TW202413443A

TW202413443A - 靶向ＦＡＰ和ＴＧＦβ的抗體融合蛋白及其用途

Info

Publication number: TW202413443A
Application number: TW112129429A
Authority: TW
Inventors: 虹凌; 黃瀟; 黨羽佳; 張鵬
Original assignee: 大陸商南京維立志博生物科技有限公司
Priority date: 2022-08-03
Filing date: 2023-08-04
Publication date: 2024-04-01

Abstract

本發明提供了一種抗體融合蛋白。該抗體融合蛋白可以特異性結合FAP蛋白並阻斷TGFβ信號通路。本發明進一步提供了編碼該抗體融合蛋白的核酸分子、用於表達該抗體融合蛋白的表達載體、宿主細胞及其製備方法。本發明還提供了該抗體融合蛋白的用途。

Description

靶向FAP和TGFβ的抗體融合蛋白及其用途

本發明提供了一種靶向FAP和TGFβ的雙功能的抗體融合蛋白。該抗體融合蛋白可以特異性結合FAP蛋白並阻斷TGFβ信號通路。本發明進一步提供了編碼該抗體融合蛋白的核酸分子、用於表達該抗體融合蛋白的表達載體、宿主細胞及其製備方法。本發明還提供了該抗體融合蛋白的用途。

纖維化疾病的病理特徵是器官中存在過量的纖維結締組織比如膠原的積聚，其病因一般由化學損傷、持續感染、代謝和自身免疫反應等因素引起的，它是一種慢性炎症伴隨的必經和影響病理進程的關鍵病理特徵，也代表著疾病向更嚴重的階段進展，極大的影響機體的重要器官，比如心、肺、肝和腎的功能。臨床上以纖維化為主要病理特徵和過程的疾病非常多，發生率非常高的有HBV引起的肝硬化，糖尿病誘發的腎纖維化，以及原因不明的特發性肺纖維化(IPF)以及皮膚疾病。纖維化對慢性損傷和持續性炎症的一個修復反應，早期可能是一個可逆的過程，隨著程度的不斷加深，會導致組織的結構性損傷和器官功能性障礙。纖維化反應跟TGFβ驅動的成纖維細胞的變化相關，包括：靜息狀態下成纖維細胞被激活，過度生長；轉變表型為肌成纖維細胞；提高基質蛋白的產生，引發膠原胞外沉積；抑制MMP的合成，誘導合成蛋白酶抑制劑TIMP-1的表達，抑制酶類對基質的降解，上調結締組織生長因子(CTGF)，更進一步促進成纖維細胞的增殖(ANNA BIERNACKA,et al.(2011).TGF-b signaling in fibrosis)。

對於纖維化起主要作用的是成纖維細胞的激活，涉及成纖維細胞激活的蛋白包括成纖維細胞激活蛋白(Fibroblast-activation protein，FAP)、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)等。由於其他分子在靜息成纖維細胞、周細胞以及血管平滑肌細胞中也有表達，而FAP僅在激活的成纖維細胞中高特異性表達，因此，FAP是纖維化的較好分子標誌物。FAP同時也是潛在驅動纖維化過程的重要分子。FAP是一個細胞表面糖蛋白，表達在激活的成纖維細胞上。健康的成人中幾乎檢測不到，但涉及一些組織修復活躍的部位，例如傷口癒合、纖維化疾病等條件下有所表達(Pinak S.,et al.(2006)."Fibroblast activation protein：a serine protease expressed at the remodeling interface in idiopathic pulmonary fibrosis" Human Pathology(2006)37,352-360)。

TGF-β分子調控多種生物學過程，涉及多種疾病，包括心血管，纖維化，生殖，腫瘤等。TGF-β的信號通路主要藉由Smad2/3的磷酸化而傳遞的。細胞產生的TGF-β都是以非活性形式存在的，它的活化需要一個複雜的過程：起初TGF-β以同源二聚體的形式，共價結合到LTBP(Latent Transforming Growth Factor Beta Binding Protein)上。TGF-β的激活需要基質中蛋白酶水解，後續活化過程涉及整合素介導的構象變化，最終釋放出有活性的TGF-β。然後TGF-β與TGFβ-RII結合，能夠進一步招募TGFβ-RI，三者結合後TGFβ-RI的催化活性被激活。後者能夠引發Smad2和Smad3的絲胺酸殘基的磷酸化。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成三聚體複合物，藉由進入到細胞核中，調控目標基因的轉錄。調控的目標基因包括膠原(collages)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、纖溶酶原激活物抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP)、α-SMA等(Xiao-ming Meng,et al.(2016).TGF-β：the master regulator of fibrosis)。

纖維化的發生和發展的病理特徵、機制和對各器官功能的影響比較類似，包括在纖維化過程中參與病理過程的細胞也比較一致，比如激活成纖維細胞，TGF-β信號通路所起的關鍵作用。目前在全球範圍對於靶向FAP和TGFβ的雙功能抗體融合蛋白暫無研究。

本發明首次研究並發現了靶向FAP和TGFβ的雙功能抗體融合蛋白，利用FAP的靶向作用向纖維化組織遞送TGFβR2融合蛋白，藉由對TGFβ信號通路的拮抗作用來達到有利的影響。同時，本發明還可以利用抗FAP抗體具有的Fc效應對產生細胞外基質纖維化成分的激活的成纖維細胞進行殺傷和清除，從而與TGF-β拮抗作用配合，多機制的改善組織細胞損傷，減低並抑制膠原等纖維化成分的產生。

本發明涉及一種靶向FAP和TGFβ的雙功能抗體融合蛋白。

在一些方面，本發明涉及以下實施方案：

1、融合蛋白分子，其特異性結合人FAP以及人TGFβ，例如人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。

2、實施方案1所述的融合蛋白分子，其包含第一靶標結合區和第二靶標結合區，其中第一靶標結合區特異性結合FAP，且第二靶標結合區特異性結合TGFβ。

3、實施方案2所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區與第二靶標結合區藉由接頭連接，或不藉由接頭直接連接，例如該接頭是(G₄S)_n，其中該n=1、2、3、4、5或6，例如n=4。

4、實施方案2或3的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區來自抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體或28H1抗體或其人源化抗體。

5、實施方案2至4中任一項所述的融合蛋白分子，其中該第一靶標結合區包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中

(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：7所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：1所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：13所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：15所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：21所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：15所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(iv)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：30所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和 LCDR3為如SEQ ID NO：27所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(v)相對於(i)至(iv)中任一項的序列，在該三個HCDR區或該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，例如該胺基酸改變是增強抗體穩定性的突變，例如對脫醯胺位點進行突變，例如存在於HCDR2，其包含G56R置換；

較佳地，CDR藉由Kabat編號方案確定。

6、實施方案2至4中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含

(i)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：11所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或

(ii)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：22所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；

(iii)WO2012020006中揭露的28H1抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(iv)相對於(i)或(ii)或(iii)中任一項的序列，在該三個HCDR區或該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，例如該胺基酸改變是增強抗體穩定性的突變，例如對脫醯胺位點進行突變，例如存在於HCDR2，其包含G56R置換。

7、實施方案2至6中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區

(i)包含與SEQ ID NO：7、13、21或30的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：7、13、21或30的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

8、實施方案2至7中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含其包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區

(i)包含與SEQ ID NO：1或15或27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：1或15或27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

9、實施方案2至8中任一項所述的融合蛋白分子，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中

(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

10、實施方案2至9中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：

(i).SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：1；

(ii).SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；

(iii).SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：15；或

(iv).SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：27。

11、實施方案2至10中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區還包含Fc或重鏈恆定區CH，例如，

該Fc區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，較佳的IgG1的Fc區，視需要地，該Fc區的末尾胺基酸K被缺失或被突變為A；或者

該抗體重鏈恆定區CH為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區，視需要地，該重鏈恆定區的末尾胺基酸K被缺失或被突變為A。

12、實施方案11所述的融合蛋白分子，其中重鏈恆定區CH

(i)包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

該Fc區

(i)包含與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

13、實施方案2至12中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區還包含輕鏈恆定區，例如該輕鏈恆定區為lambda或kappa輕鏈恆定區。

14、實施方案13所述的融合蛋白分子，其中該輕鏈恆定區

(i)包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

15、實施方案2至14中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：9、14、23、35、41或42的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

16、實施方案2至15中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含輕鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：3、16或28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

17、實施方案15或16所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈和輕鏈，其中

(i)該重鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(ii)該重鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(iii)該重鏈包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(iv)該重鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；或

(v)該重鏈包含SEQ ID NO：41或42的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

18、實施方案17所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或由該如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列組成：

(i).SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：3；

(ii).SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16；

(iii).SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：16；

(iv).SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：16；

(v).SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：28；或

(vi).SEQ ID NO：42和SEQ IDNO：28。

19、實施方案2至18中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區為人源化抗體或嵌合抗體。

20、實施方案2至19中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區為單株抗體。

21、實施方案2至20中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區為抗原結合片段，其選自：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。

22、實施方案2至21中任一項所述的融合蛋白分子，其中第二靶標結合區包含特異性結合TGFβ的TGFβ受體或其功能性片段。

23、實施方案22所述的融合蛋白分子，其中該TGFβ受體是TGFβRII分子，例如該TGFβRII分子

(i)包含與選自SEQ ID NO：34的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含選自SEQ ID NO：34的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與選自SEQ ID NO：34的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

24、實施方案22或23所述的融合蛋白分子，其中該功能性片段包含ECD或者是ECD。

25、實施方案24所述的融合蛋白分子，其中該ECD是野生型TGFβ受體的ECD，例如野生型TGFβRII分子的ECD，或者是相對於野生型ECD包含修飾的變體ECD，例如，該修飾包含N末端或C末端的截短或取代。

26、實施方案25所述的融合蛋白分子，其中

該取代選自將ECD的第20位的G取代為T，即G20T；或將ECD的第19位的N取代為E；或二者的組合；或者

該截短第N末端截短，例如在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如選自將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。

27、實施方案24至26中任一項所述的融合蛋白分子，其中該ECD是TGFβRII分子的ECD，例如該TGFβRII分子的ECD

(i)包含與SEQ IDNO：24、37或39的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含SEQ ID NO：24、37或39的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)包含與SEQ ID NO：24、37或39的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；較佳地，該胺基酸改變選自在第20位包含T(即包含G20T)，和/或在第19位包含E(即包含N19E)；

(iv)包含與(i)至(iii)中任一項相比具有截短的N末端和/或C末端的胺基酸序列，其中較佳地，該截短是指在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。

28、實施方案1至27中任一項所述的融合蛋白分子，其包含

(i)鏈A：抗FAP抗體輕鏈；

(ii)鏈B：在N末端或C末端藉由不藉由接頭連接TGFβ受體或其功能性片段的抗FAP抗體重鏈。

29、實施方案28所述的融合蛋白分子，其中該融合蛋白分子由2條鏈A和2條鏈B組成。

30、實施方案28或29所述的融合蛋白分子，其中鏈A包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

31、實施方案28至30中任一項所述的融合蛋白分子，其中鏈B包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

32、實施方案28或29所述的融合蛋白分子，其中

鏈A包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且

鏈B包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

鏈A包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且

鏈B包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

33、實施方案32所述的融合蛋白分子，其中

鏈A包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或由其組成，且鏈B包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或由其組成；或

鏈A包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或由其組成，且鏈B包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或由其組成。

34、抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含

SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：22所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

35、抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中

(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

36、實施方案34或35所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：

(v).SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；或

(vi).SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：15。

37、實施方案34至36中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含Fc或重鏈恆定區CH，例如，

38、實施方案37所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中重鏈恆定區CH

該Fc區

(ii)包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

39、實施方案34至38中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含輕鏈恆定區，例如該輕鏈恆定區為lamlbda或kappa輕鏈恆定區。

40、實施方案39所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈恆定區

(ii)包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

41、實施方案34至40中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：14、23或35的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

42、實施方案34至41中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

43、實施方案41或42所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中

(i)該重鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(ii)該重鏈包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；或

(iii)該重鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

44、實施方案43所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或由該如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列組成：

(vii).SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16；

(viii).SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：16；或

(ix).SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：16；

45、實施方案34至44中任一項所述的融合蛋白分子，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或嵌合抗體。

46、實施方案34至45中任一項所述的融合蛋白分子，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段為單株抗體。

47、實施方案34至46中任一項所述的融合蛋白分子，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段，其選自：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。

48、核酸分子，其包含編碼實施方案1至33中任一項所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體的任一條鏈的核酸序列，或由該核酸序列組成。

49、表達載體，其包含實施方案48所述的核酸分子，較佳地，該表達載體為pCDNA，例如pCDNA3.1。

50、宿主細胞，其包含實施方案48所述的核酸分子或實施方案49所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，例如293細胞或CHO細胞，例如293F細胞或293T細胞或CHO-S容細胞。

51、製備實施方案1至33中任一項的所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體的方法，該方法包括，在適合該融合蛋白的鏈表達的條件下，培養包含實施方案48所述的核酸分子或實施方案49所述的表達載體的宿主細胞，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該融合蛋白分子或抗體。

52、醫藥組成物或藥物或製劑，其包含實施方案1至33中任一項所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體以及視需要地藥用輔料。

53、藥物組合產品，其包含實施方案1至33中任一項所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體，以及一種或多種其它治療劑(例如抗纖維化劑其它抗體或小分子藥物)。

54、在受試者中預防或治療纖維化(例如在肺、腎、肝或皮膚的纖維化)的方法，包括向受試者施用有效量的實施方案1至33中任一項的所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體，或實施方案52所述的醫藥組成物或製劑；或實施方案53的藥物組合產品。

55、在受試者中降低纖維化病變(例如肺部、腎或肝中的纖維化病變，例如特發性肺纖維化，肝硬化，硬皮病或糖尿病腎病)的方法，包括向受試者施用有效量的實施方案1至33中任一項所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體，或實施方案52所述的醫藥組成物或製劑；或實施方案53所述的藥物組合產品。

56、在受試者中抑制成纖維細胞增殖，例如激活的成纖維細胞，例如特異性表達FAP的(激活的)成纖維細胞的方法，包括向受試者施用有效量的實施方案1至33中任一項所述的融合蛋白分子或實施方案34至47中任一項所述的抗體，或實施方案52所述的醫藥組成物或製劑；或實施方案53所述的藥物組合產品。

57、實施方案54至56中任一項所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官中存在FAP表達或具有升高的FAP表達(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官)。

58、實施方案57所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官中的成纖維細胞中存在FAP表達或具有升高的FAP表達(例例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官的成纖維細胞)。

59、實施方案54至56中任一項所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官中存在FAP核酸或具有升高的FAP核酸(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官)。

60、實施方案59所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官的成纖維細胞中存在FAP核酸或具有升高的FAP核酸(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官的成纖維細胞)。

圖1為FAP抗體與人FAP重組蛋白的相對結合活性檢測結果(ELISA)圖；

圖2為FAP抗體與293T-食蟹猴FAP細胞結合(2A)及與293T-人FAP細胞結合(2B)的檢測結果(FACS)圖；

圖3為FAP抗體及DPP4抗體與DPP4細胞結合檢測結果圖；

圖4為優化後的FAP抗體與293T-食蟹猴FAP細胞結合(A)及與293T-人FAP細胞結合(B)的檢測結果(FACS)圖；

圖5為huF19-LG-NGR-Trap與293T-人FAP細胞結合的檢測結果(FACS)圖；

圖6為抗FAP-Trap的報告基因活性圖；

圖7為IPF模型病理切片染色圖；

圖8為IPF模型纖維化染色評分(A)及纖維化分級評分(B)圖；

圖9為UUO模型病理切片染色圖；

圖10為UUO模型纖維化評分及百分比圖；

圖11為靶向FAP和TGFβ融合蛋白結構示意圖。

[發明詳述]

應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附申請專利範圍限制。

I.定義

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項或全部。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

在本文中當提及“第一”“第二”時，僅為了區分兩個結構域或兩條鏈，而不以任何方式表明兩個結構域的位置。

如本文中使用的，術語“成纖維細胞激活蛋白(FAP)”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物諸如靈長類(例如人，參見NM_004460.2，或食蟹猴，參見XM_005573320.2)和齧齒類(例如小鼠)的任何天然FAP，除非另外指明。該術語涵蓋“全長”、未加工的FAP以及FAP因細胞中的加工所致的任何形式。示例性全長人FAP蛋白的胺基酸序列可在登錄號NM_004460.2下找到，而可在登錄號XM_005573320.2下找到示例性全長食蟹猴FAP蛋白序列。該術語還涵蓋FAP的天然存在變體，例如剪接變體或等位變體。例示性人、食蟹猴的胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32中。

本文所用的術語“抗FAP抗體”、“抗FAP”、“FAP抗體”或“結合FAP的抗體”是指這樣的抗體，該抗體能夠以足夠的親和力結合FAP蛋白或其片段。在一個實施方案中，抗FAP抗體與非FAP蛋白結合的程度低於該抗體與FAP結合的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或以上，如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物光干涉測定法或MSD測定法測量的。在一些實施方案中，該結合例如藉由放射性免疫測定(RIA)、生物膜薄層干涉測定法(BLI)、生物光干涉法、MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)或流式細胞術測量的。

“TGFβR”或“TGFβ受體”表示，具有野生型人TGFβ受體的胺基酸序列的多肽，或與該野生型胺基酸序列具有基本相同的序列的多肽。

“TGFβRII”或“TGFβ受體II”表示，具有野生型人TGFβ受體2型同種型A序列(例如，NCBI參照序列(RefSeq)登錄號NP_001020018的胺基酸序列或Uniprot ID：P37173的胺基酸序列)的多肽，或具有野生型人TGFβ受體2型同種型B序列(例如，NCBI RefSeq登錄號NP_003233的胺基酸序列)的多肽，或與該野生型胺基酸序列具有基本相同的序列的多肽。TGFβRII可保留野生型序列的TGFβ-結合活性的至少75%、80%、85%、90%、95%，或99%，或等於或高於野生型序列的結合活性。在一個實施方案中，本發明的TGFβRII包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。

“胞外結構域”或“ECD”是指TGF βR的細胞外結構域，其可以結合TGF-β並且阻斷其活性。在一些實施方案中，ECD是根據Uniprot的Topological domain確定的。在一些實施方案中，本文所述的ECD還涵蓋保留原胞外結構域功能但是進行某些修飾的變體ECD。在一些是實施方案中，該修飾是取代或截短。在一些實施方案中，該取代是例如將第20位的G取代為T，即G20T；或例如將第19位的N取代為E。在一些實施方案中，該截短是N末端截短，或C末端截短，從而獲得截短的N末端或截短的C末端。在一些實施方案中，該截短是N末端截短，例如在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。在一些實施方案中，TGFβRII的ECD通常包含SEQ ID NO：24、37或39所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：24、37或39所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

術語蛋白的“功能性片段”包括蛋白質的一部分，其是比完整或完全蛋白的胺基酸殘基數要少的完整或完全蛋白的一部分或一段，但是仍然保留所需的蛋白質功能。

術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指天然存在的包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。在一些實施方案中，本發明的抗體重鏈恆定區HC為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區。術語“抗體片段”包括完整抗體的一部分。在較佳的實施方案中，抗體片段為抗原結合片段。

術語“抗原結合片段”是比完整或完全抗體的胺基酸殘基數要少的完整或完全抗體的一部分或一段，其能結合抗原或與完整抗體(即與抗原結合片段所來源的完整抗體)競爭結合抗原。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、單鏈Fv、雙體抗體(diabody)、單結構域抗體(sdAb)。該Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，例如，藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。此外，藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體產生F(ab')2，其為Fab'的二聚體，是二價的抗體片段。F(ab')2可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原，由此將F(ab')2二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段(其它抗體片段的更詳細的描述請參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993))。該Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們藉由能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產生的合成性連接肽連接，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單鏈Fv(scFv)。可以藉由化學方法、重組DNA方法或蛋白酶消化法獲得該抗體片段。

“Fab片段”或“Fab”在本文中可互換使用，用於指，由兩條多肽鏈組成的、包含免疫球蛋白重鏈可變結構域VH、重鏈恆定結構域CH1、輕鏈可變結構域VL和輕鏈恆定結構域CL的免疫球蛋白片段，其中，一條多肽鏈從N端到C端包含VH和選自CH1和CL的一個恆定區，另一條多肽鏈從N端到C端包含VL和選自CL和CH1的另一恆定區，其中該VH結構域和VL結構域配對形成抗原結合位點。在本文中，包含重鏈恆定區CH1的Fab鏈也稱作“Fab重鏈”；相應地，包含輕鏈恆定區CL的Fab鏈也稱作“Fab輕鏈”。

術語“靶標”是指結合分子(例如融合蛋白)所針對的被結合物。靶標可以是抗原，也可以是配體或受體。

術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。所屬技術領域具有通常知識者將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。如本文所用，術語“表位”指抗原中與抗體分子特異性相互作用的部分。

如本文所用的術語“靶標結合區”是指多特異性結合分子，例如融合蛋白的結合特定靶標或抗原的部分。靶標結合區可以是例如抗體或免疫球蛋白本身或抗體片段。這種靶標結合區可以具有或可以不具有獨立於雙特異性抗體分子的剩餘部分的三級結構，並且可以作為單獨實體結合或不結合其靶標。靶標結合區還可以是受體或配體，或受體的能夠結合配體的結構域。在靶標結合區是抗體時，也將“靶標結合區”稱為“抗原結合區”。

當提及“靶標結合區來源於抗體”時，是指構成該靶標結合區的結合結構域為或衍生自該抗體的特異性結合抗原的結合結構域，例如，靶標結合區的重鏈可變區和/或輕鏈可變區為或衍生自該抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區，或者該靶標結合區的1個、2個、3個、4個、5個或6個CDR為該抗體的CDR。

術語“衍生自”是指在靶標結合區中的片段與其所來源的抗體的片段基本相同，但是在一個或多個位點處具有突變，例如取代、缺失或添加。在一個具體的實施方案中，該突變不在抗體的CDR中。

術語“免疫球蛋白”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈可變區(VH)，也稱作重鏈可變結構域，隨後是三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL)，也稱作輕鏈可變結構域，隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一，稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些類別可以進一步劃分成亞類，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一，稱作κ和λ。IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和兩個二聚化的Fc區(Fc二聚體)組成。

術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變區通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區。

“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派方案的任一種或其組合確定，該指派方案包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

以下為採用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定義的CDR的區域範圍。

除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的Kabat編號系統的編號位置。

在一本實施方案中，本發明抗體中的HCDR和LCDR按照Kabat方案確定。

應該注意，基於不同的指派方案獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派方案下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派方案規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

術語“Fc結構域”或“Fc區”或“Fc片段”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恆定區的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然的免疫球蛋白“Fc結構域”包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。例如，在天然抗體中，免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外說明，否則Fc區或重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號根據如Edelman,G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)(https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5257969/)中所述的EU編號體系(也稱作EU索引)進行編號，還參見http：//www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html。在本文中，術語“Fc結構域”或“Fc區”或“Fc片段”不包括免疫球蛋白的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL以及重鏈恆定區CH1和輕鏈恆定區CL，但在一些情況下可以包括在重鏈恆定區N端的鉸鏈區，例如EPKSS或EPKSC。在一些實施方案中，適用於本發明的重鏈恆定區Fc來自抗體重鏈恆定區，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區，較佳來自IgG1的恆定區。

免疫球蛋白的“效應子功能”的例子包括：C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。

術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恆定區或其部分改變、替換或交換，從而抗原結合位點與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以藉由將其恆定區更換為來自人免疫球蛋白的恆定區進行修飾。由於更換為人類恆定區，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的免疫原性。

“人源化抗體”是一種保留非人類抗體(例如小鼠單株抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥對人施用時免疫原性較低的抗體。這可以例如藉由保留非人類抗原結合位點並將抗體的剩餘部分替換成它們的人類相應部分(即，將恆定區以及可變區中不參與結合的部分替換為人類抗體的相應部分)來實現。

如本文所用，術語“抗”、“結合”或“特異性結合”意指結合作用對靶標或抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。結合位點與特定靶標或抗原結合的能力可以藉由流式細胞術或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物膜薄層干涉測定法或MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)測定。

“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(K_D)表示，解離常數是解離速率常數和締合速率常數(分別是K_dis和K_on)的比例。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。

胺基酸序列的“同一性百分數(%)”是指將候選序列與本說明書中所示的具體胺基酸序列進行比對並且如有必要的話為達到最大序列同一性百分數而引入空位後，並且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分時，候選序列中與本說明書中所示的具體胺基酸序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分數。在一些實施方案中，本發明考慮本發明抗體分子的變體，該變體相對於在本文中具體揭露的抗體分子及其序列而言具有相當程度的同一性，例如同一性為至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%或更高。該變體可以包含保守性改變，或為保守性修飾變體。

對於多肽序列，“保守性改變”包括對多肽序列的置換、缺失或添加，但不實質性改變多肽序列的期望功能活性。例如，保守性置換常常導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。以下列出了8組含有互為保守替換的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)。在一些實施方案中，術語“保守序列改變”用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的本發明抗體分子或結合蛋白分子的目的抗原結合特徵的胺基酸修飾。例如保守修改變體相對於親本抗體或結合蛋白保持對目的抗原至少 80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高，例如100-110%或更高的結合親和力。

“單鏈可變片段”或“scFv”在本文中用於指，包含由接頭連接的重鏈可變結構域VH和輕鏈可變結構域VL的單鏈抗體片段，其中VH和VL配對形成抗原結合位點。

在本文中，抗體恆定區或抗體恆定結構域，包括CH1，CL和Fc結構域以及構成Fc結構域的CH2、CH3和可選的CH4結構域，可以根據抗體分子的預期功能進行選擇。例如，恆定區可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM區，尤其是人IgG的免疫球蛋白恆定結構域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定結構域，較佳人IgG1的恆定結構域。作為一個例子，抗體的Fab片段可以包含來自IgG1的CH和CL恆定區。作為再一例子，抗體的Fc區可以包含來自IgG1的CH2和CH3結構域。免疫球蛋白恆定區可以具有天然序列或變體序列。

如本文所用的術語“接頭”是指使得能夠直接連接雙特異性結合分子的不同部分的任何分子。在不同分子部分之間建立共價連接的接頭的實例包括肽接頭和非蛋白質聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。在一些實施方案中，接頭是肽接頭(又稱為“連接肽”)，其是指是指由胺基酸組成的短胺基酸序列，例如單獨或組合使用的甘胺酸(G)和/或絲胺酸(S)和/或蘇胺酸殘基(T)，或來自免疫球蛋白的鉸鏈區，用於將結合分子的第一部分的胺基酸序列連接至結合分子的第二部分。例如，肽接頭可以將結合分子的第一靶標結合區連接至第二靶標結合區。例如，肽接頭也可以將抗體的一部分連接至抗體的另一部分，諸如將輕鏈可變區連接至重鏈可變區。較佳地，該肽接頭具有這樣的長度，其足以連接兩個實體，其方式使得它們維持它們相對於彼此的構象，使得不妨礙期望的活性。有用的接頭還包括甘胺酸-丙胺酸聚合物、甘胺酸-絲胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和其他柔性接頭。在一個實施方案中，接頭是例如甘胺酸-絲胺酸聚合物，例如(G₄S)_n(SEQ ID NO：43)，其中n=1-10的整數，例如1、2、3、4、5或6。

在再一實施方案中，連接肽為來自免疫球蛋白的鉸鏈區或鉸鏈區部分，包括天然的鉸鏈區或其部分，或者突變的鉸鏈區或其部分。在一個實施方案中，連接肽例如是免疫球蛋白(例如IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的鉸鏈區或其部分(例如EPKSC(SEQ ID NO：44))或是突變的鉸鏈區或其部分，例如EPKSS(SEQ ID NO：45)。或者，可以使用計算機程序模擬蛋白和肽的三維結構，或藉由噬菌體展示方法，來合理地設計合適的柔性連接肽。

術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞，包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，這包括原代轉化的細胞和從其衍生的子代。宿主細胞是可以用來產生本發明抗體分子的任何類型的細胞系統，包括真核細胞，例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞；和原核細胞，例如，大腸桿菌細胞。宿主細胞包括培養的細胞，也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。

術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。術語“表達載體”是指包含重組多核苷酸的載體，其包含有效連接要表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包含足夠的用於表達的順式作用元件；用於表達的其它元件可以由宿主細胞提供或在體外表達系統中。表達載體包括本領域已知的所有那些，包括被摻入重組多核苷酸的黏粒、質粒(例如，裸的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。

術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，個體是人。

術語“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉疾病的症狀、併發症、或生化指徵的發作、緩解症狀或阻止或抑制疾病、病狀或病症的進一步發展。

術語“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。

本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療纖維化，例如纖維化病變中有效的任何物質，包括但不限於抗纖維化劑、其它抗體或小分子藥物。

術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。“小分子”被定義為分子量小於10kD、通常小於2kD和較佳小於1kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不易感和更不易於引發免疫應答。

術語“有效量”指本發明的抗體或片段或組成物或組合的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。

“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。治療有效量也是這樣的一個量，其中融合蛋白或組成物或組合的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數或改善可度量參數至少約40%、甚至更佳地至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。

“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。

術語“纖維化”，也稱為纖維化瘢痕形成，其中結締組織取代正常的實質組織，達到不受控制的程度，細胞外基質過度無序沉積。纖維化一般由化學損傷、持續感染、自身免疫反應等因素引起的，纖維化最初是一個可逆的過程，其中細胞外基質成分(例如由成纖維細胞產生的膠原蛋白)過度無序積累，隨著程度的不斷加深，會嚴重影響各組織或器官的正常生理功能。這種纖維化也被稱為器官或組識的“纖維化病變”或“纖維化疾病”。纖維化可產生自各種損傷或疾病，可作為各類疾病的併發症而發生，是許多疾病的病理特徵。

術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。

術語“醫藥組成物”指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。

術語“藥物組合或藥物組合產品或組合產品”是指非固定組合產品或固定組合產品，包括但不限於藥盒、醫藥組成物。術語“非固定組合”意指活性成分(例如，(i)本發明的融合蛋白、以及(ii)其他治療劑)以分開的實體被同時、無特定時間限制或以相同或不同的時間間隔、依次地施用於患者，其中這類施用在患者體內提供預防或治療有效水平的兩種或更多種活性劑。術語“固定組合”意指兩種或更多種活性劑以單個實體的形式被同時施用於患者。較佳對兩種或更多種活性劑的劑量和/或時間間隔進行選擇，從而使各部分的聯合使用能夠在治療疾病或病症時產生大於單獨使用任何一種成分所能達到的效果。各成分可以各自呈單獨的製劑形式，其製劑形式可以相同也可以不同。

術語“組合療法”是指施用兩種或更多種治療劑或治療方式(例如放射療法或手術)以治療本文該疾病。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。

“受試者/患者/個體樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如淚液、玻璃體液、腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。在一些實施方案中，組織樣品是纖維化組織。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。

II.融合蛋白

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段以高親和力結合FAP(例如人FAP)。在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段不結合或以較低的親和力結合DPP4，例如人DPP4。

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段以較高親和力結合TGFβ(例如人TGFβ，例如人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3)。

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段以高親和力結合FAP(例如人FAP)和以較高親和力結合TGFβ(例如人TGFβ，例如人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3)，視需要地，本發明的融合蛋白還以比結合FAP低的親和力結合TGFβ(例如人TGFβ，例如人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3)。

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段與人FAP的結合親和力與已知的抗FAP抗體相當或高於已知的抗FAP抗體。在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段與人TGFβ的結合親和力高於已知的融合蛋白分子。在一些實施方案中，藉由生物光干涉測定融合蛋白分子或其片段的親和力。

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段，以以下平衡解離常數(K_D)與人TGFβ1結合，該K_D小於或等於大約100nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、或0.1nM。

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子或其片段，以以下平衡解離常數(K_D)與人FAP結合，該K_D小於或等於大約1nM、0.5nM、0.1nM、50pM、10pM、5pM、2pM或1pM。

在一些實施方案中，本發明的分子或其片段能夠阻斷TGFβ(例如TGFβ1、2或3)信號傳導。

在一些實施方案中，本發明的分子或其片段能夠靶向FAP或靶向成纖維細胞，例如激活的成纖維細胞。

在一些實施方案中，本發明的分子或其片段更加穩定。

在一些實施方案中，本發明的分子或其片段能夠治療纖維化，例如抑制纖維化病變，例如表達FAP的激活的成纖維細胞。

在一些實施方案中，本發明的分子或其片段能夠用於治療纖維化。在一些實施方案中，本發明的分子或其片段，能夠有效抑制纖維化病變。

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白包含針對FAP的第一結合特異性和針對TGFβ的第二結合特異性。

因此，本發明的一個方面涉及一種融合蛋白，其包含第一靶標結合區和第二靶標結合區，其中第一靶標結合區特異性結合FAP，且第二靶標結合區特異性結合TGFβ。

在一些實施方案中，第一靶標結合區與第二靶標結合區藉由接頭連接，或不藉由接頭直接連接。

在一些實施方案中，第一靶標結合區來源於抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體，或該抗體的抗原結合片段。

適用於本發明的融合蛋白的第一靶標結合區可以包含本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段，或由其組成，只要其能夠特異性結合FAP即可，包括但不限於，例如特異性結合FAP的全長抗體、單鏈Fv、Fab、Fab'、(Fab)2、單域抗體、VHH或重鏈抗體等。

在一些實施方案中，抗原結合區來源於抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的1、2、3、4、5、或6個CDR。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的1、2和3個重鏈可變區CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的1、2和3個輕鏈可變區CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的3個重鏈可變區CDR和3個輕鏈可變區CDR。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的重鏈可變區。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的輕鏈可變區。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的重鏈。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的輕鏈。

在一些實施方案中，抗原結合區包含抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體(例如本文所述的抗FAP人源化抗體)或WO2012020006中揭露的抗FAP抗體，例如28H1抗體的重鏈和輕鏈。

適用於本發明的融合蛋白的第二靶標結合區可以包含任何特異性結合TGFβ的蛋白或其功能性片段，例如TGFβ受體，例如TGFβRII，或其功能結構域，例如TGFβ的胞外區。

III.抗FAP抗體

本發明一方面提供一種FAP抗體，其具有與FAP的結合親和力，例如相比已知FAP抗體更高的結合親和力。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段以更高的親和力結合FAP(例如人FAP或猴FAP例如食蟹猴FAP)。在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段能夠既結合人FAP，又結合猴FAP例如食蟹猴FAP。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段與細胞表達的FAP結合。在一些實施方案中，藉由流式細胞術測定抗FAP抗體與細胞表達的FAP的親和力。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段具有較好的穩定性，例如相比已知FAP抗體更好的穩定性。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。

在一些方面中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含抗體重鏈恆定區CH。在一些實施方案中，本發明抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含抗體輕鏈恆定區CL。在一些實施方案中，本發明抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區CH和輕鏈恆定區CL。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體的重鏈可變區

(i)包含與SEQ ID NO：7、13或21、30的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：7、13或21、30的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：7、13或21、30的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體的輕鏈可變區

(i)包含與SEQ ID NO：1、15、27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：1、15、27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：1、15、27的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體的3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3選自

(i)如SEQ ID NO：13或21中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，或

(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，

例如該CDR藉由Kabat方案確定。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3選自

(i)如SEQ ID NO：15所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或

(ii)相對於(i)中任一項的序列，在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，

例如該CDR藉由Kabat方案確定。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體包含3個由SEQ ID NO：7、13、21或30的胺基酸序列組成的重鏈可變區所含的互補決定區(HCDR)以及3個由SEQ ID NO：1、15或27的胺基酸序列組成的輕鏈可變區所含的互補決定區(LCDR)。

在一些實施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與SEQ ID NO：10的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO：11或22的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與SEQ ID NO：11或22的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與SEQ ID NO：12的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與SEQ ID NO：5的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與SEQ ID NO：6的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含如上所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和/或LCDR3。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含如上所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中

HCDR1包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，

HCDR2包含SEQ ID NO：11或22的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，

HCDR3包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，

LCDR1包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，

LCDR2包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，和

LCDR3包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：11或22所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中

該VH含有SEQ ID NO：7、13、21或30所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，和該VL含有SEQ IDNO：1或15或27所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；

SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：15；

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：1；

SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：27。

在本發明的一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈。在本發明的一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含輕鏈。在本發明的一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈。

在一些具體的實施方案中，抗FAP抗體的重鏈包含SEQ ID NO：9、14、23、35、41或42的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

在一些具體的實施方案中，抗FAP抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：3、16或28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

在一些具體的實施方案中，抗FAP抗體包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含如下SEQ ID NO：9、14、23、35、41或42所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，且該輕鏈包含SEQ ID NO：3、16或28所示的胺基酸序列，或與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。

在一些具體的實施方案中，抗FAP抗體包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含如下SEQ ID NO：9、14、23、35、41或42所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且其中輕鏈包含SEQ ID NO：3、16或28所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

在一些具體的實施方案中，抗FAP抗體包含重鏈和輕鏈，其中

在一些具體的實施方案中，抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或由該如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列組成：

(i).SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：3；

(ii).SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16；

(iii).SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：16；

(iv).SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：16；

(v).SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：28；或

(vi).SEQ ID NO：42和SEQ IDNO：28。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的抗FAP抗體的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。

在本發明的一個實施方案中，本發明所述的抗FAP抗體的胺基酸改變為增強抗體穩定性的突變，例如對脫醯胺位點進行突變，例如存在於抗FAP抗體的CDR中，例如抗FAP抗體的HCDR2，其包含G56R置換。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：

(i)顯示與本發明抗體對FAP相同或相似的結合親和力和/或特異性；

(ii)抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體與FAP的結合；

(iii)與本發明抗體結合相同或重疊的表位；

(iv)與本發明抗體競爭結合FAP；

(v)具有本發明抗體的一個或多個生物學特性。

在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG3形式的抗體或IgG4形式的抗體，例如，為IgG1形式的抗體。在一些實施方案中，本發明的抗FAP抗體的輕鏈恆定區為lambda或kappa輕鏈恆定區，例如Kapppa輕鏈恆定區。

在一些實施方案中，抗FAP抗體是單株抗體。

在一些實施方案中，抗FAP抗體是人源化的。

在一些實施方案中，抗FAP抗體是嵌合抗體。

在一個實施方案中，本發明的抗FAP抗體還涵蓋其抗體片段(例如抗原結合片段)，較佳地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。

IV. TGFβ受體或其功能性片段

本領域已知的任何TGFβ受體或其功能性片段都適用於本發明的融合蛋白分子，只要其能夠特異性結合TGFβ。在一些實施方案中，TGFβ受體是TGFβRII分子。

在一些實施方案中，本發明融合蛋白分子的第二靶標結合區包含TGFβ受體，或者是TGFβ受體。在一些實施方案中，本發明融合蛋白分子的第二靶標結合區包含TGFβRII分子，或者是TGFβRII分子。

在一些實施方案中，本發明的TGFβRII分子

在一些實施方案中，本發明融合蛋白分子的第二靶標結合區包含TGFβ受體的功能性片段，或者是TGFβ受體的功能性片段。在一些實施方案中，本發明融合蛋白分子的第二靶標結合區包含TGFβRII分子的功能性片段，或者是TGFβRII分子的功能性片段。在一些實施方案中，TGFβ受體的功能性片段包含或者是TGFβ受體的胞外功能結構域(胞外區，ECD)。

在一些實施方案中，ECD是野生型TGFβ受體的ECD，例如野生型TGFβRII分子的ECD。在一些實施方案中，ECD是變體ECD，其相對於野生型ECD包含修飾，例如截短或取代。在一些實施方案中，該取代是例如將ECD的第20位的G取代為T，即G20T；或例如將ECD的第19位的N取代為E，即N19E，或二者的組合。在一些實施方案中，該截短是N末端截短，或C末端截短，從而獲得截短的N末端或截短的C末端。在一些實施方案中，該截短是N末端截短，例如在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。

在一些實施方案中，TGFβRII分子的ECD

(i)包含與選自SEQ ID NO：24的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含選自SEQ ID NO：24的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)包含與選自SEQ ID NO：24的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iv)包含與(i)-(iii)中任一項相比具有截短的N末端和/或C末端的胺基酸序列，其中較佳地，該截短是指在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。

在一些實施方案中，本發明的TGFβRII分子的ECD

(i)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，較佳地該胺基酸序列包含在第20位包含T(即包含G20T)；

(ii)包含選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，較佳地該胺基酸序列包含在第20位包含T(即包含G20T)；或者

在一些實施方案中，本發明的TGFβRII分子的ECD

(i)包含與選自SEQ ID NO：39的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，較佳地該胺基酸序列包含在第19位包含E(即包含N19E)；

(ii)包含選自SEQ ID NO：39的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)包含與選自SEQ ID NO：39的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，較佳地該胺基酸序列包含在第19位包含E(即包含N19E)；或者

V.示例性融合蛋白

在一些實施方案中，本發明的融合蛋白分子包含

(i)特異性結合FAP的第一靶標結合區，其包含抗FAP抗體或其抗原結合片段；

(ii)特異性結合TGFβ的第二靶標結合區，其包含TGFβ受體或其功能性片段，例如TGFβ受體是TGFβRII分子，例如功能性片段是ECD。

在一些實施方案中，(i)與(ii)之間藉由接頭連接。在一些實施方案中，(i)與(ii)之間不藉由接頭而直接連接。

在一些實施方案中，第一靶標結合區包含Fc區。適用於本發明融合蛋白的Fc區片段可以是任何抗體Fc區。Fc區可以包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然序列Fc結構域涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列，例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014,doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)。例如，本發明抗體的Fc區可以包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。在一些實施方案中，抗體Fc區還可以在N端帶有IgG鉸鏈區或部分IgG鉸鏈區，例如，IgG1鉸鏈區或部分IgG1鉸鏈區。在該鉸鏈區中可以含有突變。在一些實施方案中，鉸鏈區可以是EPKSS或EPKSC。較佳地，本發明抗體的Fc區從N端到C端包含：CH2-CH3，或從N端到C端包含：鉸鏈區-CH2-CH3。在一些實施方案中，適用於本發明融合蛋白分子的Fc區為人的IgG Fc，例如，人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3或人IgG4 Fc。在一個實施方案中，Fc區包含胺基酸序列SEQ ID NO：40或與其具有至少90%同一性，例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。

可以將本發明的抗體或融合蛋白中的Fc區進行突變以獲得所需的特性。在一些實施方案中，將Fc區C末端的賴胺酸替換以防止融合蛋白斷裂，例如替換為丙胺酸。

在一個實施方案中，第一靶標結合區是全長抗體，一個或多個第二靶標結合分別與全長抗體的重鏈和/或輕鏈的N末端和/或C末端(經由或不經由接頭)連接。

在一個實施方案中，第一靶標結合區是全長抗體，一個或多個第二靶標結合分別與全長抗體的重鏈的N末端和/或C末端(經由或不經由接頭)連接。

在一個實施方案中，第一靶標結合區是全長抗體，一個或多個第二靶標結合分別與全長抗體的重鏈的C末端(經由或不經由接頭)連接。

在一個實施方案中，第二靶標結合區包含或者是TGFβ受體(例如TGFβRII分子)的功能性片段，例如ECD。

在一個具體的實施方案中，本發明的融合蛋白分子包含

(i)鏈A：抗FAP抗體輕鏈；

(ii)鏈B：在N末端或C末端(經由或不經由接頭)連接TGFβ受體(例如TGFβRII分子)的ECD的抗FAP抗體重鏈。

在一個實施方案中，本發明的融合蛋白分子由2條鏈A和2條鏈B組成。

在本發明的實施方案中，鏈A中的抗FAP抗體輕鏈如上文所定義。在本發明的一些實施方案中，鏈B中的抗FAP抗體重鏈如上文所定義。在本發明的一些實施方案中，TGFβRII受體(例如TGFβRII分子)的ECD如上文所定義。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的融合蛋白分子的鏈A：

包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的融合蛋白分子的鏈B：

包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

V.本發明的核酸以及包含其的宿主細胞

在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗體或融合蛋白分子的核酸。例如，本發明的核酸包含編碼SEQ ID NO：13、14、15、16、21、23、25、29、35、36或38所示胺基酸序列的核酸，或編碼與SEQ ID NO：13、14、15、16、21、23、25、29、35、36或38所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。

如所屬技術領域中具有通常知識者明瞭的，因為密碼子簡併性，每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。編碼本發明分子的核酸序列可以採用本領域熟知的方法，例如藉由從頭固相DNA合成，或藉由PCR擴增而產生。

在一方面，本發明提供編碼以上任何抗體或任何抗體鏈的核酸。當從適宜的表達載體表達時，由該核酸編碼的多肽能夠顯示人FAP抗原(和/或猴(例如食蟹猴))結合能力。

在再一方面，本發明提供編碼以上任何融合蛋白的核酸。當從適宜的表達載體表達時，由該核酸編碼的多肽能夠顯示人或猴(例如食蟹猴)FAP抗原結合能力。在一個實施方案中，編碼融合蛋白的各條鏈的核酸可以在相同的載體中或在不同的載體中。在再一實施方案中，編碼融合蛋白的各條鏈的核酸可以引入相同或不同的宿主細胞以表達。因此，在一些實施方案中，本發明的融合蛋白的生產方法包括步驟：在適於表達該分子的各條鏈的條件下，培養包含編碼該各條鏈的核酸的宿主細胞，產生本發明融合蛋白。

在一個實施方案中，提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在一個實施方案中，載體是例如pcDNA載體，例如pcDNA3.1。

在一個實施方案中，提供包含該核酸或該載體的宿主細胞，例如用於選殖或表達編碼抗FAP抗體或融合蛋白的載體。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞例如CHO細胞(例如CHO-S，如ExpiCHO-S)或293細胞(例如293F或HEK293細胞))或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核的，例如是細菌，例如大腸桿菌。

在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。例如，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是關於編碼抗體的載體的合適選殖或表達宿主。例如，糖基化途徑已經進行“人源化”的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK293、293F或293T細胞)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞、CHO-S細胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤細胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本領域已知適合產生抗體的哺乳動物宿主細胞系。

VI.本發明的抗體或融合蛋白分子的生產和純化

在一個實施方案中，本發明提供製備本發明抗體或融合蛋白分子或其片段(較佳的抗原結合片段)的方法，其中該方法包括在適於表達編碼本發明抗體或融合蛋白分子或其片段的核酸的條件下培養該宿主細胞，以及視需要地分離該抗體或融合蛋白或其片段。在某個實施方案中，該方法還包括從宿主細胞回收本發明抗體或融合蛋白分子或其片段。

在一個實施方案中，提供了製備本發明抗體或融合蛋白分子的方法，其中該方法包括，在適合抗體或融合蛋白表達的條件下，培養包含編碼該抗體或融合蛋白各條鏈例如鏈A和鏈B(視需要的在一個載體中或在兩個載體中)的核酸或包含該核酸的表達載體的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體或融合蛋白。

為了重組產生本發明抗體或融合蛋白分子，分離編碼抗體或融合蛋白的鏈的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。可以使用所屬技術領域中具有通常知識者熟知的方法來構建表達載體。一旦已經製備了用於表達的包含本發明的一種或多種核酸分子的表達載體，則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質體的轉染或其他常規技術。

如本文所述製備的抗體或融合蛋白分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域中具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。

VII.測定法

可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗體或融合蛋白的鑑定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體或融合蛋白測試其FAP和/或TGFβ結合活性，例如藉由已知的方法諸如生物光干涉等來進行。

本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗體或融合蛋白的測定法。生物學活性可以包括例如結合FAP或TGFβ(例如結合人FAP或TGFβ)，阻斷TGFβ(例如TGFβ1、2或3)的信號傳導，逆轉TGFβ(例如TGFβ1、2或3)對T細胞的抑制，和/或激活T細胞，對成纖維細胞的抑制作用或對纖維化病變的抑制作用等。

在某些實施方案中，對本發明的抗體或融合蛋白測試此類生物學活性。

供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表達FAP或TGFβ或經改造而表達或過表達FAP或TGFβ細胞系。此類細胞還包括表達FAP或TGFβ和並非正常情況下表達FAP或TGFβ的編碼FAP或TGFβ DNA轉染的細胞系。

VIII.醫藥組成物和藥物製劑

在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗體或融合蛋白分子或其片段的組成物，較佳地組成物為醫藥組成物。在一個實施方案中，該組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中，組成物，例如，醫藥組成物，包含本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段，以及一種或多種其它治療劑的組合。

本發明還包括包含本文所述的抗體或融合蛋白分子或其片段的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)，或包含編碼本文所述的融抗體或合蛋白分子或其片段的多核苷酸的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)。這些組成物還可以包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。

如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。

對於藥用輔料的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。

本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、散劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。

可以藉由將具有所需純度的本發明的抗體或融合蛋白分子與一種或多種視需要的藥用輔料混合來製備包含本文所述的抗體的藥物製劑，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。

本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分，該活性成分是被治療的特定適應證所需的，較佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它治療劑，例如抗纖維化劑、化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、或小分子藥物等。該活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。

IX.藥物組合和藥盒

在一些實施方案中，本發明還提供了藥物組合或藥物組合產品，其包含本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段，以及一種或多種其它治療劑(例如抗纖維化劑、化療劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、或小分子藥物等)。

本發明的另一個目的是提供一種成套藥盒，其包含本發明的藥物組合，較佳地該藥盒為藥物劑量單元形式。由此可以依據給藥方案或藥物施用間隔提供劑量單元。

在一個實施方案中，本發明的成套藥盒在同一包裝內包含：

- 含有包含本文所述的抗體或融合蛋白分子或其片段的醫藥組成物的第一容器；

- 含有包含其它治療劑的醫藥組成物的第二容器。

X.治療用途

本發明一方面提供了在受試者中預防或治療纖維化(例如纖維化病變)的方法，包括向受試者施用有效量的本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段、醫藥組成物、藥物組合或藥盒。

在一些實施方案中，該患者或患者組織/器官中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白質水平的)FAP(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官)。

在一個具體的實施方案中，本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段能夠抑制成纖維細胞增殖，例如激活的成纖維細胞，例如特異性表達FAP的(激活的)成纖維細胞。

在一些實施方案中，該患者或患者組織/器官的成纖維細胞中具有 (例如升高水平的，例如核酸或蛋白質水平的)FAP(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官的成纖維細胞)。

在一個具體的實施方案中，本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段能夠降低纖維化例如纖維化病變。在一些實施方案中，纖維化選自在肺、腎、肝或皮膚的纖維化。在一些實施方案中，纖維化病變選自肺部、腎或肝中的纖維化病變。在一些實施方案中，纖維化病變選自特發性肺纖維化，肝硬化，硬皮病或糖尿病腎病。

受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的個體)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如抗纖維化劑治療。

在其他方面，本發明提供抗體或融合蛋白分子或其片段或醫藥組成物或藥物組合或藥盒在生產或製備藥物中的用途，該藥物用於本文所述的用途，例如用於預防或治療本文提及的相關疾病或病症。

在一些實施方案中，本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段或醫藥組成物或藥物組合或藥盒會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。

在一些實施方案中，本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段或醫藥組成物還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用，用於本文所述的用途，例如用於預防和/或治療本文提及的相關疾病或病症。

在一些實施方案中，治療劑選自抗纖維化劑、其它抗體或小分子藥物。

此類組合療法涵蓋組合施用(例如兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的治療劑和/或藥劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體或融合蛋白分子或其片段的施用。

醫藥組成物的施用途徑是根據已知方法，例如，經口、藉由靜脈內注射、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門脈內或病灶內途徑；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施方案中，組成物可藉由彈丸注射或藉由連續輸注或藉由植入裝置施用。

本發明的這些以及其它方面和實施方案在圖式(圖式簡述緊隨其後)和以下的發明詳述中得到描述並且示例於以下實施例中。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且所屬技術領域中具有通常知識者可以進行多種修改。

[實施例]

實施例1：FAP抗體人源化

1.1 FAP抗體人源化準備

F19抗體是特異性結合FAP的鼠源抗體，其與人、猴具有種屬交叉活性(WO1999057151A2)。本實施例以抗體F19作為候選分子進行人源化的構建。

採用CDR移植技術(CDR grafting technology)對鼠抗F19進行人源化。簡言之，藉由將F19 VH(SEQ ID No：7)及F19 VL(SEQ ID No：1)序列在IMGT數據庫中檢索比對，分別獲得與F19重鏈可變區和輕鏈可變區同源性較高的人胚系基因序列IGHV1-8*02和IGKV1-16*01，將其作為人源化抗體可變區的框架；分別將鼠抗F19的CDR移植到相應的人源化抗體重輕鏈可變區框架中，形成人源化的抗FAP抗體可變區。為了維持鼠源抗體針對FAP的親和力，需要對獲得的人源化抗體可變區進行回復突變。

由此分別獲得了FAP抗體的人源化重鏈可變區序列(huF19-LG-VH)(SEQ ID No：13)和輕鏈可變區序列(huF19-LG-VL)(SEQ ID No：15)，參見表1，其中還列出人源化序列的回復突變位點。

表1：人源化抗FAP抗體huF19-LG的重輕鏈可變區序列

人源化的對照抗體(sibrotuzumab)可變區序列來自專利WO9957151，其中重鏈可變區序列為SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。

將上述huF19-LG以及對照抗體sibrotuzumab的可變區胺基酸序列送至金斯瑞生物技術有限公司進行密碼子優化和基因合成。將編碼抗體的VH區和VL區的基因分別插入含有人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID No：8)編碼基因/Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID No：2)編碼基因的表達載體pcDNA3.1(+)中，以分別獲得表達抗FAP抗體huF19-LG以及sibrotuzumab全長重鏈的質粒和表達抗FAP抗體huF19-LG以及sibrotuzumab全長輕鏈的質粒。huF19-LG(重鏈：SEQ ID NO：14；輕鏈：SEQ ID NO：16)和sibrotuzumab的全長重鏈和輕鏈(重鏈：SEQ ID NO：18；輕鏈：SEQ ID NO：20)見序列表。

依據製造商產品手冊說明，使用ExpiCHO^TM表達系統(ThermoFisher, Cat#A29133)將上文獲得的含全長重鏈序列的質粒和全長輕鏈序列的質粒共轉染ExpiCHO-S細胞以表達全長抗FAP人源化抗體huF19-LG以及表達對照抗體sibrotuzumab。轉染後培養細胞10-12天，當細胞存活率下降到60%至70%時，收集上清液，使用MabSelect Sure蛋白A親和層析系統(GE healthcare)純化表達在上清液中的抗體。

濃縮純化的抗體，無菌過濾，藉由分子排阻色譜(SEC)確認了抗體的純度。具體而言，使用100mM磷酸鈉+100mM Na₂SO₄(pH 7.0)作為運行緩衝液，將20μg樣品注入到TSK G3000SWXL管柱上。運行30分鐘。收集的流出液採用Agilent 1220 HPLC進行測量，並使用OpenLAB軟體分析數據。人源化抗FAP抗體huF19-LG及對照抗體sibrotuzumab純度>90%，具有高的純度和完整性，可用於後續實驗。

1.2 人源化FAP抗體ELISA活性檢測

使用ELISA測定來確定抗體對重組人FAP的相對結合活性。

藉由在4℃ PBS緩衝液孵育過夜將人FAP蛋白(Sino Biological，貨號：10464-H07H)固定到96孔板上。然後將該板藉由在37℃與含有1%BSA的PBS一起孵育1小時來封閉。在封閉之後，將該板用PBST(含有0.05% Tween20的PBS)洗滌3次。在結合緩衝液(含有0.05% Tween20和0.5% BSA的PBS)中製備以2nM為起始濃度三倍連續稀釋抗FAP抗體(huF19-LG,Sibrotuzumab)並且在37℃將其與固定的蛋白質一起孵育1小時。在結合之後，將該板用PBST洗滌3次，在37℃與在結合緩衝液中1/15,000稀釋的過氧化物酶標記的山羊抗人IgG，F(ab')₂ fragment specific(Jackson Immuno Research，貨號：109-035-097)一起孵育1小時，再次洗滌，用TMB顯影並且使用1M H₂SO₄停止。該抗體與人FAP結合的EC₅₀(nM)和代表性結合曲線示於圖1中。

結果表明，人源化抗體huF19-LG與人FAP特異性結合，並顯示出與對照抗體Sibrotuzumab相當的結合能力。

1.3 人源化FAP抗體流式細胞結合檢測

藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的人源化抗體能否與穩定表達在293T細胞表面的人FAP蛋白結合。首先採用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen，貨號：11668019)轉染試劑將編碼人FAP蛋白序列(NM_004460.2,SEQ ID NO：31)及食蟹猴FAP蛋白(XM_005573320.2,SEQ ID NO：32)選殖到PIRES-puro3(Clontech，貨號：631619)表達載體中，用於分別轉染293T細胞，然後用0.3μg/mL嘌呤黴素(Gibco，貨號：A1113802)篩選，得到了高表達人FAP的293T細胞(293T-人FAP)或高表達食蟹猴FAP的293T細胞(293T-食蟹猴FAP)。

將等比例梯度稀釋的人FAP抗體(huF19-LG,Sibrotuzumab)(初始濃度為200nM，4倍等比稀釋，共8個點)加入到細胞中，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson Immuno Research，貨號：109-116-098)，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號，結果見圖2。

從圖2所示的結果可知，huF19-LG可結合工程化293T細胞上表達的人FAP蛋白和食蟹猴FAP蛋白，其結合能力與對照抗體相當。

1.4 FAP人源化抗體與DPP4的結合

藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的人源化抗體能否與穩定表達在工程化293T細胞表面的人DPP4蛋白結合。

首先採用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen,Cat#11668019)轉染試劑將編碼人DPP4蛋白序列(NM_001935.3,SEQ ID NO：33)選殖到表達載體PIRES-puro3(Clontech，貨號：631619)中，轉染293T細胞，然後用0.3μg/mL嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)篩選，得到了高表達人DPP4的293T細胞(293T-DPP4細胞)。

待測抗人FAP抗體(huF19-LG,Sibrotuzumab)用PBS稀釋到10μg/mL和1μg/mL，重新懸浮293T-DPP4細胞4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Feγ Fragment Specific(Jackson Immuno Research，貨號：109-116-098)，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。同時293T-DPP4細胞用FITC anti-human CD26(DPP4)(biolegend，貨號：302704)作為系統陽性對照檢測是否表達DPP4蛋白。抗體用PBS按1：100稀釋後重新懸浮細胞沉澱，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後，用100μl的PBS重新懸浮後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。結果見圖3。

從圖3所示的結果可知，huF19-LG不能結合293T細胞上表達的人DPP4蛋白。

1.5 人源化抗FAP抗體物理化學分析以及穩定性檢測

對huF19-LG抗體進行40℃放樣穩定性檢測，分別在0週(0W)，2週(2W)，4週(4W)檢測ELISA(參見實施例1.2)和SEC(參見實施例1.1)，結果如下：

從上述結果可知，放樣過程中純度有所下降，同時對應的活性也有輕微下降。推測為CDR中的天冬醯胺脫醯胺引起的分子不穩定性產生的影響。後續將對該位進行改造。

實施例2：FAP抗體的序列改造

2.1 脫醯胺位點突變

對重鏈CDR中的位點進行突變G56R(Kabat)，對該突變後全長抗體序列進行真核表達，方法同實施例1。突變後的抗體命名為huF19-LG-NGR，可變區胺基酸序列如下：

2.2 突變後抗體分子的流式檢測

藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的突變後抗體能否與穩定表達在293T細胞表面的人或食蟹猴FAP蛋白結合。高表達人FAP或食蟹猴FAP的293T細胞如實施例1.3中描述。梯度稀釋抗體huF19-LG-NGR及huF19-LG(初始濃度為200nM，4倍等比稀釋，共8個點)加入到細胞中，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098)，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。

從圖4所示的結果可知，huF19-LG-NGR可結合工程化293T細胞上表達的人FAP蛋白和食蟹猴FAP蛋白，其結合能力與突變前抗體相當。

2.3 突變後抗體的穩定性放樣檢測

在穩定性放樣中藉由SEC確認了分子活性與純度。具體方法參見實施例1.5。結果如下表格所示

由上述結果可知突變後的抗體huF19-LG-NGR在純度上並未發生明顯變化，突變後的抗體穩定性增強。後續使用huF19-LG-NGR構建抗體融合蛋白。

實施例3：抗體融合蛋白

3.1 基於huF19-LG-NGR的抗體融合蛋白分子

3.1.1 分子結構優化構建

本發明構建了如圖11所示的融合蛋白LG-NGR-Trap，其中FAP抗體部分來源於huF19-LG-NGR，Trap部分來源於TGFβR2胞外區(SEQ ID No：24、SEQ ID No：37(G20T)和SEQ ID No：39(N19E))。抗FAP抗體部分靶向表達FAP的細胞，Trap部分阻礙游離TGFβ分子與細胞上的TGFβR2結合。同時，該抗體可藉由抗體依賴的細胞毒性作用(ADCC)殺傷靶細胞。

本申請使用標準構建方法獲得了如圖11抗體融合蛋白LG-NGR-Trap、LG-NGR-TrapE(N19E)、LG-NGR-TrapGT(G20T)，其胺基酸序列在序列表中列出。表示該序列從N端到C端依次包括來源於FAP人源化抗體huF19-LG-NGR的序列和TGFβR2的胞外區序列。

如下構建如圖11所示的抗體融合蛋白分子：

LG-NGR-Trap重鏈：擴增編碼抗FAP抗體重鏈可變區的核苷酸序列，將其選殖到人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：8)pcDNA3.1(+)載體中；將TGF β R2胞外區(SEQ ID NO：24)的編碼核苷酸序列連接到上述恆定區的C端，且為了防止斷裂將Fc末尾賴胺酸替換為丙胺酸。獲得LG-NGR-Trap重鏈的表達載體。其中LG-NGR-Trap重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示，其中N端到C端依次包括：LG-NGR-VH-重鏈恆定區(末端K突變為A)-TGFβ胞外區。

基於LG-NGR-Trap重鏈分別對Trap部分分別進行N19E或G20T突變，在擴增時引入接頭(G₄S)₄，獲得LG-NGR-TrapE重鏈(SEQ ID NO：38(N19E))、LG-NGR-TrapGT重鏈(SEQ ID NO：36(G20T))。

LG-NGR-Trap輕鏈：將編碼huF19-LG的輕鏈可變區的基因插入含有人Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID No：2)編碼基因的表達載體pcDNA3.1(+)中，以獲得LG-NGR-Trap輕鏈(即huF19-LG全長輕鏈)的質粒。LG-NGR-Trap輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

將上述表達載體(分別包含LG-NGR-Trap、LG-NGR-TrapE、LG-NGR-TrapGT重鏈編碼核酸和huF19-LG輕鏈編碼核酸的質粒)共轉ExpiCHO-S 細胞，在合適的條件下表達獲得如圖11所示的抗體融合蛋白。表達、純化、初步分析步驟同實施例1.1。

3.1.2 抗體融合蛋白理化與穩定性檢測

3.1.2.1對於獲得的抗體融合蛋白LG-NGR-Trap，藉由分子排阻色譜確認了抗體的純度。具體方法參見實施例1。LG-NGR-Trap純度>95%，可用於後續實驗。

3.1.2.2對抗體融合蛋白LG-NGR-Trap，進行pH4.5,1d條件下的穩定性放樣實驗，同樣藉由分子排阻色譜確認純度。

表7結果顯示，該條件下，LG-NGR-Trap在SEC上的主峰基本未發生改變，表明該分子較為穩定。

3.1.3 抗體融合蛋白的流式細胞檢測

藉由細胞結合實驗來判斷本發明中的抗體融合蛋白能否與穩定表達在工程化293T細胞表面的人的FAP蛋白結合。高表達人FAP的293T細胞如實施例1.3中描述。梯度稀釋的LG-NGR-Trap(初始濃度為150nM，4倍等比稀釋，共8個點)加入到細胞中，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後加入螢光二抗R-PE-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγ Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,Cat#109-116-098)，4℃孵育30分鐘。PBS洗細胞兩遍後重新懸浮細胞，最後用BD Accuri C5(BD Bioscience)流式細胞儀檢測螢光信號。

從圖5所示的結果可知，LG-NGR-Trap可較好結合工程化293T細胞上表達的人FAP蛋白。

3.1.4 抗體融合蛋白與人/食蟹猴FAP以及TGFβ親和力檢測

在本實驗中，根據廠商說明，利用ForteBio Octet RED96檢測了抗體融合蛋白LG-NGR-Trap與人FAP蛋白(Sino biological，貨號：10464-H07H)，人TGFβ1蛋白(Sinobiological，貨號：10804-HNAC)、人TGFβ2蛋白(Novoprotein，貨號：CJ79)和人TGFβ3蛋白(Novoprotein，貨號：CJ44)的結合親和力。

簡要地，將AHC傳感器(ForteBio，貨號：18-5060)放進Running Buffer(1 X PBS Hyclone，貨號：SH30256.01，包含0.02% Tween20，pH7.0)，在室溫條件下進行預平衡10min。在96孔板中，動力學實驗方法按照以下步驟進行：a)用Running Buffer平衡基線180s，b)加入用Running Buffer稀釋的抗體融合蛋白LG-NGR-Trap，終濃度5μg/mL，固化200s，c)用Running buffer平衡基線300s，d)向各孔中加入如下濃度的用Running Buffer稀釋的人的FAP、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白：25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM、1.56nM、0.78nM和0.39nM，結合200s，解離600s。實驗數據使用Fortebio Data Analysis軟體1：1結合模型進行擬合併計算。

表10總結了抗體融合蛋白LG-NGR-Trap與人FAP蛋白結合親和力。表11總結了抗體融合蛋白LG-NGR-Trap與人TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3蛋白結合親和力。

表10-11表明本申請構建的抗體融合蛋白可以特異地結合來自人的FAP蛋白和TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3蛋白。本申請獲得的抗體融合蛋白針對TGFβ蛋白的KD值比針對FAP蛋白低兩個數量級，高親和力的FAP可以有效降低靶向TGF β的副作用。

3.2 藥效替代分子

3.2.1 藥效替代分子構建

由於huF19-LG-NGR不能結合鼠蛋白，在藥效評估階段需要增加構建替代抗體用來結合鼠FAP。該替代抗體來自WO2012020006中28H1。具體構建方法參見實施例1和3.1，用28H1替代huF19-LG-NGR，構建完成分子命名為28H1-Trap。

3.2.2 報告基因檢測

本實施例檢測抗FAP-Trap抗體融合蛋白對293T/SBE-luc2P報告基因系統的激活作用。在293T細胞上轉入包含SBE-luc2P報告基因元件(質粒：pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro]Vector，Promega，貨號：E367A)，藉由潮黴素(Gibco，貨號：10687010)加壓篩選及有限稀釋獲得穩定表達了SBE-luc2P報告基因元件的單株細胞株293T/SBE-luc2P細胞。外加的人TGFβ1(Sino Biological，貨號：10804-HNAC)因子能夠與293T細胞表面內源性表達的TGFβR結合後啟動信號級聯形成SMAD複合物，SMAD複合物進入細胞核後進而導致SBE報告基因元件的激活產生螢光信號。而抗FAP-Trap抗體融合蛋白可以結合人TGFβ1因子，進而阻斷SBE報告基因元件的激活。具體步驟如下：

消化離心收集293T/SBE-luc2P細胞，棄上清用含10%滅活胎牛血清(Gibco，貨號：10099-141，56℃水浴滅活30min)的DMEM(Gibco，貨號：11995-065)完全培養基重新懸浮細胞沉澱，Countstar細胞計數儀計數，細胞懸液用上述完全培養基稀釋至8×10⁵個細胞/mL。用上述培養基配製2×工作濃度的TGFβ1蛋白工作液，終工作濃度為0.4ng/mL。用TGFβ1蛋白工作液配製2×最終檢測濃度的待測融合蛋白(LG-NGR-Trap和28H1-Trap、LG-NGR-TrapGT、LG-NGR-TrapE)。待測抗體最終檢測濃度為0.145pM，0.434pM，1.301pM，3.902pM，5.853pM，8.779pM，13.169pM，19.753pM和29.630pM。將293T/SBE-luc2P細胞懸液接種到384孔檢測白板(Corning，貨號：3570)，25μL/孔加樣。梯度抗體稀釋液按25μL/孔加樣。置於37℃、5%CO₂、飽和濕度的培養箱中孵育過夜(18~20小時)。第二天加入25μl One-Glo^TM Luciferase Assay Reagent(Promega，貨號：E6130)混勻，室溫下用多功能酶標儀(Tecan，型號：F200PRO)的螢光檢測模塊檢測發光信號。

結果見圖6及下表：

LG-NGR-Trap、LG-NGR-TrapGT和LG-NGR-TrapE與對照28H1-Trap的TGFβ激活通路抑制作用相比無明顯差異，且經確認28H1-Trap在細胞水平結合人FAP(同實施例3.1.3)，因此28H1-Trap能夠模擬LG-NGR-Trap進行小鼠體內藥效實驗。

實施例4：IPF動物藥效實驗

動物藥效使用凱斯艾生物提供的小鼠氣管滴注博來黴素誘導雙側特發性肺纖維化模型。在此模型上評估替代抗體融合蛋白28H1-Trap對肺纖維化的藥效。

8-9週齡的C57BL/6小鼠(卡文斯百格(蘇州)有限公司)，建模當天開始給藥，給藥後氣管滴注博來黴素誘導肺纖維化建模。此後的三週時間，每週腹腔給藥兩次，每兩天稱一次體重，具體藥物和劑量見下表：

表12

在實驗的終點對小鼠進行安樂死。15隻/組(正常組動物6隻)終點存活動物採集雙肺，肺內福爾馬林灌注固定，進行肺組織病理切片，Masson染色，成像(圖7A-H)並進行肺纖維化分級評分。病理染色如圖7顯示，其中黑色箭頭表示完整肺泡結構，間隙深色部分表示膠原的積累。結果顯示，28H1-Trap高劑量組(C&G)對比建模組(B&F模型組)可以降低肺部纖維化病變的程度(A&E：正常組，B&F：模型組，C&G：28H1-Trap，20mg/kg，D&H：28H1-Trap，3mg/kg)。

肺纖維化染色評分的結果如圖8A所示，顯示28H1-Trap對比建模組在高劑量下可以減少肺部的纖維化病變。肺纖維化分級的評分(Ashcroft評分法)結果如圖8B所示，顯示28H1-Trap對比建模組降低肺部纖維化病變，且有藥物的劑量依賴。

實施例5：UUO動物藥效實驗

動物藥效使用凱斯艾生物提供的小鼠結紮左側輸尿管誘導左側腎間質纖維化模型。在此模型上評估替代抗體融合蛋白28H1-Trap對腎纖維化的藥效。

8-9週齡的C57BL/6J小鼠(上海市吉輝實驗動物飼養有限公司)，將根據動物體重隨機分組。建模當天為第0天，組2-組4小鼠經異氟烷麻醉後，經腹中線打開腹腔，結紮動物左側輸尿管，關腹並逐層縫合動物皮膚。建模當天腹腔注射給予藥物。組1動物，經異氟烷麻醉後，經腹中線打開腹腔，立即關腹，逐層縫合動物皮膚。此後的10天時間，每隔一天腹腔給藥一次，每兩天稱一次體重，具體藥物和劑量見下表：

表13

分別在第0天、第2天、第4天、第6天和第8天給予動物腹腔注射受試物，在第1天-第3天皮下注射給予動物美洛昔康鎖痛劑。每天記錄動物體重變化；利用Masson染色對UUO側腎臟進行纖維化評分。

建模第10天，動物經戊巴比妥鈉麻醉後進行解剖，確認動物完全麻醉後，沿腹中線打開腹腔，下腔靜脈採集終點血；沿胸膈肌和胸肋軟骨打開胸腔暴露心臟，離斷下腔靜脈，經左心室灌入預冷的生理鹽水行全身灌流，待腎臟血跡褪去後取UUO側腎，小心剝離腎膜，沿腎門將腎臟分為左右兩半，左半腎臟液氮速凍後轉-80℃凍存；右半腎臟浸入200mL 10%福爾馬林固定3天以上，進行Masson染色(圖9)，評價腎臟纖維化程度(見圖10)。

經Masson染色病理結果(圖9)及腎臟纖維化評分(圖10)提示受試物28H1-Trap對腎臟皮質區纖維化均有顯著的改善作用，且28H1-Trap呈一定的劑量依賴性。

TW202413443A_112129429_SEQL.xml

Claims

一種融合蛋白分子，其特異性結合人FAP以及人TGFβ，例如人TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。
如請求項1所述的融合蛋白分子，其包含第一靶標結合區和第二靶標結合區，其中第一靶標結合區特異性結合FAP，且第二靶標結合區特異性結合TGFβ。
如請求項2所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區與第二靶標結合區藉由接頭連接，或不藉由接頭直接連接，例如該接頭是(G₄S)_n，其中該n=1、2、3、4、5或6，例如n=4。
如請求項2或3所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區來自抗FAP抗體，例如F19抗體或其人源化抗體或28H1抗體或其人源化抗體。
如請求項2至4中任一項所述的融合蛋白分子，其中該第一靶標結合區包含重鏈可變區VH的3個CDR，HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區VL的3個CDR，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中

(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：7所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：1所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：13所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：15所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：21所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：15所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(iv)該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自如SEQ ID NO：30所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3；且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO：27所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(v)相對於(i)至-(iv)中任一項的序列，在該三個HCDR區或該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，例如該胺基酸改變是增強抗體穩定性的突變，例如對脫醯胺位點進行突變，例如存在於HCDR2，其包含G56R置換；

較佳地，CDR藉由Kabat編號方案確定。
如請求項2至4中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含

(i)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：11所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或

(ii)如SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：22所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；

(iii)WO2012020006中揭露的28H1抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(iv)相對於(i)或(ii)或(iii)中任一項的序列，在該三個HCDR區或該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，例如該胺基酸改變是增強抗體穩定性的突變，例如對脫醯胺位點進行突變，例如存在於HCDR2，其包含G56R置換。
如請求項2至6中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈可變區VH，其中該重鏈可變區

(i)包含與SEQ ID NO：7、13、21或30的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：7、13、21或30的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項2至7中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含其包含輕鏈可變區VL，其中該輕鏈可變區

(i)包含與SEQ ID NO：1或15或27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：1或15或27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項2至8中任一項所述的融合蛋白分子，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中

(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項2至9中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：

(vii).SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：1；

(viii).SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；

(ix).SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：15；或

(x).SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：27。
如請求項2至10中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區還包含Fc或重鏈恆定區CH，例如，

該Fc區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，較佳的IgG1的Fc區，視需要地，該Fc區的末尾胺基酸K被缺失或被突變為A；或者

該抗體重鏈恆定區CH為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區，視需要地，該重鏈恆定區的末尾胺基酸K被缺失或被突變為A。
如請求項11所述的融合蛋白分子，其中重鏈恆定區CH

(i)包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

該Fc區

(i)包含與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項2至12中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區還包含輕鏈恆定區，例如該輕鏈恆定區為lambda或kappa輕鏈恆定區。
如請求項13所述的融合蛋白分子，其中該輕鏈恆定區

(i)包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項2至14中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：9、14、23、35、41或42的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項2至15中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含輕鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：3、16或28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9.8%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項15或16所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈和輕鏈，其中

(i)該重鏈包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(ii)該重鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(iii)該重鏈包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(iv)該重鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；或

(v)該重鏈包含SEQ ID NO：41或42的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項17所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或由該如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列組成：

(x).SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：3；

(xi).SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16；

(xii).SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：16；

(xiii).SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：16；

(xiv).SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：28；或

(xv).SEQ ID NO：42和SEQ IDNO：28。
如請求項2至18中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區為人源化抗體或嵌合抗體。
如請求項2至19中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區為單株抗體。
如請求項2至20中任一項所述的融合蛋白分子，其中第一靶標結合區為抗原結合片段，其選自：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。
如請求項2至21中任一項所述的融合蛋白分子，其中第二靶標結合區包含特異性結合TGFβ的TGFβ受體或其功能性片段。
如請求項22所述的融合蛋白分子，其中該TGFβ受體是TGFβRII分子，例如該TGFβRII分子

(i)包含與選自SEQ ID NO：34的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含選自SEQ ID NO：34的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與選自SEQ ID NO：34的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項22或23所述的融合蛋白分子，其中該功能性片段包含ECD或者是ECD。
如請求項24所述的融合蛋白分子，其中該ECD是野生型TGFβ受體的ECD，例如野生型TGFβRII分子的ECD，或者是相對於野生型ECD包含修飾的變體ECD，例如，該修飾包含N末端或C末端的截短或取代。
如請求項25所述的融合蛋白分子，其中

該取代選自將ECD的第20位的G取代為T，即G20T；或將ECD的第19位的N取代為E；或二者的組合；或者

該截短第N末端截短，例如在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如選自將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。
如請求項24至26中任一項所述的融合蛋白分子，其中該ECD是TGFβRII分子的ECD，例如該TGFβRII分子的ECD

(i)包含與SEQ ID NO：24、37或39的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含SEQ ID NO：24、37或39的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(iii)包含與SEQ ID NO：24、37或39的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；較佳地，該胺基酸改變選自在第20位包含T(即包含G20T)，和/或在第19位包含E(即包含N19E)；

(iv)包含與(i)-(iii)中任一項相比具有截短的N末端和/或C末端的胺基酸序列，其中較佳地，該截短是指在N末端將第1-19位胺基酸中的任何幾個胺基酸或全部胺基酸缺失，例如將ECD的第1-19位胺基酸缺失，或將ECD的第4-19位胺基酸缺失，或將ECD的第18-19位胺基酸缺失。
如請求項1至27中任一項所述的融合蛋白分子，其包含

(i)鏈A：抗FAP抗體輕鏈；

(ii)鏈B：在N末端或C末端藉由不藉由接頭連接TGFβ受體或其功能性片段的抗FAP抗體重鏈。
如請求項28所述的融合蛋白分子，其中該融合蛋白分子由2條鏈A和2條鏈B組成。
如請求項28或29所述的融合蛋白分子，其中鏈A包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項28至30中任一項所述的融合蛋白分子，其中鏈B包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項28或29所述的融合蛋白分子，其中

鏈A包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且

鏈B包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

鏈A包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且

鏈B包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項32所述的融合蛋白分子，其中

鏈A包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或由其組成，且鏈B包含SEQ ID NO：25、36或38所示的胺基酸序列或由其組成；或

鏈A包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或由其組成，且鏈B包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列或由其組成。
一種抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含

SEQ ID NO：10所示的HCDR1、如SEQ ID NO：22所示的HCDR2、如SEQ ID NO：12所示的HCDR3；如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
一種抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中

(i)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(iii)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項34或35所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成：

(xi).SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15；或

(xii).SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：15。
如請求項34至36中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含Fc或重鏈恆定區CH，例如，

該Fc區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，較佳的IgG1的Fc區，視需要地，該Fc區的末尾胺基酸K被缺失或被突變為A；或者

該抗體重鏈恆定區CH為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區，視需要地，該重鏈恆定區的末尾胺基酸K被缺失或被突變為A。
如請求項37所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中重鏈恆定區CH

(i)包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

該Fc區

(i)包含與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項34至38中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段還包含輕鏈恆定區，例如該輕鏈恆定區為lambda或kappa輕鏈恆定區。
如請求項39所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈恆定區

(i)包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或

(ii)包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項34至40中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：14、23或35的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項34至41中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項41或42所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中

(i)該重鏈包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；

(ii)該重鏈包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；或

(iii)該重鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成；且該輕鏈包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或包含與該胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成。
如請求項43所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈和輕鏈分別包含如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列，或由該如下SEQ ID NO所示的胺基酸序列組成：

(xvi).SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16；

(xvii).SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：16；或

(xviii).SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：16。
如請求項34至44中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或嵌合抗體。
如請求項34至45中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段為單株抗體。
如請求項34至46中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，其中該抗FAP抗體或其抗原結合片段為抗原結合片段，其選自：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。
一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段的任一條鏈的核酸序列，或由該核酸序列組成。
一種表達載體，其包含如請求項48所述的核酸分子，較佳地，該表達載體為pCDNA，例如pCDNA3.1。
一種宿主細胞，其包含如請求項48所述的核酸分子或如請求項49所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，例如293細胞或CHO細胞，例如293F細胞或293T細胞或CHO-S細胞。
一種製備如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括，在適合該融合蛋白的鏈表達的條件下，培養包含如請求項48所述的核酸分子或如請求項49所述的表達載體的宿主細胞，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該融合蛋白分子或抗體。
一種醫藥組成物或藥物或製劑，其包含如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段以及視需要地藥用輔料。
一種藥物組合產品，其包含如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種其它治療劑(例如抗纖維化劑其它抗體或小分子藥物)。
一種在受試者中預防或治療纖維化(例如在肺、腎、肝或皮膚的纖維化)的方法，包括向受試者施用有效量的如請求項1至33中任一項的所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，或如請求項52所述的醫藥組成物或製劑，或如請求項53所述的藥物組合產品。
一種在受試者中降低纖維化病變(例如肺部、腎或肝中的纖維化病變，例如特發性肺纖維化，肝硬化，硬皮病或糖尿病腎病)的方法，包括向受試者施用有效量的如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，或如請求項52所述的醫藥組成物或製劑，或如請求項53所述的藥物組合產品。
一種在受試者中抑制成纖維細胞增殖，例如激活的成纖維細胞，例如特異性表達FAP的(激活的)成纖維細胞的方法，包括向受試者施用有效量的如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白分子或如請求項34至47中任一項所述的抗FAP抗體或其抗原結合片段，或如請求項52所述的醫藥組成物或製劑，或如請求項53所述的藥物組合產品。
如請求項54至56中任一項所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官中存在FAP表達或具有升高的FAP表達(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官)。
如請求項57所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官中的成纖維細胞中存在FAP表達或具有升高的FAP表達(例例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官的成纖維細胞)。
如請求項54至56中任一項所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官中存在FAP核酸或具有升高的FAP核酸(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官)。
如請求項59所述的方法，其中該受試者的具有纖維化的組織或器官的成纖維細胞中存在FAP核酸或具有升高的FAP核酸(例如相比健康受試者的組織/器官，或相比同一患者的健康組織/器官的成纖維細胞)。