JP2012533620A - 凍結保存細胞の生存率を向上させるための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年7月20日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N.61/227,023に対して、35U.S.C.§119(e)のもとに優先権を主張し、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いられる「抗炎症剤」は、炎症の1つまたは2つ以上の徴候または症状を阻害する任意の物質を指す。
本発明は、ある種のポリマー、例えばポリエーテルが、凍結細胞の解凍処理の前または間に添加されると、凍結保存細胞の生存率を向上させるという認識に由来する。
生存率の向上は、典型的には、凍結前に細胞に添加する凍結保護剤の使用にかかわらず観察される。特別な理論に拘束されることを望まないが、ポリマーは、細胞膜と相互作用し、シールするか、解凍処理中、または処理直後の細胞膜への欠失を防ぎ、一度解凍した細胞への損傷を防止または最小限に押さえると考えられる。凍結保存細胞への損傷を防止することで、解凍後のアポトーシスおよび細胞死の広がりを軽減し、ある種の下流適用、特に、移植などの下流臨床適用の成功および一貫性の向上に援助する。ある態様において、本発明は、対象(例えば、ヒト)における脂肪移植を改善させるためのポリマー、組成物、および方法を提供する。本発明のシステムを、幹細胞を含む他の種類の細胞を保管/凍結保存するのに用いることもできる。
本発明は、冷凍保存後の細胞膜をシールするおよび/または安定化するのに寄与するポリマーおよびこれを達成する方法の発見に基づく。例えば、解凍前、解凍中などに、解凍後の損傷から細胞膜を安定化および保護するのに十分な濃度で、ポリマーを凍結保存細胞と混合する。かかるポリマーを、細胞移植などの下流適用の成功を向上させる他の技術および材料と組み合わせて用いてもよい。
本発明で採用するポリマーは、凍結保存細胞の生存率を向上させるのに有用である。方法は、典型的には、ポリマー、例えば、P188などのポリエーテルの存在下で凍結保存細胞を解凍すること含む。細胞を凍結保存してその凍結保存細胞をポリマーの存在下で解凍することを含む細胞処理のために、方法が提供される。細胞を、任意の段階(例えば、採取後、凍結前、解凍後、または移植前)で随意に洗浄してもよい。ポリマーを、凍結前に細胞に添加してもよい。ポリマーを、例えば細胞が凍結する前に、凍結保護剤とともに添加してもよい。ポリマーを、解凍前に、凍結保存細胞に添加してもよい。例えば、凍結保存細胞、例えばポリマーの非存在下で凍結されたものを、凍結状態の貯蔵庫から取り出し、ポリマーを細胞に加え、そして、解凍のためのポリマーを有した状態で冷凍庫へ返してもよい。また、ポリマーを解凍直前に凍結保存細胞に添加してもよい。例えば、凍結状態の貯蔵庫から凍結保存細胞を取り出し、細胞に即座に、例えば、細胞がポリマーの存在下で解凍するように、細胞を培養室(例えば、水浴、ヒートブロック、オーブン)に内のセルを配置する前にポリマーを添加してもよい。ポリマーを解凍開始後、例えば細胞を培養室配置した後に凍結保存細胞に添加してもよい。ポリマーを、細胞を凍結保存する前に添加してもよい。また、ポリマーを凍結保存細胞が解凍されたあとに添加してもよい。ポリマーは、細胞を凍結または解凍する前、間、または後の任意の段階で添加することができる。
細胞はまた、病変組織、例えば癌から単離してもよい。よって、細胞は癌細胞であってもよい。例えば、以下の種類の癌の任意のものから単離または由来してもよい:乳がん;胆道癌;膀胱癌;神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌;子宮頸癌;絨毛癌;大腸癌;子宮内膜癌;食道癌;胃癌;急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液学的新生物;T細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫;有毛細胞白血病;慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫;AIDS関連白血病および成人T細胞白血病/リンパ腫;ボーエン病およびページェット病を含む上皮内新生物;肝臓癌;肺癌;ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫;神経芽細胞腫;扁平上皮癌を含む口腔癌;上皮細胞、ストローマ細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣癌;膵臓癌;前立腺癌;直腸癌;平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫;メラノーマ、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌;セミノーマ、非セミノーマ(奇形腫、絨毛癌)などの胚腫瘍、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍を含む精巣癌;甲状腺腺癌および髄質癌を含む甲状腺癌;ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎癌。
本発明は、対象中に細胞を移植する方法を提供する。本方法は、典型的には、ポリマー、例えばポリエーテルの存在下で凍結保存細胞を解凍し、および対象へと解凍された細胞を移植すること含む。本方法は、例えば同種移植片、同系移植片、または異種移植片として用いるために、移植レシピエントではないドナーから細胞を獲得することを伴ってもよい。方法は、自家移植片として用いるために、移植レシピエントである対象から細胞を獲得することを伴ってもよい。本方法は、移植の前にin vitroで細胞を膨張させることを伴ってもよい。組織に配置させる間に、細胞を凍結保存してもよい。細胞を、組織から単離してから凍結保存してもよい。組織に位置させて、解凍後に組織を単離する間に、細胞を凍結保存してもよい。
凍結保存細胞を、任意の適切な下流の適用、例えば、研究、創薬、生物製剤の製造などに用いてもよい。細胞を、例えば、免疫染色、インサイチュハイブリダイゼーションなどと組み合わせて、顕微鏡に対して用いてもよい。細胞を、遺伝子ノックダウンまたは過剰発現研究などの機能的研究のために用いてもよい。細胞を、例えば、細胞周期、細胞シグナル伝達、遺伝子調節などの様々な分子経路についての研究でもよい。細胞を、フローサイトメトリーによって分離してもよい。細胞を、細胞株を作製するために用いてもよい。細胞を、分画研究、例えば、異なる細胞区画からのタンパク質または分子を精製するために用いてもよい。細胞を、異なる病気の経路、例えば、癌を研究するために用いてもよい。細胞を、例えば、腫瘍増殖を研究するために動物モデル内に移植してもよい。細胞を、遺伝子(例えば、mRNAまたはmiRNA)プロファイリング研究のために用いてもよい。細胞の核型または遺伝子型を評価してもよい。細胞を様々な生体分子、例えば、抗体、タンパク質、RNA、DNA、リガンドなどの分離に用いてもよい。
本発明はまた、1つまたは2つ以上のポリマー、例えばポリエーテル、または本明細書に容器内にあると記載されたポリマーコンポーネントを含むパッケージまたはキットを提供する。たとえば、容器は、凍結保存細胞を解凍するのに用いられるようになっているポリエーテルまたはポリエーテル組成物を含んでもよい。ポリマーを使用するための説明書もまた含んでもよい。特に、説明書は、細胞の解凍中にポリマーを凍結保存細胞と接触させることについての情報を含んでもよい。かかる説明書はまた、患者へのポリマー/細胞組成物の、例えば、ポリマーの存在下で細胞を解凍した後の投与に関連する情報を含んでもよい。パッケージはまた、投与前のポリマー/細胞組成物に含まれる生物学的に活性な剤(単数または複数)を含む1つまたは2つ以上の容器を含んでもよい。パッケージはまた、一般的に、製造、使用、医療機器、および/または医薬品の販売を規制する政府機関によって処方される形式で、容器に関連する通知を含むことができ、ここで、該通知は組織移植におけるヒトまたは獣医学的投与に対する、該組成物の機関による承認を示す。
例1:含脂肪組織の改善された凍結保存のための剤
背景:我々は、トリブロックコポリマー(P188)を用いる含脂肪細胞蘇生の研究において、移植片保存において有意な改善を発見した。我々は、同様の戦略は凍結脂肪を同様に保護するために利用してもよいという仮説を立てた。本研究では、凍結貯蔵された含脂肪組織を保護剤として種々の剤で処置し、次いでヌードマウスモデルへの注射ならびに連続的な解釈および分析を行った。
処理。
細胞死(アポトーシス)の量を低減させる解凍処理中に用いられるP188の有効性を評価した。図3を参照。試料を生理食塩水(対照)またはDMSO+トレハロース(至適基準)のいずれかで処理し、それから−80℃で8週間凍結させた。それから、試料を生理食塩水で解凍した、またはP188溶液で解凍した。解凍後、各群を、ヌードマウスモデルに1.0ccアリコートで注射した。第5日に、注射物を各群からサンプル化し、移植片における細胞死の量を蛍光標識を用いて測定した。生理食塩水処理群に対するP188処理群の比較により、解凍処理中にP188を用いた場合における細胞死の量の減少が示される。これらの結果は、事前の凍結保護の使用にかかわらず、解凍中に傷害を標的とすることによりP188が結果を向上させることを示す。
まず、脂肪吸引を用いて対象から脂肪を単離する。脂肪を注射器、例えば60ml注射器に約30mlのアリコートで分配する。凍結保護剤を、随意にアリコートに添加する。次に、脂肪アリコートを−80℃で凍結する。脂肪のアリコートは、のちに使用するために保管する。解凍直前に、ポリマー、例えばポリエーテル、典型的にはP188の等量の溶液を凍結保存された脂肪アリコートに添加する。その後、凍結保存脂肪アリコートを、ポリマーの存在下で、約37.5℃での約20分間の水浴中でのインキュベーションにより解凍し、次いで約15分間約37度での穏やかなロッカーでさらに培養する。そして、試料をスピンし、対象に移植する。
当業者は、定常の実験を用いるだけで、本明細書に記載された発明の具体的な態様の多数の均等物を理解し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は上記の記載に限定されると意図されず、むしろ、添付の特許請求の範囲に規定される。
Claims (79)
- 凍結保存細胞の生存率を向上させる方法であって、ポリエーテルの存在下で凍結保存細胞を解凍することを含む、前記方法。
- ポリエーテルがジブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがトリブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがテトラブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがポリアルキルエーテルである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリアルキルエーテルおよび他のポリマーのブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリアルキルエーテルおよび第二のポリアルキルエーテルのブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリエチレングリコールおよび第二のポリマーのブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- 第二のポリマーが、ポリエチレングリコールより疎水性である、請求項8に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリプロピレングリコールおよび第二のポリマーのブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- 第二のポリマーが、ポリプロピレングリコールより親水性である、請求項10に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)−ポリ(エチレンオキシド)のブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのトリブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが、形態:ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ポリエチレングリコールのトリブロックコポリマーである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがポロキサマーP188である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがポロキサマーP108である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがポリエチレングリコールである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがポリソルベート80である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがメロキサポールである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルがポロキサミンである、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが少なくとも95%純度である、請求項1に記載の方法
- ポリエーテルが少なくとも98%純度である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが少なくとも99%純度である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルの分子量が約1,000g/mol〜約10,000g/molの範囲である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルの分子量が約2,000g/mol〜約10,000g/molの範囲である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルの分子量が約3,000g/mol〜約10,000g/molの範囲である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルの分子量が約5,000g/mol〜約10,000g/molの範囲である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが非イオン性である、請求項1に記載の方法。
- ポリエーテルが解凍前に凍結保存細胞に添加される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ポリエーテルが解凍直前に凍結保存細胞に添加される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ポリエーテルが解凍開始後に凍結保存細胞に添加される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ポリエーテルの濃度が約1mg/ml〜約10mg/mlの範囲である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- ポリエーテルの濃度が約10mg/ml〜約20mg/mlの範囲である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- ポリエーテルの濃度が約20mg/ml〜約50mg/mlの範囲である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が約1ml以下の容積を占める組成物中に存在する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が約1ml〜約100mlの容積を占める組成物中に存在する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が約100ml〜約500mlの容積を占める組成物中に存在する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が約500ml〜約1Lの容積を占める組成物中に存在する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約−205℃〜約−195℃の範囲の温度の貯蔵庫から凍結保存細胞を獲得することを含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約−80℃〜約−60℃の範囲の温度の貯蔵庫から凍結保存細胞を獲得することを含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約0℃未満の温度で貯蔵庫から凍結保存細胞を獲得することを含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、凍結保存細胞を約15℃〜約40℃の範囲の温度で培養することを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、凍結保存細胞を約30℃〜約45℃の範囲の温度で培養することを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が約1分以内に完了する、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が約1分〜約5分の範囲内に完了する、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が約5分〜約10分の範囲内に完了する、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が約10分〜約30分の範囲内に完了する、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約1℃/分〜約5℃/分の範囲の速度で凍結保存細胞を暖めることを含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約5℃/分〜約25℃/分の範囲の速度で凍結保存細胞を暖めることを含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約25℃/分〜約50℃/分の範囲の速度で凍結保存細胞を暖めることを含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 解凍工程が、約50℃/分〜約100℃/分の範囲の速度で凍結保存細胞を暖めることを含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を洗浄することをさらに含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 洗浄工程が1〜5回繰り返される、請求項53に記載の方法。
- ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グリセロール、プロピレン、グリコール、トレハロース、デキストロース、スクロース、グルコース、マルトースおよび血清からなる群から選択される1つまたは2つ以上の剤の存在下で細胞が凍結保存される、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が、臍帯血細胞、幹細胞、胚幹細胞、成人幹細胞、前駆細胞、自己細胞、同種移植細胞、異種移植細胞,および遺伝子操作された細胞からなる群から選択される、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が、結合、神経、筋肉、および上皮からなる群から選択される組織の細胞である、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 結合組織が脂肪組織である、請求項57に記載の方法。
- 凍結保存細胞が、間葉、外胚葉、または内胚葉起源の細胞である、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞が、リンパ細胞、B細胞、T細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞、ヘルパーT細胞、骨髄細胞、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、過分葉好中球、単球、マクロファージ、網状赤血球、血小板(platelet)、マスト細胞、血小板(thrombocytes)、巨核球、樹状細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、松果体細胞、松果体細胞(pinealocytes)、膠細胞、膠芽細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞、巨細胞性神経分泌細胞、星細胞、ベッチャー細胞;脳下垂体細胞、ゴナドトロピン産生細胞、副腎皮質刺激因子、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、肺胞上皮細胞、I型肺胞上皮細胞、II型肺胞上皮細胞、クララ細胞;杯状細胞、肺胞マクロファージ、心筋細胞、周皮細胞、胃細胞、胃主細胞、壁細胞、杯状細胞、パネート細胞、G細胞、D細胞、ECL細胞、I細胞、K細胞、S細胞、腸内分泌細胞、腸クロマフィン細胞、APUD細胞、肝臓細胞、肝細胞、クッパー細胞、骨細胞(bone cells)、骨芽細胞、骨細胞(osteocytes)、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、エナメル芽細胞、軟骨細胞(cartilage cells)、軟骨芽細胞、軟骨細胞(chondrocytes)、皮膚細胞、毛細胞、毛胞、ケラチノサイト、メラノサイト、母斑細胞母斑、筋肉細胞、筋細胞、筋芽細胞、筋管、含脂肪細胞、線維芽細胞、腱細胞、足細胞、糸球体近接細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、腎細胞、腎細胞、緻密斑細胞、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵母細胞、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞の容器にポリエーテルを添加することをさらに含む、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞の容器にポリエーテルの溶液を添加することをさらに含む、請求項1〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を処理する方法であって、
細胞を凍結保存すること、および
ポリエーテルの存在下で凍結保存細胞を解凍すること
を含む、前記方法。 - 対象に細胞を移植する方法であって、
ポリエーテルの存在下で凍結保存細胞を解凍すること、および
解凍された細胞を対象へ移植すること
を含む、前記方法。 - ドナーから細胞を獲得することをさらに含む、請求項64に記載の方法であって、ドナーは移植レシピエントではない、前記方法。
- 対象から細胞を獲得することをさらに含む、請求項64に記載の方法。
- 移植前に細胞を膨張させることをさらに含む、請求項64または65に記載の方法。
- 細胞が脂肪組織からである、請求項64〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、対象に脂肪吸入を実行することにより獲得される、請求項64〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が幹細胞である、請求項64〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞における多能性を誘発する幹細胞関連遺伝子で細胞を形質転換することをさらに含む、請求項64〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 幹細胞関連遺伝子が、Oct3、Oct4、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5、Nanog、Lin28、C−Myc、L−Myc、およびN−Mycからなる群から選択される、請求項71に記載の方法。
- 対象が哺乳類である、請求項64〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項64〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 凍結保存細胞の生存率を向上させる方法であって、
凍結保護剤の存在下で細胞を凍結すること;および
ポリエーテルの存在下で凍結保存細胞を解凍すること
を含む、前記方法。 - 凍結保護剤がポリエーテルである、請求項75に記載の方法。
- 凍結保護剤がP188である、請求項75に記載の方法。
- 細胞を洗浄する工程をさらに含む、請求項75〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を対象に移植する工程をさらに含む、請求項75〜78のいずれか一項に記載の方法。
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