DE3007913A1

DE3007913A1 - Verfahren zum einfrieren von biologischem zellmaterial unter benutzung von frierschutzmitteln, die vor dem einsatz des zellmaterials nicht ausgewaschen werden muessen

Info

Publication number: DE3007913A1
Application number: DE19803007913
Authority: DE
Inventors: Horst Prof. Dr.-Ing. 7250 Leonberg Chmiel; Gerhard Dr. 7000 Stuttgart Knaup; Klaus-Dieter Dr. Kulbe
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Laevosan GmbH and Co KG
Priority date: 1980-03-01
Filing date: 1980-03-01
Publication date: 1981-09-17

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren von biologischem
Zellmaterial unter Benutzung von Frierschutzmitteln, die vor dem Einsatz des Zellmaterials nicht ausgewaschen werden müssen.
Derartige Verfahren sind bereits bekannt (vgl. Auslegeschrift 2039182).
Bei diesem Verfahren wird eine Überlebensrate (recovery) der Erythrozyten von 96,3 % erreicht (s. obere Tabelle, Spalte 2). Dieses Ergebnis stellt gegenüber früheren Verfahren bereits eine wesentliche Verbesserung dar. Im Hinblick darauf, daß abgestorbene Zellen das Kapillarbett - insbesondere die MikrokaDillaren der Nieren - verstopfen könwäre jedoch - -nen, jede Verringerung des Anteils nicht lebenstählger Zellen nach Abschluß des Einfrier-Auftauvorgangs erstrebenswert.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, durch Verbesserung des Einfrierverfahrens die Zahl der bei diesem Vorgang irreversibel geschädigten Zellen erheblich zu reduzieren. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen gekennzeichneter 'erfahren gelöst. Auf diese Weise wird eine Verminderung der Anzahl unerwünsohtar Zellfragmente um etwa 50 % erreicht.
Die bisher zur Reinfusion verwendeten Frierschutzmittel verschlechtern die Fließeigenschaften des Blutes und damit die Hämodynamik und zwar umso stärker je höher die Konzentration und das mittlere Molekulargewicht werden. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht deshalb darin, daß durch die Erniedrigung der optimalen Frierschutzmittelkonzentration auf 9 - 12 % (w/v) vorzugsweise 10 - 11 %(w/v) gegenüber dem bekannten Verfahren, bei dem 13 - 17 % (w/v) verwendet werden, eine wesentliche stärkere Annäherung der Fließeigenschaften und damit der Hämodynamik an die physiologischen Verhältnisse des Blutes erreicht wird. In gleicher Richtung wirkt sich die beschriebene Verwendung eines Frierschutzmittels mit deutlich verringertem mittleren Molekulargewicht aus.
Vorteilhafterweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Frierschutzmittel ein Gemisch aus mindestens zwei Komponenten verwendet, z.B. ein Gemisch von Molekulargewi chtsfraktionen pol ydisperser Material ien, vorzugsweise von hydroxyäthyl ierter oder hydroxypropylierter Stärke oder Stärkebestandteilen. Durch Verwendung von niedermolekularen gegenüber den bisher eingesetzten hochmolekularen Hydroxyäthylstärken, die als Plasmaexpander entwickelt wurden, wird eine wesentlich erleichterte Abbaubarkeit und damit eine schnelle Entfernung aus der Zirkulation erreicht. Daraus resultiert eine geringere Kreislaufbelastung des Patienten.
Zur Erzielung der kombinierten intra- und extrazellulären kryoprotektiven Eigenschaften des Gemisches werden zur Gefrierkonservierung von Erythrozyten vorzugsweise Mischungen von Fraktionen mit einem mittleren Molekulargewicht a 40000 D bzw.(10000 D herangezogen. Für das Einfrieren von Thrombozyten und immunkompetenten Zellen wird als niedermolekulare Komponente eine Fraktion mit einem mittleren Molekulargewicht 1000 D eingesetzt. Diese Obergrenzen der Werte haben sich in denvon uns durchgeführten Untersuchungen als optimal herausgestellt. Das gleiche ergibt sich für die Einstellung der Frierschutzmittelkonzentration auf vorzugsweise 10 - 11 % (w/v).
Beispielsweise kann das Verfahren in folgender Weise durchgeführt werden. Dabei sei vorausgesetzt, daß alle Schritte unter sterilen Bedingungen mit sterilen Reagentien und Materialien durchgeführt werden.
440 ml Spenderblut werden in einem Behälter, welcher 110 ml CPD oder ACD-Stabilisator enthält, gesammelt und wenn möglich, in eben diesem Behälter zur Abtrennung des Plasmas und des "buffy-coat" (= Leukozyten und Thrombozyten) zentrifugiert (Plasma, weiße Blutzellen sowie Blutplättchen können für die Isolierung von Plasmaproteinen, Granulozyten-und Thrombozytenkonserven weiterverwendet werden). Ist die Zentrifugation im Sammelbehälter nicht möglich, muß in spezielle Zentrifugengefäne umgefüllt werden.
Nach den vorliegenden Erfahrungen ist das nach dem ersten Zentrifugationsschritt gewonnene E rythrozytenkonzentrat bereits zum Einfrieren ohne weitere Manipulationen verwendbar. Um jedoch das Risiko einer Transfusionshepatitis zu senken, kann sich noch eine zweimalige Waschung der roten Zellen mit physiologischer Kochsalzlösung anschließen.
Nach Einstellen des Hämatokrits im Erythrozytenkonzentrat auf 73 % und Bestimmung dessen Volumens (alternativ: Wägung des Konzentrates) ist dieses für den Einfriervorgang verwendungsfähig.
Das Erythrozytenkonzentrat wird mit einer Stammlösung des Kryoschutzmittels HES im Verhältnis 5:3 (v) gemischt. Die optimale Endkonzentration an Frierschutzmittel ist 9-12 %, vorzugsweise 10 - 11 %. Der Hämatokrit der Mischung liegt bei 43 %.
Das Mischen der beiden Komponenten kann durch einfaches Zusammengeben in dem eigentlichen Sammelbehälter erfolgen. In diesem Fall muß der Behälter zwecks Herstellung einer homogenen Phase in geeigneter Weise mindestens 15 Minuten, vorzugsweise 20 Minuten, bewegt werden.
Danach wird in einen Einfrierbehäl ter umgefüllt.
Der gefüllte und verschlossene Behälter wird in bekannter Weise eingefroren, gelagert und aufgetaut. Hiernach stehen die Proben zur weiteren medizinischen Verwendung direkt zur Verfügung, wenn eine Volumen- und Erythrozytensubstitution indiziert ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Einfrieren von biologischem Zellmaterial unter Benutzung von frierschutzmitteln, die vor dem Einsatz des Zellmaterials nicht ausgewaschen werden müssen, dadurch gekennzeichnet, daß als Frierschutzmittel ein Gemisch von extrnzelluldr und intrazellulär wirkenden Komponenten verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß als Frierschutzmittel ein Gemisch aus mindestens zwei Komponenten verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß als Frierschutzmittel ein Gemisch von Molekulargewichtfraktionen polydisperser Materialien verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß als Frierschutzmittel Äther-substituierte hydrolysierte Stärke oder Stärkebestandteile verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß als Frierschutzmittel Hydroxyäthylstörke verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß als Frierschutzmittel Hydroxypropylstärke verwendet wird.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 - 6 dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus einer traktion mit dem mittleren Molekulargewicht # 40000 und einer Fraktion mit einem Molekuargewicht # 10000 besteht und zum Einfrieren von Erythrozyten ver-wendet wird.
8. Verfahren nach Ansprüchen 1 - 6 dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus einer Fraktion mit dem mittleren Molekulargewicht + 40000 und 4 1000 -besteht und zum Einfrieren von immunkompetenten Zellen und Thrombozyten verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dctß die Konzentration des Frierschutzmittels in der Blutkonserve auf 9 - 12 % eingestellt wird.