JPH04501260A - 分画化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分画化方法 本発明は、ポリエチレングリコール−蛋白質付加体を分画化するための方法に関 する。

ポリエチレングリコールは、エチレンオキサイド単位、ＨＯ（ＣＨ。

ＣＨ２０）　ｎ　ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ（式中、ｎは変化でき、２００〜２０．　０ ００の分子量を有する化合物を与え得る）から成る長鎖の線状合成ポリマーであ る。これは無毒であり、そしてヒトに対して経口的にそして静脈内注射的に投与 されてきている（ひどい複合免疫不全症のためのＰＥＧ−アデノシンデアミナー ゼ：急性リンパ芽球白血病のためのＰＥＧ−アスパラギン；酸素前のためのＰＥ Ｇ−スーパーオキシドジスムターゼ（３−７））。ＰＥＧは、このＰＥＧのＯＨ 基に関する適切な誘導化に続いて、蛋白質に対して連成させることができる。リ ジンの側鎖のＮＨ２基は、特に利用し易い部位であり、そしていくつかか、或は 多くの部位が修飾され得る。それらの製造に対する適切な技術が得られれば、Ｐ ＥＧで修飾された蛋白質は、数多くの治療学的および他の用途を有することにな る。潜在的な臨床的使用のための多くの蛋白質は、連続注入による投与に必要な 半減期が極めて短い（高価であり、不快でありそして潜在的な危険度の多い操作 ）。ＰＥＧの修飾は、血漿の半減期を伸ばし、そして酵素の生物利用性を増大さ せるために用いられてきた（以下を参照）。蛋白質の抗原性の減少もまた、ＰＥ Ｇの修飾によって生じ、そしてこれは臨床的使用を広げ、そしてより長引いた投 与を可能にしている。

更に、多面的な生物学的効果を有する蛋白質を用いると、ＰＥＧの修飾は、個別 の生物学的特性の差別的損失のため、新規な活性スペクトルを有する生成物を作 り出す。抗体を用いると、例えば、ＰＥＧ修飾は、抗体結合および補体結合活性 を解離する。ＰＥＧ修飾はまた、それらの有用性を上昇させ得る方法で蛋白質の 生化学的および物理学的特性を変化させる（例えば、増大した溶解性：蛋白質分 解的劣化に対する増大した耐性；変化した反応速度、ｐＨおよび／または温度最 適条件、および酵素に関する変化した基質特異性）。蛋白質に関するこの共有結 合修飾は次のような数多くの重要性を有している：（ｉ）向上した血漿の半減期 ；これは数多くの蛋白質を用いて見いだされ（表１および出典８〜１７参照）、 そして既に臨床的に利用されてきた。アデノシンデアミナーゼ欠乏症の２人の子 供が、ＰＥＧ修飾されたウシのアデノシンデアミナーゼを用いて成功裏に治療さ れた（１８）。

急性リンパ芽球性白血病において、ＰＥＧ−アスパラギナーゼを用いて、２０人 の患者の７４％に完全なもしくは部分的緩解傾向が達成された（５）。Ｍｅｔｈ Ａマウスの肉腫モデル中、ＰＥＧ−インターロイキン２を用いて、向上した半減 期および増強された抗腫瘍力もまた観察された（１９）。半減期に関するこの向 上に対する基礎は分かっていないが、ＰＥＧ修飾で大きさが増大するため、小さ いペプチドの糸球体濾過の減少のような因子を含んでいる可能性がある（１９） 。生物学的潜在能力の増大（これには、向上した半減期に加えて他の現象も関係 し得る）は、癌の治療における薬理学的薬剤であるＰＥＧ−シトキン付加体の使 用において潜在的に非常に重要である。

表Ｉ 循環半減期に対する、蛋白質へのＰＥＧの連結に関する公知の効果。

蛋白質　動物　半減期　（時間）　出典未変性蛋白質　ＰＥＧ−蛋白質 アスパラギナーゼ　ヒト　２０　３５７　８゜グルタミナーゼ−アスパラギナー ゼ　ヒト　＜０．５　７２　９゜ウリカーゼ　ヒト　＜３　８　１０゜ グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ　マウス　２　２４　−１１゜アスパラギナ ーゼ　マウス　＜６　９６　１２゜アルギナーゼ　マウス　＜１　１２　１３゜ スーパーオキシドジスムターゼ　マウス　０．０６　１６．５　１４゜ラクトフ ェリン　マウス　０．０５　１　１４゜ストレプトキナーゼ　マウス　０．０７ 　０．３３　１５゜血漿−ストレプトキナーゼ　マウス　０．０５　０．２２　 １５゜複合体 アデノシンデアミナーゼ　マウス　０．５　２８　１６゜アスパラギナーゼ　ラ ット　２．９　５６　１？。

ｉｔ）変化した生化学的および物理学的特性二枚水性ＰＥＧ鎖の添加（生理学的 ｐＨては制限された溶解性を有するインターロイキン２のような蛋白質にとって 有益である（１９））のため増大した溶解性（２０）、蛋白質分解劣化に対する 向上した耐性（２１）、反応速度またはｐＨおよび温度最適条件の変化、或は酵 素の基質特異性（１０，２０，２２，２３）が含まれる。この目的は、機能、例 えば補体固定活性および抗原−結合に対する差別的効果が、各々、ＩｇＧのＰＥ Ｇ修飾の後失われそして保持されることの観察に関係している。ＰＥＧ−リボヌ クレアーゼは、高分子量の基質に関しては変化した活性を有するが、しかし低分 子量の基質に関しては有していない（２５）。これらの効果は、修飾された蛋白 質上の部位の数およびＰＥＧポリマーの長さを変化させることによっである程度 調節され得る。

（ｉ　ｉ　ｉ）減少した抗原性：これには、未修飾蛋白質に対する抗体への反応 に関する減少した能力、およびＰＥＧ蛋白質それら自身の低い免疫不全が含まれ る（２６）。

蛋白質へのＰＥＧの達成は、通常、蛋白質中の核性の基（主にリジンピーアミノ 基）で充分に置換され得る適切な薬剤を用いてＰＥＧのヒルは、ＰＥＧの活性化 のための薬剤として最も広（用いられている薬剤であり、そしてこれには、修飾 すべき蛋白質を用いた次の達成段階のために非常に塩基性のｐＨが必要とされる （２８．２７）。このような不利な条件を避ける目的で（成長因子のような不安 定な蛋白質で処理するとき特に重要である）、代替方法が探求されてきた。しか しながら、１゜１′−カルボニルジイミダゾールは達成段階に非常に長時間要し く１４）、そしてフェニルクロロ蟻酸エステル類を用いても塩基性のｐＨが必要 であることは避けられない（２５）。

このような多くの情報が長年に渡って利用されてきたが、ＰＥＧ−蛋白質は商業 的には広く利用されていない。

トレシルクロライド（２，２，２−トリフルオロエタン−スルホニルクロライド ）が、アガロース、およびヒドロキシル基を有する他の固体状の支持体を活性化 するために有益であることが見いだされ、従って、それらは蛋白質に対して連成 され得る。この方法の魅力は、蛋白質に対する達成が迅速にそして非常に穏やか な条件下で生じることである（２８．２９）。我々は、この方法を成功裏に、モ ノメトキシＰＥＧ　（ＭＰＥＧ）（これは誘導可能な単一の遊離ＯＨ基を有して いる）の活性化に適用した。我々は、次に、穏やかな条件（ｐＨが７．５のホス フェート緩衝液、室温）下、抗体（３０）およびアルブミン（実施例１参照）の 両方に対してＭＰＥＧを連成させることを実証した。従来技術に対する優位性は 、この反応混合物が無害であり、そしてＰＥＧ−蛋白質を使用する前に除去する 必要がないことである。我々はまた、達成段階後の過剰なトレシル−ＰＥＧを中 和する技術を開発しく他の蛋白質および／または細胞との反応を抑制する）、従 って、それを除去するための面倒なりロマトグラフィーまたは限外濾過法の必要 性を避けた。これらの改良は、この方法を不安定な成長因子蛋白質（これらは、 周知のごとく、限界濾過法のような操作に対して敏感である）に適用するときに 重要である。

達成段階に対する許容される（変性させない）条件が得られると、ＰＥＧ−蛋白 質の生物学的特性に影響を与える２つの主要な変法があり、そしてこれらはこの 製造工程中制御され得る。１つは、蛋白質１分子当たりに付着しているＰＥ０分 子の長さであり、そして２番目は、１個の蛋白質当たりのＰＥ０分子の数である 。

蛋白質が数個のリジン基を有している場合、蛋白質に対する活性化ＭＰＥＧのモ ル比を変化させると、置換の度合に対して著しく影響を与える（実施例２参照） 。必要なのは、所望される生物学的特性に対する最良の成果を与える置換度を決 定する手段であり、従って、このような置換度を達成するための最良の製造計画 を考案することである。生化学的な監視方法は、取り扱いに＜＜（２Ｌそして修 飾された蛋白質分子の割合に関する置換の可変性の見積もりを与えない。それら はまた、異なる度合の置換を有する材料の回収を可能にしない（後者は、モル比 を変えることによる制御が困難である、何故ならば、高モル比での充分な置換に 近づくまで、いかなる与えられたモル比でも置換度の幅広い分布が観察されるか らである（実施例２参照））。どのような置換度が最適な効果を生じるかを決定 するための分析上の研究、および製造方法の両方共、異なる（好適には精密に限 定された）度合の置換を有するペプチド／蛋白質を分画するための手段が必要と されている。この問題は、幅広いものであると考えられる、何故ならば、臨床的 に最も有益な蛋白質は数個のりジン残基を有しているからである（表ＩＩ）。

表■ インターロイキン１．　１９　２７１ インターロイキン２　１０　１５３ インターロイキン３　９　１６６ （マスト細胞成長因子；１１３と同様）インターフェロン： ガンマ　２０　１４６ 繊維芽細胞（ベータ）１１　１６６ 白血球（ベータ）　８　１６６ Ｇ−Ｃ３Ｆ　４　１７８ ＧＭ−Ｃ３Ｆ　６　１４４ に実際上の詳細においてはしばしば、ＰＥＧで置換されているそれらの度合に関 するＰＥＧ−蛋白質の不均質さに対してはほとんど注意が払われていなかった（ ２３）。

ＰＥＧ含有水系の二相系中のＰＥＧ蛋白質付加体の分配挙動は、今まで明らかに されておらず、そしてまた、ＰＥＧ置換の度合と分配係数との間の関係も明らか にされていなかった。このような系における分配挙動の調査研究において、我々 は、驚くべきことに、ＰＥＧ含有水系二相系が、特徴的に、ＰＥＧ−蛋白質を選 択的に分離するように作り変えられ、従って、生化学的特性に対する修飾の度合 の効果を監視するために用いることができ、そして大規模スケールでは、特定の 度合の置換を有するＰＥＧ蛋白質を製造するために用いることができることを見 い出した。

従って、本発明は、ＰＥＧ含有水系の二相系中、ＰＥＧ蛋白質付加体。

を分配させることを含む、ＰＥＧ−蛋白質付加体の混合物を分画化するための方 法を提供する。好適には、この工程は更に、該二相系の１つの相から予め決めら れた度合のＰＥＧ置換を有するＰＥＧ−蛋白質付加体を回収する段階を含む。い かなるＰＥＧ蛋白質付加混合物も本発明に従って分画化され得るが、モノメトキ シＰＥＧの付加体、好適には蛋白質とトレシルモノメトキシＰＥＧ　（ＴＭＰＥ Ｇ）との反応で生じる付加体の使用が好適である。本発明の詳細な面においては 、リジンまたはアルブミンの添加によって、未反応のＴＭＰＥＧが壊されるか、 或は付加体生成反応が抑制される。分配は、バッチ式もしくは連続式で行われ、 例えば２つの相の向流の流れによって行われ、そして追加的分画化を得るため繰 り返してもよい。

蛋白質に対するＰＥＧの修飾度合の分析（モルＷ＞我々は、ＰＥＧとデキストラ ンとの水系の二相系中の相分配を用いて、ＰＥＧ−蛋白質の分配係数の対数とＰ ＥＧに対して連成されたアミノ酸の数との間に直線関係が存在していることを確 立した。この関係は、我々の知る限りでは、以前には確立されておらず、そして 対数の直線関係は予測されていたが、理論的に予測された挙動からの有意な逸脱 が存在している。回帰に関するパラメーターは、この２つの成分の分配の挙動を 基として予測されたものではない。従って、この発見は従来の研究には実質的に は含まれていない。本方法の基礎は、蛋白質に対してＰＥＧを連成させると、お のずと、ＰＥＧの豊富な上相に対する親和力が増大し、従って、分配係数（上相 中の濃度／底部相中の濃度）が上昇することにある。この関係の指数的性質は、 分配を、修飾を監視するための非常に敏感な方法にする。本発明は以下の実施例 １中で詳細に説明する。

該回帰に関する方程式はまた、蛋白質調製に関する置換の不均質性を分析するた め、そして個々の画分中に存在する置換の度合を明らかにするためにも用いられ る。

個々の反応条件下で生じた修飾の不均質性に関する分析のための方法論（即ち、 蛋白質１分子当たりのＰＥＧ分子数の範囲）ＰＥＧ修飾物に対して一連の移行を 行うための向流分布に関連した相分配の使用 驚（べきことに、この関係は、ＰＥＧ修飾された蛋白質全てに対して適用できる ものではない。ある場合には、分配係数の対数と修飾との間−に複雑な関係が存 在している。このような発見は従来の研究には実質的に含まれていない。この観 察は、凝集、変性および表面特性の付随する変化、等電点の変化を含む多くの因 子が基となっている。理論によって範囲を限定されるのを望むものではないが、 この結果は（実施例３参照）、ＰＥＧで修飾された蛋白質を分画するための相分 配の使用が、必須条件として、分析的相分配のために必要であることを強調して いる。

蛋白質は、均質的にまたは不均質的に修飾された蛋白質類を識別する。

均質的に修飾された蛋白質は、同一の分配係数を有しているが、我ケは、て分配 係数における増分が存在していることを示した。方法１の分析を基とした方程式 を用いて、個々の画分中の置換度が計算でき、そして与えられたモル比で製造さ れたサンプルの不均質性が明らかにされ得る。

本方法は、我々が知る限り、以前には、ＰＥＧ−蛋白質付加体の置換に関する不 均質性を示すために適用されていなかった。この方法の詳細を以下の実施例２に 示す。

異なる度合に修飾された蛋白質および／またはペプチド類の分離達成段階中の与 えられた（飽和以下の）モル比で得られる置換度合に関して普及している考えを あてはめると、蛋白質の最適機能が達成されるＰＥＧ−蛋白質比を決定するため には、置換と蛋白質の生物学的特性（望まれるのと望まれないとの両方）との間 の関係を試験する必要がある。これは、ＰＥＧの長さ、並びに置換の度合を変化 させた母体として行う必要がある。

本方法は、ＰＥＧで異なる度合に置換されたＰＥＧ−蛋白質を分画するため、向 流分布に関連した製造的スケールの相分配を用いている。　−次に、最適な蛋白 質の特性にどの分配係数が関係しているかが確立されたならば、製造的相分配（ 向流分布の使用の有無に拘らず）を、所望される度合の置換を有する蛋白質を分 画するために用いてことができる。

このことは、置換度が最適な生物学的特性を得るのに重要である場合、モしてＰ ＥＧ連成に関する反応条件を変化させることによって、充分に精密な度合の置換 ができない場合、製造工程において必要である。

遺伝工学で製造された蛋白質は数多（の潜在的な臨床的役割を有しており、従つ て、我々はここに広範な実施例を与えることはできない。ＰＥＧは、酵素、抗体 、ペプチドホルモン、成長因子およびシトキン類を含む多（の種類の蛋白質を修 飾するために使用されてきた。組換えＤＮＡ技術を用いた臨床的使用のための蛋 白質の増大し続ける製造によって、臨床的および他の用途のための上記蛋白質の 利用度が大きく増大している。造血成長因子は、例えば、化学的および放射線療 法によって誘発された血球減少症を軽減するのに顕著な効果を有している（３１ −３３）。

分化因子およびシトキン類もまた、直接抗腫瘍効果を通して、並びに宿主応答を 調節することによる両方で、異常増殖の治療において将来の見込みを示している （４．５中で再考）。バイオ活性を示すペプチド類もまた臨床的な試みを受け、 そしてペプチドホルモン類（例えば、インシュリン）の使用が良好に確立されて いる。

しかしながら、これらの蛋白質の使用には制限があり、これは適切なＰＥＧ−蛋 白質付加体の製造によって解決できる。最初は、それらは迅速に清澄化され、従 ってしばしば、連続した注入が必要とされる。それ−らはまた、製造コストが高 （、従って、供給が制限されており、特に開発の初期段階にある。該蛋白質の抗 原性および物理的または生化学的特性もまた望ましいものではない（上述したよ うに）。更に、いくつかの因子が多面的な作用を有しており、これらは、もし修 飾できれば、新規な可能性のある臨床的使用を有する蛋白質を単独で生じさせる 。例えば、いくつかの因子は有力な分化誘発剤であるがまた、成長刺激効果を有 しており、このことが、変性を受けていない状態のそれらに関して、悪性の分化 治療における用途としては不適切なものにしている。これらの特性の１つのみを 維持しているＰＥＧ−蛋白質付加体の製造は、異なる範囲の臨床的使用を有する 新規な因子を生じさせる。

記述した方法は、置換の最良の割合が選択できるようにＰＥＧ−蛋白質比と生物 学的特性との間の関係を分析することを可能にする。この分析的方法はまた、所 望の置換度を有するＰＥＧ−蛋白質付加体（即ち、所望の生物学的特性を有する ）を製造および／または分画するための製造計画を設計するための必須な情報も 与える。

ｉｉ）研究手段として 本方法はまた、可能な研究用途を有する。ＰＥＧによる置換度を変化させて、蛋 白質の生物学的特性に影響を与える様式を分析することによって、特定の特性を 促進（または抑制）する置換の範囲が測定できる。置換度を変化させた一連の画 分を製造するための予備的方法を用いて、種々の置換度で修飾されたアミノ酸の 位置を生化学的に（例えば、ペプチド地図を用いて）確立することができる。こ れは、受容部位を即座に最大から最小に修飾すると共に達成段階中のモル比を増 大させると、変化する。これによって、蛋白質上のどの位置が個々の生物学的特 性に関係−しているかの測定が可能になる。

本発明を以下の実施例で説明する。

使用した全ての試薬はＡＮＡＬＡＲグレードであった。特定の製品に関しては、 原産地が示しである。

トレシル化モノメトキシポリエチレングリコール（ＴＭＰＥＧ）の製造トレシル クロライドの加水分解を避けるため、全ての試薬は使用前に乾燥した。

ａ）モノメトキシポリエチレングリコールの乾燥Ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　（Ｍｒ　５０ ００、［Ｉｎ１ｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ、　ＵＳＡ）をベンゼン（沸点７９〜８０ ℃）に溶解した後、水−有機共沸混合物（沸点６５℃）を蒸留して除去した。減 圧上溶媒を除去してＭＰＥＧを回収した後、これを真空下室温に一晩放置するこ とによって最終的乾燥を行った。

ｂ）ジクロロメタンの乾燥 ジクロロメタン（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｄｒｕｇ　ＨｏｕｓｅＳＰｏｏｌｅ、　Ｕ、 に、がらのＡＮＡＬＡＲ）を、モレキュラーシーブＡ３（溶媒リットル当たり１ ００ｇ５を用いて、−室温で一晩乾燥した。

ｃ）　！−レシルクロライドを用いたＭＰＥＧの活性化トレシルクロライドを用 いたＭＰＥＧ−５０００の活性化を、２．５：１の、トレシルクロライドとＭＰ ＥＧ中の利用され得るヒドロキシル基とのモル比を用いて行った。

乾燥したＭＰＥＧ　（１８ｇ、３．５ミリモル）を、室温で、乾燥ジクロロメタ ン（４５ｍＬ）中に溶解した。この混合物を０℃に冷却し、マグネティックスタ ーラーを用いて撹拌し、そして１．１２５ｍＬ　（１４ミリモル）のピリジン（ ＢＤＨ，Ｕ、　Ｋ、　）および１ｉｎＬ（９ミリモル）のトレシルクロライド（ ＦｌｕｋａＡＧ、スイス）を０℃で滴下した。１．５時間一定した撹拌で、この 反応を室温で継続させた後、減圧下の蒸留でジクロロメタンを除去した。白色の 固体を、室温で一部真空下乾燥した。

ｄ）ＴＭＰＥＧの洗浄 ＴＭＰＥＧをメタノール−ＨＣｌ混合物（２５０：　１）に懸濁した後、−２０ ℃で８時間沈澱させた。得られる白色の固体を０℃で集めた後、この濾液のピリ ジン含有量を検査した（２５５ｎｍ）。ピリジンが検出されなくなるまで、洗浄 用混合物としてメタノール−ＨＣｌ　（１０００：１）を用いてこの操作を繰り 返した。最後に、このピリジンを含んでいないＴＭＰＥＧ　（１２〜１４ｇ、収 率６５〜７５％）を、電属で数時゛間真空下乾燥した。

この得られる白色固体の硫黄含有量は０．　５％であった。この活性化したポリ マーに関する平均分子量は５０００であることを考慮すると、ＭＰＥＧ１分子当 たり１個のトレシル基の理論含有量は０．６２％である。従って、該ＭＰＥＧ中 の約８０％のヒドロキシル基が、−トレシルエ。

ステルに変換された。

トレシル化ＭＰＥＧは、室温で３力月間に渡って保存しても安定であることが示 された。１バツチの生成物から、製造時がら異なる期間縁たＭＰＥＧサンプルを 取り出して、ＢＳＡと反応させた。この生成物ＭＰＥＧ−ＢＳＡを、水系のＰＥ Ｇ−デキストラン二相系中で分配させることによって分析した。この期間中に得 られるＭＰＥＧ−ＢＳＡサンプルの分配係数には０．　９〜１．　２　（Ｌｏｇ 　Ｋ）の範囲内であり、このＴＭＰＥＧ製造物の製造性を示唆していた。

ｅ）蛋白質に対するＴＭＰＥＧの達成 ウシの血清アルブミン（９８〜９９％、ＳｉｇＩＩａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、））を用いた。達成は、塩化ナトリウムを含有している燐酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中室温で行った（詳細は、各々の数値に対する 底部の解説を参照）。相当する達成用緩衝液中で製造した適当容積の蛋白質とＴ ＭＰＥＧ溶液とを混合した後、室温で穏やかに撹拌した。間隔を開けてサンプル を取り出し、以下に示すように分析した。

ｆ）未変性の蛋白質およびＭＰＥＧ修飾した蛋白質の分析ｉ）未変性アルブミン 中の一級アミノ基を、ＴＮＢＳ−一級アミン結合体のＵＶ吸収を測定することが ら成るトリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）方法で定量した（ ３６）。ＰＥＧがこの一方法を干渉するため、ＰＥＧ修飾したアルブミンおよび 未修飾の対照区中の一級アミノ基を、５ｔｏｃｋｓ他（３７）が記述した蛍光分 析によって測定した。

ｉｆ）未変性およびＭＰＥＧ修飾アルブミンの両方の分配係数を、４．７５％（ Ｗ／Ｗ）のＰ　Ｅ　Ｇ　−６０００（Ｌｏｔ　９１５９１１０、ＢＩＩＩ（、Ｕ Ｋ）、４．７５％（ｗ／ｗ）のＤｅｘｔｒａｎ−Ｔ５００　（Ｄｘ）　（Ｌｏｔ 　３８６２４、ＰｈａｒｍａｃｉａＳＳｗｅｄｅｎ）　、Ｏ，ＯＩＭの燐酸ナト リウム緩衝液ｐＨ６，８，０，１５Ｍの塩化ナトリウムから成る二相系が１ｇ入 っている単一管中、２５℃で測定した。この相系は、４０％のＰＥＧ、約２０％ のＤｅｘｔｒａｎ　（旋光計で標準化した）、領　４４の燐酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ５，８、および０．６Ｍの塩化ナトリウムから成るストック溶液から製造し た。アルブミン、およびＭＰＥＧに連成したアルブミンを、相に対して用いられ ている水０．１ｇを、該達成用緩衝液中のアルブミンとＰＥＧ−アルブミンとの 溶液０．１ｇで置き換えることによって、該相系中に混合した。

３０〜４０回逆さにすることによって混合した後、この相を放置して、この相の 完全な分離が達成されるまで静置した。上相および底部相からの一定分量を、蛋 白質濃度に関して分析した。該分配係数は、上相と底部相中の蛋白質の比率であ る。

１ｉｉ）蛋白質濃度を、クーフシ−ブリリアントブル一定量法によって測定した （３８）。この定量法は、低濃度の蛋白質を検出するために用いられ、ＰＥＧに 対してもそしてＤｅｘｔｒａｎに対しても、Ｌｏｗｒｙ方法で生じるようないか なる干渉をも受けさせない（３９）。

（ｉｖ）向流分布 アルブミンおよびＭＰＥＧ−修飾アルブミンに関する向流分布（Ｃ（。

Ｄ）を、４．７５％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ、４７５％（ｗ／ｗ）のＤｘおよびＯ， ＯＩＭの燐酸ナトリウムｐＨ６，８で緩衝させた０、１５Ｍの塩化ナトリウムで 生じさせた相系中で行った。この相系は、所望される量の４０％（ｗ／ｗ）のＰ 　Ｅ　Ｇ　−６０００（Ｌｏｔ　９１５９１１０、ＢＤＨｌＵＫ）、２０％（Ｗ ／Ｗ）のＤ　ｘ−Ｔ　５００　（Ｌｏｔ　Ｍｌ　０２４３４、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａＳＳｗｅｄｅｎＬｏ、６Ｍの塩化ナトリウム、０．４４Ｍの燐酸ナトリウム緩 衝液ｐＨ６，８および蒸留水を混合することによって製造した。一度、上相と底 部相を、必要とされるところまで２５℃で分離させた。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　５ｈｅｆｆｉｅｌｄ　（ＵＫ）で作られた自動薄 膜向流分布装置ＢＩＯ８ＨＥＦ　ＴＬＣＣＤ　ＭＫ２を用いた（４０）。分布ロ ーターは、以下のように充填された６０個の空洞で成り立っている：０．８２３ ｍＬの底部相および０．８２３ｍＬの上相は、空洞２〜３０および３２〜６０中 に充填されていた。空洞１および３１は０．８２３ｍＬの底部相が充填されてお り、そして二相系の上相の０．８２３ｍＬがサンプルを含有している。これは、 大容積系としての同様なストック溶液から製造されたが、この蒸留水を、適切な 蛋白質を含有している溶液で置き換え、そして実験を行う直前に作り上げた。静 置時間は７分であり振とう時間は２５秒であった。

室温での３０回の移行を完了した後、この空洞の内容物を直接プラスチック類の 管中に集めた。１つおきの空洞の内容物を、０．ＯＩＭの燐酸ナトリウムでｐＨ ５，８に緩衝させた０、１５Ｍの塩化ナトリウム０゜８ｍして希釈して、この相 系を壊した。次に、蛋白質の濃度を、Ｂｒａｄｆ。

ｒｄ定量法で測定して、分布の形を得た。２つの相を未だ含有している残りの管 を、上相および底部相中の蛋白質濃度測定による該蛋白質の分配係数の測定用と して用いた。

実施例１ ＭＰＥＧを用いたアルブミンの修飾およびこの複合体ＭＰＥＧ−ＢＳＡの分配挙 動 １分子当たり６０個のリシル残基を有する良好に差別化された蛋白質として、Ｂ ＳＡを選択した（４１）。Ｓｉｇｍａから供給されたＢＳＡ粉末は、１分子当た り６１±６　（ｎ＝１２）のアミノ基を示しており、従って、精製しないで用い た。

０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有している０、２Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ７，５中、室温で、この蛋白質をＴＭＰＥＧと一緒に培養した。ＢＳＡの最終濃 度は１．５ｒｎｇ／ｍＬであり、モしてリシル基に対するＴＭＰＥＧのモル比は １に対して１６でありた。この蛋白質の分配係数Ｋを、３０．６０．９０および １２０分の培養後測定した。図１に示されるように、Ｋは、最初の１時間ＢＳＡ とＴＭＰＥＧとの培養が進行するにつれて上昇した後、「平行」に達する。Ｋの 」二昇は、ＭＰＥＧがＢＳＡに結合したことを示しており、即ち、蛋白質の表面 がよりＰＥＧ様になり、結果として、該二相系のＰＥＧの豊富な上相に向かう。

これは、他の部分に詳しく記述した親和力による分配化の例である（４２．４３ ）。我々は、通常のＭＰＥＧと一緒に培養したＢＳＡがその分配係数を上昇させ なかったことを観察した（データは示し、てぃない）。従って、分配係数の上昇 （図１）は、蛋白質上への該ポリマーの吸着によるというよりはむしろ、該蛋白 質へのＭＰＥＧの共有結合によるものであると述べることが可能である。１時間 培養した後のＭＰＥＧ−ＢＳＡ複合体に関して得られる一定なに値（図１）は、 明らかに、達成され得るＫの最大変化を示しており、そしてこれは、おそらく、 利用され得るＰ−ＥＧ結合部位の飽和を示している。

異なる置換度を有するＰＥＧ−蛋白質付加体を作る目的で、我々は、複合体ＭＰ ＥＧ−ＢＳＡの生成におけるＢＳＡ　Ｃリシル残基）に対するＴＭＰＥＧのモル 比の影響を試験した。２時間の培養時間を用いた。図２に示されるように、リシ ル基に対するＴＭＰＨＧのモル比を２；４〜。

１６　：　１の範囲に渡って上昇させると、ＢＳＡの分配係数の連続的上昇がも たらされた。

分配係数と修飾度との間の関係 水系の二相系における分配化は、複合体ＭＰＥＧ−アルブミン（材料および方法 を参照）に関するいかなる精製も必要としない、アルブミンに対するＴＭＰＥＧ の達成を定性的にそして定量的に分析する手段を与える。これは、付加体ＭＰＥ Ｇ−蛋白質を未反応のＭＰＥＧから分離する必要がある他の方法（４４）に比べ て相当に有利である。

分配係数にと修飾度との間の量的な関係を確立するため、後者を、分配係数の対 数と、試験した範囲（０〜３０％の修飾）に渡るアミノ基の置換度との間の関係 における１級アミンに関する換算によって測定した（図３；ｒ＝０．９６、ｐ＜ ０．００１）。

Ｂｒｏｏｋｓ他（４５）は、修飾した蛋白質に関するＫ　（Ｋ、Ｌ）は遊離蛋白 質（Ｋ９）およびリガンド（ＫＬ）の両方のに１並びに付着したポリマー分子数 （ｎ）との関係を有するべきであることを予測している。彼らは、下記のように 表され得る方程式に、１．＝に、・ＫＬ”を与えた：ｌｏｇ　ＫｐＬ＝Ｉｏｇ　 Ｋ、＋ｎ　１ｏｇＫ＋。

従って、修飾した蛋白質に関する分配係数の対数と付着したリガンドの分子の数 との間の直線関係は、各々ＩｏｇＫ＋、および１ｏｇＫ、のスロー−プおよび切 片を用いて予測される。

図３から、この切片は、未修飾のアルブミンのｌｏｇ　Ｋに関する実験値の−０ ，３９±０．０９（平均値±ＳＤ、ｎ＝５）と良好に一致した−０．３６である ことが見いだされた。しかしながら、このスロープ（１ｏ　ｇ　Ｋｔ）は０．０ ８であり、相系中のＰＥＧ　（１４Ｃ−−ＰＥＧ、−４０００）の分配に関する 独立した測定によって得られる実験値（ｌｏｇＫ＝０．４±０．００２、平均値 ±ＳＤ、ｎ＝３）よりもずっと小さい。ＭＰＥＧに関する分配係数のこのような 実験値と計算値との間の相違は、修飾されたアミノ基の数の過剰な見積もりによ るものであるとは考えられない、何故ならば、これは、ここで得られる結果を生 じさせるためには過剰な見積もりが８０％である必要があるからである。

５ｈａｒｐ他（１）は、異なる度合に修飾したＭＰＥＧ−１ｇＧｓの分配係数を 測定し、そして、分配係数を基として、蛋白質に付着したＭＰＥＧ分子の数を計 算するためＢｒｏｏｋｅｓの方程式を用いた場合、Ｉ４０で標識したＭＰＥＧを 用いることで訂接これを測定したとき得られる値に対して、これは著しく下に見 積もることになることを記述している。しかしながら、これらの著者は、置換と Ｌｏｇ　Ｋとの間の関係を確立しなかった。

実施例２ 向流分布による、ＭＰＥＧ修飾アルブミンの不均質性の実証アルブミンの分配係 数とＭＰＥＧによる修飾度合との間の関係を実証した後、我々は、ＭＰＥＧ−ア ルブミンをクロマトグラフィーを分析するため、多数回分配（即ち、向流分布、 Ｃ０Ｄ）を用いた。

図４は、アルブミン、ＭＰＥＧ修飾したアルブミン類１および２に関するＣＣＤ の形を示している。これらの最後の２つは、各々２：１および１６：１のＴＭＰ ＥＧ：　１　ｙｓモル比を用いてアルブミンをＴＭＰＥＧと一緒に培養すること によって得られた。各々の画分中に存在している蛋白質に関する分配係数もまた 示した。

未修飾アルブミンは、ＣＣＤの列の左側に対して、画分７および１３の間に分布 している（図４の上）。このＣＯＤの列の左側にある分布ピークの位置は、アル ブミンの分配が二相系の底部相に対して有利であり（即ち、低い分配係数）、こ のことは、単一管の分配化における観察と一致している（図１および２）。分布 ピークに沿った全ての未修飾アルブミンの分配係数に関する一定値（図４の上） は、蛋白質製造の均質性と一致している。

ＭＰＥＧ−アルブミン１は、画分１４と２６との間のＣＣＤの形（図４の中間） が未修飾のアルブミン（画分７〜１５、図４の上部）に関するものより右側によ っていることを示している。この結果は、未修飾の。

アルブミンとの比較における、修飾したアルブミンに関する単一管の分配からの 単一管分配から得られる、より高い分配係数を反映している（図１および２）。

画分１４と２６との間の両分のいずれか中に存在しているアルブミンの分配係数 は、未修飾のアルブミンのそれ（図４の中および上）よりも高かった。更に、前 者の分配係数は、未修飾アルブミンのようには一定でな（、しかし漸次的に、分 布の形が左側から右側に増大した（図４の中）。分配係数と修飾度との間の関係 により（図３）、分配に関するこの不均質性は、修飾されたアルブミン類とＭＰ ＥＧ修飾されたアルブミン類との混合物からなっているＭＰＥＧ−アルブミンが 、修飾度を基とした向流分布によって分画され得ることを示している。

ＭＰＥＧ修飾したアルブミン！　（ＴＭＰＥＧ：　Ｌｙｓのモル比は１６：１） に関するＣＣＤの形（これは、単一管中の最も高い分配係数を示した）（図２） は、画分２３と２８との間のＣＯＤの列が右側によって存在していた（図４の下 ）。これらの画分中にあるアルブミンの分配係数（図４の下）は、画分１〜２３ 中のアルブミンに相当するｔのより高−かった（図４の上および下）。画分２４ および２６中に局在しているＭＰＥＧ修飾アルブミン類は、複合体ＭＰＥＧ−ア ルブミン１（図４の中）中に存在しているか、或はＭＰＥＧ−アルブミン、（図 ４の下）中に存在しているかに拘らず、同じ分配係数を有していることは特記す べきである。

ｌｏｇ　Ｋと図３の回帰から計算された置換度との関係（１ｏｇＫ＝０．０８４ ｘｎ＝０．３６）を定義している方程式を用いて、修飾の度合（ｎ）が個々の画 分に対して見積もられ得る（表ＩＩ）。

」 ＭＰＥＧ−アルブミン１．（図４．中間）画分　ｌｏｇ　Ｋ　修飾されたＮＨ２ の計算した番号本１４−０゜３８　０ １６　０．０２４　４．６ １８　０．３３　８．２ ２０　０．５２　１０．５ ２３　０．９０　１５．０ ２５　２．００　２８．１ ２７　２．００　２８．Ｉ ＭＰＥＧ−アルブミン、（図４．底部）２５　２、００　２８．１ ２７　２．００　２８．１ ２９　２．００　２８．１ ＊注；用いたＴＭＰＥＧ製造において鎖長に関する有意な不均質性が存在してい る場合、この見積もり値を補正する必要がある、何故ならば、−これが、ＰＥＧ −蛋白質の付加体の分配係数に影響を与えるからである（１）。

実施例３ 蛋白質顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子ｇｍ−Ｃ８Ｆを、アルブミンに 関して記述したのと同様にして、ＭＰＥＧに連成させた。ＰＥＧによる異なる置 換度を有するＰＥＧ−ｇｍ−Ｃ３Ｆ複合体を生じさせるため、ある範囲のＰＥＧ ：リジンモル比をこの達成反応ｐために用いた（１０：１〜１０００：１）。こ の蛋白質は、６個のリジンを有しており、結果として１〜６の置換度を有する種 類が理論的に可能である。

生物学的に活性な市販の標識されたｇ　ｍ　−ＣＳ　Ｆ　−Ｉ　’　”　（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）を、これらの実験に用いた。モル比を変化させた同様な実験のＦ ＰＬＣの形（以下の実施例４を参照）は、モル比を増大させると漸次的な置換が 生じることを示している。

モル比を増大させると、ｌｏｇ　Ｋは上昇し、そして降下する（図５）。

このことは、明らかに、ＢＳＡとは異なり、Ｂｒｏｏｋ方程式で予測される期待 された対数の直線的関係に従わないことを示している。同じ実験において、沸騰 することで変性させたｇｍ−Ｃ３Ｆは、減少したｌｏｇＫを有しており、このこ とは、この蛋白質の立体的変化が、ＰＥＧ相への分配を減少させるように表面特 性を変化させたことを示唆している。

この材料を用いると、より低いモル比で、より際だったＫの上昇が見られた。こ れは、おそらくは、この変性した蛋白質のより開かれた構造により、ＰＥＧ修飾 がより容易になったことを反映しているものと考えら−れる（この示唆は、変性 したｇｍ−Ｃ３Ｆを用いたとき３０５　：　１のＴＭＰＥＧ：リジンでのＰＥＧ 化が、より大きな高分子量ピークを生じるところのＦＰＬＣによって明確に示さ れる）（図６）。

これはこの方法の欠点であると考えられるが、次のことを特記すべきである： １）Ｋ値は、未修飾蛋白質に関する値以下にはならなかった（従って、ＣＣＤ分 離を可能にする可能性をまだ有している）。

２）未変性の材料を用いた場合、Ｋの低下は、蛋白質に対して非常に高いモル比 を用いるときのみ生じる（生物学的に活性を示すＰＥＧ−ｇｍ−Ｃ３Ｆを生じさ せるために用いられるような範囲ではない）。

３）性能において、代替方法、即ちＦＰＬＣおよびＰＡＧＥは、ＣＯＤよりも優 れていなかった（以下を参照）。

実施例４ 代表的な実験を図７ａおよび７ｂに示し、ここでは、ｇｍ−Ｃ３Ｆを、ある範囲 のリジンに対するＴＭＰＥＧのモル比に対して暴露した。ＦＰＬＣは、非常に小 さい割合の材料を修飾した最も低いモル比を例外として（見掛は分子量における シフトを基とした単一リジン上、ＰＥＧ−ＩＬ２を用いたＫａｔｒｅの実験（１ ９）参照）、該材料が不均質であることを示している。不均質性を示す目的でＦ ＰＬＣがここでは用いられているが、この方法にはい（つかの欠点がある（以下 を参照）。

この実施例は、均一に修飾されたＰＥＧ−蛋白質複合体を得るための問題が、ア ルブミンの如く数多くのリジンを有する大きな蛋白質に限定−されるものでない ことを示している。

実施例５ この新規な方法の必要性を強調しているＦＰＬＣおよびＰＡＧＥの欠点１）ＴＭ ＰＥＧの漸次的熟成がＦＰＬＣ上で溶解しないＰＥＧ−シトキン複合体を生じさ せることの実証 我々は、ＢＳＡ　（図８ａ）およびｇｍ−Ｃ３Ｆを含む蛋白質のＦＰＬＣの形に おいて、ゆっくりした溶出に変化させると、ＭＰＥＧが非特定の拡散効果を誘発 することを見い出した。このことは、ＴＭＰＥＧで修飾されたｇｍ−Ｃ３Ｆに関 するＦＰＬＣの形に対して行った観察と関係している。我々は、ＴＭＰＥＧのバ ッチがより古くなるにつれて、リジンに対する１”ＭＰＥＧの同モル比で得られ る修飾された種類の数値の減少によって示されるような低下した活性になるばか りでなく、低下させた溶出速度に伴うＦＰＬＣの形の分解能が漸次的に失われる ことに気が付いた（図８ｂ）。トレシル基が失われるか、或は不活性になるにつ れて、ＭＰＥＧもしくはその同等物（反応性を示さないＴＭＰＥＧ）でもつて製 造物が影響を受けるように汚染され、そしてこれは、図８ａの発見を考慮すると 、上記観察を説明し得る。

未達成のＰＥＧ　（ＭＰＥＧ）は、有意には分配に影響を与えないため（図９は Ｉ”５−ｇｍ−Ｃ３Ｆに対する効果の不足を示している）、不活性なＴＭＰＥＧ またはＭＰＥＧが、ＦＰＬＣに対して悪い影響を与えるのとは反対に、ＣＣＤの 如き分配方法には影響を与えないことを記述できる。

図１０ａおよびｂは、ＣＣＤを用いると、修飾した材料が未修飾の材料から明ら かに区別され、一方、「熟成させたＪＴＭＰＨＧ調製物を用いたときのＦＰＬＣ の場合、かなりのオーバーラツプがあり、そして修飾した材料と未修飾の材料と の間に明らかな分離が見られなかった。

この点に関して更に、ＭＰＥＧを用いたときの発見とＦＰＬＣは、ＦＰＬＣが必 要な場合、中和処理方策の選択を考慮すべきであることを示している。アルブミ ンはＰＥＧ−アルブミンを生じさせ、リジンはカルボキシル基を有するＰＥＧ誘 導体を生じさせ、ヒドロキシア、ミンは末端ヒドロキシル基を有するＰＥＧ分子 を生じさせる。各々の中和生成物の影響を、製造された特定のＰＥＧ−蛋白質を 用いて検査する必要がある。

蛋白質分子の大部分を修飾するために充分なＴＭＰＥＧ：リジンの比（例えば、 ３０５　：　１またはそれ以上の）を用いた全ての実験において、修飾したｇｍ −Ｃ５Ｆは、未修飾の材料よりも速いか遅いの両方で溶出した（図１１ａおよび ｂ）。

同様の結果が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて得られ（図１２）、こ こでは、未変性および変性した両方のｒＨｕ−ｇ柘Ｃ８Ｆ　（レーン１２．１４ 〜１６．１９．２０）に関して、該修飾は、結果として、材料を未修飾帯の前と 後の両方で流れさせた。しかしながら、この実験は、明らかに、ＰＡＧＥはＦＰ ＬＣとは異なり、ＭＰＥＧによる悪影響を受けていないことを示している。

二のことは、修飾の度合、特に、ＰＥＧで修飾したりジン残基の数は、−このど ちらかの方法からも推測するのは困難であることを明らかに示している。

３）ＦＰＬＣはＰＥＧ−蛋白質生成物の不均質性を覆い隠しうるＦＰＬＣは、以 下の実施例６で示されるように、ある程度は生成物の不均質性を示すことができ るが、ＣＣＤは、ＦＰＬＣでは外観上単純な形しか得られない材料に関してでさ え、不均質性を示す。

実施例６ ＣＣＤは、ＦＰＬＣを基にすると明らかには示されない修飾された材料でさえ不 均質性を明らかに示す 曲線に合致した演算規則によって分析された向流分布の形は、存在する種類（こ の場合、種々のＰＥＧ−ｇｍ−ＣＳＦ複合体）の数の計算を可能にする。図１３ 中のＦＰＬＣとＣＯＤの形の比較は、後者は、前者においては目立たない不均質 性を表示することができることを示している。

ＣＣＤは、大スケールで行うことができる追加的長所を有しており、ＰＥＧ−蛋 白質の産業的生産に適している。

実施例７ 異なる度合に修飾させたｇｍ−ＣＳＦが種々の生物学的活性を有していることの 実証 未修飾の材料よりもａ）速く、ｂ）−緒に、およびＣ）遅く、溶出する修飾した サンプル（ＴＭＰＥＧ：リジンが３０５　：　１で製造）のＦＰＬＣ画分からサ ンプルを取り出した。ｇｍ−Ｃ８Ｆは、数多くの異なる生物学的活性を有してお り、我々は、そのｆ−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｐｈｅ誘発された好中球酸化的突発活性 の開始にトロブルーテトラゾリウム還元によって定量）の使用を選択した。両分 を、ミクロタイタープレート中、ＦＭＬＰを有するヒトの末梢血液の好中球に暴 露した。

この両分の生物学的活性を、放射能（■１２５標識したｇｍ−Ｃ８Ｆ、＾ｍｅｒ ｓｈａｍを用いて）を用いて、蛋白質に対して正規化した。両分は、生物学的活 性がないところから、同じＦＰＬＣ分画化からの未修飾材料のピークから得られ る画分中に見られる活性の３〜６倍の、範囲であった（図１４）。

この実施例は、所望の生物学的活性を達成するためには、ＰＥＧ−蛋白質の種類 の正確な制御または分画を生じさせる必要があることを示している。

方法 １）ＦＰＬＣ 達成用緩衝液で前もって平衡にした５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムの備わってい るＦｈａｒｍａｃＪａ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃシステム上でサンプルを分析した。この サンプルの２００ｕ　１を該カラム上に置き、そして次に、達成用緩衝液を用い て、１分当たりＱ、３ｍ１ｓの流速で溶出させ、１２５ｍＬづつの画分を集めた 。

溶出用の緩衝液を変化させ、例えばいくつかの用途では、達成用緩衝液（０，１ ２５ＭのＮａＣｌを含有している０、０５Ｍの燐酸ナトリウ。

ムｐＨ７，５）を用いた。細胞が直接溶離剤に暴露される場合、燐酸塩で緩衝さ せた食塩水ｐＨ７，３および約２８５ｍ０５ｍを用いた。蛋白質は、充分に豊富 な場合、波長２８０ｍｍの吸収で検出し、或は放射能標識（１１２５）を検知す ることで検出した。

２）ＳＤＳゲル電気泳動（ＰＡＧＥ） １５％のポリアクリルアミドゲルを濃縮用ゲルと一緒に用いた。サンプルを、等 容積の装荷用緩衝液と混合した後、得られる混合物を、１分間１００℃の水浴中 に置くことで変性させた。この変性させた混合物を（ぼみ当たり４０ｕ　Ｉ装荷 し、そして１５０ボルト：最大電流で電気泳動を行った。このゲルをＷｈａｔｍ ａｎ　Ｎｏ　ｌ濾紙上で乾燥した後、希土類増感紙を用い一７０℃で、このゲル の放射線写真を撮った。このフィルムを、例えば４日間暴露した後現像した。

３）ＮＢＴ還元試験 多形核白血球（ＰＭＮ）を、Ｅｇｇｌｅｔｏｎ他の分画遠心分離法を用いて単離 した（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２１（１９８９）１０５−１ １３）　。用いた細胞濃度はハンクス液（ＨＢＳＳ）中１ｍＬ当たりＩ　Ｘ　１ ０７であった。ＦＭＬ　Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳ Ｏ，ＢＤＨ）に溶解した後、ｌＸｌ０−２％のＤＭＳＯ中１ｘｌＯ−’の最終濃 度で用いた。

この試験溶液の一定分量（３０ｕｌ）を取り、そして三重のミクロタイタープレ ート（１プレート当たり９６個のくぼみ、ＮＵＮＣ）の（ぼみ中に充填した。

５．２５％のウシ胎児血清を含有している５０ｕ１のＨＢＳＳを各々のくぼみに 加えた。このプレートを３７℃に温め、そしてＰＭＮを含有している予め温めた Ｈ　Ｂ　Ｓ　Ｓを２５ｕｌ加えた。開始させるため、二の一細胞を２時間培養し た。ＦＭＬＰを含有している予め温めたＮＢＴ溶液１００ｕｌ　にトロブルーテ トラゾリウムグレードＩ　Ｉ　Ｉ　、ＳＩＧＭＡ、　０゜１％Ｗ／Ｖ）を、各々 のくぼみに加えた（後者がＮＥＴ還元を開始させる）。氷上に１５分間装いた後 、反応を停止させた。操作は、Ｒｏｃｋ　（Ｊ。

Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２（１９８９）１６１−１６７）が記述 している方法の改良法に従って行った。このプレートを遠心分離（１０００ｒｐ ｍ、６分間）にかけた後、上澄み液を除去した。３分間空気乾燥した後、２５０ ｕｌの７０％メタノールを加えた。遠心分離しそして上澄み液を除いた後、この 細胞を、１００ｕ　１の２Ｍ　ＫＯＨを用いて溶解させた。１２時間後１２５ｕ ｌのＤＭＳＯを各々のくぼみに加えた。フィルター７　（６２０ｎｍ）およびフ ィルター３　（４５０ｎｍ）を用いて、モードＡｂｓ２にセットしたＴｉｔｅｒ ｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ読取機（ＦｌＯｗ　Ｌａｂｓ）上で比色定量を行っ た。

追加的図の解説 阻　生物学的に活性な蛋白質および変性した（沸騰した）蛋白質に対して、ＴＭ ＰＥＧ暴露した後のＰＥＧ／デキストラン系中で、１Ｉ２Ｂ櫟識した組換え型の ヒトのｇｍ−Ｃ３Ｆ　（ｒＨｕ−ｇｍＣ５Ｆ）の相分配を行った。両方の製造に 関して、ｌｏｇ　Ｋは達成比（ＴＭＰＥＧ　：リジン）に対して曲線型である。

後者は、修飾度を決定する（反応したリジン基の数）。

閃旦　ＴＭＰＥＧ：リジンの比が３０５　：　１のとき、ｒＨｕ−ｇｍＣ８Ｆの ＴＭＰＥＧ暴露に先立って沸騰させると（下方のパネル）、最高分子量で（矢印 ）ＦＰＬＣビークが増大した。これは、沸騰していない対照区（上方のパネル） に対して中間的なピーク４および５を減少させた。

界７　ｒＨｕ−ｇｍＣ３Ｆ−Ｉ”’の異なる２つのバッチのＦＰＬＣ−ａ）上方 のパネル：未修飾のｒＨｕ−ｇｍＣ３Ｆ：中間のパネル３’０５：１のＴＭＰＥ Ｇ：リジンのモル比。

下方のパネル１０００　：　１のＴＭＰＥＧ：リジンのモル比。

ｂ）上方のパネル１０：１のＴＭＰＥＧ：リジンのモル比。

下方のパネル３０５　：　１ 履旦 ａ）ＦＰＬＣに先立って、蛋白質に対してＭＰＥＧを暴露すると、形の拡散が生 じ、これは潜在的に、サンプルがＭＰＥＧまたは不活性化ＴＭＰＥＧで汚染され ている場合、ＴＭＰＥＧで修飾された蛋白質のＦＰＬＣを干渉し得る。

ｂ）漸次的に古くなったＴＭＰＨＧ　（乾燥上室温で保存）の使用は、修飾され た蛋白質のＦＰＬＣの形を有意に変化させる。

履旦 ｒＨｕ−ｇｍＣ８Ｆの分配挙動に対するＴＭＰＥＧ　（上方の）（ネル）および ＭＰＥＧ暴露（下方のパネル）の影響に関する比較。後者は有意−なＫの増分を 生じない。

履を旦 ＴＭＰＥＧ：リジンのモル比が３０５　：　１のとき、ＴＭＰＥＧの熟成した（ １９週）サンプルをｒＨｕ−ｇｍ−Ｃ８Ｆに暴露したときの、ＣＣＤ（上方のパ ネル）とＦＰＬＣ（下方のパネル）との比較。ＣＣ８のみが、成功裏に、修飾と 未修飾（矢印）との間のピークを区別していた。

履１↓ ＰＥＧ修飾したｒＨｕ−ｇｍＣ３Ｆ　（３０５：　１のＴＭＰＥＧ：リジンに暴 露した）は、未修飾の材料よりも速（そして遅くの両方で流れ、このことは、Ｆ ＰＬＣにおいては、見掛は分子量と、ＰＥＧで修飾したりジン残基の数との間に は明らかな関係がないことを示している。

履↓ｌ 未修飾と、ＴＭＰＥＧ：リジンの種々のモル比に暴露してＰＥＧ修飾したｒＨｕ −ｇｍＣ８Ｆのポリアクリルアミドゲル電気泳動。レーン：１＝未修飾；２＝変 性；　６＝１０００　：　１のＴＭＰＥＧ：リジンに暴露；４＝５００　：　１ 　；　５＝３０５　：　１　；　６＝マーカーニア＝１００：１；８＝１０　： 　１　：　９＝０　：　１．１０＝３０５　＋　１のＭＰＥＧ：リジン；１１＝ １０　：　１　：　１２＝１００　：　１で修飾した変性ｒＨｕ−ｇｍｃｓＦ　 ；　１５＝１０　：　１　；　１６＝０−１　；　１７＝１０．００　：　１で 修飾したｒＨｕ−ｇｍＣ３Ｆ　；　１８＝３０５　＋　１で修飾したｒＨｕ＝ｇ ｍｃｓＦ；　１９＝３０５　：　１テ修１１１’ｌｉシタ変性ｒＨｕ−ｇｍＣ３ Ｆ；　２０＝変性したｒＨｕ−ｇｍｃｓＦｏ：１゜ 履１旦 １０：１のＴＭＰＥＧ：リジンに暴露したｒＨｕ−ｇｍＣ８Ｆに対するＣＣＤ　 （上方のパネル）およびＦＰＬＣ（下方のパネル）。ＦＰＬＣは未修飾の材料に 関する小さいピークのみを示しているが、ＣＯＤの形はよりくっきりと不均質性 を表している。このＣＯＤの形は、コンピュータープログラム（Ｂｌｏｎｑｕｉ ｓｔ　ａｎｄ　ｆｏｌｄ、　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｗ　５ｃａｎｄ　Ｂ２８．５６： １９７４）に適合し、そして未修飾材料（矢印）の位置におけるそれに加えて３ つの曲線を表示している。

罹１１ ＮＢＴ還元で測定した後（原文を参照）、１画分当たりの１１１８（Ｃ。

ｐ、　ｍ、　）に関して表される存在する蛋白質の量に関して正規化させた一ｒ Ｈｕ−ｇｍＣ３Ｆの好中球開始活性。

未修飾（網目状の陰影をつけた）および３０５　：　１で修飾したｒ　Ｈｕ−ｇ ｍＣ３Ｆ　（平行線をつけた）に関するＦＰＬＣからの両分は、生物学的活性の 比較を可能にする。この修飾した材料は、活性のない種類および未修飾材料より も高い活性を有する種類を含んでいる。

出典 １　）　５ｈａｒｐ　Ｋ、　Ａ１、Ｙａｌｐｊｎｉ　Ｍ、、Ｈｏｗａｒｄ　Ｓ、 　Ｊ、およびＢｒｏｏｋｓ　Ｄ、Ｅ、　（１９８６）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　１５４．１１０−１１７゜２　）　５ｔｏｃｋｓ　Ｓ、　Ｊ、、Ｊｏｎｅｓ ＾、　Ｊ、　Ｍ、、Ｒａｍｅｙ　Ｃ，１１，およびＢｒｏｏｋｓ　Ｄ、Ｅ、　（ １９８６）著［ポリエチレングリコールを用いた蛋白質−級アミン類の修飾度に 関する蛍光定量法Ｊ　”　Ａ　ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉ ｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｍｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇ ｌｙｃｏ１″’　Ａｎａｌ、@Ｂ ｉｏｃｅ■、１５４．２３２−２３４゜３）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｆｎ　Ｂｉｏ ｃｏｍｍｅｒｃｅ　（１９８８）　ＬＯ（３）：要約２４７６９゜４）　Ａｂｓ ｔｒａｃｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｏｍｍｅｒｃｅ　（１９８８）　１０　（３）： 要約２４７７０゜５）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｏｍｍｅｒｃｅ　（ １９８８）　１０　（３）：要約２４７７１゜７）　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｉｎ 　Ｂｉｏｃｏｍｍｅｒｃｅ　（１９８ｇ）　１０　（３）：要約２４７７２゜ｇ ）　Ｈａ　Ｄ、Ｈ，、Ｂｒｏｗｎ　Ｎ、Ｓ、、Ｙｅｎ　Ａ、、Ｈｏｌｍｅｓ　Ｒ ，、Ｋｅａｔｉｎｇ　Ｉｌ、、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾１、Ｎｅｗａａｎ　Ｒ， ＾、およびＫｒａｋｏｆｆ　１．Ｔｌ、著（１９８６）　ｒポリエチレングリコ ール−Ｌ−アスパラギナーゼの臨床的薬理学Ｊ　”　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｐｈａ ｒｉａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ−Ｌ−ａ ｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ″Ｄｒｕｇ　Ｍｅｔａｂｏｉｓｓ　１４．３４９−３５ ２゜ ９　）　Ａｂｕｃｈｗｓｋｉ＾１、Ｄａｖｉｓ　Ｆ、Ｆ、およびＤａｖｉｓ　Ｓ 、著（１９８１）　「ヒト中のポリエチレングリコールに共有結合的に付着した アクロモバ）ターグルータミナーゼーアスパラギナーゼの免疫抑制特性および循 環寿命」“Ｉｌｕｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ 　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　１ｉｆｅ　ｏｆ　Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｇ ■ ｕｔａｍｉｎａｓｅ−ａｓｐａｒａｇｆｎａｓｅ　ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ａｔ ｔａｃｈｅｄ　ｔｏ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃB １　ｉｎ　ｍａｎ”　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔ、　６ ５．１０７７−１０８１゜ｌ　Ｑ）　Ｄａｖｉｓ　Ｓ、、Ｐａｒｋ　Ｙ、に、、 Ａｂｕｃｈｏｗｓｋ　ｉ＾、およびＤａｖｉｓ　Ｆ、Ｆ、著ｃｉ９ｇｏ−「ポリ エチレングリコール修飾した尿酸オキシダーゼの低尿酸血症効果」”　Ｈｙｐｏ ｕｒｉｃａｅｍｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃ ｏｌ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｕｒａｔｅ　ｏｘｉ■ ａｓｅ”　Ｌａｎｃｅｔ、　２８１−２８３゜１１）＾ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾１ 、Ｖａｎ　Ｅｓ　Ｔ、、Ｐａ１ｃｚｕｋ　Ｎ、Ｃ，、ＭｃＣｏｙ　Ｊ、Ｒ，およ びＤａｖｉｓＦ、Ｆ、著（１９７９）　ｒ非免疫原性Ｌ−グルタミナーゼ−し− アスパラギナーゼを用いた腫瘍を持っＢＤＦＩマウスＬ５１７８Ｖの治療」”Ｔ ｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ　Ｌ５１７８Ｖ　ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ　ＢＤＦＩ 　ｍ１ｃｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｌ−ｇｌｕｔ＋魔 ■ ｎａｓｅ−Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔａ＋ｅｎ ｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　６３．１１２７−１１３２゜１２）　Ｂｅｎｄｉｃｈ　Ａ 、、Ｋａｆｖｅｅｗｉｔｚ　Ｄ、、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　Ａ、およびＤａｖｉ ｓ　Ｆ、　Ｆ、著−（１９８２）　ｒ正常なそして腫瘍を持つマウス中のビブリ オ菌スクシノゲンおよび大腸菌からの、未変性およびポリエチレングリコール修 飾したアスパラギナーゼ免疫学的効果Ｊ　”　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅ ｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｎａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌ ｙｃｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｓ　ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｖｉｂｒ ｉｏ　ｓｕｃｃｉｎｏ■ ｅｎｅｓｅ　ａｎｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｓａ　ｃｏｌｉ　ｉｎ　ｎｏｒｍａ ｌ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｕｒ−ｂｅａｒｆｎｇ　ｍ１ｃｅ″Ｃｌ１ｎ、　ｅｘｐ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、４８．２７３−２７８゜１３　）　５ａｃｏｖａ　Ｋ、　Ｖ 、、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾１、ｖａｎ　Ｅｓ　Ｔ、、Ｄａｖｉｓ　Ｆ、Ｆ、お よびＰａｃｚｕｋ　Ｎ、Ｃ，著（１９７９）　ｒポリエチレングリコールの共有 結合付着による非免疫原生アルギナーゼの製造Ｊ　”　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ 　ｏｆ　ａ　ｎｏｎ−ｉｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ａｒｇｉａｎｓｅ　ｂｙ　ｔｈｅ 　ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ 　ｇｌｙｃｏｌ”　Ｂｉｏｃｈ■ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　５７８．４７−５３゜１４　）　Ｂｅａｕｃ ｈａｍｐ　Ｃ，０，、Ｇｏｎｉａｓ　Ｓ、　Ｌ、、Ｍｅｎａｐａｃｅ　Ｄ、　Ｐ 、およびＰｉｚｚｏ　Ｓ、　Ｖ。

著（１９８３）　ｒポリエチレングリコール−蛋白質付加体の合成に関する新規 な操作；機能、レセプター認識に対する効果、並びにスーパーオキシドジスムタ ーゼ、ラクトフェリン、および２−マクログロブリンめクリアランスＪ　”　Ａ 　ｎｅｗ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　 ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｄｄｕｃｔｓ； 　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅｃｏｇ ｎｉｔｉｏｎB ａｎｄ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｏｆ　５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓ ｅ、　１ａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ、　ａｎｄ　２−ｍａｃｒ。

ｇｌｏｂｕｌｉｎ”　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３１．２５−３３゜１ ５　）　Ｒａｊａｇｏｐａｉａｎ　Ｓ、、Ｇｏｎｉａｓ　Ｓ、　Ｌ、およびＰｉ ｚｚｏ　Ｓ、　Ｖ、著（１９８５）　ｒプラスミノーゲン活性化因子機能を用い た非抗原性共有結合ストレプトキナーゼ−ポリエチレングリコール複合体Ｊ　” 　Ａ　ｎｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｃｏｖａｌｅｎｔｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓ ｅ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｗｉｔｈ　ｐ ｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉ■ ａｔｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ″Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｔ　７５．４１１３− ４１９゜１５）　Ｄａｖｉｓ　Ｓ、、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾６、Ｐａｒｋ　Ｙ 、　Ｋ、およびＤａｖｉｓ　Ｆ、　Ｆ、著（１９８１）［ポリエチレングリコー ルの付着によるマウス中のウシのアデノシンデアミナーゼの循環寿命および抗原 性特性の変更Ｊ　”　Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｃｉｒｃｕｌａｔｉ ｎｇ　１ｉｆｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　 ｂｏｖｉｎｅ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄ■ ａＩＩＩｉｎａｓｅ　ｉｎ　ｍ１ｃｅ　ｂｙ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐ ｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ”　Ｃ１１ｎ、　ｅ■吹B Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４６．６４９−６５２゜１７　）　Ｋａｍｉｓａｋｉ　Ｙ、 、Ｗａｄａ■１、Ｙａｇｕｒａ　Ｔ、、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　Ａ、およびＩｎ ａｄａＹ、著（１９８１）　ｒモノメトキシエチレングリコールを用いた修飾に よる大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼの免疫原性およびクリアランス速度の減少」” 　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍａ＋ｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎ ｄ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒ奄■ ｈｆａ　ｃｏｌｔ　Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ　ｂｙ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈ■ ｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ”　Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒａ ｐ、　２１６．４１０−４１４゜１８　）　Ｈｅｒｓｈｆｅｌｄ　Ｍ、　Ｊ、、 Ｂｕｃｋｌｅｙ　Ｒ，Ｈ，、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ　Ｍ、Ｌ、、Ｍｅｌｔｏｎ　Ａ 、Ｌ、、５ｃｈｉｆｆ　Ｒ，、ｌ’ｌａｔｅｍ　Ｃ，、Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ　Ｊ 、、Ｍａｒｋｅｒｔ　Ｍ、、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｒ，［１，、Ｋｏｂａｙａｓ ｈｉ　Ａ、Ｌ、および＾ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾、著（１９８７）　ｌポリエチヤ ング」ノコーール修飾したアデノシンデアミナーゼを用いたアデノシンデアミナ ーゼ欠乏症の治療Ｊ　”　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄ ｅａｍｉｎａｓｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｗｉｔｈｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ 　ｇｌｙｃｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ａｄｅｎｓｉｎｅ　ｄｅａＩＩｌｉｎａｓ ｅ″Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１６．５８９−５９６゜ １９　）　Ｋａｔｒｅ　Ｎ、　Ｖ、、Ｋｎａｕｆ　ＭＪ、およびＬａ１ｒｄ　ｆ 、Ｊ、著（１９８７）　ｒポリエチレングリコールによる組換えインターロイキ ン２の化学的修飾はマウスのＭｅｔｈ　Ａ肉腫モデル中の効力を上昇させる」Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎｔ　１ ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２　ｂｙ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｉ　 １ｎｃｒｅａｓｅｓ　ｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｃｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｕｒｉｎｅ　 Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ　ｍｏｄｅｌ”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａ ｄ。

Ｓｃｊ、　８４．１４８７−１４９１゜２０　）　Ｃｈｅｎ　Ｒ，Ｈ，−Ｌ、、 Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　Ａ、、ｖａｎ　Ｅｓ　Ｔ、、ａｌｃｚｕｋ　Ｎ、Ｃ，お よびＤａｖｉｓ　Ｆ、Ｆ、著（１９８ｇ）　ｒポリ（エチレングリコール）への 共有結合的付着によって修飾された２種の尿酸オキシダーゼの特性」”Ｐｒｏｐ ｅｅｒｔｉｅｓｏｆ　ｔｗｏ　ｕｒａｔｅ　ｏｘｉｄａｓｅｓ　ｍｏｄｉｆｉｅ ｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｐｏ■ ｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）”　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、Ａｃｔａ　６６０．２９３−２９８゜２１　）　Ｌｉ５ｉ　Ｐ、　Ｌ、、ｖａ ｎ　Ｅｓ　Ｔ、、＾ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾１、Ｐａ１ｃｚｕｋ　Ｎ、Ｃ１および ＤａｖｉｓＦ、Ｆ、著（１９８２）　ｒ酵素治療１：ポリエチレングリコール二 Ｂ−グルクロニダーゼは酸ムコ多糖症における潜在的治療剤として接合する」” Ｅｎｚｙｍｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　］、　Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏ ｌ：Ｂ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　′ｃｏｎｊｕｇａｔ■刀@“ ａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｇｅｎｔｓ　ｉｎ　ａ ｃｉｄ　ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ″。

２２）　Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　Ａ、およびＤａｖｉｓ　Ｆ、　Ｆ、著（１９７ ９）　ｒポリエチレングリコール−トリプシン付加体の製造および特性Ｊ　”　 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｅｔ ｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ−ｔｒｙｐｓｉｎ　ａｄｄｕｃｔｓ”　Ｂｉｏｃｈ ｉｍ、　ＢｉｏｐｈｙｓB Ａｃｔａ　５７ｇ、４１−４６゜ ２３　）　Ｗｉｅｄｅｒ　Ｋ、　Ｊ、、Ｐａ１ｃｚｕｋ　Ｎ、Ｃ，、ｖａｎ　Ｅ ｓ　Ｔ、およびＤａｖｉｓ　Ｆ、Ｆ、著（１９７９）「ポリエチレングリコール ：フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ付加体のいくつかの特性」Ｓｏｍｅ　 ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ：ｐｈ ｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｍｍｏｎｉａ−１ｙａｓｅ　ａｄｄｕｃｔｓ″Ｊ、 　ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２５４．１２５７９．１２５８７゜ ２４）　５ｕｚｕｋｉ　Ｔ、、Ｋａｎｂａｒａ　Ｎ、、Ｔｏｍｏｎｏ　Ｔ、、Ｈ ａｙａｓｈｉ　Ｎ、および５ｈｉｎｏｈａｒａＩ、著（１９８４）　ｒポリ（エ チレングリコール）が連成した免疫グロブリンＧの物理化学的および生物学的特 性Ｊ　”　Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ　 ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）− ｃｏｕｐｌｅｄ　ｉａ＋ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ■ Ｇ”　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　７８８．２４８−２５５ ゜２５　）　Ｖｅｒｏｎｅｓｅ　Ｆ」、、Ｌａｒｇａｊｏｌｌｉ　Ｒ，、Ｂｏｃ ｃｕ　Ｅ、、Ｂｅｎａｓｓｉ　Ｃ，Ａ、および５ｃｈｉａｖｏｎ　Ｏ１著（１９ ８５）　ｒ蛋白質の表面修飾：フェニルクロロ蟻酸エステルによるモノメトキシ −ポリエステルグリコールの活性化およびリボヌクレアーゼおよびスーパーオキ シドジスムターゼの修飾」Ｓｕｒｆａｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ、　Ａｃｔｔｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏＩＩｌｅｔｈｏｘｙ −ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ■獅■ ｇｌｙｃｏｌｓ　ｂｙ　ｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅｓ　ａｎｄ　 ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｂｏｎｕｌｅａｓｅａｎｄ　５ｕｐｅｒ ｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ″Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌ、　１１．１４１−１５２゜ ２６）「バイオ薬学的ポリマー類：バイオ薬学的使用のためのポリマー状材料お よび薬剤Ｊ　”　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｐｏｌｙｍｅｒｉ ｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ｆｏｒ　Ｂ ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｓｅ”編集Ｅ、Ｐ、　ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＡ。

Ｎｋａｊｉｍａ、　ｐｐ　４４１−４５２、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ１Ｎ Ｙ中のＤａｖｉｓ　Ｆ、Ｆ、、＾ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ＾８、ｖａｎ　Ｅｓ　Ｔ、 、Ｐａ１ｃｚｕｋ　Ｎ、Ｃ，，５ａｃｏｖａ　Ｋ、、Ｃｈｅｎ　Ｈ，−Ｌ、およ びＰｙａｔａｋＰ、著（１９８０）　ｒ可溶非抗原性ポリエチレングリコール結 合酵素」”５ｏ１ｕｂｌｅ、ｎｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅ ｎｅ　ｇｌｙｅｏｌ−ｂｏｕｎｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ。

２７　）　Ｒａｒｒｉｓ　Ｊ」、著（１，９８５）　ｒポリエチレングリコール 誘導体の実験室的合成」Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐ ｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｅｓ”　Ｒｅｖ、　 Ｍａｃｒｏｍｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｃ２５，３２５−３７３゜２８ ）　Ｎｉ１ｓｓｏｎ　Ｋ、およびｍｏｓｂａｃｈ　Ｋ、著（１９８１）　ｒ酵素 並びに高度に活性を示す塩化スルホニルを用いた支持体を有する種々のヒドロキ シル基に対する親和性リガンドの固定化」”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｅｎｚ）＋＋＋＋ｅｓ　ａｎｄ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｔｏ 　ｖａｒｉｏｕｓ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｇｒｏｕｐ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　５ｕｐ ｐｏｒｔｓ　ｕｓｉｎ■@− ｈｉｇｈｌｙ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　５ｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅｓ”　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａｕｎ、　１０２．４ ４９−４５７゜ ２９）　Ｎｉ１．５ｓｏｎ　Ｋ、およびＭｏ５ｂａｃｈ　Ｋ、著（１９８４）　 ｒ有機スルホニルクロライドを用いたリガンドの固定化Ｊ　”　ＩｍｍｏｂｉＬ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｗｉｔｈ　。

ｒｇａｎｉｃ　５ｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅｓ”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０４．５６−６９゜３０）［細胞生物学およびバ イオテクノロジーにおける水系の相系を用いた分離の進展Ｊ　”　Ａｄｖａｎｃ ｅｓ　ｉｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｐｈａｓ ｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　Ｃｅ１．Ｉ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ−（編集Ｄ　ＦｉｓｈｅｒおよびＩＡ　５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ ）、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ発行中のＤｅｌｇａｄｏ　Ｃ，、Ｆｒａｎｃｉｓ 　Ｇ、Ｅ、およびＦｉｓｈｅｒ　Ｄ、著（１９８８ａ）　ｒ　）レシルクロライ ドを用いた活性化による蛋白質へのＰＥＧの連成：免疫親和性細胞の分配におけ る応用」”ＣｏｕｐＩｊｎｇ　ｏｆ　ＰＥＧ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　 ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔ、ｒｅｓｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｐｐ ■ ｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｅｌｌ　ｐａｒｔ ｉｔｉｏｎｉｎｇ″３１　）　Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ　Ｓ、、ＬｅＭａｉｓｔｒ ｅ＾９、Ｋｅａｔｉｎｇ　Ｍ、他（１，９８７）　ｒ悪性を有する患者および骨 髄不全を有する患者中の組換え型ヒトの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因 子の効果（要約）　Ｊ　”　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　 ｈｕｍａｎ　ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ　 ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　■ ａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ　ａｎｄ　ｉｎ　ｐａｔｉｅ ｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｆａｉｌｕｒ■ （ａｂｓｔｒａｃｔ）　’　Ｂｌｏｏｄ　７０．１４４ａ０３２）　Ｇａｂｒｉ ｌｏｖｅ　Ｊ。、Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ＾６、Ｆａｉｎ　Ｋ、他（１９８７）　 ｒ化学療法で誘発された好中球減少症の危険を有する癌患者におけるｒｈＧ−Ｃ ３ＦのフェーズＩ／Ｉ　Ｉ研究（要約）　Ｊ　”　Ａ　ｐｈａｓｅ　Ｉ／ＩＩ　 ５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｒｈＧ−Ｃ５Ｆｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａ ｔ　ｒｉｓｋ　ｆｏｒ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　１ｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｕｔ ｒｏｐｅｎｉａ（ａｂｓｔｒａｃｔ）　”　Ｂｌｏｏｄ　７０．１３５ａＯ３３ ）　Ｍｏｒｓｔｙｎ　Ｇ。、Ｄｕｈｒｓｅｎ　Ｕ、、Ｃａｍｐｂｅｌｌ　Ｌ、他 ［メルフェラニンを受けている進行した癌を有する患者中の顆粒球−コロニー刺 激活性（要約）Ｊ　”　Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌ ａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｄ■ ａｎｃｅｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ　ｍｅｌｐｈａｌａｎ　（ａｂ ｓｔｒａｃｔ）Ｂｌｏｏｄ　７０．１４０ａ０３４　）　Ｆｒａｎｃｉｓ　Ｇ、 　Ｅ、　＆　Ｐｉｎｓｋｙ　Ｃ，著（１９８７）　ｒ分化誘発剤の臨床的試行： 現在の試行および将来の見込みＪ　”　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｔｒｉａｌｓ　ｏｆ 　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ：　Ｃｕ ｒｒｅｎｔ　ｔｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”　ｒ 分化治療Ｊ　”　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｔｈｅｒａｙ”に関する第 ２回会議の会報中の章、Ｒａｖｅｎｓ　Ｐｒｅｓｓ　（同封されたコピー）３５ ）「癌の化学療法および生物学的応答修飾剤、年会誌９」”ＣａｎｃｅｒＣｅｍ ｏｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄ ｉｆｉｅｒｓ　Ａｎｎｕａｌｌ　９″編集Ｈ１Ｍ、　ＰｉｎｅｄｏＳＢ、Ａ、　 Ｃｈａｂｎｅｒおよびり、　Ｌ、　Ｌｏｎｇｏ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅ ｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ、　Ｖ、、刊行中のＦｒａｎｃｉｓ　Ｇ、Ｅ 、　＆　Ｐｊｎｓｋｙ　Ｃ，著（１９８７）　ｒ成長および分化制御Ｊ　”　Ｇ ｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｊｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ″３６ 　）　５ｔｏｃｋｓ　Ｓ、　Ｊ、、Ｊｏｎｅｓ＾、　ＪｏＭ、　、　Ｒａｍｅｙ 　Ｃ，Ｗ、およびＢｒｏｏｋｓ　Ｄ、　Ｅ、著（１９８６）＾ｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　１５４．２３２−２３４゜３７　）　Ｈａｂｅｅｄ＾、Ｓ、Ｆ、Ａ 、　（１９６６）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４．３２８−３３６゜３８ ）　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｍ、Ｎ、　（１９７６）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　７２．２４８−２５４゜３９　）　Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ　Ｇ、著（１９８５ ）　ｒバイオテクノロジーにおける水系の二相系の分配、理論、方法、使用およ び応用」”Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｔｔｏ−ｐｈａｓｅ　 Ｓｙｓｔｅｍｓ、　ＴｈｅｏｒｙＳＭｅｔｈｏｄｓ、　Ｌｌｓｅｓ　ａｎｄ　Ａ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｂｉｏ■ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｈ，、Ｂｒｏｏｋｓ　Ｄ、　Ｅ、およ びＦｉｓｈｅｒ　Ｄ、編集＞　１６１−２２６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ０４０　）　Ｔｒｅｆｆｒｙ　Ｔ、　Ｅ、　、　５ｈａ ｒｐｅ　Ｐ、　Ｔ、、Ｗａｉｔｅｒ　Ｈ，およびＢｒｏｏｋｓ、　Ｄ、　Ｅ、著 （１９８５）　ｒバイオテクノロジーにおける水系の二相系の分配、理論、方法 、使用および応用Ｊ　”　Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｔｗｏ −ｐｈａｓｅ　ＳｙｓｔｅｍｓＳＴｈｅｏｒｙ。

ＭｅｔｈｏｄｓＳＵｓｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｈ，、Ｂｒｏｏｋｓ　Ｄ、　Ｅ、お よびＦｉｓｈｅｒ　Ｄ、編集＞　１３２−１４８頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ。

ｋ０ ４１　）　Ｐｅｔｅｒｓ　Ｔ、　Ｊｒ、著（１９７２）　ｒ血漿蛋白質Ｊ　”　 Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”　（Ｐｕｔｎａｍ　Ｆ、Ｗ編集）第 ２版、第１巻、１４０−１４２頁、ＡｃａｄｅＩＩｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

４２）＾１ｂｅｒｔｓｏｎ　Ｐ、−＾、著（１９８５）　ｒ細胞粒子および巨大 分子の分配」＋Ｐａｒｔｊｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　ａｒｔｉｃｌｅｓ　ａｎ ｄ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＋第３版、Ｗｉｌｅｙ。

Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ０４３　）　Ｆｌａｎａｇａｎ 　Ｓ、　Ｄ、およびＢａｒｏｎｄｅｓ　Ｓ、　Ｈ０著（１９７５）　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５０．１４８４−１４８９゜ ４４）　Ｈａｒｒｉｓ　Ｊ、Ｍ、著（Ｒｅｖ、　Ｍａｃｒｏｍａｌ、　Ｃｈｅｍ 、　Ｐｈｙｓ、　Ｃ２５，３２５−３７３゜４５　）　Ｂｒｏｏｋｓ　Ｄ、　Ｅ 、、５ｈａｒｐ　Ｋ、　Ａ、およびＦｉｓｈｅｒ　Ｄ、著（１９８５）　ｒバイ オテクノロジーにおける水系の二相系の分配、理論、方法、使用および応用」” 　Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ　Ｓｙｓｔ ｅｍｓ、　Ｔｈｅｏｒｙ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｕｓｅｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　（Ｗａｉｔｅｒ　Ｈ，、 Ｂｒｏｏｋｓ　Ｄ、Ｅ、およびＦｉｓｈｅｒ　Ｄ、編集）　１１−８４頁、Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ０矛９；檀予アＳノ苓 画　ケ　（ｍｌ） 画＃　（ｍｌｌ １９週間造）ぶ九　丁ＭＰＥＣ５ 画ケ（ｍ［） 介ｂ１汗けうＴＭＰＥ（Ｅ処理効果 ＰＥ［３：　リジン９モルル １　２３　４　５６７　８　９　１０１１１２１３１１＋ｌ５１６１７１Ｂ１９ ２０−卜・　− ６有　（ｍｏ ※ヒ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年４月１８日 ＰＣＴ／ＧＢ　８９１０１２６１ 、発明の名称 分画化方法 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドンエヌダブリュ−３２ビーエフ・ロウランドヒルスト リート（番地なし）名称　ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メ ディシン４、代理人　〒１０７ ５、補正書の提出年月日 １９９０年１０月２２日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 補正 。該回帰に関する方程式はまた、蛋白質調製に関する置換の不均質性を分析する ため、そして個々の両分中に存在する置換の度合を明らかにするためにも用いら れる。

驚くべきことに、この関係は、ＰＥＧ修飾された蛋白質全てに対して適用できる ものではない。ある場合には、分配係数の対数と修飾との間に複雑な関係が存在 している。このような発見は従来の研究には実質的に含まれていない。この観察 は、凝集、変性および表面特性の付随する変化、等電点の変化を含む多くの因子 が基となっている。理論によって範囲を限定されるのを望むものではないが、こ の結果は（実施例３参照）、ＰＥＧで修飾された蛋白質を分画するための相分配 の使用が、必須条件として、分析的相分配のために必要であることを強調してい る。

ＰＥＧ修飾した蛋白質に対して一連の移行を行うための向流分布に関連した相分 配を使用することで、均質的にまたは不均質的に修飾された蛋白質類が識別され る。均質的に修飾された蛋白質は、同一の分配係数を有しているが、我々は、不 均質的に修飾された蛋白質に関して、蛋白質を有する両分の範囲に渡って分配係 数における増分が存在していることを示した。方法１の分析を基とした方程式を 用いて、個々の両分中の請求の範囲 １．ＰＥＧ含有水系の二相系中のＰＥＧ／蛋白質蛋白質付分体することを含む、 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−蛋白質付加体の混合物を分画するための方 法。

２、更に、該二相系の１つの相から、予め決められた度合のＰＥＧ置換のＰＥＧ −蛋白質付加体を回収する段階を含む請求の範囲１に従う方法。

３、該ＰＥＧ−蛋白質蛋白質付上体メトキシＰＥＧの付加体である請求の範囲１ または請求の範囲２に従う方法。

４、該モノメトキシＰＥＧ（＝Ｉ加体が、蛋白質と２．　２．　２−）リフルオ ロエタンスルホニルモノメトキシポリエチレングリコール（ＴＭＰＥＧ）との反 応によって生じる請求の範囲３に従う方法。

５、未反応のＴＭＰＥＧを分解するか或はリジンまたはアルブミンを添加するこ とによって該付加体生成反応を抑制する請求の範囲４に従う方法。

６、分配をバッチ式または連続的に行う請求の範囲１〜５のいずれか１項に従う 方法。

７、分配を該二相の向流の流れによって行う請求の範囲６に従う方法。

８、該蛋白質が顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｇｍ−Ｃ３Ｆ）であ る請求の範囲１〜７のいずれか１項に従う方法。

９、ＰＥＧ−ｇｍ−Ｃ３Ｆ付加体。

１０、ＰＥＧ−ｇｍ−Ｃ５Ｆ付加体および薬学的に許容される担体またはそれら のための希釈剤を含む薬学的調剤。

１１、該希釈剤または担体が注射に適切である請求の範囲１０に従う調剤。

１２、該希釈剤または担体が注射用の無菌水であるかそれを含む請求の範囲１１ に従う調剤。

１３、更に、少なくとも１種の緩衝液、等浸透剤、防腐剤または抗酸化剤を含む 請求の範囲１０〜１２のいず第１か１項に従う組成物。

１４、ヒトまたは動物体の治療方法またはヒトもしくは動物体に対して行う診断 方法における使用のための請求の範囲９に従うＰＥＧ−ｇｍ−Ｃ８Ｆ付加体か、 或は請求の範囲１０〜１３のいずれか１項に従う薬学的調剤。

１５、ヒトまたは動物体の治療方法またはヒトもしくは動物体に対して行う診断 方法における使用のための薬剤の製造における請求の範囲９に従うＰＥＧ−ｇｍ −Ｃ８Ｆ付加体か、或は請求の範囲１０〜１３のいずれか１項に従う薬学的調剤 の使用。

１６、該薬剤を静脈または皮下の注射または注入によって投与する請求の範囲１ ５に従う使用。

１７、それらを必要としているヒトまたはヒト以外の動物に対して有。

効でありそして無毒量の、請求の範囲９に従うＰＥＧ−ｇｍ−Ｃ３Ｆ付加体、或 は請求の範囲１０〜１３のいずれか１項に従う薬学的組成物を投与することを含 む、ヒトまたは動物体の治療のための治療学的または診断上の方法。

国際調査報告 ””１噛””’””””ＩＩＡ”ＰＣＴ／ＧＢ８９１０１２６１１−＋ｅｍａ＋ □ａ−＋噸ａｅ釦、＋＋ｕ、ａ−ｖａ、ＰＣＴ／に８Ｂ９１０１２〆り１国際調 査報告　ＰＣＴ１０８　Ｅ１９１０１２６１

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ＰＥＧ含有水系の二相系中のＰＥＧ／蛋白質付加体を分配することを含む、 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−蛋白質付加体の混合物を分画するための方 法。
2. ２．更に、該二相系の１つの相から、予め決められた度合のＰＥＧ置換のＰＥＧ −蛋白質付加体を回収する段階を含む請求の範囲１に従う方法。
3. ３．該ＰＥＧ−蛋白質付加体がモノメトキシＰＥＧの付加体である請求の範囲１ または請求の範囲２に従う方法。
4. ４．該モノメトキシＰＥＧ付加体が、蛋白質と２，２，２−トリフルオロエタン スルホニルモノメトキシポリエチレングリコール（ＴＭＰＥＧ）との反応によっ て生じる請求の範囲３に従う方法。
5. ５．来反応のＴＭＰＥＧを分解するか或はリジンまたはアルブミンを添加するこ とによって該付加体生成反応を抑制する請求の範囲４に従う方法。
6. ６．分配をバッチ式または連続的に行う請求の範囲１〜５のいずれか１項に従う 方法。
7. ７．分配を該二相の向流の流れによって行う請求の範囲６に従う方法。
8. ８．該蛋白質が顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子−（ｇｍ−Ｃ−ＳＦ） である請求の範囲１〜７のいずれか１項に従う方法。
9. ９．ＰＥＧ−ｇｍ−ＣＳＦ付加体。
10. １０．ＰＥＧ−ｇｍ−ＣＳＦ付加体および薬学的に許容される担体またはそれら のための希釈剤を含む薬学的調剤。
11. １１．該希釈剤または担体が注射に適切である請求の範囲１０に従う調剤。
12. １２．該希釈剤または担体が注射用の無菌水であるかそれを含む請求の範囲１１ に従う調剤。
13. １３．更に、少なくとも１種の緩衝液、等浸透剤、防腐剤または抗酸化剤を含む 請求の範囲１１〜１３のいずれか１項に従う組成物。
14. １４．ヒトまたは動物体の治療方法またはヒトもしくは動物体に対して行う診断 方法における使用のための請求の範囲１０に従うＰＥＧ−ｇｍ−ＣＳＦ付加体か 、或は請求の範囲１１〜１３のいずれか１項に従う薬学的調剤。
15. １５．ヒトまたは動物体の治療方法またはヒトもしくは動物体に対して行う診断 方法における使用のための薬剤の製造における請求の範囲１０に従うＰＥＧ−ｇ ｍ−ＣＳＦ付加体か、或は請求の範囲１１〜１３のいずれか１項に従う薬学的調 剤の使用。
16. １６．該薬剤を静脈または皮下の注射または注入によって投与する請求の範囲１ ５に従う使用。
17. １７．それらを必要としているヒトまたはヒト以外の動物に対して有効でありそ して無毒量の、請求の範囲１０に従うＰＥＧ−ｇｍ−ＣＳＦ付加体、或は請求の 範囲１１〜１３のいずれか１項に従う薬学的組成物を投与することを含む、ヒト または動物体の治療のための治療学的または診断上の方法。