KR100918746B1 - 항 ａ３３ 항체 - Google Patents

항 ａ３３ 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR100918746B1
KR100918746B1 KR1020077007788A KR20077007788A KR100918746B1 KR 100918746 B1 KR100918746 B1 KR 100918746B1 KR 1020077007788 A KR1020077007788 A KR 1020077007788A KR 20077007788 A KR20077007788 A KR 20077007788A KR 100918746 B1 KR100918746 B1 KR 100918746B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
ser
leu
gly
val
Prior art date
Application number
KR1020077007788A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070088570A (ko
Inventor
시로 가타오까
다까후미 도무라
노리꼬 오타니
Original Assignee
교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 filed Critical 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Publication of KR20070088570A publication Critical patent/KR20070088570A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100918746B1 publication Critical patent/KR100918746B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A33에 결합할 수 있으면서 또한 A33을 발현하는 종양 세포를 ADCC나 CDC에 의한 면역 시스템을 이용하여 특이적으로 공격하고, 또한 HAHA가 생산되지 않는 항체 또는 그 항체 단편의 제공 및 상기 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는, 현재 치료 곤란한 고형 종양을 비롯한 각종 악성 종양의 예방 또는 치료제의 제공. A33에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편이며, 하이브리도마 M10(수탁 번호: FERM BP-10107), M96(수탁 번호: FERM BP-10108), M165(수탁 번호: FERM BP-10106), N26(수탁 번호: FERM BP-10109), Q47(수탁 번호: FERM BP-10104), Q54(수탁 번호: FERM BP-10105) 또는 R5(수탁 번호: FERM BP-10107)에 의해 생산되는 A33에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편, 및 상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 종양의 예방 또는 치료제.
A33, 항 A33 항체, CDC, ADCC, 악성 종양 치료제, 면역 반응

Description

항 Ａ３３ 항체 {ANTI-A33 ANTIBODY}
본 발명은 A33 항원에 특이적으로 결합하는 항 A33 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항 A33 항체를 유효 성분으로 하는, A33을 발현하는 세포에서 기인하는 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료제에 관한 것이다.
암(종양)은 일본에서의 사망 원인 제1위를 차지하고, 또한 환자수는 해마다 증가하고 있어, 유효성 및 안정성이 높은 약제나 치료법에 대한 개발이 강하게 요망되고 있다. 그 중에서도 대장암은 1999년도 조사에서 전체 암의 12.2 ％를 차지하였고, 사망률은 남성에서는 제3위, 여성에서는 제2위이지만, 최근에는 현저히 증가하여, 이후에 대장암은 발병률이나 사망률에서 위암을 추월할 것으로 예상되고 있다. 또한, 위암은 1999년도 조사에서 전체 암의 17.4 ％를 차지하였고, 사망률은 남성에서는 제2위, 여성에서는 제1위이다.
치료약으로서의 항체의 사용은 댜앙한 병태(암형)의 치료에서 중요하면서 또한 가치가 있는 접근법으로서 확인되고 있다. 항체의 특이성에 의해, 종양 특이적 항원이 이종 세포의 특성을 나타내는 병태의 치료에 유용하다. 항체는 세포 표면에 발현하는 단백질인 종양 특이적 항원에 결합하고, 이러한 세포를 효과적으로 표적으로 한다. 현재, 세포막 상에 존재하는 수용체인 CD20을 표적으로 한 키메라 항체(Rituximab), Her2/neu를 표적으로 한 인간화 항체 등의 모노클로날 항체가 악성 종양을 대상 질환으로서 사용되고 있으며, 그의 치료 효과가 확인되고 있다. 항체는 혈중 반감기가 길고, 항원에의 특이성이 높은 특징을 가지며, 항종양제로서 특히 유용하다. 예를 들면, 종양 특이적인 항원을 표적으로 한 항체이면, 투여한 항체는 종양에 집적될 것으로 추정되기 때문에, 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC)이나 항체 의존적 세포성 세포 상해 활성(ADCC)에 의한, 면역 시스템의 암 세포에 대한 공격을 기대할 수 있다. 또한, 그 항체에 방사성 핵종이나 세포 독성 물질 등의 약제를 결합시켜 둠으로써, 결합한 약제를 효율적으로 종양 부위에 송달하는 것이 가능해지고, 동시에 비특이적인 다른 조직에의 상기 약제 도달량이 감소하여 부작용의 경감도 기대할 수 있다. 종양 특이적 항원에 세포사멸을 유도하는 것과 같은 활성이 있는 경우에는 작용적(agonistic) 활성을 갖는 항체를 투여함으로써, 또한 종양 특이적 항원이 세포의 증식 및 생존에 관여하는 경우에는 중화 활성을 갖는 항체를 투여함으로써, 종양 특이적인 항체의 집적과 항체 활성에 의한 종양의 증식 정지 또는 퇴축(退縮)이 기대된다. 항체는 상기와 같이 그의 특징 때문에 항종양제로서 적용하는 데 적절하다고 생각된다.
최초의 항체 제조에의 진출에는, 대상 동물로서 마우스가 사용되었다. 그러나, 다수의 이유로 인해 마우스 항체의 생체내에서의 사용은 제한되어 있다. 인간 숙주에 의해 외래물로서 인식되는 마우스 항체는, 소위 「인간 항 마우스 항체」, 즉 「HAMA」 응답을 야기한다(문헌[Schiff et al., Canc. Res.(1985), 45, 879-885] 참조). 또한, 마우스 항체의 Fc 부분은 인간 보체 또는 세포 상해 활성의 자 극에 효과적이지 않다.
이러한 문제를 회피하기 위한 접근법 중 하나로서 키메라 항체가 개발되었다(유럽 특허 출원 120694 및 125023 참조). 키메라 항체는 2개 또는 그 이상의 종류 유래의 항체 일부(마우스 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역 등)를 포함한다. 이러한 키메라 항체의 이점은 마우스 항체의 특징은 유지하지만, 인간 Fc을 갖기 때문에 인간 보체 또는 세포 상해 활성을 자극할 수 있다는 것이다. 그러나, 이러한 키메라 항체도 여전히 「인간 항 키메라 항체」, 즉 「HACA」 응답을 야기한다(문헌[Bruggemann, et al., J. Exp. Med., 170, 2153-2157, 1989] 참조).
또한, 치환된 항체의 일부만이 상보성 결정 영역(즉, 「CDR」)인 재조합 항체가 개발되었다(영국 특허 GB2188638A 및 미국 특허 제5585089호). CDR 이식 기술을 사용하여 마우스 CDR, 인간 가변부 프레임 워크 및 불변 영역을 포함하는 항체(즉, 「인간화 항체」)가 생산되었다(문헌[Riechmann, et al., Nature(1988), 332, 323-327] 참조).
「A33」이라 불리는 클래스 I의 세포 막 단백질로 Ig 수퍼패밀리의 하나이며 종양 특이적 항원인 항원에 대한 마우스 항 A33 항체 및 인간화 항체에 대하여 보고되었다(특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1 내지 5를 참조). 이 항원은 결장암 및 위암에 관련된 것으로 공지되었다(특허 문헌 2, 특허 문헌 3 및 비특허 문헌 6을 참조). 또한, 이 인간화 A33 항체를 이용하여 최근에 제1상의 임상 시험을 결장암 환자를 대상으로 행하였다(비특허 문헌 4 및 5를 참조). 전자의 항체 단독 투여의 보고에서는, 항체 투여 가능한 환자 11명 중 1명에 부분 반응이 확인되었다. 또 한, 후자의 항체와 화학 요법과의 병용 시험을 행한 보고에서는, 항체 투여 가능한 환자 12명 중 3명에 부분 반응, 1명에 혼합 반응이 확인되었다. 최근에 제네테크(Genentech)사로부터 개발이 진행되고 있는 아바스틴(베바시주마브; 인간화 항 VEGF 항체)조차도, 제1상 임상 시험에 있어서 표준 화학 요법과의 병용으로 12명 중 1명의 부분 반응을 나타내었다고 하는 보고가 있었다(문헌[Margolin K. et al., J. Clin. Oncol. (2001) 19, 851-856]). 이로부터도, 항체 단독 투여로 11 명 중 1명에 부분 반응이 확인된 것은, 대장암에서 높은 항종양 효과를 나타내는 것으로 기대되었다.
그러나, 상기와 같이 제1상 임상 시험에서 매우 높은 종양 반응을 인간화 A33 항체는 나타내었지만, 두 시험 모두 50 ％ 이상의 높은 확률로 인간 항 인간화 항체(즉, 「HAHA」)가 생산되었다. 흥미롭게도, 종양 반응성이 높았던 환자에 대해서는 HAHA가 확인되지 않았다.
특허 문헌 1 미국 특허 제5958412호 명세서
특허 문헌 2 미국 특허 제5643550호 명세서
특허 문헌 3 미국 특허 제5160723호 명세서
비특허 문헌 1 문헌[King D. J. et al., British J. Cancer(1995) 72, 1364-1372]
비특허 문헌 2 문헌[Welt S. et al., J. Clinical Oncology(1994), 12, 1561-1571]
비특허 문헌 3 문헌[Welt S. et al., J. Clinical Oncology(1996), 14, 1787-1797]
비특허 문헌 4 문헌[Welt S. et al., Clinical Cancer Res. (2003), 9, 1338-1346]
비특허 문헌 5 문헌[Welt S. et al., Clinical Cancer Res. (2003), 9, 1347-1353]
비특허 문헌 6 문헌[Garin-Chesa P. G. et al., International J. 0ncology(1996), 9, 465-471]
<발명의 개시>
본 발명의 목적은 A33에 결합할 수 있으면서 또한 A33을 발현하는 종양 세포를 ADCC이나 CDC에 의한 면역 시스템을 이용하여 특이적으로 공격하고, 또한 HAHA가 생산되지 않는 항체를 개발함으로써 현재 치료 곤란한 고형 종양을 비롯한 각종 악성 종양의 예방 또는 치료제를 제공하는 것에 있다.
상술한 바와 같이, A33 항원을 표적으로 한 항체는 항종양제로서 적용하는 데 적절하다고 생각된다. 또한, HAHA가 생산되지 않는 항체이면, 더욱 높은 항종양 효과가 얻어질 가능성이 있다. 따라서, 본 발명자들은 A33에 대한 항체의 제조에 대하여 예의 연구한 결과, A33을 발현하는 암 세포에 대하여 항종양 효과를 나타내는 모노클로날 항체의 취득에 성공하고, 또한 상기 모노클로날 항체의 가변 영역의 서열을 특정하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
본 발명은 그의 제1 양태에 있어서, 마우스-마우스 하이브리도마에 의해 생산되는 A33과 결합하는 모노클로날 항체, 예를 들면 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA에 의해 생산되는, 바람직하게는 인간 항체인 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 타입은 인간 면역 글로불린 G(IgG)형이다. 상술한 하이브리도마 중 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA는 2004년 8월 24일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센타(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1 쪼메 1 반지 1 주오 다이 6)에 각각 순서대로 수탁 번호 FERM BP-10107(식별을 위한 표시: M10), FERM BP-10106(식별을 위한 표시: M165), FERM BP-10108(식별을 위한 표시: M96), FERM BP-10109(식별을 위한 표시: N26), FERM BP-10104(식별을 위한 표시: Q47), FERM BP-10105(식별을 위한 표시: Q54) 및 FERM BP-10103(식별을 위한 표시: R5)로서 기탁되어 있다.
본 발명의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 상기 하이브리도마가 생산하는 항체의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서브클래스가 개변된 항체도 포함하고, 하이브리도마 263A17이 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 125M10AA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 125M165DAAA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능 단편, 하이브리도마 125M96ABA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 125N26F6AA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 125Q47BA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 125Q54AAAA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 lgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 또는 하이브리도마 125R5AAAA가 생산하는 항체이며 서브클래스가 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 하이브리도마 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA가 생산하는 항체의 가변 영역을 포함하는, A33과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다.
본 발명의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 23 및 25로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 27 및 29로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 31 및 33에 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 35 및 37로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 39 및 41로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 43 및 45로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 47 및 49로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 51 및 53로 나타내어지는 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 87 및 89로 나타내어지는 아미노산 서열의 전체 영역을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명은 또다른 양태에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편이며 종양(예를 들면 누드 마우스에 이식된 대장암 세포주 COL0205 세포에서 유래하는 것)의 증식을 억제하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 종양 억제시, 종양을 담지하는 피검 동물(예를 들면 결장암 세포 담암 마우스 모델 등의 담암 실험 동물, 체중 20 g으로 함)에 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여하는 양은 10 ㎍/마리 내지 100 ㎍/마리이다. 예를 들면, 투여량으로서 100 ㎍/마리 또는 5 mg/kg, 바람직하게는 10 ㎍/마리 또는 0.5 mg/kg을 들 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 있어서 본 발명의 항체는 하기 중 어느 하나의 특성을 갖는다.
(a) ADCC 시험
정상 인간 말초혈 유래 단핵구 존재하에서 A33을 발현하는 인간 암 세포에 대하여 항체 의존적 세포성 세포 장해 활성(ADCC)을 나타낸다.
(b) CDC 시험
인간 혈청 유래 보체 존재하에서 A33을 발현하는 인간 암 세포에 대하여 보체 의존성 세포 장해 활성(CDC)을 나타낸다.
(c) 생체내 시험
A33을 발현하는 인간 암 세포를 담지한 비인간 동물에 대하여 항종양 효과를 나타낸다.
(d) 경합 시험
키메라 항 A33(하이브리도마 ATCC HB-8779가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함함)와 (i) 강하게 경합함 (블로커(blocker)), (ii) 약하게 경합함 (부분적 블로커) 또는(iii) 경합하지 않음 (논-블로커(non-blocker)).
(e) 면역 조직 화학 시험
인간 성인 결장암 조직, 인간 성인 정상 결장 조직 및 인간 정상 소장 조직을 염색한다.
본 발명은 또다른 양태에 있어서 하이브리도마 125M10AA(수탁 번호 FERM BP-10107), 125M165DAAA(수탁 번호 FERM BP-10106), 125M96ABA(수탁 번호 FERM BP-10108), 125N26F6AA(수탁 번호 FERM BP-10109), 125Q47BA(수탁 번호 FERM BP-10104), 125Q54AAAA(수탁 번호 FERM BP-10105) 및 하이브리도마 125R5AAAA(수탁 번호 FERM BP-10103)로 이루어지는 군에서 선택되는 하이브리도마가 보유하는 항체를 코딩하는 핵산 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질, 상기 핵산을 갖는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 갖는 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 포유 동물 세포 및 식물 세포 및 포유 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주를 제공한다.
본 발명은 또다른 양태에 있어서 하이브리도마 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 하이브리도마 125R5AAAA로 이루어지는 군에서 선택되는 하이브리도마로부터 항 A33 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자, 예를 들면 중쇄 아미노산 서열의 가변 영역을 코딩하는 유전자 및 경쇄 아미노산 서열의 가변 영역을 코딩하는 유전자를 단리하여 상기 유전자를 갖는 발현 벡터를 구축하고, 상기 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 숙주를 배양하며, 상기 모노클로날 항체를 발현시켜 얻어지는 숙주, 숙주의 배양 상청액 또는 숙주의 분비물 등의 배양물로부터 항 A33 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 채취하는 것을 포함하는, 항 A33 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또다른 양태에 있어서 상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 함유하는 종양의 예방, 치료 또는 진단제를 제공한다.
예방 또는 치료 가능한 종양으로서, 대장암, 결장암, 직장암, 위암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 신장 세포암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 전립선암, 고환암, 중피암으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 들 수 있다.
본 발명의 또다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은, COL0205 세포가 이식된 담암 누드 마우스에 있어서, 종양 이식 후에 상기 항체 또는 그의 기능적 단편의 투여량 10 또는 100 ㎍/마리로, 비히클 투여군 또는 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 유의하게 종양의 억제가 확인되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 하이브리도마 M10(수탁 번호: FERM BP-10107)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체, 하이브리도마 M96(수탁 번호: FERM BP-10108)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체, 하이브리도마 M165(수탁 번호: FERM BP-10106)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체, 하이브리도마 N26(수탁 번호: FERM BP-10109)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체, 하이브리도마 Q47(수탁 번호: FERM BP-10104)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체, 하이브리도마 Q54(수탁 번호: FERM BP-10105)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체, 및 하이브리도마 R5(수탁 번호: FERM BP-10103)에 의해 생산되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 에피토프를 인식하는 A33에 결합하는 항체이다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2004-259090호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1A는 각 모노클로날 정제 항체를 이용하여 COL0205 세포를 표적으로 하였을 때의 ADCC 활성을 나타낸 도면이다.
도 1B는 각 모노클로날 정제 항체를 이용하여 COL0205 세포를 표적으로 하였을 때의 CDC 활성을 나타낸 도면이다.
도 1C는 각 모노클로날 정제 항체를 이용하여 NCI-H508 세포를 표적으로 하였을 때의 ADCC 활성을 나타낸 도면이다.
도 1D는 각 모노클로날 정제 항체를 이용하여 NCI-H508 세포를 표적으로 하였을 때의 CDC 활성을 나타낸 도면이다.
도 2A는 재조합 항체를 이용하여 COL0205 세포를 표적으로 하였을 때의 ADCC 활성을 나타낸 도면이다.
도 2B는 재조합 항체를 이용하여 COL0205 세포를 표적으로 하였을 때의 CDC 활성을 나타낸 도면이다.
도 2C는 재조합 항체를 이용하여 NCI-H508 세포를 표적으로 하였을 때의 ADCC 활성을 나타낸 도면이다.
도 2D는 재조합 항체를 이용하여 NCI-H508 세포를 표적으로 하였을 때의 CDC 활성을 나타낸 도면이다.
도 3A는 정제 항체 및 재조합 항체에 의한 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3B는 정제 항체 및 재조합 항체에 의한 웨스턴 블롯 해석의 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 정제 항체 및 재조합 항체에 의한 인간 결장암 조직의 면역 조직 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 정제 항체 및 재조합 항체에 의한 인간 정상 소장 조직의 면역 조직 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 정제 항체 및 재조합 항체에 의한 인간 정상 결장 조직의 면역 조직 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 7A는 COL0205 세포를 이식하였을 때의 마우스 담암 모델에 대한 재조합 항체 cA33 및 rec263의 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 7B는 NCI-H508 세포를 이식하였을 때의 마우스 담암 모델에 대한 재조합 항체 cA33 및 rec263의 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 7C는 COL0205 세포를 이식하였을 때의 마우스 담암 모델에 대한 하이브리도마 정제 항체 125M10AA, 125M165DAAA 및 125M96ABA의 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 7D는 NCI-H508 세포를 이식하였을 때의 마우스 담암 모델에 대한 재조합 항체 recN26 및 recM165의 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 7E는 NCI-H508 세포를 매트리겔(Matrigel)과 함께 이식하였을 때의 마우스 담암 모델에 대한 재조합 항체 recN26 및 recM165의 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
도 7F는 NCI-H508 세포를 매트리겔과 같이 이식하였을 때의 마우스 담암 모델에 대한 재조합 항체 recM10 및 recQ54의 항종양 효과를 나타낸 도면이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
A33에 대하여 이미 마우스 항 A33 항체 및 인간화 항 A33 항체가 취득되었고, 마우스 항 A33 항체(문헌[Welt S. et al., J. Clinical Oncology(1994), 12, 1561-1571]: 문헌[Welt S. et al., J. Clinical Oncology(1996), 14, 1787-1797] 참조) 또는 인간화 A33 항체(문헌[Welt S. et al., Clinical Cancer Res. (2003), 9, 1338-1346]; 문헌[Welt S. et al., Clinical Cancer Res. (2003), 9, 1347-1353] 참조)를 이용하여 결장암 환자를 대상으로 한 제1상의 임상 시험을 실시한 것도 보고되었다. 그러나, 매우 높은 확률로 HAMA 또는 HAHA가 항체 투여 환자에 생산되어, 그 후의 임상 시험에는 이르지 못하였다. 한편, 매우 흥미롭게도, 인간화 항 A33 항체의 임상 시험에서 종양 반응성이 확인된 환자는 HAHA의 생산이 확인되지 않았다.
본 발명의 신규 인간 항 A33 모노클로날 항체는 완전 인간 항체이고, 마우스 항체 또는 인간화 항체에서 항상 문제가 되는 마우스의 서열로 이루어지는 부분에 대한 항원성에 대해서는 이미 회피되었다. 즉, 상술한 임상 시험의 보고에서는 인 간화 항체를 이용하였기 때문에 HAHA가 생산되었지만, 본 발명의 신규 인간 항 A33 모노클로날 항체는 완전 인간 항체이기 때문에 항체의 항원성이 회피되고, HAHA가 생산되지 않기 때문에 결장암 환자에 대하여 높은 항종양 효과를 기대할 수 있다.
상기 항체의 클래스로서는 면역 글로불린 G(IgG), 동 A(IgA), 동 E(IgE) 및 동 M(IgM)이 이용되지만, 바람직하게는 IgG이다. 또한, IgG의 서브클래스로서는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 이용되지만, 바람직하게는 IgG1, IgG2 및 IgG4이고, 더욱 바람직하게는 IgG1이다.
이하, 본 발명에서 사용되는 어구의 의미를 분명히 함으로써 본 발명을 상세히 설명한다.
1. A33 및 그의 항체
본 발명의 항체는 클래스 I의 세포 막 단백질로 Ig 수퍼패밀리의 하나인 A33에 대한 항체이다.
본 발명에 있어서의 「A33과 결합하는 항체」란, A33 또는 그의 일부에 반응성을 갖는 항체, 또는 A33 또는 그의 일부를 인식하는 항체이다. 「기능적 단편」이란, 항체의 일부분(부분 단편)으로서 항체의 항원에의 작용을 하나 이상 유지하는 것을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 디술피드 결합 Fv, 1본쇄 Fv(scFv) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다[D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd]. 또는, 「기능적 단편」은 항체의 단편이며 항원과 결합할 수 있는 단편이다.
본 발명에서 「인간 항체」란, 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다. 인간 항체는 후술하는 바와 같이 인간 항체 유전자좌를 도입하여, 인간 유래 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 동물에게 항원을 투여함으로써 얻을 수 있다. 상기 트랜스제닉 동물로서 마우스를 들 수 있고, 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 작출 방법은, 예를 들면 국제 공개 WO02/43478호 공보에 기재되어 있다.
본 발명의 항체로서는, 예를 들면 후술하는 실시예에 기재된, A33을 발현하는 암 세포에 대하여 저농도로 항종양 효과를 나타내는 각종 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항체에는 항체를 구성하는 중쇄 및/또는 경쇄 각각의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄로 이루어지는 모노클로날 항체도 포함된다. 본 발명의 항체의 아미노산 서열 중에, 상기와 같은 아미노산의 부분적 개변(결실, 치환, 삽입, 부가)은 그 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 부분적으로 개변함으로써 도입할 수 있다. 이 염기 서열의 부분적 개변은 기지의 부위 특이적 변이 도입법(site specific mutagenesis)를 이용하여 통상법에 의해 도입할 수 있다(문헌[Proc Natl Acad Sci USA., 1984 Vol 81: 5662]). 여기서, 항체란, 면역 글로불린을 구성하는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역, 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄의 불변 영역을 포함하는 모든 영역이 면역 글로불린을 코딩하는 유전자에서 유래하는 면역 글로불린이다.
본 발명의 항체는 모든 면역 글로불린 클래스 및 이소형을 갖는 항체도 포함 한다.
본 발명의 항 A33 항체는 하기와 같은 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면 A33, 그의 일부 또는 그의 일부와 항원의 항원성을 높이기 위한 적당한 캐리어 물질(예를 들면, 소혈청 알부민 등)과의 결합물을, 필요에 따라서 면역 부활제(프로인드(Freund)의 완전 또는 불완전 어쥬번트 등)와 함께 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스 등의 비인간 포유 동물에게 면역시킨다. A33은 천연의 A33나 재조합 A33도 이용할 수도 있다. 또는, A33을 코딩하는 유전자를 도입하여, A33을 세포 표면에 과잉으로 발현하는 동물 세포를 투여함으로써 면역 감작을 행할 수 있다. 모노클로날 항체는, 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 자기 항체 생산능이 없는 골수종계 세포(미엘로마 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양하고, 면역에 이용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 취득할 수 있다.
본 발명의 항체는 당업자에게 주지된 유전자 공학적 개변(예를 들면, 유럽 특허 EP314161 공보를 참조할 것)에 의해 다른 서브클래스의 것으로 변환된 것도 포함한다. 즉, 본 발명의 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 이용하여 유전자 공학적 수법을 이용하여 원래의 서브클래스와는 다른 서브클래스의 항체를 얻을 수 있다. ADCC는 대식세포, NK 세포, 호중구 등의 표면에 발현된 Fc 수용체를 통해 항체의 불변 영역과 결합함으로써 세포를 인식하고, 인식된 세포가 활성화함으로써 유도되는, 세포 장해 활성을 말한다. 한편, CDC는 항체가 항원과 결합함으로써 활성화된 보체계에 의해 야기되는 세포 장해 활성을 말한다. 이들 활성은 항체의 서 브클래스에 따라서 그 활성의 강약이 다른 것으로 알려져 있고, 그것은 항체의 불변 영역의 구조 차이에서 기인하는 것을 알았다(문헌[Charles A. Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.]). 예를 들면, 본 발명의 항체의 서브클래스를 IgG2 또는 IgG4로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 낮은 항체를 취득할 수 있다. 반대로, 본건 발명의 항체의 서브클래스를 IgG1 또는 IgG3으로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 높은 항체를 취득할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 불변 영역의 아미노산 서열을 유전자 공학적으로 개변하는 것, 또는 그와 같은 서열을 갖는 불변 영역 서열과 결합함으로써 Fc 수용체에 대한 결합도를 변화시키는 것(문헌[Janeway CA. Jr. and Travers P.(1997), Immunobiology, Third Edition, Current Biology Ltd./Garland Publishing Inc.] 참조), 또는 보체에 대한 결합도를 변화시키는 것(문헌[Mi-Hua Tao, et al. 1993. J. ExP. Med] 참조)은 가능하다. 예를 들면, 중쇄 정상 부분의 EU 넘버링 시스템(문헌[Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242]를 참조)에 있어서의 331번째의 프롤린(P)을 코딩하는 서열 CCC를 세린(S)을 코딩하는 TCC로 변이시켜 프롤린을 세린으로 치환함으로써 보체에 대한 결합도를 변화시킬 수 있다. 만일 항암제에 대하여 생각하는 경우, 항체 단독에서 세포사멸 유도 활성이 없는 경우에는, Fc 수용체를 통한 항체 의존성 세포 장해 활성(ADCC)이나 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC)에 의한 항종양 활성을 갖는 항체가 바람직하지만, 항체 단독에 세포사멸 유도 활성이 있는 경우에는 Fc 수용체와의 결합도가 낮은 항체가 보다 바람직한 경우도 있다. 또한, 면역 억제제 에 대하여 생각하는 경우, T 세포와 항원 제시 세포의 결합만을 입체적으로 저해하는 경우 등 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 갖지 않는 항체가 바람직하다. 또한, ADCC 활성 또는 CDC 활성이 독성의 원인이 될 수 있는 경우, 독성의 원인이 되는 활성을 Fc 부분의 변이 또는 서브클래스를 변경함으로써 회피한 항체가 바람직한 경우도 있다.
본 발명에 있어서 모노클로날 항체의 제조에 있어서는 하기의 작업 공정을 포함한다. 즉, (1) 면역원으로서 사용하는, 생체 고분자의 정제 및/또는 항원 단백질을 세포 표면에 과잉으로 발현하는 세포의 제조, (2) 항원을 동물에게 주사함으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하여 그의 항체가를 검정하여 비장 등의 적출 시기를 결정하고 나서 항체 생산 세포를 제조하는 공정, (3) 골수종 세포(미엘로마)의 제조, (4) 항체 생산 세포와 미엘로마와의 세포 융합, (5) 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마군의 선별, (6) 단일 세포 클론에의 분할(클로닝), (7) 경우에 따라서는 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육, (8) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 및 그의 인식 특이성 검토, 또는 표지 시약으로서의 특성 검정 등이다.
A33에는 다형(多型)이 존재하지만, 본 발명의 항체는 현재 알려져 있는 모든 A33 다형을 인식하여 결합하기 때문에, 환자가 갖는 A33 형에 대한 차이에 관계없이 본 발명의 항체를 포함하는 치료 예방제는 효과적으로 작용한다.
이하, 항 A33 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정에 따라서 상술하지만, 상기 항체의 제조법은 이것으로 제한되지 않고, 예를 들면 비장세포 이외의 항체 생산 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.
(1) 항원의 정제
항원으로서는, A33을 코딩하는 DNA를 동물 세포용 발현 벡터에 조립하고, 상기 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여, 취득한 형질 전환주 그 자체를 사용할 수 있다. 단, A33의 단백질의 일차 구조는 공지되어 있기 때문에[Gen Bank accession No. NP_005305, 서열 12], 당업자에게 주지된 방법에 의해 A33의 아미노산 서열로부터 펩티드를 화학 합성하고, 이것을 항원으로서 사용할 수도 있다.
또한, 면역원으로서는, A33의 전장을 FM3A 세포 또는 L929 세포에 도입하여 세포 표면에 A33을 과잉으로 발현하는 세포도 효과적이다. pΔEGFP-N1-A33은 A33 단백질을 코딩하는 DNA를 동물 세포용 발현 벡터 pΔEGFP-N1(개변 pEGFP-N1[벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사(Becton Dickinson Bioscience Clontech) 제조]의 EGFP 단백질을 코딩하는 영역을 삭제함)에 조립함으로써 제조할 수 있다. 단, A33을 코딩하는 DNA, 벡터, 숙주 등은 이들로 한정되지 않는다.
구체적으로는, pΔEGFP-N1-A33으로 FM3A 세포 또는 L929 세포를 형질 전환하여 얻어진 형질 전환주를 배양하고, pΔEGFP-N1 벡터가 삽입된 세포에 획득되는 네오마이신 내성 형질 및 마우스 A33 항체(ATCC No. HB-8779)를 이용한 A33 발현의 확인을 지표로, A33을 그 세포 표면에 과잉으로 발현하는 FM3A 세포 또는 L929 세포를 제조할 수 있다.
(2) 항체 생산 세포의 제조
공정(1)에서 얻어진 항원과 프로인드의 완전 또는 불완전 어쥬번트 또는 칼리명반(황산알루미늄칼륨)과 같은 보조제를 혼합하여, 면역원으로서 실험 동물에게 면역시킨다. 실험 동물로서는, 인간 유래의 항체를 생산하는 능력을 갖는 트랜스제닉 마우스가 가장 바람직하게 이용되지만, 그와 같은 마우스는 도미즈카 등의 문헌[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97: 722]에 기재되어 있다.
마우스 면역시의 면역원 투여법은 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 족척(足蹠) 주사 등 어느 것일 수도 있지만, 복강내 주사, 족척 주사 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
면역은 1회 또는 적당한 간격으로(바람직하게는 2주간 내지 4주간 간격으로) 복수회 반복하여 행할 수 있다. 그 후, 면역시킨 동물의 혈청 중의 항원에 대한 항체가를 측정하여, 항체가가 충분히 높아진 동물을 항체 생산 세포의 공급원으로서 이용하면, 이후의 조작 효과를 높일 수 있다. 일반적으로는, 최종 면역 후 3 내지 5일 후의 동물 유래의 항체 생산 세포를 이후의 세포 융합에 이용하는 것이 바람직하다.
여기서 사용되는 항체가의 측정법으로서는, 방사성 동위 원소 면역 정량법(이하, 「RIA법」이라 함), 고상 효소 면역 정량법(이하, 「ELISA법」이라 함), 형광 항체법, 수신(受身) 혈구 응집 반응법 등 다양한 공지 기술을 들 수 있지만, 검출 감도, 신속성, 정확성 및 조작의 자동화 가능성 등의 관점에서 RIA법 또는 ELISA법이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들면 ELISA법에 따르면, 이하에 기재하는 것과 같은 순서에 의해 행할 수 있다. 우선, 인간 항체에 대한 항원을 ELISA용 96웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되지 않은 고상 표면을 항원과 무관계한 단백질, 예를 들면 소혈청 알부민(BSA)에 의해 피복하고, 상기 표면을 세정 후, 1차 항체로서 단계 희석한 시료(예를 들면 마우스 혈청)에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 항 A33 항체를 결합시킨다. 또한, 이차 항체로서 효소 표지된 인간 항체에 대한 항체를 첨가하여 인간 항체에 결합시키고, 세정 후 상기 효소의 기질을 첨가하여, 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도 변화 등을 측정함으로써 항체가를 산출한다.
(3) 미엘로마의 제조 공정
미엘로마로서는, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유 동물에서 유래하는 자기 항체 생산능이 없는 세포를 이용할 수 있지만, 일반적으로는 마우스로부터 얻어진 주화 세포, 예를 들면 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 미엘로마주 P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton, D. E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)], P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler, G, et al. European J. Immunology, 6, 511-519(1976)], Sp2/0-Ag14(SP-2)[Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270(1978)], P3X63Ag8.653(653)[Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550(1979)], P3X63Ag8(X63)[Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497(1975)] 등을 이용하는 것이 바람직하다. 이들 세포주는 적당한 배지, 예를 들면 8-아자구아닌 배지[글루타민, 2-메르캅토에탄 올, 겐타마이신 및 소태아 혈청(이하, 「FCS」라 함)을 첨가한 RPMI-1640 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; 이하, 「IMDM」이라 함), 또는 둘베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; 이하, 「DMEM」이라 함)에서 계대 배양하지만, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지(예를 들면, 10 ％ FCS를 포함하는 DMEM 배지)에서 계대 배양하여, 융합 당일에 2×107 이상의 세포수를 확보해둔다.
(4) 세포 융합
항체 생산 세포는 형질 세포 및 그의 전구 세포인 림프구이고, 이것은 개체의 모든 부위로부터 얻을 수 있고, 일반적으로는 비장, 림프절, 골수, 편도, 말초혈, 또는 이들을 적절하게 조합한 것 등으로부터 얻을 수 있지만, 비장세포가 가장 일반적으로 이용된다.
최종 면역 후, 소정의 항체가가 얻어진 마우스로부터 항체 생산 세포가 존재하는 부위, 예를 들면 비장을 적출하여 항체 생산 세포인 비장세포를 제조한다. 이어서, 비장세포와 미엘로마를 융합시킬 수 있다. 이 비장세포와 공정(3)에서 얻어진 미엘로마를 융합시키는 수단으로서 현재 가장 일반적으로 행해지고 있는 것은, 세포 독성이 비교적 적으며 융합 조작도 간단한 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 방법이다. 이 방법은, 예를 들면 이하의 순서로 이루어진다.
비세포와 미엘로마를 무혈청 배지(예를 들면, DMEM) 또는 인산 완충 생리 식염액(이하, 「PBS」라 함)으로 잘 세정하고, 비장세포와 미엘로마의 세포수의 비가 5:1 내지 10:1 정도가 되도록 혼합하여 원심 분리한다. 상청액을 제거하고, 침전된 세포군을 잘 풀어준 후, 교반하면서 1 mL의 50 ％(w/v) 폴리에틸렌글리콜(분자량 1000 내지 4000)을 포함하는 무혈청 배지를 적하한다. 그 후, 10 mL의 무혈청 배지를 천천히 첨가한 후 원심 분리한다. 다시 상청액을 버리고, 침전된 세포를 적량의 히포크산틴 아미노프테린 티미딘(이하,「HAT」라 함)액 및 인간 인터루킨 6(이하, 「IL-6」이라 함)을 포함하는 정상 배지(이하, 「HAT 배지」라 함) 중에 현탁하여 배양용 플레이트(이하, 「플레이트」라 함)의 각 웰에 분주하고, 5 ％ 탄산 가스 존재하에 37 ℃에서 2주간 정도 배양한다. 도중에 적절하게 HAT 배지를 보충한다.
(5) 하이브리도마군의 선택
상기 미엘로마 세포가 8-아자구아닌 내성주인 경우, 즉 히포크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT) 결손주인 경우, 융합하지 않은 상기 미엘로마 세포 및 미엘로마 세포끼리의 융합 세포는 HAT 함유 배지 중에서는 생존할 수 없다. 한편, 항체 생산 세포끼리의 융합 세포, 또는 항체 생산 세포와 미엘로마 세포와의 하이브리도마는 생존할 수 있지만, 항체 생산 세포끼리의 융합 세포에는 수명이 있다. 따라서, HAT 함유 배지 중에서의 배양을 계속함에 따라서, 항체 생산 세포와 미엘로마 세포와의 융합 세포인 하이브리도마만이 살아남고, 결과적으로 하이브리도마를 선택할 수 있다.
콜로니상으로 생육해 온 하이브리도마에 대하여, HAT 배지로부터 아미노프테린를 제거한 배지(이하, 「HT 배지」라 함)로의 배지 교환을 행한다. 이후, 배양 상청액의 일부를 채취하여, 예를 들면 ELISA법에 의해 항 A33 항체가를 측정한다. 단, ELISA용 항원으로서 상기 융합 단백질을 이용하는 경우에는, 인간 IgG의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 클론을 선택하지 않도록, 상기 클론을 제거하는 조작이 필요하다. 그와 같은 클론의 유무는, 예를 들면 인간 IgG의 Fc 영역을 항원으로 한 ELISA 등에 의해 확인할 수 있다.
이상, 8-아자구아닌 내성의 세포주를 이용하는 방법을 예시하였지만, 그 밖의 세포주도 하이브리도마의 선택 방법에 따라서 사용할 수 있고, 그 경우에 사용하는 배지 조성도 변화된다.
(6) 클로닝 공정
(2)에 기재된 것과 동일한 방법으로 항체가를 측정함으로써, 특이적 항체를 생산하는 것이 판명된 하이브리도마를 다른 플레이트에 옮겨 클로닝을 행한다. 이 클로닝법으로서는, 플레이트 1웰에 1개의 하이브리도마가 포함되도록 희석하여 배양하는 한계 희석법, 아가로스 배지 중에서 배양하여 콜로니를 회수하는 연한천법, 마이크로매니퓰레이터에 의해 1개씩 세포를 취출하여 배양하는 방법, 셀 소터(cell sorter)에 의해 1개의 세포를 분리하는 「소터 클론」 등을 들 수 있지만, 한계 희석법이 간편하여 자주 이용된다.
항체가가 확인된 웰에 대하여, 예를 들면 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 내지 4회 반복하고, 안정적으로 항체가가 확인된 것을 항 A33 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.
또한, 본 발명의 인간 항 A33 모노클로날 항체의 생산 세포인 마우스-마우스 하이브리도마 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA는 평성 16년 8월 24일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1 쪼메 1 반지 1 주오 다이 6)에 각각 순서대로 수탁 번호 FERM BP-10107(식별을 위한 표시: M10), FERM BP-10106(식별을 위한 표시: M165), FERM BP-10108(식별을 위한 표시: M96), FERM BP-10109(식별을 위한 표시: N26), FERM BP-10104(식별을 위한 표시: Q47), FERM BP-10105(식별을 위한 표시: Q54) 및 FERM BP-10103(식별을 위한 표시: R5)로서 기탁되어 있다.
(7) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 제조
클로닝을 완료한 하이브리도마는 배지를 HT 배지로부터 정상 배지로 바꾸어 배양된다. 대량 배양은 대형 배양병을 이용한 회전 배양, 스피너 배양 또는 홀로파이버 시스템 등을 이용한 배양으로 행해진다. 이 대량 배양에 있어서의 상청액을 겔 여과 등 당업자에 주지된 방법을 이용하여 정제함으로써 항 A33 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 동일 계통의 마우스(예를 들면 BALB/c) 또는 nu/nu 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복강내에서 상기 하이브리도마를 증식시킴으로써, 항 A33 모노클로날 항체를 대량으로 포함하는 복수(復水)를 얻을 수 있다. 간편한 정제 방법으로서는, 시판용 모노클로날 항체 정제 키트(예를 들면, MAbTrap GII 키트; 아마샴 파마시아 바이오테크사 제조) 등을 이용할 수도 있다.
이렇게 얻어지는 모노클로날 항체는 A33에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.
(8) 모노클로날 항체의 검정
이렇게 얻어진 모노클로날 항체의 이소형 및 서브클래스의 결정은 이하와 같이 행할 수 있다. 우선, 동정법으로서는 오크텔로니(0uchterlony)법, ELISA법 또는 RIA법을 들 수 있다. 오크텔로니법은 간편하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다. 한편, ELISA법 또는 RIA법을 이용한 경우에는, 배양 상청액을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 또한 이차 항체로서 각종 면역 글로불린 이소형, 서브클래스에 대응하는 항체를 이용함으로써 모노클로날 항체의 이소형, 서브클래스를 동정하는 것이 가능하다.
또한, 단백질의 정량은 폴린 로우리(Folin-Lowry)법 및 280 nm에서의 흡광도[1.4(OD280)=면역 글로불린 1 mg/mL]로부터 산출하는 방법 등에 의해 행할 수 있다.
모노클로날 항체의 인식 에피토프의 동정은 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 우선, 모노클로날 항체가 인식하는 분자의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조에 있어서는, 공지된 올리고펩티드 합성 기술을 이용하여 그 분자의 다양한 부분 펩티드를 제조하는 방법, 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 바람직한 발현 플라스미드에 조립하여, 대장균 등의 숙주내외에서 생산하는 방법 등이 있지만, 상기 목적을 위해서는 양자(兩者)를 조합하여 이용하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 항원 단백질의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 차례로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에 주지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조한 후, 이들에 대한 모노클로날 항체의 반응성을 검토하여 대략적인 인식 부위를 결정한다.
그 후, 더욱 미세하게, 그 대응 부분의 올리고펩티드, 또는 상기 펩티드의 변이체 등을 당업자에게 주지된 올리고펩티드 합성 기술을 이용하여 다양하게 합성하여, 본 발명의 예방 또는 치료제가 유효 성분으로서 함유하는 모노클로날 항체의 그들 펩티드에 대한 결합성을 조사하거나, 또는 상기 모노클로날 항체와 항원과의 결합에 대한 펩티드의 경합 저해 활성을 조사함으로써 에피토프를 한정한다. 다종의 올리고펩티드를 얻기 위한 간편한 방법으로서, 시판용 키트(예를 들면, SPOTs 키트(제노시스 바이오테크놀로지즈사 제조), 멀티 핀 합성법을 이용한 일련의 멀티 핀 펩티드 합성 키트(카이론사 제조) 등)을 이용할 수도 있다.
또한, 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 인간 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주(예를 들면 포유류 세포주, 대장균, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입하여, 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산시킨 재조합 항체를 제조할 수도 있다(문헌[P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS]).
본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마가 보유하는 항체의 유전자 서열을 포함하는 핵산, 특히 후술하는 본 발명의 하이브리도마가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 핵산도 포함한다. 여기서, 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함된다.
하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 제조하기 위해서는, 모노클로날 항체의 L쇄 V 영역, L쇄 C 영역, H쇄 V 영역 및 H쇄 C 영역을 각각코딩하는 DNA를 PCR법 등에 의해 제조하는 방법이 채용된다. 프라이머는 항 A33 항체 유전자 또는 아미노산 서열로부터 설계한 올리고 DNA를, 주형으로서는 하이브리도마로부터 제조한 DNA를 사용할 수 있다. 이들 DNA를 하나의 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주에 도입하여 발현시키거나, 또는 이들 DNA를 각각 적당한 벡터에 조립하여 공발현시킨다.
벡터에는, 숙주 미생물에서 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 플라스미드 DNA로서는 대장균, 고초균 또는 효모 유래의 플라스미드 등을 들 수 있고, 파지 DNA로서는 λ 파지를 들 수 있다.
형질 전환에 사용되는 숙주로서는, 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 세균(대장균, 고초균 등), 효모, 동물 세포(COS 세포, CH0 세포 등), 곤충 세포를 들 수 있다.
숙주에의 유전자의 도입 방법은 공지되어 있고, 임의의 방법(예를 들면 칼슘이온을 이용하는 방법, 전기 천공법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등)을 들 수 있다. 또한, 후술하는 동물에게 유전자를 도입하는 방법으로서는, 마이크로인젝션법, ES 세포에 전기 천공이나 리포펙션법을 사용하여 유전자를 도입하는 방법, 핵 이식법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 항 A33 항체는 형질 전환체를 배양하여 그의 배양물로부터 채취 함으로써 얻을 수 있다. 「배양물」이란, (a) 배양 상청액, (b) 배양 세포 또는 배양 균체 또는 그의 파쇄물, (c) 형질 전환체의 분비물을 모두 의미한다. 형질 전환체를 배양하기 위해서는, 사용되는 숙주에 적합한 배지를 이용하여 정치 배양법, 롤러보틀에 의한 배양법 등이 채용된다.
배양 후, 목적 단백질이 균체내 또는 세포내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 항체를 채취한다. 또한, 목적 항체가 균체밖 또는 세포밖에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 단리 정제에 이용되는 각종 크로마토그래피를 이용한 일반적인 생화학적 방법을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 이용함으로써, 상기 배양물 중에서 목적하는 항체를 단리 정제할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물 제조 기술을 이용하여, 목적 항체의 유전자가 내재성유전자에 조립된 동물 숙주, 예를 들면 트랜스제닉 소, 트랜스제닉 염소, 트랜스제닉 양 또는 트랜스제닉 돼지를 제조하고, 그 트랜스제닉 동물로부터 분비되는 유즙 중에서 그 항체 유전자에서 유래하는 모노클로날 항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다(문헌[Wright, G., et al. (1991) Bio/Technology 9, 830-834]). 하이브리도마를 시험관내에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구의 목적 및 배양 방법 등의 여러 조건에 따라서 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청액 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위해서 이용되는 것과 같은 기지의 영양 배지, 또는 기지의 기본 배지로부터 유도 제조되는 모든 영양 배지를 이용하여 실시하는 것이 가능하다.
(9) 항체의 성질
본 발명의 항체는 하기 중 어느 하나의 특성을 갖는다.
(a) ADCC 시험
정상 인간 말초혈 유래 단핵구 존재하에서 A33을 발현하는 인간 암 세포에 대하여 항체 의존적 세포성 세포 장해 활성(ADCC)을 나타낸다.
(b) CDC 시험
인간 혈청 유래 보체 존재하에서 A33을 발현하는 인간 암 세포에 대하여 보체 의존성 세포 장해 활성(CDC)을 나타낸다.
(c) 생체내 시험
A33을 발현하는 인간 암 세포를 담지한 비인간 동물에 대하여 항종양 효과를 나타낸다.
(d) 경합 시험
키메라 항 A33(하이브리도마 ATCC HB-8779가 생산하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과, 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함함)와 (i) 강하게 경합함 (블로커), (ii) 약하게 경합함 (부분적 블로커) 또는(iii) 경합하지 않음 (논-블로커).
(e) 면역 조직 화학 시험
인간 성인 결장암 조직, 인간 성인 정상 결장 조직 및 인간 정상 소장 조직을 염색한다.
이러한 항체로서, 예를 들면 하이브리도마 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 하이브리도마 125R5AAAA가 생산하는 항체를 들 수 있고, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA는 2004년 8월 24일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1 쪼메 1 반지 1 주오 다이 6)에 각각 순서대로 수탁 번호 FERM BP-10107(식별을 위한 표시: M10), FERM BP-10106(식별을 위한 표시: M165), FERM BP-10108(식별을 위한 표시: M96), FERM BP-10109(식별을 위한 표시: N26), FERM BP-10104(식별을 위한 표시: Q47), FERM BP-10105(식별을 위한 표시: Q54) 및 FERM BP-10103(식별을 위한 표시: R5)로서 기탁되어 있다.
2. 의약 조성물
본 발명의 인간 항 A33 항체를 함유하는 제제도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 제제는 바람직하게는 항체에 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 캐리어를 더 포함하고, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수도 있다. 적절한 캐리어에는, 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코스액 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또는, 항체는 동결 건조시켜, 필요할 때에 상기와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성하여 사용할 수도 있다. 이러한 예방 또는 치료제는 다양한 형태로 투여할 수 있고, 이들의 투여 형태로서는, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구 투여, 또는 주사제, 점적제, 좌약 등에 의한 비경구 투여를 들 수 있다.
그의 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상적으로 경구 투여에서는, 성인에 대하여 1일 약 0.01 mg 내지 1000 mg이고, 이들을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여에서는, 1회 약 0.01 mg 내지 1000 mg을 피하 주사, 근육 주사 또는 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 의약 조성물을 이용한 상기 질환의 예방 또는 치료법도 포함하고, 또한 본 발명은 본 발명의 항체의 상기 질환의 예방 또는 치료제의 제조에의 사용도 포함한다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편에 의해 예방 치료가 가능한 종양은 대장암, 결장암, 직장암, 위암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 신장 세포암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 전립선암, 고환암, 중피암 등이고, 본 발명의 항체를 적용할 때의 종양은 1 종류로 한정되지 않고, 복수 종류의 종양이 병발한 것일 수도 있다.
3. 제제예
본 발명의 분자는 물 또는 그 이외의 약리학적으로 허용할 수 있는 용액에 용해시킨 무균성 용액 또는 현탁액의 앰플로서 사용된다. 또한, 무균 분말 제제(본 발명의 분자를 동결 건조시키는 것이 바람직함)를 앰플에 충전해두고, 사용시에 약리학적으로 허용할 수 있는 용액으로 희석할 수도 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 그 실시예에 기재되는 양태로만 한정되지 않는다.
실시예 1 마우스 항 A33 항체의 제조
인간 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝이나 각종 실험에 사용하기 위한 양성 대조군 항체로서, 마우스 항 A33 항체의 제조를 실시하였다. ATCC로부터 마우스 항 A33 항체를 생산하는 AS33 하이브리도마(American Type Culture Collection(ATCC) No. HB-8779)를 구입하여, ATCC의 부속 설명서에 따라서 하이브리도마를 배양하였다. 이 하이브리도마를 동결 보존하였다. 그 후, AS33 하이브리도마를 10 ％ 저-IgG 소 태아 혈청(하이크론사 제조) 함유 eRDF 배지(교쿠토 세이야꾸 제조)에 순화시켰다. 이 순화된 하이브리도마를 동결 보존하였다. 다음에, 그 일부를 항체 정제를 목적으로 소 인슐린(5 ㎍/mI, 기브코 비알엘사 제조), 인간 트랜스페린(5 ㎍/ml, 기브코 비알엘사 제조), 에탄올아민(0.01 mM, 시그마사 제조), 아셀레늄산나트륨(2.5×10-5 mM, 시그마사 제조), 1 ％ 저-IgG 소 태아 혈청(하이크론사 제조) 함유 eRDF 배지(교쿠토 세이야꾸 제조)에 순화시켰다. 플라스크에서 배양하여 배양 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액 중의 하이브리도마 유래 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/mL를 1.4 OD로서 산출하였다.
실시예 2 키메라 항 A33 항체의 제조
인간 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝이나 각종 실험에 사용하기 위한 양성 대조군 항체로서, 중쇄 및 경쇄의 불변 영역이 인간 IgG1인 키메라 항 A33 항체의 제조를 실시하였다.
(1) 키메라 항 A33 항체 유전자의 cDNA 클로닝과 발현 벡터 제조
실시예 1에서 구입한 마우스 항 A33 항체 생산 하이브리도마 AS33을 10 ％ 소 태아 혈청(하이크론사 제조) 함유 DMEM 배지(기브코 비알엘사 제조)에서 배양하고, RNA 추출 시약 ISOGEN(닛본 진사 제조)을 이용하여 프로토콜에 따라서 전체 RNA를 정제하였다. 다음에, 전체 RNA로부터 0ligotex TM-dT30<Super>(다카라바이오사 제조)에 의해 polyA+RNA를 정제하였다. 얻어진 polyA+RNA(2.5 ㎍)를 재료로 하여 SMART RACE cDNA 증폭 키트(벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사)를 이용하여, 그의 첨부 설명서에 따라서 클로닝 실험을 실시하여 항체 유전자의 가변 영역의 cDNA를 취득하였다.
1) 제1 가닥 cDNA의 합성
polyA+RNA(2.5 ㎍)/3 ㎕
5'-CDS 프라이머 1 ㎕
SMART II A oligo 1 ㎕
상기 조성의 반응액을 70 ℃에서 2분간 인큐베이션한 후, 하기의 시약 및 효소를 첨가하여 42 ℃에서 1.5시간 인큐베이션하여 cDNA의 합성을 행하였다.
5X 제1 가닥 완충액 2 ㎕
DTT(20 mM) 1 ㎕
dNTP Mix(10 mM) 1 ㎕
PowerScript 역전사 효소 1 ㎕
반응 종료 후, 100 ㎕의 트리신 완충액을 첨가하여 72 ℃에서 7분간 인큐베 이션하였다.
2) PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭
얻어진 cDNA를 주형으로 하고, 마우스 항 A33 항체의 중쇄(이하, 중쇄는 H쇄라고도 함) 가변 영역 및 경쇄(이하, 경쇄는 L쇄라고도 함) 가변 영역 DNA의 3' 말단 각각에 특이적인 PCR용 프라이머(H쇄용: GPAHvR3Nhe(5'-GCC CTT GGT GCT AGC TGA AGA GAC GGT GAC CAG AGT CCC TTG-3')(서열 1)), L쇄용: GPALvR3Bsi, (5'-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3')(서열 2)) 중 어느 하나와, SMART RACE cDNA 증폭 키트 부속의 UPM 프라이머(합성한 cDNA의 5' 말단에 제조되는 공통 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드)를 프라이머 셋트로서 사용하여, PCR에 의한 H쇄 리더 서열과 가변 영역(이하, HV라고도 함) 및 L쇄 리더 서열과 가변 영역(이하, LV라고도 함)의 증폭을 행하였다. cDNA의 증폭은 KOD-Plus-DNA 중합효소(도요보사 제조)를 이용하여 하기 반응액을 제조하여 실시하였다.
멸균 H2O 29.5 ㎕
cDNA 2.5 ㎕
KOD-Plus-완충액(10X) 5 ㎕
dNTP Mix(2 mM) 4 ㎕
MgSO4(25 mM) 2 ㎕
KOD-Plus-DNA 중합효소(1 unit/㎕) 1 ㎕
범용(universal) 프라이머 A mix(UPM)(10X) 5 ㎕
유전자 특이적 프라이머(GSP) 1 ㎕
총 부피 50 ㎕
열 사이클의 증폭 반응 조건은 하기와 같이 실시하였다.
5 사이클:
94 ℃ 30초
72 ℃ 1분
5 사이클:
94 ℃ 30초
70 ℃ 30초
72 ℃ 1분
25 사이클:
94 ℃ 30초
68 ℃ 30초
72 ℃ 1분
증폭된 PCR 단편은 에탄올 침전으로 회수한 후, 아가로스 겔 전기 영동으로 회수하고, 멤브레인을 이용하는 DNA 정제 키트인 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아겐사 제조)로 정제하였다. 정제한 HV 및 LV의 증폭 단편은 각각 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)의 PCR 4 Blunt-TOPO 벡터에 서브클로닝을 행하여, 얻어진 클론의 플라스미드 DNA에 대하여 인서트 DNA의 염기 서열을 해석하였다. DNA 염기 서열 결정을 위해 프라이머로서 M13FW(5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3')( 서열 3) 및 M13RV(5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3')(서열 4)를 사용하였다. 결정한 HV 및 LV의 유전자 영역 중에 코딩되는 항체의 아미노산 서열은 King D. J. 등이 보고한 마우스 항 A33 항체(문헌[Br J Cancer. 1995 Dec; 72(6): 1364-72]) 가변 영역의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
3) 키메라 항 A33 항체의 발현 벡터(N5KG1_mVhCA33)의 제조
취득한 항체의 HV쇄를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 말단에 연결을 위한 제한 효소 부위를 부가하도록 디자인한 프라이머(증폭을 위한 프라이머 셋트 GPAHv2F5Sal(5'-AGA GAG AGG TCG ACC CAC CAT GAA CTT TGG GCT GAG CTT AGT T-3')(서열 5) 및 프라이머 GPAHvR3Nhe(서열 1))을 이용하여, 마우스 항 A33 항체의 HV를 PCR로 증폭(94 ℃ 3분 → 94 ℃ 10초, 68 ℃ 45초(35 사이클) → 72 ℃ 7분)시켰다. HV의 증폭 단편은 정제한 후, PCR 4 Blunt-TOPO 벡터로 서브클로닝을 행하였다. 서브클론에 대하여 삽입 부분의 DNA 염기 서열 해석을 행하여, 주형으로 한 유전자 서열과 차이가 없는 디자인 그대로의 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 선택하였다. 그 플라스미드 DNA를 제한 효소 SalI와 NheI로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동으로 약 440 bp의 DNA를 회수하여 정제하였다. 한편, 벡터인 N5KG1-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(미국 특허 6001358의 개변 벡터)에 대해서는 동일하게 제한 효소 SalI와 NheI로 처리를 행한 후, 탈인산화 처리로서 알칼라인 포스파타아제(이. 콜라이 C75)(다카라바이오사 제조)로 처리한 후에, 아가로스 겔 전기 영동과 DNA 정제 키트로 약 8.9 kb의 DNA를 회수하였다. 이들 2개의 단편을 DNA 라이게이션 키트 Ver2.1(다카라바이오사 제조)로써 라이게이션 반응시킨 후 , 대장균 DH5α에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 형질 전환체를 스크리닝하여 목적으로 하는 HV가 삽입된 클론, N5KG1_GPA33Hv(클론 #2)를 선택하였다. 이렇게 해서 얻어진 N5KG1_GPA33Hv에 LV를 삽입하기 위해서, 본 플라스미드 DNA를 제한 효소 BglII 및 BsiWI로 차례로 절단하고, 또한 탈인산화를 행한 후, 약 9.2 kb의 벡터 DNA를 정제하였다. 한편, 마우스 항 A33 항체의 LV를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 LV 영역을 PCR로 증폭시켰다. 증폭을 위한 프라이머 셋트는 GPALv2FBg1(5'-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG GCA TCA AGA TGG AGT TTC AG-3')(서열 6) 및 GPALvR3Bsi(서열 2)를 사용하였다. 정제한 LV의 증폭 단편은 PCR 4 Blunt-TOPO로써 서브클로닝을 행하였다. 서브클론에 대하여 삽입 부분의 DNA 염기 서열 해석을 행하여, 주형으로 한 유전자 서열과 차이가 없는 디자인 그대로의 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 선택하였다. 그 DNA를 제한 효소 BglII와 BsiWI로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동으로 약 400 bp의 DNA를 회수하여 정제하였다. 이 DNA를 제한 효소 BglII와 BsiWI 절단 처리한 상기 N5KG1-A33Hv 벡터 단편에 라이게이션하고, 대장균에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 형질 전환체를 스크리닝하여, 목적으로 하는 LV가 삽입된 클론, N5KG1_GPA33HvLv(클론 #2)를 선택하였다. 최종적으로 얻어진 키메라 항 A33 항체 발현 플라스미드 DNA의 대량 정제를 행하여, L쇄와 H쇄의 DNA 단편 삽입 단편과 그 삽입 부위 주변의 DNA 염기 서열에 변이가 없는 것을 확인하였다.
키메라 항 A33의 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다 .
Figure 112007026367397-pct00001
Figure 112007026367397-pct00002
Figure 112007026367397-pct00003
Figure 112007026367397-pct00004
중쇄 핵산 서열(서열 7)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 408번째의 아데닌(A)와 409번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 8)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 136번째의 세린(S)와 137번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 7)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 8)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 키메라 항 A33 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 7)은 58번째의 구아닌(G)로부터 408번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 8)은 20번째의 글루탐산(E)로부터 136번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 9)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 393번째의 아데닌(A)와 394번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 10)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 131번째의 리신(K)와 132번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 9)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 72번째의 아데닌(A)와 73번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 10)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 24번째의 구아닌(G)와 25번째의 아스파라긴산(D) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 키메라 항 A33 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 9)는 73번째의 구아닌(G)로부터 393번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 10)은 25번째의 아스파라긴산(D)로부터 131번째의 리신(K)까지이다.
후술하는 표 5에 합성 DNA의 염기 서열을 나타낸다.
이와 같이 제조된 키메라 항 A33 재조합 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입 하여 재조합 항체 발현 세포를 제조하였다. 발현을 위한 숙주 세포에는, 예를 들면 CHO 세포의 dhfr 결손주(ATCC CRL-9096), CHO-Ras(문헌[Katakura Y., et al., Cytotechnology, 31: 103-109, 1999]), HEK293T(ATCC CRL-11268) 등이 이용된다.
숙주 세포에의 벡터의 도입은 전기 천공법이나 리포펙션 등에 의해 실시하였다. 전기 천공법은 항체 발현 벡터 약 2 ㎍을 제한 효소로 선상화하고, Bio-Rad 전기 천공기를 이용하여 350 V, 500 μF의 조건에서 4×106개의 CHO 세포에 유전자를 도입하고, 96웰 배양 플레이트에 파종하였다. 리포펙션은 Lipofect AMINE Plus(기브코 비알엘사 제조)를 이용하여 메뉴얼에 따라서 실시하였다. 벡터의 도입 처리 후, 발현 벡터의 선택 마커에 대응한 약제를 첨가하여 배양을 계속하였다. 콜로니를 확인한 후, 실시예 6에 나타낸 방법에 의해 항체 발현주를 선별하였다. 선별한 세포로부터의 항체 정제는 실시예 8에 따라서 행하였다.
실시예 3 항원의 제조
면역원이나 항체의 스크리닝 등에서 사용되는 A33이 세포막 상에 과잉 발현되는 세포를 얻기 위해서, A33 전장 아미노산의 발현 플라스미드 벡터를 제조하였다. A33을 코딩하는 DNA는 PCR법에 의해 제조하였다.
a) 전장 A33 발현 벡터의 제조
전장 A33 발현 벡터를 제조하기 위해서, A33을 코딩하는 cDNA를 유지하는 플라스미드 벡터 pΔEGFP-N1-GPA33을 제조하였다. pΔEGFP-N1-GPA33은 이하의 방법 으로 제조되었다. 완전 길이 A33 DNA(GenBank DNA NM_005814: 서열 11, 단백질 NP_005305: 서열 12)의 5' 말단에 EcoRI 서열을, 3' 말단에 NotI 서열과 정지 코돈을 부가하기 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 행하여 수식하였다. 벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사로부터 구입한 인간 결장 Marathon-Ready cDNA를 주형으로 하고, 프라이머로서 A33-F2 5'-GCAGACGAATTCAAGACCATGGTGGGGAAGAT-3'(서열 13) 및 A33-R1 5'-CTCGAGCGGCCGCTCTGCTGCTGGCCTGTCACTGGTCGAGGTG-3'(서열 14)를 합성하며, KOD-plus DNA 중합효소(도요보사 제조)를 사용하여 (94 ℃, 15초; 60 ℃, 30초; 68 ℃, 60초간)×30 사이클의 PCR 반응을 행하였다. 합성된 서열을 EcoRI-NotI로 소화시키고, EcoRI-NotI 단편으로서 단리하여, 동일 효소로 절단한 pΔEGFP-N1-벡터(개변 pEGFP-N1[벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사 제조]의 EGFP 단백질을 코딩하는 영역을 삭제함)에 연결하였다. 얻어진 플라스미드를 pΔEGFP-N1-GPA33이라 명명하였다. pΔEGFP-N1-GPA33에 조립된 A33은 977 bp의 cDNA를 코딩한다. 이하, 실시예 중의 모든 PCR의 반응 온도 조절은 진앰프(GeneAmp)® PCR 시스템 9700((주)퍼킨 엘머 재팬사 제조)를 사용하였다.
b) A33 발현 세포의 제조
a)에서 제조한 pΔEGFP-N1-GPA33을 FM3A 세포(후생 노동부 연구 자원 뱅크 사업(JCRB) No.0701) 및 L929 세포(ATCC No. CCL-1)의 2개의 세포주에 도입하여 2종의 A33 발현 세포를 제조하였다. FM3A 세포에는 전기 천공법을 이용하였다. pΔEGFP-N1-A33 벡터 20 ㎍을, BTX사 제조 전기 천공기를 이용하여 350 V, 950 μF 의 조건에서 5×106개의 FM3A 세포에 유전자를 도입하고, 6웰 배양 플레이트에 파종하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에서 48시간 배양한 후, G418(기브코 비알엘사 제조)를 1 mg/mL이 되도록 첨가하여 1주간 배양하였다. 세포막 표면 상에 발현된 A33 항원의 확인은 AS33 하이브리도마(ATCC No. HB-8779)의 배양 상청액을 이용하여 행하였다. AS33 하이브리도마 배양 상청액을 1차 항체로, R-피코에리트린 표지한 염소 항 마우스 Ig gamma F(ab')2 항체(다코사 제조)를 2차 항체로서 이용한 플로우사이토미터(FCM: 벡톤 디킨슨사 제조) 해석을 행하여, 유전자 도입된 세포에서 G418 내성의 형질을 획득한 것 중, 세포막 표면 상에 A33을 발현한 세포를 선택적으로 소팅(sorting)하였다.
L929 세포에는, Trans IT-LT1(다카라바이오사 제조)를 이용하여 도입하였다. 유전자 도입은 메뉴얼의 방법으로 행하였다. 37 ℃, 5.0 ％ 탄산 가스하에서 24시간 배양한 후, G418(기브코 비알엘사 제조)를 1 mg/mL이 되도록 첨가하여 1주간 배양하였다. FM3A 세포의 경우와 동일하게, 세포막 표면 상에 발현된 A33 항원의 확인은 AS33 하이브리도마의 배양 상청액을 이용하여 행하였다. AS33 하이브리도마(ATCC No. HB-8779)를 1차 항체로, R-피코에리트린 표지한 염소 항 마우스 Ig gamma F(ab')2 항체(다코사 제조)를 2차 항체로서 이용한 플로우사이토미터(FCM: 벡톤 디킨슨사 제조) 해석을 행하여, 유전자 도입된 세포에서 G418 내성의 형질을 획득한 것중, 세포막 표면 상에 A33을 발현한 세포를 선택적으로 소팅하였다.
두 세포주 모두 인간 전장 A33 항원을 고발현하는 단일 클론을 취득할 수 있 었다. A33 항원 단백질을 고발현한 FM3A 세포를 FM3A/A33으로, L929 세포를 L929/A33으로 명명하였다.
shA33EX-hFc 단백질을 면역원 또는 항체를 스크리닝할 때의 ELISA에 사용하기 위해 제조하였다.
c) 가용형 세포막외 A33 인간 Fc 융합 단백질 발현 벡터의 제조
가용형 세포막외 A33 인간 Fc 융합 단백질 발현 벡터(이하 shA33EX-hFc라 함)를 제조하기 위해서, A33의 세포막외 영역을 코딩하는 cDNA를 유지하는 플라스미드 벡터 pTracer-CMV-humanFc-A33EXR을 제조하였다. pTracer-CMV-humanFc-A33EXR은 이하의 방법으로 제조되었다. 분비 시그널 서열을 포함하는 세포막외 영역 A33 DNA(서열 11)을, 그의 5' 말단에 EcoRI 서열을, 그의 3' 말단에 NotI 서열과 정지 코돈을 부가하기 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 행하여 수식하였다. a)에서 제조한 pΔEGFP-N1-A33cDNA를 주형으로 하고, 프라이머로서 A33-F2(서열 13) 및 GPA-EXCRR2 5'-CTCGAGCGGCCGCCAGTTCATGGAGGGAGATCTGACG-3'(서열 15)를 합성하며, KOD-plus DNA 중합효소(도요보사 제조)를 사용하여 (94 ℃, 15초; 60 ℃, 30초; 68 ℃, 60초간)×30 사이클의 PCR 반응을 행하였다. 합성된 서열을 EcoRI-NotI로 소화시키고, EcoRI-NotI 단편으로서 단리하여, 동일 효소로 절단한 pTracer-CMV-humanFc 벡터(개변 pTracer-CMV[인비트로젠 라이프테크놀로지즈사 제조]의 Xba I 부위와 Apa I 부위의 부분에 FLAG 및 인간 IgG1의 Fc 영역을 도입한 플라스미드)에 연결하여 얻어진 플라스미드를 pTracer-CMV-humanFc-A33EXR이라 명명하였다.
PCR용 프라이머 등의 올리고뉴클레오티드의 합성은 전부 DNA 자동 합성기(모 델 3948; (주)퍼킨 엘머 재팬 어플라이드 바이오시스템즈 지교부 제조)를 이용하여, 그의 메뉴얼에 따라서 행하였다(문헌[Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H.(1981)], [J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191] 참조). 각 올리고뉴클레오티드는 합성 종료 후, 지지체로부터 개열시켜 탈보호를 행하고, 얻어진 용액을 건고시킨 후 증류수에 용해시키고, 사용할 때까지 -20 ℃에서 동결 보존하였다.
d) shA33EX-hFc 단백질의 발현과 정제
c)에서 구축한 shA33EX-hFc 단백질 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 가용형 세포막외 A33 단백질 발현 세포를 제조하였다. 발현을 위한 숙주 세포에는, 예를 들면 CHO 세포의 dhfr 결손주(ATCC CRL-9096), CHO-Ras(문헌[Katakura Y. et al,, Cytotechnology, 31: 103-109, 1999]), HEK293T(ATCC CRL-11268) 등이 이용된다.
숙주 세포에의 벡터의 도입은 전기 천공법이나 리포펙션 등에 의해 실시하였다. 전기 천공법은 shA33EX-hFc 단백질 발현 벡터 약 2 ㎍을 제한 효소로 선상화하고, Bio-Rad 전기 천공기를 이용하여 350 V, 500 μF의 조건에서 4×106개의 CHO 세포에 유전자를 도입하여 96웰 배양 플레이트에 파종하였다. 리포펙션은 LipofectAMINE Plus(기브코 비알엘사 제조)를 이용하여 메뉴얼에 따라서 실시하였다. 벡터의 도입 처리 후, 발현 벡터의 선택 마커에 대응하는 약제를 첨가하여 배양을 계속하였다.
배양 상청액으로부터의 shA33EX-hFc 단백질의 정제는 이하의 방법으로 행하 였다. shA33EX-hFc 단백질을 포함하는 배양 상청액을 Hitrap Protein A FF(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)를 이용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 20 mM 시트르산나트륨, 50 mM 염화나트륨(pH 2.7)을 이용하여 친화성 정제하였다. 용출 분획은 50 mM 인산나트륨 용액(pH 7.0)을 첨가하여 pH 5.5로 제조하였다. 제조된 가용형 세포막외 A33 단백질 용액은 Amicon Ultra-15(아미콘사 제조)를 이용하여 PBS로 치환하고, 공경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(밀리포어사 제조)로 여과 멸균하여 정제 shA33EX-hFc 단백질을 얻었다. shA33EX-hFc 단백질의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여, 1 mg/mL를 1.4 OD로서 산출하였다.
실시예 4 인간 항체 생산 마우스의 제조
면역에 이용한 마우스는 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대하여 동종접합체의 유전적 배경을 가지면서 또한 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 동시에 유지하였다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자를 갖는 계통 B의 마우스와의 교배에 의해 제조되었다. 계통 A는 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대하여 동종접합체가고, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 계통이고, 예를 들면 도미즈카 등의 보고(문헌[Tomizuka. et al., Ploc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97: 722])에 기재되어 있다. 또한, 계통 B는 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대하여 동종접합체가며, 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 유지하는 마우스 계통(트랜스제닉 마우 스)이고, 예를 들면 Fishwild 등의 보고(문헌[Nat Biotechnol, (1996), 1I4: 845])에 기재되어 있다.
계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어진, 혈청 중에 인간 Ig 중쇄 및 κ경쇄가 동시에 검출되는 개체(문헌[Ishida & Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000])를 이하의 면역 실험에 이용하였다. 또한, 상기 인간 항체 생산 마우스(KM 마우스라 함)는 계약에 의하여 기린 비어 가부시끼가이샤로부터 입수 가능하다.
실시예 5 A33에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조
본 실시예에 있어서의 모노클로날 항체의 제조는 단클론 항체 실험 조작 입문(안도 다이메 저서, 고단샤 발행 1991) 등에 기재된 것과 같은 일반적 방법에 따라서 제조하였다. 면역원으로서의 A33은 실시예 1에서 제조한 A33 발현 FM3A 세포 또는 shA33EX-hFc 단백질을 이용하였다. 피면역 동물은 실시예 2에서 제조한 인간 면역 글로블린을 생산하는 인간 항체 생산 마우스를 이용하였다.
A33에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조를 목적으로 하여, 인간 항체 생산 마우스에게 실시예 3에서 제조한 A33 발현 FM3A 세포(1×107 세포/마리)를 복강내에 RIBI 어쥬번트(고리쿠사사 제조)와 혼합하여 첫회 면역화하였다. 첫회 면역부터 이후, 동세포와 RIBI 어쥬번트를 매주 총 8회 면역화하였다. 이하에 서술하는 비 장 취득 3일 전에 shA33EX-hFc 단백질 20 ㎍/마우스 개체를 꼬리 정맥 투여 및 5 ㎍/마우스 개체의 재조합 인간 IL-6을 피하 투여하였다.
또한, shA33EX-hFc 단백질 10 ㎍/마우스 개체를 CpG 어쥬번트(퀴아겐사 제조)와 혼합하여 첫회 면역화하였다. 첫회 면역부터 이후, 동단백질과 CpG 어쥬번트를 2주간마다 2회 면역화하고, 또한 2주간 후에 동단백질만 면역화하였다. 이하에 서술하는 비장 취득 3일 전에 shA33EX-hFc 단백질 10 ㎍/마우스 개체를 꼬리 정맥 투여하였다.
또한, shA33EX-hFc 단백질 10 ㎍/마우스 개체와 A33 발현 FM3A 세포(5×106 세포/마리)를 RIBI 어쥬번트와 함께 복강내에 면역화하고, 2주간마다 1 내지 4회 면역화하였다. 이하에 서술하는 비장 취득 4일 전에 shA33EX-hFc 단백질 5 ㎍/마우스 개체를 복강내 투여하였다.
면역화된 마우스로부터 비장을 외과적으로 취득하고, 350 mg/mL 탄산수소나트륨, 50 단위/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 무혈청 DMEM 배지(기브코 비알엘사 제조)(이하 「무혈청 DMEM 배지」라 함) 10 mL 중에 넣어, 메쉬(셀 스트레이너: 팔콘사 제조)위에서 스패츌러를 이용하여 으깨었다. 메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 이 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세정하고 나서, 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 한편, 10 ％ FCS(시그마사 제조)를 포함하는 DMEM 배지(기브코 비알엘사 제조)(이하, 「혈청 포함 DMEM 배지」라 함)에서 37 ℃, 5 ％ 탄산 가스 존재하에 세포 농도가 1×106 세포/mL를 넘지 않도록 배양한 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC No. CRL-1581)을 동일하게 무혈청 DAEM 배지로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 회수한 세포의 현탁액과 마우스 미엘로마 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하고, 원심분리 후, 상청액을 완전히 제거하였다. 이 펠릿에 융합제로서 50 ％(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링커 만하임사 제조) 1 mL를, 피펫 앞부분으로 펠릿을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 미리 37 ℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지 1 mL를 2회로 나누어 천천히 첨가하고, 7 mL의 무혈청 DMEM 배지를 더 첨가하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하여 얻어진 융합 세포를 이하에 기재하는 한계 희석법에 의한 스크리닝에 사용하였다. 하이브리도마의 선별은 10 ％ FCS, IL-6(10 ng/mL)(또는 10 ％ 하이브리도마 클로닝 팩터(이하 「HCF」라 함: 바이오베이스사 제조)) 및 히포크산틴(H), 아미노프테린(A), 티미딘(T)(이하, 「HAT」라 함: 시그마사 제조)를 함유하는 DMEM 배지 중에서 배양함으로써 행하였다. 또한, HT(시그마사 제조), 10 ％ FCS, IL-6(또는 10 ％ HCF) 함유 DMEM 배지를 이용하여 한계 희석법에 의해 단일 클론으로 하였다. 배양은 96웰 마이크로타이터 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조) 중에서 행하였다. 항 A33 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선별(스크리닝) 및 각각의 하이브리도마가 생산하는 인간 모노클로날 항체의 특징 부여는, 후술하는 효소 표지 면역 흡착 검정(ELISA) 및 플로우사이토메트리(FMC)로 측정함으로써 행하였다.
실시예 6에 서술하는 세포 ELISA, 단백 ELISA 및 FMC 해석에 의해, 인간 면 역 글로블린 γ쇄(hIgγ) 및 인간 면역 글로블린 경쇄 κ를 가지면서 또한 A33에 특이적인 반응성을 갖는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마를 얻었다. 또한, 본 실시예를 포함하여 이하의 모든 실시예 중, 및 실시예에 있어서의 시험 결과로서 나타낸 표 또는 도면 중에 있어서는, 각각의 본 발명의 인간 항 A33 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론은 기호를 이용하여 명명하였다. 또한, 상기 기호의 전후에 「항체」를 붙인 것은 각각의 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 상기 하이브리도마로부터 단리된 항체 유전자(전장 또는 가변 영역)를 유지하는 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 항체를 의미한다. 또한, 문맥상 분명한 범위에 있어서, 하이브리도마 클론의 명칭이 항체의 명칭을 나타내는 경우가 있다. 이하의 하이브리도마 클론은 단일 클론을 나타낸다: 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 125R5AAAA. 125 M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 또는 125R5AAAA는 2004년 8월 24일자로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1 쪼메 1 주오 다이 6)에 각각 순서대로 수탁 번호 FERM BP-10107(식별을 위한 표시: M10), FERM BP-10106(식별을 위한 표시: M165), FERM BP-10108(식별을 위한 표시: M96), FERM BP-10109(식별을 위한 표시: N26), FERM BP-10104(식별을 위한 표시: Q47), FERM BP-10105(식별을 위한 표시: Q54) 및 FERM BP-10103(식별을 위한 표시: R5)로서 기탁되어 있다.
실시예 6 인간 면역 글로블린 γ쇄( hIg γ) 및 인간 면역 글로블린 경쇄 κ( Ig κ)를 갖는 인간 항 A33 모노클로날 항체 생산 클론의 선택
세포 ELISA의 경우, 이하와 같이 실시하였다. 실시예 3에서 제조한 FM3A/A33을 96웰 플레이트(팔콘사 제조)의 각 웰에 1×105개 첨가한 후, 하이브리도마 상청액을 첨가하여 4 ℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 이어서, 2 ％ FCS 함유 PBS로 2회 세정하고, 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 염소 항 인간 IgG F(ab')2 항체(50 ㎍/웰: IBL사 제조)를 첨가하여 4 ℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 2 ％ FCS 함유 PBS로 2회 세정하고, TMB 발색 기질(DAKO사 제조)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온하에서 20분간 인큐베이션하였다. 각 웰에 0.5 M 황산(100 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450 nm(참조 파장 570 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(1420 ARV0 멀티 라벨 카운터: WALLAC사 제조)로 측정하여 양성 반응을 나타낸 항체 생산 클론을 선택하였다. 이 때에, A33 항원을 발현하지 않은 FM3A 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 즉, FM3A/A33 세포에 반응하고, FM3A 세포에 반응하지 않는 배양 상청액을, 양성 반응을 나타낸 항체 생산 클론으로서 선택하였다.
또한, 단백 ELISA의 경우에는 이하와 같이 실시하였다. 실시예 3에서 제조한 shA33EX-hFc 단백질을 1 ㎍/ml 탄산 완충액 pH 9.4로 제조한 것을 50 ㎕씩, ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp, 눈크사 제조)의 각 웰에 첨가하여 실온에서 1시간 또는 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, shA33EX-hFc 단백질을 마이크로플 레이트에 흡착시켰다. 이어서, 상청액을 버리고, 각 웰에 10 ％ FCS 함유 PBS를 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 인큐베이션하여 shA33EX-hFc 단백질이 결합하지 않은 부위를 블로킹하였다. 이와 같이 하여, 각 웰을 shA33EX-hFc 단백질로 코팅한 마이크로플레이트를 제조하였다. 각 웰에 각각의 하이브리도마의 배양 상청액(50 ㎕)을 첨가하고, 실온하에서 1시간 반응시킨 후, 각 웰을 0.1 ％ 트윈 20 함유 PBS(PBS-T)로 2회 세정하였다. 이어서, 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 양(羊) 항 인간 Igκ 항체(50 ㎕/웰, The Binding Site사 제조)를 0.1 ％ 트윈 20 함유 PBS(PBS-T)로 2500배로 희석한 용액을 각 웰에 50 ㎕ 첨가하여 37 ℃ 1시간 배양하였다. 마이크로플레이트를 PBS-T로 3회 세정 후, TMB 발색 기질액(DAKO사 제조)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온하에서 20분간 인큐베이션하였다. 각 웰에 0.5 M 황산(100 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450 nm(참조 파장 570 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(VersaMax, 몰레큘러 디바이스사 제조)로 측정하여 양성 반응을 나타낸 항체 생산 클론을 선택하였다.
또한, FMC의 경우에는 이하와 같이 실시하였다. A33 항원을 발현하는 인간 대장암 세포주 COL0205 세포에 대한 하이브리도마 배양 상청액의 반응성을 검토하였다. 2×106/ml의 농도로 COL0205 세포주를 0.1 ％ NaN3, 2 ％ FCS 함유 PBS의 염색 완충액(SB)에 부유시켰다. 세포 부유액(50 ㎕/웰)을 96-웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 분주하였다. 각각의 하이브리도마의 배양 상청액(50 ㎕)을 첨가하여 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 각 서브클래스에 따라, 인간 IgG1 항체(시그마사 제조)를 이용하여 하이브리도마 배양 배지로 2 ㎍/ml의 농도로 제조하고, 50 ㎕ 첨가 후 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. SB로 2회 세정한 후, RPE 형광 표지 염소 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Southern Biotech사 제조) 50 ㎕를 첨가하여 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. SB로 1회 세정한 후, 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁시켜 FACS(FACScalibur, 벡톤 디킨슨사 제조)로 각 세포의 평균 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, COL0205 세포주에 강한 결합 활성을 갖기 때문에, 세포에 발현하는 A33과 결합하는 항체인 것이 판명되었다.
실시예 7 각 모노클로날 항체 배양 상청액의 서브클래스 동정
shA33EX-hFc 단백질을 1 ㎍/ml 탄산 완충액(이하, 「PBS」라 함)으로 제조한 것을 50 ㎕씩, ELISA용 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp, 눈크사 제조)의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하여 shA33EX-hFc 단백질을 마이크로플레이트에 흡착시켰다. 이어서, 상청액을 버리고, 각 웰에 10 ％ FCS 함유 PBS를 첨가하여 실온에서 1시간 또는 4 ℃에서 밤새 배양하여, shA33EX-hFc 단백질이 결합하지 않은 부위를 블로킹하였다. 이와 같이 하여, 각 웰을 shA33EX-hFc 단백질로 코팅한 마이크로플레이트를 제조하였다. 이어서, 0.1 ％ 트윈 20 함유 PBS(PBS-T)로 2회 세정하고, 각 웰에 각각 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 양 항 인간 IgG1 항체, 양 항 인간 lgG2 항체, 양 항 인간 IgG3 항체 또는 양 항 인간 IgG4 항체(각각 1600, 6400, 25000, 25000배 희석, 50 ㎕/웰, The Binding Site사 제조)를 첨가하여 실온하에서 1.5시간 인큐베이션하였다. 0.1 ％ 트윈 20 함유 PBS(PBS-T)로 3회 세정 후, 기질 완충액(TMB, 100 ㎕/웰, DAK0사 제조)을 각 웰에 첨가하여 실온하에서 20분간 인큐베이션하였다. 이어서, 0.5 M 황산(100 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450 nm(참조 파장 570 nm)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(VersaMax, 몰레큘러 디바이스사 제조)로 측정하여, 각 클론의 서브클래스를 결정하였다. 인간 항 A33 항체는 ADCC 및 CDC 활성을 중요시하기 때문에, 서브클래스가 IgG1인 것만 선별하였다.
최종적으로 선택한 클론만의 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00005
실시예 8 각 항체의 제조
실시예 6으로부터 얻어진 하이브리도마의 배양 상청액으로부터의 인간 항 A33 모노클로날 항체의 정제는 이하의 방법으로 행하였다. 인간 항 A33 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청액을 10 ％ 초 저-IgG FBS(인비트로젠사 제조)를 포함하는 SFM 배지(인비트로젠사 제조)에서 배양한 배양 상청액을 Protein A Fast Flow gel(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)를 이용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 0.02 M 글리신 완충액(pH 3.6)을 이용하여 친화성 정제하였다. 용출 분획은 1 M 트리스(pH 8.0)을 첨가하여 pH 7.2 부근으로 조정하였다. 제조된 항체 용액은 Sephadex G25 탈염 칼럼(NAP 칼럼; 아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)를 이용하여 PBS로 치환하고, 공경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(밀리포어사 제조)로 여과 멸균하여 정제 인간 항 A33 모노클로날 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/mL를 1.4 OD로서 산출하였다.
실시예 9 A33 발현 세포에 대한 각 모노클로날 정제 항체의 반응 시험
A33 항원을 발현하는 인간 대장암 세포주 COL0205 세포, LoVo 세포(ATCC No. CCL-229), LS174T 세포(ATCC No. CL-188) 및 NCI-H508 세포(ATCC No. CCL-253)에 대한 실시예 8에서 취득한 각 모노클로날 정제 항체의 반응성 검토를 FCM에서 행하였다. 또한, 음성 대조군 세포로서 A33 항원을 발현하지 않는 인간 대장암 세포주 HT-29 세포(ATCC No. HTB-38)도 행하였다. 2×106개/ml의 농도로 각 세포주를 0.1 ％ NaN3, 2 ％ FCS 함유 PBS의 염색 완충액(SB)에 부유시켰다. 세포 부유액(50 ㎕/웰)을 96-웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 분주하였다. 각각의 모노클로날 정제 항체를 SB로 2000, 400, 80, 16 ng/ml를 50 ㎕ 첨가하고, 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 서브클래스에 따라서, 인간 IgG1 항체(시그마사 제조)를 이용하고, SB로 2000, 400, 80, 16 ng/ml의 농도로 제조하여 50 ㎕ 첨가 후 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. SB로 2회 세정한 후, FITC 형광 표지 염소 항 인간 IgG F(ab')2 항체(Southern Biotech사 제조) 50 ㎕를 첨가하여 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. SB로 1회 세정한 후, 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁시키고, FACS(FACScan, 벡톤 디킨슨사 제조)로 각 세포의 평균 형광 강도를 측정하였다.
그 결과를 표 2에 나타내었다. COL0205 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 90, LoVo 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 25, LS174T 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 125, NCI-H508 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 125로 하고, 거기에 도달하는 항체 농도가 10<=x<100 ng/ml일 때는 +++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 ++, 1000<=x<10000 ng/ml일 때는 +, 결합이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다. A33 항원을 발현하는 어떤 세포에 대해서도, 각 모노클로날 정제 항체는 결합을 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00006
실시예 10 각 모노클로날 정제 항체의 마우스 항 A33 항체와의 경합 시험
실시예 8에서 취득한 각 모노클로날 정제 항체가 마우스 항 A33 항체와 동일한 에피토프를 인식하는가 아닌가를 FCM을 이용한 경합 실험으로 검토하였다. 2×106개/ml의 농도로 COL0205 세포주를 0.1 ％ NaN3, 2 ％ FCS 함유 PBS의 염색 완충액(SB)에 부유시켰다. 세포 부유액(50 ㎕/웰)을 96-웰 환저 플레이트(벡톤 디킨슨사 제조)에 분주하였다. 거기에, 실시예 1에서 제조한 마우스 항 A33 정제 항체를 100 ㎍/ml의 농도로 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을, 1 ㎍/ml의 각 모노클로날 정제 항체(50 ㎕)와 함께 웰에 첨가하여 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. 항 A33 정제 항체를 첨가하지 않은 마우스 음성 대조군은 인간 IgG1 항체(시그마사 제조)를 이용하여 SB로 1 ㎍/ml의 농도로 제조하고, 50 ㎕ 첨가 후 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. SB로 2회 세정한 후, FITC 형광 표지 염소 항 인간 IgG F(ab')2 항체(아이비엘사 제조) 50 ㎕를 첨가하여 빙온하에 30분간 인큐베이션하였다. SB로 1회 세정한 후, 300 ㎕의 FACS 완충액에 현탁시키고, FACS(FACScan, 벡톤 디킨슨사 제조)에서 각 세포의 평균 형광 강도를 측정하였다. 각 모노클로날 정제 항체의 마우스 A33 항체와의 저해율을 하기 식에 의해 산출하였다: 저해율={100-(100 x 마우스 A33 항체 예비인큐베이션한 후의 평균 형광 강도)/(마우스 A33 항체 없이 예비인큐베이션한 후의 평균 형광 강도)}. 저해율이 25 ％ 이하인 것을 「논-블로커」, 25 ％ 이상 90 미만인 것을「부분적 블로커」, 90 ％ 이상인 것을 「블로커」로 명명하였다. 그 결과, 263A17, 125M10AA 및 125M96ABA는 「논-블로커」, 125M165DAAA 및 125N26F6AA는 「블로커」, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 125R5AAAA는 「부분적 블로커」로 분류되었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00007
실시예 11 정상 인간 단핵구의 취득 방법
먼저 정상 인간 말초혈 유래 단핵구를 Ficoll(Ficoll-PaquePLUS: 아마샴 파마시아 바이오텍사 제조)를 이용하여 통상법에 따라서 제조하였다. 항응고제로서 시트르산나트륨액을 포함한 채혈 백(bag)(데루모사 제조)에 채취한 정상 인간 혈액을 Ficoll에 중층하여, 비중 원심(800 G, 실온 15분간)에 의해 단핵 세포를 분리하였다. 중간층을 단핵구로서 추출하여 PBS로 희석하고, 200 G로 10분간 원심 분리를 3회 반복하여 상청액 중에 잔류한 혈소판을 제거하였다. 이상의 방법으로 정상 인간 말초혈 유래 단핵구(이하 PBMC라 함)를 취득하여 실시예 12의 PBMC로서 사용하였다. 또한, PBMC로부터 CD4+ T 세포 단리 키트 II(밀테니 바이오텍사 제조)를 이용하여, 부속 설명서에 따라서 CD4+ T 세포를 단리한 나머지 세포군도 실시예 12의 PBMC로서 사용하였다.
실시예 12 각 모노클로날 정제 항체에서의 세포 상해성 시험
항체를 통한 세포 상해성 활성은, NK 세포 또는 호중구 등의 킬러 활성을 갖는 세포와 항체의 존재하에서 표적 세포에의 상해 활성(항체 의존성 세포성 세포 상해 활성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity), 이하 ADCC), 및 보체와 항체의 존재하에 표적 세포에의 상해 활성(보체 의존성 세포 상해 활성(Complement-Dependent Cytotoxicity), 이하 CDC)의 측정을 실시하였다. 항체는 실시예 8에서 제조한 각 모노클로날 정제 항체와 항 A33 항체의 대조군으로서 cA33 재조합 항체를 이용하였다. 또한, 음성 대조군으로서 항 DNP IgG1 항체를 이용하였다.
방법은 간단하게는, 표적 세포에 방사성 크롬(51Cr)을 세포질내에 포함시키고, 세포사멸에 의해 배양액 중에 유리되는 51Cr량을 γ선량으로 측정하였다.
구체적으로는, 표적 세포로서 대장암 세포주 COL0205(ATCC No. CCL-86) 및 NCI-H508 세포(ATCC No. CCL-253)를 106개를 15 ㎕의 송아지 태아 혈청(FCS)에 현탁시키고, 50 ㎕(37 MBq/mL)의 51Cr 표지된 크롬산나트륨(퍼킨 엘머사 제조: 이하, 51Cr이라 함)을 첨가하여 1시간 37 ℃에서 배양하였다. 다음에, 배지를 10 mL 첨가하고, 원심분리하고 배지를 버리는 것을 3회 반복함으로써 세포내에 포함되지 않은 51Cr을 제거하였다.
ADCC 검정은 51Cr 표지한 표적 세포 5000개에 대하여 실시예 11에 기재된 방법으로 취득한 정상 건강인 말초혈 단핵구 500000개를, V 바닥 96웰 플레이트(코스타사 제조) 중에서 전체 용량 200 ㎕로, 각 항체 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에서 4시간 배양하였다.
CDC 검정은 51Cr 표지한 표적 세포 5000개에 대하여 최종 농도 5 ％의 인간 혈청 유래 보체(시그마사 제조)를 V 바닥 96웰 플레이트 중에서 전체 용량 200 ㎕로, 각 항체 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에서 4시간 배양하였다.
ADCC 및 CDC 검정 모두 배양 후, 플레이트를 원심분리하여 세포를 가라앉힌 후, 각 모노클로날 정제 항체를 0.4 내지 500 ng/ml로 제조하여 50 ㎕를 분말 신틸레이터 함유의 96웰 플레이트(Lumaplate TM-96: 팩커드사 제조)에 옮기고, 55 ℃, 1.5시간 동안 건조시켰다. 건조를 확인한 후, 전용 커버(TopSeal TM-A: 96-웰 Microplates: 팩커드사 제조)로 플레이트를 커버하고, 신틸레이션 카운터(톱 카운트: 팩커드사 제조)로 γ선량을 측정하였다.
그 결과를 도 1A 내지 도 1D, 표 4에 나타내었다. ADCC는 COL0205 세포의 경우에는, 특이적 용해율 반값을 15 ％로 하고, 거기에 도달하는 항체 농도가 1<=x<10 ng/ml일 때는 +++, 10<=x<100 ng/ml일 때는 ++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 +, 특이적 용해율이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다. 또한, NCI-H508 세포의 경우에는, 특이적 용해율 반값을 15 ％로 하고, 거기에 도달하는 항체 농도가 1<=x<10 ng/ml일 때는 +++, 10<=x<100 ng/ml일 때는 ++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 +, 특이적 용해율이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다.
CDC에서는, COL0205 세포의 경우에는 특이적 용해율 반값을 10 ％로 하고, 거기에 도달하는 항체 농도가 10<=x<100 ng/ml일 때는 +++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 ++, x>=1000 ng/ml일 때는 +, 특이적 용해율이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다. 또한, NCI-H508 세포의 경우에는 특이적 용해율 반값을 25 ％로 하고, 거기에 도달하는 항체 농도가 10<=x<100 ng/ml일 때는 +++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 ++, x>=1000 ng/ml일 때는 +, 특이적 용해율이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다.
ADCC에서는 cA33 및 125Q54AAAA가 높은 상해 활성을 나타내었다. 한편, CDC에서는 125M10AA가 높은 상해 활성을 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00008
실시예 13 각 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자의 제조
(1) 각 모노클로날 항체의 cDNA 합성
하이브리도마 263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125M96ABA, 125N26F6AA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 125R5AAAA를 10 ng/mL IL-6 또는 10 ％ HCF(바이오베이스사 제조), 10 ％ 소 태아 혈청(하이크론사 제조) 함유 DMEM 배지(기브코 비알엘사 제조)에서 배양하여 원심 분리에 의해 세포를 모은 후 ISOGEN(닛본 진사 제조)을 첨가하고, 취급 설명서에 따라서 전체 RNA를 추출하였다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은 SMART RACE cDNA 증폭 키트(벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사 제조)를 이용하여 첨부 설명서에 따라서 행하였다.
5 ㎍의 전체 RNA를 주형으로 하여 제1 가닥 cDNA를 제조하였다.
제1 가닥 cDNA의 합성
전체 RNA 5 ㎍/3 ㎕
5' CDS 프라이머 1 ㎕
SMART oligo 1 ㎕
상기 조성의 반응액을 70 ℃에서 2분간 인큐베이션한 후,
5×완충액 2 ㎕
DTT 1 ㎕
DNTP mix 1 ㎕
PowerScript 역전사 효소 1 ㎕
를 첨가하여 42 ℃에서 1.5시간 인큐베이션하였다.
또한, 100 ㎕의 트리신 완충액을 첨가한 후, 72 ℃에서 7분간 인큐베이션하여 제1 가닥 cDNA를 취득하였다.
(2) PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭과 염기 서열의 확인
(2)-1; 하이브리도마 263A17의 PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭
cDNA의 증폭은 KOD-Plus- DNA 중합효소(도요보사 제조)를 이용하여 하기의 반응액을 제조하여 실시하였다.
멸균 H2O 29.5 ㎕
cDNA 2.5 ㎕
KOD-P1us-완충액(10X) 5 ㎕
dNTP Mix(2 mM) 4 ㎕
MgS04(25 mM) 2 ㎕
KOD-P1us- DNA 중합효소 (1 unit/㎕) 1 ㎕
범용 프라이머 A mix(UPM)(10X) 5 ㎕
유전자 특이적 프라이머(GSP) 1 ㎕
총 부피 50 ㎕
상기 조성의 반응액을 다시 증류수로 최종 용량 50 ㎕로 하여 PCR에 적용하였다.
263A17의 중쇄 유전자의 증폭은 SMART RACE cDNA 증폭 키트 부속의 UPM 프라이머와 IgG1p 프라이머(5'-TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG-3')(서열 16)을 사용하여 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 30회 반복하였다. 한편, 263A17의 경쇄 유전자의 증폭은 UPM 프라이머와 hk-2(5'-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3')(서열 17) 프라이머를 사용하고, 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다.
(2)-2; 하이브리도마 125M10AA, 125M96ABA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 125R5AAAA의 PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭
반응 조건은 (2)-1과 동일하게 행하였다. 125M10AA, 125M96ABA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 125R5AAAA의 중쇄 유전자의 증폭은 UPM 프라이머와 IgG1p 프라이머(서열 16)을 이용하여, 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUPM 프라이머(SMART RACE cDNA 증폭 키트; 벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사 제조)와 IgG2p/G134 프라이머(5'-TGC ACG CCG CTG GTC AGG GCG CCT GAG TTC C-3')(서열 18)을 사용하여 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 20회 반복하였다. 한편, 125M10AA, 125M96ABA, 125Q47BA, 125Q54AAAA 및 125R5AAAA의 경쇄 유전자의 증폭은 UPM 프라이머와 hk-2 프라이머(서열 17)을 사용하고, 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUPM 프라이머와 hk-5 프라이머(5'-AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3')(서열 19)를 사용하여 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 20회 반복하였다.
(2)-3: 하이브리도마 125M165DAAA 및 125N26F6AA의 PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭
반응 조건은 (2)-1과 동일하게 행하였다. 125M165DAAA 및 125N26F6AA의 중쇄 유전자의 증폭은 UPM 프라이머와 hh-2 프라이머(5'-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3')(서열 20)을 사용하여 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 30회 반복하였다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUPM 프라이머와 hh-4 프라이머(5'-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3')(서열 21)을 사용하여 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 20회 반복하였다. 한편, 125M165DAAA 및 125N26F6AA의 경쇄 유전자의 증폭은 UPM 프라이머와 hk-2 프라이머(서열 17)을 사용하고, 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUPM 프라이머와 hk-5 프라이머(서열 19)을 사용하여 98 ℃ 1초, 68 ℃ 30초의 사이클을 20회 반복하였다.
이상과 같이 증폭시킨 각각의 중쇄 및 경쇄의 PCR 단편은 에탄올 침전으로 회수한 후, 아가로스 겔 전기 영동으로 회수하여, 멤브레인을 이용하는 DNA 정제 키트인 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아겐사 제조)로 정제하였다. 정제한 HV 증폭 단편 또는 LV 증폭 단편은 각각 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)의 PCR 4 Blunt-TOPO 벡터에 서브클로닝을 행하고, 얻어진 클론의 플라스미드 DNA에 대하여 인서트 DNA의 염기 서열을 해석하였다. DNA 염기 서열 결정을 위해 프라이머로서 M13FW(서열 3) 및 M13RV(서열 4)를 사용하였다.
263A17의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00009
Figure 112007026367397-pct00010
Figure 112007026367397-pct00011
Figure 112007026367397-pct00012
중쇄 핵산 서열(서열 22)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 429번째의 아데닌(A)와 430번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 23)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 143번째의 세린(S)와 144번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 22)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 23)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 263A17 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 22)는 58번째의 구아닌(G)로부터 429번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 23)은 20번째의 글루탐산(E)로부터 143번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 24)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 387번째의 아데닌(A)와 388번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 25)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 129번째의 리신(K)와 130번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 24)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 66번째의 시토신(C)와 67번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 25)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 22번째의 시스테인(C)와 23번째의 아스파라긴산(D) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 263A17 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 24)는 67번째의 구아닌(G)로부터 387번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 25)는 23번째의 아스파라긴산(D)로부터 129번째의 리신(K)까지이다.
125M10AA의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00013
Figure 112007026367397-pct00014
Figure 112007026367397-pct00015
Figure 112007026367397-pct00016
중쇄 핵산 서열(서열 26)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 441번째의 아데닌(A)와 442번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 27)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 147번째의 세린(S)와 148번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 26)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 78번째의 시토신(C)과 79번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 27)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 26번째의 세린(S)와 27번째의 글루타민(Q) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M10AA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 26)은 79번째의 시토신(C)로부터 441번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 27)은 27번째의 글루타민(Q)로부터 147번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 28)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 381번째의 아데닌(A)와 382번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 29)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 127번째의 리신(K)와 128번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 28)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 60번째의 아데닌(A)와 61번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 29)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M10AA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 28)은 61번째의 구아닌(G)로부터 381번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 29)는 21번째의 글루탐산(E)로부터 127번째의 리신(K)까지이다.
125M165DAAA 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00017
Figure 112007026367397-pct00018
Figure 112007026367397-pct00019
Figure 112007026367397-pct00020
중쇄 핵산 서열(서열 30)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 420번째의 아데닌(A)와 421번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 31)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 140번째의 세린(S)와 141번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 30)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 31)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루타민(Q) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M165DAAA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 30)은 58번째의 시토신(C)로부터 420번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 31)은 20번째의 글루타민(Q)로부터 140번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 32)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 381번째의 아데닌(A)와 382번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 33)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 127번째의 리신(K)와 128번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 32)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 60번째의 아데닌(A)와 61번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 33)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M165DAAA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 32)는 61번째의 구아닌(G)로부터 381번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 33)은 21번째의 글루탐산(E)로부터 127번째의 리신(K)까지이다.
125M96ABA 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00021
Figure 112007026367397-pct00022
Figure 112007026367397-pct00023
Figure 112007026367397-pct00024
중쇄 핵산 서열(서열 34)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 420번째의 아데닌(A)와 421번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 35)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 140번째의 세린(S)와 141번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 34)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 시토신(C)와 58번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 35)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 세린(S)와 20번째의 글루타민(Q) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M96ABA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 34)는 58번째의 시토신(C)로부터 420번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 35)는 20번째의 글루타민(Q)로부터 140번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 36)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 381번째의 아데닌(A)와 382번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 37)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 127번째의 리신(K)와 128번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 36)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 60번째의 아데닌(A)와 61번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 37)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 20번째의 글리신(G)와 21번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M96ABA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 36)은 61번째의 구아닌(G)로부터 381번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 37)은 21번째의 글루탐산(E)로부터 127번째의 리신(K)까지이다.
125N26F6AA 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00025
Figure 112007026367397-pct00026
Figure 112007026367397-pct00027
Figure 112007026367397-pct00028
중쇄 핵산 서열(서열 38)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 420번째의 아데닌(A)와 421번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 39)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 140번째의 세린(S)와 141번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 38)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 39)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루타민(Q) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M96ABA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 38)은 58번째의 시토신(C)로부터 420번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 39)는 20번째의 글루타민(Q)로부터 140번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 40)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 388번째의 아데닌(A)와 389번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 41)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 126번째의 리신(K)와 127번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 40)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 41)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 글리신(G)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125M96ABA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 40)은 58번째의 구아닌(G)로부터 388번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 41)은 20번째의 글루탐산(E)로부터 126번째의 리신(K)까지이다.
125Q47BA의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00029
Figure 112007026367397-pct00030
Figure 112007026367397-pct00031
Figure 112007026367397-pct00032
중쇄 핵산 서열(서열 42)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 420번째의 아데닌(A)와 421번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 43)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 140번째의 세린(S)와 141번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 42)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 43)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125Q47BA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 42)는 58번째의 구아닌(G)로부터 420번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 43)은 20번째의 글루탐산(E)로부터 140번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 44)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 387번째의 아데닌(A)와 388번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 45)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 129번째의 리신(K)와 130번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 44)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 66번째의 티민(T)와 67번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 45)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 22번째의 시스테인(C)와 23번째의 아스파라긴산(D) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125Q47BA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 44)는 67번째의 구아닌(G)로부터 387번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 45)는 23번째의 아스파라긴산(D)로부터 129번째의 리신(K)까지이다.
125Q54AAAA의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00033
Figure 112007026367397-pct00034
Figure 112007026367397-pct00035
Figure 112007026367397-pct00036
중쇄 핵산 서열(서열 46)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 420번째의 아데닌(A)와 421번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 47)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 140번째의 세린(S)와 141번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 46)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 47)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125Q54AAAA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 46)은 58번째의 구아닌(G)로부터 420번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 47)은 20번째의 글루탐산(E)로부터 140번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 48)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 387번째의 아데닌(A)와 388번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 49)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 129번째의 리신(K)와 130번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 48)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 66번째의 티민(T)와 67번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 49)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 22번째의 시스테인(C)와 23번째의 아스파라긴산(D) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125Q54AAAA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 48)은 67번째의 구아닌(G)로부터 387번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 49)는 23번째의 아스파라긴산(D)로부터 129번째의 리신(K)까지이다.
125R5AAAA의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00037
Figure 112007026367397-pct00038
Figure 112007026367397-pct00039
Figure 112007026367397-pct00040
중쇄 핵산 서열(서열 50)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 420번째의 아데닌(A)와 421번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 51)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 140번째의 세린(S)와 141번째의 알라닌(A) 사이에 위치한다. 또한, 중쇄 핵산 서열(서열 50)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 57번째의 티민(T)와 58번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 중쇄 아미노산 서열(서열 51)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 19번째의 시스테인(C)와 20번째의 글루탐산(E) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125R5AAAA 항체 중쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 50)은 58번째의 구아닌(G)로부터 420번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 51)은 20번째의 글루탐산(E)로부터 140번째의 세린(S)까지이다.
경쇄 핵산 서열(서열 52)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 387번째의 아데닌(A)와 388번째의 시토신(C) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 53)에 있어서의 항체 가변 영역과 항체 불변 영역의 경계는 129번째의 리신(K)와 130번째의 아르기닌(R) 사이에 위치한다. 또한, 경쇄 핵산 서열(서열 52)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 66번째의 티민(T)와 67번째의 구아닌(G) 사이에 위치하고, 경쇄 아미노산 서열(서열 53)에 있어서의 시그널 서열과 항체 가변 영역의 경계는 22번째의 시스테인(C)와 23번째의 아스파라긴산(D) 사이에 위치한다.
이상으로부터, 125R5AAAA 항체 경쇄의 가변 영역의 핵산 서열(서열 52)는 67번째의 구아닌(G)로부터 387번째의 아데닌(A)까지이다. 또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열(서열 53)은 23번째의 아스파라긴산(D)로부터 129번째의 리신(K)까지이다.
실시예 14 하이브리도마 125 N26F6AA 및 125 M10AA 에서 발현하는 인간 항체 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 불변 영역을 포함하는 전장 서열의 결정
실시예 13에 있어서, 각 항체의 항체 가변 영역의 DNA 염기 서열 및 아미노산 서열을 결정하였지만, KM 마우스 유래 하이브리도마 125N26F6AA 및 125M10AA에 대하여 불변 영역을 포함하는 전장 서열의 해석을 실시하였다. cDNA의 합성은 실시예 13에 따라서, 하이브리도마 125N26F6AA 및 125M10AA로부터 제조한 전체 RNA를 재료로 하고, SMART RACE cDNA 증폭 키트(벡톤 디킨슨 바이오사이언스 클론텍사 제조)를 이용하여 행하였다.
제1 가닥 cDNA의 합성
전체 RNA 5 ㎍/3 ㎕
3' CDS 프라이머 1 ㎕
H20 1 ㎕
상기 조성의 반응액을 70 ℃에서 2분간 인큐베이션한 후,
5×완충액 2 ㎕
DTT 1 ㎕
dNTP Mix 1 ㎕
PowerScript 역전사 효소 1 ㎕
를 첨가하여 42 ℃에서 1.5시간 인큐베이션하였다.
또한, 50 ㎕의 트리신 완충액을 첨가한 후, 72 ℃에서 7분간 인큐베이션하여 제1 가닥 cDNA를 취득하였다.
불변 영역의 코딩 영역 전체를 포함하는 DNA를 취득하기 위해서, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 또한 각 항체 유전자의 5' 말단의 ATG 개시 코돈 부근에 결합하는 서열을 갖는 합성 DNA(5' 프라이머)와 인간 항체 유전자 3' 비번역 영역에 특이적으로 결합하는 합성 DNA(3' 프라이머)를 프라이머 셋트로서 이용하여 PCR에 의한 증폭 반응을 행하였다. 이 증폭 반응에 의해, 항체 유전자(cDNA)의 ATG 개시 코돈으로부터, 정지 코돈을 포함하는 3' 비번역 영역까지의 전장 서열을 얻을 수 있다.
125N26F6AA의 중쇄의 DNA 증폭은 H쇄 5' 프라이머: N26H5SalI(서열 58)과 H쇄 3' 프라이머: H_3UTR1848(5'-CGGGGTACGTGCCAAGCATCCTCGTG-3', 서열 74)의 프라이머 셋트, 또는 H쇄 5' 프라이머: N26H5SalI(서열 58)과 H쇄 3' 프라이머: H_3UTR1875(5'-ATGCTGGGCGCCCGGGAAGTATGTAC-3', 서열 75)의 프라이머의 조합으로, 94 ℃ 15초, 68 ℃ 2분의 인큐베이션 사이클을 35회 반복하였다. 한편, 125N26F6AA의 경쇄(κ)의 증폭은 L쇄 5'용 프라이머: N26KA10Minor L Bgl(서열 64)와 L쇄 3'용 프라이머: L_3UTR_823(5'-GAAAGATGAGCTGGAGGACCGCAATA-3', 서열 76)의 프라이머 셋트를 이용하여 행하였다. 프라이머 이외의 반응액 조성은 실시예 13의 (2)-1과 동일한 조성으로 실시하였다.
125M10AA의 중쇄의 DNA 증폭용으로서는, H쇄 5'용 프라이머: M10H5Sal(서열 70)과 H쇄 3'용 프라이머: H_3UTR1848(서열 74)의 프라이머 셋트, 또는 H쇄 5' 프라이머: M10H5Sal(서열 70)과 H쇄 3' 프라이머: H3UTR1875(서열 75)이고, 125M10AA의 경쇄(κ)의 DNA 증폭용으로서는, L쇄 5'용 프라이머: M10KBgl(서열 66)과 L쇄 3'용 프라이머: L_3UTR_823(서열 76)의 프라이머 셋트이다.
증폭시킨 각 PCR 단편은 에탄올 침전으로 회수한 후, 아가로스 겔 전기 영동으로 회수하여 QIAquick 겔 추출 키트((주)퀴아겐사 제조)로써 정제하였다. 정제한 증폭 단편은 각각 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로겐사 제조)의 PCR 4 Blunt-TOPO 벡터에 서브클로닝하였다. 취득한 클론에 대하여, 시퀀싱 주형용 DNA 제조 시약인 TempliPhi DNA 증폭 키트(아마샴 바이오사이언스 가부시끼가이샤 제조)를 사용하고, 첨부 프로토콜에 따라서 시퀀싱 주형용 DNA를 제조하여 인서트 DNA의 염기 서열을 결정하였다. 인간 항체 중쇄의 DNA 염기 서열 해석의 프라이머로서 M13FW(서열 3), M13RV(서열 4), hh4(서열 21), hh1(5'-CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC-3')(서열 77), CMVH903F(5'-GACACCCTCATGATCTCCCGGACC-3')(서열 78), CMVHR1303(5'-TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT-3')(서열 79), hh-6(5'-GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTT-3')(서열 80), hh-2(서열 20), H_3UTR1848(서열 74) 및 H_3UTR1875(서열 75)를, 또한 인간 항체 경쇄(κ)의 DNA 염기 서열 해석용 프라이머로서 M13FW(서열 3), M13RV(서열 4), hk-5(서열 19) 및 hk-1(5'-TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC-3')(서열 81)을 이용하였다.
125N26F6AA 항체의 중쇄, 및 경쇄 전체 영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 및 경쇄 전체 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00041
Figure 112007026367397-pct00042
Figure 112007026367397-pct00043
Figure 112007026367397-pct00044
Figure 112007026367397-pct00045
Figure 112007026367397-pct00046
Figure 112007026367397-pct00047
Figure 112007026367397-pct00048
Figure 112007026367397-pct00049
125M10AA 항체의 중쇄 및 경쇄 전체 영역을 코딩하는 DNA, 및 중쇄 및 경쇄 전체 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00050
Figure 112007026367397-pct00051
Figure 112007026367397-pct00052
Figure 112007026367397-pct00053
Figure 112007026367397-pct00054
Figure 112007026367397-pct00055
Figure 112007026367397-pct00056
Figure 112007026367397-pct00057
Figure 112007026367397-pct00058
실시예 15 재조합 항체 발현 벡터의 구축
263A17, 125M10AA, 125M165DAAA, 125N26F6AA 및 125Q54AAAA 항체에 대해서는 재조합 항체 발현 벡터를 구축하였다.
263A17, 125M165DAAA 및 125N26F6AA 항체에 대해서는, 취득한 항체의 HV쇄를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 말단에 연결용 제한 효소 부위(5' 말단측 SalI, 3' 말단측 NheI)를 부가하도록 설계한 프라이머를 사용하였다. 구체적인 프라이머는 이하와 같았다.
263A17;
Figure 112007026367397-pct00059
각 A33 항체의 HV를 PCR로 증폭(94 ℃ 3분 → 94 ℃ 10초, 68 ℃ 45초(35 사이클) → 72 ℃ 7분)시켰다. 증폭시킨 DNA 단편을 SalI, NheI로 소화시키고, 동일 효소로 절단한 N5KG1-Val Lark 벡터(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(미국 특허 6001358)의 개변 벡터)에 도입하였다. 삽입된 서열이 서브클로닝한 HV의 DNA 염기 서열 해석에 의해 결정된 것과 동일한 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인하였다.
이어서, 얻은 HV가 삽입된 플라스미드 벡터에 LV의 삽입을 행하였다. 취득한 항체의 LV쇄를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 말단에 연결용 제한 효소 부위(5' 말단측 BglII, 3' 말단측 BsiWI)를 부가하도록 설계한 프라이머를 사용하였다. 구체적인 프라이머는 이하와 같았다.
263A17;
Figure 112007026367397-pct00060
각 A33 항체의 LV를 PCR로 증폭(94 ℃ 3분 → 94 ℃ 10초, 68 ℃ 45초(35 사이클) → 72 ℃ 7분)시켰다. 증폭시킨 DNA 단편을 BglII, BsiWI로 소화시키고, 동일 효소로 절단한 N5KG1-HV 벡터에 도입하였다. 삽입된 서열이 서브클로닝한 LV의 DNA 염기 서열 해석에 의해 결정된 것과 동일한 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인하였다.
125M10AA 및 125Q54AAAA 항체에 대해서는, 취득한 항체의 LV쇄를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 말단에 연결용 제한 효소 부위(5' 말단측 BgIII, 3' 말단측 BsiWI)를 부가하도록 설계한 프라이머를 사용하였다. 구체적인 프라이머는 이하와 같았다.
Figure 112007026367397-pct00061
각 A33 항체의 LV를 PCR로 증폭(94 ℃ 3분 → 94 ℃ 10초, 68 ℃, 45초(35 사이클) → 72 ℃ 7분)시켰다. 증폭시킨 DNA 단편을 BglII, BsiWI로 소화시키고, 동일 효소로 절단한 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입하였다. 삽입된 서열이 서브클로닝한 LV의 DNA 염기 서열 해석에 의해 결정된 것과 동일한 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인하였다.
이어서, 얻은 LV가 삽입된 플라스미드 벡터에 HV의 삽입을 행하였다. 취득한 항체의 HV쇄를 포함하는 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, 말단에 연결용 제한 효소 부위(5' 말단측 SalI, 3' 말단측 NheI)를 부가하도록 설계한 프라이머를 사용하였다. 구체적인 프라이머는 이하와 같았다.
Figure 112007026367397-pct00062
각 A33 항체의 HV를 PCR로 증폭(94 ℃ 3분 → 94 ℃ 10초, 68 ℃ 45초(35 사이클) → 72 ℃ 7분)시켰다. 증폭시킨 DNA 단편을 SalI, NheI로 소화시키고, 동일 효소로 절단한 N5KG1-LV 벡터에 도입하였다. 삽입된 서열이 서브클로닝한 HV의 DNA 염기 서열 해석에 의해 결정된 것과 동일한 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인하였다.
표 5에 합성 DNA의 염기 서열을, 표 6에 재조합 벡터 및 생산되는 항체의 명칭을 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00063
Figure 112007026367397-pct00064
실시예 16 재조합 항체의 제조
실시예 15에서 구축한 재조합 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 재조합 항체 발현 세포를 제조하였다. 발현용 숙주 세포에는, 예를 들면 CHO 세포의 dhfr 결손주(ATCC CRL-9096), CHO-Ras(문헌[Katakura Y., et al., Cytotechnology, 31: 103-109, 1999]), HEK293T(ATCC CRL-11268) 등이 이용된다.
숙주 세포에의 벡터의 도입은 전기 천공법이나 리포펙션 등에 의해 실시하였다. 전기 천공법은 항체 발현 벡터 약 2 ㎍을 제한 효소로 선상화하고, Bio-Rad 전기 천공기를 이용하여 350 V, 500 μF의 조건에서 4×106개의 CHO 세포에 유전자를 도입하여 96웰 배양 플레이트에 파종하였다. 리포펙션은 LipofectAMINE Plus(기브코 비알엘사 제조)를 이용하여 메뉴얼에 따라서 실시하였다. 벡터의 도입 처리 후, 발현 벡터의 선택 마커에 대응하는 약제를 첨가하여 배양을 계속하였다. 콜로니를 확인한 후, 실시예 6에 나타낸 방법에 의해 항체 발현주를 선별하였다. 선별한 세포로부터의 항체 정제는 흡착 후 PBS로 세정하고, Mab Select Protein A 3.2×10 cm 칼럼(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)를 이용하여 흡착 후 PBS로 세정하고, 20 mM (글리신) 시트르산나트륨, 50 mM NaCl(pH 2.7) 완충액으로 용출시켰다. 용출액을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 중화시켰다. 다음에, 음이온 교환 칼럼인 Hitrap Q HP 세파로스 칼럼(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)ㅇ으로, 또한 동일하게 양이온 칼럼인 Hitrap SP HP 세파로스 칼럼(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)로 정제하였다. 제조된 항체 용액은 투석막(10000 컷트, Spectrum Laboratories사 제조)를 이용하여 PBS로 치환하고, 공경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(밀리포어사 제조)로 여과 멸균하여, 순도를 적어도 95 ％ 이상, 엔도톡신 0.1 EU/mg 이하의 정제 항체를 취득하였다. 재조합 정제 항 A33 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/mL를 1.4 OD로서 산출하였다.
실시예 17 재조합 항체에 의한 반응 시험
A33 항원을 발현하는 인간 대장암 세포주 COL0205 세포, LS174T 세포(ATCC No. CL-188) 및 NCI-H508 세포(ATCC No. CCL-253)에 대한 실시예 16에서 취득한 재조합 항체의 반응성 검토를 FCM에서 행하였다. 또한, 음성 대조군 세포로서 A33 항원을 발현하지 않는 인간 대장암 세포주 HT-29 세포(ATCC No. HTB-38)도 행하였다. 시험 방법은 실시예 9와 동일하게 행하였다.
그 결과를 표 7에 나타내었다. COL0205 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 45, LS174T 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 100, NCI-H508 세포에서는 평균 형광 강도 반값을 175로 하고, 거기에 도달하는 항체 농도가 10<=x<100 ng/ml일 때는 +++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 ++, 1000<=x<10000 ng/ml일 때는 +, 결합이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다. A33 항원을 발현하는 어떤 세포에 대해서도, 재조합 항체는 결합을 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00065
실시예 18 재조합 항체의 마우스 항 A33 항체와의 경합 시험
실시예 16에서 취득한 재조합 항체를 마우스 항 A33 항체와 동일한 에피토프를 인식하는가 아닌가를 FCM을 이용한 경합 실험으로 검토하였다. 시험 방법은 실시예 10과 동일하게 행하였다.
실시예 10의 각 모노클로날 정제 항체의 결과와 동일하게, rec263 및 recM10은 「논-블로커」, recM165 및 recN26은 「블로커」, recQ54는 「부분적 블로커」로 분류되었다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00066
실시예 19 재조합 항체에서의 세포 상해성 시험
실시예 16에서 취득한 재조합 항체에서의 ADCC 및 CDC의 측정을 실시하였다. ADCC 검정은 51Cr 표지한 표적 세포(COL0205 또는 NCI-H508) 5000개에 대하여 실시예 11에 기재된 방법으로 취득한 정상 건강인 말초혈 단핵구 50만개를, V 바닥 96웰 플레이트(코스타사 제조) 중에서 전체 용량 200 ㎕로, 각 항체 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에서 4시간 배양하였다.
CDC 검정은 51Cr 표지한 표적 세포(COL0205 또는 NCI-H508) 5000개에 대하여 최종 농도 5 ％의 인간 혈청 유래 보체(시그마사 제조)를, V 바닥 96웰 플레이트 중에서 전체 용량 200 ㎕로, 각 항체 농도와 함께 37 ℃, 5 ％ Co2 존재하에서 4시간 배양하였다.
시험 방법은 실시예 12와 동일하게 행하였다.
그 결과를 도 2A 내지 도 2D 및 표 9에 나타내었다. ADCC는 특이적 용해율 반값을 COL0205 세포를 타겟으로 하였을 때는 12.5 ％로 하고, NCI-H508 세포를 타겟으로 하였을 때는 30 ％로 하였다. 거기에 도달하는 항체 농도가 1<=x<10 ng/ml일 때는 +++, 10<=x<100 ng/ml일 때는 ++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 +, 특이적 용해율이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다. CDC에서는 특이적 용해율 반값을 COL0205 세포를 타겟으로 하였을 때는 7 ％로 하고, NCI-H508 세포를 타겟으로 하였을 때는 20 ％로 하였다. 거기에 도달하는 항체 농도가 10<=x<100 ng/ml일 때는 +++, 100<=x<1000 ng/ml일 때는 ++, x>=1000 ng/ml일 때는 +, 특이적 용해율이 확인되지 않은 경우에는 -로 나타내었다. ADCC에서는 cA33, recM10 및 recQ54가 높은 상해 활성을 나타내었다. 한편, CDC에서는 recM10이 높은 상해 활성을 나타내었다.
Figure 112007026367397-pct00067
실시예 20 정제 항체 및 재조합 항체에 의한 웨스턴 블롯 해석
마우스 항 A33 항체 및 인간화된 A33 항체는 구조적 에피토프를 인식한다고 보고되었다. 즉, 웨스턴 블로팅 해석에서 환원 조건(5 ％ β-메르캅토에탄올)하에서는 반응성이 확인되지 않는다고 보고되었다. 따라서, 인간 항 A33 정제 항체 및 재조합 항체의 반응성에 대하여 조사하는 것을 목적으로 하여 웨스턴 블롯 해석을 실시하였다.
실시예 3에서 제조한 shA33EX-hFc 단백질을 환원(5 ％ β-메르캅토에탄올) 및 비환원 조건하에서 10 내지 20 ％ 폴리아크릴아미드 구배 겔(다이이찌 가가꾸 야꾸힝사 제조)에 의한 SDS-PAGE에 의해서 분리하였다. 이 때, 1 레인당 shA33EX-hFc 단백질이 2.5 ng이 되도록 희석하였다. 한편, 마커로서 비오틴화 SDS-PAGE 스텐다드(표준) 브로드레인지(바이오라드사 제조)도 1 레인에 적용하였다. shA33EX-hFc 단백질을 PVDF막에 팬더 세미드라이 일렉트로블로터(Panther Semidry Electroblotter)(다이이찌 가가꾸 야꾸힝)로 150 mA/매, 1시간 블로팅하였다. TBS 완충액 및 0.05 ％ 트윈 함유 TBS(TTBS)로 단백질이 블로팅된 막을 세정하고, 블록에이스(다이니폰 세이야꾸 제조)로 블로팅을 행하였다. TTBS로 2회를 세정하였다. 125M10AA, 125Q54AAAA, 125M96ABA, 125Q47BA 및 125R5AAAA는 하이브리도마 정제 항체를 1 ㎍/ml로 실온 60분 동안 반응시켰다. 한편, 키메라 항 A33 항체, 125M165DAAA(즉 recM165) 및 125N26F6AA(즉 recN26)은 재조합 항체를 1 ㎍/ml로 실온 60분 동안 반응시켰다. TTBS로 세정한 후, 검출용 항체로서 1000배 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 염소 항 인간 Kappa쇄 F(ab')2 항체(바이오소스사 제조)를 사용하였다. 이 때, 마커를 검출하기 위해서 3000배 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 스트렙토아비딘도 첨가하여 반응시켰다. TTBS로 2회, PBS로 1회 세정한 후, 웨스턴 블로팅 디텍션 시스템 ECL-plus(아마샴 바이오사이언스사 제조)를 이용하여 밴드를 검출하였다. 이미지 분석기 LAS-100(후지 필름사 제조)을 이용하여 화학 발광을 도입하고, 화상 처리를 행하였다.
결과를 도 3A 및 도 3B에 나타내었다. 그 결과, 125Q54AAAA만 환원 조건하에서도 약 67 kD 단백질의 밴드와 반응하였다. 그 밖의 항체는 키메라 항 A33 항체와 동일하게 비환원 조건하에서만 반응이 확인되었다.
실시예 21 정제 항체 및 재조합 항체에서의 면역 조직 화학
인간 항 A33 항체의 특이성, 선택성이 키메라 항 A33 항체와 동등한가 아닌가를 평가하기 위해서, 면역 조직 화학에 의해 종양 조직 세그먼트 및 정상 조직 세그먼트와의 반응성을 해석하였다.
(1) 정제 항체 및 재조합 항체의 형광 표지
실시예 8에 의해 제조된 각 모노클로날 정제 항체 또는 실시예 16에서 제조된 재조합 항체, rec263, 125M10AA, recM165, recN26 및 125Q54AAA를 Alexa Flour TM488(몰레큘라 프로브사 제조)로 직접 표지하였다. 양성 대조군으로서 키메라 항 A33 항체, 음성 대조군으로서 항 DNP-IgG1 항체도 동일하게 직접 표지하였다. 정제 항체 및 재조합 항체의 형광 표지화는 이하와 같이 행하였다. Alexa FluorTM488을 부속 설명서에 따라서 실시예 8 또는 실시예 16에서 제조한 항 A33 항체에 결합시켰다. 2 mg/ml의 정제 항체 및 재조합 항체 0.5 ml에 50 ㎕의 1 M 탄산 완충액을 첨가 후, Alexa FluorTM488과 혼합하여 교반하면서 실온에서 1시간 반응시켰다. 히드록실아민을 첨가하여 반응을 중지시키고, 겔 여과 칼럼(NAP5, 아마샴 파마시아 바이오텍사 제조)에 혼합액을 사용하여, 항체에 미결합된 Alexa FluorTM488을 제거하였다. 이 조건에서 항체 1 분자에 4 내지 6개의 형광 물질이 결합하였다. 형광 표지된 항체는 COL0205 세포에 결합하고, 그의 결합 활성은 표지되지 않은 항체와 동등하였다.
(2) 면역 조직 화학
사용한 조직 세그먼트는 인간 성인 결장암 동결 조직 세그먼트(바이오체인사 제조), 인간 성인 정상 결장 동결 조직 세그먼트(바이오체인사 제조), 인간 성인 소장 동결 조직 세그먼트(바이오체인사 제조) 및 인간 성인 위 동결 조직 세그먼트(바이오체인사 제조)이다. 10 ％ 염소 혈청(기브코 비알엘사 제조) 함유 PBS로 실온에서 1 내지 2시간 블로킹하였다. PBS로 2회 세정하고, 실시예 21(1)에서 Alexa Fluor488로써 표지된 각 모노클로날 정제 항체 또는 재조합 항체를 1 ㎍/ml로 실온에서 30 내지 60분 반응시켰다. 그 후, 밀봉하고, 형광 현미경(BX51, 올림푸스사 제조)으로 관찰하고 화상은 올림푸스사 제조 DP70에서 해석하였다.
그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다. Garin-Chesa P. 등이 보고한 대장암 조직의 면역 조직 염색(문헌[Int. J. 0ncology 1996 9: 465-471])과 동일하게 키메라 항 A33 항체, rec263, 125M10AA, recM165, recN26 및 125Q54AAA 모두 결장암 조직의 선상피 세포나 형성 이상 선 구조에 폭넓고 균일하며 강하게 염색되는 것이 확인되었다(도 4). 또한, 정상 소장 조직(도 5), 정상 결장 조직(도 6)에도 키메라 항 A33 항체와 동일한 염색이 확인되었다. 한편, 정상 위 조직에서는, 논문에서도 염색이 확인되지 않은 것과 동일하게 본 항체에서도 염색이 확인되지 않았다. 또한, 음성 대조군의 항 DNP-IgG1 항체에서는, 모든 조직에서 염색은 확인되지 않았다.
실시예 22 마우스 담암 모델에 대한 하이브리도마 정제 항체 및 재조합체의 효과
실시예 16으로부터 얻어진 인간 항 A33 재조합 항체의 효과를, 이하에 기재하는 방법에 따라서 마우스 담암 모델을 이용하여 검토하였다. 사용한 대장암 세포주는 COL0205 세포와 NCI-H508 세포이다.
COL0205 세포주를 사용한 마우스 담암 모델의 제조 방법은 이하와 같다. 6주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아사로부터 구입)의 배부(背部) 피하에, 대장암 세포주 COL0205를 5×106개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 후 1, 2, 7 및 10일 후에 10마리를 1군으로 하여, 담암 마우스의 복강내에 키메라 항 A33 및 rec263 항체 10, 100 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS에 용해시킨 것)를 투여하고, 이식 7, 9, 11, 14, 17, 21일 후의 종양 크기를 측정하였다. 항체의 음성 대조군으로서 동량의 인간 항 DNP-IgG1 항체를 사용하였다. 「비히클」은 항체 투여를 하는 데 있어서 용해시키기 위한 매체로서 사용한 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS(200 ㎕)를 나타낸다.
NCI-H508 세포주를 사용한 마우스 담암 모델의 제조 방법은 이하와 같다. 6주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아사로부터 구입)의 배부 피하에, 대장암 세포주 NCI-H508을 종양 세포의 생착성을 높이는 마우스 악성 육종을 포함하는 매트리겔(벡톤 디킨슨 바이오사이언스사 제조)와 1:1의 용량이 되도록, 1×107개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 후 1, 4 및 7일 후에 10마리를 1군으로 하여, 담암 마우스의 복강내에 키메라 항 A33 및 rec263 항체 10, 100 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS에 용해시킨 것)를 투여하고, 이식 7, 11, 14, 18, 21, 27, 33, 40, 48, 55, 62일 후의 종양 크기를 측정하였다. 항체의 음성 대조군으로서 동량의 인간 항 DNP-IgG1 항체를 사용하였다. 「비히클」은 항체 투여를 하는 데 있어서 용해시키기 위한 매체로서 사용한 0.1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS(200 ㎕)를 나타낸다.
이상의 실험 결과를 도 7에 나타내었다.
COL0205 세포주를 이식한 계에서는, rec263 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 7, 9, 11일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 이식 후 7, 9, 11, 14일 후에 종양 크기에 유의한 차가 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 이식 후 14, 17일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 한편, 키메라 항 A33 재조합 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 7, 11일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 이식 후 7, 9, 11, 14, 17, 21일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 7, 9, 14일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 이식 후 7, 9, 11, 14, 17, 21일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05)(도 7A).
한편, NCI-H508 세포주를 이식한 계에서는, rec263 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는 항종양 효과를 전혀 나타내지 않았다. 한편, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 18일 이후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여, 거의 모든 측정일에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 한편, 키메라 항 A33 재조합 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 21, 55, 62일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 이식 후 7, 21, 33일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 거의 모든 측정일에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 항 DNP-IgG1 항체 투여군과 비교하여 이식 후 33일 후까지 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05).
이상의 점으로부터, 본 발명의 항체는 2종의 대장암 세포주를 이용한 마우스 담암 모델에서 높은 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났다(도 7B).
인간 항 A33 생산 하이브리도마 정제 항체 및 인간 항 A33 재조합 항체의 효과를 마우스 담암 모델을 이용하여 검토하였다. 사용한 대장암 세포주는 COL0205 세포와 NCI-H508 세포이다.
(125M10AA, 125M165DAAA 및 125M96ABA 하이브리도마로부터 정제한 항체의 COL0205 세포주를 사용하였을 때의 항종양 효과)
6주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아사로부터 구입)의 배부 피하에 대장암 세포주 COL0205를 5×106개/마우스 개체로 이식하였다. 이식 후 1, 3, 7, 10, 14, 17일 후에 10마리를 1군으로 하여(비히클 투여군은 15마리를 1군), 담암 마우스의 복강내에 125M10AA, 125M165DAAA 및 125M96ABA 항체 20 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS에 용해시킨 것)를 투여하고, 이식 7, 10, 12, 14, 17일 후의 종양 크기를 측정하였다. 「비히클」은 항체 투여를 하는 데 있어서 용해시키기 위한 매체로서 사용한 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS(200 ㎕)를 나타낸다.
이상의 실험 결과를 도 7C에 나타내었다. 도 7C 중, M10은 125M10AA 항체를, M96은 125M96ABA 항체를, M165는 125M165DAAA 항체를 나타낸다. 125M10AA 항체를 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 모든 측정일에 있어서 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 125M165DAAA 항체를 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 12, 14, 17일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(P<0.05). 한편, 125M96ABA 항체를 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 12, 14일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05).
(N26 및 M165 재조합 항체의 COL0205 및 NCI-H508 세포주를 사용하였을 때의 항종양 효과)
6주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아사로부터 구입)의 배부 피하에 대장암 세포주 COL0205를 5×106/마우스 개체로 이식하였다. 이식 후 1, 3, 6일 후에 10마리를 1군으로 하여, 담암 마우스의 복강내에 recN26 및 recM165 항체 10 및 100 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS에 용해시킨 것)를 투여하고, 이식 8, 10, 13, 15, 17, 20, 23일 후의 종양 크기를 측정하였다.
이상의 실험 결과를 도 7D에 나타내었다. 도 7D 중, M165-10은 recM165 항체(10 ㎍/마리 투여)를, M165-100은 recM165 항체(100 ㎍/마리 투여)를, N26-10은 recN26 항체(10 ㎍/마리 투여)를, N26-100은 recN26 항체(100 ㎍/마리 투여)를 나타낸다. recN26 항체를 10 ㎍/마리로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 10, 13일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). recN26 항체를 100 ㎍/마리로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 8, 10, 13,15, 17, 20일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(P<0.05). 또한, recM165 항체를 100 ㎍/마리로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 8, 10, 13, 15, 17, 20일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05).
6주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아사로부터 구입)의 배부 피하에, 대장암 세포주 NCI-H508을 종양 세포의 생착성을 높이는 마우스 악성 육종을 포함하는 매트리겔(벡톤 디킨슨 바이오사이언스사 제조)과 1:1의 용량이 되도록, 1×107/마우스 개체로 이식하였다. 이식 후 1, 4 및 7일 후에 10마리 1군(비히클 투여군은 12마리 1군)으로 하여, 담암 마우스의 복강내에 recN26 및 recM165 항체 10 및 100 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS에 용해시킨 것)를 투여하고, 이식 후 11, 18, 28, 36, 43, 50, 57, 64일 후의 종양 크기를 측정하였다.
이상의 실험 결과를 도 7E에 나타내었다. 도 7E 중, N26-10은 recN26 항체(10 ㎍/마리 투여)를, N26-100은 recN26 항체(100 ㎍/마리 투여)를, M165-10은 recM165 항체(10 ㎍/마리 투여)를, M165-100은 recM165 항체(100 ㎍/마리 투여)를 나타낸다. NCI-H508 세포주를 이식한 계에서는, recN26 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 11, 18, 36, 43일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 11, 18, 28, 36, 50일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 한편, recM165 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 11, 18일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 모든 측정일에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05).
(M10 및 Q54 재조합 항체의 NCI-H508 세포주를 사용하였을 때의 항종양 효과)
6주령의 Balb/c 누드 마우스(닛본 구레아사로부터 구입)의 배부 피하에, 대장암 세포주 NCI-H508을 종양 세포의 생착성을 높이는 마우스 악성 육종을 포함하는 매트리겔(벡톤 디킨슨 바이오사이언스사 제조)과 1:1의 용량이 되도록, 1×107/마우스 개체로 이식하였다. 이식 후 1, 4 및 7일 후에 10마리를 1군으로 하여, 담암 마우스의 복강내에 recM10 및 recQ54 항체 10 및 100 ㎍/마우스 개체(200 ㎕의 1 ％ 누드 마우스 혈청 함유 PBS에 용해시킨 것)를 투여하고, 이식 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63일 후의 종양 크기를 측정하였다.
이상의 실험 결과를 도 7F에 나타내었다. 도 7F 중, M10-10은 recM10 항체(10 ㎍/마리 투여)를, M10-100은 recM10 항체(100 ㎍/마리 투여)를, Q54-10은 recQ54 항체(10 ㎍/마리 투여)를, Q54-100은 recQ54 항체(100 ㎍/마리 투여)를 나타낸다. NCI-H508 세포주를 이식한 계에서는, recM10 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 14, 21, 28, 42, 49, 56일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 한편, recQ54 항체를 10 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 28, 42일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05). 또한, 100 ㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 비히클 투여군과 비교하여 이식 후 14, 21, 28, 35, 42, 56일 후에 종양을 유의하게 억제하는 것이 확인되었다(p<0.05).
본 명세서에 인용된 모든 간행물은 그 내용의 전체를 본 명세서에 포함하는 것으로 한다. 또한, 첨부 청구 범위에 기재되는 기술 사상 및 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위내에서 본 발명의 다양한 변형 및 변경이 가능한 것은 당업자에는 용이하게 이해될 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변경도 포함하는 것으로 한다.
본 발명에 의해, A33을 발현하는 세포에서 기인하는 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료약으로서 A33 다형을 갖는 환자에게도 유용한 분자가 제공되었다.
현재 A33의 mRNA에는 9개의 다형이 알려져 있지만, 그 중 7개는 비번역 영역에서의 다형이다. 또한, 나머지 2개 중 1개는 3번째 코돈에서의 다형이기 때문에 아미노산 치환을 하지 않는 침묵 돌연변이이다. 또한, 나머지 2개 중 다른 1개는 아미노산 치환을 수반하는 다형이지만 시그널 서열내에 있다. 이상의 점으로부터, 본 항체는 A33의 다형에 관계없이 치료, 예방제에 효과적이다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.
<110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> Anti A33 antibody <130> PH-2569-PCT <140> <141> <150> JP 2004/259090 <151> 2004-09-06 <160> 89 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 gcccttggtg ctagctgaag agacggtgac cagagtccct tg 42 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 gtaaaacgac ggccagtg 18 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 caggaaacag ctatgac 17 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 agagagaggt cgacccacca tgaactttgg gctgagctta gtt 43 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 agagagagag atctctcacc atgggcatca agatggagtt tcag 44 <210> 7 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgaactttg ggctgagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcgc tttcagtacc tatgacatgt cttgggttcg ccagactccg 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactattta 240 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacagtg ccaggaacac cctatacctg 300 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcacc gactacggta 360 gtcccgtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctcttcagc tagc 414 <210> 8 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Arg Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Pro Thr Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 <210> 9 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgggcatca agatggagtt tcagacccag gtctttgtat tcgtgttgct ctggttgtct 60 ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaaat tcatgtccac atcagtagga 120 gacagggtca gcatcacctg caaggccagt cagaatgttc gtactgttgt agcctggtat 180 caacagaaac cagggcagtc tcctaaaaca ctgatttact tggcctccaa ccggcacact 240 ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccattagc 300 aatgtgcaat ctgaagacct ggcagattat ttctgtctgc aacattggag ttatcctctc 360 acgttcggct cggggacaaa gttggaagta aaacgt 396 <210> 10 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Ile Lys Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Val Leu 1 5 10 15 Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln 20 25 30 Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Val Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys 100 105 110 Leu Gln His Trp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Val Lys Arg 130 <210> 11 <211> 2793 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctaccccttt gtgagcagtc taggactttg tacacctgtt aagtagggag aaggcagggg 60 aggtggctgg tttaagggga acttgaggga agtagggaag actcctcttg ggacctttgg 120 agtaggtgac acatgagccc agccccagct cacctgccaa tccagctgag gagctcacct 180 gccaatccag ctgaggctgg gcagaggtgg gtgagaagag ggaaaattgc agggacctcc 240 agttgggcca ggccagaagc tgctgtagct ttaaccagac agctcagacc tgtctggagg 300 ctgccagtga caggttaggt ttagggcaga gaagaagcaa gaccatggtg gggaagatgt 360 ggcctgtgtt gtggacactc tgtgcagtca gggtgaccgt cgatgccatc tctgtggaaa 420 ctccgcagga cgttcttcgg gcttcgcagg gaaagagtgt caccctgccc tgcacctacc 480 acacttccac ctccagtcga gagggactta ttcaatggga taagctcctc ctcactcata 540 cggaaagggt ggtcatctgg ccgttttcaa acaaaaacta catccatggt gagctttata 600 agaatcgcgt cagcatatcc aacaatgctg agcagtccga tgcctccatc accattgatc 660 agctgaccat ggctgacaac ggcacctacg agtgttctgt ctcgctgatg tcagacctgg 720 agggcaacac caagtcacgt gtccgcctgt tggtcctcgt gccaccctcc aaaccagaat 780 gcggcatcga gggagagacc ataattggga acaacatcca gctgacctgc caatcaaagg 840 agggctcacc aacccctcag tacagctgga agaggtacaa catcctgaat caggagcagc 900 ccctggccca gccagcctca ggtcagcctg tctccctgaa gaatatctcc acagacacat 960 cgggttacta catctgtacc tccagcaatg aggaggggac gcagttctgc aacatcacgg 1020 tggccgtcag atctccctcc atgaacgtgg ccctgtatgt gggcatcgcg gtgggcgtgg 1080 ttgcagccct cattatcatt ggcatcatca tctactgctg ctgctgccga gggaaggacg 1140 acaacactga agacaaggag gatgcaaggc cgaaccggga agcctatgag gagccaccag 1200 agcagctaag agaactttcc agagagaggg aggaggagga tgactacagg caagaagagc 1260 agaggagcac tgggcgtgaa tccccggacc acctcgacca gtgacaggcc agcagcagag 1320 ggcggcggag gaagggttag gggttcattc tcccgcttcc tggcctccct tctcctttct 1380 aagccctgtt ctcctgtccc tccatcccag acattgatgg ggacatttct tccccagtgt 1440 cagctgtggg gaacatggct ggcctggtaa gggggtccct gtgctgatcc tgctgacctc 1500 actgtcctgt gaagtaaccc ctcctggctg tgacacctgg tgcgggcctg gccctcactc 1560 aagaccaggc tgcagcctcc acttccctcg tagttggcag gagctcctgg aagcacagcg 1620 ctgagcatgg ggcgctccca ctcagaactc tccagggagg cgatgccagc cttggggggt 1680 gggggctgtc ctgctcacct gtgtgcccag cacctggagg ggcaccaggt ggagggtttg 1740 cactccacac atctttcttg aatgaatgaa agaataagtg agtatgcttg ggccctgcat 1800 tggcctggcc tccagctccc actccctttc caacctcact tcccgtagct gccagtatgt 1860 tccaaaccct cctgggaagg ccacctccca ctcctgctgc acaggccctg gggagctttt 1920 gcccacacac tttccatctc tgcctgtcaa tatcgtacct gtccctccag gcccatctca 1980 aatcacaagg atttctctaa ccctatccta attgtccaca tacgtggaaa caatcctgtt 2040 actctgtccc acgtccaatc atgggccaca aggcacagtc ttctgagcga gtgctctcac 2100 tgtattagag cgccagctcc ttggggcagg gcctgggcct catggctttt gctttccctg 2160 aagccctagt agctggcgcc catcctagtg ggcacttaag cttaattggg gaaactgctt 2220 tgattggttg tgccttccct tctctggtct ccttgagatg atcgtagaca cagggatgat 2280 tcccacccaa acccacgtat tcattcagtg agttaaacac gaattgattt aaagtgaaca 2340 cacacaaggg agcttgcttg cagatggtct gagttcttgt gtcctggtaa ttcctctcca 2400 ggccagaata attggcatgt ctcctcaacc cacatggggt tcctggttgt tcctgcatcc 2460 cgatacctca gccctggccc tgcccagccc atttgggctc tggttttctg gtggggctgt 2520 cctgctgccc tcccacagcc tccttctgtt tgtcgagcat ttcttctact cttgagagct 2580 caggcagcgt tagggctgct taggtctcat ggaccagtgg ctggtctcac ccaactgcag 2640 tttactattg ctatcttttc tggatgatca gaaaaataat tccataaatc tattgtctac 2700 ttgcgatttt ttaaaaaatg tatattttta tatatattgt taaatccttt gcttcattcc 2760 aaatgctttc agtaataata aaattgtggg tgg 2793 <210> 12 <211> 319 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Gly Lys Met Trp Pro Val Leu Trp Thr Leu Cys Ala Val Arg 1 5 10 15 Val Thr Val Asp Ala Ile Ser Val Glu Thr Pro Gln Asp Val Leu Arg 20 25 30 Ala Ser Gln Gly Lys Ser Val Thr Leu Pro Cys Thr Tyr His Thr Ser 35 40 45 Thr Ser Ser Arg Glu Gly Leu Ile Gln Trp Asp Lys Leu Leu Leu Thr 50 55 60 His Thr Glu Arg Val Val Ile Trp Pro Phe Ser Asn Lys Asn Tyr Ile 65 70 75 80 His Gly Glu Leu Tyr Lys Asn Arg Val Ser Ile Ser Asn Asn Ala Glu 85 90 95 Gln Ser Asp Ala Ser Ile Thr Ile Asp Gln Leu Thr Met Ala Asp Asn 100 105 110 Gly Thr Tyr Glu Cys Ser Val Ser Leu Met Ser Asp Leu Glu Gly Asn 115 120 125 Thr Lys Ser Arg Val Arg Leu Leu Val Leu Val Pro Pro Ser Lys Pro 130 135 140 Glu Cys Gly Ile Glu Gly Glu Thr Ile Ile Gly Asn Asn Ile Gln Leu 145 150 155 160 Thr Cys Gln Ser Lys Glu Gly Ser Pro Thr Pro Gln Tyr Ser Trp Lys 165 170 175 Arg Tyr Asn Ile Leu Asn Gln Glu Gln Pro Leu Ala Gln Pro Ala Ser 180 185 190 Gly Gln Pro Val Ser Leu Lys Asn Ile Ser Thr Asp Thr Ser Gly Tyr 195 200 205 Tyr Ile Cys Thr Ser Ser Asn Glu Glu Gly Thr Gln Phe Cys Asn Ile 210 215 220 Thr Val Ala Val Arg Ser Pro Ser Met Asn Val Ala Leu Tyr Val Gly 225 230 235 240 Ile Ala Val Gly Val Val Ala Ala Leu Ile Ile Ile Gly Ile Ile Ile 245 250 255 Tyr Cys Cys Cys Cys Arg Gly Lys Asp Asp Asn Thr Glu Asp Lys Glu 260 265 270 Asp Ala Arg Pro Asn Arg Glu Ala Tyr Glu Glu Pro Pro Glu Gln Leu 275 280 285 Arg Glu Leu Ser Arg Glu Arg Glu Glu Glu Asp Asp Tyr Arg Gln Glu 290 295 300 Glu Gln Arg Ser Thr Gly Arg Glu Ser Pro Asp His Leu Asp Gln 305 310 315 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 gcagacgaat tcaagaccat ggtggggaag at 32 <210> 14 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 ctcgagcggc cgctctgctg ctggcctgtc actggtcgag gtg 43 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 15 ctcgagcggc cgccagttca tggagggaga tctgacg 37 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 16 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 17 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc 26 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 18 tgcacgccgc tggtcagggc gcctgagttc c 31 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 19 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 20 gctggagggc acggtcacca cgctg 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 21 ggtgccaggg ggaagaccga tgg 23 <210> 22 <211> 435 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagttgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtgctagtg gtggtagcac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatcggata 360 gtgggagcta cgaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420 gtctcctcag ctagc 435 <210> 23 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Ile Val Gly Ala Thr Asn Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser 145 <210> 24 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggttcc 60 agatgcgaca tccagatgac ccagtctcca ccttccgtgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcat 180 aaaccaggga aagccccaaa gctcctgatc tatggtgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttactattgt caacaggcta atagtttccc tatcaccttc 360 ggccaaggga cacgactgga gattaaacgt 390 <210> 25 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser 20 25 30 Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg 130 <210> 26 <211> 447 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 atggatctca tgtgcaagaa aatgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcggct 60 cccagatggg tcctgtccca gctgcaggtg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcat ctgcactgtc tctggtggct ccatcaggac cagtggttac 180 tactggggct ggttccgcca gcccccaggg aagggactgg agtggattgg gactagtcat 240 aatagtggga gcacctacta caacccgtcc ctcaagagtc gagtcaccat atccgtagac 300 acgtccaaga accagttctc cctgaagctg aactctgtga ccgccgcaga cacggctgtg 360 tattactgtg cgagacaagg ttacgatttt aaagtcaata tagacgtctg gggacaaggg 420 accacggtca ccgtctcctc agctagc 447 <210> 27 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Val Gln Glu 20 25 30 Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Ile Cys 35 40 45 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp 50 55 60 Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ser His 65 70 75 80 Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser 100 105 110 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Tyr 115 120 125 Asp Phe Lys Val Asn Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser 145 <210> 28 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acga 384 <210> 29 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 30 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagttat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaaaac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggcat 360 agcagtggct ggggggactt ccagcactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210> 31 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Tyr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly His Ser Ser Gly Trp Gly Asp Phe Gln 115 120 125 His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 32 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctccttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg caatttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acga 384 <210> 33 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 34 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt cctgtcccaa 60 ctgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagcact agtagttact actggggctg gatccgccag 180 ccccccggga agggcctgga atggattggg actatctatt ataatgggag cacctactac 240 agcccgtccc tcaagagtcg agtcagtata tccgtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 300 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acgtctgtgt attactgtgc gagacaaggt 360 tacgatatta aaatcaatat agacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210> 35 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile Tyr Tyr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ser 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Tyr Asp Ile Lys Ile Asn Ile Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 36 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgtt gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acga 384 <210> 37 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 38 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtcac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccctta 360 gcagctggta cgtcctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210> 39 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser His Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Leu Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 40 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa 60 attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc 120 acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat 180 cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa 300 gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttac cattcacttt cggccctggg 360 accaaagtgg atatcaaa 378 <210> 41 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser 100 105 110 Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 115 120 125 <210> 42 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagcagc tacgccatga cctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagatatt agtggtagtg gtggttatac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aacaggcgct 360 ggttcgggga gttattcccc tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210> 43 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Asp 115 120 125 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 44 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc gtacactttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga 390 <210> 45 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg 130 <210> 46 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagatatt agtggtagtg gtggttacac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aacaggcgat 360 ggttcgggga gttattcccc tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210> 47 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Asp 115 120 125 Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 48 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcaggt ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc gtacactttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga 390 <210> 49 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg 130 <210> 50 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcagatatt agtggtagtg gtggttacac atactacgca 240 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaaaac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa aacaggcgat 360 ggttcgggga gttattcccc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gctagc 426 <210> 51 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Asp Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 <210> 52 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc gtacactttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga 390 <210> 53 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg 130 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 54 gcgactaagt cgaccatgga gtttgggctg agctg 35 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 55 tgggcccttg gtgctagctg aggagacggt gaccg 35 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 56 agagagagag gtcgaccacc atggagtttg ggctgagctg ggttt 45 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 57 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggtgc 39 <210> 58 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 58 agagagagag gtcgaccacc atggagtttg ggctgagctg ggttt 45 <210> 59 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 59 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggttcc c 41 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 60 atcacagatc tctcaccatg gacatgaggg tcccc 35 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 61 acagatggtg cagccaccgt acgtttaatc tccag 35 <210> 62 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 62 agagagagag agatctcacc atggaagccc cagctcagct tctct 45 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 63 agagagagag cgtacgtttg atttccacct tggtcccttg gc 42 <210> 64 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 64 agagagagag atctctcacc atgtcgccat cacaactcat tggg 44 <210> 65 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 65 agagagagag cgtacgtttg atatccactt tggtcccagg g 41 <210> 66 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 66 agagagagag agatctcacc atggaagccc cagctcagct tctct 45 <210> 67 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 67 agagagagag cgtacgtttg atctccacct tggtccctcc g 41 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 68 agagagagag agatctcacc atggacatga gggtcctcgc tcagc 45 <210> 69 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 69 agagagagag cgtacgtttg atctccagct tggtcccctg g 41 <210> 70 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 70 agagagagag gtcgaccacc atggatctca tgtgcaagaa aatgaagc 48 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 71 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccgtggtccc t 41 <210> 72 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 72 agagagagag gtcgaccacc atggagtttg ggctgagctg gcttt 45 <210> 73 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 73 agagagagag gctagctgag gagacggtga ccagggttcc c 41 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 74 cggggtacgt gccaagcatc ctcgtg 26 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 75 atgctgggcg cccgggaagt atgtac 26 <210> 76 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 76 gaaagatgag ctggaggacc gcaata 26 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 77 ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 30 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 78 gacaccctca tgatctcccg gacc 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 79 tgttctccgg ctgcccattg ctct 24 <210> 80 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 80 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 81 tggctgcacc atctgtcttc atcttc 26 <210> 82 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtcac tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatccctta 360 gcagctggta cgtcctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413 <210> 83 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser His Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Leu Ala Ala Gly Thr Ser Tyr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 84 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 atgtcgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcctc caggggtgaa 60 attgtgctga ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc 120 acctgccggg ccagtcagag cattggtagt agcttacact ggtaccagca gaaaccagat 180 cagtctccaa agctcctcat caagtatgct tcccagtcct tctcaggggt cccctcgagg 240 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc accctcacca tcaatagcct ggaagctgaa 300 gatgctgcag cgtattactg tcatcagagt agtagtttac cattcacttt cggccctggg 360 accaaagtgg atatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 702 <210> 85 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser 100 105 110 Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 86 <211> 1434 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 atggatctca tgtgcaagaa aatgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcggct 60 cccagatggg tcctgtccca gctgcaggtg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcat ctgcactgtc tctggtggct ccatcaggac cagtggttac 180 tactggggct ggttccgcca gcccccaggg aagggactgg agtggattgg gactagtcat 240 aatagtggga gcacctacta caacccgtcc ctcaagagtc gagtcaccat atccgtagac 300 acgtccaaga accagttctc cctgaagctg aactctgtga ccgccgcaga cacggctgtg 360 tattactgtg cgagacaagg ttacgatttt aaagtcaata tagacgtctg gggacaaggg 420 accacggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 480 tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 540 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660 agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 720 gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 780 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 1434 <210> 87 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Met Asp Leu Met Cys Lys Lys Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Val Gln Glu 20 25 30 Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Ile Cys 35 40 45 Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp 50 55 60 Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ser His 65 70 75 80 Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 85 90 95 Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser 100 105 110 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Tyr 115 120 125 Asp Phe Lys Val Asn Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215 220 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 88 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 89 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 1/66

Claims (17)

  1. N26(수탁 번호: FERM BP-10109)로 표시되는 하이브리도마.
  2. 제1항의 하이브리도마에 의해 생산되고, 서열 39로 표시되는 중쇄 아미노산 서열의 가변 영역 및 서열 41로 표시되는 경쇄 아미노산 서열의 가변 영역을 갖는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 삭제
  4. 제1항의 하이브리도마에 의해 생산되는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역의 클래스가 IgG인 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, IgG의 서브클래스가 IgG1인 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효 성분으로 하는, 종양의 예방 또는 치료제인 의약 조성물.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 종양이 A33을 발현하는 암 세포를 포함하는 종양인 의약 조성물.
  10. 제1항에 기재된 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항체를 취득하는 것을 특징으로 하는 항체의 제조 방법.
  11. 제1항에 기재된 하이브리도마로부터 A33에 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 단리하여, 상기 유전자를 갖는 발현 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 숙주를 배양하며, 배양물로부터 상기 항체를 취득하는 것을 특징으로 하는 항체의 제조 방법.
  12. 서열 39로 표시되는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 및 서열 41로 표시되는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터를 숙주에 도입하여 상기 숙주를 배양하며, 배양물로부터 상기 항체를 취득하는 것을 특징으로 하는 항체의 제조 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
KR1020077007788A 2004-09-06 2005-09-02 항 ａ３３ 항체 KR100918746B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004259090 2004-09-06
JPJP-P-2004-00259090 2004-09-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070088570A KR20070088570A (ko) 2007-08-29
KR100918746B1 true KR100918746B1 (ko) 2009-09-24

Family

ID=36036478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077007788A KR100918746B1 (ko) 2004-09-06 2005-09-02 항 ａ３３ 항체

Country Status (10)

Country Link
US (2) US7579187B2 (ko)
EP (2) EP1801208A4 (ko)
JP (2) JP4088655B2 (ko)
KR (1) KR100918746B1 (ko)
CN (1) CN101010427B (ko)
AU (1) AU2005280975B2 (ko)
CA (1) CA2579391C (ko)
HK (1) HK1105993A1 (ko)
TW (1) TW200621803A (ko)
WO (1) WO2006028197A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2667067A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-24 Merck & Co., Inc. Antibody antagonists of interleukin-13 receptor .alpha.1
US7883705B2 (en) 2007-02-14 2011-02-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
NZ584911A (en) 2007-11-02 2011-08-26 Novartis Ag Improved nogo-a binding molecules and pharmaceutical use thereof
ES2445755T3 (es) * 2007-11-07 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Anticuerpos que se unen a células dendríticas y epiteliales humanas 205 (DEC-205)
MX2010014319A (es) 2008-07-08 2011-05-19 Geneuro Sa Uso terapeutico de ligando especifico en enfermedades asociadas con msrv.
EP2917236A2 (en) * 2012-11-06 2015-09-16 MedImmune, LLC Combination therapies using anti-pseudomonas psl and pcrv binding molecules
AU2013370171B2 (en) * 2012-12-28 2018-09-13 Precision Biologics, Inc. Humanized monoclonal antibodies and methods of use for the diagnosis and treatment of colon and pancreas cancer
EP2777714A1 (en) 2013-03-15 2014-09-17 NBE-Therapeutics LLC Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme
AU2016219350A1 (en) 2015-02-10 2017-08-24 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-MUC1* antibodies
CN110540591A (zh) * 2019-08-09 2019-12-06 无锡傲锐东源生物科技有限公司 一种抗糖蛋白A33（Glycoprotein A33）单克隆抗体及其免疫检测应用
US20240026037A1 (en) * 2020-11-18 2024-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-gpa33 multi-specific antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994013805A1 (en) * 1992-12-10 1994-06-23 Celltech Limited Humanised antibodies directed against a33 antigen

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0199141A3 (en) 1985-04-19 1988-07-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancer
US5851526A (en) * 1985-04-19 1998-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
US5160723A (en) 1985-04-19 1992-11-03 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method of imaging colorectal carcinoma lesion and composition for use therein
US5431897A (en) * 1985-04-19 1995-07-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method of imaging colorectal carcinoma lesion and composition for use therein
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
FI884924A (fi) 1987-10-28 1989-04-29 Oncogen Humanimmuglobulin som producerats med hybrid-dna-teknik.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6307026B1 (en) * 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
AU1102401A (en) * 1999-10-22 2001-05-08 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for reducing the effects of cancers that express a33 antigen using a33 antigen specific immunoglobulin products
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
US6643550B2 (en) * 2000-12-15 2003-11-04 Cardiac Pacemakers, Inc. Multi-polar connector
JP2004259090A (ja) 2003-02-27 2004-09-16 Toshiba Corp 情報処理装置および情報処理方法
US7432359B2 (en) * 2004-09-06 2008-10-07 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Anti-A33 antibody
JP4976741B2 (ja) * 2006-05-16 2012-07-18 株式会社東芝 平面アンテナ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994013805A1 (en) * 1992-12-10 1994-06-23 Celltech Limited Humanised antibodies directed against a33 antigen

Also Published As

Publication number Publication date
HK1105993A1 (en) 2008-02-29
EP1801208A4 (en) 2009-04-01
EP1801208A1 (en) 2007-06-27
US20090299039A1 (en) 2009-12-03
CN101010427A (zh) 2007-08-01
US20070141054A1 (en) 2007-06-21
TWI359154B (ko) 2012-03-01
CN101010427B (zh) 2011-07-27
CA2579391C (en) 2010-10-26
AU2005280975A1 (en) 2006-03-16
EP2145954A1 (en) 2010-01-20
WO2006028197A1 (ja) 2006-03-16
JP4088655B2 (ja) 2008-05-21
US7579187B2 (en) 2009-08-25
TW200621803A (en) 2006-07-01
CA2579391A1 (en) 2006-03-16
KR20070088570A (ko) 2007-08-29
JP2008138004A (ja) 2008-06-19
AU2005280975B2 (en) 2009-06-18
JPWO2006028197A1 (ja) 2008-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100918746B1 (ko) 항 ａ３３ 항체
RU2756236C2 (ru) PD-L1 специфические антитела
CN107922496B (zh) IL2Rβ/通用γ链抗体
CA2501984C (en) Erythropoietin receptor binding antibodies
DK2236604T3 (en) The anti-NR10 antibody and use thereof
CN101124240B (zh) 肝细胞生长因子的特异性结合物
US20040175379A1 (en) Erythropoietin receptor binding antibodies
KR20220071179A (ko) 인간화 항-il17a 항체 및 이의 용도
CN114685660A (zh) 抗cldn18.2抗体及其制备方法和应用
KR20160131082A (ko) Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체
KR20200109339A (ko) Tim3에 대한 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법
CN115151570A (zh) 抗人cd19抗体
AU2020316495A1 (en) Humanized anti-VEGF Fab antibody fragment and use thereof
US7432359B2 (en) Anti-A33 antibody
KR20220071177A (ko) 인간화 항-vegf 단클론 항체
CN113226371A (zh) 与TfR结合的双特异性抗体
KR20220131279A (ko) 항lag3단일 클론 항체 및 그 제조 방법과 응용
RU2802960C2 (ru) Fab ФРАГМЕНТ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ VEGF И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
RU2810756C2 (ru) Биспецифические антитела, связывающиеся с tfr
RU2804963C2 (ru) Гуманизированное антитело против il17a и его применение
CN117580861A (zh) 用抗icos抗体治疗pd-l1阴性或低表达癌症
CN117460529A (zh) 抗icos抗体的用途

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120821

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130822

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee