DE2039182A1

DE2039182A1 - Verfahren zur Tiefsttemperaturkonservierung von Blut und Erythrozyten und die dabei erhaltenen Produkte

Info

Publication number: DE2039182A1
Application number: DE19702039182
Authority: DE
Inventors: Brake Jon Michael
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Current assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1969-08-08
Filing date: 1970-08-06
Publication date: 1971-02-18
Also published as: NL7011085A; NL164203C; JPS4928965B1; CH536115A; DE2039182C3; IT1050113B; DE2039182B2; FR2068474B1; CA928215A; NL164203B; GB1279356A; FR2068474A1; SE395835B

Description

AMERIGAK HOSPITAL SUPPLY CCRPOIiATlON Evanston, Illinois, USA

Verfahren zur Tiefsttemperaturkonservierung von Blut und Erythrozyten und die dabei erhaltenen Produkte

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Tiefsttemperaturkonservierung (Aufbewahrung) von menschlichem Blut und Erythrozyten und die dabei erhaltenen Produkte.

Bei den kryogenen Verfahren zur Konservierung von menschlichem Blut oder Erythrozyten enthaltenden Fraktionen davon besteht das Hauptproblem darin, die Zersetzung der Erythrozyten (der roten Blutkörperchen), die selbst bei. den modernsten Einfrier- und Auftauverfahren, wie z.B. dem Flüssigstickstoff ^-Verfahren von Linde oder der Verbesserung dieses Verfahrens zur Druckbehandlung (bulk processing) von Blut und Erythrozyten, wie es in der USA-Patentschrift 3 347 745 beschrieben ist, einer Zerstörung der Membran oder der Hämolyse unterliegen, zu vermeiden oder mindestens minimal zu halten. Es hat sich als wesentlich herausgestellt, ein kryophylaktisches Mittel zum Schutz der Erythrozyten während des Einfrierens und Auitauens zu verwenden,

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und es besteht seit langem ein Bedürfnis nach besseren Schutzmitteln (Konservierungsmitteln). Intrazellulare Schutzmittel, wie z.B. Glycerin, wurden zwar mit Erfolg zur Konservierung von Erythrozyten über längere Zeiträume hinweg verwendet, sie v:eisen jedoch einen schwerwiegenden Nachteil auf. Vor der Verabreichung muss nämlich das intrazellulare Schutzmittel aus den Erythrozyten entfernt werden.

Um die Bearbeitung nach dem Auftauen auf ein Minimum herabzusetzen, wäre es von Vorteil,"ein extrazellulares Schutzmittel zu finden, das eine gute Schutzwirkung hat und gleichseitig den Zellen verabreicht werden kann. Es sind zwar bestimmte extrazellulare Schutzzusätze bekannt, diese wurden jedoch nicht als ungefährlich bei der Verabreichung an Menschen angesehen. So hat sich beispielsweise Polyvinylpyrrolidon (PVP) als höchst wirksam zur Konservierung von Erythrozyten erwiesen, es ist Jedoch anerkanntermassen gefährlich, PVP in das Gefäss-System einzuführen. Las PVP, mindestens jedoch seine Fraktionen mit höherem Molekulargewicht, können in dem Körper für lange Zeiträume verbleiben und eine solche PVP-Retention wird als unerwünscht angesehen. Um ausserhalb der Zellen zu bleiben, muss das Schutzmittel im allgemeinen ein-Polymerisat mit einer verhältnismässig langen Kettenlänge sein, und deshalb nahm man bis?ier an, dass das Problem der langen Retention in dem Körper allen extrazellularen Schutzmitteln eigen ist.

Gewöhnliche, unmodifizierte Stärke oder andere Saccharidpolymerisate, die der Amylolyse unterliegen, werden von den Bi utamylasen angegriffen und stellen deshalb keine wirksamen Schutzmittel dar. Die Erythrozyten werden gewöhnlich in Gegenwart von Blutamylasen eingefroren. Dieses Problem ist besonders akut bei Gesamtblut, es tritt jedoch auch bei Erythrozyten auf, die in einem wässrigen Medium, das mindestens zum Teil Blutplasma darstellt, suspendiert sind.

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Es wurde bereits vorgeschlagen, als Schutzzusatz für die Tiefsttemperaturkonservierung von menschlichem Blut, und Erythrozyten hydrolysierte, verätherte Stärke zu verwenden. Bisher wurde jedoch angenommen, dass dafür eine Stärke mit einem höheren Äthergruppen-Substitutionsgrad erforderlich wäre. So enthalten beispielsweise die bisher zur Einfrierkonservierung von Erythrozyten geeigneten modifizierten Stärken 0,6 bis 0,8 (z.B. 0,75) Hydroxyäthyl·-oder Hydroxypropylgruppen pro Mol Glukose. Ausserdem wurde bisher angenommen, dass dann, wenn .der Äthergruppen-Substitutionsgrad auf einen wesentlich niedrigeren Wert verringert würde, die Wirksamkeit des Produktes als Konservierungsmittel beträchtlich herabgesetzt würde.

Die vorliegende Erfindung beruht nun auf der überraschenden Erkenntnis, dass hydrolysierte, verätherte, wachsartige Stärken (waxy starches), die einen kritischen niedrigen Substitutionsgrad an Äthergruppen aufweisen, gute und wirksame'Konservierung?-· mittel für Blut und Erythrozyten darstellen. Gegenstand der Erfindung ist daher ein verbessertes Verfahren, nach dem das Blut und die Erythrozyten während des kryogenen Verfahrens geschützt und konserviert sind, das jedoch gleichzeitig ermöglicht·, das Blut und die Erythrozyten ohne Entfernung des Stärkeschutzmittels z\i verabreichen und die durch das Verbleiben des Stärkeschutzmittels in dem Blutstrom verursachten Nebenwirkungen minimal zu halten. Bei dem niedrigen Substitutionsgrad der erfindungsgemäss verwendeten Stärke wird die Stärke aus dem Blutstrom schnell ausgeschieden und dieser erwünschte Effekt wird noch weiter verbessert, wenn die Stärke auf eine niedrige Eigenviskosität hydrolysiert worden ist.

Es wurde ferner gefunden, dass die Schutzwirkung der niedrigsubstituierten Stärken im Vergleich zu den hoch-substituierten Stärken maximal gehalten werden kann, indem man die Konzentration der Stärke in dem Blut oder in der Erythrozyten-Suspension um einen sehr kleinen Wert, beispielsweise 12 bis 15%» erhöht. Auf diese Weise kann der Vorteil einer minimalen intravaskulären

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Verweilzeit erzielt werden, ohne die Schutzwirkung dabei zu verringern, und in der Tat kann die maximal mögliche Schutzwirkung bei jedem Ithergruppen-Substitutionsgrad (DS) von bis zu 0,75 ^S erzielt werden.

Das zur Durchführung der Erfindung bevorzugt verwendete Ausgangsmaterial ist eine wachsartige Stärke in Körnchenform. Es kann z.B. wachsartige Milo(Sorghum)-Stärke, wachsartige Maisstärke oder wachsartige Reisstärke verwendet werden. Diese wachsartigen Stärken bestehen hauptsächlich aus Amylopectin mit einem geringeren Gehalt an Amylose. Die erfindungsgemäss verwendbaren wachsartigen Stärken enthalten vorzugsweise 90 oder inehr Gewichtsprozent Amylopectin. Es können auch vorgelatinierte, wachsartige Stärken verwendet werden, es hat sich jedoch herausgestellt, dass es zweckmässig ist, die Stärke \inmittelbar vor oder gleichzeitig mit der Hydrolyse zu gelatinieren. Das heisst mit anderen Worten, dass die Gelatinierung und die Hydrolyse eine kontinuierliche Beerbeitungsstufe darstellen können. Wachsartige Stärken, die beim Kochen dünnflüssig werden·, sind besonders geeignet, z.B. solche mit Fluiditätswerten (Beweglichkeiten) von 85 oder darüber. Es ist natürlich klar, dass das Stärke-Ausgangsmaterial eine wesentlich höhere Eigenviskosität (inherent viscosity) aufweist als das gewünschte Endprodukt nach der Hydrolyse.

Bei den nicht vorgelatinierten Stärken erfolgt bei den Säurehydrolysierbedingungen eine wirksame Vervollständigung der Gelatinierung. Nach der Gelatinierung Wird die Stärke säurehydrolysiert, um ihre Eigenviskosität herabzusetzen. Die Gelatinierung und die Hydrolyse der Stärke werden in einer wässrigen Suspension durchgeführt. Die Konzentration der Suspension an Stärke ist nicht besonders kritisch, geeignete Verhältnisse von Stärke zu H2O liegen innerhalb des Bereiches von etwa 0,65 bis etwa O,75> * bezogen auf eine Gewichtsbasis. Die Suspension weist vorzugsweise einen niedrigen sauren pH-Wert auf- z.B. einen pH-Wert zv/iseken 2,0 und 5,0. Der pH-Wert kann mit verschiedenen Säuren, z.B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, und so weiter, eingestellt

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werden. Die Hydrolysegeschwindigkeit hängt von der Temperatur ab. Eine geeignete Temperatur liegt innerhalb des Bereiches von 85 bis 95⁰C. Die Hydrolyse läuft vorzugsweise ausreichend langsam ab, so dass ihr Verlauf analytisch verfolgt werden kann, wodurch es möglich ist, die Hydrolyse an dem gewünschten Endpunkt zu beenden. Durch Entnahme einer Reihe von Proben währenddes Ablaufs der Hydrolyse kann die zur Vervollständigung der Hydrolyse erförderliche Zeit durch Extrapolation mit ziemlich guter Genauigkeit ermittelt werden.

Zur Bestimmung der Eigenviskosität (inherent viscosity) können die verschiedenen bekannten Verfahren angewendet werden. So kann beispielsweise die in Deziliter (dl) pro Gramm (g) angegebene Viskosität durch die Fliesszeit in einem Ubellohde-Viskosimeter gemessen werden und die gemessene Viskosität kann für die gemessene Konzentration nach der optischen Rotations- oder der Anthron-Colorimeter-Methode korrigiert werden. Die Einzelheiten der geeigneten analytischen Verfahren gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der einzelnen Durchführungsbeispiele· hervor.

j)_er Hydrolysegrad bestimmt die Eigenviskosität des Endprodukts. Es ist deshalb ratsam, den Viskositätsendpunkt der Hydrolysestufe vorher festzulegen. Die Endviskosität sollte nicht mehr als 0,27 dl/g bei 25°C und vorzugsweise nicht mehr als 0,24 bis 0,25 dl/g bei 25°C betragen. Das hydrolysierte Produkt sollte seinen StärkeCharakter beibehalten und nicht zu Dextrinen oder niedrigeren Polysacchariden hydrolysiert werden. Der Stärkecharakter des Produkts wird aber »beibehalten bis zu Viskositäten von herunter bis _Zu 0,07 bis 0,10 dl/g bei 25⁰C, wobei jedoch eine Hydrolyse auf unter 0,11 dl/g bei 25°C gewöhnlich nicht erwünscht ist. Die maximalen Vorteile werden erfindungsgemäs3 bei einem optimalen Bereich der Eigenviskosität (I.V.) von. 0,13 "bis 0,17 dl/g bei 25°C erzielt.

Die Stärke wird entweder vor oder nach der Hydrolyse durch Umsetzung mit Äthylen- oder Propylenoxyd, vorzugsweise mit Äthylenoxyd, verethert. Die Veretherung sollte unter basischen pH-Be-

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dingungen durchgeführt werden, da die Anwesenheit von Alkali, S.B. Natriumhydroxyd, die Verätherungsreaktion fordert. Die Verätherung kann bei einem pH-Wert von etwa 11 bis etwa 13 bei einer Alkalikonzentration von etwa 8 bis 10% - bezogen auf die Stärkefeststoffe - durchgeführt werden. Die Temperatur der -Reaktionsmischung wird während der Verätherung vorzugsweise wesentlich niedriger als während der Hydrolyse gehalten. Die Verätherung kann zwar bei Temperaturen innerhalb des Bereiches von 35 "bis 7O°C durchgeführt werden, die Temperatur der Verätherungsstufe sollte jedoch so gewählt werden, dass die Verätherung gefördert und der gewünschte Substitutionsgrad erzielt wird, ohne dass sich dabei die Eigenviskosität der Stärke wesentlich ändert. Die Hydrolyse der Stärke während der Verätherung sollte vernachlässigbar klein gehalten werden.

In der Verätherungsstufe kann die gleiche Konzentration an Stärke in <fer Suspension wie in der Hydrolysestufe verwendet werden. Infolgedessen kann nach Beendigung der Hydrolyse die Reaktiocsmischung für die Verätherung durch Abkühlen und Zugeben von Natriumhydroxyd oder einem anderen Alkali hergestellt werden. Vorzugsweise wird die Stärke jedoch vor der Hydrolyse veräthert. Es wurde gefunden, dass durch diese Reihenfolge die Bildung von gefärbten Nebenprodukten stark herabgesetzt werden kann, und deshalb sind zur Herstellung eines weissen Produktes oder einer farblosen Lösung weder Behandlungen mit Natriumbisulfit noch mit Aktivkohle erforderlich.

Ein geeigneter analytischer Test -zur Bestimmung des Substitutionsgrades ist in den nachfolgend beschriebenen Ausführungsbeispielen angegeben. Bei dem erfindungsgemäscen Verfahren sollte die Substitution so gewählt werden, dass der Substitutionsgrad (DS)/weniger als 0,5 und vorzugsweise oberhalb 0,20 liegt. Der optimale Bereich liegt bei 0,25 bis* 0,45, Die verätherte Stärke enthält dann 0,25 bis 0,45 Mol gebundene Äthergruppen (bzw. Hydroxyäthyl- oder Hydroxypropylgruppen) pro Mol Stärke (AnhydroglukoBeeinhoit).

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Das verätherte und hydrolysierte Produkt kann zur Entfernung von Glykol und anderen Nebenprodukten gereinigt werden. Beispielsweise kann Äthylenglykol oder Propylenglykol durch Extraktion mit Aceton entfernt werden, oder das Produkt kann durch Dialyse gereinigt werden. Das gereinigte Material enthält vorzugsweise nach dem Trocknen weniger als 0,5 Gewichtsprozent Glykol. Das Produkt kann nach bekannten Verfahren, beispielsweise durch Trocknen in der Trommel oder durch Sprühtrocknen, in ein trockenes Pulver umgewandelt werden.

Bei Verwendung des erfindungsgemassen extrazellularen Schutzmittels muss dieses nur in das Gesamtblut oder in das wässrige Medium, in dem die Erythrozyten suspendiert sind, in einer ausreichenden Konzentration eingearbeitet werden, so dass die Erythrozyten während des Einfrierens und Auftauens geschützt sind. Die dabei verwendete Menge ist nicht kritisch, es muss Jedoch eine ausreichende Konzentration vorliegen, welche die Schutzwirkunc ausüben kann. Da Jedoch das Blut oder die Erythrozyten ohne vorherige Entfernung des StärkeSchutzmittels verabreicht werden sollen, verwendet man Jedoch vorzugsweise eine minimale Menge an Stärke, die gerade noch die Erythrozyten optimal oder praktisch vollständig schützt. Die optimale Menge variiert Je nach der., ob man das kryogene Verfahren auf das Gesamtblut anwendet oder ob die Erythrozyten abgetrennt worden sind, die in einem wässrigen Medium entweder in der gleichen oder einer anderen Konzentration als in dem Gesamtblut vorliegen. Wenn die Erythrozyten vor dem Einfrieren mit einer Zentrifuge abgetrennt werden, sollten sie in einem geeigneten wässrigen Medium, z.B. einer sterilen normalen Kochsalzlösung wieder suspendiert verden. Das das StärkeSchutzmittel enthaltende wässrige Medium sollte mit den Membranen Jeder Zelle in Berührung stehen, und dies kann am besten durch eine geeignete Suspension der Zellen in dem das Schutzmittel enthaltenden wässrigen Medium er-, zielt werden.

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Schütz von Menschlichem Ge samtblüt kann das

fctyö-Schützmittei in einer Konzentration des Bereiches von 13 bis 17 Gew./VoIS verwendet Seispielsweise kann eine Konzentration von 15 6 "vor-" ;

iiydroiysierter Stärke pro 1ÖG ml des den Zusatz enthaltenden Gesamtblutes verwendet werden* Der optimale Wert liegt bei JSesämtblut bei etwa 14 bis etwa 16 Gewi/Vol*%.

Wie bereite oben angedeutet, kann die Erfindung auf kryogene Schäeileinfriervörfahren zum Schutz von Erythrozyten angewendet Werden, wenn die Erythrozyten in Blut oder einem wässrigen Medium suspendiert sind, wodurch es möglich ist, dasSchutzmittel vor dem Einfrieren in das Medium einzuarbeiten. Das sogenannte "Fiüssigstickstoff^-Linde-Verfahren" zum Schutz von Erythrozyten ist bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben /vgl. z.B. P,W. Gikas, CT. Knorpp, N.W. Thompson, W.R. Merchant in "Proc. Congr. Int. Soc^ Blood Transfus.¹¹, 10. Stockholm 1964 (Karger, Basel und New York, 1965), Seiten 714 bis 718; N.W. Thompson, CT. Knorpp, P.W. Gikas, M.A. Tinker; W.R. Merchant ibid., Seiten 719 bis 725 und CT. Knorpp, P.W. Gikas, N. Thompson, "Cryobiology", 2_, 268 (1966)7.

Ein geeignetes Verfahren zur Druckkenservierung von Blut und Erythrozyten (bulk preservation) ist in der USA-Patentschrift 3 347 745 beschrieben. Das Blut oder die Erythrozytenwerden auf die bekannte und in den genannten Literaturstellen beschriebene Art und Weise aufgetaut. Der hauptsächliche Unterschied zwischen dem erfindungsgemässen Verfahren .im Abschluss an das Auftauen besteht darin, dass keine weitere Bearbeitung zur Entfernung eines Teils oder des gesamten StärkeSchutzmittels erforderlich ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

1560 g einer beim Sieden dünnflüssigen (thin-boiling) wachsai'tige Sorghum-Stärke wurden in 2190 ml Wasser suspendiert und in ein

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Reaktionsgefäss gegeben, das dann verschlossen wurde. Dann wurde gerührt und das Reaktionsgefäss wurde zweimal nacheinander evakuiert und mit Stickstoff gefüllt. Dann wurden 585 ml 9,2n Natriumhydroxyd zugegeben und das Reaktionsgefäss <drde erneut zweimal evakuiert und mit Stickstoff gefüllt. Nach dem Evakuiere: auf 63,5 cm (25 inches) Hg wurden aus einem Gaszylinder 100 S Ä'thylenoxyd mit einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, dass der Druck 0,7 kg/cm (10 psi) nicht überstieg. Das Reaktionsgefäss wurde durch Durchleiten von 45°C warmem Wasser durch den Mantel erwärmt. Nachdem die Temperatur des Reaktionsgefässes 55°G erreicht hatte, wurde sie 1 Stunde lang bei 4-5 bis 5O⁰C gehalten. Der erzielte Substitutionsgrad betrug 0,30. V

Es wurden 572 ml« einer 6,2n Chlorwasser st off säure zugegeben, eine Probe zurrpH-Wert-Messung entnommen und der pH-Wert durch weitere Zugabe von Natriumhydroxyd oder Chlorwasserstoffsäure, je nach Erfordernis, auf 2,0 eingestellt. Dann wurde das Reaktionsgefäss mit Wasserdampf' bis auf eine Temperatur von 90^üC erwärmt. In 1/2-stündigen Abständen wurden zur Bestimmung der ;§!§| Eigenviskosität Proben entnommen. Als Verdünnungsmittel für die : Messungen kann Wasser verwendet werden. Beim Erreichen der Eigenviskosität von 0,15 dl/g wurde die Reaktion durch Abkühlen des Reaktionsgefässes mit kaltem Leitungswasser beendet. Nach dem Abkühlen auf 30⁰C wurde das Produkt entfernt und unter Stickstoff bei 4⁰C aufbewahrt.

510 ml des oben genannten Sirups wurden mit 153 HiI Wasser und 867 ml Aceton 15 Minuten lang gemischt. Nach 4-5-minüti^em Stehenlassen, wobei sich während* die'ser Zeit 2 Schichten bildeten, wurde die obere, an Aceton reiche Schicht abgehebert. Die untere, an HES reiche Schicht wurde mit 246 ml Wasser und 57^· ml Aceton gemischt und 15 Minuten lang gerührt. Nach 45-minütigem Stehenlassen wurde die obere Schicht abgehebert und die untere Schicht wurde mit 246 ml Wasser und mit 574 ml Aceton . 15 Minuten lang gemischt. Nach 45-minütigem Stehenlassen wurde die obere Schicht verworfen und die untere Schicht wurde .mit 123 ml Wasser und 697 ml Aceton 1.5 Minuten lang gemischt. Nach 45-minütigem Stehenlassen wurde die obere Schicht verworfen.

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Zu der unteren Schicht wurden 400 ml Wasser zugegeben und das restliche Aceton wurde durch 15-minütiges Erwärmen auf 8O⁰C in einem Rotationsverdampfor unter einem Vakuum von etwa 50,8 cm (20 inches) Hg entfernt. Das dabei erhaltene Produkt wurde bei 4°C aufbewahrt.

Eine HES-Stärke mit der Eigenviskosität (I.V.) von 0,25 und einem Substitutionsgrad (DS) von 0,36 wurde - wie in Beispiel 1 beschrieber. - hergestellt, wobei jedoch die folgenden Änderungen vorgenommen wurden:

a) Anstelle von 100 g Äthylenoxyd wie in Beispiel 1 wurden 180 g Äthylenoxyd verwendet;

b) die Hydrolysereaktion wurde anstatt bei einem I.V.-Wert von 0,15 wie in Beispiel 1 bei einem I.V.-Wert von 0,25 durch Abkühlen des Reaktionsgefässes beendet.

Eine beim Sieden dünnflüssige wachsartige Sorghum-Stärke (238 g) wurde mit 335 ml Wasser und 3tO ml 1,1n HCl in einem mit einem Rührer, einem Tropftrichter, einem Probeentnahmerohr und einem zu einer Wasserstrahlpumpe und einem Stickstofftank führenden Mehrfachhahn versehenen 1 Liter-Harzkolben verrührt. Der Kolben wurde abwechselnd dreimal mit Stickstoff gefüllt und evakuiert. Dann wurde der Kolben in einem Wasserbad auf 90⁰C erwärmt. In 30-minütigen Abständen wurden Proben entnommen und die Eigenviskosität der Stärke bestimmt. Venn .die durch Extrapolation errechnete Eigenviskosität 0,15 betrug, wurde die Reaktion durch Zugabe von 3 ml 1n NaOH und Abkühlen auf 22⁰C beendet.

Es wurden 55 ml einer 10,2n NaOfl zugegeben und dann wurden durch den Tropftrichter langsam 48 ml Propylenoxyd eingetropft. Der Kolben wurde auf 62 erwärmt und 40 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten. Anschliessend wurden 90 ml 6n HCl zugegeben, der Sirup wurde entfernt und unter Stickstoff bei 4°C aufbewahrt.

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I)er ÖJLrup (TOO ml) wurde mit 1,21 1 Aceton und. 210 ml Wasser 15 Himitfn lang verrührt. Dann liess man ihn 1 Stütze lang steheii und die oben stehende Flüssigkeit wurdfe abgehebert* Der IJiederschlag vrvirde mit 333 ml Wasser und 875 Wl Aceton 15 Minuten lang verrührt. Nach einstündigem Stehenlassen wurde die oben stehende Flüssigkeit erneut.entfernt, Dann wurden zu dem Niederschlag 790 ml Aceton und 334 ifll Wasser zugegeben und die Mischung wurde 1*> Minuten lang gerührt. Nach einstündigem Stehenlassen wurde die oben stehende Flüssigkeit abgehebert.

I5Ö ml des Hl^S-Sirups wurden langsam zu 4 1 Aceton zugegeben und mit einem Mischer mit hoher Scherwirkung dispergiert. Der HPS-lIiederschlcG wurde durch Filtrieren gesammelt und 2 Tage lang an der Luft getrocknet. Das dabei erhaltene Produkt (48 g) hatte eine Eigenviskosität von 0,15 "und einen Substitutionsgrad von 0,35·

Dieses HPS-Produkt konnte ebenso wie das HES-Produkt der Beispiele 1 und 2 als KryoSchutzmittel verwendet werden.

Die Produkte der Beispiele 1, 2 und 3 wurden mit Wasser verdünnt, so dass eine 40 'Gew./Völ.^iee-Lösung von HES oder HPS entstand (äie Konzentration wurde durch die optische Drehung £*c7j) = 178° be stimmt). Der Natriumchlorid-Gehalt wurde durch Titrieren mit Silbernitrat ermittelt und es wurde ausreichend Natriumchlorid zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,9 Gew./Vol.% zu verhalten. · *

Die Lösung wurde durch ein 0,8 /i-Killipore-Firter mit einem aufgesetzten Millipore-Vorfilter filtriert. Das FiItrat wurde in Vakoliter-Behältern gesammelt, die evakuiert, verschlossen und 30 Minuten lang bei 24O°C in einem Autoklaven sterilisiert wurden. Dann waren die Kryo Schutzmittel fertig für den Handel, die Lagerung und Verwendung.

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B_e_i_s_|)_i_e_l j?

Gesamtblut, das ein geeignetes Antikoagulans,. z.B. ACD, enthielt, wurde mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, die eine Menge des in den oben beschriebenen Beispielen hergestellten HES oder HPS (d.h. 14- bis 16 Gew./Vol.%) enthielt, die ausreichte, um in vitro eine Regenerierung der roten Zellen nach dem Einfrieren und Auftauen der Blut-HES-Mischung von 90% oder mehr zu erzielen^ gemischt. Diese Mischung wurde in einem Metallbehälter in einem -Kältebad bei einer Temperatur von nicht mehr als etwa -1OO°C unter heftigem Rühren gebracht, so dass die Wärmeübergangsgeschwindigkeit mindestens 14 000 BTU-Einheiten pro Stunde pro 0,09 m Behälteroberfläche betrug. /Die Mischung kann beispielsweise in einen Aluminiumbehälter gegeben und in flüssigem Stickstoff unter Schütteln mit einer Geschwindigkeit von 200 Hin- und Herbewegungen pro Minute eingetaucht werden/⁷* Das eingefrorene Blut wurde bei einer Temperatur von etwa -100⁰C oder weniger gelagert. Es vurde aufgetaut, indem man es in ein Wasserbad von 4-5°C brachte und mit einer Geschwindigkeit; von etw8 150 UpM rührte.

Die Regenerierung in vitro der roten Zellen ist der Prozentsatz

an nicht hamolysierten Erythrozyten, der

1.) durch Messen der Hämoglobinmenge in der nach dem Zentrifugieren einer eingefrorenen und aufgetauten Blut-EES-Mischung erhaltenen oben stehenden Lösung,

2.) durch Messen der Gesamtmenge an Hämoglobin in der Blut-HES-Mischung vor dem Einfrieren,·

3.) durch Abziehen des Wertes der Stufe 1.) von demjenigen der Stufe 2.) und

4-.) durch Umrechnen des Wertes der Stufe 3·) in den Prozentsatz des Gesamthämoglobins,

ermittelt wird.

Das Volumen an dem Blut vor dem Einfrieren zugesetzter EES- oder HPS-Löeung wird vorzugsweise im Vergleich zu den Voliaien z^z

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Blutes klein gehalten, um eine übermässige Verdünnung des Blutes zu vermeiden. ·

Gesamtblut, das ein geeignetes Antikoagulans, z.B. AGl), enthielt, wurde zur Abtrennung der roten Zellen von dem Plasma zentrifugiert. Das Plasma würde entfernt und durch eine Ö,9Soige Natriumchloridlösung, die eine zur Erzielung einer Regenerierung der roten Zellen in vitro nach dem Einfrieren und Auftauen von 90% oder mehr '<- wie in Beispiel 4 beschrieben ■- ausreichende Menge an HES oder HPS enthielt, ersetzt.

Zur Kontrolle der Eigenviskosität und des Substitutionsgra.des können die verschiedensten Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann· das durchschnittliche Molekulargewicht der Hydroxyäthyl- oder Hydroxypropylstärke durch Messen der Eigenviskosität (I.V.) der Stärke während der Hydrolyse bis zu einem bestimmten Endpunkt kontrolliert werden. Die Eigenviskosität ist durch die folgende Gleichung definiert: .

^η._Λ«^>ι,Λ^^+7τ η \ In t-Lösung/t-Lösungsmittel Eigenviskositat (I.V.) =

Darin bedeuten t-Lösung und t-Lösungsmittel die Fliesszeiten der Lö-Bung bzw. des Lösungsmittels, gemessen in einen Viskosi meter. Die Lösung war 0,8'+_ 0,1%ig an Stärke in 1n NaOH, das als Lösungsmittel diente. Die Fliesszeiten wurden in einem Ubellohde-Viskosimeter bei 25»O ;f 0,2⁰C gemessen. Die genaue Stärkekonzenträtion wurde durch Messung der optischen Drehung der Lösung nach der folgenden Gleichung ermittelt:

% Stärke (g/100 αϊ; QE χ 0,61

Darin bedeutet OR die optische Drehung in Grad bei 20 bis unter Verwendung der Natrium-D-Linie und eines 10 cm-Polarimater

rohres.

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Der Substitutionsgrad (DS) kann durch Umsetzung mit Jodwasserstoffsäure ermittelt werden. Die Hydroxyalkylgruppen werden quantitativ in Äthylen und Äthyljodid (oder Propylen und Isopropyljodid) umgewandelt, die ihrerseits durch Umsetzung mit Brom bzw. Silbernitrat bestimmt werden. Das angewendete Verfahren ist von P.W. Morgan in "Industrial and Analytical Chemistry", Analytische Auflage 18, Seiten 500 bis 504 (1946), beschrieben.

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Es ist bekannt, dass Hydrozyäthylstärke (HES)/andere Polysaccharide (z.B. Dextran) die Blutkoagulation nachteilig beeinflussen, wenn sie in einer hohen Konzentration vorhanden sind (vgl. z.B. A.A. Garzon et al, SURGERY, 62, 670, 1967). Da ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin besteht, dass das konservierte, eingefrorene Blut ohne Herauswaschen der FES (oder HPS) verabreicht werden kann, ist es höchst erwünscht, dass die als Kryoschutz verwendete HES aus dem Körper schnell entfernt wird, um die Zeit der hohen Konzentration der HES in dem Blut minimal zu halten oder zu unterdrücken. Es wurde festgestellt, dass dies dadurch erzielt werden kann, dass man die Hydroly se ge schwindigkeit der HES in vivo erhöht, den Substitutionsgrad erniedrigt. Dies kanu auch dadurch erzielt v/erden, dass man das durchschnittliche Molekulargewicht der HES erniedrigt und die Eigenviskosität erniedrigt. Die Grenze für den Substitutionsgrad und die Eigenviskosität für die wirksame Kryokoncervierung wurde, wie nachfolgend beschrieben, bestimmt.

Die wie oben b eschrieben hergestellte HES wurde zu ACD-Kenschenblut zugegeben unter Bildung von HES-Endkonzentrationen von 12, 15 ⁿJiid 20 Gew./Vol.%. Diese Konzentrationen wurden dadurch erreicht, dass man die folgenden Mengen von (A) 40% HES in 0,9%igem Natriumchlorid und (B) ACD-Blut zur Erzielung von 55 ml Mischung miteinander mischte.

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HES-Endkonzentration

2039182	,5
38	,4
34	,5
27

16,5 20,6

20% 27,5

Nach 20-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde die HEE/ACD-Blut-Kischung in einen Linde-IIOml-Aluminium-Blutbehälter Y~wie er von G.F. Doebbler et al in "TRANSFUSION"., 6, 104 (1966) beschrieben ist_7 gebracht. Der Behälter wurde durch Eintauchen in eine PVP-Methanollösung (vgl. die oben genannte Doebbler-Literatursteile) mit PVP beschichtet und durch 2-oinütigr;s Schütteln in flüssigem Stickstoff mit einer Geschwindigkeit von 200 UpH eingefroren. Durch 1,5-minütiges Schütteln in einem Wasserbad von 45°C mit einer Geschwindigkeit von 150 Mph wurde es dann wieder aufgetaut.

Das aufgetaute Blut wurde auf die Erythrozytenregenerierung (ER) und obenstehendes Hämoglobin (SE),wie in Beispiel 5 beschrieben, untersucht. Der Hämoglobingehalt (Hb) wurde nach der Cyanmethämoglobin-IIethode bestimmt. Die Stabilität in einer Salzlösung (SS) wurde durch Verdünnen des Blutes in 100 Volumenteilen einer 0,9%igen Hatri^mchloridlösung, Zentrifugieren, Messen des obenstehenden Hämoglobins und Umrechnen in den Prozentwert Gesamthämoglobin in der Blutprobe bestimmt.

Die Werte für ER, SH und SS geben die Qualität des eingefrorenen Blutes an. Gut konserviertes Blut hat einen niedrigen SH- und einen hohen ER- und SS-Wert. ♦ .'

Der Einfluss des Substitutionsgrades (DS) auf die Kryoschutzwirkung der HES ist in der folgenden Tabelle I wiedergegeben.

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T a belle

(I.V. » 0,15; Konzentrationen: 12%, 15%, 20%; die 15%-Werte stehen in runden, die 20%-

Werte in eckigen Klammern)

DS	SH	302	(mg %)	97,2	•	ER (50	SS	*>	/"7^,9	J
0,75	492	(244) /3147	95,7	(97,D /~95,5_7	87,3	(85,1)
0,61	364	(232)	97,1	(97,4)	72,6	(90,8)	/~82,9	J
0,36	472	(371) ^"1446_7	96,0	(96,3) Γ77,6 J	89,0	(89,5)
0,30		(366)	(96,3)	69,8	(89,7)
0,00	(1500)	(83,2)		(61,1)

Es wurde gefunden, dass die HES mit einem DS innerhalb des Bereiches von 0,30 bis 0,75 eine gute Kryoschutzwirkung aufwies, vorausgesetzt, dass die Konzentration in dem 12 bis 15%-Bereich die richtige Höhe aufwies. Reine Stärke (HES mit einem DS-wert von 0,00) hatte eine geringe Kryoschutzwirkung.

Der Einfluss der Eigenviskosität (I.V.) auf die Kryoschutzwirkung der HES ist in der folgenden Tabelle II dargestellt.

T ab e 1 1 e II

(DS = 0,75; Konzentrationen 12%, 15%; die 15%-Werte sind in Klammern angegeben) ; , .

I.V.	, SH	(mg %)	ER	(%)	SS	(%)
0,15	302	(244)	97,2	(97,1)	87,3	(85,1)
0,114	412	(292)	96,2	(96,9)	70,5	<84,6)
0,08	494	(378)	95,2	(96,0)	33,7	(35,2)
0,049	1240	(712)	88,4	(91,8)	28,2	(25,0)

Es wurde gefunden, dass bei eine:? Eigenviskosität (I.V.) von 0,114 oder höher eine gute Kryoschutzwirkung erzielt wurde, dass jedoch eine I.V. von 0,08 oder weniger schlechte Ergebnisse lieferte.

» . ·
Die vorstehend beschriebenen Versuche zeigen,dass eine I.V. von etwa 0,11 und ein DS von etwa 0,30 die unteren Grenzen für eine wirksame Kryoschutzwirkung der HES für Blut darstellen. Die optimalen HES-Konzentrationen variieren - wie in der Tabelle I dargestellt ist - zwischen 12 und 15%, D? nach der I.V. und dem DS.

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Claims

1. Verfahren zur Einfrierkonservierung von Erythrozyten zum nachfolgenden Aufrauen und Verabreichen an Menschen, bei dem lebensfähige Erythrozyten in einem wässrigen Medium eingefroren werden, dadurch gekennzeichnet, dass man in das wässrige Medium vor dein Einfrieren der Erythrozyten hydrolysierte Stärke in einer die Erythrozyten schützenden Konzentration einarbeitet, wobei man als Stärke eine wachsartige Stärkeverbindung auf Basis von Amylopectin mit einem Äthergruppen-Substitutionsgrad von weniger a3.3 0,50 und mehr als 0,20 pro Mol Glukose mit einer Eigenviskösität bei 25°C von 0,11 bis 0,27 dl/g mit Hydro:xyäthyl- oder Hydroxypropylgruppen als Äthersubstitutionsgruppen verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Stärke mit einem Äthergruppen-Sübstitutionsgrad von 0,25 "bis 0,45 pro Mol Glukose verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete wässrige Medium mindestens teilweise aus Plasma be steht.

4-, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Erythrozyten und das verwendete wässrige Medium Komponenten von Gesamtblut sind.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stärke mit einer Eig<
0,17 dl/g verwendet wird.

eine Stärke mit einer Eigenviskosität bei 25°C von 0,13 bis

6. Verfahren zur Einfrierkonservierung von Erythrozyten zum anschliessenden Auftauen und Verabreichen an Menschen, bei dem lebensfähige Erythrozyten in einem wässrigen Medium eingefroren werden, dadurch gekennzeichnet, dass in das wässrige Medium vor dem Einfrieren der Erythrozyten eine hydrolysierte verätherte

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Stärke in einer die Erythrozyten schützenden Konzentration eingearbeitet wird, wobei als Stärke eine hauptsächlich aus Amylopectin bestehende wachsartige Starke mit einem Äthergruppen-Substitutionsgrad von weniger als 0,50 und mehr als 0,20 pro

Mol Glukose und einer Eigenviskosität bei 25°C von 0,11 bis 0,27 dl/g mit Hydroxyäthyigruppen als Äthergruppen verwendet vird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stärke mit einem Äthercruppen-Substitutionsgrad von 0,25· bis 0,45 pro Hol Glukose verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete wässrige Medium mindestens teilweise aus Plasma besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Erythrozyten und des verwendete wässrige Medium Komponenten von Gesamtblut sind.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stärke mit einer Eigi
0,17 dl/g verwendet wird.

eine Stärke mit einer Eigenviskosität bei 25°C von 0,13 bis

r11. Eingefrorenes menschliches Gesantblut, dadurch gekennzeichnet, dass es 13 bis 17 Gevr./Vol.So einer hydrolysieren verätherten Stärke enthält, die ein«* hauptsächlich aus Amylopectin bestehende wachsartige Stärke mit einer Eigenviskosität bei 2y C von 0,11 bis 0,27 dl/g und nit einen Äthergruppen-Substiturior.sgrad von weniger als 0,50 und mehr als 0,20 pro Hol Glukose mit Hydroxyäthyl- oder Hydroxypropylgruppeη als Äthersubstitutionsgruppen darstellt, und dass das Blut nach dem Auftauen ohne Entfernung der Stärke an Menschen verabreicht werden kann.

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12. Gesamtblut nach Anspruch 11, 'dadurch gekennzeichnet» dass die Stärke einen Äthergruppen-Substitutionsgrad von 0,25 bis 0,4-5 pro Mol Glukose, aufweist.

13. Gesamtblut nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke in einer Menge von 14 bis 15 Gew./Vol.% vorhanden ist.

Eingefrorenes menschliches Gesamtblut, dadurch gekennzeichnet, dass es etwa. 13 bis etwa 1? Gew./⁷VoI.% einer hydrolysierten verätherten Stärke enthält, die eine hauptsächlich aus Amylcpectin bestehende wachsartige Stärke mit einer Eigenviskosität bei 25°C von 0,11 bis 0,27 dl/g "und einem Äthergruppen-Substitutionsgrad von veniger als 0,50 und mehr als 0,20 pro Mol Glukose mit Hydroxyäthylgruppen als Äthersubstitutionsgruppen darstellt.

15· Gesamtblut nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke einen Äthergruppen-Substitutionsgrad von 0,25 bis 0,45 pro Mol Glukose aufweist.

16. Gesamtblut nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke in einer Menge von 14 bis 16 Gew./Vol.% vorliegt.

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