WO2009133905A1 - ヒト線維芽細胞増殖因子23（ヒトfgf23)の作用を抑制するペプチドおよびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

ヒト線維芽細胞増殖因子23（ヒトfgf23)の作用を抑制するペプチドおよびそれを含む医薬組成物 Download PDF

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amino acid
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浦川到
山崎雄司
山下武美
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協和発酵キリン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide that suppresses the action of human fibroblast growth factor 23 (human FGF23).
  • Fibroblast growth factor was first purified from bovine pituitary gland as a substance that stimulates the growth of the fibroblast cell line NIH3T3. Since then, similar proteins have been identified from various tissues, and these groups of substances form a polypeptide family (FGF family). To date, 22 proteins have been identified in vertebrates as belonging to the FGF family. As biological activities of these proteins, not only fibroblast proliferation activity but also various effects such as proliferation of mesoderm and neuroectodermal and angiogenic action, limb bud formation in developmental stage are known. FGF also varies in its gene expression site and expression time, and is often expressed only at specific stages in the developmental stage or in adults.
  • FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4 genes are known as FGF receptor-encoding genes.
  • FGF receptor-encoding genes In FGFR1, FGFR2, and FGFR3, different receptor proteins have different extracellular domains due to differences in splicing. It is known to exist.
  • heparin and heparan sulfate proteoglycans regulate the action by interacting with FGF and FGF receptors.
  • many belong to the FGF family due to structural similarity, but their biological activity, receptor binding, etc. are hardly elucidated. Such features of the FGF family are summarized as a review (see Non-Patent Document 1).
  • the FGF23 gene (generally sometimes referred to as FGF-23) was first cloned from a mouse using a database search utilizing the homology with FGF15 and PCR, and further utilizing the sequence homology of mouse FGF23 The human FGF23 gene was cloned.
  • Human FGF23 protein which is the gene product of the human FGF23 gene, consists of a polypeptide of 251 amino acid residues. In addition, it is expected that the amino terminal side sequence up to the 24th as a secretory signal sequence is cleaved during secretion (see Non-Patent Document 2).
  • ADHR autosomal dominant hypophosphatemic rickets / osteomalacia
  • a missense mutation was characteristically found in the human FGF23 gene of ADHR patients (see Non-Patent Document 3). This finding strongly suggested the physiological significance of human FGF23 protein in vivo.
  • neoplastic osteomalacia which is one of hypophosphatemic Kur disease and osteomalacia, that determined the biological activity of human FGF23 protein. In this disease, it has been considered that the responsible tumor of the disease secretes and produces a humoral disease-causing factor, and the disease-causing agent acts to cause pathologies such as hypophosphatemia and osteomalacia.
  • X-linked hypophosphatemic rickets (hereinafter referred to as XLH) is known as a disease that has similar clinical findings to ADHR and neoplastic osteomalacia. It was shown that the human FGF23 protein concentration in the blood was high even in the pathological condition (see Non-Patent Documents 5 and 6).
  • human FGF23 protein is the secretory disease-causing factor of vitamin D-resistant clough disease and osteomalacia observed in tumor osteomalacia, XLH, etc., whose cause has been unknown so far.
  • high levels of human FGF23 protein in the blood and hypophosphatemia, rickets and osteomalacia also occur in other mineral metabolic diseases such as fibrous dysplasia, McCune-Albright syndrome, and autosomal recessive hypophosphatemic kulu disease. (See Non-Patent Documents 7 to 9).
  • Hyp mice which are XLH model mice with high serum human FGF23 protein concentration and hypophosphatemia, bone elongation disorder and calcification disorder
  • an increase in blood phosphorus concentration was observed in Hyp mice, and bone elongation disorder and calcification disorder were improved. From these results, it is considered that suppression of human FGF23 protein action leads to an effective treatment method in hypophosphatemic Kur disease and osteomalacia.
  • hypophosphatemic Kur disease / osteomalacia is characterized by a decrease in serum phosphorus concentration due to excessive excretion of phosphate from the urine, leading to bone mineralization disorders.
  • phosphoric acid is intermittently orally administered, and phosphorus that leaks from the kidneys is supplemented excessively.
  • the treatment method is not fundamentally efficient.
  • the administered phosphoric acid has a very short therapeutic effect, requires frequent administration several times a day, and the burden on the patient is large. Therefore, a drug that suppresses the action of the human FGF23 protein that causes hypophosphatemic Kur disease and osteomalacia has been desired as an effective treatment of the disease.
  • An object of the present invention is to provide a peptide comprising the amino acid sequence of a fragment peptide of the carboxy terminal region of human FGF23 protein (fragment consisting of amino acids 180 to 251 of human FGF23 protein (SEQ ID NO: 7)) or a peptide thereof
  • a pharmaceutical composition such as a therapeutic agent for a disease that can be prevented or treated by inhibiting the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor using a protein added with protein, polyethylene glycol, chemical substance, etc.
  • Another object of the present invention is to use the peptide of the present invention as a control substance to help search for a substance that inhibits the binding between human FGF23 protein and FGF23 receptor.
  • a peptide consisting of the carboxy-terminal region of human FGF23 protein has hypophosphatemia-inducing activity and phosphodiuretic-inducing activity similar to human FGF23 protein.
  • the present inventors diligently investigated the activity of the peptide of the present invention, and found that the peptide surprisingly inhibits the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor. Furthermore, it has a neutralizing activity that inhibits the action of human FGF23 protein and induces an increase in serum phosphorus and an increase in 1,25 (OH) 2 D, that is, an activity completely opposite to that of human FGF23 protein. Found to show.
  • the present inventors have still discovered low molecular weight compounds and peptides that inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor, which are controls for searching for substances that inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor. Therefore, if such substances and methods were invented, it was thought that the development of therapeutic agents for diseases that could be treated by inhibiting the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor would be accelerated. .
  • the present inventors have found that the peptide of the present invention serves as a control for searching for substances that inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor.
  • the present invention is as follows.
  • X 2 ProX 3 X 4 X 3 X 3 X 5 X 6
  • X 2 is aspartic acid or glutamic acid, three X 3 are independently valine, leucine or isoleucine, and X 4 is glycine , Alanine, asparagine or glutamine, X 5 is lysine or arginine, and X 6 is a peptide comprising an amino acid sequence represented by glycine, alanine or proline].
  • X 4 is glycine, alanine, asparagine or glutamine
  • X 5 is lysine or arginine
  • X 6 is a peptide having an amino acid sequence represented by glycine, alanine or proline].
  • X 1 X 2 ProX 3 X 4 X 3 X 3 X 5 [where X 1 is serine, threonine, arginine or lysine, X 2 is aspartic acid or glutamic acid, and three X 3 are independent Valine, leucine or isoleucine, X 4 is glycine, alanine, asparagine or glutamine, and X 5 is a peptide comprising an amino acid sequence represented by lysine or arginine].
  • X 3 is valine, leucine or isoleucine
  • X 4 is glycine, alanine, asparagine or glutamine
  • X 5 is a peptide having an amino acid sequence represented by lysine or arginine].
  • X 1 is serine, threonine, arginine or lysine
  • X 2 is aspartic acid or glutamic acid
  • X 3 is independently valine, leucine or isoleucine
  • X 4 is glycine, alanine, asparagine or glutamine
  • X 5 is lysine or arginine
  • X 6 is glycine, alanine or proline
  • X 7 is glycine. , Alanine, arginine or lysine].
  • Y 1 Asp Pro Leu Y 2 Val Y 3 Y 4 Y 5 Y 6 (SEQ ID NO: 32) [where Y 1 is serine, threonine, arginine or lysine, and Y 2 is glycine, alanine, asparagine or glutamine. Y 3 is valine, leucine or isoleucine, Y 4 is lysine or arginine, Y 5 is glycine, alanine or proline, and Y 6 is glycine, alanine, arginine or lysine.
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 15, 16, 17, 18, 22, 23, or 24.
  • a peptide comprising the peptide according to any one of [1] to [11], [13] and [15].
  • a peptide comprising the peptide according to any one of [12], [14] and [16].
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which Cys is added to the amino terminal side or the carboxy terminal side of the peptide according to any one of [1] to [33].
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which Cys is added to the amino terminal side and the carboxy terminal side of the peptide according to any one of [1] to [33].
  • a peptide comprising 2, 3, 4 or 5 peptides according to any one of [1] to [36].
  • the peptide according to any one of [1] to [38].
  • a protein selected from the group consisting of glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), human immunoglobulin Fc region, albumin, transferrin, haptoglobin and lipoprotein has been added [1]-[38] The peptide according to any one of the above.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of [1] to [40] as an active ingredient.
  • Neoplastic osteomalacia ADHR, XLH, fibrous dysplasia, McCune-Albright syndrome, autosomal recessive hypophosphatemia, hypophosphatemia, bone mineralization failure, bone pain, muscle weakness, skeletal deformity, growth Disability, low 1,25 (OH) 2 Demia, osteoporosis, Kru disease, hypercalcemia, hypocalcemia, ectopic calcification, osteosclerosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, parathyroid gland [41]
  • [44] A method for screening a substance that inhibits the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor using the test substance's ability to inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor as an index, and [1] The peptide according to any one of [40] to [40] is compared with the ability to inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor, and the inhibitory ability of the test substance according to any one of [1] to [40]
  • a method of screening for a substance that inhibits the binding between human FGF23 protein and FGF23 receptor comprising a step of selecting the substance as a substance capable of inhibiting the binding between human FGF23 protein and FGF23 receptor when it is equal to or larger than a peptide.
  • [45] A method for screening a substance that inhibits the action of human FGF23 protein using as an index the ability of the test substance to inhibit the action of human FGF23 protein, wherein the test substance and any of [1] to [40]
  • the described peptides are compared in their ability to suppress the action of human FGF23 protein, and the inhibitory ability of the test substance is equal to or greater than the peptide described in any one of [1] to [40]
  • human FGF23 protein A method for screening a substance that suppresses the action of human FGF23 protein, comprising a step of selecting as a substance capable of suppressing the action of FGF23.
  • [50] A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to [49] into a host cell.
  • the transformant according to [50] is cultured in a medium, the peptide according to any one of [1] to [35] is produced and accumulated in the medium, and the peptide is collected from the medium.
  • the method for producing a peptide according to any one of [1] to [35] is cultured in a medium, the peptide according to any one of [1] to [35] is produced and accumulated in the medium, and the peptide is collected from the medium.
  • the peptide of the present invention inhibits the binding between human FGF23 protein (hereinafter also referred to as FGF23) and FGF23 receptor.
  • FGF23 human FGF23 protein
  • FGF23 receptor FGF23 receptor
  • Such a peptide suppresses the action of human FGF23 protein and can be used for the prevention and treatment of diseases and disorders caused by the excessive action of human FGF23 protein.
  • the peptide of the present invention can be used as a control substance when screening for a substance that inhibits the binding between human FGF23 protein and FGF23 receptor.
  • the present invention is a peptide comprising the amino acid sequence of a fragment peptide of the carboxy terminal region of human FGF23 protein (fragment consisting of amino acids 180 to 251 of human FGF23 protein (SEQ ID NO: 7)). is there.
  • the fragment peptide in the carboxyl terminal region is sometimes referred to as a carboxy terminal fragment or a carboxy terminal fragment.
  • a peptide having all or part of the amino acid sequence of the carboxy-terminal fragment consisting of amino acids 180 to 251 of human FGF23 amino acid sequence (SEQ ID NO: 7), Peptides containing all or part of the amino acid sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal fragment of the protein, and the peptides described below, for example, are referred to as human FGF23C terminal peptides.
  • the human FGF23 C-terminal peptide of the present invention inhibits the binding between human FGF23 protein and FGF23 receptor.
  • examples of the FGF23 receptor include klotho and FGFR1 (IIIc), that is, a complex of klotho and FGFR1 (IIIc).
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention include peptides having 10, 11, 12, or 16 or more amino acid residues, and examples include peptides having 12 to 72 or 12 to 25 amino acid residues.
  • Examples of the human FGF23C terminal peptide of the present invention include peptides having the following amino acid sequences.
  • X 4 is glycine, alanine, asparagine or glutamine
  • X 5 is lysine or arginine
  • X 6 is glycine, alanine or proline
  • X 7 is glycine, alanine, arginine or lysine.
  • the three X 3 may be the same amino acid or different amino acids.
  • examples of the human FGF23C terminal peptide of the present invention include peptides having the following amino acid sequences.
  • examples of the human FGF23C terminal peptide of the present invention include peptides having the following amino acid sequences.
  • (Peptide F) A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3, 12, 15, 16, 17, 18, 22, 23 or 24.
  • examples of the human FGF23C terminal peptide of the present invention include peptides having the following amino acid sequences.
  • examples of the human FGF23C terminal peptide of the present invention include the following peptides.
  • the “peptide containing the peptide described in any of peptides A to G” means that the amino acid sequence of peptide A is included in the amino acid sequence of peptide H.
  • the peptide consists of, for example, at least 8, 10, 12, or 16 amino acids.
  • the peptide consists of amino acids of 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 or 20 residues or less, for example. Alternatively, for example, it consists of 12 to 72 residues, 12 to 25 residues, or 16 to 25 amino acids.
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention includes a peptide comprising an amino acid sequence represented by SDPLGVVRGG (SEQ ID NO: 2), and comprising a peptide consisting of at least 10, 11, 12, or 16 amino acids or more, Examples thereof include peptides having 12 to 72, 12 to 25, or 16 to 25 amino acid residues.
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention may be a partial peptide of the carboxy terminal region of human FGF23 protein consisting of a continuous partial sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal region of human FGF23, or the carboxy terminal of human FGF23 protein. It includes a continuous partial sequence of the amino acid sequence of the side region, with one or several (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9) amino acids added to both ends. May be. Examples of the amino acid to be added include Cys, and one in which one Cys is added to the amino terminal side and / or the carboxy terminal side of the continuous partial sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal region of human FGF23 protein. It can be illustrated.
  • the carrier can be bound to the FGF23C terminal peptide via the added Cys.
  • a peptide in which Cys is added to both the amino terminal side and the carboxy terminal side of the contiguous partial sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal region of human FGF23 protein forms a disulfide bond between the Cys at both ends to form a cyclic peptide.
  • the peptides of the present invention also include such cyclic peptides. In the present invention, these peptides are also called human FGF23C terminal peptides.
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention includes a peptide having an amino acid sequence represented by RDPRNVLKPR (SEQ ID NO: 3). Furthermore, a peptide comprising the above peptide, which is a peptide composed of at least 10, 11, 12, or 16 amino acids or more. Moreover, for example, peptides having 12 to 72, 12 to 25, or 16 to 25 amino acid residues can be mentioned.
  • Examples of the human FGF23C terminal peptide of the present invention include a peptide comprising the amino acid sequence of the 187th to 197th amino acid sequence of the human FGF23 protein represented by SEQ ID NO: 7, or a peptide comprising the amino acid sequence. Specifically, including the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a peptide consisting of 12 or more amino acids, a peptide consisting of 16 or more amino acids, 12 to 72 amino acid residues, amino acids Examples include peptides having 12 to 25 residues or 16 to 25 amino acid residues.
  • the human FGF23C end peptide of the present invention may be a partial peptide on the carboxy end side of the human FGF23 protein consisting of a continuous partial sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal side region of the human FGF23 protein, or the carboxy end of the human FGF23 protein. It may include a partial sequence that is a contiguous portion of the amino acid sequence of the side region, with one or several amino acids added to both ends. Examples of the amino acid to be added include Cys, and one in which one Cys is added to the amino terminal side and / or the carboxy terminal side of the continuous partial sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal region of human FGF23 protein. It can be illustrated.
  • the carrier can be bound to the FGF23C terminal peptide via the added Cys.
  • a peptide in which Cys is added to both the amino terminal side and the carboxy terminal side of the continuous partial sequence of the amino acid sequence of the carboxy terminal region of human FGF23 protein forms a disulfide bond between the Cys at both ends to form a cyclic peptide.
  • the peptides of the present invention also include such cyclic peptides. In the present invention, these peptides are also called human FGF23C terminal peptides.
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention is a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequences of the peptides A to F, Also included are peptides having the activity of inhibiting the binding of FGF23 receptor.
  • the fact that several amino acids are deleted, substituted and / or added means that a plurality of amino acids may be deleted, substituted or added simultaneously.
  • Deletion, substitution and / or addition of one or several amino acids means deletion, substitution and / or addition of 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2 amino acids.
  • a peptide when calculated using the amino acid sequence of the above peptide and BLAST etc. (for example, using default or default parameters), at least 50% or more, preferably 75% or more, more preferably Include peptides having 90% or more, particularly preferably 95% or more identity.
  • the peptides of the present invention include peptides containing 2, 3, 4 or 5 of the above peptides.
  • the phrase “containing 2, 3, 4 or 5 peptides” means that the amino acid sequence of the peptide contains 2, 3, 4 or 5 amino acid sequences of the above peptides.
  • Two, three, four or five peptides may be included consecutively or may be included separately.
  • the two, three, four or five peptides may be the same peptide or different peptides.
  • the 2, 3, 4 or 5 peptides may be included in a linked state.
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention includes, for example, polyethylene glycol (PEG), dextran, poly (N-vinyl-pyrrolidone), polypropylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol and the like. It may be modified by polymer bonding. As the modification method, any known method can be adopted, and for example, it is disclosed in detail in JP-T-10-510980.
  • a tag protein such as glutathione S transferase (GST) or maltose binding protein (MBP) may be bound to the amino terminus or carboxy terminus of the peptide of the present invention.
  • GST glutathione S transferase
  • MBP maltose binding protein
  • these proteins facilitate the purification of the human FGF23C end peptide of the present invention and increase blood stability.
  • the full-length or partial region of a protein present in human serum such as human immunoglobulin Fc region, albumin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein and the like is bound to the amino terminus or carboxy terminus of the human FGF23C terminal peptide of the present invention. May be.
  • a protein cleavage sequence and / or a linker sequence may be included between the protein and the FGF23C terminal peptide.
  • any polypeptide can be used as the linker.
  • the polypeptide for example, any polypeptide of 1 to 100 amino acids, preferably any polypeptide of 10 to 50 amino acids, more preferably any polypeptide of 10 to 30 amino acids can be used.
  • These proteins or peptides can increase the stability of the peptides of the present invention.
  • a human FGF23C end peptide added with a polymer or protein such as polyethylene glycol is referred to as a human FGF23C end peptide adduct (or simply a peptide adduct).
  • a plurality of human FGF23C terminal peptides of the present invention can be linked.
  • a polypeptide having improved blood stability or activity can be produced by linking a plurality of human FGF23C terminal peptides of the present invention.
  • the number to be linked may be any number that can improve blood stability by linking peptides or a number that can inhibit the binding of human FGF23 protein and its receptor, for example, 2 to 10, preferably 2 ⁇ 5, more preferably 2 or 3.
  • a linker can be used for linking each peptide. In this case, any polypeptide can be used as the linker.
  • polypeptide for example, any polypeptide of 1 to 100 amino acids, preferably any polypeptide of 10 to 50 amino acids, more preferably any polypeptide of 10 to 30 amino acids can be used.
  • the present invention encompasses such polypeptides.
  • the human FGF23C end peptide of the present invention can be prepared by synthesizing DNA encoding the same based on sequence information and expressing it in a suitable host. It can also be directly synthesized using a peptide synthesizer. It can also be prepared by digesting full-length human FGF23 protein with an appropriate enzyme. It can also be prepared by purifying the peptide of human FGF23 produced when the human FGF23 protein is expressed in, for example, animal cells or insect cells.
  • a peptide adduct to which polyethylene glycol or the like is bound can be produced by a known method, for example, a method described in JP-T-10-510980.
  • Peptide adducts to which proteins such as GST are bound can be prepared as a fusion protein by fusing the DNA encoding the protein to be added with the DNA encoding the human FGF23C end protein and expressing it in an appropriate host. .
  • a polypeptide in which human FGF23C end peptide is linked can be prepared by linking a plurality of DNAs encoding human FGF23C end peptide and expressing them in a suitable host as a fusion protein.
  • DNA encoding a protein cleaving enzyme sequence and / or DNA encoding a linker sequence may be connected as necessary.
  • the human FGF23C end peptide and human FGF23C end peptide adduct of the present invention inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor.
  • the peptide of the present invention and 125 I-labeled human FGF23 protein are added to a solution containing cells expressing Klotho protein which is a cofactor of the receptor for human FGF23 protein.
  • the amount of 125 I-labeled human FGF23 protein bound to cells is measured using a gamma counter (Nature, 444: 770-774, 2006).
  • the peptide of the present invention "inhibits the binding between human FGF23 protein and FGF23 receptor" means that 125 I-labeled human FGF23 protein bound to Klotho-expressing cells compared to PBS, which is a negative control in the system shown in Example 5. This means that the amount of radioactivity, that is, the radioactivity count is decreased. As shown in the Examples, the peptide of the present invention inhibits the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor, and consequently suppresses the action of human FGF23 protein. Examples of methods for detecting inhibitory activity include a system in which the peptide of the present invention is administered to a transgenic mouse expressing human FGF23 and the serum phosphorus concentration and serum 1,25 (OH) 2 D concentration are measured. .
  • compositions of the present invention are a pharmaceutical composition comprising the human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct of the present invention as defined above and a pharmaceutically acceptable carrier. .
  • “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners. , Flavoring agents, solubilizers or other additives.
  • a composition can be prepared. Liposomes, microcapsules or microspheres, encapsulated complexes or other types of carriers can also be used to administer the pharmaceutical composition of the invention.
  • compositions can be administered orally or parenterally.
  • Other forms for parenteral administration include topical solutions containing one or more active substances and prescribed by conventional methods, suppositories for enteric administration, pessaries, and the like.
  • the dose varies depending on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of active ingredient (such as the aforementioned polypeptide or antibody) contained in the pharmaceutical composition, etc.
  • the dose can be administered in the range of 10 ⁇ g to 1000 mg (or 10 ⁇ g to 500 mg) per adult. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required.
  • the peptide of the present invention is added at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml carrier to 10 mg / ml carrier in a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection. It can manufacture by melt
  • the thus-prepared injection is administered to a human patient in need of treatment at a rate of 1 ⁇ g to 100 mg per kg body weight in a single administration, preferably at a rate of 50 ⁇ g to 50 mg per day. Can be administered several times to several times. Examples of administration forms include medically suitable administration forms such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. Intravenous injection is preferred.
  • injections can be prepared as non-aqueous diluents (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions or emulsions. .
  • non-aqueous diluents for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.
  • Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation.
  • the injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvents before use.
  • neoplastic osteomalacia ADHR, XLH, fibrous dysplasia, McCune-Albright, which have been shown to have excessive effects of human FGF23 protein.
  • diseases associated with abnormal mineral metabolism such as syndrome and autosomal recessive hypophosphatemia.
  • osteoporosis is controlled by the peptide of the present invention by controlling the regulation of calcium metabolism through the regulation of phosphorus metabolism and vitamin D metabolism of human FGF23 protein, Kuru disease (including hypophosphatemic Kuru disease, vitamin D-resistant Kuru disease), hypercalcemia, hypocalcemia, ectopic calcification, osteosclerosis, Paget's disease, hyperparathyroidism, It can be used therapeutically and prophylactically for diseases caused by abnormalities in mineral metabolism and vitamin D metabolism such as hypoparathyroidism and pruritus.
  • Kuru disease including hypophosphatemic Kuru disease, vitamin D-resistant Kuru disease
  • hypercalcemia hypocalcemia
  • hypocalcemia ectopic calcification
  • osteosclerosis Paget's disease
  • hyperparathyroidism hyperparathyroidism
  • renal failure such as renal osteodystrophy, dialysis osteopathy, tubular dysfunction, etc. It can also be used therapeutically and prophylactically for diseases associated with dialysis.
  • 1,25 (OH) 2 D has been reported not only for the above-described mineral metabolism such as calcium, but also for cell growth inhibitory ability, cell differentiation promoting ability, etc. ) by 2 D it can be used therapeutically and prophylactically against disease caused by cell under the control of such proliferation and differentiation.
  • the present invention includes a prophylactic or therapeutic agent for the above diseases or disorders comprising human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct as an active ingredient.
  • the present invention also includes a method for preventing or treating the above-mentioned disease or disorder, comprising administering human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct to a patient.
  • the present invention includes the use of human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct for the manufacture of a medicament for preventing or treating the above-mentioned diseases or disorders.
  • the present invention includes human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct which can be used for the prevention or treatment of the above-mentioned diseases or disorders.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises an effective amount of a peptide of the invention and a pharmaceutically acceptable diluent, preservative, solubilizer, emulsifier, adjuvant and / or carrier.
  • a pharmaceutically acceptable diluent eg, Tris-HCl, acetate, phosphate
  • an additive eg, detergent such as Tween 80, polysorbate 80.
  • solubilizers eg, ascorbic acid, sodium metabisulfite
  • preservatives eg, timmersol, benzyl alcohol
  • bulking agents eg, lactose, mannitol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise other pharmaceutically acceptable pharmaceutical vehicles, liquids that function as excipients or vehicles, or semi-solid or solid diluents. These include, but are not limited to, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, magnesium stearate, methyl- or propyl-hydroxybenzoate, starch, sucrose, dextrose, acacia gum, calcium phosphate, mineral oil, cocoa butter and cocoa oil. Not.
  • compositions of the invention can affect the physical state, stability, in vivo release rate and in vivo clearance rate of the peptide of the invention. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, p.1435-1712, Mack Publishing Co. (1990), located in Easton, PA, which is incorporated herein by reference.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be manufactured in liquid form, may be a dry powder (eg, lyophilized form), or may be an implantable sustained release formulation such as a subcutaneous formulation. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for example intravenous, intradermal, intramuscular, intramammary, intraperitoneal, intrathecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonary (eg aerosolized drug) or (for prolonged release)
  • subcutaneous injection including cumulative administration
  • injection including surgical implantation such as implantation in the subsplenic, subcerebral or cornea, orally, nasally, transdermally or It can be administered in other dosage forms.
  • liposomes, microcapsules or microspheres, encapsulated complexes or other types of carriers can be used for administration of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • human FGF23C end peptide and human FGF23C end peptide adduct of the present invention inhibit the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor. It can be used as a control substance when screening a substance. Examples of screening methods, for example, human FGF23 protein receptor cofactor in a Klotho protein human FGF23 was labeled 125 I to cells expressing a protein (hereinafter referred to as 125 I labeled FGF23) by binding, binding There is a system for measuring the amount of 125 I-labeled FGF23 using a gamma counter.
  • Other systems for measuring the binding between human FGF23 protein and Klotho-expressing cells include the use of human FGF23 protein labeled with lanthanoids typified by europium such as DELFIA and LANCE (Perkin Elmer, USA). And a system for detecting human FGF23 protein bound on the cell surface using a flow cytometer using an anti-human FGF23 antibody. Furthermore, for example, a method of measuring the amount of coprecipitated protein by performing an immunoprecipitation experiment using an anti-Klotho antibody and an anti-human FGF23 antibody to bind the protein in the extracellular region of the Klotho protein and the human FGF23 protein.
  • cells expressing Klotho are downstream of MAP kinases such as Early growth response gene-1 and Fos.
  • a system that measures the increase in luciferase activity due to stimulation of human FGF23 protein by introducing a reporter gene in which the promoter region of the gene whose expression is increased is linked to the luciferase gene, and phosphorylation of ERK1 / 2 in Klotho-expressing cells Examples include a system (Nature, 444: 770-774, 2006) that detects enhancement by Western blotting using an anti-phosphorylated ERK1 / 2 antibody.
  • human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct of the present invention As a control in these systems, it becomes possible to search for substances that suppress the action of the human FGF23 protein. Furthermore, by administering the human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct of the present invention to animals such as mice and rats, it can be used as a control for testing substances that suppress the action of human FGF23 protein.
  • the present invention further includes a kit for screening a substance that inhibits the binding of human FGF23 protein and FGF23 receptor, or a substance that suppresses the action of human FGF23 protein.
  • the kit contains the human FGF23C end peptide or human FGF23C end peptide adduct of the present invention as a control, and further includes a labeled human FGF23 protein and the like.
  • Example 1 Preparation of recombinant human FGF23 protein expression vector
  • Construction of human FGF23 protein expression vector The cDNA encoding human FGF23 protein is based on the human cDNA library of the tumor responsible for neoplastic osteomalacia as a template, F1EcoRI primer (SEQ ID NO: 4) and LHisNot primer (SEQ ID NO: 5).
  • F1EcoRI primer SEQ ID NO: 4
  • LHisNot primer SEQ ID NO: 5
  • the F1EcoRI primer anneals to a sequence further 5 'upstream of the base sequence encoding human FGF23 protein, and adds an EcoRI restriction enzyme site to the 5' side of the region encoding human FGF23 protein of the amplified fragment.
  • the LHisNot primer is a sequence that anneals to the 5'-end sequence of the sequence encoding the human FGF23 protein and the His6-tag sequence (His-His-His-His-His-His-His) (SEQ ID NO: 1). Followed by a stop codon and a NotI restriction enzyme sequence.
  • the amplified fragment encodes a human FGF23 protein having a His6-tag sequence added to the carboxy terminus, and has a NotI restriction enzyme site downstream thereof.
  • This amplified fragment was digested with EcoRI and NotI and ligated with pcDNA3.1Zeo (Invitrogen) which is an animal cell expression vector similarly digested with EcoRI and NotI.
  • the expression vector thus prepared was cloned, the nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that it encoded the human FGF23 protein to which the target His6-tag sequence was added. This vector is referred to as pcDNA / hFGF23H.
  • F1EcoRI CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG (SEQ ID NO: 4)
  • LHisNot ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA (SEQ ID NO: 5)
  • F1EcoRI primer, LNot primer (SEQ ID NO: 6) and LA-Taq DNA polymerase were incubated at 94 ° C for 1 minute, then at 94 ° C for 30 seconds. Amplification was carried out by carrying out 25 cycles of PCR, with a cycle consisting of 30 seconds at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C.
  • the fragment encoding human FGF23 protein was purified by digestion with EcoRI and NotI. This is applied to the EcoRI and NotI restriction enzyme sites of the pEAK8 / IRES / EGFP vector in which the intramolecular ribosome entry sequence (IRES) and enhanced green fluorescent protein (EGFP) are linked to the animal cell expression vector pEAK8 (Edge Biosystem). Inserted and cloned. The nucleotide sequence of the obtained plasmid was determined and confirmed to encode human FGF23 protein. This vector is called pEAK8 / IRES / EGFP / hFGF23.
  • IRES intramolecular ribosome entry sequence
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • the cells were cultured in a MEM ⁇ medium (Gibco BRL) containing 10% FCS for 24 hours, and then Zeocin (Invitrogen) was added to a final concentration of 0.5 mg / ml and cultured for 1 week. Cells that adhered and proliferated were released with trypsin and cloned by limiting dilution in the presence of Zeocin at a final concentration of 0.3 mg / ml to obtain a plurality of cloned cells. Among these cells, the cell that best expresses human FGF23 protein was identified by Western blotting.
  • CHO-OST311H is referred to as CHO-hFGF23H.
  • the pEAK8 / IRES / EGFP / hFGF23 vector was introduced into CHO Ras clone-1 cells by a gene introduction method using membrane fusion lipid.
  • CHO Ras clone-1 cells are cultured on a 6-well plate so that the cells cover about 60% of the bottom surface. Then, the culture solution is removed, and 1 ml of MEM ⁇ culture solution without serum is added. Mix 2.5 ⁇ g of the vector to be introduced and 10 ⁇ l of Transfectam (registered trademark) (Promega) with 50 ⁇ l of MEM ⁇ medium without serum, mix both, and let stand for 10 minutes. It added to the 6-well plate prepared beforehand.
  • CHO-hFGF23 After culturing for 2 hours, the culture medium containing this DNA was removed and replaced with a culture medium containing 10% FCS and cultured overnight. The next day, Puromycin (Sigma) was added so that the final concentration was 5 ⁇ g / ml, and drug resistant cells were selected. The drug resistant cells thus obtained were cloned by the limiting dilution method. Furthermore, a cell line that best expresses the protein of interest was obtained by Western blot. This cell is referred to as CHO-hFGF23.
  • the amino acid sequence from the 180th position of SEQ ID NO: 7 was confirmed from the band having a small molecular weight, and was found to be a carboxy-terminal fragment generated by cleavage between the 179th and 180th positions.
  • the presence of a polypeptide (amino terminal side fragment) that is considered to have the amino terminal side sequence from the 179th position was also observed ( International Publication No. WO02 / 14504 pamphlet).
  • the synthesized peptide was purified by reverse phase HPLC so that the final purification purity was 95% or more.
  • the purified peptide was subjected to molecular weight confirmation using matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF / MS Voyager-DE TM STR, Applied Biosystems, USA).
  • cyclic peptide of SEQ ID NO: 24 a linear peptide having cysteine residues introduced at both ends was synthesized and purified, and then a disulfide bond was formed in a solution at pH 8.0 to cyclize. Using MALDI-TOF / MS, the molecular weight was reduced by 2 before and after the cyclization, thereby confirming the cyclization within the same molecule.
  • the purified lyophilized peptide was dissolved in PBS so as to be 1 mg / mL, and then diluted so as to have the described solvent and concentration.
  • the GST-human FGF23C terminal peptide (180-251) expression vector prepared in Example 4- (1) was transformed into E. coli BL21. Transformation was carried out according to the manual attached to the strain (Takara Bio Inc., Japan). E. coli selected with ampicillin-containing LB medium was cultured overnight in 1 mL of ampicillin-containing LB medium, the entire amount was added to 100 mL of ampicillin-containing LB medium, and cultured at 37 ° C. for 3 hours. After adding 0.5 mM IPTG, the cells were cultured at 28 ° C. for 4 hours, and the cells were collected by centrifugation.
  • Escherichia coli was suspended in PBS in which complete (Roche, Switzerland) was dissolved, and the cells were disrupted by ultrasonic waves.
  • the GST-human FGF23C terminal peptide (180-251) was purified from the supernatant of the cell disruption solution using Glutathione Sepharose 4B (Amersham, USA) according to the attached document. GST for control was also obtained in the same manner using pGEX-6P-1 (Amersham, USA).
  • the sequence of the obtained GST-human FGF23C terminal peptide (180-251) is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the 1st M to 220th D is a GST sequence
  • the 221nd L to 228th P is a protein cleavage sequence for cleaving GST and the FGF23C terminal peptide
  • From the 229th L to the 234th F is the linker sequence
  • From the 235th S to the 306th I is the sequence of the FGF23C terminal peptide.
  • protein cleavage sequences and linker sequences are indicated by underlined parts.
  • the human FGF23 protein (SEQ ID NO: 7) prepared in Example 2 was transferred to Iodine-125 radionuclide (Perkin Elmer, USA) using IODO-GEN (registered trademark) Pre-Coated Iodination Tubes (PIERCE, USA) according to the attached manual.
  • 125 I label In order to remove unreacted 125 I, separation was performed with PBS containing 1% bovine serum albumin using a PD-10 column (GE Life Science, USA) to obtain 125 I-labeled FGF23. The concentration of the 125 I-labeled FGF23 obtained was measured using an FGF23 measurement ELISA kit (Kainos, Japan) according to the attached manual. The radioactivity of 125 I-labeled FGF23 was measured using a COBRA gamma counter (Perkin Elmer, USA).
  • the primer of SEQ ID NO: 28 is a primer starting from the first base portion of the human Klotho gene sequence, and further contains a sequence homologous to the pDNR-CMV vector (Clontech, USA).
  • the primer of SEQ ID NO: 29 is a primer containing up to the stop codon of the human Klotho gene sequence and contains a sequence homologous to the pDNR-CMV vector.
  • a human kidney cDNA library (Clontech, USA) was used as a template.
  • PCR reaction was performed using PrimeSTAR (registered trademark) HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Japan) according to the attached manual.
  • the amplified product by PCR was subjected to electrophoresis on an agarose gel, and the band portion was excised from the gel.
  • Extraction of amplification products from the gel was performed using the MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, USA).
  • the expression vector was introduced into the pDNR-CMV vector using an In-Fusion PCR cloning kit (Clontech, USA) according to the attached document.
  • the human Klotho gene on the human Klotho-pDNR-CMV vector was transferred to the pLP-IRESneo vector.
  • Vector transfer was performed using Cre recombinase (Clontech, USA) according to the attached manual.
  • the human Klotho-pLP-IRESneo vector thus prepared was transfected into HEK293 cells using TransIT LT1 (Takara Bio Inc., Japan), and Geneticine (Invitrogen, USA) was added at a concentration of 1 mg / mL.
  • Cells with high expression level of human Klotho were selected from the grown clones by Western blotting using anti-human Klotho antibody as the primary antibody.
  • Example 5- (3) Evaluation of inhibitory action of human FGF23C terminal peptide on binding of human FGF23 protein to Klotho-expressing cells
  • the binding assay of human FGF23 protein to human Klotho-expressing cells was performed as follows.
  • the human Klotho-expressing HEK293 cells prepared in Example 5- (2) are suspended in DF medium containing 0.25% BSA and 0.02% NaN 3, and about 50,000 cells are added per well to Multiscreen BV (Millipore, USA) did.
  • the human FGF23C end peptide of SEQ ID NOs: 8 to 24 and the human FGF23 protein of SEQ ID NO: 7 (positive control) were added at the concentrations shown in FIG. 1, and the 125 I-labeled FGF23 protein prepared in Example 5- (1) was finally added.
  • EGR-1 Promoter Luciferase 6- Assay with Human Klotho-Expressing PEAK Cells Using EGR-1 Promoter Luciferase 6- (1) Preparation of EGR-1 Promoter Reporter Gene Cloning of the mouse EGR-1 promoter portion was performed by PCR. Primers were prepared as follows based on literature (Barbara, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vpl. 85, pp. 7857-7861).
  • EGR-1proFW GGGGTACCAACAGATCCTGGCGGGGACTTAGGAC (SEQ ID NO: 30)
  • EGR-1proRV CCCAAGCTTTCGCGACTCCCCGAATCGGCCTCTATT (SEQ ID NO: 31)
  • the primer of SEQ ID NO: 30 is a primer starting from the ⁇ 1023 base portion of the mouse EGR-1 promoter portion, and a KpnI site is further added.
  • the primer of SEQ ID NO: 31 is a primer including the mouse EGR-1 mRNA start site (+1) and has a HindIII site added thereto. Mouse genomic DNA (Clontech, USA) was used as a template.
  • the PCR reaction was performed using LA Taq GC Buffer (Takara Shuzo, Japan) according to the attached manual. PCR reaction conditions were 94 ° C for 5 minutes with primary denaturation, followed by 30 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute, and finally extension reaction at 72 ° C for 7 minutes. It was.
  • the amplification product by PCR was confirmed by electrophoresis on a 2% agarose gel. As a result, a single band was confirmed in the vicinity of about 1 kbp, so the band was excised from the gel and purified with the GeneClean kit (Bio 101, USA). Then, cleavage was performed with HindIII and KpnI.
  • the cells were detached with PBS containing 0.53 mM EDTA and seeded on a white 96-well plate (Corning, USA). After culturing for 24 hours, human FGF23 protein was added at 10 ng / ml, and heparin (Sigma, USA) was also added at 10 ⁇ g / ml at the same time. Furthermore, after leaving still at 37 degreeC for 24 hours, Luciferase activity was measured according to the protocol using Steady-Glo Luciferase assay system (US Promega). The measurement was performed using TopCount (Packard, USA).
  • Example 7 Inhibition of human FGF23 protein action of GST-human FGF23C end peptide (180-251)
  • In vitro FGF23 activity constructed in Example 6 on the effect of GST-human FGF23C end peptide (180-251) on the action of human FGF23 protein The measurement system was used.
  • GST-human FGF23C end peptide (180-251) was added at the concentration shown in FIG. 3 at the same timing as the addition of human FGF23 protein in the assay of Example 6.
  • the GST-human FGF23C terminal peptide (180-251) prepared in Example 4 was applied to normal mice. The following experiment was conducted to examine the impact. Normal mice (BALB / c, male, 6 weeks old) were randomly divided into 3 groups each consisting of 5 animals, and as shown in FIG. was administered at a dose of 1.2 mg / ml GST-human FGF23C terminal peptide (180-251), and 1.2 mg / ml GST was administered as a control to the third group once in the tail vein.
  • the obtained results are shown in FIG.
  • the measured values are expressed as the mean value +/- standard deviation in each group.
  • the group given * indicates a group showing p ⁇ 0.01 with respect to both the vehicle (PBS) administration group and the GST administration group as a result of performing a significant difference test by student's-t.
  • FIG. 4 in mice administered with GST-human FGF23C end peptide (180-251), significant increases in serum phosphorus and serum 1,25 (OH) 2 D were confirmed.
  • composition containing a human FGF23C terminal peptide represented by a carboxy terminal fragment (180-251) of human FGF23 protein suppresses the action of human FGF23 protein in vivo, and serum phosphorus, 1,25 (OH ) is possible to increase the 2 D indicated.
  • Example 9 Serum Phosphorus and 1,25 (OH) 2 D Elevating Action of Human FGF23C End Peptide
  • human FGF23C terminal peptide prepared in Example 3, or eg polyethylene glycol, dextran, poly (N-vinyl-pyrrolidone), polypropylene glycol homopolymer
  • a human FGF23C terminal peptide modified by appropriately selecting a tag protein such as a polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, glutathione S-transferase (GST), or maltose-binding protein (MBP) can be administered.
  • a tag protein such as a polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, glutathione S-transferase (GST), or maltose-binding protein (MBP)
  • the human FGF23C terminal peptide containing either SEQ ID NO: 2 or 3, the human FGF23C terminal peptide of SEQ ID NOs: 9 to 24, or any known method for these human FGF23C terminal peptides for example, a special table
  • polyethylene glycol, dextran, poly (N-vinyl-pyrrolidone), polypropylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl by the modification method disclosed in detail in JP-A-10-510980 Peptides modified by appropriately selecting tag proteins such as alcohol, glutathione S-transferase (GST), maltose-binding protein (MBP) and the like can be administered.
  • tag proteins such as alcohol, glutathione S-transferase (GST), maltose-binding protein (MBP) and the like
  • the human FGF23C terminal peptide having human FGF23 protein inhibitory action shown in Example 6 such as SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24, or the human FGF23 protein shown in Example 6
  • a human FGF23C terminal peptide having an inhibitory action for example, SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24
  • a peptide modified with, for example, polyethylene glycol serum phosphorus and serum 1,25
  • serum phosphorus and serum 1,25 A significant increase in OH) 2 D can be confirmed. From these facts, it can be shown that modified products such as human FGF23C terminal peptide or its adducts suppress the action of human FGF23 protein in vivo and raise serum phosphorus and 1,25 (OH) 2 D .
  • the human FGF23C terminal peptide of the present invention can be used in the prevention and treatment of diseases and disorders caused by excessive action of human FGF23 protein, and is useful in the medical field. Furthermore, it can be used as a control substance when screening a substance that suppresses the action of human FGF23 protein, and can contribute to the development of medicine.

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Abstract

　ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制することにより予防または治療が可能な疾患に対する治療または予防のための医薬品組成物の提供。 　Ｘ1Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6Ｘ7[ここで、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、３つのＸ3は独立にバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。

Description

ヒト線維芽細胞増殖因子23（ヒトFGF23)の作用を抑制するペプチドおよびそれを含む医薬組成物
　本発明は、ヒト線維芽細胞増殖因子23（ヒトFGF23)の作用を抑制するペプチドに関する。
　線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factor）は、最初に線維芽細胞株NIH3T3の増殖を刺激する物質としてウシの下垂体より精製された。以降、種々の組織より類似のタンパク質が同定されており、それら一群の物質はポリペプチドファミリー（FGFファミリー）を形成している。現在までのところ、FGFファミリーに属するものとして脊椎動物において22種のタンパク質が同定されている。これらのタンパク質の生物活性としては、線維芽細胞増殖活性だけでなく中胚葉や神経外胚葉の増殖や血管新生作用、発生段階における肢芽形成など多岐にわたる作用が知られている。FGFはその遺伝子の発現部位、発現時期についても多様であり、発生段階や成人における特定部位においてのみ発現しているというものも多い。FGFの受容体をコードする遺伝子としてはFGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4の少なくとも４種が知られており、またFGFR1、FGFR2、FGFR3においてはスプライシングの違いにより細胞外ドメインの異なる受容体タンパク質がそれぞれにおいて存在することが知られている。また、ヘパリンやヘパラン硫酸プロテオグリカンがFGFやFGF受容体と相互作用することにより作用を調節することが知られている。また、構造的類似性よりFGFファミリーに属するが、その生物活性や受容体結合性等について、ほとんど解明されていないものも多い。このようなFGFファミリーの特徴については、総説としてまとめられている（非特許文献１を参照）。
　FGF23遺伝子（一般的にFGF-23と表されることもある）は、FGF15との相同性を利用したデータベース検索とPCR法にて最初にマウスよりクローニングされ、さらにマウスFGF23の配列相同性を利用してヒトFGF23遺伝子がクローニングされた。ヒトFGF23遺伝子の遺伝子産物であるヒトFGF23タンパク質は251アミノ酸残基のポリペプチドからなる。また、分泌シグナル配列として24番目までのアミノ末端側配列が分泌時に切断されることが予想されている（非特許文献２を参照）。続いて常染色体優性低リン血症性クル病・骨軟化症（Autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalacia：以下ADHRという）の研究において、ADHR患者における変異遺伝子領域を絞り込み、責任遺伝子の同定を進めるなかで、ADHR患者のヒトFGF23の遺伝子にミスセンス変異が特徴的に見出された（非特許文献３を参照）。この発見により生体内におけるヒトFGF23タンパク質の生理的重要性が強く示唆された。一方、ヒトFGF23タンパク質の生物活性を決定づけたのは低リン血症性クル病、骨軟化症のひとつである腫瘍性骨軟化症の研究であった。この疾患では、疾患の責任腫瘍が液性の疾患惹起因子を分泌産生し、この疾患惹起因子の作用により低リン血症、骨軟化症等の病態に陥ることが考えられていた。
　この責任腫瘍が産生する疾患惹起因子の探索において、腫瘍に高発現する遺伝子としてヒトFGF23遺伝子がクローニングされ、さらにこの因子を投与することにより、低リン血症や骨軟化症が再現されることが示された（非特許文献４および特許文献１を参照）。この研究により、ヒトFGF23タンパク質が生体内のリンやカルシウムに関連する代謝調節に関わることが示されるとともに、生体内を循環して作用を発現する全身性因子として作用することが示唆された。さらにその後の研究において、実際に腫瘍性骨軟化症患者血中のヒトFGF23タンパク質濃度が健常人に比較して高値であることも示された（非特許文献５および６を参照）。
　また、ADHRや腫瘍性骨軟化症と臨床的所見において類似した様態を呈する疾患としてX染色体連鎖低リン血症性クル病（X-linked hypophosphatemic rickets、以下XLHという）が知られているが、この病態においても血中のヒトFGF23タンパク質濃度は高値となっていることが示された（非特許文献５および６を参照）。
　すなわちこれまで原因不明であった腫瘍性骨軟化症、XLHなどで観察されるビタミンD抵抗性クル病・骨軟化症の分泌性の疾患原因因子がヒトFGF23タンパク質であるということが示された。さらに、fibrous dysplasia 、McCune-Albright syndrome、常染色体劣性低リン血症性クル病など他のミネラル代謝性疾患においても血中のヒトFGF23タンパク質濃度の高値と低リン血症やクル病・骨軟化症との関係が報告されている（非特許文献７～９を参照）。
　以上の報告により、生体内のヒトFGF23タンパク質過剰状態は低リン血症やそれに伴うクル病・骨軟化症などを誘導することが示された。さらに慢性腎不全高リン血症においても血清ヒトFGF23タンパク質の異常高値が報告されており、過剰なヒトFGF23タンパク質が腎不全時におけるミネラル代謝性疾患などの一部に関わっている可能性も示唆されている（非特許文献１０および１１を参照）。
　これらのヒトFGF23タンパク質の過剰が原因となり誘導される疾患において、ヒトFGF23タンパク質作用の抑制あるいはヒトFGF23タンパク質の除去が疾患の治療方法となりうることが考えられる。これまでに、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制するものとして、抗FGF23マウスモノクローナル抗体の報告がある（特許文献２を参照）。この報告において使用されている抗FGF23マウスモノクローナル抗体2C3Bおよび3C1Eは正常マウスに投与すると内在性のマウスFGF23の機能を阻害し、腎からのリン排泄を抑制し、腎におけるビタミンD代謝酵素の発現を変動させることにより、結果的に血清中のリン濃度および1α, 25-ジヒドロキシビタミンD（以下1,25(OH)2Dという）濃度を上昇させることが示されている。さらに、血清中のヒトFGF23タンパク質濃度が高値であり、かつ低リン血症と骨の伸長障害や石灰化障害を呈するXLHのモデルマウスであるHypマウスへの抗ヒトFGF23マウスモノクローナル抗体の反復投与を行った結果、Hypマウスにおいて血中リン濃度の上昇を認め、かつ骨の伸長障害と石灰化障害が改善された。これらの結果から低リン血症性クル病・骨軟化症において、ヒトFGF23タンパク質作用を抑制することが有効な治療法につながることが考えられる。
　上記のように、ヒトFGF23タンパク質と低リン血症性クル病・骨軟化症とは関連が明らかとなりつつある。低リン血症性クル病・骨軟化症は尿からのリン酸の過剰な排出により、血清中のリン濃度が低下し、骨の石灰化障害が誘発されることが特徴であるが、現状の治療においては、ビタミンD製剤に加え、リン酸を間歇的に経口投与し、腎臓から漏出していくリンを過剰に補充するといった方法が取られている。また、治療に使われるビタミンD製剤やリン酸そのものがFGF23の産生・分泌をさらに上昇させる因子であることから、その治療方法は根本的・効率的とはいえない。また投与するリン酸は治療効果が非常に短く、一日数度という頻回の投与が必要とされ、患者の負担も大きい。そのため、低リン血症性クル病・骨軟化症の原因となっているヒトFGF23タンパク質の作用を抑制するような薬剤が疾患の効果的治療を実現するものとして望まれていた。
　このようなヒトFGF23タンパク質の作用を抑制するような物質等を検索するためのコントロールとなるヒトFGF23タンパク質の機能を抑制する低分子化合物やペプチドはいまだ発見されていない。これまでに、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端断片（ヒトFGF23タンパク質のアミノ酸配列の第180番目から251番目のアミノ酸からなる断片）由来のペプチドはヒトFGF23タンパク質と同様の低リン血症誘導活性やリン利尿誘導活性を持つことが報告されている（非特許文献１２参照）。しかし、その他の活性についての報告はない。
国際公開第WO02/14504号パンフレット 国際公開第WO03/057733号パンフレット 欧州特許出願公開第120694号明細書 欧州特許出願公開第125023号明細書 英国特許第GB2188638A号明細書 米国特許第5585089号明細書 Ornitz, D. et al., Genome biology, 2: 3005.1-3005.12, 2001 Yamashita, T. et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 277: 494-498, 2000 White, K.E. et al., Nature Genet., 26: 345-348, 2000 Shimada, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98:6500-6505, 2001 Yamazaki, Y. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.,87:4957-4960, 2002. Jonsson, K.B., et al., N. Engl. J. Med.,348:1656-1663, 2003 Riminucci, M. et al., J. Clin. Invest.,112:683-692,2003 Yamamoto, T. et al., J. Bone Miner. Metab. ,23:231-237, 2005 Lorenz-Depiereux, B. et al., Nat. Genet., 38:1248-1250, 2006 Gupta, A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 89:4489-4492, 2004 Larsson, T. et al., Kidney Int., 64:2272-2279, 2003 Berndt, T. et al., Pflugers Arch., 454:615-623 2007
　本発明の目的は、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域（ヒトFGF23タンパク質（配列番号７）の第180番目のアミノ酸から251番目のアミノ酸からなる断片）の断片ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドまたはそのペプチドにタンパク質、ポリエチレングリコール、化学物質などを付加させたものを用いて、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害することにより予防または治療が可能な疾患に対する治療剤などの医薬品組成物を提供することにある。また、本発明のペプチドをコントロール物質として用いてヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質の探索に役立てることにある。
　上記のように、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域からなるペプチドは、ヒトFGF23タンパク質と同様の低リン血症誘導活性やリン利尿誘導活性を持つことが報告されていた。しかし、その他の活性についての報告はない。本発明者等は、本発明のペプチドの活性について鋭意検討し、そのペプチドが驚くべきことにヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害することを見出した。そして、更にヒトFGF23タンパク質の作用を阻害する中和活性を有し、血清リンの上昇および1,25(OH)2Dの上昇を誘導すること、すなわち、ヒトFGF23タンパク質とは全く逆の活性を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質等を検索するためのコントロールとなるヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する低分子化合物やペプチドはいまだ発見されていないことから、このような物質と方法が発明されれば、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害することにより治療が可能となる疾患の治療薬の開発が加速されると考えた。本発明者等は、本発明のペプチドがヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質等を検索するためのコントロールとなることを見出した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1]　ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6Ｘ7[ここで、３つのＸ3は独立にバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[2]　(a) Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号３３）、(b)Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg Gly Gly（配列番号３４）、(c)Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg Gly Gly（配列番号３５）、(d)Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg Gly Gly（配列番号３６）、(e)Pro Leu Gly Val Val Ｘ5 Gly Gly（配列番号３７）、(f)Pro Leu Gly Val Val Arg Ｘ6 Gly（配列番号３８）または(g)Pro Leu Gly Val Val Arg GlyＸ7（配列番号３９）[ここで、Ｘ3はバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[3]　Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6[ここで、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、３つのＸ3は独立にバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[4]　(a)Ｘ2 Pro Leu Gly Val Val Arg Gly（配列番号４０）、(b)Asp Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg Gly（配列番号４１）、(c)Asp Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg Gly（配列番号４２）、(d)Asp Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg Gly（配列番号４３）、(e)Asp Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg Gly（配列番号４４）、(f)Asp Pro Leu Gly Val Val Ｘ5 Gly（配列番号４５）または(g)Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Ｘ6（配列番号４６）[ここで、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ3はバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[5]　Ｘ1Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5[ここで、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、３つのＸ3は独立にバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[6]　(a) Ｘ1 Asp Pro Leu Gly Val Val Arg（配列番号４７）、(b) Ser Ｘ2 Pro Leu Gly Val Val Arg（配列番号４８）、(c) Ser Asp Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg（配列番号４９）、(d) Ser Asp Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg（配列番号５０）、(e) Ser Asp Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg（配列番号５１）、(f) Ser Asp Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg（配列番号５２）または(g) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Ｘ5（配列番号５３）[ここで、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ3はバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[7]　Ｘ1Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6Ｘ7[ここで、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、３つのＸ3は独立にバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[8]　(a) Ｘ1 Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号５４）、(b) Ser Ｘ2 Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号５５）、(c) Ser Asp Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号５６）、(d) Ser Asp Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg Gly Gly（配列番号５７）、(e) Ser Asp Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg Gly Gly（配列番号５８）、(f) Ser Asp Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg Gly Gly（配列番号５９）、(g) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Ｘ5 Gly Gly（配列番号６０）、(h) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Ｘ6 Gly（配列番号６１）、または(i) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Ｘ7（配列番号６２）[ここで、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘ3はバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[9]　Ｙ1Asp Pro LeuＹ2ValＹ3Ｙ4Ｙ5Ｙ6（配列番号３２）[ここで、Ｙ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｙ2はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｙ3はバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｙ4はリジンまたはアルギニンであり、Ｙ5はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｙ6はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[10]　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[11]　配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[12]　配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２２、２３または２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
[13]　[1]～[11]のいずれかに記載のペプチドにおいて、（A）１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているか、あるいは（B）2個のアミノ酸について、(i)一方が欠失され、もう一方が欠失、置換または付加されているか、(ii)一方が置換され、もう一方が欠失、置換または付加されているか、もしくは(iii) 一方が付加され、もう一方が欠失、置換または付加されているペプチド。
[14]　[12]に記載のペプチドにおいて、（A）１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているか、あるいは（B）2個のアミノ酸について、(i)一方が欠失され、もう一方が欠失、置換または付加されているか、(ii)一方が置換され、もう一方が欠失、置換または付加されているか、もしくは(iii)一方が付加され、もう一方が欠失、置換または付加されているペプチド。
[15]　ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する活性を有する、[1]～[11]および[13]のいずれかに記載のペプチド。
[16]　ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する活性を有する、[12]または[14]に記載のペプチド。
[17]　[1]～[11]、[13]および[15]のいずれかに記載のペプチドを含むペプチド。
[18]　[12]、[14]および[16]のいずれかに記載のペプチドを含むペプチド。
[19]　少なくとも１０残基のアミノ酸からなる[17]または[18]に記載のペプチド。
[20]　少なくとも１２残基のアミノ酸からなる[17]または[18]に記載のペプチド。
[21]　少なくとも１６残基のアミノ酸からなる[17]または[18]に記載のペプチド。
[22]　１００残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[23]　９０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[24]　８０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[25]　７０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[26]　６０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[27]　５０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[28]　４０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[29]　３０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[30]　２０残基以下のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[31]　１２から７２残基のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[32]　１２から２５残基のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[33]　１６から２５残基のアミノ酸からなる[17]に記載のペプチド。
[34]　[1]～[33]のいずれかに記載のペプチドのアミノ末端側またはカルボキシ末端側にCysが付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
[35]　[1]～[33]のいずれかに記載のペプチドのアミノ末端側およびカルボキシ末端側にCysが付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
[36]　アミノ末端およびカルボキシ末端のCysがジスルフィド結合を形成した環状ペプチドである[35]に記載のペプチド。
[37]　[1]～[36]のいずれかにに記載のペプチドを２、３、４または５個含むペプチド。
[38]　[1]～[36]のいずれかにに記載のペプチドが２、３、４または５個連結したペプチド。
[39]　ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（N-ビニル－ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーが付加された[1]～[38]のいずれかに記載のペプチド。
[40]　グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク（MBP)、ヒト免疫グロブリンFc領域、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビンおよびリポタンパク質からなる群から選択されるタンパク質が付加された[1]～[38]のいずれかに記載のペプチド。
[41]　[1]～[40]のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
[42]　ヒトFGF23タンパク質の過剰作用に起因する疾患または障害の予防または治療のための[41]に記載の医薬組成物。
[43]　腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、fibrous dysplasia、McCune-Albright syndrome、常染色体劣性低リン血症、低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低1,25(OH)2D血症、骨粗鬆症、クル病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、掻痒および腎不全からなる群から選択される疾患または障害の予防または治療のための[41]に記載の医薬組成物。
[44]　ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質を、被験物質がヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する能力を指標にスクリーニングする方法であって、被験物質と[1]～[40]のいずれかに記載のペプチドがヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する能力を比較し、被験物質の阻害能力が[1]～[40]のいずれか１項に記載のペプチドと同等または大きい場合に、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害し得る物質として選択する工程を含む、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法。
[45]　ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質を、被験物質がヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する能力を指標にスクリーニングする方法であって、被験物質と[1]～[40]のいずれかに記載のペプチドが、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する能力を比較し、被験物質の抑制能力が[1]～[40]のいずれか１項に記載のペプチドと同等または大きい場合に、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制し得る物質として選択する工程を含む、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質をスクリーニングする方法。
[46]　[1]～[40]のいずれかに記載のペプチドを含む、[44]に記載の方法によりヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
[47]　[1]～[40]のいずれかに記載のペプチドを含む、[45]に記載の方法によりヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質をスクリーニングするためのキット。
[48]　[1]～[35]のいずれかに記載のペプチドをコードするDNA。
[49]　[48]に記載のDNAを含有する組換えベクター。
[50]　[49]に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[51]　[50]に記載の形質転換体を培地に培養し、培地中に[1]～[35]のいずれかに記載のペプチドを生成蓄積させ、培地中から該ペプチドを採取することを特徴とする[1]～[35]のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
　本発明のペプチドは、ヒトFGF23タンパク質（以下、FGF23ともいう）とFGF23受容体の結合を阻害する。このようなペプチドは、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制し、ヒトFGF23タンパク質の過剰作用に起因する疾患や障害の予防や治療に用いることができる。さらに、本発明のペプチドは、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質をスクリーニングするときのコントロール物質として用いることができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-117661号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
ヒトFGF23タンパク質のKlotho発現細胞への結合に対するヒトFGF23C末ペプチドの阻害作用を示す図である。 ヒトFGF23C末ペプチドによるヒトFGF23タンパク質の作用阻害のまとめを示す図である。 GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）のヒトFGF23タンパク質の作用の阻害（インビトロアッセイ）を示す図である。 GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）のマウスへの投与による血清リンの上昇作用を示す図である。 GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）のマウスへの投与による1,25(OH)2Dの上昇作用を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
I．ペプチドおよびその付加物
１．ヒトFGF23C末ペプチド
　本発明は、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域（ヒトFGF23タンパク質（配列番号７）の第180番目のアミノ酸から251番目のアミノ酸からなる断片）の断片ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドである。本発明において、カルボキシル末端側領域の断片ペプチドをカルボキシ末端断片またはカルボキシ末端側断片ということがある。本発明のペプチドのうち、ヒトFGF23のアミノ酸配列（配列番号７）の第180番目のアミノ酸から251番目のアミノ酸からなるカルボキシ末端断片のアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチドであって、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端断片のアミノ酸配列の連続した全部または一部のアミノ酸配列を含むペプチド、および例えば以下に述べるペプチドをヒトFGF23C末ペプチドという。本発明のヒトFGF23 C末ペプチドは、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する。ここでFGF23受容体としては、klothoおよびFGFR1（IIIc）、すなわちklothoおよびFGFR1（IIIc）の複合体が挙げられる。本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、例えばアミノ酸残基数が10、11、12または16以上のペプチドが挙げられ、また例えばアミノ酸残基数が12～72または12～25からなるペプチドが挙げられる。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、例えば以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
（ペプチドA）Ｘ1Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6Ｘ7（例えば、(a) Ｘ1 Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号５４）、(b) Ser Ｘ2 Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号５５）、(c) Ser Asp Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号５６）、(d) Ser Asp Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg Gly Gly（配列番号５７）、(e) Ser Asp Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg Gly Gly（配列番号５８）、(f) Ser Asp Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg Gly Gly（配列番号５９）、(g) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Ｘ5 Gly Gly（配列番号６０）、(h) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Ｘ6 Gly（配列番号６１）、または(i) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Gly Ｘ7（配列番号６２））
（ペプチドB）ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6Ｘ7　（例えば、(a) Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg Gly Gly（配列番号３３）、(b)Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg Gly Gly（配列番号３４）、(c)Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg Gly Gly（配列番号３５）、(d)Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg Gly Gly（配列番号３６）、(e)Pro Leu Gly Val Val Ｘ5 Gly Gly（配列番号３７）、(f)Pro Leu Gly Val Val Arg Ｘ6 Gly（配列番号３８）または(g)Pro Leu Gly Val Val Arg GlyＸ7（配列番号３９））
（ペプチドC）Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6（例えば、(a)Ｘ2 Pro Leu Gly Val Val Arg Gly（配列番号４０）、(b)Asp Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg Gly（配列番号４１）、(c)Asp Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg Gly（配列番号４２）、(d)Asp Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg Gly（配列番号４３）、(e)Asp Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg Gly（配列番号４４）、(f)Asp Pro Leu Gly Val Val Ｘ4 Gly（配列番号４５）または(g)Asp Pro Leu Gly Val Val Arg Ｘ6（配列番号４６））
（ペプチドD）Ｘ1Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5（例えば、(a)Ｘ1 Asp Pro Leu Gly Val Val Arg（配列番号４７）、(b)Ser Ｘ2 Pro Leu Gly Val Val Arg（配列番号４８）、(c)Ser Asp Pro Ｘ3 Gly Val Val Arg（配列番号４９）、(d)Ser Asp Pro Leu Ｘ4 Val Val Arg（配列番号５０）、(e)Ser Asp Pro Leu Gly Ｘ3 Val Arg（配列番号５１）、(f) Ser Asp Pro Leu Gly Val Ｘ3 Arg（配列番号５２）または(g) Ser Asp Pro Leu Gly Val Val Ｘ5（配列番号５３））
　上記のペプチドA、B、CおよびDにおいて、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、３つのＸ3は独立してバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジンである。この場合、３つのＸ3は同じアミノ酸であっても、異なるアミノ酸であってもよい。
　また、本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、例えば以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
（ペプチドE）Ｙ1Asp Pro LeuＹ2ValＹ3Ｙ4Ｙ5Ｙ6（配列番号３２）
ここで、Ｙ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｙ2はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｙ3はバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｙ4はリジンまたはアルギニンであり、Ｙ5はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｙ6はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジンである。
　また、本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、例えば以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
（ペプチドF）配列番号２、３、１２、１５、１６、１７、１８、２２、２３または２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
　また、本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、例えば以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
（ペプチドG）上記ペプチドA～Fにおいて、（A）１個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているか、あるいは（B）2個のアミノ酸について、(i)一方が欠失され、もう一方が欠失、置換または付加されているか、(ii)一方が置換され、もう一方が欠失、置換または付加されているか、もしくは(iii)一方が付加され、もう一方が欠失、置換または付加されているペプチドが挙げられる。
　また、本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、例えば以下ペプチドが挙げられる。
（ペプチドH）上記ペプチドA～Gのいずれかに記載のペプチドを含むペプチド。
「ペプチドA～Gのいずれかに記載のペプチドを含むペプチド」とは、ペプチドＨのアミノ酸配列中にペプチドＡ～Ｈのアミノ酸配列が含まれることをいう。該ペプチドは、例えば、少なくとも８、１０、１２または１６残基のアミノ酸からなる。また、該ペプチドは、例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０または２０残基以下のアミノ酸からなる。あるいはまた、例えば、１２から７２残基、１２から２５残基または１６から２５残基のアミノ酸からなる。
　さらに、本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、SDPLGVVRGG（配列番号２）で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、少なくとも10、11、12または16残基以上のアミノ酸からなるペプチドが挙げられ、また例えばアミノ酸残基数が12～72、12～25、または16～25からなるペプチドが挙げられる。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、配列番号７で表されるヒトFGF23タンパク質のアミノ酸配列の220番目～228番目、220番目～229番目、220番目～230番目、220番目～231番目、220番目～235番目、220番目～240番目、220番目～244番目、221番目～228番目、221番目～229番目、221番目～230番目、221番目～231番目、221番目～235番目、221番目～240番目、221番目～244番目、222番目～229番目、222番目～230番目、222番目～231番目、222番目～235番目、222番目～240番目、222番目～244番目、223番目～230番目、223番目～231番目、223番目～235番目、223番目～240番目、223番目～244番目、216番目～231番目、216番目～235番目、216番目～240番目、216番目～244番目、211番目～231番目、211番目～235番目、211番目～240番目、211番目～244番目、または180番目～251番目のアミノ酸配列を含むペプチドまたは該アミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。より好ましくは配列番号８、１５～１８、および２２～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは該アミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドは、ヒトFGF23のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列からなるヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域の部分ペプチドであってもよいし、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列を含み、その両端に１個または数個（例えば、２、３、４、５、６、７、８または９個）のアミノ酸が付加されたものであってもよい。付加されるアミノ酸としては、例えばCysが挙げられ、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列のアミノ末端側および／またはカルボキシ末端側に１個のCysが付加されたものが例示できる。例えば、付加したCysを介してFGF23C末ペプチドに担体を結合させることができる。また、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列のアミノ末端側およびカルボキシ末端側の両方にCysが付加されたペプチドは、両端のCys同士でジスルフィド結合を形成し、環状ペプチドとなり得る。本発明のペプチドは、このような環状ペプチドをも包含する。本発明においては、これらのペプチドもヒトFGF23C末ペプチドと呼ぶ。
　さらに、本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、RDPLNVLKPR（配列番号３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。さらに前記ペプチドを含むペプチドであって、少なくとも10、11、12または16残基以上のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。また例えば、アミノ酸残基数が12～72、12～25、または16～25からなるペプチドが挙げられる。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドとして、配列番号７で表されるヒトFGF23タンパク質のアミノ酸配列の187番目～197番目のアミノ酸配列を含むペプチドまたは該アミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。具体的には、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含み、12残基以上のアミノ酸からなるペプチド、16残基以上のアミノ酸からなるペプチド、アミノ酸残基数が12～72、アミノ酸残基数が12～25、またはアミノ酸残基数が16～25からなるペプチドが挙げられる。本発明のヒトFGF23C末ペプチドは、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列からなるヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末側の部分ペプチドであってもよいし、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列を含み、その両端に１個または数個のアミノ酸が付加されたものであってもよい。付加されるアミノ酸としては、例えばCysが挙げられ、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列のアミノ末端側および／またはカルボキシ末端側に１個のCysが付加されたものが例示できる。例えば、付加したCysを介してFGF23C末ペプチドに担体を結合させることができる。また、ヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端側領域のアミノ酸配列の連続する部分配列のアミノ末端側およびカルボキシ末端側の両方にCysが付加されたペプチドは、両端のCys同士でジスルフィド結合を形成し、環状ペプチドとなり得る。本発明のペプチドは、このような環状ペプチドをも包含する。本発明においては、これらのペプチドもヒトFGF23C末ペプチドと呼ぶ。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドは、上記ペプチドA～Fのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する活性を有するペプチドも含む。数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加しているとは、複数のアミノ酸が同時に欠失、置換または付加していてもよいことを意味している。１個または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加とは、１～10個、好ましくは１～5個、さらに好ましくは１または2個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加をいう。このようなペプチドとして、上記のペプチドのアミノ酸配列と、BLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも50％以上、好ましくは75％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有しているペプチドが挙げられる。
　さらに、本発明のペプチドは、上記のペプチドを２、３、４または５個含むペプチドを包含する。ここで、上記のペプチドを２、３、４または５個含むとは、ペプチドのアミノ酸配列中に上記のぺプチドのアミノ酸配列が２、３、４または５個含まれていることをいう。２、３、４または５個のペプチドは連続して含まれていてもよいし、離れて含まれていてもよい。また、２、３、４または５個のペプチドは同じペプチドでもよいし、異なるペプチドでもよい。例えば、上記２、３、４または５個のペプチドは連結した状態で含まれていてもよい。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドは、例えば、ポリエチレングリコール（PEG)、デキストラン、ポリ（N-ビニル－ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールなどのポリマーの結合により修飾されていてもよい。修飾方法は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば特表平10-510980号公報に詳細に開示されている。
　さらに本発明のヒトFGF23C末ペプチドに他のタンパク質を付加させてもよい。例えば本発明のペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端にグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク（MBP)などのタグタンパク質を結合させればよい。これらのタンパク質は、本発明のヒトFGF23C末ペプチドの精製を容易にして血中安定性を高める。さらには、本発明のヒトFGF23C末ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、例えばヒト免疫グロブリンFc領域、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、リポタンパク質などのヒト血清中に存在するタンパク質の全長または部分領域を結合させてもよい。上記タンパク質とFGF23C末ペプチドの間には、タンパク質切断配列および／またはリンカー配列が含まれていてもよい。この場合のリンカーには任意のポリペプチドを用いることができる。この場合のポリペプチドとしては、例えば、１～１００アミノ酸の任意のポリペプチド、好ましくは１０～５０アミノ酸の任意のポリペプチド、さらに好ましくは１０～３０アミノ酸の任意のポリペプチドを用いることができる。これらのタンパク質またはペプチドは、本発明のペプチドの安定性を高めることができる。本発明においては、ポリエチレングリコール等のポリマーやタンパク質を付加したヒトFGF23C末ペプチドをヒトFGF23C末ペプチド付加物（あるいは、単にペプチド付加物）と呼ぶ。
　また、本発明のヒトFGF23C末ペプチドを複数連結させることもできる。例えば、本発明のヒトFGF23C末ペプチドを複数連結させることにより、血中安定性または活性が改善されたポリペプチドを作製することができる。連結させる数としては、ペプチドを連結することにより血中安定性が改善され得る数やヒトFGF23タンパクとその受容体の結合を阻害できる数であればよく、例えば、２～１０個、好ましくは２～５個、さらに好ましくは２個または３個である。また、それぞれのペプチドを連結させるためにリンカーを用いることもできる。この場合のリンカーには任意のポリペプチドを用いることができる。この場合のポリペプチドとしては、例えば、１～１００アミノ酸の任意のポリペプチド、好ましくは１０～５０アミノ酸の任意のポリペプチド、さらに好ましくは１０～３０アミノ酸の任意のポリペプチドを用いることができる。本発明はこのようなポリペプチドを包含する。
２．本発明のヒトFGF23C末ペプチドの製造
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドは、配列情報に基づいて、それをコードするDNA等を合成し、これを適当な宿主中で発現させることにより調製できる。また、ペプチド合成装置を使用して、直接に合成することもできる。更には完全長のヒトFGF23タンパク質を適当な酵素で消化することによっても調製することができる。また、ヒトFGF23タンパク質を例えば動物細胞や昆虫細胞などで発現させたときに生じるヒトFGF23のペプチドを精製することによっても調製することができる。
　ポリエチレングリコール等を結合させたペプチド付加物は、公知の方法、例えば特表平10-510980号公報に記載の方法で製造することができる。また、GST等のタンパク質を結合させたペプチド付加物は付加するタンパク質をコードするDNAとヒトFGF23C末タンパク質をコードするDNAを融合し、これを適当な宿主中で発現させることにより融合タンパク質として調製できる。また、架橋試薬を用いて結合させてもよい。ヒトFGF23C末ペプチドを連結させたポリペプチドは、ヒトFGF23C末ペプチドをコードするDNAを複数連結し、これを適当な宿主中で発現させることにより融合タンパク質をして調製できる。また、架橋試薬を用いて結合させてもよい。
　融合したDNAを用いてFGF23C末ペプチドまたは連結したFGF23C末ペプチドを製造する際、必要に応じてタンパク質切断酵素配列をコードするDNAおよび／またはリンカー配列をコードするDNAを連結すればよい。
３．本発明のペプチドの性質
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドおよびヒトFGF23C末ペプチド付加物は、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する。　本発明のペプチドの阻害活性を検出する方法の例としては、ヒトFGF23タンパク質の受容体の補因子であるKlothoタンパクを発現する細胞を含む溶液に、本発明のペプチドおよび125IラベルヒトFGF23タンパク質を添加し、細胞に結合した125IラベルヒトFGF23タンパク質の量をガンマカウンタを用いて放射能を測定する系が挙げられる(Nature,444:770-774, 2006)。本発明のペプチドが「ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する」とは、実施例５で示される系において陰性コントロールであるＰＢＳと比較し、Klotho発現細胞に結合した125IラベルヒトFGF23タンパク質の量、即ち放射能のカウントが低下していることをいう。実施例に示される通り、本発明のペプチドはヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害し、その結果としてヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する。 抑制活性を検出する方法の例としては、本発明のペプチドをヒトFGF23を発現するトラスジェニックマウスに投与し、その血清リン濃度および血清1,25(OH)2D濃度を測定する系が挙げられる。また、Klotho発現細胞を含む溶液に、本発明のペプチドおよびヒトFGF23タンパク質を添加し、ヒトFGF23タンパク質の刺激によるEarly growth response gene-1のプロモーター活性化を測定する系があげられる(Nature,444:770-774, 2006)。
II．医薬組成物
　本発明の「医薬組成物」とは、前記で定義される本発明のヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物と、薬学的に許容され得る担体とからなる医薬組成物である。
　ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。また、本発明の医薬組成物の投与には、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、封入複合体または他のタイプの担体を使用することもできる。これらの医薬組成物 は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物 に含有される活性成分（前記ポリペプチドや抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg（あるいは10μgから500mg）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
　とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に本発明のペプチドを0.1μg/ml担体～10mg/ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１kg体重あたり、１μｇ～100mgの割合で、好ましくは50μg～50mgの割合で、１日あたり１回～数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
　また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物により予防・治療が可能な疾患はヒトFGF23タンパク質の過剰作用が示されている腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、fibrous dysplasia 、McCune-Albright syndromeおよび常染色体劣性低リン血症などのミネラル代謝異常を伴う疾患が挙げられる。さらに、これらの疾患に対して認められる低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低1,25(OH)2D血症などの障害について改善効果が期待される。またヒトFGF23タンパク質が生理的条件下で重要な役割を果たしていることから、ヒトFGF23タンパク質のリン代謝調節、ビタミンD代謝調節を介したカルシウム代謝調節作用を本発明のペプチドが制御することによって骨粗鬆症、クル病（低リン血症性クル病、ビタミンD抵抗性クル病を含む）、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症および掻痒等の、ミネラル代謝やビタミンD代謝の異常に起因する疾患に対して治療的および予防的に用いることができる。さらに、腎不全において血中のヒトFGF23タンパク質の濃度の上昇が報告されていることから、腎性骨異栄養症、透析骨症、尿細管機能障害等に代表される腎不全や腎不全時人工透析に合併する疾患に対しても治療的および予防的に用いることができる。一方で1,25(OH)2Dは上述したカルシウムなどのミネラル代謝のみならず、細胞増殖抑制能、細胞分化促進能なども報告されていることから、本発明のペプチドにより1,25(OH)2Dによって増殖や分化などの制御を受ける細胞に起因する疾患に対して治療的および予防的に用いることができる。
　本発明は、ヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物を有効成分として含む上記疾患または障害の予防または治療薬を包含する。また、本発明はヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物を患者に投与することを含む、上記疾患または障害を予防または治療する方法を包含する。さらに、本発明はヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物の上記疾患または障害を予防または治療するための医薬の製造への使用を包含する。さらに、本発明は上記疾患または障害の予防または治療に用い得るヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物を包含する。
III．製剤例
　本発明の医薬組成物は、有効量の本発明のペプチドならびに医薬的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、助剤および／または担体を含む。一般的に、該医薬組成物は、緩衝剤、特定のpHおよびイオン強度を有する希釈剤（例えば、トリス-HCl、酢酸塩、リン酸塩）、添加剤（例えばツイーン80、ポリソルベート80等の洗剤および可溶化剤）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）または増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）を含んでいてもよい。さらに、これらの物質をポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等）の粒状調製物またはリポソームへ配合させてもよい。この際、ヒアルロン酸も使用可能であり、これは循環中の持続時間を延長させる効果を有し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、他の医薬的に許容される医薬用ベヒクル、賦形剤もしくは媒体として機能する液体、または半固体もしくは固体希釈剤を含んでいてもよい。これらには、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル－もしくはプロピル－ヒドロキシベンゾエート、スターチ、スクロース、デキストロース、アカシアガム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオ脂およびカカオ油が含まれるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物に含まれる物質は、本発明のペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、援用により本明細書に含まれるとするRemington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，p.1435-1712，ペンシルバニア州イーストンに所在のMack Publishing Co.（1990年）発行を参照されたい。本発明の医薬組成物は液体形態で製造されても、乾燥粉末（例えば、凍結乾燥形態）であってもよく、また皮下処方物のような移植可能な徐放性処方物であってもよい。
　本発明の医薬組成物は、例えば静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球後、肺内（例えば、エーロゾル化薬物）もしくは（長時間放出させるための蓄積投与を含めた）皮下注射により；舌下、肛門、膣等を介して；脾膜下、脳下もしくは角膜内に埋め込むような外科移植を含めた注射、或いは経口、点鼻、経皮膚もしくは他の投与形態で投与することができる。
　また、本発明の医薬組成物の投与には、リポソーム、マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、封入複合体または他のタイプの担体を使用することもできる。
IV.本発明のヒトFGF23C末ペプチドおよびヒトFGF23C末ペプチド付加物のスクリーニングコントロールとしての使用
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドおよびヒトFGF23C末ペプチド付加物は、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質をスクリーニングするときのコントロール物質として用いることができる。スクリーニング方法の例としては、例えば、ヒトFGF23タンパク質の受容体の補因子であるKlothoタンパクを発現する細胞へ125IをラベルしたヒトFGF23タンパク質（以下、125IラベルFGF23とする）を結合させ、結合した125IラベルFGF23の量をガンマカウンタを用いて放射能を測定する系などがある。ヒトFGF23タンパク質とKlotho発現細胞の結合を測定する系としては、他にも例えばDELFIAおよびLANCE（米国　パーキンエルマー社）などのユーロピウムを代表とするランタノイドで標識したヒトFGF23タンパク質を用いてKlotho発現細胞への結合を測定する系や、フローサイトメーターを用いて細胞表面上に結合したヒトFGF23タンパク質を抗ヒトFGF23抗体を用いて検出する系、などが挙げられる。さらには、例えば、Klothoタンパク質の細胞外領域のタンパク質とヒトFGF23タンパク質の結合を抗Klotho抗体、抗ヒトFGF23抗体で免疫沈降実験を行い共沈してくるタンパクの量を測定する方法も挙げられる。また、ヒトFGF23タンパク質が引き起こすシグナル伝達を測定し、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する能力を測定する系としては、例えばKlothoを発現させた細胞にEarly growth response gene-1やFosといったMAPキナーゼの下流で発現上昇する遺伝子のプロモータ領域をルシフェラーゼ遺伝子に結合したレポーター遺伝子を導入することによりヒトFGF23タンパク質の刺激によってルシフェラーゼ活性が上昇するのを測定する系や、Klotho発現細胞でのERK1/2のリン酸化亢進を抗リン酸化ERK1/2抗体を用いたウェスタンブロッティングなどで検出する系(Nature,444:770-774, 2006)などがあげられる。これらの系に本発明のヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物をコントロールとして用いることでヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質を探索することが可能となる。さらに、マウス、ラットなどの動物に本発明のヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物を投与することで、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質を試験するためのコントロールとして用いることができる。
　本発明はさらに、ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する物質、またはヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質をスクリーニングするためのキットを含む。該キットは本発明のヒトFGF23C末ペプチドまたはヒトFGF23C末ペプチド付加物をコントロールとして含み、さらにラベルしたヒトFGF23タンパク質等を含む。
　以下、実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される様態のみに限定されるものではない。
実施例１　組換え体ヒトFGF23タンパク質発現ベクターの作製
(1)　ヒトFGF23タンパク質発現ベクターの構築
　ヒトFGF23タンパク質をコードするcDNAは、腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍のヒトcDNAライブラリーを鋳型とし、F1EcoRIプライマー（配列番号４）とLHisNotプライマー（配列番号５）とLA-Taq DNA polymeraseを用いて96℃で1分間保温した後、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒からなる工程を１サイクルとした35サイクルのPCRを実施することにより増幅した。F1EcoRIプライマーはヒトFGF23タンパク質をコードする塩基配列のさらに5’側上流に存在する配列にアニールし、その増幅断片のヒトFGF23タンパク質をコードする領域の5’側にEcoRI制限酵素部位を付加する。LHisNotプライマーはヒトFGF23タンパク質をコードする配列の終始コドンの5’側の配列とアニールする配列とHis6-tag配列（His-His-His-His-His-His）（配列番号１）をコードする配列に続く終始コドンとNotI制限酵素配列を含む。その結果、増幅断片はヒトFGF23タンパク質のカルボキシ末端にHis6-tag配列を付加したものをコードすることになり、その下流にNotI制限酵素部位を有する。この増幅断片をEcoRIとNotIで消化し、同様にEcoRIとNotIで消化した動物細胞発現ベクターであるpcDNA3.1Zeo（Invitrogen社）と連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のHis6-tag配列が付加されたヒトFGF23タンパク質をコードしていることを確認した。このベクターをpcDNA/hFGF23Hと称す。
F1EcoRI：　CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG　（配列番号４）
LHisNot：　ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA（配列番号５）
(2)　ヒトFGF23タンパク質発現ベクターの構築
　pcDNA/hFGF23Hを鋳型としてF1EcoRIプライマーとLNotプライマー（配列番号６）とLA-Taq DNA polymeraseを用いて94℃で1分間保温した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分からなる工程を１サイクルとした25サイクルのPCRを実施することにより増幅した。反応終了後、ヒトFGF23タンパク質をコードする断片をEcoRIとNotIで消化したのち精製した。これを、動物細胞発現ベクターであるpEAK8（Edge Biosystem社）に分子内リボゾームエントリー配列（IRES）と増強型緑色蛍光タンパク質（EGFP）を連結したpEAK8/IRES/EGFPベクターのEcoRIとNotI制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、ヒトFGF23タンパク質をコードしていることを確認した。このベクターをpEAK8/IRES/EGFP/hFGF23と称す。
LNot：　ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA（配列番号６）
実施例２　組換え体ヒトFGF23タンパク質および組換え体変異ヒトFGF23タンパク質の発現
(1)pcDNA/hFGF23Hをベクター中のアンピシリン耐性遺伝子内にあるFspI制限酵素部位で切断して直鎖化し、精製した。CHO Ras clone-1細胞（Shirahata, S., et al. Biosci Biotech Biochem, 59: 345-347, 1995）と混和してGene Pulser II（Bio Rad社）を用いて電気穿孔法にて細胞への遺伝子導入を行った。この細胞を10％ FCS を含むMEMα培養液（Gibco BRL社）で24時間培養したのち、終濃度0.5mg/mlとなるようにZeocin（Invitrogen社）を添加して１週間培養した。接着し増殖した細胞をトリプシンで遊離して、終濃度0.3mg/mlのZeocin存在下で限界希釈法によるクローニングを行い、クローン化細胞を複数得た。これらの細胞の中でヒトFGF23タンパク質を最もよく発現する細胞をウェスタンブロッティングにて同定した。各クローン化細胞の培養上清を採取して、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行ったのち、PVDF膜（Millipore社）にタンパク質を転写し、抗His-tag（カルボキシ末端）抗体（Invitrogen社）とECL発光システム（GEヘルスケア　バイオサイエンス社）を用いて約32kDa付近のヒトFGF23タンパク質に由来するシグナルを検出した。その結果、#20と称すクローンにおいて最も高い発現が認められ、これをCHO-OST311Hと命名して2000年8月11日付けで独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した（受託番号：FERM BP-7273）。本明細書では、CHO-OST311HをCHO-hFGF23Hと称する。
(2)ヒトFGF23タンパク質発現細胞の取得
　pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23ベクターのCHO Ras clone-1細胞への導入は膜融合脂質を用いた遺伝子導入法により行った。CHO Ras clone-1細胞を6-well plateに底面の約60％を細胞が覆う程度に培養する。そして培養液を除去し、血清を含まないMEMα培養液を１ml添加する。導入するベクター2.5μgと10μlのTransfectam（登録商標）（Promega社）をそれぞれ50μlの血清を含まないMEMα培養液と混和して、両者を混合して10分間静置したのち、両者を混合して予め準備しておいた6-well plateに添加した。2時間培養した後、このDNAを含む培養液を除去して10％のFCSを含む培養液に置換して終夜培養した。翌日、終濃度が5μg/mlとなるようにPuromycin（Sigma社）を添加して、薬剤耐性細胞を選択した。このようにして得られた薬剤耐性細胞は限界希釈法にてクローン化を行った。さらにウェスタンブロットにより目的のタンパク質を最もよく発現する細胞株を取得した。この細胞をCHO-hFGF23と称す。
(3)　組換え体ヒトFGF23タンパク質の動物細胞での発現と検出
　CHO-hFGF23Hの培養上清中の組換え体をカルボキシ末端のHis6-tag配列に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにて検出すると、約32kDaのバンドと約10kDaのバンドが認められた。この二つのバンドをゲルから切り出し、アミノ末端側のアミノ酸配列を決定したところ、分子量の大きい約32kDaのバンドは配列番号７の25番目からのアミノ酸配列が検出され、ヒトFGF23タンパク質から分泌過程でシグナル配列が除去されたものと考えられた。一方、分子量の小さいバンドからは配列番号７の180番目からのアミノ酸配列が確認され、179番目と180番目の間での切断により生じたカルボキシ末端側断片であることが判明した。また、ヒトFGF23タンパク質のアミノ末端側を認識するポリクローナル抗体を用いて検出することで、179番目よりアミノ末端側の配列を持つと考えられるポリペプチド（アミノ末端側断片）の存在も認められた（国際公開第WO02/14504号パンフレット）。
　同様にHis6-tag配列の付加されていないCHO-hFGF23の培養上清においても、179番目と180番目のアミノ酸残基の間で切断されることを確かめた（国際公開第WO02/14504号パンフレット）。そこで、切断を受けない活性体と思われる配列番号７の25番目から251番目のヒトFGF23タンパク質（FGF23全長体と呼ぶことがある）を、アミノ末端側断片（配列番号７の25番目から179番目のアミノ酸）またはカルボキシ末端側断片（配列番号７の180番目から251番目のアミノ酸）と分離して精製する目的で以下の操作を行った。
(4)組換え体ヒトFGF23タンパク質およびヒトFGF23タンパク質カルボキシ末端側断片の精製
　CHO-hFGF23の培養上清をポアサイズが0.2μmのメンブレンであるSuperCap（登録商標）（Pall Gelman Laboratory社）でろ過し、ろ過された溶液をSP-Sepharose FF（GEヘルスケア　バイオサイセンス社）に通した。カラムとの親和性が弱い物質を50mMのリン酸ナトリウム緩衝液, pH6.7で洗浄、溶出させた。この画分に179番目と180番目の間で切断されて生じたカルボキシ末端側の断片が含まれていた。このカルボキシ末端側断片の配列を配列番号８に記す。また、カラム保持されたタンパク質を0から0.7MまでのNaCl濃度勾配で溶出させたところ、約0.3MのNaClで溶出される画分にヒトFGF23タンパク質が認められた。次に金属アフィニティカラムであるTalon Superflow（登録商標）（Clontech社）に吸着させたのち、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液, pH6.7で洗浄したのち、Imidazoleの濃度を変化させて添加しヒトFGF23タンパク質を溶出精製した。さらに、目的のタンパク質を含む画分をSP Sepharose FFカラムに吸着、溶出させて精製した。
ヒトFGF23タンパク質
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF I　（配列番号７）
ヒトFGF23タンパク質カルボキシ末端側断片
SAEDDSERDP LNVLKPRARM TPAPASCSQE LPSAEDNSPM ASDPLGVVRG GRVNTHAGGT　GPEGCRPFAK FI　（配列番号８）
実施例３　ヒトFGF23C末ペプチドの作製
　配列番号９～２４のすべての合成ペプチドはペプチド合成機（米国Applied Biosystems社製 Model 433A）を用いて、固相合成法（Fmoc法）でApplied Biosystems社のプロトコールにしたがって合成した。合成したペプチドは、逆相HPLCで最終精製純度が95％以上になるように精製を行った。精製したペプチドはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF/MS Voyager-DETM STR、米国　Applied Biosystems社）を用いて分子量の確認を行った。
　ただし、配列番号２４の環状ペプチドについては両端にシステイン残基を導入したリニアペプチドを合成、精製した後に、pH8.0の溶液中でジスルフィド結合を形成させ、環状化した。MALDI-TOF/MSを用いて環状化の前後で分子量が２減ることによって、同一分子内で環状化したことを確認した。
　実験に際しては、凍結乾燥した精製ペプチドを1mg/mLになるように、PBSで溶解したのち、記述の溶媒および濃度になるように希釈した。
ヒトFGF23 C末ペプチド
180/180-194/; SAEDDSERDPLNVLKC　（配列番号９）
183/183-190/; DDSERDPL　（配列番号１０）
186/186-193/; ERDPLNVL　（配列番号１１）
188/188-196/; DPLNVLKPR　（配列番号１２）
197/197-212/; ARMTPAPASCSQELPS　（配列番号１３）
210/210-222/; LPSAEDNSPMASDC　（配列番号１４）
220/220-244/; ASDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGC　（配列番号１５）
211/211-230/; PSAEDNSPMASDPLGVVRGG　（配列番号１６）
216/216-235/; NSPMASDPLGVVRGGRVNTH　（配列番号１７）
221/221-240/; SDPLGVVRGGRVNTHAGGTG　（配列番号１８）
226/226-245/; VVRGGRVNTHAGGTGPEGCR　（配列番号１９）
237/237-251/; GGTGPEGCRPFAKFI　（配列番号２０）
244/244-251/; CRPFSKFI　（配列番号２１）
220s/220-235/; ASDPLGVVRGGRVNTH　（配列番号２２）
220vs/220-231/; ASDPLGVVRGGR　（配列番号２３）
220C/220-244（環状）/; CASDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGC (アミノ末端とカルボキシ末端のシステインのジスルフィド結合によって環状化しているペプチド)　（配列番号２４）
実施例４　ヒトFGF23C末ペプチドのアミノ末端にGSTを付加したペプチドの作製
４－（１）ヒトFGF23C末ペプチドのアミノ末端にGSTを付加したペプチドの発現ベクターの作製
　ヒトFGF23タンパク質のアミノ酸番号180番から251番目のアミノ酸のアミノ末端にGST（グルタチオン S-トランスフェラーゼ）を付加したペプチド（以下、GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）とする）は次の様に作製した。実施例１で得られたヒトFGF23遺伝子を鋳型に以下のプライマーを用いてPCR法にてヒトFGF23タンパク質のアミノ酸番号180番から251番目のアミノ酸までの領域をコードする遺伝子領域を増幅した。
GST-ヒトFGF23（180-251）FW：CCCGAATTCAGCGCCGAGGACGACTCGGA　（配列番号２５）
GST-ヒトFGF23（180-251）RV：ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAA　（配列番号２６）
　PCRによる増幅産物はアガロースゲルにて電気泳動を行い、ゲルからバンド部分の切り出しを行った。ゲルからの増幅産物の抽出はMinElute Gel Extraction Kit（米国　キアゲン社）を用いて実施した。精製したPCR増幅産物をEcoRIとNotIで切断を行い、同じくEcoRIとNotIで切断されたpGEX-6P-1（米国　アマシャム社）に導入を行った。
４－（２）GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）の大腸菌での発現と精製
　実施例４－（１）で作製されたGST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）発現ベクターを大腸菌BL21株（日本　タカラバイオ社）に添付のマニュアルに従ってトランスフォーメーションを行った。アンピシリン含有LB培地で選択された大腸菌をアンピシリン含有LB培地１mLにて一晩培養し、全量を100mLのアンピシリン含有LB培地に添加し、37℃で３時間培養を行った。0.5mMのIPTGを添加後28℃で４時間培養を行った後、遠心にて菌体を回収。コンプリート（スイス国　ロシュ社）を溶かしたPBSにて大腸菌を懸濁後、超音波にて菌体を破砕した。その菌体破砕液の上清から、Glutathione Sepharose 4B（米国　アマシャム社）を用いて添付の文書に従ってGST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）を精製した。コントロール用のGSTについてもpGEX-6P-1（米国　アマシャム社）を用いて同様に得た。得られたGST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）の配列を配列番号２７に示す。
　配列番号２７のアミノ酸配列中、１番目のMから220番目のDがGSTの配列であり、221番目のLから228番目のPがGSTとFGF23C末ペプチドを切断するためのタンパク質切断配列であり、229番目のLから234番目のFまでがリンカーの配列であり、235番目のSから306番目のIまでがFGF23C末ペプチドの配列である。下記配列中、タンパク質切断配列とリンカー配列を下線部で示す。
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYID
GDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKV
DFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFK
KRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSPEFSAEDDS
ERDPLNVLKPRARMTPAPASCSQELPSAEDNSPMASDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGCR
PFAKFI　（配列番号２７）
実施例５　ヒトFGF23タンパク質のKlotho発現細胞への結合に対するヒトFGF23C末ペプチドの阻害作用の評価
５－（１）125IラベルヒトFGF23の作製
　　125IラベルされたヒトFGF23タンパク質（以下、125IラベルFGF23とする）の作製は次のように行った。実施例２で作製したヒトFGF23タンパク質（配列番号７）をIODO-GEN（商標登録）Pre-Coated Iodination Tubes（米国　PIERCE社）を用いて添付のマニュアルに従いIodine-125 radionuclide （米国　パーキンエルマー社）にて125Iラベルを行った。未反応の125Iを除去するためにPD-10カラム（米国　GEライフサイエンス社）を用いて1%ウシ血清アルブミンを含むPBSにて分離を行い、125IラベルFGF23を得た。得られた125IラベルFGF23の濃度はFGF23測定ELISAキット（日本国　カイノス社）を用いて添付のマニュアルに従って測定した。125IラベルFGF23の放射活性は、COBRAガンマカウンター（米国　パーキンエルマー社）を用いて測定を行った。
５－（２）ヒトKlotho安定発現細胞の作製
　ヒトKlotho遺伝子はPCR法によってクローニングを行った。GenBank番号NM_004795の配列を元にプライマーを以下のように作製した。
hKLFW：GAAGTTATCAGTCGACCACCATGCCCGCCAGCGCCCCGCCGCGC　（配列番号２８）
hKLRV：ATGGTCTAGAAAGCTTCTATTTGTAACTTCTTCTGCCTTTC　（配列番号２９）
　配列番号２８のプライマーはヒトKlotho遺伝子配列の１番目の塩基部分から開始するプライマーでさらにpDNR-CMVベクター（米国　クロンテック社）に相同的な配列を含む。配列番号２９のプライマーはヒトKlotho遺伝子配列の終止コドンまでを含むプライマーでpDNR－CMVベクターに相同的な配列を含む。鋳型にはヒト腎臓cDNAライブラリー（米国　クロンテック社）を用いた。PCR反応はPrimeSTAR（登録商標）HS DNA Polymerase（日本国　タカラバイオ社）を用いて添付のマニュアルに従って行った。PCRによる増幅産物はアガロースゲルにて電気泳動を行い、ゲルからバンド部分の切り出しを行った。ゲルからの増幅産物の抽出はMinElute Gel Extraction Kit（米国　キアゲン社）を用いて実施した。発現ベクターへの導入は、In-Fusion PCRクローニングキット（米国　クロンテック社）を用い添付の文書に従ってpDNR-CMVベクターへ導入を行った。ヒトKlotho安定発現細胞作製の為に、ヒトKlotho-pDNR-CMVベクター上のヒトKlotho遺伝子をpLP-IRESneoベクターに乗せ換えを行った。ベクターの乗せ換えはCre recombinase（米国　クロンテック社）を用いて添付のマニュアルに従って行った。作製されたヒトKlotho-pLP-IRESneoベクターをHEK293細胞にTransIT LT1（日本国　タカラバイオ社）を用いて遺伝子導入を行い、Geneticine（米国　インビトロゲン社）を1mg/mLの濃度で添加した培地中で生育してきたクローンからヒトKlothoの発現量の高い細胞を抗ヒトKlotho抗体を一次抗体に用いたウェスタンブロッティングによって選別した。
５－（３）ヒトFGF23タンパク質のKlotho発現細胞への結合に対するヒトFGF23C末ペプチドの阻害作用の評価
　ヒトKlotho発現細胞に対するヒトFGF23タンパク質の結合アッセイは次のように行った。実施例５－（２）で作製したヒトKlotho発現HEK293細胞を0.25％BSAと0.02％NaN3を含むDF培地に懸濁し、マルチスクリーンBV（米国　ミリポア社）に1ウェルあたり約５万細胞を添加した。配列番号８から２４のヒトFGF23C末ペプチドおよび配列番号７のヒトFGF23タンパク（陽性コントロール）を図１に示す濃度で添加し、さらに実施例５－（１）で作製した125IラベルFGF23タンパク質を最終濃度100ng/mLになるように添加した。４℃で一晩静置した後に、0.25％BSAを含むPBSにて5回洗浄を行い、マルチスクリーンBVのメンブレン上に保持された細胞をマニュアルに従ってメンブレンごと回収した。細胞を含むメンブレンの放射能はCOBRAガンマカウンター（米国　パーキンエルマー社）を用いて測定を行った。ヒトFGF23タンパク質のKlotho発現細胞への結合に対する阻害作用は、125IラベルFGF23が細胞に結合することによって高くなる125I由来の放射能のカウントがヒトFGF23C末ペプチドによって顕著に低下することによって評価した。図１に示す様に配列番号８、１２、１５から１８、２２、２３のヒトFGF23C末ペプチドは125IラベルFGF23のKlotho発現細胞に対する結合阻害を示すことが確認された。また、配列番号２４の環状化したペプチドについても同様に125IラベルFGF23タンパク質のKlotho発現細胞に対する結合阻害を示した。
実施例６　EGR-1プロモータ・ルシフェラーゼを用いたヒトKlotho発現PEAK細胞でのアッセイ
６－（１）EGR-1プロモータレポーター遺伝子作製
　マウスEGR-1プロモータ部分のクローニングはPCR法により行なった。プライマーは文献（Barbara, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vpl.85, pp.7857-7861）を元に以下の様に作製した。
EGR-1proFW：GGGGTACCAACAGATCCTGGCGGGGACTTAGGAC（配列番号３０）
EGR-1proRV：CCCAAGCTTTCGCGACTCCCCGAATCGGCCTCTATT（配列番号３１）
　配列番号３０のプライマーはマウスEGR-1プロモータ部分の-1023塩基部分から開始するプライマーでさらにKpnIサイトが付加されている。配列番号３１のプライマーはマウスEGR-1 mRNA開始部位（+1）までを含むプライマーでHindIIIサイトが付加されている。鋳型にはマウスGenomic DNA(米国 クロンテック社)を用いた。PCR反応はLA Taq GC Buffer（日本国　宝酒造社）を使用し、添付のマニュアルにしたがって行なった。PCRの反応条件は94℃で５分を一次変性とし、次に94℃20秒、60℃30秒、72℃１分を１サイクルとして30サイクル行い、最後に伸長反応を72℃で７分行なった。PCRによる増幅産物は２％アガロースゲルによる電気泳動で確認した結果、約1kbp付近に単一バンドが確認された為、ゲルからバンド部分の切り出しを行い、GeneCleanキット（米国　バイオ101社）にて精製を行なった後、HindIII、KpnIにて切断を行なった。再度GeneCleanキット（米国　バイオ101社）にて精製を行い、同様にHindIII、KpnIにて切断したpGL3-Basic（米国　プロメガ社）にライゲーションを行なった。ライゲーション反応はTaKaRa Ligation kit version 2(日本国　宝酒造社)を用いて添付のプロトコールに準じて行なった。クローン化されたマウスEGR-1プロモータは塩基配列の確認を行ないマウスEGR-1プロモータ・ルシフェラーゼ融合遺伝子の作製を完了した。以下このプラスミドをmEGR-1promoter-luc./pGL3Basicと記す。
６－（２）Klotho―EGR-1アッセイ系構築
　上記６-(１)で作製したマウスEGR-1プロモータ・ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてマウスKlotho発現PEAK細胞でのEGR-1のヒトFGF23タンパク質による刺激時のEGR-1発現変化を調べた。PEAK rapid細胞（米国　エッジバイオシステム社）に添付のプロトコールに準じて実施例５で作製したヒトKlotho発現ベクターと実施例６－（１）で作製したmEGR-1promoter-luc./pGL3Basicを同時にトランスフェクションした。トランスフェクションは10cm径の培養ディッシュ（米国　ベクトンディッキンソン社）に行なった。トランスフェクション４時間後に細胞を0.53mM EDTA含有PBSにて剥がし、白色96ウェルプレート（米国　コーニング社）に播種した。24時間培養後、ヒトFGF23タンパク質を10ng/mlで添加し、ヘパリン（米国　シグマ社）も10μg/mlになるように同時に添加した。さらに24時間37℃にて静置後、Steady-Glo Luciferase assay system（米国　プロメガ社）を用いてプロトコールに準じてルシフェラーゼ活性を測定した。測定はトップカウント(米国　パッカード社)を用いて行なった。
実施例７　GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）のヒトFGF23タンパク質作用の阻害
　GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）のヒトFGF23タンパク質の作用に対する影響を実施例６で構築したインビトロFGF23活性測定系を用いて実施した。実施例６のアッセイにてヒトFGF23タンパク質を添加するのと同じタイミングでGST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）を図３に表示の濃度で添加した。24時間のインキュベーション後のルシフェラーゼ活性測定で、10ng/mLのヒトFGF23タンパク質によって上昇するルシフェラーゼ活性に対し、GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）を同時添加した時のルシフェラーゼ活性上昇の抑制を持って各添加物のヒトFGF23タンパク質作用阻害活性とした。図３に示す様に、GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）でヒトFGF23タンパク質によるルシフェラーゼ活性上昇の阻害が確認された。この結果から、ヒトFGF23C末ペプチドに他のタンパク質を付加したものでもヒトFGF23タンパク質の活性を阻害しうることが明らかとなった。
実施例８　GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）の血清リン、1,25(OH)2D上昇作用
　実施例４で作製したGST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）の正常マウスへの影響を検討するため、以下の実験を実施した。正常マウス（BALB/c、雄、６週齢）を５匹ずつからなる３つの群に無作為に分別し、図４に示すように、第1群には媒体としてPBSを、第2群には1.2 mg/mlのGST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）を、また第３群には対照として1.2 mg/mlのGSTを、それぞれ0.5mlずつ尾静脈内に単回投与した。投与前、９時間後および24時間後に、眼窩採血で70μLの採血を実施し、マイクロテイナ(米国　ベクトンディッキンソン社)を用いて血清を分離した。得られた血清中のリン酸濃度をリン-テストワコー(日本国 和光純薬社)、血清1,25(OH)2D濃度を1,25(OH)2D RIAキットTFB(米国　テイエフビー社)をそれぞれ用いて添付の文書に従い測定した。投与から採血までの間、各群毎にプラスチックケージで飼育し、リンおよびカルシウムを１％ずつ含む固形食CE-2(日本国 日本クレア社)および水道水を自由摂取させた。
　得られた結果を図４に示す。測定値は各群における平均値+/-標準偏差で表されている。＊を付与した群は、student’s-tにより有意差検定を実施した結果、媒体（PBS）投与群およびGST投与群の双方に対し、p<0.01を示した群を表す。図４に示されるように、GST-ヒトFGF23C末ペプチド（180-251）を投与したマウスでは、血清リンおよび血清1,25(OH)2Dの有意な上昇が確認された。これらのことから、ヒトFGF23タンパク質のカルボシキ末端断片（180-251）に代表されるヒトFGF23C末ペプチドを含む組成物は生体内でヒトFGF23タンパク質の作用を抑制し、血清リン、1,25(OH)2Dを上昇させることが示された。
実施例９　ヒトFGF23C末ペプチドの血清リン、1,25(OH)2D上昇作用
　実施例３で作製したヒトFGF23C末ペプチドのマウスへの影響を検討するため、以下の様な実験が実施できる。正常マウス（例えばBALB/c、雄、６週齢）に対し、実施例３で作製したヒトFGF23C末ペプチド、または例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（N-ビニル－ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク（MBP)などのタグタンパク質などを適宜選択して修飾したヒトFGF23C末ペプチドを投与できる。具体的には、配列番号２もしくは３のいずれかを含むヒトFGF23C末ペプチド、配列番号９～２４のヒトFGF23C末ペプチド、またはそれらのヒトFGF23C末ペプチドに対して公知の任意の手法、例えば特表平10-510980号公報に詳細に開示されている修飾方法により例えばポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（N-ビニル－ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク（MBP)などのタグタンパク質などを適宜選択して修飾を行ったペプチドなどを投与できる。
　投与前、９時間後および24時間後に、眼窩採血で採血を実施し、マイクロテイナ(米国　ベクトンディッキンソン社)を用いて血清を分離できる。得られた血清中のリン酸濃度をリン-テストワコー(日本国 和光純薬社)、血清1,25(OH)2D濃度を1,25(OH)2D RIAキットTFB(米国　テイエフビー社)をそれぞれ用いて添付の文書に従い測定できる。その結果、実施例６で示したヒトFGF23タンパク質抑制作用を有するヒトFGF23C末ペプチド、例えば、配列番号１５、１６、１７、１８、２２、２３、２４、または、実施例６で示したヒトFGF23タンパク質抑制作用のあるヒトFGF23C末ペプチド（例えば配列番号１５、１６、１７、１８、２２、２３、２４）に例えばポリエチレングリコールで修飾を行ったペプチドを投与したマウスでは、血清リンおよび血清1,25(OH)2Dの有意な上昇が確認できる。これらのことから、ヒトFGF23C末ペプチドまたはその付加物等の修飾物は生体内でヒトFGF23タンパク質の作用を抑制し、血清リン、1,25(OH)2Dを上昇させることを示すことができる。
　本発明のヒトFGF23C末ペプチドは、ヒトFGF23タンパク質の過剰作用に起因する疾患や障害の予防や治療等に用いることができ医療分野で有用である。さらに、ヒトFGF23タンパク質の作用を抑制する物質をスクリーニングするときのコントロール物質として用いることができ医療の発展に貢献し得る。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. Ｘ1Ｘ2ProＸ3Ｘ4Ｘ3Ｘ3Ｘ5Ｘ6Ｘ7[ここで、Ｘ1はセリン、トレオニン、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ2はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、３つのＸ3は独立にバリン、ロイシンまたはイソロイシンであり、Ｘ4はグリシン、アラニン、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ5はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ6はグリシン、アラニンまたはプロリンであり、Ｘ7はグリシン、アラニン、アルギニンまたはリジン]で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
  2. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
  3. 　配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
  4. 　配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２２、２３または２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
  5. 　ヒトFGF23タンパク質とFGF23受容体の結合を阻害する、請求項１～４のいずれか１項に記載のペプチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド。
  7. 　ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（N-ビニル－ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択されるポリマーが付加された請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド。
  8. 　グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク（MBP)、ヒト免疫グロブリンFc領域、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビンおよびリポタンパク質からなる群から選択されるタンパク質が付加された請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
  10. 　腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、fibrous dysplasia 、McCune-Albright syndrome、常染色体劣性低リン血症、低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低1,25(OH)2D血症、骨粗鬆症、クル病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、掻痒および腎不全からなる群から選択される疾患または障害の予防または治療のための請求項９に記載の医薬組成物。
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