DE2127408C3 - Verfahren zur Herstellung leuko cyten und thrombocytenarmer Blutkon serven - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Blutkonserven, deren Leukocyten- und Thrombocytengehalt gegenüber dem von Vollblut erheblich erniedrigt ist.

Es ist bekannt, daß Vollbluttransfusionen zur BiI-dung von Leucocyten- und Thrombocytenantikörpern führen können, wobei eine deutliche Abhängigkeit von der Dosis und den Zeltintervallen zwischen den einzelnen Transfusionen besteht. Besondere Bedeutung kommt dieser F.rscheinung bei Organtransplantationen zu, da die nach Vollbluttransfusionen bereits existierenden Antikörper für die Rejektion des Transplantates verantwortlich sein können. Aus diesem Grunde ist es angezeigt, dem für eine spätere Organtransplantation vorgesehenen Patienten lediglich leukocyten- und thrombocytenarme Blutkonserven zu verabfolgen und auf diese Weise eine Präimmunisierung gegen Gewebe-Antigene weitgehend auszuschließen.

Daneben sind solche Präparationen von Bedeutung für Patienten mit besonderen hämatologisch-serologischen Veränderungen, wie z. B. für polytransfundierte und für anämische Menschen. Auch sind solche Präparationen besonders geeignet für wissenschaftliche Untersuchungen, bei denen Leukocyten und Thrombocyten störende Faktoren sind, z. B. bei der Darstellung von Erythrocytenmembran-Enzymen.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Gewinnung leukocyten- und thrombocytenarmer Blutkonserven bekannt. Einmal können die Leukocyten- und Thrombocytenzahlen durch wiederholtes Waschen von Vollblut mit physiologischer Kochsalzlösung erniedrigt werden. Dieses Verfahren ist jedoch bedenklieh, weil durch das dabei erforderliche wiederholte Waschen und Zentrifugieren eine Schädigung der Erythrocyten eintreten kann. Weiterhin ist bekanntgeworden, daß man die Leukocyten- und Thrombocytenzahl durch Verwendung von Kunststoffiltern reduzieren kann, allerdings nur in heparinisiertem oder mit Ionenaustauscher behandeltem Blut; genauere Analysen haben darüber hinaus gezeigt, daß hierbei im wesentlichen nur die Granulocyten, nicht aber die Lymphocyten entfernt werden. Schließlich ist es bekannt, daß man die Erythrocyten durch Zusatz großmolekularer Substanzen wie Dextran sedimentieren und dadurch gleichzeitig den Leukocyten- und Thrombocytengehalt erheblich vermindern kann.

Es ist bekannt, daß der kritische Wert für den Leukocytengehalt bei etwa 1000Leukocyten je μΐ (0,47 bis 1,0 χ 10⁹ Leukocyten je Transfusionseinheit) liegt, wenn eine Antigen- und -immunwirkung vermieden werden soll (Gert Jensen, K. and Kissmeyer-Nielsen, F.: Progress in Clinical Pathology II, Grüne and Stratton, New York [1969]; Brittingharn, T.E. und Chaplin jr., Blood, 17, 139 [1961]; Dausset, J. et al., Vox Sanguinis, 2, 248 [1957]). Die zuvor beschriebenen vorbekannten Verfahren ermöglichen die Erreichung dieses Grenzwertes entweder überhaupt nicht oder führen in nicht genau reproduzierbarer Weise zu Blutkonserven, deren Leukocytenzahl teils unter, teil über 1000/μί liegt. Es ist deshalb erforderlich, den Leukocytengehalt jeder einzelnen Konserve zu bestimmen und dabei alle diejenigen auszuscheiden, deren Gehalt zu hoch ist. Selbst das beste bislang bekannte Verfahren, nämlich die Sedimentation, führt zu mehr als 20% zu unbrauchbaren Konserven, während durch Adsorption an Kunststoffiltem nicht einmal 50% der behandelten Vollblutkonserven auf den angestrebten Leukocytengehalt von weniger als 1000/μί gebracht werden können.

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein zuverlässiges Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe in reproduzierbarer Weise leukocyten- und thrombocytenarme Blutkonserven mit einer Leukocytenzahl von weniger als 1000/μί und einer 1 hrombocytenzahl von weniger als 20 000/μ1 einfach und schnell hergestellt werden können.

Demgemäß ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung leukocyten- und thrombocytenarmer Blutkonserven, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Vollblut in einem sterilen Behälter mit einem Stabilisator zur Verhinderung der Blutgerinnung sowie mit Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 250 000 versetzt und nach Beendigung der Sedimentation das erhaltene Sediment zur weiteren Reduzierung des Leukocytengehaltes auf einen Wert unter 1000 Leukocyten/μΐ und des Thrombocytengehaltes auf einen Wert unter 20 000/μ1 durch ein Adsorptionsfiltermaterial in Form von Watte aus feinen Natur- und/oder Synthesefasern oder Glasfasern, vorzugsweise aus Polyamidfasern, oder eines Pulvers oder Granulates aus diesen Materialien in einen zweiten sterilen Behälter fließen läßt.

Als Adsorptionsfiltermaterial hat sich Watte aus feinen Polyamidfasern, Polyesterfasern sowie Perfluoräthylenfasern besonders bewährt, wobei die ersteren besonders bevorzugt sind.

Das für die Sedimentation verwendete Dextran kann ein Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 250 000 aufweisen; vorzugsweise liegt das Molekulargewicht bei etwa 60 bis 110000, insbesondere bei etwa 70 000. Als Stabilisatoren zur Verhinderung der Blutgerinnung kommen die bekannten Systeme für Blutkonserven in Frage, insbesondere Stabilisatoren auf Heparinbasis sowie die sogenannten ACD-Stabilisatoren aus Zitronensäure, Zitrat und Dextrose. Besonders günstige Ergebnisse werden durch die Kombination der letztgenannten Stabilisatoren mit Dextran und anschließendes Filtrieren erhalten.

3 4

Der Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens Trinatriumcitrat · 2H₂O 13,2 g

war auf Grund der bisherigen Kenntnisse auf diesem Zitronensäure ⁴'⁴ S

Gebiet äußerst überraschend und in keiner Weise rwtrn«> ¹⁴-⁷S

vorhersehbar. Insbesondere war bekannt, daß eine λ ?-!. i 1000 Oe

Behandlung von ACD-haltigem Vollblut mit einem 5 ^Ac*^{ua bldest}· ^{ad g}

Adsorptionsfiltermaterial zu überhaupt keiner merk- sowie ferner 70,0 ml einer 6% Dextran enthaltenden liehen Senkung der Leukocyten- und Thrombocyten- physiologischen Kochsalzlösung (Dextran mit einem zahl führt, jedoch durch das gleiche Verfahren mit durchschnittlichen Molekulargewicht von 60 000, beheparinhaltigem Vollblut grundsätzlich nur der Gehalt zogen von der Firma KnoU AG, Ludwigshafen) entan Granulocyten, nicht aber der an Lymphooyten io hielt. Das Blut wurde gründlich mit der in der Flasche vermindert werden kann (vgl. T. J. G r e e η w a 11 enthaltenen Lösung vermischt, worauf die Flasche et al., Transfusion, 2, S. 221 bis 229 [1962], insbeson- umgedreht und bei Zimmertemperatur 90 Minuten dere S. 222, rechte Spalte). Nach Sedimentation des lang hängengelassen wurde. Nachdem sich die Erybeispielsweise einen ACD-Stabilisator und Dextran throcyten abgesetzt hatten, wurde das Sediment enthaltenden Vollblutes gelingt es dagegen über- 15 während 45 Minuten über ein Adsorptionsfiltermateraschend, den bereits verminderten Leukocytengehalt rial aus Nylonfasern (Filtermaterial der Firma Fenwal zuverlässig und reproduzierbar auf Werte weit unter Laboratories, Morton Grove, Illinois, USA) in eine 1000/μΙ zu senken, und die Throm'oocytenzahl auf zweite sterile pyrogenfreie Flasche abgelassen. Das einen Wert unter 20 000/μ1 zu bringen, wenn man das filtrierte Sediment wurde mit einem gleichen Volumen bereits vorbehandelte Blut dei an sich bekannten 20 physiologischer Kochsalzlösung versetzt, um das Filtration durch ein Adsorptionsfiltermaterial unter- ursprüngliche Volumen wiederherzustellen. Nach wirft. gründlicher Vermischung des Flascheninhaltes wurden

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Blut- jeweils Proben von 2 ml für die Bestimmung der aufbereitungsverfahrens dient vorzugsweise eine ge- Leukocytenzahl sowie des Gehaltes an Blutplättchen brauchsfertige Ausrüstungskombination; diese Korn- »5 entnommen.

bination besteht aus einem ersten, die erforderliche Zum Vergleich wurden weitere Vollblutkonserven

Menge an Stabilisator- und Dextranlösung enthalten- wie zuvor beschrieben behandelt, wobei jedoch die den sterilen Behälter, einem zweiten leeren sterilen zusätzliche Filtration entfiel.

Behälter sowie einem mit Adsorptionsfiltermaterial Die erhaltenen Ergebnisse sind in den F i g. 1

gefüllten Verbindungsstück für die beiden Behälter, 30 und 2 sowie in der nachfolgenden Tabelle zusammenweiches auch fest mit einem der Behälter, insbesondere gefaßt. Wie die Werte in der Tabelle zeigen, wird mit dem ersten, verbunden sein kann. Die sterilen Behälter Hilfe der Dextran-Sedimentation bereits eine Mindekonnen Kunststoffbeutel sein. rung der Leukocyten und der Blutplättchen um 85%

Mit Hilfe dieser Ausrüstung ist es möglich, auf erreicht; wie jedoch aus F i g. 1 hervorgeht, ist bei einfachste Weise leukocyten- und thrombocytenarme 35 dieser Arbeitsweise nicht sicher, daß eine ausreichende Blutkonserven bei Bedarf herzustellen. Das Vollblut Verminderung der Leukocytenzahl in jedem Einzelfall wird direkt vom Blutspender in den vorbereiteten erreicht wird, denn etwa 20% der Proben liegen oberersten Behälter geleitet, in welchem es mit <iem Stabi- halb des Grenzwertes von 1000 Leukocyten/μΐ. Wenn lisator sowie mit dem Dextran vermischt wird. Nach man dagegen erfindungsgemäß zusätzlich filtriert, so dem Vermischen wird der Behälter umgekehrt auf- *o wird eine Verminderung der Leukocytenzahl um 96 % gehängt und so lange sich selbst überlassen, bis die beobachtet, wobei 48 von 50 Versuchen Leukocyten-Sedimentation abgeschlossen ist; je nach Temperatur zahlen zwischen 50 und 400/μΙ ergaben und nur zwei sind hierfür im allgemeinen etwa 30 bis 120 Minuten Versuche zu einem Gehalt von 650/μΙ, also immer noch irforderlich, wobei die Sedimentationsgeschwindigkeit zu einem weit unter der Grenze liegenden Wert führten, mit steigender Temperatur zunimmt. Anschließend 45 Überraschend ist darübei hinaus, daß die erfindungswird der erste Behälter mit dem sterilen Zwischen- gemäß im Anschluß an die Dextran-Sedimentation stück, welches gleichzeitig das Adsorptionsfiltermate- durchgeführte Filtration über Polyamidfasern nicht rial enthält, mit dem zweiten sterilen Behälter ver- nur die Granulocytenzahl, sondern auch die Lymphobunden, worauf man das Sediment langsam aus dem cytenzahl erniedrigt, was im Gegensatz zu den FiI-ersten in den zweiten Behälter fließen läßt, in welchem 50 trationsversuchen mit heparinhaltigem Vollblut steht sich die fertige Blutkonserve sammelt, wozu mindestens (vgl. die Ergebnisse in der Tabelle sowie T. J. Greenetwa 30 Minuten erforderlich sind. wait, a. a. Ο.).

Von besonderer praktischer Bedeutung ist, daß das Zwar wurde kein nachteiliger Einfluß der Dextran-

erfindungsgemäße Verfahren keine Konserven mit Sedimentation und der Filtration auf die roten Blutzu hohen Leukocyten- und Th^ombocytenzahlen 55 körperchen beobachtet, doch ist eine Aufbewahrung liefert, welche verworfen werden müßten. Besonders der erfindungsgemäß hergestellten Blutkonserven länwichtig ist dies dann, wenn Blutkonserven mit einer ger als 24 Stunden im allgemeinen nicht empfehlensbestimmten Blutfaktorkombination benötigt werden wert. Im Hinblick auf die Leichtigkeit der Herstellung und nur wenige Spender zur Verfugung stehen. ergeben sich hierdurch in der Praxis keinerlei Schwierig-

Zur näheren Erläuterung der Erfindung soll nach- 60 keiten.

folgendes Beispiel dienen: In den Figuren ist jeweils die Zahl der Einzelver

suche gegen die Leukocytenzahl/μΐ aufgetragen.

Beispiel Fig. 1 gibt die Verteilung für 50 Blutkonserven nach

der Dextran-Sedimentation wieder, während F i g. 2

400 ml Blut wurden einem Spender entnommen 65 die Ergebnisse für 50 erfindungsgemäß hergestellte und direkt in eine pyrogenfreie Glasflasche geleitet, Blutkonserven wiedergibt, welche zunächst mit Dexwclche 50,0 ml ACD-Stabilisatorlösung gemäß USP trän sedimentiert und anschließend über Polyamid-XVI B der nachfolgenden Zusammensetzung: fasern filtriert wurden.

Tabelle
Hämatologische Untersuchung von 50 Proben

	Leukocyten/μΐ	Abnahme	Relatives	Verhältnis	Blutplättchen/μΐ	Abnahme
	Mittelwert (Streuung)	der Leuko-			Mittelwert (Streuung)	der Blut
		cyten- zahl	von Lymphocyten (%)	zu Granulocyten (7o)		plättchen zahl
		in«/.				in Vo
Ausgangs	6380 ± 1550				217 140 ± 31 690
werte	(4000 bis 14 000)	—	41 ±7	59 ±7	(127 000 bis 293 000)	—
			(32 bis 51)	(48 bis 69)
Werte nach
der Dextran- ,
Sedimenta	950 ± 380				27 640 ± 11 740
tion	(475 bis 2450)	85,1	55 ± 10	45 ±10	(4250 bis 98 000)	87,2
			(43 bis 78)	(22 bis 57)
Werte nach
der zusätz
lichen Fil	260 ± 110				6840 ± 3150
tration	(50 bis 650)	95,9	70 ±8	30 ±8	(2250 bis 16 000)	96,9
		(54 bis 86)	(14 bis 46)

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung leukocyten- und thrombocytenarmer Blutkonserven, dadurch gekennzeichnet, daß man Vollblut in einem sterilen Behälter mit einem Stabilisator zur Verhinderung der Blutgerinnung sowie mit Dexträn mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 bis 250 000 versetzt und nach Beendigung der Sedimentation das erhaltene Sediment zur weiteren Reduzierung des Leukocytengehaltes auf einen Wert unter 1000 Leukocyten/μΐ und des Thrombocytengehaltes auf einen Wert unter 20 000/μΙ durch ein Adsorptionstiltermaterial in Form von Watte aus feinen Natur- und/oder Synthesefasern oder Glasfasern, vorzugsweise aus Polyamidfasern, oder eines Pulvers oder Granu-Jates aus diesen Materialien in einen zweiten sterilen Behälter fließen läßt.