KR102431887B1 - 이식용 매체 - Google Patents

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가부시키가이샤 헤리오스
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Abstract

RPE 세포가, 폴록사머를 함유하고 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체에 현탁되는 본 발명에 따르면, 동결 보존되고 이후 해동되는 RPE 세포의 생존률이 증가될 수 있고, 해동 직후 이식된 RPE 세포의 시세포-보호 효과가 향상될 수 있고, 해동으로부터 이식까지의 단계에서 RPE 세포의 손실이 회피될 수 있다.

Description

이식용 매체
본 발명은, 망막 색소 표피 (RPE) 세포의 현탁제, 현탁제에 현탁된 RPE 세포-함유 조성물, 및 RPE 세포를 현탁제에 현탁시키는 것을 포함하는, RPE 세포-함유 조성물의 제조 방법 등에 관한 것이다.
망막 색소 표피 (RPE) 세포는, 망막의 최외층에, 색소를 수반하는 표피 세포 조직의 하나의 층으로서 존재하고, 시각을 맡는 안구 망막의 기능 유지에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 이의 대표적인 기능으로서, 식작용 기능 (phagocytotic function) 으로 인한 망막 광수용기 세포의 외절의 신생, 광수용기 세포의 외절에 특이적으로 존재하는 광감성 단백질인 시각적 물질의 리사이클, 다양한 사이토카인의 분비에 의한 RPE 의 인접 조직인 광수용기 세포 및 맥락막의 보호 효과 등을 들 수 있다. 따라서, RPE 세포가 에이징, 유전자 이상 등으로 인해 기능 부전이 되어 이와 연관된 변성 및 세포사를 초래하는 경우, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 슈타르가르트병 (Stargardt disease) 등과 같은 황반 변성 또는 망막 색소 변성 (RP: retinitis pigmentosa) 등과 같은 심각한 망막 변성이 일어나는 것으로 알려져 있다. 특히, AMD 는 고령자의 중심 시력의 손상 및 실명을 일으키는 안질환이며, 향후 전례없는 고령화 사회가 될 일본을 포함한 선진국에 있어서 중요한 사회 문제가 되고 있다. 현재, AMD 에 대한 치료법은 대증 요법인 항체 의약의 안내 투여가 일반적이고, 여전히 유효한 치료법이 확립되어 있지 않다. 따라서, 대안적 치료법의 개발이 요망되고 있다. 또한, 슈타르가르트병 및 RP 에 대해 유효한 치료법은 현재까지 전혀 확립되어 있지 않다.
최근, AMD 및 RP 의 신규한 치료법으로서, 다능성 줄기 세포로부터 분화되도록 유도된 RPE 세포를 보충 또는 치환하는 것을 포함하는 세포 이식 요법이 각광을 받고 있다. 따라서, 세포 요법용 그라프트 (graft) 재료로서의 RPE 세포의 활용이 기대되고 있다. 예를 들어, Ocata Therapeutics, Inc. (이전에, Advanced Cell Technology (ACT), Inc.) 는, 인간 배아 줄기 세포 (ES 세포) 유래의 RPE 세포를 사용한 연령 관련 황반 변성 (AMD) 및 슈타르가르트병에 대한 임상 연구를 진행시키고 있다 (비특허 문헌 1). 일본에서, 2014 년에, 인간 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 유래의 RPE 세포 시트를 삼출성 AMD 환자에게 이식하는 수술이 실시되었다. 이 수술은 세계 최초의 iPS 세포 이식 요법로서 많은 주목을 끌었고, 현재 여전히 치료 경과가 양호하다는 것이 보고되고 있다.
현재, RPE 세포의 이식에는, (1) 제조한 RPE 세포 시트, 또는 스캐폴드 재료에 RPE 세포를 파종해 제조한 스캐폴드를 갖는 RPE 세포 시트를, 망막에서 형성된 절개로부터 망막 색소 표피가 변성 또는 결손되는 부위에 이식하는 방법, 또는 (2) RPE 세포 현탁액을 유사한 부위에 주입하는 방법이 있다. 이식용 세포의 배양은 GMP 레벨로 실시할 필요가 있다. 따라서, 전자의 경우, 제조 이후 RPE 세포 시트는 세포 처리 센터 (CPC: Cell Processing Center) 로부터 이식 수술이 실시되는 시설 (병원) 에 수송된다. 다른 한편으로는, 후자의 경우, 예를 들어 Ocata Therapeutics 에 의해 수행된 임상 시험에서, CPC 에서 제조된 동결 보존 RPE 세포를 병원에 수송하고, 병원에서 세포를 해동하고, 이식 매체에 현탁시키고, 즉시 수술실에 가져오고, 이식한다. 세포를 CPC 로부터 동결 상태로 병원에 수송할 수 있으므로, 후자는 매우 편리한 것으로 여겨진다.
그럼에도 불구하고, 동결-해동 처리가 이식 세포에 대한 손상을 야기하는 가능성은 부정할 수 없다. 종래, 국소 이식에 사용되는 말단 분화 세포 및 조직은, 일반적으로 생체간 이식, 또는 동결 단계를 포함하지 않는 제조에 의해 제공되었다. 불가피하게 동결 보존된 세포를 이식하는 경우, 동결-해동 단계는 세포 및 조직의 구조에 대한 손상 및 이의 기능의 열화를 야기하는 것으로 염려된다. 국소화된 세포 이식 요법을 실현하는데 있어서, 동결 보존 세포의 기능에 있어서의 저하의 억제는 큰 과제이다. 치료 효과에 대한 해동 직후 RPE 세포의 이식의 영향은, 지금까지 검토되지 않았다.
폴록사머 188 (폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜) 은, 물리적 또는 화학적으로 손상된 세포막을 수복하는 것에 의한 세포 보호 효과를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 지금까지는, 근육 위축병, 심부전, 신경변성, 전기적 손상 등과 같은 병리적 병상의 치료, 및 이식 등과 같은 의료적 응용에 있어서의 세포막 실링제 (sealing agent) 로서의 폴록사머 188 의 사용에 관한, 여러 특허 및 특허 출원이 이루어졌다 (비특허 문헌 2). 예를 들어, Austen 등은, 지방 흡입 동안 손상된 지방 조직의 세포막을, 폴록사머 188 을 사용하여 실링하는 방법을 개시하고 있다 (특허 문헌 1). 그들은 또한 동결 보존 세포를 폴록사머 188 의 존재하에서 해동하여 동결 보존 세포의 생존률을 향상시키는 방법을 개시하고 있다 (특허 문헌 2).
그러나, RPE 세포의 이식 또는 동결 보존 RPE 세포의 해동 동안 폴록사머 188 의 사용에 대해서는 지금까지 보고되지 않았다.
[문헌 목록]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: JP-B-5795961
특허 문헌 2: 국제 특허 출원의 국내 공보 번호 2012-533620
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1 : Schwartz et al., Lancet, 379: 713-720 (2012)
비특허 문헌 2 : Moloughney et al., Recent Pat. Biotechnol., 6(3): 200-211 (2012)
본 발명의 목적은, 황반 변성, 망막 색소 변성 (RP) 등과 같은 망막 변성 질환의 치료를 위한 RPE 세포의 사용에 적합한 RPE 세포 현탁제, 현탁제에 현탁된 RPE 세포를 함유하는 조성물, RPE 세포를 현탁제에 현탁시키는 것을 포함하는, 이식에 적절한 RPE 세포-함유 조성물의 제조 방법 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 언급된 목적을 달성하기 위한 시도에서 예의 연구를 수행하였고, 해동 후에 첨가되는 이식 매체 (현탁제) 에 폴록사머 188 을 첨가함으로써, 동결 보존 RPE 세포의 해동후 생존률 및 해동후 회수율이 향상된다는 것을 밝혀냈다.
ES 세포 유래의 RPE 세포를 사용하는 것에 의한 황반 변성에 대한 임상 시험에 있어서, 동결 보존 RPE 세포는 해동 직후에 이식되었다 (상기 언급된 비특허 문헌 1). 상기 언급된 결과로부터, 본 발명자들은, 해동 직후 RPE 세포의 이식이 세포의 생존력을 저하시키고, 세포 상태를 악화시킬 수 있고, 이는 결국 이식 효과 (예를 들어, 광수용기 세포 보호 효과) 를 손상시킬 수 있다는 발상을 가졌다. 망막 변성 모델인 RCS (Royal College of Surgeons) 랫트에 대해, 해동 직후 RPE 세포의 이식과 해동 후 특정 기간 배양한 이후의 이식 사이에서, 광수용기 세포 보호 효과를 비교하였다. 결과로서, 후자가 더 높은 광수용기 세포 보호 효과를 나타냈음이 명확하였다.
본 발명자들은, 해동 직후의 RPE 세포에서의 광수용기 세포 보호 효과의 저하를 방지하기 위한 시도에서 예의 검토를 실시하였다. 결과로서, 이식 매체에 폴록사머 188 을 첨가했을 때, RPE 세포는 심지어 해동 직후에도, 특정 기간 동안 배양한 이후와 동등하거나 더 우수한 높은 광수용기 세포 보호 효과를 나타냈다. 결과는, 폴록사머의 사용에 의해, 일단 동결 보존으로부터의 해동 이후 RPE 세포를 CPC 중에서 배양하지 않고서, 심지어 동결 보존한 상태의 RPE 세포를 병원에 수송 하고, 해동 직후에 이식하는 경우에도, 높은 이식 효과가 얻어진다는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 이식 매체에 대한 폴록사머 188 의 첨가가, 해동 이후 RPE 세포의 생존률 및 이식 효과 뿐만 아니라, 해동으로부터 이식까지의 다양한 작업 동안의 RPE 세포의 손실의 감소 (세포 회수율의 향상) 에도 기여할 수 있는지 여부를 시험했다. 결과로서, 해동 직후의 희석 및 세정 작업의 단계로부터 현탁제로서 폴록사머 188-함유 매체를 사용하는 것에 의해, 해동 이후 세포의 손실, 원심분리 작업에 의한 세포의 손실, 이식 디바이스 통과시의 세포의 손실 모두가 감소될 수 있다는 것이 분명하였다.
이러한 발견을 기반으로, 본 발명자들은 폴록사머 188 을 함유하는 현탁제의 이식용 매체로서의 사용이, RPE 세포의 이식 치료에 있어서, 이식 프로토콜의 간편화 및 신속화, 이식 효과의 개선 및 균일화, 및 또한 비용 절감에 유용하다는 것을 밝혀냈고, 이는 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 하기를 제공한다.
[1] 폴록사머 및 안 관류 (ocular irrigating)/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체를 포함하는, 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 위한 현탁제.
[2] [1] 에 있어서, 매체가 조정된 행크 평형 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution) 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류/세정액인 현탁제.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, 폴록사머의 농도가 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 현탁제.
[4] [1] 또는 [2] 에 있어서, 폴록사머의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 현탁제.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 세포의 배양 없이 동결 보존 RPE 세포를 이식하기 위한 현탁제.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 해동 후 8 시간 이내에 이식하기 위한 현탁제.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, RPE 세포의 보호제로서의 현탁제.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 해동 이후 및 이식까지의 임의의 단계에서 사용되고, 그 단계 전후에 RPE 세포수의 감소를 억제하는 현탁제.
[9] RPE 세포 및 폴록사머를 포함하는, 이식을 위한 의약 조성물.
[10] [9] 에 있어서, RPE 세포가 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 폴록사머-함유 매체중에 현탁되는 의약 조성물.
[11] [10] 에 있어서, 매체가 조정된 행크 평형 염 용액 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류/세정액인 의약 조성물.
[12] [10] 또는 [11] 에 있어서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 의약 조성물.
[13] [10] 또는 [11] 에 있어서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v)인 의약 조성물.
[14] [9] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, RPE 세포가 동결 보존으로부터 해동 이후 1 시간 이내의 세포이고, 의약 조성물이 제조 이후 8 시간 이내에 대상체에 이식되는 의약 조성물.
[15] [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 생존률을 나타내는 의약 조성물.
[16] [9] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 회수율을 나타내는, 의약 조성물.
[17] 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 폴록사머-함유 매체 중에 RPE 세포를 현탁시키는 것을 포함하는, RPE 세포-함유 조성물의 제조 방법.
[18] [17] 에 있어서, 매체가 조정된 행크 평형 염 용액 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류/세정액인 방법.
[19] [17] 또는 [18] 에 있어서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 방법.
[20] [17] 또는 [18] 에 있어서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 방법.
[21] [17] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, RPE 세포가 동결 보존으로부터 해동한 이후 1시간 이내의 세포이고, RPE 세포-함유 조성물이 제조 이후 8시간 이내에 대상체에 이식되는 이식용 의약 조성물인 방법.
[22] [17] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 생존률을 나타내는 방법.
[23] [17] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 회수율을 나타내는 방법.
[24] [9] 내지 [16] 중 어느 하나에 있어서, 광수용기 세포를 보호하기 위한 의약 조성물.
[25] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188 인 현탁제.
[26] [9] 내지 [16] 및 [24] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188 인 의약 조성물.
[27] [17] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188 인 방법.
[발명의 효과]
본 발명에 따르면, 폴록사머를 사용하여, 동결 보존 RPE 세포의 해동후 생존률 및 해동후 회수율이 향상될 수 있다. 효과는 심지어 상온에서도 장시간 동안 지속되고, 이식을 위한 세포 현탁액의 제조 이후 상온에서의 보존 및 수송을 가능하게 한다.
폴록사머를 사용하여, 동결 보존되고 해동 직후에 이식된 RPE 세포는, 해동 후 주어진 기간 동안 배양한 이후 이식된 RPE 세포의 것과 동등하거나 그 이상의 광수용기 세포 보호 효과를 나타낸다. 따라서, RPE 세포를 동결 상태로 CPC 로부터 병원에 수송하고, 병원에서 해동 직후 이식할 수 있다. 이는 이식 프로토콜의 간략화 및 이식의 실시 이전 시간의 단축화를 가능하게 한다.
또한, 폴록사머를 사용하여, 해동으로부터 이식까지의 각 단계에 있어서의 RPE 세포의 손실을 저감시킬 수 있고, 세포의 수를 균등하게 할 수 있다. 따라서, 이식을 위한 충분한 세포의 수를 보장하기 위해서 준비되는 RPE 세포수를 감소시킬 수 있다. 또한, 모든 이식에 있어서 이식 세포의 생존률 및 수의 변수가 감소될 수 있다. 따라서, 치료 효과는 균등화되고, 손상 세포의 투여의 방지와 관련한 안전성이 향상될 수 있다.
도 1 은, 동결-해동 이후, 4 ℃ 에서 48 시간 동안 정치시킨 RPE 세포의 생존률에 대한 다양한 농도의 폴록사머 188 의 효과를 나타낸다.
도 2 는, 동결-해동 이후, 실온 또는 4 ℃ 에서 6 시간 동안 정치시킨 RPE 세포의 생존률에 대한 0.05 % (w/v) 폴록사머 188 의 효과를 나타낸다.
도 3 은, 동결-해동 이후, 실온에서 8 시간 동안 정치시킨 RPE 세포의 생존률에 대한 다양한 농도의 폴록사머 188 의 효과를 나타낸다.
도 4 는, 해동 직후 또는 해동 이후 14 일 동안 배양한 이후 RPE 세포를 매체 (BSS) 단독 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188 이 첨가된 매체에 현탁시키고, RCS 랫트에게 이식했을 경우, 광수용기 세포 보호 효과를 나타낸다.
도 5 는, 해동 동안 RPE 세포의 회수율에 대한 폴록사머 188 의 효과를 나타낸다.
도 6 은, 이식되는 세포 현탁액의 제조 단계에서, RPE 세포의 회수율에 대한 폴록사머 188 의 효과를 나타낸다.
본 발명은, 폴록사머 및 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체를 포함하는, 망막 색소 표피 (RPE) 세포를 위한 현탁제를 제공한다. 본 발명은 또한 RPE 세포 및 폴록사머를 포함하는, 이식용 의약 조성물을 제공한다.
(A) 망막 색소 표피 (RPE) 세포
본 명세서에 있어서 "망막 색소 표피 (RPE) 세포" 는, 망막 색소 표피를 구성하는 표피 세포, 및 이의 선구 세포를 말한다. 세포가 망막 색소 표피 세포인지 여부는, 예를 들어 세포 마커 (RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1 등) 의 발현, 세포 형태 (세포내 멜라닌 색소 침착, 다각형의 평평한 표피형 세포 형태, 다각형의 액틴 다발 형성 등) 등에 의해 확인될 수 있다. 망막 색소 표피 세포의 선구 세포는, 망막 세포로의 분화의 유도가 프로그래밍된 세포를 의미한다. 세포가 선구 세포인지 여부는, 세포 마커 (Mitf (색소 표피 세포, 색소 표피 선구 세포), Pax6 (색소 표피 선구 세포), Rx (망막 선구 세포), OTX2 (망막 선구 세포), RPE65 (색소 표피 세포), BEST1 (색소 표피 세포)) 의 발현 등에 의해 확인될 수 있다. 망막 색소 표피 세포의 기능 평가는, 예를 들어 사이토카인 (VEGF, PEDF 등) 의 분비 활성, 식작용 활성 등을 지표로서 사용하여 확인될 수 있다. 당업자는 적절히 조건을 설정하여, 상기 기능 평가 및 확인 작업을 수행할 수 있다.
RPE 세포는, RPE 세포를 갖는 임의의 동물로부터 얻을 수 있거나, 다능성 줄기 세포 등으로부터 공지된 방법 그 자체에 따라 분화를 유도함으로써 얻을 수 있다. RPE 세포의 예는, 예를 들어 다능성 줄기 세포로부터 분화를 유도하여 수득된 것을 포함한다. 다능성 줄기 세포는, 생체 기관에 존재하는 임의의 세포로의 분화를 허용하는 다능성 (pluripotency) 을 갖고, 또한 증식능 (proliferative capacity) 을 갖는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 배아 줄기 세포 (ES 세포), 핵 이식에 의해 얻어지는 클론배아-유래 배아 줄기 세포 (ntES 세포), 정자 줄기 세포 (GS 세포), 배아 생식 세포 (EG 세포), 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포), 배양 섬유아세포 또는 골수 줄기 세포로부터 유래된 다능성 세포 (Muse 세포) 등이 포함된다. 바람직한 다능성 줄기 세포는, ES 세포 및 iPS 세포이다. 다능성 줄기 세포의 유래는 특별히 제한되지는 않고, 예를 들어 하기의 다능성 줄기 세포 중 어느 하나의 확립이 보고된 임의의 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간, 마우스, 랫트 등이 언급될 수 있다.
ES 세포는 수정란의 8-세포기에서의 상실배 이후의 배아인 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래되는 배아-유래 줄기 세포이고, 성체를 구성하는 다양한 세포로 포화되는 능력, 소위 다능성 및 자기-재생에 의한 증식능 (proliferation potency) 을 갖는다. ES 세포는, 마우스에서 1981 년에 발견되었고 (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156), 그 후 인간, 원숭이 등과 같은 영장류에서 ES 세포주가 또한 확립되었다 (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165).
ES 세포는, 대상 동물의 수정란의 배반포로부터 내부 세포 덩어리를 제거하고, 내부 세포 덩어리를 섬유아세포 피더 (fibroblast feeder) 상에서 배양함으로써 수립될 수 있다. 또한, 세포는 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor (LIF)), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor (bFGF)) 등과 같은 물질이 첨가된 배양액을 사용하여 계대 배양 (passage culture) 에 의해 유지될 수 있다. 인간 및 원숭이의 ES 세포의 수립 및 유지의 방법은, 예를 들어 USP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848; Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585;Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485 등에 기재되어 있다.
iPS 세포는, ES 세포의 것과 거의 동등한 특성, 예컨대 다능성 및 자기-재생에 의한 증식능을 갖는 체세포-유래 인공 줄기 세포이고, 특정의 리프로그래밍 인자를, DNA 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입함으로써 제조될 수 있다 (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); WO 2007/069666).
본 명세서중에서 사용되는 용어 "체세포" 는, 난자, 난모, ES 세포 등과 같은 생식 계열 세포 또는 전분화 (totipotent) 세포를 제외한 임의의 동물 세포 (바람직하게는, 인간을 포함하는 포유 동물의 세포) 를 나타낸다. 체세포에는, 비한정적으로, 태아의 체세포 (pup), 신생아의 체세포 (pup), 및 성숙된 건강한 또는 질환이 있는 체세포 중 임의의 것을 포함하고, 초기 배양 세포, 계대배양 세포, 및 주화 세포의 계 중 임의의 것을 포함한다. 구체적으로는, 체세포의 예는, (1) 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 펄프 줄기 세포 등과 같은 조직 줄기 세포(체질 줄기 세포), (2) 조직 선구 세포, (3) 임파구, 표피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유아세포 (피부 세포 등), 털 세포, 간세포, 위 점막 세포, 장세포, 비세포, 췌세포 (췌 외분비 세포 등), 뇌세포, 폐세포, 신장 세포, 지방 세포 등과 같은 분화 세포 등을 포함한다.
리프로그래밍 인자는, ES 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자, 이의 유전자 생성물 또는 비-코딩 RNA 또는 ES 세포의 미분화 상태를 유지하는데 중요한 역할을 하는 유전자, 이의 유전자 생성물 또는 비-코딩 RNA, 또는 저분자 화합물로 구성될 수 있다. 리프로그래밍 인자에 함유되는 유전자의 예는, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 베타-카테닌, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1 등을 포함하고, 이러한 리프로그래밍 인자는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 리프로그래밍 인자의 조합의 예는, WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO 2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720, 및 Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9. 에 언급된 것을 포함한다.
ES 세포의 RPE 세포로의 분화를 유도하는 방법의 예는, SDIA 방법 (PNAS, 99: 1580-1585, 2002), SFEB 방법 (Nat. Biotechnol., 26: 215-224, 2008) 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 유사한 방법에 의해 iPS 세포로부터 RPE 세포의 분화가 유도될 수 있다 (예를 들어, Neurosci. Lett., 458: 126-131, 2009; PLoS One, 8: 409-412, 2011). 대안적으로, WO2015/053375, WO2015/053376, WO2015/125941, WO2017/043605 등에 기재된 방법을 또한 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서의 RPE 세포로서, 구체적으로는 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포로부터 분화하도록 유도된 RPE 세포가 언급될 수 있다.
본 발명의 현탁제가 적용되는 RPE 세포 또는 본 발명의 의약 조성물 중에 함유되는 RPE 세포는, 바람직하게는 동결 보존된 상태로부터 해동 이후 1 시간 또는 20 분 이내, 또는 해동 직후의 RPE 세포이다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 RPE 세포는, 공지된 방법 그 자체에 따라서 동결 보존되고, 본 발명의 현탁제 중의 현탁 직전에 해동된다. RPE 세포의 동결 보존 방법의 예는, RPE 세포를 원심분리 튜브 등에서 회수하고, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 동결 보호제를 함유하는 동결 보존액 중에 세포를 현탁시키고, 현탁액을 동결 보존 튜브에 넣고, 이를 -80 ℃ 에서 냉각기로 동결시키고, 이를 질소 탱크에서 기상 또는 액상으로 보존하는 것을 포함하는 방법 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 동결 보호제로서, 예를 들어, DMSO, 글리세린, 부동 단백질, 부동 당단백질 등을 적절히 사용할 수 있다.
동결 보존 RPE 세포의 해동 방법으로서, 당해 기술 분야에서 익히 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, Freshney RI, Culture of Animal cells: A Manual of Basic Technique, 4 th Edition, 2000, Wiley-Liss, Inc., Chapter 19). 바람직하게는, 세포를 약 37 ℃ 에서 고온수 배쓰 (hot-water bath) 중에서 급속 해동한다. DMSO 와 같은 세포독성이 강한 동결 보호제를 사용하는 경우, 해동 직후 적합한 희석제로 DMSO 를, 세포에 대한 악영향이 없는 농도로 희석하는 것이 바람직하다. 원심분리에 의해 상청액을 제거함으로써, 독성이 있는 동결 보호제 등을 제거하는 것이 바람직하다. 희석제로서, 혈청-함유 또는 혈청-불함유 매체, 식염수 또는 PBS 를 사용할 수 있고, 의약상 허용가능한 매체를 본 발명의 현탁제 중의 안 관류/세정액으로서 또한 사용할 수 있다.
(B) 폴록사머
본 발명의 명세서에 있어서, "폴록사머" 는 하기 구조식으로 나타내어지는 트리블록 코폴리머이다:
Figure 112019010373019-pct00001
폴록사머의 예는, 폴록사머 124, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 407 을 포함하고, 바람직한 것은 폴록사머 188, 폴록사머 237, 보다 바람직하게는 폴록사머 188 을 포함한다.
폴록사머 188 (식 중, a=80, b=30) 은, 적용을 위한 의약 첨가제로서 예컨대 안정(안정화) 제, 계면활성제, 윤활제, 가용(가용화) 제, 베이스, 결합제, 현탁(현탁화) 제, 코팅제, 습윤제, 유화제, 증점제, 부형제, 분산제, 붕괴제, 가용화제 등으로서 사용될 수 있고, 안전하게 사용될 수 있다.
폴록사머 188 은, 공지된 방법 그 자체에 의해 제조할 수 있다. 폴록사머 188 은, 예를 들어 Pluronic (등록 상표) F68 (BASF), Pluronic F68 10 % (100×) (Thermo Fisher Scientific (이전의 Life Technologies)), PRONON (등록 상표) #188 P (NOF CORPORATION) 등의 상품명으로 시판되고 있다.
본 발명의 현탁제, 또는 본 발명의 의약 조성물에서의 매체 중에 함유되는 폴록사머, 예를 들어 폴록사머 188 의 농도는, 이것이 예를 들어 RPE 세포, 특히 동결 보존으로부터 해동된 RPE 세포를 보호하고, 세포 손상 또는 세포사를 억제하고 (RPE 세포 보호 효과), RPE 세포의 광수용기 세포 보호 효과를 향상시키고 (감소의 방지), 및/또는 해동으로부터 이식까지의 다양한 단계에 있어서의 RPE 세포수의 손실을 방지하는데 충분한 한, 특별히 제한은 없다. 이는 바람직하게는 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v), 보다 바람직하게는 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) (예를 들어, 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 미만, 0.01 % (w/v) ~ 0.09% (w/v), 0.08% (w/v), 0.07 % (w/v), 0.06 % (w/v) 또는 0.05 % (w/v) 등) 이다. 0.1 내지 2 % (w/v) 또는 그 이상인, 동결 보존한 지방 조직의 "해동" 동안의 세포사를 방지하는데 필요한 폴록사머 188 의 농도의 고려시에 (상기 언급된 특허 문헌 2), 0.1 % (w/v) 미만의 저농도로 폴록사머를 "해동 이후" 에 첨가하는 것에 의해, 우수한 RPE 세포 보호 효과가 달성된다는 것은 놀라운 발견이다.
(C) 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체
본 발명의 현탁제 및 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 "안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체" 는, RPE 세포가 매체 중에 현탁되고, 이의 질환 부위, 즉 황반 변성 또는 망막 색소 변성에서의 망막하 망막 색소 표피의 변성 또는 결손 부위에의 직접 주입이 의약상 허용가능한 현탁액인 한, 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 완충제, 등장화제, 점성 베이스, 킬레이트제, pH 조정제, 항산화제 등이 적절히 선택되고, RPE 세포의 생존률에 대한 영향을 주지 않는 범위로 함유될 수 있다.
완충제의 예는, 인산 완충제, 붕산 완충제, 시트레이트 완충제, 타르타르산 완충제, 아세테이트 완충제, 아미노산 등을 포함한다.
등장화제의 예는, 소르비톨, 글루코오스, 만니톨 등과 같은 당류, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 등과 같은 다가 알코올, 염화 나트륨 등과 같은 염, 붕산 등을 포함한다.
점성 베이스의 예는, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(비닐 알코올) 등과 같은 수용성 중합체, 하이드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 등을 포함한다.
킬레이트제의 예는, 에데트산나트륨, 시트르산 등을 포함한다.
pH 조정제의 예는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 붕산 또는 이의 염 (붕사), 염산, 시트르산 또는 이의 염 (시트르산나트륨, 시트르산 이수소 나트륨 등), 인산 또는 이의 염 (인산 수소 2나트륨, 인산 이수소 칼륨 등), 아세트산 또는 이의 염 (아세트산 나트륨, 아세트산 암모늄 등), 타르타르산 또는 이의 염 (타르타르산 나트륨 등) 등을 포함한다.
항산화제의 예는, 글루타티온, 아황산수소나트륨, 건조 아황산나트륨, 피로 아황산나트륨, 토코페롤 등을 포함한다.
본 발명의 작용제의 pH 는, 일반적으로 약 5.0 ~ 약 8.5, 바람직하게는 약 7.0 ~ 약 8.0 으로 조정된다. 바람직하게는, 멤브레인 필터 등을 사용한 여과에 의한 멸균과 같은 멸균 처리를 실시할 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 양태에 있어서, "안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체" 로서, 조정된 행크 평형 염 용액 (HBSS) 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류/세정액을 사용할 수 있다. 조정된 HBSS 의 예는, 페놀 레드 (phenol red)-불함유 HBSS (-) (400 mg/L KCl, 8 g/L NaCl, 350 mg/L NaHCO3, 60 mg/L KH2PO4, 47.9 mg/L 무수 Na2HPO4, 1 g/L D-글루코오스; 이하, 단순히 "HBSS(-)" 로 또한 나타냄), 페놀 레드-불함유 HBSS(+) (140 mg/L 무수 CaCl2, 100 mg/L MgCl2·6H2O, 100 mg/L MgSO4·7H2O 를 첨가한 HBSS(-); 이하, 단순히 "HBSS(+)" 로 나타냄) 등을 포함한다. 옥시글루타티온을 함유하는 조정된 안 관류/세정액의 예는, BSS Plus (등록 상표) 안 관류액 0.0184 % (Nihon Alcon) (이하, 단순히 "BSS" 로 또한 나타냄) 등을 포함한다.
(D) 본 발명의 현탁제·본 발명의 의약 조성물
본 발명의 현탁제는, 상기 언급된 (C) 의 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체에, 적절한 양의 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 첨가함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 상기 언급된 RPE 세포를 본 발명의 현탁제에 현탁시키는 것에 의해 제조할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 한 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 현탁제에 현탁되고 본 발명의 의약 조성물로서 제조되는 RPE 세포는, 동결 보존 상태로부터 해동된 직후의 세포이다. 상기 언급된 방법에 의한 해동 직후의, 동결 보존 RPE 세포는 바람직하게는 적합한 희석제에 희석되고, 원심분리에 의해 세정된다. 여기서 희석제로서, 상기 언급된 바와 같이, 식염수, PBS, 및 상기 언급된 (C) 의 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체 (예를 들어, HBSS(+), BSS 등) 를 사용할 수 있다. 희석제는 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 원심분리에 의한 세정 단계에서의 RPE 세포에 대한 손상 또는 세포사를 억제하고, 작업 동안 세포수의 손실을 방지하기 위해, 희석제에 폴록사머 188 을 첨가하는 것이 바람직하다. 즉, 한 구현예에 있어서, 희석 및 세정 단계는, 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 함유하는 안 관류/세정액으로서 의약상 허용가능한 매체 중에서 실시되어, RPE 세포 보호 효과, 또는 RPE 세포의 손상 또는 세포사에 대한 억제 효과가 인정되고, RPE 세포의 회수율이 개선된다. 따라서, 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 함유하고 안 관류/세정액으로서의 의약상 허용가능한 매체에 RPE 세포를 현탁시키는 것에 의한, RPE 세포의 보호 방법, RPE 세포에 대한 손상 또는 세포사의 억제 방법, 및 RPE 세포의 회수율의 개선 방법은 또한 본 발명에 포함된다. 폴록사머의 첨가 농도는, 유사하게 본 발명의 현탁액 중의 폴록사머의 농도 범위에 의해 예시된다. 희석 및 세정 단계는 실온 내지 약 37 ℃ 에서 실시되거나, 약 4 ℃ 에서의 냉각 하에 실시될 수 있다. 세정 작업은 오로지 1 회 실시될 수 있거나, 2 내지 수 회 반복될 수 있다.
희석 및 세정한 RPE 세포를 본 발명의 현탁제에 재현탁함으로써, 본 발명의 의약 조성물, 즉 RPE 세포-함유 조성물이 수득될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물에서 RPE 세포는, 동결 보존 상태로부터의 해동 이후 1 시간 이내, 더 바람직하게는 20 분 이내의 RPE 세포이다. 본 발명의 의약 조성물에서 RPE 세포의 밀도는, 치료적 유효량의 RPE 세포가 질환 부위, 즉 황반 변성 및 망막 색소 변성에서의 망막 색소 표피의 결손 부위에 주입되는 현탁액 (예를 들어, 50 ~ 500 μL, 바람직하게는 100 ~ 300 μL) 중에 함유되는 한, 특별히 제한은 없다. 예를 들어, RPE 세포는 100 ~ 20,000 세포/μL, 바람직하게는 1,000 ~ 10,000 세포/μL 의 세포 밀도로 현탁될 수 있다. 황반 변성에 대한 ES 세포-유래 RPE 세포를 사용한 임상 시험에서는, 생 RPE 세포를 최종적으로 333 개의 세포/μL 로 BSS 에 현탁시키고, 세포 현탁액 (150μL, 생 RPE 세포의 총 수, 50,000 개의 세포) 를 황반부에 주입하였다 (상기 언급된 비특허 문헌 1). 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 함유하는 본 발명의 의약 조성물은, RPE 세포를 매체 (예를 들어, BSS) 단독에 현탁 시켰을 경우보다 더 RPE 세포를 보호할 수 있고, RPE 세포에 대한 손상 및 세포사를 현저하게 억제할 수 있고, 희석 및 세정을 위한 원심분리 단계, 이의 재현탁, 및 이의 이식 동안 이식 디바이스 (시린지 등) 의 통과 동안의 세포 손실을 현저하게 방지할 수 있다. 따라서, 종래 방법에서와 동등량의 생 RPE 세포를 이식 부위에 도달시키는데 필요한 출발 RPE 세포의 수를 감소시킬 수 있고, 이식에 필요한 RPE 세포의 제조에 필요한 비용 및 시간을 감소시킬 수 있다.
동결 보존 RPE 세포를 해동 직후에 본 발명의 현탁제 중에 현탁시킴으로써 수득된 본 발명의 의약 조성물은, 심지어 4 ℃ 에서 적어도 48 시간 동안 또는 상온에서 적어도 8시간 동안 정치된 경우에도, RPE 세포의 생존률의 저하를 나타내지 않는다. 이는, CPC 중에 동결 보존된 RPE 세포를 해동하고, 이식용 제제로서 제조하고, 냉각 또는 상온 하에서 이식을 실시하는 병원에 수송할 수 있고, 그 결과 수송시의 번잡함을 해소할 수 있고, 병원 도착 직후에 이식을 실시할 수 있다는 이점을 의미한다. 즉, 한 양태에서, 동결 보존 RPE 세포를 해동 직후에 본 발명의 현탁제 중에 현탁시켜, 해동 이후 48 시간 이내, 바람직하게는 8 시간 이내에, RPE 세포를 대상 환자에게 이식할 수 있다.
따라서, 이하의 단계:
(1) 동결 보존 RPE 세포를 해동하는 단계,
(2) 해동된 RPE 세포를 본 발명의 현탁액 중에 현탁시키는 단계, 및
(3) (2) 에서 얻어진 RPE 세포를 함유하는 현탁액을, 해동 후 48 시간 이내, 바람직하게는 8 시간 이내에 환자의 눈 조직에 투여하는 단계
를 포함하는, RPE 세포의 환자에 대한 이식 방법이 또한 본 발명의 범주 이내이다.
다른 한편으로는, 심지어 본 발명의 의약 조성물을 동결 보존 RPE 세포를 해동 직후에 본 발명의 현탁제에 현탁시킨 직후 이식에 사용한 경우에도, 해동한 세포를 특정 기간 동안 배양한 이후 이식하는 것과 동등한 또는 그 이상의 높은 광수용기 세포 보호 효과를 나타낸다. 즉, 한 양태에서, 동결 보존 RPE 세포를 해동 이후 회복 배양 없이 이식할 수 있다. 즉, 해동 이후 RPE 세포를 배양하는 단계의 부재를 특징으로 하는, 상기 언급된 환자에 대한 이식 방법이 또한 본 발명의 범주 이내이다.
본원에서 사용된 바와 같이, RPE 세포에 의한 "광수용기 세포 보호 효과" 는, RPE 세포의 이식에 의해, 광수용기 세포의 생존을 유지하고 망막 기능을 보호 및 정상화하는 효과를 나타낸다.
황반 변성에 대한 ES 세포-유래 RPE 세포를 사용한 임상 시험에서, 폴록사머를 포함하지 않는 BSS 에 해동 직후의 RPE 세포를 현탁하고, 배양 단계를 포함하지 않고서 이식에 그대로 사용하여 (상기 언급된 비특허 문헌 1), 주어진 치료 효과를 얻었다. 본 발명은, 상기 종래 방법이 RPE 세포의 광수용기 세포 보호 효과의 현저한 감소를 야기할 가능성이 높다는 새로운 과제, 및 현탁제에 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 첨가함으로써 상기 과제를 해결하는 수단을 동시에 제공하였다. 이러한 새로운 과제는, RPE 세포의 치료 효과 (광수용기 세포 보호 효과)의 향상의 목적을 위해서, 동결 보존 상태의 RPE 세포를 CPC 로부터 병원에 수송하고, 병원에서 해동하고 그 직후에 이식하는, 종래에 실시되고 있던 용이한 이식 프로토콜의 재고를 상기시킨다. 본 발명은, 폴록사머 188 의 첨가에 의해, 심지어 해동 직후 RPE 세포를 이식에 사용하는 경우에도, 주어진 기간 동안의 배양 후의 RPE 세포를 이식하여 달성되는 것과 동등한 치료 효과를 얻을 수 있다는 것을 입증하였고, 이에 따라 종래의 단순한 이식 프로토콜이 치료 효과를 손상시키지 않으면서 실시될 수 있다는 것을 보여주었다. 즉, 본 발명은 간편하고 효과적인 RPE 세포를 사용한 이식 처리를 실현할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 시린지 및 바늘을 함유하는 적합한 이식 디바이스 (예를 들어, MedOne0 (등록 상표) Poly Tip (등록 상표) Cannula 25 g/38 g 등) 를 사용하여, 예를 들어 황반 변성 (예를 들어, 위축형 및 삼출성 연령 관련 황반 변성, 슈타르가르트병), 망막 색소 변성 등과 같은 망막 질환을 갖는 포유 동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 랫트 등, 바람직하게는 인간) 에 망막하 주입함으로써 이식할 수 있다. 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 함유하는 본 발명의 의약 조성물은, 이식 디바이스 내에서의 유동성을 향상시킬 수 있고, 주입시에 디바이스 내에 잔존하는 RPE 세포수를 현저하게 감소시킬 수 있다. 따라서, 이식 용량을 정확하게 결정할 수 있고, 임상 연구, 임상 시험 및 승인 후의 임상 사용에 있어서 용량-의존적 치료 효과의 평가 판정을 정확하게 실시할 수 있고, 이에 따라 재생 의학 등과 같은 제품의 실용화에 크게 공헌할 수 있다.
하기 실시예를 참조로 본 발명이 더 상세하게 설명되나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 폴록사머 188 의 RPE 세포 보호 효과의 검증
RPE 세포에 대한, 세포 보호 효과를 갖는 것으로 공지되어 있는 폴록사머 188 의 보호 효과를, RPE 세포를 다양한 농도로 폴록사머 188 을 함유하는 HBSS (+) 에 현탁하고 세포 현탁액의 상태로 보존했을 때, 시간에 따른 RPE 세포의 생 세포율 (cell survival rate) 을 측정함으로써 검증하였다.
동결 보존 (STEM-CELL BANKER (등록 상표) GMP 등급) 되고 있는 RPE 세포 (1120C7 iPS 세포-유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University) 를 37 ± 2 ℃ 에서 해동하고, 트리판 블루 (Trypan Blue) 염색법에 의해 생 세포수 및 생 세포율을 측정하고, 1.5 × 105 개의 세포/튜브의 세포수로 분배하였다. RPE 세포를 원심분리 (200 g, 4 분, 실온) 하고, 상청액을 제거했다. 0 % (w/v), 0.005 % (w/v), 0.05 % (w/v), 또는 0.5 % (w/v) 의 농도로 폴록사머 188 을 함유하는 HBSS (+) 450 μL 를 첨가하고, 재현탁한 RPE 세포 현탁액을 4 ℃ 에서 정치시키고, 시간에 걸친 생 세포율을 측정했다. 폴록사머 188-함유 HBSS(+) 를, Pluronic F-68, 10 % (100 X) (Thermo Fisher Scientific (이전의 Life Technologies)) 를 HBSS(+) 로 희석하여 제조했다 (이하의 모든 실시예에서, 유사한 방법에 의해 폴록사머 188-함유 매체를 제조함). 샘플링을 현탁액 제조 직후를 0 시간으로서, 24 시간 이후, 48 시간 이후의 각 측정 시점에서 실시하고, 트리판 블루 염색법에 의해 생 세포율을 측정했다.
결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1a 는 측정 값으로서 생 세포율의 변동의 플롯을 나타내고, 도 1b 는 현탁액 제조 직후 (0 시간 후) 의 생 세포율이 100 % 인 상대적 값으로서 4 ℃ 에서의 정치 이후의 생 세포율의 변동을 나타낸다. 무조정 (plain) HBSS (+) 에 현탁하는 것과 비교했을 때, 0.005 % (w/v), 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 현탁한 RPE 세포의 생 세포율의 저하는, 4 ℃ 정치 48 시간까지 억제되었다 (도 1a). 다른 한편으로는, 무조정 HBSS (+) 에 현탁하는 것과 비교했을 때, 0.5 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 현탁한 RPE 세포의 생 세포율의 저하의 기울기는 가파르고, 생 세포율의 저하는 억제되지 않았다 (도 1b). 이러한 결과는, 폴록사머 188 이 첨가 농도 0.005 % (w/v) 및 0.05 % (w/v) 에서 생 세포율의 저하를 억제함을 드러낸다. 또한, 폴록사머 188 의 첨가 농도 0.5 % (w/v) 는 생 세포율의 저하를 억제할 수 없었다. 세포 독성이 이러한 농도에서 계면활성제의 세포 막 가용화 작용으로 인해 나타난다는 것이 제안되었다.
임상 실시에 있어서 RPE 세포 현탁액 제조 작업을 실온에서 실시하는 것을 고려하여, 실온 및 4 ℃ 에서의 무조정 HBSS 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS 에 현탁한 RPE 세포 현탁액의 보존 안정성을 평가할 목적으로 이하의 실험을 실시했다.
동결 보존된 RPE 세포 (1120C7 iPS 세포-유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University) 를 37 ± 2 ℃ 에서 해동하고, BSS 로 희석하고, 세정하고, 트리판 블루 염색법에 의해 생 세포수 및 생 세포율을 측정하고, 세포를 3 × 106 개의 세포/튜브의 세포수로 분배하였다. RPE 세포를 원심분리 (200 g, 4 분, 실온) 하고, 상청액을 제거했다. 무조정 HBSS 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS 1 mL 를 첨가하고, 재현탁된 RPE 세포 현탁액을 실온 또는 4 ℃ 에서 정치시키고, 6 시간 후에 nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포율을 측정했다.
결과를 도 2 에 나타낸다. 무조정 HBSS 에 현탁시킨 것과 비교했을 때, 폴록사머 188-함유 BSS 에 현탁한 RPE 세포의 생 세포율은 실온 및 4 ℃ 에서 6 시간 동안 정치시킨 이후 높게 유지되었다. 또한, 폴록사머 188-함유 BSS 에 현탁한 RPE 세포 현탁액의 보존 안정성은 실온 및 4 ℃ 에서 정치시킨 이후 6 시간까지 변화하지 않았음이 나타났다. 따라서, RPE 세포에 대한 폴록사머 188 의 보호 효과는 심지어 실온에서도 발견됨이 명백해졌다. 이식용 매체로서 폴록사머 188-함유 BSS 의 사용은, 온도 조절이 용이한 실온 조건 하에, 병원 CPC 등과 같은 특수 환경 및 원격지에서 RPE 세포 현탁액을 제조, 저장 또는 수송하는데 유효하다.
또한, RPE 세포에 대한 폴록사머 188 의 보호 효과에 대한 유효 농도를 상세하게 검증하기 위해 이하의 실험을 실시했다.
동결 보존 RPE 세포 (Ff-I01 iPS 세포 유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University) 를 37 ± 2 ℃ 에서 해동하고, HBSS (+) 로 희석하고, 세정하였다. nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포수 및 생 세포율을 측정하고, 1 × 106 개의 세포/튜브로 세포를 분배하고, 원심분리 (200 g, 4 분, 실온) 하고, 상청액을 제거했다. 0 % (w/v), 0.001 % (w/v), 0.005 % (w/v), 0.01 % (w/v), 0.05 % (w/v) 또는 0.1 % (w/v) 의 농도로 폴록사머 188 을 함유하는 HBSS (+) 1 mL 를 첨가하고, 재현탁된 RPE 세포 현탁액을 실온에 정치시키고, 시간에 걸쳐 생 세포율을 측정했다. 샘플링은 현탁액 제조 직후, 2 시간 후, 4 시간 후, 8 시간 이후의 각 측정 시점에서 실시하고, nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포율을 측정했다.
무조정 HBSS (+) 에 현탁하는 것과 비교했을 때, 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 현탁한 RPE 세포의 생 세포율은, 모든 시험한 폴록사머 188 농도로, 실온에서 8 시간 동안 정치시킨 이후에 높게 유지되었다 (도 3). 폴록사머 188 의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 경우, 특히 높은 생 세포율을 나타냈다. 이러한 결과는, 이식용 매체로서 RPE 세포 보호 효과에 바람직한 폴록사머 188 의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 임을 드러낸다. 이에 따라, 특별한 조건을 필요로 하지 않는 병원에서의 일반적인 제조 동안의 환경 하에서, 제조 이후 제조 장소로부터의 이동 및 수송, 및 이식을 위한 안과 수술에 충분한 것으로 가정되는 기간 동안 RPE 세포의 생 세포율을 안정하게 유지하고, RPE 세포 제제로서의 품질을 손상시키지 않으면서 안전하게 이식을 실시할 수 있다. 또한, 이러한 이식용 매체의 사용은, 병원 CPC 등과 같은 특수 환경 또한 원격지에서 RPE 세포 현탁액을 제조하고, 상온에서 이를 저장 또는 수송하는데 유효하다.
실시예 2. RCS 랫트를 사용한 광수용기 세포 보호 효과 시험
인간 iPS 세포-유래 RPE 세포를 사용한 세포 현탁액의 유효성으로서, 해동 이후의 배양 단계의 유무 및 이식용 매체에 대한 폴록사머 188 의 첨가의 유무로 인한 효과의 차이를, 망막 변성 랫트 모델로서 RCS 랫트에게 망막하 이식 이후 망막 광수용기 세포 보호 효과에 의해 평가했다.
동물 대상체: 3주령의 RCS (Royal College of Surgeons) 랫트 (입수처: CLEA Japan, Inc.) 를 사용했다. RCS 랫트는 자연 발생 망막 변성을 표현형으로서 갖는 랫트이며, 망막 색소 변성 및 연령 관련 황반 변성의 모델 동물로서 이러한 질환에 대한 유효성을 지지하는 시험 시스템에서 폭넓게 사용되고 있다.
시험 물질: 이식 직전에 해동되고 배양 없이 2 개의 상이한 종류의 이식용 매체 (BSS PLUS 500 안 관류액 0.0184 % (Nihon Alcon; 이하, BSS), 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS) 를 사용하여 현탁액으로서 제조된 (시험 물질 -1A 및 -1B) RPE 세포 (1120C7 iPS 세포-유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University), 또는 이식에 앞서 RPE 세포 제조 시설에서 해동되고, 재활성화 이후 14 일 동안 배양되고, 동결 없이, 2 개의 상이한 종류의 이식용 매체 (폴록사머 188-함유 BSS, BSS) 를 사용하여 현탁액으로서 제조된 (시험 물질 -2 및 -3) RPE 세포를 시험 물질로서 사용했다.
시험 물질-1A: BSS 에 현탁된 해동된 RPE 세포
시험 물질-1B: 폴록사머 188-함유 BSS 에 현탁된 해동된 RPE 세포
시험 물질-2: 폴록사머 188-함유 BSS 에 현탁된 배양된 RPE 세포
시험 물질-3: BSS 에 현탁된 배양된 RPE 세포
이식 방법: 염산 케타민 (25 mg/mL; Supriya Lifescience Ltd.) 및 자일라진 (10 mg/mL; Bayer Yakuhin, Ltd.) 의 9:2 (부피비) 혼합물을 2.0 mL/kg 으로 근육내 투여하여, 마취하고, 산동성제 (MydrinP 점안액, Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 점안 해, 산동 (mydriasis) 시켰다. 산동의 확인 이후, Benoxil 점안액 0.4 % (Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) 로 안구의 표면을 마취하고, 0.1 % 포비돈-요오드 함유 생리 식염수로 이루어지는 소독액으로 안구 표면 및 눈꺼풀을 소독했다. 소독액은 즉시 생리 식염수로 안구로부터 씻어 냈다. 소독 후, SCOPISOL SOLUTION FOR EYE (Senju Pharmaceutical Co., Ltd.) 를 점안하고, 알코올로 소독되고 생리 식염수으로 세정한 unicorn 사제 콘택트 렌즈를 안구에 착용하였다. 현미경 하에서, 바늘 (33 G) 을 사용하여 안구에 구멍을 내고, Hamilton Syringe (10 μL) 및 바늘 (33 G) 을 사용하여 시험 물질 또는 매체를 망막하 주입했다. 주입 종료 이후, Atipamezole Hydrochloride (ANTISEDAN; 5.0 mg/mL, Orion Pharma) 를 근육내 투여 (0.72 mL/kg) 했다. 모의 (mock) 처리 안구는, 주입 작업을 제외하고는 매체 및 시험 물질 투여 안구와 동일한 작업을 실시했다.
병리학적 검사 (표본 제조): 안구 및 시신경을 SUPER FIX (KURABO INDUSTRIES LTD.) 로 고정했다. 부검일로부터 2 일 이후에, 이를 물을 사용한 세정 없이, 밀폐된 자동 고정 및 포매를 위한 장치로 처리하였다. 슬라이스를 형성하였다.
시험 방법: 각 개체에 대해 적어도 하나의 표본 (매체 군, 모의 처리 군, 비처리 군에서 각각의 눈에 대해 하나의 표본, 시험 물질 투여 군에서 각각의 눈에 대해 10 개의 표본) 을 사용하여, 시신경유두·시신경을 관찰했다. 잔존 광수용기 세포의 수에 대해, 망막 영역을 4 개의 부분으로 (이식측 전방, 이식측 후방, 비이식측 전방 및 비이식측 후방) 나누고, 각 영역에서 각각의 슬라이드에 대한 외부 과립 층에 잔존하는 광수용기 세포의 최대 수를 점수매기고, 각 영역의 최대 수의 평균을 산출했다.
[표 1]
Figure 112019010373019-pct00002
결과를 도 4 에 나타낸다. 이식용 매체로서 BSS 를 사용했을 경우, 잔존하는 광수용기 세포층의 수 (ONL 점수) 는, BSS 투여군에 비하여, 배양된 RPE 세포 현탁액 (시험 물질-3) 투여 군에서 유의하게 높았다. 그러나, BSS 투여군과 비교했을 때, 해동된 RPE 세포의 현탁액 (시험 물질-1A) 투여 군은 높은 값을 나타내는 경향이 있으나, 유의한 차이가 발견되지는 않았다. 결과는, 이식된 RPE 세포가 광수용기 세포 보호 효과를 가지나, 효과는 해동된 RPE 세포에서보다 배양된 RPE 세포에서 더 높음을 보인다. 다른 한편으로는, 이식용 매체로서 폴록사머 188-함유 BSS 를 사용했을 경우, 잔존하는 광수용기 세포 층의 수 (ONL 점수) 는, 폴록사머 188-함유 BSS 투여 군에 비하여, 해동된 RPE 세포 현탁액 (시험 물질-1B) 및 배양된 RPE 세포 현탁액 (시험 물질-2) 투여 군에서 유의하고 현저하게 더 높았다. 더욱 놀랍게도, 해동된 RPE 세포 현탁액 (시험 물질-1B) 투여 군은 배양된 RPE 세포 현탁액 (시험 물질-2) 투여 군보다 더 높은 값을 나타내는 경향이 있었다.
결과는, 이식용 매체로서 폴록사머 188-함유 BSS 의 사용이, 해동된 RPE 세포와 배양된 RPE 세포의 동등하거나 오히려 역전된 광수용기 세포 보호 효과를 야기하는 것으로 드러났다. 이식용 매체로서 폴록사머 188-함유 BSS 를 사용하면, 모든 이식에 대해서 사용시에, 동결-해동된 세포를 14 일 동안 배양하는 단계, 이후 배양된 세포를 박리 및 회수하는 단계, 세포 현탁액으로서 세포를 제조하는 단계, 및 현탁액을 수송하는 단계의 일련의 단계, 및 이러한 기간 동안 품질 및 성능을 안정하게 보장하기 위한 모든 시험을 생략하는 것이 가능하다. 임상 현장 및 병원내 제조 등과 같은 환경적 및 기술적 변수를 고려하여, 병원에서 특정 기간 동안 동결 세포를 해동하고 배양하는 것은 어려웠다. 그러나, 본 발명의 방법을 사용하면, 심지어 제조 센터 (CPC) 에서 동결에 의해 제형화된 세포 의약품을 의료 현장에서 해동하고 즉시 사용하는 경우에도, 배양된 세포의 것과 동등한 또는 더 높은 광수용기 세포 보호 기능을 유지 또는 나타내는 세포를 제공하는 것이 가능해졌다.
실시예 3. 해동시의 세포 회수율에 대한 폴록사머 188 첨가의 영향
해동 이후 세포 회수율에 대한, 동결 보존된 세포를 해동하는데 사용되는 이식용 매체로서의 무조정 HBSS (+) 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 의 영향을 검증했다.
제조 이후 동결 보존된 RPE 세포 (QHJI01 iPS 세포 유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University) 를 37 ± 2 ℃ 에서 해동하고, 무조정 HBSS (+) 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 현탁시켰다. 이후, 현탁액을 원심분리 (200 g, 4 분, 실온) 하고, 상청액을 제거했다. 동일한 무조정 HBSS (+) 또는 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 세포를 재현탁하고, nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 또는 트리판 블루 염색법을 사용하여 생 세포수 및 사멸 세포수를 측정했다. 2 × 107 개의 세포/바이알 로 동결 보존된 세포에서의 생 세포, 2 × 107 개의 세포를 100 % 로 했을 때 사멸 세포의 회수율 및 손실 세포의 비율을 산출했다.
결과를 도 5 에 나타낸다. nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포수 및 사멸 세포수를 측정했을 때, 무조정 HBSS (+) 에 재현탁된 것의 해동후 회수율은 생 세포 60.50 %, 사멸 세포 2.10 %, 손실 세포 37.40 % 였다. 다른 한편으로는, 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 재현탁된 것의 해동후 회수율은 생 세포 79.10 %, 사멸 세포 1.55 %, 손실 세포 19.35 % 였다. 트리판 블루 염색법에 의해 생 세포수 및 사멸 세포수를 측정했을 때, 무조정 HBSS (+) 에 재현탁된 것의 해동후 회수율은 생 세포 45.5 %, 사멸 세포 2.75 %, 손실 세포 51.75 % 였다. 다른 한편으로는, 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 재현탁된 것의 회수율은 생 세포 87.50 %, 사멸 세포 7.50 %, 손실 세포 5.00 % 이었다.
이러한 결과로부터, 동결 보존된 RPE 세포가 해동될 때 큰 손상을 받기 때문에, 생 세포의 회수율은 저하되고, 손실 세포의 비율이 증가됨이 입증되었다. 그러나, 해동 직후에, RPE 세포를 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 현탁시킴으로써, 손실 세포의 비율을 크게 저감시킬 수 있음이 밝혀졌다. 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 의 사용에 의한 세포 손실의 감소는, 동결 보존된 제제에서 세포의 수의 엄밀한 제어가 가능한 산업상의 이점, 뿐만 아니라 환자마다 필요한 세포수의 확보 및 부담 비용의 절감을 야기한다.
실시예 4. 이식되는 세포 현탁액의 제조 단계에서 세포 회수율에 대한, 폴록사머 188 첨가의 영향
이식 매체로서, 무조정 HBSS (+) 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 RPE 세포를 현탁한 세포 현탁액을 제조했다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 생 세포수 및 사멸 세포수를 계수하고, RPE 세포의 회수율을 산출하고, 이를 기반으로 세포 회수율에 대한 폴록사머 188 첨가의 영향을 검증했다.
해동 이후, 이식 매체로 1 회 세정한 RPE 세포 (QHJI01 iPS 세포 유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University) 을 이전 단계에서와 동일한 무조정 HBSS (+) 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 현탁시켰다. nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 또는 트리판 블루 염색법을 사용하여 생 세포수를 계수하고, RPE 세포 현탁액을 1 × 106 개의 세포/튜브 의 세포수로 분배하였다. 이후, 원심분리 이전의 세포 수로서, nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 또는 트리판 블루 염색법을 사용하여 생 세포수 및 사멸 세포수를 계수했다. 원심분리 (200 g, 4 분, 실온) 이후, 상청액을 제거했다. 무조정 HBSS (+) 또는 폴록사머 188-함유 HBSS (+) 에 RPE 세포를 재현탁시켰다. 이후, 원심분리 이후의 세포 수로서, nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 또는 트리판 블루 염색법을 사용하여 생 세포수 및 사멸 세포수를 측정했다. 원심분리 이전의 생 세포수를 100 % 로 하여, 원심분리 이후의 세포의 회수율을 산출했다.
결과를 도 6 에 나타낸다. nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포수 및 사멸 세포수를 측정했을 때, 무조정 HBSS (+) 에 재현탁된 것의 회수율은 생 세포 54.23%, 사멸 세포 2.36%, 손실 세포 43.41 % 이었다. 다른 한편으로는, 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 HBSS (+)에 재현탁된 것의 회수율은 생 세포 98.42%, 사멸 세포 1.03%, 손실 세포 0.55 % 이었다. 트리판 블루 염색법에 의해 생 세포수 및 사멸 세포수를 측정했을 때, 무조정 HBSS (+) 에 재현탁된 것의 회수율은 생 세포 74.80 %, 사멸 세포 15.45 %, 손실 세포 9.75 % 이었다. 다른 한편으로는, 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유HBSS (+) 에 재현탁된 것의 회수율은 생 세포 86.60 %, 사멸 세포 5.36 %, 손실 세포 8.04 % 이었다.
이러한 결과는, 이식 매체에 대한 폴록사머 188 의 첨가가, 세포 현탁액 제조 단계에서의 원심분리 작업으로 인한 사멸 세포의 수 또는 손실 세포의 비율을 크게 감소시키고, 생 세포의 회수율을 개선한다는 것을 입증하였다. 이에 따라, 세포 현탁액 제조의 작업 환경, 예를 들어 사용 기기, 및 작업자에게 의존하는 세포의 해동 및 세정, 및 현탁액 중의 세포의 계수의 조작 등에 있어서의 편차로 인한 세포 상해의 영향을 감소시키고, 유효한 세포의 수를 보장할 뿐만 아니라, 수를 정확하게 파악하고, 이는 결국 임상 현장에서 이식하고자 하는 세포 현탁액의 제조 작업의 안정화를 가능하게 한다.
실시예 5. 이식 디바이스 (MedOne (등록 상표) Poly Tip (등록 상표) Cannula 25 g/38 g) 를 통한 RPE 세포의 통과 효율의 개선
이식 매체로서, 무조정 BSS 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS 에 RPE 세포를 현탁한 세포 현탁액을 제조했다. 이식 디바이스를 통과한 이후의 생 세포의 수를 측정함으로써, 이식 디바이스를 통한 세포 현탁액의 통과 효율을 평가했다.
무조정 HBSS 또는 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS 에 현탁시킴으로써, RPE 세포 (Ff-I01 iPS 세포 유래 RPE 세포; iPS 세포 입수처: Kyoto University) 현탁액을 제조했다. 이식 디바이스를 통과하기 이전의 세포로서, nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포의 수를 측정했다. 이식 디바이스를 통과한 이후의 세포 현탁액을 수집하고, nucleocounter (등록 상표) NC-200 (제조사: ChemoMetec) 를 사용하여 생 세포수를 측정했다. 이식 디바이스를 통과하기 이전의 생 세포수를 초기 값 (100 %) 으로 하여, 이식 디바이스를 통과한 이후의 생 세포수의 비율을 산출하고, 이식 디바이스를 통한 통과 효율을 평가했다.
결과를 표 2 에 나타낸다. 무조정 HBSS 에 재현탁된 생 세포수는, 이식 디바이스를 통한 통과 이전에 1.26 × 106 개의 세포/mL/튜브 (초기 값) 이었고, 이식 디바이스를 통한 통과 이후에 1.08 × 106 개의 세포/mL/튜브 (통과 효율 85.7 %) 였다. 다른 한편으로는, 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS 에 재현탁된 생 세포수는, 이식 디바이스를 통한 통과 이전에 1.48 × 106 개의 세포/mL/튜브 (초기값) 이었고, 이식 디바이스를 통한 통과 이후에 1.45 × 106 개의 세포/mL/튜브 (통과 효율 98.0 %) 였다.
[표 2]
Figure 112019010373019-pct00003
이러한 결과는, 이식 매체로서 0.05 % (w/v) 폴록사머 188-함유 BSS 의 사용이, 이식 디바이스에서의 RPE 세포 현탁액의 유동성을 향상시키고, 이식 디바이스에 트랩되는 세포수를 감소시키고, 이식 디바이스를 통한 통과 효율을 개선시킴이 입증되었다. 지금까지, 이식되는 세포수와 이식 디바이스를 통한 통과 이후의 세포수 사이에 약 15 % 의 편차가 있었다. 그러나, 폴록사머 188 의 첨가는 편차를 크게 감소시킴이 명백해졌다. 이에 따라, 이식 디바이스를 통한 통과로 인한 이식된 세포의 생 세포율의 감소에 대한 염려가 완화되었다. 또한, 이식 용량의 정확한 결정이 가능해져, 임상 연구 및 임상 시험, 및 승인 이후의 임상 사용에 있어서 용량-의존적 치료 효과의 평가 판정을 정확하게 실시할 수 있고, 재생 의료 등과 같은 제품의 실용화에 크게 공헌할 수 있다.
[산업상 이용 가능성]
폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188) 를 함유하는 본 발명의 현탁제는, 동결 보존 RPE 세포의 해동후 생존률에 대한 개선 효과, RPE 세포를 해동 직후에 이식할 때 광수용기 세포 보호 효과에 대한 개선 효과, 및 해동으로부터 이식까지 각종 단계에 있어서의 세포의 손실에 대한 방지 효과를 제공한다. 따라서, 본 발명의 현탁제에 현탁된 RPE 세포를 함유하는 본 발명의 의약 조성물은 취급이 편리하고, 또한 치료 효과에 있어서 우수하고, 황반 변성을 포함하는 망막 질환의 이식 요법에 있어서 매우 유용하다.
본 출원은, 특허 출원 번호 2016-131171 (출원일: 2016 년 6 월 30 일) 을 기초로 하고, 그 내용은 모두 본원에서 인용된다.

Claims (27)

  1. 폴록사머, 및 안 관류 및 세정액으로서 의약상 허용가능한 매체를 포함하는, 망막 색소 표피 (RPE: retinal pigment epithelial) 세포를 위한 현탁제로서, 폴록사머의 농도가 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 이고, 폴록사머가 폴록사머 188 인 현탁제.
  2. 제 1 항에 있어서, 매체가 조정된 행크 평형 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution) 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류 및 세정액인 현탁제.
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴록사머의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 현탁제.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포의 배양 없이 동결 보존 RPE 세포를 이식하기 위한 현탁제.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 해동 후 8 시간 이내에 이식하기 위한 현탁제.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, RPE 세포의 보호제로서의 현탁제.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 해동 이후 및 이식까지의 임의의 단계에서 사용되고, 그 단계 전후에 RPE 세포수의 감소를 억제하는 현탁제.
  9. RPE 세포 및 폴록사머를 포함하는, 이식을 위한 의약 조성물로서, RPE 세포가, 안 관류 및 세정액으로서 의약상 허용가능한 폴록사머-함유 매체 중에 현탁되고, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 이고, 폴록사머가 폴록사머 188 이고, 황반 변성증 또는 망막 색소 변성증 치료용인 의약 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 황반 변성증은, 위축형 및 삼출형 가령 황반 변성증 및 슈타르가르트병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환인 의약 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 매체가 조정된 행크 평형 염 용액 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류 및 세정액인 의약 조성물.
  12. 삭제
  13. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 의약 조성물.
  14. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포가 동결 보존으로부터 해동 이후 1 시간 이내의 세포이고, 의약 조성물이 제조 이후 8 시간 이내에 대상체에 이식되는 의약 조성물.
  15. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 생존률을 나타내는 의약 조성물.
  16. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 회수율을 나타내는, 의약 조성물.
  17. 안 관류 및 세정액으로서 의약상 허용가능한 폴록사머-함유 매체 중에 RPE 세포를 현탁시키는 것을 포함하는, RPE 세포-함유 조성물의 제조 방법으로서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.001 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 이고, 폴록사머가 폴록사머 188 인 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 매체가 조정된 행크 평형 염 용액 또는 옥시글루타티온-함유 안 관류 및 세정액인 제조 방법.
  19. 삭제
  20. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 매체 중의 폴록사머의 농도가 0.01 % (w/v) ~ 0.1 % (w/v) 인 제조 방법.
  21. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, RPE 세포가 동결 보존으로부터 해동한 이후 1시간 이내의 세포이고, RPE 세포-함유 조성물이 제조 이후 8시간 이내에 대상체에 이식되는 이식용 의약 조성물인 제조 방법.
  22. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 생존률을 나타내는 제조 방법.
  23. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 폴록사머를 함유하지 않는 것에 비해 향상된 RPE 세포의 회수율을 나타내는 제조 방법.
  24. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 광수용기 세포를 보호하기 위한 의약 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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