cells/well, and the concentration of FGF23 added was 4 ng/ml. The same FGF23 as in Example 3 was used after being diluted with a standard culture medium.
  • Example 10 Production of antibody with modified heavy chain constant region of antibody A An antibody with amino acid modified heavy chain constant region of antibody A (hereinafter referred to as CH modified antibody) was produced by the method described below.
  • the CH-modified antibody replaces the CH (human IgG1) of antibody A with human IgG2, IgG2AAAS (for the Fc of human IgG2, valine at EU index position 234 is changed to alanine, glycine at position 237 is changed to alanine, and proline at position 331 is changed to human IgG2 modified antibody with serine substitution) (Michael, S., et al., J.Immunol., 1997, 159: 3613; J.Immunol.
  • IgG4PE_R409K human IgG4 Fc isotype antibody in which CH is substituted for serine at position 228 of the EU index, leucine at position 235 is replaced with glutamic acid, and arginine at position 409 is replaced with CH (human IgG4 modified antibody) (International Publication No. 2006/033386).
  • Fc regions (10-1) to (10-5) which are known to improve the binding activity to human and monkey FcRn, are added to the Fc region of each of the A antibody or three isotype antibodies of the A antibody. A total of 23 types of antibodies with amino acid modifications were produced.
  • the CH-modified antibody in which the CH of antibody A is replaced with the CH of human IgG2 will be referred to as the A_G2 antibody.
  • CH modified antibodies substituted with other subclasses are also described.
  • CH modified antibodies in which the above amino acid modifications (10-1) to (10-5) are added to the Fc region of antibody A are referred to as A_YTE antibody, A_QL antibody, A_A antibody, A_P antibody, and A_LS antibody, respectively.
  • CH modified antibodies obtained by adding the above amino acid modifications (10-1) to (10-5) to the A_G2 antibody, A_G2AAS antibody, and A_G4PE_R409K antibody are also described.
  • the plasmid containing the base sequence encoding the amino acid sequence of the variable region and constant region of the H chain of antibody A prepared in Example 2 was treated with restriction enzymes with NheI and BamHI to prepare a vector fragment excluding the constant region portion. . Based on the plasmid fragment, a gene fragment containing the base sequence encoding the amino acid sequence of the above 23 types of CH modified antibodies was synthesized at Fasmac and introduced into an appropriate expression vector to produce the necessary plasmid. . Antibodies were prepared in the same manner as in Example 2 using the obtained plasmids.
  • Example 11 Measurement of binding activity to FcRn of antibody A and CH-modified antibody of antibody A.
  • Antibody A and CH-modified antibody of antibody A produced in Examples 2 and 10 were measured by the method described below.
  • the binding activity to human and monkey FcRn was measured using Biacore.
  • HBS-EP+ Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd., Cat. No. BR-1006-69
  • HBS-EP+ Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd., Cat. No. BR-1006-69
  • Each antibody was buffer exchanged using NAP25 into HBS-EP+ at pH 6 as described above.
  • Human FcRn and monkey FcRn were also diluted using HBS-EP+ pH 6.
  • Human FcRn and monkey FcRn used in the experiment were produced as follows.
  • Human FcRn (only amino acids 1 to 297 of the full-length amino acid sequence of human FcRn are used to express it as a soluble molecule) and human FcRn-His tag with six histidines added to its C-terminus (
  • a DNA sequence encoding human ⁇ 2 microglobulin (amino acid sequence: SEQ ID NO: 54) and human ⁇ 2 microglobulin (amino acid sequence: SEQ ID NO: 55) was inserted into a mammalian cell expression plasmid downstream of the CMV promoter. Using the plasmid, transient expression was performed using the Expi293 Expression System Kit (Life Technologies) in the same manner as in Example 2.
  • Monkey FcRn (only amino acids 1 to 297 of the full-length amino acid sequence of monkey FcRn are used to express it as a soluble molecule) and monkey FcRn-His tag with six histidines added to its C-terminus ( Amino acid sequence: SEQ ID NO: 56) and monkey ⁇ 2 microglobulin (amino acid sequence: SEQ ID NO: 57) were also transiently expressed in the same manner as human FcRn-His tag.
  • Tetra His Antibody BSA Free (QIAGEN) was immobilized on a CM5 sensor chip (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd., Cat. No. BR100530). Human FcRn and monkey FcRn adjusted to 10 ⁇ g/mL were added to a flow cell on which Tetra His Antibody BSA Free was immobilized at a flow rate of 10 ⁇ L/min for 120 seconds. Next, each Fc-modified antibody was prepared stepwise at 5 concentrations by 3-fold dilution from 450 ⁇ g/mL, and the binding reaction was monitored for 2 minutes and the dissociation reaction was monitored for 5 minutes at a flow rate of 30 ⁇ L/min.
  • Example 12 Preparation of CH modified antibodies of I100 and D105 modified antibodies Among the I100 and D105 modified antibodies that were confirmed to suppress antibody degradation more than antibody A in Example 4 and Example 8, D105N , I100A, I100H, and I100Y antibodies, CH modified antibodies with the following amino acid modifications (12-1) to (12-5) were produced by the method described below.
  • CH modified antibodies in which the above amino acid modifications (12-1) to (12-5) have been made are referred to as D105N_YTE, D105N_G2_YTE, D105N_G2_LS, D105N_G4PE_R409K_P, and D105N_G4PE_R409K_LS antibodies, respectively. Similar descriptions are given for other antibodies.
  • the amino acid sequences of CH of the CH modified antibodies in which the above amino acid modifications (12-1) to (12-5) were carried out are SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, and SEQ ID NO: 52, respectively. Describe it in
  • the plasmid produced in Example 10 was treated with restriction enzymes Bstz17I and NheI to prepare a vector fragment from which the variable region portion was removed. Based on the plasmid fragment, a gene fragment containing the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the VH of antibodies D105N, I100A, I100H, and I100Y was synthesized at Fasmac and introduced into an appropriate expression vector to produce the necessary A plasmid was created. Each antibody was prepared in the same manner as in Example 2 using the obtained plasmids.
  • Example 13 Measurement of FGF23 neutralizing activity of heavy chain constant region modified antibodies The FGF23 neutralizing activity of the 20 types of CH modified antibodies prepared in Example 12 was measured in the same manner as in Example 9. The results obtained are shown in Table 14.
  • antibodies with the same variable region amino acid sequence exhibited similar FGF23 neutralizing activity even if the constant region amino acid sequence was changed. From the above, it was confirmed that the amino acid modification of the heavy chain constant region of each antibody did not affect the FGF23 neutralizing activity of the antibody.
  • Example 14 Production of modified antibodies that improve antigen-binding activity
  • Abwiz Bio conducted an affinity test using a phage display method. Maturation was performed to obtain the following amino acid sequence information (14-1) to (14-9).
  • VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the 50th amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is L, the 54th amino acid is W, and the 55th amino acid is VH (J2H2B9_A, amino acid sequence: SEQ ID NO: 39) in which the 57th amino acid is replaced with H, the 57th amino acid is replaced with T, the 58th amino acid is replaced with F, and the 100th amino acid is replaced with A.
  • VH a VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the 50th amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is V
  • the 54th amino acid is F
  • the 55th amino acid is VH (J2H2E9_A, amino acid sequence: SEQ ID NO: 40) in which C is substituted
  • the 57th amino acid is substituted with F
  • the 58th amino acid is substituted with V
  • the 100th amino acid is substituted with A.
  • VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 the 51st amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is L, the 54th amino acid is W, and the 55th amino acid is VH (2H2E1_A, amino acid sequence: SEQ ID NO: 41) in which the 57th amino acid is replaced with T, the 57th amino acid is replaced with Y, the 58th amino acid is replaced with R, and the 100th amino acid is replaced with A.
  • Example 15 Preparation of modified antibodies Using the amino acid sequence information obtained in Example 14 and the amino acid sequence of VH described in (15-1), modifications of A-1 to A-8 described in Table 15 were made. Antibodies were produced.
  • a plasmid containing a base sequence encoding the amino acid sequence of each antibody was prepared in the same manner as in Example 12, and antibodies were prepared from the plasmid in the same manner as in Example 2.
  • Example 16 Evaluation of modified antibodies Antigen binding activity, FGF23 neutralizing activity, and thermal stability were evaluated using the eight types of modified antibodies prepared in Example 15 and antibody A as a control.
  • the buffer was D-PBS (Nacalai Tesque Co., Ltd., Code 14249-24), and the concentration was adjusted to 0.5 mg/mL.
  • Various measurements were performed by diluting the sample according to the purpose. .
  • Example 3 the antigen binding activity of the I100A antibody and I100Y antibody was lower than that of the A antibody. Furthermore, in all antibodies A-1 to A-8, the 100th amino acid residue of VH is A or Y.
  • Example 9 the FGF23 neutralizing activity of the I100A antibody and I100Y antibody was lower than that of the A antibody. Furthermore, in all antibodies A-1 to A-8, the 100th amino acid residue of VH is A or Y.
  • the isoelectric point of each antibody was determined using the iCE3 system (Protein Simple).
  • Pharmalyte 3-10 for IEF Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd., Cat. No. 17-0456-01
  • pI Marker 5.12 Protein Simple Co., Ltd., Cat. No. .102224
  • pI Marker 9.77 Protein Simple, Cat. No. 102219 was used as the basic marker.
  • the measurement method followed a standard protocol.
  • thermostability Six antibodies, A antibody, A_YTE antibody, A-1 antibody, A-3 antibody, A-5 antibody, and A-8 antibody, were tested using the method described in Example 5. Similarly, thermal stability evaluation was conducted. The results obtained are shown in Table 19.
  • thermostability of each antibody site between antibody A and antibody A_YTE As shown in Table 19, there was no change in the thermostability of each antibody site between antibody A and antibody A_YTE. On the other hand, for antibodies A-1 and A-3, which have the same heavy chain constant region amino acid sequence as antibody A_YTE, it was confirmed that the thermostability of Fab was improved by approximately 3 degrees compared to antibody A and antibody A_YTE. .
  • Example 17 Production of A-9 antibody and A-10 antibody A-9 antibody and A-10 antibody listed in Table 20 were produced in the same manner as in Example 2 (hereinafter referred to as A-9 antibody and A-10 antibody). -10 antibody is sometimes referred to as a modified antibody).
  • the L chain expression vector for the A-9 antibody the pcDNA3.4 vector (Invitrogen) was used instead of the pCI vector of Example 2. Furthermore, for both the A-9 antibody and the A-10 antibody, the L chain expression vector and the H chain expression vector were mixed at a ratio of 1:1 and introduced into cells.
  • affinity maturation was performed using the phage display method at Abwiz Bio for the I100A antibody, and the following amino acid sequence information was obtained.
  • VL was designed and used for the A-10 antibody.
  • Example 18 Evaluation of modified antibodies Antigen binding activity, FGF23 neutralizing activity, and thermal stability were evaluated using the two types of modified antibodies prepared in Example 17 and antibody A as a control.
  • the buffer was D-PBS (Nacalai Tesque Co., Ltd., Code 14249-24), the concentration was adjusted to 1 mg/mL, and various measurements were performed by diluting the sample according to the purpose.
  • the A-9 antibody had twice the antigen binding activity of the A antibody, and the A-10 antibody had the same antigen binding activity as the A antibody.
  • the antigen binding activity of the I100A antibody and the I100Y antibody was lower than that of the A antibody.
  • the 100th amino acid residue of VH is A and Y, respectively. From the above, replacing the 100th amino acid residue of VH of antibody A with A or Y reduces the antigen-binding activity of the antibody, but substitution of additional amino acid residues in antibody A-9 and I100Y causes It was confirmed that the binding activity of the antibody was improved to the same level or higher than that of antibody A.
  • Example 9 the neutralizing activity of I100A and I100Y was lower than that of antibody A. Furthermore, in the A-9 antibody and the A-10 antibody, the 100th amino acid residue of VH is A and Y, respectively.
  • the antibody used in this example was obtained by inserting the target gene sequence into a mammalian expression vector, introducing it into CHO cells, and then using MabSelect SuRe (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.) from the mammalian cell culture medium supernatant. Purified antibodies were obtained by affinity purification using cation exchange chromatography. Using NAP25 (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.), the solvent of the antibody solution was replaced with a pH 4 and pH 4.5 solvent containing 10 mM Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, and 0.05 mg/mL Polysorbase 80. The concentration was 1 mg/mL.
  • the obtained antibody solution was left standing at 40 degrees for one month and at 25 degrees for three months, and then frozen at -80 degrees. After melting the antibody solution, decomposition of the antibody was confirmed using a biological product analysis system PA800Plus (SCIEX). Basic conditions such as sample preparation and analysis were performed according to the method of Oscar Salas-Solano et al. (2006, Anal. Chem.:6583-6594), and were modified as appropriate.
  • the results at pH 4.5 are shown in Table 22, and the results at pH 5.0 are shown in Table 23.
  • Initial sample frozen at -80 degrees immediately after solvent replacement sample frozen at -80 degrees after being left at 40 degrees for 1 month, 40 degrees Celsius 1M, left at 25 degrees for 3 months, then at -80 degrees. Frozen samples were labeled as 25°C 3M. All samples were melted under the same conditions and then measured.
  • Example 20 Confirmation of degradation inhibition rate of modified antibody The degradation inhibition rate was confirmed using the two types of modified antibodies prepared in Example 17 and the A antibody and A-1 antibody as controls.
  • the A antibody and A-1 antibody used in this example were obtained by inserting the target gene sequence into a mammalian expression vector, introducing it into CHO cells, and then using MabSelect SuRe (Global Life) from the mammalian cell culture medium supernatant. Purified antibodies were obtained by affinity purification and cation exchange chromatography (Science Technologies Japan Co., Ltd.). Using NAP25 (Global Life Science Technologies Japan Co., Ltd.), the solvent of the antibody solution was replaced with a pH 4, pH 4.5, and pH 5 solvent containing 10 mM Sodium L-glutamate, 262 mM D-Sorbitol, and 0.05 mg/mL Polysorbate. , the protein concentration was 1 mg/mL.
  • the obtained antibody solution was allowed to stand at 40 degrees for one month, and then the antibody was extracted using a microchip electrophoresis system LabChip (PerkinElmer) and a Protein Clear Reagent kit (PerkinElmer, Cat. CLS960014). The decomposition of was confirmed. Regarding sample preparation and electrophoresis conditions, the experiment was conducted according to the protocol included with the kit.
  • the results at pH 4.0 are shown in Table 24, the results at pH 4.5 are shown in Table 25, and the results at pH 5.0 are shown in Table 25.
  • the results are shown in Table 26.
  • the A-9 antibody and A-10 antibody were also tested for one month under the buffer conditions of pH 4.0, pH 4.5, or pH 5.0 and the storage condition of 40 degrees. It was confirmed that the degradation was suppressed compared to antibody A.
  • Example 21 In order to confirm the sustainability of the pharmacological effect of a single subcutaneous administration of the test antibody to male cynomolgus monkeys, the serum inorganic phosphorus concentration (mg/dL) was measured. A8 antibody (1.8 mg/kg) was administered subcutaneously as a test antibody. Blood was collected over time for 56 days after administration, and the inorganic phosphorus concentration in the serum was measured at each time point. The phosphorus concentration was measured by the PNP-XDH method using a clarifier (JCA-BM6070).
  • the A-8 antibody was shown to have a longer duration of serum inorganic phosphorus concentration in cynomolgus monkeys than burosumab.
  • A-1 antibody and A-5 antibody were subcutaneously administered to cynomolgus monkeys at 3 mg/kg, and the inorganic phosphorus concentration in the serum was measured in the same manner as above.
  • these antibodies like burosumab, increased the serum inorganic phosphorus concentration from the 3rd day after administration, and the inorganic phosphorus concentration decreased to the baseline on the 42nd day after administration.
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region of burosumab is represented by SEQ ID NO: 53, and the amino acid sequence of the heavy chain constant region of A-1 antibody, A-5 antibody, and A-8 antibody is represented by SEQ ID NO: 48.
  • SEQ ID NO: 53 amino acid sequence of the heavy chain constant region of A-1 antibody, A-5 antibody, and A-8 antibody is represented by SEQ ID NO: 48.
  • antibodies A-1, A-5, and A-8 which have the same heavy chain constant region amino acid sequence, only antibody A-8 sustained serum inorganic phosphorus concentration longer than burosumab in cynomolgus monkeys.
  • Example 22 Inorganic phosphorus concentration (mg/dL) in serum was measured in the same manner as in Example 21. A-9 antibody and A-10 antibody (3.0 mg/kg) were administered subcutaneously as test antibodies. Blood was collected over time for 57 days after administration, and the inorganic phosphorus concentration in the serum was measured at each time point.
  • the serum inorganic phosphorus concentration increased from the third day after administration. Even on the 57th day, the inorganic phosphorus concentration was higher than the baseline inorganic phosphorus concentration (phosphorus concentration on Day 0 in Table 28).
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the A-9 antibody and A-10 antibody is the same as the heavy chain constant region amino acid sequence of the A-1 antibody, A-5 antibody, and A-8 antibody, and is represented by SEQ ID NO: 48. It is an amino acid sequence.
  • the duration of the inorganic phosphorus concentration in the serum of cynomolgus monkeys is longer than that for burosumab, A-1 antibody, and A-5 antibody. It was suggested that this was due to a difference in the amino acid sequence of the variable region, similar to the A-8 antibody, rather than a difference in sequence.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of VH of antibody A SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of VL of antibody A SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of VH of I100A antibody SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of VH of I100L antibody SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of I100V antibody Amino acid sequence of VH of I100Y antibody SEQ ID NO: 7: Amino acid sequence of VH of I100W antibody SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of VH of I100T antibody SEQ ID NO: 9: Amino acid sequence of VH of I100S antibody Number 10: Amino acid sequence of VH of I100R antibody SEQ ID NO: 11: Amino acid sequence of VH of I100Q antibody SEQ ID NO: 12: Amino acid sequence of VH of I100N antibody SEQ ID NO: 13: Amino acid sequence of VH of I100M antibody SEQ ID NO: 14: Amino acid sequence of

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Abstract

本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（以下、ＶＨと記載）および配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記載）を含む抗体において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基または１０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたＦＧＦ２３に結合する抗体または該抗体断片に関する。

Description

抗ＦＧＦ２３抗体又は該抗体断片
　本発明は、抗ＦＧＦ２３抗体又は該抗体断片に関する。
　線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、以下ＦＧＦと記載）は、構造的に類似した一群のポリペプチドファミリーを形成しており、線維芽細胞増殖活性のみならず、中胚葉や神経外胚葉の増殖や血管新生作用、発生段階における肢芽形成など様々な作用が報告されている。また、成人においては、組織の維持や修復、再生や代謝など、ホメオスタシス因子としても機能している（非特許文献１）。
　哺乳動物においては、ＦＧＦファミリーに属するタンパク質として、２２種類が知られている。ヒトにおいては、ＦＧＦ１５を除くＦＧＦ１からＦＧＦ２３の２２種類が同定されている。また、ヒトのＦＧＦファミリーは約１５０～３００アミノ酸から構成されており、コア配列の約１２０アミノ酸は約３０～６０％の割合で一致している。ＦＧＦファミリーは、分泌タンパク質として発現し、受容体チロシンキナーゼに作用するものと、細胞内タンパク質として発現し、電位依存的ナトリウムチャネルやその他の分子に作用するものに分類される（非特許文献２）。　
　ＦＧＦ２３は、ＦＧＦ１５との相同性を利用したデータベース検索及びＰＣＲ法を用いてマウスより同定され、その後相同性検索により同定された分泌タンパク質である。ヒトのＦＧＦ２３は２５１アミノ酸残基のポリペプチドで構成され、Ｎ末端の２４残基が分泌シグナルとして機能し、タンパク質の成熟過程で切断されることが知られている（非特許文献３）。
　ＦＧＦ２３の産生過剰による低リン血症性疾患が知られており、原因遺伝子が判明している疾患と後天性疾患に大きく分類される（非特許文献４）。原因遺伝子が判明しているＦＧＦ２３関連低リン血症性疾患では、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ（ＰＨＥＸ）変異によるＸ染色体遺伝性低リン血症性くる病（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ　ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ　ｒｉｃｋｅｔｓ、以下ＸＬＨと記載）の頻度が最も高く、これまでに多数のＰＨＥＸ遺伝子変異が報告されている（非特許文献５）。
　ＰＨＥＸは膜１回貫通型タンパク質であり、軟骨、骨芽細胞、象牙芽細胞に多く発現していることが知られており（非特許文献６及び非特許文献７）、ＸＬＨは２万人に１人の頻度で発症するといわれている（非特許文献８）。後天性疾患の例としては、腫瘍性骨軟化症（ｔｕｍｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ：ＴＩＯ）などが知られている。
　これらのＦＧＦ２３関連低リン血症性疾患に対して、従来は対症療法として活性型ビタミンＤ３製剤と経口リン製剤が用いられてきた。しかし、長期投与による高カルシウム血症及び尿症、腎石灰化、持続性の副甲状腺機能亢進症の合併などが起こる可能性があった（非特許文献９及び非特許文献１０）。
　ＦＧＦ２３の過剰生産が原因と考えられる上記疾患の治療薬として、ＦＧＦ２３中和抗体であるブロスマブが知られている。
　また、その他に、ヒトＦＧＦ２３中和抗体としては、特許文献１に記載される抗体なども知られている。
国際公開第２００８／０９９９６９号
Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2015 May-Jun;4(3):215-66 J Biochem. 2011 Feb;149(2):121-30 Biochem Biophys Res Commun. 2000 Oct 22;277(2):494-8 Endocrinology. 2011 Jan;152(1):4-10 Hum Mutat. 2000;16(1):1-6. J Clin Invest. 2008 Feb 1; 118(2): 722-734 J Clin Invest. 1997 Mar 15; 99(6): 1200-1209. Orphanet J Rare Dis. 2019; 14: 58 Lancet. 2019 Jun 15;393(10189):2416-2427 J Bone Miner Res. 2011 Jul;26(7):1381-8
　本発明者らは、国際公開第２００８／０９９９６９号に記載される抗ヒトＦＧＦ２３抗体の物性を鋭意検討した結果、当該抗体が低ｐＨにおいて安定性が低下し、分解されること、および当該分解は、抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列において、９９番目のＤと１００番目のＩとの間の切断によるものであることを見出した。一般的に、抗体製剤を高濃度化する際に抗体が凝集しやすいこと、およびタンパク質溶液中のタンパク質の電荷の絶対値が高まると、タンパク質の凝集が生じる可能性を低減できることが知られている（Arch Pharm Res Vol 35, No 11, 1871-1886, 2012）。そのため、抗体製剤を高濃度化する際には、抗体の凝集を抑制する方法の一つとして、当該製剤のｐＨを低下させることがある。したがって、抗体製剤のｐＨを低下させる必要がある場合には、検討可能なｐＨの幅が広い抗体がより望まれる。
　したがって、本発明は、国際公開第２００８／０９９９６９号に記載される抗ヒトＦＧＦ２３抗体よりも低ｐＨでの抗体の分解が抑制された新規な抗ＦＧＦ２３抗体を提供することを目的とする。
　上記課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、国際公開第２００８／０９９９６９号に記載される抗ＦＧＦ２３抗体のＶＨの１００番目のアミノ酸残基または１０５番目のアミノ酸残基を置換した抗ＦＧＦ２３抗体により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
１．配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（以下、ＶＨと記載）および配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記載）を含む抗体において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基または１０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、ＦＧＦ２３に結合する抗体または該抗体断片。
２．ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、チロシン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、トリプトファン残基、およびメチオニン残基から選ばれる１のアミノ酸残基に置換された、前記１に記載の抗体または該抗体断片。
３．ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、またはチロシン残基に置換された、前記１または２に記載の抗体または該抗体断片。
４．ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１０５番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、リシン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、およびセリン残基から選ばれる１のアミノ酸残基に置換された、前記１～３のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
５．前記抗体が下記（ａ１）～（ａ４）から選ばれる１の置換をさらに含む、前記１～４のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ１）ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換、５４番目のアミノ酸残基のトリプトファン残基への置換、５５番目のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換、５７番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および５８番目のアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、
（ａ２）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸残基のメチオニン残基またはロイシン残基への置換、９２番目のアミノ酸残基のチロシン残基への置換、９４番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、および９６番目のアミノ酸残基のアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、
（ａ３）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の２８番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、２９番目のアミノ酸残基のバリン残基への置換、３１番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および３４番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、並びに
（ａ４）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸残基のチロシン残基またはトリプトファン残基への置換、９４番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、および９６番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換。
６．前記抗体が下記（ｃ１）～（ｃ１０）から選ばれる１である、前記１～５のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ｃ１）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ２）配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ４）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ５）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ６）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ７）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ８）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｃ１０）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
７．前記抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、前記１～６のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
８．前記抗体のＦｃ領域が下記（ｄ１）～（ｄ５）から選ばれる１である、前記１～７のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ｄ１）ＥＵインデックス２５２番目のアミノ酸残基のチロシン残基への置換、２５４番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および２５６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸残基への置換を含むＦｃ領域、
（ｄ２）ＥＵインデックス４２８番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換、および４３４番目のアミノ酸残基のセリン残基への置換を含むＦｃ領域、
（ｄ３）ＥＵインデックス３０８番目のアミノ酸残基のプロリン残基への置換を含むＦｃ領域、
（ｄ４）ＥＵインデックス２５０番目のアミノ酸残基のグルタミン残基への置換、および４２８番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換を含むＦｃ領域、並びに
（ｄ５）ＥＵインデックス４３４番目のアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含むＦｃ領域。
９．前記抗体の重鎖定常領域が配列番号４８、４９、５０、５１、または５２で表されるアミノ酸配列を含む、前記１～８のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
１０．前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる１である前記１～９のいずれか１に記載の抗体断片。
１１．前記１～１０のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を有する核酸。
１２．前記１１に記載の核酸を含有するベクター。
１３．前記１２に記載のベクターを含む形質転換細胞。
１４．前記１３に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培養物から抗体または該抗体断片を採取することを含む、前記１～１０のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
１５．前記１～１０のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を含む組成物。
１６．前記１～１０のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を含むヒトＦＧＦ２３関連疾患の治療薬。
１７．前記１～１０のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を含むヒトＦＧＦ２３関連疾患の治療方法。
　本発明の抗ＦＧＦ２３抗体は、国際公開第２００８／０９９９６９号に記載される抗ＦＧＦ２３抗体と比較して、低ｐＨにおける分解が抑制され、優れた安定性を示す。本発明によれば、抗ＦＧＦ２３抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を有する核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含む形質転換細胞、該抗体または該抗体断片の製造方法、および該抗体または該抗体断片を含む組成物を提供することができる。
　本発明は、国際公開第２００８／０９９９６９号に記載される線維芽細胞増殖因子２３（以下、ＦＧＦ２３と記載する）に結合する抗体（以下、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（以下、ＶＨと記載する）および配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記載する）を含む抗体と記載する）において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基または１０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたＦＧＦ２３に結合する抗体または該抗体断片に関する（以下、本発明の抗体と記載する）。
　「ＦＧＦ２３」は、線維芽細胞増殖因子の一種で、骨細胞由来のホルモンである。ヒトＦＧＦは、Ｎ末端に２４アミノ酸の分泌シグナルを含む２５１アミノ酸からなるタンパク質であり、当該分泌シグナルはタンパク質の成熟過程で切断される。ＦＧＦ２３の機能としては、主に腎臓の腎近位尿細管細胞上のＦＧＦ受容体１（以下ＦＧＦＲ１とも記載する）／α－Ｋｌｏｔｈｏ複合体を介して、腎臓でのリンの再吸収とビタミンＤの活性化を抑制することなどが挙げられる。　
　本発明においてヒトＦＧＦ２３としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトＦＧＦ２３の機能を有するポリペプチド、あるいはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつヒトＦＧＦ２３の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
　ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えばＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ヒトＦＧＦ２３をコードする遺伝子としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２０６３８の塩基配列が挙げられる。ＮＭ＿０２０６３８の塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列から成り、かつヒトＦＧＦ２３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ＮＭ＿０２０６３８の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列から成り、かつヒトＦＧＦ２３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子またはＮＭ＿０２０６３８の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡから成り、かつヒトＦＧＦ２３の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子なども本発明のヒトＦＧＦ２３をコードする遺伝子に含有される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、ＮＭ＿０２０６３８の塩基配列を含むＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡのことをいう。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター若しくはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドガラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、ＮＭ＿０２０６３８の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も本発明のヒトＦＧＦ２３をコードする遺伝子に含有される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である。
　ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができる。具体的には、ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記と同様の方法により、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。さらに、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６５６８９のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明において、アミノ酸の欠失、置換または付加等をアミノ酸の改変ともいう。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびオリゴクローナル抗体のいずれの抗体をも包含する。ポリクローナル抗体とは、異なるクローンの抗体産生細胞が分泌する抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（一次配列）が均一である抗体をいう。オリゴクローナル抗体とは、複数の異なるモノクローナル抗体を混合した抗体分子の集団をいう。
　本発明におけるモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
　エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する、単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列および該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がＯＨ置換基を有するＴｙｒおよびＳｅｒに結合したＯ結合型糖鎖、ＮＨ２置換基を有するＧｌｎおよびＡｓｎに結合したＮ結合型糖鎖ならびに硫酸分子がＯＨ置換基を有するＴｙｒおよびＳｅｒに結合した硫酸基などが結合したアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の抗体がヒトＦＧＦ２３に結合することは、ヒトＦＧＦ２３に対する本発明の抗体の結合性を、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することにより確認することができる。また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
　本発明の抗体が結合するヒトＦＧＦ２３のアミノ酸残基またはエピトープは、ヒトＦＧＦ２３の一部のドメインを欠失させた欠損体、他のタンパク質由来のドメインと置換した変異体およびヒトＦＧＦ２３の部分ペプチド断片等を用いて抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。
　または、本発明の抗体が結合するヒトＦＧＦ２３のアミノ酸残基またはエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したヒトＦＧＦ２３のペプチド断片に本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いてエピトープマッピングを行うことによっても決定することができる。
　抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
　抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＶＨ、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＶＬ、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。ＣＨは各サブクラスにおいて、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
　本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックス［Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］（以下、単にＥＵインデックスと記載する）により、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８～２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６～２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１～３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１～４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
　本発明の抗体としては、特に遺伝子工学的に作製された組換えマウス抗体、組換えラット抗体、組換えラビット抗体、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも略記する）、ヒト化抗体（ヒト型相補性決定領域ＣＤＲ移植抗体ともいう）およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。また、本発明の抗体には、異なる２種類の抗体由来のＨ鎖（又はＶＨ）とＬ鎖（又はＶＬ）とを組換えて作製される遺伝子組換え抗体も含まれる。異なる２種類の抗体は、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体いずれのものであってもよい。更に本発明の抗体としては、上述の遺伝子組換え抗体を作製するに当たって、適当なアミノ酸残基を置換した遺伝子組換え抗体も含まれる。
　キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体を意味する。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
　ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。したがって、ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域は、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列からなる。
　キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、該モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
　ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
　ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A.　97, 722-7, 2000）に所望の抗原を免疫することにより、取得することが出来る。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したｐｈａｇｅ　ｄｉｓｐｌａｙライブラリーを用いることにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することで、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Winter G. et al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994)。さらに、EBウイルスを用いてヒトB細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Rosen A. et al., Nature 267, 52-54.1977）。
　ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を得ることができ、該リンパ球を培養した培養物中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
　本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体、非ヒト動物抗体またはヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のいずれでもよい。
　本発明の抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
　本発明の抗体のＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスに属するサブクラス、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）およびγ４（ＩｇＧ４）が好ましい。
　本発明の抗体は、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等をも包含する。
　本発明の抗体又は該抗体断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸残基を含む抗体または該抗体断片をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ　ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］またはポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への変換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736（2013）］。
　本発明において、抗体断片とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体よりも、低ｐＨでの分解が抑制されたヒトＦＧＦ２３に結合する抗体断片である。本発明において抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）または複数のＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明の抗体の一態様としては、下記（i）および（ii）の抗体または該抗体断片等が挙げられる。
（i）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＦＧＦ２３に結合する抗体において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、チロシン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、トリプトファン残基、およびメチオニン残基から選ばれる１のアミノ酸残基に置換されたＦＧＦ２３に結合する抗体または該抗体断片。
（ii）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＦＧＦ２３に結合する抗体において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１０５番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、リシン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、およびセリン残基から選ばれる１のアミノ酸残基に置換されたＦＧＦ２３に結合する抗体または該抗体断片。
　当該抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、低ｐＨにおける安定性が高く、抗体の分解を抑制できる。当該抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基がアラニン残基またはチロシン残基に置換されたＦＧＦ２３に結合する抗体であることが好ましい。
　本発明において、低ｐＨとはｐＨ６未満の弱酸性又は酸性をいい、例えば、ｐＨ５、ｐＨ４．５、ｐＨ４等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
　本発明の抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、低ｐＨにおける分解が抑制され、優れた安定性を示す。本発明において、抗体の分解は、サイズ除去クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（以下、ＳＥＣと記載する））またはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと記載する）等で測定することができる。
　本発明の抗体で、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、低ｐＨでの抗体の分解が抑制されていることは、例えば、以下の工程（I）～（III）を含む方法で確認することができるが、特に該方法に限定されるものではない。
（I）本発明の抗体、または配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体を含有する抗体溶液の溶媒を、ＮＡＰ（商標）２５（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）等のカラムを用いて、ｐＨ４、４．５または５の適当な溶媒に置換した抗体溶液を調製する。
（II）上記（I）で調製した抗体溶液を４０度で１か月間もしくは２週間、または２５度で３カ月間静置した後、ＳＥＣにて抗体の分解物に相当するピーク（％）を検出する。
　または、上記（I）で調製した抗体溶液を４０度で１か月間もしくは２週間、または２５度で３カ月間静置した後、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、抗体の分解物に相当する４０ｋＤａ付近（例えば、３５ｋＤａ～４５ｋＤａ）のバンドを検出する。
（III）上記（II）のＳＥＣにより検出される抗体の分解物に相当するピーク（％）が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体よりも、本発明の抗体で減少している場合、またはＳＤＳ－ＰＡＧＥの４０ｋＤａ付近のバンドの濃さが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体よりも、本発明の抗体で低下している場合、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、本発明の抗体で、低ｐＨでの抗体の分解が抑制されていると確認できる。
　上記（II）に記載のＳＤＳ－ＰＡＧＥの代わりに、バイオアナライザー電気泳動システム（アジレント・テクノロジー株式会社）およびＡｇｉｌｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ２３０キット（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いてもよい。このとき、得られるエレクトロフェログラムにおいて、Ｈ鎖全長のピークよりも１０～２０ｋＤａ程度小さいサイズに検出される抗体の分解物に相当するバンド（例えば、４０～６０ｋＤａ）のピーク面積率（％）が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体よりも、本発明の抗体で低下している場合に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、本発明の抗体で低ｐＨでの抗体の分解が抑制されていると確認できる。
　すなわち、本発明の抗体の低ｐＨにおける安定性を示す態様として、例えば、下記が挙げられる。
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、ｐＨ４、４．５または５等の低ｐＨおよび４０度にて１か月間もしくは２週間、または２５度にて３か月間静置後における、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量が４０ｋＤａ付近のバンドの濃さが低下している。バンドの濃さは目視により評価できる。
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、ｐＨ４、４．５または５等の低ｐＨおよび４０度にて１か月間もしくは２週間静置後、または２５度にて３か月間における、ＳＥＣにより検出される抗体の分解物に相当するピーク（％）が減少している。該ピーク（％）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上減少していることが好ましい。
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と比較して、ｐＨ４、４．５または５等の低ｐＨおよび４０度にて１か月間もしくは２週間静置後、または２５度にて３か月間における、バイオアナライザー電気泳動システム（アジレント・テクノロジー株式会社）およびＡｇｉｌｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ２３０キット（アジレント・テクノロジー株式会社）によるエレクトロフェログラムにおいて、Ｈ鎖全長のピークよりも１０～２０ｋＤａ程度小さいサイズに検出される抗体の分解物に相当するバンド（例えば、４０～６０ｋＤａ）のピーク面積率（％）が減少している。該ピーク面積率（％）が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体よりも、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上減少していることが好ましい。
　本発明の抗体の一態様としては、下記（ａ１）～（ａ４）から選ばれる１の置換をさらに含む、前記抗体が挙げられる。
（ａ１）ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換、５４番目のアミノ酸残基のトリプトファン残基への置換、５５番目のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換、５７番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および５８番目のアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、
（ａ２）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸残基のメチオニン残基またはロイシン残基への置換、９２番目のアミノ酸残基のチロシン残基への置換、９４番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、および９６番目のアミノ酸残基のアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、
（ａ３）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の２８番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、２９番目のアミノ酸残基のバリン残基への置換、３１番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および３４番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、並びに
（ａ４）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸残基のチロシン残基またはトリプトファン残基への置換、９４番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、および９６番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換。
　なお、本発明の抗体は、上記（ａ１）～（ａ４）それぞれについて、記載されるすべてのアミノ酸残基の置換がなされていることが好ましい。
　本発明の抗体は、上記（ａ１）～（ａ４）から選ばれる１のアミノ酸残基の置換により、抗体のＦＧＦ２３に対する結合活性およびＦＧＦ２３中和活性を向上させることができる。ＦＧＦ２３中和活性とは、ＦＧＦ２３が受容体に結合することで生じるシグナルを阻害する活性をいう。ＦＧＦ２３の受容体としては、ＦＧＦＲ１とαＫｌｏｔｈｏとの複合体が挙げられる。
　本発明の抗体のＦＧＦ２３中和活性は、Ｎａｔｕｒｅ　２００６　Ｄｅｃ　７；４４４（７１２０）に記載されるレポーターアッセイ（プロモーターアッセイともいう）などで確認することができる。また、マウスＥｇｒ１遺伝子由来のプロモーターを有するルシフェラーゼ発現ベクターで形質転換されたαＫｌｏｔｈｏ安定発現ＨＥＫ２９３細胞を用いたレポーターアッセイなどでも本発明の抗体のＦＧＦ２３中和活性を確認することができる。
　本発明の抗体の具体的な例としては、下記（ｂ１）～（ｂ５）から選ばれるいずれか１の抗体が挙げられる。
（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体において、ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸残基がロイシン残基に、５４番目のアミノ酸残基がトリプトファン残基に、５５番目のアミノ酸残基がヒスチジン残基に、５７番目のアミノ酸残基がトレオニン残基に、５８番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基に、および１００番目のアミノ酸残基がアラニン残基またはチロシン残基に置換された抗体、
（ｂ２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体において、ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基がアラニン残基またはチロシン残基に、およびＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸残基がメチオニン残基に、９２番目のアミノ酸残基がチロシン残基に、９４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に、および９６番目のアミノ酸残基がアスパラギン残基に置換された抗体、
（ｂ３）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体において、ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基がアラニン残基またはチロシン残基に、およびＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の２８番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に、２９番目のアミノ酸残基がバリン残基に、３１番目のアミノ酸残基がトレオニン残基に、および３４番目のアミノ酸残基がロイシン残基に置換された抗体、
（ｂ４）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体において、ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基がアラニン残基またはチロシン残基に、およびＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸残基がロイシン残基に、９２番目のアミノ酸残基がチロシン残基に、９４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に、および９６番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に置換された抗体、並びに
（ｂ５）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体において、ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基がアラニン残基またはチロシン残基に、およびＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸残基がチロシン残基、またはトリプトファン残基に、９４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に、および９６番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基に置換された抗体。
　また、本発明の抗体の具体例としては下記（ｃ１）～（ｃ１０）から選ばれる抗体も挙げられ、（ｃ１）、（ｃ８）、（ｃ９）または（ｃ１０）が好ましく、（ｃ１）または（ｃ９）がより好ましい。
（ｃ１）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ２）配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ４）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ５）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ６）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ７）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ８）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｃ１０）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
　本発明の抗体には、血中半減期の制御を目的として、ＦｃＲｎへの結合性を制御するために、アミノ酸残基を置換したＦｃ領域なども用いることができる。
　抗体のＦｃＲｎへの結合性を向上させるためにアミノ酸残基を置換したＦｃ領域としては、下記（ｄ１）～（ｄ５）のいずれか１のＦｃ領域などが挙げられる。中でも（ｄ１）のＦｃ領域が好ましい。
（ｄ１）ＥＵインデックス２５２番目のアミノ酸残基のチロシン残基への置換、２５４番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および２５６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸残基への置換を含むＦｃ領域、
（ｄ２）ＥＵインデックス４２８番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換、および４３４番目のアミノ酸残基のセリン残基への置換を含むＦｃ領域、
（ｄ３）ＥＵインデックス３０８番目のアミノ酸残基のプロリン残基への置換を含むＦｃ領域、
（ｄ４）ＥＵインデックス２５０番目のアミノ酸残基のグルタミン残基への置換、および４２８番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換を含むＦｃ領域、並びに
（ｄ５）ＥＵインデックス４３４番目のアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含むＦｃ領域。
　また、本発明において、抗体のＦｃＲｎへの結合性を向上させるためにアミノ酸残基が置換されたＦｃ領域を含む重鎖定常領域のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号４８、４９、５０、５１、および５２で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。中でも、配列番号４８で表されるアミノ酸配列が好ましい。
　本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片には、本発明のヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体または該抗体断片の誘導体を包含する。
　抗体または該抗体断片の誘導体は、本発明のヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片のＨ鎖若しくはＬ鎖のＮ末端側、Ｃ末端側、抗体分子中の適当な置換基または側鎖あるいは糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、タンパク質、抗体医薬または核酸医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
　また、本発明のヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたいタンパク質または抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕまたは２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン若しくはプレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン若しくはインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート若しくはペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド若しくはアザチオプリンなどの免疫抑制剤またはマレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｏｔｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ若しくはタルセバなどのＥｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（タルグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミンまたはメイタンシノイドあるいはその誘導体などが挙げられる。
　低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体またはその抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的若しくは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、または（３）免疫原性の消失若しくは抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
　例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（例えば、レンチナンまたはシゾフィラン）またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
　タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージまたは好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子または毒素タンパク質などが挙げられる。
　サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシンまたはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
　抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原、免疫機能を調節する抗原または病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
　抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩまたはＥｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
　腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１またはＢＴＬＡ）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（例えば、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（例えば、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３またはＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体、サイトカイン［例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）βまたはＴＮＦαなど］若しくはこれらのサイトカインの受容体、またはケモカイン（例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣまたはＣＴＡＣＫなど）若しくはこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
　病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ－８、ｅｐｈｒｉｎまたはＳＤＦ－１若しくはこれらの受容体などが挙げられる。
　核酸医薬としては、例えば、遺伝子の機能を制御することによって生体に作用するｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ｓｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡなどの核酸を含む医薬品が挙げられる。例えば、Ｔｈ１７細胞のマスター転写因子ＲＯＲγｔを抑制する核酸医薬とのコンジュゲートが考えられる。
　本発明の抗体または該抗体断片の誘導体をヒトＦＧＦ２３の検出および測定ならびにヒトＦＧＦ２３関連疾患の診断に使用する場合に、当該抗体に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　また、本発明の一実施形態は、本発明の抗体または該抗体断片を含む組成物である。組成物の形態としては、ヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有する組成物などが挙げられる。本発明の抗体または該抗体断片を含む組成物は、ヒトＦＧＦ２３関連疾患の治療に用いることができる。本発明の一実施形態として、本発明の抗体を含むヒトFGF23関連疾患の治療剤が提供される。
　また、本発明は、ヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを含む、ヒトＦＧＦ２３関連疾患の治療方法に関する。
　ヒトＦＧＦ２３関連疾患としては、ヒトＦＧＦ２３又はヒトＦＧＦ２３の受容体が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍性骨軟化症（ＴＩＯ）、常染色体顕性低リン血症性くる病・骨軟化症（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、ｆｉｂｒｏｕｓ　ｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＭｃＣｕｎｅ－Ａｌｂｒｉｇｈｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ、常染色体潜性低リン血症性くる病・骨軟化症（ＡＲＨＲ）、骨粗鬆症、くる病（低リン血症性くる病、ビタミンＤ抵抗性くる病を含む）、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、掻痒、ならびに腎性骨異栄養症、透析骨症、および尿細管機能障害等に代表される腎不全や腎不全時人工透析に合併する疾患等が挙げられる。
また、本発明は、ヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ＴＩＯ、ＡＤＨＲ、ＸＬＨ、ｆｉｂｒｏｕｓ　ｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＭｃＣｕｎｅ－Ａｌｂｒｉｇｈｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ及びＡＲＨＲなどの疾患で見られる低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低１，２５ビタミンＤ血症などの症状の治療剤も含む。
　本発明の抗体または該抗体断片を含む治療剤は、有効成分としての該抗体または該抗体断片のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与を挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　本発明の組成物の一実施形態としては、ヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を含有する、ＦＧＦ２３の検出若しくは測定用試薬が挙げられる。また本発明はヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を用いたＦＧＦ２３の検出若しくは測定方法に関する。本発明においてヒトＦＧＦ２３を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などが挙げられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　本発明の組成物の一実施形態としては、ヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片を含む、ＦＧＦ２３関連疾患の診断薬が挙げられる。また、ヒトＦＧＦ２３に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてＦＧＦ２３の検出または測定をすることを含む、ＦＧＦ２３関連疾患の診断方法に関する。本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いて、上記の方法に従いヒトＦＧＦ２３を検出または測定することにより、ヒトＦＧＦ２３が関連する疾患を診断することができる。
　本発明においてヒトＦＧＦ２３を検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織、細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養液など、ヒトＦＧＦ２３を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含有する診断薬は、目的の診断方法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などが挙げられる。検出用試薬としては、該モノクローナル抗体若しくはその抗体断片を認識する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　本発明の一実施形態はＦＧＦ２３関連疾患の治療薬若しくは診断薬の製造のための、抗ヒトＦＧＦ２３モノクローナル抗体または該抗体断片の使用に関する。また、本発明の一実施形態はＦＧＦ２３関連疾患の治療方法または診断方法に関する。
　以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるヒトＦＧＦ２３は、ヒトＦＧＦ２３全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞または動物細胞などに導入することで得ることができる。また、ヒトＦＧＦ２３は、ヒトＦＧＦ２３を多量に発現している各種ヒト細胞株、ヒト細胞およびヒト組織などからヒトＦＧＦ２３を精製することによっても得ることができる。また、これらヒト細胞株、ヒト細胞およびヒト組織などをそのまま抗原として使用することもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりヒトＦＧＦ２３の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。ヒトＦＧＦ２３またはヒトＦＧＦ２３の部分配列を有する合成ペプチドには、Ｃ末端またはＮ末端にＦＬＡＧまたはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。
　本発明で用いられるヒトＦＧＦ２３は、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ヒトＦＧＦ２３をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ヒトＦＧＦ２３をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトＦＧＦ２３をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ヒトＦＧＦ２３をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトＦＧＦ２３の生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４，６８６，１９１号明細書、米国特許第４，９３９，０９４号明細書、米国特許第１６０，７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターまたはＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターまたはｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなどが挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)］が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社製）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターまたはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci.,60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II(pp. 883-900)］、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)］、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］、などが挙げられる。
　以上のようにして得られるヒトＦＧＦ２３をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物または動物細胞などの由来の形質転換体を培地中で培養し、培養液中に該ヒトＦＧＦ２３を生成蓄積させ、該培養液から採取することにより、ヒトＦＧＦ２３を製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたヒトＦＧＦ２３を得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、EagleのMEM培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396 (1959)］、199培地[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)］若しくはＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中に必要に応じて、カナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ヒトＦＧＦ２３をコードする遺伝子の発現方法としては、例えば、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］が挙げられる。
　ヒトＦＧＦ２３の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞または生産させるヒトＦＧＦ２３の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ヒトＦＧＦ２３が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ヒトＦＧＦ２３を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してヒトＦＧＦ２３の生産量を上昇させることもできる。
　得られたヒトＦＧＦ２３は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ヒトＦＧＦ２３が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーまたはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　ヒトＦＧＦ２３が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ヒトＦＧＦ２３の不溶体を回収する。回収した該ヒトＦＧＦ２３の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ヒトＦＧＦ２３を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ヒトＦＧＦ２３またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ヒトＦＧＦ２３またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるヒトＦＧＦ２３は、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、マウスＦＧＦ２３ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269 (1978)]、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 (1979)］またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495 (1975)］などが用いられる。
　該骨髄腫細胞は、正常培地（グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地）で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ヒトＦＧＦ２３を含む抗原に反応し、ヒトＦＧＦ２３を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを行い、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラムまたはプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。タンパク質量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は以下に示すように、ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＦＧＦ２３への抗体の結合性を測定することなどにより行う。
　ヒトＦＧＦ２３を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。次に、当該プレートをＰＢＳなどで、よく洗浄した後、第２抗体として酵素試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。その後、当該プレートをＰＢＳなどでよく洗浄した後、基質を添加してプレートリーダーで各ウェルの吸光係数を測定することにより、ヒトＦＧＦ２３に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体、およびヒト化抗体の作製方法を示す。遺伝子組換えのマウス抗体、ラット抗体およびラビット抗体なども同様の方法で作製することができる。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 (1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 (1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Cytotechnol., 4, 173 (1990)］またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79 (1993)］などを用いる。動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)］または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 (1985)］とエンハンサー［Cell, 33, 717 (1983)］などが挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［J．Immunol． Methods， 167， 271（1994）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ若しくはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスターまたはラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、またはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（登録商標）Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58 (1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐＣＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］またはｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］などを用いる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Strategies, 5, 81 (1992)］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440 (1954)］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778 (1983)］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)］またはＪＭ１０５［Gene, 38, 275 (1985)］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
　決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することによって見出すことができる。
　また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターまたはヒト型キメラ抗体改変体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＶＨ、ＶＬ各々について各６本の合成ＤＮＡを設計する。さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの５’または３’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
　または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)］またはコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501 (1994）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変抗体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有するヒト化抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’または３’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
　また、上述キメラ抗体、ヒト化抗体などの遺伝子組換え抗体を作製する場合に、異なる２種類の抗体由来のＨ鎖（またはＶＨ）とＬ鎖（またはＶＬ）とを組み換えた抗体発現用ベクターを作製することで、ＶＬ置換キメラ抗体発現用ベクターを構築することができる。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のキメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞［American Type Culture Collection(ATCC)番号:CRL1651］を用いる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)］、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現用ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２、またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質、Ｎ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質若しくは細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)］などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）若しくはＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を向上させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などのタンパク質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680 (1970)］、またはウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］など用いて測定することができる。
３．精製モノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
　本発明の抗体または該抗体断片のヒトＦＧＦ２３に対する結合活性は、ＥＬＩＳＡ法または表面プラズモン共鳴法などを用いて測定できる。
　本発明の抗体または該抗体断片のヒトＦＧＦ２３中和活性は、上記のレポーターアッセイなどを用いて測定することができる。
４．本発明の抗ヒトＦＧＦ２３モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、ヒトＦＧＦ２３が関連する疾患の治療に用いることができる。
　本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体または該抗体断片のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などが挙げられる。
　乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤または噴霧剤などである。注射剤は、塩溶液若しくはブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
５．本発明の抗ヒトＦＧＦ２３モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いて、ヒトＦＧＦ２３を検出または測定することにより、ヒトＦＧＦ２３関連疾患を診断することができる。
　ヒトＦＧＦ２３関連疾患の診断は、例えば患者体内に存在するヒトＦＧＦ２３を免疫学的手法により検出または測定して行うことができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などを用いる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに酵素などで標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、基質を添加して反応液の吸光度を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。
　例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識またはビオチン標識などを用いる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素またはビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水または眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作成した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition,Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック (1987)］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステルまたはロフィンなどを用いる。
　ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル）［Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるヒトＦＧＦ２３と本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］Ａ抗体の分解物の検出
　国際公開第２００８／０９９９６９号に記載される抗ヒトＦＧＦ２３抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列を配列番号１、軽鎖可変領域アミノ酸配列を配列番号２に記載する。以下、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むヒトＩｇＧ１抗体をＡ抗体と記載する。
　Ａ抗体を実施例２と同様の方法で作製し、当該抗体溶液の溶媒を、１０ｍＭ　ＳｏｄｉｕｍＬ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、および０．０５ｍｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０を含む、ｐＨ４の溶媒に置換した。得られた抗体溶液を、４０度で１ヶ月間静置（以下、４０度１Ｍ検体と記載する）または－８０度で１ヶ月間静置した後解凍した（以下、イニシャル検体と記載する）。
　その後、４０度１Ｍ検体およびイニシャル検体を用いてＳＥＣ分析と還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＥＣ分析の結果、イニシャル検体においては、抗体の分解物に相当するピークが約３％程度を示した一方、４０度１Ｍ検体は９．３２％を示した。
　また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、イニシャル検体に比べ、４０度１Ｍ検体では、５０ｋＤａ付近のＨ鎖よりも約１０ｋＤａ小さいサイズに位置するバンド（バンドＡ）が顕著に濃くなっており、それと相関してＨ鎖のバンドが薄くなっていた。したがって、バンドＡはＨ鎖の分解物のバンドであり、４０度１Ｍ検体はＨ鎖で分解されることが示唆された。バンドＡについて、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した結果、Ａ抗体の重鎖可変領域の９９番目のＤと１００番目のＩで切断されていることが確認できた。
［実施例２］Ｉ１００改変抗体の作製
　Ａ抗体について、ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基であるＩを、表１に記載するアミノ酸残基と置換した抗体を以下に記載する方法で作製した。以下、表１に記載の抗体の一部または全部を、Ｉ１００改変抗体とも記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に記載する各抗体のＶＨのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対応する遺伝子断片を、シームレスクローニング法（ファスマック社に委託）を用いて発現ベクターに導入して必要なプラスミドを作製した。Ｈ鎖発現ベクターとしてはシグナル配列およびヒトγ鎖定常領域配列を有したｐＣＩ－ＯｔＣＡＧ＿ｈＧ１ベクターを用いた。いずれのクローンも、Ｈ鎖定常領域はヒトＩｇＧ１を使用した。
　また、Ｉ１００改変抗体のＶＬのアミノ酸配列は、いずれもＡ抗体のＶＬのアミノ酸配列（配列番号２）を使用した。Ｌ鎖発現ベクターとしてはシグナル配列およびヒトκ鎖定常領域配列を有したｐＣＩ－ＯｔＣＭＶ＿ｈＫベクターを用いた。完成したプラスミドは、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて大量調製した。
　次に、各抗体をＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して一過性に発現させた。プラスミドの導入の方法は添付書類に従った。Ｌ鎖発現ベクターとＨ鎖発現ベクターは、１：２の比率で混合して導入した。プラスミド導入後の細胞を、３７度、５％　ＣＯ２、１２５ｒｐｍの条件下で、３日間培養した。その後、細胞培養懸濁液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を通して培養上清を回収した。培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティー精製により、精製抗体を取得した。
　具体的には、カラムに充填したレジンをＰＢＳで平衡化した後、当該カラムに培養上清を添加し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｗａｓｈバッファー１（ＰＢＳ　ｗｉｔｈ　１Ｍ　ＮａＣｌ）、Ｗａｓｈバッファー２（２０ｍＭ　クエン酸、５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ５．０）で各１回洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭ　クエン酸、５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ３．４）を用いて抗体を溶出した。
　得られた抗体溶液に中和バッファー（１Ｍ　リン酸－ＮａＯＨ，ｐＨ７．０）を１／１０　量加えて中和し、ＮＡＰ２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて抗体溶液の溶媒をＰＢＳに置換した。バッファー置換後の抗体溶液について、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ（ミリポア社）を用いて限外濾過による濃縮を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して吸光度Ａ２８０を測定し、抗体溶液の濃度の測定と調整を行った。吸光係数は、Ｃ．Ｎ．Ｐａｃｅらの方法に従って（1995,Prot. Sci.4:2411-2423）それぞれのヒト化抗体のアミノ酸配列から算出した。
［実施例３］Ｉ１００改変抗体の抗原結合活性評価
　実施例２で得られたＩ１００改変抗体とＡ抗体について、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－２３（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ　Ｎｏ．２６０４－ＦＧ－０２５／ＣＦ）に対する結合活性を以下のように測定した。
　Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９）を用いて、添付のプロトコルに従い、Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙをＣＭ５センサーチップ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ１００５３０）に固定化した。
　Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、１μｇ／ｍＬに調製した抗体を１０μＬ／分の流速で３０秒間添加した。
　次に、１３０．５ｎｇ／ｍＬより２倍希釈で段階的に５濃度に調製したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－２３を３０μＬ／分の流速で、結合反応を２分間、解離反応を１０分間モニターした。測定は、シングルサイクル法を用いた。取得したセンサーグラムは、Ｂｉａ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。算出された各抗体の結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および解離定数［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ］の一部の結果を表２、表３に示す。表３のＡ＿１、Ａ＿２、Ａ＿３は、いずれもＡ抗体をさす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２、表３より、Ｉ１００Ａ抗体およびＩ１００Ｙ抗体を含むほぼ全てのＩ１００改変抗体で、Ａ抗体よりも抗原結合活性が低下していることが確認できた。
　また、Ｉ１００Ｗ、Ｉ１００Ｓ、Ｉ１００ＫおよびＩ１００Ｅ抗体では、Ａ抗体より抗原結合活性が低下していること、およびＩ１００Ｔ、Ｉ１００Ｑ、Ｉ１００ＭおよびＩ１００Ｆ抗体は、Ａ抗体と同程度の抗原結合活性を有することも確認できた。
［実施例４］Ｉ１００改変抗体の分解抑制効果の確認
　実施例２で得られたＩ１００改変抗体およびＡ抗体について、ＮＡＰ２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて抗体溶液の溶媒を１０ｍＭ　ＳｏｄｉｕｍＬ－ｇｌｕｔａｍａｔｅおよび２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌを含むｐＨ４の溶媒に置換した。得られた抗体溶液を、４０度で１ヶ月間または２週間静置した後、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。各抗体とＡ抗体とで、抗体の分解物に相当する４０ｋＤａ付近のバンドの濃さを比較した結果を表４に示す。Ａ抗体と比較して、改変抗体で当該バンドの濃さが低下している場合に、Ａ抗体と比較して、改変抗体で分解が抑制されたと判断した。
　表４の分解抑制効果の欄に記載される数値は、以下のように設定した。Ａ抗体よりも分解が抑制されていた抗体を１、Ａ抗体と同程度分解された抗体を２、Ａ抗体よりも分解が促進された抗体を３と記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、Ｉ１００Ａ、Ｉ１００Ｙ、Ｉ１００Ｗ、Ｉ１００Ｒ、Ｉ１００Ｎ、Ｉ１００Ｍ、Ｉ１００Ｈ、Ｉ１００Ｇ、およびＩ１００Ｄは、Ａ抗体よりも分解が抑制された。Ｉ１００Ｌ、Ｉ１００Ｖ、Ｉ１００Ｔ、Ｉ１００Ｓ、Ｉ１００Ｋ、Ｉ１００Ｆ、およびＩ１００Ｅは、Ａ抗体と同程度分解された。また、Ｉ１００Ｑは、Ａ抗体よりも分解が促進された。
［実施例５］Ａ抗体およびＩ１００改変抗体の熱安定性評価
　Ａ抗体およびＩ１００改変抗体の各抗体ドメイン（Ｆａｂ、ＣＨ２、ＣＨ３）の熱安定性を、示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ、以下ＤＳＣと記載する）の手法で評価した。
　測定サンプルは、Ｄ－ＰＢＳバッファーにて０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。測定には、Ｍｉｃｒｏ　Ｃａｌ　ＶＰ‐Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ＤＳＣ　ｓｙｓｔｅｍ（スペクトリス株式会社）を用いた。また、２５度から１００度まで１分間に１度昇温するプログラムで測定を実施した。得られた結果を表５および表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５および表６より、Ｉ１００Ａ、Ｉ１００Ｇ、Ｉ１００Ｎ、およびＩ１００Ｒは、ＦａｂのピークとＣＨ２のピークが重なって検出されており、Ｆａｂの熱安定性がＡ抗体より３～８度向上した。以上より、Ｉ１００Ａ、Ｉ１００Ｇ、Ｉ１００Ｎ、およびＩ１００Ｒは、Ａ抗体よりも構造安定性が高まっていることが確認できた。
［実施例６］Ｄ１０５改変抗体の作製
　実施例２と同様の方法で、Ａ抗体の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨのアミノ酸配列の１０５番目のＤを、表７に示すアミノ酸残基に置換した抗体（以下、当該抗体の一部、または全部をＤ１０５改変抗体とも記載する）を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例７］Ｄ１０５改変抗体の抗原結合活性評価
　実施例６で得られたＤ１０５改変抗体について、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－２３（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ　Ｎｏ．２６０４－ＦＧ－０２５／ＣＦ）に対する結合活性を実施例３と同様の方法で測定した。得られた結果を表８、表９に示す。表８のＡ＿１、Ａ＿２はいずれもＡ抗体の測定結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表８、表９より、Ｄ１０５改変抗体は、いずれもＡ抗体よりも抗原結合活性が低下していることが確認できた。
［実施例８］Ｄ１０５改変抗体の分解抑制効果の確認
　実施例６で得られたＤ１０５改変抗体について、実施例４と同様の方法で、抗体の分解抑制効果を確認した。なお、抗体溶液は、４０度で２週間静置した。
　得られた結果を表１０に示す。表１０の分解抑制効果の欄に記載される数値は、Ａ抗体よりも分解が抑制された抗体を１、Ａ抗体と同程度分解された抗体を２、Ａ抗体よりも分解が促進された抗体を３と記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０より、Ｄ１０５Ｅを除くＤ１０５改変抗体１７種は、Ａ抗体より分解が抑制されていることが確認できた。いずれの抗体も、Ａ抗体よりも、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで抗体の分解物に相当する約４０ｋＤａのバンドの濃さが大幅に低下しており、抗体の分解が大幅に抑制されていることが確認できた。
　［実施例９］Ｉ１００改変抗体およびＤ１０５改変抗体のヒトＦＧＦ２３に対する中和活性の測定
　実施例４及び実施例８でＡ抗体よりも抗体の分解が抑制されていたＩ１００改変抗体およびＤ１０５改変抗体（Ｉ００Ａ、Ｉ１００Ｎ、Ｉ１００Ｇ、Ｉ１００Ｙ、Ｉ１００Ｒ、Ｉ１００Ｄ、Ｉ１００Ｈ、Ｄ１０５Ａ、Ｄ１０５Ｆ、Ｄ１０５Ｇ、Ｄ１０５Ｈ、Ｄ１０５Ｉ、Ｄ１０５Ｋ、Ｄ１０５Ｌ、Ｄ１０５Ｍ、Ｄ１０５Ｐ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｒ、Ｄ１０５Ｖ、Ｄ１０５Ｗ、Ｄ１０５Ｙ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、およびＤ１０５Ｓ）２４種類について、以下に記載する方法でヒトＦＧＦ２３に対する中和活性を測定した。
　中和活性の測定には、マウスＥｇｒ１遺伝子由来のプロモーターを有するルシフェラーゼ発現ベクターで形質転換されたαＫｌｏｔｈｏ安定発現ＨＥＫ２９３細胞（以下、ｍＥｇｒ１／αＫＬ／ＨＥＫ２９３と記載する）を用いたプロモーターアッセイを用いた。ｍＥｇｒ１／αＫＬ／ＨＥＫ２９３は、Ｎａｔｕｒｅ　２００６　Ｄｅｃ　７；４４４（７１２０）に記載される方法と同様の方法で作製した。
　当該プロモーターアッセイは、ＦＧＦ２３がｍＥｇｒ１／αＫＬ／ＨＥＫ２９３上のαＫｌｏｔｈｏに結合すると、細胞内にシグナルが流れてルシフェラーゼ遺伝子が発現し、当該ルシフェラーゼの蛍光を検出することができる。ＦＧＦ２３中和抗体の存在により、ＦＧＦ２３が中和されると、当該蛍光強度が減少する。
　抗体は１０ｍＭ　ＳｏｄｉｕｍＬ－ｇｌｕｔａｍａｔｅおよび２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌを含むバッファーにより１００μｇ／ｍｌに希釈し、原液とした。ｍＥｇｒ１／αＫＬ／ＨＥＫ２９３の標準培養培地として、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に１０（ｖｏｌ％）のＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、１（ｖｏｌ）％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したものを用いた。
　抗体を上記標準培養培地で１０００倍希釈した濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）を最高濃度とし、√１０倍希釈で８段階の希釈系列を用意し、評価に供した。評価は３８４ｗｅｌｌプレートを用いて行った。細胞は２０００細胞／ｗｅｌｌ、添加するＦＧＦ２３濃度は４ｎｇ／ｍｌとした。ＦＧＦ２３は、実施例３と同様のものを標準培養培地で希釈して用いた。
　細胞に各抗体を添加後、２４時間培養し、その後ＦＧＦ２３を添加し４時間培養した。ルシフェラーゼの蛍光強度は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用い、マルチプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）で測定した。
　得られた結果について、ＦＧＦ２３添加時の蛍光強度を１００％、非添加時の蛍光強度を０％とし、各抗体添加時の蛍光強度の割合を算出し、そのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１に示すように、いずれの改変抗体も、Ａ抗体よりもＦＧＦ２３中和活性が低下していた。
［実施例１０］Ａ抗体の重鎖定常領域改変抗体の作製
　Ａ抗体の重鎖定常領域のアミノ酸改変抗体（以下、ＣＨ改変抗体と記載する）を以下に記載する方法で作製した。
　ＣＨ改変抗体は、Ａ抗体のＣＨ（ヒトＩｇＧ１）を、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ２ＡＡＡＳ（ヒトＩｇＧ２のＦｃについて、ＥＵインデックス２３４番目のバリンをアラニンに、２３７番目のグリシンをアラニンに、および３３１番目のプロリンをセリンに置換したヒトＩｇＧ２改変抗体）（Michael, S., et al., J.Immunol., 1997, 159: 3613; J.Immunol. 2000,164:4178-4184）、もしくはＩｇＧ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ（ヒト　ＩｇＧ４のＦｃについて、ＥＵインデックス２２８番目のセリンをプロリンに、２３５番目のロイシンをグルタミン酸に、４０９番目のアルギニンをリジンに置換したヒトＩｇＧ４改変抗体）（国際公開第２００６／０３３３８６号）のＣＨに置換したアイソタイプ抗体、またはＡ抗体もしくはＡ抗体のアイソタイプ抗体３種類のそれぞれのＦｃ領域に、ヒトおよびサルＦｃＲｎへの結合活性を向上させることが知られている下記（１０－１）～（１０－５）のＦｃアミノ酸改変を加えた合計２３種類の抗体を作製した。
〈Ｆｃアミノ酸改変〉
（１０－１）ＥＵインデックス２５２番目のＭをＹに、２５４番目のＳをＴに、および２５６番目のＴをＥに置換するアミノ酸改変（J. Biol. Chem. 2006b;281:23514-23524）
（１０－２）ＥＵインデックス２５０番目のＴをＱに、および４２８番目のＮをＬに置換するアミノ酸改変（J. Biol. Chem. 2004;279:6213-6216）
（１０－３）ＥＵインデックス４３４番目のＮをＡに置換するアミノ酸改変（J. Immunol. 1997;158:2211-2217）、
（１０－４）ＥＵインデックス３０８番目のＶをＰに置換するアミノ酸改変（Drug. Metab. Dispos. 2012a;40:1545-1555）
（１０－５）ＥＵインデックス４２８番目のＭをＬに、および４３４番目のＮをＳに置換するアミノ酸改変（Nat. Biotechnol. 2010;28:157-159）
　以下、Ａ抗体のＣＨをヒトＩｇＧ２のＣＨに置換したＣＨ改変抗体をＡ＿Ｇ２抗体と記載する。他のサブクラスに置換したＣＨ改変抗体も同様に記載する。
　以下、Ａ抗体のＦｃ領域に上記（１０－１）～（１０－５）のアミノ酸改変を加えたＣＨ改変抗体は、それぞれＡ＿ＹＴＥ抗体、Ａ＿ＱＬ抗体、Ａ＿Ａ抗体、Ａ＿Ｐ抗体、Ａ＿ＬＳ抗体と記載する。また、Ａ＿Ｇ２抗体、Ａ＿Ｇ２ＡＡＳ抗体、およびＡ＿Ｇ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ抗体に、上記（１０－１）～（１０－５）のアミノ酸改変を加えたＣＨ改変抗体も同様に記載する。
　実施例２で作製したＡ抗体のＨ鎖の可変領域と定常領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドを、ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理し、定常領域部分を除いたベクター断片を調製した。当該プラスミド断片をもとにして、ファスマック社にて上記２３種類のＣＨ改変抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を合成し適当な発現ベクターに導入して必要なプラスミドを作製した。得られたプラスミドを用いて、実施例２と同様の方法で抗体を調製した。
［実施例１１］Ａ抗体、およびＡ抗体のＣＨ改変抗体のＦｃＲｎへの結合活性の測定
　実施例２、１０で作製したＡ抗体、およびＡ抗体のＣＨ改変抗体について、以下に記載する方法で、ヒトおよびサルＦｃＲｎへの結合活性をＢｉａｃｏｒｅで測定した。
　ＨＢＳ－ＥＰ＋（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００６－６９）に１Ｍの塩酸（富士フィルム和光純薬株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．０８３－０１０９５）を添加して、ｐＨ６のＨＢＳ－ＥＰ＋を調整した。各抗体は、ＮＡＰ２５を用いて上記のｐＨ６のＨＢＳ－ＥＰ＋にバッファーを交換した。ヒトＦｃＲｎとサルＦｃＲｎも、ｐＨ６のＨＢＳ－ＥＰ＋を用いて希釈した。実験で用いたヒトＦｃＲｎおよびサルＦｃＲｎは、以下のように作製した。
　ヒトＦｃＲｎ（可溶型分子として発現させるために、ヒトＦｃＲｎの全長アミノ酸配列のうち、１～２９７番目のアミノ酸のみを使用）とそのＣ末端に６個のヒスチジンを付加したヒトＦｃＲｎ－Ｈｉｓ　ｔａｇ（アミノ酸配列：配列番号５４）とヒトβ２ミクログロブリン（アミノ酸配列：配列番号５５）をコードするＤＮＡ配列を哺乳細胞の発現プラスミドのＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。当該プラスミドを用いて、実施例２に示す方法と同様に、Ｅｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して一過性に発現させた。
　サルＦｃＲｎ（可溶型分子として発現させるために、サルＦｃＲｎの全長アミノ酸配列のうち、１～２９７番目のアミノ酸のみを使用）とそのＣ末端に６個のヒスチジンを付加したサルＦｃＲｎ－Ｈｉｓ　ｔａｇ（アミノ酸配列：配列番号５６）とサルβ２ミクログロブリン（アミノ酸配列：配列番号５７）についても、ヒトＦｃＲｎ－Ｈｉｓ　ｔａｇと同様の方法で一過性に発現させた。
　それぞれの培養上清を取得後、Ｎｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３０２１０）を用いて、ヒトとサルＦｃＲｎを精製した。精製方法については、Ｎｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅのマニュアルに記載されている標準的な手法に従って実施した。
　Ｂｉａｃｏｒｅの測定は、以下の条件で実施した。Ｔｅｔｒａ　Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＢＳＡ　Ｆｒｅｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）をＣＭ５センサーチップ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ１００５３０）に固定化した。Ｔｅｔｒａ　Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ＢＳＡ　Ｆｒｅｅを固定化したフローセルに、１０μｇ／ｍＬに調製したヒトＦｃＲｎ及びサルＦｃＲｎを１０μＬ／分の流速で１２０秒間添加した。次に、４５０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に５濃度に調製した各Ｆｃ改変抗体を３０μＬ／分の流速で、結合反応を２分間、解離反応を５分間モニターした。
　測定は、マルチサイクル法で行った。取得したセンサーグラムは、Ｂｉａ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を用いて解析し、各抗体の解離定数［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ］を算出した。その結果を表１２、１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１２および表１３に示すように、Ａ抗体およびＡ抗体のアイソタイプ（Ａ２＿Ｇ２、Ａ＿Ｇ２ＡＡＡＳ、およびＡ＿ＩｇＧ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ抗体）よりも、Ｆｃに実施例１０（１）～（５）に記載するアミノ酸改変を導入したＣＨ改変抗体の方が、ヒトＦｃＲｎ及びサルＦｃＲｎへの結合活性が向上していることが確認できた。
［実施例１２］Ｉ１００およびＤ１０５改変抗体のＣＨ改変抗体の作製
　実施例４、及び実施例８でＡ抗体よりも抗体の分解が抑制されることが確認できたＩ１００およびＤ１０５改変抗体のうち、Ｄ１０５Ｎ、Ｉ１００Ａ、Ｉ１００Ｈ、及びＩ１００Ｙ抗体のそれぞれについて、下記（１２－１）～（１２－５）のアミノ酸改変を加えたＣＨ改変抗体を以下に記載する方法で作製した。
（１２－１）ＥＵインデックス２５２番目のＭをＹに、２５４番目のＳをＴに、および２５６番目のＴをＥに置換するアミノ酸改変
（１２－２）ＣＨをヒトＩｇＧ１からヒトＩｇＧ２に置換し、ＥＵインデックス２５２番目のＭをＹに、２５４番目のＳをＴに、および２５６番目のＴをＥに置換するアミノ酸改変
（１２－３）ＣＨをヒトＩｇＧ１からヒトＩｇＧ２に置換し、ＥＵインデックス４２８番目のＭをＬに、４３４番目のＮをＳに置換するアミノ酸改変
（１２－４）ＣＨをヒトＩｇＧ１からヒトＩｇＧ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋに置換し、ＥＵインデックス３０８番目のＶをＰに置換するアミノ酸改変
（１２－５）ＣＨをヒトＩｇＧ１からヒトＩｇＧ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋに置換し、ＥＵインデックス４２８番目のＭをＬに、および４３４番目のＮをＳに置換するアミノ酸改変
　以下、Ｄ１０５Ｎ抗体において、上記（１２－１）～（１２－５）のアミノ酸改変を行ったＣＨ改変抗体を、それぞれＤ１０５Ｎ＿ＹＴＥ、Ｄ１０５Ｎ＿Ｇ２＿ＹＴＥ、Ｄ１０５Ｎ＿Ｇ２＿ＬＳ、Ｄ１０５Ｎ＿Ｇ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ＿Ｐ、およびＤ１０５Ｎ＿Ｇ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ＿ＬＳ抗体と記載する。その他の抗体についても同様の記載をする。
　なお、上記（１２－１）～（１２－５）のアミノ酸改変を行ったＣＨ改変抗体のＣＨのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２に記載する。
　実施例１０で作製したプラスミドをＢｓｔｚ１７ＩとＮｈｅＩで制限酵素処理し、可変領域部分を除いたベクター断片を調製した。当該プラスミド断片をもとに、ファスマック社にて、Ｄ１０５Ｎ、Ｉ１００Ａ、Ｉ１００Ｈ、及びＩ１００Ｙ抗体のＶＨのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を合成し、適当な発現ベクターに導入して必要なプラスミドを作製した。得られたプラスミドを用いて、実施例２と同様の方法で、各抗体を調製した。
［実施例１３］重鎖定常領域改変抗体のＦＧＦ２３中和活性の測定
　実施例１２で調製した２０種類のＣＨ改変抗体について、実施例９と同様の方法で、ＦＧＦ２３中和活性を測定した。得られた結果を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１４に示すように、可変領域のアミノ酸配列が同じ抗体は、定常領域のアミノ酸配列が変わっても、同程度のＦＧＦ２３中和活性を示した。以上より、各抗体における重鎖定常領域のアミノ酸改変は、抗体のＦＧＦ２３中和活性に影響しないことが確認できた。
［実施例１４］抗原結合活性を向上させる改変抗体の作製
　Ｉ１００ＡとＩ１００Ｙ抗体について、表２および表３に記載する抗原結合活性を向上させるために、Ａｂｗｉｚ　Ｂｉｏ社にてファージディスプレイ法を用いたアフィニティマチュレーションを行い、下記（１４－１）～（１４－９）のアミノ酸配列情報を取得した。
（１４－１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５１番目のアミノ酸をＶに、５４番目のアミノ酸をＦに、５５番目のアミノ酸をＷに、５７番目のアミノ酸をＲに、５８番目のアミノ酸をＷに、および１００番目のアミノ酸をＡに置換したＶＨ（Ｈ２Ｂ１１＿Ａ、アミノ酸配列：配列番号３８）
（１４－２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸をＬに、５４番目のアミノ酸をＷに、５５番目のアミノ酸をＨに、５７番目のアミノ酸をＴに、５８番目のアミノ酸をＦに、および１００番目のアミノ酸をＡに置換したＶＨ（Ｊ２Ｈ２Ｂ９＿Ａ、アミノ酸配列：配列番号３９）
（１４－３）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸をＶに、５４番目のアミノ酸をＦに、５５番目のアミノ酸をＣに、５７番目のアミノ酸をＦに、５８番目のアミノ酸をＶに、および１００番目のアミノ酸をＡに置換したＶＨ（Ｊ２Ｈ２Ｅ９＿Ａ、アミノ酸配列：配列番号４０）
（１４－４）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５１番目のアミノ酸をＬに、５４番目のアミノ酸をＷに、５５番目のアミノ酸をＴに、５７番目のアミノ酸をＹに、５８番目のアミノ酸をＲに、および１００番目のアミノ酸をＡに置換したＶＨ（２Ｈ２Ｅ１＿Ａ、アミノ酸配列：配列番号４１）
（１４－５）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５４番目のアミノ酸をＷに、５５番目のアミノ酸をＶに、５７番目のアミノ酸をＲに、５８番目のアミノ酸をＡに、および１００番目のアミノ酸をＡに置換したＶＨ（２Ｈ２Ｅ５＿Ａ、アミノ酸配列：配列番号４２）
（１４－６）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５１番目のアミノ酸をＶに、５４番目のアミノ酸をＹに、５５番目のアミノ酸をＲに、５７番目のアミノ酸をＫに、５８番目のアミノ酸をＷに、および１００番目のアミノ酸をＹに置換したＶＨ（２Ｈ２Ｅ８＿Ｙ、アミノ酸配列：配列番号４３）
（１４－７）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬにおいて、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸をＭに、９２番目のアミノ酸をＹに、９４番目のアミノ酸をＤに、９６番目のアミノ酸をＮに置換したＶＬ（Ｌ３Ｇ１２、アミノ酸配列：配列番号４４）
（１４－８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬにおいて、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２８番目のアミノ酸をＤに、２９番目のアミノ酸をＶに、３１番目のアミノ酸をＴに、３４番目のアミノ酸をＬに置換したＶＬ（Ｌ１Ｈ８、アミノ酸配列：配列番号４５）
（１４－９）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬにおいて、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸をＬに、９２番目のアミノ酸をＹに、９４番目のアミノ酸をＤに、９６番目のアミノ酸をＤに置換したＶＬ（２Ｌ３Ｈ７、アミノ酸配列：配列番号４６）
［実施例１５］改変抗体の調製
　実施例１４で得られたアミノ酸配列情報および（１５－１）に記載するＶＨのアミノ酸配列を用いて、表１５に記載するＡ－１からＡ－８の改変抗体を作製した。
（１５－１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸をＬに、５４番目のアミノ酸をＷに、５５番目のアミノ酸をＨに、５７番目のアミノ酸をＴに、５８番目のアミノ酸をＦに、および１００番目のアミノ酸をＹに置換したＶＨ（Ｊ２Ｈ２Ｂ９＿Ｙ、アミノ酸配列：配列番号４７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　実施例１２と同様の方法で、各抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドを作製し、実施例２と同様の方法で当該プラスミドから抗体を調製した。
［実施例１６］改変抗体の評価
　実施例１５で調製した８種類の改変抗体と、コントロールとしてＡ抗体を用いて、抗原結合活性、ＦＧＦ２３中和活性、及び熱安定性を評価した。いずれの改変抗体についても、バッファーはＤ－ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社、Ｃｏｄｅ　１４２４９－２４）、濃度は０．５ｍｇ／ｍＬに調整されたサンプルを目的に応じて希釈することで各種測定を行った。
１６－１）改変抗体の抗原結合活性の測定
　実施例３と同様の方法で、ヒトＦＧＦ２３への結合活性を測定した。なお、センサーチップは、ＣＭ５センサーチップにＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化する代わりに、ＰｒｏｔｅｉｎＡセンサーチップ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．２９１２７５５５）を用いて実施した。各抗体の結合速度定数（ｋａ）、および解離速度定数（ｋｄ）およびから算出された解離定数［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ］を表１６に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６より、Ａ－１からＡ－８のいずれの抗体も、Ａ抗体と同程度の抗原結合活性を有することが確認できた。
　実施例３でI１００Ａ抗体およびI１００Ｙ抗体の抗原結合活性はＡ抗体よりも低下した。また、Ａ－１からＡ－８のいずれの抗体も、ＶＨの１００番目のアミノ酸残基はＡまたはＹである。
　以上より、Ａ抗体について、ＶＨの１００番目のアミノ酸残基をＡまたはＹに置換すると、抗体の抗原結合活性が低下するが、Ａ－１からＡ－８抗体が有する更なるアミノ酸残基の置換により、抗体の抗原結合活性がＡ抗体と同程度にまで向上することが確認できた。
１６－２）ヒトＦＧＦ２３中和活性の測定
　改変抗体について、実施例９と同様の方法で、ヒトＦＧＦ２３中和活性を測定した。得られた結果を表１６に示す。表１６より、いずれの改変抗体も、同一測定ロットでのＡ抗体と同程度のＦＧＦ２３中和活性を有することが確認できた。
　実施例９ではＩ１００Ａ抗体およびＩ１００Ｙ抗体のＦＧＦ２３中和活性はＡ抗体よりも低下した。また、Ａ－１からＡ－８のいずれの抗体も、ＶＨの１００番目のアミノ酸残基はＡまたはＹである。
　以上より、Ａ抗体について、ＶＨの１００番目のアミノ酸残基のＡまたはＹに置換すると、抗体のＦＧＦ２３中和活性が低下するが、Ａ－１からＡ－８抗体が有する更なるアミノ酸残基の置換により、抗体の中和活性がＡ抗体と同程度にまで向上することが確認できた。
１６－３）等電点の確認
　各抗体の等電点は、ｉＣＥ３　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｉｍｐｌｅ社）を使用した。測定の担体として、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ　３－１０　ｆｏｒ　ＩＥＦ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７－０４５６－０１）を使用し、酸性マーカーとしてｐＩ　Ｍａｒｋｅｒ　５．１２（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｉｍｐｌｅ社、Ｃａｔ．　Ｎｏ．１０２２２４）、塩基性マーカーとしてｐＩ　Ｍａｒｋｅｒ　９．７７（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｉｍｐｌｅ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０２２１９）を使用した。測定方法は、標準的なプロトコルに従った。
　得られた結果を表１６に示す。表１６より、いずれの改変抗体も、Ａ抗体よりｐＩが低下していることが確認できた。
１６－４）抗体の分解抑制率の確認
　実施例４と同様の方法で、Ａ－１抗体からＡ－８抗体について、分解抑制率を確認した。なお、本実施例においては、各抗体を、４０度で２週間静置し、バイオアナライザー電気泳動システム（アジレント・テクノロジー株式会社）とＡｇｉｌｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ２３０キット（アジレント・テクノロジー株式会社、Ｃａｔ．５０６７－１５１７）を用いて、抗体の分解を確認した。サンプル調製と泳動条件については、キットに付属するプロトコルに従って実験を行った。得られたエレクトロフェログラムにおいて、抗体のＨ鎖のバンドは６３ｋＤａ、抗体の分解物に相当するバンドは約５５ｋＤａに検出された。当該抗体の分解物に相当するバンドのピーク面積率（％）、およびＡ抗体に対する各抗体の分解バンドピーク面積率の比（％）を表１７と表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１７と表１８に示すように、Ａ抗体と比較し、Ａ－１抗体からＡ－８抗体の全てで分解が抑制されていることが確認できた。
１６－５）熱安定性の確認
　Ａ抗体、Ａ＿ＹＴＥ抗体、Ａ－１抗体、Ａ－３抗体、Ａ－５抗体、及びＡ－８抗体の６種の抗体について、実施例５に記載の方法と同様に、熱安定性評価を実施した。得られた結果を、表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１９に示すように、Ａ抗体とＡ＿ＹＴＥ抗体とでは、抗体の各部位の熱安定性に変化がなかった。一方、Ａ＿ＹＴＥ抗体と同じ重鎖定常領域アミノ酸配列を有するＡ－１抗体とＡ－３抗体では、Ａ抗体およびＡ＿ＹＴＥ抗体よりもＦａｂの熱安定性が約３度向上していることが確認できた。
［実施例１７］Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体の作製
　表２０に記載するＡ－９抗体およびＡ－１０抗体を実施例２と同様の方法で作製した（以下、Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体を改変抗体と記載する場合もある）。
　Ａ－９抗体のＬ鎖発現ベクターは、実施例２のｐＣＩベクターではなく、ｐｃＤＮＡ３．４ベクター（インビトロジェン）を用いた。また、Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体ともに、Ｌ鎖の発現ベクターとＨ鎖の発現ベクターを１：１の比率で混合して細胞に導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　Ａ－９抗体のＶＬは、Ｉ１００Ａ抗体について、Ａｂｗｉｚ　Ｂｉｏ社にてファージディスプレイ法を用いたアフィニティマチュレーションを行い、下記のアミノ酸配列情報を取得した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬにおいて、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸をＷに、９４番目のアミノ酸をＤに、９６番目のアミノ酸をＤに置換したＶＬ（アミノ酸配列：配列番号５８）
　Ａ－１０抗体のＶＬは、下記のＶＬを設計し、用いた。
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬにおいて、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸をＹに、９４番目のアミノ酸をＤに、９６番目のアミノ酸をＤに置換したＶＬ（アミノ酸配列：配列番号５９）
［実施例１８］改変抗体の評価
　実施例１７で調製した２種類の改変抗体と、コントロールとしてＡ抗体を用いて、抗原結合活性、ＦＧＦ２３中和活性、及び熱安定性を評価した。いずれの改変抗体についても、バッファーはＤ－ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社、Ｃｏｄｅ　１４２４９－２４）、濃度は１ｍｇ／ｍＬに調整されたサンプルを目的に応じて希釈することで各種測定を行った。
（１８－１）改変抗体の抗原結合活性の測定
　実施例１６と同様の方法で、ヒトＦＧＦ２３への結合活性を測定した。各抗体の結合速度定数（ｋａ）、および解離速度定数（ｋｄ）およびから算出された解離定数［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ］を表２１に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表２１より、Ａ－９抗体はＡ抗体の２倍、Ａ－１０抗体はＡ抗体と同程度の抗原結合活性を有することが確認できた。実施例３では、Ｉ１００Ａ抗体およびＩ１００Ｙ抗体でＡ抗体よりも抗原結合活性が低下した。また、Ａ－９抗体およびＡ－１０抗体は、ＶＨの１００番目のアミノ酸残基がそれぞれＡおよびＹである。
　以上より、Ａ抗体のＶＨの１００番目のアミノ酸残基をＡまたはＹに置換すると、抗体の抗原結合活性が低下するが、Ａ－９抗体およびＩ１００Ｙ抗体が有する更なるアミノ酸残基の置換により、抗体の結合活性がＡ抗体と同等以上に向上することが確認できた。
（１８－２）ヒトＦＧＦ２３中和活性の測定
　改変抗体について、実施例９と同様の方法で、ヒトＦＧＦ２３中和活性を測定した。得られた結果を表２１に示す。表２１より、Ａ－９抗体はＡ抗体の３倍、Ａ－１０抗体はＡ抗体の２倍強いＦＧＦ２３中和活性を有することが確認できた。
　実施例９では、Ｉ１００ＡやＩ１００ＹはＡ抗体よりも中和活性が低下した。また、Ａ－９抗体およびＡ－１０抗体は、ＶＨの１００番目のアミノ酸残基がそれぞれＡおよびＹである。
　以上より、Ａ抗体についてＶＨの１００番目のアミノ酸残基をＡまたはＹに置換すると抗体のＦＧＦ２３中和活性が低下するが、Ａ－９抗体およびＡ－１０抗体が有する更なるアミノ酸残基の置換により、抗体のＦＧＦ２３中和活性がＡ抗体以上に向上することが確認できた。
［実施例１９］改変抗体の分解抑制率の確認
　Ａ－１抗体、Ａ－３抗体、Ａ－５抗体、Ａ－８抗体の４種類の改変抗体と、コントロールとしてＡ抗体を用いて、分解抑制率を確認した。
　なお、本実施例で用いた抗体は、目的遺伝子配列を哺乳動物用発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に導入後、哺乳動物細胞用培地上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を用いたアフィニティー精製及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより、精製抗体を取得した。ＮＡＰ２５（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を用いて抗体溶液の溶媒を１０ｍＭ　ＳｏｄｉｕｍＬ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、および０．０５ｍｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｓｅ　８０を含むｐＨ４およびｐＨ４．５の溶媒に置換し、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬとした。
　得られた抗体溶液を、４０度で１ヶ月間および２５度で３ヶ月間静置した後に－８０度で凍結した。当該抗体溶液を融解した後、生物製剤解析システムＰＡ８００Ｐｌｕｓ（ＳＣＩＥＸ社）を用いて、抗体の分解を確認した。サンプル調製や分析などの基本条件は、Ｏｓｃａｒ　Ｓａｌａｓ－Ｓｏｌａｎｏらの方法に従って実施し（2006,Anal. Chem.:6583-6594）、適宜変更した。
　当該抗体の分解物に相当するバンドのピーク面積率（％）について、ｐＨ４．５での結果は表２２に、ｐＨ５．０での結果は表２３に示した。溶媒置換直後に－８０度で凍結したサンプルをＩｎｉｔｉａｌ、４０度で１ヶ月間静置した後に－８０度で凍結したサンプルを４０℃１Ｍ、２５度で３ヶ月間静置した後に－８０度で凍結したサンプルを２５℃３Ｍと表記した。いずれのサンプルも同条件で融解後、測定を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　表２２と表２３に示すように、実施例１６同様、バッファー条件がｐＨ４．５およびｐＨ５．０、保存条件が４０度で１ヶ月間および２５度で３ヶ月間であっても、Ａ抗体と比較し、Ａ－１抗体、Ａ－３抗体、Ａ－５抗体、およびＡ－８抗体は全て分解が抑制されていることが確認できた。
［実施例２０］改変抗体の分解抑制率の確認　
　実施例１７で調製した２種類の改変抗体と、コントロールとしてＡ抗体及びＡ－１抗体を用いて、分解抑制率を確認した。
　なお、本実施例で用いたＡ抗体及びＡ－１抗体は、目的遺伝子配列を哺乳動物用発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に導入後、哺乳動物細胞用培地上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を用いたアフィニティー精製及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより、精製抗体を取得した。ＮＡＰ２５（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社）を用いて抗体溶液の溶媒を１０ｍＭ　ＳｏｄｉｕｍＬ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、２６２ｍＭ　Ｄ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、および０．０５ｍｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅを含むｐＨ４、ｐＨ４．５、およびｐＨ５の溶媒に置換し、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬとした。
　得られた抗体溶液を、４０度で１ヶ月間静置した後、マイクロチップ型電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ（パーキンエルマー社）とＰｒｏｔｅｉｎ　Ｃｌｅａｒ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（パーキン・エルマー社、Ｃａｔ．ＣＬＳ９６００１４）を用いて、抗体の分解を確認した。サンプル調製と泳動条件については、キットに付属するプロトコルに従って実験を行った。
　還元条件での測定結果における当該抗体の分解物に相当するバンドのピーク面積率（％）について、ｐＨ４．０での結果は表２４に、ｐＨ４．５での結果は表２５に、ｐＨ５．０での結果は表２６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表２４、表２５および表２６に示すように、Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体についても、バッファー条件がｐＨ４．０、ｐＨ４．５またはｐＨ５．０、保存条件が４０度で１ヶ月間において、Ａ抗体と比較し分解が抑制されていることが確認できた。
［実施例２１］
　雄性カニクイザルに対し、被験抗体を単回皮下投与した時の薬理作用の持続性を確認するため、血清中の無機リン濃度（ｍｇ／ｄＬ）の測定を実施した。
　被験抗体としてＡ８抗体（１．８　ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。投与後５６日間、経時的に採血を行い、各時点での血清中の無機リン濃度を測定した。リン濃度の測定は、クリナライザ（ＪＣＡ－ＢＭ６０７０）を用いて、ＰＮＰ－ＸＤＨ法により測定した。
　得られた結果を表２７に示す。Ａ－８抗体投与後、血清中の無機リン濃度は投与後３日目から上昇し、投与後５６日目でもベースラインの無機リン濃度（表２７のＤａｙ０でのリン濃度）に比べて高値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 
 
　一方で、ブロスマブ（ＫＲＮ２３，クリースビータ）は、３ｍｇ／ｋｇをカニクイザルに単回皮下投与した後、投与後３日目から血清中の無機リン濃度が上昇し、投与後４２日目には媒体投与群およびベースライン（投与０日）と同等まで無機リン濃度が低下する（クリースビータ皮下注　医薬品インタビューフォーム２０２１年１２月改定（第５版）Ｐ４４）。
　したがってＡ－８抗体は、ブロスマブに比べて、カニクイザルでの血清中の無機リン濃度持続時間が長いことが示された。
　また、Ａ－１抗体、Ａ－５抗体を、３ｍｇ／ｋｇでカニクイザルに皮下投与し、上記と同様の方法で血清中の無機リン濃度を測定した。その結果、これらの抗体は、ブロスマブと同様に、投与後３日目から血清中の無機リン濃度が上昇し、投与後４２日目にはベースラインまで無機リン濃度が低下した。
　ブロスマブの重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号５３で表され、Ａ－１抗体、Ａ－５抗体、Ａ－８抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号４８で表される。同一の重鎖定常領域アミノ酸配列を有するＡ－１抗体、Ａ－５抗体およびＡ－８抗体のうち、Ａ－８抗体のみがカニクイザルでブロスマブよりも長く血清中の無機リン濃度が持続した。
　したがって、Ａ－８抗体がブロスマブやＡ－１抗体、Ａ－５抗体よりもカニクイザルでの血清中の無機リン濃度の持続時間が長いことは、重鎖定常領域のアミノ酸配列の違いではなく、可変領域のアミノ酸配列の違いによるものであることが示唆された。
［実施例２２］
　実施例２１と同様の方法で、血清中の無機リン濃度（ｍｇ／ｄＬ）を測定した。被験抗体としてＡ－９抗体、Ａ－１０抗体（３．０ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。投与後５７日間、経時的に採血を行い、各時点での血清中の無機リン濃度を測定した。
　得られた結果を表２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表２８に示すように、実施例２２のＡ－８抗体と同様に、Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体の投与後、血清中の無機リン濃度は投与後３日目から上昇し、投与後５７日目でもベースラインの無機リン濃度（表２８におけるＤａｙ０でのリン濃度）に比べて高値を示した。
　Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、Ａ－１抗体、Ａ－５抗体およびＡ－８抗体の重鎖定常領域アミノ酸配列と同じ、配列番号４８で表されるアミノ酸配列である。
　したがって、Ａ－９抗体、Ａ－１０抗体についても、ブロスマブやＡ－１抗体、Ａ－５抗体よりもカニクイザルでの血清中の無機リン濃度の持続時間が長いことは、重鎖定常領域のアミノ酸配列の違いではなく、Ａ－８抗体と同様に可変領域のアミノ酸配列の違いによるものであることが示唆された。
　本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加え得ることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２２年８月１０日付けで出願された日本特許出願（特願２０２２－１２８０１１）及び２０２２年１０月１２日付けで出願された日本特許出願（特願２０２２－１６４２５６）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：Ａ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２：Ａ抗体のＶＬのアミノ酸配列
配列番号３：Ｉ１００Ａ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号４：Ｉ１００Ｌ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号５：Ｉ１００Ｖ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号６：Ｉ１００Ｙ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号７：Ｉ１００Ｗ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号８：Ｉ１００Ｔ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号９：Ｉ１００Ｓ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０：Ｉ１００Ｒ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１１：Ｉ１００Ｑ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１２：Ｉ１００Ｎ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１３：Ｉ１００Ｍ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１４：Ｉ１００Ｋ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１５：Ｉ１００Ｈ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１６：Ｉ１００Ｇ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７：Ｉ１００Ｆ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１８：Ｉ１００Ｅ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１９：Ｉ１００Ｄ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２０：Ｄ１０５Ａ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２１：Ｄ１０５Ｅ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２２：Ｄ１０５Ｆ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２３：Ｄ１０５Ｇ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２４：Ｄ１０５Ｈ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２５：Ｄ１０５Ｉ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２６：Ｄ１０５Ｋ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２７：Ｄ１０５Ｌ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２８：Ｄ１０５Ｍ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２９：Ｄ１０５Ｐ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３０：Ｄ１０５Ｑ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３１：Ｄ１０５Ｒ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３２：Ｄ１０５Ｖ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３３：Ｄ１０５Ｗ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３４：Ｄ１０５Ｙ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３５：Ｄ１０５Ｔ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３６：Ｄ１０５Ｎ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３７：Ｄ１０５Ｓ抗体のＶＨのアミノ酸配列
配列番号３８：Ｈ２Ｂ１１＿Ａのアミノ酸配列
配列番号３９：Ｊ２Ｈ２Ｂ９＿Ａのアミノ酸配列
配列番号４０：Ｊ２Ｈ２Ｅ９＿Ａのアミノ酸配列
配列番号４１：２Ｈ２Ｅ１＿Ａのアミノ酸配列
配列番号４２：２Ｈ２Ｅ５＿Ａのアミノ酸配列
配列番号４３：２Ｈ２Ｅ８＿Ｙのアミノ酸配列
配列番号４４：Ｌ３Ｇ１２のアミノ酸配列
配列番号４５：Ｌ１Ｈ８のアミノ酸配列
配列番号４６：２Ｌ３Ｈ７のアミノ酸配列
配列番号４７：Ｊ２Ｈ２Ｂ９＿Ｙのアミノ酸配列
配列番号４８：ＹＴＥのＣＨのアミノ酸配列
配列番号４９：Ｇ２＿ＹＴＥのＣＨのアミノ酸配列
配列番号５０：Ｇ２＿ＬＳのＣＨのアミノ酸配列
配列番号５１：Ｇ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ＿ＰのＣＨのアミノ酸配列
配列番号５２：Ｇ４ＰＥ＿Ｒ４０９Ｋ＿ＬＳのＣＨのアミノ酸配列
配列番号５３：Ｇ１定常領域のアミノ酸配列
配列番号５４：ヒトＦｃＲｎ細胞外ドメインＨｉｓ－ｔａｇ体のアミノ酸配列
配列番号５５：ヒトβ２ミクログロブリンのアミノ酸配列
配列番号５６：カニクイザルＦｃＲｎ細胞外ドメインＨｉｓ－ｔａｇ体のアミノ酸配列
配列番号５７：カニクイザルβ２ミクログロブリンのアミノ酸配列
配列番号５８：Ａ－９抗体のＶＬのアミノ酸配列
配列番号５９：Ａ－１０抗体のＶＬのアミノ酸配列

Claims (17)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（以下、ＶＨと記載）および配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記載）を含む抗体において、少なくともＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基または１０５番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、ＦＧＦ２３に結合する抗体または該抗体断片。
  2. 　ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、アスパラギン残基、グリシン残基、チロシン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、トリプトファン残基、およびメチオニン残基から選ばれる１のアミノ酸残基に置換された、請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
  3. 　ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、またはチロシン残基に置換された、請求項１または２に記載の抗体または該抗体断片。
  4. 　ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の１０５番目のアミノ酸残基が、アラニン残基、フェニルアラニン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、リシン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、プロリン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、およびセリン残基から選ばれる１のアミノ酸残基に置換された、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  5. 　前記抗体が下記（ａ１）～（ａ４）から選ばれる１の置換をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
    （ａ１）ＶＨにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列の５０番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換、５４番目のアミノ酸残基のトリプトファン残基への置換、５５番目のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換、５７番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および５８番目のアミノ酸残基のフェニルアラニン残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、
    （ａ２）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９１番目のアミノ酸残基のメチオニン残基またはロイシン残基への置換、９２番目のアミノ酸残基のチロシン残基への置換、９４番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、および９６番目のアミノ酸残基のアスパラギン残基またはアスパラギン酸残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、
    （ａ３）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の２８番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、２９番目のアミノ酸残基のバリン残基への置換、３１番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および３４番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換、並びに
    （ａ４）ＶＬにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸残基のチロシン残基またはトリプトファン残基への置換、９４番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換、および９６番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸残基への置換から選ばれる少なくとも１の置換。
  6. 　前記抗体が下記（ｃ１）～（ｃ１０）から選ばれる１である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
    （ｃ１）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ２）配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ４）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ５）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ６）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ７）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ８）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、並びに
    （ｃ１０）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
  7. 　前記抗体のサブクラスがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  8. 　前記抗体のＦｃ領域が下記（ｄ１）～（ｄ５）から選ばれる１である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
    （ｄ１）ＥＵインデックス２５２番目のアミノ酸残基のチロシン残基への置換、２５４番目のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、および２５６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸残基への置換を含むＦｃ領域、
    （ｄ２）ＥＵインデックス４２８番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換、および４３４番目のアミノ酸残基のセリン残基への置換を含むＦｃ領域、
    （ｄ３）ＥＵインデックス３０８番目のアミノ酸残基のプロリン残基への置換を含むＦｃ領域、
    （ｄ４）ＥＵインデックス２５０番目のアミノ酸残基のグルタミン残基への置換、および４２８番目のアミノ酸残基のロイシン残基への置換を含むＦｃ領域、並びに
    （ｄ５）ＥＵインデックス４３４番目のアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含むＦｃ領域。
  9. 　前記抗体の重鎖定常領域が配列番号４８、４９、５０、５１、または５２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  10. 　前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる１である請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体断片。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片をコードする塩基配列を有する核酸。
  12. 　請求項１１に記載の核酸を含有するベクター。
  13. 　請求項１２に記載のベクターを含む形質転換細胞。
  14. 　請求項１３に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、培養物から抗体または該抗体断片を採取することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
  15. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含む組成物。
  16. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含むヒトＦＧＦ２３関連疾患の治療薬。
  17. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含むヒトＦＧＦ２３関連疾患の治療方法。
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