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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf eine Technik zur Abtrennung weißer Blutzellen
gerichtet, indem diese veranlasst werden, sich in einer Populationsdichte
die größer als
die normale in der Natur auftretende ist, anzusammeln, und auf ein
Verfahren, um eine angereicherte Konzentration in Verbindung mit
einer Gruppierung von Beuteln zu bewirken, die in einem Satz angeordnet
sind, der sowohl den Konzentrationsprozess als auch ein Verfahren
zum Konservieren der weißen
Blutzellen ermöglicht.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Es
ist allgemein bekannt, dass Plazenta/Nabelschnur-Blut (PB) große Anzahlen
hämotopoetischer Stamm-
und Vorläuferzellen
enthält,
die PB ganz besondere therapeutische Fähigkeiten bei der Wiederherstellung
von Knochenmark verleihen, das als Folge von Erbkrankheiten, Unfällen oder
medizinischen Prozeduren beschädigt
ist. Wie in dem Falle einer normalen Sammlung von Knochenmark zur
Transplantation enthält
PB Immunzellen, die potentiell in der Lage sind, spezifische Reaktionen
gegen die Empfänger
derartiger Transplantate zu erzeugen, aber im Gegensatz zu reifen
immunologischen Zellen zeigen diejenigen in PB eine geringere, und
vielleicht wesentlich geringere Tendenz schädigende Immunreaktionen gegen
den Empfänger
zu erzeugen. Das durch die Immunreaktionen des Transplantates gegenüber den
Empfängerzellen
und Geweben erzeugte klinische Syndrom wird als "Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit" (GVHD – Graft
versus Host Desease) bezeichnet. In der typischen klinischen Situation
wird die eigene Immunreaktion des Empfängers gegen das Transplantat
durch Medikamente und Bestrahlungsbehandlungen, die auf die Reduzierung
oder Eliminierung der immunologischen oder anderen hämatopoetischen
Zellen ausgelegt sind, unterdrückt,
um somit die Wirt-gegen-Implantat-Immunreaktion zu vermeiden, die
die Abstoßung
des Implantats bewirken würde.
Es hat sich gezeigt, dass die prinzipiellen Ziele dieser Implantat-gegen-Wirt- und Wirt-gegen-Transplantat-Immunreaktionen
Antigene sind, die durch Gene des HLA-(Human Leukocyte Antigen)-Systems
codiert werden, und dass erfolgreiche Er gebnisse von Knochenmarktransplantationen
von der gemeinsamen Nutzung der HLA-Antigene durch den Spender und Empfänger abhängen. Geschwisterspender,
welche dieselben väterlichen
und mütterlichen
HLA-Gene geerbt haben, die in dem Empfänger vorhanden sind, sind HLA-identisch
und somit unter diesem Gesichtspunkt optimal. Patienten ohne derartige
HLA-identische Geschwisterspender müssen Transplantate von entfernteren
Verwandten oder unverwandten Spendern empfangen. Da das HLA-System verschiedene
diskrete Gene enthält,
wovon jedes eine extrem große
Anzahl antigen-mäßig unterschiedlicher Varianten
in der Population enthält,
muss erwartet werden, dass Transplantate von derartig entfernt verwandten
Spendern oder unverwandten Spendern eine variable Anzahl von HLA-Inkompatibilitäten enthalten,
sofern sie nicht von den möglichen
Spendern ausselektiert werden, und die in jedem vorhandenen spezifischen
Varianten identifiziert und diejenigen Spender ausgewählt werden,
deren HLA-Antigene
mit denen des Empfängers übereinstimmen.
Um diese Auswahl mit einer signifikanten Erfolgswahrscheinlichkeit
auszuführen,
ist es erforderlich, Zugriff auf große Personengruppen möglicher
Spender zu haben, deren HLA-Antigene bekannt sind. In dem Falle
von PB nicht verwandter Spender erfordert dies den Aufbau einer
Bank eingefrorener HLA-typisierter Einheiten, die von zufälligen Plazentas
gesammelt werden. Bisher bestand das am breitesten akzeptierte Verfahren
zum Einfrieren von PB darin, dass der gesamten PB-Einheit ein gleiches
Volumen einer Tieftemperatur- bzw. Cryo-Schutzlösung mit dem doppelten Nachteil
hinzugefügt
wurde, dass das Volumen jeder cryo-geschützten Einheit sehr groß wird,
und dass eine relativ große
Menge von möglicherweise
schädlichen
Cryo-Schutzmitteln schließlich
den Empfängern
derartiger PB-Einheiten
verabreicht wird. Die Verabreichung von Cryo-Schutzmittel und Hämoglobin
aus Erythrozyten, die durch Anwendung eines Gefrier- und Auftauverfahrens
zerstört
wurden, das zum Schutz der Stamm- und Vorläuferzellen, aber nicht der
Erythrozyten ausgelegt ist, kann toxische Effekt im Allgemeinen
und insbesondere an spezifischen Organen, wie z.B. der Niere des
Empfängers
haben. Zusätzlich
besteht die logistische Folge darin, dass eine große Anzahl
von Tiefgefriergeräten
erforderlich ist, um eine nutzbringende Anzahl der großvolumigen
eingefrorenen Einheiten in Reserve zu halten. Die Anmelder haben
ein praktisches Verfahren entwickelt, das eine erhebliche Reduzierung
des Volumens der PB-Einheiten ermöglicht, indem die nicht benötigten reifen
roten Blutzellen und ein äquivalentes
Plasmavolumen beseitigt werden. Diese Anmeldung beschreibt dieses
Verfahren und einen speziell ausgelegten Satz von Kunststoffbeuteln
und Verbindungsschläuchen,
die dafür
gedacht sind, das Erzielen der gewünschten
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Konzentration
der benötigten
Stammzellen und Vorläuferzellen
mit minimaler Manipula tion und Risiko einer Kontamination zu ermöglichen.
Im Wesentlichen ermöglicht
dieses Verfahren, dass ein experimenteller, zeitaufwändiger Laborprozess
zu einer Routineprozedur in Blutbanken wird.
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Die
nachstehende Beschreibung reflektiert den Stand der Technik, dessen
sich die Anmeldung insofern bewusst ist, als diese Dokumente für den Patentprozess
von Bedeutung erscheinen.
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Das
US Patent Nr. 5 118 428 beschreibt,
dass rote Blutzellen (RBCs) aus Vollblutproben entfernt werden können, indem
die Probe mit einer Lösung
in Kontakt gebracht wird, die eine Säure enthält, und indem dann die agglutinierten
RBCs aus der sich ergebenden Lösung
entfernt werden, was eine im Wesentlichen RBC-freie Probe hinterlässt.
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Der
weitere Stand der Technik (Einschließlich Autor, Titel, Datum,
entsprechende Seiten usw. ist Pablo Rubenstein, Richard E. Rosenfield,
John W. Adamson and Class E. Stevens (The Lindsley F. Kimball Research Institute
of the New York Blood Center); Stored Placental Blood for Unrelated
Bone Marrow Reconstitution; May, 1993; gesamter Artikel
US-A-4 004 975 beschreibt
ein Verfahren zur Konzentration von Blutzellen, wobei ein Anticoagulans
enthaltendes Blut zentrifugiert wird, das thrombozytenreiche Plasma
ausgedrückt
wird und die Leukozyten- und Thrombozytenschicht ("buffy coat") plus dem obersten
Teil der roten Zellen entnommen und die Leukozyten- oder Thrombozyten schicht
mit Hydroxyethylstärke
gemischt wird. Nach der Sedimentation wird der Leukozyten-angereicherte Überstand
in Aufbewahrungsbeutel ausgedrückt.
Ein Cryo-Schutzmittel (DMSO)
kann vor dem Einfrieren der Suspension zugesetzt werden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung ist in den beigefügten
Ansprüchen
definiert.
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Die
vorliegende Erfindung ist erstens vorteilhaft, da sie alle oder
nahezu alle Stamm- und
Vorläuferzellen
der ursprünglichen
Sammlung von PB in einem kleinen gleichmäßigen Volumen, das minimalen
und vorhersagbaren Lagerraum benötigt,
zurückgewinnt,
zweitens, weil sie ein konsistentes Verfahren zur Verarbeitung von
PG-Einheiten ermöglicht,
was zu einem routinemäßig zuverlässigen Produkt
mit weniger Abhängigkeit
von der Ausbildung des Personals führt und drittens, weil die
möglicherweise
schädlichen
Auswirkungen des Cryo-Schutzmittels und des freien Hämoglobins
minimiert werden.
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Ein
erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Verfahren,
mittels welchem die weißen
Blutzellen (welche die hämatopoetischen
Stamm- und Vorläuferzellen
enthalten, von der Menge der anderen Komponenten in dem gesamten
PB getrennt werden, und die Art und Weise, in welcher die Lebensfähigkeit
derartiger weißer
Zellen bewahrt wird, indem eine Aussetzung an Bakterien- und Pilz-Kontamination,
potentiell schädigende
chemische Mittel, exzessive Zentrifugalkräfte und osmotische Ungleichgewichte
vermieden wird. Typischerweise tritt eine Bakterien- und/oder Pilz-Kontamination
auf, wenn PB oder aus PB gewonnene weiße Blutzellensuspensionen Umgebungsluft
im Verlauf von Herstellungsmanipulationen ausgesetzt werden; eine chemische
Schädigung
ist möglich,
wenn bestimmte Chemikalien verwendet werden, um die begleitenden
roten Blutzellen zu lösen,
oder weiße
Zellen zu aggregieren; und eine physikalische Schädigung folgt
der Anwendung zu hoher Zentrifugalgeschwindigkeiten bei der Trennung
der zellularen Komponenten des Blutes aufgrund ihrer Dichte durch
Zentrifugalschichtung. Zusätzlich
ermöglicht
das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
eine Vermeidung einer längeren
Aussetzung der abgetrennten weißen
Blutzellen an Kälteschutzlosungen
bei Raumtemperatur, eine Aussetzung, die zu verringerter Lebensfähigkeit
der weißen
Blutzellen und der darin enthaltenen Stamm- und Vorläuferzellen
aufgrund osmotischer Ungleichgewichte und möglicherweise weiterer toxischer
Effekte der intrazellularen Cryo-Schutzmittel selbst führt.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet den Satz miteinander
verbundener Kunststoffbehälter
(welche als Beutel bezeichnet werden). Der Satz der vorliegenden
Erfindung ermöglicht
eine selektive Konzentration der weißen Blutzellen und der darin
enthaltenen Stamm- und Vorläuferzellen,
ohne deren normalerweise hohe Lebensfähigkeit zu reduzieren und frei
von Kontamination durch infektiöse
Organismen aus der Umwelt. Das gesamte PB wird in einem Mutterbeutel
gesammelt und anschließend
durch eine Serie von Beuteln mit geeignetem chemischen Aufbau und
physikalischer Form und Kapazität
verarbeitet, was in einer Lagerung einer abgetrennten Fraktion kulminiert,
die den größten Teil
der weißen
Blutzellen des gesammelten PB's
in flüssigem
Stickstoff bei –196°C innerhalb
eines speziell aufgebauten Gefrierbeutels gipfelt. Zwischeneingriffsschritte
beinhalten die Zusetzung von Substanzen, die die Aggregationsfähigkeit
der roten Blutzellen und die Trennung von Komponenten durch Übertragen
von Überständen in
verbundene Satellitenbeutel verbessern. Ein spezieller Beutel und
seine Verbindungsgruppierung ermöglicht
die Hinzufügung
von abgemessenen Mengen eines Cryo-Schutzmittels zu dem abgetrennten
Konzentrat weißer
Blutzellen. Diese Verbindungsgruppierung ermöglicht die Hinzufügung des
Cryo-Schutzmittels zu den weißen
Zellen bei einer genauen, langsamen Geschwindigkeit, die erforderlich
ist, um die optimale Zellenlebensfähigkeit aufrechtzuerhalten.
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Der
Beutel, welcher zum Einfrieren und Lagern zu verwenden ist, enthält mehrere
verbundene, jedoch abtrennbare Kompartimente/Abteilungen bzw. Abschnitte
zur Aufteilung der weißen
Blutzellen in verschiedene diskrete Kammern. Eine Kammer, der Hauptabschnitt,
ist dafür
vorgesehen, den Großteil
der weißen
Blutzellen aufzunehmen. Eine kleinere Kammer bietet sich zur Lagerung
eines kleineren Anteils der Beutelinhalte an, welche von dem Hauptabschnitt
ohne Auftauen getrennt und für
den momentanen Bedarf davon weggenommen werden kann, um die in dem
entsprechenden Anteil der weißen
Blutzellen enthaltenen hämatopoetischen Stamm-
und Vorläuferzellenpopulationen
getrennten aufzutauen und anschließend in vitro zu expandieren. Eine
dritte und anschließende
Kammer enthält
sehr kleine Restanteile der Suspension der weißen Blutzellen und ist dafür gedacht,
um als abtrennbare Proben zum Testen der Eignung der Einheit zur
Transplantation oder zur Bewertung ihrer Eignung als Spendergewebe
für einen
spezifischen Empfänger
zu dienen. Der Gefrierbeutel enthält auch Beschriftungen auf
der Außenoberfläche seiner
abtrennbaren Bereiche zur Identifikation der spezifischen Einheit,
die darin gelagert wird, um die Lagerung, und das Herausholen aus
bestimmten Sektoren von Cryo-Lagerungsdepots zu ermöglichen.
Es sind auch Mittel in einer Außenoberfläche des
Gefrierbeutels vorgesehen, um die Platzierung und Entfernung des
Gefrierbeutels in und aus seinem zugeordneten Lagerungsplatz durch
automatisierte Geräte
zu ermöglichen.
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AUFGABEN DER ERFINDUNG
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Demzufolge
ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zum
Herstellen von aus PB abgeleiteten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen
in einer neuen und therapeutisch nützlicheren Form bereitzustellen.
Das Produkt wird zu einem Beutel, der eine hohe Konzentration weißer Blutzellen
mit einem hohen Grad an Zellenlebensfähigkeit enthält.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines aseptischen und miteinander verbundenen Beutelsatzes zur Verwendung
in Verbindung mit dem vorgenannten Verfahren.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Gefrierlagerungsbeutels, der dafür konfiguriert, die therapeutische
Dosis in einer cryo-geschützten Umgebung
für längere Zeitdauer
bis zur Notwendigkeit der Verabreichung aufzunehmen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Gefrierbeutels gemäß vorstehender
Angabe, der mit mehreren Abschnitten versehen ist, in welchen die
therapeutische Dosis so verteilt worden ist, sodass verschiedene
Kleinmengen strategisch aus dem Gefrierbeutel für verschiedene Zwecke entnommen
werden können.
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Diese
und weitere Aufgaben werden ersichtlich, wenn die detaillierte Beschreibung
in Verbindung mit den beigefügten
Zeichnungsfiguren betrachtet wird.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein System zur Konzentration
von Blutzellen bereitgestellt, das aufweist:
ein Anticoagulans,
einen
ersten Beutel zur Aufnahme von Blut und des Anticoagulans,
einen
lösbar
mit dem ersten Beutel durch ein Kopplungssystem verbundenen Behälter, der
ein Sedimentationsreagens für
rote Blutzellen enthält,
einen
lösbar
mit dem ersten Beutel durch ein Kopplungssystem verbundenen zweiten
Beutel zum Aufnehmen eines ersten Überstandes des ersten Beutel,
der 80–95%
an weißen
Blutzellen enthält,
die in dem ersten Beutel enthalten sind, nachdem das Blut mit dem
Sedimentationsreagens für
rote Blutzellen vermischt worden ist und nachdem der erste Beutel
bei einer Geschwindigkeit zentrifugiert worden ist, welche hinreichend
ist, um den ersten Überstand
sowie ein erstes Sediment, welches zumindest 90% von den in dem
ersten Beutel enthaltenen roten Blutzellen enthält zu erhalten,
Mittel
zum Absondern von weißen
Blutzellen und Plasmaüberstand
aus dem ersten Beutel und in den zweiten Beutel,
Mittel zum
Trennen von weißen
Blutzellen aus dem Plasma in dem zweiten Beutel,
einen lösbar mit
dem zweiten Beutel durch ein Kopplungssystem verbundenen dritten
Beutel zum Aufnehmen eines in dem zweiten Beutel enthaltenen zweiten Überstandes
aus dem zweiten Beutel, nachdem der zweite Beutel bei einer Geschwindigkeit
zentrifugiert worden ist, die hinreichend ist, um einen zweiten Überstand
und ein zweites Sediment zu erhalten zu erhalten;
einen ein
Cryo-Schutzmittel enthaltenden zweiten Behälter, wobei der zweite Behälter lösbar mit
dem zweiten Beutel durch ein Kopplungssystem zum Einbringen des
Cryo-Schutzmittel
in den zweiten Beutel verbunden ist, und
einen lösbar mit
dem zweiten Beutel durch ein Kopplungssystem verbundenen Gefrierbeutel,
zum Übertragen von
Inhalten aus dem zweiten Beutel in den Gefrierbeutel.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Konzentrieren von weißen
Blutzellen bereitgestellt, die in Plazenta-, Nabelschnur- und/oder
peripheren Spenderblut enthalten sind, wobei das Verfahren das Durchführen der
nachfolgenden Schritte in lösbar
miteinander verbundenen Beuteln unter aseptischen Bedingungen umfasst:
Zuführen des
Blutes zu einem mit einem Anticoagulans versehenen Blutbeutel,
Zuführen von
Sedimentationsreagens für
rote Blutzellen zu dem Blutbeutel aus einem Reagensbeutel,
Zentrifugieren
des Blutbeutels bei einer genauen Geschwindigkeit, um ein erstes
Sediment und einen ersten Überstand
zu erhalten, wobei das erste Sediment zumindest 90% der roten Blutzellen
aufweist, die in dem ursprünglich
gesammelten Blut enthalten sind, und der erste Überstand 80–85% der weißen Blutzellen
aufweist, die in dem ursprünglich
gesammelten Blut enthalten sind;
Ausdrücken des ersten Überstands
in einen Beutel für
weiße
Zellen;
Zentrifugieren des Beutels für weiße Zellen, um ein zweites Sediment
und einen zweiten Überstand
zu erhalten; und
Ausdrücken
des zweiten Überstandes
in einen Plasmabeutel.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGSFIGUREN
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1 ist
eine schematische Ansicht des Beutelsatzes zur Stammzellenverarbeitung
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2 ist
eine detaillierte Ansicht des in 1 dargestellten
Gefrierbeutels.
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3 ist
eine Ansicht ähnlich
der von 2, die das Innere des Gefrierbeutels
darstellt.
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4 ist
ein Flussdiagramm des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
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BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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In
den Zeichnungen, in welchen gleiche Bezugszeichen gleiche Teile
durchgängig
durch die verschiedenen Figuren bezeichnen, bezieht sich das Bezugszeichen 100 auf
eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
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Im
Wesentlichen kann die Vorrichtung 100 als drei Gruppierungen
von Beuteln gesehen werden, welche zusammen einen Beutelsatz definieren.
Die einzelnen Beutel sind mit lösbaren
Verbindungsmitteln versehen, um eine selektierte Zuführung in
die verschiedenen Beutel nur unter aseptischen Bedingungen sicherzustellen.
Die Gruppierungen der Beutel 100 umfassen sechs Beutel:
einen Blutbeutel 100, der eine erste Gruppierung definiert;
einen Reagensbeutel 20, einen Beutel 30 für weiße Zellen,
einen Plasmabeutel 40 und einen Cryo-Schutzmittelbeutel 50,
die eine zweite Gruppierung definieren; und einen Stammzellengefrierbeutel 60, der
eine dritte Gruppierung definiert. Nabelschnurblut (d.h., Blut aus
der Plazenta und der Nabelschnur) wird dem Blutbeutel 10 zugeführt, in
welchem zuvor ein Antikoagulans dosiert wurde. Anschließend wird
die zweite Gruppierung mit dem Blutbeutel 10 verbunden.
Ein Trennungsreagens wird dem Blutbeutel über eine Leitung 26 aus
einem Reagensbeutel 20 zugeführt. Es folgt eine Zentrifugation
des Blutbeutels 10. Die weißen Blutzellen enthaltender Überstand
wird in den Beutel 30 für
die weißen
Zellen gedrückt,
worauf eine weitere Zentrifugation stattfindet. Anschließend wird
das überstehende
Plasma in den Plasmabeutel 40 gedrückt, was sedimentierte weiße Blutzellen
in dem Beutel 30 für
die weißen
Blutzellen zurücklässt. Cryo-Schutzmittel
aus dem Cryo-Schutzmittelbeutel 50 wird über die
Leitung 59 dem Beutel 30 für die weißen Zellen langsam zugeführt. Anschließend werden
die Inhalte des Beutels 30 für die weißen Zellen in den Stammzellengefrierbeutel 60 überführt, welcher
danach eingefroren und in flüssigem
Stickstoff zur anschließenden
Nutzung gelagert wird.
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Insbesondere
und gemäß Bezugnahme
auf 1 wird das gesamte Plazenta- und Nabelschnurblut in
einem Blutbeutel 10 gesammelt, welcher mit einem Antikoagulans,
wie z.B. Citrat, Phosphat und Dextrose (CPD) versehen ist. Es werde
zur Vereinfachung der Erläuterung
angenommen, dass 100 ml Blut in dem Blutbeutel untergebracht werden.
Typischerweise zeigt Nabelschnurblut ein Verhältnis von 1000 roten Zellen
zu jeder "nicht-roten" Zelle (zur Vereinfachung
werde angenommen, dass nicht-rote Blutzellen als weiße Blutzellen
bezeichnet werden können).
Natürlich
umfassen die die im Blut zirkulierenden hauptsächlich erkennbaren und funktionell
erfassbaren Zellen, Erythrozyten, neutrophile, eosinophile und basophile
Granulozyten; B-, T- und nicht-B-, nicht-T-Lymphozyten; Monozyten und Thrombozyten.
Diese reifen Zellen stammen von und werden bei Bedarf von morphologisch
erkennbaren sich teilenden Vorläuferzellen
für die
entsprechenden Verzweigungen, wie z.B. Erythroblasten für die Erythrozyten-Reihe,
Myeloblasten, Promyelozyten und Myelozyten für die Granulozyten-Reihe, und
Megakariozyten für
die Thrombozyten ersetzt. Die Vorläuferzellen stammen von primitiveren
Zellen, die in einfachster Weise in zwei Hauptuntergruppen, Stammzellen
und Vorläuferzellen,
unterteilt werden können.
Natürlich
hat das Blut von Neugeborenen andere Zellularbestandteile, welche
hier nicht diskutiert werden. Der Blutbeutel 10 enthält wenigstens
zwei Zugangsöffnungen.
Eine erste Öffnung 2 nimmt das
Nabelschnurblut auf, wonach die Öffnung 2 versiegelt
wird. Eine typische Versiegelung beinhaltet eine Heißversiegelung,
um Asepsis sicherzustellen. Eine zweite Öffnung 4 ist vorgesehen,
welche mit einer Einstechspitze 22 in Verbindung steht,
die über
eine Leitung 26 mit einem Trennungsreagensbeutel 20 und über eine
Leitung 32 mit dem Beutel 30 für weiße Zellen aus der zweiten Gruppierung
der vorstehend diskutierten Beutel in Verbindung steht. Zusätzlich kann
der Blutbeutel 10 auch mit einem dritten Zugang 6 versehen
sein, welcher ein einfaches Rohr beinhaltet, falls es für erwünscht erachtet
werden sollte, ein Exemplar des Nabelschnurblutes zu lagern, welches
ursprünglich
abgezogen wurde. Der Zugang 6 kann auch alternative Verbindungen
zu dem Beutel 10 bereitstellen.
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Sobald
das Nabelschnurblut in den Blutbeutel 10 eingeführt wurde,
verhindert die Beimischung eines Antikuagolanz, wie z.B. CPD, die
Gerinnung des Plazentablutes und bereitet das Blut für die Beimischung
mit einem in dem Reagensbeutel 20 enthaltenen Reagens vor.
Nach der Zuführung
des Reagens zu dem Blutbeutel und sorgfältigen Vermischen wird der
Beutel mit einer genauen Geschwindigkeit zentrifugiert und der an weißen Zellen
reiche überstand
in den Beutel 30 für
weiße
Zellen ausgedrückt.
Das Reagens ist dafür
gedacht, die Sedimentation der roten Blutzellen zu verbessern, welche
stark durch einen sehr leichten Zentrifugierungsschritt (50 × G × 5 Min.)
beschleu nigt wird. Die Effekte der Zusetzung eines Trennungsmittels
und der Zentrifugation bestehen in der Erzeugung eines Überstands,
welcher 80 bis 95% der weißen
Blutzellen und weniger als 10% der roten Blutzellen des ursprünglich gesammelten
Blutes enthält.
Dieses reduziert das Vorhandensein roter Zellen (im Vergleich zu
weißen
Zellen) um angenähert
90%. In dem Beutel der weißen
Zellen ist nun das Verhältnis
der roten Zellen zu den weißen
Zellen auf angenähert
100:1 reduziert.
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Typischerweise
arbeiten Reagenzien, welche eine effektive Trennung der roten Blutzellen
von den weißen
Blutzellen begünstigen,
auf der Basis von Mechanismen, welche Gegenstand einer gewissen
Spekulation bezüglich
der physikalischen Prozesse oder des Modells, das den Trennungsprozess
beschreibt, arbeiten. Ein Gesichtspunkt begünstigt die Voraussetzung, dass
die Zusetzung des Reagens die dielektrische Feldstärke des
Suspensionsmediums erhöht
und dann dessen Ladungstrennungsvermögen, sodass die Tendenz der
roten Blutzellen in einer gleichmäßigen Verteilung zu verbleiben,
gestört
wird. Eine weitere Ansicht besteht darin, dass die polymerischen
Moleküle
des Reagens sich an zwei oder mehr rote Blutzellen binden, was diese veranlasst,
sich zu aggregieren und charakteristische "Rouleau", d.h., lose Klumpen aus roten Blutzellen
zu bilden, die aufgrund der ebenen Aspekte ihrer scheibenartigen
Oberfläche übereinander
gestapelt sind. Der Effekt besteht jedoch unabhängig von dem physikalischen
Modell, das man sich vorstellt, darin, dass eine Trennung zwischen
den roten und weißen
Zellen mit einer relativ geringen sanften und kurzen Zentrifugation möglich ist.
Diese beschleunigt das Absetzen der roten Zellen und hält die weißen Zellen
in dem suspendierten, unmodifizierten Zustand. In einer bevorzugten
Ausführungsform
liefert, sobald das Reagens aus dem Beutel 20 in dem Blutbeutel 10 untergebracht
wurde, eine Zentrifugation bei 50 G für angenähert fünf Minuten eine effektive Trennung.
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Reagentien,
welche die Ladungsableitungscharakteristik ändern oder die dielektrische
Feldstärke
der Bestandteilskomponenten ändern,
können
aus einem relativ breiten Bereich geeigneter Substanzen ausgewählt werden.
Eine sechsprozentige Konzentration von "Heptastarch" wird derzeit sowohl aufgrund des Wirkungsgrades,
der Kosten und der breit gestreuten Nutzung in der klinischen Blutverarbeitung
bevorzugt. Jedoch könnte
sie durch ähnliche
natürliche
Polymere, wie z.B. Dextrane, Gelatinen, modifizierte oder unmodifizierte
Stärken
oder synthetische Mittel, wie z.B. Polyethylenglykol oder Polyvinyl-Pyrrolidon,
und viele andere abhängig
von den Bedingungen ersetzt werden. Ein ähnlicher Effekt kann auch mit
Substanzen erzielt werden, deren Moleküle sich mit hoher Affinität an zwei
oder mehr roten Zellen anhaften, wie z.B. Antikörper und Lectine. In jedem
Falle wird irgendeines von diesen in dem Reagensbeutel enthaltenen
Cryo-Vorbereitungsreagentien
für die
roten Zellen aus dem Reagensbeutel 20 über den Auslass 24,
durch die Zweigleitung 26 und die in der Öffnung 4 oder
alternativ Öffnung 6 aufgenommnen
Auslassspitze 22, in den Blutbeutel 10 ausgegeben.
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Die
Vermischung des Reagens mit dem Blut in dem Beutel 10 gefolgt
von einer sanften Zentrifugation führt zu einer Trennung, in welcher
der aus Plasma, dem größten Teil
der weißen
Blutzellen und einem kleinen Anteil der roten Blutzellen bestehende Überstand
in den Beutel 30 für
die weißen
Blutzellen über
eine Zweigleitung 32 ausgedrückt wird, die mit der Einstechspitze 22 und
dem Beutel 30 über
einen T-Adapter 34 in Verbindung steht, welcher die Aufteilung
zwischen dem Zweig 26 und Zweig 32 ermöglicht.
Der Großteil
der roten Blutzellen verbleibt in dem Beutel 10.
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Das
angereicherte Gemisch weißer
Zellen wird an dem Eintritt in den Reagensbeutel mittels einer Klammer 28 gehindert,
die funktionell mit dem Zweigkanal 26 in Eingriff steht.
Das in dem Beutel 10 für
weiße Zellen
angereicherte Gemisch weißer
Zellen am Einlass 36 ist nun für eine weitere Verarbeitung
bereit.
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Als
ein Beispiel werde angenommen, dass 100 ml PB ursprünglich in
dem Blutbeutel 10 gesammelt wurden. Eine bevorzugte Ausführungsform
stellt einen Reagensbeutel 20 mit ausreichendem Volumen
an Hydroxyethylstärke
(Heptastarch, Dupont) bereit, um die Hinzufügung eines Volumens von einem
Fünftel
von dem der PG-Sammlung in dem Beutel 10 vorzusehen. In
diesem Beispiel ist ein Fünftel
von 100 ml gleich 20 ml. Typischerweise werden 70 ml (die Reagenslösung enthaltendes)
mit weißen
Zellen angereichertes Überstandsplasma
erzeugt, welches in dem Beutel 30 für weiße Zellen ausgedrückt werden.
Sobald sie hier sind, werden die Inhalte einer weiteren Zentrifugation
bei 400 × G × 10 Minuten)
unterworfen. Typischerweise werden von den 70 ml, die in dem Beutel 30 für die weißen Zellen
eingeführt
wurden, 55 ml in einen Plasmabeutel 40 ausgedrückt, was
angenähert
15 ml eines hoch angereicherten Produktes weißer Zellen im Beutel 30 hinterlässt. Der
in den Beutel 40 übertragene Überstand
enthält
den Hauptteil des Plasmas, Antikoagulans und des Reagens und im
Wesentlichen keine Zellen.
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Der
Beutel 30 für
weiße
Zellen enthält
eine Auslassöffnung 38,
die mit dem Plasmabeutel 40 über eine Zweigleitung 42 mit
einem T-Adapter 44 und einer Verengungseinrichtung 46 in
der Leitung in Verbindung steht. Der Überstand wird aus dem Beutel 30 für weiße Zellen über die
Leitung 42 in den Plasmabeutel 40 über dessen
eigenes Öffnung 48 übertragen.
Sobald der Überstand
in dem Plasmabeutel 40 aufgenommen wurde, wird er versiegelt,
und der Plasmabeutel 40 von dem Beutel 30 für die weißen Zellen
abgetrennt.
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Das
Cryo-Schutzmittel aus dem Cryo-Schutzmittelbeutel 50 wird
anschließend
in den Beutel 30 für
die weißen
Zellen einführt.
Der Cryo-Schutzmittelbeutel 50 enthält einen Auslass 52,
eine Zweigleitung 54 und ein Abschnürungselement 56 auf
der Leitung 54 in Fluidverbindung mit dem Öffnung 38 des
Beutels 30 für
weiße Zellen über einen
T-Adapter 44.
Typischerweise werden 3,8 ml Cryo-Schutzmittel in die in dem Beutel 30 mit den
weißen
Zellen enthaltenen 15 ml zugegeben. Es ist sehr erwünscht, das
Cryo-Schutzmittel
in den Beutel 30 mit den weißen Blutzellen mit einer relativ
langsamen Rate zuzugeben. Typischerweise werden die 3,8 ml Cryo-Schutzmittel
in den Beutel über
ein Intervall von zwanzig Minuten zugegeben, während gleichzeitig das Cryo-Schutzmittel
mit den Inhalten des Beutels für
die weißen
Blutzellen von Hand oder mittels eines Schwenkschüttlers vermischt
wird. Eine bevorzugte Cryo-Schutzmittellösung enthält Dimethylsulfoxyd (DMSO (ein
intrazelluläres
Cryo-Schutzmittel) auf 50% mit Dextran einem extrazellulären Cryo-Schutzmittel
verdünnt. Ein
Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Abschnürungselement 56 festlegt,
dass das intrazelluläre
Cryo-Schutzmittel in den Beutel 30 für die weißen Zellen nur sehr langsam
eintreten kann. Somit steigert das intrazelluläre Cryo-Schutzmittel seine
Konzentration und durchdringt das in dem Beutel 30 für weiße Zellen
enthaltene Gemisch weißer
Zellen ohne einen Schaden an den Zellen zu verursachen. Um dasselbe zu
bewirken, kann (falls die Abschnürung
keine konstante Strömungsrate
erzeugt) eine Dosierungseinrichtung 58 anstelle des Abschnürungselementes 56 in
den Zweig 54 und in Fluidverbindung mit der Öffnung 38 eingefügt werden.
Die Dosierungseinrichtung 58 kann eine Pumpe sein. Alternativ
können
der Cryo-Schutzmittelbeutel und die Pumpenanordnung durch eine Spritze
oder eine andere Dosierungsvorrichtung ersetzt werden, welche die
langsame Zufügung
des Cryo-Schutzmittels zu dem Beutel 30 für die weißen Zellen
ermöglichen.
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Die
physikalische Analogie für
das Cryo-Schutzmittel besteht darin, dass das DMSO die Membrane der
weißen
Zellen durchdringt und die Fähigkeit
des intrazellulären
Wassers reduziert, während
des Einfrierens intrazellulär
zu kristallisieren und eine Beschädigung an den Zellwänden hervorzurufen.
Man glaubt, dass Dextran und andere extrazelluläre Cryo-Schutzmittel, wie z.B.
unterschiedliche Arten von löslichen
Stärken, Proteinen
und Zuckern, extrazelluläre
Schichten um die weißen
Zellen erzeugen, die die Zellen vor der Tendenz des Wassers Kristalle
während
des Einfriervorgangs auszubilden und eine übermäßige extrazelluläre Hyperosmolarität zu entwickeln,
welche beide die Integrität
der Zellwand und zellulare Lebensfähigkeit verringern können, abzuschirmen.
Durch die Bereitstellung des Cryo-Schutzmittels mit einer gemessenen
Rate über
einer relativ langen Zeitdauer wird die Zellenlebensfähigkeit
maximiert, indem reichlich Zeit für die Diffusion des DMSO in
die Zellen und zum Erreichen eines Gleichgewichts über der
Zellenmembrane und für
die homogene Lösung
des Dextrans in dem umgebenden Plasma bereitgestellt wird.
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Als
ein Beispiel der bevorzugten Ausführungsform werden 3,8 ml des
Cryo-Schutzmittels den 15 ml der weißen Zellen in dem Beutel 30 für die weißen Zellen
hinzugefügt.
Diese Hinzufügung
bringt die Konzentration von DMSO auf 10% im Beutel 30.
Der Beutel 30 für
die weißen
Zellen besitzt einen weiteren Auslass 62, welcher eine
Einstechspitze 64 aus dem Stammzellengefrierbeutel 60 in
einer aseptischen Weise aufnimmt. Der Beutel 30 für die weißen Zellen
steht mit dem Stammzellengefrierbeutel 60 über eine
Leitung 66 in Verbindung, die durch eine Klemme 67 kontrolliert
wird. Das cryo-geschützte Gemisch
der weißen
Zellen wird in dem Stammzellengefrierbeutel 60 über die Öffnung 68 aufgenommen.
Die Öffnung 68 ist
besonders dafür konfiguriert,
ein Standrohr zu enthalten, was es ermöglicht, darin eine stehende
Säule des
Stammzellengemisches zur Verteilung in eine Reihe von Abschnitten 70,
wovon jeder von dem Anderen durch Heißsiegelung getrennt ist, festzuhalten.
Diese Proben 70 können
für die
Bestätigung
einer optimalen HLA-Übereinstimmung vor
einer Infusion oder für
andere Tests verwendet werden, sobald eine spezieller Stammzellengefrierbeutel 60 als
für den
vermutlichen Empfänger
geeignet ausgewählt
wurde.
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Der
Stammzellengefrierbeutel 60 ist ferner dadurch gekennzeichnet,
dass er mehrere Kammern innerhalb des Hauptkörpers des Beutels 60 aufweist,
wobei jede Kammer mit Beschriftungen 75 darauf zur Identifikation
der spezifischen Einheit versehen ist, was eine Form einer Überwachungskette
darstellt. insbesondere enthält
der Stammzellengefrierbeutel 60 wenigstens einen ersten
Hauptabschnitt 74 und einen zweiten kleineren Abschnitt 76.
Typischerweise beträgt
das Verhältnis
zwischen dem Hauptabschnitt 74 und dem kleineren Abschnitt 76 80%
(größerer Abschnitt)
und 20% (kleinerer Abschnitt). Diese Abschnitte des Beutels 60 werden durch
eine Heißsiegelung 80 abgegrenzt
und tragen nach dem Füllen
zur Unterteilung des Stammzellengefrierbeutels in zwei unmittelbar
aneinander befestigte, jedoch unabhängige Behälter weißer Zellen bei, sobald die
Heißsiegelungen
an beiden Stellen 82 ausgeführt sind.
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Jeder
Abschnitt befindet sich in Verbindung mit seinem eigenen Auslass.
Der Hauptabschnitt 74 steht mit seiner Öffnung 84 in Verbindung,
während
der kleinere Abschnitt 76 mit seiner eigenen Öffnung 86 in
Verbindung steht. Zusätzlich
kann die Heißsiegelungsstelle
eine Abgrenzungslinie 81 enthalten, welche eine Abreißlinie definiert,
welche die Abtrennung des Hauptabschnittes 74 ermöglicht,
ohne den kleineren Abschnitt 76 aufzutauen. Es wird in
Betracht gezogen, dass die in dem kleineren Abschnitt 76 enthaltenen
Stammzellen anderen Nutzungen zugeordnet werden, wie z.B. zur Erhöhung der
Anzahl der brauchbaren Zellen, indem die Stamm- und Vorläuferzellen
in einem Wachstumsmedium kultiviert werden. Die Stammzellen in dem
Hauptabschnitt 74 bleiben zur Verabreichung als Transplantate
ungestört.
Der Einfrierbeutel 60 und das Standrohr/Öffnung 68 weisen
eine vernachlässigbare
Dicke auf. Der Zweck dieser speziellen Geometrie ist die Sicherstellung,
dass die weißen
Zellen in den Kammern 76, 74 und 70 alle
eine gleichmäßige und
geringe Dicke aufweisen, so dass die anschließenden Einfriervorgänge nahezu
identische kontrollierte Einfrierratenbedingungen erzielen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind angenähert
19 ml therapeutisches Produkt in dem Gefrierbeutel 60 enthalten.
Der Stammzellengefrierbeutel 60 wird stufenweise auf eine
extrem niedrige Temperatur, wie z.B. in flüssigem Stickstoff, zur permanenten
Lagerung abgekühlt.
Dieses hält
die Stammzellen in einem solchen Zustand, dass sie nach dem Auftauen
in großen
Mengen zurückgewonnen
werden und einen hohen Grad an Zellenlebensfähigkeit aufweisen.
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Sobald
festgestellt worden ist, dass die gegebenen Stammzellen innerhalb
eines Gefrierbeutels 60 in einer Transplantationsprozedur
zu verwenden sind, werden die Stammzellen zuerst auf eine Temperatur
aufgetaut, bei der die Stammzellen und Bestandsteilkomponenten ihre
Phase wieder aus einem Festkörper
in eine Flüssigkeit ändern. Anschließend werden
die Stammzellen gewaschen, um das Cryo-Schutzmittel zu entfernen,
das vor dem Einfrieren zugesetzt wurde. Bevorzugt ist das Waschen
dafür vorgesehen,
das DMSO zu entfernen, indem ein isotonisches Fluid, bevorzugt ein
Kolloid verwendet wird. Beispielsweise wird ein Gemisch mit 5% Albumin
und 10% Dextran in einer Salzlösung
verwendet, um das DMSO in der extrazellulären Umgebung zu lösen und
um sekundär
dessen Konzentration innerhalb der weißen Blutzellen zu senken. Anschließend wird
das Gemisch bei 400 G für
zehn Minuten mit dem darüber
ausgedrückten Überstand
zentrifugiert.
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Wie
vorstehend erwähnt,
sind die angereicherten weißen
Zellen in dem Volumen mit angenähert
15 ml vor der Zusetzung von 3,8 ml Cryo-Schutzmittel vorhanden.
Wenn sie in dem Stammzellengefrierbeutel untergebracht werden, werden
etwa 4 ml in der sekundären
Kammer 76 und 15 ml in dem primären Behälter 74 aufgenommen.
Tatsächlich
werden etwas weniger als 4 ml wie eben vorstehend beschrieben zugeteilt,
da wie eben beschrieben die Stammzellenproben innerhalb der Kammer 70 zusammen
bis zu 1 ml enthalten können. In
jedem Falle enthält
die aufgetaute Suspension von weißen Blutzellen und Stammzellen
vor dem Waschen 10 Volumenprozent Cryo-Schutzmittel. Nach
der Verdünnung,
dem Schleudern und Ausdrücken
werden die sedimentierten Stammzeller (typischerweise in einem Volumen
von kleiner als 3 ml) noch einmal auf ein Volumen verdünnt, das
für die
Verabreichung an den Empfänger
geeignet ist, wie z.B. 15 ml oder mehr. Diese zweite Verdünnung reduziert
die Konzentration von DMSO auf unter 1%. Daher ist die Menge des
enthaltenen DMSO in der Größenordnung
von 1/10 Gramm. Dieses ist sehr wenig im Vergleich zu dem Stand
der Technik, bei dem typischerweise 200 ml von 10% DMSO, d.h., 20
Gramm dieser Verbindung einbezogen sein können.
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Zusätzlich hat
die hierin vorstehend beschriebene therapeutische Dosis eine spezielle
Wirksamkeit, da die hierin vorstehend beschriebene Verarbeitung
aus dem Vollblut den Großteil
der roten Zellen, des Plasmas, des Cryo-Schutzmittels, freien Hämoglobins
usw. entfernt hat, welche bisher nachteilige Folgen für den Empfänger zeigten,
und die Osmolarität
der Stamm- und Vorläuferzellen
auf den normalen Bereich von 300 Milliosmol von über 1000 Milliosmol der 10%
DMSO-Lösung
zurückgestellt
wurde.
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Es
ist anzumerken, dass die Stammzellen, die in Gefrierbeuteln gelagert
werden, auf extrem niedrigen Temperaturen gehalten werden müssen, wie
z.B. denjenigen, die durch Verwendung von flüssigem Stickstoff erzielbar
sind. Indem weiße
Stammzellen in Mengen von 20 ml bereitgestellt werden, sind wahrscheinlich
die Probleme, die zuvor durch die Bereitstellung von Lagerraum für Einheiten
mit den zehnfach größeren Volumina von
cryo-konserviertem Plazentablut (Vollblut) vorhanden waren, durch
die geringeren Lagerungsanforderungen der abgetrennten weißen Blutzellen
in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung gelöst.
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Die
therapeutische Dosis enthält
einen relativ niedrigen Anteil an DMSO in dem fertigen Produkt,
das zu verabreichen ist. Eine zehnfach niedrigere Konzentration
roter Blutzellen ist in einer Einheit ohne erheblichen Verlust an
Stamm- und Vorläuferzellen
enthalten. Die geringeren Anzahlen von roten Blutzellen reduzieren
das Vorhandensein von Hämoglobin
in der aufgetauten Probe und verringern die Probleme in Verbindung mit
Inkompatibilitäten
mit den roten Blutzellen. Ferner ist die Lebensfähigkeit der in der Dosis nach
dem Auftauen enthaltenen weißen
Zellen drei- bis viermal höher
als nach dem Stand der Technik, insbesondere nach der Verabreichung
und Verdünnung
im eigenen Plasma des Empfängers.
Experimentell werden aufgetaute weiße Zellen in 20 ml Plasma vor
dem Zählen
auf Lebensfähigkeit
verdünnt.
In der herkömmlichen
Technik war die Lebensfähigkeit
ungewaschener weißer
Zellen typischerweise in der Größenordnung
von 20%. Gemäß dem vorstehenden
Verfahren sind unter Anwendung der DNA-Fluoreszenzfärbungs- oder anderen Lebensfähigkeitstests
die mononuklearen Zellen wesentlich mehr als 20%, typischerweise
mehr als 90%, lebensfähig. Wenn
Stamm- und Vorläuferzellen
in vitro aus derartigen Konzentraten weißer Zellen nach dem Auftauen
gemäß Beschreibung
kultiviert werden, ist die Anzahl lebensfähiger Zellen, abgeschätzt anhand
der Anzahl von ausgebildeten Kolonien, ebenfalls größer als
90% der Ursprungszahl.