JPH02117920A - ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規かつペプチド(特に、蛋白質)修飾試剤と
して有用なポリエチレングリコール誘導体、および当該
ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されたグア
ニジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関する
。 〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕近年、蛍
白質の研究の発展に伴い種々の作用を持つペプチド、特
に生理活性蛋白質が数多く発見されている。また、遺伝
子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進歩によりこ
れら生理活性ペプチド、またはその[4)1構造化合物
を大量に人手することが可能となってきた。これらの特
殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に有用の
ものが多い。 しかしながら、循環系に投与されたペプチドのクリアラ
ンスは一般に非常に速いことが知られているので、当該
ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチド
が異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学に
て設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構造
の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤な
症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプチ
ドの抗原性の改善が待望される。 これらのペプチドを医薬品として用いるためにはこれら
の抗原性や持続性に対する問題を解決しなければならな
い。このような問題点を解決する手段としてペプチドを
高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて有
効な手段であることが知られている。 しかして、ポリエチレングリコール誘導体は、それ自体
免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド(蛋白質)の
3次構造に影響を与えないという優れた特徴を持ってい
るため、ペプチドの高分子修飾試剤として多用されてい
る。 ポリエチレングリコール誘導体を用いてペプチドを修飾
するに際して、その活性化法としてはトリアジン誘導体
による活性化法〔稲田等Jpn、 J。 Cancer 1ies、 (Gann)、 77、1
264−1270 (1986)、 ]、]N−ヒドロ
キシコハク酸イミによる活性エステル法〔レオナルト、
エム等Tetrahedron+ 401581−1
584 (1984)、 ) 、カルボニルジイミダゾ
ールによる活性化法〔チャールズ、オー、ビーチャム等
Ana1. Bioche+*、 131 25−33
(1983)、1 、アルデヒドによる活性化法(藤
野等、特開昭61−178926号公報〕等号一般的の
ものとして知られている。 しかしながら、これらの修飾法はいずれもペプチドのN
末端またはりジン残基t[!1 鎖のアミノ基を修飾す
るものである。 一方、ペプチドには生理活性の発現にN末端アミノ基や
リジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多く
存在する。従って、この様なペプチドの場合には上記の
様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾することは活性
の低下につながるので好ましくない、また、リジン残基
のみを修飾するものではその修飾部位が限られてしまう
。ペブチi′の性質をコントロールするためにはアミノ
基以外の種々の部位を修飾することが効果的であると考
えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発する意義
は極めて大きい。現在名に知られている他の官能基の修
飾試剤としては、メルカプトMを修飾するマレインイミ
ド誘導体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フ
ランクF、デービス等、特公昭56−23587号公報
〕等が知られている。しかしながら、メルカプト基は分
子表面にメルカプト基の形で存在しなければ修飾困難で
あると考えられるが、その様な構造を持つペプチドは非
常に少ない。 また、アミノ誘導体による修飾の場合、ペプチド中のア
ミノ基による副反応が起きる為に修!1i試剤のみを選
択的に反応させることが困難である。 一方、ペプチド中のグアニジノ基の低分子修飾試剤とし
ては、フェニルグリオキザール(ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、248巻、6171 (
1968))、2.3−ブタンジオン(バイオケミスト
リー、12巻、3915 (1973))、1.2−シ
クロヘキサンジオン(ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、250巻、557 (1975))
などが知られているが、ポリエチレングリコール誘導体
でペプチド中のグアニジノ基を修飾できる誘導体は、未
だ知られていない。 本発明の目的は、ベブチ、ドのグアニジノ基を選択的に
修飾することのできるポリエチレングリコール誘導体を
提供することである。 本発明の他の目的は、当該ポリエチレングリコール誘導
体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提供
することである。 本発明のさらに他の目的は、当該修飾ペプチドの製造方
法を提供することである。 [課題を解決するための手段] 本発明者らは上記目的を達成するために種々研究を重ね
て来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体(1
)がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾する
ことを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに
至った。 本願の第1番目の発明は式 (式中、Rは低級アルキル基を表し、nはポリエチレン
グリコール部分の平均分子量が約1 、000〜12.
000となる任意の正の整数であることを表す。)で表
されるポリエチレングリコール誘導体(1)である。 本願の第2番目の発明は、ポリエチレングリコール誘導
体(+)とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることによって得られる修飾ペプチドである。 本願の第3番目の発明は、ポリエチレングリコール誘導
体(r)とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることによって得られる修飾ペプチドの製造方法である
。 式(+)においてRで表される低級アルキル基は、直鎖
状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチル、エチル
、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル等の炭素数
1〜4の低級アルキル基が好適である。 本発明のポリエチレングリコール誘導体(1)は以下の
方法にて容易に製造することができる。 即ち、式 %式%() (式中、Rおよびnは前記と同意義) で表されるモノアルコキシポリエチレングリコール(n
)と適当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反応
させることにより、式 %式%() 〔式中、X゛はアルキルスルホニルオキシ(たとえば、
メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ等の
炭素数1〜4の低級アルキルスルホニルオキシ)、芳香
族スルホニルオキシ(たとえば、トルエンスルホニルオ
キシ等)またはハロゲン(塩素、臭素等)を表す〕 で表される活性体(I[+)に導びく。 この際用いられる活性化試薬としては、たとえば■アル
キルスルホニルクロリド(そのアルキル部分としては前
記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチルス
ルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例示
される) (Ronald K。 Cro3s 1and等、J、 Org、 Chell
、 3M、 3195 (1970))、■芳香族ス
ルホニルクロリド(たとえば、トルエンスルホニルクロ
リド等) (Vladis+ir C,5ekera
等、J、Amer、Ches、 Sac、 55.34
5 (1933)) 、■五臭化リン(James C
a5on等、J、 Org、 Chew、 26゜36
45 (1961) )などが挙げられ、さらに0式(
R′)3P(式中、R′はアルキル基(たとえばオクチ
ルなど)、アリル基(たとえばフェニルなど)またはジ
アルキルアミノ基(たとえばジメチルアミノなど)を表
す、〕で表される化合物の存在下で用いられる弐C(X
)4 [式中、Xはハロゲン(たとえば、塩素、臭素等
)を示す]で表わされる化合物(J、 Hooz等、C
an、 J、 Chell、 46.86(196B)
]等が挙げられる。 この際用いられる塩基としては、ピリジン、トリアルキ
ルアミン(たとえば、トリエチルアミン)のような三級
の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が挙
げられる。反応溶媒はN、N−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラ上10フラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常o’c〜、15
0°Cの範囲である。 次いで活性体(III)をN、N−ジメチルホルムアミ
ドやテトラヒドロフラン等の適当な溶媒中で炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム等の適当な無機塩基もしくはトリエ
チルアミン、トリノルマルブチルアミン、ジアザビシク
ロ−2,2,2−ウンデセン等の有機塩基を用いて60
〜120’Cの加熱下にてヒドロキシアセトフェノンと
反応させて式(式中、Pおよびnは前記と同意義) で表されるアセトフェノン誘導体(rV)を得る。 得られたアセトフェノン誘導体(IV)を二酸化セレン
等の適当な酸化剤を用いてN、 N−ジメチルホルム
アミド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、60〜
120°Cにて酸化して目的とするポリエチレングリコ
ール誘導体(()を製造することができる。 かくして製造されたポリエチレングリコール誘導体(1
)は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単離、
精製することができる。 本明細書において、ペプチドとは2個以上のアミノ酸が
ペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋白
質およびその類似構造物質である。 その構成アミノ酸の少なくとも一つは、少なくとも1個
のグアニジノ基を有するもの(たとえば、アルギニン)
である。 かかるペプチド、特に蛋白質としては、たとえばサブス
タンスP(視床下部ホルモン)、コルチロトロピン、リ
ボトロピン、メラノトロピン(下fflllJl部ホル
モン)、アルギニン−パップレシン(神経下垂体ホルモ
ン)、パラチロイドホルモン(甲状腺ホルモン)、サイ
モポエチン(胸腺因子)、インシュリン、グルカゴン(
膵臓ホルモン)、神経成長因子、上皮成長因子、インシ
ュリン様成長因子−I、ヒト形質転換発育因子、成長ホ
ルモン放出因子即ちGRF、塩基性繊維芽細胞成長因子
(成長因子)、セクレチン、コレシストキニン、バソア
クティブインスチナルペブチド、モチリン(胃腸管ホル
モン)、ゴナドトロピン(絨毛膜ホルモン)、性腺刺戟
ホルモン放出ホルモン(性腺刺戟ホルモン)、レラキシ
ン(卵巣ホルモン)、血液凝固因子■因子および■因子
(血友病因子)、ストレプトキナーゼ、フィブリノリシ
ン、デオキシリボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジス
ムターゼ、エラスターゼ、アスパラギナーゼ(酵素)、
&lI織プラスミノーゲン活性化因子、即ちtPA、ウ
ロキナーゼC線溶因子)、リンホカイン〔たとえば、イ
ンターロイキン1および■〕、顆粒球マクロファージ・
コロニー刺戟囚子叩らGM−C81・゛(刺戟因子j、
エリスロポエチン(増血因子)、カルソトニン遺伝子関
連ペプチド(Ca 11節ホルモン)、心房性ツートリ
ウム利尿ペブナド< 111 +s ホルモン)等の生
理活性を有するペプチドならびにここに例示したペプチ
ドと同様の生理活性を有する類似構造物質が例示される
。なお、」二記の例示二こむいて()内は当該ペプチド
の用途を記載するものである。 本発明においてペプチドは遺伝子T学産物、ヒトを含む
各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造さ
れたものでもよい。 本発明の修飾ペプチドの製造は、ポリエチレングリコー
ル誘導体(1)とグアニジノ基を有するペプチドとを反
応させることによってjfわれる。 当該反応に際しては、ポリエチレングリコール誘導体(
+)をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ基
に対して1〜lOO倍モル程度用いることが好ましい。 ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には1モル程度
以下のもの(たとえば、O,1倍モル〜1倍モル)も用
いることができる。当該ペプチドとポリエチレングリコ
ール誘導体(+)のモル比、反応温度、pi(等を調節
することにより(1飾の程度を任意に選択することが出
来る。また、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないもの
であればいずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、
炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、N
−エチル・モルホリン−酢酸JM tji液、マレイン
酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液
が挙げられる。また、当該ペプチドを失活させず、かつ
反応に不活性な有!a溶媒、たとえばメタノール、エタ
ノール、プロパツール等の低級アルコールやアセトニト
リル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても
よい。 反応のpHは一般的に6〜10の範囲で選択することが
好ましいが、中性から弱塩基性が特に好ましい。ただし
、アミノ末端に保護されていないα−“?ミノ基を有す
るペプチドの場合は、やや酸性側のpH5,5〜6.5
が好ましい。反応温度は当該ペプチドが失活しない温度
であればいrれでもよく、たとえば0〜25°Cの範囲
が好ましい。反応は通常暗所で行い、反応時間は3〜7
2時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲル′a、過、イオン交換
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフイー、限外濾過、逆相HPLCに
よる分取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修
飾ペプチドを得ることができる。 ところで、低分子修飾試剤であるフェニルグリオキザー
ルの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を過
酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミン反応
を起こすという副反応が知られている。(生物化学実験
法12、蛋白質の化学修飾(上)、62〜69頁、(学
会出版センター、1981)、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、248巻、6171(+9
68))本発明のポリエチレングリコール誘導体(1)
を用いた修飾においても同様の副反応の可能性が考えら
れる。そこでこのような副反応が懸念される場合には、
グアニジノ基を有するペプチドのアミン基を適当な保護
基で保護した後、ポリエチレングリコール誘導体(1)
と反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保護するとい
う方法によって、修飾ペプチドを製造する方が得策な場
合もある。アミノ基の保lil!基は、ポリエチレング
リコール誘導体(1)と反応性がなく、さらに当該ペプ
チドを失活させることなく脱保護されるものであれば良
く、例えば、スクシニル基、マレイル基、2−メチルマ
レイル基、2.3−ジメチルマレイル基、エキソ−シス
−3,6−ニンドオキソーΔ4−テトラヒドロフタロイ
ル基、エキソ−シス−3,6−ニンドオキシヘキサヒド
ロフタロイル基、テトラフルオロスクシニル基等が挙げ
られる。保護基の導入は、当該分野の公知の方法によっ
て行うことができる。導入試剤としては、相当する酸無
水物、酸ハロゲン化物、活性エステル等が用いられるが
、−i的には相当する酸無水物が多く用いられる。反応
溶媒としては、反応を妨害しないものであればいずれで
もよく、たとえば、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素す
トリウム水溶液、N−エチルモルホリン−酢酸緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。 また当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、10パノー
ル等の低級アルコールやアセトニ1〜リル、ジオキサン
、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反応のpH
は6〜10の範囲で選択することが好ましいが、中性か
ら弱塩基性が特に好ましい。反応温度は当該ペプチドが
失活しない温度であれば、いずれでも良く、たとえば−
5〜25°Cの範囲が好ましい。反応時間は30分〜3
6時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HP L Cに
よる分取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精
製して目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ること
ができるが、単離精製することなく引き続いてポリエチ
レングリコール誘導体(1)と反応させアミン拮が保護
されたポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ること
もできる。 アミノ基が保護されたグアニジノ基を有するペプチドと
ポリエチレングリコール誘導体(1)との反応および反
応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同様
の反応条件および精製法で行うことができる。 アミノ基の保護基の脱保護は反応液を酸性に保つことに
よって行うことができる0反応のpl+は1〜6の範囲
で選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、
当該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法で
も良く、たとえば酸(酢酸、トリフルオロ酢酸、有機ス
ルホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等)を用いる方法
、ダウエックス50W等の酸性樹脂を用いる方法、リン
酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の
緩衝液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法
等が挙げられる0反応は一般的には水溶液のみで行うが
、場合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反
応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノー
ル、プロパツール等の低級アルコールやアセトニトリル
、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い
。反応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればい
ずれでも良く、たとえば0〜40°Cの範囲が好ましい
。反応時間は5分〜60時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲルd#過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフイー、限外濾過、逆相HP L C
による分取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の
修飾ペプチドを得ることができる。 本修飾ペプチドは通常の製剤、たとえば皮下的、筋肉内
的もしくは静脈内的適用のための注射溶液のような適切
な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製剤
は自体既知の方法によって製造される。 調製された修飾ペプチドは医薬品組成物として哺乳動物
(ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等)に投与する
ことができる。 その投与量は、たとえば実施例3で得た化学修飾tPA
を心筋梗塞の治療のために投与する場合には通常1〜1
00gを1日1回から数回に分けて投与される。 〔作用・効果) 本発明のポリエチレングリコール誘導体(1)はペプチ
ド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができるも
のである。 当該ポリエチレングリコール誘導体(1)にて修飾され
たペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、非
常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランスも
著しく遅延(即ち、持続性が延長)され、長時間有効に
その生理活性を示す。 しかも本修飾ペプチドは非修飾ペプチドの有する生理活
性をそのまま有するものであり、当該修飾ペプチドは医
薬品として極めて有効である。 〔実施例] 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらによって制限されるものではない。 なお、以下の記載において各略号はそれぞれ次のことを
意味する。 Asに :アスパラギン酸またはアスパラギ/GIX
:グルタミン酸またはグルタミンSer :セリン
cry :グリソンHts :ヒスチジン
Arg :アルギニンThr :スレオニン Al
a :アラニンPro ニブロリン Tyr
:千ロシンシa1:バリン Met :メチオ
ニン11e:イソロイシン Leu :ロイシンPh
e :フェニルアラニン Lys、 :リジン実施例
1 (1)モノメトキシポリエチレングリコールトンレート ポリエチレングリコールモノメチルエーテル(平均分子
@5000.40g)をトルエン160−および塩化メ
チレン80dの混合溶媒に溶解した。 塩化ハラトルエンスルホニル(8,0g)、ついでトリ
エチルアミン5.8 rnlを加え室温で6時間撹拌し
た。次に塩化バラトルエンスルホニル(8,0g)を追
加し、10時間撹拌した。不溶物をと1#別しa、液を
減圧4縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレート
32.4gを得た。(収率78.6%)、情、9.55
〜57°C ’H−NMR(CDCP、、)、TM3.90 (MH
z ) 、 62.18(s)、 63.38(S
)。 δ3.62(s)、 δ7.3(ABq)(2)4−
モノメトキンポリエチレングリコール−アセトフェノン (])で得たモノメトキシポリエチレングリコールトシ
レート(20g)および4−ヒドロキシアセトフェノン
(5,6g)をN、N−ジメチルホルムアミド200d
に溶解した。炭酸カリウム(5,6g )を加え120
“Cの油浴中で4時間撹拌した。 不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシ
リカゲルカラム精製し、標記4−モノメトキシポリエチ
レングリコール−アセトフェノン(14,7g)を得た
。(収率73.9%) 、m、p、 55〜57°C ’H−NMR(CD(1,)、TMS、90 (MHz
)、 δ2.42(S)、 δ3.32(S)。 δ2.64(S)、 δ7.64(ABq)(3)4
−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ
オキザール O の製造: (2)で得た4−モノメトキシポリエチレングリコール
−アセトフェノン(50g)を1. 4−ジオキサン5
00dに溶解した。二酸化セレン(10,8g)を加え
4時間還流した。不溶物を濾別し濾液を減圧′a縮した
。得られた残渣をシリカゲルカラム精製し4−モノメト
キシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
27gを得た。(収率53.8%) 、+m、p、55
−57’C’H−NMR(CDCI 3 )、 TM
S、 90 (MHz)、 63.38(s)
、 63.66(S)。 67.48(ABq) 実施例2 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子(t−PA)の製造:t−PA温溶
液12■/d、O,I M塩化ナトリウム、pH3)4
20μlに0.2門炭酸水素ナトリウム水(IMKSC
N、pH8,5)4.6mを加えた後、実施例1で得た
4−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグ
リオキザール150■を加え室温にて4時間撹拌した。 IN塩酸水にてpH3に調整した。0.6%酢酸水中で
透析した後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を七フア
クリルS−200カラムにてゲル濾過精製した後、セフ
ァデンクス(、−50Fにより精製し、目的物1.9■
を得た。酸分解物(6N塩酸、110’C124時間処
理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 49.0
(50); Glx 51.8 (52);Set
46.7 (48): Gly 45.4 (4
3);旧s 16.4 (16); Arg 26
.7 (35);Thr 24.3 (25); A
la” 32 (32);Pro 30.8 (2
9): Tyr 23.7 (24);Vat 2
1.8 (25); Met 4.1 (5);+1
e 17.1 (19); Leu 40.6 (
39);Phe 16.6 (16); Ly
s 22.8 (21);*基準アミノ酸、()
内は理論値 この結果Argi基が選択的に修飾されていることがわ
かる。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム二マイクロボンダスフェアーCa(3,9X15
0■)(ウォーターズ社製)を容出液:グラジェント A液:水(0,1χトリフロロ酢酸) BeLニアセトニトリル(0,1χトリフロロ酢酸)初
期B液濃度=30% 濃度勾配:1%/分 流速:]af/分 検出波長:214ns 保持時間:15.2分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム: T
SK G3000S胸7.5x600mm(東ソー社製
)溶出液: 0.1 M 食塩水(pH4,0)流速
=l−/分 保持時間:11.4分 実施例3 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾&ll織プラ
スミノーゲン活性化因子(t−PA)11の製造: t−PA温溶液12■/d、0.1M塩化ナトリウム、
pH5)420μlに0.2M炭酸水素ナトリウム水(
IMKSCN、PI+8.5)4.6dを加えた後、実
施例1で得た4−モノメトキシポリエチレングリコール
ーフェニルグリオキザール25.2■を加え室温にて3
時間撹拌した。IN塩酸水溶液にてpH4に調整した。 反応液をウォーターズ製マイクロボンダスフェア−C4
,5μ、300人、φ3.9X150mmカラムを使用
して高速液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目
的物の溶出はトリフロロ酢酸を0,1%加えたアセトニ
トリル水溶液を用い毎分l−の流速でアセトニトリル濃
度を33%から43%に毎分0.5%の割合で上昇させ
ることにより行った。得られた生成物の上記条件での高
速液体クロマトグラフィーの溶出時間は −13,2分
であった。収量0.8■。本操作により低修飾率のポリ
エチレングリコール誘導体(1)修飾L−PAが得られ
た。 得られた目的物はSDSゲル電気泳動において、蛋白質
換算で約90000の位置に泳動した。 実施例4 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子(GRF (1−29)NHz )の製造: 成長ホルモン放出因子(GRF(129)NHz 31
00■を水7,3−に溶解した。0.1Mリン酸緩衝液
(pH7,2)66mおよび実施例1で得た4−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル3.6gを加え、暗所室温で終夜撹拌した。反応?f
!2.20dを透析した後凍結乾燥し粗生成物657■
を得た。このものをファルマシア製セファクリルS−2
00カラムφ2X70cmを使用し、0.1 M食塩水
で流速1−毎分の条件でゲル濾過精製を行った。得られ
た分画を山村科学製YMCパックAM3040DSφ]
X30c+aカラムを用い、高速液体クロマトグラフィ
ーにて分取精製した。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を
0.1%加えたアセトニトリル水?8液を用い毎分3m
βの流速でアセトニトリル濃度を0%から80%に毎分
2%の割合で上昇させることにより行った。収量30.
0mg。 酸分解物(6N塩酸110°C24時間)中のアミノ酸
分析値 Asx 2.94 (3); Glx 2.07
(2);Ser 2.81 (3); Gly
1.36 (1);^rg 1.04 (3)
; Thr O,97(+);Ala 1.48
(3); Tyr 1.02 (2);νa
t O,77(1); Met 0.70 (
1);!le 2.01 (2); 1.eu”
4.00 (411;Phe O,96(1)
;1.ysl、ys 1.52 (2);*基準ア
ミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム二マイクロボンダスフェア−C11(3,9X1
50m)(ウォーターズ社製))容出液;グラジェント A7&:水(0,1χトリフロロ酢酸)B液;アセトニ
トリル(0,1χトリフロロ酢酸)初”Jl 3 ?e
、 m 度: 20 %濃度勾配:1%/分 流速=1−/分 保持時間:26.9分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム:5h
odex 0H−88047,6X 500M (昭和
電工)溶出液: 0. l M 食塩水(pHz口流
速;1戚/分 保持時間:t3.S分 尖藷忽五 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾顆粒球マクロ
ファージコロニー刺戟因子(CM−C3F)の製造: GM−C3F (500μ g15 0 0−水l容
液)に実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール11.omgを0、
1 M ’) 7酸緩衝i’ff1(pH8,5) 5
00μffiニ溶解した溶液を加えた。室温で7時間撹
拌した。反応生成物をウォーターズ社製マイクロボンダ
スフェア−C4(5μ、100人、φ3.9X150m
m)カラムを使用し高速液体クロマトグラフィーにて分
取精製した。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を0、1%
加えたアセトニトリル水溶液を用い、アセトニトリル濃
度を36%から56%に毎分1%の割合で上昇させるこ
とにより行った。収lO,4111g。 得られた精製物は上記条件での高速液体クロマトグラフ
ィーで12,3分の溶出時間を示した。 類1州i ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾成長ホルモン
放出因子(CRF (1−44)NH□〕の製造: 成長ホルモン放出因子(C,RF(1〜44)NH□]
(20mg)の0.2M NaHCOt (pH8
,18,20d)iW液に4−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール18.5μg(
グアニジノ基に対して1/6当量)を加え、遮光下室温
にて5.5時間放置した。IN塩酸水t8液を用いて反
応液のpHを2,4とした後、セファクリルS−200
スーパーフアイン(ファルマシア製、スウェーデン)の
カラム(2,6c鵬φX84cm)を用いたゲルil!
過により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン
社製、米国、膜YM−10)により脱塩a縮した。得ら
れた目的物の水溶液を、さらにYMC−ODS、A−2
1L 5μ、4,6■φx25ommカラム(山村化学
型)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより二
次精製し、目的物A、目的物Bを得た。 目的物Aの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 ^sx 3.83 (4); Glx 7.18 (
7); Ser 3.82 (4);Gly 3.4
9 (3); Arg 4.87 (6); Th
r 1.17 (1);Ala 5.1B (5);
Tyr 1.89 (2); νal 1.10
(13;Met 0.78 (1); Ile 1.
95 (2); Leu” 5.00 (5);Ph
e O,99(1); Lys 2.26 (2)本
基準アミノ酸、()内は理論イ直 目的物Aの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: Y?IC−0[IS、 A−211,5μ
。 4.6μmφX 250mo+ (山村化学型)ン容出
液;グラジェント A液;水(0,1!トリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢fjJ)初期B液濃度
:25% 濃度勾配;1%/分 流速:1i/分 検出波長:214n翔 保持時間;202分 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フエノール:110
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 ^SX 3.82 (4); GIk 6.89 (
7); Ser 3.70 (4);Gly 3.
17 (3): Arg 4.17 (6)
; 丁hr 1.12 (1);Ala 5.
31 (5): Tyr 1.80 (2); V
al 1.Q5 (11;Met O,91(]);
lie 2.05 (2); Leu” 5.00
(5);Phe O,9B (1); Lys 2
.31 (2)本基準アミノ酸、()内は理論値 目的物Bの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、 A−211,5μ。 4.6mφX 250II1m (山村化学型)溶出液
;グラジェント A液:水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初XJIB液濃度
=25% 濃度勾配=1%/分 流速:1rrdl/分 検出波長:214n+1 保持時間:2L8分 実益±1 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子(GRF (l−29)Nl2 )Hの製造; 成長ホルモン放出因子(ORF(1−29)NHzl(
30■)の0.02 MリンfIII!di液(pl+
5.52.3R1)溶液に4−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール+28.5mg
(グアニジノ基に対して1当量)を加え、遮光下室温に
て72時間放置した。この反応液を七フアクリルS−2
00スーパーファイン(ファルマシア製、スウェーデン
)のカラム(2,6cmφX81cm)を用いたゲル濾
過により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン
社製、米国、膜YM−5)により脱塩濃縮した。得られ
た目的物の水溶液を、さらにYMC−ODS、A−2L
L 5μ、4.6閣φX250m++カラム(山村化学
型)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより二
次精製し、目的物を得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、110゛C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析イd
して有用なポリエチレングリコール誘導体、および当該
ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されたグア
ニジノ基を有するペプチドおよびその製造方法に関する
。 〔従来の技術・発明が解決しようとする課題〕近年、蛍
白質の研究の発展に伴い種々の作用を持つペプチド、特
に生理活性蛋白質が数多く発見されている。また、遺伝
子組み換え技術やペプチドの有機合成法の進歩によりこ
れら生理活性ペプチド、またはその[4)1構造化合物
を大量に人手することが可能となってきた。これらの特
殊な活性を持つペプチドには医薬品として非常に有用の
ものが多い。 しかしながら、循環系に投与されたペプチドのクリアラ
ンスは一般に非常に速いことが知られているので、当該
ペプチドの持続性の改善が待望される。また、ペプチド
が異種動物から得られたものやペプチド・蛋白質工学に
て設計されたペプチドのようにヒト由来のものとは構造
の異なるものである場合には、抗体が産生されて重篤な
症状を引き起こす危険性が懸念されるので、当該ペプチ
ドの抗原性の改善が待望される。 これらのペプチドを医薬品として用いるためにはこれら
の抗原性や持続性に対する問題を解決しなければならな
い。このような問題点を解決する手段としてペプチドを
高分子化合物により化学的に修飾する方法はきわめて有
効な手段であることが知られている。 しかして、ポリエチレングリコール誘導体は、それ自体
免疫原性が無く、また水溶液中でペプチド(蛋白質)の
3次構造に影響を与えないという優れた特徴を持ってい
るため、ペプチドの高分子修飾試剤として多用されてい
る。 ポリエチレングリコール誘導体を用いてペプチドを修飾
するに際して、その活性化法としてはトリアジン誘導体
による活性化法〔稲田等Jpn、 J。 Cancer 1ies、 (Gann)、 77、1
264−1270 (1986)、 ]、]N−ヒドロ
キシコハク酸イミによる活性エステル法〔レオナルト、
エム等Tetrahedron+ 401581−1
584 (1984)、 ) 、カルボニルジイミダゾ
ールによる活性化法〔チャールズ、オー、ビーチャム等
Ana1. Bioche+*、 131 25−33
(1983)、1 、アルデヒドによる活性化法(藤
野等、特開昭61−178926号公報〕等号一般的の
ものとして知られている。 しかしながら、これらの修飾法はいずれもペプチドのN
末端またはりジン残基t[!1 鎖のアミノ基を修飾す
るものである。 一方、ペプチドには生理活性の発現にN末端アミノ基や
リジン側鎖のアミノ基が重要な役割を持つものが数多く
存在する。従って、この様なペプチドの場合には上記の
様な活性化試剤を用いてアミノ基を修飾することは活性
の低下につながるので好ましくない、また、リジン残基
のみを修飾するものではその修飾部位が限られてしまう
。ペブチi′の性質をコントロールするためにはアミノ
基以外の種々の部位を修飾することが効果的であると考
えられるので他の官能基を修飾する試剤を開発する意義
は極めて大きい。現在名に知られている他の官能基の修
飾試剤としては、メルカプトMを修飾するマレインイミ
ド誘導体、カルボキシル基を修飾するアミノ誘導体〔フ
ランクF、デービス等、特公昭56−23587号公報
〕等が知られている。しかしながら、メルカプト基は分
子表面にメルカプト基の形で存在しなければ修飾困難で
あると考えられるが、その様な構造を持つペプチドは非
常に少ない。 また、アミノ誘導体による修飾の場合、ペプチド中のア
ミノ基による副反応が起きる為に修!1i試剤のみを選
択的に反応させることが困難である。 一方、ペプチド中のグアニジノ基の低分子修飾試剤とし
ては、フェニルグリオキザール(ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、248巻、6171 (
1968))、2.3−ブタンジオン(バイオケミスト
リー、12巻、3915 (1973))、1.2−シ
クロヘキサンジオン(ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、250巻、557 (1975))
などが知られているが、ポリエチレングリコール誘導体
でペプチド中のグアニジノ基を修飾できる誘導体は、未
だ知られていない。 本発明の目的は、ベブチ、ドのグアニジノ基を選択的に
修飾することのできるポリエチレングリコール誘導体を
提供することである。 本発明の他の目的は、当該ポリエチレングリコール誘導
体を使用することによって得られる修飾ペプチドを提供
することである。 本発明のさらに他の目的は、当該修飾ペプチドの製造方
法を提供することである。 [課題を解決するための手段] 本発明者らは上記目的を達成するために種々研究を重ね
て来たところ、下記ポリエチレングリコール誘導体(1
)がペプチドにおけるグアニジノ基を選択的に修飾する
ことを知見し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに
至った。 本願の第1番目の発明は式 (式中、Rは低級アルキル基を表し、nはポリエチレン
グリコール部分の平均分子量が約1 、000〜12.
000となる任意の正の整数であることを表す。)で表
されるポリエチレングリコール誘導体(1)である。 本願の第2番目の発明は、ポリエチレングリコール誘導
体(+)とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることによって得られる修飾ペプチドである。 本願の第3番目の発明は、ポリエチレングリコール誘導
体(r)とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させ
ることによって得られる修飾ペプチドの製造方法である
。 式(+)においてRで表される低級アルキル基は、直鎖
状、分岐状のいずれでもよく、たとえばメチル、エチル
、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル等の炭素数
1〜4の低級アルキル基が好適である。 本発明のポリエチレングリコール誘導体(1)は以下の
方法にて容易に製造することができる。 即ち、式 %式%() (式中、Rおよびnは前記と同意義) で表されるモノアルコキシポリエチレングリコール(n
)と適当な活性化試薬とを好適には塩基の存在下で反応
させることにより、式 %式%() 〔式中、X゛はアルキルスルホニルオキシ(たとえば、
メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ等の
炭素数1〜4の低級アルキルスルホニルオキシ)、芳香
族スルホニルオキシ(たとえば、トルエンスルホニルオ
キシ等)またはハロゲン(塩素、臭素等)を表す〕 で表される活性体(I[+)に導びく。 この際用いられる活性化試薬としては、たとえば■アル
キルスルホニルクロリド(そのアルキル部分としては前
記と同様の低級アルキルが好ましく、たとえばメチルス
ルホニルクロリド、エチルスルホニルクロリド等が例示
される) (Ronald K。 Cro3s 1and等、J、 Org、 Chell
、 3M、 3195 (1970))、■芳香族ス
ルホニルクロリド(たとえば、トルエンスルホニルクロ
リド等) (Vladis+ir C,5ekera
等、J、Amer、Ches、 Sac、 55.34
5 (1933)) 、■五臭化リン(James C
a5on等、J、 Org、 Chew、 26゜36
45 (1961) )などが挙げられ、さらに0式(
R′)3P(式中、R′はアルキル基(たとえばオクチ
ルなど)、アリル基(たとえばフェニルなど)またはジ
アルキルアミノ基(たとえばジメチルアミノなど)を表
す、〕で表される化合物の存在下で用いられる弐C(X
)4 [式中、Xはハロゲン(たとえば、塩素、臭素等
)を示す]で表わされる化合物(J、 Hooz等、C
an、 J、 Chell、 46.86(196B)
]等が挙げられる。 この際用いられる塩基としては、ピリジン、トリアルキ
ルアミン(たとえば、トリエチルアミン)のような三級
の有機塩基もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、炭酸ナトリウム、水素化ナトリウム等の無機塩基が挙
げられる。反応溶媒はN、N−ジメチルホルムアミド、
ベンゼン、トルエン、低級ジアルキルエーテル、四塩化
炭素、クロロホルム、塩化メチレン、ジオキサン、テト
ラ上10フラン等自体不活性な溶媒であればいずれでも
よく、またピリジンのように上記の塩基そのものを溶媒
にすることもできる。反応温度は、通常o’c〜、15
0°Cの範囲である。 次いで活性体(III)をN、N−ジメチルホルムアミ
ドやテトラヒドロフラン等の適当な溶媒中で炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム等の適当な無機塩基もしくはトリエ
チルアミン、トリノルマルブチルアミン、ジアザビシク
ロ−2,2,2−ウンデセン等の有機塩基を用いて60
〜120’Cの加熱下にてヒドロキシアセトフェノンと
反応させて式(式中、Pおよびnは前記と同意義) で表されるアセトフェノン誘導体(rV)を得る。 得られたアセトフェノン誘導体(IV)を二酸化セレン
等の適当な酸化剤を用いてN、 N−ジメチルホルム
アミド、ジオキサン等の反応に不活性な溶媒中、60〜
120°Cにて酸化して目的とするポリエチレングリコ
ール誘導体(()を製造することができる。 かくして製造されたポリエチレングリコール誘導体(1
)は自体既知の手段にて任意の純度のものとして単離、
精製することができる。 本明細書において、ペプチドとは2個以上のアミノ酸が
ペプチド結合により結合したものであり、好適には蛋白
質およびその類似構造物質である。 その構成アミノ酸の少なくとも一つは、少なくとも1個
のグアニジノ基を有するもの(たとえば、アルギニン)
である。 かかるペプチド、特に蛋白質としては、たとえばサブス
タンスP(視床下部ホルモン)、コルチロトロピン、リ
ボトロピン、メラノトロピン(下fflllJl部ホル
モン)、アルギニン−パップレシン(神経下垂体ホルモ
ン)、パラチロイドホルモン(甲状腺ホルモン)、サイ
モポエチン(胸腺因子)、インシュリン、グルカゴン(
膵臓ホルモン)、神経成長因子、上皮成長因子、インシ
ュリン様成長因子−I、ヒト形質転換発育因子、成長ホ
ルモン放出因子即ちGRF、塩基性繊維芽細胞成長因子
(成長因子)、セクレチン、コレシストキニン、バソア
クティブインスチナルペブチド、モチリン(胃腸管ホル
モン)、ゴナドトロピン(絨毛膜ホルモン)、性腺刺戟
ホルモン放出ホルモン(性腺刺戟ホルモン)、レラキシ
ン(卵巣ホルモン)、血液凝固因子■因子および■因子
(血友病因子)、ストレプトキナーゼ、フィブリノリシ
ン、デオキシリボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジス
ムターゼ、エラスターゼ、アスパラギナーゼ(酵素)、
&lI織プラスミノーゲン活性化因子、即ちtPA、ウ
ロキナーゼC線溶因子)、リンホカイン〔たとえば、イ
ンターロイキン1および■〕、顆粒球マクロファージ・
コロニー刺戟囚子叩らGM−C81・゛(刺戟因子j、
エリスロポエチン(増血因子)、カルソトニン遺伝子関
連ペプチド(Ca 11節ホルモン)、心房性ツートリ
ウム利尿ペブナド< 111 +s ホルモン)等の生
理活性を有するペプチドならびにここに例示したペプチ
ドと同様の生理活性を有する類似構造物質が例示される
。なお、」二記の例示二こむいて()内は当該ペプチド
の用途を記載するものである。 本発明においてペプチドは遺伝子T学産物、ヒトを含む
各種動物由来のもの、合成品等のいずれの方法で製造さ
れたものでもよい。 本発明の修飾ペプチドの製造は、ポリエチレングリコー
ル誘導体(1)とグアニジノ基を有するペプチドとを反
応させることによってjfわれる。 当該反応に際しては、ポリエチレングリコール誘導体(
+)をグアニジノ基を有するペプチド中のグアニジノ基
に対して1〜lOO倍モル程度用いることが好ましい。 ただし低修飾率のペプチドを得たい場合には1モル程度
以下のもの(たとえば、O,1倍モル〜1倍モル)も用
いることができる。当該ペプチドとポリエチレングリコ
ール誘導体(+)のモル比、反応温度、pi(等を調節
することにより(1飾の程度を任意に選択することが出
来る。また、反応に用いる溶媒は反応を妨害しないもの
であればいずれでもよく、たとえばトリス塩酸緩衝液、
炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、N
−エチル・モルホリン−酢酸JM tji液、マレイン
酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液
が挙げられる。また、当該ペプチドを失活させず、かつ
反応に不活性な有!a溶媒、たとえばメタノール、エタ
ノール、プロパツール等の低級アルコールやアセトニト
リル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても
よい。 反応のpHは一般的に6〜10の範囲で選択することが
好ましいが、中性から弱塩基性が特に好ましい。ただし
、アミノ末端に保護されていないα−“?ミノ基を有す
るペプチドの場合は、やや酸性側のpH5,5〜6.5
が好ましい。反応温度は当該ペプチドが失活しない温度
であればいrれでもよく、たとえば0〜25°Cの範囲
が好ましい。反応は通常暗所で行い、反応時間は3〜7
2時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲル′a、過、イオン交換
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィ
ニティクロマトグラフイー、限外濾過、逆相HPLCに
よる分取等の通常の蛋白質の精製法で精製して目的の修
飾ペプチドを得ることができる。 ところで、低分子修飾試剤であるフェニルグリオキザー
ルの研究において、試薬濃度を大きくするなど条件を過
酷にすると、アミノ末端のα−アミノ基が脱アミン反応
を起こすという副反応が知られている。(生物化学実験
法12、蛋白質の化学修飾(上)、62〜69頁、(学
会出版センター、1981)、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、248巻、6171(+9
68))本発明のポリエチレングリコール誘導体(1)
を用いた修飾においても同様の副反応の可能性が考えら
れる。そこでこのような副反応が懸念される場合には、
グアニジノ基を有するペプチドのアミン基を適当な保護
基で保護した後、ポリエチレングリコール誘導体(1)
と反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保護するとい
う方法によって、修飾ペプチドを製造する方が得策な場
合もある。アミノ基の保lil!基は、ポリエチレング
リコール誘導体(1)と反応性がなく、さらに当該ペプ
チドを失活させることなく脱保護されるものであれば良
く、例えば、スクシニル基、マレイル基、2−メチルマ
レイル基、2.3−ジメチルマレイル基、エキソ−シス
−3,6−ニンドオキソーΔ4−テトラヒドロフタロイ
ル基、エキソ−シス−3,6−ニンドオキシヘキサヒド
ロフタロイル基、テトラフルオロスクシニル基等が挙げ
られる。保護基の導入は、当該分野の公知の方法によっ
て行うことができる。導入試剤としては、相当する酸無
水物、酸ハロゲン化物、活性エステル等が用いられるが
、−i的には相当する酸無水物が多く用いられる。反応
溶媒としては、反応を妨害しないものであればいずれで
もよく、たとえば、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素す
トリウム水溶液、N−エチルモルホリン−酢酸緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。 また当該ペプチドを失活させず、かつ反応に不活性な有
機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、10パノー
ル等の低級アルコールやアセトニ1〜リル、ジオキサン
、テトラヒドロフラン等を添加しても良い。反応のpH
は6〜10の範囲で選択することが好ましいが、中性か
ら弱塩基性が特に好ましい。反応温度は当該ペプチドが
失活しない温度であれば、いずれでも良く、たとえば−
5〜25°Cの範囲が好ましい。反応時間は30分〜3
6時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー、限外濾過、逆相HP L Cに
よる分取等の通常のペプチドおよび蛋白質の精製法で精
製して目的のアミノ基が保護されたペプチドを得ること
ができるが、単離精製することなく引き続いてポリエチ
レングリコール誘導体(1)と反応させアミン拮が保護
されたポリエチレングリコール修飾ペプチドを得ること
もできる。 アミノ基が保護されたグアニジノ基を有するペプチドと
ポリエチレングリコール誘導体(1)との反応および反
応終了後の精製は、前述の反応条件および精製法と同様
の反応条件および精製法で行うことができる。 アミノ基の保護基の脱保護は反応液を酸性に保つことに
よって行うことができる0反応のpl+は1〜6の範囲
で選択することが好ましい。酸性に保つ方法としては、
当該ペプチドが失活しない方法ならばどのような方法で
も良く、たとえば酸(酢酸、トリフルオロ酢酸、有機ス
ルホン酸等の有機酸、塩酸等の無機酸等)を用いる方法
、ダウエックス50W等の酸性樹脂を用いる方法、リン
酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の
緩衝液を用いる方法、およびこれらを組み合わせた方法
等が挙げられる0反応は一般的には水溶液のみで行うが
、場合によっては、当該ペプチドを失活させず、かつ反
応に不活性な有機溶媒、たとえばメタノール、エタノー
ル、プロパツール等の低級アルコールやアセトニトリル
、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加しても良い
。反応温度は当該ペプチドが失活しない温度であればい
ずれでも良く、たとえば0〜40°Cの範囲が好ましい
。反応時間は5分〜60時間で充分である。 反応終了後、反応液を塩析やゲルd#過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフイー、限外濾過、逆相HP L C
による分取等の通常の蛋白質の精製法で精製した目的の
修飾ペプチドを得ることができる。 本修飾ペプチドは通常の製剤、たとえば皮下的、筋肉内
的もしくは静脈内的適用のための注射溶液のような適切
な通常の投与形態に調製することが出来る。かかる製剤
は自体既知の方法によって製造される。 調製された修飾ペプチドは医薬品組成物として哺乳動物
(ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ等)に投与する
ことができる。 その投与量は、たとえば実施例3で得た化学修飾tPA
を心筋梗塞の治療のために投与する場合には通常1〜1
00gを1日1回から数回に分けて投与される。 〔作用・効果) 本発明のポリエチレングリコール誘導体(1)はペプチ
ド中のグアニジノ基を選択的に修飾することができるも
のである。 当該ポリエチレングリコール誘導体(1)にて修飾され
たペプチドは対応する非修飾ペプチドと比較すると、非
常に安定な化合物であり、さらに生体内クリアランスも
著しく遅延(即ち、持続性が延長)され、長時間有効に
その生理活性を示す。 しかも本修飾ペプチドは非修飾ペプチドの有する生理活
性をそのまま有するものであり、当該修飾ペプチドは医
薬品として極めて有効である。 〔実施例] 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらによって制限されるものではない。 なお、以下の記載において各略号はそれぞれ次のことを
意味する。 Asに :アスパラギン酸またはアスパラギ/GIX
:グルタミン酸またはグルタミンSer :セリン
cry :グリソンHts :ヒスチジン
Arg :アルギニンThr :スレオニン Al
a :アラニンPro ニブロリン Tyr
:千ロシンシa1:バリン Met :メチオ
ニン11e:イソロイシン Leu :ロイシンPh
e :フェニルアラニン Lys、 :リジン実施例
1 (1)モノメトキシポリエチレングリコールトンレート ポリエチレングリコールモノメチルエーテル(平均分子
@5000.40g)をトルエン160−および塩化メ
チレン80dの混合溶媒に溶解した。 塩化ハラトルエンスルホニル(8,0g)、ついでトリ
エチルアミン5.8 rnlを加え室温で6時間撹拌し
た。次に塩化バラトルエンスルホニル(8,0g)を追
加し、10時間撹拌した。不溶物をと1#別しa、液を
減圧4縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し標記モノメトキシポリエチレングリコールトシレート
32.4gを得た。(収率78.6%)、情、9.55
〜57°C ’H−NMR(CDCP、、)、TM3.90 (MH
z ) 、 62.18(s)、 63.38(S
)。 δ3.62(s)、 δ7.3(ABq)(2)4−
モノメトキンポリエチレングリコール−アセトフェノン (])で得たモノメトキシポリエチレングリコールトシ
レート(20g)および4−ヒドロキシアセトフェノン
(5,6g)をN、N−ジメチルホルムアミド200d
に溶解した。炭酸カリウム(5,6g )を加え120
“Cの油浴中で4時間撹拌した。 不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシ
リカゲルカラム精製し、標記4−モノメトキシポリエチ
レングリコール−アセトフェノン(14,7g)を得た
。(収率73.9%) 、m、p、 55〜57°C ’H−NMR(CD(1,)、TMS、90 (MHz
)、 δ2.42(S)、 δ3.32(S)。 δ2.64(S)、 δ7.64(ABq)(3)4
−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ
オキザール O の製造: (2)で得た4−モノメトキシポリエチレングリコール
−アセトフェノン(50g)を1. 4−ジオキサン5
00dに溶解した。二酸化セレン(10,8g)を加え
4時間還流した。不溶物を濾別し濾液を減圧′a縮した
。得られた残渣をシリカゲルカラム精製し4−モノメト
キシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール
27gを得た。(収率53.8%) 、+m、p、55
−57’C’H−NMR(CDCI 3 )、 TM
S、 90 (MHz)、 63.38(s)
、 63.66(S)。 67.48(ABq) 実施例2 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾組織プラスミ
ノーゲン活性化因子(t−PA)の製造:t−PA温溶
液12■/d、O,I M塩化ナトリウム、pH3)4
20μlに0.2門炭酸水素ナトリウム水(IMKSC
N、pH8,5)4.6mを加えた後、実施例1で得た
4−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグ
リオキザール150■を加え室温にて4時間撹拌した。 IN塩酸水にてpH3に調整した。0.6%酢酸水中で
透析した後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品を七フア
クリルS−200カラムにてゲル濾過精製した後、セフ
ァデンクス(、−50Fにより精製し、目的物1.9■
を得た。酸分解物(6N塩酸、110’C124時間処
理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 49.0
(50); Glx 51.8 (52);Set
46.7 (48): Gly 45.4 (4
3);旧s 16.4 (16); Arg 26
.7 (35);Thr 24.3 (25); A
la” 32 (32);Pro 30.8 (2
9): Tyr 23.7 (24);Vat 2
1.8 (25); Met 4.1 (5);+1
e 17.1 (19); Leu 40.6 (
39);Phe 16.6 (16); Ly
s 22.8 (21);*基準アミノ酸、()
内は理論値 この結果Argi基が選択的に修飾されていることがわ
かる。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム二マイクロボンダスフェアーCa(3,9X15
0■)(ウォーターズ社製)を容出液:グラジェント A液:水(0,1χトリフロロ酢酸) BeLニアセトニトリル(0,1χトリフロロ酢酸)初
期B液濃度=30% 濃度勾配:1%/分 流速:]af/分 検出波長:214ns 保持時間:15.2分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム: T
SK G3000S胸7.5x600mm(東ソー社製
)溶出液: 0.1 M 食塩水(pH4,0)流速
=l−/分 保持時間:11.4分 実施例3 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾&ll織プラ
スミノーゲン活性化因子(t−PA)11の製造: t−PA温溶液12■/d、0.1M塩化ナトリウム、
pH5)420μlに0.2M炭酸水素ナトリウム水(
IMKSCN、PI+8.5)4.6dを加えた後、実
施例1で得た4−モノメトキシポリエチレングリコール
ーフェニルグリオキザール25.2■を加え室温にて3
時間撹拌した。IN塩酸水溶液にてpH4に調整した。 反応液をウォーターズ製マイクロボンダスフェア−C4
,5μ、300人、φ3.9X150mmカラムを使用
して高速液体クロマトグラフィーにて分取精製した。目
的物の溶出はトリフロロ酢酸を0,1%加えたアセトニ
トリル水溶液を用い毎分l−の流速でアセトニトリル濃
度を33%から43%に毎分0.5%の割合で上昇させ
ることにより行った。得られた生成物の上記条件での高
速液体クロマトグラフィーの溶出時間は −13,2分
であった。収量0.8■。本操作により低修飾率のポリ
エチレングリコール誘導体(1)修飾L−PAが得られ
た。 得られた目的物はSDSゲル電気泳動において、蛋白質
換算で約90000の位置に泳動した。 実施例4 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子(GRF (1−29)NHz )の製造: 成長ホルモン放出因子(GRF(129)NHz 31
00■を水7,3−に溶解した。0.1Mリン酸緩衝液
(pH7,2)66mおよび実施例1で得た4−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル3.6gを加え、暗所室温で終夜撹拌した。反応?f
!2.20dを透析した後凍結乾燥し粗生成物657■
を得た。このものをファルマシア製セファクリルS−2
00カラムφ2X70cmを使用し、0.1 M食塩水
で流速1−毎分の条件でゲル濾過精製を行った。得られ
た分画を山村科学製YMCパックAM3040DSφ]
X30c+aカラムを用い、高速液体クロマトグラフィ
ーにて分取精製した。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を
0.1%加えたアセトニトリル水?8液を用い毎分3m
βの流速でアセトニトリル濃度を0%から80%に毎分
2%の割合で上昇させることにより行った。収量30.
0mg。 酸分解物(6N塩酸110°C24時間)中のアミノ酸
分析値 Asx 2.94 (3); Glx 2.07
(2);Ser 2.81 (3); Gly
1.36 (1);^rg 1.04 (3)
; Thr O,97(+);Ala 1.48
(3); Tyr 1.02 (2);νa
t O,77(1); Met 0.70 (
1);!le 2.01 (2); 1.eu”
4.00 (411;Phe O,96(1)
;1.ysl、ys 1.52 (2);*基準ア
ミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム二マイクロボンダスフェア−C11(3,9X1
50m)(ウォーターズ社製))容出液;グラジェント A7&:水(0,1χトリフロロ酢酸)B液;アセトニ
トリル(0,1χトリフロロ酢酸)初”Jl 3 ?e
、 m 度: 20 %濃度勾配:1%/分 流速=1−/分 保持時間:26.9分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム:5h
odex 0H−88047,6X 500M (昭和
電工)溶出液: 0. l M 食塩水(pHz口流
速;1戚/分 保持時間:t3.S分 尖藷忽五 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾顆粒球マクロ
ファージコロニー刺戟因子(CM−C3F)の製造: GM−C3F (500μ g15 0 0−水l容
液)に実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール11.omgを0、
1 M ’) 7酸緩衝i’ff1(pH8,5) 5
00μffiニ溶解した溶液を加えた。室温で7時間撹
拌した。反応生成物をウォーターズ社製マイクロボンダ
スフェア−C4(5μ、100人、φ3.9X150m
m)カラムを使用し高速液体クロマトグラフィーにて分
取精製した。目的物の溶出はトリフロロ酢酸を0、1%
加えたアセトニトリル水溶液を用い、アセトニトリル濃
度を36%から56%に毎分1%の割合で上昇させるこ
とにより行った。収lO,4111g。 得られた精製物は上記条件での高速液体クロマトグラフ
ィーで12,3分の溶出時間を示した。 類1州i ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾成長ホルモン
放出因子(CRF (1−44)NH□〕の製造: 成長ホルモン放出因子(C,RF(1〜44)NH□]
(20mg)の0.2M NaHCOt (pH8
,18,20d)iW液に4−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール18.5μg(
グアニジノ基に対して1/6当量)を加え、遮光下室温
にて5.5時間放置した。IN塩酸水t8液を用いて反
応液のpHを2,4とした後、セファクリルS−200
スーパーフアイン(ファルマシア製、スウェーデン)の
カラム(2,6c鵬φX84cm)を用いたゲルil!
過により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン
社製、米国、膜YM−10)により脱塩a縮した。得ら
れた目的物の水溶液を、さらにYMC−ODS、A−2
1L 5μ、4,6■φx25ommカラム(山村化学
型)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより二
次精製し、目的物A、目的物Bを得た。 目的物Aの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 ^sx 3.83 (4); Glx 7.18 (
7); Ser 3.82 (4);Gly 3.4
9 (3); Arg 4.87 (6); Th
r 1.17 (1);Ala 5.1B (5);
Tyr 1.89 (2); νal 1.10
(13;Met 0.78 (1); Ile 1.
95 (2); Leu” 5.00 (5);Ph
e O,99(1); Lys 2.26 (2)本
基準アミノ酸、()内は理論イ直 目的物Aの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: Y?IC−0[IS、 A−211,5μ
。 4.6μmφX 250mo+ (山村化学型)ン容出
液;グラジェント A液;水(0,1!トリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢fjJ)初期B液濃度
:25% 濃度勾配;1%/分 流速:1i/分 検出波長:214n翔 保持時間;202分 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フエノール:110
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 ^SX 3.82 (4); GIk 6.89 (
7); Ser 3.70 (4);Gly 3.
17 (3): Arg 4.17 (6)
; 丁hr 1.12 (1);Ala 5.
31 (5): Tyr 1.80 (2); V
al 1.Q5 (11;Met O,91(]);
lie 2.05 (2); Leu” 5.00
(5);Phe O,9B (1); Lys 2
.31 (2)本基準アミノ酸、()内は理論値 目的物Bの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、 A−211,5μ。 4.6mφX 250II1m (山村化学型)溶出液
;グラジェント A液:水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初XJIB液濃度
=25% 濃度勾配=1%/分 流速:1rrdl/分 検出波長:214n+1 保持時間:2L8分 実益±1 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子(GRF (l−29)Nl2 )Hの製造; 成長ホルモン放出因子(ORF(1−29)NHzl(
30■)の0.02 MリンfIII!di液(pl+
5.52.3R1)溶液に4−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フェニルグリオキザール+28.5mg
(グアニジノ基に対して1当量)を加え、遮光下室温に
て72時間放置した。この反応液を七フアクリルS−2
00スーパーファイン(ファルマシア製、スウェーデン
)のカラム(2,6cmφX81cm)を用いたゲル濾
過により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン
社製、米国、膜YM−5)により脱塩濃縮した。得られ
た目的物の水溶液を、さらにYMC−ODS、A−2L
L 5μ、4.6閣φX250m++カラム(山村化学
型)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより二
次精製し、目的物を得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、110゛C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析イd
【
^sx 3.09 (3h Glx 2.2
6 (2); Ser 2.86 (3);
Gly 1.+7 (1); 八rg 1.
92 (3); Thr O,9B (1);
Ala 2.95 (3h Tyr 1.8
4 (2); Val 1.03 (1):
Met 1.10 (1); Ile 1.
84 (2); Leu” 4.00 (4
);Phel、01(1):Lys2.03(2)本基
準アミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、 A−211,5μ。 4.6■φ×250帥(山村化学型) 溶出fL:グラジェント A液:水(0,lχトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:2
5% 濃度勾配:1%/分 流速=1献/分 検出波長:214rv 保持時間=21.9分 O高速ゲルi+1過クロマトグラフィーカラム: TS
K G3000PW 7.5 Inl1φ×60011
111(東ソー社製) 溶出液:0.2M食塩水 流速70.6rdZ分 検出波長:254n削 保持時間;23分 尖施旌■ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子(GRF (1−29)NH! 3■の製造; 成長ホルモン放出因子(GRF(1−29)NH,)(
lOllg)の0.02 Mリン酸緩衝液(ρ)16.
53.5d)ン容液に4−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール43■(クアニジノ
基に対して1当量)を加え、遮光上室温にて39時間放
置した。この反応液をセファクリルS−200スーパー
フアイン(ファルマシア製、スウェーデン)のカラム(
2,6c+aφ×81c謬)を用いたゲル濾過により精
製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン社製、米国
、YM−5)により脱塩濃縮した。得られた目的物の水
溶液を、さらにYMC−ODS、A−21]、5μ、4
.6 rmφX250m5カラム(山村化学型)を用い
た逆相高速液体クロマトグラフィーにより二次精製し、
目的物を得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値A3X
2.63 <3); Glx 2.00 (2);
Ser 2.65 (3);Gly 1.04 (
1); Arg 1.60 (3); Thr O
,81(1);Ala 2.96 (3); Tyr
1.75 (2); νat 1.01 (1)
:Met 1.19 (1): IIs 1.83
(2); Leu” 4.00 (4);Phe O
,85(1); Lys 1.95 (2)本基準ア
ミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム : vIIc−005,A−211,5u。 4.6鵬φ×250閏(山村化学型) 溶出液:グラジェント A液:水(0,1χトリフルオロ酢酸)8eニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:2
5% 濃度勾配:1%/分 流速:1m/分 検出波長:214nm 保持時間:21.9分 夫血汎エ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾&I礒プラス
ミノーゲン活性化囚子D−PA)[[lの製造: tPA5.0mg10.85%NaCj2−0.01χ
Ti+een80 (170μjりに0.02 M
N a Hz P O−−H,PO,(IM KSC
N含有、pH6,0) 5. Odを加え、lNNaO
Hでpo6.oに調整する。 実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレングリコー
ル−フェニルグリオキザール66.5u(グアニジノ基
に対して5当量)を加え、遮光上室温にて16時間放置
後、さらに修飾試剤66.5 tagを加え、同様にし
て16時間放置した。反応液を限外濾過(アミコン社製
、米国、膜YM−30)により過剰の試剤と塩類を除去
した後、セファクリルS−200(ファルマシア社製、
スウェーデン)のカラム(2,6cmφX94cm)を
用いたゲル濾過により目的物Aを含む分画、目的物Bを
含む分画が得られた。それらをそれぞれ限外濾過(アミ
コン社製、米国、膜YM−30)により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物AおよびBの水7容イ夜を得た
。 目的物への酸分解物(6N塩酸−フェノール、+10“
C224時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析(直 Asx 47.5 (50); Glx 5
4.8 (52);Set 45.4 (48);
Gly 47.9 (43);旧s 15.0
(16); 八rg 25.8 (35)
;Thr 20.7 (25); Ala 31.
8 (32);Pro 29.4 (29);
Tyr 22.3 (24);Val 21.1
(25); Met 4.30 (5);lie
16.1 (19)B Leu” 39.0
(39);Phe 17.1 (16); Lys
22.8 (21)*基準アミノ酸、()内は理論
値 目的物への高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、^−211,5μ。 4.6111!lφ×25011IIl(山村化学社製
)l容出液:グラジェント A液:水(0,1Xトリフルオロ酢酸)8液;アセトニ
トリル(0,1ズトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:3
0% 濃度勾配:1%/分 流速:1id1分 検出波長:214nm 保持時間714.6分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5卿φX 6
00mm(東洋ソーダ社製) 溶出液=0.2M食塩水 流速:0.6μ1分 検出波長:254nm 保持時間:21.4分 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 Asx 46.5 (50); Glx 48.0
(52);Ser 46.3 (48); G
ly 47.1 (イ3);旧s 14.6 (1
6); ^rg 27.2 (35hThr 21.
2 (25); Ala 32.1 (32);Pr
o 30.4 (29); Tyr 24.2 (2
4);Val 21.9 (25); Met 6.
06 (5);11e 16.5 (19); Le
u” 39.0 (39);Phe 16.5 (16
); Lys 20.9 (21)*基準アミノ酸、
()内は理論値 目的物Bの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−005,A−211,5μ。 4.6Mφ×250In11(山村化学社製)溶出e:
グラジェント A液;水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液ニア七ト二
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:3
0% 濃r変勾配:1%/分 流速:1d/分 検出波長:214na+ 保持時間:14.5分 ○高速ゲルil!過クロマトグラフィーカラム: TS
K G3000PW 7.5 舗φX 600mm(東
洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 流速:0.6d/分 検出波長:254nm 保持時間: 22.1分 実淘LLL則 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトCu、Z
n−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)の製造: Cu、Zn−hsOD (4,89n+g、シグマ社製
、ヒト赤血球由来)の0.2 M N a HCOs
0102M Naz COz (pH8
,97、2,5m1Vt容液に 4−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール70I1
g(グアニジノ基に対してIO当型)を加え、遮光下室
温にて23.5時間攪拌した。酢酸を用いて反応液のp
Hを5.0とした後、限外濾過(アミコン社製、米国、
YM−30)により過剰の試剤と塩類を除去した後、セ
ファクリルS−200(ファルマシア社製、スウェーデ
ン)のカラム(2,6cmφX94cm)を用いたゲル
濾過により精製し、目的とする分画を限外il!過(ア
ミコン社製、米国、YM−30)により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物を含む水?8?&(10ml、
蛋白含量14.0μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C224時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値へsx、33.
2 (36); Glx 26.6 (26);Se
r 18.7 (20); cly 49.4 (5
0);His 14.1 (+6); Arg 4.
7 (8);Thr 13.5 (16): Al
a” 20.0 (20);Pro 11.1 (10
); Val 26.2 (28);11e 13.
1 (18); Leu 19.6 (18);Ph
e 8.4 (8); Lys 19.9 (22
)*基準アミノ酸、()内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 O高速ゲルal!5クロマトグラフィーカラム: TS
K G3000PW 7.5 mmφX 600u+m
(東洋ソーダ社製) 溶出液二〇、2M食塩水 流速:0.6rd1分 検出波長:254nm 保持時間=20.6分 11屯−例II ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾中Cu。 Z n−スーパーオキシドジスムターゼの製造:牛Cu
、Zn−スーパーオキンドデスムターゼ(Cu、 Z
n −bsOD) 7.5mgを0.2 M Na1
lCOr水(pH8,5) 1.875戚に溶かした後
、実施例1で得た4−メトキシポリエチレングリコール
−フェニルグリオキザール47.5mgを加え、遮光下
室温にて19時間反応させた。反応終了後水2dを加え
、2規定酢酸にて約pH4とした。ごの16Wi、をセ
ファクリルS−200を用いたゲル濾過(カラムサイズ
2.6c+*φx80cm、i出M0.1M酢酸水十0
.2M食塩水(pH2,8)、流速2m1/分)にて精
製を行った。目的物を含む分画を集め、限外濾過により
脱塩・濃縮を行い、目的物を含む0.01M酢酸水溶液
10−(蛋白含量4.21mg)を得た。 酸分解物(6N塩酸、110’C124時間処理)中の
アミノ酸分析値 ^!!X 27.4 (34); Glx 2]、5
(22);Ser 14.5 (16); Gly
42.1 (50);旧s 12.7 (+6);
Arg 5.7 (8);Thr 19.1
(24); 八la 18.0′″ (18);
Pro 12.9 (12): Tyr 2.8
(2):Val 22.4 (30); M
eL 2.8 (2);lie 12.8 (1
8); Leu 17.1 (16):Phe
8.4 (8); Lys 16.0 (2
0)*を基準よして、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:マイクロボンダスフェア−CIll(3,9y
mφX150u+a) (ウォーターズ社!!り l古川7夜:グラジェント A液;水(0,1χトリフルオロ酢酸)Baニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初!IJIB液濃
度;35% 濃度勾配:1%/分 流速;1d/分 検出波長:220n信 保持時間;12.3分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム: T
SK G3000PWXL(7,8rmφ×300In
11)×2(東ソー社製) 溶出?li : 0.2 M食塩水 流速:0.6rnl1分 検出波長:254n− 保持時間:22.6分 月11[1 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾インシュリン
様成長因子−1(ICF−1)の製造:IGF−1(4
,3mg)の0.2 M N a HC0wl0.0
2 M N a zCO:+ (pH8,97,3,0
d )溶液に室温で撹拌下、2−メチルマレイン酸無水
物(20μl)を10分間隔で5回加えた。この間反応
液のpHを8〜9になる様にIN NaOHを加え調
節した。さらに、1時間反応液のpHを8〜8.5にな
る様IN NaOHを加えながら室温で攪(牢した。 ついで、上記パンファー1I111!を加え、IN
NaOHでpH8,97とした後、実施例1で得た4−
モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオ
キザール12.63 II+g (グアニジノ基に対し
て0.7当量)を加え、遮光上室温にて16時間攪拌し
た。酢酸を用いて反応液のpHを6,74とした後、セ
ファクリルS−200(ファルマシア社製、スウェーデ
ン)のカラム(2,6cmφ×94c+i)を用いたゲ
ル濾過により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミ
コン社製、米国、膜YM−10)により、脱塩・aW+
・した。この濃縮物に酢酸を加えρ112.12とし、
37゛Cで9.5時間撹拌した。lNNaOHで中和後
、限外i11過(アミコン社製、米国、膜YM−10)
により、脱塩・濃縮し、更に、限外濾過(ミリボア社製
、米国、UFPI TGC)により濃縮することによ
って、目的物を含む水溶液(500μP、蛋白合計14
8μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 4.7
5 (5): Glx 5.60 (6); Se
r 4.81 (5):Gly 6.96 (7);
Arg 3.5B (6); Thr 2.9
5 (3);^Ia 6.35 (6); Pr
o 5.22 (5); Tyr 3.08 (
3);Val 2.37 (3): Met 0
.37 (1); Ile O,42(1):!
、eu’ 6.00 (6): Phe 3.94
(4); Lys 3.32 (3)本店率ア
ミノ酸、()内は理論値 この結果、Arg残基が選択的に修飾されていることが
わかる。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−005,^−211,5II。 4 、6 mmφX 250+am (山村化学社製)
l古用l夜=グラジェント ^液;水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル(0,lχ1−リフルオロ酢酸)初期Ba、濃度
;25% 濃度勾配;1%/分 流速:l−7分 検出波長:214nm 保持時間:2+、0分 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5 mnφX
600nm(東洋ソーダ社製) 溶出液・0,2M食塩水 流速二0.6#l/分 検出波長:254nm 保持時間:21.6分 尖施撚土l ポリエチレングリコール誘導体(1)(lliインツユ
リン様成長因子−1(IGF−1)(lの製造;lG1
1 (4,1lrlg)の0.2 M N a HC
03N a zCOs (pH8,97、2,0
ml ) ン容l夜に撹拌下、室温で、2−メチルマ
レイン酸無水物(20μf)を10分間隔で5回加えた
。この間反応液のpHを8〜9になる様にlNNa0t
(を加え調節した。さらに、1時間反応液の−pHを8
〜8.5になる様I N N a OHを加えながら
室温で攪拌した。ついで、上記バッファー1 talを
加え、lNNaOHでPH8,97とした後、実施例1
で得た4−モノメトキシポリエチレングリコールーフェ
ニルグリオキザール3.3g(グアニジノ基に対して0
.17当fit)を加え、遮光下室温にて17時間攪拌
した。セファクリルS−200(ファルマシア社製、ス
ウェーデン)のカラム(2,6cmφ×94cm)を用
いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を限外濾過
(アミコン社製、米国、膜YM−10)により、脱塩・
濃縮した。このawi物に酢酸を加えp112.12と
し、37°Cで8時間攪拌した。 IN NaOHで中和後、限外i!!過(アミコン社
製、米国、膜YM−10)により、脱塩・a縮し、さら
に、限外濾過(ミリボア社製、米国、UFPI TG
C)により濃縮することによって、目的物を含む水溶液
(500μr、蛋白含量133.5μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 5.1
9 (5); Glx 6.81 (6); Se
r 5.00 (5);Gly 7.21 (7);
Arg 4.14 (6); Thr 3.01
(3);Ala 5.79 (6); Pro 4.
47 (5); Tyr 2.68 (3);Val
2.65 (3); Met 0.63 (1);
Ile 1.31 (1);Leu” 6.00
(6); Phe 3.49 (4); Ly
s 3.04 (3)本基準アミノ酸、()内は理論
値 本操作により、低修飾率のポリエチレングリコール修飾
ICF−1が得られた。目的物の高速液体クロマトグラ
フィーの挙動は以下の通りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−005,^−211,5μ。 4.61φ×250鵬(山村化学社製)溶出液:グラジ
ェント A液:水(0、lχトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期Bl濃度:2
5% 濃度勾配81%7分 流速=1d/分 検出波長:214n− 保持時間:19.2分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5 rmφX
600m+a(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 流速:0,6d/分 検出波長:254nm 保持時間:231分 見I!i□士 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾インシュリン
様成長因子(Ic;F−1)IIIの製造;IGF−1
(5,00mg)の0゜2M NaHCO*0.02
M Nag Cot (pl+8.97.2.01
11)溶液に撹拌上室温で、2−メチルマレイン酸無水
物(20μN)を5分間隔で5回加えた。この間IN
NaOHを用いて、反応液のpl+を8〜9に調節し
た。さらに、1時間IN NaOHを加えながら、反
応液のpHを8〜8.5に保持した。ついで、反応液の
pl+を8.97に調整した後、実施例1で得た4−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ5オ
キザール3.4■(グアニジノ基に対して0.17当量
)を加え、遮光下室温にて16時間放1した0反応混合
物をセファクリルS−200(ファルマシア社製、スウ
ェーデン)のカラム(2、6cr1φX94c+i)を
用いたゲルi1.#、 iにより精製し、目的とする分
画を限外源I!1(アミコン社製、米国、膜YM−10
)により、脱塩・1l11i!シた。 この濃縮物に酢酸を加えpH2,01とし、40“Cで
11時間攪拌した。lNNaOHでpl+5.0とした
後、限外iit過(アミコン社製、米国、lI@ Y
M −10)により、脱塩・濃縮し、さらに限外濾過(
ミリボア社製、米国、UFPI TGC)により再濃
縮することによって、目的物の水溶液(800μl、蛋
白含量144μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 5.2
9 (5); Glx 6.58 (6); Se
r 5.11 (5);Gly 8.47 (7);
Arg 4.67 (6); Thr 2.76
(3):Ala 7.35 (6); Pro 6.
85 (5); Tyr 3.08 (3);Val
2.63 (3); Met 1.15 (1);
lle O,58(1);Leu” 6.00 (
6); Phe 3.64 (4); Lys 2.1
? (3)本基準アミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、 A−211,5μ。 4.6閣φ×250−(山村化学社製)溶出液;グラジ
ェント A液:水(0、lχトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初j’JI B
fi1度: 25 %濃度勾配=1%/分 流速:]d/分 検出波長:214nm 保持時間:17.4分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5順φX 6
00m(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 流速70.6d/分 検出波長:254ns+ 保持時間:24.7分 夫隻舅土■ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子[GRF (1−29)NH□]■の製造: 成長ホルモン放出因子(G RF (1−29) NH
z)100■を0.2M NaHCO,−Nag C
05(pH9)50affiに溶解した。この溶液に無
水マレイン酸260■を含むアセトン溶液3I11を氷
冷下加え、氷冷下2時間反応させた0反応終了後反応液
をそのまま、ウォーターズ製マイクロボンダスフェア−
C11、φ19X150mカラムを使用して高速液体ク
ロマトグラフィーにて分取精製した。 目的物の溶出はアセトニトリル水溶液を用い、毎分9.
9dの流速でアセトニトリル濃度を30%から75%ま
で毎分1%の割合で上昇させることにより行った。目的
物を含む分画を凍結乾燥することにより目的とするマレ
イル化GRF(129)NHz′を45■得た。このよ
うにして得たマレイル化G RF (1−29) N
H! 15mgを0.2M NaHCO。 (p)18.2)に溶かし、実施例1で得た4−メトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール6
15■を加え、暗所室温にて8時間反応した6反応終了
後IN−酢酸にて中和し、その溶液を2回に分け、セフ
ァクリルS−200を用いたゲル濾過精製(カラムサイ
ズ2.6 c+*φX 94 cm、溶出液0.2M食
塩水、流速2d/分)を行った。 目的物を含む分画を集め、脱塩・濃縮を行い、目的物を
含む水溶液4.5 dを得た。続いて、この溶7夜25
−に2規定酢酸水2.5社を加え、37゛Cにて400
時間反応せ、脱マレイル化を行い、目的とするポリエチ
レングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン放出因子
(GRF (+19)NH,)を得た。 酸分解物(6N塩酸、1]0°C124時間処理)中の
アミノ酸分析値 八SX 3.06 (3); Glx 1.97 (
2); Ser 2.80 (3);Gly 1.0
2 (1); Arg 1.19 (3); Th
r 1.03 (1);八la 3.32 (3)
; Tyr 1.99 (2); Val
1.04 (1);Met 1.09 (1);
lie 2.09 (2); Leu 4.00
” (4);Phe 1.09 (1); Lys
1.84 (2)*を基準として、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム;マイクロボンダスフェア−C0(3,9mmφ
×150止) (ウォーターズ社製) ン古用l&:グラジェント A液:水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:3
5% 濃度勾配;2%/分 流速:1rd/分 検出波長:220nm 保持時間10.5分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム: T
SK G3000P賀 7.5膿φ×600薗 (東ソー社製) 溶出1: 0.2 M食塩水 流速:0.6d/分 検出波長:254nm 保持時間: 22.1分 実[ ポリエチレングリコール誘導体N)修飾ヒトCu、Zn
−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)Hの製造: Cu、Zn−hsOD (15,12+g、シグマ社製
、ヒト赤血球由来)の0.2M NaHCO,−0,
02M NazCOz (pH9,25、7,
5dH容液に4−モノメトキシポリエチレングリコール
−フェニルグリオキザール19,6■(グアニジノ基に
対してl当りを加え、遮光下室温にて8時間攪拌した。 さらに試剤39.2mg(グアニジノ基に対して2当り
を加え、同様にして、16時間放置した。2N−酢酸を
用いて反応液のpHを6.95とした後、セファクリル
S−200(ファルマシア社製、スウェーデン)のカラ
ム(2,6cmφ×94cm)を用いたゲル濾過および
高速ゲル濾過クロマトグラフィー(TSK C300
0SW)により精製し、目的物Aを含む分画、目的物B
を含む分画が得られた。各々の分画を限外濾過(アミコ
ン社11、米国、膜YM−30) によ#)、脱塩・f
aIli!することによって、目的物Aを含む水/8液
]、8m(蛋白含量1.78mg/if)および目的物
Bを含む水溶液1.8d(蛋白含量460μs / I
i)を得た。 目的物Aの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110“
C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 Asx 33.5 (36); Gl++ 26.0
(26);Set 18.7 (20); Gly
49.0 (50);旧s 16.8 (16);
Arg 6.21 (8);Thr 14.7 (1
6); Ala” 20.0 (20);Pro 1
0.9 (10); Val 25.8 (28);
11e 13.9 (1B); Leu 19.4
(18);Phe 8.1 (8); Lys 1
8.3 (22);*基準アミノ酸、()内は理論値 目的物への高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000SW 7.5■φ×60
0馴(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 (5%エタノール含有) 流速70.6d/分 検出波長:220n■ 保持時間422.45分 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
c、24時間処理後の分解物〕中のアミノ酸分析値 八sx 34.2 (36); GIX 26.5
(26)iSer 18.4 (20); Gly
48.8 (50);tlis 16.4 (16);
Arg 7.03 (8);Thr 14.6 (
16); Ala” 20.0 (20);Pro
11.0 (10); Val 25.4 (28)
;11e 13.1 (18); Leu 18.4
(1B);Phe 7.4 (8); Lys
17.1 (22);*基準アミノ酸、()内は理論値 目的物Bの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000!J 7.5 mφX
600m(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 (5%エタノール含有) 流速:O,6−7分 検出波長:220nm 保持時間:25.16分 夫施■上1 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトCu、Z
n−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)mの製造: Cu、Zn−hsOD (10,20+ag、シグマ社
製、ヒト赤血球由来)の0.2 M N a HCO
*−〇、0 2M NatCOs (pH9,
25、5,0−)i容液に4−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フチニルグリオキザール70■(グアニ
ジノ基に対して5当M)を加え、遮光下室温にて18時
間放置した。2N−酢酸を用いて反応液のpHを6.9
とした後、セファクリルS−200(ファルマシア社製
、スウェーデン)のカラム(2,6csφ×94C重)
を用いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を限外
濾過(アミコン社製、米国、膜YM−30)により、脱
塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶液1.8
d(蛋白含量1.59■/d)を得た。酸分解物(6N
塩酸−フェノール、110℃、24時間処理後の分解物
)中のアミノ酸分析値Asx 33.0 (36);
Glx 26.2 (26):Set 18.6 (
20); Gly 4B、2 (50):旧s 16
.4 (16); Arg 5.89 (8);Th
r 14.4 (16); Ala” 20.0 (
20);Pro 11.1 (10); Val 2
6.4 (28);lie 13.9 (18);
Leu 19.5 (1B):Phe 7.9 (8
): Lys 17.0 (22>本基準アミノ酸、
()内は理諜自(面 木操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSKG3000SW 7.5 trmφX
600M(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 溶出液: 0.2 M食塩水 (5%エタノール含有) 流速:0.61d/分 検出波長:220Mm 保持時間:20.19分 1隻炭上l ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトCu、Z
n−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)IVの製造: Cu、Zn−hsOD (4,92mg、シグマ社製、
ヒト赤血球由来)の0.2M NaHCO,−0,0
2M NaICO3(llH9,25,2,5d)溶
液に4−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニ
ルグリオキザール70■(グアニジノ基に対して10当
量)を加え、遮光上室温にて24時間撹拌した。2N−
酢酸を用いて反応液のpifを6.89とした後、セフ
ァクリルS−200(ファルマシア社製、スウェーデン
)のカラム(2,6cmφ×941)を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン社
製、米国、膜YM−30)により、脱塩・濃縮すること
によって、目的物を含む水溶11.8d(蛋白含量1,
34■/−)を得た。酸分解物(6N塩酸−フェノール
、110°C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸
分析値 Asx 33.1 (36); GIX 24.9
(26);Ser 18.6 (20);
Gly 48.7 (50);旧s 16.8 (1
6); Arg 5.5 (8);Thr 14
.5 (16); Ala’″20.0 (20
);Pro 11.4 (10); Val
25.1 (28);+1e 13.2 (18
); Leu 1B、5 (18);Phe 7
.3 (8); Lys 15.0 (22
)本基準アミノ酸、()内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000SIn 7.5閤φ×6
00■(東洋ソーダ社製) 溶出液:0.2M食塩水 (5%エタノール含を) 流速:0.6d/分 検出波長:220rv 保持時間19.58分 手続(甫正書(自発) 平成1年7月31日 1、事件の表示 平成1年特許願第112716号 2、発明の名称 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびそ
の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名(名称) 住友製薬株式会社 4、代理人■541 住所 大阪市中央区平野町三丁目3番9号(場末ビル) Tn、 (06) 227−1156 5、補正の対象 明細書の[発明の詳細な説明Jの欄 6、補正の内容 (1)明細書第66頁第5行の次行に以下の記載を加入
する。 「犬施置土J ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド(hCGRP)の製造; h CGRP (0,5mg) の0.2 M
N a HCO30,02M NazCOs
(pH8,97,100uf)溶液に、室温で20%2
−メチルマレイン酸無水物アセトン溶液(10μl)を
10分間隔で2回加えた。この間IN NaOHを用
いて、反応液のpiを9〜lOに調節した。さらにlN
NaOHでpHを9〜10とし、1時間室温にて放置し
た。 次いで実施例1で得た4〜モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール2.6■および0.
2M NaHCOz −0,02M NatCOs
(50tt l )を加え、IN NaOHでp
H9〜10に調整し、遮光上室温にて6.5時間放置放
置した。反応混合物をTSKge lG3000SW(
東ソー社製、7.5MφX60cm)を用いたゲルit
t過により精製し、目的物Aを含む分画、目的物Bを含
む分画が得られた。各々の分画を凍結乾燥後、遠心濾過
チューブ(ミリボア社製、ウルトラフリーC3LGC)
により、脱塩・濃縮することによって、目的物Aを含む
水溶液50μPおよび目的物Bを含む水溶?050μl
を得た。 目的物Aの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
c、24時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 八SX 3.8 (4) ; Ser 2.9
(3) ;Gly 4.4 (4) ; 旧s
1.0 (1) ;Arg O,8(2) : T
hr 3.4 (4) ;^1a” 4 (4)
; Pro 1.0 (1) ;Val 4.
2 (5) ; Cys −(2) ;Leu
2.0 (3) ; Phe 1.9 (2) :
Lys 1.9 (2) ; 本基準アミノ酸、()内は理論値、−は末より定は以下
の通りである。 ○高速ゲルiIt過クロマトグラフィーカラム:TSK
ge 1G3000sW(7,5mmφx60c+a)
(東ソー社製)溶出液: 0. I M食塩水(5%エ
タノール含有)流速:0.1M1分 検出波長:214nm 保持時間:19.6分 ゛ 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
c、24時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 Asx 3.8 (4) : Ser 2.7
(3) ;Gly 4.4 (4) ; H4s
1.1 (1) ;Arg O,8(2) ;
Thr 3.4 (4) ;^1a” 4 (4
) ;Pro 1.0 (1) ;Val 4.2
(5) : Cys −(2) ;Leu 3
.0 (3) ; Phe 1.9 (2) ;L
ys 1.9 (2) ; ネ基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物B
の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りであ
る。 ○高速ゲルisクロマトグラフィー カラム:TSKge lG3000SW(7,5m+s
φX60cm)(東ソー社!り溶出液: 0. I M
食塩水(5%エタノール含有)流速:0.1d/分 検出波長:214nm 保持時間=21.4分 叉1華]J ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾エラスターゼ
の製造。 エラスターゼ(0,5mg)の0.2 M N a
)I COsO,02M N a zc Os (
pH8,97,150μf)i8液に、室温で10%2
−メチルマレイン酸無水物アセトン?H!(10μl)
を5分間隔で5回加えた。この間IN NaOHを用
いて、反応液のpHを9〜10に調節した。さらにIN
NaOHでpi(を9〜lOとし、2.5時間室温
にて放置した。 次いで実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール(2,3111g)
を加え、IN NaOHでpH9〜10に調整し、遮
光下室温にて18時間放置した後、酢酸を加えpH3と
し、40°Cで4時間放置した。反応混合物をTSKg
e 1G3000sW (東ソー社製、7、5 mll
φx60cm)を用いたゲル濾過により精製し、目的と
する分画を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ(ミリポア社
製、ウルトラフリーC3LGC)により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物の水溶液50μlを得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 22
.3 (24) : Glx 17.6 (19)
;Ser 16.6 (22) ; Gly
27.6 (25) ;1(is 6.9 (6)
; Arg 8.43(12) ;Thr 1
5.8 (19) ; Ala” 17 (IT)
;Pro 6.9 (7) ; Tyr 9
.9 (11) ;Val 23.7 (27) :
Met 0.5 (2) ;Cys−(8)
; Ile 8.3 (10) :Leu 1
8.7 (1B) ; Phe 3.2
(3) ;しys 2.6 (3)
; Trp −(7) ;*基準アミノ
酸、()内は理論値、−は未測定目的物の高速液体クロ
マトグラフィーの$勅は以下の通りである。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G4000PWxL(7,8m
rsφX30c+a)2本連結十T S K guar
dcolomun P W x L(6,0amφx4
cm)(東ソー社製)、i 出111(j] −0,2
M NaC1流速:0.6tnl1分 検出波長:2+4nm 保持時間:24.9分 太換炭I上 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒト心房性ナ
トリウム利尿ペプチド(hANP)の製造; hANP (216μg)の0.2 M N a t
−I COsN a t C03(pH8,97、10
0μ j2)?容ン(((に、室〆昌で10%2−メチ
ルマレイン酸無水物含有アセトン?8t7.(9μりを
5分間隔で2回加えた。 この間I N N a Oi+を用いて、反応液のp
Hを8〜9に調節した。1時間30分後、実施例1で得
た4−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール(0,87■)を含む0.2MNa H
COx−NaxCOl(pH8,97)水溶tL(50
μf)を加え、IN NaOHでpH8〜9とした後
、遮光下室温にて2時間30分放置した。IN酢酸水に
てpHを2〜3とし、37°Cにて遮光下8時間30分
放置した。反応液をTSKgelG3000SW(東ソ
ー社製、7.5 +++mφ×60c+a)を用いたゲ
ル濾過により精製し、目的物を含む分画を限外lIl過
により、脱塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶
液(60μりを得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、+10°C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値ASX
1.7 (2) ; Glx O,9(])
:Set 3.7 (5) ; Gly 4.9
(5) ;Arg 2.4 (5) ; Ala
1.1 (1) ;Tyr O,9(1)
; Met O,4(1) ;11e 1
.0 (1) ; Leu” 2.0 (2
) ;Phe 2.1 (2) ; Cy
s −(2) ;*基準アミノ酸、()内は理
論値、−は未測定目的物の高速液体クロマトグラフィー
の挙動は以下の通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge lG3000SW(7,5mφX
60cm+)(東ソー社製)溶出液: 0. I M食
塩水(5%エタノール含有)流速:0.5ml/分 検出波長:220um 保持時間726.42分 尖施開11 ポリエチレングリコール誘導体(])修飾性腺刺激ホル
モン放出ホルモン(L HRH)の製造:L HRH2
24a gを含む0.2 M N a HCOy−N
a、COs (pH9)200μffiの溶液に、室
温にて、実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレン
グリコール−フェニルグリオキザール1.9■を加え、
遮光下室温にて24時間放置した。lN酢酸水にてpH
を約7とした後、逆相高速液体クロマトグラフィーCY
MC−ODS、4.6師φ×2501側 : ン古用液
A液=0,1 %TFA水とB7夜−アセトニトリル
(0,1%TFA)を用いたグラジェント(初1III
B?a、a度30%、勾配置%/分);流速、Itnl
1分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水60μpを加え、目的物を含む水溶液として
得た。 目的物の酸分解物<6N塩酸−フェノール、llo’c
、24時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値GIX
1.0 (1) ; Ser 1.0 (1)
:Gly 2.3 (2) ; 1lis 1
.0 (1) ;Arg 0.2 (1) ; P
ro 】、1 (1) :Tyr O,8(1
) ; Leu’ I (1ン
;↑rp −(1) ; *基準アミノ酸、()内は理論値、−は未atlI定目
的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通り
である。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSKge lG300QSW(7゜5Mφ
X60cm)(東ソー社製)溶出M : 0.1 M食
塩水(5%エタノール含有)流速:0.5rd1分 検出波長:220um 保持時間;34.46分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS、AM−303,5,y4、6
waφx250mm(山村化学社製)ビ古用l&、:
グラジェント A液:水(0,1%トリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル (0,1%トリフルオロ酢酸) 初DB液4度;35% 1度勾配:1%/分 流速:ld/分 検出波長:220um 保持時間:12.71分 尖旌斑主主 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾α−メラノト
ロピンの製造コ α−メラノトロピン228ugを含む0.2 MNaH
CO* −NatCOs (pi−19)100μn
の溶液に、室温にて、実施例1で得た4−モノメトキシ
ポリエチレングリコールーフェニルグリオキザー/1,
685μgを含む0.2 M N a HCO3N
a zc Ox (pH9)水7容?& I OOu
lを加え、遮光下室温にて24時間放置した。lN酢
酸水に7pNを約7とした後、TSKge IC;30
(IO5W(東ソー社製、7.5閾φX60cm)を用
いたゲル濾過により精製し、目的物を含む分画を脱塩し
、凍結乾燥した後、水60μlを加え、目的物を含む水
溶液として得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、l I O
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値G
lx O,9(1) ; Ser 2.0 (2
) ;Gly 1.1 (1) ; His 1
.0 (1) ;Arg O,4(1) : Pr
o 1.1 (1) :Tyr 1.0 (1)
; Val 1.1 (1) ;Met O,9
(1) ; Phe” 1 (1) :Lys
O,9(1) ; Trp −(1)
:本基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物
の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りであ
る。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G3000sW(7,5mrs
φX60cm)(東ソー社製)溶出液: 0.1 M食
塩水(5%エタノール含有)流速:0.5d/分 検出波長:220nm 保持時間:34.42分 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS、AM−303゜5μ4、6
mφ×250順(山村化学社製)f古用液;グラジェン
ト へ液:水(011%トリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル (0,1%トリフルオロ酢酸) 初期B液濃度=35% 濃度勾配;1%/分 流速:1−7分 検出波長:220nm 保持時間12.71分 叉施炭斐土 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾パラチロイド
ホルモン(1−34) (PTH(1−34))の製
造: PTH(134)224μgを含む0.2MNaHCO
,−Na、COs (pH8,97)100μlのン
容液に、室温にてl゛0%2−メチルマレイン酸無水物
含有アセトン溶液(9μりを5分間隔で2回加えた。こ
の間IN NaOHを用いて、反応液のpHを8〜9
に調節した。1時間後、実施例1で得た4−モノメトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール2
72μgを含む0.2M NaHCO:+ Naz
COt (pH8,97)水溶液50ulを加え、1
NNaOHでpl+を8〜9とした後、遮光下室温にて
2時間放置後、さらに修飾試剤27QtIgを含む0.
2M NaHCOx N a tCOx (Pi
18.97 )水溶液25μ!を加え、遮光下室温にて
2時間30分放置した。 IN酢酸水にてpHを2〜3とし、37゛Cにて遮光下
8時間放置した。反応液をTSKge lG3000S
W(東ソー社製、7.5In111φX60cm)を用
いたゲルd#過によりt#復し、目的物を含む分画をさ
らに逆相高速液体クロマトグラフィーCYMC−ODS
、4.6 順φ X250 tm : i古用液
A液−0,1%TFA水とF3M−アセトニトリル(0
,1%TFA)を用いたグラジェント(初y、ute度
20%、勾配置%/分);流速1−/分〕により精製を
行った。目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水50μ
βを加え、目的物を含む水溶液として得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、I 10
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値^
sx 3.8 (4> ; Gl
x 4.5 (5) ;Ser 2.
7 (3) ; Gly 1.1 (1) ;Ha
s 2.9 (3) : Arg 1.3 (2
) ;Val 2.8 (3) : Met O
,8(2) ;lie 1.0 (1) ; Le
u” 5 (5) ;Phe 1.0 (1)
; Lys 2.6 (3) :Trp −(
1); 本基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物の
高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである
。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G3000sW(7,5tmφ
X60c+s)(東ソー社製)溶出i : 0.1 M
食塩水(5%エタノール含有)流速:0.5d/分 検出波長:220nm 保持時間:34.03分 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS、AM−303,5μ4.6閣
φ×250市(山村化学社製)ン容出液:グラジエント A液:水(0,1%トリフルオロ酢酸)Bl&ニアセト
ニトリル (0,1%トリフルオロ酢酸) 初期B液濃度;35% 濃度勾配:1%/分 流速:IIdl/分 検出波長:220μm 保持時間:11.82分J 手続事甫正書(自発) 1、事件の表示 平成1年特許願第112716号 2、発明の名称 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ベプ氏名(名称)
住友製薬株式会社 4、代理人■541 住所 大阪市中央区平野町三丁目3番9号(湯水ビル) k (06) 227−1156 明細書の「発明の詳細な説明]の欄 6、補正の内容 (+1 明細書の「発明の詳細な説明」の欄(平成1
年7月31日付提出の手続補正書(自発)第17頁第3
行)の次行に以下の記載を加入する。 「月11[j ポリエチレングリコール誘導体(])修飾インシュリン
様成長因子−II (IGI”−11)の製造:IGF
−11(200μg)の0.2M NaHCOzN
a 2COx (1)118.97.100μり溶液
に、室温にて10%2−メチルマレイン酸無水物含有ア
セトン溶液(9μl)を5分間隔で2回加えた。 この間IN NaOHを用いて、反応液のpl+を8
〜9に調節した。35分後、実施例1で得た4−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル(0,5mg)を含む0.2 M N a HCO*
−NatCOx (pt18.97)水溶液(50μ
l)を加え、lNNaOHでpHを8〜9とした後、遮
光上室温にて2時間45分放置した。IN酢酸水にて9
11を2〜3とし、37゛Cにて遮光下9時間放置した
8反応液をTSKg、e 1G3000sW(東ソー社
製、7.5 !IIφX60cm)を用いたゲル濾過べ
より精製し、目的物を含む分画を限外濾過にまり脱塩・
濃縮することにより、目的物を含む水?8液(50μ!
、蛋白含量15.4Mg150μ2)を得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値^sx
3.0 (3) ; Glx 6.1 (7)
;Ser 6.7 (7) ; Gly 5.
8 (5) ;Arg 5.4 (8) ; Th
r 3.0 (4) ;Ala” 5.0 (5)
; Pro 2.4 (3) ;Tyr 2.4
(3) ; νat 3.2 (4) ;11e
O,8(1) : Leu 4.7 (6)
;Phe 3.3 (4) ; Lys 1.0
(1) :Cys −(6) F *基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物の
高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである
。 ○高速ゲルiIt過クロマトグラフィーカラム:TSK
ge IG3000SW(7,5rrmφX60cmN
東ソー社製)溶出液: 0. I M食塩水(5%エタ
ノール含有)流速:0.5d/分 検出波長・220nm 保持時間: 26.67分 実」l殊2」□ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ウリカーゼの
製造: ウリカーゼ(0,5mg)の0.2 M N a H
C030、02M N a zCOh (pHB、
97.100μm)溶液に、室温で20%2−メチルマ
レイン酸無水物アセトン)容′e、(10μP)を5分
間隔で3回加えた。この間IN NaOHを用いて、
反応液のρ11を9〜lOにjJi1節した。さらにI
N Na○11でpHを9〜10とし6時間室温にて
放置した。次いで、実施例1で得た4−モノメトキシポ
リエチレングリコール−フェニルグリオキザール15■
および0.2M NaHCO,−0,02M Na
、CO。 (50μl)を加え、lNNaOHでpHを9〜10に
調整し、遮光上室温にて24時間放置した後、酢酸を加
え、pH3とし、40’Cで3時間放置した。 反応混合物をTSKge Ic;4000PWxL (
7,8■φX30cm) 2不連結+T S Kgua
rdcolumnPWxLゲル濾過により精製し、目的
とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ(ミリボア
社製、ウルトラフリーC3LGC)により、脱塩・濃縮
することによって、目的物の水溶液50μpを得た。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G4000PWxL(7,8m
φX30c+e)2不連結+T S Kguardco
lomun P W x L(6,0amφx4cm)
(東ソー社製)I古用液 :0.2M NaCl 流速:0.6d/分 検出波長:254nm 保持時間:24.6分」
6 (2); Ser 2.86 (3);
Gly 1.+7 (1); 八rg 1.
92 (3); Thr O,9B (1);
Ala 2.95 (3h Tyr 1.8
4 (2); Val 1.03 (1):
Met 1.10 (1); Ile 1.
84 (2); Leu” 4.00 (4
);Phel、01(1):Lys2.03(2)本基
準アミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、 A−211,5μ。 4.6■φ×250帥(山村化学型) 溶出fL:グラジェント A液:水(0,lχトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:2
5% 濃度勾配:1%/分 流速=1献/分 検出波長:214rv 保持時間=21.9分 O高速ゲルi+1過クロマトグラフィーカラム: TS
K G3000PW 7.5 Inl1φ×60011
111(東ソー社製) 溶出液:0.2M食塩水 流速70.6rdZ分 検出波長:254n削 保持時間;23分 尖施旌■ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子(GRF (1−29)NH! 3■の製造; 成長ホルモン放出因子(GRF(1−29)NH,)(
lOllg)の0.02 Mリン酸緩衝液(ρ)16.
53.5d)ン容液に4−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール43■(クアニジノ
基に対して1当量)を加え、遮光上室温にて39時間放
置した。この反応液をセファクリルS−200スーパー
フアイン(ファルマシア製、スウェーデン)のカラム(
2,6c+aφ×81c謬)を用いたゲル濾過により精
製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン社製、米国
、YM−5)により脱塩濃縮した。得られた目的物の水
溶液を、さらにYMC−ODS、A−21]、5μ、4
.6 rmφX250m5カラム(山村化学型)を用い
た逆相高速液体クロマトグラフィーにより二次精製し、
目的物を得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値A3X
2.63 <3); Glx 2.00 (2);
Ser 2.65 (3);Gly 1.04 (
1); Arg 1.60 (3); Thr O
,81(1);Ala 2.96 (3); Tyr
1.75 (2); νat 1.01 (1)
:Met 1.19 (1): IIs 1.83
(2); Leu” 4.00 (4);Phe O
,85(1); Lys 1.95 (2)本基準ア
ミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム : vIIc−005,A−211,5u。 4.6鵬φ×250閏(山村化学型) 溶出液:グラジェント A液:水(0,1χトリフルオロ酢酸)8eニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:2
5% 濃度勾配:1%/分 流速:1m/分 検出波長:214nm 保持時間:21.9分 夫血汎エ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾&I礒プラス
ミノーゲン活性化囚子D−PA)[[lの製造: tPA5.0mg10.85%NaCj2−0.01χ
Ti+een80 (170μjりに0.02 M
N a Hz P O−−H,PO,(IM KSC
N含有、pH6,0) 5. Odを加え、lNNaO
Hでpo6.oに調整する。 実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレングリコー
ル−フェニルグリオキザール66.5u(グアニジノ基
に対して5当量)を加え、遮光上室温にて16時間放置
後、さらに修飾試剤66.5 tagを加え、同様にし
て16時間放置した。反応液を限外濾過(アミコン社製
、米国、膜YM−30)により過剰の試剤と塩類を除去
した後、セファクリルS−200(ファルマシア社製、
スウェーデン)のカラム(2,6cmφX94cm)を
用いたゲル濾過により目的物Aを含む分画、目的物Bを
含む分画が得られた。それらをそれぞれ限外濾過(アミ
コン社製、米国、膜YM−30)により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物AおよびBの水7容イ夜を得た
。 目的物への酸分解物(6N塩酸−フェノール、+10“
C224時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析(直 Asx 47.5 (50); Glx 5
4.8 (52);Set 45.4 (48);
Gly 47.9 (43);旧s 15.0
(16); 八rg 25.8 (35)
;Thr 20.7 (25); Ala 31.
8 (32);Pro 29.4 (29);
Tyr 22.3 (24);Val 21.1
(25); Met 4.30 (5);lie
16.1 (19)B Leu” 39.0
(39);Phe 17.1 (16); Lys
22.8 (21)*基準アミノ酸、()内は理論
値 目的物への高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、^−211,5μ。 4.6111!lφ×25011IIl(山村化学社製
)l容出液:グラジェント A液:水(0,1Xトリフルオロ酢酸)8液;アセトニ
トリル(0,1ズトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:3
0% 濃度勾配:1%/分 流速:1id1分 検出波長:214nm 保持時間714.6分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5卿φX 6
00mm(東洋ソーダ社製) 溶出液=0.2M食塩水 流速:0.6μ1分 検出波長:254nm 保持時間:21.4分 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 Asx 46.5 (50); Glx 48.0
(52);Ser 46.3 (48); G
ly 47.1 (イ3);旧s 14.6 (1
6); ^rg 27.2 (35hThr 21.
2 (25); Ala 32.1 (32);Pr
o 30.4 (29); Tyr 24.2 (2
4);Val 21.9 (25); Met 6.
06 (5);11e 16.5 (19); Le
u” 39.0 (39);Phe 16.5 (16
); Lys 20.9 (21)*基準アミノ酸、
()内は理論値 目的物Bの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−005,A−211,5μ。 4.6Mφ×250In11(山村化学社製)溶出e:
グラジェント A液;水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液ニア七ト二
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:3
0% 濃r変勾配:1%/分 流速:1d/分 検出波長:214na+ 保持時間:14.5分 ○高速ゲルil!過クロマトグラフィーカラム: TS
K G3000PW 7.5 舗φX 600mm(東
洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 流速:0.6d/分 検出波長:254nm 保持時間: 22.1分 実淘LLL則 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトCu、Z
n−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)の製造: Cu、Zn−hsOD (4,89n+g、シグマ社製
、ヒト赤血球由来)の0.2 M N a HCOs
0102M Naz COz (pH8
,97、2,5m1Vt容液に 4−モノメトキシポリ
エチレングリコール−フェニルグリオキザール70I1
g(グアニジノ基に対してIO当型)を加え、遮光下室
温にて23.5時間攪拌した。酢酸を用いて反応液のp
Hを5.0とした後、限外濾過(アミコン社製、米国、
YM−30)により過剰の試剤と塩類を除去した後、セ
ファクリルS−200(ファルマシア社製、スウェーデ
ン)のカラム(2,6cmφX94cm)を用いたゲル
濾過により精製し、目的とする分画を限外il!過(ア
ミコン社製、米国、YM−30)により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物を含む水?8?&(10ml、
蛋白含量14.0μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C224時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値へsx、33.
2 (36); Glx 26.6 (26);Se
r 18.7 (20); cly 49.4 (5
0);His 14.1 (+6); Arg 4.
7 (8);Thr 13.5 (16): Al
a” 20.0 (20);Pro 11.1 (10
); Val 26.2 (28);11e 13.
1 (18); Leu 19.6 (18);Ph
e 8.4 (8); Lys 19.9 (22
)*基準アミノ酸、()内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 O高速ゲルal!5クロマトグラフィーカラム: TS
K G3000PW 7.5 mmφX 600u+m
(東洋ソーダ社製) 溶出液二〇、2M食塩水 流速:0.6rd1分 検出波長:254nm 保持時間=20.6分 11屯−例II ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾中Cu。 Z n−スーパーオキシドジスムターゼの製造:牛Cu
、Zn−スーパーオキンドデスムターゼ(Cu、 Z
n −bsOD) 7.5mgを0.2 M Na1
lCOr水(pH8,5) 1.875戚に溶かした後
、実施例1で得た4−メトキシポリエチレングリコール
−フェニルグリオキザール47.5mgを加え、遮光下
室温にて19時間反応させた。反応終了後水2dを加え
、2規定酢酸にて約pH4とした。ごの16Wi、をセ
ファクリルS−200を用いたゲル濾過(カラムサイズ
2.6c+*φx80cm、i出M0.1M酢酸水十0
.2M食塩水(pH2,8)、流速2m1/分)にて精
製を行った。目的物を含む分画を集め、限外濾過により
脱塩・濃縮を行い、目的物を含む0.01M酢酸水溶液
10−(蛋白含量4.21mg)を得た。 酸分解物(6N塩酸、110’C124時間処理)中の
アミノ酸分析値 ^!!X 27.4 (34); Glx 2]、5
(22);Ser 14.5 (16); Gly
42.1 (50);旧s 12.7 (+6);
Arg 5.7 (8);Thr 19.1
(24); 八la 18.0′″ (18);
Pro 12.9 (12): Tyr 2.8
(2):Val 22.4 (30); M
eL 2.8 (2);lie 12.8 (1
8); Leu 17.1 (16):Phe
8.4 (8); Lys 16.0 (2
0)*を基準よして、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:マイクロボンダスフェア−CIll(3,9y
mφX150u+a) (ウォーターズ社!!り l古川7夜:グラジェント A液;水(0,1χトリフルオロ酢酸)Baニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初!IJIB液濃
度;35% 濃度勾配:1%/分 流速;1d/分 検出波長:220n信 保持時間;12.3分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム: T
SK G3000PWXL(7,8rmφ×300In
11)×2(東ソー社製) 溶出?li : 0.2 M食塩水 流速:0.6rnl1分 検出波長:254n− 保持時間:22.6分 月11[1 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾インシュリン
様成長因子−1(ICF−1)の製造:IGF−1(4
,3mg)の0.2 M N a HC0wl0.0
2 M N a zCO:+ (pH8,97,3,0
d )溶液に室温で撹拌下、2−メチルマレイン酸無水
物(20μl)を10分間隔で5回加えた。この間反応
液のpHを8〜9になる様にIN NaOHを加え調
節した。さらに、1時間反応液のpHを8〜8.5にな
る様IN NaOHを加えながら室温で攪(牢した。 ついで、上記パンファー1I111!を加え、IN
NaOHでpH8,97とした後、実施例1で得た4−
モノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリオ
キザール12.63 II+g (グアニジノ基に対し
て0.7当量)を加え、遮光上室温にて16時間攪拌し
た。酢酸を用いて反応液のpHを6,74とした後、セ
ファクリルS−200(ファルマシア社製、スウェーデ
ン)のカラム(2,6cmφ×94c+i)を用いたゲ
ル濾過により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミ
コン社製、米国、膜YM−10)により、脱塩・aW+
・した。この濃縮物に酢酸を加えρ112.12とし、
37゛Cで9.5時間撹拌した。lNNaOHで中和後
、限外i11過(アミコン社製、米国、膜YM−10)
により、脱塩・濃縮し、更に、限外濾過(ミリボア社製
、米国、UFPI TGC)により濃縮することによ
って、目的物を含む水溶液(500μP、蛋白合計14
8μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 4.7
5 (5): Glx 5.60 (6); Se
r 4.81 (5):Gly 6.96 (7);
Arg 3.5B (6); Thr 2.9
5 (3);^Ia 6.35 (6); Pr
o 5.22 (5); Tyr 3.08 (
3);Val 2.37 (3): Met 0
.37 (1); Ile O,42(1):!
、eu’ 6.00 (6): Phe 3.94
(4); Lys 3.32 (3)本店率ア
ミノ酸、()内は理論値 この結果、Arg残基が選択的に修飾されていることが
わかる。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−005,^−211,5II。 4 、6 mmφX 250+am (山村化学社製)
l古用l夜=グラジェント ^液;水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル(0,lχ1−リフルオロ酢酸)初期Ba、濃度
;25% 濃度勾配;1%/分 流速:l−7分 検出波長:214nm 保持時間:2+、0分 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5 mnφX
600nm(東洋ソーダ社製) 溶出液・0,2M食塩水 流速二0.6#l/分 検出波長:254nm 保持時間:21.6分 尖施撚土l ポリエチレングリコール誘導体(1)(lliインツユ
リン様成長因子−1(IGF−1)(lの製造;lG1
1 (4,1lrlg)の0.2 M N a HC
03N a zCOs (pH8,97、2,0
ml ) ン容l夜に撹拌下、室温で、2−メチルマ
レイン酸無水物(20μf)を10分間隔で5回加えた
。この間反応液のpHを8〜9になる様にlNNa0t
(を加え調節した。さらに、1時間反応液の−pHを8
〜8.5になる様I N N a OHを加えながら
室温で攪拌した。ついで、上記バッファー1 talを
加え、lNNaOHでPH8,97とした後、実施例1
で得た4−モノメトキシポリエチレングリコールーフェ
ニルグリオキザール3.3g(グアニジノ基に対して0
.17当fit)を加え、遮光下室温にて17時間攪拌
した。セファクリルS−200(ファルマシア社製、ス
ウェーデン)のカラム(2,6cmφ×94cm)を用
いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を限外濾過
(アミコン社製、米国、膜YM−10)により、脱塩・
濃縮した。このawi物に酢酸を加えp112.12と
し、37°Cで8時間攪拌した。 IN NaOHで中和後、限外i!!過(アミコン社
製、米国、膜YM−10)により、脱塩・a縮し、さら
に、限外濾過(ミリボア社製、米国、UFPI TG
C)により濃縮することによって、目的物を含む水溶液
(500μr、蛋白含量133.5μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 5.1
9 (5); Glx 6.81 (6); Se
r 5.00 (5);Gly 7.21 (7);
Arg 4.14 (6); Thr 3.01
(3);Ala 5.79 (6); Pro 4.
47 (5); Tyr 2.68 (3);Val
2.65 (3); Met 0.63 (1);
Ile 1.31 (1);Leu” 6.00
(6); Phe 3.49 (4); Ly
s 3.04 (3)本基準アミノ酸、()内は理論
値 本操作により、低修飾率のポリエチレングリコール修飾
ICF−1が得られた。目的物の高速液体クロマトグラ
フィーの挙動は以下の通りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−005,^−211,5μ。 4.61φ×250鵬(山村化学社製)溶出液:グラジ
ェント A液:水(0、lχトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期Bl濃度:2
5% 濃度勾配81%7分 流速=1d/分 検出波長:214n− 保持時間:19.2分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5 rmφX
600m+a(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 流速:0,6d/分 検出波長:254nm 保持時間:231分 見I!i□士 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾インシュリン
様成長因子(Ic;F−1)IIIの製造;IGF−1
(5,00mg)の0゜2M NaHCO*0.02
M Nag Cot (pl+8.97.2.01
11)溶液に撹拌上室温で、2−メチルマレイン酸無水
物(20μN)を5分間隔で5回加えた。この間IN
NaOHを用いて、反応液のpl+を8〜9に調節し
た。さらに、1時間IN NaOHを加えながら、反
応液のpHを8〜8.5に保持した。ついで、反応液の
pl+を8.97に調整した後、実施例1で得た4−モ
ノメトキシポリエチレングリコール−フェニルグリ5オ
キザール3.4■(グアニジノ基に対して0.17当量
)を加え、遮光下室温にて16時間放1した0反応混合
物をセファクリルS−200(ファルマシア社製、スウ
ェーデン)のカラム(2、6cr1φX94c+i)を
用いたゲルi1.#、 iにより精製し、目的とする分
画を限外源I!1(アミコン社製、米国、膜YM−10
)により、脱塩・1l11i!シた。 この濃縮物に酢酸を加えpH2,01とし、40“Cで
11時間攪拌した。lNNaOHでpl+5.0とした
後、限外iit過(アミコン社製、米国、lI@ Y
M −10)により、脱塩・濃縮し、さらに限外濾過(
ミリボア社製、米国、UFPI TGC)により再濃
縮することによって、目的物の水溶液(800μl、蛋
白含量144μM)を得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 5.2
9 (5); Glx 6.58 (6); Se
r 5.11 (5);Gly 8.47 (7);
Arg 4.67 (6); Thr 2.76
(3):Ala 7.35 (6); Pro 6.
85 (5); Tyr 3.08 (3);Val
2.63 (3); Met 1.15 (1);
lle O,58(1);Leu” 6.00 (
6); Phe 3.64 (4); Lys 2.1
? (3)本基準アミノ酸、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム: YMC−ODS、 A−211,5μ。 4.6閣φ×250−(山村化学社製)溶出液;グラジ
ェント A液:水(0、lχトリフルオロ酢酸)B液ニアセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初j’JI B
fi1度: 25 %濃度勾配=1%/分 流速:]d/分 検出波長:214nm 保持時間:17.4分 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000PW 7.5順φX 6
00m(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 流速70.6d/分 検出波長:254ns+ 保持時間:24.7分 夫隻舅土■ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン
放出因子[GRF (1−29)NH□]■の製造: 成長ホルモン放出因子(G RF (1−29) NH
z)100■を0.2M NaHCO,−Nag C
05(pH9)50affiに溶解した。この溶液に無
水マレイン酸260■を含むアセトン溶液3I11を氷
冷下加え、氷冷下2時間反応させた0反応終了後反応液
をそのまま、ウォーターズ製マイクロボンダスフェア−
C11、φ19X150mカラムを使用して高速液体ク
ロマトグラフィーにて分取精製した。 目的物の溶出はアセトニトリル水溶液を用い、毎分9.
9dの流速でアセトニトリル濃度を30%から75%ま
で毎分1%の割合で上昇させることにより行った。目的
物を含む分画を凍結乾燥することにより目的とするマレ
イル化GRF(129)NHz′を45■得た。このよ
うにして得たマレイル化G RF (1−29) N
H! 15mgを0.2M NaHCO。 (p)18.2)に溶かし、実施例1で得た4−メトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール6
15■を加え、暗所室温にて8時間反応した6反応終了
後IN−酢酸にて中和し、その溶液を2回に分け、セフ
ァクリルS−200を用いたゲル濾過精製(カラムサイ
ズ2.6 c+*φX 94 cm、溶出液0.2M食
塩水、流速2d/分)を行った。 目的物を含む分画を集め、脱塩・濃縮を行い、目的物を
含む水溶液4.5 dを得た。続いて、この溶7夜25
−に2規定酢酸水2.5社を加え、37゛Cにて400
時間反応せ、脱マレイル化を行い、目的とするポリエチ
レングリコール誘導体(1)修飾成長ホルモン放出因子
(GRF (+19)NH,)を得た。 酸分解物(6N塩酸、1]0°C124時間処理)中の
アミノ酸分析値 八SX 3.06 (3); Glx 1.97 (
2); Ser 2.80 (3);Gly 1.0
2 (1); Arg 1.19 (3); Th
r 1.03 (1);八la 3.32 (3)
; Tyr 1.99 (2); Val
1.04 (1);Met 1.09 (1);
lie 2.09 (2); Leu 4.00
” (4);Phe 1.09 (1); Lys
1.84 (2)*を基準として、()内は理論値 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム;マイクロボンダスフェア−C0(3,9mmφ
×150止) (ウォーターズ社製) ン古用l&:グラジェント A液:水(0,1χトリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル(0,1χトリフルオロ酢酸)初期B液濃度:3
5% 濃度勾配;2%/分 流速:1rd/分 検出波長:220nm 保持時間10.5分 0分子ふるい高速液体クロマトグラフィーカラム: T
SK G3000P賀 7.5膿φ×600薗 (東ソー社製) 溶出1: 0.2 M食塩水 流速:0.6d/分 検出波長:254nm 保持時間: 22.1分 実[ ポリエチレングリコール誘導体N)修飾ヒトCu、Zn
−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)Hの製造: Cu、Zn−hsOD (15,12+g、シグマ社製
、ヒト赤血球由来)の0.2M NaHCO,−0,
02M NazCOz (pH9,25、7,
5dH容液に4−モノメトキシポリエチレングリコール
−フェニルグリオキザール19,6■(グアニジノ基に
対してl当りを加え、遮光下室温にて8時間攪拌した。 さらに試剤39.2mg(グアニジノ基に対して2当り
を加え、同様にして、16時間放置した。2N−酢酸を
用いて反応液のpHを6.95とした後、セファクリル
S−200(ファルマシア社製、スウェーデン)のカラ
ム(2,6cmφ×94cm)を用いたゲル濾過および
高速ゲル濾過クロマトグラフィー(TSK C300
0SW)により精製し、目的物Aを含む分画、目的物B
を含む分画が得られた。各々の分画を限外濾過(アミコ
ン社11、米国、膜YM−30) によ#)、脱塩・f
aIli!することによって、目的物Aを含む水/8液
]、8m(蛋白含量1.78mg/if)および目的物
Bを含む水溶液1.8d(蛋白含量460μs / I
i)を得た。 目的物Aの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110“
C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 Asx 33.5 (36); Gl++ 26.0
(26);Set 18.7 (20); Gly
49.0 (50);旧s 16.8 (16);
Arg 6.21 (8);Thr 14.7 (1
6); Ala” 20.0 (20);Pro 1
0.9 (10); Val 25.8 (28);
11e 13.9 (1B); Leu 19.4
(18);Phe 8.1 (8); Lys 1
8.3 (22);*基準アミノ酸、()内は理論値 目的物への高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000SW 7.5■φ×60
0馴(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 (5%エタノール含有) 流速70.6d/分 検出波長:220n■ 保持時間422.45分 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
c、24時間処理後の分解物〕中のアミノ酸分析値 八sx 34.2 (36); GIX 26.5
(26)iSer 18.4 (20); Gly
48.8 (50);tlis 16.4 (16);
Arg 7.03 (8);Thr 14.6 (
16); Ala” 20.0 (20);Pro
11.0 (10); Val 25.4 (28)
;11e 13.1 (18); Leu 18.4
(1B);Phe 7.4 (8); Lys
17.1 (22);*基準アミノ酸、()内は理論値 目的物Bの高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の
通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000!J 7.5 mφX
600m(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 (5%エタノール含有) 流速:O,6−7分 検出波長:220nm 保持時間:25.16分 夫施■上1 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトCu、Z
n−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)mの製造: Cu、Zn−hsOD (10,20+ag、シグマ社
製、ヒト赤血球由来)の0.2 M N a HCO
*−〇、0 2M NatCOs (pH9,
25、5,0−)i容液に4−モノメトキシポリエチレ
ングリコール−フチニルグリオキザール70■(グアニ
ジノ基に対して5当M)を加え、遮光下室温にて18時
間放置した。2N−酢酸を用いて反応液のpHを6.9
とした後、セファクリルS−200(ファルマシア社製
、スウェーデン)のカラム(2,6csφ×94C重)
を用いたゲル濾過により精製し、目的とする分画を限外
濾過(アミコン社製、米国、膜YM−30)により、脱
塩・濃縮することによって、目的物を含む水溶液1.8
d(蛋白含量1.59■/d)を得た。酸分解物(6N
塩酸−フェノール、110℃、24時間処理後の分解物
)中のアミノ酸分析値Asx 33.0 (36);
Glx 26.2 (26):Set 18.6 (
20); Gly 4B、2 (50):旧s 16
.4 (16); Arg 5.89 (8);Th
r 14.4 (16); Ala” 20.0 (
20);Pro 11.1 (10); Val 2
6.4 (28);lie 13.9 (18);
Leu 19.5 (1B):Phe 7.9 (8
): Lys 17.0 (22>本基準アミノ酸、
()内は理諜自(面 木操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSKG3000SW 7.5 trmφX
600M(東洋ソーダ社製) 溶出液: 0.2 M食塩水 溶出液: 0.2 M食塩水 (5%エタノール含有) 流速:0.61d/分 検出波長:220Mm 保持時間:20.19分 1隻炭上l ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトCu、Z
n−スーパーオキシドジスムターゼ(Cu。 Zn−hsOD)IVの製造: Cu、Zn−hsOD (4,92mg、シグマ社製、
ヒト赤血球由来)の0.2M NaHCO,−0,0
2M NaICO3(llH9,25,2,5d)溶
液に4−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニ
ルグリオキザール70■(グアニジノ基に対して10当
量)を加え、遮光上室温にて24時間撹拌した。2N−
酢酸を用いて反応液のpifを6.89とした後、セフ
ァクリルS−200(ファルマシア社製、スウェーデン
)のカラム(2,6cmφ×941)を用いたゲル濾過
により精製し、目的とする分画を限外濾過(アミコン社
製、米国、膜YM−30)により、脱塩・濃縮すること
によって、目的物を含む水溶11.8d(蛋白含量1,
34■/−)を得た。酸分解物(6N塩酸−フェノール
、110°C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸
分析値 Asx 33.1 (36); GIX 24.9
(26);Ser 18.6 (20);
Gly 48.7 (50);旧s 16.8 (1
6); Arg 5.5 (8);Thr 14
.5 (16); Ala’″20.0 (20
);Pro 11.4 (10); Val
25.1 (28);+1e 13.2 (18
); Leu 1B、5 (18);Phe 7
.3 (8); Lys 15.0 (22
)本基準アミノ酸、()内は理論値 本操作により、アルギニン残基が修飾されたポリエチレ
ングリコール修飾SODが得られた。目的物の高速液体
クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSK G3000SIn 7.5閤φ×6
00■(東洋ソーダ社製) 溶出液:0.2M食塩水 (5%エタノール含を) 流速:0.6d/分 検出波長:220rv 保持時間19.58分 手続(甫正書(自発) 平成1年7月31日 1、事件の表示 平成1年特許願第112716号 2、発明の名称 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびそ
の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名(名称) 住友製薬株式会社 4、代理人■541 住所 大阪市中央区平野町三丁目3番9号(場末ビル) Tn、 (06) 227−1156 5、補正の対象 明細書の[発明の詳細な説明Jの欄 6、補正の内容 (1)明細書第66頁第5行の次行に以下の記載を加入
する。 「犬施置土J ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド(hCGRP)の製造; h CGRP (0,5mg) の0.2 M
N a HCO30,02M NazCOs
(pH8,97,100uf)溶液に、室温で20%2
−メチルマレイン酸無水物アセトン溶液(10μl)を
10分間隔で2回加えた。この間IN NaOHを用
いて、反応液のpiを9〜lOに調節した。さらにlN
NaOHでpHを9〜10とし、1時間室温にて放置し
た。 次いで実施例1で得た4〜モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール2.6■および0.
2M NaHCOz −0,02M NatCOs
(50tt l )を加え、IN NaOHでp
H9〜10に調整し、遮光上室温にて6.5時間放置放
置した。反応混合物をTSKge lG3000SW(
東ソー社製、7.5MφX60cm)を用いたゲルit
t過により精製し、目的物Aを含む分画、目的物Bを含
む分画が得られた。各々の分画を凍結乾燥後、遠心濾過
チューブ(ミリボア社製、ウルトラフリーC3LGC)
により、脱塩・濃縮することによって、目的物Aを含む
水溶液50μPおよび目的物Bを含む水溶?050μl
を得た。 目的物Aの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
c、24時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 八SX 3.8 (4) ; Ser 2.9
(3) ;Gly 4.4 (4) ; 旧s
1.0 (1) ;Arg O,8(2) : T
hr 3.4 (4) ;^1a” 4 (4)
; Pro 1.0 (1) ;Val 4.
2 (5) ; Cys −(2) ;Leu
2.0 (3) ; Phe 1.9 (2) :
Lys 1.9 (2) ; 本基準アミノ酸、()内は理論値、−は末より定は以下
の通りである。 ○高速ゲルiIt過クロマトグラフィーカラム:TSK
ge 1G3000sW(7,5mmφx60c+a)
(東ソー社製)溶出液: 0. I M食塩水(5%エ
タノール含有)流速:0.1M1分 検出波長:214nm 保持時間:19.6分 ゛ 目的物Bの酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’
c、24時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値 Asx 3.8 (4) : Ser 2.7
(3) ;Gly 4.4 (4) ; H4s
1.1 (1) ;Arg O,8(2) ;
Thr 3.4 (4) ;^1a” 4 (4
) ;Pro 1.0 (1) ;Val 4.2
(5) : Cys −(2) ;Leu 3
.0 (3) ; Phe 1.9 (2) ;L
ys 1.9 (2) ; ネ基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物B
の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りであ
る。 ○高速ゲルisクロマトグラフィー カラム:TSKge lG3000SW(7,5m+s
φX60cm)(東ソー社!り溶出液: 0. I M
食塩水(5%エタノール含有)流速:0.1d/分 検出波長:214nm 保持時間=21.4分 叉1華]J ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾エラスターゼ
の製造。 エラスターゼ(0,5mg)の0.2 M N a
)I COsO,02M N a zc Os (
pH8,97,150μf)i8液に、室温で10%2
−メチルマレイン酸無水物アセトン?H!(10μl)
を5分間隔で5回加えた。この間IN NaOHを用
いて、反応液のpHを9〜10に調節した。さらにIN
NaOHでpi(を9〜lOとし、2.5時間室温
にて放置した。 次いで実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレング
リコール−フェニルグリオキザール(2,3111g)
を加え、IN NaOHでpH9〜10に調整し、遮
光下室温にて18時間放置した後、酢酸を加えpH3と
し、40°Cで4時間放置した。反応混合物をTSKg
e 1G3000sW (東ソー社製、7、5 mll
φx60cm)を用いたゲル濾過により精製し、目的と
する分画を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ(ミリポア社
製、ウルトラフリーC3LGC)により、脱塩・濃縮す
ることによって、目的物の水溶液50μlを得た。 酸分解物(6N塩酸−フェノール、110’C124時
間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値Asx 22
.3 (24) : Glx 17.6 (19)
;Ser 16.6 (22) ; Gly
27.6 (25) ;1(is 6.9 (6)
; Arg 8.43(12) ;Thr 1
5.8 (19) ; Ala” 17 (IT)
;Pro 6.9 (7) ; Tyr 9
.9 (11) ;Val 23.7 (27) :
Met 0.5 (2) ;Cys−(8)
; Ile 8.3 (10) :Leu 1
8.7 (1B) ; Phe 3.2
(3) ;しys 2.6 (3)
; Trp −(7) ;*基準アミノ
酸、()内は理論値、−は未測定目的物の高速液体クロ
マトグラフィーの$勅は以下の通りである。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G4000PWxL(7,8m
rsφX30c+a)2本連結十T S K guar
dcolomun P W x L(6,0amφx4
cm)(東ソー社製)、i 出111(j] −0,2
M NaC1流速:0.6tnl1分 検出波長:2+4nm 保持時間:24.9分 太換炭I上 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ヒト心房性ナ
トリウム利尿ペプチド(hANP)の製造; hANP (216μg)の0.2 M N a t
−I COsN a t C03(pH8,97、10
0μ j2)?容ン(((に、室〆昌で10%2−メチ
ルマレイン酸無水物含有アセトン?8t7.(9μりを
5分間隔で2回加えた。 この間I N N a Oi+を用いて、反応液のp
Hを8〜9に調節した。1時間30分後、実施例1で得
た4−モノメトキシポリエチレングリコール−フェニル
グリオキザール(0,87■)を含む0.2MNa H
COx−NaxCOl(pH8,97)水溶tL(50
μf)を加え、IN NaOHでpH8〜9とした後
、遮光下室温にて2時間30分放置した。IN酢酸水に
てpHを2〜3とし、37°Cにて遮光下8時間30分
放置した。反応液をTSKgelG3000SW(東ソ
ー社製、7.5 +++mφ×60c+a)を用いたゲ
ル濾過により精製し、目的物を含む分画を限外lIl過
により、脱塩・濃縮することにより、目的物を含む水溶
液(60μりを得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、+10°C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値ASX
1.7 (2) ; Glx O,9(])
:Set 3.7 (5) ; Gly 4.9
(5) ;Arg 2.4 (5) ; Ala
1.1 (1) ;Tyr O,9(1)
; Met O,4(1) ;11e 1
.0 (1) ; Leu” 2.0 (2
) ;Phe 2.1 (2) ; Cy
s −(2) ;*基準アミノ酸、()内は理
論値、−は未測定目的物の高速液体クロマトグラフィー
の挙動は以下の通りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge lG3000SW(7,5mφX
60cm+)(東ソー社製)溶出液: 0. I M食
塩水(5%エタノール含有)流速:0.5ml/分 検出波長:220um 保持時間726.42分 尖施開11 ポリエチレングリコール誘導体(])修飾性腺刺激ホル
モン放出ホルモン(L HRH)の製造:L HRH2
24a gを含む0.2 M N a HCOy−N
a、COs (pH9)200μffiの溶液に、室
温にて、実施例1で得た4−モノメトキシポリエチレン
グリコール−フェニルグリオキザール1.9■を加え、
遮光下室温にて24時間放置した。lN酢酸水にてpH
を約7とした後、逆相高速液体クロマトグラフィーCY
MC−ODS、4.6師φ×2501側 : ン古用液
A液=0,1 %TFA水とB7夜−アセトニトリル
(0,1%TFA)を用いたグラジェント(初1III
B?a、a度30%、勾配置%/分);流速、Itnl
1分〕により精製を行い、目的物を含む分画を凍結乾燥
した後、水60μpを加え、目的物を含む水溶液として
得た。 目的物の酸分解物<6N塩酸−フェノール、llo’c
、24時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値GIX
1.0 (1) ; Ser 1.0 (1)
:Gly 2.3 (2) ; 1lis 1
.0 (1) ;Arg 0.2 (1) ; P
ro 】、1 (1) :Tyr O,8(1
) ; Leu’ I (1ン
;↑rp −(1) ; *基準アミノ酸、()内は理論値、−は未atlI定目
的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通り
である。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム: TSKge lG300QSW(7゜5Mφ
X60cm)(東ソー社製)溶出M : 0.1 M食
塩水(5%エタノール含有)流速:0.5rd1分 検出波長:220um 保持時間;34.46分 ○逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS、AM−303,5,y4、6
waφx250mm(山村化学社製)ビ古用l&、:
グラジェント A液:水(0,1%トリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル (0,1%トリフルオロ酢酸) 初DB液4度;35% 1度勾配:1%/分 流速:ld/分 検出波長:220um 保持時間:12.71分 尖旌斑主主 ポリエチレングリコール誘導体(+)修飾α−メラノト
ロピンの製造コ α−メラノトロピン228ugを含む0.2 MNaH
CO* −NatCOs (pi−19)100μn
の溶液に、室温にて、実施例1で得た4−モノメトキシ
ポリエチレングリコールーフェニルグリオキザー/1,
685μgを含む0.2 M N a HCO3N
a zc Ox (pH9)水7容?& I OOu
lを加え、遮光下室温にて24時間放置した。lN酢
酸水に7pNを約7とした後、TSKge IC;30
(IO5W(東ソー社製、7.5閾φX60cm)を用
いたゲル濾過により精製し、目的物を含む分画を脱塩し
、凍結乾燥した後、水60μlを加え、目的物を含む水
溶液として得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、l I O
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値G
lx O,9(1) ; Ser 2.0 (2
) ;Gly 1.1 (1) ; His 1
.0 (1) ;Arg O,4(1) : Pr
o 1.1 (1) :Tyr 1.0 (1)
; Val 1.1 (1) ;Met O,9
(1) ; Phe” 1 (1) :Lys
O,9(1) ; Trp −(1)
:本基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物
の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りであ
る。 ○高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G3000sW(7,5mrs
φX60cm)(東ソー社製)溶出液: 0.1 M食
塩水(5%エタノール含有)流速:0.5d/分 検出波長:220nm 保持時間:34.42分 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS、AM−303゜5μ4、6
mφ×250順(山村化学社製)f古用液;グラジェン
ト へ液:水(011%トリフルオロ酢酸)B液;アセトニ
トリル (0,1%トリフルオロ酢酸) 初期B液濃度=35% 濃度勾配;1%/分 流速:1−7分 検出波長:220nm 保持時間12.71分 叉施炭斐土 ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾パラチロイド
ホルモン(1−34) (PTH(1−34))の製
造: PTH(134)224μgを含む0.2MNaHCO
,−Na、COs (pH8,97)100μlのン
容液に、室温にてl゛0%2−メチルマレイン酸無水物
含有アセトン溶液(9μりを5分間隔で2回加えた。こ
の間IN NaOHを用いて、反応液のpHを8〜9
に調節した。1時間後、実施例1で得た4−モノメトキ
シポリエチレングリコール−フェニルグリオキザール2
72μgを含む0.2M NaHCO:+ Naz
COt (pH8,97)水溶液50ulを加え、1
NNaOHでpl+を8〜9とした後、遮光下室温にて
2時間放置後、さらに修飾試剤27QtIgを含む0.
2M NaHCOx N a tCOx (Pi
18.97 )水溶液25μ!を加え、遮光下室温にて
2時間30分放置した。 IN酢酸水にてpHを2〜3とし、37゛Cにて遮光下
8時間放置した。反応液をTSKge lG3000S
W(東ソー社製、7.5In111φX60cm)を用
いたゲルd#過によりt#復し、目的物を含む分画をさ
らに逆相高速液体クロマトグラフィーCYMC−ODS
、4.6 順φ X250 tm : i古用液
A液−0,1%TFA水とF3M−アセトニトリル(0
,1%TFA)を用いたグラジェント(初y、ute度
20%、勾配置%/分);流速1−/分〕により精製を
行った。目的物を含む分画を凍結乾燥した後、水50μ
βを加え、目的物を含む水溶液として得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、I 10
’C124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値^
sx 3.8 (4> ; Gl
x 4.5 (5) ;Ser 2.
7 (3) ; Gly 1.1 (1) ;Ha
s 2.9 (3) : Arg 1.3 (2
) ;Val 2.8 (3) : Met O
,8(2) ;lie 1.0 (1) ; Le
u” 5 (5) ;Phe 1.0 (1)
; Lys 2.6 (3) :Trp −(
1); 本基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物の
高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである
。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G3000sW(7,5tmφ
X60c+s)(東ソー社製)溶出i : 0.1 M
食塩水(5%エタノール含有)流速:0.5d/分 検出波長:220nm 保持時間:34.03分 O逆相高速液体クロマトグラフィー カラム:YMC−ODS、AM−303,5μ4.6閣
φ×250市(山村化学社製)ン容出液:グラジエント A液:水(0,1%トリフルオロ酢酸)Bl&ニアセト
ニトリル (0,1%トリフルオロ酢酸) 初期B液濃度;35% 濃度勾配:1%/分 流速:IIdl/分 検出波長:220μm 保持時間:11.82分J 手続事甫正書(自発) 1、事件の表示 平成1年特許願第112716号 2、発明の名称 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ベプ氏名(名称)
住友製薬株式会社 4、代理人■541 住所 大阪市中央区平野町三丁目3番9号(湯水ビル) k (06) 227−1156 明細書の「発明の詳細な説明]の欄 6、補正の内容 (+1 明細書の「発明の詳細な説明」の欄(平成1
年7月31日付提出の手続補正書(自発)第17頁第3
行)の次行に以下の記載を加入する。 「月11[j ポリエチレングリコール誘導体(])修飾インシュリン
様成長因子−II (IGI”−11)の製造:IGF
−11(200μg)の0.2M NaHCOzN
a 2COx (1)118.97.100μり溶液
に、室温にて10%2−メチルマレイン酸無水物含有ア
セトン溶液(9μl)を5分間隔で2回加えた。 この間IN NaOHを用いて、反応液のpl+を8
〜9に調節した。35分後、実施例1で得た4−モノメ
トキシポリエチレングリコール−フェニルグリオキザー
ル(0,5mg)を含む0.2 M N a HCO*
−NatCOx (pt18.97)水溶液(50μ
l)を加え、lNNaOHでpHを8〜9とした後、遮
光上室温にて2時間45分放置した。IN酢酸水にて9
11を2〜3とし、37゛Cにて遮光下9時間放置した
8反応液をTSKg、e 1G3000sW(東ソー社
製、7.5 !IIφX60cm)を用いたゲル濾過べ
より精製し、目的物を含む分画を限外濾過にまり脱塩・
濃縮することにより、目的物を含む水?8液(50μ!
、蛋白含量15.4Mg150μ2)を得た。 目的物の酸分解物(6N塩酸−フェノール、110°C
124時間処理後の分解物)中のアミノ酸分析値^sx
3.0 (3) ; Glx 6.1 (7)
;Ser 6.7 (7) ; Gly 5.
8 (5) ;Arg 5.4 (8) ; Th
r 3.0 (4) ;Ala” 5.0 (5)
; Pro 2.4 (3) ;Tyr 2.4
(3) ; νat 3.2 (4) ;11e
O,8(1) : Leu 4.7 (6)
;Phe 3.3 (4) ; Lys 1.0
(1) :Cys −(6) F *基準アミノ酸、()内は理論値、−は未測定目的物の
高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通りである
。 ○高速ゲルiIt過クロマトグラフィーカラム:TSK
ge IG3000SW(7,5rrmφX60cmN
東ソー社製)溶出液: 0. I M食塩水(5%エタ
ノール含有)流速:0.5d/分 検出波長・220nm 保持時間: 26.67分 実」l殊2」□ ポリエチレングリコール誘導体(1)修飾ウリカーゼの
製造: ウリカーゼ(0,5mg)の0.2 M N a H
C030、02M N a zCOh (pHB、
97.100μm)溶液に、室温で20%2−メチルマ
レイン酸無水物アセトン)容′e、(10μP)を5分
間隔で3回加えた。この間IN NaOHを用いて、
反応液のρ11を9〜lOにjJi1節した。さらにI
N Na○11でpHを9〜10とし6時間室温にて
放置した。次いで、実施例1で得た4−モノメトキシポ
リエチレングリコール−フェニルグリオキザール15■
および0.2M NaHCO,−0,02M Na
、CO。 (50μl)を加え、lNNaOHでpHを9〜10に
調整し、遮光上室温にて24時間放置した後、酢酸を加
え、pH3とし、40’Cで3時間放置した。 反応混合物をTSKge Ic;4000PWxL (
7,8■φX30cm) 2不連結+T S Kgua
rdcolumnPWxLゲル濾過により精製し、目的
とする分画を凍結乾燥後、遠心濾過チューブ(ミリボア
社製、ウルトラフリーC3LGC)により、脱塩・濃縮
することによって、目的物の水溶液50μpを得た。 目的物の高速液体クロマトグラフィーの挙動は以下の通
りである。 O高速ゲル濾過クロマトグラフィー カラム:TSKge 1G4000PWxL(7,8m
φX30c+e)2不連結+T S Kguardco
lomun P W x L(6,0amφx4cm)
(東ソー社製)I古用液 :0.2M NaCl 流速:0.6d/分 検出波長:254nm 保持時間:24.6分」
Claims (4)
- (1)式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中、Rは低級アルキル基を表し、nはポリエチレン
グリコール部分の平均分子量が約1,000〜12,0
00となる任意の正の整数であることを表す。)で表さ
れるポリエチレングリコール誘導体。 - (2)ペプチド中のグアニジノ基が請求項(1)記載の
ポリエチレングリコール誘導体によって修飾されている
修飾ペプチド。 - (3)請求項(1)記載のポリエチレングリコール誘導
体とグアニジノ基を有するペプチドとを反応させること
を特徴とする修飾ペプチドの製造方法。 - (4)グアニジノ基を有するペプチドのアミノ基を保護
した後、請求項(1)記載のポリエチレングリコール誘
導体を反応させ、続いてアミノ基の保護基を脱保護する
ことを特徴とする修飾ペプチドの製造方法。
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