DE2908436A1 - Kolloidales gefrierschutzmittel - Google Patents

Kolloidales gefrierschutzmittel

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hydroxyethyl
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Michael Dr Beez
Eike Dirks
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Dr Eduard Fresenius Chemisch Pharmazeutische Industrie KG
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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Description

5. März 1979
Dr. Eduard Presenius
Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg v.d.H.
Kolloidales Gefrierschutzmittel
Die Erfindung bezieht sich auf ein kolloidales Gefrierschutzmittel.
Bisher werden zur Gefrierung von Blutzellen vorwiegend Dimethylsulfoxid, Polyvinylpyrrolidon und Glycerin eingesetzt. Diese Mittel haben den Nachteil, daß sie in die Zellen diffundieren und diese nach dem Auftauen ausgewaschen werden müssen, was mit erheblichem Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Ein weiterer Nachteil für diese Mittel ergibt sich aus der Notwendigkeit zeitlicher Einfrierungsprogramme, damit eine Zerstörung der Zellen vermieden wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein kolloidales Gefriermittel zu schaffen, mit dem es möglich ist, einfach und ohne große Zellverluste Blutzellen und Organzellen ohne Beeinträchtigung ihrer biologischen Aktivität zu kryokonservieren.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Hydroxyäthylstärke als kolloidales Gefrierschutzmittel .
Der mit der Erfindung erzielbare Vorteil besteht darin, daß es erstmals durch den Einsatz von Hydroxyäthylstärke als extrazellulärem Kryoprotektiv gelingt, einfach und ohne große Zellverluste Blutzellen und Organzellen ohne Beeinträchtigung ihrer biologischen Aktivität zu kryokonservieren. Ein weiterer Vorteil liegt in einer Vereinfachung des Einfrier- und Auftauverfahrens und der Möglichkeit eines Verzichts auf das Auswaschen der aufgetauten Zellen.
Die Vorteile beruhen auf folgenden Mechanismen:
a) Hydroxyäthylstärke (HÄS) ist als glykogenartige Kolloidlösung nur extrazellulär wirksam und dringt kaum in die Zellen ein.
b) Während des Gefriervorganges mindert HÄS den extrazellulären Anstieg des osmotischen Druckes und den Flüssigkeitsstrom aus den Zellen; ein übermäßiges Austrocknen und Schrumpfen der Zellen wird somit vermieden;
c) HÄS dichtet schwammartig durch "coating" die Zellmembran extrazellulär ab und schützt diese damit vor Beschädigungen während des Gefriervorganges;
d) während des Auftauvorganges mindert HÄS den Flüssigkeitseinstrom in die Zellen und vermindert eine zerstörende Überwässerung der Zellen;
e) HÄS vermindert also die extreme Ent- bzw. Überwässerung beim Einfrieren bzw. Auftauvorgang und stabilisiert die Zellmembran, so daß die Zelle während des Gefriervorganges im osmotischen Gleichgewicht gehalten und damit vor Zerstörung geschützt wird;
Ö30039/0 02Ö
f) HAS kann zudem durch seine erwiesene Punktion als Volumenersatzmittel zusammen mit den Blutzellen infundiert werden, ohne daß ein Auswaschen nötig ist. Damit können zusätzliche waschbedingte physikalische Belastungen der Zelle vermieden werden.
Ist dennoch eine Entfernung von HÄS erwünscht, so läßt sich HSs als extrazelluläres Gefrierschutzmittel leichter und zellschonender auswaschen.
An einem allgemeinen Beispiel wird die Erfindung im folgenden näher erläutert:
1. Gewinnung der Zellen (z.B. durch Zentrifugation, Zellseparation, Filtration, Adsorption).
2. Aufnahme der Zellen in HÄS-Lösung variierbarer Konzentrationen; weitere Variationsmöglichkeiten für HÄS sind durch Variation von Molekulargewicht du^ch/oder Substitutionsgrad möglich.
|Hydroxyäthylstärke (HÄS)
Zellen
z.B. Konzentration: z.B. RBC 5- 50 % Lösung WBC
Molekulargewicht: Plättchen
30 000 - 700 000 Knochenmarkzellen
Substitutionsgrad: Organzellen 0,0 - 0,9
3. Das Einfrieren in flüssigen Stickstoff unter Schütteln z.B. innerhalb von 90 see;
4. Das Auftauen erfolgt z.B. im Wasserbad von 47°C unter Schütteln,Bis ca. 18°C erreicht werden;
G-
5. Die Kontrolle der biologischen Vitalität erfolgt mit den üblichen Testmethoden, z.B.:
a) Erythrocyten: Erythrocytenzahl
freies Hämoglobin
ATP
freies k+, Na+
b) Thrombocyten: Plättchenzahl
Plättchenaggregation Plättchenf aktoren
c) Leukocyten: Leukocytenzahl
Mikroskopie
d) Knochenmark: Mikroskopie
Punktionstest
e) Organzellen: Mikroskopie
Punktions test
Bei Erythrocytenkonzentraten sollte nach Auftauen die Hämolyserate gemessen werden: sollte sie 10 % überschreiten, so empfiehlt sich ein einmaliges Auswaschen mit Hydroxyäthylstärke.
Bezüglich Einfriergeschwindigkeit und Konzentration der HÄS-Lösung, des Hydroxyäthylierungsgrades der HJiS bestehen breite Variationsmöglichkeiten. Qualitätsunterschiede der aufgetauten Zellen bei verschiedenen Varianten der genannten Parameter haben nur graduellen Charakter.
Der wesentliche Vorteil der Kryokonservierung von Blutzellen mit HÄS liegt darin, daß bei Infusion der vital?n Zellen ein
0 3 00 39/0020
voliamenstabilisierender Effekt auftritt, der in etwa der Volumenwirkung von 5 % Humanalbuminlösung entspricht.
Anhand dieses allgemeinen Beispieles wurde ein Erythrocytenkonzentrat, wie nachügend beschrieben, kryokonserviert.
Durch Zellseparation wurden aus antikoaguliertem Vollblut Erythrocyten-Konzentrate gewonnen.
Diesen Konzentraten setzte man in einem Verhältnis von 2/3 (HÄS/Erythrocyten-Konzentrat) eine 10%ige HÄS-Lösung als Gefrierschutzmittel zu. (HÄS: M^ 200 OOO/DS 0,45). Das Einfrieren der Zellen in Plastikbeuteln bzw. Aluminium-BehSltern erfolgte durch Schock-Einfrieren (60 sec.) in flüssigem Stickstoff. Die Aufbewahrung erfolgte bei -60°C in der Tiefkühltruhe. Zur Infusion wurde das Konzentrat aufgetaut und im Wasserbad von 48°C auf 37°C gebracht. Die Zeil-Ausbeute lag zwischen 95 - 98%, die Stabilität der Zellen in 0,15 molarer Kochsalzlösung nach einer Stunde bei 22°C zwischen 80 - 87%.
Ein entsprechendes Vorgehen ergibt auch bei Thrombocyten und Granulocyten verbesserte Ausbeuten.
In der Klinik ergeben sich folgende Einsatzgebiete für mit Hydroxyäthylstärke gefrierkonservierte Zellen:
1. Erythrocytenkonzentrate:
Verbesserung der O2 - Versorgung im Rahmen der Infusionstherapie bei Blutverlusten (Unfälle, Operationen, Innere Erkrankungen, Anämie und Blutungen).
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2. Thrombocytenkonzentrate:
Verbesserung der Blutgerinnung im Rahmen der Infusionstherapie bei Blutverlust, Thrombopenien, Thrombopathien, Hämophilien, Strahlungs-ZChemotherapieschäden, onkologische Endstadien.
3. Leufcocyten:
Verbesserung des Immunsystems im Rahmen der Infusionstherapie bei Leukopenien, Infektionserkrankungen, Blutverlust, nach schweren operativen Eingriffen, Brandverletzungen, bei Sepsis, bei Strahlungsschäden, bei Immunsuppression, zur Verstärkung der Immunabwehr, zur Leukämiebehandlung, zur Auto-Immunbehandlung und Autoagrßösions-Behandlung,bei Transplantation zur Verminderung der Abstoßungsreaktion.
4. Knochenmarkszellen:
Verbesserung der Immunabwehr bei Leukämiepatienten, Entnahme von Knochenmark und Rückgabe in aggressiver Phase.
5. Organzellen:
Organkonservierung für Transplantationen, z.B. Nieren, Herzen, Leber.

Claims (11)

Patentansprüche
1. Kolloidales Gefrierschutzmittel aus Hydroxyäthylstärken (HSS).
2. Kolloidales Gefrierschutzmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyäthylstärke einen Anteil von mindestens 90 % Amylopectin-Hydrolysat aufweist.
3. Gefrierschutzmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyäthylstärke eine Eigenviskosität von 0,05 - 0,30 dl/g bei 25°C aufweist.
4. Gefrierschutzmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyäthylstärke einen Äthersubstitutionsgrad bis zu 0,90 Hydroxyäthylgruppen pro Stärkemolekül aufweist.
5. Gefrierschutzmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyäthylstärke ein Molekulargewicht 5^ von 30.000 bis 700.000 aufweist.
6. Gefrierschutzmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Äthylenglykolanteil der Hydroxyäthylstärke weniger als 0,5 Gewichtsteile Äthylen glykol auf 100 Teile modifizierte Stärke beträgt.
030039/0020
7. Kolloidales Gefrierschutzmittel nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Hydroxyäthylstärke Polyvinylpyrrolidon, Glycerin zugesetzt sind.
8. Kolloidales Gefrierschutzmittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß 1%ige bis zu 50%ige Hydroxyäthylstärkelösungen eingesetzt werden.
9. Kolloidales Gefrierschutzmittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die kryokonservierten Zellsuspensionen mit und ohne Entfernung des Gefrierschutzmittels HÄS beim Patienten infundiert werden können.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 zur Gefrierkonservierung von Erythrocyten, Thrombocyten, Leukocyten, Knochenmarkszellen und anderen Organzellen.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10 zur Herstellung spezieller Gefrierkonzentrate, gekennzeichnet durch spezielle Gefriergeschwindigkeit und Gefrierintensität.
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