JP6486246B2 - 凍結保存細胞からの生細胞の回収方法およびシステム - Google Patents
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Description
[1]凍結保存細胞を融解すること、および融解した細胞懸濁液を希釈液で希釈することを含む凍結保存細胞からの生細胞の回収方法であって、希釈時の最大浸透圧負荷が、250mOsm/秒以下となるように希釈することを特徴とする、前記方法。
[2]希釈時の最大浸透圧負荷が、50mOsm/秒以下となるように希釈液を添加することを特徴とする、[1]の方法。
[3]希釈時の最大浸透圧負荷が、40mOsm/秒〜50mOsm/秒となるように希釈液を添加することを特徴とする、[1]または[2]の方法。
[4]細胞が、骨格筋芽細胞である、[1]〜[3]の方法。
[5]希釈液が、融解した細胞懸濁液を別の容器に移した後の凍結保存容器をリンスしたリンス液を含む、[1]〜[4]の方法。
[6](i)希釈液を注入する動作部、および
(ii)動作部の希釈液注入速度を決定し、制御する演算制御部
を含む、凍結保存細胞融解システム。
[7]さらに
(iii)液体の浸透圧を測定する測定部
を含む、[6]のシステム。
以下、本発明の好適な実施態様に基づき、本発明を説明する。
(1)生細胞の回収方法
本発明は、1つの側面において、凍結保存細胞を融解すること、および融解した細胞懸濁液を希釈液で希釈することを含む凍結保存細胞からの生細胞の回収方法であって、希釈時の浸透圧変化を十分緩慢にすることを特徴とする、前記方法に関する。
本明細書においては、単位Osmは浸透圧の単位として用いており、1Osmは1mol/Lの理想溶液の有する浸透圧と等価な浸透圧を意味するものである。また、希釈時の浸透圧負荷は、室温条件下における1秒あたりの浸透圧の変化(単位:Osm/秒)として表しているが、浸透圧変化の大きさを表現できる単位であればどんな単位を用いてもよく、これに限定するものではないが、例えば希釈液の添加速度、体積または重量の増加速度などが挙げられる。
<凍結保存細胞の融解>
本工程において、凍結保存細胞を融解する際の条件としては、当該技術分野において知られたいかなる条件を用いてもよい。一般に、緩慢に融解すると氷晶などにより細胞への物理的ダメージが起こりやすくなるため、通常は例えば約37℃に設定したウォーターバスなどを用いて一気に温めて融解する。本工程においては、当該技術分野において生細胞の回収量を向上させるとして知られた任意の方法を用いることができる。
凍結細胞用容器は、当該技術分野において通常使用されている任意のものを用いてよく、例えば市販のクライオバイアル、アンプル、凍結保存バッグ等が用いられる。
上述のとおり、融解により得られた細胞懸濁液は細胞毒性成分(例えばDMSOなど)を含み得るため、希釈することで該細胞毒性成分の影響を低減することができる。本発明の方法は、この希釈の際に浸透圧変化を十分緩慢にする、すなわち浸透圧負荷を十分小さくすることにより、融解細胞の生存率を増大させることに特徴を有するものである。
本発明の方法において、「十分緩慢な浸透圧変化」の閾値は、用いる細胞、融解の条件、温度などにより変化し得る。例えば通常の凍結保存液(例えば10%程度のDMSOを含有するDMEM培地など)および通常の希釈液(例えば市販のDMEM培地など)を用いる場合、ある態様において最大浸透圧負荷は約250mOsm/秒以下であり、約220mOsm/秒であることが好ましい。より好ましくは約100mOsm/秒以下であり、さらに好ましくは約50mOsm/秒以下である。
本発明は、1つの側面において、凍結保存細胞を融解し、生細胞を高効率で回収するためのシステムに関する。本態様のシステムは、(i)希釈液を注入する動作部、および(ii)動作部の希釈液注入速度を決定し、制御する演算制御部を具備している。
演算制御部は、動作部から注入される希釈液の注入速度を決定し、制御するものである。注入速度の決定は、あらかじめ入力された数値を用いてもよいし、その瞬間の細胞懸濁液の浸透圧などから算出してもよい。あらかじめ入力された数値を用いる場合は、これに限定するものではないが、例えば最初の細胞懸濁液の液量および浸透圧を入力し、添加した希釈液の量、浸透圧および温度などから現在の浸透圧や添加速度を決定する、希釈液の添加速度の変化をあらかじめプログラムしておくなどが挙げられる。
本発明のシステムは凍結保存細胞を融解し、生細胞を回収するためのシステムであり、上記動作部、演算制御部および測定部以外の、凍結保存細胞を融解するための任意の設備をさらに具備していてよい。凍結保存細胞を融解し、生細胞を回収するための設備は当該技術分野において公知であり、当業者であればいかなる設備を具備するかただちに理解できる。かかる設備の例としては、これに限定するものではないが、例えば凍結保存細胞を融解したり、システム内を一定の温度に保ったりするための温度調節部、凍結保存容器から細胞懸濁液を移し替えるためのピペット部、細胞懸濁液を遠心分離するためのスピン部、生細胞数を計数するセルカウント部などが挙げられる。
凍結保存細胞の融解および生細胞の回収は次の通りに行った。凍結保存したクライオチューブを37℃に設定したウォーターバスに3〜4分間入れ、凍結保存細胞を融解した。融解した細胞懸濁液を、1.8mLクライオチューブから225mLコニカルチューブに移した。またクライオチューブに残存した細胞も回収するために、1mLの洗浄液(HBSSにアルブミンを加えたもの)でクライオチューブをリンスし、それを、添加速度を変えて前記細胞懸濁液に加えた。さらに前記リンス液と同様に添加速度を変えて、コニカルチューブに洗浄液を30mL加え、4℃、240×gで7分間遠心した後上清を廃棄した。再び洗浄液を30mL加えて4℃、240×gで7分間遠心した後上清を廃棄し、洗浄液を5mL加えて細胞懸濁液を得た。
得られた細胞懸濁液の一部を抜き取り、トリパンブルーに混合した後セルカウントを実施し、セルカウント結果から融解後の生存細胞数を算出し、下記の式にて細胞生存率を算出した。
細胞生存率(%)=融解後の生細胞数/融解後の全細胞数×100
最大浸透圧負荷は以下の計算式にしたがって算出した。なお細胞懸濁液の初期浸透圧値としては1400mOsmを、希釈液の浸透圧値として300mOsmを用いた。
Claims (4)
- 凍結保存された骨格筋芽細胞を融解し、希釈液で希釈して得られる細胞懸濁液であって、希釈時の最大浸透圧負荷が、40〜250mOsm/秒となるように希釈すること、および融解後の全細胞数に対する融解後の生細胞数の割合が90%以上であることを特徴とし、増殖培養を経ずに用いるための前記細胞懸濁液。
- 希釈時の最大浸透圧負荷が、50mOsm/秒以下となることを特徴とする、請求項1に記載の細胞懸濁液。
- 凍結保存細胞が、1×105〜1×107個/mlの細胞密度に調製して凍結されたものである、請求項1または2に記載の細胞懸濁液。
- シート状骨格筋芽細胞培養物の製造方法であって、
凍結保存細胞を融解するステップ、
該凍結保存細胞を融解して得られた細胞懸濁液を希釈するステップ、および
該希釈した細胞懸濁液を増殖培養を経ずに用いてシート状細胞培養物を形成するステップ
を含み、前記希釈するステップにおいて、希釈時の最大浸透圧負荷が、40〜250mOsm/秒となるように希釈し、前記希釈するステップの後、細胞を実質的に増殖させることなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で播種し、シート状細胞培養物を形成する、前記方法。
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