JP4799801B2 - リン酸代謝、カルシウム代謝、石灰化及びビタミンd代謝を調節するポリペプチド並びにそれをコードするdna - Google Patents
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Description
本発明は、リン酸代謝、カルシウム代謝、石灰化および/またはビタミンD代謝を調節するポリペプチド、同ポリペプチドをコードするDNA、同ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物、および同ポリペプチドを認識する抗体と同抗体を有効成分とする医薬組成物、同抗体を用いた診断方法と診断用組成物に関する。
背景技術
無機リン酸(以下、「リン酸」ということがある。)は、生体のエネルギー代謝、細胞の機能維持に必須であるとともに、カルシウムと協同して石灰化組織の形成に重要な役割を持つ。生体へのリン酸の供給は、主に腸管での吸収に依存し、排泄は腎における尿中排泄と腸管における糞中排泄による。リン酸は、生体内では体液、細胞内液、石灰化組織に流動的に分布している。成人における無機リン酸の吸収量と排泄量はほぼ同等に保たれていることから、リン酸代謝の恒常性を保つ制御機構の存在が示唆されている。リン酸と同様の生体内分布を示し、血中濃度の恒常性を有するカルシウムの代謝調節は、哺乳動物において少なくとも副甲状腺ホルモン、カルシトニン、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3などの調節因子により協調的に行われていることが知られている。
リン酸の代謝調節においては、副甲状腺ホルモンがリン酸排泄を促進すること、あるいは1α,25−ジヒドロキシビタミンD3が腸管におけるリン酸の吸収を促進することが知られており、カルシウム代謝と密接に関連していることが明らかである。しかしながら、リン酸を主体的に調節する物質はいまだ明らかにされていない。
ところで、リン酸代謝の恒常性が失われ、血中の無機リン酸濃度が低下する疾患としては、原発性副甲状腺機能亢進症、遺伝性の低リン酸血症性くる病、腫瘍性骨軟化症などがあげられる。
原発性副甲状腺機能亢進症は、副甲状腺での副甲状腺ホルモンの過剰産生を特徴とする疾患であり、過剰に産生された副甲状腺ホルモンが腎臓での無機リン酸の再吸収を抑制することにより、リン酸過剰排泄型の低リン酸血症を呈することが知られている。
また、遺伝子疾患に起因する低リン酸血症には、I型ビタミンD依存性くる病、II型ビタミンD依存性くる病、ビタミンD抵抗性くる病などが知られている。I型ビタミンD依存性くる病は、活性化ビタミンD合成酵素の遺伝的機能不全が原因で生ずる疾患であり、II型ビタミンD依存性くる病はビタミンD受容体の遺伝的機能不全によるものであり、両者ともにビタミンD3の作用が減弱することにより低カルシウム血症とともに低リン酸血症を呈するものである。一方、ビタミンD抵抗性くる病は、伴性染色体性のものと常染色体性の低リン酸血症性くる病の少なくとも二種の原因の異なる病態が存在することが知られている。
上記ビタミンD抵抗性くる病の両病態では、腎臓からの無機リン酸の漏出を特徴とした低リン酸血症を呈する。近年、伴性染色体性の低リン血症(X−linked hypophosphatemia:以下「XLH」と呼ぶことがある。)患者では、X染色体上のPHEXと命名されたエンドペプチダーゼ様蛋白質をコードする遺伝子の変異により誘導されることが明らかにされた。しかし、PHEX蛋白質の機能異常が低リン酸血症を誘導する機序については明らかではない。興味深いことに、低リン酸血症を呈する自然変異マウス(Hyp)の遺伝子解析から、このマウスではPHEXをコードする遺伝子が部分欠損していることが明らかとなった。このマウスを用いた実験により、PHEX欠損マウスの腎機能は正常であることやHypマウスの体液中に低リン酸血症を誘導する副甲状腺ホルモンとは異なる液性因子が存在することが示されている。常染色体性の低リン酸血症(Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalacia:以下ADHRということがある。)に関しては、疾患の責任遺伝子の追求がなされており、連鎖解析により12p13の領域に存在することが報告されている。しかし、依然として絞り込まれた領域は広く、多くの遺伝子がそこには含まれており候補遺伝子を特定するには至っていない。
腫瘍性骨軟化症は、腫瘍形成に伴って腎臓からの無機リン酸排泄が増加して低リン酸血症を呈し、腫瘍への放射線照射や腫瘍の除去を行うことで低リン酸血症が消失することを特徴とする疾患である。この疾患においても腎臓でのリン酸の再吸収を抑制することによる低リン酸血症を誘導する因子を腫瘍が産生すると考えられている。
ビタミンD抵抗性くる病において想定される原因分子と、腫瘍性骨軟化症において想定される原因分子が同一であるかどうかは確定していないが、両者は明らかにリン酸の尿中排泄を促進する未知のリン酸代謝因子であるという点で一致している。この想定されるリン酸代謝調節因子は、しばしばPhosphatoninという名称で呼ばれることがある。この未知のリン酸代謝調節因子と、ビタミンD抵抗性くる病や腫瘍性骨軟化症との関連性については総説としてもまとめられている(Neison,A.E.,Clinical Endocrinology,47:635−642,1997;Drezner,M.K.,Kidney Int.,57:9−18,2000)。
ビタミンD抵抗性くる病や腫瘍性骨軟化症におけるもう一つの特徴は、骨の石灰化障害である。この骨の石灰化障害は、低リン酸血症により二次的に生じているとも考えられるが、ビタミンD抵抗性くる病のモデルマウスであるHypマウスの実験では、骨石灰化異常がリン酸濃度に依存せずに生じることが示されており(Ecarot,B.,J.Bone Miner.Res.,7:215−220,1992;Xiao,Z.S.,Am.J.Physiol.,E700−E708,1998)、上述の未知のリン酸代謝調節因子が直接的に骨組織の石灰化を調節している可能性も考えられる。
上述のように、リン酸代謝を調節する未知の因子が存在する可能性が強く示唆される研究データが報告されているが、想定される活性を呈示する実体を分子的に明らかにした例はない。WO99/60017には、新規ポリペプチドホルモンPhosphatoninとして新規のポリペプチド配列が開示されているが、Phosphatoninの特徴である低リン酸血症誘導活性は示されていない。これまで明らかにされていない生体由来のリン酸代謝調節因子が存在すると考えられた。
食物より摂取されるビタミンD2およびビタミンD3、あるいは皮膚で合成されたビタミンD3は、主として肝臓に存在するビタミンD−25位水酸化酵素により水酸化を受け、25−ヒドロキシビタミンDとなる。その後、腎臓の近位尿細管上皮細胞に存在する25−ヒドロキシビタミンD−1α位水酸化酵素により水酸化を受け、1α,25−ジヒドロキシビタミンDとなる。この1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、血清カルシウム、リン濃度を上昇させる生理活性を有するミネラル調節ホルモンであり、副甲状腺ホルモンの分泌抑制、骨吸収促進を担うことなども知られている。1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、生体内においてさらに、主に腎臓や小腸に存在する24位水酸化酵素により水酸化を受け、上述の生理活性を有さない代謝物に変換される。この点において、24位水酸化酵素は1α,25−ジヒドロキシビタミンDの不活性化を担う酵素であると考えられている。一方、24位水酸化酵素は、25−ヒドロキシビタミンDに対しても作用し、24,25−ジヒドロキシビタミンDに変換することが知られている。この24,25−ジヒドロキシビタミンDには、骨量増加、軟骨分化促進などの生理作用が報告されており、生理活性を有するビタミンD代謝物の生成酵素としての一面を有することが示唆されている。
ビタミンDの活性化に重要な役割を有する1α位水酸化酵素の発現レベルを調節する因子としては、副甲状腺ホルモン(PTH)、カルシトニン、1α,25−ジヒドロキシビタミンDなどが知られている。血中カルシウム濃度の低下により分泌が促進されるPTHは、腎臓近位尿細管上皮細胞に存在するPTH受容体に作用し、細胞内cAMPの上昇を介して1α位水酸化酵素遺伝子の転写を促進し、血中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を上昇させる。1α,25−ジヒドロキシビタミンDは腸管からのカルシウム吸収と腎臓でのカルシウム再吸収を促進し、結果として血中カルシウム濃度を上昇させる。他方、1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、ビタミンD受容体(VDR)と結合して1α位水酸化酵素遺伝子やPTH遺伝子のプロモーター領域に作用して、これらの遺伝子の転写抑制をおこなっていることが報告されている。つまり、1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、その活性化因子であるPTHおよび1α位水酸化酵素に対してフィードバック制御を有しており、この機構がカルシウム代謝の恒常性維持において重要な役割を担っている。
近年、血清リン酸濃度の低下が1α位水酸化酵素遺伝子の発現を亢進することが報告されている。リン酸代謝においても、血清リン酸濃度の低下に伴う1α位水酸化酵素遺伝子の発現上昇が血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を上昇させ、結果として小腸からのリン酸吸収を促進することで血清リン酸濃度を是正するという機構の存在が推察されている。
24位水酸化酵素遺伝子の発現調節を担う因子としては、1α,25−ジヒドロキシビタミンD、PTH等が挙げられる。1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、ビタミンD受容体(VDR)を介して24位水酸化酵素遺伝子のプロモーター領域に存在するビタミンD受容体応答配列に結合することで転写を促進することが判明している。1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、24位水酸化酵素を活性化して、代謝経路の活性化による1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の低下を誘導すると考えられている。24位水酸化酵素遺伝子の発現はPTHにより抑制されることが知られているが、詳細な分子メカニズム明らかではない。
発明の開示
本発明は、血中のリン酸濃度低下を誘導することができる腫瘍由来の新規因子を提供することを目的とする。
腫瘍性骨軟化症で同定される腫瘍は、生理活性を有する分泌因子を放出して、その結果として血中のリン酸濃度が低下すると考えられる。この腫瘍由来因子がリン酸代謝の恒常性を破綻させるということは、▲1▼本来生体で産生されないものが腫瘍特異的に産生されるか、▲2▼正常組織においても産生されるが腫瘍に過剰に産生されるか、あるいは、▲3▼生理的な制御を受けずに腫瘍で産生されることのいずれかを特徴とすると考えられる。
本発明者は、前述のごとく腫瘍由来の低リン酸血症誘導因子が腫瘍性骨軟化症由来の腫瘍において特徴的に産生しているとの推察に基づき、腫瘍において低リン酸血症誘導因子をコードする遺伝子の転写が上昇していること、あるいはその因子のmRNAの安定性が上昇していることを予想した。そこで、腫瘍性骨軟化症腫瘍患者より治療目的で摘出した腫瘍組織の一部よりRNAを抽出したのち、ファージベクターおよびプラスミドベクターを用いてcDNAライブラリーを作製して、腫瘍に特徴的に発現している遺伝子断片のスクリーニングを実行した。スクリーニングは腫瘍に特異的に発現していると考えられるcDNA断片を選別する方法と腫瘍由来cDNAライブラリーより腎臓近位尿細管上皮細胞株由来のcDNAプローブと交差しないcDNA断片を選別する方法を行った。そして、選択されてきたcDNA断片の中で配列の新規性と腫瘍での特徴的な発現が確認できたものをさらに絞込み、低リン酸血症誘導因子をコードすることが期待されるcDNA断片を複数得た。これらの配列情報から、それぞれの断片が帰属するORFを含むcDNAのクローニングを試み、新規ポリペプチドをコードするDNAを取得した。さらにこの新規ポリペプチドの生物活性を見出すべく鋭意研究を進め、この新規ポリペプチドがリン酸輸送を抑制する活性を有すること、そして動物において低リン酸血症を誘導するとともに骨組織の石灰化を抑制することを明らかにし、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のポリペプチドをコードするDNA。
(a)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンD代謝調節活性を有するポリペプチド
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、前記アミノ酸配列のうち少なくとも第34番目〜第201番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、
(i)前記アミノ酸配列のうち少なくとも第34番目〜第201番目のアミノ酸配列を含み、
(ii)当該部分配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
(iii)低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンD代謝調節活性を有する、
前記ポリペプチド
(2)以下の(e)又は(f)のDNAを含むDNA。
(e)配列番号1に示される塩基配列のうち第133番目〜第885番目の塩基配列若しくは配列番号3に示される塩基配列のうち第1番目〜第681番目の塩基配列からなるDNA
(f)配列番号1若しくは3に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列からなるDNAから調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンD代謝調節活性を有するポリペプチドをコードするDNA
ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が750mM以上、好ましくは900mM以上であり、温度が40℃以上、好ましくは42℃の条件を満たすものをいう。具体的には、6×SSC、5×Denhardt、0.5%SDS、50%Formamide、42℃の条件をいう。
(3)前記DNAを含む組換えベクター。
(4)前記組換えベクターを含む形質転換体。
(5)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のポリペプチド。
(a)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号2若しくは4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンD代謝調節活性を有するポリペプチド
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、前記アミノ酸配列のうち少なくとも第34番目〜第201番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(d)配列番号2に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、
(i)前記アミノ酸配列のうち少なくとも第34番目〜第201番目のアミノ酸配列を含み、
(ii)当該部分配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
(iii)低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンD代謝調節活性を有する、
前記ポリペプチド
前記ポリペプチドには、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ(N−ビニル−ピロリドン)、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシドとポリエチレンオキシドとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つによって修飾されたものも含まれる。
(6)前記ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、生体のカルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンD代謝を調節し得るために使用することができる。また、上記医薬組成物は、高リン血症、副甲状腺機能亢進症、腎性骨異栄養症、異所性石灰化、骨粗鬆症及び高ビタミンD血症からなる群から選ばれる少なくとも一つに有効である。
(7)前記ポリペプチド又はこれらの部分断片と反応する抗体。
上記抗体は、本発明のポリペプチド又はその部分断片を抗原として動物に免疫する工程を含む方法によって得ることができる。
(8)前記抗体を有効成分として含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、生体のカルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンD代謝を調節することができる。また、骨疾患に有効である。ここで、骨疾患としては、骨粗鬆症、ビタミンD抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病及び腫瘍性骨軟化症からなる群から選択される少なくとも1つが挙げられる。
(9)前記抗体を含む、カルシウム代謝異常、リン酸代謝異常、石灰化異常及びビタミンD代謝異常のうち少なくとも1つの異常を呈する疾患(例えば腎不全、腎性リン酸漏出症、尿細管性アシドーシス及びファンコニ症候群からなる群から選択される少なくとも1つ)の診断剤。
(10)前記抗体を含む、骨疾患の診断剤。骨疾患としては、骨粗鬆症、ビタミンD抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病及び腫瘍性骨軟化症からなる群から選択される少なくとも1つが挙げられる。
(11)配列番号11に示す塩基配列を有するDNA又はその部分断片を含む、カルシウム代謝異常、リン酸代謝異常、石灰化異常及びビタミンD代謝異常のうち少なくとも1つの異常を呈する疾患の診断剤。
部分断片としては、配列番号11に示す塩基配列のうち第498番から第12966番までの配列を有するものが挙げられ、疾患としては、常染色体優性低リン酸血症性くる病が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願2000−245144号、2000−287684号、2000−391077号及び2001−121527号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
血中1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度低下活性とは、血中の活性型1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度を低下させる方向に働く活性を指す。
低リン酸血症誘導活性とは、血中のリン酸濃度を低下させる方向に働く活性を指す。血中のリン酸濃度は、(i)腸管からの吸収と尿および糞への排泄、並びに(ii)体内における細胞や骨組織に代表される石灰化組織との出納で規定される。したがって、本明細書でいう低リン酸血症誘導活性は、健全な生体に対して作用させた場合において血中リン酸濃度を低下させる活性を意味しており、必ずしも病的な低リン酸血症を引き起こすことを意味するものではない。単位組織では、腸管におけるリン酸吸収抑制活性、腎臓や腸管におけるリン酸排泄促進活性、あるいは細胞内へのリン酸移行促進活性と同等である場合がある。
また、本発明において、リン酸輸送抑制活性とは、対象細胞に作用してその細胞膜に存在するリン酸輸送担体の活性を抑制することを意味する。主たる対象細胞としては、腎臓尿細管上皮細胞、腸管上皮細胞又は骨芽細胞が考えられる。
さらに、本発明において、石灰化抑制活性とは、骨組織及び軟組織においてカルシウムとリン酸を組成物として含む結晶物を生成又は蓄積する過程を抑制する活性を意味する。
さらに、生体内ビタミンD代謝調節活性とは、生体内に存在するビタミンDおよびそれより体内にて合成される代謝物の絶対量の変化、又は存在比率の変化を調節する効力を指す。これらのビタミンDおよびその代謝物の生体内における調節は、(i)主に腸管における吸収又は排泄と、(ii)腎臓での再吸収又は排泄と、(iii)生体内におけるビタミンDの合成と、(iv)それに続く水酸化反応とを中心とした代謝的変換により規定される。(iv)の代謝的変換により生じる主たる代謝物としては、ビタミンD−25−水酸化酵素によりビタミンDの25位が水酸化されることにより生じる25−ヒドロキシビタミンD、25−水酸化ビタミンD−25−1α−水酸化酵素によりヒドロキシビタミンDの1α位が水酸化されて生じる1α,25−ジヒドロキシビタミンD、あるいは、これらの代謝物がさらに24−水酸化酵素により24位に水酸基が導入されて生じる24,25−ジヒドロキシビタミンD又は1α,24,25−トリヒドロキシビタミンDが知られている。ビタミンD代謝調節活性は、このようなビタミンD代謝物生成に関わる酵素の活性調節、遺伝子発現、又は発現蛋白量の変化を調節する活性として表されることもある。
1.リン酸代謝、カルシウム代謝、石灰化及びビタミンD代謝を調節するポリペプチドをコードするDNA
(1)DNAのクローニング
本発明のDNAの一つである配列番号1に示すDNAは、腫瘍性骨軟化症が疑われる患者から摘出した腫瘍の一部より作製したcDNAライブラリーのスクリーニングによって得られたものである。
ところで、腫瘍性骨軟化症は、腫瘍の存在に伴い低リン酸血症と骨組織の石灰化不全による骨軟化症を呈する疾患であり、腫瘍を除去するとこれらの症状が消失することを特徴とする。腫瘍抽出物がラットにおいて尿中リン酸排泄を促進すること(Popvtzer,M.M.et al.,Clinical Research 29:418A,1981)や、摘出腫瘍のマウスへの移植実験により低リン酸血症が誘導されること(Miyauchi,A.et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.67:46−53,1988)が報告されているため、腫瘍が全身性の未知の因子を産生し分泌するものと考えられている。
本発明者が使用した腫瘍に関係する症例については、Fukumoto,S.et al.,Bone 25:375−377,1999に記載されている。この症例は、腫瘍を手術的に摘出したことで、低リン酸血症が顕著に回復した。また、この症例における腫瘍のサイズは径が約1cm程度と小さいものであった。このような小さな組織より低リン酸血症と全身性の骨軟化症を惹起する活性物質が産生、分泌されていたことが推察されることを考えると、本発明者が調製した腫瘍由来のcDNAライブラリー中に、このような病態の惹起にかかわる活性物質をコードする遺伝子の少なくとも部分的な断片が他の組織に由来するcDNAライブラリーと比較して高頻度に含まれていることを予想した。そこで、この腫瘍由来の活性物質をコードする遺伝子の断片配列を同定することを目標として、本腫瘍cDNAライブラリーに特異的に多く含まれているcDNA断片をディファレンシャルスクリーニング法にて抽出した。
次に、得られたcDNA断片の塩基配列を同定し、相互比較を行い、塩基配列の重複をもとに同一遺伝子に由来すると考えられる配列はコンティグを作製して分類した。このようにして得られた塩基配列について、米国National Center for Biotechnology Information(以下、「NCBI」ということがある。)が提供するデータベースであるGenbankに登録されている塩基配列と相同性の検索を実施した。このような方法で本腫瘍cDNAライブラリーに特異的に多く含まれる塩基配列として、配列番号1で示される塩基配列の塩基番号1522番から2770番までの配列を得た。この配列はGenbankにアクセッション番号AC008012で登録されているヒト12p13 BAC RPCI11−388F6の配列の一部と一致した。この登録配列はヒト染色体配列の12p13領域の部分配列を示していると考えられるものであった。この登録配列内の推定される遺伝子の位置は塩基配列情報とともに明記されているが、配列番号1で示される塩基配列の塩基番号1522番から2770番までの配列、および本発明の配列番号1に示す塩基配列は、推定遺伝子部位として明記されていない。
次に、この配列番号1で示される塩基配列の塩基番号1522番から2770番までの塩基配列をもとにプローブおよびPCR用のプライマーを設計して、本腫瘍cDNAライブラリーに含まれる連続した塩基配列を単離同定して本発明の配列番号1に示す塩基配列を得た。配列番号1の塩基配列は、本発明の配列番号2に示すアミノ酸配列からなる分泌シグナルを有すると推定されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(以下「ORF」ということがある。)を有していた。このポリペプチドのアミノ酸配列はGenbankのアミノ酸配列データベースに登録されていないことから、新規の配列を有するポリペプチドであると考えた。さらに本発明者は、配列番号1に示す塩基配列と配列番号2に示すアミノ酸配列を用いて検索を行い、この分子のマウスオーソログと考えられる配列番号9に示す塩基配列と配列番号10に示すアミノ酸配列を同定した。後述するように、ヒトのアミノ酸配列に従い作製した組み換え体蛋白質がマウスにおいて活性を示すことから、配列番号2に示すアミノ酸配列と、配列番号10に示すアミノ酸配列又はマウス全長配列(Biochem.Biophys.Res.Commun.2000,277(2),494−498)との比較により、両者で保存されているアミノ酸以外のアミノ酸を置換した蛋白質が本発明のポリペプチドと同等あるいは同種の生物活性を有することが、本発明により容易に推察できるようになった。
(2)塩基配列の決定
上記(1)の通り得られたDNAについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機(例えばPERKIN−ELMER社製373A DNAシークエンサー等)を用いて配列決定が行われる。
配列番号1に本発明のDNAの塩基配列を、配列番号2に本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるポリペプチドが低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性又はビタミンD代謝調節活性を有する限り、当該アミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列から1又は数個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号2に示されるアミノ酸配列に1又は数個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の1又は数個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
また、置換の方法としては、アミノ酸の特性をある程度保持したファミリー内での保存的置換を行っても良い。アミノ酸側鎖の特性から一般的に分類されるファミリーは以下のものが挙げられる。
(i)酸性アミノ酸ファミリー:アスパラギン酸、グルタミン酸
(ii)塩基性アミノ酸ファミリー:リジン、アルギニン、ヒスチジン
(iii)非極性アミノ酸ファミリー:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン
(iv)非帯電極性アミノ酸ファミリー:グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン
(v)脂肪族ヒドロキシアミノ酸ファミリー:セリン、スレオニン
(vi)アミド含有アミノ酸ファミリー:アスパラギン、グルタミン
(vii)脂肪族アミノ酸:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
(Viii)芳香族アミノ酸ファミリー:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
(ix)疎水性アミノ酸ファミリー:ロイシン、イソロイシン、バリン
(x)小型アミノ酸ファミリー:アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシン
置換の例として、配列番号2において176番目のArg及び/又は179番目のArgを、他のアミノ酸、好ましくはAla、Gln又はTrpに置換して切断が阻害又は抑制されたものが挙げられる。さらに、配列番号2に示すアミノ酸配列において、N末側、C末側又は両側のアミノ酸が10個以上欠失したもの(末端欠失型)も、本発明のポリペプチドに含まれる。末端欠失型の例として、配列番号2においてC末側の20、40、45又は50個のアミノ酸が欠失したもの、及び/又はN末側24又は33個のアミノ酸が欠失したものが挙げられる。末端欠失型の態様を以下に示す。
本発明においては、上記配列番号2に示すアミノ酸配列の部分断片(末端欠失型部分断片)のほか、これらの末端欠失型ポリペプチドにおいて1個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加した変異断片も本発明のポリペプチドに含まれる。ここで、上記一覧表において配列番号2に示すアミノ酸の位置番号の後に付した括弧内の数字は、配列番号1に示す塩基配列の塩基の位置番号であり、これらの位置に示す塩基配列からなるDNA、又はこれらのDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAも本発明のDNAに含まれる。
本発明において、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部に変異を導入するには、該アミノ酸をコードするDNAの塩基配列に変異を導入する手法が採用される。
DNAに変異を導入するには、Kunkel法若しくはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異誘発法に基づいて変異を導入するが、変異導入用キット(例えばMutan−K(TAKARA社製)、Mutan−G(TAKARA社製)、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットなど)を用いて変異を導入することもできる。
さらに、上記本発明のDNA(配列番号1、3、5、7、9)から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低リン血症誘導活性、リン輸送抑制活性、石灰化抑制活性又はビタミンD代謝調節活性を有するポリペプチドをコードするDNAも、本発明のDNAに含まれる。プローブとは、配列番号1、3、5、7又は9に示す配列の全長又は長さが17塩基以上の連続する配列(部分配列)に対し相補配列を有するものをいう。
ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が750mM以上、好ましくは900mM以上であり、温度が40℃以上、好ましくは42℃の条件を満たすものをいう。具体的には、6×SSC、5×Denhardt、0.5%SDS、50%Formamide、42℃の条件をいう。なお、6×SSCとは、900mM NaCl、90mMクエン酸ナトリウムを意味する。デンハルト溶液(Denhardt)とは、BSA(ウシ血清アルブミン)、ポリビニルピロリドン及びFicoll400を含む溶液であり、50×Denhardtは1%BSA、1%ポリビニルピロリドン、1%Ficoll400の組成からなる(5×Denhardtは50×Denhardtの10分の1の濃度を意味する)。
一旦本発明のDNAの塩基配列が決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用いたPCRによって、本発明のDNAを得ることができる。
2.本発明のDNAを含む組換えベクター及び形質転換体の作製
(1)組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のDNAを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322,pBR325,pUC118,pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110,pTP5等)、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13,YEp24,YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。さらに、GST、His−tagなどが連結された融合プラスミドを用いることもできる。
ベクターに本発明のDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明のDNAは、そのDNAの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のDNAのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
(2)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、あるいはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられる、また、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞等の動物細胞や、Sf9、Sf21等の昆虫細胞を用いることもできる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)JM109、HB101などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するT7プロモーターなどが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS−7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞、ラットGH3細胞、又はヒトFL、HEK293、HeLa若しくはJurkat細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、β−アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
3.低リン酸血症誘導活性を有するポリペプチド
これまで腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症誘導活性を有する腫瘍産生因子を単離同定する試みがいくつかなされてきた。そして、本発明のポリペプチドは、腫瘍性骨軟化症の腫瘍が産生する新規な分泌因子という特徴を有することが明らかにされた。この低リン酸血症を誘導する因子の推定される生物活性としては、以下の報告がされている。
リン酸の尿中への排泄促進作用:
Aschinberg,L.C.et al.,Journal of Pediatrics 91:56−60,1977、Lau,K.et al.,Clinical Research 27:421A,1979、Miyauchi,A.et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.67:46−53,1988)
腎尿細管上皮細胞のリン酸輸送活性の抑制:
Cai,Q.et al.,N.Engl.J.Med.330:1645−1649,1994、Wilkins,G.E.et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.80:1628−1634,1995、Rowe,P.S.N.et al.,Bone 18:159−169,1996 25−ヒドロキシビタミンD−1α−ヒドロキシラーゼ活性の抑制:Miyauchi,A.et al.,J.Clin,Endocrinol.Metab.67:46−53,1988
特に、腎でのリン酸再吸収を抑制する活性を直接有する未知の分子を「Phosphatonin」と呼ぶことが提唱されている(Econs,M.J.& Drezner,M,K.,N.Engl.J.Med 330:1679−1681,1994)。このような生物活性を有する未知の因子の存在がXLHにおいても示唆されている。XLH患者の臨床所見は、腫瘍性骨軟化症患者と共通して尿中リン酸排泄が亢進した低リン酸血症を特徴とし、骨組織の石灰化不全による骨軟化症やくる病を呈する。XLHの責任遺伝子はPHEXというエンドペプチダーゼ様蛋白質をコードしている遺伝子であることが明らかにされている。自然変異マウスであるHypマウスはXLHと同様の表現形質を呈することが知られていたが、近年このマウスでPHEXをコードする遺伝子が部分欠失していることが明らかにされ、HypマウスはXLHのモデルとして位置付ける妥当性が示された(Strom,T.M.et al.Human Molecular Genetics 6:165−171,1997)。Hypマウスにおける低リン酸血症誘導因子が液性因子であることは、Hypマウスと正常マウスとの並体癒合実験により明らかにされている(Meyer,R.A.et al.,J.Bone Miner.Res.4:493−500,1989)。この実験において正常マウスの血中リン酸濃度が低下して、尿中リン酸排泄が増加したことから、Hypマウスに存在する体液性の低リン酸血症誘導因子が正常マウスに作用したものと考えられている。これまでのところ、ペプチドの切断活性が推定されるPHEXとこの未知の低リン酸血症誘導因子との関連性は明らかではないが、PHEXが未知の低リン酸血症誘導因子の活性制御の関係や、腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症誘導因子とXLHで認められる低リン酸血症誘導因子が同一である可能性についての仮説が提唱されている(Drezner,M.K.Kidney Int 57:9−18,2000)。この仮説によると、PHEX及び低リン酸血症誘導因子が、正常では同じ細胞で発現しており、PHEXが低リン酸血症誘導因子に対して抑制的に働く。XLH患者においては、PHEXの機能が低下又は消失しているので、低リン酸血症誘導因子の活性が強く現れる。腫瘍性骨軟化症においては、PHEX及び低リン酸血症誘導因子の両方が上昇しているが、結果的に活性型の低リン酸血症誘導因子が量的に正常値より増加すると仮定している。また、この低リン酸血症誘導因子は、腎臓におけるリン酸輸送担体の一つであるNPT2のリン酸輸送活性に対して抑制的に作用すると仮定している。このような未知の低リン酸血症誘導因子を探索する試みも多くなされているが、これまで分子の同定には至っていない。Caiらの研究によると、低リン酸血症誘導因子は、分子量が8kDaから25kDaの間にあると推察されているが(Cai,Q.et al.,N.Engl.J.Med.330:1645−1649,1994)、Roweらは候補分子として56kDaと58kDaの蛋白質を上げている。最近、RoweらはWO99/60017に430残基のアミノ酸からなるポリペプチドを腫瘍性骨軟化症の腫瘍由来のリン酸代謝調節因子として出願しているが、ここで開示されているポリペプチドは本来存在する蛋白質の部分配列であり、低リン酸血症誘導活性に関連する生物学的活性は開示されていない。最近、MEPEという名称でこの特許に開示されていた分子の全長に相当するポリペプチドが報告されたが、やはり低リン酸血症を誘導するような活性については開示されていない(Rowe,P.S.N.et al,Genomics 67:54−68,2000)。また、この分子と本発明のポリペプチドの間に配列上、構造上の類似性は認められない。
上述のとおり、低リン酸血症を誘導する活性をもつ生理活性因子の存在が推定されるものの、これまでその実体は明らかにされていなかった。本発明は、そのポリペプチドとしての実体を明らかにし、それをコードする遺伝子配列を明らかにした。そして、以下に記載するように、発明のポリペプチドを生産し、その生産物がリン酸代謝、カルシウム代謝、ビタミンD代謝又は石灰化と骨格形成に調節因子として作用し、医薬組成物として有用であることを明らかにした。また、本発明の抗体が治療のみならず臨床検査、診断に有用であることを明らかにした。また、本発明のポリペプチドをコードするDNAが遺伝病の診断やリン酸代謝、カルシウム代謝、骨代謝の多型診断に有用であることを明らかにした。
本発明の低リン酸血症誘導活性を有するポリペプチドは、例えば配列番号1に示す塩基配列の塩基番号133番〜885番を含む配列を、発現できる形態で適当な宿主細胞に導入して形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞に導入したDNAを発現させることによって製造することができる。また、このように産生されたポリペプチドは、宿主が持つ蛋白質修飾機構により切断や糖鎖付加などのポリペプチド鎖の改変を受けることがある。
本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で4〜48時間行う。培養期間中、pHは6.0〜8.0に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導可能なT7プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドールアクリル酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、5%CO2存在下、37℃で1〜10日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養後、本発明のポリペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のポリペプチドを採取する。また、本発明のポリペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のポリペプチドを単離精製することができる。
上述のようにXLHにおいてエンドペプチダーゼと考えられるPHEXが低リン酸血症誘導因子の調節に重要な意義を持つ事を考えると、本発明の配列番号2のアミノ酸配列を持つポリペプチドがさらに修飾、切断されて活性を変化させることも考えられる。本発明において、CHO ras−clone1細胞を宿主として用いて、発明のポリペプチド鎖のC末端にHisを6連続して付与した組み換え体を産生するクローン化した細胞株を作製した。この細胞株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託した(受託番号FERM BP−7273、原寄託日 平成12年8月11日)。
この細胞株に発明のポリペプチドを生産させ、培養液に分泌されたポリペプチドを調べたところ、図2に示すようにサイズの異なる遺伝子産物がHis−tagを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングで検出された。それぞれのバンドに相当する蛋白質を単離してN末端アミノ酸配列を実施したところ、それぞれ配列番号4と配列番号8に示すアミノ酸配列のN末側の配列に一致した。前者はシグナル配列が除かれたあとの蛋白質と考えられ、後者は、エンドペプチダーゼ等の酵素により切断されたものと考えられる。
ところで、RXXRを認識する蛋白分解酵素の一つとしてfurinが知られており、実際furin欠損細胞株で本発明のポリペプチドを発現させたところ断片は検出されなかった。さらに、furin阻害活性を有する組換え体蛋白α1−PDXを本発明のポリペプチドと共発現させたところ上清中の切断断片が著しく減少した。
従って、培養の際に、furin欠損細胞を用いることを含む、またはfurin活性を抑制する物質を共存させることを含む、本願ポリペプチドの生産方法も本発明に含まれる。
Caiらは、腫瘍性骨軟化症の腫瘍由来細胞を培養した培養上清中のリン輸送抑制活性が、透析膜による分画方法で8kDaから25kDaの分子量範囲にあることを示唆している。本発明の配列番号4のアミノ酸配列を持つポリペプチドが配列番号2の残基番号179番のArgと180番のSerとの間で切断されたポリペプチドに変換されることで、その活性を変化させていることも考えられる。
本発明のポリペプチドは、表2(実施例7)に示すように、低リン酸血症誘導活性の一つの作用様態である腎臓近位尿細管上皮細胞のリン酸輸送活性を抑制する活性を有している。血中に存在する遊離型の無機リン酸の大部分は、腎臓の糸球体で濾過されるが、そのうちの80〜90%程度が腎臓の近位尿細管で再吸収される。
この再吸収は、近位尿細管の管腔側に存在するII型Na依存性リン酸トランスポーターによるリン酸輸送により行われる。本発明のポリペプチドがリン酸輸送活性を抑制する活性を有するということは、生体においてリン酸の尿中排泄を促進することを意味する。従って、本発明のポリペプチドは、腎臓でのリン酸再吸収の抑制、特に腎臓近位尿細管細胞のリン酸輸送を抑制する活性により低リン酸血症を誘導していると考えられることから、上述のPhosphatoninと同一物質であることが想定される。
近年、腸管におけるNa依存性リン酸トランスポーターが同定され、このトランスポーターは、腎臓に存在するII型のNa依存性リン酸トランスポーターと相同性が高いことから、IIb型と命名された。腸管の管腔側にあるこのIIb型Na依存性リン酸トランスポーターの抑制も、腎臓のII型Na依存性リン酸トランスポーターと同様に本発明のポリペプチドが担当することが考えられる。これも低リン酸血症誘導活性の一つの作用様態と考えられる。
本発明のポリペプチドのin vivoでの活性は、本発明のポリペプチドを発現する上述の組み換え体細胞をヌードマウスの皮下に移植する実験により評価した。
本試験において移植した細胞は、ヌードマウスの皮下において増殖して腫瘍を形成する。これに伴い細胞が生産し、分泌する本発明のポリペプチドはマウスの体液中に放出されることを特徴としており、当該放出により腫瘍性骨軟化症をモデル化することができる。このモデル実験において、表4(実施例11)に示すように、本発明のポリペプチドを発現する細胞を移植したマウスは、本発明のDNAを導入していない対照のCHO細胞を移植して腫瘍を形成させた個体、又は腫瘍を形成していない個体と比較して、明らかな低リン酸血症を呈した。このことから、本発明のポリペプチドは低リン酸血症誘導活性を有していることが明らかとなった。また、リン酸の再吸収率も低下しており、腎臓でのリン酸の再吸収が抑制されていることも明らかとなった。これらのことから、本発明のポリペプチドは、腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症誘導因子であると考えられた。
一方、上記モデル実験において、本発明のポリペプチドを産生する組み換え体細胞を移植したマウスでは低カルシウム血症が認められた。従って、本発明のポリペプチドは、低カルシウム血症誘導因子であることも明らかとなった。実施例16に記載した本発明のポリペプチドを発現するCHO細胞のヌードマウスへの移植試験において、持続的な血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の減少が明らかとなった。また、実施例19、20に記載したとおり、変異導入ポリペプチドあるいは野生型全長ポリペプチドを正常マウスへ三回投与することで、いずれも血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を減少させることが明らかとなった。さらに、実施例24に記載したとおり、本発明のポリペプチドを単回投与後、数時間以内に血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の減少を認めたことから、この低下活性は本発明のポリペプチドの主な生理作用の一つであると考えられる。
上述のごとく、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度は、1α位水酸化酵素および24位水酸化酵素により規定されている。実施例16に記載したとおり、本発明のポリペプチドの血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度低下作用には、これら代謝酵素の発現変動を伴うことが明らかとなった。さらに、実施例24に記載したとおり、本発明のポリペプチドを投与後1時間目において、活性型ビタミンD合成酵素である1α位水酸化酵素遺伝子転写産物の減少、ならびに代謝酵素である24位水酸化酵素遺伝子転写産物の亢進を認めた。この発現変動の後に、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度が低下していくことから、本発明のポリペプチドによる血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度低下作用は、少なくとも1α位水酸化酵素遺伝子の発現抑制および24位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が原因となっていることが示唆された。
一方、実施例11に記載した本発明のポリペプチドを発現するCHO細胞のヌードマウスへの長期間移植試験(移植後44から46日目)において、1α位水酸化酵素遺伝子の発現は上昇していた。この時点でのマウス血清中PTH濃度は、対照群に比し有意に上昇していたことが判明しており、高レベルのPTH作用による1α位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が起こっていたことが推測される。しかし興味深いことに、PTH存在下においても、24位水酸化酵素遺伝子の発現は依然亢進されたままであることから、本発明のポリペプチドによる24位水酸化酵素遺伝子の発現制御にはPTHの干渉が及んでいないことがわかる。実施例11に記載したとおり、本マウスは重度の低リン血症およびくる病様所見を示していたにも拘わらず、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度が上昇しない原因として、本発明のポリペプチドによる持続的な24位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が影響していることが示唆された。
25−ヒドロキシビタミンDは、腎臓近位尿細管において再吸収を受けることがA.Nykjaerらによって明らかにされている(Cell,Vol.96,p507−515,1999)。本明細書に記載はないが、本発明のポリペプチドを発現するCHO細胞のヌードマウスへの移植試験において、25−ヒドロキシビタミンDの血清濃度に著明な変化を認めていない。また、本発明のポリペプチドの作用により、ナトリウム、カリウム、クロライドなどの主要電解質、主要アミノ酸、あるいはグルコースの分画排泄(尿中濃度/血清濃度/GFRで算出される)に影響を認めなかったことからも、尿細管再吸収機能が障害されていないことを支持する(T.Shimada et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,in press)。従って、本発明のポリペプチドは、25−ヒドロキシビタミンDの尿細管における再吸収阻害の結果、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度低下を引き起こしているのではなく、1α,25−ジヒドロキシビタミンDの合成経路に特異的に作用していることが示唆された。
腫瘍性骨軟化症において、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度は著明に低下していることが知られている。また、低リン血症性ビタミンD抵抗性くる病(XLH)あるいはその病態モデルマウスであるHypでは、重度の血清リン酸濃度低下にも拘わらず血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度は正常範囲あるいはそのやや下限域である。また、Hypマウスの24位水酸化酵素遺伝子の発現は亢進していることも知られている。これらの低リン血症を呈する病態では、本来、血清リン酸濃度の低下に伴い血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を上昇させるべく上述の1α位水酸化酵素遺伝子の上昇が引き起こされるはずであるが、その制御システムのいずれかが破綻しており、正常な生理応答ができていないことが病態の原因の少なくとも一つであると考えられている。これらの現象は、実施例11、19あるいは20に記載したマウスでの生理応答と類似しており、本発明のポリペプチドが、上述の病態において、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度を低下させるべく機能していることが強く示唆される。
本発明のポリペプチドを発現する組み換え体細胞を移植したマウスの骨組織における石灰化の程度は、対照群に比べて著しく低下していることが図5に示すX線像より明らかである。胸郭の変形など、骨格形成に対する作用も認められた。 すなわち、本発明のポリペプチドは、骨組織の石灰化の抑制作用、又は骨組織からのカルシウムおよびリン酸の動員を促進する作用を有していると考えられる。この石灰化の低下は、血中のリン酸とカルシウムの両者が著しく減少したため二次的に骨組織の石灰化が抑制されたと考えることもできる。
Hypマウスにおいては、腎臓の近位尿細管でのリン酸輸送活性を抑制する因子を骨由来細胞が産生していると考えられている(Lajeunesse,D.et al.,Kidney Int.50:1531−1538,1996)。また、Hypマウスの骨芽細胞が石灰化抑制因子を放出していることが報告されている(Xiao,Z.S.,Am.J.Physiol.,E700−E708,1998)。上述のとおり、XLHと腫瘍性骨軟化症では、低リン酸血症と骨組織の石灰化不全という臨床所見が酷似することと、これらが単一の液性因子により誘導される可能性が高いことを考え合わせると、このHypマウスの研究で報告されている腎臓のリン酸輸送抑制活性と骨石灰化抑制活性は、同一の因子により引き起こされている可能性がある。また、Hypマウスの骨芽細胞は、カルシウムとリン酸が正常域にある状況でも骨形成の異常を呈することが報告されている(Ecarot,B.et al.,J.Bone Miner.Res.7:215−220,1992)。本発明のポリペプチドは、上記のHypマウスで想定されている因子と同様の活性を有しており、低リン酸血症誘導活性以外にカルシウムやリン酸代謝を介さずに直接骨組織の石灰化を調節する作用を有していることが考えられる。
本発明を完成させる過程において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子とともに、実施例3の表1に示すようにデンチンマトリックス蛋白質−1(DMP−1)が取得された。この遺伝子は、歯の象牙質にて多く発現し、コードされている蛋白質は象牙質の細胞外基質蛋白質として象牙質の石灰化基質の形成に重要な役割を有していると考えられる。同様にマトリックス細胞外リン酸化蛋白質(MEPE)をコードする遺伝子をOST190として取得した。この分子の機能の詳細については知られていない。また、同様にオステオポンチンをコードする遺伝子も得られている。MEPE、DMP−1、オステオポンチンはRGDモチーフ配列を有するリン酸化蛋白質である点で共通しており、リン酸化されうるセリン、スレオニンに富み、また、酸性アミノ酸であるグルタミン酸やアスパラギン酸の含有率も高く、強度の酸性蛋白質の性質を示すという特微を有する。MEPEとDMP−1の間では、ASARM配列と命名された特徴的な酸性領域が保存されており(Rowe,P.S.N.et al,Genomics 67:54−68,2000)、両者の生理的あるいは機能的意義の類似性が示唆されている。このような、特徴的な蛋白質の機能の一つとして、石灰化の開始における無機カルシウム塩やリン酸塩との相互作用が考えられている。オステオポンチンの遺伝子発現は骨芽細胞、破骨細胞に加えマクロファージなど幅広く報告されている。一方、DMP−1に関しては近年、骨組織での発現、とくに骨細胞での発現が報告されている。MEPEの遺伝子発現は骨髄組織での発現やSaOS−2といった骨肉腫細胞での発現が知られている。このような石灰化組織で認められる酸性マトリックス蛋白質が本発明の過程において本発明のポリペプチドとともに見出されたことは、本発明のポリペプチドが有する作用様式の一面を示していると考えられる。すなわち、本発明のポリペプチドが上記分子に代表される石灰化組織に特徴的な分子の発現を誘導し、協調的に石灰化やカルシウム代謝やリン代謝を調節する可能性や誘導された分子が2次的に、石灰化やカルシウム代謝やリン代謝を調節する可能性が考えられる。また、本発明のポリペプチドが、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞に直接作用して骨代謝を制御しうることが考えられ、骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患の治療に有効性を示すことが考えられる。
近年、異所性石灰化部位で骨芽細胞様の表現形質をもつ細胞が出現し、骨組織での石灰化過程と同様の機序により石灰化がおこることが示唆されている。従って、本発明のポリペプチドが、このような石灰化細胞の出現や機能を抑制することで、異所性石灰化の治療に有効であることも考えられる。
本発明においては、上記ポリペプチドを修飾することもできる。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ(N−ビニル−ピロリドン)、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールなどを適宜選択して使用する。修飾方法は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば特表平10−510980号公報に詳細に開示されている。
4.本発明のポリペプチドに対する抗体
本発明の抗体は、上記本発明のポリペプチドと特異的に反応する。本発明において「抗体」とは、抗原であるポリペプチド又はその断片に結合し得る抗体分子全体またはその断片(例えば、Fab又はF(ab’)2断片)を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、常法に従って調製することができ、例えば、アジュバントとともに抗原で動物を一回あるいは数週間間隔で複数回追加免疫する生体内(in vivo)の方法、免疫細胞を分離して適当な培養系で感作させる生体外(in vitro)の方法のいずれかの方法によって調製し得る。本発明の抗体を産生し得る免疫細胞としては、例えば脾細胞、扁桃腺細胞、リンパ節細胞などがあげられる。
抗原として使用するポリペプチドは、必ずしも上記の本発明のポリペプチド全体を使用する必要はなく、該ポリペプチドの一部分を抗原として使用してもよい。抗原が短いペプチド、特にアミノ酸20残基前後の場合は、キーホールリンペットヘモシアニンや牛血清アルブミンのような抗原性の高いキャリアタンパク質と化学修飾などによって結合させて用いるか、あるいは、キャリアタンパク質のかわりに分枝骨格を持つペプチド、例えばリジンコアMAPペプチド(Posnett et al.,J.Biol.Chem.263,1719−1725,1988;Lu et al.,Mol.Immunol.28,623−630,1991;Briand et al.,J.Immunol.Methods 156,255−265,1992)と共有結合させて用いる。
アジュバントは、例えば、フロイントの完全、または不完全アジュバントや水酸化アルミニウムゲルなどが用いられる。抗原を投与する動物としては例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、モルモット、ハムスターなどが用いられる。
ポリクローナル抗体は、これらの免疫された動物から血液を採取して血清を分離し、硫安沈澱、陰イオン交換クロマトグラフィーまたはプロテインA若しくはGクロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて免疫グロブリンを精製して得られる。上記動物がニワトリの場合は、卵から抗体を精製することもできる。
モノクローナル抗体は、例えばin vitroで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞を培養可能な親細胞と融合させて作製したハイブリドーマ(hybridoma)細胞の培養上清から、又は同ハイブリドーマ細胞を動物腹腔内接種して得られる腹水から精製して調製することができる。親細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えばX63、NS−1、P3U1、X63.653、SP2/0、Y3、SKO−007、GM1500、UC729−6、HM2.0、NP4−1細胞などがあげられる。
モノクローナル抗体を作製するための具体的手法は以下の通りである。
前記のようにして作製したポリペプチド又はその断片を抗原として、前記動物に投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いて1〜100μgである。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1〜3週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から1〜10日後、好ましくは1〜4日後に抗体産生細胞を採集する。
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞と親細胞(ミエローマ細胞)との細胞融合を行う。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で、5×106〜1×108個/mlの抗体産生細胞と1×106〜2×107個/mlのミエローマ細胞とを混合し(抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比5:1が好ましい)、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に5×105個/well程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、本発明のポリペプチドに反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。
また、in vitroで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞にEBウイルスなどの適当なウイルスを感染させ、得られる不死化抗体産生細胞を培養することにより調製することもできる。
これら細胞工学的手法とは別に、in vitroで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞から抗体遺伝子をPCR(polymerase chain reaction)反応によって増幅して取り出し、大腸菌等の微生物に導入して抗体を産生させたり、抗体を融合タンパク質としてファージ表面に発現させるなど、遺伝子工学的手法により得ることもできる。
本発明の抗体を用いて、生体における本発明のポリペプチドを定量する事により、本発明のポリペプチドの各種疾患の病態との係わりを解明する事が出来、さらに同抗体は疾患の診断ひいては治療、且つ本発明のポリペプチドの効率的なアフィニティー精製に資する事が出来る。
本発明のポリペプチドが過度に作用することで、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンDの低下を引き起こすことが主たる原因である疾患の存在が想定される。例えば、低リン血症性ビタミンD抵抗性くる病(XLH)では重度な低リン血症を呈するにも拘わらず、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度は上昇を認めない。その理由は、ビタミンD代謝酵素遺伝子群の異常が想定されているが、この疾患において本発明のポリペプチドの過剰作用が関与している可能性がある。XLHのマウスモデルであるHypでは、24位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が報告されており、本発明のポリペプチドの24位水酸化酵素遺伝子発現亢進作用と一致する。従って、本発明のポリペプチドに対する抗体を投与することで、ビタミンD代謝を正常化し、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度を是正することで本疾患を治療できることが期待される。XLHの類似の所見を呈する疾患として常染色体優性遺伝性低リン血症くる病(ADHR)がある。我々は本発明のポリペプチドのクローニングに際して、その染色体上の位置より、本ポリペプチドをコードする遺伝子がADHRの責任遺伝子であろうと推察していた。最近、ADHRの責任遺伝子の解析がなされ、本ポリペプチドをコードする遺伝子のミスセンス変異が原因であることが報告された。我々はさらにこの変異が酵素的切断に対して耐性を与えるものであることを明らかにし、この分子の過剰作用が疾患の原因であることを示した。この疾患に対して、本発明のポリペプチドに対する抗体がその作用を抑制することで疾患治療に有用であることが考えられる。ADHRが骨軟化症やミネラル代謝異常、ビタミンD代謝異常を呈することから、このような代謝経路が関係する代謝性骨疾患において、本発明のポリペプチドが病因の一つとして作用している疾患の存在が推察され、そのような疾患に対して、本発明のポリペプチドに対する抗体が有効であることが期待できる。1α,25−ジヒドロキシビタミンDの作用の一つとして、脂肪細胞への分化抑制が知られている。加齢に伴い骨髄中の脂肪細胞が増加することが知られているが、骨髄中に存在する骨芽細胞、脂肪細胞および造血支持細胞の共通の前駆細胞から、脂肪細胞への分化が亢進していると考えられる。この過程において本発明のポリペプチドが過度に作用して、1α,25−ジヒドロキシビタミンDの局所における濃度を低減している可能性が考えられる。従って、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることで血中あるいは局所の1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を増加させ、脂肪細胞への分化を抑制し、骨形成能や造血能の低下を改善することが期待できる。また、肥満に対しても有効であることが期待される。このような、本発明のポリペプチドが関与する疾患は他にも存在することが考えられる。この様な疾患は、本発明のポリペプチドに対する抗体を組み合わせたELISAに代表される免疫学的な物質定量法にてスクリーニングすることができる。これにより、本発明のポリペプチドの生理的な正常範囲を設定することができ、またその範囲から逸脱する疾患群を明らかにすることができる。このようにして認められる本発明のポリペプチドの血中濃度が異常高値を示す疾患に対して、本発明のポリペプチドに対する抗体を治療的に使用することが期待できる。
5.医薬組成物
(1)本発明のポリペプチドを含む医薬組成物
本発明のポリペプチドは、血中リン酸濃度の上昇が好ましくない疾患に対して医薬組成物として用いることができる。慢性腎不全においては、腎からのリン酸の排泄量が減少により、血中のリン酸濃度の上昇がおこる。高リン酸血症が腎機能をさらに増悪させるとともに、副甲状腺からの副甲状腺ホルモンの分泌を促進して二次性副甲状腺機能亢進症を引き起こす。本症は、皮膚の掻痒を起こすとともに、腎臓での1α,25−ジヒドロキシビタミンD3合成障害による腸管からのCa吸収の低下をもたらす。また、血中リン酸の貯留による副甲状腺ホルモンの過分泌状態が、骨組織からのCa動員を促進する。この状態が続くと腎性骨異栄養症の様態の一つである線維性骨炎や副甲状腺の過形成を生じる。この状態を回避する好ましい方法の一つが、前述の高リン酸血症の改善であるが、現在の医療では高リン酸血症を十分に制御できていない。本発明のポリペプチドは、排尿機能が残存するまでの慢性腎不全において、腎臓近位尿細管上皮細胞に存在するII型Na依存性リン酸トランスポーターを抑制して尿中へのリン酸排泄を促進することで、血中のリン酸を是正する活性を有する(リン酸輸送抑制活性)。また本発明のポリペプチドは腸管に作用して、腎臓と同様にIIb型Na依存性リン酸トランスポーターを抑制することでリン酸の体内への吸収も低下させ、血中リン濃度を是正させることができる。
本発明のポリペプチドはまた、カルシウム代謝とリン酸代謝の異常による疾患に対し医薬組成物として用いることができる。カルシウム代謝異常とは、血清カルシウム濃度が臨床上定義されている正常域を逸脱している状態、あるいは、血清カルシウム濃度は正常域であるが、この血清カルシウム濃度を保つために腎臓、腸管、骨組織、副甲状腺の機能が異常に亢進又は低下している状態、あるいは、副甲状腺ホルモン、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3、カルシトニンといった血清カルシウムを調節するホルモンが異常値を示す状態を意味する。また、リン酸代謝異常とは、血清リン酸濃度が臨床上定義されている正常域を逸脱している状態、あるいは、血清リン酸濃度は正常域であるが、腎臓、腸管、骨組織におけるリン酸出納機能が異常に亢進又は低下している状態を意味する。
上述の二次性副甲状腺機能亢進症に伴う腎性骨異栄養症は、臨床においては線維性骨炎のほかに無形成骨やその混合型など多様な形態をとる。これは、二次性副甲状腺機能亢進症に対して、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3又は1α−ヒドロキシビタミンD3などが、副甲状腺ホルモンを抑制する目的で一般に用いられている。副甲状腺ホルモン値が十分抑制されない場合は、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3又は1α−ヒドロキシビタミンD3の投与の過剰量を投与するパルス療法(以下、「ビタミンDパルス療法」ということがある。)が行われることがある。血清の副甲状腺ホルモンの正常濃度は65pg/ml以下であるが、この病態において副甲状腺ホルモンの濃度が正常値レベルであるときは、腎性骨異栄養症の一つの様態である無形成骨を生じる。しかも、副甲状腺ホルモン濃度が上昇すると線維性骨炎を生じるといった相反する病態を示す。このような疾患に対する最近の治療指針としては、副甲状腺ホルモン濃度を130〜260pg/ml程度に維持することが提唱されているが、根本的な代謝異常の原因は不明のままである。副甲状腺ホルモンは、血中リン酸濃度の上昇により誘導され、血清カルシウムの上昇により抑制されることが知られている。本発明のポリペプチドは、血中リン酸濃度および血中カルシウム濃度を低下させることから、副甲状腺ホルモンの機能を修飾しうることが推察できる。また、腫瘍性骨軟化症患者において、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3が検出限界以下まで低下することが報告されており、本発明のポリペプチドが1α,25−ジヒドロキシビタミンD3の活性調節に関連していることも推察できる。上述の副甲状腺ホルモンの制御異常や活性異常を伴う腎性骨異栄養症において、本発明のポリペプチドが無形性骨又は線維性骨炎のいずれかに対して臨床上有用な医薬組成物として利用できることが考えられる。従って、腎性骨異栄養症の繊維性骨炎と無形成骨といった相反する病態のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドの投与が有用な治療方法を提供することが考えられる。
さらに、本発明のポリペプチドは、異所性石灰化に対し医薬組成物として用いることができる。骨組織以外の組織における石灰化は、生体機能を損なうものである。特に心臓や血管の石灰化による機能不全は生命を脅かすものである。この異所性石灰化の危険因子としては、血中のカルシウムイオンとリン酸イオンの濃度の積(以下、「カルシウム−リン積」ということがある。)が上昇することが挙げられる。上述の二次性副甲状腺機能亢進症の治療において、高リン酸血症の状態に対してビタミンDパルス療法を行う際に、カルシウム−リン積が上昇して異所性石灰化を起こす場合がある。また、血液透析患者における心血管系の石灰化は重大な問題である。本発明のポリペプチドは、表4に示すように、血清のカルシウム濃度とリン酸濃度を顕著に低下させる活性を有しており、種々の疾患に付随する異所性石灰化に対して有効であることが期待できる。
さらに、本発明のポリペプチドは、代謝性骨疾患に対し医薬組成物として用いることができる。本発明のポリペプチドは、カルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンD代謝に対して強力な調節活性を有している。カルシウム代謝とリン代謝に関連するホルモンとしては、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3がある。カルシトニンは血清カルシウムを低下させる活性を有し、副甲状腺ホルモンと1α,25−ジヒドロキシビタミンD3は、血清カルシウムを上昇させる活性を有している。副甲状腺ホルモンは尿中へのリン酸排泄作用を有しており、カルシトニンにも同様の活性があることが報告されている。1α,25−ジヒドロキシビタミンD3は、腸管からのリン酸の吸収を促進する活性を有する。このように、それぞれのホルモンが血中のカルシウムとリン酸のバランス維持に対して異なる活性を有しているが、カルシトニン及び1α,25−ジヒドロキシビタミンD3は骨粗鬆症の治療薬として使用されている。また、副甲状腺ホルモンも骨粗鬆症に対する治療薬として開発中である。
骨代謝には、骨吸収と骨形成という骨組織の異化と同化が相互調節しているという特徴がある。副甲状腺ホルモンを持続的に投与すると骨量を減少させるが、間歇的に作用させることにより骨形成を促進することが知られている。本発明のポリペプチドも、カルシウム代謝とリン酸代謝の調節作用を有していることから、適切な使用方法を選択することで骨粗鬆症をはじめ代謝性骨疾患に対して有効であることが期待できる。
さらに、本発明のポリペプチドは、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の上昇が好ましくない疾患又は状態に対して、あるいは、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンDによって誘導される生理応答が好ましくない状態に対して、医薬組成物として用いることができる。
1α,25−ジヒドロキシビタミンDは副甲状腺に対して作用し、副甲状腺ホルモン(PTH)の分泌を抑制する事が知られている。そのため臨床では慢性腎不全における二次性副甲状腺機能亢進症、とりわけ血清中PTH濃度が高い症例において、間欠的に高濃度の1α,25−ジヒドロキシビタミンDを投与する治療法が確立している。しかしこの治療法の短所として、異所性石灰化を誘発しやすい点が上げられる。血清中リン酸濃度が高い慢性腎不全患者において、1α,25−ジヒドロキシビタミンDの投与により骨組織以外の組織における好ましくない石灰化がしばしば認められる。本発明のポリペプチドの投与は数時間以内に速やかな血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンDの低下を促す作用を有することから、1α,25−ジヒドロキシビタミンDの過剰が原因となる異所性石灰化の治療および予防に有用である。
また、高濃度1α,25−ジヒドロキシビタミンDの間欠的投与は過度のPTH分泌抑制をもたらし、骨の代謝が停止したような所見を呈する無形成骨症を誘発することがある。このような症例に対しても、本発明のポリペプチドの投与により、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンDを低下させ、副甲状腺における適切なPTH分泌を促し、無形性骨からの回復をもたらすことが期待できる。
血管の石灰化においても1α,25−ジヒドロキシビタミンDが石灰化促進因子として関与していることが報告されている。本発明のポリペプチドは血管の石灰化を伴う病態、例えば加齢による動脈硬化、糖尿病性血管症、透析患者による心血管系の石灰化などに対して治療的あるいは予防的に用いることができる。
腸管からのカルシウム吸収は血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンDにより促進されることが知られている。本発明のポリペプチドは、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を低下させることにより、高カルシウム血症の是正に用いることができる。高カルシウム血症の原因としては、原発性副甲状腺機能亢進症によるPTHの過剰産生、サルコイドーシスや結核などの慢性肉芽腫に伴った高濃度1α,25−ジヒドロキシビタミンD、あるいは悪性腫瘍が産生するPTHrPによる骨吸収促進などが挙げられる。1α,25−ジヒドロキシビタミンD過剰だけでなくPTH又はPTHrPが主な原因である高カルシウム血症において、本発明のポリペプチドを投与することにより、血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を低下させることで高カルシウム血症を改善することが期待できる。特に、サルコイドーシスや結核などの慢性肉芽腫中の活性化マクロファージは1α位水酸化酵素活性を有しており、1α,25−ジヒドロキシビタミンD3を過剰産生する。本発明のポリペプチドにより、この1α位水酸化酵素活性を直接低下させることが期待される。
1α,25−ジヒドロキシビタミンDは、破骨細胞の分化を促進することが知られており、本発明のポリペプチド投与により骨吸収抑制が期待される。in vitroにおいて、1α,25−ジヒドロキシビタミンDは強力な破骨細胞分化誘導因子として知られている。破骨細胞による過度な骨吸収は、骨粗鬆症に代表される骨減少疾患を招く。本発明のポリペプチドは、このような骨吸収の促進が認められる疾患において、一過性に血清中1α,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を低下させることにより、骨代謝回転を正常に戻すことが期待される。また、1α,25−ジヒドロキシビタミンDはin vtroで骨芽細胞の分化を抑制することが報告されているが、in vivoにおいても骨形成を抑制する因子であることがビタミンD受容体欠損マウスの骨移植実験で示唆されている。このような観点からも、1α,25−ジヒドロキシビタミンDを低下させうる本発明のポリペプチドは骨量の減少を伴う代謝性骨疾患に対して有用であることが期待できる。また、ビタミンD3代謝物の一つである、24,25−ジヒドロキシビタミンDを投与することにより、骨量の増加を認める報告がなされている。24,25−ジヒドロキシビタミンDは、25−ヒドロキシビタミンDを基質として24位水酸化酵素が水酸化を行うことで合成される。本発明のポリペプチドは、24位水酸化酵素遺伝子の発現を有意に亢進させる作用を有しているため、本ペプチドの投与により、血中24,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を上昇させ、骨粗鬆症などの骨疾患、あるいは骨格形成異常などに対する骨量の増加を期待することができる。
PTHは強力な骨吸収促進作用を有することが知られているが、これを間歇投与することで骨代謝回転を刺激することができ、結果的に骨量を増加させる効果を発現させることができる。本発明のポリペプチドの生理活性として、1α,25−ジヒドロキシビタミンDの調節作用や血清カルシウム、血清リン酸濃度調節作用、石灰化調節作用を有することが明らかとなっているが、本ポリペプチドを効果的に骨組織に作用させることで骨代謝回転を調節することは可能であると考えられる。従って、骨代謝回転が亢進している閉経後骨粗鬆症や骨代謝回転が低下している退行期骨粗鬆症に対して本ポリペプチドが有用であることが期待できる。このような、本発明のポリペプチドが関与する疾患は他にも存在することが考えられる。この様な疾患は、本発明のポリペプチドに対する抗体を組み合わせたELISAに代表される免疫学的な物質定量法にてスクリーニングすることができる。
これにより、本発明のポリペプチドの生理的な正常範囲を設定することができ、またその範囲から逸脱する疾患群を明らかにすることができる。このようにして認められる本発明のポリペプチドの血中濃度が異常低値を示す疾患に対して、本発明のポリペプチドを治療的に使用することが期待できる。
(2)本発明の抗体を含む医薬組成物
本発明の抗体は、ビタミンD抵抗性くる病や腫瘍性骨軟化症に対し、医薬組成物として用いることができる。上述の抗体の調製方法により本ポリペプチドの中和抗体をポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として取得することができる。抗体を医薬としてより適正に用いる方法としては、ヒト型抗体やヒト型化抗体を作製することが可能である。腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症や骨軟化症の治療又は改善は本発明のポリペプチドの過剰な活性を抑制することで達成できる。本発明のポリペプチドに対する中和抗体を投与することにより腫瘍性骨軟化症の症状改善が期待できる。また、XLHにおける低リン酸血症誘導因子や石灰化抑制因子が本発明のポリペプチドと同等であると考えられ、XLHを含むビタミンD抵抗性くる病に対する治療薬にもなり得る。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドが過剰状態に存在するカルシウム代謝又はリン酸代謝異常疾患や代謝性骨疾患に対し、医薬組成物として用いることができる。上述にあるように、慢性腎不全患者や血液透析患者においてはカルシウム代謝やリン酸代謝の恒常性維持機構に異常が生じているが、本発明のポリペプチドが過剰産生や蓄積が原因である可能性がある。本発明のポリペプチドが骨代謝を調節することを示したが、本発明のポリペプチドが過剰に存在することで生じる代謝性骨疾患の存在も考えられる。この場合に本発明のポリペプチドに対する抗体により病態の治療又は改善が期待できる。
本発明の抗体を適用し得る疾患は、骨粗鬆症、ビタミンD抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病、腫瘍性骨軟化症などの少なくとも1種の骨疾患が挙げられる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
(3)投与プロトコール
本発明のポリペプチド又は抗体を有効成分として含む医薬組成物は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明のポリペプチド又は抗体を骨疾患の予防剤又は治療剤として使用する場合は、使用する対象を特に限定するものではない。
本発明のポリペプチドについては、生体のカルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンD代謝を調節し得る医薬組成物として使用することができる。
本発明の抗体については、上記のとおり骨粗鬆症、ビタミンD抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病、腫瘍性骨軟化症などの少なくとも1種の骨疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであっても、本発明のポリペプチド又は抗体の使用の対象とすることができる。
本発明のポリペプチド又は抗体を含む予防剤又は治療剤は、ポリペプチドにあっては経口的又は非経口的に、抗体にあっては非経口的に投与することができる。
本発明のポリペプチドを経口的に投与する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの液体製剤等とすればよい。特に顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位量投与形態とすることができ、液体製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
これら剤形のうち経口用固形剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有する。また、経口用液体製剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有する。
本発明のポリペプチド又は抗体を非経口的に投与する場合は、注射剤、坐剤等とすることができる。
注射の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供され、使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。これらの剤形は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。注射手法としては、例えば点滴静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射が挙げられる。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。
この場合、本発明のペプチド又は抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、ポリペプチドにあっては、一回につき体重1kgあたり0.01〜100μg、好ましくは0.5〜20μgである。また、抗体にあっては、一回につき体重1kgあたり0.1μg〜2mg、好ましくは1〜500μgである。
6.疾患の診断剤
(1)本発明の抗体又はポリペプチド
本発明の抗体は、血中や尿中に存在する本発明のポリペプチドあるいはその代謝物の検出や定量に用い、本発明のポリペプチドと病態の関連性をあきらかにすることができるとともに、関連疾患の診断剤として確立できる。
関連疾患とは、骨疾患またはカルシウム代謝異常、リン酸代謝異常、石灰化異常、及びビタミンD代謝異常のうち少なくとも1つの異常を呈する疾患を意味し、例えば骨粗鬆症、ビタミンD抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病、腎不全、腎性リン酸漏出症、尿細管性アシドーシス、ファンコニ症候等が挙げられる。
抗体を用いた結合分子の定量方法は、ラジオイムノアッセイやエンザイムイムノアッセイなどにより一般化している。このような方法を用いて、血中や尿中の本発明のポリペプチドを測定することは、新たな臨床判断の指標となり得る。例えば、くる病患者において、本発明のポリペプチドの血中値が健常人と比較して高値を示す場合には、XLH又はADHRを強く疑うことができる。また、本発明のポリペプチドの血中濃度の変化により慢性腎不全患者の二次性副甲状腺機能亢進症への進展を予想できる。
腫瘍性骨軟化症については、一般に腫瘍の発見が容易でない場合が多いが、本発明の抗体を用いることで有用な診断方法が確立できる。例えば、くる病や骨軟化症の家族歴がない患者において、血中の本発明のポリペプチド濃度が健常人と比較して著しい高値を示した場合、腫瘍性骨軟化症を疑うことができる。
(2)本発明のDNA
本発明においては、リン酸代謝異常疾患やカルシウム代謝異常疾患および代謝性骨疾患患者から本発明のDNA異常を検出することにより、当該疾患の診断と予防を可能にする。
本発明のDNAの塩基配列をGenbankの塩基配列データベース中でサーチすると、3つに断片化した状態で、ヒト12p13 BAC RPCI11−388F6(アクセッション番号AC008012)の配列と一致する。この断片化は、染色体配列からスプライシングにより本発明のDNAの塩基配列が得られることを示しており、本発明のポリペプチドをコードするDNAは、少なくとも配列番号11に示す配列のうち第498番から第12966番までの配列又はその一部の断片を含むことが明らかである。この領域内の塩基の置換や挿入や欠失により、本発明のポリペプチドの生物学的および生理的活性の上昇や低下や消失が起こる。本発明のポリペプチドは、リン酸代謝、カルシウム代謝、骨代謝、ビタミンD代謝に強力な作用を有することから、この配列番号11に示す塩基配列又はその一部の領域(例えば第498番から第12966番までの配列)において、一部の塩基の置換、挿入、欠失などによる遺伝子多型や変異を明らかにすることにより、リン酸代謝異常やカルシウム代謝異常を含む疾患、あるいは骨代謝異常を呈する疾患、ビタミンD代謝異常を呈する疾患の診断、予防が可能となる。
ところで、ADHRを有する家系の連鎖解析がなされ、その責任遺伝子が12p13に存在することが報告されている(Econs,M.J.et al.,J.Clin.Invest.100:2653−2657,1997)。この報告において、責任遺伝子がマイクロサテライトマーカーD12S100とD12S397の18cMの範囲に存在することが明らかにされている。本発明者は、本発明のDNAが存在する染色体上の位置をこれらと比較して確認したところ、本発明のポリペプチドをコードするDNAは、ADHRの責任遺伝子が存在する領域と一致した。本発明のポリペプチドの生物活性と遺伝子の染色体上の位置から、本発明のポリペプチドがADHRの責任遺伝子によりコードされていると考えられる。このことは、ADHR患者の血液より細胞成分を分離して、これより染色体DNAを単離して、配列番号11に示されている領域の塩基配列の変異を見つけることで確定することができる。従って、上記塩基配列領域を有する遺伝子は、常染色体優性低リン酸血症性くる病、伴性染色体性低リン酸血症性くる病、低リン酸血症性骨症、骨粗鬆症等の診断剤として使用される。
本発明者が特定した本発明のポリペプチドをコードするDNA領域のexon1とexon2との間には、NCBIのGenbankにアクセッション番号G19259で登録されているSTS配列が存在する。このマーカーは本DNAと遺伝的形質との関連性を調べる上で非常に重要であると考えられる。
本発明は、これまでのカルシウム代謝、リン酸代謝、骨代謝及びビタミンD代謝に対する理解に大きな変革をもたらす。慢性腎不全から血液透析期の移行遅延やリン酸代謝とカルシウム代謝関連疾患や代謝性骨疾患に対する新しい治療法と診断方法を提供する。また、既存の治療方法の改善やそれを補助するものとして有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例1 ヒト腫瘍性骨軟化症由来腫瘍cDNAライブラリーの作製
液体窒素で凍結させた腫瘍組織を5mlのISOGEN(日本国ニッポンジーン)液中で破砕、懸濁させた後、添付文書に従って約0.13mgのトータルRNAを調製した。このトータルRNA1.5μlより、SMART cDNAライブラリー作製キット(米国CLONTECH社)を用いて、添付文書に従いcDNAを合成した。以下、本cDNAをcDNA#2と表記する。このcDNA#2にEcoRIアダプターを付加し、あらかじめ制限酵素EcoRIで消化したλZAPIIファージベクター(米国STRATAGENE社)に組み込みんだ後、Gigapack III Goldファージパッケージングキット(米国STRATAGENE社)を用い、添付文書に従い、腫瘍性骨軟化症腫瘍ファージライブラリーを作製した。得られたライブラリーは、独立なクローンを合計で約60万種類を含んでいた。さらに、上記ファージライブラリーを大腸菌XLI−Blue MRF’株に感染させた後、15cmのシャーレ20枚に蒔き直し、37℃で10時間保温することで、プラークを形成させた。このプラークをすべてSMバッファーに抽出し、腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAファージライブラリーとした。
実施例2 腫瘍cDNAのポジティブスクリーニングの実施
概要
腫瘍性骨軟化症の原因遺伝子は、腫瘍の外科的除去において治癒し得ることから、腫瘍において特異的に高発現している可能性が示唆されている。また、これまでの報告では、腫瘍性骨軟化症の腫瘍は中杯葉系、とりわけ間充織細胞由来であることが多い。したがって、正常な中杯葉由来組織中には発現が低く、腫瘍組織中にのみ特異的に高発現している遺伝子群を同定することが必要と考えられる。そこで、以下に示すとおり、cDNAサブトラクション法を応用したポジティブスクリーニングを実施した。腫瘍組織由来cDNAと、対照として骨組織より単離したcDNAとをサブトラクションすることで、腫瘍組織中にのみ特異的に高発現し、骨組織中には発現していない遺伝子群を濃縮した。このサブトラクションしたcDNA群をプローブに用い、腫瘍cDNAファージライブラリーをハイブリダイゼーションすることで、腫瘍特異的発現遺伝子断片を得た。
(1)対照ヒト骨組織cDNAの作製
液体窒素で凍結させたヒト骨組織を5mlのISOGEN(日本国ニッポンジーン)液中で破砕、懸濁させた後、添付文書に従って約0.011mgのトータルRNAを調整した。このトータルRNA3μlより、SMART cDNAライブラリー作製キット(米国CLONTECH社)を用いて、添付文書に従いcDNAを合成した。このようにして得られたcDNAを、以下、cDNA#4と表記する。
(2)腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAと対照骨組織cDNAのサブトラクション
実施例1で記載したcDNA#2に高発現している遺伝子を濃縮するため、PCR−Select cDNAサブトラクションキット(米国CLONTECH社)を用い添付文書に従って、実施例2(1)で記載したcDNA#4とハイブリダイゼーションさせることにより、cDNA#2からcDNA#4に含まれている遺伝子断片を差し引いた(サブトラクションした)。その後、差し引かれたcDNA#2は添付文書に従いPCR増幅され、サブトラクション済みcDNA群(A)を得た。
一方、サブトラクションキットの性質上、ハイブリダイゼーションの過程が2回であり、定法に比べ少ないため、両者に共に多く存在する遺伝子は完全にサブトラクションされにくい。そのため、サブトラクション済みcDNA群(A)のみをプローブとして、腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーとハイブリダイゼーションした場合、完全にサブトラクションできていない遺伝子もポジティブクローンとして得られてしまう。そこで、対照プローブとして実施例2(1)で記載したcDNA#4からcDNA#2を同様の手法で差し引いた後、PCR増幅したサブトラクション済みcDNA群(B)を調製した。このサブトラクション済みcDNA群(B)と、先に述べたサブトラクション済みcDNA群(A)とをそれぞれ腫瘍cDNAライブラリーに対してハイブリダイゼーションし、両者のシグナルを比較することで、腫瘍性骨軟化症腫瘍に特異的に含まれる遺伝子断片を単離する事が可能となる。
(3)腫瘍cDNAライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーション
実施例1に記載した腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAファージライブラリーを大腸菌XLI−Blue株に感染後、15cmシャーレ一枚あたり3,000プラークを形成するように蒔き直し、37℃で8時間保温した。その後、Hybond N+(米国Amersham Pharmacia Biotech社)ナイロンフィルターに各2枚ずつプラークを写し取った。転写したナイロンフィルターを添付文書に従ってDNAの固定処理を行い、実施例2(2)で記載したサブトラクション済みcDNA(A)およびサブトラクション済みcDNA(B)をそれぞれプローブとしてスクリーニングを実施した。
プローブ標識、ハイブリダイゼーション及びシグナル検出は、Alphos Directシステム(米国Amersham Pharmacia Biotech社)を用い、添付文書に従い実施した。プローブには、実施例2(2)で記載したサブトラクション済みcDNA(A)およびサブトラクション済みcDNA(B)をそれぞれ100ngずつ用い、プロトコールに従い蛍光標識した。本プローブをAlphos Directシステム付属のハイブリダイゼーションバッファー50mlにそれぞれ加え、同時に8枚のプラークを転写したナイロンフィルター2組をそれぞれプロトコールに従いハイブリダイズ、洗浄した。洗浄後、ナイロンフィルターを発光反応に供し、ECLフィルム(米国Amersham Pharmacia Biotech社)に2時間露光し、自動現像機(日本国フジフィルム)にて現像し、結果を解析した。
その結果、サブトラクション済みcDNA(A)をプローブに用いた場合に強く露光し、サブトラクション済みcDNA(B)をプローブに用いた場合に露光しない部分に位置する単一のプラークを目視で選択し、シャーレから掻き取り0.5mlのSMバッファーに懸濁後、4℃に2時間以上静置することにより、ファージを抽出した。
(4)ポジティブクローンの塩基配列解析
実施例2(3)で得られたポジティブクローンを含んだファージ溶液0.5μlを鋳型とし、ファージベクター内部配列であるT7プライマー(TAATACGACTCACTATAGGG)(配列番号24)およびT3プライマー(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)(配列番号25)、LA−taqポリメラーゼ(日本国宝酒造社)を用い、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒からなる工程を1サイクルとして35サイクルのPCRを実施した。PCR産物を0.8%アガロースゲルにて電気泳動し、明瞭な単一のバンドが認められたクローンについて、PCR増幅断片を鋳型に用いてABI377DNAシーケンサー(米国PEアプライドシステムズ社)を用いて配列決定した。
一方、明瞭な2本のバンドが認められた場合、相当するバンドのゲル部分より、それぞれQIAquick Gel Extraction kit(独国QIAGEN社)を用いてPCR産物を抽出し、ABI377DNAシーケンサーにより配列決定した。
腫瘍性骨軟化症ファージライブラリー34万1千個のプラークについてディファレンシャルハイブリダイゼーションを行った結果、456個のポジティブプラークを確認し、これらすべてを塩基配列決定した。
実施例3 ヒト低リン誘導因子候補遺伝子の絞り込み
実施例2において得られたポジティブクローン456個の配列情報について、NCBIが提供する塩基配列データベースであるGenbankに登録されている塩基配列に対して相同性検索した。その結果、出現頻度の高い既知遺伝子として表1に記載した遺伝子群が得られた。一方、データベース検索の結果、生物活性の不明な未知遺伝子断片が100クローン存在した。これら未知遺伝子断片の塩基配列情報について、クローン間での重複を頻度情報として抽出した。その中で最も高頻度に重複した遺伝子として、7クローンが連続して1つのコンティグを形成した配列OST311が得られた。このとき得られた塩基配列情報は、配列番号1の塩基番号1522から2770であった。本遺伝子断片を既存データベースにて検索したところ、cDNA又はESTとして登録されてはおらず、ゲノム配列にのみ一致した。該当するゲノム配列はAC008012であり、染色体上の12p13に位置することがすでに報告されている。しかしながら、得られた配列内には蛋白質をコードする領域(ORF)は認められず、3’側非翻訳領域であると予想されたため、腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーよりcDNAの全長クローニングを実施した。なお、ORFの予測には、DNASIS−Mac version3.7のORF予測機能を用いた。
実施例4 OST311の全長クローニング
実施例3で得られたOST311の配列に基づいて、以下のプライマーを合成し、腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーのファージ溶液を鋳型として、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒からなる工程を1サイクルとして35サイクルのPCRを実施した。
PCR産物を2%アガロースゲルにて電気泳動し、予想されるサイズのPCR産物の増幅を確認した後、MicroSpinカラムS−300HR(米国Amersham Pharmacia Biotech社)を用いてPCR産物を精製した。得られたPCR産物をAlphos Directシステム(米国Amersham Pharmacia Biotech社)を用い添付文書に従って蛍光標識し、これをプローブとして、2万クローンの腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーのプラークハイブリダイゼーションを実施した。
得られた40個のポジティブクローンを、T7およびT3を用いて、実施例2(4)に記載した要領でPCR増幅し、得られたPCR産物の塩基配列を基に、プライマー311−L296(配列番号14、GGGGCATCTAACATAAATGC)を合成した。再度、311−U65(配列番号12)と311−L344(配列番号13)プライマーで増幅されるPCR産物をプローブとして、2万クローンの腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーのプラークハイブリダイゼーションを実施した。ポジティブクローン62個について、T7と311−L296(配列番号14)プライマーで増幅したPCR産物の塩基配列を決定し、これまで判明した塩基配列と連結した。その結果、配列番号1に示す塩基配列が得られた。この配列番号1の塩基番号133に位置する開始コドンからOST311のORFが始まることが判明した。さらにORFの配列を最終的に確定するため、以下のプライマーを合成した。
上記311−F2(配列番号16)および311−L6(配列番号21)プライマーを用い、腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーを鋳型として、Pyrobest DNA polymerase(日本国 宝酒造社)を用いて、96℃、30秒、55℃、30秒、72℃、30秒からなる工程を1サイクルとした35サイクルのPCRを実施した。
このPCR産物を2%アガロースゲルにて電気泳動したところ、約980塩基対からなる単一の増幅断片が認められた。そこで、本増幅断片を、上記プライマー(配列番号15から21)を用いて塩基配列決定した結果、配列番号1の塩基番号133に位置する開始コドンATG、および塩基番号886に位置する終止コドンTAGに挟まれた、配列番号2に示すポリペプチドをコードするORF領域を確定した(配列番号1)。
実施例5 OST311の腫瘍性骨軟化症腫瘍特異性
OST311の腫瘍特異性を検討するため、腫瘍組織より抽出したfirst−strand cDNAおよび対照骨組織より抽出したfirst−strand cDNAを鋳型に、下記に示すOST311特異的プライマー(配列番号22及び23)を用い、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒からなる工程を1サイクルとした35サイクルのPCRを実施した。なお、両反応液中には終濃度2%となるようDMSOを添加し、酵素にはLA−taq DNA polymerase(日本国宝酒造社)を用いた。また、内部標準としてG3PDHに特異的なプライマー(FW:ACCACAGTCCATGCCATCAC(配列番号26)、RV:TCCACCACCCTGTTGCTGTA(配列番号27))によるPCRも同様な条件で実施した。
図1に示したように、これらのPCR産物を2%アガロースゲルにて電気泳動したところ、OST311プライマーを用いた場合、腫瘍組織を鋳型にした場合のみ予想されるサイズのPCR産物が認められた。一方、G3PDHプライマーを用いた場合では、腫瘍組織、対照骨組織共に予想されるサイズのPCR産物が同程度に認められた。この結果から、OST311が腫瘍組織特異的に発現していることが確認された。
実施例6 OST311安定発現CHO細胞の取得
(1)OST311発現ベクターの構築
実施例5で示した311F1EcoRI(配列番号22)および311LHisNot(配列番号23)プライマーを用い、腫瘍性骨軟化症腫瘍cDNAライブラリーを鋳型に、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒からなる工程を1サイクルとした35サイクルのPCRを実施した。なお、応液中には終濃度2%となるようDMSOを添加し、酵素にはLA−taq DNA polymerase(日本国宝酒造社)を用いた。311F1EcoRIプライマーは、Kozak配列より上流に位置する、配列番号1の塩基番号111よりアニーリングし、311LHisNotプライマーは配列番号1の塩基番号871よりアニーリングし、両プライマーを用いたPCRを行うことで、配列番号2に示した全長ポリペプチドをコードする領域を増幅できる。また、311LHisNotプライマー中には、配列番号2のアミノ酸番号251番目に続きヒスチジン残基を6個付加した後、終止コドンとなるような塩基配列が含まれている。そのため、翻訳された組換え蛋白質はC末端にHis6タグ配列を有しており、抗体による組換え体の認識やニッケルレジンによる組換え体精製に有用できる。
PCR増幅断片を制限酵素EcoRIおよびNotIで消化した後、同様にEcoRI、NotIで消化した動物細胞発現用プラスミドベクターpcDNA3.1Zeo(米国INVITROGEN社)と連結した。得られた組換えベクターを大腸菌DH5α株に遺伝子導入し、100mg/mlアンピシリンを含むLB培地3mlで培養後、GFXプラスミド精製キット(米国Amersham Pharmacia Biotech社)を用いてプラスミドの精製を行った。挿入遺伝子の配列を常法に従って決定し、配列番号1の相当部分と一致し、かつ終止コドン直前にHis6タグ配列をコードする塩基配列が付加されていることを確認した。
(2)OST311安定発現CHO細胞の取得
実施例6(1)で作製したOST311ORF部分を挿入したプラスミド約20μgを、ベクター内にあるアンピシリン耐性遺伝子を1か所で切断する制限酵素FspIで消化した後、エタノール沈殿させ、10μlの超純水に溶解した。その後、Gene Pulser II(米国Bio Rad社)を用いて電気穿孔法(エレクトロポレーション)により全量を宿主細胞に導入した。宿主細胞にはCHO Ras clone−1細胞(Shirahata,S.,Biosci.Biotech.Biochem,59(2):345−347,1995)を用いた。75cm2培養フラスコ(米国コーニング社)で37℃、5%CO2,湿度100%下、10%FCS入りMEMα培地で培養面積の約90%を占めるまでCHO Ras clone−1を培養した。その後、接着細胞をトリプシン処理することで剥離させ、約1×107個の細胞を得た。得られた細胞を0.8mlのPBSに懸濁した後、FspI消化したプラスミドと混合し、10分間氷冷した。プラスミドを含んだ細胞を0.4cm間隔の専用キュベットに移し、電気パルスを0.25kV、975μFの設定値でかけた後、キュベットを再度10分間冷却した。遺伝子導入された細胞を10%FCS入りMEMα培地で24時間培養した後、終濃度0.5mg/mlとなるようゼオシン(米国INVITROGEN社)を加え、さらに1週間培養した。その後、薬剤耐性能を示した細胞をクローン化するため、限界希釈法により0.2細胞/ウェルとなるように96ウェルプレート(米国コーニング社)に播種し直し、終濃度0.3mg/mlゼオシン存在下、約3週間培養することで、薬剤耐性株35クローンを得た。
(3)OST311安定発現CHO細胞の組換え体産生の確認
薬剤耐性を示した35クローンについて、その培養上清中の組換え体OST311の存在をウエスタンブロッティング法で確認した。
回収した培養上清0.2mlをウルトラフリーMCM.W.5,000カットメンブレンシステム(米国MILLIPORE社)を用いて約40〜50μlに濃縮し、1M Tris−Cl pH6.8、5%SDS、50%グリセロール、100mM DTTを含むサンプルバッファーを10μl添加し、95℃、5分間加熱した。そして、10−20%勾配のポリアクリルアミド電気泳動にて培養上清中の蛋白質を分離した。その後、セミドライブロッティング装置(米国Owl Separation Systems社)を用い、ゲル中の蛋白質をImmobilon PVDF膜(米国MILLIPORE社)に転写した。このPVDF膜を、TTBSバッファー(米国Sigma社)中で1/5000希釈した抗His(C末)抗体(米国INVITROGEN社)とともに室温で1時間インキュベーションした後、ECL発光システム(米国Amersham Pharmacia Biotech社)を用いてフィルムに5分露光し、自動現像機(日本国フジフィルム社)で現像した。その結果、約32kDaおよび約10kDaに最も強いシグナルを認めたクローン#20を単離した。以下、#20細胞を、CHO−OST311Hと命名し、独立行政法人産業技術総合研究所、特許微生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1)に寄託した(受託番号FERM BP−7273)。
実施例7 CHO−OST311H培養上清によるリン輸送阻害活性の測定
CHO−OST311Hを225cm2培養フラスコ(米国コーニング社)で37℃、5%CO2,湿度100%下、10%FCS入りMEMα培地でフラスコ面積の約80%を占めるまで増殖させた後、培地を無血清培地CHO−S−SFM II(米国LIFE TECHNOLOGY社)30mlに置き換え、48時間後に上清を回収した。浮遊細胞等を除くため上清を1,200gで5分間遠心した後、Minisart−plus 0.22μmフィルター(独国Sartorius社)を用いて濾過した。
この培養上清を用いて、ヒト腎臓近位尿細管細胞株(CL−8細胞)のリン酸輸送活性に対する作用を検討した。ヒト腎臓近位尿細管細胞株は、10%のFCSを含むDMEM培地(LIFE TECHNOLOGY社)を用いて5%CO2,湿度100%下37℃にて培養した。リン輸送活性の測定には、まず48−ウェルプレート(米国コーニング社)にヒト腎臓近位尿細管細胞株を10%のFCSを含むDMEM培地で培養した。培養開始から3日目に細胞がプレート底面の全体を覆うようにまで増殖したところで培養液を200μlの無血清培地CHO−S−SFM II(米国LIFE TECHNOLOGY社)に置き換え、さらに20〜24時間培養した。この状態の細胞を用いて以下のリン酸輸送活性測定実験(実験1と実験2)を実施した。
(1)実験1:
CHO−S−SFM II培地を除去して、上述のCHO−S−SFM II培地で調製したCHO−OST311H細胞の培養上清をウェルあたり200μl添加した。このとき対照として、CHO−S−SFM IIを置換しないウェル、および、CHO−OST311Hと同様に調製したCHO−OST190H細胞の培養上清を200μl添加したウェルを、それぞれ3ウェルずつ作製した。上述のCHO−OST190H細胞は、CHO−OST311H細胞と同様の方法で本発明者がクローン化したOST190Hを発現できる形でCHO ras clone−1に導入して作製した組み換え体細胞である。CHO−OST190Hは、Rowe,P.S.N.et al,Genomics 67:54−68,2000で報告されている、MEPEと名付けられたポリペプチドと同じポリペプチドのC末端に、OST311Hと同様にHis6タグ配列を付与したものを発現する。このサンプル添加後、さらに26時間CO2インキュベーター内でインキュベートしたのち、次に示すリン酸輸送活性測定法により、各ウェルの細胞のリン酸輸送活性を測定した。
(2)実験2:
200μlのCHO−S−SFM IIのうち100μlを除去した。これにCHO ras clone−1細胞の培養上清100μlを添加したウェル、および、CHO−OST311H細胞培養上清を100μl添加したウェルを、それぞれ3ウェルずつ作製して24時間CO2インキュベーター内でインキュベートした。その後、以下のリン酸輸送測定法により、各ウェルの細胞のリン酸輸送活性を測定した。
リン酸輸送活性測定法:
培養上清を添加してインキュベーションが終了した細胞をリン酸を含まない緩衝液(150mM NaCl、1mM CaCl2、1.8mM MgSO4、10mM HEPES pH7.4)で洗浄したのち、同溶液で10分間室温でインキュベートする。この液を除去し、この緩衝液に放射活性を含むKH2PO4(NEN社)を0.105mMとなるように加えたアッセイ溶液を添加して、室温で10分間インキュベートする。インキュベート終了後、アッセイ溶液を除去して直ちに氷冷しておいた停止溶液(150mM塩化コリン、1mM CaCl2、1.8mM MgSO4、10mM HEPES pH7.4)で細胞を3回洗浄する。この洗浄液を除去したのち、0.2N NaOHを80μl添加して室温で10分間インキュベートし、細胞を溶解させた。この細胞溶解液中の放射活性を測定するために、この溶解液をReadyCap(Beckman社)に移して50℃で乾燥させた後、ガラスバイアルに入れてシンチレーションカウンター(Wallac1410、Pharmacia社)で測定した。各アッセイにおけるリン酸輸送活性は、培養上清を添加しなかった対照における取り込みの平均値を100%として表2に示した。CHO−OST311H細胞の培養上清は、有意にヒト腎臓近位尿細管上皮細胞のリン酸輸送活性を抑制した。
実施例8 CHO−OST311H培養上清からの組換えOST311の部分精製
実施例7に記載した要領で調製した培養上清を、以下に示す方法で部分精製した。なお、工程1)から4)は4℃クロマトチャンバー内で実施した。
1)ProBondニッケルレジン(米国INVITROGEN社)をベッドボリュームが3mlとなるよう使い捨てポリプロピレンカラムに詰め、30mlのバッファー1(表3)で洗浄、平衡化した。
2)実施例7に記載した要領で調製した培養上清120mlを上記ニッケルカラムに自由落下により供し、組換えOST311を結合させた。
3)表3に示すバッファー2を30ml用い、非特異的に吸着しているタンパク質を除去した。
4)表3に示すバッファー3を3mlずつ4回にわけて添加し、組換えOST311を溶出した。4つの画分を20μlずつ、それぞれ原液のまま実施例6(3)に記載した要領でウエスタンブロッティングに供し、抗His抗体でOST311の検出を試みた。
その結果、第2画分に集中して約32kDaおよび約10kDaのシグナルが認められた。
5)上記第2画分をNAP25およびNAP10カラム(米国Amersham Pharmacia Biotech社)に供し、溶媒を表3に示すバッファー4に置換した。
6)バッファー4に置換した組換えOST311を、高速液体クロマトグラフィー(日本国日立製作所)を用い、強陽イオン交換樹脂であるSP−5PW(日本国トーソー社)に1ml/分の流速で供し、表3に示すバッファー5を1%/分の勾配で加えることにより溶出し、2mlずつ分取した。図2に示すように、それぞれの溶出画分について、実施例8(5)の要領でウェスタンブロッティングを実施しOST311の検出を試みたところ、約280mM NaClで約10kDaのシグナルが分離され、約400mM NaClで約32kDaのシグナルが分離されたことを確認した。対応する画分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、銀染色キット(日本国第一化学社)を用いて染色したところ、約10kDaおよび約32kDaを含む画分の純度は70%以上であった。
実施例9 部分精製した組換えOST311のN末端アミノ酸配列解析
実施例8に記載した方法で得られた、抗His抗体で認識される約10kDaおよび約32kDaの部分精製画分をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、セミドライブロッティング装置(米国Owl Separation Systems社)を用い、ゲル中の蛋白質をImmobilon PVDF膜(米国MILLIPORE社)に転写した。このPVDF膜をCBB染色することで約10kDaおよび約32kDaのバンドを切り出し、プロテインシーケンサModel492(米国PEアプライドシステムズ社)を用いてN末端アミノ酸配列を決定した。
その結果、約35kDaのバンドのN末端アミノ酸配列は、配列番号2の残基番号25番目のTyrから始まるOST311の配列であることが判明し、このことから配列番号2の残基番号1番目のMetから24番目のAlaまでは分泌シグナル配列として切断されていることが確認された。一方、約10kDaのバンドのN末端アミノ酸配列は、配列番号2の残基番号180番目Serから始まるOST311の配列であることが判明した。この180番目Serの直前にRRXXRからなるモチーフが存在していることから、組換えOST311はCHO細胞由来の何らかのプロテアーゼにより切断を受けていることが判明した。
以上のことから、CHO−OST311H細胞が産生する組換えOST311は、分泌後、配列番号2において、残基番号25番目Tyrから251番目Ileまでのポリペプチド(配列番号4)、残基番号25番目Tyrから179番目Argまでのポリペプチド(配列番号6)、残基番号180番目Serから251番目Ileまでのポリペプチド(配列番号8)の少なくとも3種類のポリペプチドとして存在していることが判明した。
実施例10 抗OST311部分ペプチドポリクローナル抗体の作製
配列番号2のポリペプチドをMacVector version6.5.1の計算機能を用いて、疎水性度を予測し、ペプチド抗体作製に適した部位を予測した(図3AおよびB)。親水性の程度が高く、かつ糖鎖修飾やリン酸化部位となりうる部位以外という観点から、配列番号2の残基番号48番目Argから始まる20アミノ酸からなるペプチドにC末端に合成段階でシステイン残基を人工的に付加した311−48(配列番号28)および、残基番号114番目Argから始まる20アミノ酸からなるペプチドに同様にシステイン残基を付加した311−114(配列番号29)を抗原として選択、合成した。なお、両ペプチドのC末端に合成段階でシステイン残基を人工的に付加し、キャリア蛋白質(ウシサイログロブリン)との結合に用いた。キャリア蛋白質との結合およびウサギへの免疫は、免疫生物研究所(群馬県藤岡市1091番地1号)に委託した(受託番号:1515)。
実施例11 CHO−OST311H細胞のヌードマウスへの移植試験
OST311が腫瘍性骨軟化症の惹起因子であるかを検証するため、6週齢BALB/cヌードマウス(雄)にCHO−OST311H細胞を移植し、腫瘍を形成させることにより、恒常的に腫瘍から組換えOST311を分泌するマウス腫瘍性骨軟化症モデルを構築した。実験対照としてCHO ras clone−1細胞と実施例7に記載したCHO−OST190Hも同様に移植実験に用いた。
(1)CHO細胞移植
CHO−OST311H細胞とCHO−OST190細胞を培養フラスコからトリプシン処理により分散させ、1×108個/mlとなるようPBSに懸濁し、これをヌードマウスの両脇腹に0.1mlずつ皮下注射した(2×107個/匹)。また、対照群として、同数個のCHO ras clone−1細胞を同様の方法で皮下注射した。その後、約1か月間、固形食CE−2(日本国日本クレア社)および水道水を自由摂取させ、5匹ずつプラスチックケージで飼育した。移植して2週間経過した時点での腫瘍形成の認められる割合は、対照群が75%、OST311群が66.7%であった。
(2)体重変化の比較
CHO−OST311H細胞を移植してから31日間の、非腫瘍形成群(avr.−で表示されたグラフ)およびCHO−OST311H細胞腫瘍形成群(avr.+で表示されたグラフ)の平均体重の経時変化を比較した。図4に示すように、CHO−OST311H細胞腫瘍形成群は非腫瘍形成群に比し、体重増加抑制を示し、両群間には明らかに有意差が認められた(24.1±1.5g vs.26.7±1.0g,p<0.001,day31)。一方、対照CHO ras clone−1細胞腫瘍形成群と非腫瘍形成群との平均体重において、同様な差は認められなかった(27.0±1.8g vs.26.7±1.0g,有意差無し,day31)。
(3)血清リン、カルシウムおよび尿中リン、カルシウムの測定
細胞移植して30から40日後、代謝ケージで24時間飼育し尿を回収後、エーテル麻酔下、心採血または眼窩採血を実施した。末梢血は、マイクロテイナ(米国ベクトンディッキンソン社)により血清分離した。尿は容量測定後、遠心分離により上清を回収した。血清、尿中リン濃度の測定はリン−テストワコー(日本国和光純薬社)を、血清、尿中カルシウム濃度の測定はカルシウム−テストワコー(日本国和光純薬社)を、血清、尿中クレアチニン濃度の測定はCRE−ENカイノス(日本国カイノス)をそれぞれ用いて実施した。
実験1:
細胞移植後34日目における、非腫瘍形成群、CHO ras clone−1細胞腫瘍形成群、CHO−OST190H細胞腫瘍形成群、CHO−OST311H細胞腫瘍形成群の血清リン酸濃度を測定した。
実験2:
細胞移植後44日〜46日目の腫瘍非形成群とCHO−OST311H細胞腫瘍形成群での血清および尿中のリン酸濃度、カルシウム濃度、クレアチニン濃度を測定した。腎臓のリン酸およびカルシウム分画排泄は、リン酸又はカルシウムのクリアランスをクレアチニンクリアランスで除して求めた。
測定結果を以下の表4に示す。
(4)全身骨格のX線撮影
CHO−OST311H細胞移植後、腫瘍形成の認められる個体は、非腫瘍形成個体あるいは対照CHO ras clone−1移植個体と比し、顕著な体格異常と歩行機能異常を呈したことから、骨格異常が予想された。そこで、対照CHO ras clone−1細胞移植群、CHO−OST190H細胞移植群、CHO−OST311H細胞移植群より、腫瘍形成の認められる個体を無作為に抽出し、X線撮影装置μFX−100(日本国フジフィルム社)を用い、添付文書に従ってX線撮影を実施した。X線撮影は、管電圧25kV、管電流0.1mA、照射時間10秒で行い、専用イメージングプレートに露光し、BAS2000(日本国フジフィルム社)を用いて画像解析を行った。
その結果、図5に示すとおり、CHO−OST311H移植個体において骨組織のX線像輝度の減弱が全身に認められ、石灰化の低下が認められた。また胸郭の変形などの骨格異常も認められた。
(5)血清リン、カルシウム濃度およびアルカリホスファターゼ活性の測定
細胞移植して44日と46日目に心臓より採血して得た血清を−20℃で一旦保存した後、一斉に解凍して各血清に含まれるリン濃度、カルシウム濃度を再度測定するとともに、アルカリホスファターゼ活性についても測定した。リン濃度の測定はリン−テストワコー(日本国和光純薬社)を、カルシウム濃度の測定はカルシウム−テストワコー(日本国和光純薬社)を、アルカリフォスファターゼ活性の測定はカルシウムアルカリ性ホスファ B−テストワコー(日本国和光純薬社)をそれぞれ用いて実施した。結果を腫瘍非形成群(n=6)、CHO腫瘍形成群(n=10)、CHO−OST190H細胞腫瘍群(n=10)及びCHO−OST311H腫瘍群(n=6 x 2)に分類した。CHO−OST311H群は44日目に屠殺した群(CHO−OST311H−1:n=6)と46日目に屠殺した群(CHO−OST311−2:n=6)との2つに分類した。図7に示すように、CHO−OST311H腫瘍群において、血清リン濃度の低下(図7A)、血清カルシウムの低下(図7B)および血清アルカリホスファターゼ活性の上昇(図7C)といったいずれも有意な変化が認められた。
(6)腎臓近位尿細管上ナトリウム・リン酸共役輸送担体(NaPi−7)の発現
i)近位尿細管上皮細胞冊子縁膜(以下、BBMと称す)の調製
CHO−OST311H腫瘍形成個体および非腫瘍形成個体より、ジエチルエーテル麻酔下、腎臓を摘出し中央部を冠状断に二等分した(実験1:CHO−OST311H腫瘍形成個体6例、非腫瘍形成個体4例、実験2:CHO−OST311H腫瘍形成個体6例、非腫瘍形成個体2例)。それぞれの個体より摘出した0.5個分の腎臓を用い、Kesslerらが報告したプロトコールに従い、BBMを調製した(Biochem.Biophys.Acta.506,pp.136−154)。
腎臓を、3mlのホモジナイズバッファー(50mMマンニトール,2mM Tris/HEPES pH7.5)中でガラス製ホモジナイザーを用い、1,300rpmで2分間、破砕懸濁し均質な腎臓抽出液を得た。これに終濃度10mMとなるようCaCl2を加え、4℃で15分間撹拌した後、4,900gで15分間、4℃で遠心分離した。得られた上清をキムワイプで濾過した後、さらに16,200gで60分間、4℃で遠心分離することで、BBMを多く含む画分を沈殿させた。この沈殿物を5mlのサスペンジョンバッファー(50mMマンニトール,2mM Tris/HEPES pH7.5)中に分散した後、再度16,200gで60分間、4℃で遠心分離した。この操作を2回繰り返した後、0.1mlのサスペンジョンバッファーに溶解した。得られた溶液を定法に従い蛋白質濃度定量を実施したところ、3から4mg/mlであった。
ii)BBM蛋白質のウェスタンブロッティング
上述の通り、個々のマウスより調製したBBM蛋白質をそれぞれ10μg/μlとなるようサスペンジョンバッファーで希釈し、1M Tris−Cl pH6.8、5%SDS、50%グリセロール、100mM DTTを含むサンプルバッファーを2.5μl添加し、95℃、5分間加熱した後、10−20%勾配のポリアクリルアミド電気泳動にてBBM溶液中の蛋白質を分離した。その後、セミドライブロッティング装置(米国Owl Separation Systems社)を用い、ゲル中の蛋白質をImmobilon PVDF膜(米国MILLIPORE社)に転写した。このPVDF膜を、TTBSバッファー(米国Sigma社)中で1/2000希釈した抗NaPi−7ポリクローナル抗体と室温で3時間インキュベーションした。本抗体は、キリンビール株式会社医薬探索研究所内にて、マウスNaPi−7のC末端部位に相当する合成ペプチド(LALPAHHNATRL)を定法によりウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。本抗体との反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合した抗ウサギIgG二次抗体(デンマークDAKO社)とインキュベーションし、ECL発光システム(米国Amersham Pharmacia Biotech社)を用いてバンドを検出した。
還元条件下、本抗体により約80kDa、約35kDaおよび約170から200kDaの高分子スメアが確認される(図8)。このバンドパターンは、Tatsumiらが、J.Biol.Chem.Vol.273,pp28568−28575,1998に報告している事例と一致すること、また、マウスあるいはラットの食事中リン酸摂取量に応じて、これらのバンドが一様に変化することがすでに確認されていることから、NaPi−7由来のポリペプチドであることが判明している。図8に示した様に、CHO−OST311H腫瘍形成個体から調製したBBM蛋白質に含まれるNaPi−7のシグナルは、前述の断片すべてにおいて(矢印で示したバンド)、非腫瘍形成個体から調製したそれと比べ、顕著に減弱していた。この結果は、独立して実施した実験1および2において、再現された。一方、これらのBBM蛋白質を10−20%勾配のポリアクリルアミド電気泳動にて分離後、CBB染色した結果、それぞれのBBM蛋白質が一様に染色されたことから、ウェスタンブロッティングにおけるシグナルの減弱は、NaPi−7に特異的なものであることがわかる(図8)。この事実より、OST311蛋白質は腎臓の近位尿細管細胞に作用し、NaPi−7の発現量を蛋白質レベルで下方修正することにより、低リン酸血症を惹起していることが推察される。
(7)腎臓および小腸におけるリン酸輸送担体とビタミンD代謝酵素のmRNAの変動解析
i)トータルRNAの調製
細胞移植後44日〜46日目に屠殺したマウスより小腸と腎臓を摘出した。腎臓はドライアイスにて急速に冷凍した。凍結した腎臓は−80℃超低温フリーザー中にて使用時まで凍結保存した。凍結された腎臓1個をISOGEN(日本国ニッポンジーン社)5mlに溶解し、添付文書に従ってトータルRNAを調製した。調製したトータルRNA15μgを常法にしたがって、アガロース濃度1%のホルムアルデヒド含有変性ゲルにて電気泳動し、キャピラリートランスファー法によって一夜、Hybond−N+(米国アマシャムファルマシア社)に転写した。転写されたフィルターをストラタリンカー(米国ストラタジーン社)にてUVを照射し、転写されたRNAを固定、2XSSCで洗浄後、風乾し、使用時まで室温にて保存した。小腸は生理食塩水にて内容物を洗浄除去し、反転させたのち、プレパラートにて小腸上皮を掻き取り液体窒素にて急速に冷凍した。凍結した小腸上皮は−80℃超低温フリーザー中にて使用時まで凍結保存した。凍結された小腸上皮をISOGEN(日本国ニッポンジーン)5mlに溶解し、添付文書に従ってトータルRNAを調製した。調製したトータルRNA20μgを常法にしたがって、アガロース濃度1%のホルムアルデヒド含有変性ゲルにて電気泳動し、キャピラリートランスファー法によって一夜、Hybond−N+(米国アマシャムファルマシア社)に転写した。転写されたフィルターをストラタリンカー(米国ストラタジーン社)にてUVを照射し、転写されたRNAを固定、2XSSCで洗浄後、風乾し、使用時まで室温にて保存した。
ii)プローブ用鋳型DNAの調製
個体番号1のマウスより調製したトータルRNA5μgを用いて20μLの反応液中(50mM Tris(pH8.3),75mM KCl,3mM MgCl2,10mM DTT,25g/mL(dT)18,2.5mM dNTP,MMLV逆転写酵素(日本国東洋紡)200units)、37℃、1時間cDNAを合成させた後、70℃、15分間処理して酵素を失活させた。合成されたcDNAは5倍に稀釈し、以下の反応に使用した。
GenBank(米国NCBI)に登録されている配列から以下のプライマーを合成し、PCR反応に使用した。
マウスGAPDHcDNA取得用合成プライマー
マウスNpt−1cDNA取得用合成プライマー
マウスNaPi−7cDNA取得用合成プライマー
マウスNaPi−2b cDNA取得用合成プライマー
マウスビタミンD1α水酸化酵素cDNA取得用合成プライマー
マウスビタミンD24水酸化酵素cDNA取得用合成プライマー
TakaLa LA−Taq(日本国宝酒造)の添付文書にしたがって反応液を調製し、50mL反応液中に上記cDNA1μL、及びプライマー各10pmolを添加し、94℃で1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分のインキュベートを1サイクルとして40サイクル増幅し、0.8%アガロースゲル電気泳動にて増幅バンドを分離し、ジーンクリーンII(米国Bio101社)を用いて目的の断片を回収した。GAPDHに関しては本操作で得られた断片を鋳型としてメガプライムラベリングキット(米国アマシャムファルマシア社)を用いて32P標識プローブを調製し、以下のハイブリダイゼーションに使用した。他の遺伝子については取得したPCR断片をpGEM−Tベクター(米国プロメガ)に組みこみ、大腸菌DH5αに導入した。T7(配列番号42)及びSP6プライマー(配列番号43)を各10pmol添加したPCR反応液に形質転換大腸菌を添加し、94℃で10分保温したのち、94℃にて30秒、55℃にて30秒、72℃にて1分を1サイクルとして40サイクル増幅した。反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動にて増幅バンドを分離してジーンクリーンII(米国Bio101)にて目的の断片を抽出した。
以上の操作によって得られた増幅断片の塩基配列は、ABI377DNAシーケンサー(米国PEアプライドシステムズ社)を用いて決定し、それぞれ目的の断片を取得したことを確認した。このようにして得たDNA断片をメガプライムラベリングキット(米国アマシャムファルマシア)を用いて32P標識し、以下のハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用した。
iii)ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはExpressHybハイブリダイゼーション溶液(米国クロンテック社)またはPerfecthybハイブリダイゼーション溶液(日本国東洋紡)を用いて、添付文書に従って実施した。ハイブリダイゼーション、洗浄終了後、イメージングプレート(日本国富士フィルム社)に30分から1夜の間露光し、BAS2000イメージアナライザー(日本国富士フィルム社)にて解析した(図9A〜C)。併せて目的のバンドのシグナル強度を測定した。それぞれの遺伝子のシグナル強度をGAPDHのシグナル強度で補正したのち、非腫瘍形成群(個体番号1〜4)と腫瘍形成群(個体番号5〜10)の平均値の比を求めた。以下の表5にその値を記す。CHO−OST311H腫瘍形成に伴い、腎臓のI型のリン酸輸送担体(NPT−1)は大きく変動しなかったが、腎臓のII型リン酸輸送担体であるNaPi−7のmRNAは顕著に減少した。また、小腸のリン酸輸送担体であるNaPi−IIbのmRNAも顕著な減少が認められた。一方、腎臓のビタミンD代謝酵素に関しては、25−hydroxyvitaminD−1−α−hydroxylase(1α OHase)と25−hydroxyvitaminD−24−hydroxylase(24OHase)のmRNAがともに上昇していた。
(8)血清1,25−dihydroxyvitaminD濃度の測定
腫瘍移植後44日目および46日目に採取したコントロール群マウスの血清とOST311H群マウスの血清を各個体より等量づつ採取して、総量0.5mlとして三菱化学ビーシーエルに提出し、血清に含まれる1,25−ジヒドロキシビタミンDの濃度を、臨床検査と同様の方法で測定した。その結果、コントロール群とOST311群の血清中1,25−ジヒドロキシビタミンDの濃度は、それぞれ28.0pg/mlと23.9pg/mlであった。上述のとおり、低リン酸血症、低カルシウム血症が認められるにも関わらず、1,25−ジヒドロキシビタミンDの濃度が上昇しないことは、明らかにOST311による作用の結果としてビタミンD代謝が影響を受けていることを示すものである。
(9)大腿骨のX線撮影
非腫瘍形成マウスとCHO ras clone−1、CHO−OST190H、CHO−OST311Hを移植したマウスを移植後44日目から46日目に屠殺して大腿骨を採取し、4%の中性ホルマリンで3日間固定した。その後、骨周囲の軟組織を除去して、各群より2個体を無作為に抽出して、X線撮影装置μFX−100(日本国フジフィルム社)を用いて、管電圧25kV、管電流0.1mA、照射時間5秒でX線を照射し、イメージングプレートを露光した。その結果を図10に示す。CHO−OST311H群で皮質骨の骨梁骨の減少が認められた。
実施例12 OST311の塩基配列相同性とゲノム領域の解析
配列番号2に示されるアミノ酸配列および配列番号1に示される塩基配列の少なくとも一部を用いて、OST311に相当する分子を種を超えて検索することができる。配列番号1の一部の塩基配列を用いてマウスのゲノム配列データベースを検索することでGenbankにアクセッション番号AC0 15538で登録されているマウス6番染色体の配列中に、OST311と相同性の高い配列を見出した。この配列より得られたマウスOST311の部分ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号10に、cDNAの部分配列に相当する塩基配列を配列番号9に示した。ヒトOST311ポリペプチドとマウスOST311のポリペプチドとの間におけるアミノ酸の相同性を比較した結果を図6に示す。実施例11で示したように、ヒトのアミノ酸配列を有するOST311ポリペプチドは、マウスにおいて明確な生物活性を有していることが明らかとなった。これらのことは図6に示すアミノ酸配列で相同性の低い領域のアミノ酸を置換したり欠失させたり、若しくはアミノ酸を挿入したりしても活性が保持されやすいことを示す。
配列番号1に示す塩基配列をデータベースで一致する領域が認められたヒト12p13 BAC RPCI11−388F6(アクセッション番号AC008012)と照合して、OST311がコードされる領域の配列を同定した。配列番号11にOST311の遺伝子近傍の塩基配列を示した。配列番号11の塩基番号498番から502番にTATAAボックスがある。配列番号11の塩基番号1713番から本発明者が同定したcDNA配列(配列番号1)と一致する配列が出現し、2057番まで続く。次に配列番号1に示した塩基配列と一致する部分は、配列番号11の塩基番号8732番から8833番までである。ここはexon2と考えられる。そして最後に現れる配列番号1に示した塩基配列と一致する部分は配列番号11の塩基番号10644番から始まり、配列番号11の塩基番号12966番が配列番号1の塩基配列と一致する末尾である。この配列番号11の塩基番号498番から塩基番号12966番までの配列はOST311をコードする遺伝子の少なくとも一部であると考えられる。また、exon1とexon2との間にはGenbankにアクセッション番号G19259で登録されているSTS配列があることが判明した。OST311は、12p13領域にあるがEcons,M.J.et al.,J.Clin.Invest.100:2653−2657,1997によると、常染色体性のビタミンD抵抗性くる病(ADHR)の責任遺伝子は、連鎖解析の結果、12p13のマイクロサテライトマーカーであるD12S100とD12S397との間の18cM内(特にD12S314とD12S397の間の約10cM)に存在することが推定されている。本発明者は、OST311の遺伝子と上記マイクロサテライトマーカーの12番染色体上の物理的位置を調べた。その結果、D12S100およびD12S314が4602〜6129kb、OST311が8958〜9129kb、D12S397が16280〜16537kbという結果を得た。これらの結果と、OST311が持つ強力なリン代謝調節活性とを考えると、OST311がADHRの責任遺伝子であるということが分かった。
実施例13 CHO−OST311H細胞のヌードマウスへの短期移植試験
CHO−OST311H細胞をヌードマウス(6週齢、BALB/c、雄)の背部皮下に移植し、2日後および6日後における血清リン酸、カルシウム濃度を測定して、組換えOST311が短期間で与える影響について検討した。実験対照としてCHO ras clone−1細胞を同様に移植実験に用いた。
(1)CHO細胞移植
実施例11の(1)に記載した方法と同様に、CHO−OST311H細胞およびCHO ras clone−1細胞を2×107個ずつヌードマウスに皮下移植した(n=6ずつ)。また、同容量のPBSを同様に皮下移植した(n=6)。各群6匹毎を、プラスチックケージで飼育し、固形食CE−2(日本国日本クレア社)および水道水を自由摂取させた。移植して6日間経過した時点において、顕著な腫瘍形成は認められなかった。
(2)細胞移植後2日目における血清リン、カルシウム濃度の測定
細胞移植した翌日、エーテル麻酔下、眼窩採血を実施した。末梢血は、マイクロテイナ(米国ベクトンディッキンソン社)により血清分離した。血清リン濃度の測定はリン−テストワコー(日本国和光純薬社)を、血清カルシウム濃度の測定はカルシウム−テストワコー(日本国和光純薬社)をそれぞれ用いて実施した。図11Aに示すように、PBS投与群およびCHO ras clone−1細胞移植群に比し、CHO−OST311H細胞移植群は全例において、血清リン酸濃度の有意な低下を認めた。一方、血清カルシウム濃度においては、変化は認められなかった。これらの結果から、OST311は投与2日後において、血清リン酸濃度のみを低下させることが明らかとなった。
(3)細胞移植後6日目における血清リン、カルシウム濃度の測定
細胞移植後6日目、エーテル麻酔下、心採血を実施した。上述のごとく、各群の血清リン酸、カルシウム濃度をそれぞれ測定した。図11Bに示すように、移植後2日目と同様、PBS投与群およびCHO ras clone−1細胞移植群に比し、CHO−OST311H細胞移植群は全例において血清リン酸濃度の有意な低下を認めた。一方、CHO−OST311H細胞移植群は全例において血清カルシウム濃度の若干の低下を認めた。
実施例14 組換え体OST311の精製
CHO−OST311H細胞を225cm2培養フラスコ(米国コーニング社)で37℃、5%CO2,湿度100%下、10%FCS入りMEMα培地でフラスコ面積の約80%を占めるまで増殖させた後、培地を無血清培地CHO−S−SFM II(米国LIFE TECHNOLOGY社)50mlに置き換え、48時間後に上清を回収した。この要領で得られた、計1,000mlの培養上清を用いて、以下の方法で組換えOST311を精製した。
培養上清1000mlを、16,200gで15分間、4℃で遠心分離し、浮遊細胞を除去した後、上清を内径30mm×長さ200mmのガラスカラムにパッキングしたSP−sepharose FF(アマシャムファルマシア社、米国)に供し、その素通り画分を金属キレートレジンであるTalon Superflow(CLONTECH社、米国)に吸着させた。非特異的な吸着物を50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)および0.3M NaClからなる洗浄バッファーで除いた後、50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.7)および0.2M Imidazoleで溶出した。図12の右パネルには、抗His6抗体(INVITROGEN社、米国)を用いてこの溶出画分を検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。この画分には、実施例9に記載したアミノ酸残基180番Serから251番Ileからなる部分ポリペプチド(配列番号8)が含まれている。一方、前述のSP−sepharose FFに吸着した培養上清中に含まれる蛋白質は、50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.7)および0から0.7MまでのNaCl濃度勾配を用いて溶出させた。図12の左パネルには、抗His6抗体(INVITROGEN社、米国)を用いて検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。この約0.3M NaClで溶出される画分には、実施例9に記載したアミノ酸残基25番Tyrから251番Ileからなる部分ポリペプチド(配列番号4)が含まれている。また、図12の中央パネルは、実施例10で記載したOST311部分ペプチド(配列番号29)を用いて作製したポリクローナル抗体(311−114)によって検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。この約0.4M NaClの濃度で溶出される画分には、実施例9に記載したアミノ酸残基25番Tyrから179番Argからなる部分ポリペプチド(配列番号6)が含まれている。このようにして、3種類のOST311部分ペプチド、即ち、配列番号4(以下311:25−251と称す)、配列番号6(以下311:25−179と称す)、配列番号8(以下311:180−251と称す)を含む画分は精製分離された後、限外分子量10,000のVIVASPINカラム(ザルトリウス社、米国)を用いて濃縮し、1mlの5mM HEPES(pH6.9)および0.1M NaClからなる溶媒に置換された。
実施例15 骨非脱灰切片の組織学的検討
実施例11で作製したCHO−OST311H細胞移植マウスと腫瘍なしマウスの屠殺時に、右大腿骨と脛骨を、その膝関節で結合した状態で摘出した。そして脛骨骨幹部と大腿骨骨幹部で切断し即座に氷冷しておいた中性ホルマリン中に保存し、非脱灰標本を作製した。以下に非脱灰標本の作製方法を記載する。
骨組織をVillanueva bone stainにて3〜7日間前染色を行った。アルコール脱水列で脱水後アセトンで置換し、アセトン・モノマー、モノマーを通した後に樹脂包埋を行った。樹脂は包埋用メタクリル酸メチル(MMA)樹脂を用い、樹脂内に組織が十分に包埋されるように適宜MMAを追加しながら、約35℃の恒温器に入れて完全重合させた。ここで用いた包埋用MMAは、MMAモノマー(日本国、和光純薬工業社)100mlに対して、MMAポリマー(日本国、和光純薬工業社)を40g加えて完全に溶解させた後、Benzoyl peroxide(日本国、ナカライテスク社)を1gの割合で加えて、完全に溶解させたものである。標本は脛骨に対して作製することとし、脛骨の海面骨が観察できるように前額断面でトリミングを行ったのちに硬組織用ミクロトーム(RM2065型スーパーカット、ライカ社製)を用いて厚さ4μmの前額断面標本を作製した。後染色としてVillanuevagoldner染色を実施した。このようにして得られた標本はキシレン透徹後にクリアシール(日本国、マルトー社)およびワンライト(日本国、マルトー社)を用いて封入した。
標本の顕微鏡観察像を図13に示す。CHO−OST311H腫瘍マウスでは対照に比して、成長板幅の増大が認められた。また骨幹端部において、著しい類骨の増大と石灰化領域の減少が認められた。繊維性骨炎の所見は認められず、CHO−OST311H腫瘍マウスより採取した骨は典型的な骨軟化症の所見を呈していた。
実施例16 CHO−OST311H細胞移植後早期におけるビタミンD代謝の検討
OST311のビタミンD代謝へ与える影響を検討するため、実施例13に記載した方法と同様に、CHO−OST311H細胞のヌードマウス(6週齢、BALB/c、雄)への移植試験を実施した。実験対照として、CHO ras clone−1細胞を同様に移植した群、及び細胞懸濁液と同用量のPBSを投与した群の2群を設置して比較に用いた。各群は6匹のマウスから構成され、各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水並びに1.03%の無機リン酸および1.18%のカルシウムを含んだ固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。移植後、1、2、3、6日目における血清1,25−ヒドロキシビタミンD濃度の変動およびビタミンD代謝酵素群の発現変化を検討した。
(1)血清1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の測定
細胞移植後1、2、3、6日目において、PBS投与群、CHO−ras clone−1細胞移植群およびCHO−OST311H細胞移植群のマウスより、エーテル麻酔下、心採血を実施し、マイクロテイナ(ベクトンディッキンソン社、米国)を用いて血清を分離した。各群毎に、個々のマウスより得られた血清を等量ずつ混合し、総量を0.25mlとして、これらに含まれる1,25−ジヒドロキシビタミンDの濃度を、1,25(OH)2D RIAキット「TFB」(テイエフビー社、日本国)を用いて測定した。その結果、表6に示すように、PBS投与群、CHO−ras clone−1細胞移植群に比し、CHO−OST311H細胞移植群において、移植後1日目ですでに1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の有意な低下を認めた。この低下作用は、移植後2、3、6日目においても認められた。この結果は、腫瘍性骨軟化症における顕著な臨床所見の一つである、血清1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の低下と一致している。
(2)腎臓におけるビタミンD代謝酵素遺伝子の発現解析
上述の1,25−ジヒドロキシビタミンD3低下作用が、腎臓に発現する25−ヒドロキシビタミンD−1−α−水酸化酵素(1αOHase)あるいは、25−ヒドロキシビタミンD−24−水酸化酵素(24OHase)遺伝子の変動に起因するかを検討するため、移植後3日目のPBS投与群、CHO−ras clone−1細胞移植群およびCHO−OST311H細胞移植群より、それぞれ3または4匹のマウスを無作為に抽出し、腎臓を摘出後、実施例11(7)に記載した手順に則りトータルRNAを調製し、同記載のプローブを用いてノザンブロッティングを実施した。その結果を図14に示す。PBS投与群、CHO−ras clone−1細胞移植群に比し、CHO−OST311H細胞移植群において1αOHase遺伝子のmRNA発現レベルが顕著に減弱していることを認めた。このことは、OST311が直接的あるいは間接的に、本遺伝子の発現を抑制することで、血清1,25−ジヒドロキシビタミンDの生合成を抑制している可能性を示唆している。一方、24OHase遺伝子のmRNA発現レベルは、PBS投与群、CHO−ras clone−1細胞移植群に比し、CHO−OST311H細胞移植群において有意に亢進していた。このことは、OST311が直接的あるいは間接的に、本遺伝子の発現を亢進することで、血清1,25−ジヒドロキシビタミンDの不活性化を促進している可能性を示唆している。
実施例11(8)では、移植後44、46日目の血清1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度は対照群と比し、有意な差が認めらていない。また、1αOHaseのmRNA発現量が増加傾向にあった点が、本実施例における結果と異なる。その相違を説明する少なくとも一つの可能性として、実施例17に記載した、血清中副甲状腺ホルモンの影響が考えられる。
実施例17 CHO−OST311H細胞移植後早期における血清中副甲状腺ホルモン濃度の検討
実施例11、13および16で記載したCHO細胞移植後1、2、3、6、45日目における各マウス血清を等量ずつ混和して0.15mlとし、Rat PTH IRMAキット(日本メジフィジクス社)を用いて添付文書に従い血清副甲状腺ホルモン濃度を測定した。表7に示すように、CHO−OST311移植群で有意な血清副甲状腺ホルモンの上昇が認められ、その差は移植後45日目において顕著であった。
実施例18 CHO産生型組換えOST311H全長蛋白質の正常マウスへの投与試験
CHO産生型組換えOST311H全長蛋白質の正常マウス(BALB/c、雄、6週齢)への作用を検討するため、実施例14の(1)で示した精製法により、アミノ酸残基25番目Tyrから251番目Ile(配列番号4)のC末端にヒスチジンタグを付与したポリペプチドを部分精製した。この精製画分を正常マウスの腹腔内へ1回あたり0.1mlずつ投与した。本精製画分中には、ウェスタンブロッティングで得られた蛍光強度から、およそ0.15〜0.75μgの組換えOST311が含まれると推定される。対照群へは、実施例14と同様に、溶媒(5mM HEPES緩衝液/0.1M NaCl pH=7.0)を0.1mlずつ腹腔内に投与した。OST311投与群および対照群はそれぞれ5匹のマウスから構成され、各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および1.03%の無機リン酸および1.18%のカルシウムを含んだ固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
[試験1]
試験概略を図15のAに示す。第1回目腹腔内投与から数えて5、10、23、28、33時間後に追加投与をおこない、合計6回の腹腔内投与を実施した。その後、第1回目腹腔内投与から数えて36、47、71時間後にガラス製キャピラリを用いて眼窩より採血し、マイクロテイナ(ベクトンディッキンソン社、米国)を用いて血清を分離した。
得られた血清中のリン酸およびカルシウム濃度を、リン−テストワコーあるいはカルシウム−テストワコー(和光純薬、日本国)を用いて添付文書に従い、決定した。その結果、図15のBに示すように、初回投与から36時間後のOST311投与群において、有意な血中リン低下作用を認めた(t−test **p<0.001,*p<0.01)。また、この作用はその後11時間経過後においても維持された(初回投与から47時間後)。一方、初回投与71時間後(最終投与後38時間後)には、本活性は消失していた。また、いずれの時間においても、血中カルシウム濃度には有意な変化は認められなかった(図15のC)。[試験2]
試験概略を図16のAに示す。第1回目腹腔内投与から数えて5、11時間後に追加投与をおこない、合計3回の腹腔投与を実施した。その後、第1回目腹腔内投与から数えて13、24時間後にガラス製キャピラリを用いて眼窩より採血し、マイクロテイナ(ベクトンディッキンソン社、米国)を用いて血清を分離した。得られた血清中のリン酸およびカルシウム濃度をリン−テストワコーおよびカルシウム−テストワコーをそれぞれ用いて添付文書に従い測定した。その結果、図16のBに示すように、13時間後のOST311投与群において、有意な血清リン酸濃度低下作用を認めた(t−test **p<0.05,*p<0.01)。また、この作用はその後11時間経過後においても維持された。また、いずれの時間においても血中カルシウム濃度には有意な変化は認められなかった(図16のC)。
試験1および2の結果から、CHO産生型組換えOST311蛋白質の全長画分が、腹腔内投与により、正常マウスに低リン血症を惹起すること、またその血清リン酸濃度低下作用は初回投与後13時間後に既に認められること、さらにその活性は投与中止後少なくとも11時間は持続することが判明した。
実施例19 OST311へのアミノ酸変異導入
実施例9に記載したように、CHO−OST311H細胞により生産される組換えOST311の一部は産生過程において、アミノ酸残基25番目Tyrから179番目Argまでの配列を有するポリペプチド(配列番号6)およびアミノ酸残基180番目Serから251番目Ileまでの配列を有するポリペプチド(配列番号8)に切断されることが判明している。
この切断は、アミノ酸残基180番目Ser直前にあるRXXRもしくは、RRXXR配列からなるモチーフを認識するプロテアーゼによる可能性が考えらる。全長型組換え体を生体内に投与した際にも、この切断あるいはそれに類似した分解を受ける可能性が考えられる。そこで、アミノ酸残基176番目のArgおよびアミノ酸残基179番目のArgの両者をGlnに置換しうる配列をコードする変異導入遺伝子OST311RQを作製した。
(1)OST311/pCAGGSプラスミドの作製
OST311H/pcDNA3.1プラスミドを鋳型として311F1EcoRI(配列番号22)及び311LNot(配列番号44)をプライマーに用い、LA Taqポリメラーゼ(日本国、宝酒造社)によるPCRを行った。反応は、94℃、1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして25サイクル実施した。反応終了後、PCR産物の末端をT4 DNAポリメラーゼ(スイス、ロッシュ社)により平滑化し、フェノールクロロホルム処理によって酵素を失活させた。DNAをエタノール沈殿させたのち、ポリヌクレオチドキナーゼ(スイス、ロッシュ社)によってDNA末端のリン酸化を行なった。0.8%アガロースゲル電気泳動によって、目的のDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国、BIO101社)を用いて回収した。プラスミドベクターpCAGGS(Niwa H,et al.,Gene,1991 Dec 15;108(2):193−9.)をEcoRIで消化し、Klenow断片(スイス、ロッシュ社)を用いて末端の平滑化を行った。続いて牛小腸アルカリフォスファターゼ(日本国、宝酒造社)を用いてDNA末端の脱リン酸化を行い、0.8%アガロースゲル電気泳動によって目的のDNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国、BIO101社)を用いて回収した。DNAライゲーションキットバージョン2(日本国、宝酒造社)を用い、添付文書に従って得られたOST311cDNAとpCAGGSプラスミド消化物を結合させた。これを大腸菌DH5αに導入してクローン化し、目的のプラスミドを取得した。本プラスミドDNAをOST311RQH遺伝子の作製に使用した。
(2)OST311RQH遺伝子の作製
以下のプライマーを合成した。
OST311ME1はOST311の開始メチオニンを含む部分の順方向プライマー、OST311HNtはOST311の3’末端に6個のヒスチジンを付加する逆方向プライマー、OST311RQF及びOST311RQRはOST311cDNAのコード領域中527番目及び536番目のグアニン(配列番号1の659番目および668番目のグアニンに相当)をそれぞれアデニンに置換することで、アミノ酸番号176番目及び179番目のアルギニンをグルタミンに置換するための変異導入用の、それぞれ順方向、逆方向プライマーである。pfu DNAポリメラーゼ(米国、プロメガ社)を用い、添付文書に従って2種類の反応液を20μL調製した。一方にはプライマーとしてOST311ME1、OST311RQRを終濃度0.2μMで使用し、鋳型には実施例6の(1)に記載したOST311発現ベクター10ngを使用した。94℃、1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして25サイクルPCR反応を実施した。もう一方にはプライマーとしてOST311RQF、OST311HNtを終濃度0.2μMで使用し、鋳型にはOST311/pCAGGSプラスミド10ngを使用した。94℃、1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして35サイクルPCR反応を実施した。上記2種類の反応物をそれぞれ10倍に希釈し、それぞれ1μLをLA Taqポリメラーゼ(日本国、宝酒造社)添付文書に従って調製した反応液50μLに添加した。LA Taqポリメラーゼ(日本国、宝酒造社)を用いて、プライマーとしてOST311 ME1、OST311HNtを終濃度0.2μMで使用し、94℃、1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして25サイクルPCR反応を実施し、さらに72℃で7分保温した。得られた反応生成物をフェノール/クロロホルム処理し、除蛋白、エタノール沈殿を行った後、EcoRI、NotIで消化し、2%アガロースゲル電気泳動によって約800bpのDNA断片を分離、ジーンクリーンII(米国、Bio101社)を用いて回収した。得られたDNA断片を、プラスミドpEAK8(米国、エッジバイオシステム)に、分子内リボゾームエントリー部位(IRES)および増強型緑色蛍光蛋白質(EGFP)を連結することにより作製したベクターIRES−EGFP−pEAK8のEcoRI,NotI部位に挿入することによってOST311RQH/IRES−EGFP/pEAK8プラスミドを得た。常法に従ってプラスミドDNAを調製、ABI3700蛍光DNAシークエンサー(米国、PEアプライドシステムズ社)によって塩基配列を決定し、目的のR176QおよびR179Qの変異が導入され、かつ、C末端にヒスチジンタグをコードしていることを確認した。本遺伝子でコードされるポリペプチドを、以下OST311RQHと称す。
(3)CHO安定発現細胞の取得
トランスフェクタム(米国、プロメガ社)を用い、添付文書にしたがって、CHO−ras clone−1細胞にOST311RQH/IRES−EGFP/pEAK8プラスミドを導入した。5μg/mLピューロマイシン、10%FCSを含むMEMα培地にて薬剤耐性細胞を選択し、FACS vantage(米国、ベクトンディッキンソン社)によって、GFP(Green Fluorescent Protein)の発光強度が強い細胞をソーティングによりクローン化した。クローン化した細胞がコンフルエントになったところで、血清を含まないDF(DMEM/F−12)培地に置換し2日後に上清を回収した。回収した上清50μLを96ウエルコンバーチブル濾過装置(米国、ライフテックオリエンタル社)を用いてイモビロンPフィルター(米国、ミリポア社)に吸着させた。作製したフィルターをTBS,TTBSで洗浄後、ブロックエース(日本国、第一製薬社)で1時間室温にてブロッキングを行った。ブロッキング後、ブロックエースで5,000倍に稀釈したHRP標識した抗His6モノクローナル抗体(米国、インビトロジェン社)と1時間反応させた。反応後TTBS,TBSで洗浄し、ECL(米国、アマシャムファルマシア社)を用い、添付文書に従ってシグナルの検出を行った。このシグナル強度をもとに高発現クローンCHO−OST311RQHを選択した。
(4)OST311RQH pEAK rapid培養上清の調製
pEAK rapid細胞(米国、エッジバイオシステム)を組織培養用フラスコ(225cm2,米国、コーニング社)20本に播種した。この細胞にpEAKシステム添付文書(米国、エッジバイオシステム社)に従い、OST311RQH/IRES−GFP/pEAK8プラスミド0.48mgをリン酸カルシウム法にてトランスフェクションした。4時間静置したのち、フラスコ1本あたり50mLの血清を含まないMEMα培地に置換し後、2日間、37℃にて培養してその上清を回収した。
(5)組換えOST311RQHの発現確認
上述のCHO−OST311RQH細胞クローン2種類、及びpEAK rapid細胞を用いた一過性発現の培養上清それぞれ10μLを実施例6の(3)に記載した要領でウエスタンブロットに供し、培養上清中の組換えOST311RQHの存在を検討した。検出抗体には、抗His(C末)抗体(米国、インビトロジェン社)を用いた。その結果、図17に示すように、いずれの培養上清中においても、実施例6の(3)に記載した約32kDaのバンドと同位置に存在する強いシグナルを認めた。さらに、いずれの培養上清中においても、CHO−OST311H培養上清中に存在する約10kDaのシグナルをウェスタンブロッティングでは認めなかった。このことから、R176QおよびR179Qの変異を導入することにより、この位置で起こっていると推定されるポリペプチドの切断が阻害あるいは軽減され、その結果アミノ酸番号180番目Serから251番目Ileまでの配列を有するポリペプチド(配列番号8)の存在比が顕著に減少したことが推察される。
実施例20 組換えOST311RQHの正常マウスへの投与試験
実施例19の(5)で調製した培養上清500mlより、実施例14の(1)に記載した方法に準じて、約2.8μg/mlの組換えOST311RQH蛋白質を含む精製画分を得た。この精製画分を正常マウス(BALB/c、雄、6週齢)の腹腔内へ1回あたり0.1mlずつ連続投与し、血清リン酸、カルシウム、1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度を測定した。対照群については、溶媒(5mM HEPES緩衝液/0.1M NaCl pH=7.0)を0.1mlずつ同様に腹腔内へ投与した。OST311RQH投与群および対照群はそれぞれ6匹のマウスから構成され、各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および1.03%の無機リン酸および1.18%のカルシウムを含んだ固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
試験プロトコールを図18のAに示す。初回投与開始から5、10、24、29、34時間後に追加投与を実施し、計6回の連続投与とした。途中、初回投与から24時間後(4回目投与直前)にガラス製キャピラリを用いて眼窩採血を実施し、初回投与から48時間後にエーテル麻酔下、心採血を行った。
(1)血清リン酸、カルシウム濃度の測定
初回投与後24時間目および48時間目の血清より、実施例14の(3)に記載した方法で血清リン酸を測定した。その結果、図18のBに示す通り、いずれの採血時間においてもOST311RQH投与群は有意な低リン血症を示した(t−test **p<0.01,*p<0.05)。一方、血清カルシウム濃度に有意な変動は認められなかった(図18のC)。
(2)血清1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の測定
初回投与後48時間目において個々のマウスより採取した血清を等量ずつ各群毎に混和し、実施例16の(1)に記載した方法で、血清1,25−ジヒドロキシビタミンD濃度の測定を行った。その結果、対照群が244.7pmol/Lを示したのに比し、OST311RQH投与群は24.6pmol/Lと顕著な低下を示した。
実施例21 CHO−OST311RQH細胞移植試験
実施例19の(3)で樹立したOST311RQH安定発現細胞CHO−OST311RQHのヌードマウス(7週齢、BALB/c−nude、雄、n=8)への移植試験を、実施例13に記載した方法と同様に実施した。対照群としてCHO ras clone−1細胞を同様に移植した(n=6)。各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および1.03%の無機リン酸および1.18%のカルシウムを含んだ固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
細胞移植後2日目において、ガラス製キャピラリを用いて眼窩採血を実施し、実施例14の(3)に記載した同様の方法で血清リン酸、カルシウム濃度の測定を行った。図19のAに示すとおり、CHO−OST311RQH細胞移植群において有意な血清リン酸の低下を認めた(t−test *p<0.001)。一方、血清カルシウム濃度に有意な変化は認められなかった(図19のB)
実施例22 抗OST311部分ペプチドポリクローナル抗体の作製(2)
実施例10に記載した要領で、さらにOST311の部分ペプチド4種類を作製した(配列番号49から52)。それらを抗原としてウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて実施例6の(3)に記載した方法に準じてウェスタンブロッティングを実施し、CHO−OST311H細胞の無血清培養上清中の組換えOST311Hを検出した。抗体反応は、各々のペプチドに対する抗血清をTTBSで250倍希釈した液中で、4℃で一晩振とうさせて行った。洗浄後、これにアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体(デンマーク、DAKO社)を結合させた後、アルカリフォスファターゼ発色キット(米国、BIO−RAD社)を用いて組換えOST311を検出した(図20)。
部分ペプチド
実施例23 OST311蛋白質検出用ELISAシステムの構築
(1)抗OST311部分ペプチドウサギ抗血清からの抗体精製
Econo−Pac disposable chromatography column(米国、BIO−RAD社)にprotein A sepharose 4FF(米国、Amersham pharmacia社)をスラリーで3ml充填し、10mlの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.3)および、20mlのPBSを用いて洗浄した。実施例10に記載した2種類および実施例22に記載した4種類のウサギ抗血清をそれぞれ800−900μl加え、抗体画分をレジンに吸着させた。カラムを9mlのPBSで洗浄し挟雑物を除去後、0.1Mグリシン塩酸バッファー(pH3.3)を1mlずつ加えることにより、IgG溶出画分を得た。溶出に際し、各画分に10μlの中和緩衝液(1M Tris)を随時加え、溶液を中和した。溶出画分中に含まれる抗体濃度を280nmの吸光度を測定することで決定し(吸光係数:1.34(mg/ml)−1・(cm)−1として算出)、いくつかの画分をまとめNAP25カラムを用いて50mM炭酸水素ナトリウム液に置換した。その結果、それぞれのペプチド抗血清より5−15mgの抗体が得られた(このポリクローナル抗体を、以下それぞれ、311−48抗体、311−114抗体、311−148抗体、311−170抗体、311−180抗体、311−210抗体と称す)。
(2)抗OST311IgGのビオチン化
上述6種類の抗OST311ペプチドポリクローナル抗体すべてについて50mM炭酸水素ナトリウム液で1mg/mlに希釈した後、それぞれ1mgの抗体と、10μlのジメチルホルムアミドに溶解したBiotin−AC5−Osu(日本国、同仁化学)溶液(1.82μg/ml)とを、4℃において2時間、転倒混和した。その後、混合液をNAP10カラムに供し、未反応のBiotin−AC5−Osuを除くとともに、溶媒をPBSに置換し、6種類のビオチン化抗OST311ペプチドポリクローナル抗体を得た。
(3)抗OSTペプチドウサギポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法によるOST311発現細胞培養上清中のOST311の検出
6種類の固相化用抗OST311ペプチドポリクローナル抗体に対して上述の6種類のビオチン化抗体を検出用として組み合わせることで、サンドイッチELISAシステムを構築し、OST311発現細胞培養上清中のOST311蛋白質の検出を検討した。
上述のProtein A精製により得られた固相化用抗OST311ペプチドポリクローナル抗体6種を50mM炭酸水素ナトリウム液で10μg/mlとなるよう希釈し、96穴ELISA用プレートMaxisorp(米国、Nunc社)に1ウェルあたり50μl加え、37℃で1時間静置することで、IgGを固相化した。その後、反応液を除去し、Superblock blocking buffer in TBS(米国、PIERCE社)を1ウェルあたり50μl加え室温で10分間ブロッキングした。溶液を除去した後、実施例19の(5)で記載したOST311RQH peak rapid培養上清、または対照としてMEMα培地を1ウェルあたり50μlずつ加え、室温で1時間静置することで固相化抗体と結合させた。抗体反応後、TTBSで3回洗浄した後、10%Blockace(日本国、大日本製薬社)を含むTTBSで10μg/mlに希釈した上述のビオチン化抗OST311抗体6種(311−48、311−114、311−148、311−170、311−180、311−210)をそれぞれ1ウェルあたり50μl加え、室温で30分間静置し二次抗体反応をおこなった。各ウェルをTTBSで3回洗浄した後、10%Blockaceを含むTTBSで10,000倍に希釈したHRP標識ストレプトアビジン(デンマーク、DAKO社)を1ウェルあたり50μl加え、室温で30分間静置してビオチン化抗体と結合させた。各ウェルをTTBSで3回洗浄した後、ペルオキダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン(デンマーク、DAKO社)を1ウェルあたり50μl加え、室温で5分間発色させた後、0.5M硫酸液を1ウェルあたり50μl加えることにより反応を停止させた。測定は96穴プレート用の吸光度測定装置MTP−300(日本国、コロナ電気社)を用いて行い、450nmの吸光度を570nmの吸光度で除した値を求めた。対照としてMEMαのみを加えた場合の450nm/570nm値は全て0.02以下であった。一方、図21のAに示すとおり、311−48抗体を固相化し、311−180抗体で検出する組み合わせ、または、311−180抗体で固相化し311−148抗体で検出する組み合わせでは、対照に比し有意に培養上清中のOST311RQHを検出することができた。また、例えば311−48抗体を固相化し、311−148抗体で検出する組み合わせを用いた場合は、両抗体の抗原部位がOST311蛋白質の実施例9に記載した切断後のN末側部分ペプチド(配列番号6)に含まれるため、全長ポリペプチドを検出できるのみならず、そのN末部分ポリペプチド断片も検出できると予想される。一方、311−210抗体を固相化し311−180抗体で検出すると、全長のみならず実施例9に記載した切断後のC末側部分ペプチド(配列番号8)を検出できると予想される。したがって、これらの組み合わせを複合的に用いることにより、生体試料等の検体中のOST311全長ポリペプチドと部分ポリペプチドの絶対量の測定と存在比の識別が可能となる。
(4)抗OST311ペプチドウサギポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法による組換えOST311蛋白質濃度の定量
上述のELISAシステムについて、固相化抗体として311−48抗体または311−180抗体を、検出用抗体として311−148抗体を用いた組み合わせで、1、0.67、0.33、0.1、0.067、0.033および0.01μg/mlの希釈系列からなる精製組換えOST311Hの検出を検討した。その結果、図21のBに示すように、0.1〜1μg/mlの範囲内で良好な一次回帰直線が得られたことから(311−48:R2=0.990,311−180:R2=0.996)、少なくともこの濃度範囲における組換えOST311Hを検出可能であることが判明した。
実施例24 組換えOST311蛋白質の単回投与による影響の検討
CHO産生型組換えOST311H全長蛋白質の正常マウス(BALB/c、雄、6週齢)への短期作用を検討するため、精製した組換えOST311H全長蛋白質を尾静脈内へ1匹当たり5.0μg/0.1mlずつ単回投与した。対照群へは、溶媒(PBS)を0.1mlずつ尾静脈内へ投与した。投与後1、3、8時間目で心採血、解剖を実施し、血清リン酸、カルシウム、ビタミンD濃度の測定、腎臓近位尿細管上ナトリウム・リン酸共役輸送体の発現量を解析した。OST311投与群および対照群はそれぞれ6匹のマウスから構成され、水道水および1.03%の無機リン酸および1.18%のカルシウムを含んだ固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
(1)血清リン酸濃度の経時変化
表8に示すとおり、OST311蛋白質を単回投与後、1、3時間目における血清リン酸濃度には有意な差は認められなかったのに対し、投与後8時間では有意な低下を認めた。この結果から、OST311の作用による血清リン酸濃度の低下には、3から8時間を要することが明らかとなった。一方、すべての時間において血清カルシウム濃度には変化を認めなかった。
(2)腎臓近位尿細管上ナトリウム・リン酸共役輸送体の発現
実施例11の(6)に記載した方法に則り、投与後1、3、8時間目における腎臓を各群毎に混合し、近位尿細管冊子縁膜(BBM)を調整した。得られたBBM中のナトリウム・リン酸共役輸送体(NaPi7)蛋白質の存在比をウェスタンブロッティング法により解析した。図22のAに示すとおり、投与後1、3時間目におけるNaPi7の発現量は媒体投与群と同等であったのに対し、投与後8時間目におけるOST311投与群のNaPi7は、媒体投与群のそれに比し有意に低下していることが明らかとなった。一方、このNaPi7蛋白質の減少が、RNAの転写調節を伴ったものかを検討するため、実施例11の(7)に手順に則り、個々のマウスより摘出した腎臓よりトータルRNAを調整し、同記載のプローブを用いてノザンブロッティングを実施した。その結果、図22のBに示すとおり、投与後1、3時間目におけるNaPi7のmRNA量は媒体投与群と同等であったのに対し、投与後8時間目におけるOST311投与群のNaPi7は、媒体投与群のそれに比し有意に低下していることが明らかとなった。以上の結果より、組換えOST311蛋白質の直接又は間接作用による血清リン酸濃度の低下と、腎臓近位尿細管上ナトリウム・リシ酸共役輸送体の下方修正は、両者の変動時間において相関しており、さらにこの蛋白質レベルでの下方修正に寄与する少なくとも一つの要因として、NaPi−7のmRNA転写レベルでの抑制が起こっていることが明らかとなった。
(3)血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度の経時変化
投与後1、3、8時間目における血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度を、実施例16の(1)に記載した方法で測定した。図23に示したとおり、OST311投与群において、投与後3時間で既に血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度の有意な低下を認め、8時間目にはさらなる減少を認めた。
(4)ビタミンD代謝酵素遺伝子群の発現変化
血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度低下が、腎臓に発現する25−ヒドロキシビタミンD−1−α−水酸化酵素(1αOHase)、あるいは25−ヒドロキシビタミンD−24−水酸化酵素(24OHase)遺伝子の変動に起因するかを解明するため、投与後1、3、8時間目における腎臓より、実施例11(7)に記載した手順に則りトータルRNAを調製し、同記載のプローブを用いてノザンブロッティングを実施した。図24に示したとおり、投与1時間後において既に1αOHase遺伝子のmRNA量減少および24OHase遺伝子のmRNA量増加を認め、その傾向は投与後8時間においてより顕著なものとなることが明らかとなった。図24において、「vehicle」は20mMリン酸緩衝液(pH6.7)および0.3M NaClからなる組換えOST311蛋白質の溶媒を意味する。
これらの結果から、OST311は腎臓に発現する25−ヒドロキシビタミンD−1α−水酸化酵素(1αOHase)あるいは、25−ヒドロキシビタミンD−24−水酸化酵素(24OHase)遺伝子の発現を調節することで、血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度を低下させることが判明した。
実施例25 OST311C末欠失体の活性検討
(1)OST311C末欠失体発現系の構築
以下のプライマーを合成した。
OST311R693、OST311R633、OST311R618、OST311R603はOST311の3’末端からそれぞれ20、40、45、50アミノ酸残基を欠失させ終止コドンおよびNotI認識配列を導入する逆方向プライマーである。これらの逆方向プライマーと、実施例19に記載したOST311の開始メチオニンおよびEcoRI認識配列を含む順方向プライマーOST311ME1(配列番号45)とを終濃度0.2μMとなるよう組み合わせ、Pyrobest DNAポリメラーゼ(日本国、宝酒造社)を用い、実施例19の(2)で記載したOST311RQH/IRES−EGFP/pEAK8プラスミドDNA100ngを鋳型として、94℃、1分保温した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分からなる工程を1サイクルとして25サイクルからなるPCR反応を実施した。得られた反応生成物をフェノール/クロロホルム処理し、除蛋白、エタノール沈殿を行った後、EcoRI、NotIで消化し、2%アガロースゲル電気泳動によって各DNA断片を分離し、ジーンクリーンII(米国、Bio101)を用いて回収した。得られたDNA断片をEcoRI、NotIで消化したpEAK8ベクター(米国、エッジバイオシステム)と連結することによってpPKOST311−△C20、−△C40、−△C45、−△C50プラスミドを得た。定法に従ってプラスミドDNAを調製後、ABI3700蛍光DNAシークエンサー(米国、PEアプライドバイオシステムズ社)によって塩基配列を決定し、OST311RQH遺伝子の3’末端から目的通りの塩基対が欠失していることを確認した。
(2)CHO安定発現細胞の取得
トランスフェクタム(米国、プロメガ社)を用い、添付文書にしたがって、CHO ras clone1細胞にpPKOST311−△C20、−△C40、−△C45、−△C50プラスミドDNAをそれぞれ導入し、5μg/mlピューロマイシン、10%FSCを含むMEMα培地にて薬剤耐性を示すCHO−OST311RQ−△C20、−△C40、−△C45、−△C50細胞を取得した。これらの細胞をそれぞれ24穴プレートに蒔き、5μg/mlピューロマイシン、10%FSCを含むMEMα培地にてコンフルエントになるまで培養した後、無血清DF(DMEM/F−12)培地に置換し3日後、上清を回収した。得られた培養上清を、実施例22で記載したOST311特異的ポリクローナル抗体311−148または311−180を用いたウェスタンブロッティング法に供し、予想される分子量に相当する位置における目的蛋白質の発現を確認した。
(3)OST311C末欠失体発現CHO細胞移植試験
上述の20、40、45および50残基欠失体を発現するCHO細胞を、実施例13に記載した方法と同様にヌードマウス(6週齢、BALB/c−nude、雄、各群6匹ずつ)へ皮下移植した。対照群として全長OST311RQHを発現するCHO細胞およびCHO ras clone−1細胞をそれぞれ皮下移植した(n=6)。各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
細胞移植後3日目において心採血を実施し、実施例20に記載した同様の方法で血清リン酸、カルシウム濃度および1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度の測定を行った。図25に示すように、CHO−OST311RQ−△C20、−△C40、−△C45、−△C50細胞移植群のいずれにおいても、全長を発現する細胞移植群と同等の有意な血清リン酸濃度低下を認めた(t−test、**p<0.001)。また、CHO−OST311RQ−△C40、−△C45、−△C50細胞移植群における血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度についても著明な低下を認めた(CHO−ras clone−1移植群の平均血清濃度を100%とした場合、全長:3.1%、△C40:9.4%、△C45:10.0%、△C50:68.1%)。これらの結果から、OST311蛋白質のC末端より少なくとも50アミノ酸を欠失させても、血清リン濃度低下活性または血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度低下活性は維持されることが明らかとなった。
実施例26 OST311N末欠失体の活性検討
(1)OST311N末9アミノ酸欠末体発現系の構築
以下のオリゴDNAを合成した。
OST311SGFWは、OST311の開始メチオニンから配列番号2の24番目Alaまでのアミノ酸残基で構成されるシグナルペプチド部分をコードする遺伝子配列からなるオリゴDNAであり、その5’末端にEcoRI認識配列を含む。OST311SGRVはOST311SGFWの相補鎖であり、その5’末端にEcoRI認識配列を含む。また、OST311SGFWの3’側およびOST311SGRVの5’側には、制限酵素SphIの認識部位が導入してある。このSphI認識部位の導入により、シグナルペプチド配列内の23番目ArgがHisへと置換される。上述のオリゴDNA同士を定法に従いアニーリングさせることで、両末端部にEcoRI認識配列、およびシグナルペプチド内23番目アミノ酸残基に相当する位置にSphI認識配列を含み、OST311の開始メチオニンから始まる1残基改変されたシグナルペプチドの全長をコードする2本鎖DNA断片が得られる。このDNA断片を、EcoRI消化したpEAK8ベクター(米国、エッジバイオシステム)に挿入し、同ベクター内に存在するEF1プロモーターと上述のDNA断片とが、順方向となっているプラスミドDNAを選択することで、プラスミドpPKFGSGとした。
次に以下のプライマーを合成した。
OST311dN9は、5’末端にSphI認識部位を含み、配列番号2の24番目Ala残基の後に同34番目Ser残基以降のアミノ酸配列が続くように設計された順方向プライマーである。本プライマーと、NotI認識配列を含み、C末端部分にヒスチジン残基6個が付加した後、終始コドンとなるよう設計されたプライマーOST311HNt(実施例19、配列番号46)を逆方向プライマーとして組み合わせ、実施例19の(2)で記載したOST311RQH/IRES−EGFP/pEAK8プラスミドDNAを鋳型として用い、実施例25(1)に記載した要領でPCR増幅を実施した。得られたPCR産物をSphIおよびNotIで消化した後、同じくSphIおよびNotIで消化した上述のプラスミドベクターpPKFGSGに定法に従い挿入した。得られたプラスミドOST311△N9−pPKFGSGを、ABI3700蛍光DNAシークエンサー(米国、PEアプライドバイオシステムズ社)を用いて塩基配列を決定したところ、挿入された遺伝子配列は、OST311RQH遺伝子の開始メチオニンから24番目Alaまでのシグナルペプチドを含み(ただし、23番目ArgはHisへ置換)、続く25番目Tyrから33番目Glyまでの9アミノ酸残基に相当する遺伝子配列のみを欠失し、34番目Serからヒスチヂンタグを含む終始コドンまでの全配列をコードしていることを確認した。
(2)CHO安定発現細胞の取得
トランスフェクタム(米国、プロメガ社)を用い、添付文書にしたがって、CHO ras clone1細胞にOST311△N9−pPKFGSGプラスミドDNAを導入し、5μg/mlピューロマイシン、10%FSCを含むMEMα培地にて薬剤耐性を示すCHO−OST311RQ−△N9細胞を取得した。得られた細胞より実施例25に記載した要領で培養上清を回収し、実施例22で記載したOST311特異的ポリクローナル抗体311−148、または新たに配列番号2の237番目Glyより251番目Ileまでの部分ポリペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体311−237を用いたウェスタンブロッティング法により、予想される分子量に相当する位置における目的蛋白質の発現を確認した。このことから、配列番号2における23番目ArgをHisに改変したOST311シグナルペプチドは適切に機能しOST311組換え蛋白質を分泌させること、また少なくとも25番目Tyrから33番目Glyを欠いても、分泌後、培養上清中にある程度安定に組み換え蛋白質が存在しうることが判明した。
(3)OST311N末9アミノ酸欠失体発現CHO細胞移植試験
上述のCHO−OST311RQ−△N9細胞を、実施例13に記載した方法と同様にヌードマウス(8週齢、BALB/c−nude、雄、各群6匹ずつ)へ皮下移植した。対照群として全長OST311RQHを発現するCHO細胞およびCHO ras clone−1細胞をそれぞれ同様に皮下移植した(n=6)。各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および固形食CE2(日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
細胞移植後4日目において、ガラス製キャピラリーを用いて眼窩採血を実施し、実施例20に記載した要領で血清中リン酸濃度を測定したところ、CHO−OST311RQ−△N9細胞移植群において、全長組換え体発現細胞移植群と同等の有意な血清リン酸濃度低下を認めた(CHO−ras clone−1群:6.85±0.12mg/dL、CHO−OST311RQH群:3.91±0.23mg/dL(p<0.001、対CHO−ras clone−1群)、CHO−OST311RQ−△N9群:4.33±0.15mg/dL(p<0.001、対CHO−ras clone−1群))。この結果から、少なくとも配列番号2の25番目Tyrから33番目Glyからなる9アミノ酸残基を欠いてもOST311の生理活性が損なわれるものではないことが判明した。
実施例27 大腸菌産生型OST311組換え体の検討
(1)OST311大腸菌発現ベクターOST311/pET3aの構築
以下のプライマーを合成した。
実施例19において作製したOST311/pCAGGSプラスミドを鋳型とし、OST311N(配列番号60)及びOST311Bm(配列番号61)をプライマーとして、pfu DNAポリメラーゼ(米国、プロメガ社)を用いてPCRを行った。反応は、94℃、1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして35サイクル実施した。反応終了後、フェノールクロロホルム処理により酵素を失活させた後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。このDNAをBamHIで消化し、目的のOST311cDNA断片を2%アガロースゲル電気泳動で分離したのち、ジーンクリーンII(米国、BIO101社)を用いて回収した。一方、プラスミドベクターpET3a(米国、Novagen社)をNdeIで消化し、Klenow断片(スイス、ロッシュ社)を用いて末端の平滑化を行った。さらにこれをBamHIで消化した後、目的のプラスミドDNA断片を0.8%アガロースゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーンII(米国、BIO101社)を用いて回収した。この様にして得られたOST311cDNA断片とプラスミドpET3a消化物を、DNAライゲーションキットバージョン2(日本国、宝酒造)を用いて連結した。これを大腸菌DH5αに導入してクローン化し、プラスミドを抽出した。プラスミドの塩基配列を確認し、pET3aにOST311cDNAが目的通りに挿入されていることを確認した。これをOST311/pET3aとした。
(2)OST311大腸菌発現ベクターOST311/pET28の構築
以下のプライマーを合成した。
OST311/pET3aプラスミドを鋳型とし、OST311Nd(配列番号62)及びOST311Not(配列番号63)をプライマーとして、LA Taq(日本国、宝酒造社)を用いてPCRを行った。反応は94℃で1分保温したのち、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして35サイクル実施した。反応終了後、フェノールクロロホルム処理により酵素を失活させた。増幅したDNA断片をエタノール沈殿にて回収した。これをNdeIとNotIで消化したのち、目的のOST311cDNA断片を2%アガロースゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーンII(米国、BIO101社)を用いて回収した。一方、プラスミドベクターpET28(米国、Novagen社)をNdeIとNotIで消化し、さらに牛小腸アルカリフォスファターゼ(日本国、宝酒造社)を用いて脱リン酸化を行った。これを0.8%アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のプラスミド断片をジーンクリーンII(米国、BIO101社)を用いて回収した。このようにして得たOST311cDNA及びpET28プラスミド消化物をDNAライゲーションキットバージョン2(日本国、宝酒造社)を用いて連結し、大腸菌DH5αに導入してクローニングし、プラスミドを抽出した。プラスミドの塩基配列を確認し、N末端側にHis−tag配列を付加した組換え体OST311が発現するようなOST311cDNAがpET28に挿入されていることを確認した。これをOST311/pET28とした。このベクターにコードされる組換え体His−OST311の塩基配列とアミノ酸配列を図26に示す。
(3)組換え体His−OST311の大腸菌での発現と調製
プラスミドOST311/pET28を大腸菌BL21(DE3)Codon Plus RP(米国、ストラタジーン社)に導入し、形質転換させたクローンを取得した。得られた大腸菌クローンを10mgのカナマイシン(米国、シグマ社)を含む100mlのLB培地に植菌し37℃で終夜培養した。この菌体液を1LのLB培地にA600=0.1となるように接種し、3L容量の坂口フラスコを用いて37℃で振とう培養をおこなった。経時的に培養液の吸光度を測定してA600=0.6〜1.0になったところで、イソプロピル−1−チオ−β−ガラクトシド(IPTG)(日本国、和光純薬)を1mMとなるように加え、4時間後に遠心分離(7700gx15分)により集菌した。集めた菌体を20mlの1mM DTTを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離(7700gx15分)し、次に、沈殿画分を15mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で懸濁し、DNase I(スイス国、ロッシュ社)を0.1mg/mLになるように添加して、4℃で1時間振とうした。その後、遠心分離(23400gx15分)を行い、沈殿画分をインクルージョンボディとして回収した。得られたインクルージョンボディーを10mlの0.75M尿素および1%Triton−Xを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8)に懸濁し、遠心分離(23400gx15分)により沈殿を回収する洗浄操作を実施した。さらに、この洗浄操作を2回繰り返した。
洗浄したインクルージョンボディを5mlの変性剤溶液(1mM DTTおよび6M塩酸グアニジンを含む50mMリン酸緩衝液(pH8))に懸濁し、37℃で1時間振とうすることにより可溶化した。不溶物を遠心分離(23400gx15分)により沈殿として除去した後、6M塩酸グアニジンを含む50mMリン酸緩衝液(pH6)で平衡化した。この可溶化サンプルを、Ni−NTA Agarose(ドイツ国、QIAGEN社)を充填したカラムに供し、6M塩酸グアニジンを含む50mMリン酸緩衝液(pH6)で洗浄した。カラムに吸着された蛋白質を500mMイミダゾール(日本国、ナカライテスク社)および6M塩酸グアニジンを含む50mMリン酸緩衝液(pH4.5)にて溶出させて変性His−OST311を精製した。精製したサンプルの280nmにおける紫外吸光度から濃度を求め、最終濃度が2mg/mlとなるように6M塩酸グアニジンを含む50mMリン酸緩衝液(pH6)を加えて変性His−OST311溶液を調製した。このサンプルに終濃度が1mMになるように還元剤システインを加え、0.6M塩酸グアニジン,0.1%Tween20を含む20mMリン酸緩衝液(pH6)で100倍希釈し、リフォールディングを開始し、4℃で3日間以上インキュベートした。
このリフォールディング溶液を、0.1M酢酸緩衝液(pH4.8)に対して4℃で透析した。透析液を、限外濾過膜を用いて約10倍に濃縮し、陽イオン交換カラムSP−5PW(日本国、東ソー社)を用いてHPLCにて精製した。蛋白質の溶出には10%グリセロールを含む20mMリン酸緩衝液(pH6)を用い、0.5Mから2MまでのNaCl直線濃度勾配で溶出させた。この溶出パターンを図27に示す。溶出された2種類の蛋白質ピークのうち、より低い塩濃度で溶出されたピークにHis−OST311が含まれていることがSDS−PAGE分析および質量分析からわかった。このようにして約1Lの培養菌体から最終精製物であるHis−OST311を約0.6mg調製することができた。
(4)MK−OST311発現ベクターpET22b−MK−OST311の構築
以下のプライマーを合成した。
上述のHis−OST311発現プラスミドOST311/pET28を鋳型として、OST311MK1(配列番号64)とOST311MK2(配列番号65)をプライマーとして用いてPCRを行い目的の配列を増幅した。この操作により得られたOST311cDNAは、開始コドン(ATG)の後に続く27塩基が大腸菌型のコドンに変換されている。このPCR産物をQIAquick PCR purification Kit(ドイツ国、QIAGEN社)で精製し、制限酵素NdeI(日本国、宝酒造社)とNotI(日本国、宝酒造社)を用い37℃、1時間消化した。消化物を、アガロース電気泳動で分離後、QIAquick PCR purification Kit(ドイツ国、QIAGEN社)で精製した。このDNA断片を、制限酵素NdeIとNotIで37℃、1時間消化し、アガロース電気泳動で分離精製したプラスミドベクターpET22b(米国、Novagen社)にDNA Ligation kit Ver2(日本国、宝酒造社)を用いて16℃で15分間連結した。これを大腸菌JM109(日本国、宝酒造社)に導入してクローン化し、定法に従ってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの塩基配列を決定し、目的通りに取得したOST311cDNAがpET22bベクターに挿入されていることを確認した。これをpET22−MK−OST311とした。このベクターにコードされる組換え体MK−OST311の塩基配列とアミノ酸配列を図26に示す。
(5)MK−OST311の大腸菌での発現と調製
プラスミドpET22−MK−OST311を大腸菌BL21(DE3)Codon Plus RP(米国、ストラタジーン社)に導入し、形質転換させたクローンを取得した。得られた大腸菌クローンを10mgのアンピシリンを含む100mlのLB培地に植菌し37℃で終夜培養した。この菌体液を1LのLB培地にA600=0.1となるように接種し、3L容量の坂口フラスコを用いて37℃で振とう培養をおこなった。この菌体液にIPTGを添加することで組換え体の発現を誘導し、上述のHis−OST311調製法と同様の方法でインクルージョンボディを調製した。
洗浄したインクルージョンボディを5mlの変性剤溶液(1mM DTTおよび6M塩酸グアニジンを含む50mMリン酸緩衝液(pH8))に懸濁し、37℃で1時間振とうすることにより可溶化した。これを変成剤溶液で2倍に希釈し、さらに、0.6M塩酸グアニジンおよび0.1%Tween20を含む20mMリン酸緩衝液(pH6)を用いて100倍に希釈し、リフォールディングを開始し、4℃で3日間以上インキュベートした。酸化剤の添加およびpH7以上の条件下では、蛋白質の沈澱が生じ、リフォールディング効率が著しく低下することが明らかとなった。このリフォールディング溶液を、0.1M酢酸緩衝液(pH4.8)に対して4℃で透析した。限外濾過膜を用いて透析液を約10倍に濃縮し、陽イオン交換カラムSP−5PW(日本国、東ソー社)を用いてHPLCにて精製した。蛋白質の溶出には10%グリセロールを含む20mMリン酸緩衝液(pH6)を用い、0.5Mから2MまでのNaCl直線濃度勾配で溶出させた。図28に示すように蛋白質の溶出ピークは2種類あり、より低い塩濃度で溶出されたピークにMK−OST311が含まれていることが、SDS−PAGE分析および質量分析から明らかとなった。約1Lのフラスコ培養菌体から最終精製物であるMK−OST311を約0.6mg精製することができた。
(6)MK−OST311のPEG化
イオン交換カラムで精製した10mlのMK−OST311(0.05mg/ml)を10%酢酸を用いてpH4.8に調整した。この溶液に10mM酢酸緩衝液(pH4.8)に溶解した分子量20000の活性化PEG(米国、Sharewater社)25mgを氷中で撹拌しながら加えた。15分後に10mM酢酸緩衝液(pH4.8)に溶解した1M水素化シアノほう素ナトリウム(日本国、ナカライテスク社)を最終濃度15mMになるように加え、さらに4℃で16時間攪拌した。この反応でPEG化したOST311を陽イオン交換カラムSP−5PW(日本国、東ソー社)を用いてHPLCにて精製した。蛋白質の溶出には10%グリセロールを含む20mMリン酸緩衝液(pH6)を用い、0.5Mから2MまでのNaCl直線濃度勾配で溶出させた。PEG化されたMK−OST311は、図29に示すように、MK−OST311よりもさらに低イオン強度側において単一なピークとして溶出された。
(7)His−OST311組換え体の活性検討
精製His−OST311組換え体の生物活性を検討するため、実施例24に記載した要領で組み換え蛋白質を正常マウス(5週齢、BALB/c、雄、各群6匹)に一匹当たり4.5μg/0.1mlずつ尾静脈内単回投与し、9時間後の血清リン酸および1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度を実施例20に記載した同様の方法で測定した。また陽性対照として、同用量のCHO−OST311H細胞由来精製組換え体を、また媒体群へは20mMリン酸緩衝液(pH6.9)および0.3M NaClからなる溶媒を0.1mlずつ尾静脈内単回投与した。
図30のAに示すように、投与から9時間後のHis−OST311投与群において、媒体投与群と比し有意な血清リン低下作用を認めた。また、その低下程度はCHO由来組換え体投与群と同等であった。一方、投与から9時間後の血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度についても、図32に示すようにHis−OST311投与群において顕著な低下を認めた。
実施例24の(3)および(4)に記載したように、CHO細胞由来のOST311蛋白質を単回投与して4時間後にすでに有意な血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度低下を認めており、それに先立ち、投与後1時間目において腎臓での25−ヒドロキシビタミンD−1−α−水酸化酵素(1αOHase)の発現低下および25ヒドロキシビタミンD−24−水酸化酵素(24OHase)の発現亢進を認めている。そこで、BALB/cマウス(5週齢、雄)へ一匹当たり4.5μg/0.1mlずつHis−OST311を尾静脈内単回投与し、1および4時間後に摘出した腎臓における1αOHase遺伝子および24OHase遺伝子の発現変化をノザンブロッティング法にて解析した。陽性対照として同用量のCHO−OST311H細胞由来精製組換え体を、また媒体群へは20mMリン酸緩衝液(pH7.0)、0.3M NaClからなる溶媒を0.1mlずつ尾静脈内単回投与した。図31に示すように、His−OST311はCHO由来組換え体と同様に、投与後1時間目ですでに1αOHase遺伝子の発現低下および24OHase遺伝子の発現亢進を引き起こしており、CHO由来組換え体と同等のビタミンD代謝酵素遺伝子発現調節活性を有していることが判明した。また、図32に示すように、血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度変化は、組換え体投与後4時間目で減少傾向を示し、8時間目ではより顕著な低下を認めており、実施例24の(3)で示したCHO由来組換え体投与試験で認められた経時変化の様態とほぼ一致していることが判明した。
以上の結果から、大腸菌で産生した組換え体His−OST311は、少なくとも血清リン低下活性ならびにビタミンD代謝調節活性については、CHO−OST311H細胞が産生する分泌型組換え体と同等の生物活性を有していることが判明した。
(8)PEG化MK−OST311の活性検討
PEG化MK−OST311の生物活性を、実施例24に記載した要領で正常マウス(5週齢、BALB/c、雄、各群8匹)一匹当たり5.0μg/0.1mlずつ尾静脈内単回投与し、9時間後の血清リン酸濃度を実施例20に記載した同様の方法で測定した。媒体群へは20mM PB(pH6.0)、10%glycerol、1M NaClおよび0.1%Tween20からなる溶媒を0.1mlずつ尾静脈内単回投与した。投与後8時間目において、ガラス製キャピラリーを用いて眼窩採血を施し、得られた血清中の無機リン酸濃度を測定した。図30のBに示したように、PEG化MK−OST311投与群において、媒体投与群と比し有意な血清リン低下作用を認めた。この結果から、大腸菌産生型組換え体をPEG化してもその生物活性は阻害されないことが判明した。
実施例28 切断部分へのアミノ酸変異導入
実施例9に記載したように、OST311は配列番号2のアミノ酸残基179番目のArgと180番目のSerの間で切断を受けることが判明している。一方、実施例19に記載したようにOST311のアミノ酸残基176番目のArgおよびアミノ酸残基179番目のArgの両者を同時にGlnに置換することでこの切断が阻害されることが確認されている。これらの事実は、この切断が隣接するRXXRもしくはRRXXR配列からなるモチーフを認識するプロテアーゼによる可能性を示唆するものである。また、配列番号4に示すポリペプチドからなる全長型組換え体を生体内に投与した際にも、上述の、あるいはそれに類似した切断を受ける可能性が考えられる。そこで、配列番号2のアミノ酸残基175番目から180番目までの各残基をそれぞれAla、GlnあるいはTrpに置換することにより、CHO細胞における各変異組換え体の発現分泌パターンにどのような影響を与えるかを検討した。
(1)切断部分変異導入OST311遺伝子の作製
以下のプライマーを合成した。
pyh23PA1Fおよびpyh23PA1Rは、OST311cDNA(配列番号1)の652番目のシトシンをグアニンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基174番目のProをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をP174Aと称す。
pyh23RA1Fおよびpyh23RA1Rは、OST311cDNA(配列番号1)の655番目のシトシンをグアニンに、656番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基175番目のArgをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をR175Aと称す。
pyh23RA2Fおよびpyh23RA2Rは、OST311cDNA(配列番号1)の658番目のシトシンをグアニンに、659番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基176番目のArgをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下,本変異をR176Aと称す。
pyh23HA1Fおよびpyh23HA1Rは、OST311cDNA(配列番号1)の661番目のシトシンをグアニンに、662番目のアデニンをシトシンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基177番目のHisをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をH177Aと称す。
pyh23TA1Fおよびpyh23TA1Rは、OST311cDNA(配列番号1)の664番目のアデニンをグアニンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基178番目のThrをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をT178Aと称す。
pyh23RA3Fおよびpyh23RA3Rは、OST311cDNA(配列番号1)の667番目のシトシンをグアニンに、668番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基179番目のArgをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をR179Aと称す。
pyh23SA1Fおよびpyh23SA1Rは、OST311cDNA(配列番号1)の670番目のアデニンをグアニンに、671番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基180番目のSerをAlaに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をS180Aと称す。
pyh23RKQ1Fおよびpyh23RKQ1Rは、OST311cDNA(配列番号1)の656番目のグアニンをアデニンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基175番目のArgをGlnに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をR175Qと称す。
pyh23RKQ2Fおよびpyh23RKQ2Rは、OST311cDNA(配列番号1)の659番目のグアニンをアデニンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基176番目のArgをGlnに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をR176Qと称す。
pyh23RKQ3Fおよびpyh23RKQ3Rは、OST311cDNA(配列番号1)の668番目のグアニンをアデニンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基179番目のArgをGlnに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をR179Qと称す。
pyh23RWFおよびpyh23RWRは、OST311cDNA(配列番号1)の667番目のシトシンをチミンに置換することで、配列番号2に示すアミノ酸残基179番目のArgをTrpに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をR179Wと称す。
(1)−1 OST311P174AH遺伝子の作製
Pyrobest DNAポリメラーゼ(日本国、宝酒造社)を用い、添付文書に従って2種類の反応液を100μL調製した。一方にはプライマーとしてOST311ME1(配列番号45)、pyh23PA1F(配列番号66)を終濃度0.2μMで使用し、もう一方にはプライマーとしてpyh23PA1R(配列番号67)、OST311HNt(配列番号46)を終濃度0.2μMで使用した。それぞれの反応液に、実施例19の(1)に記載したOST311/pCAGGSプラスミド10ngを鋳型として加え、94℃て1分保温したのち、94℃で20秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとして40サイクルのPCR反応を実施した。これら2種類の反応液をそれぞれ10倍に希釈し、それぞれ1μLをPyrobest DNAポリメラーゼ(日本国、宝酒造社)添付文書に従って調製した反応液100μLに添加した。この溶液にプライマーとしてOST311ME1(配列番号45)、OST311HNt(配列番号46)を終濃度0.2μMとなるよう加え、94℃で1分保温したのち、94℃で20秒、55℃で30秒、72℃で1分30秒を1サイクルとして30サイクルのPCR反応を実施し、さらに72℃で7分保温した。得られた反応生成物をジーンクリーンII(米国、Bio101社)を用いて添付の文書に従い回収した。その後EcoRI、NotIで消化し、2%アガロースゲル電気泳動によって約800bpのDNA断片を分離、ジーンクリーンII(米国、Bio101社)を用いて回収した。得られたDNA断片をpEAK8ベクター(米国エッジバイオ社)のEcoRI,NotI部位に挿入することによって、プラスミドOST311P174AH−pEAK8を得た。定法に従ってプラスミドDNAを調製し、ABI3700蛍光DNAシークエンサー(米国、PEアプライドシステムズ社)によって塩基配列を決定し、目的のP174Hの変異が導入されたことを確認した。またC末端にヒスチジンタグが付加されてることを確認した。P174Aの変異が導入された変異遺伝子でコードされるポリペプチドをOST311P174AHと称す。
(1)−2 OST311R175AH遺伝子の作製
pyh23RA1F(配列番号68)、pyh23RA1R(配列番号69)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−3 OST311R176AH遺伝子の作製
pyh23RA2F(配列番号70)、pyh23RA2R(配列番号71)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−4 OST311H177AH遺伝子の作製
pyh23HA1F(配列番号72)、pyh23HA1R(配列番号73)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−5 OST311T178AH遺伝子の作製
pyh23TA1F(配列番号74)、pyh23TA1R(配列番号75)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−6 OST311R179AH遺伝子の作製
pyh23RA3F(配列番号76)、pyh23RA3R(配列番号77)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−7 OST311S180AH遺伝子の作製
pyh23SA1F(配列番号78)、pyh23SA1R(配列番号79)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−8 OST311R175QH遺伝子の作製
pyh23RKQ1F(配列番号80)、pyh23RKQ1R(配列番号81)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−9 OST311R176QH遺伝子の作製
pyh23RKQ2F(配列番号82)、pyh23RKQ2R(配列番号83)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−10 OST311R179QH遺伝子の作製
pyh23RKQ3F(配列番号84)、pyh23RKQ3R(配列番号85)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(1)−11 OST311R179WH遺伝子の作製
pyh23RWF(配列番号86)、pyh23RWR(配列番号87)プライマーを用いて(1)−1と同様の方法にて作製した。
(2)切断部分変異導入OST311遺伝子の一過性発現と培養上清の調製
pEAK rapid細胞(米国、エッジバイオシステム)を12ウェルプレートに播種した。この細胞にpEAKシステム添付文書(米国、エッジバイオシステム社)に従い、上述の11種類の変異OST311発現プラスミドをリン酸カルシウム法にてトランスフェクションした。4時間静置したのち、1.5mlの血清を含まないMEMα培地に置換し後、2日間、37℃にて培養してその上清を回収した。
(3)切断部分変異導入OST311遺伝子の発現確認
得られた培養上清を、実施例6の(3)に記載した要領でウエスタンブロッティングに供し、培養上清中の切断部分変異導入OST311組換え体の存在を検討した。検出抗体には、実施例22で記載したOST311特異的ポリクローナル抗体311−148を用いた。その結果、図33に示すように、アミノ酸残基174番目から180番目までの置換体の内、P174A、R175A、R175Q、H177A、T178AおよびS180Aの変異を導入したOST311組換え体において、16kDa付近に野生型と同様の、配列番号6に示すポリペプチドを含む分解産物を認めたが、R176A、R179A、R176Q、R179QあるいはR179Wの変異を導入したOST311組換え体において、いずれも分解産物を認めないことが明らかとなった。これらの結果から、アミノ酸残基179番目Argと180番目Serとの間で起こる切断には,アミノ酸残基176番目Argおよび179番目Argが特に重要な役割を果たすことが示唆された。即ち、両残基を少なくともAla、GlnあるいはTrpのいずれのアミノ酸で置換しても、切断が阻害もしくは抑制を受けることから、全長ポリペプチドの産生を促進することが期待される。
実施例29
実施例6に示すようにOST311をCHO細胞やCOS細胞で発現させた場合に得られる組換え体産物は、実施例9で示したようにRXXRモチーフの直後である179番目のアルギニンと180番目のセリンの間で切断されるものが得られる。実施例18で示したように、OST311蛋白質の低リン血症誘導活性はこの部位の切断を受けなかった全長蛋白において保持されていることが明らかとなった。さらに、RXXRモチーフがこの切断に関与していることは、実施例19および実施例28に示した変異導入試験で明らかである。組換え体OST311を効率良く生産取得する上において、この切断を回避することは重要な課題であり、実施例28で示したRXXRモチーフに変異を導入することは一つの有効な方法である。RXXRモチーフを認識する蛋白分解酵素の一つとして、furinが知られている。この酵素は、トランスゴルジ領域に局在し蛋白質が合成された後、分泌に至る過程においてRXXRモチーフを認識して蛋白質を切断すると考えられている。
(1)OST311切断へのfurinの関与
furinが欠損しているLoVo細胞にOST311/pCAGGSプラスミドをトランスフェクタム(米国、プロメガ社)を用いて導入し、48時間培養したのち、一過性に発現し、培養液中に分泌したOST311蛋白質をウェスタンブロッティングで311−148抗体を用いて解析したところ、切断断片は検出されなかった。このことから、OST311の生産時に見られる切断にfurinが関与していることが示唆された。
(2)OST311の切断の回避
上記結果より、furin活性を阻害することが179番目のアルギニンと180番目のセリンの間で切断されないOST311の生産性向上に有効であることが想定された。したがって、Lovo細胞のようなfurin活性を持たない宿主でOST311を発現させること、あるいはfurinの阻害剤を添加することによりfurin活性を抑制した状況でOST311を発現させることが考えられる。そこで、CHO−OST311H細胞のfurin活性を抑制する目的で、α1−アンチトリプシンポートランド(α1−PDX)をBenjannet Sらが報告している方法(J Biol Chem 272:26210−8,1997)に準じて一過性に発現させて培養上清を回収したところ、組換え体産物中の全長体の存在比率が、対照とした非遺伝子導入CHO−OST311H細胞上清中のものに比べて増加していた。このことから、furin活性を抑制する物質を外来的あるいは内因的に作用させることでOST311の全長蛋白の生産効率を上昇させることができると考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、リン酸代謝、カルシウム代謝および/又は石灰化を調節するポリペプチド、同ポリペプチドをコードするDNA、同ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物、および同ポリペプチドを認識する抗体と同抗体を有効成分とする医薬組成物、同抗体を用いた診断方法と診断用組成物が提供される。
配列表フリーテキスト
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【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、OST311の腫瘍特異性を検討するため、腫瘍組織より抽出したfirst−strand cDNAおよび対照骨組織より抽出したfirst−strand cDNAを鋳型に、配列番号22、23に示すOST311特異的プライマーおよび、配列番号26、27に示すG3PDH特異的プライマーを用いてPCRを実施し、その増幅産物をアガロース電気泳動で解析した写真である。
図2は、組換えOST311を、ニッケルレジンにてアフィニティー精製した後、強陽イオン交換樹脂SP−5PWで分離精製した溶出画分について、ウェスタンブロッティングを実施しOST311を検出したことを示す写真である。
図3Aは、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを、MacVector version6.5.1の計算機能を用いて、ペプチド抗体作製に適した部位を予測した結果を示す図である。
図3Bは、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを、MacVector version6.5.1の計算機能を用いて疎水性度を予測した結果を示す図である。
図4は、CHO−OST311H細胞を移植してから31日間の、非腫瘍形成群(avr.−で表示されたグラフ)およびCHO−OST311H細胞腫瘍形成群(avr.+で表示されたグラフ)の平均体重の経時変化を示した図である。
図5は、対照CHO ras clone−1細胞腫瘍形成個体、CHO−OST190H細胞腫瘍形成個体、CHO−OST311H細胞腫瘍形成個体をそれぞれX線撮影し、全身骨格を示した写真である。
図6は、ヒトOST311ポリペプチドとマウスOST311のポリペプチドとの間におけるアミノ酸の相同性を比較した結果を示す図である。
図7は、腫瘍非形成群(n=6)、CHO ras clone−1腫瘍形成群(n=10)、CHO−OST190H腫瘍形成群(n=10)、CHO−OST311H腫瘍形成群−1(n=6)、CHO−OST311H腫瘍形成群−2(n=6)より44日目〜46日目に心採血にて採取した血清中のリン濃度、カルシウム濃度、アルカリホスファターゼ活性を測定した結果を示した図である。
図8は、CHO−OST311H腫瘍形成個体および非腫瘍形成個体より摘出した腎臓から、近位尿細管上皮細胞冊子縁膜を調製し、ナトリウム・リン酸共役輸送担体(NaPi−7)の発現量をウェスタンブロッティング法で比較した写真である。
図9Aは、腫瘍移植後44日目〜46日目に屠殺したマウスより採取した腎臓におけるリン酸輸送担体(NaPi−7、NPT−1)とビタミンD代謝酵素(1αOHase、24OHase)と小腸におけるリン酸輸送担体(NaPi−IIb)のmRNA量の変化をノーザンブロッティングで検出した写真である。
図9Bは、腫瘍移植後44日目〜46日目に屠殺したマウスより採取した腎臓におけるリン酸輸送担体(NaPi−7、NPT−1)とビタミンD代謝酵素(1αOHase、24OHase)と小腸におけるリン酸輸送担体(NaPi−IIb)のmRNA量の変化をノーザンブロッティングで検出した写真である。
図9Cは、腫瘍移植後44日目〜46日目に屠殺したマウスより採取した腎臓におけるリン酸輸送担体(NaPi−7、NPT−1)とビタミンD代謝酵素(1αOHase、24OHase)と小腸におけるリン酸輸送担体(NaPi−IIb)のmRNA量の変化をノーザンブロッティングで検出した写真である。
図10は、腫瘍移植後44日目〜46日目に屠殺したマウスより採取した大腿骨のX線写真である。
図11Aは、PBS、CHO ras clone−1細胞およびCHO−OST311H細胞をヌードマウス(6週齢、BALB/c、雄)へ移植後、2日目における血清リン酸、カルシウム濃度を比較した図である。
それぞれの値は、平均±標準偏差で表されている。
図11Bは、PBS、CHO ras clone−1細胞およびCHO−OST311H細胞をヌードマウス(6週齢、BALB/c、雄)へ移植後、6日目における血清リン酸、カルシウム濃度を比較した図である。
それぞれの値は、平均±標準偏差で表されている。
図12は、CHO−OST311H細胞の培養上清を精製し、溶出画分を抗His6抗体および抗OST311ペプチド抗体(311−114)を用いてウェスタンブロッティングした結果を示す写真である。左パネルは311:26−251、中央パネルは311:25−179、右パネルは311:180−251をそれぞれ検出した図である。ゲル写真上部に「*」で記した画分を、正常マウスへの単回投与試験に用いた。
図13は、CHO−OST311H細胞移植マウスおよび腫瘍なしマウスより摘出した脛骨骨幹端部の、非脱灰切片をVillanueva goldner染色した写真である。
図14は、CHO−OST311H細胞移植マウスおよび対照マウスより摘出した腎臓における、ビタミンD代謝酵素遺伝子産物のノザンブロッティングを示した写真である。
図15は、Aは、CHO産生型組換えOST311H全長蛋白質の正常マウスへの投与試験1について、タイムスケジュールを表した図である。Bは、各採血時における血清中リン酸濃度を、Cは、同時点での血清カルシウム濃度を表したグラフである。
図16は、Aは、CHO産生型組換えOST311H全長蛋白質の正常マウスへの投与試験2について、タイムスケジュールを表した図である。Bは、各採血時における血清中リン酸濃度を、Cは、同時点での血清カルシウム濃度を表したグラフである。
図17は、変異型組換え体OST311RQHを産生するCHO−OST311RQH細胞およびOST311RQH/pEAK rapid細胞の培養上清をウェスタンブロッティングに供し、上清中組換え体を検出した写真である。
図18は、Aは、変異型組換え体OST311RQHの正常マウスへの投与試験について、タイムスケジュールを表した図である。Bは、各採血時における血清中リン酸濃度を、Cは、同時点での血清カルシウム濃度を表したグラフである。
図19は、Aは、CHO−OST311RQH細胞移植試験の移植後2日目における血清リン酸濃度を示した図である。Bは、同試験における血清カルジウム濃度を示した図である。
図20は、CHO−OST311H細胞の無血清培養上清中の組換えOST311Hを抗OST311部分ペプチドウサギ抗血清を用いてウェスタンブロッティングにより検出した写真である。
図21は、Aは、6種類の抗OST311ペプチドポリクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAを構築し、個々の組み合わせに対する組換えOST311の検出レベルを示した表である。Bは、固相化抗体として311−48抗体または311−180抗体を、検出用抗体として311−148抗体を組み合わせたELISAシステムを用いて、精製組換えOST311Hの濃度とそれぞれに対する測定値の関係をプロットしたグラフである。
図22は、Aは、組換えOST311蛋白質または媒体をマウスに投与後1、3、8時間目における腎臓NaPi−7の発現をウェスタンブロッティングで確認した図である。Bは、同様の処置をした腎臓のトータルRNAを用い、NaPi−7の発現をノザンブロッティングで確認した図である。
図23は、組換えOST311蛋白質または媒体をマウスに投与後1、3、8時間目における血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3濃度の推移を表した図である。
図24は、組換えOST311蛋白質または媒体をマウスに投与後1、3、8時間目における腎臓のトータルRNAを用いて、25−ヒドロキシビタミンD−1−α−水酸化酵素(1αOHase)あるいは、25−ヒドロキシビタミンD−24−水酸化酵素(24OHase)遺伝子の発現をノザンブロッティングで確認した図である。
図25は、細胞移植後3日目での、CHO−ras clone−1細胞移植群における平均血清リン酸濃度値を100%とした場合の、各群における平均血清リン酸レベルを表した図である。
図26は、プラスミドOST311/pET28にコードされる組換え体His−OST311のDNA塩基配列とアミノ酸配列ならびにプラスミドpET22−MK−OST311にコードされる組換え体MK−OST311のDNA塩基配列とアミノ酸配列を示した図である。
図27は、リフォールディング後の組換え体His−OST311を陽イオン交換カラムSP−5PW(日本国、東ソー社)を用いてHPLC精製した際の溶出パターンを示した図である。
図28は、リフォールディング後の組換え体MK−OST311を陽イオン交換カラムSP−5PW(日本国、東ソー社)を用いてHPLC精製した際の溶出パターンを示した図である。
図29は、PEG化した組換え体MK−OST311を陽イオン交換カラムSP−5PW(日本国、東ソー社)を用いてHPLC精製した際の溶出パターンを示した図である。
図30は、大腸菌産生型His−OST311組換え体(A)またはPEG化MK−OST311組換え体(B)を単回投与してから8または9時間後における血清リン酸濃度を表した図である。
図31は、大腸菌産生型His−OST311組換え体を単回投与してから1および4時間後での腎臓におけるビタミンD代謝酵素遺伝子の発現変化をノザンブロッティング法で解析した結果を表す図である。
図32は、大腸菌産生型His−OST311組換え体を単回投与してから1、4および9時間後での血清1,25−ジヒドロキシビタミンD3の濃度変化を表す図である。
図33は、本図はOST311のアミノ酸174〜180番目に変異を導入し、その遺伝子をpEAK細胞で発現させたときの細胞上清に分泌される変異OST311組換え体をウェスタンブロッティングにて検出した図である。
Claims (2)
- 配列番号2または4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらの断片と反応する抗体を含む、ビタミンD抵抗性くる病の診断剤。
- ビタミンD抵抗性くる病が伴性染色体性低リン血症(XLH)である、請求項1に記載の診断剤。
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