TW202413406A - 抗fgf23抗體或該抗體片段 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種抗體或該抗體片段,上述抗體係於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之重鏈可變區(以下記載為VH)及包含序列編號2所示之胺基酸序列之輕鏈可變區(以下記載為VL)的抗體中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基或第105位胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基而成,且與FGF23結合。
Description
本發明係關於一種抗FGF23抗體或該抗體片段。
成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,以下記載為FGF)形成結構上類似之一組多肽家族,不僅具有成纖維細胞生長活性,還報告了中胚層或神經外胚層之生長或血管新生作用、發育階段之肢芽形成等多種作用。又,於成人中,亦作為組織之維持或修復、再生或代謝等穩態因子發揮作用(非專利文獻1)。
哺乳動物中,已知有22種屬於FGF家族之蛋白質。人類中,已鑑定出FGF1至FGF23之22種(FGF15除外)。又,人類FGF家族由約150~300個胺基酸構成,核心序列之約120個胺基酸以約30~60%之比例一致。FGF家族分為作為分泌蛋白質表現,作用於受體酪胺酸激酶者,及作為細胞內蛋白質表現,作用於電位依賴性鈉通道或其他分子者(非專利文獻2)。
FGF23係採用利用與FGF15之同源性之數據庫檢索及PCR法自小鼠中鑑定出,隨後藉由同源性檢索鑑定出之分泌蛋白質。已知人類FGF23由251位胺基酸殘基之多肽構成,N末端之24個殘基作為分泌訊號發揮作用,於蛋白質之成熟過程被切斷(非專利文獻3)。
由FGF23之過量產生引起之低磷血症性疾病已為人所知,其大致分為已明確致病基因之疾病與後天性疾病(非專利文獻4)。已明確致病基因之FGF23相關低磷血症性疾病中,由磷酸調節內肽酶同源X連鎖phosphate-regulating endopeptidase homolog,X-linked(PHEX)突變引起之X染色體遺傳性低磷血症性佝僂病(X-linked hypophosphatemic rickets,以下記載為XLH)之頻率最高,迄今為止已有大量PHEX基因突變被報告(非專利文獻5)。
已知PHEX係膜1次貫通型蛋白質,於軟骨、成骨細胞、成牙質細胞中大量表現(非專利文獻6及非專利文獻7),據稱XLH以2萬人中1人之頻率發病(非專利文獻8)。作為後天性疾病之例,已知有腫瘤性骨軟化症(tumor-induced osteomalacia:TIO)等。
針對該等FGF23相關低磷血症性疾病,以往作為對症療法使用活性型維生素D3製劑及經口磷製劑。但長期投予可能會併發高鈣血症及尿症、腎鈣化、持續性甲狀旁腺功能亢進症等(非專利文獻9及非專利文獻10)。
作為被認為係FGF23之過量生成所致之上述疾病之治療藥,已知有作為FGF23中和抗體之Burosumab。
又,作為人類FGF23中和抗體,亦已知有專利文獻1中記載之抗體等。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
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[非專利文獻10]J Bone Miner Res. 2011 Jul;26(7):1381-8
[發明所欲解決之問題]
本發明人等對國際公開第2008/099969號中記載之抗人類FGF23抗體之物性進行了努力研究,結果發現:該抗體於低pH值下穩定性降低、被分解;並且該分解係由於抗體之重鏈可變區之胺基酸序列中第99位D與第100位I之間之切斷所致。眾所周知,一般,於將抗體製劑高濃度化時抗體容易凝集;增加蛋白質溶液中之蛋白質電荷之絕對值能夠降低發生蛋白質凝集之可能性(Arch Pharm Res Vol 35, No 11, 1871-1886, 2012)。因此,於將抗體製劑高濃度化時,作為抑制抗體凝集之一種方法,有降低該製劑之pH值之方法。因此,於需要降低抗體製劑之pH值之情形時,可考慮之pH值寬度廣之抗體更理想。
因此,本發明之目的在於提供一種新型抗FGF23抗體,其與國際公開第2008/099969號中記載之抗人類FGF23抗體相比,抑制了低pH值下之抗體分解。
[解決問題之技術手段]
本發明人等對上述問題進行了努力研究,結果發現,藉由將國際公開第2008/099969號中記載之抗FGF23抗體之VH之第100位胺基酸殘基或第105位胺基酸殘基置換而成之抗FGF23抗體,能夠解決上述問題,從而完成了本發明。
1.一種抗體或該抗體片段,上述抗體係於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之重鏈可變區(以下記載為VH)及包含序列編號2所示之胺基酸序列之輕鏈可變區(以下記載為VL)之抗體中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基或第105位胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基而成,且與FGF23結合。
2.如上述1所記載之抗體或該抗體片段,其中VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基、天冬醯胺殘基、甘胺酸殘基、酪胺酸殘基、精胺酸殘基、天冬胺酸殘基、組胺酸殘基、色胺酸殘基、及甲硫胺酸殘基中之1種胺基酸殘基。
3.如上述1或2所記載之抗體或該抗體片段,其中VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基。
4.如上述1至3中任一項所記載之抗體或該抗體片段,其中VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第105位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基、酪胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天冬醯胺殘基、及絲胺酸殘基中之1種胺基酸殘基。
5.如上述1至4中任一項所記載之抗體或該抗體片段,其中上述抗體進而包含選自下述(a1)~(a4)中之1種置換:
(a1)選自VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基、第54位胺基酸殘基置換為色胺酸殘基、第55位胺基酸殘基置換為組胺酸殘基、第57位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第58位胺基酸殘基置換為苯丙胺酸殘基中之至少1種置換;
(a2)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸殘基置換為甲硫胺酸殘基或白胺酸殘基、第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基、第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、及第96位胺基酸殘基置換為天冬醯胺殘基或天冬胺酸殘基中之至少1種置換;
(a3)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第28位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、第29位胺基酸殘基置換為纈胺酸殘基、第31位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第34位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基中之至少1種置換;以及
(a4)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基或色胺酸殘基、第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、及第96位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基中之至少1種置換。
6.如上述1至5中任一項所記載之抗體或該抗體片段,其中上述抗體係選自下述(c1)~(c10)中之1種:
(c1)含有包含序列編號39所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c2)含有包含序列編號47所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c3)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號44所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c4)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號44所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c5)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號45所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c6)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號45所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c7)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號46所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c8)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號46所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c9)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號58所示之胺基酸序列之VL的抗體;以及
(c10)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號59所示之胺基酸序列之VL的抗體。
7.如上述1至6中任一項所記載之抗體或該抗體片段,其中上述抗體之亞型為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
8.如上述1至7中任一項所記載之抗體或該抗體片段,其中上述抗體之Fc區係選自下述(d1)~(d5)中之1種:
(d1)包含EU索引第252位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基、第254位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第256位胺基酸殘基置換為麩胺酸殘基之Fc區;
(d2)包含EU索引第428位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基、及第434位胺基酸殘基置換為絲胺酸殘基之Fc區;
(d3)包含EU索引第308位胺基酸殘基置換為脯胺酸殘基之Fc區;
(d4)包含EU索引第250位胺基酸殘基置換為麩醯胺酸殘基、及第428位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基之Fc區;以及
(d5)包含EU索引第434位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基之Fc區。
9.如上述1至8中任一項所記載之抗體或該抗體片段,其中上述抗體之重鏈恆定區包含序列編號48、49、50、51、或52所示之胺基酸序列。
10.如上述1至9中任一項所記載之抗體片段,其係選自Fab、Fab'、(Fab')
2、scFv、雙功能抗體、dsFv及包含CDR之肽中之1種。
11.一種核酸,其具有編碼上述1至10中任一項所記載之抗體或該抗體片段之鹼基序列。
12.一種載體,其含有上述11所記載之核酸。
13.一種轉化細胞,其包含上述12所記載之載體。
14.一種上述1至10中任一項所記載之抗體或該抗體片段之製造方法,其包括:於培養基中培養上述13所記載之轉化細胞,自培養物中採取抗體或該抗體片段。
15.一種組合物,其包含上述1至10中任一項所記載之抗體或該抗體片段。
16.一種人類FGF23相關疾病之治療藥,其包含上述1至10中任一項所記載之抗體或該抗體片段。
17.一種人類FGF23相關疾病之治療方法,其包含上述1至10中任一項所記載之抗體或該抗體片段。
[發明之效果]
本發明之抗FGF23抗體與國際公開第2008/099969號中記載之抗FGF23抗體相比,抑制了低pH值下之分解,顯示出優異之穩定性。根據本發明,能夠提供抗FGF23抗體或該抗體片段、具有編碼該抗體或該抗體片段之鹼基序列之核酸、包含該核酸之載體、包含該載體之轉化細胞、該抗體或該抗體片段之製造方法、及包含該抗體或該抗體片段之組合物。
本發明係關於一種抗體或該抗體片段,上述抗體係於國際公開第2008/099969號中記載之與成纖維細胞生長因子23(以下記載為FGF23)結合之抗體(以下記載為含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之重鏈可變區(以下記載為VH)及包含序列編號2所示之胺基酸序列之輕鏈可變區(以下記載為VL)的抗體)中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基或第105位胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基而成,且與FGF23結合(以下記載為本發明之抗體)。
「FGF23」係成纖維細胞生長因子之一種,係源自骨細胞之激素。人類FGF係N末端包含24個胺基酸之分泌訊號之由251個胺基酸構成之蛋白質,該分泌訊號於蛋白質之成熟過程中被切斷。作為FGF23之功能,主要可例舉經由腎臟之腎近端小管細胞上之FGF受體1(以下亦記載為FGFR1)/α-Klotho複合體來抑制腎臟中磷之再吸收及維生素D之活化等。
本發明中,作為人類FGF23,可例舉:包含NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列之多肽;包含於NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列中1個以上胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列且具有人類FGF23之功能的多肽;或包含與NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列且具有人類FGF23之功能的多肽等。
具有於NCBI登錄號NP_065689所示之胺基酸序列中1個以上胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列之多肽可藉由如下方式獲得:使用定點突變導入法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)]等,例如於編碼包含NCBI登錄號NP_065689所示之胺基酸序列之多肽之DNA中導入定點突變。
缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定,較佳為1個~數十個,例如1~20個,更佳為1個~數個,例如1~5個胺基酸。
作為編碼人類FGF23之基因,可例舉NCBI登錄號NM_020638之鹼基序列。含有包含於NM_020638之鹼基序列中1個以上鹼基經缺失、置換或附加之鹼基序列且編碼具有人類FGF23之功能之多肽之DNA的基因;含有包含與NM_020638之鹼基序列具有至少60%以上之同源性之鹼基序列、較佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有90%以上之同源性之鹼基序列、最佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列且編碼具有人類FGF23之功能之多肽之DNA的基因;或含有與包含NM_020638之鹼基序列之DNA於嚴格條件下雜交之DNA且編碼具有人類FGF23之功能之多肽的基因等亦包含於本發明之編碼人類FGF23之基因中。
於嚴格條件下雜交之DNA係指藉由使用包含NM_020638之鹼基序列之DNA作為探針之菌落雜交法、噬菌斑雜交法、南方墨點雜交法或DNA微陣列法等而獲得之能夠雜交之DNA。
具體而言,可例舉可藉由如下方式鑑定之DNA:使用固定有源自雜交之菌落或噬菌斑之DNA、或者具有該序列之PCR產物或寡DNA之濾片或載玻片,於0.7~1.0 mol/L氯化鈉之存在下,於65℃下進行雜交法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]後,使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含150 mmol/L氯化鈉、15 mmol/L檸檬酸鈉),於65℃之條件下清洗濾片或載玻片。
作為能夠雜交之DNA,可例舉與NM_020638之鹼基序列具有至少60%以上之同源性之DNA,較佳為具有80%以上之同源性之DNA,進而較佳為具有95%以上之同源性之DNA。
編碼真核生物蛋白質之基因之鹼基序列常常可確認到基因之多型性。於本發明中使用之基因中由於此種多型性而使鹼基序列產生小規模突變之基因亦包含於本發明之編碼人類FGF23之基因中。
除特別明示之情形外,本發明中之同源性之數值可為使用從業者公知之同源性檢索程式計算出之數值,對於鹼基序列,可例舉使用BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]中內定之參數而計算出之數值等,對於胺基酸序列,可例舉使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25, 3389 (1997),Genome Res., 7, 649 (1997)]中內定之參數而計算出之數值等。
作為內定參數,G(Cost to open gap,起始空位罰分)於鹼基序列之情形時為5,於胺基酸序列之情形時為11;-E(Cost to extend gap,空位延伸罰分)於鹼基序列之情形時為2,於胺基酸序列之情形時為1;-q(Penalty for nucleotide mismatch,核苷酸錯配罰分)為-3;-r(reward for nucleotide match,核苷酸匹配得分)為1;-e(expect value,期望值)為10;-W(wordsize,字長大小)於鹼基序列之情形時為11個殘基,於胺基酸序列之情形時為3個殘基;-y[Dropoff(X)for blast extensions in bits,非空位延伸下降之閾值]於blastn之情形時為20,於blastn以外之程式中為7;-X(X dropoff value for gapped alignment in bits,空位比對之下降閾值)為15;-Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits,最終空位比對之下降值)於blastn之情形時為50,於blastn以外之程式中為25。
包含NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列之部分序列之多肽可藉由從業者公知之方法來製作。具體而言,可藉由使編碼NP_065689之胺基酸序列之DNA之一部分缺失,並對導入有包含上述DNA之表現載體之轉化體進行培養來製作。又,可藉由與上述同樣之方法而獲得具有於NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列中1個以上胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列之多肽。進而,包含NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列之多肽、或具有於NCBI登錄號NP_065689之胺基酸序列中1個以上胺基酸經缺失、置換或附加之胺基酸序列之多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc)法、第三丁氧羰基(tBoc)法等化學合成法而製造。
本發明中,胺基酸之缺失、置換或附加等亦稱為胺基酸之修飾。
作為本發明之抗體,多株抗體、單株抗體及寡株抗體中之任意一種抗體均包含在內。所謂多株抗體,係指不同純系之抗體產生細胞分泌之抗體分子之集群。所謂單株抗體,係指單一純系之抗體產生細胞分泌之抗體,係識別唯一之表位(亦稱為抗原決定簇),且構成單株抗體之胺基酸序列(一級序列)均勻之抗體。所謂寡株抗體,係指將複數種不同單株抗體混合而成之抗體分子之集群。
作為本發明中之單株抗體,可例舉由融合瘤產生之抗體、或由利用包含抗體基因之表現載體進行了轉化之轉化體產生之基因重組抗體。
表位可例舉單株抗體所識別、結合之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、藉由翻譯後修飾修飾之胺基酸序列及包含該胺基酸序列之立體結構等。
作為藉由翻譯後修飾修飾之胺基酸序列,可例舉:糖鏈鍵結於具有OH取代基之Tyr及Ser上之O鍵結型糖鏈、鍵結於具有NH
2取代基之Gln及Asn上之N鍵結型糖鏈、以及硫酸分子鍵結於具有OH取代基之Tyr及Ser上之鍵結有硫酸基等之胺基酸序列。
本發明之抗體與人類FGF23之結合可藉由使用ELISA及表面電漿子共振法等測定本發明之抗體對人類FGF23之結合性來確認。又,亦可組合公知之免疫檢測法Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、講談社Scientific(1987)]等來進行確認。
本發明之抗體所結合之FGF23之胺基酸殘基或表位可藉由使用使人類FGF23之一部分結構域缺失而得之缺失體、將人類FGF23之一部分結構域置換為源自其他蛋白質之結構域而得到之突變體及人類FGF23之部分肽片段等進行抗體之結合實驗來確定。
或者,本發明之抗體所結合之FGF23之胺基酸殘基或表位亦可藉由於利用蛋白水解酶消化後之人類FGF23之肽片段中添加本發明之抗體,並使用已知之質譜法進行表位定位來確定。
抗體分子亦被稱為免疫球蛋白(以下記為Ig),人類抗體根據分子結構之差異分類為IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgM之同型。亦將胺基酸序列之同源性較高之IgG1、IgG2、IgG3及IgG4統稱為IgG。
抗體分子由被稱為重鏈(Heavy chain,以下記為H鏈)及輕鏈(Light chain,以下記為L鏈)之多肽構成。又,H鏈自N末端側起由VH、H鏈恆定區(亦記為CH)之各區域構成,L鏈自N末端側起由VL、L鏈恆定區(亦記為CL)之各區域構成。CH於各亞型中分別已知有α、δ、ε、γ及μ鏈。CH進而自N末端側起由CH1結構域、鉸鏈結構域、CH2結構域、CH3結構域之各結構域構成。所謂結構域,係指構成抗體分子之各多肽之功能性結構單元。又,將CH2結構域和CH3結構域合併稱為Fc區或僅稱為Fc。CL已知有C
λ鏈及C
κ鏈。
本發明中之CH1結構域、鉸鏈結構域、CH2結構域、CH3結構域及Fc區可根據EU索引[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學關注之蛋白質序列),美國衛生與公眾服務部(1991)](以下簡稱為EU索引),利用自N末端起之胺基酸殘基之序號來特定出。具體而言,CH1特定為EU索引118~215號之胺基酸序列,鉸鏈特定為EU索引216~230號之胺基酸序列,CH2特定為EU索引231~340號之胺基酸序列,CH3特定為EU索引341~447號之胺基酸序列。
作為本發明之抗體,亦包含尤其利用基因工程製作之重組小鼠抗體、重組大鼠抗體、重組兔抗體、人型嵌合抗體(以下亦僅簡稱為嵌合抗體)、人源化抗體(亦稱為人型互補決定區CDR移植抗體)及人類抗體等基因重組抗體。又,本發明之抗體亦包括將源自2種不同抗體之H鏈(或VH)和L鏈(或VL)重組而製作之基因重組抗體。2種不同抗體可為源自融合瘤之單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體及人類抗體中之任一種。進而,作為本發明之抗體,亦包括於製作上述基因重組抗體時,將適當之胺基酸殘基置換而得之基因重組抗體。
所謂嵌合抗體,係意指包含人以外之動物(非人動物)之抗體之VH及VL、與人類抗體之CH及CL之抗體。作為非人動物,只要能夠製作融合瘤,可使用小鼠、大鼠、倉鼠、兔等任何動物。
所謂融合瘤,係指使將抗原免疫於非人動物而獲得之B細胞與源自小鼠等之骨髓瘤進行細胞融合而得之產生具有所需之抗原特異性之單株抗體之細胞。因此,融合瘤所產生之抗體之可變區包含非人動物抗體之胺基酸序列。
嵌合抗體可藉由如下方法來製造:由生產單株抗體之源自非人動物細胞之融合瘤獲得編碼該單株抗體之VH及VL之cDNA,分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體中,構建人型嵌合抗體表現載體,導入至動物細胞中使其表現。
所謂人源化抗體,係指將非人動物抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之VH及VL所對應之CDR處而得到之抗體。VH及VL之CDR以外之區域稱為框架區(以下記為FR)。
人源化抗體可藉由如下方法來製造:構建編碼包含非人動物抗體之VH之CDR之胺基酸序列和任意人類抗體之VH之FR之胺基酸序列之VH之胺基酸序列之cDNA、以及編碼包含非人動物抗體之VL之CDR之胺基酸序列和任意人類抗體之VL之FR之胺基酸序列之VL之胺基酸序列之cDNA,分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體,構建人源化抗體表現載體,導入至動物細胞中使其表現。
人類抗體原本係指天然存在於人體內之抗體,但亦包含由基於最近之基因工程、細胞工程、發育工程技術之進步而製作之人類抗體噬菌體庫及人類抗體產生基因轉殖動物獲得之抗體等。
人類抗體可藉由將所需之抗原免疫於攜帶人免疫球蛋白基因之小鼠(Tomizuka K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000)而獲得。又,藉由使用由源自人之B細胞對抗體基因進行擴增而得到之噬菌體展示庫來選擇具有所需之結合活性之人類抗體,可於不進行免疫之情形下獲得人類抗體(Winter G. et al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994)。進而,可藉由使用EB病毒使人B細胞永生化來製作生產具有所需之結合活性之人類抗體之細胞,獲得人類抗體(Rosen A. et al., Nature 267, 52-54. 1977)。
存在於人體內之抗體例如可以如下方式獲得:藉由使EB病毒等感染由人末梢血液單離之淋巴細胞使其永生化後,進行選殖,藉此能夠獲得產生該抗體之淋巴細胞,能夠自培養該淋巴細胞所得之培養物中純化出該抗體。
人類抗體噬菌體庫係藉由將由人B細胞製備之抗體基因插入至噬菌體基因中而使Fab、scFv等抗體片段表現於表面之噬菌體之庫。可以對固定有抗原之受質之結合活性為指標,自該庫回收表現具有所需之抗原結合活性之抗體片段之噬菌體。該抗體片段亦可進一步利用基因工程方法轉換成包含2條完整之H鏈及2條完整之L鏈之人類抗體分子。
人類抗體產生基因轉殖動物係指人類抗體基因整合至宿主動物之染色體內之動物。具體而言,可藉由向小鼠ES細胞中導入人類抗體基因,將該ES細胞移植至其他小鼠之早期胚胎後,使其發育來製作人類抗體產生基因轉殖動物。關於由人類抗體產生基因轉殖動物製作人類抗體之方法,可利用通常之於人以外之哺乳動物中進行之融合瘤製作方法獲得人類抗體產生融合瘤進行培養,藉此使人類抗體於培養物中產生並蓄積。
作為本發明之抗體之VH及VL之胺基酸序列,可為人類抗體、非人動物抗體或人源化抗體之VH及VL之胺基酸序列中之任一者。
作為本發明之抗體中之CL之胺基酸序列,可為人類抗體或非人動物抗體之胺基酸序列中之任一者,較佳為人類抗體之胺基酸序列之C
κ或C
λ。
作為本發明之抗體之CH,只要屬於免疫球蛋白則可為任意CH,較佳為屬於IgG類之亞型、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、及γ4(IgG4)。
本發明之抗體亦包含Fc與抗體片段結合而成之Fc融合蛋白質、Fc與天然存在之配體或受體結合而成之Fc融合蛋白質(亦稱為免疫黏附素)、使複數個Fc區融合而成之Fc融合蛋白質等。
本發明之抗體或該抗體片段亦含有包含經翻譯後修飾之任何胺基酸殘基之抗體或該抗體片段。作為翻譯後修飾,例如可例舉H鏈之C末端之離胺酸殘基之缺失[離胺酸剪切(lysine clipping)]、或多肽之N末端之麩醯胺酸殘基向焦麩胺(pyroGlu)之轉換等[Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736(2013)]。
本發明中,所謂抗體片段,係指與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,抑制了低pH值下之分解之與人類FGF23結合之抗體片段。作為本發明中之抗體片段,可例舉Fab、Fab'、F(ab')
2、單鏈抗體(scFv)、二聚化V區(雙功能抗體)、二硫化物穩定化V區(dsFv)或包含複數個CDR之肽等。Fab係將IgG抗體用蛋白水解酶木瓜酶進行處理而得之片段中(於H鏈之第224位胺基酸殘基處被切斷),H鏈之N末端側約一半與L鏈整體以二硫化物鍵(S-S鍵)結合而成之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
F(ab')
2係將IgG用蛋白水解酶胃蛋白酶處理而得之片段中(於H鏈之2第34位胺基酸殘基處被切斷)比Fab經由鉸鏈區之S-S鍵結合而成之片段稍大之分子量約10萬之具有抗原結合活性之抗體片段。Fab'係將上述F(ab')
2之鉸鏈區之S-S鍵切斷而得之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
scFv係使用由4個Gly及1個Ser殘基構成之連接子(G4S)以任意個數連接而成之連接肽等適當之肽連接子(P)將1條VH與1條VL連接而得之VH-P-VL或VL-P-VH多肽,係具有抗原結合活性之抗體片段。
雙功能抗體係抗原結合特異性相同或不同之scFv形成二聚體而成之抗體片段,係具有針對相同抗原之2價之抗原結合活性或針對不同抗原之特異性抗原結合活性之抗體片段。
dsFv係指將VH及VL中各1位胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基,使所得之多肽經由該半胱胺酸殘基間之S-S鍵進行結合而成者。
包含CDR之肽包含VH或VL之CDR中之至少1個區域而構成。包含複數個CDR之肽可使CDR彼此直接或經由適當之肽連接子進行結合。可藉由構建編碼本發明之改型抗體之VH及VL之CDR之DNA,將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中,並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中使其表現而製造。又,包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法來製造。
作為本發明之抗體之一形態,可例舉下述(i)及(ii)之抗體或該抗體片段等。
(i)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之與FGF23結合之抗體中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基、天冬醯胺殘基、甘胺酸殘基、酪胺酸殘基、精胺酸殘基、天冬胺酸殘基、組胺酸殘基、色胺酸殘基、及甲硫胺酸殘基中之1種胺基酸殘基而成之與FGF23結合之抗體或該抗體片段。
(ii)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之與FGF23結合之抗體中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第105位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基、酪胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天冬醯胺殘基、及絲胺酸殘基中之1種胺基酸殘基而成之與FGF23結合之抗體或該抗體片段。
該抗體與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,低pH值下之穩定性高,能夠抑制抗體之分解。該抗體較佳為於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基而成之與FGF23結合之抗體。
本發明中,所謂低pH值係指未達pH值6之弱酸性或酸性,例如可例舉pH值5、pH值4.5、pH值4等,但無特別限定。
本發明之抗體與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,抑制了低pH值下之分解,顯示出優異之穩定性。本發明中,抗體之分解可利用尺寸排阻層析法(Size Exclusion Chromatography(以下記載為SEC))或SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法(以下記載為SDS-PAGE)等進行測定。
本發明之抗體與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比抑制低pH值下之抗體分解例如可用包含以下步驟(I)~(III)之方法進行確認,但並不特別限定於該方法。
(I)製備使用NAP(商標)25(GE Healthcare Life Science)等管柱,將含有本發明之抗體或含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體之抗體溶液之溶劑置換為pH值4、4.5或5之適當之溶劑而成之抗體溶液。
(II)將上述(I)中製備之抗體溶液於40度下靜置1個月或2週,或於25度下靜置3個月後,利用SEC檢測與抗體之分解物相當之峰(%)。
或者將上述(I)中製備之抗體溶液於40度下靜置1個月或2週,或於25度下靜置3個月靜置後,於還原條件下進行SDS-PAGE,檢測與抗體之分解物相當之40 kDa附近(例如35 kDa~45 kDa)之條帶。
(III)於與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,本發明之抗體中上述(II)中藉由SEC檢測出之與抗體之分解物相當之峰(%)減少之情形,或與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,本發明之抗體中SDS-PAGE之40 kDa附近之條帶之濃度降低之情形時,能夠確認與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,本發明之抗體抑制了低pH值下之抗體分解。
亦可使用生物分析儀電泳系統(安捷倫科技股份有限公司)及安捷倫蛋白質230套組(安捷倫科技股份有限公司)來代替上述(II)中所記載之SDS-PAGE。此時,於與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,本發明之抗體所得之電泳圖中以比H鏈全長之峰小約10~20 kDa之尺寸檢測出之與抗體之分解物相當之條帶(例如40~60 kDa)之峰面積率(%)降低之情形時,能夠確認與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,本發明之抗體中抑制了低pH值下之抗體分解。
即,作為表現本發明之抗體之低pH值下之穩定性之形態,例如可例舉下述形態。
・與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,於pH值4、4.5或5等低pH值及40度下靜置1個月或2週,或25度下靜置3個月後,SDS-PAGE之分子量40 kDa附近之條帶之濃度降低。條帶之濃度可藉由目視進行評價。
・與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,於pH值4、4.5或5等低pH值及40度下靜置1個月或2週後,或25度下靜置3個月後,藉由SEC檢測出之與抗體之分解物相當之峰(%)減少。與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,該峰(%)較佳為減少5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上。
・與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,於pH值4、4.5或5等低pH值及40度下靜置1個月或2週後,或25度下靜置3個月後,生物分析儀電泳系統(安捷倫科技股份有限公司)及安捷倫蛋白質230套組(安捷倫科技股份有限公司)之電泳圖中,以比H鏈全長之峰小約10~20 kDa之尺寸檢測出之與抗體之分解物相當之條帶(例如40~60 kDa)之峰面積率(%)減少。與含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體相比,該峰面積率(%)較佳為減少5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上。
作為本發明之抗體之一形態,可例舉進而包含選自下述(a1)~(a4)中之1種置換之上述抗體。
(a1)選自VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基、第54位胺基酸殘基置換為色胺酸殘基、第55位胺基酸殘基置換為組胺酸殘基、第57位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第58位胺基酸殘基置換為苯丙胺酸殘基中之至少1種置換;
(a2)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸殘基置換為甲硫胺酸殘基或白胺酸殘基、第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基、第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、及第96位胺基酸殘基置換為天冬醯胺殘基或天冬胺酸殘基中之至少1種置換;
(a3)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第28位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、第29位胺基酸殘基置換為纈胺酸殘基、第31位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第34位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基中之至少1種置換;以及
(a4)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基或色胺酸殘基、第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、及第96位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基中之至少1種置換。
再者,本發明之抗體對於上述(a1)~(a4)之各者,較佳為進行所記載之所有胺基酸殘基之置換。
本發明之抗體藉由選自上述(a1)~(a4)中之1種胺基酸殘基之置換,能夠提高抗體對FGF23之結合活性及FGF23中和活性。所謂FGF23中和活性係指抑制FGF23與受體結合產生之訊號之活性。作為FGF23之受體,可例舉FGFR1與αKlotho之複合體。
本發明之抗體之FGF23中和活性可利用Nature 2006 Dec 7;444(7120)中記載之報告基因檢測(亦稱為啟動子檢測)等進行確認。又,亦可使用αKlotho穩定表現HEK293細胞之報告基因檢測等確認本發明之抗體之FGF23中和活性,其中該αKlotho穩定表現HEK293細胞係利用具有源自小鼠Egr1基因之啟動子之螢光素酶表現載體進行了轉化而成。
作為本發明之抗體之具體例,可例舉選自下述(b1)~(b5)中之任一抗體。
(b1)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體中,VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基,第54位胺基酸殘基置換為色胺酸殘基,第55位胺基酸殘基置換為組胺酸殘基,第57位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基,第58位胺基酸殘基置換為苯丙胺酸殘基,及第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基而成之抗體;
(b2)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體中,VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基,及VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸殘基置換為甲硫胺酸殘基,第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基,第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基,及第96位胺基酸殘基置換為天冬醯胺殘基而成之抗體;
(b3)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體中,VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基,及VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第28位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基,第29位胺基酸殘基置換為纈胺酸殘基,第31位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基,及第34位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基而成之抗體;
(b4)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體中,VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基,及VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基,第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基,第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基,及第96位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基而成之抗體;以及
(b5)於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之抗體中,VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基,及VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第92位胺基酸殘基被酪胺酸殘基或色胺酸殘基置換,第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基,及第96位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基而成之抗體。
又,作為本發明之抗體之具體例,亦可例舉選自下述(c1)~(c10)中之抗體,較佳為(c1)、(c8)、(c9)或(c10),更佳為(c1)或(c9)。
(c1)含有包含序列編號39所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c2)含有包含序列編號47所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c3)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號44所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c4)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號44所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c5)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號45所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c6)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號45所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c7)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號46所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c8)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號46所示之胺基酸序列之VL的抗體;
(c9)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號58所示之胺基酸序列之VL的抗體;以及
(c10)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號59所示之胺基酸序列之VL的抗體。
本發明之抗體中出於控制血中半衰期之目的,亦可使用胺基酸殘基經置換之Fc區等以控制對FcRn之結合性。
作為為了提高抗體對FcRn之結合性而置換了胺基酸殘基之Fc區,可舉出下述(d1)~(d5)中之任一Fc區等。其中較佳為(d1)之Fc區。
(d1)包含EU索引第252位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基、第254位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第256位胺基酸殘基置換為麩胺酸殘基之Fc區;
(d2)包含EU索引第428位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基、及第434位胺基酸殘基置換為絲胺酸殘基之Fc區;
(d3)包含EU索引第308位胺基酸殘基置換為脯胺酸殘基之Fc區;
(d4)包含EU索引第250位胺基酸殘基置換為麩醯胺酸殘基、及第428位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基之Fc區;以及
(d5)包含EU索引第434位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基之Fc區。
又,本發明中,作為包含為了提高抗體對FcRn之結合性而置換了胺基酸殘基之Fc區之重鏈恆定區之胺基酸序列之具體例,可例舉序列編號48、49、50、51、及52所示之胺基酸序列等。其中,較佳為序列編號48所示之胺基酸序列。
本發明之單株抗體或該抗體片段包含於本發明之與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段上利用化學方法或基因工程方法結合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質或抗體藥物等而成之抗體或該抗體片段之衍生物。
抗體或該抗體片段之衍生物可藉由於本發明之與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側、C末端側,抗體分子中之適當之取代基或側鏈或者糖鏈等上,利用化學方法[抗體工程入門,地人書館(1994)]結合放射性同位素、低分子藥劑、高分子藥劑、免疫活化劑、蛋白質、抗體藥物或核酸藥物等而製造。
又,可藉由如下基因工程方法而製造:將編碼本發明之與人類FGF23結合之單株抗體或其抗體片段之DNA與編碼欲結合之蛋白質或抗體藥物之DNA連接並插入至表現載體中,將該表現載體導入至適當之宿主細胞中使其表現。
作為放射性同位素,例如可例舉
111In、
131I、
125I、
90Y、
64Cu、
99Tc、
77Lu或
211At等。可利用氯胺T法等使放射性同位素直接結合於抗體上。又,亦可於抗體上結合對放射性同位素進行螯合之物質。作為螯合劑,例如可例舉1-異硫氰酸苄酯基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子藥劑,例如可例舉烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物生物鹼、拓樸異構酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學,癌症與化學療法出版社(1996)]、氫化可體松或潑尼松等類固醇劑、阿司匹林或吲哚美辛等非類固醇劑、硫代蘋果酸金或青黴胺等免疫調節劑,環磷醯胺或硫唑嘌呤等免疫抑制劑、或者如馬來酸氯苯那敏或氯馬斯汀之抗組織胺劑等抗炎劑[炎症與抗炎療法,醫齒藥出版股份有限公司(1982)]等。
作為抗癌劑,例如可例舉阿米福汀(氨磷汀)、順鉑、達卡巴嗪(DTIC)、更生黴素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲黴素、環磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿黴素)、表柔比星、吉西他濱(健擇)、柔紅黴素、丙卡巴肼、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春鹼、長春新鹼、博來黴素、道諾黴素、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑、克拉屈濱、喜樹鹼、10-羥基-7-乙基喜樹鹼(SN38)、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、伊達比星、美司那、依立替康(CPT-11)、拓樸替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡黴素、密妥坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾內酯、硫鳥嘌呤、塞替派、烏拉莫司汀、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、氫化可體松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉑、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,Flt3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(Vascular Endothelial Growth Facotr receptor,VEGFR)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor,FGFR)抑制劑、艾瑞莎或特羅凱等表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)抑制劑、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德黴素、雷帕黴素、安吖啶、全反式維甲酸、沙利度胺、來那度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青黴胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環孢素、雷帕黴素、氫化可體松、蓓薩羅丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、青黴胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維甲酸、蓓薩羅丁、砷、硼替佐米、別嘌呤醇、卡奇黴素、替伊莫單抗、塔革雷汀、奧唑米星、克拉黴素、瘤可維、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明或類美登醇或者其衍生物等。
作為使低分子藥劑與抗體結合之方法,例如可例舉經由戊二醛使藥劑與抗體之胺基間結合之方法、或經由水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與抗體之羧基結合之方法等。
作為高分子藥劑,例如可例舉聚乙二醇(以下記為PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、哌喃共聚物、或羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與抗體或其抗體片段結合,可期待如下等效果:(1)對化學性、物理性或生物性之各種因子之穩定性提高;(2)血中半衰期顯著延長;或(3)免疫原性消失或抑制抗體產生[生物偶聯藥品,廣川書店(1993)]。
例如,作為使PEG與抗體結合之方法,可例舉與PEG化修飾試劑反應之方法等[生物偶聯藥品,廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑,可例舉對離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、對天冬胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)、或對精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為免疫活化劑,可為作為免疫佐劑而已知之天然物,作為具體例,提高免疫之藥劑可例舉β(1→3)葡聚糖(例如香菇多糖或西佐糖)或α半乳糖苷基神經醯胺(KRN7000)等。
作為蛋白質,例如可例舉使NK細胞、巨噬細胞或嗜中性球等免疫活性細胞活化之細胞激素或生長因子或毒素蛋白質等。
作為細胞激素或生長因子,例如可例舉干擾素(以下記為IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、白細胞介素(以下記為IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。作為毒素蛋白質,例如可例舉離胺酸、白喉毒素或ONTAK等,亦包括為了調節毒性而向蛋白質中導入了突變之蛋白質毒素。
作為抗體藥物,例如可例舉針對藉由與抗體之結合而誘導細胞凋亡之抗原、與腫瘤之病態形成相關之抗原、調節免疫功能之抗原或病変部位之血管新生相關抗原之抗體。
作為藉由與抗體之結合而誘導細胞凋亡之抗原,例如可例舉分化群(cluster of differentiation,以下記載為CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人白細胞抗原(HLA)II類或表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)等。
作為腫瘤之病態形成相關之抗原或調節免疫功能之抗體之抗原,例如可例舉CD4、CD40、CD40配體、B7家族分子(例如CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3或B7-H4)、B7家族分子之配體(例如CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1或BTLA)、OX-40、OX-40配體、CD137、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體家族分子(例如DR4、DR5、TNFR1或TNFR2)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor,TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子之受體家族(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4)、核因子κ-B配體受體活化劑(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體、細胞激素[例如IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β或TNFα等]或該等細胞激素之受體、或趨化因子(例如SLC、ELC、I-309、TARC、MDC或CTACK等)或該等趨化因子之受體。
作為抑制病變部位之血管新生之抗體之抗原,例如可例舉血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血管生成素、成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)、血小板源性生長因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF),胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)、促紅細胞生成素(EPO)、TGFβ、IL-8、ephrin或SDF-1或其等之受體等。
作為核酸藥物,例如可例舉包含藉由控制基因之功能而作用於生物體之小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acid,siRNA)或microRNA等核酸之醫藥品。例如可考慮與抑制Th17細胞之主要轉錄因子RORγt之核酸藥物之偶聯物。
於將本發明之抗體或該抗體片段之衍生物用於人類FGF23之檢測及測定以及人類FGF23相關疾病之診斷之情形時,作為與該抗體結合之藥劑,可例舉通常之免疫檢測或測定法中使用之標記物。作為標記物,例如可例舉鹼性磷酸酶、過氧化酶或螢光素酶等酶、吖啶鎓酯或咯吩等發光物質、或螢光異硫氰酸鹽(FITC)或四甲基羅丹明異硫氰酸酯(RITC)等螢光物質等。
又,本發明之一實施方式為包含本發明之抗體或該抗體片段之組合物。作為組合物之形態,可例舉含有與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段作為有效成分之組合物等。包含本發明之抗體或該抗體片段之組合物可用於人類FGF23相關疾病之治療。作為本發明之一實施方式,提供包含本發明之抗體之人類FGF23相關疾病之治療劑。
又,本發明係關於一種人類FGF23相關疾病之治療方法,其包括投予與人類FGF23結合之單株抗體或其抗體片段。
作為人類FGF23相關疾病,只要為與人類FGF23或人類FGF23之受體相關之疾病即可,例如可例舉腫瘤性軟骨病(TIO)、常染色體顯性低磷血症性佝僂病/軟骨病(ADHR)、X連鎖低磷血症(XLH)、纖維性結構不良、馬科恩-亞百特氏症候群、常染色體隱性低磷血症性佝僂病/軟骨病(ARHR)、骨質疏鬆症、佝僂病(包括低磷血症性佝僂病、維生素D抵抗性佝僂病)、高鈣血症、低鈣血症、異位性鈣化、骨硬化症、佩吉特氏病、甲狀旁腺功能亢進症、副甲狀腺低能症、瘙癢、以及以腎性骨營養不良、透析骨病、及腎小管功能障礙等為代表之與腎衰竭或腎衰竭時人工透析併發之疾病等。
又,本發明亦包含TIO、ADHR、XLH、纖維性結構不良、馬科恩-亞百特氏症候群及ARHR等疾病中可見之低磷血症、骨鈣化不全、骨痛、肌力降低、骨骼變形、生長障礙、低1,25維生素D血症等症狀之治療劑,其含有與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段作為有效成分。
包含本發明之抗體或該抗體片段之治療劑可僅包含作為有效成分之該抗體或該抗體片段,但通常較佳為以與藥理學上容許之1種以上之載體一起混合並利用製劑學之技術領域中公知之任意方法所製造之醫藥製劑的形式提供。
投予路徑較佳為使用治療時最有效者,可例舉經口投予或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予,較佳者可例舉靜脈內投予。作為投予形態,例如可例舉噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
投予量或投予次數係根據目標治療效果、投予方法、治療時間、年齡及體重等而不同,通常成人每天為10 μg/kg~10 mg/kg。
作為本發明之組合物之一實施方式,可例舉含有與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段的FGF23之檢測或測定用試劑。又,本發明係關於一種使用與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段的FGF23之檢測或測定方法。作為本發明中檢測或測定人類FGF23之方法,可例舉任意公知之方法。例如可例舉免疫檢測或測定方法等。
免疫檢測或測定方法係使用實施了標記之抗原或抗體對抗體量或抗原量進行檢測或測定之方法。作為免疫檢測或測定方法,例如可例舉放射性物質標記免疫抗體法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方點墨法或物理化學方法等。
作為本發明之組合物之一實施方式,可例舉FGF23相關疾病之診斷試劑,其包含與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段。又,本發明係關於一種FGF23相關疾病之診斷方法,其包括使用與人類FGF23結合之單株抗體或該抗體片段進行FGF23之檢測或測定。藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段,按照上述方法對人類FGF23進行檢測或測定,能夠診斷與人類FGF23相關之疾病。
本發明中,作為成為進行人類FGF23之檢測或測定之對象的生物體試樣,並無特別限定,例如只要為組織、細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液或培養液等可能包含人類FGF23者即可。
含有本發明之單株抗體或其抗體片段之診斷試劑可根據目標診斷方法,包含用於進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用於進行抗原抗體反應之試劑,可例舉緩衝劑、鹽等。作為檢測用試劑,可例舉識別該單株抗體或其抗體片段之經標記之二次抗體、或與標記對應之受質等通常之免疫檢測或測定法中使用之試劑。
本發明之一實施方式係關於一種抗人類FGF23單株抗體或該抗體片段之用途,其用於製造FGF23相關疾病之治療藥或診斷試劑。又,本發明之一實施方式係關於一種FGF23相關疾病之治療方法或診斷方法。
以下,具體地對本發明之抗體之製造方法、疾病之治療方法、及疾病之診斷方法進行說明。
1.抗體之製造方法
(1)抗原之製備
作為抗原之人類FGF23可藉由將包含編碼全長或部分長度之人類FGF23之cDNA之表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得。又,人類FGF23亦可藉由自大量表現人類FGF23之各種人細胞株、人細胞及人組織等中純化人類FGF23而獲得。又,亦可直接將該等人細胞株、人細胞及人組織等用作抗原。進而,亦可利用Fmoc法或tBoc法等化學合成法製備具有人類FGF23之部分序列之合成肽,將其用作抗原。於人類FGF23或具有人類FGF23之部分序列之合成肽上,可於C末端或N末端附加FLAG或His等公知之標籤。
本發明中使用之人類FGF23可使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley &Sons(1987-1997)等中記載之方法等,例如利用以下方法使編碼該人類FGF23之DNA於宿主細胞中表現來製造。
首先,藉由將包含編碼人類FGF23之部分之全長cDNA插入至適當之表現載體之啟動子之下游來製作重組載體。亦可代替上述全長cDNA,而使用基於全長cDNA而製備之包含編碼多肽之部分之適當長度之DNA片段。繼而,將所得之該重組載體導入至適合該表現載體之宿主細胞中,藉此能夠得到生產多肽之轉化體。
作為表現載體,只要係能夠於所使用之宿主細胞中自主複製或能夠整合到染色體中,並且於能夠對編碼多肽之DNA進行轉錄之位置含有適當之啟動子之表現載體,則均可使用。作為宿主細胞,只要係大腸桿菌等屬於埃希菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等能夠表現目的基因者,則均可使用。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時,重組載體較佳為能夠於原核生物中自主複製,且包含啟動子、核糖體結合序列、包含編碼人類FGF23之部分之DNA、及轉錄終止序列之載體。又,該重組載體中轉錄終止序列並非必需,但較佳為於結構基因之正下方配置轉錄終止序列。進而,該重組載體可包含控制啟動子之基因。
作為該重組載體,較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏因-達爾加諾序列(亦稱為SD序列)與起始密碼子之間調節為適當距離(例如6~18個鹼基)之質體。
又,作為編碼該人類FGF23之DNA之鹼基序列,可對鹼基進行置換以形成最適於於宿主內表現之密碼子,藉此能夠提高作為目標之人類FGF23之生產率。
作為表現載體,只要能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能,則均可使用,例如可例舉pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上為羅氏診斷公司製造)、pKK233―2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備,日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備,日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(美國專利第4,686,191號說明書、美國專利第4,9390,94號說明書、美國專利第160,735號說明書)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)或pME18SFL3等。
作為啟動子,只要能夠於所使用之宿主細胞中發揮功能即可。例如可例舉trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又,例如可例舉將2個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子或let I啟動子等經人為設計改型之啟動子等。
作為宿主細胞,例如可例舉大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49或大腸桿菌DH5α等。
作為將重組載體導入至宿主細胞之方法,只要為將DNA導入至所使用之宿主細胞之方法則均可使用,例如可例舉使用鈣離子之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972),Gene, 17, 107 (1982),Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時,作為表現載體,只要為能夠於動物細胞中發揮功能者則均可使用,例如可例舉pcDNAI、pCDM8(舟越公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報;Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、INPEP4(Biogen-IDEC公司製造)及轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
作為啟動子,只要為能夠於動物細胞中發揮功能者則均可使用,例如可例舉巨細胞病毒(CMV)之即刻早期(IE)基因之啟動子、SV40之早期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子或莫洛尼鼠白血病病毒之啟動子或強化子。又,亦可將人CMV之IE基因之強化子與啟動子一起使用。
作為宿主細胞,例如可例舉人白血病細胞那馬瓦(Namalwa)細胞、猴細胞COS細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞[Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci.,60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II(pp. 883-900)]、二氫葉酸還原酶基因(以下記為dhfr)缺失之CHO細胞(CHO/DG44細胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUkXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14、敍利亞倉鼠細胞BHK或HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。
作為將重組載體導入至宿主細胞中之方法,只要為將DNA導入至動物細胞之方法則均可使用,例如可例舉電穿孔法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、或脂轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等。
將如上所得之源自於保有整合有編碼人類FGF23之DNA之重組載體之微生物或動物細胞等之轉化體於培養基中進行培養,使該人類FGF23於培養液中生成並蓄積,自該培養液中採取,藉此能夠製造人類FGF23。將該轉化體於培養基中進行培養之方法可按照宿主培養中使用之通常之方法來進行。
於在源自真核生物之細胞中進行表現之情形時,能夠得到附加有糖或糖鏈之人類FGF2。
於對利用使用了誘導性啟動子之重組載體進行了轉化之微生物進行培養時,可根據需要向培養基中添加誘導劑。例如,於對利用使用了lac啟動子之重組載體進行了轉化之微生物進行培養之情形時,可於培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等,於對利用使用了trp啟動子之重組載體進行了轉化之微生物進行培養之情形時,可於培養基中添加吲哚丙烯酸等。
作為對以動物細胞作為宿主而得之轉化體進行培養之培養基,例如可例舉通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]、伊格爾(Eagle)之MEM培養基[Science, 122, 501 (1952)]、杜貝可改良MEM培養基[Virology, 8, 396 (1959)]、199培養基[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)]、或Iscove改良杜貝可培養基(IMDM)、或於該等培養基中添加胎牛血清(FBS)等而得之培養基等。培養通常於pH值6~8、30~40℃、5%CO
2存在下等條件下進行1~7日。又,培養中可根據需要向培養基中添加卡那黴素或盤尼西林等抗生素。
作為編碼人類FGF23之基因之表現方法,例如除了直接表現以外,可例舉分泌生產或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。
作為人類FGF23之生產方法,例如可例舉於宿主細胞內進行生產之方法、分泌至宿主細胞外之方法、或於宿主細胞外膜上進行生產之方法,可藉由改變所使用之宿主細胞或所生產之人類FGF23之結構來選擇適當之方法。
於人類FGF23於宿主細胞內或宿主細胞外膜上進行生產之情形,可藉由使用鮑爾森等人之方法[J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)]、羅等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989),Genes Develop., 4, 1288 (1990)]、日本專利特開平05-336963號公報或國際公開第94/23021號等所記載之方法,來使人類FGF23積極地分泌至宿主細胞外。又,亦可利用使用了二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系統(日本專利特開平2-227075號公報)來提高人類FGF23之生產量。
所得之人類FGF23例如可以如下方式單離、純化。於人類FGF23於細胞內以溶解狀態表現之情形時,培養結束後藉由離心分離回收細胞,懸浮於水系緩衝液後,使用超音波破碎機、法式壓碎器、MANTON-GAULIN勻漿器或球磨機等將細胞破碎,得到無細胞提取液。自藉由將該無細胞提取液離心分離而得之上清液中,單獨使用或組合使用通常之蛋白質單離純化法,即單獨使用或組合使用溶劑提取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙基胺基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、或等電點電泳等電泳法等方法,能夠得到純化樣品。
於人類FGF23於細胞內形成不溶體而進行表現之情形時,與上述同樣地回收細胞後將其破碎,進行離心分離,藉此回收該人類FGF23之不溶體作為沈澱組分。將回收之該人類FGF23之不溶體用蛋白變性劑進行可溶化。藉由對該可溶化液進行稀釋或透析而使該人類FGF23恢復為正常之立體結構後,藉由與上述同樣之單離純化法能夠獲得多肽之純化樣品。
於人類FGF23或其糖修飾體等之衍生物分泌至細胞外之情形時,可於培養上清液中回收該人類FGF23或其糖修飾體等之衍生物。與上述同樣地利用離心分離等方法處理該培養物,藉此獲得可溶性組分,藉由使用與上述同樣之單離純化法,能夠自該可溶性組分中獲得純化樣品。
又,本發明中使用之人類FGF23亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法來製造。又,亦可利用Advanced Chemtec公司製造、珀金埃爾默公司製造、Pharmacia公司製造、Protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega公司製造、Perceptive公司製造、或島津製作所公司製造等之肽合成儀進行化學合成。
(2)動物之免疫及融合用抗體產生細胞之製備
對3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物進行(1)中得到之抗原之免疫,採取該動物之脾臟、淋巴結、末梢血液中之抗體產生細胞。又,亦可使用小鼠FGF23剔除小鼠作為被免疫動物。
免疫藉由將抗原與例如弗氏完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠與百日咳菌疫苗等適當之佐劑一起投予至動物之皮下、靜脈內或腹腔內來進行。於抗原為部分肽之情形時,製作與BSA(牛血清清白蛋白)或KLH(Keyhole Limpet hemocyanin,匙孔螺血氰蛋白)等載體蛋白之偶聯物,將其用作免疫原。
抗原之投予於第1次投予後每隔1~2週進行5~10次。於各投予後第3~7日自眼底靜脈叢採血,使用酵素免疫測定法[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測定其血清之抗體效價。將其血清對免疫所用之抗原顯示出充分之抗體效價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源。
於抗原之最終投予後第3~7日,自免疫後之動物摘除脾臟等包含抗體產生細胞之組織,採取抗體產生細胞。於使用脾臟細胞之情形時,將脾臟細切、打散後離心分離,進而去除紅細胞而獲得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備
作為骨髓瘤細胞,使用由小鼠得到之培養細胞株,例如使用8-氮鳥嘌呤抗性小鼠(源自於BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511 (1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269 (1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548 (1979)]、或P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495 (1975)]等。
該骨髓瘤細胞於正常培養基(添加有麩醯胺酸、2-巰基乙醇、慶大黴素、FBS、及8-氮鳥嘌呤之RPMI1640培養基)中傳代,於細胞融合之3~4日前傳代於正常培養基中,於融合當日確保2×10
7個以上之細胞數。
(4)細胞融合及單株抗體產生融合瘤之製備
將(2)中得到之融合用抗體產生細胞與(3)中得到之骨髓瘤細胞用最低必需培養基(Minimum Essential Medium,MEM)或PBS(磷酸二鈉1.83 g、磷酸二氫鉀0.21 g、食鹽7.65 g、蒸餾水1升、pH值7.2)充分清洗,按照細胞數為融合用抗體產生細胞:骨髓瘤細胞=5~10:1之方式混合,離心分離後,去除上清液。將沈澱之細胞團塊充分打散後,於37℃下一面攪拌一面加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基及二甲基亞碸之混合液。進而每隔1~2分鐘添加MEM培養基1~2 mL,添加數次後,添加MEM培養基使總量為50 mL。離心分離後,去除上清液。將沈澱之細胞團塊輕輕打散後,對於融合用抗體產生細胞,將細胞輕柔地懸浮於HAT培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷、及胺基蝶呤之正常培養基]中。將該懸濁液於37℃、5%CO
2培養箱中培養7~14日。
培養後,抽取一部分培養上清液,藉由後述之結合檢測等融合瘤之選擇方法,選擇出與包含人類FGF23之抗原反應,而不與不包含人類FGF23之抗原反應之細胞團塊。繼而,利用限數稀釋法進行選殖,選擇穩定確認到強抗體效價者作為單株抗體產生融合瘤。
(5)純化單株抗體之製備
對姥鮫烷處理[腹腔內投予2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鮫烷)0.5 mL,飼養2週]後之8~10週齡之小鼠或裸鼠腹腔內注射(4)中得到之單株抗體產生融合瘤。於10~21日,融合瘤形成癌性腹水。自該小鼠採取腹水,離心分離去除固形物成分後,用40~50%硫酸銨進行鹽析,利用辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白A-管柱或凝膠過濾管柱進行純化,收集IgG或IgM組分,製成純化單株抗體。
又,將(4)中得到之單株抗體產生融合瘤於添加有10%FBS之RPMI1640培養基等中進行培養後,藉由離心分離去除上清液,懸浮於Hybridoma SFM培養基中,培養3~7日。亦可對所得之細胞懸濁液進行離心分離,利用蛋白A-管柱或蛋白G-管柱自所得之上清液中進行純化,收集IgG組分,獲得純化單株抗體。再者,亦可於Hybridoma SFM培養基中添加5%DAIGO GF21。
抗體之亞型之確定使用亞型分型套組利用酵素免疫測定法來進行。蛋白質量之定量由勞里法或280 nm處之吸光度算出。
(6)單株抗體之選擇
單株抗體之選擇如以下所示,藉由使用ELISA測定抗體對人類FGF2之結合性等來進行。
將人類FGF23分注至96孔板等板中後,分注血清、融合瘤之培養上清液或純化單株抗體等受驗物質作為第1抗體,使其進行反應。繼而,將該板用PBS等充分清洗後,分注用酶試劑等進行了標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體,使其進行反應。之後,將該板用PBS等充分清洗後,添加受質,用讀板儀測定各孔之吸光係數,藉此選擇對人類FGF23特異性反應之單株抗體。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例,以下示出人型嵌合抗體及人源化抗體之製作方法。基因重組之小鼠抗體、大鼠抗體及兔抗體等亦可用同樣之方法製作。
(1)基因重組抗體表現用載體之構建
基因重組抗體表現用載體係整合有編碼人類抗體之CH及CL之DNA之動物細胞用表現載體,可藉由將編碼人類抗體之CH及CL之DNA分別選殖至動物細胞用表現載體中來構建。
人類抗體之C區可使用任意人類抗體之CH及CL。例如使用人類抗體之γ1亞型之CH及κ類之CL等。編碼人類抗體之CH及CL之DNA使用cDNA,但亦可使用包含外顯子及內含子之染色體DNA。動物細胞用表現載體只要能夠整合編碼人類抗體之C區之基因並進行表現,則可使用任何表現載體。例如使用pAGE107[Cytotechnol., 3, 133 (1990)]、pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、pHSG274[Gene, 27, 223 (1984)]、pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173 (1990)]、或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79 (1993)]等。動物細胞用表現載體中啟動子和強化子可例舉SV40之早期啟動子[J. Biochem., 101, 1307 (1987)]、莫洛尼鼠白血病病毒LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)]、或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell, 41, 479 (1985)]及強化子[Cell, 33, 717 (1983)]等。
就基因重組抗體表現用載體之構建之容易度、向動物細胞中導入之容易度、抗體H鏈及L鏈於動物細胞內之表現量之平衡達到均衡等觀點而言,基因重組抗體表現用載體使用抗體H鏈及L鏈存在於同一載體上之類型(串聯型)之基因重組抗體表現用載體[J.Immunol. Methods, 167, 271(1994)],但亦可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同載體上之類型。串聯型基因重組抗體表現用載體使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、pEE18[Hybridoma, 17, 559 (1998)]等。
(2)編碼源自於人以外之動物之抗體之V區之cDNA之獲取及胺基酸序列之解析
編碼非人類抗體之VH及VL之cDNA之獲取及胺基酸序列之解析可以如下方式進行。
自產生非人類抗體之融合瘤細胞提取mRNA,合成cDNA。將所合成之cDNA選殖至噬菌體或質體等載體中,製作cDNA庫。使用編碼小鼠抗體之C區部分或V區部分之DNA作為探針,自該庫中分別單離出具有編碼VH或VL之cDNA之重組噬菌體或重組質體。分別確定重組噬菌體或重組質體上作為目標之小鼠抗體之VH或VL之全部鹼基序列,由鹼基序列分別推定VH或VL之全胺基酸序列。
製作產生非人類抗體之融合瘤細胞之人以外之動物使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔等,但只要能夠製作融合瘤細胞,則任何動物均可使用。
由融合瘤細胞製備總RNA時,使用異硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)]或RNA easy kit(Qiagen公司製造)等套組等。
由總RNA製備mRNA時,使用固定有寡聚(dT)之纖維素管柱法[MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]或Oligo-dT30<Super>(註冊商標)mRNA純化套組(Takara Bio公司製造)等套組等。又,亦可使用Fast Track(註冊商標)mRNA分離套組(Invitrogen公司製造)、或QuickPrep(註冊商標)mRN純化套組(Pharmacia公司製造)等套組由融合瘤細胞製備mRN。
cDNA之合成及cDNA庫之製作使用公知之方法[MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, Supplement1, John Wiley &Sons(1987-1997)]、或用於cDNA合成及質體選殖之SuperScript質體系統(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA(註冊商標)合成套組(Stratagene公司製造)等套組等。
製作cDNA庫時,作為整合以由融合瘤細胞提取之mRNA為模板合成之cDNA之載體,只要為可整合該cDNA之載體,任何載體均可使用。例如使用ZAP Express[Strategies, 5, 58 (1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造),λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pCD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]、或pUC18[Gene, 33, 103 (1985)]等。
作為導入利用噬菌體或質體載體構建之cDNA庫之大腸桿菌,可使用任意者,只要能夠導入、表現及維持該cDNA庫即可。例如使用XL1-Blue MRF'[Strategies, 5, 81 (1992)]、C600[Genetics, 39, 440 (1954)]、Y1088、Y1090[Science, 222, 778 (1983)]、NM522[J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、K802[J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]或JM105[Gene, 38, 275 (1985)]等。
自cDNA庫中選擇編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA純系時,使用利用同位素或經螢光標記之探針之菌落雜交法或噬菌斑雜交法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
又,亦可製備引子,以由mRNA合成之cDNA或cDNA庫作為模板進行聚合酶鏈反應法[以下記為PCR法,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),Current Protocols in Molecular Biology, Supplement1, John Wiley &Sons(1987-1997)],藉此製備編碼VH或VL之cDNA。
將所選擇之cDNA用適當之制限酶等切斷後,選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體中,藉由通常使用之鹼基序列解析方法等確定該cDNA之鹼基序列。於鹼基序列解析方法中,例如於進行雙去氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]等反應後,使用ABI PRISM3700(PE Biosystems 公司製造)或A.L.F.DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等。
由所確定之鹼基序列分別推定VH及VL之全胺基酸序列,與已知抗體之VH及VL之全胺基酸序列[免疫學上關注之蛋白質序列,美國衛生與公眾服務部(1991)]進行比較,藉此分別確認所獲取之cDNA是否編碼包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL之全胺基酸序列。關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL之全胺基酸序列,藉由與已知抗體之VH及VL之全胺基酸序列[免疫學上關注之蛋白質序列,美國衛生與公眾服務部(1991)]進行比較,能夠推定分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列,進而可知其等所屬於之亞群。又,對於VH及VL之各CDR之胺基酸序列,亦可藉由與已知抗體之VH及VL之胺基酸序列[免疫學上關注之蛋白質序列,美國衛生與公眾服務部(1991)]進行比較來找出。
又,可使用所得之VH及VL之全胺基酸序列,例如對SWISS-PROT或PIR-Protein等任意資料庫進行BLAST法[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]等同源性檢索,確認VH及VL之全胺基酸序列是否為新穎者。
(3)人型嵌合抗體表現載體或人型嵌合抗體改型體表現載體之構建
可將分別編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(1)中所得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游,藉此構建人型嵌合抗體表現載體。
為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側與人類抗體之CH或CL之5'末端側連結,而製作以如下方式設計之VH及VL之cDNA:連結部分之鹼基序列編碼適當之胺基酸,且成為適當之限制酶識別序列。將所製作之VH及VL之cDNA以其等以適當之形式表現之方式分別選殖至(1)中所得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游,構建人型嵌合抗體表現載體。
又,亦可使用於兩端具有適當之限制酶識別序列之合成DNA,利用PCR法對編碼非人類抗體VH或VL之cDNA分別進行擴增,選殖至(1)中所得之基因重組抗體表現用載體中。
(4)編碼人源化抗體之V區之cDNA之構建
編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA可以如下方式構建。
分別選擇出用於移植非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列之人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列。所選擇之FR之胺基酸序列只要源自於人類抗體,則可使用任意FR之胺基酸序列。例如使用Protein Data Bank等資料庫中登記之人類抗體之FR之胺基酸序列、或人類抗體之FR之各亞群之共同胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學關注之蛋白質序列),美國衛生與公眾服務部(1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低,選擇與原抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(至少60%以上)之FR之胺基酸序列。
繼而,向所選擇之人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列中分別移植原抗體之CDR之胺基酸序列,分別設計出人源化抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮於抗體基因之鹼基序列中出現之密碼子之使用頻率[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學關注之蛋白質序列),美國衛生與公眾服務部(1991)],而將設計之胺基酸序列轉換成DNA序列,分別設計出編碼人源化抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列。
基於所設計之DNA序列,合成數條由約100個鹼基長度構成之合成DNA,使用該等合成DNA進行PCR反應。於此情形時,就PCR反應中之反應效率及能夠合成之DNA之長度之觀點而言,較佳為對於VH、VL分別設計各6條合成DNA。進而,藉由於位於兩端之合成DNA之5'或3'末端導入適當之限制酶之識別序列,能夠容易地將編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA選殖至(1)中得到之基因重組抗體表現用載體中。
PCR反應後,將擴增產物分別選殖至pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體中,藉由與(2)中記載之方法同樣之方法確定鹼基序列,獲得具有所需之編碼人源化抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列之質體。
或,亦可使用基於所設計之DNA序列以各1條長鏈DNA之形式合成VH全長及VL全長而得之DNA來代替上述PCR擴增產物。進而,藉由於合成長鏈DNA之兩端導入適當之限制酶之識別序列,能夠容易地將編碼人源化抗體之VH或VL之cDNA選殖至(1)中得到之基因重組抗體表現用載體。
(5)人源化抗體之V區之胺基酸序列之改型
對於人源化抗體而言,僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR中時,其抗原結合活性與原非人類抗體相比降低[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]。於人源化抗體中,藉由鑑定出人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中直接與抗原之結合相關之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構而間接與抗原之結合相關之胺基酸殘基,並將該等胺基酸殘基置換為原非人類抗體之胺基酸殘基,能夠使降低之抗原結合活性升高。
為了鑑定出與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基,可藉由使用X線結晶解析[J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)]或電腦建模[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等,來進行抗體之立體結構之構建及解析。又,藉由對各抗體製作數種改型抗體並反覆研究與各自之抗原結合活性之相關性並反覆試驗,能夠獲得所需之具有抗原結合活性之人源化抗體。
人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用改型用合成DNA進行(4)中記載之PCR反應來進行改型。對於PCR反應後之擴增產物,藉由(2)中記載之方法來確定鹼基序列,確認已實施了目標改型。
(6)人源化抗體表現載體之構建
將所構建之編碼基因重組抗體之VH或VL之cDNA分別選殖至(1)中得到之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游,能夠構建人源化抗體表現載體。
例如,藉由向(4)及(5)中得到之構建人源化抗體之VH或VL時使用之合成DNA中位於兩端之合成DNA之5'或3'末端導入適當之限制酶之識別序列,而分別選殖至(1)中得到之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游,以使其等以適當之形式進行表現。
又,於製作上述嵌合抗體、人源化抗體等基因重組抗體之情形時,藉由製作將源自於2種不同抗體之H鏈(或VH)與L鏈(或VL)重組而成之抗體表現用載體,能夠構建VL置換嵌合抗體表現用載體。
(7)基因重組抗體之暫時性表現
使用(3)及(6)中得到之基因重組抗體表現用載體或對其等進行改型而得之表現載體進行基因重組抗體之暫時性表現,能夠高效率地對所製作之多種嵌合抗體、人源化抗體之抗原結合活性進行評價。
導入表現載體之宿主細胞只要為能夠表現基因重組抗體之宿主細胞,則可使用任何細胞,例如使用COS-7細胞[American Type Culture Collection(ATCC)編號:CRL1651][Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)]。
向COS-7細胞中導入表現載體時,使用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)]或脂轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)]等。
導入表現載體後,使用酶免疫抗體法Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、單純系抗體實驗手冊,講談社Scientific(1987)]等測定培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性。
(8)穩定表現基因重組抗體之轉化株之獲取及基因重組抗體之製備
藉由將(3)及(6)中得到之基因重組抗體表現用載體或對其等進行改型而得之表現載體導入至適當之宿主細胞中,能夠得到穩定表現基因重組抗體之轉化株。
表現載體向宿主細胞中之導入使用電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報,Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等。
導入基因重組抗體表現用載體之宿主細胞只要為能夠表現基因重組抗體之宿主細胞,則可使用任何細胞。例如使用CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC編號:CRL1662,或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14(ATCC編號:CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC編號:CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(Dihydroforate Reductase,以下記為dhfr)缺失之CHO細胞(CHO/DG44細胞)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)]等。
又,亦可使用與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖之合成相關之酶等蛋白質、與於N-糖苷鍵複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡糖胺之6位上使岩藻糖之1位進行α連接之糖鏈修飾相關之酶等蛋白質、或與細胞內糖核苷酸GDP-岩藻糖向高爾基體之轉運相關之蛋白質等之活性降低或缺失之宿主細胞,例如α1,6-岩藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、獲得了凝集素抗性之Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)]等。
導入表現載體後,將穩定表現基因重組抗體之轉化株於包含G418硫酸鹽(以下記為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養,藉此進行選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
動物細胞培養用培養基使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)或Hybridoma SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或者於該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。藉由將所得之轉化株於培養基中進行培養,使基因重組抗體於培養上清液中表現並蓄積。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又,可利用dhfr基因擴增系統(日本專利特開平2-257891號公報)等使轉化株所產生之基因重組抗體之表現量升高。
基因重組抗體使用蛋白A-管柱自轉化株之培養上清液中進行純化Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。又,亦可組合凝膠過濾、離子交換層析法及超濾等蛋白質之純化中使用之方法。
純化後之基因重組抗體之H鏈、L鏈或整個抗體分子之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature, 227, 680 (1970)],或西方墨點法[Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等進行測。
3.純化單株抗體或其抗體片段之活性評價
純化後之本發明之單株抗體或其抗體片段之活性評價可以如下方式進行。
本發明之抗體或該抗體片段對人類FGF23之結合活性可使用ELISA法或表面電漿子共振法等進行測定。
本發明之抗體或該抗體片段之人類FGF23中和活性可使用上述報告基因檢測等進行測定。
4.使用本發明之抗人類FGF23單株抗體或其抗體片段之疾病之治療方法
本發明之單株抗體或其抗體片段可用於人類FGF23相關疾病之治療。
包含本發明之單株抗體或其抗體片段之治療劑可僅包含作為有效成分之該抗體或該抗體片段,但通常以與藥理學上容許之1種以上之載體一起混合並利用製劑學之技術領域中公知之方法所製造之醫藥製劑的形式提供。
作為投予路徑,例如可例舉經口投予或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予。作為投予形態、例如可例舉噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
作為適合於經口投予之製劑、可例舉乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等。
如乳劑或糖漿劑之液體製備物使用水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖類、聚乙二醇或丙二醇等二醇類、芝麻油、橄欖油或大豆油等油類、對羥基苯甲酸酯類等防腐劑、或草莓香料或胡椒薄荷等香料類等作為添加劑來製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等賦形劑、澱粉或海藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素或明膠等結合劑、脂肪酸酯等界面活性劑或甘油等塑化劑等作為添加劑來製造。
作為適合於非經口投予之製劑,為注射劑、栓劑或噴霧劑等。注射劑使用由鹽溶液或葡萄糖溶或包含兩者之混合物之載體等來製造。栓劑使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來製造。
噴霧劑使用不刺激接受者之口腔及呼吸道黏膜,且使本發明之單株抗體或其抗體片段以微細粒子之形式分散而容易吸收之載體等來製造。作為載體,例如使用乳糖或甘油等。又,亦可以霧劑或乾粉之形式製造。進而,上述非經口劑中亦可添加於適合於經口投予之製劑中作為添加劑所例示之成分。
5.使用本發明之抗人類FGF23單株抗體或其抗體片段之疾病之診斷方法
藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段對人類FGF23進行檢測或測定,能夠對人類FGF23相關疾病進行診斷。
人類FGF23相關疾病之診斷例如可利用免疫學方法對患者體內存在之人類FGF23進行檢測或測定來進行。
所謂免疫學方法,係指使用實施了標記之抗原或抗體對抗體量或抗原量進行檢測或測定之方法。例如使用放射性物質標記免疫抗體法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方點墨法或物理化學方法。
放射性物質標記免疫抗體法例如係使本發明之抗體或該抗體片段與抗原或表現抗原之細胞等反應,進而使實施了放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或該抗體片段進行反應,之後用閃爍計數器等進行測定。
酵素免疫測定法例如係使本發明之抗體或該抗體片段與抗原或表現抗原之細胞等反應,進而使利用酶等實施了標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段進行反應,之後添加受質並用吸光光度計測定反應液之吸光度。例如使用夾層ELISA法等。作為酵素免疫測定法中使用之標記物,可使用公知[酵素免疫測定法,醫學書院(1987)]之酶標記。
例如使用鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光素酶標記或生物素標記等。夾層ELISA法係使抗體結合於固相上後,使其捕獲作為檢測或測定對象之抗原,並使第2抗體與捕獲之抗原反應之方法。該ELISA法中,準備作為對欲檢測或測定之抗原進行識別之抗體或抗體片段之抗原識別部位不同之2種抗體,預先使其中之第1抗體或抗體片段吸附至板(例如96孔板),繼而將第2抗體或抗體片段預先用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶或生物素等進行標記。於吸附有上述抗體之板上,使自生物體內分離之細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水或眼液等進行反應,之後使標記之單株抗體或抗體片段進行反應,並進行與標記物質對應之檢測反應。利用將濃度已知之抗原階段性地稀釋而製作之校準曲線,計算出受驗樣品中之抗原濃度。作為夾層ELISA法中使用之抗體,可使用多株抗體或單株抗體中之任一種,亦可使用Fab、Fab'或F(ab)
2等抗體片段。作為夾層ELISA法中使用之2種抗體之組合,可為識別不同表位之單株抗體或抗體片段之組合,亦可為多株抗體與單株抗體或與抗體片段之組合。
螢光免疫測定法係利用文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition,Academic Press (1996),單純系抗體實驗手冊,講談社Scientific (1987)]等中記載之方法進行測定。作為螢光免疫測定法中使用之標記物,可使用公知[螢光抗體法,Soft Science公司(1983)]之螢光標記。例如使用FITC或RITC等。
發光免疫測定法利用文獻[生物發光與化學發光 臨床檢查42,廣川書店(1998)]等中記載之方法進行測定。作為發光免疫測定法中使用之標記物,可例舉公知之發光體標記,使用吖啶鎓酯或咯吩等。
西方點墨法係藉由將抗原或表現抗原之細胞等用SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠)[Antibodies - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]區分後,將該凝膠轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纖維素膜,使識別抗原之抗體或抗體片段與該膜進行反應,進而使實施了FITC等螢光物質、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗小鼠IgG抗體或結合片段進行反應,之後使該標記可視化來進行測定。
物理化學方法例如係藉由使作為抗原之人類FGF23與本發明之單株抗體或其抗體片段結合而形成凝集體,並檢測該凝集體來進行。作為其他物理化學方法,亦可使用毛細管法、單向免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢查法提要,金原出版(1998)]等。乳膠免疫比濁法使用以抗體或抗原致敏之粒徑約0.1~1 μm之聚苯乙烯乳膠等載體,利用對應之抗原或抗體引起抗原抗體反應時,反應液中之散射光增加,透射光減少。以吸光度或積分球濁度之形式檢測該變化,藉此測定受驗樣品中之抗原濃度等。
以下,利用實施例具體地對本發明進行說明,但本發明不限於下述實施。
[實施例]
[實施例1]A抗體之分解物之檢測
將國際公開第2008/099969號中記載之抗人類FGF23抗體之重鏈可變區胺基酸序列記載於序列編號1,將輕鏈可變區胺基酸序列記載於序列編號2。以下,含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL之人IgG1抗體記載為A抗體。
用與實施例2同樣之方法製作A抗體,將該抗體溶液之溶劑置換為包含10 mM之L-麩胺酸鈉(SodiumL-glutamate)、262 mM之D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、及0.05 mg/mL聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)之pH值為4之溶劑。將所得之抗體溶液於40度下靜置1個月(以下記載為40度1M檢體)或於-80度下靜置1個月後解凍(以下記載為原始檢體)。
之後,使用40度1M檢體及原始檢體進行SEC分析及還原條件下之SDS-PAGE。作為SEC分析之結果,原始檢體中與抗體之分解物相當之峰顯示出約3%左右,而40度1M檢體顯示出9.32%。
又,作為SDS-PAGE之結果,與原始檢體相比,40度1M檢體中,位於比50 kDa附近之H鏈小約10 kDa之尺寸之條帶(條帶A)顯著變濃,與之相關,H鏈之條帶變淡。因此,條帶A為H鏈之分解物之條帶,提示40度1M檢體於H鏈處被分解。對條帶A分析N末端胺基酸序列,結果可確認到其於A抗體之重鏈可變區之第99位D與第100位I處被切斷。
[實施例2]I100改型抗體之製作
對於A抗體,用以下記載之方法製作將VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基I與表1記載之胺基酸殘基置換而成之抗體。以下,表1中記載之抗體之一部分或全部亦記載為I100改型抗體。
[表1]
抗體名稱 | 與I100置換之胺基酸 | 重鏈可變區之胺基酸序列 |
I100A | A | 序列編號3 |
I100L | L | 序列編號4 |
I100V | V | 序列編號5 |
I100Y | Y | 序列編號6 |
I100W | W | 序列編號7 |
I100T | T | 序列編號8 |
I100S | S | 序列編號9 |
I100R | R | 序列編號10 |
I100Q | Q | 序列編號11 |
I100N | N | 序列編號12 |
I100M | M | 序列編號13 |
I100K | K | 序列編號14 |
I100H | H | 序列編號15 |
I100G | G | 序列編號16 |
I100F | F | 序列編號17 |
I100E | E | 序列編號18 |
I100D | D | 序列編號19 |
使用無縫選殖法(委託FASMAC公司),將與編碼表1記載之各抗體之VH之胺基酸序列之鹼基序列對應之基因片段導入至表現載體中製作所需之質體。作為H鏈表現載體,使用具有訊號序列及人γ鏈恆定區序列之pCI-OtCAG_hG1載體。任一純系H鏈恆定區均使用人IgG1。
又,I100改型抗體之VL之胺基酸序列均使用A抗體之VL之胺基酸序列(序列編號2)。作為L鏈表現載體,使用具有訊號序列及人κ鏈恆定區序列之pCI-OtCMV_hK載體。使用QIAGEN質量體Maxi套組(QIAGEN公司)大量製備完成之質體。
繼而,使用Expi293表現系統套組(Life Technologies公司)使各抗體進行暫時性表現。質體導入方法按照附書類件進行。L鏈表現載體與H鏈表現載體以1:2之比例混合而導入。將質體導入後之細胞於37度、5%CO
2、125 rpm之條件下培養3日。之後,進行細胞培養懸濁液之離心分離,通過0.2 μm濾膜(Thermo Scientific公司)並回收培養上清液。藉由使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司)之親和純化,自培養上清液中獲得純化抗體。
具體而言,用PBS將填充於管柱中之樹脂平衡化後,於該管柱中添加培養上清液,用PBS清洗2次,用洗滌緩衝液1(PBS with 1M NaCl)、洗滌緩衝液2(20 mM檸檬酸、50 mM NaCl,pH值5.0)各清洗1次後,使用洗提緩衝液(20 mM 檸檬酸、50 mM NaCl,pH值3.4)將抗體洗提。
於所得之抗體溶液中加入1/10量之中和緩衝液(1M 磷酸-NaOH,pH值7.0)進行中和,使用NAP25(GE Healthcare公司)將抗體溶液之溶劑置換為PBS。對於緩衝液置換後之抗體溶液,使用Amicon Ultra-4離心過濾單元(Millipore公司)進行基於超濾之濃縮,使用Nanodrop(Thermo Scientific公司)測定吸光度A280,進行抗體溶液之濃度之測定及調整。吸光係數按照C.N.Pace等人之方法(1995,Prot. Sci.4:2411-2423)由各自之人源化抗體之胺基酸序列計算出。
[實施例3]I100改型抗體之抗原結合活性評價
對於實施例2中所得之I100改型抗體及A抗體,按如下方式測定對重組人類FGF-23(R&D Systems公司,Cat No.2604-FG-025/CF)之結合活性。
使用人類抗體捕獲套組(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司,Cat.No.BR-1008-39),按照所附之操作說明將抗人IgG抗體固定於CM5感測器晶片(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司,Cat.No.BR100530)。
將以1 μg/mL製備之抗體以10 μL/分之流速加入固定有抗人IgG抗體之流槽30秒。
繼而,將比130.5 ng/mL稀釋2倍、階段性地製備成5濃度之重組人類FGF-23以30 μL/分之流速監視結合反應2分鐘,監視解離反應10分鐘。測定採用單循環法。使用Bia Evaluation Software(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)解析所得之感測圖,計算各抗體之動力學常數。將計算出之各抗體之結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及解離常數[kd1/ka1=K
D]之部分結果示於表2、表3。表3之A_1、A_2、A_3均指A抗體。
[表2]
抗體名稱 | ka | kd | KD(M) |
A | 9.12+07 | 4.11E-04 | 4.51E-12 |
I100A | 4.60E+07 | 6.46E-04 | 1.40E-11 |
I100L | 1.95E+07 | 2.46E-04 | 1.26E-11 |
I100V | 1.07E+08 | 5.04E-04 | 4.73E-12 |
[表3]
抗體名稱 | ka | kd | KD(M) |
A_1 | 5.29E+07 | 1.09E-04 | 2.06E-12 |
A_2 | 4.21E+07 | 1.10E-04 | 2.60E-12 |
A_3 | 4.20E+07 | 1.58E-04 | 3.76E-12 |
I100Y | 2.24E+07 | 4.17E-04 | 1.86E-11 |
I100A | 2.06E+07 | 5.16E-04 | 2.51E-11 |
I100H | 6.21E+06 | 4.17E-04 | 6.72E-11 |
I100N | 7.78E+06 | 7.27E-04 | 9.34E-11 |
I100G | 8.70E+06 | 1.29E-03 | 1.49E-10 |
I100D | 1.15E+07 | 2.51E-03 | 2.19E-10 |
I100R | 9.89E+05 | 2.19E-04 | 2.22E-10 |
由表2、表3可確認到包括I100A抗體及I100Y抗體之大致全部I100改型抗體與A抗體相比抗原結合活性降低。
又,亦可確認到I100W、I100S、I100K及I100E抗體與A抗體相比抗原結合活性降低,以及I100T、I100Q、I100M及I100F抗體具有與A抗體同等程度之原結合活性。
[實施例4]I100改型抗體之分解抑制效果之確認
對於實施例2中所得之I100改型抗體及A抗體,使用NAP25(GE Healthcare公司)將抗體溶液之溶劑置換為包含10 mM之L-麩胺酸鈉及262 mM之D-山梨糖醇之pH值為4之溶劑。將所得之抗體溶液於40度下靜置1個月或2週後,於還原條件下進行SDS-PAGE。對於各抗體與A抗體,將與抗體之分解物相當之40 kDa附近之條帶之濃度之比較結果示於表4。於與A抗體相比改型抗體中該條帶之濃度降低之情形時,判斷為與A抗體相比改型抗體中抑制了分解。
表4之分解抑制效果之欄中記載之數值設定如下。將與A抗體相比更抑制了分解之抗體記載為1,將與A抗體以相同程度分解之抗體記載為2,將與A抗體相比更促進了分解之抗體記載為3。
[表4]
抗體名稱 | 分解抑制效果 |
I100A | 1 |
I100L | 2 |
I100V | 2 |
I100Y | 1 |
I100W | 1 |
I100T | 2 |
I100S | 2 |
1100R | 1 |
I100Q | 3 |
I100N | 1 |
I100M | 1 |
I100K | 2 |
I100H | 1 |
I100G | 1 |
I100F | 2 |
I100E | 2 |
I100D | 1 |
如表4所示,I100A、I100Y、I100W、I100R、I100N、I100M、I100H、I100G及I100D與A抗體相比更抑制了分解。I100L、I100V、I100T、I100S、I100K、I100F、及I100E與A抗體以相同程度分解。又,I100Q與A抗體相比更促進了分解。
[實施例5]A抗體及I100改型抗體之熱穩定性評價
用示差掃描熱量測定(Differential scanning calorimetry,以下記載為DSC)之方法評價A抗體及I100改型抗體之各抗體結構域(Fab、CH2、CH3)之熱穩定性。
於D-PBS緩衝液中以0.5 mg/mL之濃度製備測定樣品。測定使用Micro Cal VP‐毛細管DSC系統(Spectris股份有限公司)。又,以自25度到100度每1分鐘升溫1度之程式實施測定。將所得之結果示於表5及表6。
[表5]
抗體名稱 | Fab (度) | CH2 or Fab+CH2(度) | CH3(度) |
A | 66.8 | 69.3(CH2) | 82.9 |
I100A | 70.0(Fab+CH2) | 82.9 | |
I100L | 64.3 | 70.1(CH2) | 83.1 |
I100V | 67.3 | 71.6(CH2) | 83.3 |
[表6]
抗體名稱 | Fab (度) | CH2 or Fab+CH2(度) | CH3(度) |
A | 66.9 | 69.9(CH2) | 83.0 |
I100A | 70.3(Fab+CH2) | 83.1 | |
I100D | 65.5 | 70.0(CH2) | 83.4 |
I100G | 70.7(Fab+CH2) | 83.4 | |
I100H | 69.3 | 72.3(CH2) | 83.3 |
I100N | 71.3(Fab+CH2) | 83.3 | |
I100R | 74.3(Fab+CH2) | 83.4 | |
I100Y | 66.8 | 69.0(CH2) | 83.5 |
根據表5及表6,I100A、I100G、I100N及I100R檢測出Fab之峰與CH2之峰重疊,Fab之熱穩定性比A抗體提高了3~8度。綜上,可確認到I100A、I100G、I100N及I100R與A抗體相比結構穩定性提高。
[實施例6]D105改型抗體之製作
按照與實施例2同樣之方法,製作將A抗體之含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH之胺基酸序列之第105位D置換為表7所示胺基酸殘基而成之抗體(以下,該抗體之一部分或全部亦記載為D105改型抗體)。
[表7]
抗體名稱 | 與D105置換之胺基酸 | 重鏈可變區之胺基酸序列 |
D105A | A | 序列香號20 |
D105E | E | 序列編號21 |
D105F | F | 序列編號22 |
D105G | G | 序列編號23 |
D105H | H | 序列編號24 |
D105I | I | 序列編號25 |
D105K | K | 序列編號26 |
D105L | L | 序列編號27 |
D105M | M | 序列編號28 |
D105P | P | 序列編號29 |
D105Q | Q | 序列編號30 |
D105R | R | 序列編號31 |
D105V | V | 序列編號32 |
D105W | W | 序列編號33 |
D105Y | Y | 序列編號34 |
D105T | T | 序列編號35 |
D105N | N | 序列編號36 |
D105S | S | 序列編號37 |
[實施例7]D105改型抗體之抗原結合活性之評價
對於實施例6中所得之D105改型抗體,按照與實施例3同樣之方法測定對重組人類FGF-23(R&D Systems公司,Cat No.2604-FG-025/CF)之結合活性。將所得之結果示於表8、表9。表8中A_1、A_2均為A抗體之測定結果。
[表8]
抗體名稱 | ka | kd | KD(M) |
A_1 | 3.72E+07 | 1.40E-04 | 3.76E-12 |
A_2 | 2.96E+07 | 1.23E-04 | 4.15E-12 |
1100A | 2.13E+07 | 6.17E-04 | 2.89E-11 |
D105E | 1.29E+07 | 2.18E-04 | 1.70E-11 |
D105F | 2.65E+06 | 4.72E-04 | 1.78E-10 |
D105G | 4.84E+06 | 4.72E-04 | 9.75E-11 |
D105H | 1.19E+06 | 1.70E-04 | 1.43E-10 |
D105I | 2.50E+06 | 1.83E-04 | 7.34E-11 |
D105K | 1.73E+06 | 4.53E-04 | 2.62E-10 |
D105L | 3.39E+06 | 2.17E-04 | 6.39E-11 |
D105M | 4.54E+05 | 3.05E-04 | 6.71E-10 |
D105N | 2.92E+06 | 1.34E-04 | 4.60E-11 |
D105P | 2.51E+06 | 5.04E-04 | 2.01E-10 |
D105Q | 1.02E+06 | 2.57E-04 | 2.52E-10 |
D105R | 3.81E+05 | 7.26E-04 | 1.91E-09 |
D105S | 1.63E+06 | 1.72E-04 | 1.06E-10 |
D105V | 1.63E+06 | 4.30E-04 | 2.63E-10 |
D105W | 2.01E+06 | 3.00E-04 | 1.49E-10 |
D105Y | 3.21E+06 | 3.27E-04 | 1.02E-10 |
[表9]
抗體名稱 | ka | kd | KD(M) |
A | 4.82E+07 | 4.78E-04 | 9.93E-12 |
D105A | 5.21E+06 | 5.61E-04 | 1.08E-10 |
D105T | 3.86E+06 | 4.28E-04 | 1.11E-10 |
根據表8、表9,可確認到D105改型抗體與A抗體相比抗原結合活性均降低。
[實施例8]D105改型抗體之分解抑制效果之確認
對於實施例6中所得之D105改型抗體,按照與實施例4同樣之方法確認抗體之分解抑制效果。再者,抗體溶液於40度下靜置2週。
將所得之結果示於表10。關於表10中分解抑制效果之欄中記載之數值,與A抗體相比更抑制了分解之抗體記載為1,與A抗體以相同程度分解之抗體記載為2,與A抗體相比更促進了分解之抗體記載為3。
[表10]
抗體名稱 | 分解抑制效果 |
D105E | 2 |
D105F | 1 |
D105G | 1 |
D105H | 1 |
D105I | 1 |
D105K | 1 |
D105L | 1 |
D105M | 1 |
D105N | 1 |
D105P | 1 |
D105Q | 1 |
D105R | 1 |
D105S | 1 |
D105V | 1 |
D105W | 1 |
D105Y | 1 |
D105A | 1 |
D105T | 1 |
根據表10,可確認到除D105E以外之17種D105改型抗體與A抗體相比更抑制了分解。任一抗體均是與A抗體相比,SDS-PAGE中與抗體之分解物相當之約40 kDa之條帶之濃度大幅降低,能夠確認抗體之分解受到大幅抑制。
[實施例9]I100改型抗體及D105改型抗體對人類FGF23之中和活性之測定
對於實施例4及實施例8中24種與A抗體相比更抑制了抗體之分解之I100改型抗體及D105改型抗體(I00A、I100N、I100G、I100Y、I100R、I100D、I100H、D105A、D105F、D105G、D105H、D105I、D105K、D105L、D105M、D105P、D105Q、D105R、D105V、D105W、D105Y、D105T、D105N、及D105S),用以下記載之方法測定對人類FGF23之中和活性。
中和活性之測定使用啟動子檢測,該啟動子檢測使用利用具有源自於小鼠Egr1基因之啟動子之螢光素酶表現載體進行了轉化之αKlotho穩定表現HEK293細胞(以下記載為mEgr1/αKL/HEK293)。mEgr1/αKL/HEK293按照與Nature 2006 Dec 7;444(7120)中記載之方法同樣之方法進行製作。
該啟動子檢測中,若FGF23與mEgr1/αKL/HEK293上之αKlotho結合,則細胞內訊號流動螢光素酶基因表現,能夠檢測出該螢光素酶之螢光。若由於存在FGF23中和抗體而FGF23被中和,則該螢光強度減少。
抗體利用包含10 mM之L-麩胺酸鈉及262 mM之D-山梨糖醇之緩衝液稀釋為100 μg/mL,製成原液。作為mEgr1/αKL/HEK293之標準培養培養基,使用於DMEM培養基(Thermofisher)中添加10(vol%)之胎牛血清(Thermofisher)、1(vol)%之盤尼西林/鏈黴素而成者。
設將抗體於上述標準培養培養基稀釋1000倍之濃度(100 ng/mL)為最高濃度,準備√10倍稀釋之8階段稀釋系列供於評價。評價使用384孔板來進行。細胞為2000細胞/孔,所添加之FGF23濃度為4 ng/mL。所使用之FGF23與實施例3相同,用標準培養培養基稀釋後使用。
對細胞添加各抗體後培養24小時,之後添加FGF23培養4小時。螢光素酶之螢光強度使用Bright-Glo(商標)螢光素酶檢測系統(Promega),用多讀板儀Envision(perkinelmer)進行測定。
對於所得之結果,設FGF23添加時之螢光強度為100%,非添加時之螢光強度為0%,計算各抗體添加時之螢光強度之比例,將其IC50值(ng/mL)示於表11。
[表11]
抗體名稱 | IC50(ng/mL) |
A | 1.4 |
D105A | >100 |
D105F | >100 |
D105G | 33.1 |
D105H | 46.7 |
D105I | 23.7 |
D105K | 45.7 |
D105L | 25.6 |
D105M | >100 |
D105N | 14.0 |
D105P | 99.2 |
D105Q | >100 |
D105R | >100 |
D105S | 27.8 |
D105T | >100 |
D105V | >100 |
D105W | 77.9 |
D105Y | 21.6 |
I100A | 5.1 |
I100D | >100 |
I100G | >100 |
I100H | 8.9 |
I100N | 26.2 |
I100R | 82.5 |
I100Y | 3.0 |
如表11所示,任一改型抗體與A抗體相比FGF23中和活性均降低。
[實施例10]A抗體之重鏈恆定區改型抗體之製作
按以下記載之方法製作A抗體之重鏈恆定區之胺基酸改型抗體(以下記載為CH改型抗體)。
關於CH改型抗體,製作將A抗體之CH(人IgG1)置換為人IgG2、IgG2AAAS(對於人IgG2之Fc,將EU索引第234位纈胺酸置換為丙胺酸,將237位甘胺酸置換為丙胺酸,及將第331位脯胺酸置換為絲胺酸而成之人IgG2改型抗體)(Michael, S., et al., J.Immunol., 1997, 159: 3613; J.Immunol. 2000,164:4178-4184)、或IgG4PE_R409K(對於人IgG4之Fc,將EU索引第228位絲胺酸置換為脯胺酸,將第235位白胺酸置換為麩胺酸,將第409位精胺酸置換為離胺酸而成之人IgG4改型抗體)(國際公開第2006/033386號)之CH而成之同型抗體、或者對A抗體或A抗體之3種同型抗體之各者之Fc區施加已知提高對人及猴FcRn之結合活性之下述(10-1)~(10-5)之Fc胺基酸改型而成之總計23種抗體。
<Fc胺基酸改型>
(10-1)將EU索引第252位M置換為Y,將第254位S置換為T,及將第256位T置換為E之胺基酸改型(J. Biol. Chem. 2006b;281:23514-23524);
(10-2)將EU索引250位T置換為Q,及將第428位N置換為L之胺基酸改型(J. Biol. Chem. 2004;279:6213-6216);
(10-3)將EU索引第434位N置換為A之胺基酸改型(J. Immunol. 1997;158:2211-2217);
(10-4)將EU索引第308位V置換為P之胺基酸改型(Drug. Metab. Dispos. 2012a;40:1545-1555);
(10-5)將EU索引第428位M置換為L,及將第434位N置換為S之胺基酸改型(Nat. Biotechnol. 2010;28:157-159)。
以下,將A抗體之CH置換為人IgG2之CH而成之CH改型抗體記載為A_G2抗體。置換為其他亞型之CH改型抗體亦同樣地進行記載。
以下,將對A抗體之Fc區施加上述(10-1)~(10-5)之胺基酸改型而成之CH改型抗體分別記載為A_YTE抗體、A_QL抗體、A_A抗體、A_P抗體、A_LS抗體。又,對A_G2抗體、A_G2AAS抗體、及A_G4PE_R409K抗體施加上述(10-1)~(10-5)之胺基酸改型而成之CH改型抗體亦同樣地進行記載。
對於包含編碼實施例2中製作之A抗體之H鏈之可變區及恆定區之胺基酸序列之鹼基序列之質體用NheI及BamHI進行限制酶處理,製備去除了恆定區部分之載體片段。以該質體片段為基礎,於FASMAC公司合成包含編碼上述23種類之CH改型抗體之胺基酸序列之鹼基序列之基因片段,並將其導入適當之表現載體而製作所需之質體。使用所得之質體,按照與實施例2同樣之方法製備抗體。
[實施例11]A抗體及A抗體之CH改型抗體對FcRn之結合活性之測定
對於實施例2、10中製作之A抗體及A抗體之CH改型抗體,按照以下記載之方法,用Biacore測定對人及猴FcRn之結合活性。
於HBS-EP+(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司,Cat.No.BR-1006-69)中添加1 M鹽酸(富士膠片和光純藥股份有限公司,Cat.No.083-01095),調整pH值為6之HBS-EP+。各抗體使用NAP25將緩衝液交換至上述pH值為6之HBS-EP+中。人FcRn及猴FcRn亦使用pH值為6之HBS-EP+進行稀釋。實驗中所用之人FcRn及猴FcRn按如下方式製作。
將編碼人FcRn(為了表現為可溶型分子,僅使用人FcRn之全長胺基酸序列中第1~297位胺基酸)、其C末端附加有6個組胺酸之人FcRn-His tag(胺基酸序列:序列編號54)、及人β2微球蛋白(胺基酸序列:序列編號55)之DNA序列插入至哺乳細胞之表現質體之CMV啟動子之下游。使用該質體,與實施例2所示方法同樣地使用Expi293表現系統套組(Life Technologies公司)進行暫時性表現。
對於猴FcRn(為了表現為可溶型分子,僅使用猴FcRn之全長胺基酸序列中第1~297位胺基酸)、其C末端附加有6個組胺酸之猴FcRn-His tag(胺基酸序列:序列編號56)、及猴β2微球蛋白(胺基酸序列:序列編號57),亦按照與人FcRn-His tag同樣之方法進行暫時性表現。
獲取各培養上清液後,使用Ni-NTA Agarose(QIAGEN,Cat.No.30210),對人及猴FcRn進行純化。對於純化方法,按照Ni-NTA Agarose之手冊中記載之標準方法實施。
Biacore之測定於以下條件下實施。將Tetra His Antibody BSA Free(QIAGEN公司)固定於CM5感測器晶片(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司,Cat.No.BR100530)。將以10 μg/mL製備之人FcRn及猴FcRn以10 μL/分之流速添加至固定有Tetra His Antibody BSA Free之流槽120秒。繼而,將比450 μg/mL稀釋3倍、階段性地製備成5濃度之各Fc改型抗體以30 μL/分之流速監視結合反應2分鐘,監視解離反應5分鐘。
測定以多循環法進行。所得之感測圖使用Bia Evaluation Software(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)進行解析,計算各抗體之解離常數[kd1/ka1=KD]。將其結果示於表12、13。
[表12]
抗體名稱 | KD(M) | |
hFcRn | Cyno FcRn | |
A | 5.05E-07 | 2.12E-07 |
A_A | 3.08E-07 | 1.55E-07 |
A_P | 1.83E-07 | 6.02E-08 |
A_QL | 1.87E-07 | Not detected |
A_YTE | 1.59E-07 | 1.15E-07 |
A_G2 | 6.24E-07 | 2.33E-07 |
A_G2_A | 2.86E-07 | 1.33E-07 |
A_G2_P | 2.34E-07 | 7.82E-08 |
A_G2_QL | 2.02E-07 | 4.33E-08 |
A_G2_YTE | 1.86E-07 | 3.91E-08 |
A_G2AAAS | 6.23E-07 | 2.42E-07 |
A_G2AAAS_A | 2.47E-07 | 1.29E-07 |
A_G2AAAS_P | 2.20E-07 | 7.53E-08 |
A_G2AAAS_QL | 2.13E-07 | 6.90E-08 |
A_G2AAAS_YTE | 1.97E-07 | 4.79E-08 |
A_IgG4PE_R409K | 9.12E-07 | 3.24E-07 |
A_IgG4PE_R409K_A | 4.29E-07 | 1.90E-07 |
A_IgG4PE_R409K_P | 1.92E-07 | 7.69E-08 |
A_IgG4PE_R409K_QL | 2.65E-07 | 8.70E-08 |
A_IgG4PE_R409K_YTE | 2.27E-07 | 1.23E-07 |
[表13]
抗體名稱 | 對hFcRn之KD(M) |
A_LS | 1.42E-07 |
A_G2_LS | 3.10E-07 |
A_G2AAAS_LS | 1.59E-07 |
A_IgG4PE_R409K_LS | 1.16E-07 |
如表12及表13所示,可確認到與A抗體及A抗體之同型(A2_G2、A_G2AAAS、及A_IgG4PE_R409K抗體)相比,Fc中導入實施例10(1)~(5)記載之胺基酸改型而成之CH改型抗體對人FcRn及猴FcRn之結合活性提高。
[實施例12]I100及D105改型抗體之CH改型抗體之製作
實施例4及實施例8中可確認到與A抗體相比更抑制了抗體之分解之I100及D105改型抗體之中,對於D105N、I100A、I100H、及I100Y抗體之各者,按照以下記載之方法製作施加了下述(12-1)~(12-5)之胺基酸改型之CH改型抗體。
(12-1)將EU索引第252位M置換為Y,將第254位S置換為T,及將第256位T置換為E之胺基酸改型;
(12-2)將CH由人IgG1置換為人IgG2,將EU索引第252位M置換為Y,將第254位S置換為T,及將第256位T置換為E之胺基酸改型;
(12-3)將CH由人IgG1置換為人IgG2,將EU索引第428位M置換為L,將第434位N置換為S之胺基酸改型;
(12-4)將CH由人IgG1置換為人IgG4PE_R409K,將EU索引第308位V置換為P之胺基酸改型;
(12-5)將CH由人IgG1置換為人IgG4PE_R409K,將EU索引第428位M置換為L,及將第434位N置換為S之胺基酸改型。
以下,將於D105N抗體中進行了上述(12-1)~(12-5)之胺基酸改型之CH改型抗體分別記載為D105N_YTE、D105N_G2_YTE、D105N_G2_LS、D105N_G4PE_R409K_P、及D105N_G4PE_R409K_LS抗體。其他抗體亦同樣地進行記載。
再者,進行了上述(12-1)~(12-5)之胺基酸改型之CH改型抗體之CH之胺基酸序列分別記載於序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52。
將實施例10中製作之質體用Bstz17I及NheI進行限制酶處理,製備去除了可變區部分之載體片段。以該質體片段為基礎,於FASMAC公司合成包含編碼D105N、I100A、I100H、及I100Y抗體之VH之胺基酸序列之鹼基序列之基因片段,並將其導入適當之表現載體製作所需之質體。使用所得之質體,按照與實施例2同樣之方法製備各抗體。
[實施例13]重鏈恆定區改型抗體之FGF23中和活性之測定
對於實施例12中製備之20種CH改型抗體,按照與實施例9同樣之方法測定FGF23中和活性。將所得之結果示於表14。
[表14]
抗體名稱 | IC50(ng/mL) |
A | 1.2 |
D105N_YTE | 12.4 |
D105N_G2_YTE | 12.4 |
D105N_G2_LS | 12.4 |
D105N_IgG4PE_R409K_P | 13.3 |
D105N_IgG4PE_R409K_LS | 11.7 |
I100A_YTE | 4 |
I100A_G2_YTE | 5 |
I100A_G2_LS | 2.4 |
I100A_IgG4PE_R409K_P | 5.2 |
I100A_IgG4PE_R409K_LS | 6.6 |
I100H_YTE | 11.3 |
I100H_G2_YTE | 8.9 |
I1001H_G2_LS | 13 |
I100H_IgG4PE_R409K_P | 14.4 |
I100H_IgG4PE_R409K_LS | 13.1 |
I100Y_YTE | 5.6 |
I100Y_G2_YTE | 2.9 |
I100Y_G2_LS | 4.4 |
I100Y_IgG4PE_R409K_P | 4.1 |
I100Y_IgG4PE_R409K_LS | 2.9 |
如表14所示,可變區之胺基酸序列相同之抗體即便恆定區之胺基酸序列有所變化,亦顯示出相同程度之FGF23中和活性。綜上,能夠確認各抗體中之重鏈恆定區之胺基酸改型不影響抗體之FGF23中和活性。
[實施例14]提高抗原結合活性之改型抗體之製作
對於I100A及I100Y抗體,為了提高表2及表3記載之抗原結合活性,於Abwiz Bio公司進行採用噬菌體展示法之親和成熟,獲得下述(14-1)~(14-9)之胺基酸序列資訊。
(14-1)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第51位胺基酸置換為V,將第54位胺基酸置換為F,將第55位胺基酸置換為W,將第57位胺基酸置換為R,將第58位胺基酸置換為W,及將第100位胺基酸置換為A而成之VH(H2B11_A,胺基酸序列:序列編號38);
(14-2)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸置換為L,將第54位胺基酸置換為W,將第55位胺基酸置換為H,將第57位胺基酸置換為T,將第58位胺基酸置換為F,及將第100位胺基酸置換為A而成之VH(J2H2B9_A,胺基酸序列:序列編號39);
(14-3)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸置換為V,將第54位胺基酸置換為F,將第55位胺基酸置換為C,將第57位胺基酸置換為F,將第58位胺基酸置換為V,及將第100位胺基酸置換為A而成之VH(J2H2E9_A,胺基酸序列:序列編號40);
(14-4)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第51位胺基酸置換為L,將第54位胺基酸置換為W,將第55位胺基酸置換為T,將第57位胺基酸置換為Y,將第58位胺基酸置換為R,及將第100位胺基酸置換為A而成之VH(2H2E1_A,胺基酸序列:序列編號41);
(14-5)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第54位胺基酸置換為W,將第55位胺基酸置換為V,將第57位胺基酸置換為R,將第58位胺基酸置換為A,及將第100位胺基酸置換為A而成之VH(2H2E5_A,胺基酸序列:序列編號42);
(14-6)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第51位胺基酸置換為V,將第54位胺基酸置換為Y,將第55位胺基酸置換為R,將第57位胺基酸置換為K,將第58位胺基酸置換為W,及將第100位胺基酸置換為Y而成之VH(2H2E8_Y,胺基酸序列:序列編號43);
(14-7)於包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL中,將序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸置換為M,將第92位胺基酸置換為Y,將第94位胺基酸置換為D,將第96位胺基酸置換為N而成之VL(L3G12,胺基酸序列:序列編號44);
(14-8)於包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL中,將序列編號2所示之胺基酸序列之第28位胺基酸置換為D,將第29位胺基酸置換為V,將第31位胺基酸置換為T,將第34位胺基酸置換為L而成之VL(L1H8,胺基酸序列:序列編號45);
(14-9)於包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL中,將序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸置換為L,將第92位胺基酸置換為Y,將第94位胺基酸置換為D,將第96位胺基酸置換為D而成之VL(2L3H7,胺基酸序列:序列編號46)。
[實施例15]改型抗體之製備
使用實施例14中所得之胺基酸序列資訊及(15-1)記載之VH之胺基酸序列,製作表15記載之A-1~A-8之改型抗體。
(15-1)於含有序列編號1所示之胺基酸序列之VH中,將序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸置換為L,將第54位胺基酸置換為W,將第55位胺基酸置換為H,將第57位胺基酸置換為T,將第58位胺基酸置換為F,及將第100位胺基酸置換為Y而成之VH(J2H2B9_Y,胺基酸序列:序列編號47)。
[表15]
抗體名稱 | VH之序列編號 | VL之序列編號 | 重鏈恆定區之序列編號 |
A | 序列編號1 | 序列編號2 | 序列編號53 |
A-1 | 序列編號39 | 序列編號2 | 序列編號48 |
A-2 | 序列編號47 | 序列編號2 | 序列編號48 |
A-3 | 序列編號3 | 序列編號44 | 序列編號48 |
A-4 | 序列編號6 | 序列編號44 | 序列編號48 |
A-5 | 序列編號3 | 序列編號45 | 序列編號48 |
A-6 | 序列編號6 | 序列編號45 | 序列編號48 |
A-7 | 序列編號3 | 序列編號46 | 序列編號48 |
A-8 | 序列編號6 | 序列編號46 | 序列編號48 |
按照與實施例12同樣之方法,製作包含編碼各抗體之胺基酸序列之鹼基序列之質體,按照與實施例2同樣之方法由該質體製備抗體。
[實施例16]改型抗體之評價
使用實施例15中製備之8種改型抗體及作為對照之A抗體來評價抗原結合活性、FGF23中和活性、及熱穩定性。對於任一改型抗體,均是將緩衝液為D-PBS(Nacalai Tesque股份有限公司,Code 14249-24)、濃度調整為0.5 mg/mL之樣品根據目的進行稀釋,由此進行各種測定。
16-1)改型抗體之抗原結合活性之測定
按照與實施例3同樣之方法測定對人類FGF23之結合活性。再者,關於感測器晶片,代替將抗人IgG抗體固定於CM5感測器晶片,而使用蛋白A感測器晶片(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司,Cat.No.29127555)來實施。將各抗體之結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)、以及由其等計算出之解離常數[kd1/ka1=KD]示於表16。
[表16]
抗體名稱 | 抗原結合活性KD(M) | FGF23中和活性IC50(ng/mL) ()為同一測定批次中之A抗體之值 | PI (4度,PBS) |
A-1 | 8.22E-12 | 3.5(3.1) | 7.84 |
A-2 | 8.08E-12 | 3.4(3.1) | 7.87 |
A-3 | 8.27E-12 | 2.7(3.3) | 7.72 |
A-4 | 8.74E-12 | 1.9(3.3) | 7.73 |
A-5 | 3.61E-12 | 1.9(3.3) | 7.31 |
A-6 | 1.13E-11 | 3.6(3.3) | 7.35 |
A-7 | 1.61E-11 | 3.2(3.3) | 7.26 |
A-8 | 6.70E-12 | 2.4(3.3) | 7.32 |
A | 8.77E-12 | 3.3 | 8.19 |
根據表16,可確認到A-1~A-8中之任一抗體均具有與A抗體相同程度之抗原結合活性。
實施例3中,I100A抗體及I100Y抗體之抗原結合活性與A抗體相比降低。又,A-1~A-8中之任一抗體均是VH之第100位胺基酸殘基為A或Y。
綜上,對於A抗體,若將VH之第100位胺基酸殘基置換為A或Y,則抗體之抗原結合活性降低,但可確認到藉由A-1~A-8抗體所具有之進一步之胺基酸殘基之置換,抗體之抗原結合活性提昇至與A抗體相同之程度。
16-2)人類FGF23中和活性之測定
對於改型抗體,按照與實施例9同樣之方法測定人類FGF23中和活性。將所得之結果示於表16。根據表16,可確認到任一改型抗體均具有與同一測定批次中之A抗體相同程度之FGF23中和活性。
實施例9中,I100A抗體及I100Y抗體之FGF23中和活性與A抗體相比降低。又,A-1~A-8中之任一抗體均是VH之第100位胺基酸殘基為A或Y。
綜上,對於A抗體,若將VH之第100位胺基酸殘基置換為A或Y,抗體之FGF23中和活性降低,但可確認到藉由A-1~A-8抗體所具有之進一步之胺基酸殘基之置換,抗體之中和活性提昇至與A抗體相同之程度。
16-3)等電點之確認
各抗體之等電點使用iCE3系統(Protein Simple公司)。使用Pharmalyte 3-10 for IEF(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司,Cat.No.17-0456-01)作為測定之載體,使用pI標記物5.12(Protein Simple公司,Cat. No.102224)作為酸性標記物,使用pI標記物9.77(Protein Simple公司,Cat.No.102219)作為鹼性標記物。測定方法係依據標準之操作說明。
將所得之結果示於表16。根據表16,可確認到任一改型抗體與A抗體相比pI均降低。
16-4)抗體之分解抑制率之確認
藉由與實施例4同樣之方法,對A-1抗體~A-8抗體確認分解抑制率。再者,本實施例中,將各抗體於40度下靜置2週,使用生物分析儀電泳系統(安捷倫科技股份有限公司)及安捷倫蛋白質230套組(安捷倫科技股份有限公司,Cat.5067-1517),確認抗體之分解。對於樣品製備及電泳條件,按照套組所附之操作說明進行實驗。所得之電泳圖中,檢測抗體之H鏈之條帶為63 kDa,與抗體之分解物相當之條帶為約55 kDa。將與該抗體之分解物相當之條帶之峰面積率(%)、及各抗體相對於A抗體之分解條帶峰面積率之比(%)示於表17及表18。
[表17]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率(%) | 分解條帶峰面積率之比(%) |
A | 39.2 | 100 |
A-1 | 14.6 | 37.2 |
A-2 | 14.8 | 37.8 |
A-3 | 15 | 38.3 |
A-4 | 7.6 | 19.4 |
A-5 | 26.8 | 68.4 |
A-6 | 7.7 | 19.6 |
[表18]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率(%) | 分解條帶峰面積率之比(%) |
A | 39.4 | 100 |
A-7 | 9.8 | 24.9 |
A-8 | 5.4 | 13.7 |
如表17及表18所示,可確認到與A抗體相比,A-1抗體至A-8抗體全部抑制分解。
16-5)熱穩定性之確認
對A抗體、A_YTE抗體、A-1抗體、A-3抗體、A-5抗體、及A-8抗體之6種抗體,與實施例5所記載之方法同樣地實施熱穩定性評價。將所得之結果示於表19。
[表19]
抗體名稱 | Fab | CH2 or Fab+CH2 | CH3 |
(度) | (度) | (度) | |
A | 66.9 | 69.7(CH2) | 82.9 |
A_YTE | 65.7 | 70.2(CH2) | 83.0 |
A-1 | 70.1(Fab+CH2) | 82.6 | |
A-3 | 69.4(Fab+CH2) | 82.9 | |
A-5 | 64.6 | 70.8(CH2) | 82.6 |
A-8 | 64.2 | 70.9(CH2) | 82.8 |
如表19所示,A抗體與A_YTE抗體中,抗體之各部位之熱穩定性無變化。另一方面,與A_YTE抗體具有相同重鏈恆定區胺基酸序列之A-1抗體與A-3抗體中,可確認到與A抗體及A_YTE抗體相比,Fab之熱穩定性提高了約3度。
[實施例17]A-9抗體、A-10抗體之製作
按照與實施例2同樣之方法製作表20記載之A-9抗體及A-10抗體(以下,有時亦將A-9抗體、A-10抗體記載為改型抗體)。
A-9抗體之L鏈表現載體使用pcDNA3.4載體(Invitrogen),而不是實施例2之pCI載體。又,A-9抗體、A-10抗體均是將L鏈之表現載體與H鏈之表現載體以1:1之比例混合而導入細胞。
[表20]
抗體名稱 | VH之序列編號 | VL之序列編號 | 重鏈恆定區之序列編號 |
A-9 | 序列編號3 | 序列編號58 | 序列編號48 |
A-10 | 序列編號6 | 序列編號59 | 序列編號48 |
關於A-9抗體之VL,對於I100A抗體,於Abwiz Bio公司進行採用噬菌體展示法之親和成熟,獲得下述胺基酸序列資訊。
於包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL中,將序列編號2所示之胺基酸序列之第92位胺基酸置換為W,將第94位胺基酸置換為D,將第96位胺基酸置換為D而成之VL(胺基酸序列:序列編號58)。
A-10抗體之VL設計並使用下述VL。
於包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL中,將序列編號2所示之胺基酸序列之第92位胺基酸置換為Y,將第94位胺基酸置換為D,將第96位胺基酸置換為D而成之VL(胺基酸序列:序列編號59)。
[實施例18]改型抗體之評價
使用實施例17中製備之2種改型抗體及作為對照之A抗體來評價抗原結合活性、FGF23中和活性、及熱穩定性。對於任一改型抗體,均是將緩衝液為D-PBS(Nacalai Tesque股份有限公司,Code 14249-24)、濃度調整為1 mg/mL之樣品根據目的進行稀釋,由此進行各種測定。
(18-1)改型抗體之抗原結合活性之測定
按照與實施例16同樣之方法測定對人類FGF23之結合活性。將各抗體之結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)、及由其等計算出之解離常數[kd1/ka1=KD]示於表21。
[表21]
抗體名稱 | 抗原結合活性KD(M) | FGF23中和活性IC50(ng/mL) ()為同一測定批次中之A抗體之值 | PI (4度,PBS) |
A-9 | 6.87E-12 | 1.0(3.2) | 7.69 |
A-10 | 2.02E-11 | 1.5(2.8) | 7.53 |
A | 1.44E-11 | 3.2 | 8.19 |
根據表21,可確認到A-9抗體具有A抗體之2倍之抗原結合活性,A-10抗體具有與A抗體相同程度之抗原結合活性。實施例3中,I100A抗體及I100Y抗體中抗原結合活性與A抗體相比降低。又,A-9抗體及A-10抗體中,VH之第100位胺基酸殘基分別為A及Y。
綜上,若將A抗體之VH之第100位胺基酸殘基置換為A或Y,則抗體之抗原結合活性降低,但可確認到藉由A-9抗體及I100Y抗體所具有之進一步之胺基酸殘基之置換,抗體之結合活性提昇至與A抗體同等以上。
(18-2)人類FGF23中和活性之測定
對於改型抗體,按照與實施例9同樣之方法測定人類FGF23中和活性。將所得之結果示於表21。根據表21,可確認到A-9抗體具有A抗體之3倍之FGF23中和活性,A-10抗體具有A抗體之2倍之FGF23中和活性。
實施例9中,I100A或I100Y與A抗體相比中和活性降低。又,A-9抗體及A-10抗體中,VH之第100位胺基酸殘基分別為A及Y。
綜上,對於A抗體,若將VH之第100位胺基酸殘基置換為A或Y,則抗體之FGF23中和活性降低,但可確認到藉由A-9抗體及A-10抗體所具有之進一步之胺基酸殘基之置換,抗體之FGF23中和活性提昇至A抗體以上。
[實施例19]改型抗體之分解抑制率之確認
使用A-1抗體、A-3抗體、A-5抗體、A-8抗體之4種改型抗體及作為對照之A抗體來確認分解抑制率。
再者,本實施例中所用之抗體係將目的基因序列插入至哺乳動物用表現載體,並導入至CHO細胞中後,藉由使用MabSelect SuRe(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)之親和純化及陽離子交換層析法,而自哺乳動物細胞用培養基上清液中獲得純化抗體。使用NAP25(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)將抗體溶液之溶劑置換為包含10 mM之L-麩胺酸鈉、262 mM之D-山梨糖醇、及0.05 mg/mL聚山梨醇酯80之pH值為4及pH值為4.5之溶劑,使蛋白質濃度為1 mg/mL。
將所得之抗體溶液於40度下靜置1個月及於25度下靜置3個月後,於-80度下冷凍。將該抗體溶液融解後,使用生物製劑解析系統PA800Plus(SCIEX公司)確認抗體之分解。樣品製備或分析等基本條件按照Oscar Salas-Solano等人之方法實施(2006,Anal. Chem.:6583-6594),並適當變更。
對於與該抗體之分解物相當之條帶之峰面積率(%),pH值4.5下之結果示於表22,pH值5.0下之結果示於表23。溶劑置換後即刻於-80度下冷凍之樣品記為Initial,40度下靜置1個月後於-80度下冷凍之樣品記為40℃1M,25度下靜置3個月後於-80度下冷凍之樣品記為25℃3M。任一樣品均以相同條件融解後實施測定。
[表22]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率Initial (%) | 分解條帶峰面積率40℃1M (%) | 分解條帶峰面積率25℃3M (%) |
A | 2.5 | 47.2 | 36.8 |
A-1 | 0.4 | 17.7 | 9.3 |
A-3 | 0.3 | 14.2 | 6.7 |
A-5 | 0.7 | 30.8 | 18.6 |
A-8 | 0.1 | 5.8 | 1.3 |
[表23]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率Initial(%) | 分解條帶峰面積率40℃1M(%) | 分解條帶峰面積率25℃3M(%) |
A | 2.5 | 19.6 | 16.8 |
A-1 | 0.4 | 9.0 | 5.4 |
A-3 | 0.3 | 6.1 | 3.0 |
A-5 | 0.7 | 15.1 | 9.4 |
A-8 | 0.1 | 3.5 | 0.9 |
如表22及表23所示,與實施例16同樣,即便緩衝液條件為pH值4.5及pH值5.0,保存條件為40度下1個月及25度下3個月,亦可確認到與A抗體相比,A-1抗體、A-3抗體、A-5抗體、及A-8抗體全部抑制了分解。
[實施例20]改型抗體之分解抑制率之確認
使用實施例17中製備之2種改型抗體及作為對照之A抗體及A-1抗體來確認分解抑制率。
再者,本實施例中所用之A抗體及A-1抗體係將目的基因序列插入至哺乳動物用表現載體,並導入至CHO細胞中後,藉由使用MabSelect SuRe(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)之親和純化及陽離子交換層析法,而自哺乳動物細胞用培養基上清液中獲得純化抗體。使用NAP25(Global Life Sciences Technologies Japan股份有限公司)將抗體溶液之溶劑置換為包含10 mM之L-麩胺酸鈉、262 mM之D-山梨糖醇、及0.05 mg/mL聚山梨醇酯之pH值為4、pH值為4.5、及pH值為5之溶劑,使蛋白質濃度為1 mg/mL。
將所得之抗體溶液於40度下靜置1個月後,使用微晶片型電泳系統LabChip(珀金埃爾默公司)及Protein Clear Reagent套組(珀金埃爾默公司,Cat.CLS960014)確認抗體之分解。關於樣品製備及電泳移動條件,按照套組所附操作說明進行實驗。
關於還原條件下之測定結果中與該抗體之分解物相當之條帶之峰面積率(%),pH值4.0下之結果示於表24,pH值4.5下之結果示於表25,pH值5.0下之結果示於表26。
[表24]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率(%) | 分解條帶峰面積率之比(%) |
A | 32.7 | 100 |
A-1 | 11.2 | 34.2 |
A-9 | 9.2 | 28.0 |
A-10 | 5.1 | 15.6 |
[表25]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率(%) | 分解條帶峰面積率之比(%) |
A | 20.7 | 100 |
A-1 | 7.1 | 34.4 |
A-9 | 5.4 | 26.0 |
A-10 | 3.2 | 15.3 |
[表26]
抗體名稱 | 分解條帶峰面積率(%) | 分解條帶峰面積率之比(%) |
A | 8.2 | 100 |
A-1 | 3.5 | 42.7 |
A-9 | 2.6 | 32.1 |
A-10 | 1.7 | 21.0 |
如表24、表25及表26所示,A-9抗體、A-10抗體亦確認到於緩衝液條件為pH值4.0、pH值4.5或pH值5.0,保存條件為40度下1個月之情形時,與A抗體相比抑制了分解。
[實施例21]
為了確認對雄性食蟹猴單次皮下投予受驗抗體時之藥理作用之持續性,實施血清中之無機磷濃度(mg/dL)之測定。
作為受驗抗體,皮下投予A8抗體(1.8 mg/kg)。於投予後56日之期間內經時性地採血,測定各時間點之血清中之無機磷濃度。磷濃度之測定使用Clinalyzer(JCA-BM6070),利用PNP-XDH法進行測定。
將所得之結果示於表27。投予A-8抗體後,血清中之無機磷濃度自投予後第3日開始升高,即便於投予後56日,亦與基準線之無機磷濃度(表27之Day0之磷濃度)相比顯示出高值。
[表27]
A-8 (1.8 mg/kg) | ||
天 | -7 | 5.54±0.90 |
-3 | 5.53±0.65 | |
0 | 5.05±0.86 | |
3 | 10.4±0.77 | |
7 | 10.9±0.64 | |
10 | 10.7±0.84 | |
14 | 10.1±0.82 | |
17 | 9.02±0.79 | |
21 | 9.18±0.87 | |
24 | 9.14±0.74 | |
28 | 8.28±0.64 | |
35 | 8.61±0.82 | |
42 | 7.9±1.11 | |
49 | 7.46±1.17 | |
56 | 7.37±0.74 |
另一方面,對食蟹猴以3 mg/kg單次皮下投予Burosumab(KRN23,Crysvita)後,血清中之無機磷濃度自投予後第3日開始升高,於投予後第42日無機磷濃度降低至與介質投予組及基準線(投予0日)同等程度(Crysvita皮下注射 醫藥品概要說明書2021年12月修訂(第5版)P44)。
因此,A-8抗體與Burosumab相比,顯示出於食蟹猴中之血清中無機磷濃度持續時間更長。
又,以3 mg/kg對食蟹猴皮下投予A-1抗體、A-5抗體,按照與上述同樣之方法測定血清中之無機磷濃度。其結果,該等抗體與Burosumab同樣,血清中之無機磷濃度自投予後第3日開始升高,於投予後第42日無機磷濃度降低至基準線。
Burosumab之重鏈恆定區之胺基酸序列以序列編號53表示,A-1抗體、A-5抗體、A-8抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列以序列編號48表示。具有同一重鏈恆定區胺基酸序列之A-1抗體、A-5抗體及A-8抗體中,僅A-8抗體於食蟹猴中之血清中無機磷濃度持續時間比Burosumab長。
因此,提示了A-8抗體與Burosumab或A-1抗體、A-5抗體相比於食蟹猴中之血清中無機磷濃度持續時間更長並非由於重鏈恆定區之胺基酸序列之差異,而是由於可變區之胺基酸序列之差異。
[實施例22]
按照與實施例21同樣之方法測定血清中之無機磷濃度(mg/dL)。作為受驗抗體,皮下投予A-9抗體、A-10抗體(3.0 mg/kg)。於投予後57日之期間內經時性地採血,測定各時間點之血清中之無機磷濃度。
將所得之結果示於表28。
[表28]
A-9 | A-10 | ||
天 | 0 | 6.37±0.21 | 5.83±0.67 |
1 | 6.27±0.31 | 5-60±0-35 | |
4 | 11.4±0.95 | 10.5±0.15 | |
8 | 11.1±1.80 | 10.5±0.97 | |
11 | 10.9±0.75 | 10.4±1.04 | |
15 | 9.80±1.05 | 9.20±1.73 | |
18 | 8.77±1.42 | 7.07±1.25 | |
22 | 9.90±0.98 | 8.40±1.71 | |
25 | 9.40±0.66 | 7.67±1.00 | |
29 | 9.53±0.81 | 7.60±0.92 | |
32 | 8.90±0.92 | 7.93±0.49 | |
36 | 8.03±0.49 | 6.47±1.07 | |
39 | 8.67±0.68 | 7.20±0.60 | |
43 | 8.37±1.45 | 7.17±0.87 | |
46 | 7.47±1.17 | 7.67±0.95 | |
50 | 8.97±0.55 | 7.23±1.12 | |
53 | 7.00±1.55 | 6-33±0-68 | |
57 | 7.67±0.74 | 6.10±1.04 |
如表28所示,與實施例22之A-8抗體同樣地,投予A-9抗體、A-10抗體後,血清中之無機磷濃度自投予後第3日開始升高,即便於投予後第57日,亦與基準線之無機磷濃度(表28中Day0之磷濃度)相比顯示出高值。
A-9抗體、A-10抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列與A-1抗體、A-5抗體及A-8抗體之重鏈恆定區胺基酸序列相同,為序列編號48所示之胺基酸序列。
因此,提示了A-9抗體、A-10抗體與Burosumab或A-1抗體、A-5抗體相比,於食蟹猴中之血清中無機磷濃度持續時間更長亦並非由於重鏈恆定區之胺基酸序列之差異,而是與A-8抗體同樣地係由於可變區之胺基酸序列之差異。
參考特定之實施方式詳細地對本發明進行了說明,但對於從業者而言顯而易見的是,可於不脫離本發明之精神及範圍之情形下進行各種變更或修正。再者,本申請基於2022年8月10日申請之日本專利申請(特願2022-128011)及2022年10月12日申請之日本專利申請(特願2022-164256),藉由引用對其全部內容進行援引。又,引用之所有參考作為整體併入本說明書中。
[序列表自由內容]
序列編號1:A抗體之VH之胺基酸序列
序列編號2:A抗體之VL之胺基酸序列
序列編號3:I100A抗體之VH之胺基酸序列
序列編號4:I100L抗體之VH之胺基酸序列
序列編號5:I100V抗體之VH之胺基酸序列
序列編號6:I100Y抗體之VH之胺基酸序列
序列編號7:I100W抗體之VH之胺基酸序列
序列編號8:I100T抗體之VH之胺基酸序列
序列編號9:I100S抗體之VH之胺基酸序列
序列編號10:I100R抗體之VH之胺基酸序列
序列編號11:I100Q抗體之VH之胺基酸序列
序列編號12:I100N抗體之VH之胺基酸序列
序列編號13:I100M抗體之VH之胺基酸序列
序列編號14:I100K抗體之VH之胺基酸序列
序列編號15:I100H抗體之VH之胺基酸序列
序列編號16:I100G抗體之VH之胺基酸序列
序列編號17:I100F抗體之VH之胺基酸序列
序列編號18:I100E抗體之VH之胺基酸序列
序列編號19:I100D抗體之VH之胺基酸序列
序列編號20:D105A抗體之VH之胺基酸序列
序列編號21:D105E抗體之VH之胺基酸序列
序列編號22:D105F抗體之VH之胺基酸序列
序列編號23:D105G抗體之VH之胺基酸序列
序列編號24:D105H抗體之VH之胺基酸序列
序列編號25:D105I抗體之VH之胺基酸序列
序列編號26:D105K抗體之VH之胺基酸序列
序列編號27:D105L抗體之VH之胺基酸序列
序列編號28:D105M抗體之VH之胺基酸序列
序列編號29:D105P抗體之VH之胺基酸序列
序列編號30:D105Q抗體之VH之胺基酸序列
序列編號31:D105R抗體之VH之胺基酸序列
序列編號32:D105V抗體之VH之胺基酸序列
序列編號33:D105W抗體之VH之胺基酸序列
序列編號34:D105Y抗體之VH之胺基酸序列
序列編號35:D105T抗體之VH之胺基酸序列
序列編號36:D105N抗體之VH之胺基酸序列
序列編號37:D105S抗體之VH之胺基酸序列
序列編號38:H2B11_A之胺基酸序列
序列編號39:J2H2B9_A之胺基酸序列
序列編號40:J2H2E9_A之胺基酸序列
序列編號41:2H2E1_A之胺基酸序列
序列編號42:2H2E5_A之胺基酸序列
序列編號43:2H2E8_Y之胺基酸序列
序列編號44:L3G12之胺基酸序列
序列編號45:L1H8之胺基酸序列
序列編號46:2L3H7之胺基酸序列
序列編號47:J2H2B9_Y之胺基酸序列
序列編號48:YTE之CH之胺基酸序列
序列編號49:G2_YTE之CH之胺基酸序列
序列編號50:G2_LS之CH之胺基酸序列
序列編號51:G4PE_R409K_P之CH之胺基酸序列
序列編號52:G4PE_R409K_LS之CH之胺基酸序列
序列編號53:G1恆定區之胺基酸序列
序列編號54:人FcRn細胞外結構域His-tag體之胺基酸序列
序列編號55:人β2微球蛋白之胺基酸序列
序列編號56:食蟹猴FcRn細胞外結構域His-tag體之胺基酸序列
序列編號57:食蟹猴β2微球蛋白之胺基酸序列
序列編號58:A-9抗體之VL之胺基酸序列
序列編號59:A-10抗體之VL之胺基酸序列
TW202413406A_112129893_SEQL.xml
Claims (17)
- 一種抗體或該抗體片段,上述抗體係於含有包含序列編號1所示之胺基酸序列之重鏈可變區(以下記載為VH)及包含序列編號2所示之胺基酸序列之輕鏈可變區(以下記載為VL)之抗體中,至少VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基或第105位胺基酸殘基置換為其他胺基酸殘基而成,且與FGF23結合。
- 如請求項1之抗體或該抗體片段,其中VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為選自丙胺酸殘基、天冬醯胺殘基、甘胺酸殘基、酪胺酸殘基、精胺酸殘基、天冬胺酸殘基、組胺酸殘基、色胺酸殘基、及甲硫胺酸殘基中之1種胺基酸殘基。
- 如請求項1或2之抗體或該抗體片段,其中VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第100位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基或酪胺酸殘基。
- 如請求項1至3中任一項之抗體或該抗體片段,其中VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第105位胺基酸殘基置換為選自丙胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基、酪胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天冬醯胺殘基、及絲胺酸殘基中之1種胺基酸殘基。
- 如請求項1至4中任一項之抗體或該抗體片段,其中上述抗體進而包含選自下述(a1)~(a4)中之1種置換: (a1)選自VH中之序列編號1所示之胺基酸序列之第50位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基、第54位胺基酸殘基置換為色胺酸殘基、第55位胺基酸殘基置換為組胺酸殘基、第57位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第58位胺基酸殘基置換為苯丙胺酸殘基中之至少1種置換; (a2)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第91位胺基酸殘基置換為甲硫胺酸殘基或白胺酸殘基、第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基、第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、及第96位胺基酸殘基置換為天冬醯胺殘基或天冬胺酸殘基中之至少1種置換; (a3)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第28位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、第29位胺基酸殘基置換為纈胺酸殘基、第31位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第34位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基中之至少1種置換;以及 (a4)選自VL中之序列編號2所示之胺基酸序列之第92位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基或色胺酸殘基、第94位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基、及第96位胺基酸殘基置換為天冬胺酸殘基中之至少1種置換。
- 如請求項1至5中任一項之抗體或該抗體片段,其中上述抗體係選自下述(c1)~(c10)中之1種: (c1)含有包含序列編號39所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c2)含有包含序列編號47所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號2所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c3)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號44所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c4)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號44所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c5)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號45所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c6)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號45所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c7)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號46所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c8)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號46所示之胺基酸序列之VL的抗體; (c9)含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號58所示之胺基酸序列之VL的抗體;以及 (c10)含有包含序列編號6所示之胺基酸序列之VH及包含序列編號59所示之胺基酸序列之VL的抗體。
- 如請求項1至6中任一項之抗體或該抗體片段,其中上述抗體之亞型為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
- 如請求項1至7中任一項之抗體或該抗體片段,其中上述抗體之Fc區係選自下述(d1)~(d5)中之1種: (d1)包含EU索引第252位胺基酸殘基置換為酪胺酸殘基、第254位胺基酸殘基置換為蘇胺酸殘基、及第256位胺基酸殘基置換為麩胺酸殘基之Fc區; (d2)包含EU索引第428位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基、及第434位胺基酸殘基置換為絲胺酸殘基之Fc區; (d3)包含EU索引第308位胺基酸殘基置換為脯胺酸殘基之Fc區; (d4)包含EU索引第250位胺基酸殘基置換為麩醯胺酸殘基、及第428位胺基酸殘基置換為白胺酸殘基之Fc區;以及 (d5)包含EU索引第434位胺基酸殘基置換為丙胺酸殘基之Fc區。
- 如請求項1至8中任一項之抗體或該抗體片段,其中上述抗體之重鏈恆定區包含序列編號48、49、50、51、或52所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至9中任一項之抗體片段,其係選自Fab、Fab'、(Fab') 2、scFv、雙功能抗體、dsFv及包含CDR之肽中之1種。
- 一種核酸,其具有編碼如請求項1至10中任一項之抗體或該抗體片段之鹼基序列。
- 一種載體,其含有如請求項11之核酸。
- 一種轉化細胞,其包含如請求項12之載體。
- 一種如請求項1至10中任一項之抗體或該抗體片段之製造方法,其包括於培養基中培養如請求項13之轉化細胞,自培養物中採取抗體或該抗體片段。
- 一種組合物,其包含如請求項1至10中任一項之抗體或該抗體片段。
- 一種人類FGF23相關疾病之治療藥,其包含如請求項1至10中任一項之抗體或該抗體片段。
- 一種人類FGF23相關疾病之治療方法,其包含如請求項1至10中任一項之抗體或該抗體片段。
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