DE2039182C3

DE2039182C3 - Gefrorene Blutkonserve

Info

Publication number: DE2039182C3
Application number: DE19702039182
Authority: DE
Inventors: Jon Michael Glendale Calif. Brake
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Current assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1969-08-08
Filing date: 1970-08-06
Publication date: 1985-12-05
Also published as: IT1050113B; DE2039182B2; JPS4928965B1; NL7011085A; GB1279356A; NL164203B; NL164203C; SE395835B; DE2039182A1; CA928215A; FR2068474B1; CH536115A; FR2068474A1

Description

Die Erfindung betrifft eine gefrorene Blutkonserve gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Eine derartige Blutkonserve ist in der Zeitschrift »Science«, Band 157, 1967, Seiten 1312 und 1313, beschrieben. Die zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung verwendeten hydrolisierten verätherten Stärken hatten einen Äthergruppen-Substitutionsgrad von größenordnungsmäßig 0,7 bis 0,9. Wird eine hydrolisierte vcrätherte Stärke mit einem Substitutionsgrad, wie er am Anmcldctag für derartige Blutkonserven additive üblich war, nicht nur zu Laborversuchen, sondern im klinischen Einsatz verwendet, so kann es bei Mchrfachübertragungen von Blutkonserven auf einen Patienten dazu kommen, daß die hydrolisierte vcrätherte Stärke durch Osmose Flüssigkeit aus den Geweben und den flüssigkeitsgefüllten Räumen des menschlichen Körpers anzieht, wodurch es zu einer Überdehnung der Adern, zu einer Erhöhung des Blutdrucks und zu vermehrter Belastung des Kreislaufs kommen kann.

In der US-PS 33 47 745 ist ferner eine gefrorene Blutkonserve beschrieben, welche als die Erythrozyten stabilisierendes Additiv ein hochmolekulares Polymer enthält, z. B. Polyvinylpyrrolidon (PVP). Es ist jedoch anerkanntermaßen unerwünscht, PVP in den Blutkreislauf einzuführen, da diese Substanz, zumindest ihre Fraktionen mit höherem Molekulargewicht für lange Zeit im Körper verbleiben. Damit das Blutkonservenadditiv nicht in die Zellen eindringt, muß es ein Polymer mit einer verhältnismäßig langen Kettenlänge sein, weshalb man bisher annahm, daß alle nicht in die Zellen eindringenden Blutkonservenadditive unerwünschterweise lange im Körper zurückgehalten werden.

In der US-PS 33 47 745 ist ferner auch Dextrose als Blutkonservenadditiv angegeben. Dextrose wird aber genauso wie gewöhnliche Stärke oder andere Polysaccharide von Blutamylasen eingegriffen. Üblicherweise werden aber Blutkonserven, insbesondere Gesamtblut, in Gegenwart derartiger Amylasen eingefroren.

Ausgehend von dem eingangs beschriebenen und im Oberbegriff des Anspruchs 1 berücksichtigten Stand der Technik soll durch die vorliegende Erfindung eine Blutkonserve angegeben werden, bei der einerseits durch das Einfrieren und Wiederauftauen entstehende Qualitätsminderungen ausgeräumt sind, bei der aber zugleich auch eine unerwünschte Volumenvergrößerung nach der Einführung in den Blutkreislauf nicht auftritt.

Ausgehend von dem im Oberbegriff des Anspruchs 1 berücksichtigten Stand der Technik ist disse Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die im Kennzeichen des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale.

s An sich wäre zu erwarten, daß mit abnehmenden Substitutionsgrad der hydrolisierten verätherten Stärke (dieser wird nachstehend mit DS abgekürzt) die Stabilität der Blutkonserve in salzigem Milieu abnehmen sollte. Diese Stabilität in salzigem Milieu, die

ίο nachstehend mit SS abgekürzt wird, läßt sich z. B. durch Verdünnen des aufgetauten Blutes mit 0,9%iger Natriumchloridlösung, durch anschließendes Zentrifugieren und Messen des obenstehenden Hämoglobins experimentell ermitteln. Eine schlechte Beständigkeit der Blutkonserve in salzigem Milieu bedeutet bekanntlich ein Aufbrechen von Blutkörperchen, was zu Nierenschäden und Vergiftungserscheinungen führen kann und somit auf jeden Fall vermieden werden muß.
Überraschenderweise ist nun bei der erfindungsgemäßen Blutkonserve, welche eine hydrolisierte verätherte Stärke mit verhältnismäßig geringem Substitutionsgrad enthält, nicht nur die Stabilität der Blutkonserve in salzigem Milieu SS, sondern auch die nachstehend durch ER abgekürzte Regenerierung der Erythrozyten und der nachstehend mit SH abgekürzte Wert für obenstehendes Hämoglobin ausgezeichnet Dies sei anhand der nachstehenden Tabelle veranschaulicht, welche Meßergebnisse an Blutkonserven darstellt, die 15¹Vb Hydroxyäthylstärke mit einer Eigenviskosität von

w 0.15 dl/g enthielten.

DS	SH	ER	SS
	(mg %)	(%)	(%)
35 0,75	244	97,1	85,1
0,61	232	97,4	90,8
0,36	371	96,3	89,5
0,30	366	96,3	98,7
40 0,20	407	95,3	84,1
0,099	348	95,7	79,2
0,00	1500	83,2	61,1

Durch die erfindungsgemäße Auswahl einer hydrolisierten verätherten Stärke wird aber auch eine drastische Verminderung der zum Abbau der Stärke im Blutkreislauf erforderlichen Zeitspanne erhalten, was für eine häufig aufeinanderfolgende Zufuhr von Blutkonserven im Hinblick auf ein Geringhalten der Osmose sehr wichtig ist. Dies kann der nachstehenden Tabelle entnommen werden, welche Meßergebnisse an Blutkonserven mit Hydroxyäthylstärke mit einer Eigenviskositäl von 0,19 dl/g wiedergibt, wobei die Konzentrationsangaben in % der Ausgangskonzentration zur Zeit / ·>= 0 angegeben sind.

(Stunden)

Substitutionsgrad
0,73

Konzentration der Hydroxyäthylstärke im Serum

0,35

1
24

48

72

96

168

54

22

15

13

14
0

Das zur Durchfahrung der Erfindung bevorzugt verwendete Ausgangsmaterial ist eine wachsartige Stärke in Körnchenform. Es kann z.B. wachsartige Milo(Sorghum)-Stärke. wachsartige Maisstärke oder wachsartige Reisstärke verwendet werden. Diese wachsartigen Stärken bestehen hauptsächlich aus Amylopectin mit einem geringeren Gehalt an Amylose. Die erfindungsgemäß verwendbaren wachsartigen Stärken enthalten vorzugsweise 90 oder mehr Gewichtsprozent Amylopectin. Es können auch vorgelatinierte, wachsartige Stärken verwendet werden, es hat sich jedoch herausgestellt, daß es zweckmäßig ist, die Stärke unmittelbar vor oder gleichzeitig mit der Hydrolyse zu gelatinieren. Das heißt mit anderen Worten, daß die Gelatinierung und die Hydrolyse eine kontinuierliche Bearbeitimgsslufe darstellen können. Wachsartige Stärken, die beim Kochen dünnflüssig werden, sind besonders geeignet, z. B. solche mit Fluiditätswerten (Beweglichkeiten) von 85 oder darüber. Es ist natürlich klar, daß das Stärkeausgangsmaterial eine wesentlich höhere Eigenviskosität aufweist als das gewünschte Endprodukt nach der Hydrolyse.

Bei den nicht vorgelatinierten Stärken erfolgt bei den Säurehydrolysierbedingungen eine wirksame Vervollständigung der Gelatinierung. Nach der Gelatinierung wird die Stärke säurehydrolysiert, um ihre Eigenviskosität herabzusetzen. Die Gelatinierung und die Hydrolyse der Stärke werden in einer wäßrigen Suspension durchgeführt Die Konzentration der Suspension an Stärke ist nicht besonders kritisch-geeignete Verhältnisse von Stärke zu H₂O liegen innerhalb des Bereiches von etwa 0,65 bis etwa 0,75, bezogen auf eine Gewichtsbasis. Die Suspension weist vorzugsweise einen niedrigen sauren pH-Wert auf, z.B. einen pH-Wert zwischen 2.0 und 3,0. Der pH-Wert kann mit verschiedenen Säuren, z.B. Chlorwasscrstoffsäure, Schwefelsäure usw., eingestellt werden. Die Hydrolysegeschwindigkeit hängt von der Temperatur ab. Eine geeignete Temperatur liegt innerhalb des Bereiches von 85 bis 95°C Die Hydrolyse läuft vorzugsweise so langsam ab. daß ihr Verlauf analytisch verfolgt werden kann, wodurch es möglich ist, die Hydrolyse an dem gewünschten Endpunkt zu beenden. Durch Entnahme einer Reihe von Proben während des Ablaufs der Hydrolyse kann die zur Vervollständigung der Hydrolyse erforderliche Zeit durch Extrapolation mit ziemlich guter Genauigkeit ermittelt werden.

Zur Bestimmung der Eigenviskosität können die verschiedenen bekannten Verfahren angewendet werden. So kann beispielsweise die in Deziliter (dl) pro Gramm (g) angegebene Viskosität durch die Fließzeit in einem Ubellohde-Viskosimeter gemessen werden und die gemessene Viskosität kann für die gemessene Konzentration nach der optischen Rotations- oder der Anthron-Colorimeter-Methode korrigiert werden. Die Einzelheiten der geeigneten analytischen Verfahren gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der einzelnen Durchführungsbeispiele hervor.

Der Hydrolysegrad bestimmt die Eigenviskosität des Endprodukts. Es ist deshalb ratsam, den Viskositätsendpunkt der Hydrolysestufe vorher festzulegen. Die Endviskosität sollte nicht mehr als 0,27 dl/g bei 25° C und vorzugsweise nicht mehr als 0,24 bis 0,25 dl/g bei 25°C betragen. Das hydrolysierte Produkt sollte seinen Stärkecharakter beibehalten und nicht zu Dextrinen oder niedrigeren Polysacchariden hydrolysiert werden. Der Stärkecharakter des Produkts wird aber beibehalten bis zu Viskositäten von herunter bis zu 0,07 bis 0,10 dl/g bei 25° C, wobei jedoch eine Hydrolyse auf unter 0,11 dl/g bei 25°C gewöhnlich nicht erwünscht ist Die maximalen Vorteile werden erfindungsgemäß bei einem optimalen Bereich der Eigenviskosität von 0,13 bis 0,17 dl/g bei 25° C erzielt

Die Stärke wird entweder vor oder nach der Hydrolyse durch Umsetzung mit Äthylen- oder Propylenoxyd, vorzugsweise mit Äthylenoxyd, veräthert Die Veretherung sollte unter basischen pH-Bedingungen durchgeführt werden, da die Anwesenheit von Alkali, z. B. Natriumhydroxyd, die Verätherungsreaktion fördert Die Veretherung kann bei einem pH-Wert von etwa 11 bis etwa 13 bei einer Alkalikonzentration von etwa 8 bis 10% — bezogen auf die Slärkefcslstoffc - durchgeführt werden. Die Temperatur der Keiiktionsmischung wird während der Veretherung vorzugsweise wesentlich niedriger als während der Hydrolyse gehalten. Die Veretherung kann zwar bei Temperaturen innerhalb des Bereiches von 35 bis 70°C durchgeführt werden, die Temperatur der Verätherungsstufe sollte jedoch so gewählt werden, daß die Veretherung gefördert und der gewünschte Substitutionsgrad erzielt wird, ohne daß sich dabei die Eigenviskosität der Stärke wesentlich ändert Die Hydrolyse der Stärke während der Veretherung sollte vernachlässigte · klein gehalten werden.

In der Verätherungsstufe kann die gleiche Konzentration an Stärke in der Suspension wie in der Hydrolysestufe verwendet werden. Infolgedessen kann nach Beendigung der Hydrolyse die Reaktionsmischung für die Veretherung durch Abkühlen und Zugeben von Natriumhydroxyd oder einem anderen Alkali hergestellt werden. Vorzugsweise wird die Stärke jedoch vor der Hydrolyse veräthert Es wurde gefunden, daß durch

j5 diese Reihenfolge die Bildung von gefärbten Nebenprodukten stark herabgesetzt werden kenn, und deshalb sind zur Herstellung eines weißen Produkts oder einer farblosen l-osung weder Behandlungen mit Natriumbisulfit noch mit Aktivkohle erforderlich.

Das verätherte und hydrolysierte Produkt kenn zur Entfernung von Glykol und anderen Nebenprodukten gereinigt werden. Beispielsweise kann Äthyicnglykol oder Propylcnglykol durch Extraktion mit Aceton entfernt werden, oder das Produkt kann durch Dialyse gereinigt werden. Das gereinigte Material enthält vorzugsweise nach dem Trocknen weniger als 0,5 Gewichtsprozent Glykol. Das Produkt kann nach bekannten Verfahren, beispielsweise durch Trocknen in der Trommel oder durch Sprühtrocknen, in ein trockenes Pulver umgewandelt werden.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Blutkonserve braucht die hydrolisierte verätherte Stärke nur in das Gesamtblut oder in das wäßrige Medium, in dem die Erythrozyten suspendiert sind, in einer ausreichenden Konzentration eingearbeitet zu werden, so daß die Erythrozyten während des Einfrierens und Auftaucns geschützt sind. Die dabei verwendete Menge ist nicht kritisch, es muß jedoch eine erreichende Konzentration vorliegen, welche die Schut/wirkung ausüben kenn.

De jedoch das Blut oder die Erythrozyten ohne vorherige Entfernung des Stärkcschutzmitiels verabreicht werden sollen, verwendet man vorzugsweise eine minimale Menge an Stärke, die gerade noch die Erythrozyten optimal oder praktisch vollständig schützt. Die optimale Menge variiert je nachdem, ob man das kryogene Verfahren auf das Gesamtblut anwendet oder ob die Erythrozyten abgetrennt worden sind, die in einem wäßrigen Medium entweder in der

gleichen oder einer anderen Konzentration als in dern Gcsainlblut vorliegen. Wenn die Erythrozyten vor dem Einfrieren mit einer Zentrifuge abgetrennt werden, sollten sie in einem geeigneten wäßrigen Medium, z. B. einer sterilen normalen Kochsalzlösung wieder suspendiert werden. Das das Stärkeschutzmittel enthaltende wäßrige Medium sollte mit den Membranen jeder Zelle in Berührung stehen, und dies kann am besten durch eine geeignete Suspension der Zellen in dem das Schutzmittel enthaltenden wäßrigen Medium erzielt werden.

Zum wirksamen Schutz von menschlichem Gesamtblut kann die hydrolisierte verätherte Stärke in einer Konzentration innerhalb des Bereiches von 13 bis 17 Gew7VoL-% verwendet werden. Beispielsweise kann eine Konzentration von 15 g verätherter, hydrolysierter Stärke pro 100 ml des den Zusaf enthaltenden Gesamtblutes verwende! werden. Der optimale Wen liegt bei Gesamtblut bei etwa )4 bis etwa 16 GewyVoL-%.

Wie bereits oben angedeutet, kann die Erfindung auf kryogene Schnelleinfrierverfahren zum Schutz von Erythrozyten angcwcndci werden, wenn die Erythrozyten in Blut oder einem wäßrigen Medium suspendiert sind, wodurch es möglich ist, das Schutzmittel vor dem Einfrieren in das Medium einzuarbeiten. Das sogenannte »Flüssigstickstoff-Linde-Verfahren« zum Schutz von Erythrozyten ist bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben. Vergleiche z.B. P.W. Gikjas, CT. Knorpp, N.W.Thompson, W.R.Merchant in »Proc. Congr. Int Soc. Blood Transfus.«, 10, Stockholm 1964 (Karger, Basel und New York, 1965), Seiten 714 bis 718-, N.W. Thompson, CT. Knorpp, P.W. Gikas, M.A. Tinker, W. R. Merchant ibid, Seiten 719 bis 725,und CT. Knorpp, P. W.Gikas, N.Thompson, »Cryobiology«,2,268(1966).

Ein geeignetes Verfahren zur Druckkonservierung von Blut und Erythrozyten ist in der US-PS 3347 745 beschrieben. Das Blut oder die Erythrozyten werden cuf die bekannte und in den genannten Literaturstellen beschriebene Art und Weise aufgetaut Im Anschluß an das Auftauen ist keine weitere Bearbeitung zur Entfernung eines Teils oder des gesamten Stärkeschutzmittcls erforderlich.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert

Beispiel 1

1560 g einer beim Sieden dünnflüssigen wachsartigen Sorghum-Stärke wurden in 2190 ml Wasser suspendiert und in ein Reaktionsgefäß gegeben, das dünn verschlossen wurde. Dann wurde gerührt und das Reaktionsgefäß wurde zweimal nacheinander evakuiert und mit Stickstoff gefüllt Dann wurden 385 ml 9,2 n-Natriumhydroxyd zugegeben und das Reaktionsgefäß wurde erneut zweimal evakuiert und mit Stickstoff gefüllt. Nach dem Evakuieren auf 63,5 cm Hg wurden aus einem Gaszylinder 100 g Äthylenoxyd mit einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, daß der Druck 0,7 kg/cm² nicht überstieg. Das Reaktionsgefäß wurde durch Durchleiten von 45⁰C warmem Wasser durch den Mantel erwärmt. Nachdem die Temperatur des Reaktionsgefäßes 55° C erreicht hatte, wurde sie 1 Stunde lang bei 45 bis 50°C gehalten. Der erzielte Substitutionsgrad betrug 0,30.

Es wurden 572 ml einer 6,2 n-Chlorwasserstoffsäure zugegeben, eine Probe zur pH-Wert-Messung entnommen und der DH-Wert durch weitere Zugabe von Natriumhydroxyd oder Chlorwasserstoffsäure, je nach Erfordernis, auf 2,0 eingestellt Dann wurde das Reaktionsgefäß mit Wasserdampf bis auf eine Temperatur von 90° C erwärmt In '/2Stündigen Abständen s wurden zur Bestimmung der Eigenviskosität Proben entnommen. Als Verdünnungsmittel für die Messungen kann Wasser verwendet werden. Beim Erreichen der Eigenviskosität von 0,15 dl/g wurde die Reaktion durch Abkühlen des Reaktionsgefäßes mit kaltem Leihingswasser beendet Nach dem Abkühlen auf 30⁰C wurde das Produkt entfernt und unter Stickstoff bei 4°C aufbewahrt

510 ml des obengenannten Sirups wurden mit 153 ml Wasser und 867 ml Aceton 15 Minuten lang gemischt

is Nach 45minütigem Stehenlassen, wobei sich während dieser Zeit 2 Schichten bildeten, wurde die obere, an Aceton reiche Schicht abgehebert Die untere, an hydrolisicrter verätherter Stärke (Hydroxyäthylstärke) reiche Schicht wurde mit 246 ml Wasser und 574 ml Aceton gemischt und 15 Minuten lang gerührt Nach 45minütigem Stehenlassen wurde die obere Schicht abgehebert und die untere Schicht wurde mit 246 ml Wasser und mit 574 ml Aceton 15 Minuten lang gemischt. Nach 45minütigem Stehenlassen wurde die obere Schicht verworfen und die untere Schicht wurde mit 123 ml Wasser und 697 ml Aceton 15 Minuten lang gemischt Nach 45minütigem Stehenlassen wurde die obere Schicht verworfen. Zu der unteren Schicht wurden 400 ml Wasser zugegeben und das restliche Aceton wurde durch 15minütiges Erwärmen auf 80° C in einem Rotationsverdampfer unter einem Vakuum von etwa 50,8 cm Hg entfernt Das dabei erhaltene Produkt wurde bei 4° C aufbewahrt

Beispiel 2 Eine hydrolysierte verätherte Stärke mit einer Eigenviskosität von 0,25 dl/g und einem Substitutions-

grad von 0,36 wurde — wie in Beispiel 1 beschrieben —

hergestellt wobei jedoch die folgenden Änderungen vorgenommen wurden:

a) Anstelle von 100 g Äthylenoxyd wie in Beispiel 1 wurden 180 g Äthylenoxyd verwendet;

b) die Hydrolysereaktion wurde anstatt bei einer Eigenviskosität von 0,15 dl/g wie in Beispiel 1 bei einem Wert von 0,25 dl/g durch Abkühlen des Reaktionsgefäßes beendet

Beispiel 3

Eine beim Sieden dünnflüssige wachsartige Sorghum-Stärke (238 g) wurde mit 335 ml Wasser und 3,0 ml 1,1 n-HCl in einem mit einem Rührer, einem Tropftrichter, einem Probeentnahmerohr und einem zu einer Wasserstrahlpumpe und einem Stickstofftank führenden Mehrfachhahn versehenen 1-Liter-Harzkolben verrührt. Der Kolben wurde abwechselnd dreimal mit Stickstoff gefüllt und evakuiert. Dann wurde der Kolben iii einem Wasserbad auf 90°C erwärmt. In 30minütigen Abständen wurden Proben entnommen und die Eigenviskosität der Stärke bestimmt. Wenn die durch es Extrapolation errechnete Eigenviskosität 0,15 dl/g betrug, wurde die Reaktion durch Zugabe von 3 ml 1 n-NapH und Abkühlen auf 22° C beendet
Es wurden 55 ml einer 10,2 n-NaOH zugegeben, und

dann wurden durch den Tropftrichter langsam 48 ml Propylenoxyd eingetropfi. Der Kolben wurde auf 62°C erwärmt und 40 Minuten lang bei dieser Toniperaitir gehalten. Anschließend wurden 90 ml 6 n-IICI zugegeben, der Sirup wurde entfernt und unter Stickstoff bei 4⁰C aufbewahrt.

Der Sirup (700 ml) wurde mit 1,21 I Aceton und 210 ml Wasser 15 Minuten lang verrührt. Dann ließ man ihn 1 Stunde lang stehen und die obensichende l'lüssigkcii wurde abgchebcrt. Der Niederschlag wurde mit 3Ji nil Wasser und 875 ml Aceton 15 Minuten lang verrührt. Nach einstündigem Stehenlassen wurde die obenstchcnde Flüssigkeit erneut entferni. Dann wurden zu dem Niederschlag 790 m! Aceton und 334 ml Wasser zugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt. Nach einstündigem Stehenlassen wurde die obenstehende Flüssigkeit abgehebert.

150 ml des Hydroxypropylstärke-Sirups wurden langsam zu 4 I Aceton zugegeben und mit einem Mischer mit hoher Scherwirkung dispergiert. Der Hydroxypropylstärke-Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und 2 Tage lang an der Luft getrocknet. Das dabei erhaltene Produkt (48 g) hatte eine Eigenviskosität von 0,15 dl/g und einen Substitutionsgrad von 0,35.

Dieses Hydroxypropylstärke-Produkt konnte ebenso wie das Hydroxyäthylstärke-Produkt der Beispiele 1 und 2 als Kryoschutzmittel verwendet werden.

Beispiel 4

Die Produkte der Beispiele 1, 2 und 3 wurden mit Wasser verdünnt, so daß eine 40gewVvol.-%ige Lösung von Hydroxyäthylstärke oder Hydroxypropylstärke entstand (die Konzentration wurde durch die optische Drehung [<x]d= 178° bestimmt). Der Natriumchlorid-Gehalt wurde durch Titrieren mit Silbernitrat ermittelt, und es wurde ausreichend Natriumchlorid zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,9 Gew7Vol.-% zu erhalten.

Die Lösung wurde durch ein Ο,β-μ-Millipore-Filter mit einem aufgesetzten Millipore-Vorfilter filtriert. Das Filtrat wurde in Vakoliter-Behältern gesammelt, die evakuiert, verschlossen und 30 Minuten lang bei 240° C in einem Autoklav sterilisiert wurden. Dann waren die Kryoschutzmittel fertig für den Handel, die Lagerung und Verwendung.

Beispiel 5

Gesamtblut, das ein geeignetes Antikoagulans, z. B. ACD, enthielt, wurde mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, die eine Menge des in den oben beschriebenen Beispielen hergestellten Hydroxyäthylstärke oder Hydroxypropylstärke (d.h. 14 bis 16 Gew7Vol.-%) enthielt, die ausreichte, um in vitro eine Regenerierung der roten Zellen nach dem Einfrieren und Auftauen der Blut-Hydroxyäthylstärke-Mischung von 90% oder mehr zu erzielen, gemischt Diese Mischung wurde in einem Metallbehälter in einem Kältebad bei einer Temperatur von nicht mehr als etwa — 100"C unter heftigem Rühren gebracht, so daß die Wärmeübergangsgeschwindigkeit mindestens 3500 kcal pro Stunde pro 0,09 m² Behälteroberfläche betrug. Die Mischung kann hierzu beispielsweise in einen Aluminiumbehälter gegeben und in flüssigem Stickstoff unier Schütteln mit einer Geschwindigkeil von 200 Hin- und llcrbcwcgungcn pro Minute eingetaucht werden. Das eingefrorene Hint wurde Ihm einer Temperatur von etwa - 100"C oder weniger gelagert. Es wurde aufgetaut, indem man es in ein Wasserbad von 45°C brachte und mit einer Geschwindigkeit von etwa 150 UpM rührte.

Die Regenerierung in vitro der roten ZeIlon ist dor IVd/oiiis.iI/ an nicht hainolysierieii l'.ryihru/yion.ilor

1) durch Messen der Hämoglobinmcngc in dor nach dem Zentrifugieren einer eingefrorenen und aufgetauten Blut-Hydroxyäthylstärkc-Mischung erhaltenen obenstehenden Lösung,
2) durch Messen der Gesamtmenge an Hämoglobin in der Blut-Hydroxyäthylstärke-Mischung vor dem

Einfrieren,
3) durch Abziehen des Wertes der Stufe 1) von demjenigen der Stufe 2) und
4) durch Umrechnen des Wertes der Stufe 3) in den

Prozentsatz des Gesamthämoglobins

ermittelt wird.

Das Volumen an dem Blut vor dem Einfrieren

zugesetzter Hydroxyäthylstärke- oder Hydroxypropylstärke-Lösung wird vorzugsweise im Vergleich zu dem

Volumen des Blutes klein gehalten, um eine übermäßige Verdünnung des Blutes zu vermeiden. Beispiel 6 Gesamtbkit, das ein geeignetes Antikoagulans, z. B.

ACD, enthielt, wurde zur Abtrennung der roten Zellen von dem Plasma zentrifugiert Das Plasma wurde entfernt und durch eine 0_r9%ige Natriumchloridlösung, die eine zur Erzielung einer Regenerierung der roten Zellen in vitro nach dem Einfrieren und Auftauen von 90% oder mehr — wie in Beispiel 4 beschrieben — ausreichende Menge an Hydroxyäthylstärke oder Hydroxypropylstärke enthielt, ersetzt.

Zur Kontrolle der Eigenviskosität und des Substitutionsgrades können die verschiedensten Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das durchschnittliche Molekulargewicht der Hydroxyäthyl- oder Hydroxypropylstärke durch Messen der Eigenviskosität der Stärke während der Hydrolyse bis zu einem

• bestimmten Bndpunkt kontrolliert werden. Die F.igcn-5ö viskosität ist durch die folgende Gleichung definier!:

Eigenviskosität = In f-Lösung/f-Lösungsmittcl Konzentration (g/100 ml)

Darin bedeuten /Lösung und /-Lösungsmittel die Fließzeiten der Lösung bzw. des Lösungsmittels, gemessen in einem Viskosimeter. Die Lösung war 0,8 ± 0,1 %ig an Stärke in 1 n-NaOH, das als Lösungsmittel diente. Die Fließzeiten wurden in einem Ubellohde-Viskosimeter bei 25,0±0,2^oC gemessen. Die genaue Stärkekonzentration wurde durch Messung der optischen Drehung der Lösung nach der folgenden

Gleichung ermittelt:

% Stärke (g/100 ml) « OR χ 0,61.

ίο

Darin bedeutet OR die optische Drehung in Grad bei 20 bis 25°C unter Verwendung der Natrium-D-Linie und eines 10-cm-Polarimcterrohres.

Der Substitutionsgrad (DS) kann durch Umsetzung mit Jodwasserstoffsäure ermittelt werden. Die Hydroxyalkylgruppen werden quantitativ in Äthylen und Äthyljodid (oder Propylen und Isopropyljodid) umgewandelt, die ihrerseits durch Umsetzung mit Brom bzw. Silbernitrat bestimmt werden. Das angewendete Verfahren ist von P.W. Morgan in »Industrial and Analytical Chemistry«, Analytische Auflage 18, Seiten 500 bis 504 (1946), beschrieben.

Beispiel 7

l^:.s isi bekannt, daß Hydroxyäthylstiirkc und andere Polysaccharide (/.. B. Dextran) die Bluikoagulation nachteilig beeinflussen, wenn sie in einer hohen Konzentration vorhanden sind (vgl. zum Beispiel A. A. Garzon et al, SURGERY, 62, 670, 1967). Da ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin besteht, daß das konservierte, eingefrorene Blut ohne Herauswaschen der Hydroxyäthylstärke oder der Hydroxypropylstärke verabreicht werden kann, ist es höchst erwünscht, daß die als Kryoschutz verwendete hydrolisierte verätherte Stärke aus dem Körper schnell entfernt wird. Es wurde festgestellt, daß dies dadurch erzielt werden kann, daß man die Hydrolysegeschwindigkeit des Stärkeadditivs in vivo erhöht, den Substitutionsgrad erniedrigt. Dies kann auch dadurch erzielt werden, daß man das durchschnittliche Molekulargewicht der Hydroxyäthylstärke erniedrigt und die Eigenviskosität erniedrigt. Die Grenze für den Substitutionsgrad und die Eigenviskosität für die wirksame Kryokonservierung wurde, wie nachfolgend beschrieben, bestimmt

Die wie oben beschrieben hergestellte Hydroxyäthylstärke wurde zu ACD-Mcnschcnblut zugegeben bei Endkonzentrationen von 12, 15 und 20 Cew JVoI-Vo. Diese Konzentralionen wurden dadurch erreicht, daß man die folgenden Mengen von (A) 40% Hydroxyäthylstärke in 0,9%igem Natriumchlorid und (B) ACD-Blut zur Erzielung von 55 ml Mischung miteinander mischte.

Endkonzentration (A)

an Hydroxyäthylstärke ml

(B)
ml

IO

12% 15% 20% 16,5
20,6
27,5

38,5
34,4
27,5

Nach 20minütigem Stehenlassen bei Raumtempera-

tür wurde die Mischung in einen Linde-110-ml-Aluminium-Blutbehälter, wie er von G. F. D ο e b b I e r et al in »TRANSFUSION«. 6, 104 (1966), beschrieben worden ist, gebracht. Der Behälter wurde durch Eintauchen in eine PVP-Melhanollösung (vgl. die obengenannte Doebbler-Literaturstelle) mit PVP beschichtet und durch 2minütiges Schütteln in flüssigem Stickstoff mit einer Geschwindigkeit von 200UpM eingefroren. Durch l,5minütiges Schütteln in einem Wasserbad von 45°C mit einer Geschwindigkeit von 150 UpM wurde es dann wieder aufgetaut

Das aufgetaute Blut wurde auf die Erythrozytenregenerierung (ER) und obenstehendes Hämoglobin (SH), wie in Beispiel 5 beschrieben, untersucht. Der Hämoglobingehalt (Hb) wurde nach der Cyanmethämoglobin-Methode bestimmt Die Stabilität in einer Salzlösung (SS) wurde durch Verdünnen des Blutes in 100 Volumenteilen einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, Zentrifugieren, Messen des obenstehenden Hämoglobins und Umrechnen in den Prozentwert Gesamthämoglobin in der Blutprobe bestimmt

Die Werte für ER, SH und SS geben die Qualität des eingefrorenen Blutes an. Gut konserviertes Blut hat einen niedrigen SH- und einen hohen ER- und SS-Wert Der Einfluß des Substitutionsgrades (DS) auf die Kryoschutzwirkung der Hydroxyäthylstärke ist in der folgenden Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I Einfluß des Substitutionsgrades auf die Kryoschutzwirkung

(Eigenviskosität = 0,15 dl/g; Konzentrationen an Hydroxyäthylstärke: 12%, 15%, 20%;

die 15%-Werte stehen in runden, die 20%-Werte in eckigen Klammern)

DS	SH	ER	SS
	(mg%)	{%)	(%)
0,75	302 (244) [314]	97,2 (97,1) [95,5]	87,3 (85,1) [74,9]
0,61	492 (232)	95,7 (97,4)	72,6 (90,8)
0,36	364(371)11446]	97,1 (96,3) [77,6]	89,0 (89,5) [82,9]
0,30	472 (366)	96,0 (96,3)	69,8 (89,7)
0,00	(1500)	(83,2)	(61,1)

Es wurde gefunden, daß Hydroxyäthylstärke mit einem Substitutionsgrad im Bereich von 030 bis 0,75 eine gute Kryoschutzwirkung aufweist, vorausgesetzt daß die Konzentration in dem 12- bis 15%-Bereich die richtige Höhe aufwies. Reine Stärke hatte eine geringe

Kryoschutzwirkung.

Der Einfluß der Eigenviskosität (I.V.) auf die Kryoschutzwirkung der Hydroxyäthylstärke ist in der folgenden Tabelle II dargestellt

I 11 12

j? Tabelle II £_{s wur}de gefunden, daß bei einer Eigenviskosität von

l' Einfluß der Eigenviskosität auf die Kryoschutzwirkung 0,114 dl/g oder höher eine gute Kryoschutzwirkung

■L von Hydroxyäthylstärke erzielt wurde, daß jedoch eine Eigenviskosität von

€ (DS = 0,75; Stärkekonzentrationen 12 %, 15 %; die 15 %- 0,08 dl/g oder weniger schlechte Ergebnisse lieferte.

i'i Werte sind in Klammern angegeben) ■> Die vorstehend beschriebenen Versuche zeigen, daß

|: " ; eine Eigenviskosität von ciwa 0,11 dl/g und c'.n

[V '■^v· SH r.K SS Siibstiliilionsgrad von elwa OJO die inneren Gren/en

i' (dl/g) (mg %) (%) (%) für eine wirksame Kryoscluii/wirkimg iler llyilroxy

h äthylstäi'ke für IiIm darstellen. Die opimialen Stärke

κι kon/.eniraliouen variieren — wie in iler Tabelle I dargestellt ist — zwischen 12 und 15%. je nach der Eigenviskosilät und dem Substitu'ionsgrad.

0,15	302	(244)	97,2	(97,1)	87.3	(85.1)
0,114	412	(292)	96,2	(96,9)	70.5	(84,6)
0,08	494	(378)	95,2	(96,0)	33,7	(35,2)
0,049	1240	(712)	88,4	(91,8)	28,2	(25,0)

Claims

Patentansprüche:

1. Gefrorene Blutkonserve, enthaltend menschliches Gesamtblut oder die die Erythrozyten enthaltende Blutfraktion sowie eine hydrolisierte, verätherte Stärke, welche wachsähnliche Konsistenz aufweist, im wesentlichen aus Amylpektin besteht und deren Äthergruppen Hydroxyaryl- oder Hydroxypropylgruppen sind, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrolisierte verätherte Stärke einen Äthergruppen-Substitutionsgrad von weniger als 0,50 und mehr als 0,20 pro Mol Glukose aufweist und bei einer Temperatur von 25" C eine Eigenviskosität von 0,!'. bis 0,27 dl/g hat.

2. Blutkonserve nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Äthergruppen-Substitutionsgrad „von 0,25 bis 0,45 Äthergruppen pro Mol Glukose.

3. Blutkonserve nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine Stärkekonzentration von 13 bis 17 GewyVolumen-%.