SE462100B - Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem - Google Patents

Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem

Info

Publication number
SE462100B
SE462100B SE8503742A SE8503742A SE462100B SE 462100 B SE462100 B SE 462100B SE 8503742 A SE8503742 A SE 8503742A SE 8503742 A SE8503742 A SE 8503742A SE 462100 B SE462100 B SE 462100B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
molecular weight
polyethylene glycol
phase
average molecular
dextran
Prior art date
Application number
SE8503742A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8503742L (sv
SE8503742D0 (sv
Inventor
E E Brown
G O Johansson
Original Assignee
Perstorp Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perstorp Ab filed Critical Perstorp Ab
Priority to SE8503742A priority Critical patent/SE462100B/sv
Publication of SE8503742D0 publication Critical patent/SE8503742D0/sv
Priority to DE19863625266 priority patent/DE3625266A1/de
Priority to JP61186123A priority patent/JPS6296541A/ja
Priority to US06/893,864 priority patent/US4740304A/en
Priority to GB8619262A priority patent/GB2179952B/en
Priority to FR868611437A priority patent/FR2591606B1/fr
Publication of SE8503742L publication Critical patent/SE8503742L/sv
Publication of SE462100B publication Critical patent/SE462100B/sv

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Description

462 100 De egenskaper som är unika för dessa system och som gör dem användbara för extraktion, upprening, koncentrering och/eller separation av biologiskt material är att vätskefaserna innehåller en mycket hög vattenhalt, ofta 85-90 % samt att såväl lösliga som partikulära substanser kan upparbetas.
De system som tidigare visat sig ha de mest gynnsamma egenskaperna beträffande separationstider ch fördelning av biologiskt material mellan polymerfaserna var sammansatta av polymererna dextran och polyetylenglykol (PEG). Den förra polymeren betingade ett så högt pris att en teknisk användning i tvåfassystem ej var möjlig ur ekonomisk synpunkt. Dessutom orsakade dextranet också en relativt hög viskositet i den dextraninnehållande fasen. Detta gav en förlängd upparbetningstid.
Albertsson testade en rad polymera tvåfassystem baserade på andra vattenlösliga polymerer än PEG och dextran. Dessa andra polymersystem uppvisade flera nackdelar, såsom dålig stabilitet, sämre fördelningsegenskaper eller hög viskositet med åtföljande orimligt långa separationstider.
Kravet på en polymer som skall ersätta dextran i ovanstående system då dessa skall användas för storskalig upparbetning av biologiska substanser är att polymeren har ett tillräck- ligt lågt pris, att viskositeten är låg och att det bildade systemets fördelningsegenskaper är lika goda eller bättre än system innehållande dextran.
Genom föreliggande uppfinning har man nu helt överraskande kunnat tillfredsställa ovanstående önskemål och därvid åstadkommit en komposition för användning i ett två- eller flerfassystem för extraktion, upprening, koncentrering och/eller separation av biologiska substanser. Kompositionen kännetecknas av att dess huvudbeståndsdelar utgöres av A) hydroxialkylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxialkylgrupper av mer än 0.02 per glukosenhet i medeltal och med en medelmolekylvikt lägre än 800.000, 462 100 företrädesvis högst 400.000, och allra helst högst 250.000, och B) minst en polymer ur gruppen polyetylenglykol, polypropylenglykol, metoxipolyetylenglykol, polyvinyl- alkohol, polyvinylpyrrolidon, metylcellulosa, hydroxietyl- cellulosa, etylhydroxietylcellulosa samt en tvärbunden reaktionsprodukt av epiklorhydrin och socker.
En lägre substitutionsgrad än 0.02 hydroxialkylgrupper per glukosenhet i medeltal ger polymerlösningar med dålig stabilitet, d.v.s. gelbildning.
Allra helst bör molekylvikten hos hydroxialkylstärkelsen uppgå till högst 250.000. Därvid uppnås tvåfassystem med bättre egenskaper för fördelning av de biologiska substanserna mellan systemets faser. Vid låg molekylvikt på hydroxialkylstärkelsen kan man dessutom exempelvis upparbeta en större mängd proteiner per volym vattenlöst polymer än vid en hög molekylvikt.
Användningen av hydroxialkylstärkelse enligt uppfinningen ger system med tillräckligt låg viskositet för teknisk användning. Polymerlösningarna får dessutom en god stabilitet.
Enligt uppfinningen innehåller kompositionen företrädesvis hydroxipropylstärkelse (HPS).
Vid användning av kompositionen enligt uppfinningen kan man lämpligen lösa upp hydroxialkylstärkelsen och den eller de övriga använda polymererna i vatten.
Ofta utgör hydroxialkylstärkelsen och de andra polymererna ca 1-40 % av vattenlösningen.
Därefter tillsätts det biologiska materialet som skall upparbetas, varpå omrörning sker. 462 100 Sedan omrörningen avbrutits uppstår skarpt avgränsade vätskeskikt (faser) mellan vilka de olika komponenterna i det biologiska materialet fördelas.
Från de olika faserna utvinner man slutligen de olika komponenterna, vilka sedan eventuellt kan renas ytterligare på lämpligt sätt.
För att erhålla en selektivare fördelning av det biologiska materialets komponenter mellan de olika faserna kan man enligt en utföringsform av uppfinningen använda s.k. affinitetsfördelning, varvid minst en substituerad ligand tillföres polymerlösningen.
De använda liganderna kan utgöras av såväl laddade som oladdade grupper. Som exempel på positivt laddade ligander kan nämnas trimetylamino-, dietylaminoetyl- och kvartära aminoetylgrupper.
Negativt laddade ligander kan exempelvis utgöras av karboxyl-, sulfonat-, karboxymetyl-, karboxyetyl-, sulfat- och fosfatgrupper.
Ytterligare exempel på användbara ligander är fettsyror eller derivat av fettsyror, triazinfärgämnen, såsom Cibracron Blue och Procion Yellow samt lektiner, coenzymer, analoger av adenosintrifosfat, adenosindifosfat och adenosinmonofosfat, thiaminbindande proteiner, glukoproteiner, flavinbindande proteiner och biotinbindande proteiner. ' För att uppnå affinitetsfördelning kan ovnastående ligander kopplas till minst en polymer i tvåfassystemet, d.v.s. hydroxialkylstärkelse och/eller en polymer ur gruppen polyetylenglykol, polypropylenglykol, metoxipolyetylen- glykol, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, metyl- cellulosa, hydroxietylcellulosa, etylhydroxietylcellulosa 462 100 samt en tvärbunden reaktionsprodukt av epiklorhydrin och socker.
Kopplingen mellan liganden och polymeren sker i regel genom kovalent bindning.
Fördelarna med användningen av ligander är att dessa selektivt binder vissa komponenter i det biologiska materialet till sig. Därvid hamnar en större del av den aktuella komponenten i en viss fas, varvid utbytet givetvis blir högt.
Ytterligare ett sätt att styra fördelningen av de biologiska komponenterna mellan faserna är att tillsätta ett vattenlösligt salt till polymerlösningen. Dessutom påverkas nämnda fördelning av de ingående polymerernas molekylvikt.
Uppfinningen förklaras närmare i anslutning till nedanstående utföringsexempel samt bifogade figurer och tabeller. Exemplen 1-9, 18-22, 24-26, 28, 29 samt 31-47 illustrerar därvid uppfinningen medan resterande exempel avser jämförelseförsök utanför uppfinningens ram. 462 100 Exempel l Hydroxipropylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxipropylgrupper av 0.14 per glukosenhet i medeltal och med en medelmolekylvikt av 125.000 löstes i vatten tillsamman med polyetylenglykol med en medelmolekylvikt av 8.000 i en bägare.
Proportionerna mellan hydroxipropylstärkelse och poly- etylenglykolen varierades i en konstant mängd vatten.
De erhållna blandningarna omrördes en kort tid, varefter omrörningen stoppades.
Därefter konstaterades om två faser erhållits eller ej.
Resultatet i form av ett s.k. fasdiagram visas i Fig. l.
Exempel 2 0.7 g hydroxipropylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxipropylgrupper av 0.14 per glukosenhet i medeltal och med en medelmolekylvikt av 125.000 löstes i vatten tillsammans med 0.25 g polyetylenglykol med en medelmolekylvikt av 8.000.
Till den erhållna polymerlösningen sattes natriumfosfat tills en koncentration av 10 m M erhölls. Total mängd tvåfassystem var 5 g. 96 Units av enzymet fiš-galaktosidas tillsattes under om- rörning. Dmrörningen fortgick underlknrt tid. Ûmrörningen stoppades, varpå lösningen bildade två faser.
Därefter mättes mängden enzym i de båda faserna, varvid ett mått på fördelningen mellan faserna bestämdes.
Resultatet redovisas i Tabell l.
Exempel 3 Förfarandet enligt Exempel 2 upprepades med den skillnaden att en polyetylenglykol med medelmolekylvikten 20.000 an- vändes.
Resultatet redovisas i Tabell l.
Exempel 4 Förfarandet enligt Exempel 2 upprepades med den skillnaden att natriumklorid tillsattes till en koncentration av 0.1 M.
Resultatet redovisas i tabell 1.
Exempel 5 Förfarandet enligt Exempel 3 upprepades med den skillnaden att natriumklorid tillsattes till en koncentration av 0.1 M.
Resultaten redovisas i tabell 1.
Exempel 6 Förfarandet enligt Exempel 2 upprepades med den skillnaden att enzymet i stället utgjordes av katalas.
Resultatet redovisas i Tabell l.
Exempel 7 Förfarandet enligt Exempel 3 upprepades med den skillnaden att enzymet utgjordes av katalas.
Resultatet redovisas i Tabell 1. 462 100 Exemgel 8 Förfarandet enligt Exempel 4 upprepades med den skillnaden att enzymet i stället utgjordes av katalas.
Resultatet redovisas i Tabell l.
Exemgel 9 Förfarandet enligt Exempel 5 upprepades med den skillnaden att enzymet i stället utgjordes av katalas.
Resultatet redovisas i Tabell l.
Exempel 10 Förfarandet enligt Exempel 2 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Resultaten visas i Tabell l.
Exempel ll Förfarandet enligt Exempel 3 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Resultatet visas i Tabell 1.
Exemgel 12 Förfarandet enligt Exempel 4 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Resultatet visas i Tabell 1.
Exempel 13 Förfarandet enligt Exempel 5 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Exempel 14 Förfarandet enligt Exempel 6 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Resultatet redovisas i Tabell 1.
Exempel 15 Förfarandet enligt Exempel 7 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Resultatet redovisas i Tabell l.
Exempel 16 Förfarandet enligt Exempel 8 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydroxipropylstärkelsen.
Resultatet redovisas i Tabell 1. 10 462 100 Exempelxl7 Förfarandet enligt Exempel 9 upprepades med den skillnaden att dextran med en medelmolekylvikt av 500.000 användes i stället för hydrøxipropylstärkelse. ' Resultatet visas i Tabell l, varav framgår att man vid förfarandena enligt Exemplen 2, 6, 10 och 14 återfinner mer än 90 % av enzymet i polyetylenglykolfasen.
Av Tabell 1 faramgâr vidare att man vid förfarandena enligt Exemplen 5, 9, 13 och 17 återfinner mer än 95 % av enzymet i bottenfasen (hydroxipropylstärkelse respek- tive dextran).
Resultatet visar således att hydroxipropylstärkelse - polyetylenglykol utgör ett lika effektivt tvåfassystem som dextran - polyetylenglykol.
Exempel 18 0.025 g hydroxipropylstärkelse med en medelmolekylvikt 800.000 och med en substitutionsgrad avseende hydroxi- propylgrupper av 0.14 per glykosenhet löstes i 1 ml vatten. 3.75 mg gammaglobulin från kanin sattes till polymerlös- ningen under omrörning. 90 % av gammaglobulinet återfanns i stärkelselösningen.
Försöket fortsattes genom tillsats av en ökande mängd hydroxipropylstärkelse, varvid utfällning av gammaglobulinet ökade vid ökad halt hydroxipropylstärkelse, vilket visas i Fig 2. ll semi 19 462' 100 Förfarandet enligt Exempel 18 upprepades med den skillnaden att en hydroxipropylstärkelse med en medelmolekylvikt av 125.000 användes.
I detta fall utfälldes inte gammaglobulinet vid någon kon- centration av hydroxipropylstärkelse, vilket visas i Fig 2.
En jämförelse av resultaten enligt Exemplen 18 och 19 visar att en hydroxipropylstärkelse med en molekylvikt innanför uppfinningens ram inte har någon utfällande effekt på gamma- globulin vid ökande polymerkonoentration. Den utfällande effekten är däremot påtaglig vid användning av hydroxi- propylstärkelse med en molekylvikt utanför uppfinningens IQITI.
Exempel 20 I en bägare löstes 0.9 g hydroxipropylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxipropylgrupper av 0.l& per glukosenhet i medeltal och med en medelmolekylvikt av 125.000 i 7.5 g 10 m M natriumfosfatbuffert, pH 7.0 tillsammans med 0.6 g polyetylenglykol med en medelmolekyl- vikt av 20.000 samt 0.06 g av en substituerad ligand be- stående av Cibacron Blue - polyetylenglykol, varvid poly- etylenglykolen hade ovanstående molekylvikt. l g extrakt av bagerijäst innehållande bl.a. enzymet fosfofruktokinas tillsattes under omrörning.
Omrörningen fortsattes under kort tid och stoppades sedan, varvid lösningen bildade två faser. Den undre fasen bestod av hydroxipropylstärkelsen.
Resultatet av fördelningen av enzymet mellan de båda faserna redovisas i Tabell 2. l2 462 100 Exemgel Zl Förfarandet enligt Exempel 20 upprepades med den skillnaden att man i stället för hydroxipropylstärkelse använde dextran med en medelmolekylvikt av 500.000.
Resultatet av fördelningen av enzymet mellan de båda faserna redovisas i Tabell 2.
Exemgel 22 Förfarandet enligt Exempel 20 upprepades med den skillnaden att i stället för extrakt av bagerijäst tillsattes enzymet glukos - 6 - Fosfatdehydogenas.
Resultatet av Fördelningen av enzymet mellan de båda faserna redovisas i Tabell 2.
Exemgel 23 Förfarandet enligt Exempel 22 upprepades med den skillnaden att i stället för hydroxipropylstärkelse användes dextran med en medelmolekylvikt av 500.000.
Resultatet redovisas i Tabell 2.
Exemgel 24 Förfarandet enligt exempel 20 upprepades med den skillnaden att någon substituerad ligand ej tillsattes.
Resultatet redovisas i tabell 2.
Exempel 25 Förfarandet enligt exempel Zl att någon substituerad ligand Resultatet redovisas i Tabell Exempel 26 Förfarandet enligt exempel 22 att någon substituerad ligand Resultatet redovisas i Tabell Exempel 27 Förfarandet enligt exempel 23 att någon substituerad ligand Resultatet redovisas i Tabell 13 462 100 upprepades med den skillnaden ej tillsattes. 2! upprepades med den skillnaden ej tillsattes. 2D upprepades med den skillnaden ej tillsattes. 2.
Exemplen 20-27 visar att tvåfassystem bestående av HP5 och PEG plus ligand fungerar på samma sätt som tvåfas- system baserade på dextran och PEG plus ligand, när det gäller rening av enzymerna Fosfofruktokinas och glukos - 6 - fosfatdehydrogenas. Enzymerna fördelas därvid sel- ektivt till toppfasen när en ligand är närfarande i systemet. 14 462 100 Exempel 28 I en bägare löstes 0.7 g hydroxipropylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxipropylgrupper av 0.14 per glukosenhet i medeltal och med en medelmolekylvikt av 125.000 i 10 m M natriumfosfatbuffert, pH 7.0, till- sammans med 0.25 g polyetylenglykol med en medelmolekyl- vikt av 8000. Total mängd tvåfassystem var 5 g.
I andra bägare blandas tvåfassystem enligt ovan, med den skillnaden att 0.5 - 2.5 % av polyetylenglykolen bestod utav en substituerad ligand bestående av Cibacron Blue - polyetylenglykol, varvid polyetylenglykolen hade ovan- stående molekylvikt. Dessutom ersattes 3 % av hydroxipro- pylsträrkelsen av en substituerad ligand bestående av Procion Yellow - hydroxipropylstärkelse, varvid hydroxi- propylstärkelsen hade ovanstående specifikation. 0.4 g extrakt av bagerijäst innehållande bl.a. enzymet glukos - 6 - fosfatdehydrogenas tillsattes under omrörning. Ûmrörningen fortsattes under kort tid och stoppades sedan, varvid två faser bildades. Den övre fasen utgjordes av polyetylenglykolen.
Genom att tillsätta liganden Cibracron Blue - polyetylen- glykol fördelas enzymet allt mer till toppfasen. På lik- nande sätt Fördelas enzymet till bottenfasen vid tillsats av Procion Yellow - hydroxipropylstärkelse.
Resultatet redovisas i Fig 3. 15 Exemgel 29 2.8 g hydroxipropylstärkelse med en substitutionsgrad av- seende hydroxipropylgrupper av 0.14 per glukosenhet i medel- tal och med en medelmolekylvikt av 125.000 löstes i 20 ml vatten tillsammans med 1.0 g polyetylenglykol med en medelmolekylvikt av 8000 i en bägare.
Efter omrörning bildades två faser, varav den understa bestod av hydroxipropylstärkelse. Viskositeten i denna fas bestämdes genom mätning av den tid det tog för 5 ml lösning att passera genom en 10 ml pipett. Tiden var 21.6 sekunder.
Exemgel 30 Förfarandet enligt Exempel 29 upprepades med den skillnaden att i stället för hydroxipropylstärkelsen användes dextran med en medelmolekylvikt av 500.000.
Efter omrörning bildades två faser, varav den understa bestod av dextran. Tiden för passagen genom pipetten be- stämdes till 37.5 sekunder.
En jämförelse av resultaten enligt Exemplen 29 och 30 visar att hydroxipropylstärkelsen enligt uppfinningen gav en betydligt lägre viskositet än dextran. Detta betyder i sin tur att upparbetningstiden i tvåfassystem med hydroxi- propylstärkelse - polyetylenglykol blir kortare än i tvâ- fassystem med dextran - polyetylenglykol.
Exemgel 31 Enzymer separerades med s.k. motströmsfördelning i tvåfas- system. Som buffert användes 0.25 M natriumfosfat pH 7.0 innehållande s n M/ïnerkaptnetanol, 0.1 n M som och 0.02 m M MgCl2. 16 lyodqoxipropylstärkelse med en medelmolekylvikt av 125.000 och en substitutionsgrad avseende hydroxipropyl- grupper av 0.14 per glukosenhet löstes i 53 g av ovanstående buffert. Buffert plus HPS utgör lösning l. 7.1 g polyety- lenglykol med en medelmolekylvikt av 20.000 samt 0.37 g av en substituerad ligand, Cibacron Blue - polyetylen- glykol, löstes i 69 g av ovanstående buffert. Buffert plus PEG plus ligand utgör lösning 2. Polyetylenglykolen hade ovanstående specifikation.
Lösning l fördelades i 55 st bägare med 0.87 ml i varje.
Till de tre första bägarna sattes under omrörning 1.13 ml av lösning 2 samt 0.27 g extrakt från bagerijäst inne- hållande enzymerna hexokinas, fosfofruktokinas, 3 - fosfoglyceratkinas, glukos - 6 - fosfatdehydrogenas, glyceraldehyd 3 -fosfatdehydrogenas, enolas, fosfoglycerat- mutas och alkoholdehydrogenas.
Efter avslutad omrörning bildades tvâ faser, varav den undre bestod av hydroxipropylstärkelse och vatten. En första fördelning av enzymerna skedde. För att förstärka denna fördelning överfördes den övre fasen i den första bägaren till lösningen i den andra bägaren, varefter 1.13 ml av lösning 2 tillfördes den första bägaren.
Efter förnyad omrörning bildades två faser i den första och den andra bägaren samtidigt som enzymerna fördelades mellan faserna. Den övre fasen i den andra bägaren fördes över till lösningen i den tredje bägare samtidigt som den övre fasen i första bägaren fördes över till den andra bägaren och ytterligare l.l3 ml av lösning 2 tillfördea den första bägaren.
Förfarandet upprepades tills alla 55 bägarna innehöll två faser. Pâ så sätt erhölls en separation av enzynerna dåd enzymer med kraftig fördelning till toppfaaen återfanns i bägarna med höga ordningstal och enzymer med kraftig fördelning till bottenfasen återfanns i bägarna ned lågt ordningstal.
Resultatet redovisas i Fig 4. - 17 462 100 14 g hydroxipropylstärkelse med en substitutionsgrad av- seende hydroxipropylgrupper av 0.14 per glukosenhet i medeltal och med en medelmolekylvikt av 125.000 löstes i 81 g vatten tillsammans med 25 g polyetylenglykol med en medelmolekylvikt av 8000 i en bägare.
Efter omrörning bildades två faser.
Stabiliteten hos tvåfassystemet kontrollerades genom för- varing i kylskåp vid en temperatur av +4°C. Ingen gelbild- ningstendens kunde noteras efter 14 dagar.
Exempel 33 Förfarandet enligt exempel 32 upprepades med den skillnaden att hydroxipropylstärkelsen hade en substitutionsgrad av- seende hydroxipropylgrupper av 0.01 per glukosenhet och en medelmolekylvikt av 14.000.
Gelbildningstendens konstaterades efter 3 dagar.
En jämförelse av resultaten enligt Exemplen 32 och 33 visar att substitutionsgraden avseende hydroxipropylgrupper på- verkar stabiliteten i de aktuella tvåfassystemen.
Fördelen med ett kylstabilt tvåfassystem är att vissa bio- logiska material kräver upparbetning i kyla.
Exempel 34 Förmågan hos olika stärkelsederivat att tillsammans med polyetylenglykol bilda tvåfassystem testades.
Som framgår av Tabell 3 är det endast hydroxialkylderivat av stärkelse som tillsammans med polyetylenglykol bildar funktionsdugliga tvåfassystem.
Uppfinningen är inte begränsad till de visade utförings- formerna, då dessa kan modifieras pâ olika sätt inom upp- finningen ram. 18 462 100 EXEMPEL 35 Deoxiribonukleinsyra, DNA, och ribonukleinsyra, RNA, separerades med s k motströmsfördelning i tvåfassystem, se exempel 31. Som buffert användes 10 mM natriumfosfatbuffert, pH 7,0, innehållande 0,1 mM natriumklorid. 7,8 g hydroxipropylstärkelse, med en medelmolekylvikt av 125 000 och en substitutionsgrad av 0,14 per glukosenhet avseende nydroxipropylgrupper, löses i 22,2 g av ovanstående buffert.
Hydroxipropylstärkelse plus buffert utgör lösning l. 3,0 g polyetylenglykol med en medelmolekylvikt på 8 000 löstes i 27 g av ovanstående buffert. Polyetylenglykol och buffert utgör lösning 2.
Lösning l fördelas på 10 st provrör med 3 g i varje. Till det första provröret tillsattes 3 g av lösning Z samt 5 mg DNA och 5 mg RNA. Provröret skakades under kort tid. Efter avslutad omskakning bildades två faser. Den övre fasen överfördes till lösning i det andra provröret varefter 3 g lösning 2 tillfördes det första provröret.
Förfarandet fortsatte enligt exempel 31, men med endast 10 provrör. Pâ så sätt erhölls separation av deoxiribonukleinsyra och ribonukleinsyra. Resultatet av separationen visas i figur 5.
EXEMPEL 36 I en bägare löstes 0,65 g hydroxipropylstärkelse, med en medelmolekylvikt på 125 000 och en substitutionsgrad av 0,14 per glukosenhet med avseende på hydroxipropylgrupper och 0,25 g polyetylenglykol med en molekylvikt på 8 000 i 10 mM natriumfosfatbuffert till en sammanlagd mängd av 5 g. 10 mg bagerijäst tillsattes under omrörning. Omrörningen fortsatte under kort tid, varefter lösningen tilläts separera i två faser. .
Resultatet av fördelningen av jästcellerna redovisas i tabell 4.
EXEMPEL 37 Förfarandet i exempel 36 upprepades med den skillnaden att bufferten innehöll 12,5 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av jästcellerna redovisas i tabell 4.
EXEMPEL 38 Förfarandet i exempel 36 upprepades med den skillnaden att bufferten innehöll 25 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av jästcellerna redovisas i tabell 4. 19 462 1ÛÜ EXEMPEL 39 Förfarandet i exempel 36 upprepades med den skillnaden att nufferten innehöll 50 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av jästcellerna redovisas i tabell 4.
EXEMPEL 40 Förfarandet i exempel 36 upprepades med den skillnaden att bufferten innehöll 75 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av jästcellerna redovisas i tabell 4.
EXEMPEL 41 Förfarandet i exempel 36 upprepades med den skillnaden att bufferten innehöll 100 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av jästcellerna redovisas i tabell 4.
Exempel 36 - 41 visar att man, genom att variera salthalten kan styra fördelningen av jästcellerna. Se figur 6 a - d.
EXEMPEL 42 I en bägare löstes 0,65 g hydroxipropylstärkelse, med en medelmolekylvikt på 125 000 och en substitutionsgrad på 0,14 per glukosenhet med avseende på hydroxipropylgrupper, och 0,25 g polyetylenglykol, med en medelmolekylvikt på-8 000, i 10 mM natriumfosfatbuffert innehållande 10 mM natriumklorid till en sammanlagd mängd av 4,75 g. 0,25 g synaptiska membran från kalvhjärna tillsattes under omrörning. Omrörningen fortsatte under kort tid, varefter lösningen tilläts separera i två skikt.
Resultatet av fördelningen av membranen redovisas i figur 7.
EXEMPEL 43 Förfarandet i exempel 42 upprepades med den skillnaden att buffert innehållande 25 mM natriumklorid användes i stället för 10 mM.
Resultatet av fördelningen av membranen redovisas i figur 7. 20 462 100 EXEMPEL 44 Förfarandet i exempel 42 upprepades med den skillnaden att bufferten innehöll 50 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av membranen redvosias i figur 7.
EXEMPEL 45 Förfarandet i exempel 42 upprepades med den skillnaden att bufferten innehöll 100 mM natriumklorid.
Resultatet av fördelningen av membranen redovisas i figur 7.
Exempel 42-45 visar att man med ökad salthalt styr membranen från toppfas till interfas.
EXEMPEL 46 4000 g hydroxipropylstärkelse med en medelmolekylvikt på 125.000 och med en substitutionsgrad av 0,14 per glukosenhet med avseende på hydroxipropylgrupper, 1520 g polyetylenglykol med en medel- molekylvikt på 8000 och 4000 g muskelextrakt från gris innehål- lande laktatdehydrogenas (LDH) löstes i 40 mM natriumfosfatbuffert med ett pH av 7,9 till en total mängd av 20.000 g.
Den erhållna blandningen separerades i tvâ faser med hjälp av en Alfa-Laval separator LAPX 202. Mängden laktatdehydrogenas (LDH) i varje fas bestämdes. Resultatet visas i tabell 5.
EXEMPEL 47 Förfarandet enligt exempel 46 upprepades med den skillnaden att 1,5 % av polyetylenglykolen hade liganden Procion Yellow kovalent bunden. Den liganden har affinitet för LDH. Resultatet visas i tabell 5.
Exemplen 46-47 visar i stor skala att enzymet LDH kan extraheras till den övre fasen med hjälp av en ligand bunden till polymeren i den övre fasen.
“Tabell 1 21 462 100 FÜRDELNINGSKÜEFFICIENTENS BERÛENDE AV TÛPPFAS- PÜLYMERENS MULEKYLVIKT OCH LÜSNINGENS JUN- SAMMANSÄTTNING Tvåfassammansättning Fördeln. koefficient kf Exempel Bottenfas I fóppfas Buffert -galaktosidas Katalas 2 HPS PEG 8000 A 23,2 -- 3 HPS PEG 20.000 A 3,94 -- 4 HPS PEG 8000 B 0,51 -- 5 HPS PEG 20.000 B 0,16 -- 6 HPS PEG 8000 A _- 1,50 7 HPS PEG 20.000 A _- 0,45 8 HPS PEG 8000 B -- 0,39 9 HPS PEG 20.000 B -- 0,16 10 Dextran 500 PEG 8000 A 1,59 -- ll Dextran 500 PEG 20.000 A 3 -- 12 Dextran 500 PEG 8000 B 0,44 -- 13 Dextran 500 PEG 20.000 B 0,2 -- 14 Dextran 500 PEG 8000 A -- 0,78 15 Dextran 500 PEG 20.000 A -- 0,16 16 Dextran 500 PEG 8000 B _- 0,09 17 Dextran 500 PEG 20.000 B -- 0,2 Buffert A: 10 mM Natriumfosfatbuffert pH 7,0 Buffert B: 10 mM natriumfosfatbuffert pH 7,0 samt 0,1 M natriumklorid 22 462 100 Tabell 2; FÜRDELNINGSKUEFFICIENTENS PÅVERKAN Av EN LIGAND, '"'" ”' CIBRACRUN BLUEK KoPPLAo TILL TUPPFASPOLYMEREN PULYETYLENGLYKUÉ Tvåfassammansätfining Fördeln. koefficient kr i Glukos - 6 - fosfat Exempel :Bottenfas Toppfas Fosfofruktokinas ! dehydrogenas zu HPs Pas anno 3,5 2 _- + ligand ; t 21 Dextran son PEG soon z 10,0 š -- I + ligand ; ' 22 HPS PEG soon É -- š 2,4 + ligand 23 Dextran 500 PEG 8000 -- 0,42 + ligand 24 HPs Pas soon 0,14 i -- 25 Dextran 500 PEG 8000 0,06 -- 26 HPS PEG 8000 -- 0,37 27 Dextran 500 PEG 8000 -- 0,10 23 462 100 Tabell 3: ÜLIKA STÄRKELSEDERIVATS FÜRMÅGA ATT TILLSAMMANS MED PÛLYETYLENGLYKÜL BILDA TVÅFASSYSTEM Typ av derivat Egenskaper i system med PEB Nonjoniska: Dextrin, vit Retrograderar Dextran, gul Hög halt nödvändig, färgad Voximajs (amylopektin) Gelbildning Stärkelseacetat Retrograderar, Nödvändigt salt Hydroxipropyl, syrahydrolyserad Fassystem instabila vid + 4°C oxiderad Stabila fassystem Hydroxietyl, oxiderad Fassystem instabila vid + AOC Katjoniska: Kvartär ammonium Utfällning Tvärbundna: Acetylerad distärkelsefosfat Utfällning Hydroxipropyl- distärkelsefosfat Utfällning 462 100 Tabell 4: Fördelningen av jästceller i tvåfassystem med varierande natriumklpridhalt.
Mängd jästceller, i %, Exempel Nâfl (NH) i toppfasen i interfasen i bottenfasen 36 - 97 3 - 37 12,5 89 ll - 38 25 20 BU - 39 SÜ Û,B 97,8 1,4 ao 75 0,5 m 38,5 al IÛÛ Û,ü 33 66,6 24 25 'IDO Tabell 5: Fördelning av LDH från grismuske1extra4<ç2 i ett storskaligt tvåfassystem.
Exempel % ïigand-PEG % LDH 1 toppfas % LDH i bottenfas 46' - 1 99 47 1,5 87 13

Claims (1)

1. 462 100 PATENTKRAV 1. . Komposition enligt patentkrav 1, Komposition för användning i ett två- eler flerfassystem för extraktion, upprening, koncentrering och/eller separation av biologiska substanser, k ä n n e t e c k - n a d därav, att dess huvudbeståndsdelar utgöres av A) hydroxialkylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxialkylgrupper av mer än 0.02 per glukosenhet i medeltal ch med en medelmolekylvikt lägre än 800.000, företrädesvis högst 400.000 och allra högst 250.000 och B) minst en polymer ur gruppen polyetylenglykol, poly- propylenglykol, metoxipolyetylenglykol, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, metylcellulosa, hydroxietylcellulosa, etylhydroxietylcellulosa samt en tvärbunden reaktions- produkt av epiklorhydrin och socker. k ä n n e t e c k n a d därav, att den även innehåller minst en substituerad ligand. k ä n n e t e c k n a d därav, att liganden är substituerad med eller kopplad till hydroxialkylstärkelse och/eller minst en polymer ur Komposition enligt patentkrav 2, gruppen polyetylenglykol, polypropylenglykol, metoxi- polyetylenglykol, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, metylcellulosa, etylhydroxietylcellulosa, hydroxietyl- cellulosa samt en tvärbunden reaktionsprodukt av epiklorhydrin och socker. . Användning av en vattenlösning av hydroxialkylstärkelse med en substitutionsgrad avseende hydroxialkylgrupper av i medeltal mer än 0,02 per glukosenhet och en medel- molekylvikt lägre än 800.000, företrädesvis högst 400.000 och allra högst 250.000 i ett två- eller flerfassystem för extraktion, upprening, koncentrering och/eller separation av biologiska substanser.
SE8503742A 1985-08-08 1985-08-08 Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem SE462100B (sv)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8503742A SE462100B (sv) 1985-08-08 1985-08-08 Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem
DE19863625266 DE3625266A1 (de) 1985-08-08 1986-07-25 Mittel zur verwendung in einem zwei- oder mehrphasensystem
JP61186123A JPS6296541A (ja) 1985-08-08 1986-08-06 生物学的物質の抽出、純化、濃縮または分離用の２相または多相系に使用するための組成物
US06/893,864 US4740304A (en) 1985-08-08 1986-08-06 Composition for use in a twophase or multiphase system
GB8619262A GB2179952B (en) 1985-08-08 1986-08-07 Composition for use in a twophase or multiphase system
FR868611437A FR2591606B1 (fr) 1985-08-08 1986-08-07 Composition a utiliser dans un systeme biphasique ou multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la separation de substances biologiques.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8503742A SE462100B (sv) 1985-08-08 1985-08-08 Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE8503742D0 SE8503742D0 (sv) 1985-08-08
SE8503742L SE8503742L (sv) 1987-02-09
SE462100B true SE462100B (sv) 1990-05-07

Family

ID=20361057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8503742A SE462100B (sv) 1985-08-08 1985-08-08 Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4740304A (sv)
JP (1) JPS6296541A (sv)
DE (1) DE3625266A1 (sv)
FR (1) FR2591606B1 (sv)
GB (1) GB2179952B (sv)
SE (1) SE462100B (sv)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5101018A (en) * 1989-06-12 1992-03-31 International Minerals & Chemical Corp. Method for recovering recombinant proteins
US5047511A (en) * 1989-08-28 1991-09-10 Pitman-Moore, Inc. Method for recovering recombinant proteins
US5525519A (en) * 1992-01-07 1996-06-11 Middlesex Sciences, Inc. Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers
SE9500778D0 (sv) * 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
SE9603068D0 (sv) * 1996-08-23 1996-08-23 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
EP0942935A1 (en) * 1996-09-11 1999-09-22 Pharmacia &amp; Upjohn Aktiebolag A process for purifying apolipoproteins and a composition for use in the process
SE9603303D0 (sv) 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
SE9603304D0 (sv) * 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a compound
DE69624823T2 (de) * 1996-11-18 2003-07-24 Nestle Sa Konzentrierung von Polysacchariden
WO2012024690A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 President And Fellows Of Harvard College Multiphase systems having multiple phase properties

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3077054A (en) * 1959-06-22 1963-02-12 Scholten Chemische Fab Erosion control
US3219519A (en) * 1963-03-28 1965-11-23 Hercules Powder Co Ltd Starch ethers in paper
JPS538750B2 (sv) * 1971-08-18 1978-03-31
US3725386A (en) * 1971-12-06 1973-04-03 Staley Mfg Co A E Method for purifying crude, dry granular reacted cold water swelling hydroxypropyl starch derivatives
JPS5027884A (sv) * 1973-07-12 1975-03-22
GB1514720A (en) * 1974-10-07 1978-06-21 Secr Defence Preparation of hydroxyethyl starch
JPS5233893A (en) * 1975-09-11 1977-03-15 Seiwa Kasei Kk Method of producing adsorbent
US4277364A (en) * 1975-12-22 1981-07-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Encapsulation by entrapment
NL165401C (nl) * 1977-01-06 1981-04-15 Helmes Maschf Bv Machine voor het frezen van een pen aan het kopse uiteinde van een houten werkstuk en werkwijze voor het bedrijven van deze machine.
US4171403A (en) * 1977-01-28 1979-10-16 Owens-Corning Fiberglas Corporation Glass fiber coated with a hydroxy-ethylated starch, a tertiary amine etherified starch, and a methyl methacrylate latex polymer or co-polymer
AT348548B (de) * 1977-04-08 1979-02-26 Laevosan Gmbh & Co Kg Verfahren zur herstellung von alsblutplasma- expander geeignerter hydroxyaethylstaerke
DE2819969A1 (de) * 1978-05-08 1979-11-22 Behringwerke Ag Verwendung von hydroxyaethylstaerke zur anreicherung und stabilisierung von antihaemophilem globulin (faktor viii)
DE2908436A1 (de) * 1979-03-05 1980-09-25 Fresenius Chem Pharm Ind Kolloidales gefrierschutzmittel
US4803071A (en) * 1980-02-11 1989-02-07 National Starch And Chemical Corporation Hair care compositions
JPS57501610A (sv) * 1980-10-23 1982-09-09
US4361669A (en) * 1981-08-17 1982-11-30 Champion International Corporation Coating compositions comprising a reaction product of a dispersed _hydroxy-alkyl modified starch product and a hydrolyzed styrene maleic anhydride copolymer
DE3141499A1 (de) * 1981-10-20 1983-04-28 Wolff Walsrode Ag, 3030 Walsrode Verfahren zur herstellung von hydroxypropylstaerke
US4431800A (en) * 1982-03-30 1984-02-14 General Foods Corporation Process for hydroxypropylating starch
SE8302483L (sv) * 1983-05-02 1984-11-03 Pharmacia Ind Forfarande vid rening av biologiskt aktiva substanser

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6296541A (ja) 1987-05-06
GB2179952A (en) 1987-03-18
SE8503742L (sv) 1987-02-09
FR2591606A1 (fr) 1987-06-19
DE3625266A1 (de) 1987-02-19
GB2179952B (en) 1989-09-13
GB8619262D0 (en) 1986-09-17
FR2591606B1 (fr) 1990-03-02
SE8503742D0 (sv) 1985-08-08
US4740304A (en) 1988-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE462100B (sv) Komposition och dess anvaendning i ett tvaa- eller flerfassystem
Lato et al. In vitro selection of RNA lectins: using combinatorial chemistry to interpret ribozyme evolution
Kostraba et al. Differential activation of transcription of chromatin by non-histone fractions
Edstrom et al. The base composition of ribonucleic acid in lampbrush chromosomes, nucleoli, nuclear sap, and cytoplasm of Triturus oocytes
US5300635A (en) Quaternary amine surfactants and methods of using same in isolation of nucleic acids
Zubay The isolation and fractionation of soluble ribonucleic acid
Daròs et al. Replication of avocado sunblotch viroid: evidence for a symmetric pathway with two rolling circles and hammerhead ribozyme processing.
DE3750774T2 (de) Chaotropisches verfahren zur schätzung von nukleinen säuren in einer biologischen probe.
McMeekin Serum albumin. I. The preparation and properties of crystalline horse serum albumin of constant solubility
Crippa et al. Persistence in early amphibian embryos of informational RNA's from the lampbrush chromosome stage of oögenesis.
Richardson Rho factor function in T4 RNA transcription
WO2005044836A2 (de) Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung
EP3199629A1 (en) Bead beating tube and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms
DE102008023297B4 (de) Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von Nukleinsäuren oder Viren
AU759401B2 (en) Improved method for the isolation of nucleic acid
DK144679B (da) Fremgangsmaade til udvinding af intravenoeskompatible gammaglobuliner
DK174784B1 (da) Kvantificering af nukleinsyremolekyler og reagenssæt dertil
DE68924601T2 (de) Reinigung von q-beta-replicase.
WO2021037075A1 (en) Method, composition and kit for size selective enrichment of nucleic acids
DE69931928T2 (de) Reversibel inhibierende sonden
Alberts [74] Fractionation of nucleic acids by dextran-polyethylene glycol two-phase systems
Tracy et al. Bean yellow mosaic, clover yellow vein, and pea mosaic are distinct potyviruses: evidence from coat protein gene sequences and molecular hybridization involving the 3′ non-coding regions
CN103314290B (zh) 核酸链的分离方法
Hunter et al. The specificity of arginase: action upon argininic acid
TWI691595B (zh) 選擇性分離核酸之方法及套組

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 8503742-2

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8503742-2

Format of ref document f/p: F