JPH02117920A - ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は新規かつペプチド（特に、蛋白質）修飾試剤と
して有用なポリエチレングリコール誘導体、および当該
ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されたグア
ニジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関する
。 〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕近年、蛍
白質の研究の発展に伴い種々の作用を持つペプチド、特
に生理活性蛋白質が数多く発見されている。また、遺伝
子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進歩によりこ
れら生理活性ペプチド、またはその［４）１構造化合物
を大量に人手することが可能となってきた。これらの特
殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に有用の
ものが多い。 しかしながら、循環系に投与されたペプチドのクリアラ
ンスは一般に非常に速いことが知られているので、当該
ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチド
が異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学に
て設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構造
の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤な
症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプチ
ドの抗原性の改善が待望される。 これらのペプチドを医薬品として用いるためにはこれら
の抗原性や持続性に対する問題を解決しなければならな
い。このような問題点を解決する手段としてペプチドを
高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて有
効な手段であることが知られている。 しかして、ポリエチレングリコール誘導体は、それ自体
免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド（蛋白質）の
３次構造に影響を与えないという優れた特徴を持ってい
るため、ペプチドの高分子修飾試剤として多用されてい
る。 ポリエチレングリコール誘導体を用いてペプチドを修飾
するに際して、その活性化法としてはトリアジン誘導体
による活性化法〔稲田等Ｊｐｎ、　Ｊ。 Ｃａｎｃｅｒ　１ｉｅｓ、　（Ｇａｎｎ）、　７７、１
２６４−１２７０　（１９８６）、　］、］Ｎ−ヒドロ
キシコハク酸イミによる活性エステル法〔レオナルト、
エム等Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ＋　　４０１５８１−１
５８４　（１９８４）、　）　、カルボニルジイミダゾ
ールによる活性化法〔チャールズ、オー、ビーチャム等
Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、　１３１　２５−３３
　（１９８３）、１　、アルデヒドによる活性化法（藤
野等、特開昭６１−１７８９２６号公報〕等号一般的の
ものとして知られている。 しかしながら、これらの修飾法はいずれもペプチドのＮ
末端またはりジン残基ｔ［！１　鎖のアミノ基を修飾す
るものである。 一方、ペプチドには生理活性の発現にＮ末端アミノ基や
リジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多く
存在する。従って、この様なペプチドの場合には上記の
様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾することは活性
の低下につながるので好ましくない、また、リジン残基
のみを修飾するものではその修飾部位が限られてしまう
。ペブチｉ′の性質をコントロールするためにはアミノ
基以外の種々の部位を修飾することが効果的であると考
えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発する意義
は極めて大きい。現在名に知られている他の官能基の修
飾試剤としては、メルカプトＭを修飾するマレインイミ
ド誘導体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フ
ランクＦ、デービス等、特公昭５６−２３５８７号公報
〕等が知られている。しかしながら、メルカプト基は分
子表面にメルカプト基の形で存在しなければ修飾困難で
あると考えられるが、その様な構造を持つペプチドは非
常に少ない。 また、アミノ誘導体による修飾の場合、ペプチド中のア
ミノ基による副反応が起きる為に修！１ｉ試剤のみを選
択的に反応させることが困難である。 一方、ペプチド中のグアニジノ基の低分子修飾試剤とし
ては、フェニルグリオキザール（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、２４８巻、６１７１　（
１９６８））、２．３−ブタンジオン（バイオケミスト
リー、１２巻、３９１５　（１９７３））、１．２−シ
クロヘキサンジオン（ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２５０巻、５５７　（１９７５））
などが知られているが、ポリエチレングリコール誘導体
でペプチド中のグアニジノ基を修飾できる誘導体は、未
だ知られていない。 本発明の目的は、ベブチ、ドのグアニジノ基を選択的に
修飾することのできるポリエチレングリコール誘導体を
提供することである。 本発明の他の目的は、当該ポリエチレングリコール誘導
体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提供
することである。 本発明のさらに他の目的は、当該修飾ペプチドの製造方
法を提供することである。 ［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記目的を達成するために種々研究を重ね
て来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体（１
）がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾する
ことを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに
至った。 本願の第１番目の発明は式 （式中、Ｒは低級アルキル基を表し、ｎはポリエチレン
グリコール部分の平均分子量が約１　、０００〜１２．
０００となる任意の正の整数であることを表す。）で表
されるポリエチレングリコール誘導体（１）である。 本願の第２番目の発明は、ポリエチレングリコール誘導
体（＋）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることによって得られる修飾ペプチドである。 本願の第３番目の発明は、ポリエチレングリコール誘導
体（ｒ）とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることによって得られる修飾ペプチドの製造方法である
。 式（＋）においてＲで表される低級アルキル基は、直鎖
状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチル、エチル
、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素数
１〜４の低級アルキル基が好適である。 本発明のポリエチレングリコール誘導体（１）は以下の
方法にて容易に製造することができる。 即ち、式 ％式％（） （式中、Ｒおよびｎは前記と同意義） で表されるモノアルコキシポリエチレングリコール（ｎ
）と適当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反応
させることにより、式 ％式％（） 〔式中、Ｘ゛はアルキルスルホニルオキシ（たとえば、
メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ等の
炭素数１〜４の低級アルキルスルホニルオキシ）、芳香
族スルホニルオキシ（たとえば、トルエンスルホニルオ
キシ等）またはハロゲン（塩素、臭素等）を表す〕 で表される活性体（Ｉ［＋）に導びく。 この際用いられる活性化試薬としては、たとえば■アル
キルスルホニルクロリド（そのアルキル部分としては前
記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチルス
ルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例示
される）　　（Ｒｏｎａｌｄ　Ｋ。 Ｃｒｏ３ｓ　１ａｎｄ等、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｌｌ
、　３Ｍ、　　３１９５　（１９７０））、■芳香族ス
ルホニルクロリド（たとえば、トルエンスルホニルクロ
リド等）　　（Ｖｌａｄｉｓ＋ｉｒ　Ｃ，５ｅｋｅｒａ
等、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｓ、　Ｓａｃ、　５５．３４
５　（１９３３））　、■五臭化リン（Ｊａｍｅｓ　Ｃ
ａ５ｏｎ等、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　２６゜３６
４５　（１９６１）　）などが挙げられ、さらに０式（
Ｒ′）３Ｐ（式中、Ｒ′はアルキル基（たとえばオクチ
ルなど）、アリル基（たとえばフェニルなど）またはジ
アルキルアミノ基（たとえばジメチルアミノなど）を表
す、〕で表される化合物の存在下で用いられる弐Ｃ（Ｘ
）４　［式中、Ｘはハロゲン（たとえば、塩素、臭素等
）を示す］で表わされる化合物（Ｊ、　Ｈｏｏｚ等、Ｃ
ａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｌｌ、　４６．８６（１９６Ｂ）
　］等が挙げられる。 この際用いられる塩基としては、ピリジン、トリアルキ
ルアミン（たとえば、トリエチルアミン）のような三級
の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が挙
げられる。反応溶媒はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラ上１０フラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常ｏ’ｃ〜、１５
０°Ｃの範囲である。 次いで活性体（ＩＩＩ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドやテトラヒドロフラン等の適当な溶媒中で炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム等の適当な無機塩基もしくはトリエ
チルアミン、トリノルマルブチルアミン、ジアザビシク
ロ−２，２，２−ウンデセン等の有機塩基を用いて６０
〜１２０’Ｃの加熱下にてヒドロキシアセトフェノンと
反応させて式（式中、Ｐおよびｎは前記と同意義） で表されるアセトフェノン誘導体（ｒＶ）を得る。 得られたアセトフェノン誘導体（ＩＶ）を二酸化セレン
等の適当な酸化剤を用いてＮ、　　Ｎ−ジメチルホルム
アミド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、６０〜
１２０°Ｃにて酸化して目的とするポリエチレングリコ
ール誘導体（（）を製造することができる。 かくして製造されたポリエチレングリコール誘導体（１
）は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単離、
精製することができる。 本明細書において、ペプチドとは２個以上のアミノ酸が
ペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋白
質およびその類似構造物質である。 その構成アミノ酸の少なくとも一つは、少なくとも１個
のグアニジノ基を有するもの（たとえば、アルギニン）
である。 かかるペプチド、特に蛋白質としては、たとえばサブス
タンスＰ（視床下部ホルモン）、コルチロトロピン、リ
ボトロピン、メラノトロピン（下ｆｆｌｌｌＪｌ部ホル
モン）、アルギニン−パップレシン（神経下垂体ホルモ
ン）、パラチロイドホルモン（甲状腺ホルモン）、サイ
モポエチン（胸腺因子）、インシュリン、グルカゴン（
膵臓ホルモン）、神経成長因子、上皮成長因子、インシ
ュリン様成長因子−Ｉ、ヒト形質転換発育因子、成長ホ
ルモン放出因子即ちＧＲＦ、塩基性繊維芽細胞成長因子
（成長因子）、セクレチン、コレシストキニン、バソア
クティブインスチナルペブチド、モチリン（胃腸管ホル
モン）、ゴナドトロピン（絨毛膜ホルモン）、性腺刺戟
ホルモン放出ホルモン（性腺刺戟ホルモン）、レラキシ
ン（卵巣ホルモン）、血液凝固因子■因子および■因子
（血友病因子）、ストレプトキナーゼ、フィブリノリシ
ン、デオキシリボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジス
ムターゼ、エラスターゼ、アスパラギナーゼ（酵素）、
＆ｌＩ織プラスミノーゲン活性化因子、即ちｔＰＡ、ウ
ロキナーゼＣ線溶因子）、リンホカイン〔たとえば、イ
ンターロイキン１および■〕、顆粒球マクロファージ・
コロニー刺戟囚子叩らＧＭ−Ｃ８１・゛（刺戟因子ｊ、
エリスロポエチン（増血因子）、カルソトニン遺伝子関
連ペプチド（Ｃａ　１１節ホルモン）、心房性ツートリ
ウム利尿ペブナド＜　１１１　＋ｓ　ホルモン）等の生
理活性を有するペプチドならびにここに例示したペプチ
ドと同様の生理活性を有する類似構造物質が例示される
。なお、」二記の例示二こむいて（）内は当該ペプチド
の用途を記載するものである。 本発明においてペプチドは遺伝子Ｔ学産物、ヒトを含む
各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造さ
れたものでもよい。 本発明の修飾ペプチドの製造は、ポリエチレングリコー
ル誘導体（１）とグアニジノ基を有するペプチドとを反
応させることによってｊｆわれる。 当該反応に際しては、ポリエチレングリコール誘導体（
＋）をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ基
に対して１〜ｌＯＯ倍モル程度用いることが好ましい。 ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には１モル程度
以下のもの（たとえば、Ｏ，１倍モル〜１倍モル）も用
いることができる。当該ペプチドとポリエチレングリコ
ール誘導体（＋）のモル比、反応温度、ｐｉ（等を調節
することにより（１飾の程度を任意に選択することが出
来る。また、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないもの
であればいずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、
炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ
−エチル・モルホリン−酢酸ＪＭ　ｔｊｉ液、マレイン
酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液
が挙げられる。また、当該ペプチドを失活させず、かつ
反応に不活性な有！ａ溶媒、たとえばメタノール、エタ
ノール、プロパツール等の低級アルコールやアセトニト
リル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても
よい。 反応のｐＨは一般的に６〜１０の範囲で選択することが
好ましいが、中性から弱塩基性が特に好ましい。ただし
、アミノ末端に保護されていないα−“？ミノ基を有す
るペプチドの場合は、やや酸性側のｐＨ５，５〜６．５
が好ましい。反応温度は当該ペプチドが失活しない温度
であればいｒれでもよく、たとえば０〜２５°Ｃの範囲
が好ましい。反応は通常暗所で行い、反応時間は３〜７
２時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲル′ａ、過、イオン交換
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフイー、限外濾過、逆相ＨＰＬＣに
よる分取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修
飾ペプチドを得ることができる。 ところで、低分子修飾試剤であるフェニルグリオキザー
ルの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を過
酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミン反応
を起こすという副反応が知られている。（生物化学実験
法１２、蛋白質の化学修飾（上）、６２〜６９頁、（学
会出版センター、１９８１）、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、２４８巻、６１７１（＋９
６８））本発明のポリエチレングリコール誘導体（１）
を用いた修飾においても同様の副反応の可能性が考えら
れる。そこでこのような副反応が懸念される場合には、
グアニジノ基を有するペプチドのアミン基を適当な保護
基で保護した後、ポリエチレングリコール誘導体（１）
と反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保護するとい
う方法によって、修飾ペプチドを製造する方が得策な場
合もある。アミノ基の保ｌｉｌ！基は、ポリエチレング
リコール誘導体（１）と反応性がなく、さらに当該ペプ
チドを失活させることなく脱保護されるものであれば良
く、例えば、スクシニル基、マレイル基、２−メチルマ
レイル基、２．３−ジメチルマレイル基、エキソ−シス
−３，６−ニンドオキソーΔ４−テトラヒドロフタロイ
ル基、エキソ−シス−３，６−ニンドオキシヘキサヒド
ロフタロイル基、テトラフルオロスクシニル基等が挙げ
られる。保護基の導入は、当該分野の公知の方法によっ
て行うことができる。導入試剤としては、相当する酸無
水物、酸ハロゲン化物、活性エステル等が用いられるが
、−ｉ的には相当する酸無水物が多く用いられる。反応
溶媒としては、反応を妨害しないものであればいずれで
もよく、たとえば、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素す
トリウム水溶液、Ｎ−エチルモルホリン−酢酸緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。 また当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、１０パノー
ル等の低級アルコールやアセトニ１〜リル、ジオキサン
、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反応のｐＨ
は６〜１０の範囲で選択することが好ましいが、中性か
ら弱塩基性が特に好ましい。反応温度は当該ペプチドが
失活しない温度であれば、いずれでも良く、たとえば−
５〜２５°Ｃの範囲が好ましい。反応時間は３０分〜３
６時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、限外濾過、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃに
よる分取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精
製して目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ること
ができるが、単離精製することなく引き続いてポリエチ
レングリコール誘導体（１）と反応させアミン拮が保護
されたポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ること
もできる。 アミノ基が保護されたグアニジノ基を有するペプチドと
ポリエチレングリコール誘導体（１）との反応および反
応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同様
の反応条件および精製法で行うことができる。 アミノ基の保護基の脱保護は反応液を酸性に保つことに
よって行うことができる０反応のｐｌ＋は１〜６の範囲
で選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、
当該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法で
も良く、たとえば酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、有機ス
ルホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等）を用いる方法
、ダウエックス５０Ｗ等の酸性樹脂を用いる方法、リン
酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の
緩衝液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法
等が挙げられる０反応は一般的には水溶液のみで行うが
、場合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反
応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノー
ル、プロパツール等の低級アルコールやアセトニトリル
、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い
。反応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればい
ずれでも良く、たとえば０〜４０°Ｃの範囲が好ましい
。反応時間は５分〜６０時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲルｄ＃過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフイー、限外濾過、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ
による分取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の
修飾ペプチドを得ることができる。 本修飾ペプチドは通常の製剤、たとえば皮下的、筋肉内
的もしくは静脈内的適用のための注射溶液のような適切
な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製剤
は自体既知の方法によって製造される。 調製された修飾ペプチドは医薬品組成物として哺乳動物
（ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等）に投与する
ことができる。 その投与量は、たとえば実施例３で得た化学修飾ｔＰＡ
を心筋梗塞の治療のために投与する場合には通常１〜１
００ｇを１日１回から数回に分けて投与される。 〔作用・効果） 本発明のポリエチレングリコール誘導体（１）はペプチ
ド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができるも
のである。 当該ポリエチレングリコール誘導体（１）にて修飾され
たペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、非
常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランスも
著しく遅延（即ち、持続性が延長）され、長時間有効に
その生理活性を示す。 しかも本修飾ペプチドは非修飾ペプチドの有する生理活
性をそのまま有するものであり、当該修飾ペプチドは医
薬品として極めて有効である。 〔実施例］ 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらによって制限されるものではない。 なお、以下の記載において各略号はそれぞれ次のことを
意味する。 Ａｓに　：アスパラギン酸またはアスパラギ／ＧＩＸ　
　：グルタミン酸またはグルタミンＳｅｒ　：セリン　
　　　ｃｒｙ　：グリソンＨｔｓ　　：ヒスチジン　　
Ａｒｇ　　：アルギニンＴｈｒ　：スレオニン　　Ａｌ
ａ　：アラニンＰｒｏ　　ニブロリン　　　Ｔｙｒ　　
：千ロシンシａ１：バリン　　　　Ｍｅｔ　　：メチオ
ニン１１ｅ：イソロイシン　Ｌｅｕ　　：ロイシンＰｈ
ｅ　　：フェニルアラニン　Ｌｙｓ、　：リジン実施例
１ （１）モノメトキシポリエチレングリコールトンレート ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子
＠５０００．４０ｇ）をトルエン１６０−および塩化メ
チレン８０ｄの混合溶媒に溶解した。 塩化ハラトルエンスルホニル（８，０ｇ）、ついでトリ
エチルアミン５．８　ｒｎｌを加え室温で６時間撹拌し
た。次に塩化バラトルエンスルホニル（８，０ｇ）を追
加し、１０時間撹拌した。不溶物をと１＃別しａ、液を
減圧４縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレート
３２．４ｇを得た。（収率７８．６％）、情、９．５５
〜５７°Ｃ ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＰ、、）、ＴＭ３．９０　（ＭＨ
ｚ　）　、　　６２．１８（ｓ）、　　６３．３８（Ｓ
）。 δ３．６２（ｓ）、　　δ７．３（ＡＢｑ）（２）４−
モノメトキンポリエチレングリコール−アセトフェノン （］）で得たモノメトキシポリエチレングリコールトシ
レート（２０ｇ）および４−ヒドロキシアセトフェノン
（５，６ｇ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２００ｄ
に溶解した。炭酸カリウム（５，６ｇ　）を加え１２０
“Ｃの油浴中で４時間撹拌した。 不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシ
リカゲルカラム精製し、標記４−モノメトキシポリエチ
レングリコール−アセトフェノン（１４，７ｇ）を得た
。（収率７３．９％）　、ｍ、ｐ、　５５〜５７°Ｃ ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ（１，）、ＴＭＳ、９０　（ＭＨｚ
）、　　δ２．４２（Ｓ）、　　δ３．３２（Ｓ）。 δ２．６４（Ｓ）、　　δ７．６４（ＡＢｑ）（３）４
−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ
オキザール Ｏ の製造： （２）で得た４−モノメトキシポリエチレングリコール
−アセトフェノン（５０ｇ）を１．　４−ジオキサン５
００ｄに溶解した。二酸化セレン（１０，８ｇ）を加え
４時間還流した。不溶物を濾別し濾液を減圧′ａ縮した
。得られた残渣をシリカゲルカラム精製し４−モノメト
キシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
２７ｇを得た。（収率５３．８％）　、＋ｍ、ｐ、５５
−５７’Ｃ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ　３　）、　　ＴＭ
Ｓ、　　　９０　　（ＭＨｚ）、　　６３．３８（ｓ）
、　　６３．６６（Ｓ）。 ６７．４８（ＡＢｑ） 実施例２ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の製造：ｔ−ＰＡ温溶
液１２■／ｄ、Ｏ，Ｉ　Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ３）４
２０μｌに０．２門炭酸水素ナトリウム水（ＩＭＫＳＣ
Ｎ、ｐＨ８，５）４．６ｍを加えた後、実施例１で得た
４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグ
リオキザール１５０■を加え室温にて４時間撹拌した。 ＩＮ塩酸水にてｐＨ３に調整した。０．６％酢酸水中で
透析した後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を七フア
クリルＳ−２００カラムにてゲル濾過精製した後、セフ
ァデンクス（、−５０Ｆにより精製し、目的物１．９■
を得た。酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０’Ｃ１２４時間処
理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ａｓｘ　　４９．０
　（５０）；　Ｇｌｘ　　５１．８　（５２）；Ｓｅｔ
　　４６．７　（４８）：　Ｇｌｙ　　４５．４　（４
３）；旧ｓ　　１６．４　（１６）；　Ａｒｇ　　２６
．７　（３５）；Ｔｈｒ　　２４．３　（２５）；　Ａ
ｌａ”　３２　　（３２）；Ｐｒｏ　　３０．８　（２
９）：　Ｔｙｒ　　２３．７　（２４）；Ｖａｔ　　２
１．８　（２５）；　Ｍｅｔ　　４．１　（５）；＋１
ｅ　　１７．１　（１９）；　Ｌｅｕ　　４０．６　（
３９）；Ｐｈｅ　　　１６．６　　（１６）；　　Ｌｙ
ｓ　　　２２．８　　（２１）；＊基準アミノ酸、（）
内は理論値 この結果Ａｒｇｉ基が選択的に修飾されていることがわ
かる。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム二マイクロボンダスフェアーＣａ（３，９Ｘ１５
０■）（ウォーターズ社製）を容出液：グラジェント Ａ液：水（０，１χトリフロロ酢酸） ＢｅＬニアセトニトリル（０，１χトリフロロ酢酸）初
期Ｂ液濃度＝３０％ 濃度勾配：１％／分 流速：］ａｆ／分 検出波長：２１４ｎｓ 保持時間：１５．２分 ０分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム：　Ｔ
ＳＫ　Ｇ３０００Ｓ胸７．５ｘ６００ｍｍ（東ソー社製
）溶出液：　０．１　Ｍ　　食塩水（ｐＨ４，０）流速
＝ｌ−／分 保持時間：１１．４分 実施例３ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾＆ｌｌ織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）１１の製造： ｔ−ＰＡ温溶液１２■／ｄ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
ｐＨ５）４２０μｌに０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水（
ＩＭＫＳＣＮ、ＰＩ＋８．５）４．６ｄを加えた後、実
施例１で得た４−モノメトキシポリエチレングリコール
ーフェニルグリオキザール２５．２■を加え室温にて３
時間撹拌した。ＩＮ塩酸水溶液にてｐＨ４に調整した。 反応液をウォーターズ製マイクロボンダスフェア−Ｃ４
，５μ、３００人、φ３．９Ｘ１５０ｍｍカラムを使用
して高速液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目
的物の溶出はトリフロロ酢酸を０，１％加えたアセトニ
トリル水溶液を用い毎分ｌ−の流速でアセトニトリル濃
度を３３％から４３％に毎分０．５％の割合で上昇させ
ることにより行った。得られた生成物の上記条件での高
速液体クロマトグラフィーの溶出時間は　−１３，２分
であった。収量０．８■。本操作により低修飾率のポリ
エチレングリコール誘導体（１）修飾Ｌ−ＰＡが得られ
た。 得られた目的物はＳＤＳゲル電気泳動において、蛋白質
換算で約９００００の位置に泳動した。 実施例４ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾成長ホルモン
放出因子（ＧＲＦ　（１−２９）ＮＨｚ　）の製造： 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ（１２９）ＮＨｚ　３１
００■を水７，３−に溶解した。０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，２）６６ｍおよび実施例１で得た４−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル３．６ｇを加え、暗所室温で終夜撹拌した。反応？ｆ
！２．２０ｄを透析した後凍結乾燥し粗生成物６５７■
を得た。このものをファルマシア製セファクリルＳ−２
００カラムφ２Ｘ７０ｃｍを使用し、０．１　Ｍ食塩水
で流速１−毎分の条件でゲル濾過精製を行った。得られ
た分画を山村科学製ＹＭＣパックＡＭ３０４０ＤＳφ］
Ｘ３０ｃ＋ａカラムを用い、高速液体クロマトグラフィ
ーにて分取精製した。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を
０．１％加えたアセトニトリル水？８液を用い毎分３ｍ
βの流速でアセトニトリル濃度を０％から８０％に毎分
２％の割合で上昇させることにより行った。収量３０．
０ｍｇ。 酸分解物（６Ｎ塩酸１１０°Ｃ２４時間）中のアミノ酸
分析値 Ａｓｘ　　２．９４　（３）；　Ｇｌｘ　　２．０７　
（２）；Ｓｅｒ　　２．８１　　（３）；　　Ｇｌｙ　
　１．３６　　（１）；＾ｒｇ　　１．０４　　（３）
；　　Ｔｈｒ　　Ｏ，９７（＋）；Ａｌａ　　１．４８
　　（３）；　　Ｔｙｒ　　１．０２　　（２）；νａ
ｔ　　Ｏ，７７（１）；　　Ｍｅｔ　　０．７０　　（
１）；！ｌｅ　　２．０１　　（２）；　　１．ｅｕ”
　　４．００　　（４１１；Ｐｈｅ　　Ｏ，９６（１）
；１．ｙｓｌ、ｙｓ　　１．５２　　（２）；＊基準ア
ミノ酸、（）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム二マイクロボンダスフェア−Ｃ１１（３，９Ｘ１
５０ｍ）（ウォーターズ社製））容出液；グラジェント Ａ７＆：水（０，１χトリフロロ酢酸）Ｂ液；アセトニ
トリル（０，１χトリフロロ酢酸）初”Ｊｌ　３　？ｅ
、　ｍ　度：　２０　％濃度勾配：１％／分 流速＝１−／分 保持時間：２６．９分 ０分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム：５ｈ
ｏｄｅｘ　０Ｈ−８８０４７，６Ｘ　５００Ｍ　（昭和
電工）溶出液：　０．　ｌ　Ｍ　　食塩水（ｐＨｚ口流
速；１戚／分 保持時間：ｔ３．Ｓ分 尖藷忽五 ポリエチレングリコール誘導体（＋）修飾顆粒球マクロ
ファージコロニー刺戟因子（ＣＭ−Ｃ３Ｆ）の製造： ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　（５００μ　ｇ１５　０　０−水ｌ容
液）に実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール１１．ｏｍｇを０、
１　Ｍ　’）　７酸緩衝ｉ’ｆｆ１（ｐＨ８，５）　５
００μｆｆｉニ溶解した溶液を加えた。室温で７時間撹
拌した。反応生成物をウォーターズ社製マイクロボンダ
スフェア−Ｃ４（５μ、１００人、φ３．９Ｘ１５０ｍ
ｍ）カラムを使用し高速液体クロマトグラフィーにて分
取精製した。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を０、１％
加えたアセトニトリル水溶液を用い、アセトニトリル濃
度を３６％から５６％に毎分１％の割合で上昇させるこ
とにより行った。収ｌＯ，４１１１ｇ。 得られた精製物は上記条件での高速液体クロマトグラフ
ィーで１２，３分の溶出時間を示した。 類１州ｉ ポリエチレングリコール誘導体（＋）修飾成長ホルモン
放出因子（ＣＲＦ　（１−４４）ＮＨ□〕の製造： 成長ホルモン放出因子（Ｃ，ＲＦ（１〜４４）ＮＨ□］
（２０ｍｇ）の０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯｔ　　（ｐＨ８
，１８，２０ｄ）ｉＷ液に４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール１８．５μｇ（
グアニジノ基に対して１／６当量）を加え、遮光下室温
にて５．５時間放置した。ＩＮ塩酸水ｔ８液を用いて反
応液のｐＨを２，４とした後、セファクリルＳ−２００
スーパーフアイン（ファルマシア製、スウェーデン）の
カラム（２，６ｃ鵬φＸ８４ｃｍ）を用いたゲルｉｌ！
過により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン
社製、米国、膜ＹＭ−１０）により脱塩ａ縮した。得ら
れた目的物の水溶液を、さらにＹＭＣ−ＯＤＳ、Ａ−２
１Ｌ　５μ、４，６■φｘ２５ｏｍｍカラム（山村化学
型）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより二
次精製し、目的物Ａ、目的物Ｂを得た。 目的物Ａの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０　
’Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 ＾ｓｘ　３．８３　（４）；　　Ｇｌｘ　７．１８　（
７）；　　Ｓｅｒ　３．８２　（４）；Ｇｌｙ　３．４
９　（３）；　　Ａｒｇ　４．８７　（６）；　　Ｔｈ
ｒ　１．１７　（１）；Ａｌａ　５．１Ｂ　（５）；　
　Ｔｙｒ　１．８９　（２）；　　νａｌ　１．１０　
（１３；Ｍｅｔ　０．７８　（１）；　　Ｉｌｅ　１．
９５　（２）；　　Ｌｅｕ”　５．００　（５）；Ｐｈ
ｅ　Ｏ，９９（１）；　　Ｌｙｓ　２．２６　（２）本
基準アミノ酸、（）内は理論イ直 目的物Ａの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　　Ｙ？ＩＣ−０［ＩＳ、　Ａ−２１１，５μ
。 ４．６μｍφＸ　２５０ｍｏ＋　（山村化学型）ン容出
液；グラジェント Ａ液；水（０，１！トリフルオロ酢酸）Ｂ液ニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢ｆｊＪ）初期Ｂ液濃度
：２５％ 濃度勾配；１％／分 流速：１ｉ／分 検出波長：２１４ｎ翔 保持時間；２０２分 目的物Ｂの酸分解物（６Ｎ塩酸−フエノール：１１０　
’Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 ＾ＳＸ　３．８２　（４）；　　ＧＩｋ　６．８９　（
７）；　　Ｓｅｒ　３．７０　（４）；Ｇｌｙ　　３．
１７　　（３）：　　　Ａｒｇ　　４．１７　　（６）
；　　　丁ｈｒ　　１．１２　　（１）；Ａｌａ　５．
３１　（５）：　　Ｔｙｒ　１．８０　（２）；　　Ｖ
ａｌ　１．Ｑ５　（１１；Ｍｅｔ　Ｏ，９１（］）；　
　ｌｉｅ　２．０５　（２）；　　Ｌｅｕ”　５．００
　（５）；Ｐｈｅ　Ｏ，９Ｂ　（１）；　　Ｌｙｓ　２
．３１　（２）本基準アミノ酸、（）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ、　Ａ−２１１，５μ。 ４．６ｍφＸ　２５０ＩＩ１ｍ　（山村化学型）溶出液
；グラジェント Ａ液：水（０，１χトリフルオロ酢酸）Ｂ液ニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初ＸＪＩＢ液濃度
＝２５％ 濃度勾配＝１％／分 流速：１ｒｒｄｌ／分 検出波長：２１４ｎ＋１ 保持時間：２Ｌ８分 実益±１ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾成長ホルモン
放出因子（ＧＲＦ　（ｌ−２９）Ｎｌ２　）Ｈの製造； 成長ホルモン放出因子（ＯＲＦ（１−２９）ＮＨｚｌ（
３０■）の０．０２　ＭリンｆＩＩＩ！ｄｉ液（ｐｌ＋
５．５２．３Ｒ１）溶液に４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール＋２８．５ｍｇ
（グアニジノ基に対して１当量）を加え、遮光下室温に
て７２時間放置した。この反応液を七フアクリルＳ−２
００スーパーファイン（ファルマシア製、スウェーデン
）のカラム（２，６ｃｍφＸ８１ｃｍ）を用いたゲル濾
過により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン
社製、米国、膜ＹＭ−５）により脱塩濃縮した。得られ
た目的物の水溶液を、さらにＹＭＣ−ＯＤＳ、Ａ−２Ｌ
Ｌ　５μ、４．６閣φＸ２５０ｍ＋＋カラム（山村化学
型）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより二
次精製し、目的物を得た。 目的物の酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０゛Ｃ
１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析イｄ

【 ＾ｓｘ　　３．０９　　（３ｈ　　　Ｇｌｘ　　２．２
６　　（２）；　　　Ｓｅｒ　　２．８６　　（３）；
Ｇｌｙ　　１．＋７　　（１）；　　　八ｒｇ　　１．
９２　　（３）；　　Ｔｈｒ　　Ｏ，９Ｂ　　（１）；
Ａｌａ　　２．９５　　（３ｈ　　　Ｔｙｒ　　１．８
４　　（２）；　　　Ｖａｌ　　１．０３　　（１）：
Ｍｅｔ　　１．１０　　（１）；　　　Ｉｌｅ　　１．
８４　　（２）；　　　Ｌｅｕ”　　４．００　　（４
）；Ｐｈｅｌ、０１（１）：Ｌｙｓ２．０３（２）本基
準アミノ酸、（）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　　ＹＭＣ−ＯＤＳ、　Ａ−２１１，５μ。 ４．６■φ×２５０帥（山村化学型） 溶出ｆＬ：グラジェント Ａ液：水（０，ｌχトリフルオロ酢酸）Ｂ液ニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初期Ｂ液濃度：２
５％ 濃度勾配：１％／分 流速＝１献／分 検出波長：２１４ｒｖ 保持時間＝２１．９分 Ｏ高速ゲルｉ＋１過クロマトグラフィーカラム：　ＴＳ
Ｋ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５　Ｉｎｌ１φ×６００１１
１１１（東ソー社製） 溶出液：０．２Ｍ食塩水 流速７０．６ｒｄＺ分 検出波長：２５４ｎ削 保持時間；２３分 尖施旌■ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾成長ホルモン
放出因子（ＧＲＦ　（１−２９）ＮＨ！　３■の製造； 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ，）（
ｌＯｌｌｇ）の０．０２　Ｍリン酸緩衝液（ρ）１６．
５３．５ｄ）ン容液に４−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール４３■（クアニジノ
基に対して１当量）を加え、遮光上室温にて３９時間放
置した。この反応液をセファクリルＳ−２００スーパー
フアイン（ファルマシア製、スウェーデン）のカラム（
２，６ｃ＋ａφ×８１ｃ謬）を用いたゲル濾過により精
製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社製、米国
、ＹＭ−５）により脱塩濃縮した。得られた目的物の水
溶液を、さらにＹＭＣ−ＯＤＳ、Ａ−２１］、５μ、４
．６　ｒｍφＸ２５０ｍ５カラム（山村化学型）を用い
た逆相高速液体クロマトグラフィーにより二次精製し、
目的物を得た。 目的物の酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０°Ｃ
１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ａ３Ｘ
　２．６３　＜３）；　　Ｇｌｘ　２．００　（２）；
　　Ｓｅｒ　２．６５　（３）；Ｇｌｙ　１．０４　（
１）；　　Ａｒｇ　１．６０　（３）；　　Ｔｈｒ　Ｏ
，８１（１）；Ａｌａ　２．９６　（３）；　　Ｔｙｒ
　１．７５　（２）；　　νａｔ　１．０１　（１）　
：Ｍｅｔ　１．１９　（１）：　　ＩＩｓ　１．８３　
（２）；　　Ｌｅｕ”　４．００　（４）；Ｐｈｅ　Ｏ
，８５（１）；　　Ｌｙｓ　１．９５　（２）本基準ア
ミノ酸、（）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム　：　ｖＩＩｃ−００５，Ａ−２１１，５ｕ。 ４．６鵬φ×２５０閏（山村化学型） 溶出液：グラジェント Ａ液：水（０，１χトリフルオロ酢酸）８ｅニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初期Ｂ液濃度：２
５％ 濃度勾配：１％／分 流速：１ｍ／分 検出波長：２１４ｎｍ 保持時間：２１．９分 夫血汎エ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾＆Ｉ礒プラス
ミノーゲン活性化囚子Ｄ−ＰＡ）［［ｌの製造： ｔＰＡ５．０ｍｇ１０．８５％ＮａＣｊ２−０．０１χ
Ｔｉ＋ｅｅｎ８０　（１７０μｊりに０．０２　Ｍ　　
Ｎ　ａ　Ｈｚ　Ｐ　Ｏ−−Ｈ，ＰＯ，（ＩＭ　　ＫＳＣ
Ｎ含有、ｐＨ６，０）　５．　Ｏｄを加え、ｌＮＮａＯ
Ｈでｐｏ６．ｏに調整する。 実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレングリコー
ル−フェニルグリオキザール６６．５ｕ（グアニジノ基
に対して５当量）を加え、遮光上室温にて１６時間放置
後、さらに修飾試剤６６．５　ｔａｇを加え、同様にし
て１６時間放置した。反応液を限外濾過（アミコン社製
、米国、膜ＹＭ−３０）により過剰の試剤と塩類を除去
した後、セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製、
スウェーデン）のカラム（２，６ｃｍφＸ９４ｃｍ）を
用いたゲル濾過により目的物Ａを含む分画、目的物Ｂを
含む分画が得られた。それらをそれぞれ限外濾過（アミ
コン社製、米国、膜ＹＭ−３０）により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物ＡおよびＢの水７容イ夜を得た
。 目的物への酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、＋１０“
Ｃ２２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析（直 Ａｓｘ　　４７．５　　（５０）；　　　Ｇｌｘ　　５
４．８　　（５２）；Ｓｅｔ　４５．４　　（４８）；
　　Ｇｌｙ　４７．９　　（４３）；旧ｓ　　１５．０
　　（１６）；　　　八ｒｇ　　２５．８　　（３５）
；Ｔｈｒ　２０．７　　（２５）；　　Ａｌａ　３１．
８　　（３２）；Ｐｒｏ　２９．４　　（２９）；　　
Ｔｙｒ　２２．３　　（２４）；Ｖａｌ　　２１．１　
　（２５）；　　Ｍｅｔ　４．３０　　（５）；ｌｉｅ
　１６．１　　（１９）Ｂ　　Ｌｅｕ”　３９．０　　
（３９）；Ｐｈｅ　１７．１　　（１６）；　　Ｌｙｓ
　２２．８　　（２１）＊基準アミノ酸、（）内は理論
値 目的物への高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　　ＹＭＣ−ＯＤＳ、＾−２１１，５μ。 ４．６１１１！ｌφ×２５０１１ＩＩｌ（山村化学社製
）ｌ容出液：グラジェント Ａ液：水（０，１Ｘトリフルオロ酢酸）８液；アセトニ
トリル（０，１ズトリフルオロ酢酸）初期Ｂ液濃度：３
０％ 濃度勾配：１％／分 流速：１ｉｄ１分 検出波長：２１４ｎｍ 保持時間７１４．６分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５卿φＸ　６
００ｍｍ（東洋ソーダ社製） 溶出液＝０．２Ｍ食塩水 流速：０．６μ１分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間：２１．４分 目的物Ｂの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０’
Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Ａｓｘ　４６．５　（５０）；　　Ｇｌｘ　４８．０　
（５２）；Ｓｅｒ　　４６．３　　（４８）；　　　Ｇ
ｌｙ　　４７．１　　（イ３）；旧ｓ　１４．６　（１
６）；　　＾ｒｇ　２７．２　（３５ｈＴｈｒ　２１．
２　（２５）；　　Ａｌａ　３２．１　（３２）；Ｐｒ
ｏ　３０．４　（２９）；　　Ｔｙｒ　２４．２　（２
４）；Ｖａｌ　２１．９　（２５）；　　Ｍｅｔ　６．
０６　（５）；１１ｅ　１６．５　（１９）；　　Ｌｅ
ｕ”　３９．０　（３９）；Ｐｈｅ　１６．５　（１６
）；　　Ｌｙｓ　２０．９　（２１）＊基準アミノ酸、
（）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　　ＹＭＣ−００５，Ａ−２１１，５μ。 ４．６Ｍφ×２５０Ｉｎ１１（山村化学社製）溶出ｅ：
グラジェント Ａ液；水（０，１χトリフルオロ酢酸）Ｂ液ニア七ト二
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初期Ｂ液濃度：３
０％ 濃ｒ変勾配：１％／分 流速：１ｄ／分 検出波長：２１４ｎａ＋ 保持時間：１４．５分 ○高速ゲルｉｌ！過クロマトグラフィーカラム：　ＴＳ
Ｋ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５　舗φＸ　６００ｍｍ（東
洋ソーダ社製） 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 流速：０．６ｄ／分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間：　２２．１分 実淘ＬＬＬ則 ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾ヒトＣｕ、Ｚ
ｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ。 Ｚｎ−ｈｓＯＤ）の製造： Ｃｕ、Ｚｎ−ｈｓＯＤ　（４，８９ｎ＋ｇ、シグマ社製
、ヒト赤血球由来）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ
　　０１０２Ｍ　　　Ｎａｚ　　ＣＯｚ　　　（ｐＨ８
，９７、２，５ｍ１Ｖｔ容液に　４−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール７０Ｉ１
ｇ（グアニジノ基に対してＩＯ当型）を加え、遮光下室
温にて２３．５時間攪拌した。酢酸を用いて反応液のｐ
Ｈを５．０とした後、限外濾過（アミコン社製、米国、
ＹＭ−３０）により過剰の試剤と塩類を除去した後、セ
ファクリルＳ−２００（ファルマシア社製、スウェーデ
ン）のカラム（２，６ｃｍφＸ９４ｃｍ）を用いたゲル
濾過により精製し、目的とする分画を限外ｉｌ！過（ア
ミコン社製、米国、ＹＭ−３０）により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物を含む水？８？＆（１０ｍｌ、
蛋白含量１４．０μＭ）を得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０°Ｃ２２４時
間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値へｓｘ、３３．
２　（３６）；　　Ｇｌｘ　２６．６　（２６）；Ｓｅ
ｒ　１８．７　（２０）；　　ｃｌｙ　４９．４　（５
０）；Ｈｉｓ　１４．１　（＋６）；　　Ａｒｇ　４．
７　　（８）；Ｔｈｒ　１３．５　（１６）：　　Ａｌ
ａ”　２０．０　（２０）；Ｐｒｏ　１１．１　（１０
）；　　Ｖａｌ　２６．２　（２８）；１１ｅ　１３．
１　（１８）；　　Ｌｅｕ　１９．６　（１８）；Ｐｈ
ｅ　８．４　　（８）；　　Ｌｙｓ　１９．９　（２２
）＊基準アミノ酸、（）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾ＳＯＤが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 Ｏ高速ゲルａｌ！５クロマトグラフィーカラム：　ＴＳ
Ｋ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５　ｍｍφＸ　６００ｕ＋ｍ
（東洋ソーダ社製） 溶出液二〇、２Ｍ食塩水 流速：０．６ｒｄ１分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間＝２０．６分 １１屯−例ＩＩ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾中Ｃｕ。 Ｚ　ｎ−スーパーオキシドジスムターゼの製造：牛Ｃｕ
、Ｚｎ−スーパーオキンドデスムターゼ（Ｃｕ、　　Ｚ
ｎ　−ｂｓＯＤ）　７．５ｍｇを０．２　Ｍ　　Ｎａ１
ｌＣＯｒ水（ｐＨ８，５）　１．８７５戚に溶かした後
、実施例１で得た４−メトキシポリエチレングリコール
−フェニルグリオキザール４７．５ｍｇを加え、遮光下
室温にて１９時間反応させた。反応終了後水２ｄを加え
、２規定酢酸にて約ｐＨ４とした。ごの１６Ｗｉ、をセ
ファクリルＳ−２００を用いたゲル濾過（カラムサイズ
２．６ｃ＋＊φｘ８０ｃｍ、ｉ出Ｍ０．１Ｍ酢酸水十０
．２Ｍ食塩水（ｐＨ２，８）、流速２ｍ１／分）にて精
製を行った。目的物を含む分画を集め、限外濾過により
脱塩・濃縮を行い、目的物を含む０．０１Ｍ酢酸水溶液
１０−（蛋白含量４．２１ｍｇ）を得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸、１１０’Ｃ１２４時間処理）中の
アミノ酸分析値 ＾！！Ｘ　２７．４　（３４）；　　Ｇｌｘ　２］、５
　（２２）；Ｓｅｒ　１４．５　（１６）；　　Ｇｌｙ
　４２．１　（５０）；旧ｓ　１２．７　（＋６）；　
　Ａｒｇ　５．７　　（８）；Ｔｈｒ　　１９．１　　
（２４）；　　　八ｌａ　　１８．０′″　（１８）；
Ｐｒｏ　　１２．９　　（１２）：　　Ｔｙｒ　２．８
　　（２）：Ｖａｌ　　２２．４　　（３０）；　　Ｍ
ｅＬ　２．８　　（２）；ｌｉｅ　　１２．８　　（１
８）；　　Ｌｅｕ　　１７．１　　（１６）：Ｐｈｅ　
８．４　　（８）；　　　Ｌｙｓ　　１６．０　　（２
０）＊を基準よして、（）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：マイクロボンダスフェア−ＣＩｌｌ（３，９ｙ
ｍφＸ１５０ｕ＋ａ） （ウォーターズ社！！り ｌ古川７夜：グラジェント Ａ液；水（０，１χトリフルオロ酢酸）Ｂａニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初！ＩＪＩＢ液濃
度；３５％ 濃度勾配：１％／分 流速；１ｄ／分 検出波長：２２０ｎ信 保持時間；１２．３分 ０分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム：　Ｔ
ＳＫ　Ｇ３０００ＰＷＸＬ（７，８ｒｍφ×３００Ｉｎ
１１）×２（東ソー社製） 溶出？ｌｉ　：　０．２　Ｍ食塩水 流速：０．６ｒｎｌ１分 検出波長：２５４ｎ− 保持時間：２２．６分 月１１［１ ポリエチレングリコール誘導体（＋）修飾インシュリン
様成長因子−１（ＩＣＦ−１）の製造：ＩＧＦ−１（４
，３ｍｇ）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣ０ｗｌ０．０
２　Ｍ　Ｎ　ａ　ｚＣＯ：＋　（ｐＨ８，９７，３，０
ｄ　）溶液に室温で撹拌下、２−メチルマレイン酸無水
物（２０μｌ）を１０分間隔で５回加えた。この間反応
液のｐＨを８〜９になる様にＩＮ　　ＮａＯＨを加え調
節した。さらに、１時間反応液のｐＨを８〜８．５にな
る様ＩＮ　　ＮａＯＨを加えながら室温で攪（牢した。 ついで、上記パンファー１Ｉ１１１！を加え、ＩＮ　　
ＮａＯＨでｐＨ８，９７とした後、実施例１で得た４−
モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオ
キザール１２．６３　ＩＩ＋ｇ　（グアニジノ基に対し
て０．７当量）を加え、遮光上室温にて１６時間攪拌し
た。酢酸を用いて反応液のｐＨを６，７４とした後、セ
ファクリルＳ−２００（ファルマシア社製、スウェーデ
ン）のカラム（２，６ｃｍφ×９４ｃ＋ｉ）を用いたゲ
ル濾過により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミ
コン社製、米国、膜ＹＭ−１０）により、脱塩・ａＷ＋
・した。この濃縮物に酢酸を加えρ１１２．１２とし、
３７゛Ｃで９．５時間撹拌した。ｌＮＮａＯＨで中和後
、限外ｉ１１過（アミコン社製、米国、膜ＹＭ−１０）
により、脱塩・濃縮し、更に、限外濾過（ミリボア社製
、米国、ＵＦＰＩ　　ＴＧＣ）により濃縮することによ
って、目的物を含む水溶液（５００μＰ、蛋白合計１４
８μＭ）を得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０’Ｃ１２４時
間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ａｓｘ　４．７
５　（５）：　　Ｇｌｘ　５．６０　（６）；　　Ｓｅ
ｒ　４．８１　（５）：Ｇｌｙ　６．９６　　（７）；
　　Ａｒｇ　３．５Ｂ　　（６）；　　Ｔｈｒ　２．９
５　　（３）；＾Ｉａ　６．３５　　（６）；　　Ｐｒ
ｏ　５．２２　　（５）；　　Ｔｙｒ　３．０８　　（
３）；Ｖａｌ　　２．３７　　（３）：　　Ｍｅｔ　０
．３７　　（１）；　　　Ｉｌｅ　Ｏ，４２（１）：！
、ｅｕ’　６．００　　（６）：　　Ｐｈｅ　３．９４
　　（４）；　　Ｌｙｓ　３．３２　　（３）本店率ア
ミノ酸、（）内は理論値 この結果、Ａｒｇ残基が選択的に修飾されていることが
わかる。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　　ＹＭＣ−００５，＾−２１１，５ＩＩ。 ４　、６　ｍｍφＸ　２５０＋ａｍ　（山村化学社製）
ｌ古用ｌ夜＝グラジェント ＾液；水（０，１χトリフルオロ酢酸）Ｂ液；アセトニ
トリル（０，ｌχ１−リフルオロ酢酸）初期Ｂａ、濃度
；２５％ 濃度勾配；１％／分 流速：ｌ−７分 検出波長：２１４ｎｍ 保持時間：２＋、０分 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５　ｍｎφＸ
　６００ｎｍ（東洋ソーダ社製） 溶出液・０，２Ｍ食塩水 流速二０．６＃ｌ／分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間：２１．６分 尖施撚土ｌ ポリエチレングリコール誘導体（１）（ｌｌｉインツユ
リン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）（ｌの製造；ｌＧ１
１　（４，１ｌｒｌｇ）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣ
０３Ｎ　　ａ　ｚＣＯｓ　　　（ｐＨ８，９７、２，０
ｍｌ　）　　ン容ｌ夜に撹拌下、室温で、２−メチルマ
レイン酸無水物（２０μｆ）を１０分間隔で５回加えた
。この間反応液のｐＨを８〜９になる様にｌＮＮａ０ｔ
（を加え調節した。さらに、１時間反応液の−ｐＨを８
〜８．５になる様Ｉ　Ｎ　　Ｎ　ａ　ＯＨを加えながら
室温で攪拌した。ついで、上記バッファー１　ｔａｌを
加え、ｌＮＮａＯＨでＰＨ８，９７とした後、実施例１
で得た４−モノメトキシポリエチレングリコールーフェ
ニルグリオキザール３．３ｇ（グアニジノ基に対して０
．１７当ｆｉｔ）を加え、遮光下室温にて１７時間攪拌
した。セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製、ス
ウェーデン）のカラム（２，６ｃｍφ×９４ｃｍ）を用
いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を限外濾過
（アミコン社製、米国、膜ＹＭ−１０）により、脱塩・
濃縮した。このａｗｉ物に酢酸を加えｐ１１２．１２と
し、３７°Ｃで８時間攪拌した。 ＩＮ　　ＮａＯＨで中和後、限外ｉ！！過（アミコン社
製、米国、膜ＹＭ−１０）により、脱塩・ａ縮し、さら
に、限外濾過（ミリボア社製、米国、ＵＦＰＩ　　ＴＧ
Ｃ）により濃縮することによって、目的物を含む水溶液
（５００μｒ、蛋白含量１３３．５μＭ）を得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０°Ｃ１２４時
間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ａｓｘ　５．１
９　（５）；　　Ｇｌｘ　６．８１　（６）；　　Ｓｅ
ｒ　５．００　（５）；Ｇｌｙ　７．２１　（７）；　
　Ａｒｇ　４．１４　（６）；　　Ｔｈｒ　３．０１　
（３）；Ａｌａ　５．７９　（６）；　　Ｐｒｏ　４．
４７　（５）；　　Ｔｙｒ　２．６８　（３）；Ｖａｌ
　２．６５　（３）；　　Ｍｅｔ　０．６３　（１）；
　　Ｉｌｅ　１．３１　（１）；Ｌｅｕ”　６．００　
　（６）；　　Ｐｈｅ　３．４９　　（４）；　　Ｌｙ
ｓ　３．０４　　（３）本基準アミノ酸、（）内は理論
値 本操作により、低修飾率のポリエチレングリコール修飾
ＩＣＦ−１が得られた。目的物の高速液体クロマトグラ
フィーの挙動は以下の通りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　　ＹＭＣ−００５，＾−２１１，５μ。 ４．６１φ×２５０鵬（山村化学社製）溶出液：グラジ
ェント Ａ液：水（０、ｌχトリフルオロ酢酸）Ｂ液ニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初期Ｂｌ濃度：２
５％ 濃度勾配８１％７分 流速＝１ｄ／分 検出波長：２１４ｎ− 保持時間：１９．２分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５　ｒｍφＸ
　６００ｍ＋ａ（東洋ソーダ社製） 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 流速：０，６ｄ／分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間：２３１分 見Ｉ！ｉ□士 ポリエチレングリコール誘導体（＋）修飾インシュリン
様成長因子（Ｉｃ；Ｆ−１）ＩＩＩの製造；ＩＧＦ−１
（５，００ｍｇ）の０゜２Ｍ　　ＮａＨＣＯ＊０．０２
Ｍ　　Ｎａｇ　Ｃｏｔ　　（ｐｌ＋８．９７．２．０１
１１）溶液に撹拌上室温で、２−メチルマレイン酸無水
物（２０μＮ）を５分間隔で５回加えた。この間ＩＮ　
　ＮａＯＨを用いて、反応液のｐｌ＋を８〜９に調節し
た。さらに、１時間ＩＮ　　ＮａＯＨを加えながら、反
応液のｐＨを８〜８．５に保持した。ついで、反応液の
ｐｌ＋を８．９７に調整した後、実施例１で得た４−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ５オ
キザール３．４■（グアニジノ基に対して０．１７当量
）を加え、遮光下室温にて１６時間放１した０反応混合
物をセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製、スウ
ェーデン）のカラム（２、６ｃｒ１φＸ９４ｃ＋ｉ）を
用いたゲルｉ１．＃、　ｉにより精製し、目的とする分
画を限外源Ｉ！１（アミコン社製、米国、膜ＹＭ−１０
）により、脱塩・１ｌ１１ｉ！シた。 この濃縮物に酢酸を加えｐＨ２，０１とし、４０“Ｃで
１１時間攪拌した。ｌＮＮａＯＨでｐｌ＋５．０とした
後、限外ｉｉｔ過（アミコン社製、米国、ｌＩ＠　Ｙ　
Ｍ　−１０）により、脱塩・濃縮し、さらに限外濾過（
ミリボア社製、米国、ＵＦＰＩ　　ＴＧＣ）により再濃
縮することによって、目的物の水溶液（８００μｌ、蛋
白含量１４４μＭ）を得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０°Ｃ１２４時
間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ａｓｘ　５．２
９　（５）；　　Ｇｌｘ　６．５８　（６）；　　Ｓｅ
ｒ　５．１１　（５）；Ｇｌｙ　８．４７　（７）；　
　Ａｒｇ　４．６７　（６）；　　Ｔｈｒ　２．７６　
（３）：Ａｌａ　７．３５　（６）；　　Ｐｒｏ　６．
８５　（５）；　　Ｔｙｒ　３．０８　（３）；Ｖａｌ
　２．６３　（３）；　　Ｍｅｔ　１．１５　（１）；
　　ｌｌｅ　Ｏ，５８（１）；Ｌｅｕ”　６．００　（
６）；　Ｐｈｅ　３．６４　（４）；　Ｌｙｓ　２．１
？　（３）本基準アミノ酸、（）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ、　Ａ−２１１，５μ。 ４．６閣φ×２５０−（山村化学社製）溶出液；グラジ
ェント Ａ液：水（０、ｌχトリフルオロ酢酸）Ｂ液ニアセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初ｊ’ＪＩ　Ｂ　
ｆｉ１度：　２５　％濃度勾配＝１％／分 流速：］ｄ／分 検出波長：２１４ｎｍ 保持時間：１７．４分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＰＷ　７．５順φＸ　６
００ｍ（東洋ソーダ社製） 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 流速７０．６ｄ／分 検出波長：２５４ｎｓ＋ 保持時間：２４．７分 夫隻舅土■ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾成長ホルモン
放出因子［ＧＲＦ　（１−２９）ＮＨ□］■の製造： 成長ホルモン放出因子（Ｇ　ＲＦ　（１−２９）　ＮＨ
ｚ）１００■を０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯ，−Ｎａｇ　Ｃ
０５（ｐＨ９）５０ａｆｆｉに溶解した。この溶液に無
水マレイン酸２６０■を含むアセトン溶液３Ｉ１１を氷
冷下加え、氷冷下２時間反応させた０反応終了後反応液
をそのまま、ウォーターズ製マイクロボンダスフェア−
Ｃ１１、φ１９Ｘ１５０ｍカラムを使用して高速液体ク
ロマトグラフィーにて分取精製した。 目的物の溶出はアセトニトリル水溶液を用い、毎分９．
９ｄの流速でアセトニトリル濃度を３０％から７５％ま
で毎分１％の割合で上昇させることにより行った。目的
物を含む分画を凍結乾燥することにより目的とするマレ
イル化ＧＲＦ（１２９）ＮＨｚ′を４５■得た。このよ
うにして得たマレイル化Ｇ　ＲＦ　（１−２９）　Ｎ　
Ｈ！　１５ｍｇを０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯ。 （ｐ）１８．２）に溶かし、実施例１で得た４−メトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール６
１５■を加え、暗所室温にて８時間反応した６反応終了
後ＩＮ−酢酸にて中和し、その溶液を２回に分け、セフ
ァクリルＳ−２００を用いたゲル濾過精製（カラムサイ
ズ２．６　ｃ＋＊φＸ　９４　ｃｍ、溶出液０．２Ｍ食
塩水、流速２ｄ／分）を行った。 目的物を含む分画を集め、脱塩・濃縮を行い、目的物を
含む水溶液４．５　ｄを得た。続いて、この溶７夜２５
−に２規定酢酸水２．５社を加え、３７゛Ｃにて４００
時間反応せ、脱マレイル化を行い、目的とするポリエチ
レングリコール誘導体（１）修飾成長ホルモン放出因子
（ＧＲＦ　（＋１９）ＮＨ，）を得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸、１］０°Ｃ１２４時間処理）中の
アミノ酸分析値 八ＳＸ　３．０６　（３）；　　Ｇｌｘ　１．９７　（
２）；　　Ｓｅｒ　２．８０　（３）；Ｇｌｙ　１．０
２　（１）；　　Ａｒｇ　１．１９　（３）；　　Ｔｈ
ｒ　１．０３　（１）；八ｌａ　　３．３２　　（３）
；　　　Ｔｙｒ　　１．９９　　（２）；　　　Ｖａｌ
　　１．０４　　（１）；Ｍｅｔ　１．０９　（１）；
　　ｌｉｅ　２．０９　（２）；　　Ｌｅｕ　４．００
”　（４）；Ｐｈｅ　１．０９　（１）；　　Ｌｙｓ　
１．８４　（２）＊を基準として、（）内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム；マイクロボンダスフェア−Ｃ０（３，９ｍｍφ
×１５０止） （ウォーターズ社製） ン古用ｌ＆：グラジェント Ａ液：水（０，１χトリフルオロ酢酸）Ｂ液；アセトニ
トリル（０，１χトリフルオロ酢酸）初期Ｂ液濃度：３
５％ 濃度勾配；２％／分 流速：１ｒｄ／分 検出波長：２２０ｎｍ 保持時間１０．５分 ０分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム：　Ｔ
ＳＫ　Ｇ３０００Ｐ賀 ７．５膿φ×６００薗 （東ソー社製） 溶出１：　０．２　Ｍ食塩水 流速：０．６ｄ／分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間：　２２．１分 実［ ポリエチレングリコール誘導体Ｎ）修飾ヒトＣｕ、Ｚｎ
−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ。 Ｚｎ−ｈｓＯＤ）Ｈの製造： Ｃｕ、Ｚｎ−ｈｓＯＤ　（１５，１２＋ｇ、シグマ社製
、ヒト赤血球由来）の０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯ，−０，
０２Ｍ　　　ＮａｚＣＯｚ　　　（ｐＨ９，２５、７，
５ｄＨ容液に４−モノメトキシポリエチレングリコール
−フェニルグリオキザール１９，６■（グアニジノ基に
対してｌ当りを加え、遮光下室温にて８時間攪拌した。 さらに試剤３９．２ｍｇ（グアニジノ基に対して２当り
を加え、同様にして、１６時間放置した。２Ｎ−酢酸を
用いて反応液のｐＨを６．９５とした後、セファクリル
Ｓ−２００（ファルマシア社製、スウェーデン）のカラ
ム（２，６ｃｍφ×９４ｃｍ）を用いたゲル濾過および
高速ゲル濾過クロマトグラフィー（ＴＳＫ　　Ｃ３００
０ＳＷ）により精製し、目的物Ａを含む分画、目的物Ｂ
を含む分画が得られた。各々の分画を限外濾過（アミコ
ン社１１、米国、膜ＹＭ−３０）　によ＃）、脱塩・ｆ
ａＩｌｉ！することによって、目的物Ａを含む水／８液
］、８ｍ（蛋白含量１．７８ｍｇ／ｉｆ）および目的物
Ｂを含む水溶液１．８ｄ（蛋白含量４６０μｓ　／　Ｉ
ｉ）を得た。 目的物Ａの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０“
Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Ａｓｘ　３３．５　（３６）；　　Ｇｌ＋＋　２６．０
　（２６）；Ｓｅｔ　１８．７　（２０）；　　Ｇｌｙ
　４９．０　（５０）；旧ｓ　１６．８　（１６）；　
　Ａｒｇ　６．２１　（８）；Ｔｈｒ　１４．７　（１
６）；　　Ａｌａ”　２０．０　（２０）；Ｐｒｏ　１
０．９　（１０）；　　Ｖａｌ　２５．８　（２８）；
１１ｅ　１３．９　（１Ｂ）；　　Ｌｅｕ　１９．４　
（１８）；Ｐｈｅ　　８．１　（８）；　　Ｌｙｓ　１
８．３　（２２）；＊基準アミノ酸、（）内は理論値 目的物への高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷ　７．５■φ×６０
０馴（東洋ソーダ社製） 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 （５％エタノール含有） 流速７０．６ｄ／分 検出波長：２２０ｎ■ 保持時間４２２．４５分 目的物Ｂの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０’
ｃ、２４時間処理後の分解物〕中のアミノ酸分析値 八ｓｘ　３４．２　（３６）；　　ＧＩＸ　２６．５　
（２６）ｉＳｅｒ　１８．４　（２０）；　　Ｇｌｙ　
４８．８　（５０）；ｔｌｉｓ　１６．４　（１６）；
　　Ａｒｇ　７．０３　（８）；Ｔｈｒ　１４．６　（
１６）；　　Ａｌａ”　２０．０　（２０）；Ｐｒｏ　
１１．０　（１０）；　　Ｖａｌ　２５．４　（２８）
；１１ｅ　１３．１　（１８）；　　Ｌｅｕ　１８．４
　（１Ｂ）；Ｐｈｅ　　７．４　（８）；　　Ｌｙｓ　
１７．１　（２２）；＊基準アミノ酸、（）内は理論値 目的物Ｂの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００！Ｊ　７．５　ｍφＸ　
６００ｍ（東洋ソーダ社製） 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 （５％エタノール含有） 流速：Ｏ，６−７分 検出波長：２２０ｎｍ 保持時間：２５．１６分 夫施■上１ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾ヒトＣｕ、Ｚ
ｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ。 Ｚｎ−ｈｓＯＤ）ｍの製造： Ｃｕ、Ｚｎ−ｈｓＯＤ　（１０，２０＋ａｇ、シグマ社
製、ヒト赤血球由来）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣＯ
＊−〇、０　２Ｍ　　　ＮａｔＣＯｓ　　　（ｐＨ９，
２５、５，０−）ｉ容液に４−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フチニルグリオキザール７０■（グアニ
ジノ基に対して５当Ｍ）を加え、遮光下室温にて１８時
間放置した。２Ｎ−酢酸を用いて反応液のｐＨを６．９
とした後、セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製
、スウェーデン）のカラム（２，６ｃｓφ×９４Ｃ重）
を用いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を限外
濾過（アミコン社製、米国、膜ＹＭ−３０）により、脱
塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶液１．８
ｄ（蛋白含量１．５９■／ｄ）を得た。酸分解物（６Ｎ
塩酸−フェノール、１１０℃、２４時間処理後の分解物
）中のアミノ酸分析値Ａｓｘ　３３．０　（３６）；　
　Ｇｌｘ　２６．２　（２６）：Ｓｅｔ　１８．６　（
２０）；　　Ｇｌｙ　４Ｂ、２　（５０）：旧ｓ　１６
．４　（１６）；　　Ａｒｇ　５．８９　（８）；Ｔｈ
ｒ　１４．４　（１６）；　　Ａｌａ”　２０．０　（
２０）；Ｐｒｏ　１１．１　（１０）；　　Ｖａｌ　２
６．４　（２８）；ｌｉｅ　１３．９　（１８）；　　
Ｌｅｕ　１９．５　（１Ｂ）：Ｐｈｅ　７．９　　（８
）：　　Ｌｙｓ　１７．０　（２２＞本基準アミノ酸、
（）内は理諜自（面 木操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾ＳＯＤが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫＧ３０００ＳＷ　７．５　ｔｒｍφＸ
　６００Ｍ（東洋ソーダ社製） 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 溶出液：　０．２　Ｍ食塩水 （５％エタノール含有） 流速：０．６１ｄ／分 検出波長：２２０Ｍｍ 保持時間：２０．１９分 １隻炭上ｌ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾ヒトＣｕ、Ｚ
ｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ。 Ｚｎ−ｈｓＯＤ）ＩＶの製造： Ｃｕ、Ｚｎ−ｈｓＯＤ　（４，９２ｍｇ、シグマ社製、
ヒト赤血球由来）の０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯ，−０，０
２Ｍ　　ＮａＩＣＯ３（ｌｌＨ９，２５，２，５ｄ）溶
液に４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニ
ルグリオキザール７０■（グアニジノ基に対して１０当
量）を加え、遮光上室温にて２４時間撹拌した。２Ｎ−
酢酸を用いて反応液のｐｉｆを６．８９とした後、セフ
ァクリルＳ−２００（ファルマシア社製、スウェーデン
）のカラム（２，６ｃｍφ×９４１）を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過（アミコン社
製、米国、膜ＹＭ−３０）により、脱塩・濃縮すること
によって、目的物を含む水溶１１．８ｄ（蛋白含量１，
３４■／−）を得た。酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール
、１１０°Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸
分析値 Ａｓｘ　３３．１　　（３６）；　　ＧＩＸ　２４．９
　　（２６）；Ｓｅｒ　　１８．６　　（２０）；　　
Ｇｌｙ　４８．７　　（５０）；旧ｓ　１６．８　（１
６）；　　Ａｒｇ　５．５　　（８）；Ｔｈｒ　　１４
．５　　（１６）；　　Ａｌａ’″２０．０　　（２０
）；Ｐｒｏ　　１１．４　　（１０）；　　Ｖａｌ　　
２５．１　　（２８）；＋１ｅ　　１３．２　　（１８
）；　　Ｌｅｕ　　１Ｂ、５　　（１８）；Ｐｈｅ　７
．３　　（８）；　　　Ｌｙｓ　　１５．０　　（２２
）本基準アミノ酸、（）内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾ＳＯＤが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＩｎ　７．５閤φ×６
００■（東洋ソーダ社製） 溶出液：０．２Ｍ食塩水 （５％エタノール含を） 流速：０．６ｄ／分 検出波長：２２０ｒｖ 保持時間１９．５８分 手続（甫正書（自発） 平成１年７月３１日 １、事件の表示 平成１年特許願第１１２７１６号 ２、発明の名称 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびそ
の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　住友製薬株式会社 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市中央区平野町三丁目３番９号（場末ビル） Ｔｎ、　（０６）　２２７−１１５６ ５、補正の対象 明細書の［発明の詳細な説明Ｊの欄 ６、補正の内容 （１）明細書第６６頁第５行の次行に以下の記載を加入
する。 「犬施置土Ｊ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾ヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（ｈＣＧＲＰ）の製造； ｈ　ＣＧＲＰ　　（０，５ｍｇ）　　の０．２　Ｍ　　
　Ｎ　ａ　　ＨＣＯ３０，０２Ｍ　　ＮａｚＣＯｓ　　
（ｐＨ８，９７，１００ｕｆ）溶液に、室温で２０％２
−メチルマレイン酸無水物アセトン溶液（１０μｌ）を
１０分間隔で２回加えた。この間ＩＮ　　ＮａＯＨを用
いて、反応液のｐｉを９〜ｌＯに調節した。さらにｌＮ
ＮａＯＨでｐＨを９〜１０とし、１時間室温にて放置し
た。 次いで実施例１で得た４〜モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール２．６■および０．
２Ｍ　　ＮａＨＣＯｚ　−０，０２Ｍ　　ＮａｔＣＯｓ
　　（５０ｔｔ　ｌ　）を加え、ＩＮ　　ＮａＯＨでｐ
Ｈ９〜１０に調整し、遮光上室温にて６．５時間放置放
置した。反応混合物をＴＳＫｇｅ　ｌＧ３０００ＳＷ（
東ソー社製、７．５ＭφＸ６０ｃｍ）を用いたゲルｉｔ
ｔ過により精製し、目的物Ａを含む分画、目的物Ｂを含
む分画が得られた。各々の分画を凍結乾燥後、遠心濾過
チューブ（ミリボア社製、ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ）
により、脱塩・濃縮することによって、目的物Ａを含む
水溶液５０μＰおよび目的物Ｂを含む水溶？０５０μｌ
を得た。 目的物Ａの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０’
ｃ、２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 八ＳＸ　　３．８　（４）　；　　Ｓｅｒ　　２．９　
（３）　；Ｇｌｙ　　４．４　（４）　；　　旧ｓ　　
１．０　（１）　；Ａｒｇ　　Ｏ，８（２）　：　　Ｔ
ｈｒ　　３．４　（４）　；＾１ａ”　　４　　（４）
　；　　Ｐｒｏ　　１．０　（１）　；Ｖａｌ　　４．
２　（５）　；　　Ｃｙｓ　　−（２）　；Ｌｅｕ　　
２．０　（３）　；　　Ｐｈｅ　　１．９　（２）　：
Ｌｙｓ　　１．９　（２）　； 本基準アミノ酸、（）内は理論値、−は末より定は以下
の通りである。 ○高速ゲルｉＩｔ過クロマトグラフィーカラム：ＴＳＫ
ｇｅ　１Ｇ３０００ｓＷ（７，５ｍｍφｘ６０ｃ＋ａ）
（東ソー社製）溶出液：　０．　Ｉ　Ｍ食塩水（５％エ
タノール含有）流速：０．１Ｍ１分 検出波長：２１４ｎｍ 保持時間：１９．６分　゛ 目的物Ｂの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０’
ｃ、２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値 Ａｓｘ　　３．８　（４）　：　　Ｓｅｒ　　２．７　
（３）　；Ｇｌｙ　　４．４　（４）　；　　Ｈ４ｓ　
　１．１　（１）　；Ａｒｇ　　Ｏ，８（２）　；　　
Ｔｈｒ　　３．４　（４）　；＾１ａ”　　４　　（４
）　；Ｐｒｏ　　１．０　（１）　；Ｖａｌ　　４．２
　（５）　：　　Ｃｙｓ　　−（２）　；Ｌｅｕ　　３
．０　（３）　；　　Ｐｈｅ　　１．９　（２）　；Ｌ
ｙｓ　　１．９　（２）　； ネ基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定目的物Ｂ
の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りであ
る。 ○高速ゲルｉｓクロマトグラフィー カラム：ＴＳＫｇｅ　ｌＧ３０００ＳＷ（７，５ｍ＋ｓ
φＸ６０ｃｍ）（東ソー社！り溶出液：　０．　Ｉ　Ｍ
食塩水（５％エタノール含有）流速：０．１ｄ／分 検出波長：２１４ｎｍ 保持時間＝２１．４分 叉１華］Ｊ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾エラスターゼ
の製造。 エラスターゼ（０，５ｍｇ）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　
）Ｉ　ＣＯｓＯ，０２Ｍ　　Ｎ　ａ　ｚｃ　Ｏｓ　　（
ｐＨ８，９７，１５０μｆ）ｉ８液に、室温で１０％２
−メチルマレイン酸無水物アセトン？Ｈ！（１０μｌ）
を５分間隔で５回加えた。この間ＩＮ　　ＮａＯＨを用
いて、反応液のｐＨを９〜１０に調節した。さらにＩＮ
　　ＮａＯＨでｐｉ（を９〜ｌＯとし、２．５時間室温
にて放置した。 次いで実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール（２，３１１１ｇ）
を加え、ＩＮ　　ＮａＯＨでｐＨ９〜１０に調整し、遮
光下室温にて１８時間放置した後、酢酸を加えｐＨ３と
し、４０°Ｃで４時間放置した。反応混合物をＴＳＫｇ
ｅ　１Ｇ３０００ｓＷ　（東ソー社製、７、５　ｍｌｌ
φｘ６０ｃｍ）を用いたゲル濾過により精製し、目的と
する分画を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ（ミリポア社
製、ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ）により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物の水溶液５０μｌを得た。 酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０’Ｃ１２４時
間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ａｓｘ　　２２
．３　（２４）　：　　Ｇｌｘ　　１７．６　（１９）
　；Ｓｅｒ　　１６．６　（２２）　；　　Ｇｌｙ　　
２７．６　（２５）　；１（ｉｓ　　６．９　（６）　
　；　　Ａｒｇ　　８．４３（１２）　；Ｔｈｒ　　１
５．８　（１９）　；　　Ａｌａ”　１７　　（ＩＴ）
　；Ｐｒｏ　　６．９　（７）　　；　　Ｔｙｒ　　９
．９　（１１）　；Ｖａｌ　　２３．７　（２７）　：
　　Ｍｅｔ　　０．５　（２）　　；Ｃｙｓ−（８）　
　；　　Ｉｌｅ　　８．３　（１０）　：Ｌｅｕ　　１
８．７　　（１Ｂ）　　；　　Ｐｈｅ　　　３．２　　
（３）　　　；しｙｓ　　　　２．６　　（３）　　　
；　　　Ｔｒｐ　　　　−（７）　　　；＊基準アミノ
酸、（）内は理論値、−は未測定目的物の高速液体クロ
マトグラフィーの＄勅は以下の通りである。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫｇｅ　１Ｇ４０００ＰＷｘＬ（７，８ｍ
ｒｓφＸ３０ｃ＋ａ）２本連結十Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｕａｒ
ｄｃｏｌｏｍｕｎ　Ｐ　Ｗ　ｘ　Ｌ（６，０ａｍφｘ４
ｃｍ）（東ソー社製）、ｉ　出１１１（ｊ］　−０，２
Ｍ　　　ＮａＣ１流速：０．６ｔｎｌ１分 検出波長：２＋４ｎｍ 保持時間：２４．９分 太換炭Ｉ上 ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾ヒト心房性ナ
トリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）の製造； ｈＡＮＰ　（２１６μｇ）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ｔ
−Ｉ　ＣＯｓＮ　ａ　ｔ　Ｃ０３（ｐＨ８，９７、１０
０μ　ｊ２）？容ン（（（に、室〆昌で１０％２−メチ
ルマレイン酸無水物含有アセトン？８ｔ７．（９μりを
５分間隔で２回加えた。 この間Ｉ　Ｎ　　Ｎ　ａ　Ｏｉ＋を用いて、反応液のｐ
Ｈを８〜９に調節した。１時間３０分後、実施例１で得
た４−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール（０，８７■）を含む０．２ＭＮａ　Ｈ
ＣＯｘ−ＮａｘＣＯｌ（ｐＨ８，９７）水溶ｔＬ（５０
μｆ）を加え、ＩＮ　　ＮａＯＨでｐＨ８〜９とした後
、遮光下室温にて２時間３０分放置した。ＩＮ酢酸水に
てｐＨを２〜３とし、３７°Ｃにて遮光下８時間３０分
放置した。反応液をＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソ
ー社製、７．５　＋＋＋ｍφ×６０ｃ＋ａ）を用いたゲ
ル濾過により精製し、目的物を含む分画を限外ｌＩｌ過
により、脱塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶
液（６０μりを得た。 目的物の酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、＋１０°Ｃ
１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値ＡＳＸ
　　１．７　（２）　；　　Ｇｌｘ　　Ｏ，９（］）　
：Ｓｅｔ　　３．７　（５）　；　　Ｇｌｙ　　４．９
　（５）　；Ａｒｇ　　２．４　（５）　；　　Ａｌａ
　　１．１　（１）　；Ｔｙｒ　　　Ｏ，９（１）　　
；　　Ｍｅｔ　　　Ｏ，４（１）　　；１１ｅ　　　１
．０　　（１）　　；　　Ｌｅｕ”　　２．０　　（２
）　　；Ｐｈｅ　　　２．１　　（２）　　；　　Ｃｙ
ｓ　　　　−（２）　　；＊基準アミノ酸、（）内は理
論値、−は未測定目的物の高速液体クロマトグラフィー
の挙動は以下の通りである。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫｇｅ　ｌＧ３０００ＳＷ（７，５ｍφＸ
６０ｃｍ＋）（東ソー社製）溶出液：　０．　Ｉ　Ｍ食
塩水（５％エタノール含有）流速：０．５ｍｌ／分 検出波長：２２０ｕｍ 保持時間７２６．４２分 尖施開１１ ポリエチレングリコール誘導体（］）修飾性腺刺激ホル
モン放出ホルモン（Ｌ　ＨＲＨ）の製造：Ｌ　ＨＲＨ２
２４ａ　ｇを含む０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣＯｙ−Ｎ
ａ、ＣＯｓ　　（ｐＨ９）２００μｆｆｉの溶液に、室
温にて、実施例１で得た４−モノメトキシポリエチレン
グリコール−フェニルグリオキザール１．９■を加え、
遮光下室温にて２４時間放置した。ｌＮ酢酸水にてｐＨ
を約７とした後、逆相高速液体クロマトグラフィーＣＹ
ＭＣ−ＯＤＳ、４．６師φ×２５０１側　：　ン古用液
Ａ液＝０，１　　％ＴＦＡ水とＢ７夜−アセトニトリル
（０，１％ＴＦＡ）を用いたグラジェント（初１ＩＩＩ
Ｂ？ａ、ａ度３０％、勾配置％／分）；流速、Ｉｔｎｌ
１分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水６０μｐを加え、目的物を含む水溶液として
得た。 目的物の酸分解物＜６Ｎ塩酸−フェノール、ｌｌｏ’ｃ
、２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値ＧＩＸ
　　１．０　（１）　；　　Ｓｅｒ　　１．０　（１）
　：Ｇｌｙ　　２．３　（２）　；　　１ｌｉｓ　　１
．０　（１）　；Ａｒｇ　　０．２　（１）　；　　Ｐ
ｒｏ　　】、１　（１）　：Ｔｙｒ　　　　Ｏ，８（１
）　　；　　　Ｌｅｕ’　　　Ｉ　　　　　（１ン　　
；↑ｒｐ　　−（１）　； ＊基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未ａｔｌＩ定目
的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通り
である。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：　ＴＳＫｇｅ　ｌＧ３００ＱＳＷ（７゜５Ｍφ
Ｘ６０ｃｍ）（東ソー社製）溶出Ｍ　：　０．１　Ｍ食
塩水（５％エタノール含有）流速：０．５ｒｄ１分 検出波長：２２０ｕｍ 保持時間；３４．４６分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ、ＡＭ−３０３，５，ｙ４、６
　ｗａφｘ２５０ｍｍ（山村化学社製）ビ古用ｌ＆、：
グラジェント Ａ液：水（０，１％トリフルオロ酢酸）Ｂ液；アセトニ
トリル （０，１％トリフルオロ酢酸） 初ＤＢ液４度；３５％ １度勾配：１％／分 流速：ｌｄ／分 検出波長：２２０ｕｍ 保持時間：１２．７１分 尖旌斑主主 ポリエチレングリコール誘導体（＋）修飾α−メラノト
ロピンの製造コ α−メラノトロピン２２８ｕｇを含む０．２　ＭＮａＨ
ＣＯ＊　−ＮａｔＣＯｓ　　（ｐｉ−１９）１００μｎ
の溶液に、室温にて、実施例１で得た４−モノメトキシ
ポリエチレングリコールーフェニルグリオキザー／１，
６８５μｇを含む０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３Ｎ　
ａ　ｚｃ　Ｏｘ　　（ｐＨ９）水７容？＆　Ｉ　ＯＯｕ
　ｌを加え、遮光下室温にて２４時間放置した。ｌＮ酢
酸水に７ｐＮを約７とした後、ＴＳＫｇｅ　ＩＣ；３０
（ＩＯ５Ｗ（東ソー社製、７．５閾φＸ６０ｃｍ）を用
いたゲル濾過により精製し、目的物を含む分画を脱塩し
、凍結乾燥した後、水６０μｌを加え、目的物を含む水
溶液として得た。 目的物の酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、ｌ　Ｉ　Ｏ
’Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値Ｇ
ｌｘ　　Ｏ，９（１）　；　　Ｓｅｒ　　２．０　（２
）　；Ｇｌｙ　　１．１　（１）　；　　Ｈｉｓ　　１
．０　（１）　；Ａｒｇ　　Ｏ，４（１）　：　　Ｐｒ
ｏ　　１．１　（１）　：Ｔｙｒ　　１．０　（１）　
；　　Ｖａｌ　　１．１　（１）　；Ｍｅｔ　　Ｏ，９
（１）　；　　Ｐｈｅ”　　１　　（１）　：Ｌｙｓ　
　　Ｏ，９（１）　　；　　Ｔｒｐ　　　−（１）　　
：本基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定目的物
の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りであ
る。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫｇｅ　１Ｇ３０００ｓＷ（７，５ｍｒｓ
φＸ６０ｃｍ）（東ソー社製）溶出液：　０．１　Ｍ食
塩水（５％エタノール含有）流速：０．５ｄ／分 検出波長：２２０ｎｍ 保持時間：３４．４２分 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ、ＡＭ−３０３゜５μ４、６　
ｍφ×２５０順（山村化学社製）ｆ古用液；グラジェン
ト へ液：水（０１１％トリフルオロ酢酸）Ｂ液；アセトニ
トリル （０，１％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度＝３５％ 濃度勾配；１％／分 流速：１−７分 検出波長：２２０ｎｍ 保持時間１２．７１分 叉施炭斐土 ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾パラチロイド
ホルモン（１−３４）　　（ＰＴＨ（１−３４））の製
造： ＰＴＨ（１３４）２２４μｇを含む０．２ＭＮａＨＣＯ
，−Ｎａ、ＣＯｓ　　（ｐＨ８，９７）１００μｌのン
容液に、室温にてｌ゛０％２−メチルマレイン酸無水物
含有アセトン溶液（９μりを５分間隔で２回加えた。こ
の間ＩＮ　　ＮａＯＨを用いて、反応液のｐＨを８〜９
に調節した。１時間後、実施例１で得た４−モノメトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール２
７２μｇを含む０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯ：＋　　Ｎａｚ
ＣＯｔ　　（ｐＨ８，９７）水溶液５０ｕｌを加え、１
ＮＮａＯＨでｐｌ＋を８〜９とした後、遮光下室温にて
２時間放置後、さらに修飾試剤２７ＱｔＩｇを含む０．
２Ｍ　　ＮａＨＣＯｘ　　Ｎ　ａ　ｔＣＯｘ　　（Ｐｉ
１８．９７　）水溶液２５μ！を加え、遮光下室温にて
２時間３０分放置した。 ＩＮ酢酸水にてｐＨを２〜３とし、３７゛Ｃにて遮光下
８時間放置した。反応液をＴＳＫｇｅ　ｌＧ３０００Ｓ
Ｗ（東ソー社製、７．５Ｉｎ１１１φＸ６０ｃｍ）を用
いたゲルｄ＃過によりｔ＃復し、目的物を含む分画をさ
らに逆相高速液体クロマトグラフィーＣＹＭＣ−ＯＤＳ
、４．６　順φ　Ｘ２５０　　ｔｍ　　：　　ｉ古用液
Ａ液−０，１％ＴＦＡ水とＦ３Ｍ−アセトニトリル（０
，１％ＴＦＡ）を用いたグラジェント（初ｙ、ｕｔｅ度
２０％、勾配置％／分）；流速１−／分〕により精製を
行った。目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水５０μ
βを加え、目的物を含む水溶液として得た。 目的物の酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、Ｉ　１０　
’Ｃ１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値＾
ｓｘ　　　　　３．８　　（４＞　　　；　　　　Ｇｌ
ｘ　　　　　４．５　　（５）　　　；Ｓｅｒ　　２．
７　（３）　；　　Ｇｌｙ　　１．１　（１）　；Ｈａ
ｓ　　２．９　（３）　：　　Ａｒｇ　　１．３　（２
）　；Ｖａｌ　　２．８　（３）　：　　Ｍｅｔ　　Ｏ
，８（２）　；ｌｉｅ　　１．０　（１）　；　　Ｌｅ
ｕ”　　５　　（５）　；Ｐｈｅ　　１．０　（１）　
；　　Ｌｙｓ　　２．６　（３）　：Ｔｒｐ　　　−（
１）； 本基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定目的物の
高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである
。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫｇｅ　１Ｇ３０００ｓＷ（７，５ｔｍφ
Ｘ６０ｃ＋ｓ）（東ソー社製）溶出ｉ　：　０．１　Ｍ
食塩水（５％エタノール含有）流速：０．５ｄ／分 検出波長：２２０ｎｍ 保持時間：３４．０３分 Ｏ逆相高速液体クロマトグラフィー カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ、ＡＭ−３０３，５μ４．６閣
φ×２５０市（山村化学社製）ン容出液：グラジエント Ａ液：水（０，１％トリフルオロ酢酸）Ｂｌ＆ニアセト
ニトリル （０，１％トリフルオロ酢酸） 初期Ｂ液濃度；３５％ 濃度勾配：１％／分 流速：ＩＩｄｌ／分 検出波長：２２０μｍ 保持時間：１１．８２分Ｊ 手続事甫正書（自発） １、事件の表示 平成１年特許願第１１２７１６号 ２、発明の名称 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ベプ氏名（名称）
　住友製薬株式会社 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市中央区平野町三丁目３番９号（湯水ビル） ｋ　（０６）　２２７−１１５６ 明細書の「発明の詳細な説明］の欄 ６、補正の内容 （＋１　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄（平成１
年７月３１日付提出の手続補正書（自発）第１７頁第３
行）の次行に以下の記載を加入する。 「月１１［ｊ ポリエチレングリコール誘導体（］）修飾インシュリン
様成長因子−ＩＩ　（ＩＧＩ”−１１）の製造：ＩＧＦ
−１１（２００μｇ）の０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯｚＮ　
ａ　２ＣＯｘ　　（１）１１８．９７．１００μり溶液
に、室温にて１０％２−メチルマレイン酸無水物含有ア
セトン溶液（９μｌ）を５分間隔で２回加えた。 この間ＩＮ　　ＮａＯＨを用いて、反応液のｐｌ＋を８
〜９に調節した。３５分後、実施例１で得た４−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル（０，５ｍｇ）を含む０．２　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ＊
−ＮａｔＣＯｘ　　（ｐｔ１８．９７）水溶液（５０μ
ｌ）を加え、ｌＮＮａＯＨでｐＨを８〜９とした後、遮
光上室温にて２時間４５分放置した。ＩＮ酢酸水にて９
１１を２〜３とし、３７゛Ｃにて遮光下９時間放置した
８反応液をＴＳＫｇ、ｅ　１Ｇ３０００ｓＷ（東ソー社
製、７．５　！ＩＩφＸ６０ｃｍ）を用いたゲル濾過べ
より精製し、目的物を含む分画を限外濾過にまり脱塩・
濃縮することにより、目的物を含む水？８液（５０μ！
、蛋白含量１５．４Ｍｇ１５０μ２）を得た。 目的物の酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール、１１０°Ｃ
１２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値＾ｓｘ
　　３．０　（３）　；　　Ｇｌｘ　　６．１　（７）
　；Ｓｅｒ　　６．７　（７）　；　　Ｇｌｙ　　５．
８　（５）　；Ａｒｇ　　５．４　（８）　；　　Ｔｈ
ｒ　　３．０　（４）　；Ａｌａ”　５．０　（５）　
；　　Ｐｒｏ　　２．４　（３）　；Ｔｙｒ　　２．４
　（３）　；　　νａｔ　　３．２　（４）　；１１ｅ
　　Ｏ，８（１）　：　　Ｌｅｕ　　４．７　（６）　
；Ｐｈｅ　　３．３　（４）　；　　Ｌｙｓ　　１．０
　（１）　：Ｃｙｓ　　−（６）　Ｆ ＊基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定目的物の
高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである
。 ○高速ゲルｉＩｔ過クロマトグラフィーカラム：ＴＳＫ
ｇｅ　ＩＧ３０００ＳＷ（７，５ｒｒｍφＸ６０ｃｍＮ
東ソー社製）溶出液：　０．　Ｉ　Ｍ食塩水（５％エタ
ノール含有）流速：０．５ｄ／分 検出波長・２２０ｎｍ 保持時間：　２６．６７分 実」ｌ殊２」□ ポリエチレングリコール誘導体（１）修飾ウリカーゼの
製造： ウリカーゼ（０，５ｍｇ）の０．２　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｈ
Ｃ０３０、０２Ｍ　　Ｎ　ａ　ｚＣＯｈ　　（ｐＨＢ、
９７．１００μｍ）溶液に、室温で２０％２−メチルマ
レイン酸無水物アセトン）容′ｅ、（１０μＰ）を５分
間隔で３回加えた。この間ＩＮ　　ＮａＯＨを用いて、
反応液のρ１１を９〜ｌＯにｊＪｉ１節した。さらにＩ
Ｎ　　Ｎａ○１１でｐＨを９〜１０とし６時間室温にて
放置した。次いで、実施例１で得た４−モノメトキシポ
リエチレングリコール−フェニルグリオキザール１５■
および０．２Ｍ　　ＮａＨＣＯ，−０，０２Ｍ　　Ｎａ
、ＣＯ。 （５０μｌ）を加え、ｌＮＮａＯＨでｐＨを９〜１０に
調整し、遮光上室温にて２４時間放置した後、酢酸を加
え、ｐＨ３とし、４０’Ｃで３時間放置した。 反応混合物をＴＳＫｇｅ　Ｉｃ；４０００ＰＷｘＬ　（
７，８■φＸ３０ｃｍ）　２不連結＋Ｔ　Ｓ　Ｋｇｕａ
ｒｄｃｏｌｕｍｎＰＷｘＬゲル濾過により精製し、目的
とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ（ミリボア
社製、ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ）により、脱塩・濃縮
することによって、目的物の水溶液５０μｐを得た。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 Ｏ高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫｇｅ　１Ｇ４０００ＰＷｘＬ（７，８ｍ
φＸ３０ｃ＋ｅ）２不連結＋Ｔ　Ｓ　Ｋｇｕａｒｄｃｏ
ｌｏｍｕｎ　Ｐ　Ｗ　ｘ　Ｌ（６，０ａｍφｘ４ｃｍ）
（東ソー社製）Ｉ古用液　：０．２Ｍ　　　ＮａＣｌ 流速：０．６ｄ／分 検出波長：２５４ｎｍ 保持時間：２４．６分」

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは低級アルキル基を表し、ｎはポリエチレン
   グリコール部分の平均分子量が約１，０００〜１２，０
   ００となる任意の正の整数であることを表す。）で表さ
   れるポリエチレングリコール誘導体。
2. （２）ペプチド中のグアニジノ基が請求項（１）記載の
   ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されている
   修飾ペプチド。
3. （３）請求項（１）記載のポリエチレングリコール誘導
   体とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させること
   を特徴とする修飾ペプチドの製造方法。
4. （４）グアニジノ基を有するペプチドのアミノ基を保護
   した後、請求項（１）記載のポリエチレングリコール誘
   導体を反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保護する
   ことを特徴とする修飾ペプチドの製造方法。